JP2001502539A - レトロウイルスベクター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非分裂標的細胞に感染および形質転換する能力を有する、レンチウイルスを基にしたベクター粒子を作製するための、レトロウイルスベクター作製システム。ここにおいて、１以上の補助遺伝子、たとえばHIV-1の場合にはvpr，vif，tat，nefのような、補助遺伝子が、このシステムには存在しない。このシステムおよびその結果得られるレトロウイルスベクター粒子は、従来のシステムおよびベクターよりも安全性が向上した。

Description

【発明の詳細な説明】 レトロウイルスベクター 本発明は、レトロウイルスベクター作製システムおよびそのシステムによって 作製されるレトロウイルスベクター粒子に関する。より詳細には、特定のレトロ ウイルス補助因子を欠いたシステムおよびベクター粒子に関する。また、本発明 は、レトロウイルスベクターの使用、特に遺伝子治療への使用に関する。 レトロウイルスベクターは、臨床的な遺伝子導入のための伝達媒体として選択 されているが、その理由はレトロウイルスベクターの効率、安全性、および安定 した長期間の遺伝子発現による。1996年９月に発行された米国国立衛生研究所RA Cリポート（Rossら、1996）によると、NIHが調査した107の研究のうち76例がマ ウス白血病ウイルス（MLV）に由来するベクターシステムに基づいていた。 上記ウイルスの一つの重大な欠点は、ニューロン、マクロファージや造血幹細 胞といった非増殖細胞に感染することができないことである。 これらの細胞は遺伝子治療の重要なターゲットである。 ヒト免疫不全ウイルス １型(HIV-1)はレトロウイルス科のレンチウイルス亜科に属し、他のレンチウイ ルスと同様に、HIVは静止細胞に感染することができる。このため、レンチウイ ルスは遺伝子治療にとって魅力的なベクターとなる。 HIV-1が非分裂細胞に感染するためのウイルス決定因子はp17マトリクスタンパ ク質(MA)およびvprにあると考えられる（Gallayら、1996）。MAは、保存された 一定の塩基残基によって与えられる細胞核親和性を有し、核局在化シグナル（NL S）を構成する（Bukrinskyら、1993）。また、vprも別のNLSを含有する（Mahali ngamら、1995）。MA-NLS変異体ウイルスは、機能性vpr遺伝子が存在しないとマ クロファージ内で十分に複製することができない（Heinzingerら、1994）。これ らのデータは、MAの みならずvprもHIV-1の細胞核親和性決定因子として機能することを意味すると解 釈される。vprが存在しないと、単球由来マクロファージの形質導入効率は機能 性MA存在下で50％以上減少する（Naldiniら、1996）。 1989年にLeverらが報告した、HIV-1のパッケージングのために必要な配列を明 らかにした研究以後、HIV-1を基にした遺伝子治療ベクターの開発に多くの関心 が寄せられてきた。複製能欠損HIV-1ベクターによるヒトＴ細胞系への外来遺伝 子の導入が、Poznanskiらによって実証された（Poznanskyら、1991）。他の研究 グループは、tat誘導性のHIV-1ベクター（Buchschacher，Jr.およびPanganiban ，1992）、または異種プロモーターを用いたHIV-1ベクター（Shimadaら、1991） をデザインした。しかしながら、これらのベクターを用いて得られたウイルス力 価は低く（最大でも1ml当り10³感染粒子）、そのベクターシステムによってヘル パーウイルスを含まないベクターを確実に作製できるか否かは明らかでなかった 。最近では、ヘルパーウイルスのないベクターを作製するための新しい試みが、 3-プラスミド同時トランスフェクションに基づいて行なわれた（Richardsonら、 1995）。水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（VSV-G）を用いてHIVベクターをシ ュードタイピング（pseudotyping）することができ、上記粒子は超遠心による濃 縮後も感染性を保持する（Akkinaら、1996）。VSV-Gによるシュードタイピング は宿主の範囲を広げ、野生型HIVエンベロープを生じるような組換えが起こる可 能性を除去する。非分裂ニュ一ロン細胞のin vivo形質導入が3-プラスミド同時 トランスフェクションシステムにおけるHIV-1のVSV-Gシュードタイピングを用い て実証された（Naldiniら、1996およびNaldiniら、1996a）。 HIV-1は９個の遺伝子を含有し、そのうち３個gag，polおよびenvはすべてのレ トロウイルスに見出される。これらは構造遺伝子である。他の６個vif，vpu，vp r，nef，tatおよびrevは補助遺伝子と呼ばれる。他のレトロウイルスは、その野 生型ゲノム中に異なる補助遺伝子群を有する。他のレトロウイルスの補助遺伝子 の一部は、文献では必ずしも同じ名前がつけられているわけではないが、HIV-1 の補助遺伝子に類似している。 類似補助遺伝子は、ヌクレオチド配列に相同性を有し、同一のまたは同様の機能 を果す。HIV-2およびSIV株は通常HIV-1のenv，vpr，vif，tatおよびnef遺伝子に 類似した同遺伝子を含有する。HIV-2および一部のSIV株は、vprを欠いた一部のS IV株においてvprに類似していると考えられるvpxも含有する。HIV-1以外のレン チウイルスはHIV-1補助遺伝子とは類似しない補助遺伝子も含有する。レトロウ イルス補助遺伝子は、たとえば、TomonagaおよびMikami(1996)によって、さらに Fields Virology，Vol2でJoagらによって概説される。 現在までのところ、HIVを基にしたすべてのベクター系はHIV補助遺伝子の一部 またはすべてを含有する。revはRNA輸送タンパク質として機能し、tatはプロウ イルスの長い末端反復配列（LTR）の主要なトランス作用因子である。補助遺伝 子はウイルスの複製および病原性に重要な役割を果す。補助遺伝子は、これまで 十分には特性決定されておらず、またその機能も明らかにされていない。 しかしながら、補助遺伝子の一部は、HIV-1の病原性に関わると考えられる。t atはカポージ肉腫の発生に関係している（Barillariら、1993;Ensoliら、1990） 。HIVvprは細胞の分裂停止およびアポトーシスを引き起こすことが明らかになり 、これがエイズ患者にみられるＴ細胞機能不全の原因であると提唱された（Jowe ttら、1995）。末梢血液中に存在する細胞外vprはHIV感染に伴う組織特異的病理 の一因となるが、これはvprが細胞の増殖および分化を誘導するためであること が示唆されている（Levyら、1993およびLevyら、1995）。 補助遺伝子の役割は明らかではないが、補助遺伝子はおそらく病原性に重要な 役割を担っていると考えられるので、十分高いレトロウイルス力価と非増殖細胞 への形質導入能力が維持されるならば、HIV-1ベクター作製システムから補助遺 伝子を除去することが望ましい。 Naldiniらのデータはvpuの有無がベクター粒子の力価に影響を与えないことを 示す。すなわち、彼らの使用したパッケージングシステムは、VSV-Gを用いてシ ュードタイピングしたとき、４ｘ10⁵の力価を生じたが、 このシステムはenvおよびvpuを含まないものであった。envのみを含まない別の システムにおいても、同じ力価が得られた（Naldiniら、1996およびNaldiniら、 l996a）。しかしながら、すでに検討したように、vpuのみならずvprも含まないN aldiniらの別のシステムでは、形質導入効率がvprを含むシステムに比べて50%低 下した。 ここで、本発明者らは、レトロウイルスベクター作製システムから補助遺伝子 の一部またはすべてを除去しても、ベクター粒子力価やベクター粒子の非分裂細 胞への形質導入能力が有意に損なわれることはないことを見出した。 したがって、この発明は、ある態様において、遺伝子治療のためにレンチウイ ルスを基にした複製能欠損ベクター粒子を作製するためのレトロウイルスベクタ ー作製システムであって、前記ベクター粒子は哺乳動物の非分裂標的細胞に感染 及び形質導入することができ、前記システムは前記ベクターの成分をコードする 一組の核酸配列を含んでなり、HIV-1補助遺伝子vpr，vif，tatおよびnefから、 または前記ベクター粒子の基になるレンチウイルスに通常存在する他のレンチウ イルスの類似補助遺伝子から選択された１以上の機能性遺伝子が前記システムに 存在しない、前記レトロウイルスベクター作製システムを提供する。作製システ ムがHIV-1を基にしたベクターのためのものであり、vprおよびvpuが両方とも存 在しない場合には、他の補助遺伝子のうちの１つも存在しないという条件のもと で機能性vpu遺伝子が存在しなくてもよい。 別の態様において、本発明は本明細書中に記載したレトロウイルスベクター粒 子作製システムによって作製されるレトロウイルスベクター粒子を提供する。 さらに別の態様において、本発明は、本明細書中に記載したレトロウイルスベ クター作製システムにおいて使用するためのDNA構築物を提供する。このDNA構築 物は、レトロウイルスベクター粒子に関するパーケージ可能なRNAベクターゲノ ムをコードし、かつ機能し得るようにプロモーターに結合している。ここで、機 能性レトロウイルス補助遺伝子の うち、場合によって存在するrev以外のすべてがこの構築物には存在しない。ベ クター粒子の構造成分の一部またはすべてをコードする一組のDNA構築物の一部 として上記のDNA構築物が提供されてもよい。 別の態様において、本発明は、本明細書中に記載したレトロウイルス粒子の遺 伝子治療への使用、および遺伝子治療のための薬剤調製における使用を提示し、 さらに標的細胞に遺伝子治療を実施する方法を提供する。ここで、この方法は、 本明細書中に記載したレトロウイルスベクター粒子を用いて標的細胞に感染およ び形質導入することを含んでなる。さらに本発明は、これらの使用および方法の 結果得られる形質導入された標的細胞を提供する。このように本発明は、医学に 使用するための遺伝子送達システムを提供する。 「レンチウイルスを基にした」という表現は、ベクター粒子がレンチウイルス に由来することを意味する。ベクター粒子のゲノムは、バックボーンとしてレン チウイルス由来の成分を含んでなる。ベクター粒子は全体として、RNAゲノムに 適合するベクター必須成分を含有し、これには逆転写および組込みシステムが包 含される。通常、これらはレンチウイルスに由来するgagおよびpolタンパク質を 包含する。 レンチウイルスに由来するため、レトロウイルスベクター粒子は非分裂細胞に 感染および形質導入する能力を有する。したがって、ベクター粒子は、治療上活 性を有する遺伝子のような選択された一または複数の遺伝子を標的細胞のゲノム に送達することができる。感染過程で、レンチウイルスは、インテグラーゼ、コ アタンパク質およびプロウイルスDNAを含有する標的細胞の細胞質において組込 み前複合体（pre-integration complex）を形成する。この複合体は、そのタン パク質のシグナル配列によって、標的細胞の核膜を通り抜けることができる。レ ンチウイルスでないレトロウイルスは、上記タンパク質を欠いているか、または そのタンパク質を有しているが適当なシグナル配列を欠いている。 レンチウイルスの例は、HIV-1およびHIV-2、SIV、FIV、BLV、EIAV、CEVおよび ビスナウイルスである。これらのうち、HIVおよびSIVが現在も っともよく理解されている。しかしながら、遺伝子治療への使用のためには、免 疫不全ウイルス以外のウイルスが望ましい。これは、免疫不全ウイルスでは、そ れにともなって安全性の考慮と先入観をもたらすことが避けられないためである 。 レトロウイルスベクター作製システムに機能性補助遺伝子が存在しないという ことは、こうした機能性遺伝子がそのシステムによって作製されたレトロウイル スベクター粒子にも存在しないことを意昧する。また、こうした遺伝子によって コードされ、ベクター粒子内に取り込まれる補助タンパク質は、ベクター粒子に はまったく存在しないであろう。公知のレトロウイルスベクター作製システムに おいて、補助遺伝子は、ベクターゲノムをコードするDNAの一部として、または パッケージング成分とともに存在してもよい。ベクター作製システムにおける補 助遺伝子の位置は、部分的には、他のレトロウイルス成分との関係によって決ま る。たとえば、vifはしばしば、パッケージング細胞のgag-polパッケージングカ セットの一部として存在する。このように、本発明の目的のために機能性補助遺 伝子を除去することには、パッケージング成分から、またはベクターゲノムから 、あるいはおそらくはその両者から、機能性補助遺伝子を除去することが包含さ れてもよい。 機能性補助遺伝子を除去することは、その遺伝子全体の除去を必ずしも必要と しない。通常、遺伝子の一部の除去、または何か他の方法による遺伝子の破壊で 十分である。機能性補助遺伝子が存在しないことは、ここでは、遺伝子が機能性 補助タンパク質をコードすることができる形態で存在しないことを意味すると理 解される。 本発明の望ましいシステムにおいて、ベクター粒子の基になったレンチウイル スに通常存在する機能性vprおよびtat遺伝子または類似の遺伝子は、いずれも存 在しない。上記二つの補助遺伝子は、遺伝子治療ベクターとして特に望ましくな いレンチウイルスの特性に関わっている。しかし、本発明において、上記以外の 場合には、存在しない補助遺伝子の組み合わせは限定されない。HIV-1を基にし たベクター粒子を作製する ための本発明のシステムにおいて、任意の組み合わせの３つまたは望ましくは４ つ以上の遺伝子が、機能的形態で存在しなくてもよい。もっとも望ましくは、５ つの補助遺伝子、vpr，vif，tat，nefおよびvpuのすべてが機能的形態で存在し ない。同様に、他のレンチウイルスに関するシステムについても、すべての補助 遺伝子が機能的形態で存在しないことがもっとも望ましい（rev/RPEシステムに 類似したシステムによって置き換えられない場合に存在することが望ましいrev を除く）。 ベクターゲノムのRNA転写物の核から細胞質への効率のよい輸送を保証するた めに、ベクターゲノム内に機能性revおよびrev応答エレメント(RRE)配列を包含 することが望ましく、または、rev/RREシステムと同じ機能を果す別の配列をゲ ノム内に包含することが望ましい。たとえば、rev/RREシステムに機能的に類似 したシステムが、Mason-Pfizerサルウイルスに見出される。これは、CTEとして 知られており、感染細胞内の因子と相互作用すると考えられているゲノム内のRR E-型配列からなっている。細胞の因子はrev類似体と考えられる。このように、C TEをrev/RREシステムの代わりとして利用することができる。 上記から明らかなように、ベクターとして機能するためには、本明細書中に記 載したレトロウイルス粒子が、プロウイルスへの変換および二本鎖DNAの標的細 胞ゲノムへの組込みを可能にする逆転写システム（適合する逆転写とプライマー 結合部位）および組込みシステム（適合するインテグラーゼおよび組込み部位） を有している必要がある。さらに、ベクターゲノムは、パッケージングシグナル を含有する必要がある。これらのシステムおよびシグナルは、一般に、ベクター の基になったレンチウイルスに由来する。本発明のベクターがレンチウイルスを 基にしていても、ベクター内に取り込まれるレンチウイルスの成分が遺伝的に、 またはその他の点で、野生型レンチウイルスにおける成分の改変形であってもよ いのは明白である。RNAゲノムまたは他のレトロウイルスベクター粒子作製シス テムの成分を操作することによって、改変を起こすことができる。たとえば、ベ クターとして必要でないレンチウイルスゲノ ムの部分を排除することができる。また、ベクター作製システムでは、たとえば レンチウイルスenv遺伝子の代替物を利用することもでき、その結果ベクターに 異なった範囲の標的細胞を与えることができる（これはシュードタイピングとし て知られている）。 本発明のレトロウイルス粒子は、標的細胞に送達するように選択された１以上 の遺伝子を運ぶ。選択された遺伝子は、達成しようとする効果にしたがって選ば れる。遺伝子治療目的では、治療又は予防が必要な症状に対して活性を有する遺 伝子産物をコードする、少なくとも１つの治療上活性を有する遺伝子がある。さ らに、検出可能な産物をコードすることによってマーカーとして作用する、選択 された遺伝子もある。治療のための遺伝子は、たとえば、アンチセンスRNA、リ ボザイム、標的とするタンパク質のトランス優性ネガティブ変異体（transdomin ant negative mutant）、毒素、条件毒素（conditional toxln）、抗体またはヘ ルパーT細胞または細胞傷害性Ｔ細胞を誘導する抗原、一本鎖抗体または腫瘍抑 制タンパク質をコードすることができる。 ベクターゲノムの構築は、DNAプロウイルスにおいて、治療のための１または 複数の遺伝子が5' LTRの転写制御を受けるか、そうでなければベクター由来の他 のいかなるプロモーターにも機能し得るように連結していないものが好ましい。 このように、上記の１または複数の遺伝子の発現は、単一の転写ユニットの中で 起こる。また、5' LTRは、プロモーター機能がtat依存性でない修飾されたレン チウイルスLTRであることも望ましい。これは、RおよびU3レンチウイルスプロモ ーター機能を、別のレトロウイルス由来の又は非レトロウイルス起源の代替プロ モーター機能によって置き換えることによって達成することができる。このため の戦略はCannonら、1996および実施例に記載されている。 「遺伝子」という用語はここでは広く使用されており、望ましいポリペプチド またはRNAをコードしたあらゆる核酸を包含する。通常、本発明のベクターによ って送達される遺伝子はcDNAである。 また、本発明のレトロウイルスベクター粒子は、ゆっくり分裂する細 胞やMLVのようなレンチウイルスでないウイルスが効率よく感染及び形質導入す ることができない細胞に、感染および形質導入することができる。ゆっくり分裂 する細胞は、およそ３日から４日ごとに１回分裂する。哺乳動物の非分裂細胞お よびゆっくり分裂する細胞は、脳細胞、幹細胞、最後まで分化したマクロファー ジ、肺上皮細胞、およびさまざまな他の細胞型を包含する。また、ある種の腫瘍 細胞も包含される。腫瘍は早く分裂する細胞を含有するが、腫瘍細胞の一部、特 に腫瘍の中心部にある細胞は、まれにしか分裂しない。 本明細書中に記載したベクターゲノムをコードするDNA構築物はCMVプロモータ ーのような効率のよいプロモーターに連結されることが望ましい。ほかにも効率 のよいプロモーターが知られている。このことがレトロウイルスベクター作製シ ステムによるベクタ−RNAの高度の発現を実現する。 本発明のレトロウイルスベクター作製システムに利用するための適当な宿主ま たは生産細胞（producer cell）は、当業界でよく知られている。多くのレトロ ウイルスは複製能欠損ゲノムおよびパッケージング成分にすでに分割されている 。技術力のない者は、それを利用することができる。生産細胞は、ベクターゲノ ムによってコードされていないウイルス成分、たとえば、gag，polおよびenvタ ンパク質をコードする。gag,polおよびenv遺伝子を生産細胞に導入し、安定な状 態で細胞ゲノムに組み込んで、パッケージング細胞系を得ることができる。次に 、レトロウイルスベクターゲノムをトランスフェクションまたは形質導入によっ てパッケージング細胞系に導入し、レトロウイルスベクター粒子を作製するため に必要なDNA配列のすべてを有する安定な細胞系を創り出すことができる。別の 方法では、たとえば、envコード配列、gag-polコード配列および欠損レトロウイ ルスゲノムのような、レトロウイルスベクター粒子を作製するために必要な異な るDNA配列を同時に、一過性三重トランスフェクションによって細胞内に導入す ることができる。本発明の望ましいシステムにおいて、構造成分とベクターゲノ ムの両方が、宿主 細胞ゲノムに安定に組み込まれたDNAによって、すべてコードされている。 添付の図面において、 第１図は、293T細胞の3-プラスミド同時トランスフェクションを用いた、本発 明のベクター作製システムを示す： 第２図は、本発明において使用したHIVに基づくベクターゲノムを示す； 第３図は、本発明において使用したHIV-1 gag-pol遺伝子発現プラスミドを示 す； 第４図は、５つの補助因子を欠いた本発明のベクターの形質導入効率を示す。 すべての不要な遺伝子を欠いた安全なHIVパッケージングシステムを作製する ために、本発明者らは、vpr，nef，tat，vifまたはvpuを含有しないシステムを 開発した（第１図）。パッケージング成分は、３の別々のプラスミドに入れ、重 複配列は最小になるようにして、組換えやヘルパーウイルスの産生が起こらない ことを保証した。このHIVベクターはアフィジコリン処理した非分裂細胞にvpr不 存在下で形質導入できることが示された。すべての補助遺伝子を含有するシステ ムに関するNaldiniらの力価と同様の力価が得られた（Naldiniら、1996a）。 これが、最初の最小レンチウイルスベクターシステムである。このシステムで 高い力価が観察されたことは、高い力価を生じるためおよび非分裂細胞を形質導 入するためには補助遺伝子（rev以外）が不要であることを示す。これは、高力 価のウイルス系が作製される原因がウイルス粒子への補助タンパク質（たとえば nef）の取り込みにあるという、Naldiniらによってなされた想定とは反対である 。 このシステムは、HIV治療に対してさらなる利点を有する。HIV-1 LTRを別のプ ロモーター、たとえば構成的なHCMVプロモーターで置き換えることによって、Ta tトランス優性変異体（Echetebuら、1994）やTARデコイ（TAR decoys）（Liszie wiczら、1993）のようなアンチTat分子を治 療薬として利用することが、これらがベクター作製に影響を及ぼさないため可能 になる。 本明細書中に記載の、野生型ウイルス補助遺伝子のすべてを欠いた最小レンチ ウイルスベクターをワクチンとしても応用できることは明らかである。 実施例 材料および方法プラスミドの構築 pGP-RRE1はpW13(Kimら、1989)由来のgag-pol vif発現プラスミドである。Sma Ｉによって切断されたpBluescript KS+に、pW13のRRE（受入れ番号：U26942）を 、StyＩ/StyＩ断片（7720-8050）を平滑末端にすることによって挿入し、pBSRRE を作製した。pW13のNarＩ/Eco R1断片（637-5743）をClaＩおよびEco RＩで切断 したpBSRREに挿入し、pBSGPRRE1を作製した。XhoＩ/NotＩ断片（gagpolおよびRR E含有）を発現プラスミドpCl-Neoに挿入し、pGR-RRE1を作製した。vifコード領 域を除去するために、pBSGPRRE1をNdeＩおよびSmaＩで切断して平滑末端とし、p BSGPRRE2を作製した。gagpol遺伝子およびRREをXhoＩおよびNotＩサイト内のpCl -neoに挿入し、pGPRRE2を作製した。 pTIN406，pTIN408およびpTIN414の構築は、すでに記載されている（Cannonら 、1996）。pH3ZおよびpH4Zの5' LTRは、U3位置、およびHIV RおよびU5領域に、C MVプロモーターを含有する。ClaＩサイトを平滑末端にすることによってHIVgpt （Pageら、1990）からHIVdgeを作製し、フレームシフト変異を生じさせた。HIVd geをBglIIおよびPstＩ（473-1414）で切断し、pTIN406に挿入した。pTIN406はCM V，R(HIV)およびU5(MLV)のLTR構造を有する。pBS5'とよばれる、HIV由来のCMV， R,およびU5を含有するハイブリッドLTRを作製した。プラスミドにrevおよびRRE を供与するために、Eco RＩ/XhoＩ断片（5743-8897）を、NdeＩからBglII(6403- 7621)までの欠失を有するHIVdge誘導体であるHIVdge1.2から切り出し、p BS5'に挿入してpBS5'Rを作製した。3' LTRは、pBS3'のNotＩ/XhoＩ断片をpBS5'R に挿人してpH2を作製することによって与えられた。pBS3'は、pWI3のXhoＩ/Hind III断片、pTIN408のHindIII/KpnＩ断片の、pBluescriptKS+（XhoＩ/KpnＩ）への 、３者の連結反応によって作製された。CMVプロモーターは、pSPCMV（SalＩ/Xho Ｉ）由来のpH2の唯一のXhoＩサイトに挿入され、pH2CMVが作製された。pSPCMVは pLNCX（受入れ番号：M28246）（PstＩ/HindIII）をpSP72（Promega）に挿入する ことによって作製された。β−ガラクトシダーゼ遺伝子は、pTIN414からpSP72（ XhoＩ/SphＩ）に挿入され、pSPlacZが作製された。pSPlacZのXhoＩ/SalＩ消化に よって、pH2-CMVに挿入されたβ−ガラクトシダーゼをコードする領域を与え、p H3Zを得た。tat-欠損ベクターを作製するために、pH4Zを構築した。pH3内のEcoR Ｉ（5743）-SpeＩ断片を、PCRプライマ−DELT5（5'-CGTGAATTCGCCTAAAACTGCTTGT ACCA-3'）およびDELT3(5'-GAACTAATGACCCCGTAATTG-3'）を用いて増幅したEcoRＩ （5881）-SpeＩ PCR産物で置き換えることによって、tatコード領域の最初の50b pを除去し、pH4を作製した。pH4由来のNsiＩ/SpeＩ断片をpH3Zに挿入しpH4Zを作 製した。 vpr発現プラスミドは、下記のプライマーを用いた、pNL4.3（受入れ番号：U26 942）由来vpｒコード領域のPCR増幅によって構築された。 5'プライマー：GCGAATTCGGATCCACCATGGAACAAGCCCCAGAAGAC（5563-5583）および 3'プライマー：GCGAATTCGGATCCTCTAGGATCTACTGGCTCCATT（5834-5853） 上記の増幅物をpLIGATOR（R & D Systems）にクローニングした。vprコード領 域を含有するMluＩおよびXhoＩ断片をpCI-Neo（Promega）に挿入することによっ て、発現プラスミドpCI-vprを作製した。 pAC29.1をBam HＩで切断し、pSA91（BglII）に挿入されるVSV-Gコード領域を 生成させた。細胞系 293T(293ts/Al609)(DuBridgeら、1987)細胞は、ダルベッコ改変イー グル培地(GIBCO)で維持し、HeLa細胞および208F細胞はMEM(GIBCO)で維持した。 すべての培地は、抗生物質を添加した10％(v/v)ウシ胎児血清を含有する。ベクターの作製およびアッセイ レトロウイルスベクター系は、本発明者らのすでに出版されたプロトコール（ Soneokaら、1995）にしたがって予め作製しておいた。簡単に述べると、ヒト腎 臓293T細胞（1.5x106)を10-cmプレートにプレーティングし、15mgの各プラスミ ド（ベクタープラスミドとともにgag-polおよびenv発現プラスミド）を用いて、 リン酸カルシウムDNA沈澱法（ChenおよびOkayama，1987）によって一過性のトラ ンスフェクションを行なった。培養上清を36時間後に回収し、0.45mmを通して濾 過し、ただちに使用するか、または-70℃で冷凍した。8mg/mlポリブレンの存在 下で、ウイルスを標的細胞に添加することによって形質導入を２時間行ない、次 いで新鮮な培地を添加した。既述のように（Soneokaら、1995)、5-ブロモ-4-ク ロロ-3-インドリルーβ-D-ガラクトシド（X-Gal）を用いて、β−ガラクトシダ ーゼの48時間後の発現を測定した。1mlあたりのlacZ（青色の点）形成単位の数 を計数することによって力価が得られた(1．f.u./ml）。感染の24時間前、次い で実験の間を通じて毎日、アフィジコリン（5mg/ml）を添加することによって、 Gl/S期停止培養物を調製した。結果 HIV ベクター作製 H3Z（tat陽性）およびH4Z（tat陰性）は、293T細胞への３プラスミド同時トラ ンスフェクションによって作製されるように設計された、HIV-1を基にしたベク ターである（第２図）。HIVコアによる効率のよいパッケージングのために、上 記ベクターはgagの最初の778塩基を含有するが、ATG開始コドンから40bpに導入 されたフレームシフト変異によりgagタンパク質の発現は妨げられる。RREは、パ ッケージング効率を高めるため に包含されており、revはHIV mRNAの輸送を支えるためにベクターから発現され る。レポーター遺伝子として働くように、内在するCMVプロモーターで駆動され るβ−ガラクトシダーゼ遺伝子が挿入された。どちらについても、ベクターゲノ ムの転写は、5'LTR U3を置き換えるために用いられたCMVプロモーターによって 駆動される。これによってベクターゲノムはtat非依存性となる。二つのHIV-1ga gpol構築物が作製された（第３図）；pGP-RREI（vif陽性）およびpGP-RRE2（vif 陰性）。CMVで駆動される発現プラスミドであるpCI-neoにgagpol遺伝子が挿入さ れているため、gagpol発現はtatに依存しない。pRV67、VSV糖タンパク質構築物 をシュードタイピングのために使用した。異なるプラスミドに別の遺伝子を載せ ることによって、組換えにより複製コンピテントウイルスを生じる可能性を最小 にすることができる。ベクターの形質導入効率 上記の３プラスミドを用いてヒト腎臓293T細胞を一過性同時トランスフェクシ ョンすることによって、複製能欠損レトロウイルス粒子を作製し、これをただち に使用するか、または-70℃で冷凍した。異なるベクター構築物を用いてウイル スを作製した。最小構築物（H4ZおよびpGP-RRE2）が、vif，vpr，nefおよびtat 陽性ウイルスと同等の力価を与えることが明らかになった（第１表）。 この最小システムをさまざまな細胞系について試験したところ、力価はさまざ まに異なっていた（第２表）。ベクターは、293T細胞において、ポリブレン処理 した場合には3.2ｘ10⁵1.f.u./ml、ポリブレン処理しない場合には9.1x10⁴l.f.u. /mlの力価を与えた。同じベクターが、HeLaおよび208F細胞においては、ポリブ レン無しで、それぞれ9.6ｘ10³l.f.u./mlおよび8.3ｘ10³1.f.u./mlを与えた。こ れらの力価はNaldiniら、1996（Naldiniら、1996）によって得られた値に匹敵し 、これまでに公表された最高値である。アフィジコリン処理細胞の形質導入へのvprの影響 非分裂細胞形質導入へのvpｒの影響を調べるために、pH4Z，pGP-RRE2およびpR V67プラスミドをともに使ったpCI-vprの同時トランスフェクションによってvpr をパッケージングシステム内に入れた。生成したウイルス粒子の形質導入効率は 、293T細胞およびHeLa細胞の増殖細胞および増殖停止細胞についてアッセイされ た（第４図）。MLV由来のパッケージングおよび形質導入ベクター（Soneoka、19 95）を対照として用いた。HeLa細胞および293T細胞は、アフィジコリン処理によ ってGl/S期で増殖停止状態となった。最小HIVベクターH4Zは増殖中のHeLaおよび 293T細胞と比較して、Gl/S期停止細胞の形質導入に際しても同等の有効性を示し たが、MLVを基にしたベクターは、わずかに0.002%しか有効ではなかった。 vpr欠損H4Zは増殖停止細胞に、vpr含有ベクターと同等の効率で形質導入する ことができたが、このことは、ベクターが非分裂細胞に形質導入することができ るためには、HIV-1 MAで十分であることを示唆する。結論 発明者らは、HIV-1を基にしたベクター作製システムを確立した。このシステ ムはvpr,vpu,nef,vifおよびtatを含有せず、３プラスミド同時トランスフェクシ ョン法に基づく。このベクターは、増殖細胞を3.2ｘ10⁵l.f.u./mlまでの力価で 形質導入することができ、この力価はほかのMLVを基にしたベクターに匹敵する が、さらに超遠心を用いた濃縮によって容易に増加することができる（データ示 さず）。ヘルパーウイルスは検出されなかった（データ示さず）。 この最小ベクターは増殖停止HeLa細胞および293T細胞に、vpr，vif,nefおよび tat含有ベクターと同様に効率よく形質導入することが明らかになった。したが って、HIVを基にした高力価のベクターを作製するためにはrevのみが必要であり 、こうしたベクターは非分裂細胞に形質導入することができると結論づけられる 。 これは、非分裂細胞に形質導入できる高力価最小レンチウイルスベクターの構 築に関する最初の報告である。６つの補助遺伝子から５つを除去すること（rev 以外）およびプラスミド間の配列重複を最小にすることによって、このシステム は、遺伝子治療のためのHIVベクターを作製するために、現在までのところもっ とも安全なものとなっている。図面の説明 第２図．HIVベクターゲノム。番号はHXB2と同様のものである。HCMVプロモー ター（-597から-1まで）。HXB2からのHIV配列（455から1415まで；5743(H3Z)ま たは5881(H4Z)から6403まで；7621から8897まで；8897から9720まで）。内部プ ロモーターとしてHCMVプロモーター(900bp)。 クローニングサイト(XhoＩ)。バックボーン；pBluescriptKS+。 第３図．HIV-1 gag-pol遺伝子発現プラスミド。HIV-1 gagpolコード領域およ びRREがpCI-neo（PROMEGA）に、XhoＩおよびNotＩ部位においてクローニングさ れた。 第４図．非分裂細胞の形質導入。H4Zベクターの形質導入効率はX-gal染色によ って測定され、Ｙ軸にl.f.u./mlとして示す。Gl/S期停止細胞ば、細胞をアフィ ジコリン（５μｇ/ml）で処理することによって調製した。 参考文献 第１表．補助遺伝子発現のベクター力価への影響 a:形質導入効率は293T細胞において、形質導入の48時間後にX-gal染色し青色コ ロニーの数を計数することによって測定し、ウイルス原液1ml当りのlacZコロニ ー形成単位（l.f.u./ml）として示した。 第２表．最小H4Zベクターのさまざまな細胞系に対する形質導人効率a:形質導入効率は、形質導入の48時間後にX-gal染色後、青色コロニーの数を計 数することによって測定し、ウイルス原液1ml当りのlacZコロニー形成単位（l.f .u./ml）として示した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ， ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ， ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 キングスマン，スーザン，マリー イギリス国 オーエックス５ ２エスエ フ，オクソン，イスリップ，ミドル スト リート，グレイストーンズ (72)発明者 キム，ナリー イギリス国 オーエックス１ ３ジェイエ イ，オックスフォード，セント クロス ロード，ライナクア カレッジ, (72)発明者 ミトロファノス，キリアコス イギリス国 オーエックス４ １エスゼッ ト，オックスフォード ウォーウィック ストリート 85

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．遺伝子治療のためにレンチウイルスを基にした複製能欠損ベクター粒子を作 製するためのレトロウイルスベクター作製システムであって、 前記ベクター粒子は哺乳動物の非分裂標的細胞に感染及び形質導入することが でき、 前記システムは前記ベクターの成分をコードする一組の核酸配列を含んでなり 、 HIV-l補助遺伝子vpr，vif，tatおよびnefから、または前記ベクター粒子の基 になるレンチウイルスに通常存在する他のレンチウイルスの類似補助遺伝子から 選択された1以上の機能性遺伝子が前記システムに存在しない、前記レトロウイ ルスベクター作製システム。 ２．機能性vprおよびvpu遺伝子が両方とも存在しない場合には、vif，tatおよび nefから選択された１以上の補助遺伝子も存在しないという条件のもとで機能性 補助遺伝子vpuも存在しない、HIV-1を基にしたベクター粒子を作製するための、 請求項１に記載のレトロウイルスベクター作製システム。 ３．機能性vprおよびtat遺伝子、またはベクター粒子の基になったレンチウイル スに通常存在する類似遺伝子が両方ともシステムに存在しない、請求項１または ２に記載のレトロウイルスベクター作製システム。 ４．機能性補助遺伝子vpr，vif，tat，nefおよびvpuのうち３つ若しくは４つま たは５つすべてがシステムに存在しない、HIVを基にしたベクター粒子を作製す るための請求項１〜３のうちいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター作製 システム。 ５．ベクターのRNAゲノムをコードする核酸配列が、１以上の治療上活性を有す る遺伝子を含んでなる、請求項１〜４のうちいずれか１項に記載のレトロウイル スベクター作製システム。 ６．ベクターの成分をコードした一組の核酸配列が、ベクターのRNAゲノムをコ ードする３つのDNA構築物、gagおよびpolタンパク質並びにenv タンパク質または各々の代替物を包含する、請求項１〜５のうちいずれか１項に 記載のレトロウイルスベクター作製システム。 ７．ベクターのRNAゲノムをコードする核酸配列がrevおよびRRE配列または機能 的にそれと同等なものを含んでなり、ゲノムの転写物を核から細胞質へ輸送する ことを可能にする、請求項１〜６のうちいずれか１項に記載のレトロウイルスベ クター作製システム。 ８．宿主細胞中の、請求項１〜７のうちいずれか１項に記載のレトロウイルスベ クター作製システム。 ９．ベクター粒子の基になったレンチウイルスに通常存在する機能性補助遺伝子 のうち、場合によって存在するrev以外のすべてがシステムに存在しない、請求 項１〜８のうちいずれか１項に記載のレトロウイルスベクター作製システム。 10．パッケージ可能なRNAベクターゲノムをコードし、かつ機能し得るようにプ ロモーターに結合した、請求項９に記載のシステムにおいて使用するためのDNA 構築物。 11．プロモーターが非レトロウイルス性の効率の高いプロモーターである、請求 項10に記載のDNA構築物。 12．請求項10または11に記載のDNA構築物並びにgagおよびpolタンパク質をコー ドするDNA構築物を含んでなる、請求項９に記載のシステムにおいて使用するた めの一組のDNA構築物。 13．envタンパク質またはその代替物をコードするDNA構築物をさらに含んでなる 、請求項12に記載の一組のDNA構築物。 14．１以上の発現ベクター中に、請求項10〜14のうちいずれか１項に記載のDNA 構築物を含んでなる、請求項９に記載のシステムにおいて使用するためのDNA構 築物。 15．請求項１〜９のうちいずれか１項に記載のシステムによって作製されるレト ロウイルスベクター粒子。 16．遺伝子治療のために、標的細胞に感染および形質導入するための請求項15に 記載のレトロウイルスベクター粒子の使用。 17．遺伝子治療に使用するための薬剤の調製における、請求項15に記載のレトロ ウイルスベクター粒子の使用。 18．請求項15に記載のレトロウイルスベクターを用いて標的細胞に感染及び形質 導入することを含んでなる、標的細胞に遺伝子治療を実施するための方法。 19．請求項16〜18のうちいずれか１項に記載の使用および方法の結果得られる標 的細胞。