PL188323B1

PL188323B1 - Kapsuła zawierająca komórki i jej zastosowanie oraz kompozycja i środek farmaceutyczny

Info

Publication number: PL188323B1
Application number: PL97329071A
Authority: PL
Inventors: Walter H. Günzburg; Peter Karle; Robert Michael Saller
Original assignee: Bavarian Nordic As; Gsf Forschungszentrum F Umwelt
Priority date: 1996-03-27
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2005-01-31
Also published as: SK132398A3; CZ305098A3; HU221349B1; NZ331765A; CZ288074B6; ES2253775T3; SK282744B6; PL329071A1; IL125795A0; WO1997035994A3; NO984540D0; JP4229982B2; AU2382797A; EP0892852A2; SI0892852T1; WO1997035994A2; HUP9904116A2; RU2185821C2; ATE309383T1; AU713382B2

Abstract

1. Kapsula zawierajaca komórki posiadajaca srednice od 0,01 mm do 5 mm, zwlaszcza od 0,1 mm do 1 mm, znamienna tym, ze pokrywa komórke produkujaca cyto chrom P450 i posiada porowata blone przepuszczalna dla czasteczek proleku przenikaja- cych do wnetrza kapsuly i aktywowanych przez cytochrom P450. PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest kapsuła zawierająca komórki posiadająca średnicę od 0,01 mm do 5 mm, zwłaszcza od 0,1 mm do 1 mm, która znajduje zastosowanie w terapii antynowotworowej z zastosowaniem proleku. Ponadto, wynalazek dotyczy także zastosowania takiej

188 323 kapsuły do przygotowywania leków, oraz kompozycji i środka farmaceutycznego zawierających przedmiotową kapsułę.

Stan techniki.

Anty - nowotworowe leki stosowane w leczeniu nowotworów są w większości przypadków stosowane systemowo i rozprzestrzeniają się w całym ciele pacjenta. Duża dawka systemowa takich leków wymagana dla leczenia nowotworu związana jest z nieprzyjemnymi skutkami ubocznymi dla pacjenta.

W celu ominięcia tego problemu użyto rakowych proleków, które muszą być metabolizowane lub aktywowane w ciele, zanim staną się cytotoksyczne. Niestety, ludzkie nowotwoiy', które zawierałyby odpowiednio wysoki poziom aktywujących enzymów występują rzadko. Głównym miejscem aktywacji proleku jest wątroba i aby zapewnić sytuację, w której guz leżący w odległym miejscu otrzymuje wystarczającą dawkę aktywowanego leku należy podać bardzo wysoką dawkę aktywowanego proleku wytwarzanego w wątrobie, co powoduje toksyczne skutki uboczne u pacjenta.

Jedna ze strategii, dzięki której problemy wysokich systemowych stężeń aktywowanego leku mogłyby być ominięte, polegałyby na dostarczeniu środków do aktywacji proleku bezpośrednio lub w pobliże miejsca nowotworowego. Strategia taka wymagałaby, aby komórki rakowe, lub komórki w miejscu, gdzie znajduje się guz, były genetycznie tak transformowane, aby produkować duże ilości enzymów wymaganych do metabolizowania tego proleku nowotworowego. Wektory retrowirusowe są doskonale dostosowane do stabilnego dostarczania genów do komórek od momentu, gdy retrowirus będzie mógł zintegrować DNA własnego genomu z genomem komórek gospodarza i tym sposobem komórki potomne zainfekowanych komórek będą nośnikami wektorów retrowirusowych, przenoszących geny terapeutyczne. Kolejną korzyścią jest to, że większość retrowirusów infekuje tylko dzielące się komórki i dlatego są one idealnym dostarczycielem genów do komórek nowotworowych.

Do tej pory przetestowano różnorodne geny cytotoksyczne przenoszone przez wektory retrowirusowe. Geny te kodują enzymy, które powodują konwersje in vivo substancji farmakodynamicznie i toksykologicznie obojętnych, nawet przy wysokich dawkach do wysoce aktywnych metabolitów (Connors, T. A. (1995), Gene Therapy 2: 702-709).

W odpowiednio zaplanowanej chemioterapii nowotworów proleki okazują się być skuteczne w leczeniu nowotworów zwierzęcych, zawierających wysoki poziom enzymów aktywujących (Connors, T. i Whisson, M. (1966), Nature 210: 866-867 i Cobb, L. i inni (1969), Biochemical Pharmacology 18: 1519-1527). Jednakże wyniki kliniczne okazały się rozczarowujące, gdyż stwierdzono, że ludzkie nowotwory, które zawierają odpowiednio wysoki poziom aktywującego enzymu są rzadko spotykane (Connors, T. (1986), Xenobiotica 16: 975-988). Terapia prolekiem z użyciem enzymu związanego z wirusem, (VDEPT - virally directed enzyme prodrug therapy) i bardziej ogólna terapia prolekiem z użyciem enzymu związanego z genem, (GDEPT - gene directed enzyme prodrug therapy) wykazują podobieństwo, jako że służą zniszczeniu komórek nowotworowych przez nowotworowo specyficzną aktywację proleku. Jednak w tym przypadku gen kodujący enzym jest albo specyficznie skierowany do komórek złośliwych albo jest pod kontrolą specyficznego promotora.

Jak dotąd większość wysiłków skierowanych na terapię prolekami koncentrowała się na zastosowaniu genu kinazy tymidynowej (HSV-tk) ludzkiego wirusa Herpes Simplex, jako genu samobójczego. Chociaż enzym HSV-tk w połączeniu z prolekiem gancyklowirem (GCV) jest polecany jako system dobry w GDEPT (Culver, K. i inni, (1992), Science 256: 1550-1552, Ram, Z. i inni, (1993), Cancer Research 53: 83-88 i Chen, S., Shine, H. i inni (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3054-3057), to istnieje wiele teoretycznych przesłanek sugerujących, że jest to niewątpliwie najlepsza kombinacja. Po pierwsze, działa specyficznie w fazie S i nie oddziaływuje na komórki w fazie spoczynkowej. Wynika to z tego, że monofosforan GCV istnieje krótko i aby zadziałać toksycznie musi być obecny, gdy komórki wchodzą w fazę S. HSV-tk fosforyluje GCV do monofosforanu (reakcja, która nie może być przeprowadzona przez enzymy ssaków), który jest następnie fosforylowany przez enzymy komórkowe do trójfosforanu węgla i ulega inkorporacji do DNA. Po drugie, aktywny lek jest trój fosforanem i nie należy się spodziewać, że będzie swobodnie dyfundował, oddziaływując na sąsiednie komórki. Jednakże takie oddziaływanie na sąsiednie komórki obserwuje się zarówno in vitro jak i in vivo,

188 323 chociaż wydaje się, że ma miejsce współdziałanie metaboliczne, a w tym ostatnim przypadku część skutków może mieć pośredni charakter, związany z komponentą immunologiczną (Bi, W., Parysek, L. i inni, (1993), Human Gene Therapy 4: 725-731, Vile, R. i Hart, I. (1993) Cancer Research 53: 3860-3864 i Freeman, S., Abboud, C., i inni (1993), Cancer Research 53: 5274- 5283). Niedogodnością jest to, że skutek oddziaływania na sąsiednie komórki jest zależny od kontaktu komórka - komórka. Może to być związane z obecnością złącz szczelinowych utworzonych przez bliski kontakt pomiędzy komórkami transdukowanymi i otaczającymi, co umożliwia transfer ufosforylowanego gancyklowiru.

Ostatnio, doniesiono o interesujących rezultatach, gdzie komórki, które były transfekowane genem kodującym formę 2B1 szczurzego cytochromu P450 i następnie traktowane cyklofosfamidem (Chen, S., Shine, H., i inni (1994), Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3054-3057).

Cel wynalazku.

Celem wynalazku jest dostarczenie nowego narzędzia znajdującego zastosowanie w terapii.

Istota wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest kapsuła zawierająca komórki posiadająca średnicę od 0,01 mm do 5 mm, zwłaszcza od 0,1 mm do 1 mm, charakteryzująca się tym, że pokrywa komórkę produkującą cytochrom P450 i posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450.

Korzystnie kapsuła według wynalazku jest wykonana z materiału zawierającego kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany. Korzystnie komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor przygotowany zgodnie z opisem z przykładu II, czyli wektor pc3/2Bl. Równie korzystnie komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450, natomiast gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.

Przedmiotem wynalazku jest także zestaw farmaceutyczny zawierający kapsułę oraz prolek, charakteryzujący się tym, że rzeczona kapsuła pokrywa komórkę produkującą cytochrom P450 i posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada średnicę od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.

Korzystnie, w zestawie według wynalazku, kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany. Równie korzystnie w zestawie według wynalazku, komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor przygotowany zgodnie z opisem z przykładu II, czyli wektor pc3/2Bl. Korzystnie w zestawie według wynalazku, komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450. Korzystnie w zestawie według wynalazku, gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X. Korzystnie w zestawie według wynalazku, kapsuły i prolek są w postaci różnych formulacji. Korzystnie w zestawie według wynalazku, kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, gdzie się znajdują, a prolek ma postać do podawania systemowego i/lub miejscowego. Korzystnie w zestawie według wynalazku, kapsuła ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu. Korzystnie w zestawie według wynalazku, prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, charakteryzujący się tym, że jako czynnik aktywny zawiera kapsułę pokrywającą komórkę produkującą cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, a średnica kapsuły wynosi od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.

188 323

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak ałginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor przygotowany zgodnie z opisem z przykładu II, czyli wektor pc3/2Bl.

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, gdzie się znajdują.

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.

Korzystnie, środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kapsuły pokrywającej komórkę produkującą cytochrom P450, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, przy czym kapsuła posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada średnicę od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor pc3/2B 1.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową pro wadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku kapsuła ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.

W jednej z korzystnych realizacji zastosowania według wynalazku rzeczony lek jest zestawem farmaceutycznym zawierającym rzeczoną kapsułę i rzeczony prolek.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku kapsuła i prolek są w postaci różnych formulacji.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, a prolek ma postać do podawania systemowego i/lub miejscowego.

Opis ujawnienia.

Ujawnienie zawarte w niniejszym opisie zawiera, między innymi:

- wadliwa replikaeyjnie wektor retro wirusowy przenoszący gen cytochromu P450 bę<^^cy pod transkrypcją kontrolą specyficznych sekwencji regulatorowych lub yasmotoropych, lub, lub indukowalnego promieniami X promotora komórek docelowych;

188 323

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej , w któiym wektor zawiera rejon 5'LTR jteukruek U3-R-U5; jcdną lub y-clc sckwcncji wybeenych z sckwcncji kodujących - nic kodujących; - ecjon 3'LTR zek-ciający cełkowicic lub częściowo usunięty ecjon U3, y któeym usunięty wymicniony ecjon U3 zastąpiony, następnic fojfoeyloweny yezcz cnzymy komóekowc do reójfojfoeenu węgle i ulcge ineaeyoeżcji do DNA. Po deugic, aktywny lck jcst teój fosfoeencm i nic nelcży się syodzicweć, żc będzic swobodnic dyfundoweł, oddziżłkwując ne sąsicdnic komóeki. Jcdnekżc tekic addziżływenic ne sąsicdnic eamóeei obsrewujc się zeeówno in y-teo jek i in yiyo, chocież wkdąjr się, żc me micjscc współdzielenic mcteboiicznc, e w tym ostetnim pezypedku część skutków możc micć yośecdni cheeektee, związeny z komponcntą immunologiczną (Bi, W., Peeksrk, L. i inni, (1993), Humen Gcnc Thceepy 4: 725-731, Vilc, R. i Heet, I. (1993) Cencce Rcscaech 53: 3860-3864 i Feccmen, S., Abboud, C., i inni (1993), Cencce R^eech 53: 5274- 5283). Nicdogodnością jcst to, żc skutck oddzieływenie ne sąsicdnic komóeki jcst zelcżny od kontektu kamóeke-komóeke. Możc to być związenc z obccnością złącz szczclinowych utwoezonych yezcz bliski kontekt pomiędzy kamóekemi reżnsrueawenkmi i oreczejącymi, co umożliwie teensfce ufosfoeylowenrgo gencykkwvieu.

Ostatnio, danirsiona o inteecsujących eczultatech, gdzic eamóeki, któec były ^ζμ&^wenc gcncm kodującym foemę 2B1 szczuzcgo cytacheomu P450 i nżjtęynic reektowenr cyklafosfemircm (Chcn, S., Shinc, H., i inni (1994), Proc. Netl. Aced. Sci. 91:3054-3057).

Ccl wynelezku.

Cclcm wynelezku jcst dostaeczcnic nowcgo nżizędzie znejdująccgo zejtosowenic w tceeyii.

Istota wynelezku.

Pezcdmiotcm wynelezku jcst keysułe zżyireejące komóeki yosiedąjące śecdnicę od 0,01 mm do 5 mm, zwłeszcze od 0,1 mm do 1 mm, cheeektcryzujące się tym, żc yokeyye kamóekę produkującą cytocheom P450 i yosiede yorowetą błonę pezcpuszczelną dle cząstcczck peolcku yezcnikejących do wnęteze keysuły i eetywowenkch yezcz cytocheom P450.

Koezystn-c kepsułe wcdług wynelezku jcst wykonene z metceiełu zeyiceejącrga komplcks clckteolityczny utwoezony z tekich związków jek elginien i polilizyną lub sieeczenu cclulozy i polichloeku dyumctylodwuąlliloemonaycgo lub innych steuktue porowetych tekich jek poliemidy i polisulfon-eny. Koezystnic komóeke produkujące cytocheom P450 zewiree wcktoe pezygotoweny zgodnic z opiscm z pezyktadu II. Równic koe-zystu-c eamóeee produkujące cytocheom P450 jcst stebilną linią komóeeoyą peowedzącą konstytutywną ^spe^ę cytocheomu P450, netomiest gcn cytochromu P450 jcst pod reenseekpcyjną kontrolą sckwcncji ecguletorowych lub promotorowych, lub peomotoee komóeck docclowych indukowelncgo peomicniemi X. Pezcdmiatrm wynelezku jcst takżc zcstew feemeccutyczny zeyiceejący kepsułę oeez peolck, cheeekteeyzujący się tym, żc ez^zone kepsułe pokeyye komóekę produkującą cytocheom P450 i pos-ede poeowetą błonę pezcpuszczelną dle cząstcczck peolcku pezcnikejących do wnęteze kepsuły i eetkyowenych pezcz cytocheom P450, pezy czym ezcczone kepsułe yosiede śecdnicę od 0,01 mm do 5 mm, koezystnic od 0,1 mm do 1 mm.

Koezystnic, w zcstewic wcdług wynelezku, komplcks clcktrolityczny utyoezany z tekich związków jek elginien i polilizyne lub sieeczenu cclulozy i polichloeku dwumctylodwuąllilaemonowcga lub innych steuktue porowetych tekich jek yaliemidy i polisulfonieny. Równ-c koezystnic w zcstewic wcdług wynelezku, komóeke produkujące cytochrom P450 zewicee wcktoe pezygatayeny zgodnic z opiscm z yezykłedu II. Koezystnic w zcstewic wcdług wynelezku, komóeke produkujące cytochrom P450 jcst stabilną linią komoekową peowedzącą konstytutywną ckspecsję cytochromu P450. Koezystnic w zcstewic wcdług wynelezku, gcn cytocheomu P450 jcst yod teenskeypcyjną kontrolą sckwcncji ecguletorowych lub yeomoraeowych, lub promatoee komóeck docclowych inrueayelncgo yromicniemi X. Koezystnic w zcstewic wcdług wynelezku, kepsuły i peolck są w yojnżci eóżnych foemulecji. Kaezystnir w zcstawic wcdług wynelezku, kepsułe me posteć do podewenie yezcz inickcję i/lub pezcz implentecję do oegenów docclowych i/lub micjsce w ich pobliżu, gdzic się znejdują, e peolck me postać do yodewenie systcmowcgo -/lub micjsc-owcgo. Koezystnic w zcstawic wcdług wynelezku, kepsułe me postać do padewenie pezcz imylentację do tkenki nayotwaeu picesi lub nowotwoeu tezustki i/lub micjsce w jcj pobliżu. Koezystnic w zcstewic wcdług wynelezku, peolck jcst cyktofosfemidcm i/lub ifosfamidrm.

188 323

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor przygotowany zgodnie z opisem z przykładu II.

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, gdzie się znajdują.

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.

Korzystnie, w środek farmaceutyczny według wynalazku charakteryzuje się tym, że prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor przygotowany zgodnie z opisem z przykładu II.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, gdzie się znajdują.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że kapsuła ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kapsuły pokrywającej komórkę produkującą cytochrom P450 oraz proleku do wytwarzania zestawu farmaceutycznego do leczenia chorób nowotworowych lub innych pokrewnych chorób lub zaburzeń, przy czym

188 323 kapsuła posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada średnicę od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora indukowalnego promieniami X komórek docelowych.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, kapsuła i prolek są w postaci różnych formulacji.

Korzystnie zastosowanie według wynalazku charakteryzuje się tym, że kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, gdzie się znajdują, a prolek ma postać do podawania systemowego 'i/lub miejscowego.

Opis ujawnienia.

Ujawnienie zawarte w niniejszym opisie zawiera, między innymi:

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy przenoszący gen cytochromu P450 będący pod transkrypcyjną kontrolą specyficznych sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub indukowalnego promieniami X promotora komórek docelowych;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, w którym wektor zawiera rejon 5'LTR struktury U3-R-U5; jedną lub wiele sekwencji wybranych z sekwencji kodujących i nie kodujących; i rejon 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty rejon U3, w którym usunięty wymieniony rejon U3 zastąpiony jest przez sekwencję polilinkera zawierającą specyficzne sekwencje regulatorowe lub promotorowe, lub indukowalny promieniami X promotor komórek docelowych, po których następują rejony R i U5, charakteryzujący się posiadaniem co najmniej jednej sekwencji kodującej dla cytochromu P450;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, w którym specyficzna sekwencja regulatorowa lub promotorowa komórek docelowych jest wybrana z jednego lub wielu elementów grupy, zawierającej specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe WAP, MMTV, β-laktoglobuliny i kazeiny, trzustkowe specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe zawierające sekwencje regulatorowe i promotorowe anhydrazy węglowej II i β-glukokinazy, limfocytowe specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe zawierające specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe immunoglobulin i MMTV oraz specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe MMTV dające reaktywność na hormony glikokortykoidowe lub kierujące ekspresją w gruczołach sutkowych;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, w którym wymienione rejony LTR są wybrane z co najmniej jednego składnika grupy zawierającej rejony LTR wirusów MLV, MMTV, MSV, SIV, HIV, HTLV, FIV, FeLV, BLV i MPMV;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, gdzie wymieniony wektor retrowirusowy bazuje na wektorze BAG, lub wektorze pLXSN;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, gdzie wymienionym wektorem retrowirusowym jest pLX2Bl, przygotowany zgodnie z opisem z przykładu I;

188 323

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, gdzie wymienionym wektorem retrowirusowym jest pc3/2Bl, przygotowany zgodnie z opisem z przykładu U;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, w którym sekwencje retrowirusowe związane z integracją retrowirusa są zmienione lub co najmniej częściowo usunięte;

- wadliwy replikacyjnie wektor retrowirusowy, jak wyżej, gdzie wymienione sekwencje regulatorowe lub promotorowe podlegają regulacji przez cząsteczki pośredniczące;

- linię komórek pakujących transfekowaną wadliwym replikacyjnie wektorem retrowirusowym, jak wyżej, przy czym wymieniona linia komórek pakujących zawiera co najmniej jeden konstrukt retrowirusa lub zrekombinowanego retrowirusa kodujący białka niezbędne do opakowania wymienionego wektora retrowirusowego;

- linię komórek pakujących, jak wyżej, gdzie linia komórek pakujących pochodzi od gryzom lub jest pochodzenia szczurzego, psiego, kociego lub ludzkiego, i jest tkankowo zgodna z tkanką ludzką;

- linię komórek pakujących, jak wyżej, gdzie linia komórek pakujących jest wybrana z grupy zawierającej psi-2, psi-Crypt, psi-AM GP+E-86, PA317 i GP+envAM-12;

- zrekombinowaną cząsteczkę retrowirusa produkowaną w wyniku hodowania w odpowiednich warunkach linii komórek pakujących, którąś z wyżej wymienionych, po czym opcjonalnie następuje izolowanie produkowanych zrekombinowanych cząsteczek wirusa;

- kompozycję farmaceutyczną zawierającą cząsteczki zrekombinowanego retrowirusa, jak wyżej, lub linię komórek pakujących, jak wyżej;

- linię komórek pakujących, jak wyżej, pokrytą kapsułami o porowatej błonie, która jest przepuszczalna dla cząsteczek zrekombinowanego retrowirusa, produkowanych przez wymienioną linię komórek pakujących;

- linię komórek pakujących, jak wyżej, pokrytych kapsułami z kompleksu siarczanu celulozy i polidwumetylodwuallilu amonowego;

- sposób usunięcia komórek nowotworowych, na który składa się podanie osobnikowi leczonemu terapeutycznie efektywnej ilości cząstek zrekombinowanego retrowirusa, jak wyżej, linii komórek pakujących, jak wyżej, lub linii komórek pakujących pokrytej kapsułami, jak wyżej, i albo równocześnie albo w odstępie czasu, proleku nowotworowego, który może być aktywowany przez cytochrom P450;

- sposób, jak wyżej, w którym komórkami nowotworowymi są komórki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki;

- sposób, jak wyżej, w którym cząsteczki zrekombinowanego retrowirusa, linia komórek pakujących, lub pokryta kapsułami linia komórek pakujących podawana jest poprzez iniekcję lub implantację do guza, lub w miejsce, gdzie znajduje się guz;

- zastosowanie cząstek zrekombinowanego retrowirusa, jak wyżej, linii komórek pakujących, jak wyżej, lub pokrytej kapsułami linii komórek pakujących, jak wyżej, do przygotowania kompozycji farmaceutycznej użytecznej w usunięciu komórek nowotworowych;

- prowirus retrowirusowy integrowany do ludzkiego genomu, przenoszący gen cytochromu P450 pod transkrypcyjną kontrolą specyficznych sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub indukowalnego promieniami X promotora komórek docelowych; oraz

- komórki ludzkie zawierające gen cytochromu P450 będący pod transkrypcyjną kontrolą specyficznych sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub indukowalnego promieniami X promotora komórek docelowych.

Szczegółowy opis wynalazku.

Cytochrom P450 tworzy rozległą grupę monooksygenaz, które katalizują utlenianie szerokiego zakresu substratów. Są one wytwarzane przez bakterie, drożdże i wyższe organizmy, gdzie odgrywają rolę w detoksykacji substancji ksenobiotycznych, reakcjach bioaktywacji i w metabolizmie różnych związków endogennych.

Cytochrom P450 katalizuje hydroksylację powszechnie stosowanych proleków nowotworowych cyklofosfamidu (CPA) i ifosfamidu do ich aktywnych toksycznych form. Normalnie ekspresja genu endogennego cytochromu P450 pacjenta jest ograniczona do wątroby, toteż anty-nowotworowe skutki systemowo podawanych CPA zależą od postępującej systemowej dystrybucji toksycznych metabolitów z wątroby. Wiąże się to z problemem toksyczności, jako

188 323 że aktywowany lek oddziaływuje nie tylko na nowotwór, ale również na inne tkanki pacjenta, takie jak szpik kostny i nerki.

Podejście terapeutyczne, gdzie gen cytochromu P450 jest selektywnie wprowadzony bezpośrednio do komórek nowotworowych i podlega wzmożonej ekspresji w tych komórkach, pozwala ominąć ten problem. Toksyczne metabolity wytwarzane przez transdukowane komórki nowotworowe oddziaływują na otaczające, nie transdukowane komórki nowotworowe w sposób zależny od stężenia. Dodatkową korzyścią, wynikającą ze stosowania systemu cytochrom P450/CPA jest brak cytotoksycznych wpływów dzielących się komórek na komórki znajdujące się w ich otoczeniu. Wynika to stąd, że wytworzone aktywne metabolity powodują powstanie międzyniciowych wiązań poprzecznych, bez względu na fazę cyklu komórkowego. Potem, podczas syntezy DNA, te międzyniciowe wiązania poprzeczne przyczyniają się do śmierci komórki.

Wektory wirusowe są najczęściej stosowanymi nośnikami do transferu genów w dotychczasowej praktyce klinicznej. Większość prób klinicznych stanowiły jednak podejścia ex vivo, gdzie komórki pacjenta były izolowane, modyfikowane w hodowli tkankowej i następnie wprowadzane do pacjenta.

W leczeniu nowotworów, mogłoby być wykonanie izolowanie komórek od pacjentów (komórek nowotworowych albo zdrowych), infekowanie ich in vitro zrekombinowanymi cząsteczkami retrowirusa, przenoszącymi gen kodujący cytochrom P450, a następnie wprowadzanie ich z powrotem do pacjenta w pobliże nowotworu. To podejście jest jednak nadzwyczaj pracochłonne, ponieważ każda komórka pacjenta musi być izolowana, hodowana, transdukowana konstruktem genowym i wprowadzona skutecznie, bez infekcji spowodowanej przypadkowymi czynnikami. Koszty i czas zaangażowane w takie podejście ograniczają jego praktyczną użyteczność.

Jako alternatywne, rozpatrywane jest podejście, gdzie jeden typ komórek jest infekowany przez zrekombinowane cząsteczki retrowirusa przenoszące gen kodujący cytochrom P450 i następnie używany w terapii wielu różnych pacjentów. Takie podejście jest łatwiej wykonanie, przy założeniu, że uda się przezwyciężyć problem reakcji odpornościowej. Jednakże większość nowotworów nie nadaje się do terapii genowej ex vivo.

Najlepiej, gen kodujący cytochrom P450 jest wprowadzony in vivo do komórek nowotworowych, lub do komórek w pobliżu nowotworu.

Dostarczanie genów in vivo związane jest z wieloma nowymi problemami. Przede wszystkim, trzeba wziąć pod uwagę względy bezpieczeństwa.

Doniosłym problemem w terapii genowej in vivo, zarówno ze względów bezpieczeństwa jak i ze względów praktycznych, jest selektywna ekspresja genów. Jest oczywiste, że geny terapeutyczne przenoszone przez wektory nie powinny bez różnicy ulegać ekspresji we wszystkich tkankach i komórkach, lecz raczej tylko w wybranych komórkach docelowych. Jest to szczególnie ważne, gdy geny, które mają być transferowane są genami aktywującymi proleki w celu zniszczenia specyficznych komórek nowotworowych. Zniszczenie innych, nie docelowych komórek byłoby oczywiście szczególnie niepożądane.

Zasadniczo przypadkowa integracja prowirusowej formy genomu retrowirusa z genomem zainfekowanej komórki rodzi istotne problemy etyczne, ponieważ taka przypadkowa integracja może prowadzić do aktywacji proto-onkogenów i w ten sposób wywołać rozwój nowego nowotworu. Większość naukowców zgodziłoby się, że prawdopodobieństwo, iż wadliwy replikacyjnie retrowirus, taki jak używane obecnie, ulegnie integracji z lub blisko genu komórkowego, który kontroluje proliferację komórki jest znikomo małe. Jednakże, można przypuszczać, że wybuchowa ekspansja populacji replikacyjnie kompetentnych retrowirusów wynikła z jednego przypadku infekcji może ostatecznie umożliwić wiele integracji, czyniąc taką integrację fenotypową realnie możliwą.

Systemy wektora retrowirusowego są optymalizowane, aby zminimalizować możliwość replikacji kompetentnego wirusa. Niemniej jednak jest dobrze udokumentowane, że przypadki rekombinacji pomiędzy komponentami systemu wektora retrowirusowego mogą prowadzić do wytworzenia potencjalnie chorobotwórczego kompetentnego replikacyjnie wirusa i w tym celu zostało skonstruowanych wiele generacji systemu wektorowego, aby zminimalizować iyzyko rekombinacji (Salmons, B. i Gunzburg, W. H. (1993), Human Gene Therapy 4(2): 129-41.

188 323

System wektora retrowirusowego składa się z dwóch komponent:

1) Samego wektora retrowirusowego, który jest zmodyfikowanym retrowirusem (wektorem plazmidowym), w którym geny kodujące białka wirusa zostały zastąpione genami terapeutycznymi. Jako, że zastąpienie genów kodujących białka wirusa skutecznie uszkadza wirusa, musi to być naprawione przez drugą komponentę systemu, która dostarcza brakujących białek wirusa do zmodyfikowanego retrowirusa.

Druga komponenta to:

2) Linia komórek produkująca duże ilości białek wirusowych, jakkolwiek brakuje jej możliwości produkcji wirusów kompetentnych replikacyjnie. Ta linia komórkowa określana jest jako linia komórek pakujących i zawiera linię komórek transfekowaną jednym lub wieloma plazmidami przenoszącymi geny, które umożliwiają opakowanie zmodyfikowanego wektora retrowirusowego.

W celu wytworzenia cząstek zrekombinowanego retrowirusa, wektor retrowirusowy jest transfekowany do linii komórek pakujących. W tych warunkach genom zmodyfikowanego retrowirusa zawierający wprowadzone geny terapeutyczne jest transkrybowany z wektora retrowirusowego i pakowany do zmodyfikowanych cząsteczek retrowirusa. Te zrekombinowane cząstki retrowirusa są następnie używane do infekcji komórek nowotworowych, podczas której genom wektora i każdy cytotoksyczny gen zostaje zintegrowany z DNA komórki docelowej. Komórka zainfekowana taką zrekombinowaną cząstką wirusa nie może produkować nowego wirusa wektorowego jako, że brak jest w tych komórkach białek wirusa, natomiast DNA wektora, przenoszącego geny terapeutyczne jest zintegrowane z DNA komórki i może ulegać ekspresji w zainfekowanej komórce.

Wcześniej została opisana pewna liczba systemów wektora retrowirusowego, umożliwiających dostarczanie przenoszonych genów cytotoksycznych (Salmons, B. i Gunzburg, W. H. (1993), Human Gene Therapy 4(2): 129-41). Większość tych sposobów zawiera albo ograniczone infekcje do uprzednio określonych typów komórek, albo stosowanie heterologicznych promotorów do bezpośredniej ekspresji połączonych heterologicznych, terapeutycznych genów, w specyficznych komórkach nowotworowych. Używa się heterologicznych promotorów, które powinny kierować ekspresją połączonych genów tylko w jednym typie komórek, w których promotor jest normalnie aktywny i/lub dodatkowo podlegający kontroli. Takie promotory zostają uprzednio wprowadzone, w kombinacji z genami terapeutycznymi, do wektora retrowirusowego, w miejsce genów gag, poi lub env.

Retrowirusowa sekwencja LTR (Long Terminal Repeat), flankująca te geny jest nośnikiem promotora retrowirusa, który jest generalnie niespecyficzny jako, że może kierować ekspresją w wielu różnych komórkach (Majors, J. (1990), w „Retroviruses - Strategies of replication” (Swanstrom, R. i Vogt, R K., Eds.): Springer-Verlag, Berlin: 49-92). W literaturze opisano współdziałanie między promotorem LTR i heterologicznymi wewnętrznymi promotorami, takimi jak tkankowo specyficzne promotory, opisane wyżej. Co więcej, jest wiadomo, że silne enhancery związane z LTR, mogą albo niezależnie, albo w połączeniu z promotorem retrowirusa, wpływać na ekspresję genów komórkowych blisko miejsca integracji retrowirusa. Wykazano, że taki mechanizm może przyczyniać się do powstawania nowotworów u zwierząt (van Lohuizen, M. i Berns, A. (1990), Biochim. Biophys. Acta 1032: 213-235). Te dwa spostrzeżenia zachęciły do opracowania, samo-inaktywujących wektorów SIV (Self-Inactivating-Vectors), w których promotory retrowirusa są funkcjonalnie inaktywowane w komórce docelowej (publikacja WO 94/29437). Dalsze modyfikacje tych wektorów obejmują insercje kaset genu promotora w rejonie LTR, w celu stworzenia wektorów z podwójną kopią (publikacja WO 89/11539). Jednak w obu tych wektorach heterologiczne promotory, wprowadzone albo do wektora albo w rejon LTR, są bezpośrednio związane z genem terapeutycznym.

Wcześniej opisany wektor SIN, wymieniony wyżej, będący nośnikiem usuniętego 3'LTR (publikacja WO 94/29437) wykorzystuje dodatkowo heterologiczny promotor, taki jak u Cytomegalovirus (CMV), zamiast promotora retrowirusowego 5'LTR (5'LTR bez U3) do kierowania ekspresją konstruktu wektora w linii komórek pakujących. Heterologiczny sygnał poliadenylacyjny jest również zawarty w 3'LTR (publikacja WO 94/29437).

Celem niniejszego wynalazku jest skonstruowanie bezpiecznego wektora retrowirusowego, który zawiera gen cytochromu P450, jako czynnik terapeutyczny. Ten nowy wektor

188 323 przenosi heterologiczne, konstytutywne, indukowalne lub tkankowo specyficzne sekwencje regulatorowe i/lub promotorowe w rejonie 3'LTR, które po infekcji zostają zduplikowane i ulegają translokacji do fragmentu 5'LTR w komórce docelowej. Tym sposobem w zainfekowanej komórce wprowadzony promotor kontroluje ekspresję genu cytochromu P450, który jest wprowadzony do wektora. Taki wektor nie ulega samoinaktywacji, a zamiast tego zachodzi wymiana promotora, dzięki czemu może być nazwany wektorem ProCon, czyli wektorem konwersji promotora (Promoter Conversion). Zasady i korzyści systemu ProCon są opisane w szczegółach w publikacji WO 96/07748.

Jako, że konwersja promotora (Promoter Conversion), nie powoduje samoinaktywacji, wektor retrowirusowy będzie transkrypcyjme aktywny w komórce docelowej. Dodatkowo, oba rejony LTR będą zawierały dużą ilość heterologicznych sekwencji promotor/enhancer w komórce docelowej. To zredukuje prawdopodobieństwo, że zintegrowany w komórce docelowej wektor będzie ulegał takiej inaktywacji przez dłuższe okresy, jak to opisano w przypadku konwencjonalnych wektorów (Xu, L., Yee, J. K. i inni, (1989), Virology 171: 331-341) i również zredukuje możliwość rekombinacji z endogenną sekwencją retrowirusową, dla wytworzenia potencjalnie chorobotwórczego, kompetentnego replikacyjnie wirusa, co zwiększy bezpieczeństwo systemu.

Według wynalazku rejon 5'LTR konstruktu wektora retrowirusa nie jest zmodyfikowany i ekspresja wektora wirusowego w linii komórek pakujących jest kierowana przez normalny promotor U3. Umożliwiona jest normalna poliadenylacja retrowirusa i żadne heterologiczne sygnały poliadenylacyjne nie są zawarte w sekwencji 3'LTR. Jest to ważne dla rozwoju strategii terapii in vivo jako, że normalna fizjologiczna regulacja wirusa, poprzez normalnego wirusowego promotora, i ewentualnie także obejmująca normalną kontrolę poliadenylacji, będzie przeważała przez dłuższy okres in vivo, podczas gdy komórki pakujące będą produkowały wirusy zrekombinowane.

W celu osiągnięcia powyższych i innych celów, wynalazek zapewnia wektor retrowirusowy przechodzący konwersję promotora zawierającego rejon 5'LTR struktury U3-R-U5; jedną lub więcej sekwencji kodujących wybranych z grupy genów znanych jako geny cytochromu P450; i rejon 3'LTR zawierający całkowicie lub częściowo usunięty rejon U3, gdzie wymieniony usunięty rejon U3 jest zastąpiony przez heterologiczny promotor, po którym następuje rejon R i U5.

Wymieniony promotor może być albo konstytutywny, jak natychmiastowy wczesny promotor/enhancer wirusa Cytomegalovirus (CMV), indukowalny przez hormony glikokortykoidowe (np. promotor MMTV) albo przez specyficzne komórki docelowe.

Specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe komórek docelowych są wybrane z jednego lub więcej elementów każdego genu, ale w tym przykładzie realizacji mogą pochodzić z promotorów sekwencji regulatorowych i promotorowych anhydrazy węglowej II i β-glukokinazy, specyficznych sekwencji regulatorowych i promotorowych limfocytów zawierających sekwencje regulatorowe i promotorowe anhydrazy węglowej II i β-glukokinazy, specyficznych limfocytamych sekwencji regulatorowych i promotorowych Whey Acidic Protein, Kwaśnego Białko Serwatki (WAP), Mouse Mammary Tumour Virus (MMTV), Mysiego Wirusa Nowotworu Sutka, specyficznych sekwencji regulatorowych i promotorowych β-laktoglobuliny i kazeiny, specyficznych trzustkowych sekwencji regulatorowych i promotorowych zawierających specyficzne limfocytowe sekwencje regulatorowe i promotorowe immunoglobulin i MMTV, oraz specyficzne sekwencje regulatorowe i promotorowe MMTV, dające reaktywność na hormony glikokortykoidowe lub kierujące ekspresją w gruczołach sutkowych. Inne promotory zawierają, na przykład, promotory CD4, CD34 i IL2. Wymienione sekwencje regulatorowe i promotorowe korzystnie regulują ekspresję wymienionego wektora retrowirusowego.

Okazuje się, że rejon promotora WAP, niezbędny dla specyficzności ekspresji w gruczołach sutkowych to fragment restrykcyjny 320 par zasad XhoI/XbaI (-413 do -93) (Kolb, A. F., Gunzburg, W. H., Albang, R., Brem, G., Erfle, V., i Salmons, B. (1995), Biochem. Biophys. Res. Commun. 217, 1^045-1052). Dodatkowo, poszczególne eksperymenty wskazują, że fragment promotora 0,6 Kb Pstl mMtV (Salmons, B., Groner, B., Calberg Baca, C. M., i Ponta, H. (1985), Virology 144: 101-114) może odgrywać rolę w regulowaniu specyficzności ekspresji

188 323 w gruczołach sutkowych, wykazywaną przez MMTV (Kolb, A. F., Gunzburg, W. H., Albang, R., Brem, G, Erfle, V., i Salmons, B. (1995) Biochem. Bioptys. Res. Commun. 217,1045-1052).

Rejony LTR są wybrane z co najmniej jednego elementu grupy zawierającej rejony LTR Murinr Leukaemia Virus (MLV) (Wirus Białaczki Mysiej), Mouse Mammary Tumour Virus (MMTV) (Wirus Mysiego Nowotworu Sutka), Murine Sarcoma Virus (MSV) (Wirus Mięsaka Myszy), Simian Immonsdoficiency Virus (SlV) (Wirus Obniżonej Odporności u Małp), Human Immo]nsreiicieccc Virus (HIV) (Wirus Obniżonej Odporności u Człowieka), Human T-cell Lookaemie Virus (HTLV) (Wirus Białaczki Komórek T), Folino Immonodąficiency Viaop (FIV) (Wirus Obniżonej Odporności u Kota), Felinr Leukaemia Virus (FELV) (Wirus Białaczki u Kota), Bovino Leokaemia Virus (BLV) (Bydlęcy Wirus Białaczki) i Massn-PfizorMonkec Virus (MPMV).

Wektor aetaowiausa korzystnie bazuje na wektorze LXSN (Miller, A. D. i Rosman, G. J. (1989), Biotechniqoes 7: 980-990), pBAG (Price, J., Turner, D. i inni (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 156-160) lub na hybrydzie obydwu.

Sekwencją kodującą gen terapeutyczny może być każdy gen c^ochromu P450, ale najbardziej korzystny jest gen formy 2B1 szczurzego cctschaomo P450 zdefiniowany przez FujiKuricama, Y., Mizukami, Y., i inni (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 2793-2797.

W kolejnym przykładzie wykonania wynalazku dostarczany jest system wektora retrowirusowego zawierający wektor retrowirusowy, jak opisano wyżej, jako pierwszą komponentę i linię komórek pakujących zawierającą co najmniej jeden konstrukt retrowirusa lub zrekombinowanego retrowiaosa, kodujący białka niezbędne do okrycia otoczką wymienionego wektora wirusowego.

Linia komórek pakujących korzystnie wybrana jest spośród elementów grupy, zawierającej ψ-2, y-Crypt, ψ/AM, Gp+E-86, PA 317 i GP+envAM-12, lub każdej z linii transfekowanych konstruktem rekombinanta, co pozwoli na ekspresję białek powierzchniowych innych wirusów otoczkowych.

Wynalazek zawiera także mRNA, pochodzące z wektora rotrowirupowogs według wynalazku.

W linii komórek pakujących ekspresja wektora aetaowirosswego jest regulowana przez normalne niesrjektcwno promotory retaswirosa zawarte w rejonie U3. Natomiast, jak tylko wektor wchodzi do komórki docelowej zachodzi konwersja promotora, i gen P450 podlega ekspresji przez tkankowe specyficzne lub indukowanie wybrane promotory, wprowadzone do wektora ProCon. Nie tylko każdy specyficzny tkankowo promotor może być włączony do systemu, dostarczanego selektywnie do szerokiego zakresu komórek różnego typu, ale dodatkowo, po konwersji, struktura i właściwości wektora retrswirusswogo przestają być podobne do wirusowych. Ma to niezwykle ważne konsekwencje z punktu widzenia bezpieczeństwa.

Ten system wektora będzie zastosowany do wytworzenia zroksmbinswαnrgs wirusa, który będzie mógł być użyty do infekcji komórek nowotworowych lub normalnych, zarówno in vitro jak i in vivo.

Zrokombinswane rotaowirusy, które zostały oczyszczone lub zagęszczone, mogą być zabezpieczone przez dodanie odpowiedniej ilości zgodnego z przepisem buforu do środowiska, zawierającego zrekombinowany retrowirus, w celu otrzymania zawiesiny wodnej. Przepisowy bufor to roztwór wodny zawierający sacharyd, jako związek add^y™^ o wysokiej masie cząsteczkowej, i składnik buforujący w wodzie. Roztwór wodny może również zawierać jeden lub więcej aminokwasów.

Zrekombinowαnc rotrowirus może być również zabezpieczony w formie oczyszczonej. Dokładniej, przed dodaniem przepisowego buforu, surowy zroksmbinowanc retrowiros, opisany wyżej, może być oczyszczony przez przepuszczenie przez filtry, następnie zagęszczony, na przykład, przez system zagęszczający o przepływie krzyżowym (Filtron Technolsgc Corp., Noatbsaoogh, MA). W jednym przykładzie wykonania, do koncentratu dodana jest DNAza w celu strawienia egzogennego DNA. Po strawieniu roztwór jest następnie diafiltrowany w celu usunięcia nadmiaru składników środowiska i otrzymania zrokombinswanego rrtaowirusa w pożądanym roztworze zbuforowanym. Diafiltrat jest następnie przepuszczany przez kolumnę żelu Sephadex S-500, po czym oczyszczony zrekombinowany wirus jest eloowanc. Do e^atu dodawana jest odpowiednia ilość przepisowego buforu w celu osiągnięcia pożądanego, osta188 323 tecznego stężenia składników, jak i w celu minimalnego rozcieńczenia zrekombinowanego retrowirusa, a następnie roztwór wodny jest przechowywany w temperaturze -70°C lub natychmiast suszony. Jak stwierdzono powyżej, przepisowy bufor jest wodnym roztworem zawierającym sacharyd, strukturalny związek addytywny o wysokim ciężarze cząsteczkowym i komponentę buforującą w wodzie. Roztwór wodny może również zawierać jeden lub więcej aminokwasów.

Surowy zrekombinowany retrowirus może być również oczyszczany poprzez chromatografię jonowymienną. Ogólnie, surowy zrekombinowany retrowirus jest oczyszczany poprzez przepuszczanie przez filtr, a filtrat wprowadzany jest do kolumny zawierającej silnie sulfonowane podłoże celulozowe. Zrekombinowany wirus jest eluowany z kolumny w formie oczyszczonej dzięki zastosowaniu buforu o wysokim stężeniu soli. Bufor o wysokim stężeniu soli jest następnie wymieniany na bardziej korzystny bufor poprzez przepuszczenie eluatu przez kolumnę o charakterze odwróconego sita molekularnego. Następnie dodaje się odpowiednią ilość przepisowego buforu, omówionego powyżej, do oczyszczonego zrekombinowanego wirusa i zawiesina wodna jest albo natychmiast suszona albo też przechowywana, korzystnie w temperaturze -70°C.

Zawiesina wodna w formie surowej lub oczyszczonej może być suszona poprzez liofilizację lub odparowywanie w temperaturze pokojowej. Dokładniej, na liofilizację składają się etapy chłodzenia zawiesiny wodnej poniżej temperatury zeszklenia lub poniżej punktu eutektycznego zawiesiny wodnej i usunięcia wody ze schłodzonej zawiesiny poprzez sublimację do formy liofilizowanego retrowirusa. W formie liofilizowanej zrekombinowany retrowirus jest stabilny i może być przechowywany w temperaturze -20°C do -25°C, co dokładniej omówiono poniżej.

W metodzie odparowywania, woda jest usuwana z wodnej zawiesiny w temperaturze pokojowej przez odparowywanie. Woda może być również usunięta poprzez suszenie rozpryskowe.

Wodny roztwór używany w przepisie, jak opisano wcześniej, składa się z sacharydu, związku addytywnego o wysokim ciężarze cząsteczkowym, komponenty buforującej oraz wody. Roztwór może również zawierać jeden lub więcej aminokwasów. Kombinacja tych składników służy do zachowania aktywności zrekombinowanego retrowirusa w czasie zamrażania i liofilizacji, lub suszenia poprzez odparowywanie.

Związek addycyjny o wysokim ciężarze cząsteczkowym służy do zapobiegania agregacji wirusa podczas mrożenia i stanowi jego strukturalne podłoże w stanie liofilizowanym albo wysuszonym. W kontekście opisywanego wynalazku, uważa się, że strukturalne związki addycyjne posiadają „wysoki ciężar cząsteczkowy”, jeśli przekracza on 5000 m.w. Korzystnym związkiem addycyjnym o wysokim ciężarze cząsteczkowym jest ludzka albumina surowicza. Aminokwasy, jeśli występują, służą do dalszego zabezpieczenia infekcyjności wirusa w warunkach chłodzenia i rozmrażania wodnych zawiesin. Dodatkowo, aminokwasy służą do dalszego zabezpieczania infekcyjności wirusa podczas sublimacji schłodzonej zawiesiny wodnej i gdy znajduje się on w stanie liofilizowanym.

Komponenta buforująca służy do buforowania roztworu poprzez zachowanie względnie stałego pH. Można użyć wielu różnych buforów, zależnie od pożądanego zakresu pH, korzystnie między pH 7,0 a 7,8.

Wodne roztwory do przygotowania zrekombinowanych retrowirusów są szczegółowo opisane w publikacji WO-A2-96121014.

Dodatkowo, korzystnie jest, gdy wodny roztwór zawiera obojętną sól służącą do ustalenia odpowiedniego izoosmotycznego stężenia soli w finalnym, przepisowym roztworze zrekombinowanego retrowirusa.

Liofilizowane lub odwodnione retrowirusy mogą być rekonstytuowane przy użyciu różnych substancji, ale korzystnie są one rekonstytuowane przy użyciu wody. W szczególnych przypadkach można użyć roztworów rozcieńczonej soli zapewniających izotoniczność finalnego roztworu. Dodatkowo, korzystne może być użycie wodnych roztworów zawierających składniki znane ze zwiększania aktywności rekonstytuowanego retrowirusa. Takie składniki zawierają cytokiny, takie jak IL-2, polikationy, takie jak siarczan protaminy, lub inne składniki zwiększające wydajność transdukcji rekonstytuowanego wirusa. Liofillizowany lub odwodniony zrekombinowany retrowirus może być rekonstytuowany w każdej dogodnej objętości

188 323 wody lub czynników rekonstytuujących, które pozwalają na znaczne, a korzystnie na całkowite, rozpuszczenie liofilizowanej lub odwodnionej próbki.

Zrekombinowane cząsteczki retrowirusa mogą być podawane do szerokiego zakresu miejsc jak, na przykład, organy ludzkie lub miejsca nowotworowe. W innych przykładach wykonania, zrekombinowany retrowirus może być podawany doustnie, dożylnie, doustnie/podjęzykowo, dootrzewnowo lub podskórnie. Dzienna dawka zależy od ustalonego sposobu podawania, formy, w jakiej się podaje, wskazań do podawania, organizmu i wagi ciała leczonego osobnika, a następnie od preferencji i doświadczenia lekarza prowadzącego.

Sposoby podawania opisane tutaj realizuje się po prostu przy pomocy bezpośredniego zastosowania igły, kateteru lub podobnych narzędzi. Szczególnie, w pewnych przykładach wykonania wynalazku, jedna lub więcej dawek może być podana bezpośrednio.

W jednym przykładzie realizacji wynalazku, komórki pakujące będą umieszczone w kapsułach. W celu skutecznego leczenia, komórki produkujące wirusa muszą przetrwać długi okres czasu w organie docelowym po implantacji, a wirus musi być produkowany i uwalniany z komórek pakujących podczas tego okresu. W ten sposób, komórki pakujące produkujące wirusa mogłyby w efekcie tworzyć niewielki punkt produkujący wirusa, usytuowany w miejscu podania. To pozwoliłoby na wydajne dostarczanie zrekombinowanego wirusa in vivo. Alternatywnie, zainfekowane komórki normalne albo pochodzenia ludzkiego, albo pochodzące od innych gatunków, będą pokryte kapsułami i zaimplantowane, stanowiąc niewielki punkt konwersji proleku, usytuowany blisko lub w masie nowotworu.

Długotrwała skuteczność takiego podejścia zależy od (1) zabezpieczenia komórek przed systemem odpornościowym gospodarza, który normalnie eliminuje komórki zainfekowane czy produkujące wirusa, a szczególnie jeśli takie komórki pochodzą z innych gatunków, jak to jest zazwyczaj w przypadku komórek produkujących wektory retrowirusowe i (2) przeżycia komórek w miejscu podania przez dłuższy okres czasu, co może wymagać waskularyzacji.

Stwierdzono, że ciągła produkcja wektora retrowirusowego przez zaimplantowane komórki pakujące może zachodzić dzięki odpowiedniemu pokryciu, przed implantacją, komórek pakujących produkujących wirusa kapsułami o półprzepuszczalnych błonach. Dodatkowo stwierdzono, że takie kapsuły dobrze wszczepiają się w ciało gospodarza, ulegają waskularyzacji i nie wywołują odpowiedzi odpornościowej czy zapalanej gospodarza. Takie warunki, wraz z półprzepuszczalnością błon kapsuł, pozwolą na długotrwałe dostarczanie wektora retrowirusa in vivo.

Opracowano technologię pokrywania kapsułami, stosowaną do pokrywania kapsułami komórek pakujących, produkujących wirusa i komórek zainfekowanych wirusem lub normalnych, materiałem opartym na celulozie. Stosując tę technikę, do 1O¹⁰, a korzystnie 10⁵-10⁷komórek pokrywanych jest kapsułami z kompleksu elektrolitycznego (np. z włókien alginowych i polilizyny, lub bardziej korzystnie z siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego) lub innych porowatych materiałów (takich jak poliamidy, polisulfoniany). Otrzymane kapsuły mają różne średnice między 0,01 i 5 mm, ale korzystnie 0,1 i 1 mm. W rezultacie, kapsuły mogą zawierać różną liczbę komórek. Kapsuła jest półprzepuszczalna dzięki porom, które są na tyle duże, że umożliwiają przechodzenie wirusów lub cząsteczek proleku, ale na tyle małe, że zapobiegają dostępowi komórek systemu odpornościowego, zmniejszając w ten sposób odpowiedź odpornościową, skierowaną przeciw tym komórkom. Kapsuły i pokryte kapsułami komórki przechowywane są w normalnym środowisku hodowli komórkowej (rodzaj którego zależy od linii pokrytych kapsułami komórek), w standardowych warunkach wilgotności, temperatury i stężenia CO2.

Po odpowiednim czasie przebywania w hodowli ( normalnie nie krócej niż 1 godz. i nie dłużej niż 30 dni), kapsuły zawierające komórki mogą być chirurgicznie implantowane do różnych obszarów organizmu albo bezpośrednio, albo strzykawką.

W różnym czasie po implantacji okrytych kapsułami komórek, do organizmu gospodarza może być podany cyklofosfamid lub ifosfamid, zarówno lokalnie, jak i systemowo. Komórki zainfekowane wirusem, kierującym ekspresją genu cytochromu P450, spowodują konwersję tych proleków do aktywnych metabolitów; które spowodują alkilację i sieciowanie DNA. Również komórki przenoszące i kierujące ekspresją genu cytochromu P450 (takie jak pokryte kapsułami komórki zainfekowane, lub pokryte kapsułami komórki pakujące) będą

188 323 również katalizować tę konwersję. W jednym przykładzie wykonania tego wynalazku, te pokryte kapsułami zainfekowane lub pakujące komórki będą albo wolno dzielącymi się komórkami albo komórkami, które potraktuje się mitomycyną C, niskimi dawkami promieniowania łub innymi środkami mającymi zapobiec dzieleniu się komórek, dla zabezpieczenia, aby komórki te nie uległy cytotoksycznemu działaniu proleku.

Następujące poniżej przykłady zilustrują wynalazek w dalszych szczegółach. Przykłady te nie ograniczają w żaden sposób zakresu stosowania niniejszego wynalazku, gdyż oczywiście możliwe są modyfikacje i substytucje oczywiste dla specjalistów z dziedziny wynalazku.

Przykład I.

Przykład ten opisuje konstrukcję retrowirusowego wektora ekspresji do infekcji wewnątrznowotworowej, który zawiera gen szczurzego cytochromu P450 2B1. ,

Wektor ekspresji pLX2B1, pokazany na fig. 1, został skonstruowany przez ligację fragmentów uzyskanych z plazmidu pLX125 i pSW1 (Kedzie, K. M., Escobar, G. Y., Grimm, S. W., He, Y. A., Pepperl, D. J., Regan, J. W., Stevens, J. C., i Halpert, J. R. (1991), J. Biol. Chem. 266(33): 2215-2). Plazmid pLX125 został przygotowany, jak to opisano w publikacji PCT/EP96/04447).

Plazmid pLX125 został zlinearyzowany przy pomocy Hpal i powstałe tępe końce zostały zdefosforylowane przy pomocy cielęcej fosfatazy jelitowej. DNA zostało oczyszczone poprzez rozdzielenie na 1% żelu agarozowym, pocięte i przygotowane według protokołu Qiaquick (Qiagen). Po precypitacji w etanolu DNA zostało ponownie zawieszone w wodzie.

Wektor do klonowania pSW1 był trawiony za pomocą Smal i HincII, aby otrzymać dwa fragmenty z tępymi końcami. Mieszanina trawiąca została rozdzielona na 1% żelu agarozowym. Najkrótszy fragment (1,5 kb), zawierający cDNA szczurzego cytochromu P450 2B1 (Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y. i inni (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2793-2797), został wycięty i wyeluowany według protokołu ekstrakcji DNA Qiaquick, wytrącony w etanolu i ponownie zawieszony w wodzie.

7,6 fMoli pLX125 i 24 fMole fragmentu Smal/Hindll pSW1 zostało zmieszanych razem i było ligowane przez 3 dni w 12°C, przy użyciu ligazy T4 (Boehringer). Ligaza była inaktywowana w 65°C przez 10 min. i DNA było precypitowane w butanolu w 10-krotnej objętości butanolu. Strącone DNA zostało ponownie zawieszone w wodzie i było elektroporowane do bakterii DH10B (Gibco). Kolonie oporne na ampicylinę zostały wyselekcjonowane, przygotowano DNA i testowo trawiono za pomocą SspBIZSalI, BamHl/SspBI, PvuI i BamHl. Finalny, prawidłowy plazmid został oznaczony jako pLX2B1 (patrz fig. 1).

Lipofekcja.

Jeden dzień przed lipofekcją 3x10⁶ komórek PA317 pakujących retrowirusa (Miller, A. D. i Buttimore, C. (1986), Mol. Cell. Biol. 6: 2895-2902) zostało umieszczonych w 10 cm szalkach Petri’ego lub płytkach hodowlanych. W dniu infekcji 4 pg pLX2Bl zostały zmieszane z 300 μΐ środowiska bez surowicy. Równocześnie 45 pl Lipofectamine (Gibco BRL) zostało zmieszane z 300 pl środowiska bez surowicy. Roztwór zawierający plazmid został dodany do mieszaniny Lipofectamine i był inkubowany przez 45 min. Po 35 min. komórki zostały przepłukane raz przy użyciu 6 ml środowiska bez surowicy. 2,4 ml środowiska bez surowicy zostało dodane do mieszaniny lipofekcyjnej, a otrzymany tak 1 ml został umieszczony na przygotowanych komórkach. Po 5 godz. dodano 3,5 ml środowiska Eagles modyfikowanego Dulbecco, zawierającego 20% FCS. Następnego dnia komórki były trawione, rozcieńczone 1:20 i osadzone na 100 mm szalkach. Po 24 godz. środowisko zostało zastąpione innym środowiskiem, zawierającym analog neomycyny G418. Populacja komórek była izolowana i analizowano ekspresję cytochromu P450.

Supernatant z tej populacji komórek został użyty do infekowania komórek docelowych CK. 1 ml supernatantu zawierającego wirus z 5x106 komórek zostało przefiltrowane przez filtr 0,45 pm, po czym dodano 1x 106 komórek docelowych CK w obecności 8 pg/ml polibrenu. Po 4 godz. został dodany 1ml środowiska Eagles modyfikowane Dulbecco z 10% surowicą z płodu cielęcia.

Następnego dnia komórki były trypsynizowane, rozcieńczone i 24 godz. później umieszczone w medium selekcyjnym, zawierającym dodatkowo 400 pg/ml G418. Po 2 tygodniach kolonie oporne na G418 były izolowane i testowane na aktywność cytochromu P450

188 323

2B1. 2x10⁴ komórek zostało położonych na 3 cm płytki i wystawione na działanie ifosfamidu o stężeniu pomiędzy 0 a 5 mM. Obserwowano wyższą czułość cytochromu P450 2B1 komórek zainfekowanych retrowirusem w porównaniu z kontrolnymi, nie zainfekowanymi komórkami.

Pokrywanie kapsułami.

Uzyskane komórki pakujące, produkujące wektor retrowirusowy są pokrywane kapsułami, jak to opisano w przykładzie 2 w publikacji WO 97/01357.

Implantacja.

Uzyskane kapsuły są wprowadzane operacyjnie przez otwór („key hole”), blisko albo w transplantowanym, albo w spontanicznym, nowotworze myszy BALB/c lub GR. Około 6 kapsuł o średnicy 1 mm wprowadza się w każde miejsce operacyjne. Miejsce zabiegu jest zamykane 1 szwem. Następnie myszom lokalnie podawano cyklofosfamid lub ifosfamid, przez wewnątrzguzowe iniekcje 100 μΐ z roztworu 20 mg/ml lub dootrzewnowo, stosując systemowe stężenia 130 mg CPA/kg wagi ciała i 40-60 mg IFO/kg wagi ciała, przez maksymalnie 10 tygodni. Podczas tego okresu codziennie monitorowano rozmiary guza i jego wygląd makroskopowy. Myszy były następnie uśmiercane, usuwano tkankę zawierającą wprowadzone kapsuły i nowotwór, i przygotowywano skrawki histologiczne dla mikroskopii świetlnej i elektronowej. Skrawki te wyraźnie wykazały dobre wszczepienie kapsuł, waskularyzację i brak dowodów na obecność limfocytów, będących wskaźnikiem komórkowej odpowiedzi odpornościowej. Skrawki te nie wykazywały również oznak śmierci komórek lub nekrozy wewnątrz kapsuł. Przeciwnie, guz wykazał nekrozę i makroskopowo wyraźnie była widoczna redukcja rozmiaru guza podczas testowanego okresu.

Przykład II.

Przykład ten opisuje konstrukcję linii stabilnych komórek, które konstytutywnie kierują ekspresją szczurzego cytochromu P450 2B1.

Wektor ekspresji pc3/2B1 został skonstruowany przez ligację fragmentów, uzyskanych z plazmidu pcDNA3 (Invitrogen) i pSW1 (Kedzie, K. M., Escobar, G. Y., Grimm, S. W., He, Y. A., Pepperl, D. J., Regan, J. W., Stevens, J. C., i Halpert, J. R. (1991), J. Biol. Chem. 266(33): 2215-21).

Plazmid pcDNA3 był trawiony za pomocą XhoI/XbaI i tak otrzymane fragmenty z lepkimi końcami defosforylowano stosując fosfatazę z jelita cielęcego. DNA szkieletu wektora zostało oczyszczone poprzez rozdzielenie na 1% żelu agarozowym, wycięte i przygotowane przy użyciu protokołu Qiaquick (Qiagen). Po precypitacji w etanolu DNA zostało ponownie zawieszone w wodzie.

Wektor do klonowania pSW1 był trawiony przy użyciu XhoI i XbaI, aby otrzymać dwa fragmenty. Mieszanina trawiąca została rozdzielona na 1% żelu agarozowym. Najkrótszy fragment (1,5 kb), zawierający cDNA szczurzego cytochromu P450 2B1 (Fuji-Kuriyama, Y., Mizukami, Y. i inni (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2793-2797) został wycięty i był eluowany według protokołu ekstrakcji DNA Qiaquick, następnie wytrącony w etanolu i ponownie zawieszony w wodzie.

8,3 fMole szkieletowego pcDNA3 i 24,8 fMole fragmentu XhoI/XbaI wektora pSW1 zostały zmieszane razem i były ligowane przez 1 dzień w 12°C przy użyciu ligazy T4 (Boehringer). Ligaza była następnie inaktywowana w 65°C przez 10 min., a DNA było strącane w butanolu w 10-krotnej objętości butanolu. Wytrącone DNA było ponownie zawieszane w wodzie i elektroporowane do bakterii DH10B (Gibco). Kolonie oporne na ampicylinę zostały wyselekcjonowane, przygotowano DNA i testowo trawiono za pomocą EcoRI, BamHI, EcoRV i XhoI. Finalny, prawidłowy plazmid został oznaczony jako pc3/2B1.

Lipofekcja. _z

Przed dniem transfekcji 3x10^u komórek nerki kota zostało umieszczonych na 100 mm płytkach. W dniu transfekcji 4 μg pc3/2B1 zostało zmieszane ze 100 μΐ środowiska bez surowicy. Równocześnie 15 μΐ Lipofectamine zostało zmieszane z 100 μl środowiska bez surowicy. Roztwór zawierający plazmid został dodany do mieszaniny Lipofectamine i był inkubowany przez 45 min. Po 35 min. komórki zostały raz przepłukane w 2 ml środowiska bez surowicy. 800 μΐ środowiska bez surowicy zostało dodane do mieszaniny lipofekcyjnej i otrzymany 1 ml został umieszczony na przygotowanych komórkach. Po 6 godz. dodano 1 ml DMEM (Glutamax) z 10%o FCS. Następnego dnia komórki były trawione trypsyną, rozcieńczane 10-^^otnie i umieszczane na 100 mm płyt188 323 kach. Po 24 godz. środowisko zostało zastąpione środowiskiem z neomycyną. Po 14 dniach wyizolowano kolonie oporne na neomycynę i testowano je na obecność i aktywność wektora.

Komórki nerki kociej wykazujące ekspresję cytochromu P450 odznaczały się 10-krotnie wyższą wrażliwością na ifosfamid lub cykolfosfamid, w porównaniu z komórkami dzikiego typu.

Skutek dodatkowy może być zademonstrowany na dzikim typie komórek nerki kota, jak i na komórkach Rin5 pochodzących z nowotworu trzustki. Pokazano to przez wspólne hodowanie klonów komórki nerki kota, zawierających gen cytochromu P450 2B1, albo z dzikim typem komórek nerki kota nie produkującymi cytochromu albo z komórkami Rin5 pochodzącymi ze szczurzego nowotworu trzustki, gdy dodano ifosfamid. Komórki CK i Rin nie produkujące cytochromu zostały zabite przez toksyczne metabolity ifosfamidu, które były wytwarzane i uwalniane przez komórki nerki kota zawierające cytochrom P450 2B1. Miareczkowanie przeprowadzone na komórkach nerki kota zawierających jeden klon komórek, które posiadają geny cytochromu P450 2B1 wykazało, że nawet tak niewielka ilość ifosfamidu, jak 0,25 mM powoduje specyficzne toksyczne skutki w stosunku do tych komórek, a 1-2 mM powoduje śmierć wszystkich komórek. W analizie łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR - Polymerase Chain Reaction), wykazano, że klony komórki nerki kota zawierające gen cytochromu P450 2B1 nabyły DNA konstruktu genowego P450 2B1. Późniejsze analizy biochemiczne klonów, przy zastosowaniu enzymatycznej dealkilacji 7-pentoxyresorufm przez cytochrom P450 2B1 ujawniły, że genetycznie zmodyfikowane komórki produkują cytochrom P450 2B1.

Kapsuły zawierające te komórki były wytwarzane, jak to opisano w przykładzie I, i implantowane do myszy blisko guza. Po podaniu cyklofosfamidu lub ifosfamidu oceniano skuteczność podania, jak wyżej.

Retrowirusowy wektor ekspresji zawierający gen kodujący szczurzy cytochrom P450 2B1 może być również przygotowywany, jak to opisano w przykładzie III poniżej:

Przykład III.

Plazmid pLX125 był najpierw częściowo trawiony przy pomocy enzymu restrykcyjnego XhoI, aby otrzymać wektor, który był linearyzowany w pozycji 3547. Taki linearny plazmid był dalej trawiony przy pomocy enzymu restrykcyjnego SspBI w celu usunięcia krótkiego fragmentu w obrębie polilinkera pLX125. Prawidłowo ucięty fragment wektora pojawił się w żelu preparacyjnym jako największy prążek. Przy zastosowaniu protokołu Quiaex (Qiagen) DNA z tego prążka zostało wyeluowane i oczyszczone z żelu.

W celu otrzymania genu szczurzego cytochromu P450 2B1 komórki raka wątroby linii HTC zostały zlizowane w roztworze D (4 M tiocyjanianu guanidyny, 25 mM cytrynianu sodu o pH 7, 0,5% N-lauNlostukozyniany sodowego, O,1M 2-merkaptoetanolu) i całe RNA zostało wyekstrahowane przez dodanie 1/15 objętości 3 M roztworu octanu sodu, w tej samej objętości wody dodano nasycony fenol i 1/5 objętości chloroformu/alkoholu ioaymylowega (49:1) i cała mieszanina była intensywnie mieszana. Po 15 min na lodzie, ekstrakt był wirowany 20 min. W 4°C przy 10000 g. RNA w fazie wodnej było wytrącane w jednej objętości izopropanolu przez 30 min. przy -20°C i wirowane przy 10000 g w 4°C. Osad został przepłukany w 70% etanolu i pozostawiony w temperaturze pokojowej przez 15 min. Po 5 min. wirowania w 4°C i przy 10000 g, osad był suszony w suszarce próżniowej i ponownie rozpuszczony w 0,5% roztworze SDS.

Wyekstrahowane RNA było odwrotnie transkrybowane przy zastosowaniu protokołu na syntezę cDNA (Pharmacia).

Otrzymane cDNA zostało użyte jako matryca do PCR. Tak zaprojektowano primery, aby zawierały miejsce restrykcji SspBI (podkreślone) w primerze lewostronnym (5'-AAGCCTGTACACTGGAGAGCATGCAC-3') i miejsce XhoI (podkreślone) w primerze prawostronnym (5'-CGATTACTCGAGaCCTGGCTGCG1CA-3'). Oba primery posiadały dodatkowe zasady na końcu 5' dla zwiększenia wydajności rozszczepiania przez odpowiednie enzymy restrykcyjne. Produkt o 1562 parach zasad był cięty przy pomocy XhoI i SspBI, aby otrzymać trzy fragmenty.

Najdłuższy fragment (1545 par zasad), zawierający gen c^ochromu P450, był ligowany z plazmidem pLX125 trawionym XhoI/SspBI.

Stabilna linia komórek wykazująca konstytutywną ekspresję formy 2B1 szczurzego cytochromu P450 może również być przygotowana, jak to opisano w przykładzie V poniżej:

188 323

Przykład IV.

W celu otrzymania mRNA z formy 2B1 genu szczurzego cytochromu P450, 4-tygodniowe samice szczura zostały uśmiercone, pobrano wątrobę i natychmiast zamrożono w płynnym azocie. Zamrożona wątroba została umieszczona w sterylnym, przefiltrowanym buforze GTC (6 M izotiocyjanianu guanidyny, 5 mM cytrynianu sodu, 0,1 M 2-merkaptoetanolu, 0,5% N-laurylosarkozynianu sodowego) i homogenizowana w temperaturze pokojowej. W celu oddzielenia RNA ekstrakt wątroby został umieszczony na podłożu z chlorku cezowego (5,7 M chlorku cezowego, 0,1 M EDTA) i wirowany w rotorze wychylnym w 20°C i przy 32000 obr/min. przez noc. Po całkowitym usunięciu supernatantu osadzone RNA zostało ponownie rozpuszczone w 10 mM Tris o pH 7,5, schłodzonego na lodzie, i strącane przez noc w-20°C w 1/15 objętości 3 M octanu sodu i 2,5 objętościach etanolu. RNA było następnie wirowane przez 40 min. przy 8000 obr/min. i 4°C, a wysuszony osad był ponownie zawieszany w sterylnej wodzie.

Wyekstrahowane RNA było odwrotnie transkrybowane przy zastosowaniu protokołu syntezy cDNA (Pharmacia). Otrzymane cDNA zostało użyte jako matryca dla następującego PCR. Primery zostały tak zaprojektowane, że posiadały miejsce restrykcyjne EcoRI w primerze lewostronnym (5'- CGTGCGGAATTCGGCGGATTCAGCAT-3') i miejsce EcoRVI w primerze prawostronnym (5'-ATAACGGATATCACCTGGCTGCCTCA-3'). Oba primery posiadały dodatkowe zasady na końcach 5' dla większej wydajności enzymów tnących. Amplifikowany DNA zawierający 1588 par zasad był trawiony za pomocą EcoRI i EcoRV, aby otrzymać trzy fragmenty.

Najdłuższy fragment (1572 par zasad), zawierający gen szczurzego cytochromu P450 2B1, był ligowany z plazmidem pcDNA3 trawionym EcoRI/EcoRV (Invitrogen).

Przykład V

Konstrukcja wektora ProCon, zawierającego gen szczurzego cytochromu P450, będącego pod transkrypcyjną kontrolą promotora WAP.

Wyekstrahowane RNA, przygotowane w przykładzie IV, było odwrotnie transkrybowane przy zastosowaniu protokołu syntezy cDNA (Pharmacia). Otrzymane cDNA zostało użyte jako matryca w reakcji PCR. Primery tak zaprojektowano, że zawierały miejsce restrykcyjne BamHI (podkreślone) w lewostronnym primerze na przykład

5'-AAGCCGGATCCCTGGAGAGCATGCAC-3') i miejsce BamHI (podkreślone) w prawostronnym primerze (na przykład, 5'-CGATTAGGATCCCTGCCTCA-3'). Oba primery posiadały dodatkowe zasady na końcach 5' dla większej wydajności rozszczepiania przez odpowiednie enzymy. Produkt zawierający 1562 par zasad był trawiony przy pomocy BamHI i uzyskany fragment zawierający gen cytochromu P450 był ligowany z plazmidem pWAP.6 trawionym BamHI (patrz zgłoszenie PCT nr PCT/EP96/03922).

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 4,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Kapsuła zawierająca komórki posiadająca średnicę od 0,01 mm do 5 mm, zwłaszcza od 0,1 mm do 1 mm, znamienna tym, że pokrywa komórkę produkującą cytochrom P450 i posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450.
2. Kapsuła według zastrz. 1, znamienna tym, że jest wykonana z materiału zawierającego kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczan celulozy i polichlorek dwumetylodwualliloamonowy lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.
3. Kapsuła według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor pc3/2B 1.
4. Kapsuła według zastrz. 1, znamienna tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.
5. Kapsuła według zastrz. 1, znamienna tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.
6. Zestaw farmaceutyczny zawierający kapsułę oraz prolek, znamienny tym, że rzeczona kapsuła pokrywa komórkę produkującą cytochrom P450 i posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada średnicę od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.
7. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.
8. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor pc3/2Bl.
9. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.
10. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.
11. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że kapsuły i prolek są w postaci różnych formulacji.
12. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, a prolek ma postać do podawania systemowego i/lub miejscowego.
13. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że kapsuła ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.
14. Zestaw farmaceutyczny według zastrz. 6, znamienny tym, że prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.
15. Środek farmaceutyczny zawierający czynnik aktywny i ewentualnie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik, znamienny tym, że jako czynnik aktywny zawiera kapsułę pokrywającą komórkę produkującą cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, a średnica kapsuły wynosi od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.

188 323
16. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniany.
17. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor pc3/2Bl.
18. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.
19. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.
20. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu.
21. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.
22. Środek farmaceutyczny według zastrz. 15, znamienny tym, że prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.
23. Zastosowanie kapsuły pokrywającej komórkę produkującą cytochrom P450, do wytwarzania leku do leczenia chorób nowotworowych, przy czym kapsuła posiada porowatą błonę przepuszczalną dla cząsteczek proleku przenikających do wnętrza kapsuły i aktywowanych przez cytochrom P450, przy czym rzeczona kapsuła posiada średnicę od 0,01 mm do 5 mm, korzystnie od 0,1 mm do 1 mm.
24. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że materiał kapsuły zawiera kompleks elektrolityczny utworzony z takich związków jak alginian i polilizyna lub siarczanu celulozy i polichlorku dwumetylodwualliloamonowego lub innych struktur porowatych takich jak poliamidy i polisulfoniemy.
25. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że komórka produkująca cytochrom P450 zawiera wektor pc3/2B 1.
26. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że komórka produkująca cytochrom P450 jest stabilną linią komórkową.prowadzącą konstytutywną ekspresję cytochromu P450.
27. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że gen cytochromu P450 jest pod transkrypcyjną kontrolą sekwencji regulatorowych lub promotorowych, lub promotora komórek docelowych indukowalnego promieniami X.
28. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu.
29. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że kapsuła ma postać do podawania przez implantację do tkanki nowotworu piersi lub nowotworu trzustki i/lub miejsca w jej pobliżu.
30. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że prolek jest cyklofosfamidem i/lub ifosfamidem.
31. Zastosowanie według zastrz. 23, znamienne tym, że rzeczony lek jest zestawem farmaceutycznym zawierającym rzeczoną kapsułę i rzeczony prolek.
32. Zastosowanie według zastrz. 23 albo 31, znamienne tym, że kapsuła i prolek są w postaci różnych formulacji.
33. Zastosowanie według zastrz. 23 albo 31, znamienne tym, że kapsuła ma postać do podawania przez iniekcję i/lub przez implantację do organów docelowych i/lub miejsca w ich pobliżu, a prolek ma postać do podawania systemowego i/lub miejscowego.