JP2001000195A - 複製性又は半複製性ウイルス構築物、その製造、及び遺伝子送達のためのその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 細胞内への遺伝子送達のための新規方策。 【解決手段】 生体内、生体外又は試験管内での、細胞
内への遺伝子送達のための組成物を製造するための、複
製性又は半複製性ウイルス構築物の使用。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明は、試験管内（in vitro）、生体外
（ex vivo）又は生体内（in vivo）で細胞内に核酸を送
達するための組成物及び方法に関する。より好ましく
は、本発明は、複製性又は半複製性ウイルス構築物、特
に複製性又は半複製性レトロウイルス構築物を用いて、
細胞内に核酸を送達するための組成物及び方法に関す
る。本発明は、該構築物、該構築物を含有する遺伝的に
改質された細胞、例えばパッケージング細胞の製造はも
とより、実験、予防、治療又は診断適用に、選択された
いかなるポリヌクレオチドをも細胞に送達するための、
これらの組成物及び方法を用いることにも関する。

【０００２】細胞への核酸の送達は、様々なバイオテク
ノロジー及び薬理学の分野で、例えば実験的研究、臨床
的研究、治療又は予防や診断処置の用途が見出されてい
る。in vitroでの遺伝子送達は、例えば、組換えタンパ
ク質又は組換えウイルスを産生するためばかりでなく、
スクリーニングの目的で、安定的な組換え細胞を産生す
るためにも用いることができる。in vivo又はex vivo
で、遺伝子送達は、トランスジェニック動物の構築、遺
伝子調節の研究、並びにヒトを含む哺乳動物の治療及び
／又は予防処置を可能にする。これに関しては、治療用
のか、又は抗原性のポリペプチドをコードする核酸を被
験者に送達することに向けて設定された、ますます増え
る、動物及び臨床的試験の文献が報告されている。これ
らの取組み方は、種々の遺伝子伝達方策を用いるが、そ
れらには、例えば、（１）ウイルスベクター（又はウイ
ルスベクターを産生する細胞）、（２）非ウイルスベク
ター（例えば、化学薬品又は物理的処理と組み合わせた
プラスミド）、（３）むきだしのＤＮＡ、又は（４）場
合により免疫反応を限定するためにカプセル封入して、
患者に移植される、遺伝的に改質された細胞の使用が含
まれる。

【０００３】組換えレトロウイルスの使用は、in vitr
o、in vivo又はex vivoで核酸を分裂細胞に導入するた
めの、最も成功している方法の一つである。この遺伝子
伝達方法は、基礎的研究と臨床的応用との双方に役立つ
ことが判明している。これに関しては、ヒトにおいて、
造血前駆細胞〔Nolta et al., Exp. Hematol. 20 (199
2) 1065-1071〕、成熟リンパ球〔Bunnell et al., Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA92 (1995) 7739-7743〕、腫瘍
細胞〔Klatzmann et al., Hum. Gen. Ther. 9 (1998) 2
595-2604； Caruso et al., PNAS 90 (1993) 7024-702
8〕等々について多大な前進がなされている。このよう
に、レトロウイルスは、ヒト被験者における、臨床的用
途（癌、遺伝病（例えばＡＤＡ不全、ＳＣＩＤ）、ウイ
ルス感染（例えばＨＩＶ治療）、免疫疾患（例えば移植
片対宿主病、自己免疫疾患等々の治療）等々のための、
in vivoでの遺伝子送達用担体として認められている。

【０００４】遺伝子送達の用途に当技術分野で用いられ
ている、組換えレトロウイルスは、トランス相補性機能
の不在下で、欠損を与えるために、すなわちそれらのゲ
ノムの複製、及び／又は適格細胞に感染しての蔓延を防
止するために、遺伝的に改質される。この面では、ほと
んどの組換えレトロウイルスは、組換えゲノムにおい
て、ウイルス遺伝子のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖを問題
の核酸と置き換えることによって生成される。組換え欠
損レトロウイルスは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖがコー
ドする相補的機能を生じる、いわゆるパッケージング細
胞内で製造される。そのようなパッケージング細胞株の
例は、例えばＰＡ３１７〔Miller & Buttimore, Mol. C
ell. Biol. 6 (1986) 2895〕、ＰｓｉＣＲＩＰ〔Danos
& Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460〕又はＧＰ＋Ｅｎｖ
Ａｍ１２〔Markowitz et al., Virology 167 (1988) p.
400〕である。レトロウイルスパッケージング細胞のそ
の他の例は、例えば、ＥＰ２４３２０４、ＷＯ８９／０
７１５０、ＷＯ９０／０２８０６、ＵＳ５，７６６，９
４５、ＥＰ４７６，９５３、ＷＯ９３／０４１６７及び
ＷＯ９３／１０２１８に記載されている。該細胞内で産
生される組換えレトロウイルスは、感染性であるが、感
染に際して、それら自身を複製することができない。こ
れに関して、それらは、複製欠損であると考えられる。
そのような複製欠損組換えレトロウイルスは、例えばＭ
ｏＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＡＬＶ、
ＢＬＶ、ＭＭＴＶ若しくはＲＳＶを含む、種々の種類の
レトロウイルスを用いてか、又は例えばＨＩＶ、ＳＩＶ
若しくはＣＡＥＶのようなレンチウイルスを用いて構築
されている。

【０００５】遺伝子送達用ベクターは、in vivoで投与
したとき不都合な効果を防止するには、できるだけ不完
全でなければならないことが広く認められている。その
ためには、現在まで用いられているレトロウイルスベク
ターは、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖというウイルスタン
パク質のすべてを欠損することが不可欠である。同じ懸
念は、現在用いられているすべての種類のベクター、例
えばアデノウイルスベクター、ＡＡＶ、ヘルペスウイル
スベクターなどについても存在する。例えば、アデノウ
イルスは、一般的には、少なくともＥ１領域の欠失を含
み、最近の試みでは、「腑抜け」アデノベクター、すな
わち、すべてのウイルスコーディング配列を欠損するア
デノウイルスベクターを産生するようになされている。
同様に、ほとんどの組換えＡＡＶベクターは、ｒｅｐ及
びｃａｐコーディング領域を欠損する。

【０００６】しかし、遺伝子送達用ベクターでは、今や
多大な発展がなされているのに対して、特に工業的用途
に向けて、遺伝子伝達の有効性、遺伝子発現の安定性、
及び／又は遺伝子ベクター産生を増大し得る、代替的方
策の必要性が、依然として存在する。

【０００７】ＰＣＴ／ＦＲ９５／００２０８では、出願
人は、新規な遺伝子送達の概念を開示している。この概
念は、細胞が組換えウイルスを産生することを可能にす
る遺伝的要素のすべてを含む、核酸構築物を該細胞にin
vitro、ex vivo又はin vivoで送達することを含む。し
たがって、この方法は、組換えウイルス産生細胞をinsi
tuで作り出す核酸を用いる。この方法は、例えば、治療
的又は有毒な遺伝子をin vivoで送達するためにか、又
はワクチン組成物を製造するために用いられている〔PC
T/FR 97/00619, Noguiez-Hellin et al., PNAS 93 (199
6) 4175-4180を参照せよ〕。この方法は、従来の遺伝子
送達ベクターに勝るいくつかの利点を提供し、特に、パ
ッケージング細胞の必要性を無用とし、組換えプラスミ
ドを用いて、ウイルス遺伝子をin vivoで送達すること
を可能にし、in vivo等での効率的な遺伝子伝達を提供
する。

【０００８】ここで、本発明は、細胞内への遺伝子送達
のための新規な取組み方を提供する。この取組み方は、
遺伝子をin vitro、ex vivo又はin vivoで送達するため
に、複製性又は半複製性ウイルス構築物を用いることに
基づく。複製性欠損ウイルス構築物を用いることに基づ
く、従来から存在するすべての方法とは対照的に、本発
明は、ここでは、複製性又は半複製性ウイルス構築物、
特に複製性又は半複製性レトロウイルス構築物をポリヌ
クレオチドのin vivo、ex vivo又はin vitroでの送達に
用いるという、新規かつ独創的な概念から生じる。本発
明は、そのような構築物が、多量に、かつ高品質で製造
され、いかなる遺伝子又はヌクレオチドをも細胞内にin
vitro、ex vivo若しくはin vivoで効率的に送達させ、
そして発現させることができることを示す。

【０００９】それゆえ、本発明は、in vitro、ex vivo
又はin vivoでの細胞内へのポリヌクレオチド送達の方
法及び組成物に関する。より詳しくは、本発明は、複製
性ウイルス構築物、及びポリヌクレオチドを細胞に送達
する際のそれらの使用に関する。本発明は、半複製性組
換えウイルス構築物を含む組成物、及びポリヌクレオチ
ドを細胞に送達する際のそれらの使用にも関する。他の
特徴としては、本発明は、複製性又は半複製性組換えウ
イルスを産生するパッケージング細胞、及びその使用で
にもある。

【００１０】複製性ウイルス構築物の使用 上記のように、一実施態様では、本発明は、複製性ウイ
ルス構築物、及びその用途、特に複製性レトロウイルス
構築物、及びその使用である。

【００１１】過去１０年間に、レトロウイルスベクター
の無数の系が、遺伝子送達及び遺伝子療法のために開発
されている。これらの系の主な利点は、これらのベクタ
ーが、宿主のゲノム内に安定的に組み込むことができる
能力に認められる。これに関して、ＭｏＭＬＶのような
レトロウイルスは、分裂中の細胞に選択的に感染し、そ
して、そのために増殖中の細胞（すなわち腫瘍細胞、増
殖中のリンパ球等々）の形質導入のための有望なベクタ
ーと考えられる。これに代えて、レンチウイルスのよう
なレトロウイルスは、非分裂細胞にも感染し、そのた
め、静止細胞に遺伝子を送達するためのベクターとして
用いることができる。例えば、ＭｏＭＬＶ由来レトロウ
イルスベクターは、腫瘍細胞又は造血細胞（特に活性化
されたＴリンパ球）のような増殖細胞に、該細胞を破壊
若しくは改質する目的で、遺伝子を送達するのに用いる
ことができる。レンチウイルス由来ベクターは、繊維芽
細胞又は筋細胞（特に平滑筋又は骨格筋）のような静止
細胞に、特に、特異的抗原、又は抗原の群に対する免疫
応答を生起する目的で、ポリヌクレオチドを送達するた
めに用いることができる。しかしながら、標的細胞又は
処置条件に応じて、これらのベクターは、必ずしも充分
な形質導入効率を与えることがなく、この特徴に対処す
るために、いくつかの取組み方が開発されている（強力
なプロモーター、標的ベクター、ex vivo遺伝子伝達等
々）。ここで、本発明は、レトロウイルスベクターの形
質導入効率を改良するための新規な取組み方を提供す
る。この取組み方は、標的細胞集団、組織又は器官内に
蔓延できる能力を保持する、複製性ウイルスの使用に基
づく。

【００１２】本発明の本文中、用語「複製性」とは、複
製性組換えウイルス、すなわち、いかなるトランス相補
性機能の不在下でも複製することができ、そしてそれゆ
え、標的細胞集団、組織又は器官内に蔓延することがで
きる、複製性組換えウイルスの産生に必要な遺伝的要素
を含むように用いられる構築物を意味する。これらの組
換えウイルスは、複製適格とも呼ばれる。

【００１３】レトロウイルスのゲノム構成は、本質的に
は、下記の要素を含むことが知られている：

【００１４】−ゲノムの各末端に位置し、複製開始点、
及び転写プロモーター領域として機能する、ＬＴＲ領域
（「Long Terminal Repeat」）。各ＬＴＲ領域は、プロ
ウイルスの組込みに関与する、Ｕ３、ＲとＵ５、Ｕ５と
Ｕ３と呼ばれる三個の機能的領域で構成されることが不
可欠である；

【００１５】−ウイルス粒子内のプロウイルスゲノムの
パッケージングに関与する、パッケージング配列（「Ｐ
ｓｉ」）；

【００１６】−コアタンパク質（ｇａｇ）、酵素（逆転
写酵素、プロテアーゼ、インテグラーゼ）及びエンベロ
ープ糖タンパク質（ｅｎｖ）をコードする、ｇａｇ、ｐ
ｏｌ及びｅｎｖと名付けられた３個のコーディング領
域。

【００１７】それゆえ、一般的には、本発明による複製
性レトロウイルス構築物は、少なくとも機能的ｇａｇ、
ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子と、細胞に送達しようとするポ
リヌクレオチドとを含むいかなる構築物（例えば核酸、
プラスミド、ウイルス）でもある。より具体的には、本
発明による複製性レトロウイルス構築物は、（１）機能
的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、（２）細胞に送達
しようとするポリヌクレオチド、（３）レトロウイルス
パッケージング配列、及び（４）少なくとも一個のＬＴ
Ｒ配列を含む。これらの要素は、本願中では、組換え型
の複製適格レトロウイルスゲノムとも呼ばれる。

【００１８】レンチウイルスに関しては、それらのゲノ
ムは、追加的なコーディング又は調節配列、例えば、ｖ
ｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｒｅｖ、ｔａｔ及びｎ
ｅｆを更に含む。したがって、本発明の複製性レンチウ
イルス型レトロウイルス構築物は、好ましくは、上記に
列挙した要素（１）〜（４）はもとより、（５）機能的
ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、ｒｅｖ、ｔａｔ及び
ｎｅｆ配列、又は該ウイルスゲノムの複製に必要なその
一部分のみを含むと思われる。

【００１９】上記により、本発明による複製性レトロウ
イルス構築物は、上記に定義されたとおり、少なくとも
複製適格レトロウイルスゲノムを含む、いかなる構築物
（例えば核酸、プラスミド、ウイルス）でもある。

【００２０】本発明の本文中、「ポリヌクレオチド」と
いう表現は、細胞、培養体、組織、器官又は生物へのそ
の送達が、以下に述べるように所望される、いかなる核
酸分子をも意味する。この用語は、レトロウイルス遺伝
子、例えば、融合（fusogenic）誘導活性を有するレト
ロウイルスエンベロープ遺伝子を包含することができ
る。この実施態様では、ポリヌクレオチドは、ｅｎｖ遺
伝子を表すと思われる。

【００２１】より好ましくは、複製適格レトロウイルス
ゲノムは、５′から３′への順に：

【００２２】（１）レトロウイルス５′ＬＴＲ領域、
（２）レトロウイルスパッケージング配列、（３）機能
的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、及び（４）レトロ
ウイルス３′ＬＴＲ領域

【００２３】を含むＤＮＡ又はＲＮＡ分子であって、該
ゲノムは、更に、該ゲノムの、複製能を妨げない領域に
挿入された、選択されたポリヌクレオチドを含む。

【００２４】要素（１）〜（４）は、様々な材料、及び
多様な種類のレトロウイルスから出発して、公知の手法
によって製造することができる。

【００２５】特に、機能的ｇａｇとｐｏｌ遺伝子、ＬＴ
Ｒ配列、及びパッケージング領域は、例えばＭｏＭＬＶ
（モロニーマウス白血病ウイルス）、ＡＬＶ、ＢＬＶ、
ＭＭＴＶ若しくはＲＳＶのようなレトロウイルスから
か、又は例えばＨＩＶ、ＳＩＶ若しくはＣＡＥＶのよう
なレンチウイルスに由来する（それらのゲノムから得る
ことができる）ことができる。これらの要素は、当業者
に周知の手法に従って単離し、そして操作するか、又は
当技術分野で市販されているプラスミドから単離するこ
とができる。

【００２６】機能的ｅｎｖ遺伝子は、エコトロピック
（同種の細胞に感染性である）、又はアンホトロピック
（様々な種に感染性である）エンベロープをコードする
ことができる。本発明に用いることができる特定のエン
ベロープは、例えば下記のウイルスのエンベロープであ
る：融合性である４０７０Ａ〔Ott et al., J. Virol.V
ol.64 (1990) p.757-766〕、ＲＤ１１４、１０Ａ１、Ｖ
ＳＶ、ＶＩＨ、狂犬病ウイルス又はＧＡＬＶ〔Delassu
s, S. et al., Virology 173 (1989) 205-213；又は融
合性若しくは非融合性であるＥＰ９９４００９６４．５
に開示された、誘導体若しくは他の種類〕。エンベロー
プは、細胞起源のもの、例えば、ＣＤ４受容体のような
選択されたリガンドをレトロウイルスの目標とすること
を可能にする、膜タンパク質であってもよい。好ましく
は、エンベロープは、哺乳動物細胞、より好ましくはヒ
トの細胞に対する向性を有するレトロウイルスエンベロ
ープ、特にアンホトロピック又は再標的化エンベロープ
である。ＧＡＬＶ、４０７０Ａ又は１０Ａ１は、本発明
の複製性ウイルス構築用の好適実施態様を表す。これに
関しては、以下に考察するとおり、エンベロープ遺伝
子、又はそのいかなる変異体もまた、ベクター構築物の
ポリヌクレオチドを意味することができる。

【００２７】加えて、要素（１）及び（４）は、in vit
ro、ex vivo又はin vivoでのレトロウイルスの、改良さ
れた形質導入効率、発現安定性、又はそのいかなる蔓延
に対する制御をも与えるために、更に改質することがで
きる。特に、好適実施態様では、目標とする部分（リガ
ンド、受容体等々）、及び／又は、例えば選択されたエ
ピトープを含む、修飾されたエンベロープタンパク質を
用いている。以下、これらの改質又は変異体をより詳細
に開示する。

【００２８】本発明の第一の実施態様では、ポリヌクレ
オチドを、好ましくはｅｎｖ遺伝子と同じ転写方向で、
エンベロープ遺伝子の３′に挿入する。この点で、本発
明は、ここでは、上記のような機能的組換え複製適格ゲ
ノムを生成する、好適かつ効率的な方法であって、ウイ
ルスゲノム内の第二のスプライス受容部位の形成を含
み、ＬＴＲ領域に含有される転写プロモーターからのポ
リヌクレオチドの翻訳を可能にする方法を開示する。そ
のような構築物の例を、図３に示す。それゆえ、好適実
施態様では、本発明は、下記の要素：

【００２９】（１）レトロウイルス５′ＬＴＲ領域、
（２）レトロウイルスパッケージング配列、（３）機能
的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子、（４）ポリヌクレ
オチド、及び（５）レトロウイルス３′ＬＴＲ領域を
５′から３′への順に含む、複製適格レトロウイルスゲ
ノムを含むレトロウイルス構築物であり

【００３０】該レトロウイルスゲノムは、ｅｎｖ遺伝子
とポリヌクレオチドとの間にスプライス受容部位を更に
含む。

【００３１】レンチウイルス型レトロウイルス構築物を
用いる場合は、上記の要素（３）は、そのようなウイル
スの複写に必要である、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｖｐ
ｘ、ｒｅｖ及びｔａｔから選ばれる、機能的コーディン
グ又は調節配列を更に含む。

【００３２】この種の構築物は、追加（内部）プロモー
ター領域を必要とせずに、ポリヌクレオチドの効率的な
発現を可能にすることから、好都合であることが判明し
ている。更に、そのような人工的構築物は、選択的スプ
ライシングによるポリヌクレオチドの発現を提供し、複
雑なレトロウイルスでの自然の発現様式を模倣する。挿
入された第二のスプライス受容部位は、レトロウイルス
構築物中の、ｅｎｖ遺伝子の上流に既に存在するスプラ
イス受容部位を複製することができる。この特定の実施
態様は、実施例で説明するが、形成されたスプライス受
容部位は、ＭｏＭＬＶスプライス受容部位を含む、レト
ロウイルスＤＮＡの１kb未満のフラグメントを含む。特
定の実施態様では、形成されたスプライス受容部位は、
レトロウイルスのスプライス受容部位、又はその変異体
の配列に相当する配列の、１kb未満、好ましくは０．６
kb未満のフラグメントを含み、スプライス受容部位の活
性を保持している。変化形は、ポリヌクレオチドの発現
を確認することによって、本発明のレトロウイルス構築
物中でのその活性について試験することができる。因み
に、スプライス受容部位、特にレトロウイルスのスプラ
イス受容部位の構造及び一般的特性は、当業者に公知で
ある。スプライス受容部位は、すべてのレトロウイルス
ゲノムで、ｐｏｌとｅｎｖ遺伝子との間に見出される。
これらのスプライス受容部位は、５′−ＬＴＲからのｅ
ｎｖ遺伝子の転写を調節する。したがって、いかなるス
プライス受容部位、例えば、スプライス受容部位、合成
配列、又は他のレトロウイルスからの相当する領域を含
む種々の大きさのＤＮＡフラグメントも、本発明に用い
ることができる。好適実施態様では、スプライス受容部
位は、配列番号：６の全部若しくは一部、又はその変化
形を含む。より好ましくは、スプライス受容部位は、配
列番号：６の第４３７〜８０２位の配列を含む核酸フラ
グメント、又はその変化形である。はるかに好ましく
は、挿入される核酸は、配列番号：６の第５３２〜５４
０位の配列、又はその変化形を含む。好適実施態様で
は、スプライス受容部位を含む挿入された核酸は、約
１．５kb未満、はるかに好ましくは約１kbの配列を含
む。

【００３３】更に、本発明の別の特徴として、レトロウ
イルス（例えばＭｏＭＬＶ）のスプライス受容部位の複
製は、ｅｎｖ遺伝子に隣接する縦列反復をもたらす（図
３）。レトロウイルスゲノム中の反復配列に起因するゲ
ノム配列の欠失は、すでに記載されている。そのような
複製されたベクター内での反復領域の大きさの変更は、
問題の遺伝子の発現に影響することなく、ウイルスｅｎ
ｖ遺伝子の目標とする不安定化によって、その病原性を
制御するための手段として、提唱されている。これに関
しては、この実施態様は、それゆえに、弱毒化した複製
適格レトロウイルスを生成する〔Sorge et al., J. Mo
l. Appl. Genet. 1 (1982) 547; Hugueset al., Virolo
gy 136 (1984) 89〕。

【００３４】これに代えて、複製性ゲノムからのポリヌ
クレオチドの欠失を観測することができるため、本発明
は、いかなるそのような欠失事象をも、ウイルスの蔓延
を制御する更なる手段として用いることも提唱する。特
に、ウイルスの複製を、ポリヌクレオチドの存在に依存
することによって、ポリヌクレオチドに影響しうるいか
なる欠失事象も利用することが可能である。より詳しい
実施態様では、複製性ウイルス構築物は、（１）ウイル
ス構築物それ自体、又は（２）もう一つのウイルス構築
物がコードするポリペプチドの存在下で活性である、修
飾されたＬＴＲ領域を含む。

【００３５】より詳しくは、本発明の具体的な目的は、
複製性ウイルス構築物であって、活性化ポリペプチドの
存在下で活性である、修飾されたＬＴＲ領域を含み、そ
して該活性化ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ
ドを含む、ウイルス構築物にある。はるかに好ましく
は、活性化ポリペプチドは、その送達が探求されている
生成物をコードする、同じポリヌクレオチドによってコ
ードされる。２種のポリペプチドは、単一の融合分子と
して生成してよく、それは、例えば、該２種のポリペプ
チドの間に導入された切断部位の消化によって、発現の
際に細胞内で切断されうる。これに代えて、２種のポリ
ペプチドを、２種の別個の分子として導入してもよく、
それぞれのコーディング核酸を、例えばＩＲＥＳによっ
て融合することができる。これらの実施態様では、ポリ
ヌクレオチドのいかなる欠失事象も、複製欠損ウイルス
構築物を生成し、こうして、その蔓延を防止する。更に
一つの好適実施態様では、活性化ポリペプチドは、調節
されたか、又は（組織若しくは細胞）選択的な、プロモ
ーターの制御下で、ウイルス構築物から発現されて、ウ
イルスの複製を更に制御する。そのようなプロモーター
の例を、本願で後に説明する。

【００３６】活性化ポリペプチドは、いかなるトランス
アクチベーター分子、例えばテトラサイクリン応答性ト
ランスアクチベーター若しくはＨＩＶ Tat/tar系、又は
系の更に高い選択性を確保するための、好ましくは非ヒ
ト起源の、他のいかなる転写活性化分子であることがで
きる。修飾されたＬＴＲは、トランスアクチベーターが
結合するオペレーティング配列を含むことができ、それ
によって、ＬＴＲからの発現を活性化する。該オペレー
ティング配列は、例えば、ＬＴＲのＵ３領域の全部又は
一部に代えて挿入することができる。オペレーティング
配列は、一つ又はいくつかの縦列コピー、例えば１〜８
コピーの間、より好ましくは１〜５コピーを挿入してよ
い。テトラサイクリンオペレーター配列（ＴｅtＯｐ）
は、慣用的手法を用いて、当業者が製造することができ
る。これに関して、本発明の他の特徴は、修飾されたレ
トロウイルスＬＴＲであって、転写活性化因子オペレー
ター配列を、Ｕ３領域の全部又は一部に代えて含むＬＴ
Ｒでもある。

【００３７】以下で更に説明するとおり、活性化ポリペ
プチドは、特に半複製性ウイルス構築物の場合は、別個
のウイルス構築物によって発現してもよい。この状況で
は、ウイルス構築物は、生成されるタンパク質の性質に
関して、互いに依存するばかりでなく、その活性化発現
についても依存する。

【００３８】上記のようなｅｎｖ核酸コーディング領域
の３′へのポリヌクレオチドの挿入は、本発明の好適実
施態様を表すが、その他の挿入部位又は他の方策も用い
得ることを理解しなければならない。より詳しくは、本
発明の複製性ウイルス構築物中に、ポリヌクレオチド
を、

【００３９】−ｅｎｖタンパク質発現を調節するために
用いる第二のスプライス受容部位を、ｅｎｖ遺伝子の
５′にか、又は

【００４０】−それを用いた二シストロン単位として、
エンベロープ遺伝子の３′に挿入することができる。よ
り詳しくは、ＩＲＥＳ配列（内部リボソームエントリー
部位）を、ｅｎｖ遺伝子とポリヌクレオチドとの間に挿
入して、５′−ＬＴＲからの該領域の共発現（co-expre
ssion）を確保することができる。

【００４１】−エンベロープ遺伝子の３′にであるが、
逆の転写配向で挿入することができる。この実施態様で
は、ポリヌクレオチドの転写は、ポリヌクレオチドに含
まれる内部プロモーター領域（後述するとおり、調節さ
れた、及び／又は組織選択的なプロモーターであってよ
い）によって制御される。

【００４２】−より好ましくないが、ポリヌクレオチド
は、ウイルスゲノムの他の位置、例えばＬＴＲ配列のＵ
３領域に存在することができる。

【００４３】本発明の好適なレトロウイルス構築物又は
ゲノム、及び特に（１）機能的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎ
ｖ遺伝子、（２）細胞に送達しようとするポリヌクレオ
チド、（３）レトロウイルスパッケージング配列、及び
（４）少なくとも一つのＬＴＲ配列を含む、本発明の好
適な複製性ウイルス構築物又はゲノムは、更に、

【００４４】−改質された宿主範囲を有する、修飾され
たエンベロープタンパク質（すなわち再標的化されたエ
ンベロープ）をコードし、及び／又は −選択されたエピトープを含む、修飾されたエンベロー
プタンパク質をコードし、及び／又は −活性化ポリペプチドの存在下で活性である、改質され
たＬＴＲ配列を含み、及び／又は −ポリヌクレオチドが、αＧａｌ４をコードし、及び／
又は −ポリヌクレオチドが、免疫原性ポリペプチド若しくは
サイトカインをコードし、及び／又は −ポリヌクレオチドが、（条件付きで）有害な分子をコ
ードし、及び／又は −ポリヌクレオチドが、調節されたか、若しくは選択的
なプロモーターを含むことを特徴とする。

【００４５】これらの特徴は、それらのいかなる組合せ
としても、本発明のウイルス構築物内に存在することが
できる。好ましくは、該特徴の少なくとも一個又は二個
が構築物内に存在する。

【００４６】上記のとおり、本発明の複製性（レトロ）
ウイルス構築物は、上記に開示されたゲノムを含む、例
えば核酸、プラスミド、ベクター又はウイルスであるこ
とができる。

【００４７】本発明の一実施態様では、レトロウイルス
構築物は、上記に定義されたとおりの組換え複製適格
（レトロ）ウイルスゲノムを含む、レトロウイルスベク
ター又はプラスミド、すなわち線状又は環状核酸（ＲＮ
Ａ又はＤＮＡ）である。

【００４８】従って、一面では、本発明は、上記に定義
されたとおりの組換え複製適格レトロウイルスゲノムを
含むプラスミドはもとより、そのようなプラスミドを含
むいかなる組成物でもある。本発明は、ポリヌクレオチ
ドを細胞に送達する方法であって、該細胞（培養体、組
織、器官等々）を該プラスミド又は組成物に、in vitr
o、ex vivo若しくはin vivoで接触させることを含む方
法でもある。

【００４９】この実施態様は、プラスミド又はベクター
の構築、操作及び生成は、慣用の組換えＤＮＡの手法に
従って、適切ないかなる宿主細胞でも実施することがで
きるため、好都合である。例えば、本発明の特定の実施
態様では、レトロウイルス構築物は、上記に定義された
とおりの、組換え複製適格レトロウイルスゲノムと、原
核又は真核宿主細胞のような、宿主細胞内で機能的であ
る複製開始点とを含むプラスミドである。したがって、
このプラスミドは、細菌（例えば大腸菌）又は酵母細胞
（例えばサッカロミセス、クルイヴェロミセス（Kluyve
romyces）等々）のような好都合な、いかなる宿主細胞
内でも調製することができ、安定的なパッケージング細
胞株、限定された環境、複雑な精製方法等々を必要とす
ることが全くない。本発明の特有の特徴としては、プラ
スミドを、マーカー遺伝子を更に含むことができ、in v
itroでのその構築、操作及び産生を更に容易にすること
ができる。

【００５０】本発明のこの実施態様のもう一つの利点
は、効率的な遺伝子送達を達成するのに、高水準のプラ
スミド形質導入を必要としないことである。実際に、細
胞、培養体、組織、器官などと接触させると、プラスミ
ド又はベクターは、細胞内に浸入し、（通常は、宿主ゲ
ノムへのその組込み後に）組換えレトロウイルスゲノム
が複製されることを可能にする。その後、複製された組
換えレトロウイルスゲノムは、レトロウイルス粒子内に
パッケージされ（機能的ｇａｇ及びｅｎｖ遺伝子から発
現された、コア及びエンベロープタンパク質の組立てに
よって形成された）、次いで、形質導入された細胞の外
部に放出される。レトロウイルスの複製及び充填の効率
を考慮すると、この方法は、一細胞に組込まれた一つの
プラスミド又はベクターから、組換えによる大量の複製
適格レトロウイルス粒子の産生を可能にする。これに関
しては、後述する実施例が、組換えレトロウイルスの効
率的増殖を明確に立証する。したがって、最初の接触工
程が改善又は最適化されない場合でさえ、この方法は、
感染性の、組換えによる、大量の複製適格レトロウイル
ス粒子の産生を可能にし、それらは、周囲の細胞に蔓延
し、そして感染することができ、そしてin vitro、ex v
ivo又はin vivoでのポリヌクレオチドの高伝達効率を可
能にする。

【００５１】したがって、本発明は、ポリヌクレオチド
を、in vitro、ex vivo又はin vivoで細胞に送達する方
法であって、該細胞を上記のプラスミド又は組成物に接
触させることを含む方法でもある。本発明は、ポリヌク
レオチドを、in vitro、ex vivo又はin vivoで細胞に送
達するための組成物を製造するための、上記のプラスミ
ド又は組成物の使用でもある。

【００５２】特定の実施態様では、接触させる工程は、
細胞の形質導入を促進することが公知である、いかなる
薬剤又は処理の存在下で実施することもできる。これに
関しては、様々な形質移入剤、例えばリポソーム、陽イ
オン性脂質、ペプチド、ポリマー等々はもとより、電
場、遺伝子銃、衝撃法などのような物理的処理が、文献
中に報告されている。そのようないかなる処理及び／又
は方法も、適切ならば、プラスミドの形質導入を更に増
大させるために、最初の接触工程に適用することができ
る。別の接触工程は、特に筋内遺伝子送達のためには、
むきだしのＤＮＡプラスミドの組成物で実施することが
できる。当然に、接触工程を改良することが公知であ
る、他のいかなる方法、薬剤、処理又は条件も、本方法
を実施する際に用いることができる。

【００５３】特定の実施態様では、接触工程は、リポソ
ーム、陽イオン性脂質、重合体又はペプチドが介在する
トランスフェクションによって実施することができる。

【００５４】本発明のもう一つの特定の変形では、複製
欠損ウイルスを用いて、上記ベクター／プラスミドを、
又は、より一般的には複製性ウイルスゲノムを、細胞に
送達する。これに関しては、レトロウイルスゲノム（又
はベクター／プラスミド）を、欠損アデノウイルス又は
ＡＡＶベクター、ヘルペスアンプリコン、ワクシニアウ
イルスベクターなどに挿入することができる。したがっ
て、最初の接触工程は、例えば、対応するウイルス（例
えばアデノウイルス、ＡＡＶ、ＨＳＶ、ワクシニア）に
よる細胞、培養体、組織又は器官の感染を含む。

【００５５】本発明のもう一つの実施態様によれば、複
製性レトロウイルス構築物は、上記に定義されたとおり
の、組換え複製適格レトロウイルスゲノムを含む、組換
えレトロウイルスである。

【００５６】したがって、本発明のもう一つの目的は、
上記に定義されたとおりの、組換え複製適格レトロウイ
ルスゲノムを含む、複製性レトロウイルスはもとより、
そのようなレトロウイルスを含むいかなる組成物、並び
にその使用にもある。より好ましくは、複製性ゲノム内
で、ポリヌクレオチドは、ＬＴＲ配列の外部に、好まし
くはｅｎｖコーディング領域の３′に、はるかに好まし
くはスプライス受容部位の下流に挿入する。

【００５７】もう一つの好適実施態様では、複製性レト
ロウイルス遺伝子は、特に、選択された、細胞集団、組
織若しくは器官の優先的感染を可能にする、修飾された
ｅｎｖ糖タンパク質、例えば、改変された走性を有する
再標的化ｅｎｖタンパク質、及び／又は、下記でより詳
細に考察するような（選択されたエピトープを含む）免
疫原性ｅｎｖタンパク質をコードする。

【００５８】当然に、特定の実施態様では、複製性レト
ロウイルスゲノムは、上記の二つの特徴はもとより、本
願で後述するその他の特徴も組み合わせてよい。

【００５９】所望ならば、組換え複製適格レトロウイル
スゲノムを含む、組換えレトロウイルスは、レトロウイ
ルス構築物による適格細胞の一過性の感染によってか、
又は対応する安定的なパッケージング細胞株、すなわ
ち、上記で定義されたような複製適格レトロウイルスゲ
ノムをそのゲノムに組み込まれて含む、細胞の集団から
かのいずれかで、in vitroで産生することができる。

【００６０】一過性の感染によるin vitro産生は、適格
な細胞集団を、複製適格レトロウイルスゲノムを含むレ
トロウイルスベクター又はプラスミドに接触させ、その
後、産生された組換えレトロウイルスを回収することに
よって、上記のとおり達成することができる。適格細胞
は、例えば、培養で増殖させることができ、既知の重大
な病原活性を示さず、かつレトロウイルスゲノムを複製
できる、いかなる哺乳動物又は昆虫細胞であることもで
きる。この細胞は、不死化細胞株としてか、又は初代細
胞の培養体として確立することができる。より好ましく
は、適格細胞は、哺乳動物細胞、例えば齧歯類細胞、霊
長類細胞又はヒト細胞である。具体的な例は、繊維芽細
胞（例えばＮＩＨ３Ｔ３）、網膜芽細胞、腎細胞（例え
ば２９３細胞）などを包含する。適格細胞又は細胞株の
その他の例は、例えば、ＥＰ２４３２０４、ＷＯ８９／
０７１５０、ＷＯ９０／０２８６又はＷＯ９３／１０２
１８に記載されている。

【００６１】これに代えて、上記のとおり、本発明の組
換え複製適格レトロウイルスを産生するパッケージング
細胞を、調製することができる。そのためには、細胞株
として確立された適格細胞の集団を、複製適格レトロウ
イルスゲノム、及び場合によりマーカー遺伝子を含む、
レトロウイルスのベクター又はプラスミドに接触させ
る。安定的に組み込まれたレトロウイルスゲノムを有す
る、適格細胞のクローンを、選択しそして継代培養する
ことができる。そうして、マスター細胞バンクを包含す
る細胞バンクを、調製することができ、組換えレトロウ
イルスゲノムを安定的に組み込むためＰＣＲのような様
々な手法によって制御することができ、そして適切な条
件下で貯蔵することができる。本発明の本文中、ゲノム
の安定的な組込みとは、組換えレトロウイルスゲノム
が、少なくとも２０世代にわたって（すなわち２０回の
細胞分裂にわたって）宿主細胞ゲノム内に組み込まれて
存続することを意味する。そのようなパッケージング細
胞からの産生は、（１）レトロウイルスの、ゲノムの複
製、コアとエンベロープタンパク質の発現、パッケージ
ング、及び放出を可能にするのに適した培地と条件とで
細胞を培養すること、次いで（２）産生されたウイルス
を回収することを含む。

【００６２】これに関して、本発明の別の目的は、レト
ロウイルスパッケージング細胞であって、該パッケージ
ング細胞が、上記のような、組換え複製適格レトロウイ
ルスゲノムをそのゲノムに組み込まれて含む、パッケー
ジング細胞にある。上記で考察したように、すでに記載
されているレトロウイルスパッケージング細胞は、複製
欠損レトロウイルスを産生する。対照的に、本発明に記
載されるパッケージング細胞は、複製性レトロウイルス
の産生を可能にする。

【００６３】組換えウイルスを用いようとする場合、細
胞の集団と組換えレトロウイルスとの間の接触は、レト
ロウイルスの懸濁液の存在下で、細胞をインキュベート
することによって、in vitro、ex vivo又はin vivoで達
成することができる。懸濁液は、ウイルスを産生するパ
ッケージング細胞の培養液の上清、又はその希釈液若し
くは濃縮液であることができる。懸濁液は、部分的に精
製した、ウイルスを濃縮した、公知の方法（すなわち勾
配遠心分離、クロマトグラフィーなど）によって得られ
た、上清であることもできる。インキュベーションを、
一般的には、約１０⁴〜１０⁷、より好ましくは約１０⁴
〜１０⁶のウイルス粒子を含む、レトロウイルスの懸濁
液で実施する。この方法に用いられる１細胞あたりのウ
イルスの適確な量は、当業者が、過度の実験を実施する
ことなく適合させることができることを理解すべきであ
る。接触は、標的の、細胞、組織、器官等々を、（in v
itro又はex vivoの使用で）上記のパッケージング細胞
と共培養するか、又は以下に述べるように、該パッケー
ジング細胞をin vivoで移植することによって達成する
ことができる。

【００６４】実施例に説明したように、本発明による
（無害化された）複製性ウイルス構築物の使用は、核酸
を、細胞に、特に増殖中の細胞、より好ましくは腫瘍細
胞にinvitro、ex vivo又はin vivoで送達する、非常に
効率的な方法を提供する。

【００６５】半複製性ウイルスの使用 別の実施態様によれば、本発明は、半複製性ウイルス構
築物、特に半複製性レトロウイルス構築物の使用であ
る。

【００６６】用語「半複製性ウイルス構築物」は、互い
にトランス相補性で、適格細胞内でのその複製を可能に
する（及び／又は複製と／若しくは遺伝子発現のために
相互依存する）、（同時にか、又は順次に用いようとす
る）ウイルス構築物の組合せを意味する。

【００６７】より詳しくは、本発明は、同時にか、別個
にか、又は順次に用いるための、少なくとも２種のレト
ロウイルス構築物を含む組成物であって、該少なくとも
２種のレトロウイルス構築物が、細胞内に存在するとき
に、互いにトランス相補性であり、該レトロウイルス構
築物のうち少なくとも１種が、問題のポリヌクレオチド
を含む組成物である。

【００６８】第一の変化形によれば、本発明の組成物
は、（１）複製性レトロウイルス構築物と、（２）機能
的ｇａｇ及び／又はｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子を欠
損するレトロウイルス構築物とを含み、該レトロウイル
ス構築物の一方又は双方は、問題のポリヌクレオチドを
含む。

【００６９】この特定の変化形では、複製欠損ウイルス
構築物は、複製性ウイルス構築物、複製性構築物の存在
下で得られた、複製欠損構築物の複製及び増殖でトラン
ス相補性である。ここに、本発明者らは、そのような状
況下で、複製欠損構築物は、非常に高い効率、すなわ
ち、複製性構築物のそれに類似するか、又はそれより高
い効率で複製することを、意外にも示した。これは、レ
トロウイルスゲノムのカプシド被包に対するｅｎｖ遺伝
子の負の効果によると思われる。そのため、この実施態
様は、治療用ポリペプチドが、欠損構築物から発現され
ることができるという利点を有する。これに代えて、治
療用ポリペプチドは、複製性構築物からか、又は双方か
ら発現することができる。好適実施態様では、複製性ウ
イルス構築物は、その蔓延、複製又は発現を制御するた
めに、上記のように安全にされる。加えて、複製性ウイ
ルス構築物からの複製又は遺伝子発現は、はるかに好ま
しくは、欠損ウイルス構築物の存在に依存する結果、両
構築物が、複製及び／又は遺伝子発現のために互いに依
存し、それによって、高い発現水準、高い形質導入効
率、及びウイルス蔓延に対する制御が確保される。その
ような相互依存性は、複製性構築物中の遺伝子発現又は
複製を、複製欠損ウイルス構築物が発現する活性化ポリ
ペプチドに依存するようにすることによって達成するこ
とができる。ウイルス蔓延に対する制御は、本願に後述
する追加的方法によって、更に達成することができる。

【００７０】好適実施態様では、本発明は、同時にか、
別個にか、又は順次に用いるための、（１）無害化され
た複製性レトロウイルス構築物と、（２）機能的ｇａ
ｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ遺伝子を欠損する複製欠損
レトロウイルス構築物とを含み、レトロウイルス構築物
の一方又は双方がポリヌクレオチドを含む、組成物に関
する。

【００７１】特定の実施態様では、この複製欠損ウイル
ス構築物は、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子の全部又は一部を
含み、機能的ｅｎｖ遺伝子を、好ましくはその全部又は
一部、より好ましくはｅｎｖコーディング配列の全部の
欠失によって欠いている。

【００７２】もう一つの特定の実施態様では、複製欠損
ウイルス構築物は、機能的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺
伝子を、好ましくはその全部又は一部、より好ましくは
それらのコーディング配列の全部の欠失によって欠いて
いる。

【００７３】好適実施態様では、無害化された複製性ウ
イルス構築物は、複製欠損ウイルス構築物がコードする
活性化ポリペプチドの存在下で活性である、改質された
ＬＴＲ領域を含む。

【００７４】これに代えてか、又はこれに加えて、無害
化された複製性ウイルス構築物は、改質されたエンベロ
ープを含むことができ、及び／又は、サイトカイン、有
害分子（例えばチミジンキナーゼ）及びαＧＡＬ４から
選ばれるポリペプチドをコードすることができる。

【００７５】更に、本発明のこれらの実施態様を実施す
る際に、少なくとも２種のウイルスが、重大な、相同又
は重複領域を本質的に欠損しており、それらの間の組換
え事象を防止することが好都合であり得る。特に、ＬＴ
Ｒ又はパッケージング配列内の相同性は許容されるが、
複製欠損ウイルス構築物は、基本的にはｇａｇ、ｐｏｌ
及びｅｎｖ遺伝子の全部を、はるかに好ましくは、ｐｏ
ｌとｅｎｖ遺伝子の全部及びｇａｇ遺伝子の少なくとも
一部を欠損することが好ましい。

【００７６】本発明は、より一般的には、in vitro、ex
vivo若しくはin vivoでの遺伝子送達のために、同時に
か、別個にか、若しくは順次に用いるための、複製性ウ
イルス構築物及び複製欠損ウイルス構築物のいかなる組
合せにも広がることを理解しなければならない。

【００７７】これに関して、本発明は、ポリヌクレオチ
ドを細胞に、in vitro、ex vivo又はin vivoで送達する
方法であって、細胞を、少なくとも（１）複製性レトロ
ウイルス構築物、及び（２）機能的ｇａｇ、ｐｏｌ及び
／又はｅｎｖ遺伝子を欠損する複製欠損レトロウイルス
構築物に、同時にか、別個にか、若しくは順次に接触さ
せることを含み、該レトロウイルス構築物の少なくとも
一方が、ポリヌクレオチドを含む方法にも関する。

【００７８】もう一つの変化形では、トランス相補性の
少なくとも２種のレトロウイルス構築物のそれぞれが、
ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ばれる少なくとも１種
のウイルス遺伝子を欠損する。

【００７９】これに関して、本発明の特有の実施態様
は、同時にか、別個にか、若しくは順次に用いるため
の、少なくとも２種の半複製性レトロウイルス構築物を
含む組成物であって、該少なくとも２種の半複製性レト
ロウイルス構築物が、細胞内に存在するとき、互いにト
ランス相補性であり、そしてポリヌクレオチドを含む組
成物である。好ましくは、該２種以上のレトロウイルス
構築物は、種々のエンベロープ糖タンパク質をコードす
るか又は示す。

【００８０】特に、半複製性ウイルス構築物は、好適実
施態様では、下記の特徴を有する少なくとも２種の種々
のレトロウイルス構築物を含む：

【００８１】−該レトロウイルス構築物は、それぞれ、
組換えレトロウイルスゲノムを含み、該ゲノムは、
（１）（例えばｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ばれ
る）少なくとも１種のウイルス遺伝子又は調節配列を欠
損し、（２）ポリヌクレオチドを含み、

【００８２】−該レトロウイルス構築物の該組換えレト
ロウイルスゲノムは、細胞内に存在するとき、互いにト
ランス相補性である。

【００８３】より好ましくは、種々の２種以上のレトロ
ウイルス構築物は、更に、各組換えレトロウイルスゲノ
ムに含まれるウイルス遺伝子のｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎ
ｖの間に、有意な配列の重複が皆無であることを特徴と
する。

【００８４】下記で更に詳細に説明するように、そのよ
うな半複製性ウイルスを用いることは、好都合であり、
細胞へのポリヌクレオチドのin vitro、ex vivo又はin
vivoでの効率的な送達及び蔓延を提供する。更に、また
複製適格ウイルスを含まず、組換え／相補性事象の危険
性及び／又は重大性を、防止若しくは最小化する、欠損
ウイルス製剤を生成することに向けられた、ウイルスゲ
ノムを改質するための従来の方策とは対照的に、本発明
は、（互いにトランス相補性である）半複製性ウイルス
構築物を用いることであり、そして細胞、組織、器官等
内でのポリヌクレオチドのより効率的な送達及び蔓延を
確実にする。このトランス相補性レトロウイルスの新た
な概念は、多様な種々の方法で、そして種々の多くの実
施態様に従って、実施することができる。

【００８５】本発明の第一好適実施態様では、下記の特
性を有する２種の半複製性レトロウイルス構築物を用い
る：

【００８６】−第一の半複製性レトロウイルス構築物
は、（１）ｅｎｖ遺伝子を欠損し、そして（２）第一の
ポリヌクレオチドを含む、第一の組換えレトロウイルス
ゲノムを含み、

【００８７】−第二の半複製性レトロウイルス構築物
は、（１）ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損し、そして
（２）第二のポリヌクレオチドを含む、第二の組換えレ
トロウイルスゲノムを含み、

【００８８】−該第一及び第二レトロウイルスゲノム
は、細胞内に存在するとき、互いにトランス相補性であ
る。

【００８９】より好ましくは、上記２種の構築物におい
て：−第二レトロウイルスゲノム中に存在するｅｎｖ遺
伝子は、第一レトロウイルスゲノム中に存在するｇａｇ
及びｐｏｌ遺伝子との有意な配列重複を欠損する。

【００９０】この系は、以前に開示されたとおり、追加
のコーディング又は調節配列で更にトランス相補性であ
る、レンチウイルス型のレトロウイルス構築物に拡張す
ることができる。

【００９１】また、第一及び第二レトロウイルスゲノム
中に存在する、第一及び第二ポリヌクレオチドは、同一
（又は本質的に類似の）生成物、又は別の種々の生成物
（すなわちサイトカイン及び免疫原ポリペプチド等）を
コードすることができる。

【００９２】本発明のもう一つの好適実施態様では、下
記の特性を有する３種の半複製性レトロウイルス構築物
を用いる：

【００９３】−第一の半複製性レトロウイルス構築物
は、（１）ｅｎｖ遺伝子を欠損し、そして（２）第一ポ
リヌクレオチドを含む、第一組換えレトロウイルスゲノ
ムを含み、

【００９４】−第二の半複製性レトロウイルス構築物
は、（１）ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損し、そして
（２）第二ポリヌクレオチドを含む、第二組換えレトロ
ウイルスゲノムを含み、

【００９５】−第三の半複製性レトロウイルス構築物
は、（１）ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損し、（２）第
二組換えレトロウイルスゲノムのｅｎｖ遺伝子とは異な
るｅｎｖ遺伝子を含み、そして（３）第三ポリヌクレオ
チドを含む、第三組換えレトロウイルスゲノムを含み、

【００９６】−該第一、第二及び第三レトロウイルスゲ
ノムは、細胞内に存在するとき、互いにトランス相補性
である。

【００９７】より好ましくは、上記３種の構築物におい
て、−第二及び第三レトロウイルスゲノム中に存在する
ｅｎｖ遺伝子は、第一レトロウイルスゲノム中に存在す
るｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子との有意な配列重複を欠損す
る。

【００９８】更に、この系は、以前に開示されたとお
り、追加のコーディング又は調節配列に更にトランス相
補性である、レンチウイルス型のレトロウイルス構築物
に拡張することができる。

【００９９】特定の好適実施態様では、第一（又はｇ
ｐ：「ｇａｇ−ｐｏｌ」の意）レトロウイルスゲノム
は、断端されたレトロウイルスのｐｏｌＤＮＡを含む。
より詳しくは、ｇｐレトロウイルスゲノムは、第二及び
第三レトロウイルスゲノムに含まれるｅｎｖコーディン
グ領域とのいかなる重複配列も欠損する、断端レトロウ
イルスｐｏｌＤＮＡを含む。そのような断端ｐｏｌＤＮ
Ａを用いることは、送達系の安全性を高める。実際、レ
トロウイルスゲノムでは、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子は重
複する。これらの重複配列は、多少の組換え事象の発生
を可能にし、構築物の遺伝的安定性、及び組換えレトロ
ウイルスの品質に影響することがある。本発明者らは、
ｅｎｖとの重複配列を欠損するか、又は減じ、そして依
然として生物学的に活性を残存する、断端レトロウイル
スｐｏｌＤＮＡが調製できることを示している（米国特
許願第０９１／１１３，２８０号）。したがって、好適
実施態様では、本発明のｇｐレトロウイルス構築物は、
少なくともＣ末端の３〜５０個のアミノ酸残基を欠損す
る、生物学的に活性であるレトロウイルスＰＯＬタンパ
ク質をコードする核酸を含む。好ましくは、この核酸
は、ｅｎｖコーディング領域の少なくとも８０％、より
好ましくは少なくとも９０％の重複配列を欠損する。そ
のような核酸の３′末端の例は、GGACCATCCTCTAG（配列
番号：１）である。ＰＯＬの生物学的活性を依然として
保持する、改変された残基を有するｐｏｌのいかなる変
異体も当然に用いることができ、ＭｏＭＬＶ、ＭＭＴＶ
又はＲＳＶレトロウイルスから調製された断端ＰＯＬコ
ーディング核酸を含む。そのような変異体は、好ましく
は、１０％未満、より好ましくは５％未満、好都合には
３％未満の、修飾されたアミノ酸を含む、上記配列の突
然変異体も包含する。

【０１００】これらの半複製性レトロウイルス構築物
は、複製性ウイルスについて説明したように、いかなる
プラスミド、ベクター、核酸、ウイルス、又は産生若し
くはパッケージング細胞であることができ、そして本質
的に、当技術分野で公知である慣用の手法に従って、調
製することができる。

【０１０１】好適実施態様では、半複製性レトロウイル
ス構築物は、上記に開示されたゲノムを含む、半複製性
レトロウイルスである。

【０１０２】この点では、本発明は、同時にか、別個に
か、若しくは順次に用いるための、少なくとも２種の半
複製性レトロウイルス（特に２種のＭｏＭＬＶ由来のレ
トロウイルス）を含む組成物であって、該半複製性レト
ロウイルスが、（１）ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選
ばれる少なくとも１種のウイルス遺伝子を欠損し、
（２）細胞内に存在するときは、互いにトランス相補性
であり、（３）ポリヌクレオチドを含み、そして（４）
種々のエンベロープ糖タンパク質を有する組成物に関す
る。

【０１０３】本発明は、同時にか、別個にか、若しくは
順次に用いるための、少なくとも３種の半複製性レトロ
ウイルス（特に３種のＭｏＭＬＶ由来のレトロウイル
ス）を含む組成物であって、該半複製性レトロウイルス
が、（１）ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ばれる少な
くとも１種のウイルス遺伝子を欠損し、（２）細胞内に
存在するときは、互いにトランス相補性であり、（３）
ポリヌクレオチドを含み、そして（４）異なるエンベロ
ープ糖タンパク質を有する組成物に関する。

【０１０４】この点では、本発明の第一の好適な変化形
は、

【０１０５】（ａ）（１）ｅｎｖ遺伝子を欠損し、そし
て（２）第一ポリヌクレオチドを含む、第一組換えレト
ロウイルスゲノムを含む第一レトロウイルスと、（ｂ）
（１）ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損し、そして（２）
第二ポリヌクレオチドを含む、第二組換えレトロウイル
スゲノムを含む第二レトロウイルスとを含む組成物であ
って、

【０１０６】該第一及び第二レトロウイルスは、細胞内
に存在するときは、互いにトランス相補性であり、そし
て種々のエンベロープ糖タンパク質を有し、該第一及び
第二ウイルスは、同時にか、又は順次に用いられる。本
発明を実施する際は、用いられる２種（又はそれ以上）
のウイルスが、異なるエンベロープ糖タンパク質を発現
することが重要である。実際、同じエンベロープタンパ
ク質を用いることは、２種（又はそれ以上）の種類のレ
トロウイルスによる細胞の共感染を著しく減じるものと
思われる。エンベロープは、上記のような、公知のいか
なるエンベロープから選んでもよい。

【０１０７】半複製性レトロウイルスは、対応するパッ
ケージング細胞、すなわち、安定的に組み込まれた半複
製性レトロウイルスゲノムを有する、レトロウイルスパ
ッケージング細胞を用いて産生することができる。これ
に関して、本発明の目的は、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ
から選ばれる少なくとも１種の機能的レトロウイルス遺
伝子を含む、組換えレトロウイルスゲノムをそのゲノム
に組み込まれて含む、レトロウイルスパッケージング細
胞にある。実際、本発明は、機能的ウイルス遺伝子を有
するレトロウイルスを産生する、レトロウイルスパッケ
ージング細胞を初めて記載する。

【０１０８】特定の実施態様では、レトロウイルスゲノ
ムは、複製性レトロウイルスゲノム、すなわち、機能的
ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子はもとより、選択され
たポリヌクレオチドも含む、上記で定義されたとおりの
レトロウイルスゲノムである。

【０１０９】もう一つの実施態様によれば、レトロウイ
ルスゲノムは、機能的ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含み、
ｅｎｖ遺伝子を欠損する半複製性レトロウイルスゲノム
である。より好ましくは、この半複製性レトロウイルス
ゲノムは、選択されたポリヌクレオチドを更に含む。よ
り好適な実施態様では、この半複製性レトロウイルスゲ
ノムは、レトロウイルスｅｎｖ遺伝子との有意な配列重
複を欠損する、断端ｐｏｌ遺伝子を含む。

【０１１０】もう一つの実施態様によれば、このレトロ
ウイルスゲノムは、機能的ｅｎｖ遺伝子を含み、ｇａｇ
及びｐｏｌ遺伝子を欠損する、半複製性レトロウイルス
ゲノムである。より好ましくは、この半複製性レトロウ
イルスゲノムは、選択されたポリヌクレオチドを更に含
む。

【０１１１】特定の実施態様では、本発明は、第一及び
第二レトロウイルスゲノムを含むレトロウイルスパッケ
ージング細胞であって、該第一レトロウイルスゲノム
は、機能的ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含み、ｅｎｖ遺伝
子を欠損する半複製性レトロウイルスゲノムであり、そ
して該第二レトロウイルスゲノムは、機能的ｅｎｖ遺伝
子を含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損する半複製性
レトロウイルスゲノムである、レトロウイルスパッケー
ジング細胞である。

【０１１２】上記のパッケージング細胞は、上記で定義
されたとおりの、いかなる適格細胞から調製することも
できる。これらの細胞は、好ましくは哺乳動物細胞、特
に齧歯類又はヒト細胞である。

【０１１３】本発明は、上記で開示されたとおりの、レ
トロウイルスパッケージング細胞を含む組成物でもあ
る。実際、これらのパッケージング細胞は、in vitroは
もとより、被験者に移植してin vivoでも、複製性又は
半複製性レトロウイルスを産生するのに用いることがで
きる。したがって、本発明は、細胞、組織又は器官にポ
リヌクレオチドをin vitro、ex vivo又はin vivoで送達
する方法であって、該細胞、組織又は器官を、上記の半
複製性レトロウイルスの組成物、又はパッケージング若
しくは産生細胞の組成物に接触させることを含む方法に
関する。半複製性レトロウイルスに接触させることは、
in vivoで用いるためには、パッケージング又は産生細
胞を用いるとき、投与を、様々な経路、例えば、腫瘍
内、筋内、静脈内、腹腔内等によって実施することがで
き、移植を、臨床試験に用いられている様々な手法（注
射、被覆等々）に従って、種々の領域（腫瘍内、皮下、
筋内等々）で達成することができる。移植すべき細胞の
量は、ポリヌクレオチド、被験者等々に応じて、当業者
が適合させることができる。当業者は、Klatzmannら〔H
um. Gen. Ther. 9 (1998) 2595-2604〕に開示された情
報を容易に用いることができ、引用によってこれを本明
細書に援用する。

【０１１４】もう一つの好適実施態様では、組成物及び
方法は、半複製性ゲノムを送達するためにＤＮＡ構築物
（例えばプラスミド、又は線状ＤＮＡ構築物）を用い
る。より好適な実施態様では、半複製性レトロウイルス
構築物は、下記の特徴を有する核酸構築物（例えばプラ
スミド）である。

【０１１５】（ａ）第一核酸構築物が、二個の別個の領
域内に、（１）機能的ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含み、
ｅｎｖ遺伝子を欠損し、かつ第一ポリヌクレオチドを含
む、第一半複製性レトロウイルスゲノムと、（２）第一
ｅｎｖ糖タンパク質をコードする核酸領域とを含み；

【０１１６】（ｂ）第二核酸構築物が、二個の別個の領
域内に、（１）第一ｅｎｖ糖タンパク質とは異なる第二
ｅｎｖ糖タンパク質をコードする機能的ｅｎｖ遺伝子を
含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損し、そして第二ポ
リヌクレオチドを含む、第二半複製性レトロウイルスゲ
ノムと、（２）機能的ｇａｇ及びｐｏｌ糖タンパク質を
コードする核酸領域とを含む。当然に、それぞれの核酸
（ａ）及び（ｂ）の領域（１）と（２）とは、図８に示
したとおり、別個の構成要素として用いることができ
る。しかし、好ましくは、これら４個の構成要素は、２
種のプラスミド（又はプラスモウイルス）の形態で用い
る。各プラスミド（又はプラスモウイルス）は、細胞に
導入したときに、組換えゲノムを含み、対応するエンベ
ロープ糖タンパク質を発現する、組換え半複製性レトロ
ウイルスを産生する。該プラスミドは、レトロウイルス
を産生するか、又はポリヌクレオチドを送達するのに、
in vitroで用いることができる。プラスミドは、ポリヌ
クレオチドを標的細胞に送達するのに、in vivoで用い
ることもできる。

【０１１７】実際、in vivoでの細胞のトランスフェク
ションの際、各プラスミドは、半複製性ウイルスの複製
及び産生を誘導する。該ウイルスの産生後は、両ウイル
スに共感染した細胞はすべて、それらの複製が可能であ
り、それによって、ポリヌクレオチドの更なる増殖を促
進することになる。このトランス相補性効果のために、
この系は、「陰陽（ｙｉｎｇ−ｙｏｎｇ）」とも呼ばれ
る。

【０１１８】当然、この系は、２種以上のレトロウイル
ス構築物に拡張することもできる。例えば、第三半複製
性レトロウイルスゲノム及び相補性遺伝子を含む、第三
プラスミドを、上記の２構築物と併用してもよい。

【０１１９】組換え事象を防止又は限定するために、半
複製性レトロウイルスゲノムに存在するｇａｇ、ｐｏｌ
及びｅｎｖ遺伝子は、有意な配列重複を欠損することが
好ましい。これに関しては、好都合にも、上記の断端ｐ
ｏｌ遺伝子を用いることができる。

【０１２０】更に、第一及び第二ポリヌクレオチドは、
本質的に同じ生成物をコードすることができ、特定の実
施態様では、種々の生成物をコードする。この点で、ポ
リヌクレオチドの１種は、マーカー生成物又は有害生成
物（すなわち、要すれば又は所望ならば、操作を停止さ
せるのに適した生成物）をコードすることができる。

【０１２１】前に説明したとおり、これらの核酸構築物
（例えばプラスミド）は、例えばＵＳ０８／６９６，９
４１に開示されたような、慣用の手法によって製造する
ことができる。好ましくは、用いられるすべてのウイル
ス構築物（プラスミド、ウイルス又はその他の分子であ
ろうと）は、ヒト細胞に対する親和性を有するエンベロ
ープ糖タンパク質を発現するよう設定する。これに関し
て、好適なエンベロープは、４０７０Ａ、ＲＤ１１４、
１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ＶＳＶ、ＶＩＨ、及びそれらの誘
導体、特に再標的化されたそれらの誘導体である。

【０１２２】これらの半複製性ウイルス構築物は、種々
の多くの方法で用いることができる。

【０１２３】特定の実施態様では、それらは、基本的に
同時に用いられる。例えば、細胞、培養体、組織、器官
などは、レトロウイルス構築物のそれぞれに、基本的に
同時に接触させる。この目的のためには、レトロウイル
ス構築物を、同じ組成物に含有させることができ、これ
を細胞、培養体、組織、器官などに加えるか、又は別個
の培地／組成物／装置に含有させ、これを細胞、培養
体、組織、器官などに基本的に同時に加えることができ
る。基本的に同時にとは、添加の正確な時期を選ぶ必要
性がなく、時間差が許容され、そして本発明の形質導入
効率に影響しないことを示す。レトロウイルス構築物
は、一旦細胞に接触させたならば、細胞内に侵入し、レ
トロウイルスゲノムが、形質導入された細胞のゲノムに
組み込まれる。２種の構築物を含む細胞では、トランス
相補性が、両ウイルスゲノムの複製及びパッケージング
へと導く。これらの細胞から放出されたウイルスは、や
はり、半複製性である、すなわち、細胞が共感染する
と、互いにトランス相補性があり、更にウイルスを産生
し、それ以上の細胞を形質導入することになる。図９に
説明した、この系によれば、ポリヌクレオチドは、効率
的に送達され、周囲の細胞、組織又は器官に蔓延する。

【０１２４】もう一つの実施態様では、半複製性ウイル
ス構築物を順次に、すなわち様々な時点で用いる。例え
ば、細胞、培養体、組織、器官などを、初めに、半複製
性レトロウイルス構築物の一つに接触させる。レトロウ
イルス構築物は、細胞内に侵入し、形質導入された細胞
のゲノムに、レトロウイルスゲノムが組み込まれる。こ
のようにして、そのような細胞は、ｅｎｖを欠損するウ
イルスキャプシド（例えばｇｐレトロウイルスゲノムに
よる）、又はエンベロープタンパク質（例えば、第二又
は第三レトロウイルスゲノムによる）のいずれかを産生
する。細胞は、組換えゲノムが送達したポリヌクレオチ
ドも含有し、そして発現する。第一ウイルス構築物によ
る形質導入効率が、適切又は最適な生物学的効果を得る
のに不充分であると判断した場合は、細胞、培養体、組
織、器官などを、第一半複製性構築物とトランス相補性
である、第二（又はそれ以上）のそれに接触させる。前
述したシナリオのように、２種の構築物を含有する細胞
は、複製し、２種のすべてのウイルスゲノムのパッケー
ジングへと導く。これらの細胞から放出されたウイルス
は、やはり、半複製性である、すなわち、細胞が共感染
すると、それらは互いにトランス相補性であり、更にウ
イルスを産生し、それ以上の細胞を形質導入することに
なる。図９及び図１０で説明した、この系によれば、ポ
リヌクレオチドは、効率的に送達され、周囲の細胞、組
織又は器官に蔓延する。

【０１２５】したがって、半複製性ウイルス構築物のい
かなる組合わせも、基本的に同時にか、又は順次に用い
て、ポリヌクレオチドを細胞、培養体、組織、器官など
にinvitro、ex vivo若しくはin vivoで送達することが
できる。この系は非常に効率的であるが、それは、実施
例及び図面に示したように、ＨＣＴ１１６細胞培養体
の、８５％〜約１００％が、本発明のレトロウイルス構
築物と接触すると、ポリヌクレオチドを効果的に含有す
るからである。

【０１２６】本発明は、細胞、培養物、組織、臓器、又
は生物へ、本質的に任意のポリヌクレオチドを送達する
ために使用されうる。より好ましくは、ポリヌクレオチ
ドは、任意のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成又は半合成のＤＮ
Ａ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡなどであり得る。ポリヌクレオチ
ドは、好ましくは、１０kb未満、より好ましくは５kb未
満を含む。本発明において使用される好ましいポリヌク
レオチドは、２００〜４０００bpの間を含む。ポリヌク
レオチドは、プロモーター領域又はその他の発現シグナ
ルを付加的に含んでいてもよいが、既に説明したよう
に、そのような因子の存在は適切な発現を確実にするた
めに必要ではないかもしれない。

【０１２７】好ましくは、ポリヌクレオチドは、レトロ
ウイルス構築物に対して異種である、すなわち構築物の
作製に使用されたレトロウイルス由来ではない。しか
し、既に示したように、ポリヌクレオチドは、例えば融
合性（fusogenic）レトロウイルスエンベロープタンパ
ク質（ＶＳＶ−Ｇ、ＧＡＬＶなど）、又はＨＩＶエンベ
ロープ、ポリオエンベロープ、若しくはそれらの配列内
の抗原性ペプチドを含む修飾されたエンベロープタンパ
ク質のような免疫原性エンベロープタンパク質のような
ウイルス又はレトロウイルスのタンパク質をコードして
いてもよい。そのような実施態様において、ポリヌクレ
オチドは、ｅｎｖ又は対応するレトロウイルス遺伝子と
置換されているであろう。特別の具体例は、異種エンベ
ロープタンパク質をコードする核酸、例えばＨＩＶエン
ベロープでシュードタイプ（pseudotype）されたＭｏＭ
ＬＶレトロウイルス構築物を含む。そのような実施態様
において、ポリヌクレオチドはｅｎｖ遺伝子である。

【０１２８】又は、ｅｎｖ遺伝子は、抗原性ペプチドを
コードする配列を含むよう修飾されてもよい。従って、
この実施態様において、ポリヌクレオチドは、レトロウ
イルスの修飾されたエンベロープタンパク質をコードす
る核酸である。

【０１２９】もう一つの実施態様においては、レトロウ
イルス構築物がＭｏＭＬＶ型であり、エンベロープが異
なる型（例えば、ＨＩＶ）であり、かつ該ポリヌクレオ
チドがサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）のような免疫
刺激ポリペプチドをコードする。

【０１３０】ポリヌクレオチドは、一つ又はいくつかの
ＲＮＡ、ペプチド、ポリペプチド、及び／又はタンパク
質を含む、任意の目的の産物をコードしてもよい。コー
ドされた産物は、治療活性又は免疫原性活性のような生
物学的活性を示しうる。それは、有毒活性、マーカー特
性、アンチセンス活性なども示しうる。本発明は、本質
的に任意の種類のポリヌクレオチドを用いて、当業者に
より使用されうると考えられる。

【０１３１】ポリヌクレオチドは、好ましくは、ヒト細
胞のような哺乳動物細胞において生物学的活性を有する
産物をコードする。

【０１３２】ポリヌクレオチドの例は、任意の自殺遺伝
子若しくは毒性遺伝子、特にチミジンキナーゼ、シトシ
ンデスアミナーゼ（cytosine desaminase）などのよう
な条件的毒性遺伝子、又はその他の細菌毒素若しくは融
合性レトロウイルスエンベロープを含む。ポリヌクレオ
チドは、ｐ５３、Ｒｂ、Ｅ１、ＢＲＣＡ１などのような
腫瘍抑制タンパク質、サイトカイン（例えば、ＩＬ−
２、又はＴＮＦ、ＩＦＮなどのような任意のその他のリ
ンホカイン）、抗血管形成誘導因子、抗原性ペプチド、
成長因子（Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮ
ＴＦなど）などをコードしてもよい。ポリヌクレオチド
は、単鎖抗体、アンチセンスＲＮＡ、リボザイムなどを
コードしてもよい。

【０１３３】ウイルス蔓延の制御 前述のように、本発明は、in vitro又はin vivoで細胞
に遺伝子を送達するために、複製適格ウイルス構築物を
使用するという新規な概念から生まれた。先行技術にお
いては、組換えウイルスの複製を防止するための努力が
常に成されていた（複雑なパッケージ細胞、高度に欠失
したウイルス構築物など）。本発明は、ここで、ウイル
ス構築物の複製が許容されうることを主張し、ポリヌク
レオチドの送達及び発現を増加させるために該複製を利
用する。実際、（ＭｏＭＬＶレトロウイルスのような）
いくつかのレトロウイルスの複製は、対象において重大
な病理学的状態を誘導しないであろうことが提唱されて
いる。特に、そのような潜在的な有害作用は、（ｉ）こ
の送達系により得られる生物学的利益と強く釣り合って
おり、かつ（ii）（例えば、他のレトロウイルスが使用
されている）いくつかの方法及び構築物により制御され
うる。この目的のため、本発明の好ましい特定の実施態
様を表す、いくつかの方策が可能である。これらの方策
は、単独で、又は組み合わせて用いられ得る。

【０１３４】序文として、ＭｏＭＬＶのようなある種の
レトロウイルスは分裂中の細胞に本質的に感染するた
め、ＭｏＭＬＶ配列を用いて構築されたレトロウイルス
・ゲノムの蔓延は、そのような分裂中の細胞に限定さ
れ、休止細胞には通常は拡張されないであろうことに注
意すべきである。しかし、休止細胞にも感染する、レン
チウイルスのような他のレトロウイルスが使用される場
合ですら、ウイルス蔓延は、以下の方法又は構築物のう
ちのいずれか一つを、単独で、又は（一つ又は複数を）
組み合わせて使用して制御又は限定されうる。

【０１３５】一つの特定の実施態様において、ウイルス
蔓延は、ウイルスの再ターゲティングにより更に制御さ
れる。実際、レトロウイルスの向性はエンベロープ糖タ
ンパク質により本質的に決定される。エンベロープのレ
トロウイルス表面タンパク質ＳＵは、特異的な細胞表面
受容体へのウイルスの結合を主に担っており、ＴＭサブ
ユニットは、後結合イベントを誘発し、膜融合及びウイ
ルス侵入を引き起こす（Ragheb et al., J. Virol. 68
(1994) 3207）。エンベロープ糖タンパク質が、例え
ば、特異的な受容体リガンド又は受容体断片を取り込む
よう修飾されうること、及び得られたエンベロープタン
パク質が該受容体又はリガンドを発現する細胞の目標と
する感染を提供することが開示される。従って、本発明
の好ましい実施態様において、ウイルスの蔓延を制御す
るため、複製性又は半複製性のウイルス・ゲノムにより
コードされるエンベロープタンパク質は、レトロウイル
ス接着の特異性を再ターゲティングする修飾された向性
を有する。修飾された向性を有するそのようなエンベロ
ープタンパク質の例は、ＣＤ４に対する親和性を有する
膜タンパク質、肝細胞成長因子断片のようなペプチドと
融合したＴＭサブユニットを含むレトロウイルスエンベ
ロープタンパク質（Nguyen et al., Hum. Gene Ther. 9
(1998) 2469）、そして例えば単鎖抗体のようなリガン
ドとＮ末端で融合した両親和性エンベロープタンパク質
を含む。

【０１３６】ウイルス蔓延は、組織特異的及び／又は制
御された（例えば、誘導可能な）プロモーター、すなわ
ち好ましい細胞、組織、若しくは臓器において、及び／
又はある種の条件下で特に活性を有するプロモーター領
域の使用によっても制御されうる。これに関し、目標と
する発現調節は、使用されているウイルス構築物の構造
に応じて、様々なレベルで導入されうる。例えば、ポリ
ヌクレオチドが自己のプロモーター領域を含む場合、ポ
リヌクレオチドの目標とする発現は、選択的及び／又は
制御されたプロモーターを該ポリヌクレオチドに導入す
ることにより達成されうる。又は、ポリヌクレオチドの
発現がＬＴＲのプロモーター領域により調節される場合
には、選択的かつ／又は制御された発現を付与するため
ＬＴＲ領域を修飾することが可能である。これに関し、
ＬＴＲの３′Ｕ３領域を任意の組織選択的／制御された
制御配列を用いて操作し、逆転写後、５′ＬＴＲが該制
御配列でウイルス遺伝子及びポリヌクレオチド発現を調
節するようにすることができる。

【０１３７】ある種の腫瘍細胞（例えば、肝癌、結腸
癌、膠芽腫）、又は例えば造血系若しくは神経系の細胞
を含むその他の異常増殖細胞における、優先的及び／又
は制御された発現を可能にするプロモーター（又はそれ
らの断片）のような、いくつかの選択的かつ／若しくは
制御されたプロモーター又は制御領域の候補が使用され
うる。選択的かつ／又は制御されたプロモーターの特定
の例は、例えば、以下のものを含む。 −原発肝腫瘍の約４０％において発現しているアルファ
−フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモーター（Mawatani
et al., Cancer Gene Ther. 5 (1998) 301）。以前の
研究は、ヒトＡＦＰプロモーターが、肝癌細胞における
レポーター遺伝子の優先的な発現を可能にすることを示
している。更に、ＡＦＰプロモーターによる選択的な肝
癌発現がレトロウイルス・ベクターに関連して観察され
ている。 −特にＨＣＣの患者において、肝腫瘍において発現して
いるアルドラーゼＡプロモーター（Moch et al., Trans
genic Research 7 (1988) 113; Guillouzo etal., J. C
ell Sci. 49 (1981) 249）。 −肝癌の最大７０％において過剰発現している膵臓関連
タンパク質（ＰＡＰ／ＨＩＰ）プロモーター（Christa
et al., J. Hepatol. 30 (1999) 105）。ＰＡＰ／ＨＩ
Ｐプロモーターは、ＨＣＣ細胞において厳密に制御され
ているようであり、その１．３kb断片はＨＣＣ細胞への
高度に優先的な発現を指令する。 −結腸癌（ＣＣ）において特に活性を有する癌胎児性抗
原（ＣＥＡ）プロモーター。このプロモーターは、ウイ
ルス関連において選択的なままであることが既に示され
ている（Richards et al., Hum. Gen. Ther. 6 (1995)
881）。 −いずれも、膠芽腫細胞において優先的に転写を開始す
ることが示されている、グリア細胞繊維性酸性タンパク
質（ＧＦＡＰ）プロモーター及びミエリン塩基性タンパ
ク質（ＭＢＰ）プロモーター（McKie et al.,Gene The
r. 5 (1998) 440; Morelli et al., J. Gen. Virol. 80
(1999) 571）。 −ある種の造血細胞における優先的な発現を提供するた
めに使用されうるインターロイキン・プロモーター。 −テトラサイクリン制御可能発現配列（Smith-Arica et
al., Cold Spring Harbor, Spring Meeting, 1999）又
は任意のその他の修飾された転写活性化因子のような制
御配列と組み合わされた（例えば、ニューロン、神経
膠、及び下垂体に特異的な活性を有する、神経系プロモ
ーター及び内分泌系プロモーターのような）組織選択的
プロモーターを含む、任意のプロモーター。

【０１３８】選択的かつ／又は制御性の発現を付与する
任意のその他のプロモーター又は制御配列が、当業者に
より使用されうることが、理解されるべきである。

【０１３９】もう一つの特定の実施態様において、ウイ
ルス蔓延はポリヌクレオチド自体によりコードされる産
物により調節される。例えば、ポリヌクレオチドは、感
染細胞を破壊するために使用されうる、（条件的）毒性
分子をコードする配列を含み得る。そのような条件的毒
性分子は、例えば、代謝物（例えば、それぞれヌクレオ
シド・アナログ又は５−ＦＵ）を、感染細胞を破壊する
生成物へと変換することができるチミジンキナーゼ、シ
トシンデスアミナーゼ、それらの誘導体などであり得
る。（条件的）毒性分子をコードする配列は、生物学的
産物を産生するその他のコーディング配列と組み合わさ
れて、ポリヌクレオチドへ付加されうる。当然、例えば
癌治療のため、生物学的活性を有する遺伝子／産物とし
ても使用されうる。ポリヌクレオチドは、感染細胞の死
滅を引き起こす、融合性エンベロープタンパク質のよう
なその他の毒性分子をコードすることもできる。

【０１４０】もう一つの特定の実施態様において、複製
性又は半複製性のウイルス構築物は、感染細胞を免疫細
胞に対して感受性にし、従って宿主生物によるそれらの
排除を引き起こす、又は刺激するポリペプチドをコード
する。そのようなポリペプチドの特定の例は、ゴログリ
ー（Gollogly）ら（Neoplasma 43(1996)285）に記載さ
れたα−ガラクトシルトランスフェラーゼ（αＧＡＬ
４）である。αＧＡＬ４は、特定のグリコシル化モチー
フを創作する、ヒト細胞には発現していない細菌酵素で
ある。特に、αＧＡＬ４は、ヒト細胞には存在しないア
ルファ（１−３）ガラクトシル・モチーフを糖脂質に導
入する。しかし、このモチーフは、多くの細菌により発
現されており、ヒトはそれに対する天然の抗体を高レベ
ルに有する。そのようなポリペプチドをコードする核酸
を、本発明の複製性又は半複製性のウイルスに導入する
ことにより、ウイルス粒子が中和され、感染細胞が宿主
の免疫系により破壊され、それによりウイルス蔓延が制
御される。更に、αＧＡＬ４は、（腫瘍細胞のような）
疾患細胞の破壊が求められている場合、治療用遺伝子又
は産物としても機能する。これに関し、特定の実施態様
において、本発明は、ＧＡＬ４ポリペプチドをコードす
る核酸を含む複製性又は半複製性のウイルス構築物にあ
る。

【０１４１】そのようなポリペプチドのその他の例は、
抗原性ペプチド、より好ましくは（破傷風トキソイド若
しくは肝炎由来の抗原性ペプチドのような）人々がワク
チン接種されている、若しくはされることができる微生
物由来であり、及び／又は（例えばインターロイキン−
２若しくはその他のサイトカインのような）免疫刺激分
子を含む。そのようなポリペプチドの発現は、該ペプチ
ド、タンパク質、及び／又は分子に対する宿主の免疫応
答を惹起し、レトロウイルス構築物に感染した細胞に対
する免疫反応を引き起こす。従って、この免疫応答は、
（ｉ）ポリヌクレオチドの送達及び発現の予想された生
物学的効果を生じ、かつ（ii）生物における感染細胞の
排除を引き起こす。従って、免疫応答（細胞性又は体液
性）を惹起するための本発明の使用は、所望の免疫効果
が得られたときにウイルス蔓延を調節する効果を有する
ため、有利である。

【０１４２】これに関し、本発明の特定の実施態様は、
既に定義されている複製性又は半複製性のウイルス構築
物の組成物にあり、該ウイルス構築物は、組み合わされ
て、又は別々に、αＧＡＬ４若しくは抗原性ペプチドを
コードするポリヌクレオチド、及びサイトカイン、より
好ましくはＩＬ−２をコードするポリヌクレオチドを含
む。より好ましくは、組成物は、同時、別々、又は順次
の使用のため、αＧＡＬ４又は抗原性ペプチドをコード
するポリヌクレオチドを含む第一の複製性又は半複製性
のウイルス構築物を少なくとも含み、サイトカイン、よ
り好ましくはＩＬ−２をコードするポリヌクレオチドを
含む第二の複製性又は半複製性のウイルス構築物を少な
くとも含む。

【０１４３】in vivoでウイルス蔓延を制御するための
更にもう一つの手法は、レトロウイルスを不活化するこ
とができる、中和抗体又は抗ウイルス化合物のような中
和化合物の投与を含む。これに関して、いくつかのレト
ロウイルス中和モノクローナル抗体が先行技術において
開示されている。ベクターが破傷風トキソイドのような
微生物由来の抗原性ペプチドを含む場合、診療所におい
て通常使用されているこの微生物に対して惹起された免
疫血清が、この状況において有利に使用されうる。適当
な抗ウイルス化合物は、例えば、ＡＺＴ（ジドブジン）
又はＤＤＣ（ジデスオキシシトシン）及びＤＤＩ（ジデ
スオキシイノシン）のようなその他のジデスオキシヌク
レオチド・アナログ、プロテアーゼｐ１２阻害剤及びプ
ロテアーゼｐ１５阻害剤のような抗プロテアーゼ、それ
らの組み合わせ、ワクチンなども含む。従って、特定の
実施態様において、本発明のin vivoでポリヌクレオチ
ドを送達する方法は、（ｉ）上記に開示された複製性又
は半複製性のレトロウイルス構築物と（ii）中和モノク
ローナル抗体（若しくはＦａｂ断片、単鎖抗体などのよ
うなそれらの誘導体）又は抗ウイルス化合物若しくは処
理剤のような中和化合物との共投与を含む。特定の実施
態様において、複製性又は半複製性のレトロウイルス構
築物は組織又は臓器に投与され、中和化合物は例えば静
脈注射により投与される。共投与とは、同時投与を意味
するのではなく、ウイルス蔓延の制御を提供するため
に、中和分子が投与されるべきであることを示している
（すなわち、レトロウイルス構築物の前、又はほぼ同
時、又は順次のいずれか）。

【０１４４】更に、ウイルス蔓延の調節は、宿主生物が
既に免疫化されている、又は容易に免疫化されうる、
（修飾された）エンベロープタンパク質を有するレトロ
ウイルス構築物の使用によっても、有利に達成されう
る。これに関して、宿主が既に抗ｅｎｖ抗体を示す場
合、ウイルス蔓延は制限されるであろう。又は、ウイル
ス蔓延を制御するため、レトロウイルス構築物の投与の
前、又はほぼ同時、又は後に、（例えば、レトロウイル
ス構築物が、場合によりＭｏＭＬＶエンベロープ又はＨ
ＩＶエンベロープのようなその他のレトロウイルスエン
ベロープと組み合わされて、ポリオエンベロープをシュ
ードタイプされている（発現している）ポリオワクチン
を使用することにより）宿主対象が免疫化されうる。又
は、エンベロープタンパク質は、抗体若しくは宿主生物
の免疫細胞により認識されるエピトープを含むよう、前
記のようにして修飾されうる。これに関して、ウイルス
粒子の表面又はそれらに感染した細胞の表面に露出して
いるエピトープが、エンベロープの活性を有意に変化さ
せることなくエンベロープタンパク質に導入されうる。
エピトープは、ヒトが免疫化されている、又は容易に免
疫化されうるエピトープの中から選択されうる。そのよ
うなエピトープは、例えば、破傷風毒素、ｆｌｕウイル
ス、ポリオウイルス、はしかウイルス、肝炎ウイル
ス....に由来する任意の免疫原性ペプチドを含む。エピ
トープ又はペプチドは、抗体による認識を可能にする適
切なコンフォメーションを確実にするために十分なサイ
ズを有するべきであるか、又はＣＴＬによる認識が求め
られる場合には一般的に２０アミノ酸未満、より好まし
くは１５アミノ酸未満の短い配列であってもよい。抗原
性ペプチドは、その露出を確実にするため、好ましくは
エンベロープのＣ末端に導入される。そのようなウイル
スの投与（又はin vivo産生）により、散在するウイル
ス粒子が宿主の抗体により中和及び排除され、感染細胞
が抗体又は免疫細胞により破壊されうる。これに関し
て、特定の実施態様において、（一つ又は複数の）エピ
トープは、感染細胞の排除を引き起こすＣＴＬリンパ球
により認識されるクラスＩ ＣＭＨペプチドを少なくと
も含む。これらは、特定の実施態様及び方法／又はウイ
ルス蔓延の制御を表す。

【０１４５】パッケージング効率を増加させるためのエ
ンベロープ修飾 前述のように、本発明の発明者らは、驚くべきことに、
ｅｎｖ遺伝子がレトロウイルス粒子におけるレトロウイ
ルスゲノムのカプシド被包に対して負の効果を及ぼすこ
とを示した。この予想外の発見は、ｅｎｖ遺伝子を修飾
することによりレトロウイルス・ベクターのパッケージ
ング効率を増加させるための新規な方策を開拓した。こ
れに関して、本発明は、非機能的ｅｎｖ遺伝子を創作す
るためレトロウイルス・ベクターにおけるｅｎｖ遺伝子
を修飾することを含む、レトロウイルス・ベクターのパ
ッケージング効率を増加させる方法にもある。修飾は、
より好ましくは、ｅｎｖ遺伝子の全部又は一部、より好
ましくはｅｎｖコーディング配列全体を欠失させること
を含む。この方法は、前述のようなレトロウイルス・ベ
クターのすべての型に適用されることができ、少なくと
も２つのレトロウイルス構築物（そのうちの一つはｅｎ
ｖを欠損している）が、（同時に、又は連続的に）使用
されている相互依存性レトロウイルス・ベクター系を作
製するために特に適している。

【０１４６】以下の実施例において開示されるように、
本発明は、ここで、in vitro、in vivo、又はex vivoで
ポリヌクレオチドを細胞に送達するための、極めて効率
のよい組成物及び方法を提供する。本発明は、ヒト及び
／又は動物における実験的研究、臨床的研究のため、更
に治療的、診断的、又は予防的処置のために使用されう
る。

【０１４７】実施例 Ａ−複製性ウイルス構築物の調製及び使用 複製性ＭｏＭＬＶベクターｐＧＨ４５を構築するため、
１コピーのウイルス・スプライス受容領域に先行して、
ｅｎｖ遺伝子の下流にレポーター遺伝子を置いた。記載
された構築物は、ゲノム構造ＬＴＲ−ｇａｇｐｏｌ−ｅ
ｎｖ−ＥＧＦＰ−ＬＴＲを有する。ｅｎｖ遺伝子とＥＧ
ＦＰレポーター遺伝子との間に、スプライス受容の既知
の重要な領域を含む、ＭｏＭＬＶｐｏｌ遺伝子の０．４
kb断片を挿入した。ＭｏＭＬＶにおけるスプライス調節
のメカニズムは、現在のところ十分に理解されていな
い。トランスジーンの発現レベルは、付加的なスプライ
ス受容の受容に依存するが、この部位における過剰スプ
ライシングは、全長ゲノミックＤＮＡの量の減少によ
り、又はｅｎｖメッセージのプロセシングの妨害によ
り、ウイルス増殖を破壊すると予想される。驚くべきこ
とに、選択された構成は、十分なレポーター遺伝子の発
現及びウイルスベクターの複製の両方を可能にする。

【０１４８】更に、ＧＨ４５におけるｅｎｖ遺伝子の目
標とする欠失によるベクターの意図的な弱化が高頻度に
観察された。ＰＣＲにより、感染細胞のクローンを、予
想された欠失に関して試験した（データは示されていな
い）。３回の感染後に単離されたＥＧＦＰ発現クローン
の約３０％（２８中８）が、ＰＣＲ試験においてｅｎｖ
欠失構造を示した。

【０１４９】Ａ．１．複製可能ベクターｐＧＨ４５の構
築（図１〜３） プラスミドｐＭＬＭ３８及びｐＥＴ４７を、ベクターに
導入されるスプライス受容部位近傍の配列の材料として
使用した。意図的なスプライス受容部位におけるトラン
スジーンの転写開始部位は、付加的な異常ＡＴＧシグナ
ルを含んでおり、以下のようにして修正された。

【０１５０】ｐＧＨ１ プラスミドｐＭＬＭ３８をＮｏｔＩ及びＡｖａＩで切断
し、オリゴヌクレオチドＧＨ５１（5′- GGCCGCTA TTTA
AATGGC CGGCCTTAAT TAAAGTCTAG AGGATGGTCC ACCC ; 配
列番号：２）及びＧＨ５２（5′- CCGGGGGTG GACCATCCT
C TAGACTTTAA TTAAGGCCGG CCATTTAAAT AGC ; 配列番
号：３）からなる合成リンカーを挿入した。得られたプ
ラスミドをｐＧＨ１と名付けた。

【０１５１】ｐＧＨ２（図２） ＳｆｉＩ及びＦｓｅＩ消化により、修正された領域を含
む０．４kb断片をｐＧＨ１から単離し、ＳｆｉＩ／Ｆｓ
ｅＩ切断ｐＥＴ４７にクローニングした。得られたプラ
スミドｐＧＨ２は、トランスジーンの改良された転写開
始領域を除けば、ｐＥＴ４７と同一である。

【０１５２】オープンリーディングフレームｇａｇ-ｐ
ｏｌ及びｅｎｖ、並びにＥＧＦＰレポーター遺伝子を含
む、ＭｏＭＬＶプロウイルス・ゲノム全体を含む複製可
能ベクターｐＧＨ２の組み立ては、以下のようにして行
われた。

【０１５３】ｐＧＨ１０ プライマーＧＨ１０順向き（AGTACCGGGA TTAATCCATG CA
TCTCCACC ACCATACTG;配列番号：４）及びＧＨ１０逆向
き（TATGGTCTCT AGACATATGC TAT GGCTCGT ACTCTATAGG C
TTCAGC; 配列番号：５）並びに鋳型としてのプラスミド
ｐＮｃａを用いて、ＭｏＭＬＶｅｎｖ遺伝子の３′プラ
イム部分を０．７５kbのＰＣＲ断片として増幅した。Ｐ
ＣＲ産物を酵素ＡｓｅＩ及びＸｂａＩで切断し、Ｎｄｅ
Ｉ／ＸｂａＩ切断ｐＵＣ１８へとライゲートし、ｐＧＨ
１０を得た。

【０１５４】ｐＧＨ１１ プラスミドｐＧＨ２をＮｄｅＩ及びＳａｃＩで消化し、
ＭｏＭＬＶｐｏｌ遺伝子の４００bpの３′−末端、ＥＧ
ＦＰリーディングフレーム全体、及び３′−ＬＴＲ配列
を含む１．６kbの断片を単離した。この断片をＮｄｅＩ
／ＳａｃＩ切断ｐＧＨ１０へライゲートすることによ
り、プラスミドｐＧＨ１１が得られた。

【０１５５】ｐＧＨ１２ ｐＧＨ１１をＮｈｅＩ及びＡｆｌIIIで分解し、ｐＮｃ
ａ（Colicelli J., J.Mol. Biol. 199 (1988) 47-59）
由来の０．７５kb断片を挿入し、３′−ＬＴＲを完成さ
せた。得られたプラスミドをｐＧＨ１２と名付けた。

【０１５６】ｐＧＨ２０ 酵素ＮｓｉＩ／ＡｆｌIIIによるｐＧＨ１２の消化によ
り、bp断片を得た。この断片をＮｓｉＩ／ＡｆｌIII切
断ｐＮｃａにライゲートし、ｐＧＨ２０を得た。プラス
ミドｐＧＨ２０は、レトロウイルス・ゲノムを発現する
機能的複製可能ＥＧＦＰを含む。

【０１５７】ベクターｐＧＨ２０のエレメントは、以下
のようにマッピングされている（図１及び３を参照）。 １〜５９３ ５′−ＬＴＲ １０７０〜２６８４ ｇａｇ、完全コーディング配列 １０７０〜６２８４ ｇａｇ-ｐｏｌ、完全コーディン
グ配列 ５９４２〜５９５１ スプライス受容部位 ６２２６〜８２２３ ｅｎｖエコトロピック、完全コー
ディング配列 ８２３１〜８５９６ ｐｏｌ配列、部分的（ＮｄｅＩ／
ＸｂａＩ） ８３１６〜８３２５ スプライス受容部位（配列番号：
６） ８６３４〜９３５３ ＥＧＦＰ遺伝子、完全コーディン
グ配列 ９４１６〜１０００８ ３′−ＬＴＲ

【０１５８】複製中に相同的組み換えを引き起こし、従
って時々のｗｔ形成を引き起こすプラスミド配列の欠失
により、ベクターｐＧＨ２０を改良した。ｐＧＨ４５と
名付けられた改良された構築物は以下のようにして構築
された（図１を参照）。

【０１５９】ｐＧＨ４３ ５′−ＬＴＲの上流の領域を操作するため、酵素Ｎｃｏ
Ｉ及びＡｆｌIIIによる消化及び再ライゲーションによ
り、プラスミドｐＮｃａからレトロウイルス配列の３′
半分を欠失させた。得られたプラスミドをｐＧＨ４３と
名付けた。

【０１６０】ｐＧＨ４４ ｐＧＨ４３をＥｃｏＲＩ及びＮｈｅＩで分解し、アニー
リングされたオリゴヌクレオチドＧＨ４３／１（AATTCA
ATGA AAGACCCCAC CTGTAGGTTT GGCAAC; 配列番号：７）
及びＧＨ４３／２（CTAGGTTGCC AAACCTACAG GTGGGGTCTT
TCATTG; 配列番号：８）からなる合成リンカーを挿入
した。従って、得られたプラスミドｐＧＨ４４において
は、プロウイルスゲノムの上流の１６０bpのプラスミド
配列が除去されている。

【０１６１】ｐＧＨ４５ ＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ消化によりｐＧＨ４４から、修正
された配列を含む４．２kbの断片を単離し、ＥｃｏＲＩ
／ＳａｌＩ切断ベクターｐＧＨ２０にライゲートした。
得られた修正されたプラスミドはｐＧＨ４５と名付けら
れ、ｐＧＨ２０と同一のプロウイルス配列を有する。

【０１６２】ｐＧＨ４５の構造マップ ７〜５９９ ５′−ＴＬＲ １０７６〜２６９２ ｇａｇ １０７６〜６２９２ ｇａｇ-ｐｏｌ ５９４８〜５９５７ スプライス受容部位 ６２３２〜８２２９ ｅｎｖエコトロピック ８２３７〜８６００ ｐｏｌ配列（ＮｄｅＩ／Ｘｂａ
Ｉ） ８３２２〜８３３１ スプライス受容部位 ８６４０〜９３５９ ＥＧＦＰ遺伝子 ９４２２〜１００１４ ３′−ＬＴＲ

【０１６３】ｐＧＨ４５の構築スキーム及び構造は図１
〜３に図示されている。

【０１６４】プラスミドｐＧＨ４５における５′−ＬＴ
Ｒの始部からｅｎｖの３′−末端までのウイルス・プロ
ウイルス配列は、ｐＮｃａに存在するｗｔ配列に相当す
る。配列は、ｅｎｖ遺伝子の下流に、プラスミドｐＭＬ
Ｍ３８に存在するｐｏｌ遺伝子の３′末端部分、ＥＧＦ
Ｐ遺伝子、及び３′−ＬＴＲを含む。スプライス受容部
位を含む反復ｐｏｌ配列は、配列番号：６又はその変異
体を含む、ＭｏＭＬＶｐｏｌ遺伝子に存在するＮｄｅＩ
部位からＸｂａＩ部位までの０．４kb断片にある。

【０１６５】Ａ２．増殖及びトランスジーン発現 リン酸カルシウム沈殿によりプロウイルスＤＮＡをＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞に形質転換し、形質移入の３日後に上清を
採取した。感染したＮＩＨ３Ｔ３細胞をプロデューサー
・プールの樹立及び反復的な感染実験に使用した。ベク
ターは、in vitro感染後の蛍光フォーカス形成（図４）
及びＲａｔＸＣ細胞におけるシンシチウムの誘導により
証明された、実質的なＥＧＦＰ発現及び複製を示した。
ＮＩＨ３Ｔ３細胞における５回の反復感染において増殖
特性を調査した。この１５日間にわたり、３日毎の感染
により、増殖は、１から２対数のＦＦＵ（蛍光フォーカ
ス形成単位）レベルで比較的安定したままであった（図
５）。構築物の機能的は、レポーター・タンパク質及び
ウイルス・タンパク質の平衡した発現の指標である。蛍
光顕微鏡及びＦＡＣＳ分析により決定されたプロデュー
サー・プールの力価（図６）は、１ml当たり約１０⁶FFU
である。低m.o.i.における感染において、１FFUは、ベ
クターの増殖を反映するＥＧＦＰ発現細胞１０²個に相
当する。

【０１６６】Ａ３ 遺伝子の安定性 野生型（ｗｔ）形成を引き起こすゲノム再編成は、レト
ロウイルス・ベクター一般による周知の問題である。特
に、複製能を有する構築物では、欠失によるトランスジ
ーン発現の消失が頻繁に観察されている。従って、ベク
ターの遺伝子の保全を、ＰＣＲにより追跡した。感染細
胞の溶解物を、ｗｔ編成又は元のベクター構造それぞれ
に特異的なＰＣＲ反応にかけた。アッセイの検出限界
は、１反応当たり５×１０³コピー未満であった。ＰＣ
Ｒの設計は、図７に図示されている。ＧＨ２０と名付け
られた第一の構築物は、３継代後に検出可能となるｗｔ
復帰を示した。ベクターの改良版（ＧＨ４５）では、６
継代後（ｄ２１）に、ＰＣＲアッセイにおいてｗｔ特異
的バンドが検出不能であり、このことは低い復帰率を示
している。興味深いことに、最初の構築物ＧＨ２０のゲ
ノミック配列は、ＧＨ４５のそれと同一であるが、ＧＨ
２０プラスミドＤＮＡにおいては、５′−ＬＴＲの直接
上流に、ゲノミック転写単位の外に１５０bpのレトロウ
イルス配列が存在する。この配列はウイルス複製から除
外されるため、形質移入中の相同的ＤＮＡ組み換えが、
観察された再編成の原因である可能性が最も高い。

【０１６７】Ａ４．目標とする欠失によるベクターの抑
止 ベクター中のＳＡ領域の重複は、ｅｎｖ遺伝子に隣接す
る０．４kbのタンデム・リピートをもたらした（図
３）。レトロウイルスゲノム中の反復配列によるゲノミ
ック配列の欠損、及びターゲティッド再編成のためのそ
の適用は以前に記載されている。実際、ＧＨ２０におい
て、リピート間の組み換えによるｅｎｖ遺伝子の消失
は、高頻度で観察された。ＰＣＲにより、感染細胞のク
ローンを、予想される欠損に関して試験した（データは
示していない）。３回の感染後に単離されたＥＧＦＰ発
現クローンの約３０％（２８中８）が、ＰＣＲ試験にお
いてｅｎｖ欠損構造を示した。ゲノム中の反復領域のサ
イズを変化させることは、目的の遺伝子の発現に負の影
響を与えることなく、ウイルスｅｎｖ遺伝子の目標とす
る不安定化により、ベクターの毒性を調節するための手
段を提供するはずである。

【０１６８】考察 トランスジーンを安定的に発現し、かつ哺乳動物におけ
る複製能を有するレトロウイルス・ベクターは、顕著に
増強された形質導入効率により、ポリヌクレオチドを細
胞に送達するための、特に自殺遺伝子治療のための有用
な道具となる。本発明者らは、ＭｏＭＬＶにおけるレポ
ーター遺伝子の発現のため、マルチプル・オルタナティ
ブ・スプライス手法を試みた。効率のよいトランスジー
ンの翻訳及びベクターの増殖は、スプライス産物の平衡
した分布を強く示している。当然、ｅｎｖ欠失によるス
プライシング及び抑止率に対する効果を改良するため、
第二のスプライス受容領域に変化を有する提示されたベ
クターの変異体が構築されうる。ＰＣＲによる構築物の
ゲノム安定性の追跡は、２１日間にわたり復帰構造が生
じないことを明らかにした。

【０１６９】Ｂ．半複製性ウイルス構築物の構築及び使
用 全体的なコンセプトは、それぞれがトランスジーンを保
持する、２つのトランス相補性（transcomplementary）
レトロウイルスの作製である。両型のレトロウイルス粒
子は、２つの異なるエンベロープでシュードタイプされ
るため、１つの単一細胞がこれらの２つの型のトランス
相補性レトロウイルス粒子により感染されうる。二重感
染した細胞は、新たな両型のレトロウイルス粒子をそれ
自体産生し、従ってトランスジーンの増殖を継続するで
あろう。

【０１７０】Ｂ１．《ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ》プラスミド
構築の説明（図８を参照） ｙｉｎｇ−ｙａｎｇプラスミドは、４個の以下の発現カ
セットを含む（図８を参照）。

【０１７１】カセットｎ°１： −Ｍｏ−ＭＬＶのＬＴＲ５′（ＰＮＣＡ（Colicelli
J., J. Mol. Biol., 1988, 199: 47-59）由来）。 −Ｍｏ−ＭＬＶのスプライスドナー部位 −Ｍｏ−ＭＬＶのパッケージング（Ψ）配列 −ｇａｇ-ｐｏｌコーディング配列。しかし、ｐｏｌ遺
伝子はＸｂａＩ部位（ＰＮＣＡの位置）でその３′末を
欠損しており、人工的なＳＴＯＰコドンがＸｂａＩ部位
の下流に付加されている。この欠損は、ｐｏｌ遺伝子の
活性に影響を与えることなく、ｅｎｖ発現カセットによ
る組み換えの可能性を減少させる。ｐｏｌ遺伝子内（Ｘ
ｂａＩ部位の上流）には、Ｍｏ−ＭＬＶのスプライス受
容部位が位置する。 −マーカー遺伝子（ガラクトシダーゼ、強化グリーン蛍
光タンパク質など）又は治療用遺伝子（ＨＳＶ−ＴＫ、
サイトカイン......）であり得るポリヌクレオチド。ポ
リヌクレオチドは、ドナー部位とアクセプター部位（上
流を参照）との間のＲＮＡのスプライシングの後に発現
される。 −Ｍｏ−ＭＬＶのＬＴＲ３′に先行し、ポリプリン域を
含む５０塩基対。 −Ｍｏ−ＭＬＶのＬＴＲ３′。

【０１７２】カセットｎ°２： −市場で入手し得るプラスミドｐＵＴＳＶ１（Cayla,To
ulouse）由来のＣＭＶエンハンサー配列及びプロモータ
ー配列。 −ＦＢＲＤＳＡＬＦプラスミド由来のネコＲｄ１１４オ
ンコルナウイルスのｇｐ７０コーディング配列（Cosset
et al, J. Virol.(1995)69: 7430-7436）。 −ＳＶ４０ウイルスのポリＡ配列

【０１７３】カセットｎ°３： −Ｍｏ−ＭＬＶのＬＴＲ５′（ＰＮＣＡ（Colicelli
J.,J.Mol.Biol.,1988,199:47-59）由来）。 −Ｍｏ−ＭＬＶのスプライスドナー部位 −カプシド被包効率にも寄与する下流配列（様々な長さ
が可能）を有するＭｏ−ＭＬＶのパッケージング（Ψ）
配列。従って、これらの下流配列はｇａｇの始部を含
み、ｇａｇの翻訳開始を阻害するためｇａｇのＡＴＧが
突然変異している。 −ｅｎｖ４０７０Ａコーディング配列。 −ｐＣＩＴＥプラスミド（NOVAGEN）由来のＥＣＭＶの
ＩＲＥＳ配列（内部リボソーム結合配列（Internal Rib
osomal Entry Sequence））。この配列は、翻訳の再開
を可能にする。 −マーカー遺伝子（□−ガラクトシダーゼ、強化グリー
ン蛍光タンパク質など）又は治療用遺伝子（ＨＳＶ−Ｔ
Ｋ、サイトカイン......）であり得るポリヌクレオチ
ド。ポリヌクレオチドは、構築物ｎ°１におけるものと
同一であってもよいし、又は別のものであってもよい。 −Ｍｏ−ＭＬＶのＬＴＲ３′に先行し、ポリプリン域を
含む５０塩基対。 −Ｍｏ−ＭＬＶのＬＴＲ３′

【０１７４】カセットｎ°４： −商業的なプラスミドｐＵＴＳＶ１（Cayla, Toulous
e）由来のＣＭＶエンハンサー配列及びプロモーター配
列。 −Ｍｏ−ＭＬＶのｇａｇ-ｐｏｌコーディング配列。カ
セットｎ°１における記載のように、ｐｏｌ遺伝子の末
部は、ＸｂａＩ部位で欠損している。 −ＳＶ４０ウイルスのポリＡ配列。

【０１７５】特定の実施態様において、《ｐｏｎｇ》半
複製レトロウイルス・プラスミドは、カセットｎ°１及
びカセットｎ°２を含み構築される。これは、いわゆる
プラスモウイルス（plasmovirus）を創作する。もう一
つの実施態様において、これらのカセットｎ°１及びｎ
°２は、共形質移入される２つの別々のプラスミドにお
いて使用されうる。

【０１７６】同様に、《ｐｉｎｇ》半複製レトロウイル
スプラスミドは、カセットｎ°３及びカセットｎ°４を
含み構築される。やはり、これらのカセットｎ°３及び
ｎ°４も、共形質移入される２つの別々のプラスミドに
おいて使用されうる。

【０１７７】ｐｏｎｇプラスモウイルスは、ｇａｇ-ｐ
ｏｌコーディング配列及びｐｏｎｇトランスジーンを保
持するレトロウイルス粒子を産生する。これらのｐｏｎ
ｇ粒子の表面には、Ｒｄ１１４エンベロープ糖タンパク
質が存在する。

【０１７８】ｐｉｎｇプラスモウイルスは、ｅｎｖ４０
７０Ａコーディング配列及びｐｉｎｇトランスジーンを
保持するレトロウイルス粒子を産生する。これらのｐｉ
ｎｇ粒子の表面には、ｅｎｖ４０７０Ａエンベロープ糖
タンパク質が存在する。

【０１７９】これらの２つの型のレトロウイルス粒子に
感染した細胞は、新たなレトロウイルス粒子を安定的に
産生する（図９参照）。これらの新たなレトロウイルス
粒子は、ｐｏｎｇウイルス配列（ｇａｇ-ｐｏｌコーデ
ィング配列及びｐｏｎｇトランスジーンを含む）又はｐ
ｉｎｇウイルス配列（ｅｎｖ４０７０Ａコーディング配
列及びｐｉｎｇトランスジーンを含む）のいずれかを導
入することができる。これらの２重感染細胞により産生
されるレトロウイルス粒子は、次にｅｎｖ４０７０によ
りエンベロープを与えられるであろう（図９）。結論と
して、この系は、ポリヌクレオチド（又はトランスジー
ン）の無限の増殖を可能にするはずである。

【０１８０】Ｂ２．in vitro実験：ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ
プラスモウイルスのような《ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ》レト
ロウイルスプラスミドの概念の立証は、細胞をin vitro
で形質移入し、その後ポリヌクレオチド発現を分析する
ことによりなされた（図１０参照）。ｐｉｎｇプラスミ
ド及びｐｏｎｇプラスミドによる形質移入に成功したＨ
ＣＴ１１６細胞において観察された増殖は、相加的では
なく相乗的であり、細胞のほぼ１００％がｇｆｐ陽性細
胞として検出可能となって初めて終了する。これらの細
胞はｙｉｎｇ−ｙａｎｇ細胞と呼ばれる。そのうえ、未
処理ＨＣＴ１１６細胞にｙｉｎｇ−ｙａｎｇＨＣＴ１１
６細胞の上清を感染させると、ポリヌクレオチド発現の
増殖の現象がやはり観察され、感染細胞の約１００％が
陽性細胞となる。この現象は、《上清の上清》、すなわ
ちｙｉｎｇ−ｙａｎｇ細胞の上清に感染した細胞の上
清、又は《上清の上清の上清》....によっても再現され
うる（データは示していない）。これらの実験は、この
２つのウイルスからなる系が、予測通り自己複製可能で
あることを立証している。そのうえ、上清において、又
は上清の上清においても、産生されたレトロウイルス粒
子はｅｎｖ４０７０Ａによってのみエンベロープを与え
られる。従って、ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ細胞の上清に感染
した細胞におけるトランスジーンの繁殖は、「単一エン
ベロープによるｙｉｎｇ−ｙａｎｇ効果」と見なされう
る。

【０１８１】この現象を更に特徴づけるため、ｙｉｎｇ
−ｙａｎｇＨＣＴ１１６細胞を限界希釈によりクローニ
ングした（表１参照）。分析した４０個のクローンのう
ち、３８個がｇｆｐ陽性であった。これらのうち、５個
は《二重陽性》であった。これらのクローンの上清によ
るＨＣＴ１１６細胞の感染は、ほぼすべての細胞がｇｆ
ｐ陽性となるまでｇｆｐの増殖を誘導した。

【０１８２】

【表１】

【０１８３】Ｂ３．in vivo実験：このｙｉｎｇ−ｙａ
ｎｇ系によるトランスジーン増殖の現象を、in vivoで
更に証明した。クローン性二重陽性ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ
ＨＣＴ１１６細胞と未処理ＨＣＴ１１６細胞との混合物
をヌードマウスに注射した。増殖の陰性対照として、い
くつかのマウスには単陽性安定的ｐｉｎｇＨＣＴ１１６
細胞を与えた。腫瘍増殖の３週間後にマウスを犠牲に
し、ｇｆｐ増殖をＦＡＣＳにより分析した。安定的ｐｉ
ｎｇＨＣＴ１１６細胞を含む対照混合物は、増殖を示さ
なかったが、ｙｉｎｇ−ｙａｎｇＨＣＴ１１６細胞を含
む混合物は、極めて高い増殖を示した（表２参照）。ｙ
ｉｎｇ−ｙａｎｇ増殖の現象は、これらのin vivo実験
においてもやはり観察される。このin vivo増殖は、
（１０⁶個の粒子を含む）上清の単回注射が全腫瘍にお
いて陽性細胞の１％を誘導しうるという事実により、更
に例示される。

【０１８４】

【表２】

【０１８５】１０⁷個のＨＣＴ１１６腫瘍細胞をヌード
マウスに注射した。感染の場合、腫瘍が５mm大になった
とき上清を注射した。腫瘍細胞の注射の３週間後、マウ
スを犠牲にし、腫瘍をコラゲナーゼにより消化し、そし
て生存細胞をパーコール勾配により分別した。生存ＨＣ
Ｔ１１６細胞を、ｇｆｐタンパク質の発現に関してＦＡ
ＣＳにより分析した。

【０１８６】結論：ｐｉｎｇレトロウイルス構築物及び
ｐｏｎｇレトロウイルス構築物で形質移入された細胞に
おいてポリヌクレオチドを増殖する、高度に効率のよい
ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ効果が観察された。ｙｉｎｇ−ｙａ
ｎｇ感染細胞の上清で観察されたｙｉｎｇ−ｙａｎｇ効
果は、「単一エンベロープによるｙｉｎｇ−ｙａｎｇ効
果」と見なされうる。これは、ｐｏｎｇ粒子に感染した
細胞が、エンベロープ糖タンパク質を発現せず、そして
次にｐｉｎｇレトロウイルス粒子に再感染して新たな安
定的なパッケージング細胞を形成できるようになるとい
う事実によるものであるに違いない。

【０１８７】いくつかの二重陽性クローン性ｙｉｎｇ−
ｙａｎｇＨＣＴ１１６細胞は、ネスティッド（nested）
ＰＣＲにより試験したとき、組み換えられた複製された
レトロウイルスの存在を示さず、このことは、観察され
たトランスジーンの増殖がｙｉｎｇ−ｙａｎｇ効果によ
るものであることを確証している。

【０１８８】当然、例えば以下の使用と共に、他の型の
半複製性レトロウイルス構築物を用いても同一の効果が
得られ得る。 −ｐｉｎｇ粒子及びｐｏｎｇ粒子を産生する安定なパッ
ケージング細胞の使用、 −ｐｉｎｇ粒子及びｐｏｎｇ粒子を含む上清の使用、 −増殖を更に増強するはずである、３つの異なるエンベ
ロープの使用（１つはｐｏｎｇプラスミド用、他の２つ
は異なるエンベロープを保持する２つのｐｉｎｇプラス
ミド用）、 −異なる成分の発現の効率及び／又は特異性を増強する
ための、目標とされるエンベロープ糖タンパク質、組織
特異的プロモーター、又はキメラＬＴＲの使用。

【０１８９】Ｃ．複製性又は半複製性のウイルス構築物
を使用したin vivo腫瘍減退 この実施例は、チミジンキナーゼポリペプチドを発現す
る複製性又は半複製性のウイルス構築物を使用したin v
ivoの腫瘍減退を例示することにより、本発明の効率を
確証する。特に、複製可能レトロウイルス構築物を産生
するパッケージング細胞を、腫瘍細胞と組み合わせて、
又は確立された腫瘍へ直接的に、マウスに注射した。遺
伝子移入を、ヌクレオシドアナログ（例えば、ガンシク
ロビル）の投与時の腫瘍減退（又はサイズ）と共に調査
した。

【０１９０】これらの実験において２つのパッケージン
グ細胞を使用した。 −パッケージ可能欠損レトロウイルス・ベクターと共
に、パッケージ不可能ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ
遺伝子を発現し、従って感染性であるが欠損のあるレト
ロウイルス粒子を産生する古典的なパッケージング細胞
（対照）。 −パッケージ可能複製可能野生型レトロウイルスとパッ
ケージ可能欠損レトロウイルス・ベクター（すなわち、
２つのトランス相補性レトロウイルス構築物）の両方を
発現し、従って感染性かつ複製可能な粒子を産生する細
胞。

【０１９１】Ｃ１．腫瘍細胞及びパッケージング細胞の
共注射 複製可能レトロウイルス・ベクターと欠損レトロウイル
ス・ベクターの特性を定量的に比較するため、ＤＨＤＫ
１２腫瘍細胞（９８％）と、ＴＫ／ＧＦＰを形質導入す
る複製性レトロウイルス・ベクター又は欠損レトロウイ
ルス・ベクターのいずれかを産生するパッケージング細
胞株（２％）との混合物を調製した。千万個の細胞をヌ
ードマウスに皮下注射した（０日目）。７日目、動物を
２群に分け、一方に７日間ガンシクロビル（１５０mg／
(kg・日)）を与えた。次に、マウスを犠牲にした（１４
日目）。腫瘍を切除し、測量し、フローサイトメトリー
分析により切裂後ＧＦＰ発現細胞のパーセンテージを測
定した。

【０１９２】この実験の結果を図１２に示す。これらの
結果は、（ｉ）ガンシクロビルを受容していない群中の
ＧＦＰ発現細胞の割合により評価したとき、欠損ベクタ
ーよりも複製可能ベクターの方が遺伝子移入がはるかに
効率よいこと、（ii）ＧＣＶ処理が両群においてＧＦＰ
発現細胞の数を劇的に減少させること、（iii）腫瘍量
の有意な減少が、トランスジーン形質導入の効率と一致
して、複製可能ベクターを受容し、ガンシクロビルで処
理された群においてのみ観察されること、を証明してい
る。この実験はヌードマウスにおいて実施されており、
従って、コンピテントな免疫系を必要とする腫瘍の完全
な根絶は存在しないことに注意すべきである。

【０１９３】Ｃ２．確立された腫瘍へのパッケージング
細胞の注射 まず、ＤＨＤＫ１２細胞の注射により、ヌードマウスに
おいて皮下腫瘍を生成させた。７日後、腫瘍が触診でき
るようになったとき、それらに、ＴＫ／ＧＦＰを形質導
入する複製可能レトロウイルス・ベクター又は欠損レト
ロウイルス・ベクターのいずれかを放出するおよそ３×
１０⁶個のパッケージング細胞を注射した。７日後、動
物を７日間ガンシクロビルで処理した、又はしなかっ
た。図１２のように腫瘍を分析した。

【０１９４】図１３に表された結果は、複製可能ベクタ
ーのみが腫瘍細胞の有意な形質導入及び治療効果を引き
起こすことを示している。

【０１９５】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Universite Pierre et Marie Curie (Paris VI) <120> Replicating or Semi-replicating viral constructs, preparation and uses for gene delivery <130> B0017EP2 <140> <141> <160> 8 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 1 ggaccatcct ctag 14 <210> 2 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 2 ggccgctatt taaatggccg gccttaatta aagtctagag gatggtccac cc 52 <210> 3 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 3 ccgggggtgg accatcctct agactttaat taaggccggc catttaaata gc 52 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 4 agtaccggga ttaatccatg catctccacc accatactg 39 <210> 5 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 5 tatggtctct agacatatgc tatggctcgt actctatagg cttcagc 47 <210> 6 <211> 1100 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Partial sequence of pGH45 <400> 6 tctaacctag aaaagtctct cacttccctg tctgaagttg tcctacagaa tcgaaggggc 60 ctagacttgt tatttctaaa agaaggaggg ctgtgtgctg ctctaaaaga agaatgttgc 120 ttctatgcgg accacacagg actagtgaga gacagcatgg ccaaattgag agagaggctt 180 aatcagagac agaaactgtt tgagtcaact caaggatggt ttgagggact gtttaacaga 240 tccccttggt ttaccacctt gatatctacc attatgggac ccctcattgt actcctaatg 300 attttgctct tcggaccctg cattcttaat cgattagtcc aatttgttaa agacaggata 360 tcagtggtcc aggctctagt tttgactcaa caatatcacc agctgaagcc tatagagtac 420 gagccatagc atatgagatc ttatatgggg cacccccgcc ccttgtaaac ttccctgacc 480 ctgacatgac aagagttact aacagcccct ctctccaagc tcacttacag gctctctact 540 tagtccagca cgaagtctgg agacctctgg cggcagccta ccaagaacaa ctggaccgac 600 cggtggtacc tcacccttac cgagtcggcg acacagtgtg ggtccgccga caccagacta 660 agaacctaga acctcgctgg aaaggacctt acacagtcct gctgaccacc cccaccgccc 720 tcaaagtaga cggcatcgca gcttggatac acgccgccca cgtgaaggct gccgaccccg 780 ggggtggacc atcctctaga ctttaattaa ggccggccat ttaaatagcg gccgccacca 840 tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg 900 gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg 960 gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc 1020 tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc 1080 agcacgactt cttcaagtcc 1100 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 7 aattcaatga aagaccccac ctgtaggttt ggcaac 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Oligonucleotide <400> 8 ctaggttgcc aaacctacag gtggggtctt tcattg 36

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドｐＧＨ４５の構築。

【図２】プラスミドｐＧＨ２の構築

【図３】複製適格ＭｏＭＬＶベクターの分子設計。Ｍｏ
ＭＬＶにおいて、オープンリーディングフレームｇａｇ
-ｐｏｌ及びｅｎｖは、オルタナティブ・スプライシン
グにより５′−ＬＴＲ内の共通のプロモーター（矢印）
から発現される。複製能を有するベクターＧＨ２０を構
築するため、天然のアクセプター領域（ＳＡ）を含むｐ
ｏｌ配列の０．４kbを二重化することにより、付加的な
スプライス受容部位を、ＭｏＭＬＶのｅｎｖ遺伝子の下
流に導入した。レポーター遺伝子ＥＧＦＰを第二のＳＡ
の下流に置いた。ＳＡ部位とトランスジーンの開始コド
ンとの間の空間は、ｅｎｖ転写単位のそれと類似してい
る。

【図４】ベクターの増殖。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の準集密的
単層に、低m.o.i.で複製構築物ＧＨ２０（Ａ）又は非複
製ＥＧＦＰ発現ベクター（Ｂ）を感染させた。感染の３
日後、蛍光フォーカスを写真撮影した。

【図５】順次感染。ＮＩＨ３Ｔ３細胞に１ウェル当たり
最大１０³フォーカス形成単位でベクターＧＨ２０を感
染させた。３日後、上清を採取し、次回の感染のため希
釈した。上清を蛍光顕微鏡によりＮＩＨ３Ｔ３細胞にお
いて力価測定した。

【図６】ベクターの力価測定。ＧＨ２０プロデューサー
細胞プール由来の５００μlの上清を、１０⁵個の ＮＩ
Ｈ３Ｔ３細胞に感染させるために用いた。感染の３日
後、蛍光顕微鏡により力価を推定した。力価を、ＦＡＣ
Ｓにより決定されたＥＧＦＰ発現細胞のパーセンテージ
と比較した（Ａ）。ＦＡＣＳ分析のための設定を開示す
るため、希釈されていない上清（Ｂ）及び感染していな
いＮＩＨ３Ｔ３細胞（Ｃ）を用いた感染を示す。

【図７】ｗｔ再編成のＰＣＲ調査。Ａ）ＭｏＭＬＶｅｎ
ｖからＥＧＦＰレポーター遺伝子の５′−末端までにわ
たるベクター特異的ＰＣＲ産物を増幅した。Ｂ）それぞ
れ、ｅｎｖ遺伝子及びＬＴＲのＵ３領域に結合するプラ
イマー対は、鋳型としてＭｏＭＬＶ ｗｔ ＤＮＡを用い
たとき１kbの断片を与える。理論的に２kbのサイズを有
するベクター特異的断片は、選択されたパラメーターの
下で増幅されない。１反応当たり５×１０⁴個の細胞の
溶解物を分析し、ＮＩＨ３Ｔ３ゲノミックＤＮＡの等価
なバックグラウンドにおいて対照反応（レーン１〜３）
を実施した。

【図８】異なる発現カセットの構造（ＳＤ＝スプライス
ドナー部位；ＳＡ＝スプライス受容部位；ＣＭＶ＝サイ
トメガロウイルスのエンハンサー配列及びプロモーター
配列；ＬＴＲ＝ロングターミナルリピート；Ψ＝カプシ
ド被包認識シグナル；ｐｏｌy Ａ＝ＳＶ４０ポリアデニ
ル化シグナル）。

【図９】ＹＩＮＧ−ＹＡＮＧレトロウイルス・プラスミ
ドの概念。ＹＩＮＧ又はＹＡＮＧで形質移入された細胞
は、それぞれ、一過性にＹＩＮＧ粒子又はＹＡＮＧ粒子
を産生する。ｐｉｎｇ粒子及びｐｏｎｇ粒子で二重感染
された細胞は、新たなレトロウイルス粒子を安定的に産
生する。

【図１０】ｙｉｎｇ−ｙａｎｇ効果の概念の証明。ＨＣ
Ｔ１１６結腸癌細胞を、単独のｐｉｎｇプラスモウイル
ス若しくはｐｏｎｇプラスモウイルスにより（０日
目）、又は順次にｐｉｎｇプラスモウイルス（−１５日
目）及びｐｏｎｇプラスモウイルス（０日目）により形
質転換した。ＥＧＦＰトランスジーンの発現が、これら
の観察の後観察される。これらのプラスミドの明確な相
乗効果が存在する。この実験は５回再現された。ｐｏｎ
ｇプラスモウイルスがｐｉｎｇプラスモウイルスの前に
形質移入される場合、２９３ヒト細胞系又はＨＣＴ１１
６において同一の結果が得られる。

【図１１】配列番号６。ヌクレオチド（ｎｔ）位置１
は、ｐＧＨ４５におけるヌクレオチド７８０１に対応す
る。ｎｔ４２７の要素（Ｉ）はｅｎｖの終止コドンであ
り、ｎｔ４３７の要素（II）は、ｎｔ８０２の要素（I
V）で終結する、ＳＡ部位を含む反復ｐｏｌ領域の開始
部を表す。この領域４３７〜８０２は、スプライス受容
部位を含む特定の断片である。要素（III）、ｎｔ５３
２〜ｎｔ５４０は、スプライス受容部位を表す。ｎｔ８
４０の要素（Ｖ）（ＡＴＧ）は、ＥＧＦＰ遺伝子の開始
コドンである。

【図１２】ＴＫ／ＧＦＰ融合タンパク質を形質導入する
複製可能レトロウイルス・ベクター又は欠損レトロウイ
ルス・ベクターを用いたトランスジーン発現及び治療用
遺伝子導入効率の比較。棒は、複製可能ベクター又は欠
損ベクターにより形質導入され、ガンシクロビルで治療
された、又はされていない腫瘍の平均腫瘍重量を表す。
各群に関し、ＧＦＰ発現細胞の割合は、棒の斜線の領域
により示されている。

【図１３】ＴＫ／ＧＦＰ融合遺伝子を形質導入する複製
可能ベクター又は欠損ベクターによる樹立された腫瘍の
処理。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ジョルジュ・オルゼール フランス国、75005 パリ、リュ・ポリヴ ォー 46 (72)発明者 ジャン−ルー・サルツマン フランス国、75005 パリ、リュ・クロー ド・ベルナール 70

Claims (38)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 生体内、生体外又は試験管内での、細胞
   内への遺伝子送達のための組成物を製造するための、複
   製性又は半複製性ウイルス構築物の使用。
2. 【請求項２】 ＬＴＲ配列の外側に挿入されたポリヌク
   レオチドを含む、組換え複製性レトロウイルスゲノム。
3. 【請求項３】 該ゲノムが、ポリヌクレオチドを含み、
   そして修飾されたエンベロープ糖タンパク質をコードす
   る、組換え複製性レトロウイルスゲノム。
4. 【請求項４】 ポリヌクレオチドが、ｅｎｖ遺伝子の下
   流に挿入され、スプライス受容部位が、該ｅｎｖ遺伝子
   と該ポリヌクレオチドとの間に挿入された、請求項２又
   は３記載の組換え複製性レトロウイルスゲノム。
5. 【請求項５】 ポリヌクレオチドが、調節されたプロモ
   ーターの転写制御下にある、請求項２〜４のいずれか１
   項記載の組換え複製性レトロウイルスゲノム。
6. 【請求項６】 修飾されたエンベロープ糖タンパク質
   が、選択されたエピトープを含む、請求項３記載の組換
   え複製性レトロウイルスゲノム。
7. 【請求項７】 修飾されたエンベロープ糖タンパク質
   が、改質された宿主範囲を有する、請求項３記載の組換
   え複製性レトロウイルスゲノム。
8. 【請求項８】 該ウイルス構築物が、活性化ポリペプチ
   ドの存在下で活性である修飾されたＬＴＲ領域を含み、
   そして該ウイルス構築物が、該活性化ポリペプチドをコ
   ードするポリヌクレオチドを含む、組換え複製性ウイル
   ス構築物。
9. 【請求項９】 該構築物が、αＧＡＬ４をコードするポ
   リヌクレオチドを含む組換え複製性ウイルス構築物。
10. 【請求項１０】 該複製性レトロウイルスが、請求項２
    〜９のいずれか１項記載のレトロウイルスゲノム又は構
    築物を含む複製性レトロウイルス。
11. 【請求項１１】 該プラスミドが、複製性レトロウイル
    スゲノム、特に請求項２〜９のいずれか１項記載の複製
    性レトロウイルスゲノム又は構築物を含むプラスミド。
12. 【請求項１２】 請求項１０記載のレトロウイルス、又
    は請求項１１記載のプラスミドを含む組成物。
13. 【請求項１３】 請求項２〜１１のいずれか１項記載
    の、複製性ウイルス構築物又はゲノムを含む、薬学的組
    成物。
14. 【請求項１４】 ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ばれ
    る少なくとも一個の機能的レトロウイルス遺伝子を含む
    組換えレトロウイルスゲノムを、そのゲノムに組み込ま
    れて含む、レトロウイルスパッケージング細胞。
15. 【請求項１５】 該レトロウイルスゲノムが、複製性レ
    トロウイルスゲノムである、請求項１４記載のレトロウ
    イルスパッケージング細胞。
16. 【請求項１６】 該レトロウイルスゲノムが、機能的ｇ
    ａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含み、ｅｎｖ遺伝子を欠損す
    る、半複製性レトロウイルスゲノムである、請求項１４
    記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
17. 【請求項１７】 該レトロウイルスゲノムが、機能的ｅ
    ｎｖ遺伝子を含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子を欠損す
    る、半複製性レトロウイルスゲノムである、請求項１４
    記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
18. 【請求項１８】 第一及び第二レトロウイルスゲノムを
    含む請求項１４記載のレトロウイルスパッケージング細
    胞であって、該第一レトロウイルスゲノムが、機能的ｇ
    ａｇ及びｐｏｌ遺伝子を含み、ｅｎｖ遺伝子を欠損する
    半複製性レトロウイルスゲノムであり、該第二レトロウ
    イルスゲノムが、機能的ｅｎｖ遺伝子を含み、ｇａｇ及
    びｐｏｌ遺伝子を欠損する半複製性レトロウイルスゲノ
    ムであるレトロウイルスパッケージング細胞。
19. 【請求項１９】 該細胞が、哺乳動物細胞、好ましくは
    齧歯類又はヒトの細胞である、請求項１４〜１８のいず
    れか１項記載のレトロウイルスパッケージング細胞。
20. 【請求項２０】 請求項１４〜１９のいずれか１項記載
    のレトロウイルスパッケージング細胞を含む組成物。
21. 【請求項２１】 請求項１４〜１９のいずれか１項記載
    のレトロウイルスパッケージング細胞によって産生され
    るレトロウイルス。
22. 【請求項２２】 請求項１６記載のパッケージング細胞
    によって産生されるレトロウイルス、又は請求項１７記
    載のパッケージング細胞によって産生されるレトロウイ
    ルスを含む組成物。
23. 【請求項２３】 同時にか、別個にか、又は順次に用い
    るための、少なくとも２種のレトロウイルス構築物を含
    む組成物であって、該少なくとも２種のレトロウイルス
    構築物が、細胞内に存在するときには互いにトランス相
    補性であり、該レトロウイルス構築物のうち少なくとも
    １種が、問題のポリヌクレオチドを含む組成物。
24. 【請求項２４】 該少なくとも２種のレトロウイルス構
    築物のそれぞれが、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ば
    れる少なくとも一個の遺伝子を欠損する、請求項２３記
    載の組成物。
25. 【請求項２５】 （１）複製性レトロウイルス構築物
    と、（２）機能的ｇａｇ及び／又はｐｏｌ及び／又はｅ
    ｎｖ遺伝子を欠損するレトロウイルス構築物とを含み、
    該レトロウイルス構築物の一方又は双方が、問題のポリ
    ヌクレオチドを含む、請求項２３記載の組成物。
26. 【請求項２６】 該欠損レトロウイルス構築物が、
    （１）機能的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子を欠損す
    るか、又は（２）機能的ｅｎｖ遺伝子を欠損する、請求
    項２５記載の組成物。
27. 【請求項２７】 該ポリヌクレオチドが、調節されたプ
    ロモーターの転写制御下にある、請求項２３〜２６のい
    ずれか１項記載の組成物。
28. 【請求項２８】 該複製性レトロウイルス構築物が、修
    飾されたエンベロープ糖タンパク質を含み、該エンベロ
    ープが、選択されたエピトープを含むか、又は改質され
    た宿主範囲を有する、請求項２５〜２７のいずれか１項
    記載の組成物。
29. 【請求項２９】 該複製性レトロウイルス構築物が、複
    製欠損ウイルス構築物がコードする活性化ポリペプチド
    の存在下で活性である改質されたＬＴＲ領域を含む、請
    求項２５〜２８のいずれか１項記載の組成物。
30. 【請求項３０】 該レトロウイルス構築物の少なくとも
    １種が、感染した細胞を宿主生物の免疫系に対して感受
    性にさせるポリペプチドをコードする、請求項２３〜２
    ９のいずれか１項記載の組成物。
31. 【請求項３１】 該ウイルス構築物が、αＧＡＬ４をコ
    ードするポリヌクレオチドと、サイトカインをコードす
    るポリヌクレオチドとを、組み合わせてか、又は別個に
    含む、請求項２３〜３０のいずれか１項記載の組成物。
32. 【請求項３２】 該レトロウイルス構築物が、プラスミ
    ド及び／又はレトロウイルス及び／又はレトロウイルス
    パッケージング細胞である、請求項２３〜３１のいずれ
    か１項記載の組成物。
33. 【請求項３３】 同時にか、別個にか、又は順次に用い
    るための、少なくとも２種の半複製性レトロウイルスを
    含む組成物であって、該半複製性レトロウイルスが、
    （１）ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ばれる少なくと
    も一種のウイルス遺伝子を欠損し、（２）細胞内に存在
    するときは、互いにトランス相補性であり、（３）ポリ
    ヌクレオチドを含み、そして（４）異なるエンベロープ
    糖タンパク質を有する組成物。
34. 【請求項３４】 同時にか、別個にか、又は順次に用い
    るための、少なくとも３種の半複製性レトロウイルスを
    含む組成物であって、該半複製性レトロウイルスが、
    （１）ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖから選ばれる少なくと
    も一種のウイルス遺伝子を欠損し、（２）細胞内に存在
    するときには、互いにトランス相補性であり、（３）ポ
    リヌクレオチドを含み、そして（４）異なるエンベロー
    プ糖タンパク質を有する組成物。
35. 【請求項３５】 細胞、組織又は器官にポリヌクレオチ
    ドを試験管内若しくは生体外で送達する方法であって、
    該細胞、組織又は器官を請求項１２、２０及び２２〜３
    ４のいずれか１項記載の組成物に接触させることを特徴
    とする方法。
36. 【請求項３６】 細胞、組織又は器官にポリヌクレオチ
    ドを試験管内若しくは生体外で送達するための組成物を
    製造するための、請求項１２、２０及び２２〜３４のい
    ずれか１項記載の組成物の使用。
37. 【請求項３７】 細胞、組織、器官又は生物にポリヌク
    レオチドを送達するための組成物を製造するための、
    （１）異なるエンベロープ糖タンパク質を有し、（２）
    細胞内に存在するときには、互いにトランス相補性であ
    り、（３）ポリヌクレオチドを含む、２種以上の半複製
    性レトロウイルスの使用。
38. 【請求項３８】 細胞、組織、器官又は生物にポリヌク
    レオチドを送達するための組成物を製造するための、該
    レトロウイルス構築物の一方又は双方が問題のポリヌク
    レオチドを含む、少なくとも（１）複製性レトロウイル
    ス構築物及び（２）機能的ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺
    伝子を欠損するレトロウイルス構築物の使用。