KR20000049251A - 레트로바이러스 벡터 - Google Patents

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킹스만수잔매리
김나리
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옥스포드 바이오메디카 (영국) 리미티드
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Abstract

분열하지 않는 표적 세포를 감염 및 형질도입할 수 있는 렌티바이러스-기초한 벡터 입자를 제조하는 레트로바이러스 벡터 제조 시스템이 제공되며, 여기서 HIV-1인 경우에는 vpr, vif, tat 및 nef와 같은 하나 이상의 보조 유전자가 시스템에 없다. 상기 시스템 및 결과 레트로바이러스 벡터 입자는 안정성 면에서 현존하는 시스템 및 벡터보다 개선된다.

Description

레트로바이러스 벡터{RETROVIRAL VECTORS}
레트로바이러스 벡터는 효율, 안정성 및 안정한 장기간 유전자 발현으로 인하여 임상적인 유전자 전달을 위한 선택 매개체이었다. 1996년 9월에 발간된 United States National Institutes of Health RAC 보고서(Ross등, 1996)에 따르면, NIH에 의해 재검토된 107개 시험중 76개가 쥐 백혈병 바이러스(MLV)로부터 유도된 벡터 시스템에 기초한 것이다.
이들 벡터의 한가지 주요한 단점은 뉴런, 마크로파지(거식세포) 및 조혈 간(幹)(haematopoeitic stem) 세포와 같은 증식하지 않는 세포를 감염시키는데 있어서의 무능력에 있다. 이들 세포는 유전자 치료에 대한 중요한 표적이다.
인간 면역결핍 바이러스 타입 1(HIV-1)은 레트로바이러스내의 소 계통군, 렌티바이러스에 속하며, 이들 계통군의 다른 멤버와 같이 HIV는 휴지기 세포를 감염시킬 수 있다. 이는 렌티바이러스를 유전자 치료를 위한 매력있는 벡터로 만든다.
분열하지 않는 세포의 HIV-1 감염에 대한 바이러스 결정군은 p17 매트릭스 단백질(MA) 및 vpr(Gallay 등, 1996)내에 존재하는 것으로 여겨진다. MA는 염기성 잔기의 보존된 신장에 의해 부여되는 친핵성(karyphilic) 특성을 갖으며, 이는 핵 국소화 신호(NLS)를 구성한다(Bukrinsky등, 1993). Vpr은 또한 별개의 NLS를 포함한다.(Mahalingam등, 1995). MA-NLS 돌연변이주 바이러스는 기능적 vpr 유전자의 부재시 거식세포내에서 효율적으로 복제하는데 실패하였다(Heinzinger등, 1994). 이들 데이터는 MA뿐만 아니라 vpr도 HIV-1의 친핵성 결정군으로서 작용하는 것으로 해석되었다. vpr의 부재시, 단핵세포-유도된 거식세포의 형질도입 효율은 기능적 MA의 존재하에 50%이상 감소하였다. (Naldini등, 1996).
Lever등에 의해, 1989에 의해 보고되었으며, HIV-1을 포장하는데 요구되는 서열을 보이는 작업에 따르면, HIV-1 기초한 유전자 치료 벡터의 개발에 많은 관심이 있어왔다. 복제 결손 HIV-1 기초한 벡터에 의한 인간 T-세포계내로의 외부 유전자 전달은 Poznanski등에 의해 입증되었다(Poznansky등, 1991). 다른 그룹은 tat-유도가능하거나(Buchschacher, Jr. 및 Panganiban, 1992) 혹은 이형(heterologous) 촉진제(Shimada등, 1991)를 사용하여 HIV-1 기초한 벡터를 고안하였다. 그러나 이들 벡터로 얻어진 바이러스 역가는 낮으며(거의 103감염성 입자/ml), 이는 벡터 시스템이 헬퍼 바이러스가 없는 벡터의 생성을 보증할 수 있는지에 대해서는 분명하지 않다. 보다 최근에는, 헬퍼 바이러스가 없는 벡터를 제조하고자 하는 새로운 노력이 3가지-플라스미드 공형질감염체에 기초되고 있다(Richardson등, 1995). HIV 벡터는 Vesicular Stomatitis Virus 글리코단백질(VSV-G)로 위형(pseudotype)될 수 있으며, 이들 입자는 초원심 분리에 의해 농축후 감염성을 보유한다(Akkina등, 1996). VSV-G와의 위형은 보다 넓은 숙주 범위를 부여하고 재조합의 기회를 제거하여 야생 타입 HIV막을 제조한다. 생체내에서, 비분열하는 신경성 세포의 형질도입은 3가지 플라스미드 공형질감염 시스템내에서 HIV-1의 VSV-G 위형으로 입증되었다(Naldini, 1996 and Naldini등, 1996a).
HIV-1은 9개의 유전자를 포함하며, 그중에서 3가지인 gag, pol 및 env가 모든 레트로바이러스내에서 발견되었다. 이들은 구조 유전자이다. 나머지 6가지:vif, vpu, vpr, nef, tat 및 rev는 보조 유전자로서 언급된다. 나머지 레트로바이러스는 그들의 야생 타입 게놈내에서 다른 셋트의 보조 유전자를 갖는다. 다른 레트로바이러스중 몇몇 보조 유전자는 이들이 문헌상에서 항상 동일명을 줄 수는 없지만 HIV-1에 대하여는 유사체(analogous)이다. 유사한 보조 유전자는 뉴클레오티드 서열내에서 상동성을 갖으며, 동일하거나 유사한 작용을 수행한다. HIV-2 및 SIV 스트레인은 일반적으로 HIV-1에 대한 env, vpr, vif, tat 및 nef 유전자를 포함한다. HIV-2 및 SIV의 몇몇 스트레인은 vpr이 부족한 몇몇 SIV 스트레인내에서 vpr에 대한 구조 유사체로 간주될 수 있는 vpx를 또한 포함한다. HIV-1을 제외한 렌티바이러스는 HIV-1 보조 유전자에 대하여 유사하지 않은 보조 유전자를 또한 포함한다. 레트로바이러스 보조 유전자는 예를 들면 Tomonaga 및 Mikami(1996) 및 Joag등에 의해 Fields Virology, Vol 2.에 의해 검토되었다.
최근까지 HIV에 기초한 모든 벡터 시스템은 몇몇 혹은 모든 HIV 보조 유전자를 포함한다. RNA로서 작용하는 Rev는 단백질을 수출하고, tat은 프로바이러스 긴 말단 반복체(LTR)의 주된 변동자(transactivator)이다. 상기 보조 유전자는 바이러스 복제 및 위형내에서 도가니 역할을 한다. 상기 보조 유전자는 완전하게 특징화되지 않아 그 작용을 한정하지 않는다.
그러나 몇몇 보조 유전자는 HIV-1의 병원균내에 포함된 것으로 여겨진다. tat은 Kaposi의 육종 개발내에 포함되었다(Barillari등, 1993; Ensoli등, 1990). HIV vpr은 세포 정지 및 앱토시스(apoptosis)를 유발하는 것으로 보여지며, 이는 AIDS 환자에게서 보여지는 T-Cell 기능장애의 요인인 것으로 제안된다(Jowett등, 1995). 또한 말초 혈액내에 존재하는 세포외 Vpr은 Vpr이 세포 증식 및 분화를 유도하기 때문에 HIV 감염에 관련된 조직-특이성 병리학에 기여하는 것으로 제안되었다(Levy등, 1993 및 Levy등, 1995).
보조 유전자의 역할이 분명하지 않고, 이들은 아마도 병원균내에서 주된 역할을 하기 때문에, 증식하지 않는 세포를 형질도입하기 위해 충분히 높은 레트로바이러스 벡터 역가 및 성능이 보유될 수 있다면 HIV-1 벡터 생성 시스템으로부터 제거하는 것이 바람직하다.
Naldini등의 데이터는 vpu의 존재 혹은 부재가 벡터 입자 역가에 영향을 미치지 못함을 보인다. 즉, 이들이 사용된 포장 시스템은 VSV-G로 위형될 때 4×10`역가를 낳으며, 이 시스템은 env 및 vpu음성이었다. 단지 env음성인 또다른 시스템에 있어서, 이들은 동일한 역가를 얻었다(Naldini등, 1996 및 Naldini등, 1996a). 그러나 이미 논의된 바와 같이, vpu 음성인 것뿐만 아니라 vpr 음성인 Naldini등의 또다른 시스템은 vpr 양성 시스템에 비하여 50%정도 감소된 형질도입 효율을 보였다.
본 발명자들은 레트로바이러스 벡터 생성 시스템중에 몇몇 혹은 모든 보조 유전자를 남겨두는 것이 벡터 입자 역가 혹은 벡터 입자의 능력을 충분하게 절충하지 못하게 하여 분열하지 않는 세포를 형질도입한다는 것을 발견하였다.
본 발명은 레트로바이러스 벡터 생성 시스템 및 상기 시스템에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터 입자에 관한 것이다. 보다 상세하게는 특정 레트로바이러스 보조 인자가 결여된 시스템 및 벡터 입자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 유전자 치료에 사용하는 레트로바이러스 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 일견지에 의하면, 유전자 치료를 위한 렌티바이러스-기초한, 복제 결손 벡터 입자를 제조하기 위한 레트로바이러스 벡터 생성 시스템이 제공되며,
상기 벡터 입자는 분열하지 않는 포유류 표적 세포를 감염하고 형질도입할 수 있으며,
상기 시스템은 벡터 성분을 엔코딩하는 헥산 서열 셋트를 포함하며,
여기서 하나 이상의 기능적 유전자는 HIV-1 보조 유전자 vpr, vif, tat 및 nef 또는 다른 렌티바이러스의 유사한 보조 유전자로 부터 선택되며,
벡터 입자가 기초로된 렌티바이러스내에 통상 존재하는 보조 유전자는 시스템으로부터 부재한다.
생성 시스템이 HIV-1 기초한 벡터에 대한 것이고, vpr 및 vpu가 모두 부재할 때를 조건으로 하여 기능적 vpu 유전자가 또한 부재하며, 다른 보조 유전자중 하나가 또한 부재한다.
본 발명의 제2견지에 의하면, 본 발명은 본 명세서내에 기술된 레트로바이러스 벡터 입자 생성 시스템에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터 입자가 제공된다.
본 발명의 제3견지에 의하면, 본 발명은 본 명세서내에 기술된 레트로바이러스 벡터 생성 시스템에 사용하는 DNA 구조가 제공되며, 상기 DNA구조는 레트로바이러스 벡터 입자에 대하여 포장가능한 RNA 벡터 게놈을 엔코딩하며, 촉진제에 실시적으로 결합되며,
rev가 임의로 존재하는 것을 제외하고는 모든 기능적 레트로바이러스 보조 유전자가 상기 구조로부터 부재한다. DNA 구조는 벡터 입자의 구조 성분을 몇몇 내지는 모두 엔코딩하는 DNA 구조 셋트의 일부로서 제공될 수 있다.
본 발명의 제4견지에 의하면, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같이 유전자 치료 및 유전자 치료용 의약품의 제조에 사용하는 레트로바이러스 벡터 입자; 및 본 명세서내 기술된 레트로바이러스 벡터 입자를 사용하여 표적 세포를 감염 및 형질도입함을 포함하는 표적 세포상에서 유전자 치료를 수행하는 방법이 제공된다. 본 발명은 나아가 이들 사용 및 방법으로부터 제조된 형질도입된 표적 세포가 제공된다. 따라서 본 발명에서는 의약품내에서 사용하기 위한 유전자 전달 시스템이 제공된다.
표현 "렌티바이러스-기초한"이란 벡터 입자가 렌티바이러스로부터 유도된 것을 의미한다. 벡터 입자의 게놈은 백본으로서 렌티바이러스로부터의 성분을 포함한다. 상기 모든 벡터 입자는 역전사 및 통합 시스템을 포함하여, RNA 게놈과 양립가능한 필수적인 벡터 성분을 포함한다. 보통 이들은 렌티바이러스로부터 유도된 gag 및 pol 단백질을 포함할 것이다.
렌티바이러스로부터 유도되기 때문에, 상기 레트로바이러스 벡터 입자는 분열하지 않는 세포를 감염 및 형질도입할 수 있다. 따라서 상기 벡터 입자는 치료적으로 활성있는 유전자와 같은 선별된 유전자 혹은 유전자들을 표적 세포의 게놈으로 전달할 수 있다. 감염과정동안, 렌티바이러스는 인테그라제, 코어 단백질 및 프로바이러스 DNA를 포함하는 표적 세포 세포질내에서 예비-통합 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 단백질내 신호 서열에 의하여, 표적 세포의 핵막을 가로질러 통과할 수 있다. 비-렌티바이러스 레트로바이러스는 단백질이 부족하거나 혹은 단백질을 갖더라도 적당한 신호 서열이 없다.
렌티바이러스의 예는 HIV-1 및 HIV-2, SIV, FIV, BLV, EIAV, CEV 및 비스나(visna) 바이러스이다. 이중 HIV 및 SIV가 현재 최상으로 여겨진다. 그러나 면역결손 바이러스는 불가피하게 안전성 측면 및 손상을 초래하기 때문에 비-면역결손 바이러스가 유전자 치료에 사용하기에 바람직하다.
레트로바이러스 벡터 생성 시스템으로부터의 기능적 보조 유전자가 부재한다는 것은 이들 기능적 유전자가 시스템에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터 입자로부터 부재할 것이라는 것을 의미한다. 또한 이들 유전자에 의해 엔코드되고 벡터 입자내로 편입된 어떠한 보조 단백질은 벡터 입자로부터 부재할 것이다. 알려진 레트로바이러스 벡터 생성 시스템에 있어서, 상기 보조유전자는 벡터 게놈-엔코딩 DNA의 일부로서 존재하거나 혹은 포장 성분과 함께 존재할 것이다. 벡터 생성 시스템내 보조 유전자의 위치는 다른 레트로바이러스 성분과의 관계에 일부 의존한다. 예를 들면, vif는 종종 포장 세포내에서 gag-pol 포장 카셋트의 부분이다. 따라서 본 발명의 목적을 위하여 기능적 보조 유전자를 제거하기 위해서는 포장 성분, 혹은 벡터 게놈 혹은 둘다로부터의 제거를 포함할 수 있다.
기능적 보조 유전자를 제거하는데는 유전자의 완전한 제거를 필요로 하지 않는다. 통상, 유전자의 부분적 제거 혹은 몇몇 다른 방식에 의한 유전자의 파괴면 충분할 것이다. 기능적 보조 유전자의 부재란 본 명세서에서는 유전자가 기능적 보조 단백질을 엔코딩할 수 있는 형태로 존재하지 않는다는 의미로 여겨진다.
본 발명의 바람직한 시스템에 있어서, 벡터 입자가 기초하는 렌티바이러스내에 통상 존재하는 기능적 vpr 및 tat 유전자 혹은 구조 유사체 유전자가 모두 부재한다. 이들 2가지 보조 유전자는 유전자 치료 벡터에 특히 바람직하지 않은 렌티바이러스의 특성과 관련이 있다. 그러나 상기 주어진 조건을 제외하고는, 본 발명은 부재하는 보조 유전자의 조합에 관하여 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 의한 시스템에 있어서, HIV-1 기초한 벡터 입자를 제조하기 위해서는 유전자중 3 혹은 보다 바람직하게는 4개의 어떠한 조합이 그들의 기능적 형태내에서 부재할 수 있다. 가장 바람직하게는 보조 유전자 vpr, vif, tat, net 및 vpu의 5가지 모두가 그들의 기능적 형태내에서 부재하는 것이다. 유사하게는 다른 렌티바이러스에 관한 시스템에 있어서, 보조 유전자 모두(rev/RRE 시스템에 대한 구조 유사체 시스템으로 대체되지 않는다면 존재하는 것이 바람직한 rev를 제외하고는)가 그들의 기능적 형태내에서 부재하는 것이 가장 바람직하다.
핵으로부터 세포질로의 벡터 게놈의 RNA 전사체의 효율적인 수출을 확고히 하기 위해서, 벡터 게놈내에 기능적 rev 및 rev 응답 요소(RRE) 서열을 포함하거나 혹은 rev/RRE 시스템과 동일한 작용을 수행하는 게놈내에서 대체 서열을 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들면, rev/RRE의 기능적 구조 유사체는 Mason Pfizer 원숭이 바이러스에서 발견되었다. 이는 CTE로서 알려졌으며, 감염된 세포내에서 인자와 상호작용하는 것으로 여겨지는 게놈내에서 RRE-타입 서열로 이루어진다. 상기 세포성 인자는 rev 구조유사체로 여겨질 수 있다. 따라서 CTE는 rev/RRE 시스템에 대한 대안으로서 사용될 수 있다.
명백한 바와 같이, 벡터로서 작용하기 위하여 본 명세서에서 기술된 레트로 바이러스 벡터 입자는 프로바이러스의 전환 및 표적 세포 게놈내로 이중-스트랜드된 DNA의 통합을 가능케하는 역전사 시스템(역전사효소 및 프라이머 결합 자리와 양립가능함) 및 통합 시스템(인테그라제 및 통합 자리와 양립가능함)를 갖을 필요가 있다. 부가하여 상기 벡터 게놈은 포장 신호를 포함할 필요가 있다. 이들 시스템 및 신호는 일반적으로 벡터가 기초로 하는 렌티바이러스로부터 유도될 것이다. 이는 본 발명에 의한 벡터가 렌티바이러스에 기초한다고 하더라도, 벡터내로 편입된 렌티바이러스의 요소는 유전학적으로 혹은 야생 타입 렌티바이러스내에서 요소의 변형판일 수 있음이 명백할 것이다. 변형은 RNA 게놈 혹은 레트로바이러스성 벡터 입자 생성 시스템의 다른 성분을 조작함으로써 얻어질 수 있다. 예를 들면, 벡터를 필요로 하지 않는 렌티바이러스 게놈의 분획은 배제될 수 있다. 또한 상기 벡터 생성 시스템은 예를 들어 렌티바이러스 env 유전자와 같이 다른 표적 세포 범위를 줄 수 있는 치환체(이는 위형 타입으로서 알려져 있다)를 제공할 수 있다.
본 발명에 의한 레트로바이러스 벡터 입자는 표적 세포를 전달하기 위한 하나 이상의 선별된 유전자를 나른다. 선별된 유전자는 얻고자 하는 효과에 따라 선택된다. 유전자 치료 목적을 위해서, 처치 혹은 방지하기에 바람직한 조건에 대하여 활성있는 유전자 산물을 엔코딩하는 치료적으로 활성있는 최소한의 유전자가 있을 수 있다. 부가하여 검출가능한 산물을 엔코딩함으로써 마커로서 작용하는 선별된 유전자일 수 있다. 치료 유전자는 예를 들면, 항감응성 RNA, 리보짐(rybozyme), 표적 단백질의 트란스우세(transdominant) 음성 돌연변이주, 독소, 잠정적인 독소, 항체 혹은 헬퍼 T-세포 혹은 세포독성 T-세포를 유도하는 항원, 단일쇄 항체 혹은 종양 억제 단백질을 엔코드할 수 있다.
바람직하게는 벡터 게놈의 구조는 DNA 프로바이러스내에서, 치료 유전자 혹은 유전자들이 5' LTR의 전사제어하에 있거나 혹은 벡터로부터 어떠한 다른 촉진제에 실시가능하게 결합된 것이다. 따라서 유전자 혹은 유전자들의 발현은 단일 전사 유니트내에서 이다. 바람직하게는 또한 5' LTR은 촉진제 작용이 tat-의존적이지 않은 변형된 렌티바이러스 LTR이다. 이는 R 및 U3 렌티바이러스 촉진제 작용을 대체적인 촉진제 작용으로 대체함으로써 얻어질 수 있으며, 이는 또다른 레트로바이러스로부터 유도될 수 있거나 혹은 비-레트로바이러스 근원일 수 있다. 이에 대한 방법은 Cannon등 1996내 및 그 실시예에 기술되어 있다.
용어 "유전자"는 넓게 사용되는 의미이며, 바라는 폴리펩티드 혹은 RNA를 코딩하는 어떠한 헥산을 포함하는 것이 명백할 것이다. 보통, 본 발명에 의한 벡터에 의해 전달될 유전자는 cDNA일 것이다.
본 발명에 의한 레트로바이러스성 벡터 입자는 또한 서서히-분열하는 감염 및 형질 도입 세포일 것이며, MLV와 같은 비-렌티바이러스가 효과적으로 감염 및 형질도입할 수 없다. 서서히 분열하는 세포는 3-4일마다 한번씩 분열한다. 포유류의 분열하지 않고 서서히-분열하는 세포는 뇌 세포, 간세포, 말단이 상이한 거식세포, 허파 상피성(epithelial) 세포 및 다수의 다른 세포 타입을 포함한다. 또한 특정 종양 세포를 포함한다. 종양이 신속하게 분열하는 세포를 포함하더고 하더라도, 종양의 중심에 있는 몇몇 종양 세포는 자주 분열한다.
본 명세서에서 기술된 벡터 게놈을 엔코딩하는 DNA 구조는 CMV 촉진제와 같은 고 효율성 촉진제에 결합되는 것이 바람직하다. 다른 고효율성 촉진제가 알려져 있다. 이는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템에 의해 벡터 RNA의 높은 수준의 발현을 일으킨다.
본 발명에 의한 레트로바이러스 벡터 시스템에서 사용하기 적합한 숙주 혹은 생산물 세포가 이 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 많은 레트로바이러스가 이미 복제 결손 게놈 및 포장 성분으로 분할되어졌다. 이 기술을 갖지 않는 것에 대하여 이렇게 하도록 하는 것이 이용가능하다. 상기 생산물 세포는 gag, pol 및 env 단백질과 같은 벡터 게놈에 의해 엔코드되지 않는 바이러스 성분들을 엔코드한다. 상기 gag, pol 및 env 유전자는 생산물 세포내로 도입될 수 있으며, 포장 세포계를 얻도록 세포 게놈내로 안전하게 통합될 수 있다. 그런 다음 상기 레트로바이러스 벡터 게놈은 레트로바이러스 벡터 입자를 제조하는데 필요한 모든 DNA 서열을 갖는 안정한 세포계를 생성하도록 형질감염 내지는 형질도입에 의해 포장 세포계내로 도입된다. 또다른 접근법으로는 예를 들어 env 코딩 서열, gag-pol 코딩 서열 및 결손 레트로바이러스 게놈과 같은 레트로바이러스 벡터 입자를 일시적인 삼중 형질도입에 의해 동시에 제조하는데 필요한 다른 DNA 서열을 도입하는 것이다. 본 발명에 의한 바람직한 시스템에 있어서, 구조 성분과 벡터 게놈 모두는 숙주 세포 게놈내로 안전하게 통합된 DNA에 의해 모두 엔코드될 것이다.
첨부된 도면에서,
도 1은 293T 세포의 3가지 플라스미드 공-형질감염체를 사용하는, 본 발명에 의한 벡터 생성 시스템을 도시한 도면이며;
도 2는 본 발명에 사용하는 HIV-기초 벡터 게놈을 도시한 도면이며;
도 3은 본 발명에 사용하기 위한 HIV-1 gag-pol 유전자 발현 플라스미드를 도시한 도면이며;
도 4는 5가지 보조 인자가 부족한 본 발명에 의한 벡터에 대한 형질도입 효율을 도시한 도면이다.
모든 불필요한 유전자가 결여된 안정한 HIV 포장 시스템을 제조하기 위해서, 본 발명자들은 vpr, nef, tat, vif 혹은 vpu를 함유하지 않은 시스템을 개발하였다(도 1). 상기 포장 성분을 3가지 별개의 플라스미드상에 배치하고, 재조합이 없고 헬퍼 바이러스 생성이 없는 것을 확고히 하도록 하여 중첩하는 서열을 최소화하였다. 이 HIV 벡터는 vpr의 부재시 에이피디콜린(aphidicolin) 처치된 분열하지 않는 세포를 형질도입함을 보였다. 역가는 모든 보조 유전자를 함유하는 시스템에 대한 Naldini등 역가와 유사한 것으로 얻어졌다(Naldini등, 1996a).
이는 제1 최소 렌티바이러스 벡터 시스템이다. 이 시스템으로 높은 역가가 관찰된다는 사실은 보조 유전자(rev 제외)가 높은 역가의 생성에 대하여 그리고 분열하지 않는 세포의 형질도입을 위한 중복체인 것을 보인다. 이는 고 역가 바이러스 모액을 생성하는 이유가 바이러스 입자내로 부속 단백질(nef와 같은)의 편입에 기인한 것이라는 점에서 Naldini등에 의해 제조된 가정과 대조적인 것이다. (Naldini등 1996)
상기 시스템은 HIV 치료에 대한 부가적인 잇점을 가질 수 있다. HIV-1 LTR을 구성 성분의 HCMV 촉진제와 같은 다른 촉진제로 대체하는 것은 Tat 트란스우세 돌연변이주(Echetebu등, 1994) 혹은 TAR 유인물(Lisziewxicz등,1993)와 같은 항-Tat 분자가 벡터 생성에 영향을 미치지 않을 것이므로 이들을 치료제로 사용하도록 한다.
모든 야생-타입 바이러스 보조 유전자가 없는, 본 명세서에 기술된 최소 렌티바이러성 벡터는 또한 백신으로서의 적용처를 가질 수 있음이 명백할 것이다.
물질 및 방법
플라스미드 구조
pGP-RRE1은 gagpol vif 발현 플라스미드 유도된 pWI3(Kim등, 1989)이다. pWI3의 RRE(Accession number:U26942)가 pBSRRE를 제조하는 pBluescript KS+ Sma I 절단물내로 Sty l/Sty l 분획(7720-8050)을 무딘-말단에 의해 삽입되었다. pWI3의 Nar l/Eco Rl 분획(637-5743)은 Cla l 및 Eco Rl를 갖는 pBSRRE 절단물내로 삽입되어 pBSGPRRE1을 제조하였다. Xhol l/Not l 분획(gagpol 및 RRE를 포함함)이 발현 플라스미드 pCl-Neo내로 삽입되어 pGR-RRE1을 제조하였다. vif 코딩 영역을 제거하기 위하여, pBSGPRRE1은 Ndel 및 Smal로 절단되었으며, 무딘-말단 처리되었으며, 퇴거(relegate)되어 pBSGPRRE2를 생성하였다. 상기 gagpol 유전자 및 RRE는 Xhol 및 Notl 자리내에서 pCl-neo내로 삽입되어 pGPRRE2를 제조하였다.
pTIN406, pTIN408 및 pTIN414의 구조가 기술되어 있다(Cannon등, 1996). 상기 pH3Z 및 pH4Z의 5' LTR은 U3 위치 및 HIV R 및 U5 영역에 CMV 촉진제를 함유한다. HIVdge는 프레임이동 돌연변이를 생성하도록 Cla l 자리(829)를 무딘-말단 처리하여 HIVgpt로부터 제조되었다(Page등, 1990). HIVdge는 Bgl ll과 Pst l(473-1414)로 절단되고, pTIN406내로 삽입되었다. pTIN406은 CMV, R(HIV) 및 U5(MLV)의 LTR 구조를 갖는다. 이는 HIV로부터 CMV 및 R,U5를 함유하는, pBS5'라 불리우는 하이브리드 LTR를 제조한다. rev 및 RRE를 갖는 플라스미드를 제조하기 위하여, Ndel으로부터 Bgl ll(6403-7621)로의 결손을 포함하는 HIVdge 유도체인 HIVdge1.2로부터 Eco Rl/Xho l 분획(5743-8897)을 절단하고, pBS5'내로 삽입하여 pBS5'R을 제조하였다. 상기 3' LTR은 pH2를 생성하는 pBS5'R내로 pBS3'의 Not l/Xho l분획을 삽입함으로써 제조된다. pWI3의 Xho l/Hind lll 분획, pTIN408의 Hind lll/Kpn l 분획을 pBluescript KS+(Xho l/Kpn l)내로 세가지 방식으로 결찰(ligation)시켜 pBS3'를 제조하였다. CMV 촉진제는 pH2CMV를 제조하는 pSPCMV(Sal l/ Xhol)로부터 pH2의 단일 Xho l 자리내로 삽입되었다. pSPCMV는 pSP72(Promega)내로 pLNCX(Accession number:M28246)(Pst l/Hind lll)를 삽입함으로써 제조되었다. β-갈락톡시다제 유전자를 PTIN414로부터 pSP72(Xhol l/Sph l)내로 삽입함으로써 pSPlacZ를 제조하였다. pSPlacZ의 Xho I/Sal I 소화(digest)는 pH2-CMV내로 삽입된 β-갈락톡시다제 코딩 영역을 주어 pH3Z를 얻었다. pH4Z는 tat-결손 벡터를 제조하도록 구조화되었다. PCR 프라이머 DELT 5(5'-CGTGAATTCGCCTAAAACTGCTTGTACCA-3') 및 DELT3(5'-GAACTAATGACCCCGTAATTG-3')를 사용하여 증폭된 EcoRl(5881)-Spel PCR 산물로 pH3내의 EcoRl(5743)l-Spel 분획을 대체함으로써 tat-코딩 영역의 첫50bp가 제거되어 pH4를 제조하였다. 상기 pH4로부터의 Nsi l/Spe l 분획을 pH3Z내로 삽입하여 pH4Z를 생성하였다.
vpr 발현 플라스미드는 하기 프라이머를 사용하여 pNL4.3(Accession number:U26942)로부터 vpr 코딩 영역의 PCR 증폭에 의해 구조화되었다: 5'프라이머 GCGAATTCGGATCCACCATGGAACAAGCCCCAGAAGAC(5563-5583) 및 3'프라이머 GCGAATTCGGATCCTCTAGGATCTACTGGCTCCATT(5834-5853). 이 앰플리콘(amplicon)은 pLIGATOR내로 유전자 조작되었다(R&D Systems). 상기 발현 플라스미드 pCl-vpr은 pCl-Neo(Promega)내로 vpr 코딩 영역을 함유하는 Mlu l 및 Xho l 분획을 삽입함으로써 제조되었다.
pAC29.1은 Bam Hl에 의해 절단되어 pSA91(Bgl ll)내로 삽입된 VSV-G 코딩 영역을 얻었다.
세포계
293T(293ts/A1609)(DuBridge등 1987) 세포는 Dulbelco의 변형된 Eagle의 배지(GIBCO), HeLa 세포 및 MEM내 208F 세포(GIBCO)내에서 유지되었으며, 이들 모두는 항생물질이 보충된 송아지 태아 혈청을 10%(v/v)를 포함한다.
벡터의 생성 및 검정
본 발명자들이 예전에 공개한 프로토콜(Soneoka등, 1995)에 의해 레트로바이러스 벡터 모액이 제조되었다. 간략하게는 인간 신장 293T(1.5×106) 세포를 10cml 플레이트상에 배치하고, 칼슘 포스페이트 DNA 침전법(Chen and Okayama, 1987)에 의해 각 플라스미드(벡터 플라스미드와 함께 gag-pol 및 env 발현 플라스미드) 15mg을 일시적으로 형질감염시켰다. 상기 배양물 상청액을 36시간후 회수하고, 0.45mm를 통하여 여과시키고 즉시 사용하거나 -70℃에서 동결시켰다. 신선한 배지의 첨가에 이어 폴리브렌 8mg/ml의 존재하에 바이러스를 표적 세포상에 2시간동안 첨가함으로써 형질도입이 수행되었다. 미리 기술된 바와 같이(Soneoka등, 1995), 5-브로모-4-클로로-3-인돌일일 b-D-갈락톡시다제(X-Gal)을 48시간후 β-갈락톡시다제의 발현을 측정하는데 사용하였다. ml당 lac z(청색 병소)를 형성하는 유니트의 수(l.f.u./ml)의 수를 셈으로써 역가를 얻었다. G1/S 파지 정지된 배양물은 감염 24시간전에 에이피디콜린을 첨가(5mg/ml)한 다음, 매일 실험하였다.
결과
HIV 벡터 생성
H3Z(tat 양성) 및 H4Z(tat 음성)은 293T 세포내로 공형질감염되는 3가지 플라스미드에 의해 제조되는 것으로 고안된 HIV-1 기초한 벡터이다(도 2). HIV 코어에 의한 효율적인 포장을 위하여, 상기 벡터는 gag의 첫778 염기를 포함하나, ATG 개시 코돈으로부터 40bp도입된 프레임이동 돌연변이는 gag 단백질의 발현을 방지한다. 포장 효율을 끌어올리도록 RRE가 포함되며, HIV mRNA 수출을 지지하도록 rev가 벡터로부터 발현되었다. 내부 CMV 촉진제-유도된 β-갈락톡시다제 유전자는 보고자 유전자로서 작용하도록 삽입되었다. 이들 모두에 대하여 벡터 게놈 전사는 5' LTR U3를 대체하는데 사용되어온 CMV 촉진제에 의해 유도된다. 이는 벡터 게놈을 tat 독립적으로 제조한다. 2가지 HIV-1 gagpol 구조가 제조되었다(도 3); pGP-RRE1(vif 양성) 및 pGP-RRE2(vif 음성). 상기 gagpol 유전자가 CMV 유도된 발현 플라스미드가 있는 pCl-neo내로 삽입되기 때문에, gagpol 발현은 tat 독립적이다. pRV67, 상기 VSV 글리코단백질 구조가 위형을 위해 사용되었다. 다른 플라스미드상에 다른 유전자를 배치함으로써, 재조합에 의한 복제 적격의 바이러스를 생성할 확률을 최소화할 수 있다.
벡터의 형질도입 효율
상기 기술된, 즉시 사용되거나 -70℃로 동결된 3가지 플라스미드를 갖는 인간 신장 293T 세포의 일시적인 공형질감염에 의해 복제 결손 레트로바이러스 입자가 제조되었다. 다른 벡터 구조가 바이러스를 제조하는데 사용되었다. 상기 최소 구조(H4Z 및 pGP-RRE2)는 vif, vpr, nef 및 tat 양성 바이러스에 필적하는 역가를 주었다(표 1).
최소 시스템이 다수의 세포계상에서 시험될 때, 역가는 다르다(표 2). 상기 벡터는 폴리브렌 처리로는 3.2×105l.f.u./ml의 역가를 얻으며, 폴리브렌 처리없이는 293T 세포내에서 9.1×104l.f.u./ml를 얻었다. 또한 동일한 벡터가 폴리브렌없이 HeLa 및 208F 세포내에서 각각 9.6×103l.f.u./ml 및 8.3×103l.f.u./ml를 얻었다. 이들 역가는 Naldini등, 1996에 의해 얻어진 것(Naldini등, 1996)에 필적하며, 이는 지금까지 공개된 것중 가장 높은 것이다.
에이피디콜린-처치된 세포의 형질도입에 있어서, vpr이 미치는 영향
분열하지 않는 세포 형질도입에 있어서, vpr이 미치는 효과를 시험하기 위하여, vpr을 pH4Z, pGP-RRE2 및 pRV67플라스미드에 따라 pCl-vpr의 공-형질감염에 의해 포장 시스템내에 포함되었다. 생성된 바이러스 입자의 형질도입 효율을 293T 세포 및 HeLa 세포를 성장시키고, 성장-정지시키면서 검정하였다(도 4). MLV-유도된 포장 및 형질도입 벡터(Soneoka, 1995)를 대조군으로서 제공하였다. HeLa 세포 및 293T 세포는 에이피디콜린 처치에 의해 G1/S 파지에서 성장-정지되었다. MLV-기초 벡터가 단지 0.002%만큼 효과적인데 반하여, 최소 HIV 벡터 H4Z는 HeLa 및 293T 세포를 증식함에 따라 G1/S-정지물을 형질도입하기에 효율적이었다.
vpr-결손 H4Z는 HIV-1 MA가 분열하지 않는 세포를 형질도입하는 능력을 갖는 벡터를 제공하기에 충분하다고 제안하는 경우, vpr-포함 벡터만큼 효율적으로 성장-정지된 세포를 형질도입할 수 있다.
결론
본 발명자들은 HIV-1 기초한 벡터 생성 시스템을 배열하였으며, 여기에는 3가지 플라스미드 공-형질감염법에 기초한 vpr, vpu, nef, vif 및 tat은 포함되지 않는다. 이 벡터는 역가가 최대 3.2×105l.f.u./ml인 증식 세포를 형질도입할 수 있으며, 이는 다른 MLV-기초한 벡터와 대비가능한 것이며, 초미세 원심분리를 사용하여 농축에 의해 쉽게 증가될 수 있다(미도시됨). 헬퍼 바이러스는 검출되지 않았다(미도시됨).
상기 최소 벡터는 vpr, vif, nef 및 tat 함유 벡터만큼 효과적인 성장-정지된 HeLa 세포 및 293T 세포를 형질도입하는 것이 입증되었다. 따라서 단지 rev만이 높은 역가 HIV 기초한 벡터의 제조에 필요시되며, 이들 벡터는 분열하지 않는 세포를 형질도입할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.
이는 분열하지 않는 세포를 형질도입할 수 있는 높은 역가 최소 렌티바이러스 벡터의 구조에 관한 첫 보고서이다. 6개 보조 유전자중 5개의 제거(rev제외) 및 플라스미드간에 최소 서열 중첩은 이들 시스템을 최근까지 유전자 치료를 위한 HIV-벡터의 제조중에서 가장 안정하게 한다.
도면에 대한 설명
도 2. HIV 벡터 게놈. 숫자는 HXB2로부터의 배위체를 나타낸다. HCMV 촉진제(-597∼-1), HXB2로부터의 HIV 서열(455∼1415; 5743(H3Z) 혹은 5881(H4Z)∼6403; 7621∼8897; 8897∼9720). 내부 촉진제(900bp)로서의 HCMV 촉진제. 유전자 조작 자리(Xhol). 백본;pBluescriptKS+.
도 3. HIV-1 gag-pol 유전자 발현 플라스미드. HIV-1 gagpol 코딩 영역 및 RRE는 Xhol과 Notl 자리에서 pCl-neo(PROMEGA)내로 유전자 조작되었다.
도 4. 분열하지 않는 세포의 형질도입. H4Z 벡터의 형질도입 효율을 X-gal 염색에 의해 측정하고 l.f.u./ml로서 Y-축에 나타내었다. 세포를 에이피디콜린으로 처리(5㎍/ml)함으로써 G1/S 파지 정지된 세포가 제조되었다.
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벡터 역가에 있어서, 부속 유전자 발현이 미치는 영향
부속 유전자 플라스미드 역가(l.f.u./ml)a
Tat Vif Nef Vpr 벡터 Gagpol Nef Vpr
+ + - + pH3Z pGP-RRE1 pCl-Vpr 2.2×105
+ + + _ pH3Z pGP-RRE1 pC-Nef 2.5×105
+ + - _ pH3Z pGP-RRE1 4.0×105
+ - - _ pH3Z pGP-RRE2 3.7×105
- - - _ pH4Z pGP-RRE2 4.6×105
a:형질도입 효율은 형질도입후 48시간 X-gal 염색한 다음 청색 군체수를 셈으로써 293T 세포내에서 측정되었으며, 바이러스 모액 ml당 lacZ 군체를 형성하는 유니트로서 나타내었다(l.f.u./ml)
다수의 세포계상에서 최소 H4Z 벡터의 형질도입 효율
세포계 역가(l.f.u./ml)a폴리브렌없음 폴리브렌있음
293T 인간 신장 9.1×1043.2×105
HeLa 인간 상피(epithelium) 9.6×103없음
208f 쥐 섬유아세포(Rat fibroblast) 8.3×103없음
a:형질도입 효율은 형질도입후 48시간 X-gal 염색한 다음 청색 군체수를 셈으로써 293T 세포내에서 측정되었으며, 바이러스 모액 ml당 lacZ 군체를 형성하는 유니트로서 나타내었다(l.f.u./ml)
본 발명에 의하면, 분열하지 않는 표적 세포를 감염 및 형질도입할 수 있는 렌티바이러스-기초한 벡터 입자를 제조하는 레트로바이러스 벡터 제조 시스템이 제공된다. 상기 시스템 및 결과 레트로바이러스 벡터 입자는 안정성면에서 현존하는 시스템 및 벡터보다 개선된다.

Claims (19)

  1. 유전자 치료를 위한 렌티바이러스-기초한, 복제 결손 벡터 입자를 제조하는 시스템에 있어서,
    상기 벡터 입자는 분열하지 않는 포유류 표적 세포를 감염하고 형질도입할 수 있으며,
    상기 시스템은 벡터 성분을 엔코딩하는 헥산 서열 셋트를 포함하며,
    여기서 하나 이상의 기능적 유전자는 HIV-1 보조 유전자 vpr, vif, tat 및 nef로 혹은 다른 렌티바이러스의 유사한 보조 유전자부터 선택되며,
    벡터 입자가 기초한 렌티바이러스내에 통상 존재하는 보조 유전자는 시스템에 없는, 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  2. 제1항에 있어서, HIV-1-기초한 벡터 입자를 제조하기 위해서, 상기 기능적 보조 유전자 vpu는 기능적 vpu 및 vpr 유전자가 모두 부재(不在)하는 것을 조건으로 하여 또한 부재하며, 또한 vif, tat 및 nef로부터 선택된 하나 이상의 보조 유전자 또한 부재함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 벡터 입자가 기초로 하는 렌티바이러스내에 통상 존재하는 기능적 vpr 및 tat 유전자 혹은 유사체 유전자는 시스템으로부터 모두 부재함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한항에 있어서, HIV-기초한 벡터 입자를 제조하기 위해서, 기능적 보조 유전자 vpr, vif, tat, nef 및 vpu중 3 혹은 4 혹은 5개 모두가 시스템으로부터 부재함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  5. 제1항 내지 제4항중 어느 한항에 있어서, 상기 벡터의 RNA 게놈을 엔코딩하는 헥산 서열은 하나 이상의 치료적으로 활성있는 유전자를 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한항에 있어서, 상기 벡터 성분을 엔코딩하는 헥산 서열 셋트는 벡터의 RNA게놈, gag 및 pol 단백질 및 env 단백질 혹은 그 치환체를 각각 엔코드하는 3가지 DNA 구조를 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한항에 있어서, 상기 벡터의 RNA 게놈을 엔코딩하는 헥산 서열은 핵으로부터 세포질로 게놈의 전사체를 수출할 수 있도록, rev 및 RRE 서열 혹은 그 기능적 등가물을 포함함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  8. 숙주 세포내에서의 제1항 내지 제7항중 어느 한항에 의한 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  9. 제1항 내지 제8항중 어느 한항에 있어서, 벡터 입자가 기초로 되는 렌티바이러스내에 통상 존재하는 모든 기능적 보조 유전자는 임의로 존재하는 rev를 제외하고는 시스템으로부터 부재함을 특징으로 하는 레트로바이러스 벡터 생성 시스템
  10. 포장가능한 RNA 벡터 게놈을 엔코딩하며, 실시가능하게 촉진제에 결합되는 제9항에 의한 시스템에서 사용하는 DNA 구조
  11. 제10항에 있어서, 상기 촉진제는 비-레트로바이러스성, 고효율성 촉진제임을 특징으로 하는 DNA 구조
  12. 제10항 또는 제11항에 의한 DNA 구조를 포함하며, gag 및 pol 단백질을 엔코딩하는 DNA 구조를 포함하는 제9항에 의한 시스템에서 사용하는 DNA 구조 셋트
  13. 제12항에 있어서, 나아가 env 단백질 혹은 그 치환체를 엔코딩하는 DNA 구조를 포함함을 특징으로 하는 DNA 구조 셋트
  14. 하나 이상의 발현 벡터내에 제10항 내지 제14항중 어느 한항에 의한 DNA 구조를 포함하는 제9항에 의한 시스템에서 사용하는 DNA 구조
  15. 제1항 내지 제9항중 어느 한항에 의한 시스템에 의해 제조된 레트로바이러스 벡터 입자
  16. 제15항에 있어서, 표적 세포의 감염 및 형질 도입을 위한 유전자 치료에 사용하는 레트로바이러스 벡터 입자
  17. 유전자 치료에 사용하는 의약품을 제조하는데 사용하는 제15항에 의한 레트로바이러스 벡터 입자
  18. 표적 세포를 제15항에 의한 레트로바이러스 벡터로 감염 및 형질도입함을 포함하는 표적 세포상에서 유전자 치료를 수행하는 방법
  19. 제16항 내지 제18항중 어느 한항에 의해 제조된 표적 세포
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