JP2004526450A - ウイルスベクター - Google Patents

Abstract

本発明はウイルスＲＮＡがＨＩＶ−２キャプシド内にパッケージングされないようにパッケージングシグナル内に突然変異をもつヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）ベクターに関する。別のベクターはＨＩＶ−２パッケージングシグナルと、ベクターで発現させることが可能な異種遺伝子を含む。これらのベクターを宿主細胞にコトランスフェクトすると、異種遺伝子を発現することが可能なＨＩＶ−２ウイルス粒子を生産することができる。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明はベクターと遺伝子導入におけるその使用に関する。このベクターはそれ自体のＲＮＡをパッケージングできないように改変したレトロウイルスをベースとし、例えば体細胞遺伝子治療用の外来遺伝子を導入するための感染剤として使用することができる。
【背景技術】
【０００２】
レトロウイルスはいくつかの方法で分類される。まず、その形態に基づいて各種グループに分けられる。これらのグループはＡ、Ｂ、Ｃ及びＤ型ウイルスである。また、３種のサブファミリー即ちオンコウイルス、スプマウイルス及びレンチウイルスの１つに分類されることもある。
【０００３】
Ｃ型ウイルスと呼ぶレトロウイルスファミリーは、細胞膜におけるキャプシドアセンブリを特徴とし、レンチウイルスグループのウイルス、例えばヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）を含む。
【０００４】
レトロウイルスは、感染宿主細胞のゲノムに組込まれたＤＮＡプロウイルス中間体を介して複製するＲＮＡウイルスである。このウイルス粒子はプラス鎖ゲノムＲＮＡ分子の二量体を含む。このゲノムＲＮＡはプロウイルスＤＮＡから宿主ＲＮＡポリメラーゼＩＩにより転写される全長種である。ウイルスのｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子をコードするこれらの全長ＲＮＡの一定割合は宿主細胞リボソームにより翻訳され、ビリオン粒子の産生に必要な構造タンパク質と酵素タンパク質を産生する。プロウイルスはエンベロープタンパク質をコードする種々のより小さい単独又は多重スプライスしたｍＲＮＡと、より複雑なレトロウイルスの場合には１群の調節タンパク質も産生する。ゲノム（及びサブゲノム）ＲＮＡ分子は５’ｍ^７Ｇキャップとポリアデニル化３’テールをもつという点で細胞ｍＲＮＡと構造的に類似する。
【０００５】
ゲノムＲＮＡのパッケージングに成功するためには一連の問題を解決しなければならない。全長ＲＮＡは、次世代ビリオンの遺伝情報の全補体をもつ唯一のものであるので、スプライスしたウイルスメッセージより優先的にパッケージングされなければならない。多くの他のウイルスと異なり、レトロウイルスは一般に宿主ＲＮＡ合成を阻まないので、ウイルスは膨大な量の多様な物理的に類似する宿主細胞ｍＲＮＡに対してゲノムＲＮＡを特異的に選択しなければならない。ゲノムＲＮＡは感染細胞では全ＲＮＡの約１％に過ぎないが、ウイルス粒子に取込まれる主要種である。一定割合を翻訳及びアセンブリ部位へ輸送しないように保護するか又は翻訳直後にコードしたｇａｇ前駆体ポリプロテインと会合させるようにパッケージングすべきゲノムＲＮＡを認識するメカニズムがなければならない。最後に、３〜４０００個のｇａｇ前駆体タンパク質、十分な数の逆転写酵素分子、プロテアーゼ、ｔＲＮＡプライマー及び場合により調節タンパク質の多重コピーと組合せて正確な数のゲノムをパッケージングしなければならないという化学量論的な問題もある。
【０００６】
このように、ゲノムのパッケージングにはＲＮＡ選択の特異性の問題だけでなくＲＮＡ区画化の問題もある。
【０００７】
ウイルスは、ウイルスゲノムｍＲＮＡにシス作用性エレメント即ち「パッケージングシグナル」が存在することとトランス作用性タンパク質因子の存在によりこれらの問題を解決する。天然に存在するものと実験室で構築したウイルス突然変異体を試験した結果、ＲＮＡ認識とパッケージングには特定配列が不可欠であることが確認された。Ｌｉｎｉａｌら，Ｃｅｌｌ １５：１３７１−１３８１（１９７８）、Ｍａｎｎら，Ｃｅｌｌ ３３：１５３−１５９（１９８３）、Ｗａｔａｎａｂｅら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ７９：５９８６−５９９０）１９７９）及びＷＯ−Ａ−９１１９７９８は、５’非翻訳リーダー配列の欠失が夫々ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、脾臓壊死ウイルス（ＳＮＶ）及びＨＩＶでパッケージング欠損を生じることを開示している。
【０００８】
ＨＩＶ−１の場合には、ウイルスＧａｇポリプロテインがその未開列状態でΨパッケージングシグナルを含むＲＮＡを特異的に認識してこれに結合する（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７０：８８０−８８６（１９９６））。ＨＩＶ−１はウイルスゲノムからシス翻訳されずにこの機能を果たすことができるようであるので（ＭｃＢｒｉｄｅら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：４５４４−４５５４（１９９７））、ＨＩＶ−１は遺伝子ベクターシステムとして使用できると思われる。
【０００９】
ＨＩＶ−１とＨＩＶ−２が相互にＲＮＡをパッケージングする能力には非相互関係があり、野生型ＨＩＶ−２はそれ自体のＲＮＡしかパッケージングすることができないが、ＨＩＶ−１はそれ自体のＲＮＡゲノムに加えてＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２系ベクター構築物の両者を有効にパッケージングする（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５８７７−５８８５（１９９８））。ＨＩＶ−２は明らかにそれ自体のゲノムＲＮＡしかパッケージングしない。これを実施するために使用されるメカニズムは共翻訳であり、即ち、無傷のヌクレオキャプシド領域を含む全長Ｇａｇポリプロテインの鋳型であるゲノムＨＩＶ−２ ＲＮＡしか子孫ビリオンに有効に組込まれない（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７４：３０２３−３０３１（１９９９））。このメカニズムは野生型ＨＩＶ−２がＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２系ベクターをトランスパッケージングできないことを説明するものであり、従って、ＨＩＶ−２は遺伝子ベクターとして使用できないと考えられていた。
【００１０】
欠失及び置換突然変異誘発により、数種のレトロウイルスでＲＮＡパッケージングに必要な配列が明らかにされている。これらのうちにはパッケージングに十分な程度の配列もマッピングされている。パッケージングシグナルとＲＮＡ二次構造の説明は、この配列を異種ＲＮＡに導入すると理論的には異種ＲＮＡがレトロウイルス粒子によりパッケージングされるという前提を暗黙裡に想定している。パッケージングには、パッケージングシグナル（ＰＳＩ）に隣接する配列がＰＳＩを破壊する代替二次構造の形成を助長すべきでないという理論的制約がある（これについては、Ｍａｎｎら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５４：４０１−４０７（１９８５）がいくつかの状況証拠を提供している）。更に、パッケージングされるＲＮＡの全長はウイルスが所定寸法のＲＮＡをパッケージングする能力により物理的に制限されている。ＨＩＶ−１では、異種遺伝子を組込んだプロウイルス構築物は産生されるウイルスＲＮＡの全長が元のウイルスの全長を有意に越えると複製欠損を生じることがＴｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒら，ＰＮＡＳ ＵＳＡ ８６：３８５７−３８６１（１９８９）により示されている。複製欠損はＲＮＡパッケージングの効率低下と同じである。
【００１１】
しかし、各種ウイルス間にはそのパッケージング配列の種類と部位に有意変動がある。ＲＮＡ認識メカニズムはよく解明されていないので、実験データなしにパッケージング配列の正確な部位と種類を予想することは理論的に不可能である。
【００１２】
レトロウイルスベクターシステムの開発は上記研究の直接成果であった。これらのシステムでは、高度改変ＲＮＡゲノムをパッケージングする粒子を作製するためにパッケージング欠損「ヘルパー」ウイルス（ベクター）を使用している。Ｗａｔａｎａｂｅら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２２４１−２２４９（１９８３）とＥｇｌｉｔｉｓら，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６：６０８−６１４（１９８８）はウイルスの長い末端反復配列とパッケージングシグナルとプライマー結合部位と異種マーカー遺伝子を最低限含むベクターをビリオン粒子にパッケージングし、これを親ウイルスが向性の細胞に導入したと報告している。こうして、ＲＮＡをウイルス粒子にパッケージングするために必要な最小配列を規定することが可能になった。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
１側面では、本発明はウイルスＲＮＡがＨＩＶ−２キャプシド内にパッケージングされないようにＨＩＶ−２パッケージングシグナル内に突然変異を含むヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）ベクターを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
前記ベクターは、
（ａ）配列番号１の配列もしくはその変異体の欠失、
（ｂ）５ヌクレオチド長以上のその内部フラグメントの欠失、又は
（ｃ）１７ヌクレオチド長以上のそのフラグメントの欠失を含む突然変異をもつ。
【００１５】
本発明の別の側面では、ＨＩＶ−２パッケージングシグナルと、ベクターで発現させることが可能な異種遺伝子を含むベクターが提供される。
【００１６】
本発明は異種遺伝子をコードするＨＩＶ−２ウイルスの生産方法として、ＨＩＶ−２キャプシドを産生することが可能なベクターと、異種遺伝子を発現することが可能であり、ベクターをＨＩＶ−２キャプシドにパッケージングするために十分なＨＩＶ−２パッケージング配列をもつ本発明のベクターを宿主細胞に感染させ、宿主細胞を培養する方法も提供する。本発明により生産したウイルスは例えば遺伝子治療法、ワクチン接種又は科学研究において異種遺伝子を宿主細胞に送達するために使用することができる。
【００１７】
本発明の別の側面では、ＨＩＶ−２パッケージング配列をＳＩＶ又はＨＩＶ感染の治療又は予防に使用する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
パッケージング欠損ＨＩＶ−２ベクター
本発明はＨＩＶ−２ゲノムでパッケージングシグナルを特定した研究に基づく。このようなパッケージング配列を欠失させると、それ自体ＨＩＶ−２キャプシドにパッケージングすることができないＨＩＶ−２ベクターを作製することができる。このようなＨＩＶ−２ベクターを使用するとＨＩＶ−２キャプシドを生産することができる。更に、ＨＩＶ−２パッケージングシグナルを組込んだベクターで同時形質転換した宿主細胞を使用すると、異種タンパク質を発現することが可能なヌクレオチド配列をもつＨＩＶキャプシドを生産することができる。本発明はパッケージング欠損性ベクターを提供する。このようなベクターは他のＨＩＶ−２遺伝子内に他の突然変異も含んでいてもよい。このようなベクターはＨＩＶ−２キャプシドを発現させて組立てる能力を維持していることが好ましい。
【００１９】
パッケージング欠損ベクターは機能的ＨＩＶ−２遺伝子産物を発現するために十分な数のＨＩＶ−２ゲノムのヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含むＨＩＶ−２ヌクレオチドセグメントを含んでいなければならないが、上述のように、ウイルスＲＮＡをビリオンに有効にパッケージングするために十分な数のＨＩＶ−２ヌクレオチドを含むべきではない。
【００２０】
ＨＩＶ−２は多数の文献に記載されている。例えば、ＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ，Ｊ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：４１３３−４１３７（１９９７）はサルウイルス４０の複製起点を含むＲＯＤ株ＨＩＶ−２の感染性プロウイルスクローンであるｐＳＶＲを開示している。本明細書にＨＩＶ−２ヌクレオチド位置を記載する場合にはウイルスＲＮＡの最初のヌクレオチド、即ち１と定義する転写開始部位を基準にナンバリングする。
【００２１】
配列番号１はＨＩＶ−２ＲＮＡの３８０〜４０８位を含み、本発明によるＨＩＶ−２のパッケージングに重要であることが分かった。配列番号１の２８塩基ヌクレオチド配列はＡＡＣＡＡＡＣＣＡＣＧＡＣＧＧＡＧＴＧＣＴＣＣＴＡＧＡＡである。
【００２２】
本発明のパッケージング欠損ベクターは（ａ）配列番号１の配列もしくはそのフラグメントの欠失または突然変異、（ｂ）５ヌクレオチド長以上のその内部フラグメントの欠失または突然変異、又は（ｃ）１７ヌクレオチド以上のそのフラグメントの欠失又は突然変異を、少なくとも含むように改変したＨＩＶ−２ゲノムを含むことが好ましい。
【００２３】
突然変異としては配列番号１の配列の欠失又は変異が挙げられる。適切な変異としては置換、付加及び／又は欠失が挙げられる。適切な突然変異はウイルスＲＮＡがＨＩＶ−２キャプシド内にパッケージングされる可能性を低減する突然変異である。このような突然変異はＨＩＶ−２キャプシド内にウイルスＲＮＡをパッケージングできないようにするものが好ましい。
【００２４】
この突然変異は配列番号１の配列のフラグメント又は５ヌクレオチド長以上のその変異体の欠失又は変異でもよい。このようなフラグメントは内部フラグメントであり、即ち配列番号１の末端ヌクレオチドを含まない配列番号１内の５ヌクレオチド以上が欠失している。このようなフラグメントは例えば５、１０、１５、２０又は２５ヌクレオチド長とすることができる。あるいは、このフラグメントは配列番号１の任意位置から選択される１７ヌクレオチド長以上のフラグメント又はその末端フラグメントを含むその変異体でもよい。このようなフラグメントは例えば１７、１９、２１、２３、２５又は２７ヌクレオチド長とすることができる。
【００２５】
あるいは、より大きい欠失を組込むこともできる。より大きい欠失はＨＩＶ−２ＲＮＡの３８０〜４０８位を含み、この位置から１方向又は両方向に延びていることが好ましい。このような欠失としては例えばこの配列の少なくとも一端又は両端の１、２、５、１０、２０、３０、５０又はそれ以上の塩基の欠失が挙げられる。ＨＩＶ−２ゲノムのこの領域は図１に示すような提案構造フォールドを含み、パリンドローム末端に結び付けられる。欠失はパリンドローム末端の形成を妨害することによりこの構造を除去するものが好ましい。プライマー結合部位とこの提案構造フォールドの間に欠失を配置することが好ましい。
【００２６】
配列番号１に示す配列の変異体の１例は変異体ＨＩＶ−２ゲノムに由来する対応配列であり、例えば変異体ＨＩＶ−２ゲノムの主５’スプライスドナー部位、プライマー結合部位又はｇａｇ開始コドンを同定し、配列番号１又はＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ（前出）に記載されているＨＩＶ−２の配列に変異体の配列を整列させて配列番号１に対応する変異体ＨＩＶ−２ゲノムの配列を確認することにより同定できる。
【００２７】
本明細書においてＨＩＶ−２ゲノムとはＨＩＶ−２に由来するウイルスＲＮＡを意味する。本発明のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−２）は任意ＨＩＶ−２株又はその誘導体に由来するものを利用できる。誘導体はＨＩＶ−２ゲノムに対して少なくとも７０％の配列相同度をもつことが好ましく、少なくとも８０％がより好ましく、少なくとも９０又は９５％が更に好ましい。本発明のウイルスを得るために使用することができる他の誘導体としては所定ＨＩＶ−２遺伝子に元々突然変異をもつ株が挙げられる。以下に詳述するような他の突然変異も存在していてもよい。プライマー結合部位や５’主スプライスドナー部位等の部位の位置は公開ＨＩＶ−２配列を参照するか又は例えば変異体ＨＩＶ−２を本明細書に記載する配列と整列させることにより当業者が容易に設定することができる。
【００２８】
本発明の１側面によると、ＨＩＶ−２ベクターは突然変異ＨＩＶ−２ＲＮＡがＨＩＶ−２エンベロープタンパク質又はキャプシド内にパッケージングされないようにＨＩＶ−２パッケージングシグナル内に突然変異を含む。特に、本発明のパッケージング欠損ベクターは機能的ＨＩＶ−２エンベロープタンパク質を発現してＨＩＶ−２キャプシドを生産するために十分な手段を含むことが好ましい。ＨＩＶ−２ゲノムがキャプシドにパッケージングされるとしても複製できないように、ポリメラーゼ欠失等のＨＩＶ−２ゲノムの他の欠失をベクターに組込んでもよい。
【００２９】
ＨＩＶ−２パッケージング配列を含むベクター
パッケージング欠損ベクターから産生されるＧａｇタンパク質はパッケージングするためのパッケージングシグナルを含む別のＲＮＡを検出することが今般判明した。即ち、ＨＩＶ−２パッケージング配列を含むが、それ自体ではパッケージングできないか又は野生型ＨＩＶ−２によりパッケージングできないベクターはパッケージングシグナルを欠失するＨＩＶ−２ベクターにより産生されるＧａｇに関して競合することができる。ＨＩＶ−２へのパッケージングは特に厳密に制御される。Ｇａｇタンパク質は他の任意ＲＮＡに対してパッケージングシグナルをもつＲＮＡを選択的にパッケージングする。Ｇａｇタンパク質レベルは制限的であるため、最高親和性シグナルをもつＲＮＡしかパッケージングされない。これと全く対照的にＨＩＶ−１ではＧａｇタンパク質が非常に過剰であり、産生されたウイルス粒子が親和性の高低に拘わらずパッケージングシグナルをもつ任意ＲＮＡを含むことができる。ＨＩＶ−２へのパッケージングは厳密に制御されるので、ウイルス調製物は高純度になり、望ましくない核酸を含みにくい。従って、本発明のベクターは異種遺伝子の送達又は異種遺伝子を含むキャプシドの産生に特に有用である。従って、体細胞遺伝子治療に使用するのに理想的である。
【００３０】
ＨＩＶ−２パッケージング配列を含むベクターはＨＩＶ−２エンベロープ又は異種ウイルスエンベロープ（例えば水疱性口内炎ウイルスＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）のアンフォトロピックマウス白血病ウイルスエンベロープ）によりパッケージングできるものを利用できる。これらのベクターはＨＩＶ−１によりパッケージングできるものでもよい。
【００３１】
本発明は更にＨＩＶ−２パッケージング配列を使用することによりＨＩＶ−２ゲノムにパッケージングできる異種遺伝子発現用ベクターにも関する。このようなベクターはＨＩＶ−２パッケージング配列が組込まれる限り、提案されるウイルスの投与又は使用に適合可能な適当な任意ベクターとすることができる。ベクターはＨＩＶ−２ゲノムに由来するが、例えばＨＩＶ−２ゲノム複製を欠損させるように１個以上のＨＩＶ−２遺伝子に突然変異を含むものが好ましい。
【００３２】
このようなベクターに存在するパッケージング配列はパッケージング欠損ＨＩＶ−２ベクターを産生するように突然変異させた上記配列に対応することが好ましい。パッケージングシグナルの実質的部分を含むことが好ましい。１好適側面では、パッケージング配列は配列番号１の配列又はそのフラグメント又はその変異体を含む。その変異体は欠失させようとするゲノムの領域の決定について上述したように同定することができる。ＨＩＶ−２パッケージング欠損ベクターを産生するための突然変異又は欠失について上述した全配列はベクターをＨＩＶ−２キャプシド又はタンパク質エンベロープによりパッケージングできるようにベクターに組込むのに好適な配列である。１好適側面では、パッケージング配列は図１に示すような構造をもつパリンドローム末端を形成できるように選択する。
【００３３】
上記パッケージング配列に加え、他のＨＩＶ−２パッケージング配列がベクターに存在していてもよい。これらの配列は５’スプライスドナー部位の下流の領域から１０、２０、５０、１００、２００、３００又は４００以上のポリヌクレオチドを含むことができる。１好適側面では、これらのパッケージング配列はｇａｇの５’部分を含み、ｇａｇ ＯＲＦのマトリックス（ＭＡ）領域を含むことが好ましい。１好適側面では、パッケージング配列はＨＩＶ−２ＲＮＡの５５３〜９１２位の配列又はその変異体を含む。このようなパッケージング配列の変異体の１例は変異体ＨＩＶ−２ゲノムに由来する対応配列であり、例えば変異体ＨＩＶ−２ゲノムの主５’スプライスドナー部位、プライマー結合部位又はｇａｇ開始コドンを同定し、ＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ（前出）に記載されているＨＩＶ−２の配列に変異体の配列を整列させて配列番号２に対応する変異体ＨＩＶ−２ゲノムの配列を確認することにより同定できる。
【００３４】
これらのベクターは所望遺伝子配列をパッケージングし、ＨＩＶ−２により感染可能な細胞に標的送達するために非常に有効な方法として使用することができる。これはＨＩＶ−２のパッケージングヌクレオチド（ＨＩＶ−２パッケージング領域）に対応する十分な数のヌクレオチドを含むヌクレオチドセグメントと、所定遺伝子と、パッケージング配列と所定遺伝子の両側に配置され、パッケージング、逆転写、ターゲット細胞へのベクター組込み及びベクターからの遺伝子発現のためのＬＴＲの内部及び近傍からの十分な数の配列に対応する配列を含むベクターを作製することにより実施することができる。
【００３５】
パッケージング領域は少なくとも配列番号１の配列に対応することが好ましい。このようなベクターのパッケージングに関して以下に示す実験データによると、ベクターはｇａｇの５’部分も含むことができ、パッケージング効率を高めるためにＨＩＶ−２のマトリックス（ＭＡ）配列を含むことが好ましい。例えば、パッケージングし、逆転写し、ターゲット細胞に組込んで発現させるために十分な数のＨＩＶ−２配列としては、ＬＴＲのＵ３、Ｒ及びＵ５配列、パッケージング配列並びに（逆転写に必要な）ＬＴＲの両側の所定配列が挙げられる。パッケージングに必要なシス作用性ｇａｇヌクレオチド配列を維持しながらこの点から翻訳が開始しないようにｇａｇ開始コドンを突然変異させてもよいと思われる。例えば、ｇａｇ ＡＴＧを部位特異的突然変異誘発によりＡＴＣに変異させてもよい。
【００３６】
このベクターを使用してＨＩＶ−２パッケージング欠損細胞にトランスフェクトすると、このベクターからのヌクレオチド配列は産生されるビリオンにパッケージングされる。これらのＨＩＶ−２パッケージ遺伝子を更にＨＩＶ−２により感染可能な細胞にターゲティングすることができる。この形質転換法は既存方法よりも著しく有効であると予想される。更に、遺伝子の適切な選択により、ＨＩＶ−２感染法をモニターすることができる。
【００３７】
例えば、ベクターは発現、逆転写及び組込みに十分な数のＨＩＶ−２の５’及び３’両者のＬＴＲに対応するヌクレオチドと、パッケージングするために十分な数のＨＩＶ−２パッケージング配列に対応するヌクレオチドを含むことができる。ベクターは更に機能的遺伝子（例えば遺伝子セグメント）を産生するために十分な数の導入が所望される遺伝子のヌクレオチドも含む。この遺伝子は後述するような任意所望遺伝子とすることができる。ベクターは更に遺伝子の発現を調節するプロモーター領域に対応する配列も含むことができる。ベクターは自己不活化ベクター、例えば自己不活化レトロウイルスベクターでもよい。これはベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域に突然変異を含むことができ、逆転写中にターゲット細胞の感染後にコピーされるので５’ＬＴＲはこの不活化突然変異を含み、ＬＴＲプロモーターは不活化される。このため、全内部プロモーターは競合非依存的に機能できる。
【００３８】
パッケージング配列
本発明の代替態様では、ＨＩＶ−２パッケージング配列は野生型ＨＩＶ−２をパッケージングさせないか又はＨＩＶ−２キャプシドにＨＩＶ−２をパッケージングさせないようにそれ自体又はアンチセンス分子として提供することができる。従って、このパッケージング配列はＳＩＶ又はＨＩＶ感染（例えばＳＩＶ、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２感染、好ましくはＨＩＶ−１感染）の予防又は治療に使用することができる。特に、欠失に関して上述したものや異種遺伝子の発現用ベクターの組込みについて後述するようなもの等のパッケージング配列を単独で使用したり、以下に詳述するようにアンチセンス分子の作製に使用することができる。このパッケージング配列は例えば非ＳＩＶ又はＨＩＶ配列に挟まれた適当な送達ビヒクルに配置することができる。このようなパッケージング配列を使用してＳＩＶ又はＨＩＶキャプシドタンパク質に結合させたり、このような結合部位を飽和させたり、このような部位を野生型ウイルスゲノムと競合させてこのようなゲノムがキャプシドにパッケージングされないようにすることができる。従って、パッケージング配列はそれ自体治療に有用であると思われる。アンチセンス分子を使用すると、野生型ウイルスゲノムパッケージング配列に結合し、その認識及びウイルスキャプシドとの結合を阻止することができる。このようなパッケージングヌクレオチドは後述するように処方してもよいし、裸のポリヌクレオチドとして投与してもよいし、当分野で周知のようなトランスフェクション助長剤と処方して適当な任意方法により送達してもよい。
【００３９】
パッケージング配列はパッケージング欠損ＨＩＶ−２ベクターを産生するように突然変異させた上記配列に対応することが好ましい。パッケージングシグナルの実質的部分を含むようにしてもよい。１好適側面では、パッケージング配列は配列番号１の配列又はそのフラグメントもしくはその変異体を含む。特に、パッケージング配列は図１に示すような構造をもつパリンドローム末端を形成できるように選択する。その変異体は欠失させようとするゲノムの領域の決定について上述したように同定することができる。ＨＩＶ−２パッケージング欠損ベクターを産生するための突然変異又は欠失について上述した全配列はベクターをＨＩＶ−２キャプシド又はタンパク質エンベロープによりパッケージングできるようにベクターに組込むのに好適な配列である。例えば５’スプライスドナー部位の下流の領域から１０、２０、５０、１００、２００、３００又は４００以上のポリヌクレオチド等の付加配列を配置することも好ましい。１好適側面では、パッケージング配列はｇａｇの５’部分を含み、ｇａｇＯＲＦのマトリックス（ＭＡ）領域を含むことが好ましい。１好適側面では、パッケージング配列はＨＩＶ−２ＲＮＡの５５３〜９１２位の配列を含む。
【００４０】
上記に代えて又は上記に加えて、パッケージング配列の送達用として他のフランキング配列を配置してもよい。本明細書に記載するパッケージング配列に相補的なアンチセンス分子も配置してもよい。
【００４１】
宿主細胞
本発明の１側面では、異種遺伝子の発現用ベクターを含むＨＩＶ−２ウイルスを産生するように宿主細胞を作製する。ウイルスはＨＩＶ−２キャプシドを産生することが可能なベクターと、ＨＩＶ−２パッケージングシグナルと異種遺伝子をもつ本発明のベクターを細胞にコトランスフェクトすることにより産生される。１好適側面では、ＨＩＶ−２キャプシドを産生することが可能なベクターは本発明のパッケージング欠損ＨＩＶ−２ベクターである。このようなウイルスは哺乳動物細胞等の適切な細胞に両者ベクターをコトランスフェクトすることにより生産される。
【００４２】
各々ＨＩＶ−２ゲノムの異なる部分を含むが、ウイルスパッケージングに必要な配列を含まない少なくとも２種の異なるベクターを使用して選択細胞株を形質転換することが好ましい。その後、細胞に各ベクターをコトランスフェクトすることにより、細胞は全ＨＩＶ−２構造及び酵素タンパク質を発現し、ビリオンを産生することができる。１好適態様では、ベクター又は各ベクターはＨＩＶ−２ＬＴＲ（長い末端反復配列）に対応する配列を含まないが、プロモーター領域及び／又は別のゲノムのポリアデニル化配列は含む。ベクター又は各ベクターは自己不活化ベクターでもよい。これは、例えばベクターの３’ＬＴＲのＵ３領域に突然変異を含むことができ、逆転写中にターゲット細胞の感染後にコピーされるので５’ＬＴＲはこの不活化突然変異を含み、ＬＴＲプロモーターは不活化される。このため、全内部プロモーターは競合非依存的に機能できる。特定プロモーター及びポリアデニル化配列の選択は特定宿主細胞に基づいて容易に決定することができる。配列が対応しないＬＴＲは３’ＬＴＲであることが好ましい。
【００４３】
１好適態様では、第１のベクターはｅｎｖの上流のＨＩＶ−２タンパク質の発現を可能にする配列を含み、第２のベクターは残りのタンパク質の発現を可能にする。例えば、一方のベクターは最も５’側の遺伝子産物を発現させるためにｅｎｖ遺伝子配列までのｇａｇ開始コドンの上流の十分な数のヌクレオチドに対応するＨＩＶ−２ヌクレオチドセグメントを含む。他方のベクターはｇａｇ遺伝子配列の下流の十分な数のヌクレオチドに対応し、機能的ｅｎｖ遺伝子配列を含むＨＩＶ−２ヌクレオチドセグメントを含む。このようなベクターはＨＩＶ−２ゲノムの報告されている遺伝子配列から化学的に合成することもできるし、当業者が本明細書の開示に基づいてこれらのウイルスの既知制限エンドヌクレアーゼ部位を利用することにより、多数の入手可能なＨＩＶ−２プロウイルスから誘導することもできる。
【００４４】
ベクター毎に異なるマーカー遺伝子を加えることが好ましい。この場合には、これらの各種ベクターをコトランスフェクトした予め選択した細胞株を使用し、両者マーカーを含む細胞を探索することにより、両者ベクターがコトランスフェクトされている細胞を検出する。このような細胞は全ＨＩＶ−２タンパク質を産生することができる。ビリオンは産生されるが、完全ウイルス配列に対応するＲＮＡはこれらのビリオンにパッケージングされない。所望により３種以上のベクター、例えばｇａｇ／ｐｏｌベクターとプロテアーゼベクターとｅｎｖベクターを使用することもできる。
【００４５】
レトロウイルスは場合により他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質でシュードタイプ化してもよい。従って、別のレトロウイルスからｅｎｖ遺伝子に対応するために十分な数のヌクレオチドを含むベクターを作製することができる。このベクターの５’ＬＴＲはｅｎｖ遺伝子と同一ゲノムをもつことが好ましい。このようなベクターはＨＩＶ−２ｅｎｖパッケージング欠損ベクターに代用してビリオンを産生することができる。このような変更により、得られるベクターシステムをより広い宿主範囲で使用したり、より狭い宿主範囲に制限することができる。水疱性口内炎ウイルス又は狂犬病ウイルスエンベロープタンパク質を使用するとベクターを多種多様な細胞型に向性にすることができる。
【００４６】
ほぼ任意細胞株を使用することができる。哺乳動物細胞株を使用することが好ましく、例えばＣＶ−１、ＨｅＬａ、Ｒａｊｉ、ＳＷ４８０又はＣＨＯが挙げられる。
【００４７】
ウイルス細胞産物の産生を増すために、５’ＬＴＲ以外のプロモーターを使用してもよく、例えばＣＶ−１又はＨｅＬａ細胞で優先的に遺伝子を発現させるプロモーターを５’ＬＴＲに代用してもよい。使用する特定プロモーターは本明細書の開示に基づいて使用する細胞株に応じて当業者が容易に決定することができる。
【００４８】
ウイルス細胞産物のレベルを高めるために、ＨＩＶ−２ＬＴＲ及び／又はプロモーターを強化するようにベクターにエンハンサー配列も加えてもよい。特定エンハンサー配列は使用する細胞株に応じて当業者が容易に決定することができる。
【００４９】
全体で完全ＨＩＶ−２ゲノムを含む一連のベクターを使用することにより、ＨＩＶ−２ＲＮＡを含まない以外はＨＩＶ−２ビリオンと同一のビリオンを産生する細胞株を創製することができる。これらのビリオンは細胞から容易に得ることができる。例えば、細胞を培養し、上清を回収する。所望用途に応じてビリオンを含む上清を使用するか、又はこれらのビリオンを勾配遠心、濾過等の標準技術により上清から分離することができる。
【００５０】
これらの弱毒化ビリオンはワクチンの製造に極めて有用である。これらのビリオンはＨＩＶ−２ビリオンに対する抗体応答を発生させるために使用することができ、これらのビリオンは内部にウイルスＲＮＡを含まない点を除いて実際のＨＩＶ−２ビリオンと同一であるので、製造したワクチンは特に有用であると思われる。ＨＩＶ−２ｇａｇ／ｐｏｌとプロテアーゼ遺伝子をコトランスフェクトし、別のウイルスからのｅｎｖ遺伝子を含む細胞株から産生させたシュードタイプ化ビリオンもこの他のウイルスに対するワクチンを製造するのに有用であると思われる。例えば、ＳＩＶｅｎｖベクターはＳＩＶに対する抗体応答を誘発することが可能なＳＩＶｅｎｖをもつウイルス粒子を細胞内で産生するが、この粒子は他のＳＩＶタンパク質又はＳＩＶＲＮＡがないため、病原性をもたない。
【００５１】
突然変異法
当業者に周知の相同組換え法によりＨＩＶ−２に突然変異を導入することができる。例えば、相同ＨＩＶ−２配列に挟まれた突然変異配列を含むベクター、好ましくはプラスミドベクターと共にＨＩＶ−２ゲノムＲＮＡをトランスフェクトする。突然変異配列は欠失、挿入又は置換を含むことができ、いずれも日常的技術により構築できる。挿入としては選択マーカー遺伝子が挙げられ、例えばβ−ガラクトシダーゼ活性により組換えウイルスを選択するための選択マーカー（例えばｌａｃＺ）が挙げられる。
【００５２】
欠失又は突然変異が必要な塩基数は多様である。例えば、パッケージング能を低下させるためにはＨＩＶ−２の所定２８塩基対欠失で十分である。しかし、この領域のもっと小さな欠失でもパッケージング効率を低下させることができる。実際に、この領域の約５、１０、１５、１７、１８、１９、２０、２５、２６又は２７塩基程度の小さな欠失で有効なパッケージング能を失わせることができると予想される。突然変異としては配列番号１のフラグメント又は５ヌクレオチド長以上のその変異体の欠失又は変異が挙げられる。このようなフラグメントは内部フラグメントであり、即ち配列番号１の末端ヌクレオチドを含まない配列番号１内の５ヌクレオチド以上が欠失している。あるいは、突然変異は配列番号１の任意位置から選択される１７ヌクレオチド長以上のフラグメント又はその末端フラグメントを含むその変異体の欠失又は変異でもよい。あるいは、上述のようにもっと大きな欠失を組込んでもよい。特定欠失の寸法は本明細書の開示に基づいて当業者が容易に決定することができる。
【００５３】
当分野で周知の数種の技術により必須遺伝子を機能的に不活性にしてもよい。例えば、欠失、置換又は挿入、好ましくは欠失によりこれらの遺伝子を機能的に不活性にすることができる。欠失は遺伝子を部分的に除去してもよいし、遺伝子全体でもよい。例えば、ヌクレオチドを１個だけ欠失させてフレームシフトしてもよい。しかし、欠失は大きいほうが好ましく、例えばコーディング配列と非コーディング配列合計の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％（あるいは絶対数で言えば、少なくとも１０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも１０００ヌクレオチド）とする。遺伝子全体とフランキング配列の一部を除去することが特に好ましい。挿入配列としては以下に述べる異種遺伝子が挙げられる。
【００５４】
異種遺伝子及びプロモーター
異種遺伝子即ちＨＩＶ−２ゲノムに存在する以外の遺伝子をもつように本発明のベクター又はウイルスを改変してもよい。特に、本発明はＨＩＶ−２キャプシドにベクターをパッケージングさせるために十分なＨＩＶ−２由来配列をもつベクターを提供する。これらのベクターは１個以上のＨＩＶ−２遺伝子に突然変異又は欠失を組込んだＨＩＶ−２ゲノム由来ベクターでもよいし、ＨＩＶ−２パッケージング配列を組込むように改変した他の発現ベクターに由来するものでもよい。「異種遺伝子」なる用語はＨＩＶ−２ゲノムに存在する以外の任意遺伝子を意味する。異種遺伝子は野生型遺伝子の任意対立遺伝子変異体でもよいし、突然変異遺伝子でもよい。「遺伝子」なる用語は少なくとも転写可能な核酸配列を意味する。従って、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡをコードする配列がこの定義に含まれる。これらの配列はプロモーターに対してセンス方向でもアンチセンス方向でもよい。アンチセンス構築物は周知技術により細胞で遺伝子発現を阻止するため使用することができる。ｍＲＮＡをコードする配列は５’及び／又は３’転写非翻訳フランキング配列の一部又は全部を天然又は天然以外の方法で翻訳コーディング配列と関連させた形で含む場合がある。場合により、転写配列に通常関連する転写制御配列（例えば転写停止シグナル、ポリアデニル化部位及び下流エンハンサーエレメント）も含んでいてもよい。
【００５５】
異種遺伝子は例えばＨＩＶ−２配列に挟まれた異種遺伝子をもつプラスミドベクターとＨＩＶ−２株の相同組換えにより例えばＨＩＶ−２に挿入することができる。異種遺伝子は当分野で周知のクローニング技術を使用してＨＩＶ−２配列を含む適切なプラスミドベクターに導入することができる。異種遺伝子はＨＩＶ−２ベクターの任意位置に挿入することができる。必須ＨＩＶ−２遺伝子に異種遺伝子を挿入することが好ましい。ベクターはＨＩＶ−２ゲノムに由来するが、異種遺伝子をパッケージング及び発現できるようにするためにＨＩＶ−２ゲノムの最小配列までＨＩＶ−２遺伝子の１、２又は数個を欠失しているものが好ましい。
【００５６】
異種遺伝子の転写配列は哺乳動物細胞で異種遺伝子を発現させる制御配列に機能的に連動していることが好ましい。「機能的に連動」なる用語は記載する成分がその所期方法で機能できるような関係にある配置を意味する。制御配列に適合可能な条件下でコーディング配列を発現できるようにコーディング配列に「機能的に連動」した制御配列をライゲートする。
【００５７】
制御配列は異種遺伝子を発現させるプロモーターと転写終結シグナルを含む。プロモーターは哺乳動物、好ましくはヒト細胞で機能的なプロモーターから選択される。プロモーターは真核遺伝子のプロモーター配列に由来するものを利用できる。例えば、異種遺伝子が発現される細胞のゲノムに由来するプロモーターを利用できる。真核プロモーターについては、遍在的に機能するプロモーター（例えばβ−アクチン、チューブリンのプロモーター）でもよいし、あるいは組織特異的に機能するプロモーター（例えばピルビン酸キナーゼの遺伝子のプロモーター）でもよい。更に、特定刺激に応答するプロモーター（例えばステロイドホルモン受容体に結合するプロモーター）でもよい。例えばモロニーマウス白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＭＭＬＶＬＴＲ）プロモーターやＨＩＶ−２遺伝子のプロモーター等のウイルスプロモーターも使用できる。
【００５８】
ＨＩＶ−２ＬＴＲプロモーターと、ＬＴＲプロモーター領域のエレメントを含むプロモーターが特に好ましい。発現カセットは更に第１のプロモーター及び第１の異種遺伝子と逆又は同一方向で順に機能的に連動した第２のプロモーターと第２の異種遺伝子を加えてもよく、前記第２のプロモーターと第２の異種遺伝子は第１のプロモーター及び第１の異種遺伝子と同一又は異なる。このように１対のプロモーター／異種遺伝子構築物を使用し、同一又は異なるプロモーターの制御下に同一でも異なっていてもよい異種遺伝子対を発現させてもよい。更に、第１の異種遺伝子の産物により適切な生理的条件下で第２の異種遺伝子を（又は逆に第２の異種遺伝子の産物で第１の異種遺伝子を）調節してもよい。
【００５９】
発現カセットは当業者に公知の日常的クローニング技術を使用して構築することができる（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ−ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ参照）。
【００６０】
細胞の半減期中に異種遺伝子の発現レベルを調節できるようにプロモーターを誘導型にすると有利な場合もある。誘導型とはプロモーターを使用して得られる発現レベルを調節できることを意味する。例えば、２種以上の異種遺伝子をベクター又はＨＩＶ−２ゲノムに挿入する好適態様では、第１のプロモーターは第２のタンパク質の発現に応答して発現を調節したい異種遺伝子を誘導するプロモーターを含む。第２のプロモーターは第２のタンパク質の発現を誘導する強力なプロモーター（例えばＣＭＶＩＥプロモーター）を含む。
【００６１】
更に、他の調節配列、例えばエンハンサー配列の付加によりこれらのプロモーターの任意のものを改変してもよい。上記２種以上の異なるプロモーターからの配列エレメントを含むキメラプロモーター（例えばＭＭＬＶＬＴＲ／ＨＩＶ−２融合プロモーター）を使用してもよい。
【００６２】
異種遺伝子は例えば細胞分裂の調節に関与するタンパク質をコードすることができ、このようなタンパク質としては例えばマイトジェン増殖因子、サイトカイン（例えばα−、β−もしくはγ−インターフェロン、ＩＬ−１、ＩＬ−２等のインターロイキン、腫瘍壊死因子、又はインスリン様増殖因子ＩもしくはＩＩ）、タンパク質キナーゼ（例えばＭＡＰキナーゼ）、タンパク質ホスファターゼ及び上記の任意のものの細胞受容体が挙げられる。異種遺伝子は細胞代謝経路に関与する酵素、例えばアミノ酸生合成又は分解に関与する酵素（例えばチロシンヒドロキシラーゼ）又はこのような経路の調節に関与するタンパク質（例えばタンパク質キナーゼ及びホスファターゼ）をコードするものでもよい。異種遺伝子は更に転写因子又はその調節に関与するタンパク質、膜タンパク質（例えばロードプシン）、構造タンパク質（例えばジストロフィン）又は熱ショックタンパク質（例えばｈｓｐ２７、ｈｓｐ６５、ｈｓｐ７０及びｈｓｐ９０）をコードするものでもよい。
【００６３】
異種遺伝子は治療用ポリペプチド又はその機能もしくは機能欠失が疾患過程に重要であり得るポリペプチドをコードすることが好ましい。例えば、パーキンソン病の治療にはチロシンヒドロキシラーゼを使用することができ、眼疾患の治療にはロードプシンを使用することができ、筋ジストロフィーの治療にはジストロフィンを使用することができ、虚血性ストレスに関連する心臓及び脳疾患を治療するに熱ショックタンパク質を使用することができる。治療用ポリペプチドとしては更にリシン等の細胞毒性ポリペプチドや、例えばウイルスによる酵素プロドラッグ治療又は遺伝子による酵素プロドラッグ治療で使用される細胞毒性化合物に前駆体プロドラッグを変換することが可能な酵素も挙げられる。後者の場合には、酵素がその細胞表面誘導に適したシグナル配列、好ましくは酵素を細胞膜に固定したままで細胞表面の外側に暴露させるシグナル配列をもつようにすることが望ましいと思われる。
【００６４】
異種遺伝子はワクチンとして使用する抗原性ポリペプチドをコードするものでもよい。このような抗原性ポリペプチドは病原生物（例えば細菌やウイルス）や腫瘍に由来するものが好ましい。
【００６５】
異種遺伝子はマーカー遺伝子（例えばβ−ガラクトシダーゼ又は緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子）や、その産物が他の遺伝子の発現を調節する遺伝子（例えば転写調節因子）でもよい。
【００６６】
遺伝子治療及び他の治療用途には多重遺伝子の投与を大いに必要とする場合がある。多重遺伝子の発現は各種症状の治療に有利であると思われる。
【００６７】
投与
従って、本発明の方法のベクター、宿主細胞及びウイルスは治療を必要とするヒト又は動物に治療遺伝子を送達するために使用することができる。
【００６８】
遺伝子治療投与法の１例は上述のように本発明のベクターに治療遺伝子を挿入する。その後、異種遺伝子とＨＩＶ−２パッケージング配列を含むベクターとパッケージング欠損ＨＩＶ−２ベクターを細胞にｉｎ ｖｉｔｒｏコトランスフェクトする。細胞を培養して産生したＨＩＶ−２ウイルスキャプシドにＨＩＶ−２パッケージング配列を介して異種遺伝子ベクターをパッケージングする。このようなＨＩＶ−２システムでは特異的パッケージング競合が起きることが本発明により判明したので、望ましくないヘルパーウイルス配列のパッケージングを他のレトロウイルスシステム（例えばＨＩＶ−１システム）よりも著しく厳密に排除することが可能である。得られた組換えウイルスを医薬的に許容可能なキャリヤー又は希釈剤に組合せると、医薬組成物を製造することができる。適切なキャリヤー及び希釈剤としては等張食塩水（例えばリン酸緩衝食塩水）が挙げられる。発生する免疫応答を高めるようにアジュバントを加えると、異種遺伝子が抗原ペプチド又はタンパク質をコードするワクチン組成物を処方することができる。組成物は非経口、筋肉内、静脈内、皮下、眼内又は経皮投与用に処方することができる。
【００６９】
医薬組成物は遺伝子治療用治療遺伝子を含むウイルスを細胞の適切な領域に組込むことができるように投与する。異種遺伝子構築物を含むＨＩＶ−２キャプシドは多数の異なる型の非分裂細胞にＨＩＶ−２を感染させることができるため、特に有用である。
【００７０】
ウイルス投与量は１０^４〜１０^１０ｐｆｒ、好ましくは１０^５〜１０^８ｐｆｕ、より好ましくは 約１０^６〜１０^７ｐｆｕである。注射する場合には、医薬的に許容可能な適切なキャリヤー又は希釈剤にウイルス１〜１０μｌを加えて投与するのが一般的である。
【００７１】
記載する投与経路及び剤形は指針に過ぎず、当業者は任意特定患者及び症状に最適な投与経路及び剤形を容易に決定することができよう。
【００７２】
アッセイ方法
本発明のウイルスは種々の科学研究法でも使用することができる。従って、本発明の別の側面は哺乳動物細胞における遺伝子機能のｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏアッセイ方法に関する。異種遺伝子の機能は、
（ａ）ＨＩＶ−２キャプシドとＨＩＶ−２パッケージングシグナルを介してパッケージングされた異種遺伝子をもつベクターを含むウイルス粒子を産生させること、
（ｂ）得られたウイルスを哺乳動物細胞株に導入すること、および
（ｃ）前記哺乳動物細胞株における前記異種遺伝子の発現の効果を測定することからなる方法により決定することができる。
【００７３】
例えば、細胞株は細胞分裂に温度感受性欠損をもつものとすることができる。本発明の異種遺伝子を含むＨＩＶ−２株を欠損細胞株に導入して細胞株を制限温度で増殖させると、当業者は異種遺伝子が細胞分裂の欠損を相補できるか否かを容易に調べることができる。同様に、他の公知方法を使用して異種遺伝子の発現が哺乳動物細胞株で観測可能な突然変異表現型を補正できるか否かを調べることもできる。
【００７４】
この方法は遺伝子によりコードされるタンパク質のどの領域が突然変異表現型の復元に関与しているかを確かめるために異種遺伝子の系統的突然変異誘発を実施するためにも使用することができる。
【００７５】
この方法は所謂「遺伝子ノックアウト」をもつ動物（例えばマウス）で使用することもできる。本発明の突然変異ＨＩＶ−２株を使用して野生型異種遺伝子を動物に導入し、当分野で公知の各種行動、組織化学又は生化学アッセイを使用して動物に及ぼす効果を測定することができる。あるいは、突然変異異種遺伝子を野生型又は「遺伝子ノックアウト」動物に導入し、疾患関連病態が誘導されるか否かを調べることができる。本発明のウイルス粒子を使用してアンチセンスヌクレオチドを導入し、実際にノックアウト動物を創製することもできる。
【００７６】
あるいは、本発明の突然変異ＨＩＶ−２ウイルスを使用してターゲット細胞で被験遺伝子を発現させた後、試験物質と共にインキュベートし、試験物質がターゲット遺伝子に及ぼす効果をモニターすることもできる。
【００７７】
従って、本発明の方法は特に疾患に関与する遺伝子の機能試験に使用することができる。
【００７８】
以下、実施例により本発明を説明するが、以下の実施例は例証に過ぎず、発明を限定するものではない。
【実施例１】
【００７９】
主スプライスドナーの上流に位置する領域の欠失はＣＯＳ−１細胞の一過性トランスフェクションにおけるパッケージング効率の有意低下をもたらすことが示されている（ＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：４１３３−４１３７（１９９７）；ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３０２３−３０３１（１９９９））。ＨＩＶ−２における主パッケージングシグナル（Ψ）の正確な位置についてはまだ多少の論争がある。このように合意に達していないのは各種突然変異の表現型がＨＩＶ−１系で報告されているほど重大でなかったり、欠失自体が大き過ぎるために個別シグナルを同定できていないという事実を反映している。そこで、従来の研究で特性決定されていない領域を分析するために付加欠失を導入した。
【００８０】
ｐＳＶＲはサルウイルス４０の複製起点を含むＨＩＶ−２のＲＯＤ株の感染性プロウイルスクローンである（ＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ（１９９７），前出）。制限部位を記載する場合にはウイルスＲＮＡの最初のヌクレオチドを基準にナンバリングする。ＨＩＶ−２のサブクローンであるｐＧＲＡＸＳ（ＫａｙとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：５８７７−５８８５（１９９８））にＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １５４：３６７−３８２（１９８７））に従って部位特異的突然変異誘発により５’リーダーの欠失突然変異を導入した。
【００８１】
プロウイルス構築物ｐＳＶＲΔ１、２、３及び４は５’リーダー領域に欠失を含み、ＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：４１３３−４１３７（１９９７）に記載されている。ｐＳＶＲΔ１とｐＳＶＲΔ２はいずれも主スプライスドナーの上流の３５９〜３８５位と３９２〜４３４位を夫々欠失している。ｐＳＶＲΔ３とｐＳＶＲΔ４はいずれも主スプライスドナーの下流の４９９〜５２６位と４９４〜５３３位を夫々欠失している。
【００８２】
コンピューターモデリングにより得られる入手可能な構造情報とＨＩＶ−２リーダーＲＮＡの生化学分析に基づいて付加欠失を設計した（ＢｅｒｋｈｏｕｔとＳｃｈｏｎｅｖｅｌｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１：１１７１−１１７８（１９９３）；Ｄａｍｇａａｒｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２６：３６６７−３６７６（１９９８））。
【００８３】
第１の欠失Ψ１は４４５〜４６２位からの予想ステムループを除去するように設計した。これらの位置は突然変異誘発オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣ−３’を使用して欠失させた。ヌクレオチド３８０〜４０８に相当する第２の欠失ＤＭは欠失ｐＳＶＲΔ１及びｐＳＶＲΔ２とオーバーラップする（図２）。ＤＭ欠失は突然変異誘発オリゴヌクレオチド５’−ＧＧＣＡＧＴＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＧＣ−３’を使用して導入した。Ψ１及びＤＭの欠失領域はいずれも主スプライスドナー（４７２位）の上流に位置する。欠失を含む得られたサブクローンｐＧＲＡＸΨ１及びｐＧＲＡＸＤＭからの配列を次にＡａｔＩＩ（１３８４位）−ＸｈｏＩ（２０３２位）フラグメントに置換することによりプロウイルスに導入した。Ψ１オリゴヌクレオチドを使用してｐＧＲＡＸＤＭを突然変異させ、これをプロウイルスに導入することにより、両者領域の二重欠失突然変異体ＤＭ／Ψ１も構築した。
【００８４】
これらの突然変異を含むプロウイルスクローンを使用してＣＯＳ−１細胞に一過性トランスフェクトした。次に、細胞質及びビリオンフラクションからのＲＮＡをＲＰＡにより分析し、パッケージングに及ぼす欠失の効果を検討した。Ψ１突然変異はパッケージング効率に非常に弱い効果しかなかったが、ＤＭ欠失は子孫ビリオンに組込まれるＲＮＡのレベルに多大な効果があり（表１）、野生型ＨＩＶ−２のレベルの約２０％までパッケージングが低下すると従来記載されているｐＳＶＲΔ２欠失よりも著しく大きな効果があった。これはウイルスのコアΨエレメントを含むＤＭ突然変異により欠失させた領域に一致する。更に、二重突然変異も同様の表現型であり、ＤＭ欠失が重大な欠損を生じ、Ψ１欠失はパッケージングに付加欠損を生じないことが確認された。野生型に比較して突然変異体ではパッケージングに利用可能なＲＮＡの明白な欠失もない。
【００８５】
【表１】

【００８６】
パッケージングに及ぼす欠失の上記効果が異常なタンパク質産生に起因するものでないことを裏付けるために、野生型又は突然変異プロウイルスをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞を^３５Ｓメチオニンで代謝標識し、ＨＩＶ−２感染個体からプールした免疫血清を使用して細胞及びビリオンフラクションからウイルスタンパク質を免疫沈降させた（ＭＲＣ ＡＩＤＳ試薬プロジェクト）。突然変異体を野生型プロウイルスと比較した処、タンパク質産生はこれらの欠失突然変異の影響を受けていなかった。細胞フラクションでは有意量のウイルスＧａｇ及びＥｎｖポリプロテイン前駆体が見られたが、これらの前駆体は上清中に存在するビリオンでは大部分が成熟タンパク質に分解していた。これは、これらの欠失に起因するウイルスタンパク質の翻訳後プロセシングの明白な欠損がないことを示している。従って、パッケージング欠損はパッケージングへのＧａｇポリプロテインの利用性の低下又は細胞表面からの粒子放出の欠損に起因するものでないと思われる。これらの所見はＨＩＶ−２キャプシド（ＣＡ）タンパク質に対するモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングでも確認され（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、培養上清中で野生型と突然変異体の逆転写酵素活性に有意差がないことを示す試験により更に裏付けられた。
【００８７】
モデルシステムで試験する突然変異は必ずしもｉｎ ｖｉｖｏと同一表現型をもつとは限らない。そこで、生理的近縁度の高い細胞型でウイルス複製に及ぼすΨ１とＤＭの効果を試験した。トランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞からの上清を下記のように調製し、これをレプリカーゼアッセイで使用してＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞に感染させた。上清中に存在する逆転写酵素活性によりビリオン粒子産生を経時的に測定した。野生型ウイルスを感染させた培養液は粒子産生の漸増を示し、感染後１４日（ｄｐｉ）にピークに達した。この時点から粒子産生は減少したが、これはアッセイに新鮮な細胞を加えないので生存感受性細胞集団が減少したためであると思われた。Ψ１突然変異体を感染させた細胞は中間複製表現型を示し、１４ｄｐｉに識別可能なピークは認められなかった。ＣＯＳ−１細胞でも同様の弱いパッケージング欠損が認められ、培養液に放出される感染性粒子が少ないためにウイルス伝播が遅れていた。単独及び二重突然変異体の場合の両者でＤＭ欠失を含むウイルスを感染させた培養液からのウイルス産生は著しく低減した。元々低い４ｄｐｉの初期粒子産生レベルから漸減し、２１ｄｐｉではバックグラウンドを上回る逆転写酵素活性レベルを殆ど測定できなくなった。これはウイルスが当初の接種材料を感染させた細胞よりも有効に伝播できなかったことを示している。更に、感染開始に成功していることは初期逆転写酵素活性値から明らかであるので、ＤＭ欠失がウイルス生活環の初期イベントを妨げるとは思われない。従って、ＤＭ欠失が許容性細胞に複製表現型をもたらすのは専らＲＮＡパッケージングの欠損に起因する。
【実施例２】
【００８８】
野生型ウイルスのコトランスフェクションはパッケージング効率を計算する際に突然変異体を野生型ウイルスに標準化することができるので、パッケージング試験中にＲＮＡレベルの内部コントロールとして使用されている（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７３：３０２３−３０３１（１９９９）；ＭｃＢｒｉｄｅとＰａｎｇａｎｉｂａｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１：２０５０−２０５８（１９９７））。同様の試験を行い、等量の野生型及び突然変異体プロウイルスをＣＯＳ−１細胞にコトランスフェクトし、結果をＲＰＡにより分析した。スプライスドナーの上流に位置する欠失をもつ突然変異体のパッケージング効率は単独トランスフェクトした場合に比較して常に低かった。競合に起因する最大のパッケージング低下はΨ１突然変異体で認められ、野生型に対する相対効率は約７０％から４０％まで低下した（図３）。ｐＳＶＲΔ１及びｐＳＶＲΔ２欠失突然変異体はいずれも小幅に低下したが、これらのウイルスは元々パッケージング欠損性が非常に高い。スプライスドナーの下流に位置する欠失であるｐＳＶＲΔ４もパッケージング自体への効果は弱いが、競合パッケージング効率の僅かな低下を示した。ＤＭ突然変異体のパッケージング効率は競合の不在下でも元々非常に低いので、変化の検出はアッセイの感度レベルを超えている。これらの所見に基づき、Ψ領域突然変異体はｄｅ ｎｏｖｏ合成したＧａｇをそれ自体のＲＮＡにシスターゲットする効率が野生型ＨＩＶ−２よりも低いと思われる。更に、無傷のΨ領域をもつ野生型ＨＩＶ−２ＲＮＡはこのＧａｇに競合し、突然変異体パッケージング効率を低下させる。
【００８９】
競合効果がΨ領域突然変異体のパッケージングを低減させるならば、野生型ＲＮＡのパッケージングの対応する増加があるか否かが論理的問題となる。これを検討するために、（下記のように）ＤＭ欠失とＧａｇ ＯＲＦの早期停止コドンを含むＨＩＶ−２プロウイルスｐＳＶＲＤＭΔＨを構築した。この停止突然変異を含むＨＩＶ−２ベクターがＲＮＡをビリオンに組込むことができない切断Ｇａｇポリプロテインを合成することは公知である（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ，１９９９，前出）。このようなベクターは野生型ＨＩＶ−２により有効にトランスパッケージングすることもできない。このウイルス又はそれ自体の全長Ｇａｇを形成することが可能なｐＳＶＲＤＭとの競合下の野生型ＨＩＶ−２ＲＮＡのパッケージングを比較するためにコトランスフェクション実験を実施した。細胞で利用可能なＧａｇの量は後者が２倍となるはずである。ＲＰＡにより分析した結果を示す（図４）。予想通り、全長Ｇａｇを形成することが可能なＤＭ突然変異体と競合下の野生型ＨＩＶ−２はこれを形成できないＤＭウイルスと競合させた場合の約２倍の効率でパッケージングされた。細胞質でパッケージングに利用可能な野生型ＲＮＡのレベルはどちらの場合も同一であるので、観測される効率の増加はＧａｇの存在量が２倍であるためであると考えられる。従って、Ｇａｇの利用性はＨＩＶ−２ＲＮＡパッケージングに制限的である。
【００９０】
野生型ＨＩＶ−２はパッケージング（シスパッケージングと言う）に用いるそのゲノムＲＮＡを選択するのに共翻訳法を使用するのでベクターを有効にトランスパッケージングできないことが知られている。他方、ＨＩＶ−１は有効にパッケージングすることができ、主スプライスドナーの下流のＨＩＶ−１のコアΨ領域の位置により可能になるストラテジーであるトランス作用性メカニズムを主に使用してパッケージングに用いるそのゲノムを選択している。競合実験の結果、競合させるＧａｇはＨＩＶ−２Ψ領域突然変異体により形成されたものであることが判明した。これはこのようなＧａｇがその鋳型ＲＮＡに有効にシスターゲットされていないのでトランス経路に利用可能であったことを意味する。ＨＩＶ−２Ψ領域突然変異体がヘルパーウイルスとして機能してＨＩＶ−２ベクターをトランスパッケージングできるか否かを試験するために、上記Ｇａｇに停止突然変異を含むベクターをＨＩＶ−２Ψ領域突然変異体にコトランスフェクトした。野生型ＨＩＶ−２をヘルパーウイルスとして使用した類似実験とは対照的に、試験した全ＨＩＶ−２Ψ領域突然変異体はベクターＲＮＡを有効にビリオンに組込むことができた。更に、スプライスドナーの下流に欠失をもつ突然変異体もベクターＲＮＡを有効にトランスパッケージングすることができた。
【００９１】
ｅｎｖ欠失ＨＩＶ−２プロウイルスｐＳＶＲΔＮＢ（後記）に由来するピューロマイシン耐性選択マーカーを含む新規ＨＩＶ−２ベクターを設計した。２種のベクターのいずれも親プラスミドと同一の欠失をｅｎｖにもち、この遺伝子座にｐｕｒｏ^ｒカセットを配置した。第１のベクターｐＳＶＲΔＮＢＰｕｒｏΔＨはＲＰＡ試験で使用したｐＳＶＲΔＨと同一の早期停止コドンを含むようにした。第２のベクターｐＳＶＲΔＮＢＰｕｒｏΔＥはｇａｇ及びｐｏｌ ＯＲＦの大部分を除去する大きな欠失を含むようにした。競合効果を評価するために、ＤＭ欠失を含むｐＳＶＲΔＮＢＤＭに親ｐＳＶＲΔＮＢを比較した。使用した構築物の構造を図５に示す。ベクターをＶＳＶ−Ｇ糖蛋白質でシュードタイプ化し、ＨｅＬａ ＣＤ４^＋ＬＴＲ−βｇａｌ細胞に形質導入するその能力を評価した。
【００９２】
ベクター及びヘルパープラスミド各５μｇとＶＳＶ−Ｇ発現構築物ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧ（下記参照）２μｇ又は空のベクターを含むＣＯＳ−１一過性トランスフェクション（下記参照）から濃厚上清を調製した。次に、１２穴プレートでＨｅＬａ ＣＤ４^＋ＬＴＲ−βｇａｌ細胞が２０％コンフルエントに達した時点で等量のＲＴ活性を含むＣＯＳ−１上清を形質導入した。翻訳後３日にピューロマイシンを含む選択培地を細胞に加えた。全モック形質導入細胞が死滅するまで選択を持続した。選択後にエンベロープ陰性形質導入対照細胞にはピューロマイシン耐性が認められず、ＨＩＶ−２ Ｅｎｖ糖タンパク質の機能を失わせるにはΔＮＢ欠失で十分であると思われた。細胞を記載通りに固定及び染色し、コロニー数を計数し、ＲＴ活性１００００単位当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／１００００ＲＴＵ）として結果を表した。
【００９３】
ＤＭ欠失構築物は野生型よりもはるかに有効なヘルパーであった。これは上記パッケージングからのデータに一致している。更に、ｇａｇに停止突然変異を含むベクターと欠失を含むベクターには差があり、前者のほうがはるかに高力価であった。力価の差がベクターのパッケージング効率の差に対応することを確認するために、類似ＣＯＳ−１細胞トランスフェクションをＲＰＡにより評価した。ベクターの相対パッケージング効率は確かにベクター力価に対応し、最高効率の組み合わせはｇａｇ ＯＲＦに大きな欠失をもたないベクターをＤＭ欠失ヘルパーでパッケージングする場合であった。
【００９４】
以上の結果から、無傷のΨを含むＨＩＶ−２ヘルパーはウイルスが共翻訳パッケージングメカニズムを使用するのでベクター系で有効に機能することができない。他方、Ψ欠失ヘルパーを使用すると、制限因子であるＧａｇポリプロテインの競合により比較的高力価のベクター調製物を生産することができる。
【実施例３】
【００９５】
各種ピューロマイシン耐性ベクター間の力価とパッケージング効率の両者の相違はｇａｇ ＯＲＦに存在するシス作用性シグナルに関係があると思われる。野生型ＨＩＶ−２がベクターＲＮＡをパッケージングする場合にこのような領域を含む効果は従来認められていない（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９９），前出）。ＤＭ突然変異体が各種長さのｇａｇ ＯＲＦを含む一連のＨＩＶ−２ベクターをパッケージングする能力を試験した。いずれもｐｏｌＯＲＦを欠失させた。等量（５μｇ）のベクターとｐＳＶＲＤＭをＣＯＳ−１細胞にトランスフェクトし、ＲＮＡパッケージングをＲＰＡにより評価した（図６）。
【００９６】
従来示されているように、無傷のｇａｇ ＯＲＦを含むＨＩＶ−２ベクターｐＳＶＲΔｐｏｌはそれ自体のＲＮＡを有効にパッケージングすることができるので陽性対照として使用する。他方、早期停止コドンを含むｐＳＶＲΔＨΔｐｏｌは程度は低いが、ＤＭ突然変異体ヘルパーにより提供されるＧａｇにより有効にパッケージングされる。この構築物は完全ｇａｇＯＲＦを含むので、これに含まれるシス作用性シグナルをもつ。ｐＳＶＲΔｐｏｌｎｃｍは上記構築物と同程度までパッケージングされるので、完全ｇａｇＯＲＦのリボソームスキャニングは有効なベクターパッケージングに不要であると思われる。構築物ｐＳＶＲΔＨＸ及びｐＳＶＲΔＡＸはいずれも上記構築物と同程度までパッケージングされるので、ＭＡの３’領域までの配列を除去してもベクターパッケージングに有害な影響はない。他のベクターと異なり、ｐＳＶＲΔＸはＤＭヘルパーウイルスにより非常に不十分にしかパッケージングされなかった。このベクターはＡＴＧ（５３３位）の近傍からほぼ完全にｇａｇＯＲＦを欠失する。これは、ＭＡ特異的にｇａｇの５’部分にパッケージングを増強するシグナルがあるらしいこと、あるいはリーダー又はｇａｇ自体に存在するＲＰＡ構造の正確なフォールディングを促進するにはこの領域のリボソームスキャニングが重要であるらしいことを示している。このように翻訳とパッケージングはＨＩＶ−２感染細胞に関連していると思われる。
【実施例４】
【００９７】
レンチウイルス系の単独欠失によりウイルスＲＮＡのパッケージングが完全に不可能になることはない。これはパッケージングシグナルの機能的冗長性に起因すると思われる。従って、予想治療ベクター調製物のヘルパーウイルス配列による汚染は重大なバイオアッセイの問題である。Ｇａｇレベルが制限因子であるらしいという事実が競合によりヘルパーＲＮＡを完全に除去できるか否かを検討するために、停止コドンを含む増加量のベクターｐＳＶＲΔＨΔｐｏｌと一定量のｐＳＶＲ又はｐＳＶＲＤＭをＣＯＳ−１細胞にコトランスフェクトし、パッケージングに及ぼす効果をＲＰＡにより分析した（図７）。いずれの場合も必要に応じて補完量の非ＨＩＶ−２スタッファーＤＮＡとしてｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋をトランスフェクトし、合計ＤＮＡ使用量を２１μｇにした。
【００９８】
ベクターはＤＮＡ欠失ウイルスによってのみ有効にトランスパッケージングされた。ベクター：ヘルパー比が２０：１でも野生型ＨＩＶ−２はベクターＲＮＡを有効にパッケージングせず、ＨＩＶ−２では翻訳とパッケージングの関係が確かに非常に強いと思われた。他方、ｐＳＶＲＤＭによるベクターパッケージング量はベクター：ヘルパー比が増加するにつれてゆっくりと増加する。更に、両者を等量でトランスフェクトした場合に比較して５：１でもベクターパッケージング効率は低下する。これは存在する制限量のＧａｇではパッケージングできない膨大な量のベクターＲＮＡが細胞質に存在するためである。逆に、ベクターパッケージングの明白な増加の原因はパッケージングされるｐＳＶＲＤＭ ＲＮＡの量の減少である。従って、ヘルパーとベクターのビリオン：細胞質ＲＮＡ比が変化し、ベクターのパッケージング効率の明白な増加を生じる。これらの実験のビリオンフラクションにおけるｐＳＶＲＤＭ ＲＮＡのレベルはゼロまで低下しないが、野生型ＨＩＶ−２が高いパッケージングレベルを維持しているのに対してバックグラウンドぎりぎりで測定可能なレベルに止まる。従って、これらの実験はＨＩＶ−２ベクター調製物に由来するＤＭ欠失ヘルパーのパッケージング力価を完全に測定することが理論的に可能であることを示している。
【００９９】
方法：
プラスミド構築。ｐＳＶＲはサルウイルス４０の複製起点を含むＨＩＶ−２のＲＯＤ株の感染性プロウイルスクローンであり、従来記載されている（ＭｃＣａｎｎとＬｅｖｅｒ（１９９７））。制限部位を記載する場合にはウイルスＲＮＡの最初のヌクレオチドを基準にナンバリングする。５’リーダー領域に欠失を含むプロウイルス構築物ｐＳＶＲΔ１、２、３及び４は従来記載されている。これらと新規に導入した欠失の位置を示す（図２）。５’リーダーの欠失突然変異は従来記載されているＨＩＶ−２のサブクローンであるｐＧＲＡＸＳ（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９８））にＫｕｎｋｅｌ法（Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７））に従って部位特異的突然変異誘発により導入した。Ψ１欠失の構築に使用した突然変異誘発オリゴヌクレオチドは５’−ＧＧＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＣＧＧＧＧＴＧＡＡＧＧＴＡＡＧＴＡＣＣ−３’であり、ＤＭ欠失には５’−ＧＧＣＡＧＴＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＧＧＧＣＣＧＡＧＧＴＡＣＣＡＡＡＧＧＣ−３’を使用した。欠失を含む得られたサブクローンｐＧＲＡＸΨ１及びｐＧＲＡＸＤＭからの配列を次にＡａｔＩＩ（１３８４位）−ＸｈｏＩ（２０３２位）フラグメントに置換することによりプロウイルスに導入した。Ψ１オリゴヌクレオチドを使用してｐＧＲＡＸＤＭを突然変異させ、これをプロウイルスに導入することにより、ＤＭ／Ψ１二重突然変異体も構築した。
【０１００】
ＨＩＶ−２ベクターｐＳＶＲΔＨはｇａｇ ＯＲＦのキャプシド（ＣＡ）領域に早期停止コドンを含むｐＳＶＲ由来ベクターである。これはＨｉｎｄＩＩＩ部位（１４５８位）の消化後にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗフラグメントを再充填した後にＤＮＡの再ライゲーションにより作製した。ｐＳＶＲＤＭΔＨはリーダー領域のＤＭ欠失とｐＳＶＲΔＨからの停止コドンを含み、ｐＳＶＲΔＨからのＥｃｏＲＶ（１１０１位）−ＸｈｏＩ（２０３２位）フラグメントをｐＧＲＡＸＤＭに導入することにより作製した。次にこのプラスミドからのＡａｔＩＩ（１１４４４位）−ＸｈｏＩ（２０３２位）フラグメントを使用してｐＳＶＲの同一領域を置換した。ｐＳＶＲΔＸは突然変異誘発オリゴ５’−ＧＧＡＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＡＧＡＡＡＣＴＣＣＧ−３’を使用して上述のように部位特異的突然変異誘発により５５３位の人工ＸｂａＩ部位に導入することにより作製した。次いでＸｂａＩで部分消化してｇａｇ及びｐｏｌＯＲＦ（５５３〜５０６７）をほぼ完全に除去した。ＨＩＶ−２ベクターｐＳＶＲΔＡＸ、ｐＳＶＲΔＨＸ、ｐＳＶＲΔｐｏｌ、ｐＳＶＲΔＨΔｐｏｌ及びｐＳＶＲΔｐｏｌｎｃｍは従来記載されている（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９９））。要約すると、ｐＳＶＲΔＡＸはＡｃｃＩ（９１２位）〜ＸｂａＩ（５０６７位）に欠失を含む。ｐＳＶＲΔＨＸはＨｉｎｄＩＩＩ（１４５８位）〜ＸｂａＩ（５０６７位）に欠失を含む。ｐＳＶＲΔｐｏｌはＸｈｏＩ（２０３２位）〜ＸｂａＩ（５０６７位）に欠失を含む。ｐＳＶＲΔＨΔｐｏｌはＨｉｎｄＩＩＩ部位の５’突出末端をＫｌｅｎｏｗポリメラーゼで充填して平滑末端を再ライゲートしてｐＳＶＲΔｐｏｌのＨｉｎｄＩＩＩ部位（１４５８位）に翻訳停止コドンを導入することにより構築した。ｐＳＶＲΔＮＢは次のように構築した。ｐＳＶＲからＥｈｅＩフラグメント（３０６〜５８６４）を除去してｐＳＶＲΔＥを作製した。次にこれをＮｓｉＩとＢｓｔＸＩで消化し、ＲＲＥとｒｅｖ及びｔａｔ ＯＲＦを無傷のままにしてｅｎｖ遺伝子の５５０ｂｐフラグメント（６３６９〜６９１９）を欠失させた。上述のようにＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後にこの位置にＳａｌＩ部位を含むＤＮＡリンカーをライゲートし、ｐＳＶＲΔＥＮＢＳａｌＩを作製した。次にこのプラスミドにＥｈｅＩフラグメントを再導入し、ｐＳＶＲΔＮＢを得た（図５）。ｐＳＶＲΔＮＢＤＭ（図５）はｐＳＶＲΔＮＢのＡａｔＩＩ−ＸｈｏＩ（１１４４４〜２０３７）領域をｐＳＶＲＤＭからの同一領域で置換することにより作製した。ｐＳＶＲΔＮＢＰｕｒｏΔＥとｐＳＶＲΔＮＢＰｕｒｏΔＨ（図５）はいずれもｐＳＶＲΔＮＢに由来し、プラスミドＫＳＩＩＳＶＰｕｒｏからのＳａｌＩフラグメントをリンカー部位に導入した後、夫々ＥｃｏＲＶフラグメント（１１０１−２９３９）を除去するか又は前記フラグメントをｐＳＶＲΔＨの同一領域で置換した。ｐＣＭＶ−ＶＳＶＧはｐＣＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のコンテキストでＶＳＶ Ｇ糖タンパク質を含む。ＨＩＶ−２プロウイルス配列に由来する全プラスミドは組換えを避けるように３０℃又は室温でＴＯＲＦ’１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）大腸菌中で増殖させた。他の全プラスミドは標準条件下でＤＨ５α大腸菌中で増殖させた。
【０１０１】
ＲＮアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）で用いるアンチセンスリボプローブの作製に使用したプラスミドは次のように作製した。プラスミドＫＳ２ΨＫＥ及びＫＳ２ＥＳは従来記載されている（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９８）；ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９９））。これらのプラスミドは夫々３０６〜７５１位及び４９１５〜５２８４位に対応するＨＩＶ−２ゲノムの領域にアンチセンスの転写産物を産生し、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＫＳＩＩ＋転写ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のコンテキストに含まれる。プラスミドＫＳ２ΨＥＰはＥｈｅＩ（３０６位）〜ＰｓｔＩ（−２８６位）のウイルス配列にアンチセンスのプローブを産生し、同様にＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのコンテキストに含まれる。プラスミドＳＫＨ２ＣＡはｇａｇ ＯＲＦのＣＡ領域に対してアンチセンスのプローブを産生する。Ｔ３（ＳＫＨ２ＣＡの場合にはＴ７）、ＲＮＡポリメラーゼ及びリボプローブ転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して直鎖化鋳型ＤＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を実施した。
【０１０２】
細胞培養及びトランスフェクション。ＣＯＳ−１サル類上皮細胞は１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えたダルベッコの改変イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で培養した。ＤＥＡＥデキストラン法（Ｍｏｒｔｌｏｃｋら，１９９３）により直径１０ｃｍ皿でＤＮＡ合計１０μｇを細胞にトランスフェクトした。４４〜４８時間後に細胞と上清を回収し、ウイルス産生を逆転写酵素アッセイ（Ｐｏｔｔｓ，１９９０）により評価した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は１０％ウシ胎仔血清、ペニシリン及びストレプトマイシンを加えたＲＰＭＩ−１０培地（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で培養した。ＨｅＬａ ＣＤ４^＋ＬＴＲ−βｇａｌ細胞は記載通り（Ｐａｇｅら，１９９０）にダルベッコの改変イーグル培地で培養した。
【０１０３】
タンパク質分析。ＣＯＳ−１細胞はトランスフェクション後４４〜４８時間に^３５Ｓメチオニン（＞１０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で代謝標識した。ウイルスタンパク質を細胞及びビリオンフラクションから回収し、従来記載されているように可視化した（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９９））。
【０１０４】
Ｔ細胞複製アッセイ。トランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞からの上清１０ｍｌをトランスフェクション後４８時間に抽出し、０．４Ｍ ＮａＣｌ中３０％ポリエチレングリコール８０００を５ｍｌ入れたチューブに０．４５μＭフィルターを通して加えた。内容物を転倒により混合し、４℃で一晩放置した。翌日４℃で４０分間卓上遠心ローターで２０００ｒｐｍで遠心分離することによりビリオンをペレット化した。次にペレットをＴＮＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ ｐＨ７．５）０．５ｍｌに再懸濁し、１０μｌ試料を抽出して逆転写酵素アッセイにより粒子産生を測定した。次に残余をＴＮＥ中２０％スクロース０．５ｍｌに重層した。４℃で２時間Ｂｅｃｋｍａｎ ＴＬＡ−４５ローターで４００００ｒｐｍで遠心分離することによりビリオンを精製した。ペレット化したウイルスをＲＰＭＩ−１０培地１００μｌに再懸濁し、Ｕ底９６穴培養プレートの各ウェルに５００００個のＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞を加え、５０００００単位に等価の量の逆転写酵素活性を最終容量２００μｌで加えた。所与の任意ウェルに１種ずつのトランスフェクション上清からのウイルスを加え、どの段階でもウイルスをプールしなかった。複製後３〜４日毎に逆転写酵素アッセイを行った。１０μｌ試料を各ウェルからアッセイ用に抽出し、更に４０μｌを抽出した。次に元の容量になるまで新鮮な培地を加えたが、アッセイ中に新鮮なＪｕｒｋａｔ細胞を追加しなかった。
【０１０５】
ＲＮＡ単離。従来記載されているように細胞質及びビリオンＲＮＡを回収し、精製し、ＤＮアーゼ処理し、保存した（ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９８）；ＫａｙｅとＬｅｖｅｒ（１９９９））。
【０１０６】
リボヌクレアーゼプロテクションアッセイ（ＲＰＡ）。リボプローブシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）Ｔ３又はＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用して直鎖化ＤＮＡ鋳型から^３２Ｐ標識アンチセンスリボプローブをｉｎ ｖｉｔｒｏ転写した。リボプローブを使用前に５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲルで精製した。
【０１０７】
ＲＰＡ用試薬は市販キット（Ａｍｂｉｏｎ）から入手した。ＲＮＡ材料は全反応に標準化し、細胞質ＲＮＡについてはスペクトロフォトメトリーにより試料濃度を測定し、同一量（一般に１μｇ）を各チューブに加えた。ビリオンＲＮＡ材料は逆転写酵素アッセイにより標準化し、５００００単位当量を反応当たり標準使用量とした。リボプローブ２×１０^５ｃｐｍとＴｏｒｒｕｌａ酵母（Ａｍｂｉｏｎ）由来キャリヤーＲＮＡ３μｇでＲＮＡを同時沈降させた。ハイブリダイゼーションと後続ヌクレアーゼ保護は製造業者の指示に従って実施した。ペレット化ＲＮＡをＲＮＡローディング緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁し、５％ポリアクリルアミド−８Ｍ尿素ゲル上で分離し、オートラジオグラフィーにより可視化し、リアルタイムＩｎｓｔａｎｔ Ｉｍａｇｅｒ（Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して定量した。フラグメントのサイズ測定はＣｅｎｔｕｒｙ Ｍａｒｋｅｒ鋳型セット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して作製した^３２Ｐ標識ＲＮＡマーカーを平行して泳動させることにより実施した。
【０１０８】
各実験で同一ＲＮＡ材料を使用して個別ＲＰＡを実施したが、ウイルスプラスミドＤＮＡの探索にはプラスミドＫＳ２ΨＥＰから作製したプローブを使用した。更に、細胞質ＲＰＡ材料の変動を制御するためにヒトβアクチンＲＮＡプローブ（Ａｍｂｉｏｎ）も反応に加えた。パッケージング効率を計算する際にはβアクチンシグナルのＤＮＡ汚染又は変動を考慮し、野生型に対する突然変異体のビリオンと細胞質ＲＮＡの比の相対値として計算した。
【０１０９】
ＨｅＬａ ＣＤ４^＋ＬＴＲ−βｇａｌ細胞の形質導入と選択。ヘルパー、ｅｎｖ発現又は空のｅｎｖ発現バックボーンのベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ−１細胞とモックトランスフェクト細胞からの上清を上述のように回収したが、得られたペレットはダルベッコの改変イーグル培地１００μｌに再懸濁した。次に、得られたベクター調製物のＲＴ活性を上述のように測定し、こうして１２穴プレートに加える細胞の量を標準化した。各ウェルが２０％コンフルエントに達した時点でベクターを加えた。３日後に細胞株を培養するのに適した抗生物質とピューロマイシン１μｇ／ｍｌを加えた選択培地に培地を交換した。次に、全モック形質導入細胞が死滅するまで細胞を選択培養した。次にウェルを固定し、従来記載されているようにβ−ガラクトシダーゼ染色し（Ｐａｇｅら，１９９０）、各ウェルのコロニー数を計数した。ＲＴ活性１００００単位当たりのコロニー形成単位（ｃｆｕ／１００００ＲＴＵ）として形質導入効率を表した。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】ＨＩＶ−２リーダーＲＮＡの予想ＲＮＡ二次構造。
【図２】ＨＩＶ−２リーダーにおけるＤＭ及びΨ１欠失の位置とｐＳＶＲΔ１、Δ２、Δ３及びΔ４欠失の位置の概念図。
【図３】野生型ＨＩＶ−２と競合下の突然変異体パッケージング効率の低下。棒グラフは競合下と非競合下の突然変異体のパッケージング効率の定量を示す。結果は少なくとも３回の別個の実験の平均であり、誤差線は実験間の平均の標準偏差を示す。
【図４】Ｇａｇタンパク質を産生することができたＤＭ突然変異体ウイルスをコトランスフェクトした場合の野生型ＨＩＶ−２のパッケージングをＲＰＡにより評価し、産生できなかったものに比較する。棒グラフは実験の定量を示す。非Ｇａｇ産生ウイルスであるｐＳＶＲＤＭΔＨとの競合下のｐＳＶＲのパッケージング効率を１００％とする。結果は４回の別個の実験の平均であり、誤差線は実験間の平均の標準偏差を示す。
【図５】２種のＨＩＶ−２由来ヘルパーウイルス構築物と、サルウイルス４０プロモーターの制御下のピューロマイシン耐性遺伝子カセットを含む２種のＨＩＶ−２ベクターの構造。
【図６】ｐＳＶＲＤＭが各種量のｇａｇ ＯＲＦを含むＨＩＶ−２ベクターをトランスパッケージングする能力。ベクターパッケージング効率の定量。結果は少なくとも２回の別個の実験の平均であり、誤差線は実験間の平均の標準偏差を示す。
【図７】制限量のＧａｇポリプロテインを競合後のベクターパッケージング効率。結果は３回の別個の実験の平均であり、誤差線は実験間の平均の標準偏差を示す。

Claims (16)

1. ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ−２）のウイルスＲＮＡがＨＩＶ−２キャプシドにパッケージングされないように、ＨＩＶ−２パッケージングシグナル内に突然変異を含み、
   前記突然変異は、
   （ａ）配列番号１の配列もしくはその変異体の欠失、
   （ｂ）５ヌクレオチド長以上のその内部フラグメントの欠失、又は
   （ｃ）１７ヌクレオチド長以上のそのフラグメントの欠失を含む、
   ヒト免疫不全ウイルス２型ベクター。
2. ＨＩＶ−２キャプシドにベクターをパッケージングするために十分なＨＩＶ−２パッケージングシグナルと、前記ベクターにより発現されることが可能な異種遺伝子とを含むベクター。
3. （ａ）配列番号１の配列もしくはその変異体、
   （ｂ）５ヌクレオチド長以上のその内部フラグメント、又は
   （ｃ）１７ヌクレオチド長以上のそのフラグメントを含む請求項２に記載のベクター。
4. ｇａｇＯＲＦのマトリックス（ＭＡ）領域又はそのフラグメントを含む請求項２又は３に記載のベクター。
5. ＨＩＶ−２ＲＮＡの核酸５５３〜９１２又はそのフラグメントを含む請求項２又は３に記載のベクター。
6. 異種遺伝子が治療タンパク質もしくはペプチド又は抗原タンパク質もしくはペプチドをコードする請求項２から５のいずれか一項に記載のベクター。
7. ＨＩＶ−２キャプシドを産生することが可能なベクターと請求項２から６のいずれか一項に記載のベクターを宿主細胞に感染させ、前記宿主細胞を培養する、異種遺伝子をコードするＨＩＶ−２ウイルスの生産方法。
8. ＨＩＶ−２キャプシドを産生することが可能なベクターが請求項１に記載のベクターである請求項７に記載の方法。
9. 請求項７又は８に記載の方法により生産されたウイルス。
10. 請求項９に記載のウイルスと医薬的に許容可能なキャリヤーを含む医薬組成物。
11. ＳＩＶ又はＨＩＶ感染の治療又は予防用ＨＩＶ−２パッケージング配列又はそのアンチセンス配列。
12. （ａ）配列番号１の配列もしくはその変異体、
    （ｂ）５ヌクレオチド長以上のその内部フラグメント、又は
    （ｃ）１７ヌクレオチド長以上のそのフラグメントを含む請求項１１に記載のＨＩＶ−２パッケージング配列。
13. ｇａｇＯＲＦのマトリックス（ＭＡ）領域、ＨＩＶ−２ＲＮＡの核酸５５３〜９１２又はそのいずれかのフラグメントを含む請求項１１に記載のＨＩＶ−２パッケージング配列。
14. 治療又は抗原タンパク質又はペプチドを個体に送達する方法であって、有効量の請求項９に記載のウイルス又は請求項１０に記載の医薬組成物を個体に投与する前記方法。
15. 有効量の請求項１１、１２又は１３のいずれか一項に記載のＨＩＶ−２パッケージング配列を個体に投与する、ＳＩＶ又はＨＩＶ感染の治療又は予防方法。
16. ＳＩＶ又はＨＩＶ感染の治療又は予防用医薬の製造に使用するための請求項１１、１２又は１３のいずれか一項に記載のＨＩＶ−２パッケージング配列。

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