CN112955174A - 融合剂脂质体组合物和其用途 - Google Patents

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J.R.鲁本斯
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Abstract

本公开至少部分地提供了用于体内递送融合剂脂质体的方法和组合物。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包含促进对靶细胞具有特异性的元件组合，例如融合剂、正向靶细胞特异性调节元件以及非靶细胞特异性调节元件中的一种或多种。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包含减少针对所述融合剂脂质体的免疫应答的一种或多种修饰。

Description

融合剂脂质体组合物和其用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年7月9日提交的标题为“融合剂脂质体组合物和其用途(FUSOSOME COMPOSITIONS AND USES THEREOF)”的美国临时申请第62/695,537号、2018年11月14日提交的标题为“融合剂脂质体组合物和其用途”的第62/767,241号、2019年5月15日提交的标题为“融合剂脂质体组合物和其用途”的第62/848,284号、2018年7月9日提交的标题为“融合剂脂质体组合物和其用途”的第62/695,650号、2018年11月14日提交的标题为“融合剂脂质体组合物和其用途”的第62/767,261号和2019年5月15日提交的标题为“融合剂脂质体组合物和其用途”的第62/848,305号，所述申请的内容以全文引用的方式并入。
通过引用合并序列表
本申请正与电子格式的序列表一起提交。序列表以文件标题V2050-7024WO_SeqList.TXT提供，所述文件在2019年7月9日创建，大小为2,549,164字节。电子格式的序列表的信息以全文引用的方式并入。
背景技术
复合生物制剂是用于多种疾病的有前景的治疗候选物。然而，由于质膜充当细胞与细胞外空间之间的屏障，因此难以将大的生物制剂递送到细胞中。所属领域中需要将复合生物制剂递送到个体的细胞中的新方法。
发明内容
本公开至少部分地提供了用于体内递送融合剂脂质体的方法和组合物。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包含促进针对靶细胞的特异性的元件的组合，例如融合剂、正向靶细胞特异性调节元件和非靶细胞特异性调节元件中的一种或多种。在一些实施例中，融合剂脂质体包含减少针对融合剂脂质体的免疫应答的一种或多种修饰。
列举的实施例
本文提供了融合剂脂质体，包括逆转录病毒载体或颗粒，如慢病毒载体或颗粒，与非靶细胞相比，所述融合剂脂质体在引入个体的细胞中之后，通常使得所期望的外源药剂(例如治疗转基因)在肝靶细胞中的表达增加。举例来说，在一些情况下，表达的增加是在向个体(例如人类个体)体内施用所提供的融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或颗粒)之后。具体地说，成功的基因疗法的主要挑战之一是治疗转基因(例如外源药剂)在体内的经基因修饰的细胞中维持稳定、长期表达的能力。在一些方面中，非靶细胞(如抗原呈递细胞(APC))中的转基因表达能够引起适应性免疫应答的活化，从而使B细胞产生针对转基因产物的中和抗体和/或使T细胞消除产生转基因的细胞。因此，限制靶细胞的转基因表达可以通过避免免疫清除来基本上影响转基因表达的持久性。此外，细胞类型特异性转基因表达可能与疾病生物学极其相关，如限制细胞凋亡基因向靶向肝细胞的表达。
具体地说，本文提供了融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或颗粒)，其包括在正向肝细胞特异性调节元件(例如，肝细胞启动子)和/或非肝细胞特异性调节元件的控制下或受其调节的核酸序列的表达。在一些实施例中，非肝细胞特异性调节元件是经受miRNA介导的基因沉默，如与非肝细胞中的miRNA序列互补的核酸序列所引起的基因沉默。在一些实施例中，所提供的融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或颗粒)能够特异性地驱动转基因(外源药剂)在肝细胞中的表达，同时约束或限制其在非靶(非肝)细胞中的表达。
所提供的实施例是：
1.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因，例如编码表5的外源药剂的有效负载基因，任选地，其中所述外源药剂是SEQ ID NO：161-518中的任一个中所示或是其功能片段或包含与SEQ ID NO：161-518中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的功能变异体；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的正向肝细胞特异性调节元件(例如，肝细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述正向肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述正向肝细胞特异性调节元件增加有效负载基因在肝细胞中的表达。
2.根据实施例1所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包含可操作地连接到所述有效负载基因的非肝细胞特异性调节元件(例如，非肝细胞特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述非肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述非肝细胞特异性调节元件减小所述有效负载基因在-肝细胞中的表达。
3.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因，例如表5的外源药剂，任选地，其中所述外源药剂是SEQ ID NO：161-518中的任一个中所示或是其功能片段或包含与SEQ ID NO：161-518中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的功能变异体；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的启动子，其中所述启动子是选自Apoa2、Cyp3a4、LP1B、MIR122、血红素结合蛋白、SERPINA1或HLP启动子，例如根据表3的序列或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列，任选地，其中所述启动子包含SEQ ID NO：133-136或519-525中的任一个中所示的所述序列或与SEQ ID NO：133-136或519-525中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列
4.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因，例如编码表5的外源药剂的有效负载基因，任选地，其中所述外源药剂是SEQ ID NO：161-518中的任一个中所示或是其功能片段或包含与SEQ ID NO：161-518中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的功能变异体；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)(例如，非靶细胞特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE减小所述有效负载基因在非靶细胞或组织中的表达。
5.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因，例如编码表5的外源药剂的有效负载基因，任选地，其中所述外源药剂是SEQ ID NO：161-518中的任一个中所示或是其功能片段或包含与SEQ ID NO：161-518中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的功能变异体；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的负向靶细胞特异性调节元件(负向TCSRE)(例如，组织特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述阴性TCSRE的其它方面类似的核酸，所述负向TCSRE减小所述外源药剂在非靶细胞或组织中的表达。
6.根据实施例4或5所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包含可操作地连接到所述有效负载基因的正向肝细胞特异性调节元件(例如，肝细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述正向肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述正向肝细胞特异性调节元件增加所述有效负载基因在肝细胞中的表达。
7.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；
b)核酸，其包含编码外源药剂的有效负载基因，例如编码表5的外源药剂的有效负载基因，任选地，其中所述外源药剂是SEQ ID NO：161-518中的任一个中所示或是其功能片段或包含与SEQ ID NO：161-518中的任一个至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的功能变异体；以及
c)以下中的一种或两种：
(i)所述脂质双层上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；或
(ii)第一免疫刺激性蛋白质，其不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
8.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体与靶细胞融合的速率高于非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
ii)所述融合剂脂质体与靶细胞融合的速率高于另一种融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
iii)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合；
iv)所述融合剂脂质体使所述核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞的速率高于递送到非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
v)所述融合剂脂质体使所述核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞的速率高于另一种融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；或
vi)所述融合剂脂质体以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率将所述核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞。
9.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一项或多项(例如2项或所有3项)适用：所述融合剂脂质体是逆转录病毒载体，所述脂质双层被包膜(例如病毒包膜)包含，以及所述核酸是逆转录病毒核酸。
10.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包含以下核酸序列中的一种或多种(例如全部)：5′LTR(例如，包含U5并且缺乏功能U3域)、Psi封装元件(Psi)、可操作地连接到所述有效负载基因的中心多嘌呤段(cPPT)启动子、有效负载基因(任选地包含位于开放阅读框之前的内含子)、Poly A尾序列、WPRE和3′LTR(例如，包含U5并且缺乏功能U3)。
11.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包含以下中的一种或多种(例如全部)：聚合酶(例如逆转录酶，例如pol或其一部分)、整合酶(例如pol或其一部分，例如功能或非功能变异体)、基质蛋白(例如gag或其一部分)、衣壳蛋白(例如gag或其一部分)、核衣壳蛋白(例如gag或其一部分)以及蛋白酶(例如pro)。
12.根据实施例7所述的融合剂脂质体，其包含(i)和(ii)。
13.根据实施例7到12中任一项所述的融合剂脂质体，其还包含所述脂质双层上的第二外源性或过度表达的免疫抑制蛋白。
14.根据实施例7到13中任一项所述的融合剂脂质体，其还包含第二免疫刺激性蛋白质，所述第二免疫刺激性蛋白质不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
15.根据实施例7到14中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如逆转录病毒载体)还包含可操作地连接到所述有效负载基因的正向肝细胞特异性调节元件(例如，肝细胞特异性启动子)，其中相对于缺乏所述正向肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述正向肝细胞特异性调节元件增加所述有效负载基因在肝细胞中的表达。
16.根据实施例7到15中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含可操作地连接到所述有效负载基因的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)(非靶细胞特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE减小所述有效负载基因在非靶细胞或组织中的表达。
17.根据实施例7到15中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含可操作地连接到所述有效负载基因的负向靶细胞特异性调节元件(负向TCSRE)(例如组织特异性miRNA识别序列)，其中相对于缺乏所述负向TCSRE的其它方面类似的核酸，例如逆转录病毒核酸，所述负向TCSRE减小所述外源药剂在非靶细胞或组织中的表达。
18.根据实施例7到17中任一项所述的融合剂脂质体，其中，当施用个体(例如，人类个体或小鼠)时，以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体不产生可检测到的抗体应答(例如在单次施用或多次施用之后)，或针对所述融合剂脂质体的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过FACS抗体检测分析，例如实例13或实例14的分析)；
ii)所述融合剂脂质体不产生可检测到的细胞免疫应答(例如T细胞应答、NK细胞应答或巨噬细胞应答)，或针对所述融合剂脂质体的细胞免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过PBMC溶解分析(例如实例5的分析)、NK细胞溶解分析(例如实例6的分析)、CD8杀手T细胞溶解分析(例如实例7的分析)或巨噬细胞吞噬分析(例如实例8的分析)；
iii)所述融合剂脂质体不产生可检测到的先天性免疫应答，例如补体活化(例如单次施用或多次施用之后)，或针对所述融合剂脂质体的先天性免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过补体活性分析(例如实例9的分析)；
iv)低于10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体被血清灭活，例如通过血清灭活分析，例如实例11或实例12的分析；
v)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的抗体应答(例如在单次施用或多次施用之后)，或针对所述靶细胞的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过FACS抗体检测分析，例如实例15的分析；或
vi)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的细胞免疫应答(例如T细胞应答、NK细胞应答或巨噬细胞应答)，或针对所述靶细胞的细胞应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在，例如通过巨噬细胞吞噬分析(例如实例16的分析)、PBMC溶解分析(例如实例17的分析)、NK细胞溶解分析(例如实例18的分析)或CD8杀手T细胞溶解分析(例如实例19的分析)。
19.根据实施例18所述的融合剂脂质体，其中所述背景水平是同一个体在施用所述融合剂脂质体之前的对应水平。
20.根据实施例7到19中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫抑制蛋白(例如，第一免疫抑制蛋白或第二免疫抑制蛋白)是补体调节蛋白或CD47。
21.根据实施例7到20中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫刺激性蛋白质(例如，第一免疫刺激性蛋白质或第二免疫刺激性蛋白质)是MHC I(例如，HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E或HLA-G)或MHC II(例如，HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ或HLA-DR)蛋白质。
22.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述外源药剂是选自：OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAH、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LMBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL、GRHPR、HOGA1或LDLR。
23.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包含VSV-G。
24.根据实施例1、2、6、15、22或23中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含肝特异性启动子、肝特异性增强子、肝特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的肝特异性位点、肝特异性mRNA核输出启动位点、肝特异性翻译增强位点或肝特异性翻译后修饰位点。
25.根据任何实施例1、2、6、15或22到24所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含肝细胞特异性启动子。
26.根据实施例25所述的融合剂脂质体，其中所述肝细胞特异性启动子包含表3的基序，任选地，其中所述启动子是SEQ ID NO：133-136或519-525中的任一个中所示或是与SEQ ID NO：133-136或519-525中的任一个具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列
27.根据实施例25或26所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含选自以下的启动子：增强的转甲状腺素蛋白(ET)、hAAT、Alb、Apoa2、Cyp3a4、LP1B、MIR122、血红素结合蛋白、SERPINA1或HLP启动子。
28.根据实施例4到6或16到21中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含非靶细胞特异性miRNA识别序列、非靶细胞特异性蛋白酶识别位点、非靶细胞特异性泛素连接酶位点、非靶细胞特异性转录抑制位点或非靶细胞特异性表观遗传抑制位点。
29.根据实施例4到6、16到21或28中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。
30.根据实施例4到6、16到21、28或29中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含非肝细胞特异性miRNA识别序列、非肝细胞特异性蛋白酶识别位点、非肝细胞特异性泛素连接酶位点、非肝细胞特异性转录抑制位点或非肝细胞特异性表观遗传抑制位点。
31.根据实施例4到6、16到21或28到30中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含由表4的miRNA结合的非肝细胞特异性miRNA识别序列，例如由miR-142、mir-181a-2、mir-181b-1、mir-181c、mir-181a-1、mir-181b-2、mir-181d、miR-223或miR-126中的一个或多个(例如，两个或更多个)结合。
32.根据实施例28到31中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE位于已转录区(例如，编码所述外源药剂的所述转录区)内或在所述已转录区内编码，例如使得由所述已转录区产生的RNA包含UTR或编码区内的所述miRNA识别序列。
33.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸包含一个或多个隔离元件。
34.根据实施例33所述的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸包含两个隔离元件，例如所述有效负载基因上游的第一隔离元件和所述有效负载基因下游的第二隔离元件，例如其中所述第一隔离元件和所述第二隔离元件包含相同或不同的序列
35.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其不具有遗传毒性或不增加靶细胞的肿瘤形成速率。
36.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸能够整合到靶细胞的基因组中。
37.根据实施例36所述的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸是整合胜任慢病毒或整合缺陷慢病毒。
38.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞是选自肝细胞、肝窦内皮细胞、胆管上皮细胞、星状细胞、肝驻留抗原呈递细胞(例如，库普弗细胞(Kupffer Cell))、肝驻留免疫淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)或门静脉成纤维细胞。
39.根据实施例4到6和9到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中具有以下中的一个或多个：
i)可检测到地存在于所述个体中的低于10％、5％、4％、3％、2％或1％的所述外源药剂处于非靶细胞中；
ii)所述个体中的可检测到地包含所述外源药剂的至少90％、95％、96％、97％、98％或99％细胞是靶细胞(例如，单一细胞类型的细胞，例如T细胞)；
iii)所述个体中的可检测到地包含所述外源药剂的细胞中低于1,000,000、500,000、200,000、100,000、50,000、20,000或10,000个细胞是非靶细胞；
iv)所述个体的所有靶细胞中的所述外源药剂的平均水平是所述个体的所有非靶细胞中的所述外源药剂的平均水平的至少100倍、200倍、500倍或1,000倍；或
v)所述个体的任何非靶细胞中均检测不到所述外源药剂。
40.根据前述实施例中任一项的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸编码正向TCSRE和/或NTCSRE或负向TCSRE。
41.根据前述实施例中任一项的融合剂脂质体，其中所述核酸，例如逆转录病毒核酸包含正向TCSRE和/或NTCSRE或负向TCSRE的补体。
42.根据实施例40或41中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述正向TCSRE包含在肝细胞(例如，肝细胞)比在非肝细胞中高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、400％、500％、750％、1000％或更多活性的肝特异性启动子。
43.根据实施例40到42中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述负向TCSRE或NTCSRE包含与肝细胞相比，使在造血细胞中的基因表达减少至少10％、25％、50％、75％或100％的miRNA识别序列。
44.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其不将核酸，例如逆转录病毒核酸递送到非靶细胞，例如抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞。
45.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中低于10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％、0.001％、0.0001％、0.00001％或0.000001％的非靶细胞类型(例如抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞中的一种或多种)包含核酸，例如逆转录病毒核酸，例如使用定量PCR，例如使用实例1的分析。
46.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述靶细胞的每个宿主细胞基因组包含核酸(例如逆转录病毒核酸或其一部分)的0.00001-10、0.0001-10、0.001-10、0.01-10、0.1-10、0.5-5、1-4、1-3或1-2个拷贝，例如其中在体内施用之后评估所述核酸，例如逆转录病毒核酸的拷贝数。
47.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
小于10％、5％、2.5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％的非靶细胞(例如抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞，或非癌细胞)包含所述外源药剂；或
外源药剂(例如蛋白质)在非靶细胞中检测不到，例如抗原呈递细胞、II类MHC+细胞、专门的抗原呈递细胞、非典型抗原呈递细胞、巨噬细胞、树突状细胞、骨髓性树突状细胞、浆细胞样树突状细胞、CD11c+细胞、CD11b+细胞、脾细胞、B细胞、肝细胞、内皮细胞或非癌细胞。
48.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体将核酸(例如逆转录病毒核酸)递送到靶细胞，例如T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀手细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞。
49.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％靶细胞(例如T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀手细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞中的一种或多种)包含所述核酸，例如逆转录病毒核酸，例如使用定量PCR，例如使用实例3的分析。
50.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少0.00001％、0.0001％、0.001％、0.001％、0.01％、0.1％、1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％靶细胞(例如T细胞、CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、肝细胞、造血干细胞、CD34+造血干细胞、CD105+造血干细胞、CD117+造血干细胞、CD105+内皮细胞、B细胞、CD20+B细胞、CD19+B细胞、癌细胞、CD133+癌细胞、EpCAM+癌细胞、CD19+癌细胞、Her2/Neu+癌细胞、GluA2+神经元、GluA4+神经元、NKG2D+自然杀手细胞、SLC1A3+星形胶质细胞、SLC7A10+脂肪细胞或CD30+肺上皮细胞中的一种或多种)包含所述外源药剂。
51.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用后，包含所述核酸(例如逆转录病毒核酸)的靶细胞与包含所述核酸(例如逆转录病毒核酸)的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据定量PCR分析，例如使用实例1和实例3的分析。
52.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞中的核酸(例如逆转录病毒核酸)或其一部分的平均拷贝数与非靶细胞中的核酸(例如逆转录病毒核酸)或其一部分的平均拷贝数的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据定量PCR分析，例如使用实例1和实例3的分析。
53.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞中的核酸(例如逆转录病毒核酸)或其一部分的中值拷贝数与非靶细胞中的核酸(例如逆转录病毒核酸)或其一部分的中值拷贝数的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据定量PCR分析，例如使用实例1和实例3的分析。
54.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中包含外源RNA药剂的靶细胞与包含所述外源RNA药剂的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据逆转录定量PCR分析。
55.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的平均外源RNA药剂水平与非靶细胞的平均外源RNA药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据逆转录定量PCR分析。
56.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的中值外源RNA药剂水平与非靶细胞的中值外源RNA药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据逆转录定量PCR分析。
57.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中包含外源蛋白质药剂的靶细胞与包含所述外源蛋白质药剂的非靶细胞的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据FACS分析，例如使用实例2和实例4的分析。
58.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的平均外源蛋白质药剂水平与非靶细胞的平均外源蛋白质药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据FACS分析，例如使用实例2和实例4的分析。
59.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中靶细胞的中值外源蛋白质药剂水平与非靶细胞的中值外源蛋白质药剂水平的比率为至少1.5、2、3、4、5、10、25、50、100、500、1000、5000、10,000，例如根据FACS分析，例如使用实例2和实例4的分析。
60.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包含以下中的一种或两种：
i)所述脂质双层(例如包膜)上的外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；以及
ii)免疫刺激性蛋白质，其不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
61.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包含以下中的一种或多种：
i)所述脂质双层(例如包膜)上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白，以及所述脂质双层(例如包膜)上的第二外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；
ii)所述脂质双层(例如包膜)上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白，以及不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第二免疫刺激性蛋白质；或
iii)不存在的或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第一免疫刺激性蛋白质，以及不存在的或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在的第二免疫刺激性蛋白质。
62.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体在施用个体之后，在循环系统中存在至少0.5、1、2、3、4、6、12、18、24、36或48小时。
63.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在30分钟。
64.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在1小时。
65.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在2小时。
66.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在4小时。
67.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在8小时。
68.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在12小时。
69.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在18小时。
70.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在24小时。
71.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在36小时。
72.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在施用之后，至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体在循环系统中存在48小时。
73.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，在所述融合剂脂质体一次或多次施用于适当的动物模型(例如本文所描述的动物模型)之后，与参考融合剂脂质体，例如其它方面与融合剂脂质体类似的未经修饰的融合剂脂质体相比，所述融合剂脂质体具有减少的免疫原性，如根据体液应答的减少所测量。
74.根据实施例73所述的融合剂脂质体，其中根据抗细胞抗体效价，例如抗逆转录病毒抗体效价，例如通过ELISA，测量出血清样品中的体液应答减少。
75.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与施用未经修饰的细胞的来自个体的血清样品相比，施用所述融合剂脂质体的来自动物的所述血清样品的抗融合剂脂质体抗体效价减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
76.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，施用所述融合剂脂质体的来自个体的血清样品具有增加的抗细胞抗体效价，例如从基线增加了1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中基线是指施用所述融合剂脂质体之前的来自同一个体的血清样品。
77.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中：
待施用所述融合剂脂质体或包含所述融合剂脂质体的药物组合物的所述个体具有或已知具有或经测试具有对所述融合剂脂质体具有反应性的预先存在的抗体(例如IgG或IgM)；
待施用所述融合剂脂质体的所述个体并不具有对所述融合剂脂质体具有反应性的预先存在抗体的可检测到的水平；
已接受所述融合剂脂质体或包含所述融合剂脂质体的药物组合物的个体具有或已知具有或经测试具有对所述融合剂脂质体具有反应性的抗体(例如IgG或IgM)；
已接受所述融合剂脂质体或包含所述融合剂脂质体的药物组合物(例如至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的所述个体并不具有对所述融合剂脂质体具有反应性的抗体的可检测到的水平；或
抗体水平在两个时间点之间升高不超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点是在第一次施用所述融合剂脂质体之前，而第二时间点是在一次或多次施用所述融合剂脂质体之后。
78.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是通过实例5、6或7的方法，例如由经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞产生。
79.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与由NMC或NMC-空白载体产生的融合剂脂质体相比，在特定时间点，由NMC-HLA-G细胞产生的融合剂脂质体具有减小的溶解百分比，例如PBMC介导的溶解、NK细胞介导的溶解和/或CD8+T细胞介导的溶解。
80.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述经修饰的融合剂脂质体规避了巨噬细胞的吞噬。
81.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是通过实例8的方法，例如由经CD47 cDNA转染的细胞产生。
82.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当巨噬细胞与来源于NMC-CD47的融合剂脂质体一起培育，相对于与来源于NMC或NMC-空白载体的那些融合剂脂质体一起培育时，吞噬指数降低。
83.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，与参考融合剂脂质体，例如其它方面与所述融合剂脂质体类似的未经修饰的融合剂脂质体相比，所述融合剂脂质体的巨噬细胞吞噬减少，例如巨噬细胞吞噬减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中巨噬细胞吞噬的所述减少是通过分析体外吞噬指数来确定，例如如实例8中所描述。
84.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中当在巨噬细胞吞噬的体外分析中与巨噬细胞一起培育时，所述融合剂脂质体组合物具有0、1、10、100或更大的吞噬指数，例如如根据实例8的分析所测量。
85.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其经修饰且与未经修饰的融合剂脂质体相比具有降低的补体活性。
86.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其是通过实例9的方法，例如由编码补体调节蛋白(例如DAF)的经cDNA转染的细胞产生。
87.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与对应小鼠血清(例如HEK-293DAF小鼠血清)一起培育的所述经修饰的融合剂脂质体(例如HEK293-DAF)的存在200pg/ml C3a时的融合剂脂质体剂量大于与对应小鼠血清(例如HEK293小鼠血清)一起培育的参考融合剂脂质体(例如HEK293逆转录病毒载体)。
88.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与未处理小鼠血清一起培育的所述经修饰的融合剂脂质体(例如HEK293-DAF)的存在200pg/ml C3a时的融合剂脂质体剂量大于与未处理小鼠血清一起培育的所述参考融合剂脂质体(例如HEK293逆转录病毒载体)。
89.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中根据实例9的分析，在施用之后30分钟，所述融合剂脂质体对患者血清中的补体介导灭活具有抗性。
90.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中至少0.001％、0.01％、0.1％、1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的融合剂脂质体对补体介导灭活具有抗性。
91.根据实施例86到90中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述补体调节蛋白包含结合加速衰减因子(DAF，CD55)的一种或多种蛋白质，例如因子H(FH)样蛋白质-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白质(MCP，CD46)，例如保护素(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质。
92.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其是通过实例10的方法，例如由编码靶向shRNA的I类MHC的经DNA转染的细胞产生，例如其中与NMC和NMC载体对照相比，来源于I类NMC-shMHC的逆转录病毒载体具有降低的I类MHC表达。
93.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中融合剂脂质体的免疫原性的量度是血清灭活，例如如本文所描述(例如如实例11中所描述)测量的血清灭活。
94.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在已与血清和来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的热灭活血清一起培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源药剂的细胞的百分比没有差异。
95.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在已与来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清一起培育的融合剂脂质体样品与无血清对照培育之间，接受所述外源药剂的细胞的所述百分比没有差异。
96.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中已与阳性对照血清一起培育的融合剂脂质体样品中的接受所述外源药剂的细胞的百分比小于已与未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清一起培育的融合剂脂质体样品。
97.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在多次(例如，超过一次，例如2次或更多次)施用经修饰的融合剂脂质体之后，所述经修饰的融合剂脂质体，例如通过本文所描述的方法修饰，具有降低(例如，与未经修饰的融合剂脂质体施用相比的降低)的血清灭活。
98.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中本文所描述的融合剂脂质体在多次施用之后，不被血清灭活。
99.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在多次施用之后所述融合剂脂质体的免疫原性量度为血清灭活，例如在如本文所描述测量的多次施用之后的血清灭活，例如如实例12中所描述。
100.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在已和血清和来自用经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合剂脂质体处理的小鼠的热灭活血清一起培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源药剂的细胞的所述百分比没有差异。
101.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在来自用经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合剂脂质体处理1、2、3、5或10次的小鼠的已经培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源药剂的细胞的所述百分比没有差异。
102.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中在来自经媒剂处理的小鼠和来自用经修饰的(例如，HEK293-HLA-G)融合剂脂质体处理的小鼠的已与血清一起培育的融合剂脂质体样品之间，接受所述外源药剂的细胞的百分比没有差异。
103.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中对于来源于参考细胞(例如HEK293)的融合剂脂质体来说，接受所述外源药剂的细胞的所述百分比小于经修饰的(例如HEK293-HLA-G)融合剂脂质体。
104.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中融合剂脂质体的免疫原性量度是抗体应答。
105.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受本文所描述的融合剂脂质体的个体具有结合到并且识别融合剂脂质体的预先存在的抗体，例如如本文所描述测量，例如如实例13中所描述。
106.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清展示的信号(例如荧光)强于阴性对照，例如来自IgM和IgG耗竭的小鼠的血清，例如表明已出现免疫原性。
107.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来自未经融合剂脂质体处理的小鼠的血清展示的信号(例如荧光)类似于阴性对照，例如表明未出现可检测到的免疫原性。
108.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其为经修饰的融合剂脂质体，例如通过本文所述的方法修饰，并且其在多次(例如，超过一次，例如2次或更多次)施用所述经修饰的融合剂脂质体之后，具有降低的(例如，与施用未经修饰的融合剂脂质体相比降低的)体液应答，例如如本文所描述测量，例如如实例14中所描述。
109.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体是通过实例5、6、7或14的方法，例如由经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞产生。
110.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中通过测定抗融合剂脂质体抗体(例如IgM、IgG1和/或IgG2抗体)的水平的值来评估体液应答。
111.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中与对照物(例如NMC融合剂脂质体或无NMC融合剂脂质体)相比，经修饰的(例如NMC-HLA-G)融合剂脂质体在注射之后的抗病毒IgM或IgG1/2抗体效价减小(例如如根据FACS荧光强度所测量)。
112.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中抗体应答不靶向接受者细胞，或抗体应答将低于参考水平，例如如本文所描述测量，例如如实例15中所描述。
113.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来自经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞的信号(例如平均荧光强度)类似。
114.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是巨噬细胞应答。
115.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中巨噬细胞不靶向接受者细胞，或以低于参考水平靶向接受者细胞。
116.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞的吞噬指数类似，例如如本文所描述测量，例如如实例16中所描述。
117.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是PBMC应答。
118.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞并不诱发PBMC应答。
119.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞中的CD3+/CMG+细胞百分比类似，例如如本文所描述测量，例如如实例17中所描述。
120.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是自然杀手细胞应答。
121.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞并不诱发自然杀手细胞应答或诱发较低的自然杀手细胞应答，例如低于参考值。
122.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞中的CD3+/CMG+细胞百分比类似，例如如本文所描述测量，例如如实例18中所描述。
123.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞的免疫原性量度是CD8+T细胞应答。
124.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中接受者细胞并不诱发CD8+T细胞应答或诱发较低的CD8+T细胞应答，例如低于参考值。
125.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中来源于经融合剂脂质体处理的小鼠和经PBS处理的小鼠的接受者细胞中的CD3+/CMG+细胞百分比类似，例如如本文所描述测量，例如如实例19中所描述。
126.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂是再靶向融合剂。
127.根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体，其包含编码以下中的一种或两种的核酸，例如逆转录病毒核酸：(i)可操作地连接到编码外源药剂的核酸的正向靶细胞特异性调节元件；或(ii)可操作地连接到编码所述外源药剂的所述核酸的非靶细胞特异性调节元件或负向TCSRE。
128.一种药物组合物，其包含根据前述实施例中任一项所述的融合剂脂质体和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
129.一种将外源药剂递送到个体(例如，人类个体)的方法，其包含施用所述个体根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求128所述的药物组合物，从而将所述外源药剂递送到所述个体。
130.一种在个体(例如，人类个体)中调节靶组织(例如，肝)或靶细胞(例如，肝细胞，例如肝细胞)功能的方法，其包含使所述个体的所述靶组织或所述靶细胞与根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物接触，例如向所述个体施用。
131.根据实施例130所述的方法，其中所述靶组织或所述靶细胞存在于个体中。
132.一种治疗个体(例如，人类个体)的基因缺陷的方法，其包含向所述个体施用根据实施例1到127中任一向所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物。
133.根据实施例132所述的方法，其中所述基因缺陷为表5的基因缺陷。
134.根据实施例132或133所述的方法，其中所述基因缺陷为能够由编码所述外源药剂的所述有效负载基因治疗的基因缺陷。
135.根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物，其用于治疗具有基因缺陷的个体(例如，人类个体)。
136.一种根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体或根据实施例128所述的药物组合物的用途，其用于制造供治疗具有基因缺陷的个体(例如，人类个体)使用的药物。
137.一种用于实施例135或用于实施例136的融合剂脂质体或药物组合物，其中所述融合剂脂质体包含编码用于治疗所述基因缺陷的外源药剂的有效负载基因。
138.一种制备根据实施例1到127中任一项所述的融合剂脂质体的方法，其包含：
a)提供包含核酸(例如逆转录病毒核酸)和融合剂的细胞；
b)在允许所述融合剂脂质体产生的条件下培养所述细胞，以及
c)从所述细胞中分离、富集或纯化所述融合剂脂质体，从而制备所述融合剂脂质体。
本发明的其它特征、目标和优势将在具体实施方式和附图以及权利要求书中显而易见。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文所提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入。举例来说，本文中(例如本文的任何表中)所提及的所有GenBank、Unigene和Entrez序列都以引用的方式并入。除非另外说明，否则本文中(包括本文的任何表中)所指定的序列登录号均指截至2018年5月15日的当前数据库条目。当一种基因或蛋白质参考多个序列登录号时，涵盖所有的序列变异体。另外，材料、方法和实例仅是说明性的并且并不意欲是限制性的。
附图说明
当结合附图阅读时将更好地理解本发明的以下详细描述。出于说明本发明的目的，在本文所描述的图式中示出了某些实施例，其为当前示例的。然而，应理解，本发明不限于图式中示出的实施例的精确布置和手段。
图1定量了对于F-肌动蛋白，用染料对融合剂脂质体的染色。
图2是示出在3、5和24小时的时段内，融合剂脂质体和亲本细胞对聚合酶肌动蛋白的能力的图示。
图3是示出根据NTA和显微法所测量的融合剂脂质体和亲本细胞的大小分布统计的表。
图4是示出融合剂脂质体和亲本细胞的平均大小和体积的表。
图5是一系列图，示出了对于融合剂脂质体或细胞制剂所观察到的可溶物：不溶物比率。
图6是一系列图，示出了MvH(CD8)+F融合剂脂质体与靶细胞或非靶细胞的融合和靶向融合的绝对量。
图7是示出VSV-G融合剂脂质体中的2-NBDG平均荧光强度的图。
图8是示出VSV-G融合剂脂质体的胞质溶胶中的酯酶活性的图。
图9A-9B是一系列图，示出了通过生物发光成像在小鼠中检测到的由融合剂脂质体递送的Cre重组酶。(A)静脉内融合剂脂质体处理的小鼠(1×和3×浓度)的暴露的肝脏和脾脏的腹侧图像和发光信号叠加图。下部部分是单独的发光信号。(B)靶向融合剂脂质体的脾脏和肝脏的总通量信号；v刻度为log10刻度。在处理后72小时，用3×浓度的融合剂脂质体处理进行处理的小鼠在脾脏中的信号显著大于背景(p＝0.0004)。
图10A-10B是一系列图，示出了通过生物发光成像检测到的融合剂脂质体对鼠类肝脏和脾脏的Cre重组酶。(A)从左到右；在安乐死的5分钟内收集和成像的切除的肝脏、心脏、肺、肾脏、小肠、胰脏和脾脏的背侧图像和发光信号叠加图。下部部分是单独的发光信号。(B)靶向融合剂脂质体的脾脏和肝脏以及其它组织的总通量信号；y刻度为log10刻度。相比于具有最低信号的组织(心脏)，用3×浓度的融合剂脂质体处理进行处理的小鼠在脾脏中的信号明显更大(p＜0.0001)。
图11是示出通过NivG+F融合剂脂质体经由非内吞途径的Cre货物递送的表。
图12是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的GAPDH∶总蛋白比率的图示。
图13是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的脂质∶蛋白质比率的图示。
图14是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的蛋白质∶DNA比率的图示。
图15是示出融合剂脂质体和亲本细胞中通过二喹啉甲酸分析测量的脂质∶DNA比率的图不。
图16是示出外泌体和融合剂脂质体中的外泌体标记CD63的蛋白质水平的图示。
图17是示出融合剂脂质体和亲本细胞中检测到的钙联蛋白信号的强度的图示。
图18是示出针对融合剂脂质体和亲本细胞确定的脂质∶DNA比率的图示。
图19A-19B是一系列图示，示出了亲本细胞、外泌体和融合剂脂质体中呈总脂质的百分比形式的脂质物中的比例。
图20是一系列图示，示出了相对于与特定区室相关的蛋白质，亲本细胞、外泌体和融合剂脂质体的蛋白质含量，如所指示。
图21是一系列图示，示出了亲本细胞、外泌体和融合剂脂质体中呈总蛋白含量的百分比形式的ARRDC1(左图)或TSG101(右图)的水平。
图22A-22C展示细胞系的结果，包括靶人类肝癌细胞系(HepG2)和非靶(非肝)细胞系，其经编码含有正向TCSRE或NTCSRE的核酸构建体的慢病毒(LV)转导。图22A展示了经LV转导的人类肝瘤细胞系(HepG2)、人类胚肾细胞系(293LX)、造血起源的人类T细胞系(Molt4.8)以及来源于小鼠脑的内皮细胞系(bEND.3)中的GFP表达，所述LV在PGK启动子的控制下使用miRT序列(hPGK-eGFP+miRT)或不使用miRT序列(hPGK-eGFP)产生。图22B展示了经以下LV转导的HepG2和293LX细胞中的GFP表达：在PGK启动子(hPGK-eGFP)控制下产生的LV或在肝细胞特异性启动子ApoE(hApoE-eGFP+miRT)控制下含有mirT序列和GFP的LV。图22C展示了经以下LV转导的HepG2和293LX细胞上清液中的苯丙氨酸(Phe)的定量：在SFFV启动子(SFFV-PAL)控制下含有转基因苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)的LV或在hApoE启动子(hApoE-PAL+miRT)控制下含有mirT序列的LV。
具体实施方式
本公开至少部分地提供了用于体内递送融合剂脂质体的方法和组合物。在一些实施例中，所述融合剂脂质体包含促进针对靶细胞的特异性的元件组合，例如再靶向融合剂、正向靶细胞特异性调节元件以及非靶细胞特异性调节元件中的一种或多种。在一些实施例中，融合剂脂质体包含减少针对融合剂脂质体的免疫应答的一种或多种修饰。
定义
除非另外说明，否则权利要求书和说明书中所使用的术语定义如下。
如本文所用，“可检测到地存在”当在外源药剂可检测到地存在的上下文中使用时，意指外源药剂本身可检测到地存在。举例来说，如果外源药剂是蛋白质，则外源蛋白质药剂能够可检测到地存在，不论编码其的核酸是否可检测到地存在或不存在。
如本文所用，“融合剂脂质体”是指两亲脂质的双层，其包封内腔或空腔以及与两亲脂质双层相互作用的融合剂。在实施例中，融合剂脂质体包含核酸。在一些实施例中，融合剂脂质体是膜包封的制剂。在一些实施例中，融合剂脂质体来源于源细胞。
如本文所用，“融合剂脂质体组合物”是指包含一种或多种融合剂脂质体的组合物。
如本文所用，“融合剂”是指在两个膜封闭的内腔之间产生相互作用的药剂或分子。在实施例中，融合剂促进膜的融合。在其它实施例中，融合剂使两个内腔(例如逆转录病毒载体的内腔和靶细胞的细胞质)之间产生连接，例如孔。在一些实施例中，融合剂包含两种或更多种蛋白质的复合物，例如其中两种蛋白质都不具有单独的融合活性。在一些实施例中，融合剂包含靶向域。
如本文所用，“隔离元件”是指阻断增强子或阻止异染色质展开的核苷酸序列。隔离元件可以是野生型或突变体。
如本文所用，术语“有效量”是指足以显著地且积极地改善待治疗的症状和/或病状(例如得到积极的临床应答)的药物组合物的量。药物组合物中使用的活性成分的有效量将随以下因素而变：所治疗的特定病状、病状的严重程度、治疗的持续时间、并行疗法的性质、所采用的一种或多种特定活性成分、所利用的特定的药学上可接受的一种或多种赋形剂和/或一种或多种载剂，以及主治医师了解且擅长的类似因素。
如本文中提及病毒、VLP或融合剂脂质体时所用的“外源药剂”是指由对应野生型源细胞产生的对应野生型病毒或融合剂即不包含、也不编码的药剂。在一些实施例中，外源药剂并非天然地存在，如序列相对于天然存在的蛋白质改变(例如插入、缺失或取代)的蛋白质或核酸。在一些实施例中，外源药剂并非天然地存在于源细胞中。在一些实施例中，外源药剂天然地存在于源细胞中，但对于病毒来说是外源的。在一些实施例中，外源药剂并非天然地存在于接受者细胞中。在一些实施例中，外源药剂天然地存在于接受者细胞中，但不以所期望的水平或所期望的时间存在。在一些实施例中，外源药剂包含RNA或蛋白质。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断的范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏反应或其它问题或并发症，与合理的效益/风险比相称的赋形剂、组合物和/或剂型。
如本文所使用，“启动子”是指在可操作地连接到基因编码序列时驱动基因转录的顺式调节DNA序列。启动子可以包含转录因子结合位点。在一些实施例中，启动子与在基因远侧的一种或多种增强子协同作用。
如本文所用，“正向靶细胞特异性调节元件”(或正向TCSRE)是指相较于非靶细胞，使靶细胞中的外源药剂水平增加的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到正向TCSRE。在一些实施例中，正向TCSRE是功能核酸序列，例如正向TCSRE可以包含启动子或增强子。在一些实施例中，正向TCSRE编码功能RNA序列，例如正向TCSRE可以编码促进靶细胞中的RNA正确剪接的剪接位点。在一些实施例中，正向TCSRE编码功能蛋白序列，或正向TCSRE可以编码促进蛋白质发生正确的翻译后修饰的蛋白质序列。在一些实施例中，正向TCSRE使外源药剂下调剂或抑制剂的水平或活性降低。在一些实施例中，靶细胞为肝细胞且正向靶细胞特异性调节元件为正向肝细胞特异性调节元件。
如本文所用，“负向靶细胞特异性调节元件”(或负向TCSRE)是指相较于靶细胞，使非靶细胞中的外源药剂水平降低的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到负向TCSRE。在一些实施例中，负向TCSRE是功能核酸序列，例如促使非靶细胞中的逆转录病毒核酸降解或抑制的miRNA识别位点。在一些实施例中，核酸序列编码功能RNA序列，例如核酸编码miRNA序列，所述miRNA序列存在于编码外源蛋白质药剂的mRNA中，使得mRNA在非靶细胞中被降解或抑制。在一些实施例中，负向TCSRE使外源药剂的下调剂或抑制剂的水平或活性增加。在一些实施例中，非靶细胞是非肝细胞。
如本文所用，“非靶细胞特异性调节元件”(或NTCSRE)是指相较于靶细胞，使非靶细胞中的外源药剂的水平降低的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到NTCSRE。在一些实施例中，NTCSRE是功能核酸序列，例如促使非靶细胞中的逆转录病毒核酸被降解或抑制的miRNA识别位点。在一些实施例中，核酸序列编码功能RNA序列，例如核酸编码miRNA序列，所述miRNA序列存在于编码外源蛋白质药剂的mRNA中，使得mRNA在非靶细胞中被降解或抑制。在一些实施例中，NTCSRE使外源药剂的下调剂或抑制剂的水平或活性增加。在一些实施例中，非靶细胞是非肝细胞，并且非靶细胞特异性调节元件是非肝细胞特异性调节元件。术语“负向TCSRE”和“NTCSRE”在本文中可互换地使用。
如本文所用，“非肝细胞特异性调节元件”是指非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中靶细胞是肝细胞。因此，非肝细胞特异性调节元件是指与肝细胞相比降低非肝细胞(例如，免疫细胞)或组织中的外源药剂的水平的核酸序列，其中编码外源药剂的核酸可操作地连接到非肝细胞特异性调节元件。
如本文所用，“再靶向融合剂”是指包含靶向部分的融合剂，所述靶向部分的序列不是融合剂的天然存在形式的一部分。在实施例中，融合剂包含相对于融合剂的天然存在形式中的靶向部分不同的靶向部分。在实施例中，融合剂的天然存在形式缺乏靶向域，并且再靶向融合剂包含融合剂的天然存在形式中不存在的靶向部分。在实施例中，融合剂经修饰而包含靶向部分。在实施例中，相对于融合剂的天然存在形式，融合剂包含位于靶向部分外部(例如在跨膜域、融合活性域或细胞质域中)的一个或多个序列变化。
如本文所用，“逆转录病毒核酸”是指单独或与辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒组合的核酸，所述核酸至少含有用于封装于逆转录病毒或逆转录病毒载体中所需的最小序列。在一些实施例中，逆转录病毒核酸还包含或编码外源药剂、正向靶细胞特异性调节元件、非靶细胞特异性调节元件或负向TCSRE。在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如全部)：5′LTR(例如，促进整合)、U3(例如，活化病毒基因组RNA转录)、R(例如，Tat结合区)、U5、3′LTR(例如，促进整合)、封装位点(例如，psi(Ψ))、RRE(例如，结合到Rev并促进核输出)。逆转录病毒核酸可以包含RNA(例如，当成为病毒粒子的一部分时)或DNA(例如，当引入源细胞中时或在接受者细胞中逆转录之后)。在一些实施例中，使用包含gag、pol和env中的一种或多种(例如全部)的辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒封装逆转录病毒核酸。
如本文所用，“靶细胞”是指期望外源药剂被融合剂脂质体(例如慢病毒载体)递送到的类型的细胞。在实施例中，靶细胞是特定组织类型或类别的细胞，例如免疫效应细胞，例如T细胞。在一些实施例中，靶细胞是病变细胞，例如癌细胞。在一些实施例中，融合剂，例如再靶向融合剂(单独或与正向TCSRE、NTCSRE、负向TCSRE或其任何组合来组合)使外源药剂优先递送到靶细胞(相较于非靶细胞)。
如本文所用，“非靶细胞”是指不期望外源药剂被慢病毒载体递送到的类型的细胞。在一些实施例中，非靶细胞是特定组织类型或类别的细胞。在一些实施例中，非靶细胞是非病变细胞，例如非癌细胞。在一些实施例中，融合剂，例如再靶向融合剂(单独或与正向TCSRE、NTCSRE、负向TCSRE或其任何组合来组合)使外源药剂递送到非靶细胞低于递送到靶细胞。
如本文所用，术语“治疗(treat/treating/treatment)”是指改善疾病或病症，例如减缓或遏制或减少疾病或病症的发展，例如病症或其至少一种临床症状的根本原因。
如本文所用，“细胞生物物质”是指包含内腔和细胞膜的细胞的一部分，或具有部分或完全核灭活的细胞。在一些实施例中，细胞生物物质包含细胞骨架组分、细胞器和核糖体中的一个或多个。在实施例中，细胞生物物质为去核细胞、微囊泡或细胞影。
融合剂脂质体，例如细胞来源的融合剂脂质体
融合剂脂质体可以采用各种形式。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体来源于源细胞。融合剂脂质体可以是或包含例如细胞外囊泡、微囊泡、纳米囊泡、外泌体、细胞凋亡体(来自凋亡细胞)、微米颗粒(可以来源于例如血小板)、核外粒体(可来源于例如血清中的嗜中性粒细胞和单核细胞)、前列腺体(可获自前列腺癌细胞)、心脏体(可来源于心肌细胞)，或其任何组合。在一些实施例中，融合剂脂质体天然地从源细胞中释放，并且在一些实施例中，对源细胞进行处理以增强融合剂脂质体的形成。在一些实施例中，融合剂脂质体的直径在约10-10，000nm之间，例如直径在约30-100nm之间。在一些实施例中，融合剂脂质体包含一种或多种合成脂质。
在一些实施例中，融合剂脂质体是或包含病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒。根据本发明的一个实施例，包含脂质双层的融合剂脂质体包含含有包膜的逆转录病毒载体。举例来说，在一些实施例中，两亲脂质的融合剂脂质体双层是或包含病毒包膜。病毒包膜可以包含融合剂，例如病毒内源性融合剂或假型化融合剂。在一些实施例中，融合剂脂质体的内腔或空腔包含病毒核酸，例如逆转录病毒核酸，例如慢病毒核酸。病毒核酸可以是病毒基因组。在一些实施例中，所述融合剂脂质体的空腔或内腔中还包含一种或多种病毒非结构蛋白。
融合剂脂质体可以具有促进将有效负载(如所需的转基因或编码外源药剂)递送至靶细胞的各种特性。举例来说，在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞合起来包含足以制备可以与靶细胞融合的颗粒的一种或多种核酸。在实施例中，这些一种或多种核酸编码具有以下活性中的一种或多种(例如全部)的蛋白质：gag多聚蛋白活性、聚合酶活性、整合酶活性、蛋白酶活性和融合剂活性。
融合剂脂质体还可以包含有助于将有效负载递送到靶细胞的各种结构。举例来说，在一些实施例中，融合剂脂质体(例如病毒，例如逆转录病毒，例如慢病毒)包含以下蛋白质中的一种或多种(例如全部)：gag多聚蛋白、聚合酶(例如pol)、整合酶(例如功能或非功能变异体)、蛋白酶和融合剂。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含rev。在一些实施例中，前述蛋白质中的一种或多种是在逆转录病毒基因组中编码，并且在一些实施例中，前述蛋白质中的一种或多种以反式提供，例如通过辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)包含以下核酸序列中的一种或多种(例如全部)：5′LTR(例如包含U5并且缺乏功能U3域)、Psi封装元件(Psi)、可操作地连接到有效负载基因的中心多嘌呤段(cPPT)启动子、有效负载基因(任选地包含位于开放阅读框之前的内含子)、PolyA尾序列、WPRE和3′LTR(例如包含U5并且缺乏功能U3)。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含一个或多个隔离元件。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)还包含一个或多个miRNA识别位点。在一些实施例中，一个或多个miRNA识别位点位于poly A尾序列的下游，例如介于poly A尾序列与WPRE之间。
在一些实施例中，本文所提供的融合剂脂质体施用于个体，例如哺乳动物，例如人类。在此类实施例中，个体可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。在一个实施例中，个体具有基因缺陷，如在表5中所列出的任何基因缺陷。在一些实施例中，融合剂脂质体含有编码用于治疗所述疾病或病状的外源药剂的核酸序列，如用于治疗基因缺陷。
慢病毒组分和辅助细胞
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含以下中的一种或多种(例如全部)：5′启动子(例如控制完整封装的RNA的表达)、5′LTR(例如包括R(聚腺苷酸化尾信号)和/或U5，所述U5包括引物活化信号)、引物结合位点、psi封装信号、用于核输出的RRE元件、直接位于转基因上游以控制转基因表达的启动子、转基因(或其它外源药剂元件)、多嘌呤段和3′LTR(例如包括突变U3、R和U5)。在一些实施例中，逆转录病毒核酸还包含cPPT、WPRE和/或隔离元件中的一种或多种。
逆转录病毒典型地通过将其基因组RNA逆转录成线性双链DNA拷贝来复制并且随后将其基因组DNA共价整合到宿主基因组中。适用于特定实施例中的说明性逆转录病毒包括(但不限于)：莫洛尼鼠(Moloney murine)白血病病毒(M-MuLV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(MoMSV)、哈维鼠(Harvey murine)肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猫白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗兰德鼠(Friend murine)白血病病毒、鼠干细胞病毒(MSCV)和劳斯肉瘤病毒(Rous Sarcoma Virus；RSV)以及慢病毒。
在一些实施例中，逆转录病毒是γ逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是ε逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是α逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是β逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是6逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是慢病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是唾液逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒是内源性逆转录病毒。
说明性慢病毒包括(但不限于)：人免疫缺陷病毒(HIV；包括HIV 1型和HIV 2型)；维斯纳-梅迪病毒(visna-maedi virus；VMV)病毒；山羊关节炎-脑炎病毒(caprinearthritis-encephalitis virus；CAEV)；马传染性贫血病毒(equine infectious anemiavirus；EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些实施例中，使用基于HIV的载体主链(即，HIV顺式作用序列元件)。
在一些实施例中，本文中的载体是能够转移或输送另一种核酸分子的核酸分子。所转移的核酸通常连接到载体核酸分子，例如插入载体核酸分子中。载体可以包括在细胞中引导自主复制的序列，或可以包括足以允许整合到宿主细胞DNA中的序列。有用的载体包括例如质粒(例如DNA质粒或RNA质粒)、转座子、粘质粒、细菌人工染色体和病毒载体。有用的病毒载体包括例如复制缺陷型逆转录病毒和慢病毒。
病毒载体可以包含例如包括病毒来源的核酸元件的核酸分子(例如转移质粒)，所述核酸元件典型地促进核酸分子的转移或整合到细胞基因组中或介导核酸转移的病毒颗粒中。除了一种或多种核酸之外，病毒颗粒还将典型地包括各种病毒组分并且有时还包括宿主细胞组分。病毒载体可以包含例如能够将核酸转移到细胞中或已转移的核酸(例如作为裸DNA)的病毒或病毒颗粒。病毒载体和转移质粒可以包含主要来源于病毒的结构和/或功能基因元件。逆转录病毒载体可以包含含有主要来源于逆转录病毒的结构和功能基因元件或其一部分的病毒载体或质粒。慢病毒载体可以包含含有结构和功能基因元件或其一部分(包括主要来源于慢病毒的LTR)的病毒载体或质粒。
在实施例中，慢病毒载体(例如慢病毒表达载体)可以包含慢病毒转移质粒(例如作为裸DNA)或感染性慢病毒颗粒。关于如克隆位点、启动子、调节元件、异源核酸等元件，应理解，这些元件的序列可以RNA形式存在于慢病毒颗粒中并且可以DNA形式存在于DNA质粒中。
在本文所描述的一些载体中，对复制有贡献或为复制所必需的一个或多个蛋白质编码区的至少一部分相较于对应野生型病毒可能不存在。这使得病毒载体出现复制缺陷。在一些实施例中，载体能够转导靶标非分裂宿主细胞和/或将其基因组整合到宿主基因组中。
野生型逆转录病毒基因组的结构通常包含5′长末端重复序列(LTR)和3′LTR，其间或其内部定位了能够封装基因组的封装信号、引物结合位点、能够整合到宿主细胞基因组内的整合位点，以及编码促进病毒颗粒组装的封装组件的gag、pol和env基因。更复杂的逆转录病毒具有其它特征，例如HIV中的rev和RRE序列，其能够使整合的原病毒的RNA转录物从细胞核有效地输出到被感染的靶细胞的细胞质中。在原病毒中，病毒基因的两端侧接称为长末端重复(LTR)的区域。LTR涉及原病毒整合和转录。LTR还充当增强子-启动子序列并且可以控制病毒基因的表达。逆转录病毒RNA的衣壳化是借助于位于病毒基因组5′端的psi序列发生。
LTR本身是通常相似(例如一致)的序列，其可以分成三种元件，称为U3、R和U5。U3来源于RNA的3′端独有的序列。R来源于RNA两端重复的序列并且U5来源于RNA的5′端独有的序列。三种元件的大小在不同逆转录病毒之间可以显著不同。
对于病毒基因组来说，转录起始位点典型地位于一个LTR中的U3与R之间的边界处，并且poly(A)添加(终止)位点位于另一LTR中的R与U5之间的边界处。U3含有原病毒的大部分转录控制元件，包括启动子和多个增强子序列(响应于细胞的并且在一些情况下病毒的转录活化蛋白质)。一些逆转录病毒包含对涉及调节基因表达的蛋白质进行编码的以下基因中的任一种或多种：tot、rev、tax和rex。
关于结构基因gag、pol和env本身，gag编码病毒的内部结构蛋白。Gag蛋白以蛋白水解方式处理成成熟蛋白质MA(基质)、CA(衣壳)和NC(核衣壳)。pol基因编码含有DNA聚合酶、相关核糖核酸酶H和整合酶(IN)的逆转录酶(RT)，其介导基因组复制。env基因编码病毒粒子的表面(SU)糖蛋白和跨膜(TM)蛋白，其形成与细胞受体蛋白特异性相互作用的复合物。这个相互作用促进感染，例如病毒膜与细胞膜的融合。
在复制缺陷型逆转录病毒载体基因组中，gag、pol和env可以不存在或无功能。RNA两端的R区通常是重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组的5′和3′端处的独有序列。
逆转录病毒还可以含有除gag、pol和env之外的编码蛋白质的其它基因。其它基因的实例包括(在HIV中)vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef中的一种或多种。EIAV具有(除其它以外)其它基因S2。由其它基因编码的蛋白质发挥不同功能，其中一些可以是细胞蛋白所提供的功能的重复。在EIAV中，例如，tat充当病毒LTR的转录活化因子(Derse和Newbold1993《病毒学(Virology)》194：530-6；Maury等人，1994《病毒学》200：632-42)。其结合到稳定的茎环RNA二级结构，称为TAR。Rev通过rev应答元件(RRE)来调节并协调病毒基因的表达(Martarano等人，1994《病毒学杂志(J.Virol.)》68：3102-11)。这两种蛋白质的作用机理被认为广泛类似于灵长类动物病毒的类似机理。另外，已鉴别出由tat的第一外显子编码的EIAV蛋白Ttm，所述第一外显子与位于跨膜蛋白起点的env编码序列剪接。
除蛋白酶、逆转录酶和整合酶之外，非灵长类动物慢病毒还含有编码脱氧尿苷三磷酸酶的第四种pol基因产物。这可以对这些慢病毒感染某些非分裂细胞类型或缓慢分裂细胞类型的能力发挥作用。
在实施例中，重组慢病毒载体(RLV)是具有足够的逆转录病毒基因信息的载体，以允许RNA基因组在封装组分存在下封装到能够感染靶细胞的病毒颗粒中。靶细胞的感染可以包含逆转录以及整合到靶细胞基因组中。RLV通常携有通过载体递送到靶细胞的非病毒编码序列。在实施例中，RLV不能独立复制以在靶细胞内产生感染性逆转录病毒颗粒。RLV通常缺乏功能gag-pol和/或env基因和/或涉及复制的其它基因。载体可以配置为分裂内含子载体，例如如PCT专利申请WO 99/l5683中所描述，所述申请以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，慢病毒载体包含最小病毒基因组，例如病毒载体已经操纵以便去除非必需元件并保留必需元件以便提供感染、转导和递送所关注核苷酸序列到靶宿主细胞所需的功能，例如如WO 98/17815中所描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
最小的慢病毒基因组可以包含例如(5′)R-U5-一个或多个第一核苷酸序列-U3-R(3′)。然而，用于在源细胞内产生慢病毒基因组的质粒载体还可以包括转录调节控制序列，所述转录调节控制序列可操作地连接到慢病毒基因组以引导所述基因组在源细胞中的转录。这些调节序列可以包含与已转录的逆转录病毒序列有关的天然序列，例如5′U3区域，或其可以包含异源启动子，如另一种病毒启动子，例如CMV启动子。一些慢病毒基因组包含其它序列以促进病毒高效产生。举例来说，在HIV的情况下，可以包括rev和RRE序列。替代地或组合，可以使用密码子优化，例如编码外源药剂的基因可以是密码子优化的，例如如WO 01/79518中所描述，所述文献以全文引用的方式并入本文中。还可以使用与rev/RRE系统执行类似或相同功能的替代序列。举例来说，在梅森辉瑞(Mason Pfizer)猴病毒中发现了rev/RRE系统的功能类似物。这称为CTE并且在基因组中包含RRE型序列，所述RRE型序列被认为与被感染的细胞中的因子相互作用。细胞因子可以被认为是rev类似物。因此，CTE可以用作rev/RRE系统的替代物。另外，HTLV-I的Rex蛋白可以在功能上替换HIV-I的Rev蛋白。Rev和Rex具有与IRE-BP类似的效应。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸(例如慢病毒核酸，例如灵长类动物或非灵长类动物慢病毒核酸)(1)包含缺失的gag基因，其中gag缺失使位于gag编码序列的核苷酸约350或354下游的一个或多个核苷酸去除；(2)不存在来自逆转录病毒核酸的一个或多个辅助基因；(3)缺乏tat基因，但包括介于5′LTR的末端与gag的ATG之间的前导序列；以及(4)(1)、(2)和(3)的组合。在一个实施例中，慢病毒载体包含特征(1)和(2)以及(3)的全部。这种策略更详细地描述于WO 99/32646中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，对载体产生来说或对于分裂和非分裂细胞的转导来说，灵长类动物慢病毒最小系统不需要额外的HIV/SIV基因vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev和nef。在一些实施例中，对于载体产生来说或对于分裂和非分裂细胞的转导来说，EIAV最小载体系统不需要S2。
其它基因的缺失可以容许产生不含与慢病毒(例如HIV)感染疾病有关的基因的载体。具体地说，tat与疾病有关。第二，其它基因的缺失容许载体封装较大异源性的DNA。第三，功能未知的基因(如S2)可以省去，从而降低引起非期望效应的风险。最小慢病毒载体的实例公开于WO 99/32646和WO 98/17815中。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸至少缺乏tat和S2(如果其是EIAV载体系统)，并且还可能缺乏vif、vpr、vpx、vpu和nef。在一些实施例中，逆转录病毒核酸还缺乏rev、RRE或两者。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含vpx。Vpx多肽结合到SAMHD1限制因子并诱导SAMHD1限制因子降解，其使细胞质中的游离dNTP降解。因此，随着Vpx使SAMHD1降解并且逆转录活性增强，细胞质中的游离dNTP的浓度增加，从而促进逆转录病毒基因组的逆转录并整合到靶细胞基因组中。
不同的细胞在其特定密码子的利用率方面不同。这种密码子偏倚对应于细胞类型中的特定tRNA的相对丰度的偏倚。通过改变序列中的密码子以便定制其以与对应tRNA的相对丰度匹配，有可能增加表达。同样，可以通过有意选择密码子来减少表达，所述密码子的对应tRNA在特定细胞类型中已知是罕见的。从而能达到额外程度的翻译控制。密码子优化的其它描述见于例如WO 99/41397中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
许多病毒(包括HIV和其它慢病毒)使用许多罕见密码子，并且通过改变这些密码子以对应于常用的哺乳动物密码子，可以实现使封装组分在哺乳动物生产细胞中的表达增加。
密码子优化还有许多其它优点。编码封装组分的核苷酸序列凭借其序列的变化而可以减少或排除来自其的RNA不稳定性序列(INS)。同时，保留了封装组分的氨基酸序列编码序列，使得所述序列所编码的病毒组分保持相同或至少充分相似，以便封装组分的功能不受损。在一些实施例中，密码子优化还克服了针对输出的Rev/RRE要求，从而使得优化的序列Rev独立。在一些实施例中，密码子优化还减少了载体系统内的不同构建体之间(例如gag-pol和env开放阅读框中的重叠区域之间)的同源重组。在一些实施例中，密码子优化引起病毒效价增加和/或安全性提高。
在一些实施例中，对仅与INS有关的密码子进行密码子优化。在其它实施例中，对序列整体进行密码子优化，但涵盖gag-pol的框移位点的序列除外。
gag-pol基因包含编码gag-pol蛋白质的两个重叠阅读框。两种蛋白质的表达取决于翻译期间的框移。这种框移是作为翻译期间核糖体“滑移”的结果发生。这种滑移被认为至少部分地由核糖体中止的RNA二级结构引起。此类二级结构存在于gag-pol基因中的框移位点的下游。对于HIV来说，重叠区域从gag起点(核苷酸1是gagATG中的A)下游的核苷酸1222延伸到gag的末端(nt 1503)。因此，跨越两个阅读框的框移位点和重叠区域的281 bp片段优选不进行密码子优化。在一些实施例中，保留这个片段将能够使gag-pol蛋白质的表达更有效。对于EIAV来说，重叠的起点位于nt 1262(其中核苷酸1是gagATG中的A)处。重叠的末端位于nt 1461处。为了确保框移位点和gag-pol重叠得以保留，可以保留从nt 1156到1465的野生型序列。
可以根据最优密码子使用进行衍生，例如以便容纳适宜的限制位点，并且可以将保守的氨基酸变化引入gag-pol蛋白质中。
在一些实施例中，密码子优化是基于哺乳动物系统中的密码子使用不良的密码子。可以改变第三碱基，并且有时可以改变第二和第三碱基。
由于遗传密码的简并性质，因此应了解，熟练的工作人员可以实现许多gag-pol序列。此外，所描述许多逆转录病毒变异体可以用作产生密码子优化的gag-pol序列的起点。慢病毒基因组可以是相当可变的。举例来说，HIV-I存在许多仍具有功能的准物种。EIAV也是如此。这些变异体可以用于增强转导过程的特定部分。HIV-I变异体的实例可以在LosAlamos国家实验室维护的HIV数据库中找到。EIAV克隆的详细信息可以在美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)维护的NCBI数据库中找到。
gag-pol序列的密码子优化策略可以结合任何逆转录病毒使用，例如EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-I和HIV-2。另外，这种方法可以用于增加HTLV-I、HTLV-2、HFV、HSRV和人类内源性逆转录病毒(HERV)、MLV和其它逆转录病毒的基因的表达。
如上文所描述，逆转录病毒载体的封装组分可以包括gag、pol和env基因的表达产物。另外，封装可以利用4个茎环的短序列，继之为来自gag和env的部分序列作为封装信号。因此，缺失的gag序列纳入逆转录病毒载体基因组中(除封装构建体上的完整gag序列之外)可以加以使用。在实施例中，逆转录病毒载体包含封装信号，所述封装信号在仍保留env序列的载体中包含gag的255到360个核苷酸，或在剪接供体突变、gag和env缺失的特定组合中包含gag的约40个核苷酸。在一些实施例中，逆转录病毒载体包括包含一个或多个缺失的gag序列，例如gag序列包含可来源于N端的约360个核苷酸。
逆转录病毒载体、辅助细胞、辅助病毒或辅助质粒可以包含逆转录病毒结构和辅助蛋白质，例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef蛋白质或其它逆转录病毒蛋白质。在一些实施例中，逆转录病毒蛋白质来源于相同逆转录病毒。在一些实施例中，逆转录病毒蛋白质来源于超过一种逆转录病毒，例如2、3、4或更多种逆转录病毒。
gag和pol编码序列在原生慢病毒中通常被组构为Gag-Pol前体。gag序列编码55kD的Gag前体蛋白，也称为p55。p55在成熟过程期间被病毒编码的蛋白酶4(pol基因的产物)分裂成四种较小蛋白质，命名为MA(基质[p17])、CA(衣壳[p24])、NC(核衣壳[p9])和p6。pol前体蛋白被病毒编码的蛋白酶分裂而脱离Gag，并且还被消化而分离出蛋白酶(p10)、RT(p50)、核糖核酸酶H(p15)和整合酶(p31)活性。
原生Gag-Pol序列可以用于辅助载体(例如辅助质粒或辅助病毒)，或可以产生修饰。这些修饰包括嵌合Gag-Pol，其中Gag和Pol序列从不同病毒(例如不同物种、亚种、病毒株、分枝系等)获得，和/或其中所述序列已经修饰以改进转录和/或翻译，和/或减少重组。
在不同实例中，逆转录病毒核酸包括编码gag蛋白的150-250(例如168)核苷酸部分的多核苷酸，其(i)包括突变的INS1抑制性序列，相对于野生型INS1，其减少RNA核输出的限制；(ii)含有导致框移和过早终止的两个核苷酸插入；和/或(iii)不包括gag的INS2、INS3和INS4抑制性序列。
在一些实施例中，本文所描述的载体是既包含逆转录病毒(例如慢病毒)序列又包含非慢病毒序列的杂合载体。在一些实施例中，杂交载体包含用于逆转录、复制、整合和/或封装的逆转录病毒(例如慢病毒)序列。
根据某些特定实施例，大多数或全部病毒载体主链序列来源于慢病毒，例如HIV-1。然而，应理解，可以使用多种不同来源的逆转录病毒和/或慢病毒序列，或某些慢病毒序列可以容纳大量取代和变化的组合而不损害转移载体执行本文所描述功能的能力。多种慢病毒载体描述于Naldini等人(1996a、1996b和1998)；Zufferey等人(1997)；Dull等人，1998，美国专利第6,013,516号；以及第5,994,136号中，其中多者可适于产生逆转录病毒核酸。
在原病毒的每一端处通常发现长末端重复(LTR)。LTR通常包含位于逆转录病毒核酸末端的域，在其天然序列的背景下，其是直接重复并且含有U3、R和U5区域。LTR通常促进逆转录病毒基因的表达(例如基因转录物的启动、起始和聚腺苷酸化)和病毒复制。LTR可以包含大量调节信号，包括转录控制元件、聚腺苷酸化信号以及用于复制和整合病毒基因组的序列。病毒LTR通常分成三个区域，称为U3、R和U5。U3区域通常含有增强子和启动子元件。U5区域通常是引物结合位点与R区域之间的序列并且可以含有聚腺苷酸化序列。R(重复序列)区域可以与U3和U5区域侧接。LTR通常是由U3、R和U5区域组成，并且可以存在于病毒基因组的5′和3′端。在一些实施例中，与5′LTR相邻的是用于基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和用于病毒RNA有效封装到颗粒中(Psi位点)的序列。
封装信号可以包含位于逆转录病毒基因组内的序列，所述序列介导病毒RNA插入病毒衣壳或颗粒内，参见例如Clever等人，1995，《病毒学杂志》，第69卷，第4期；第2101-2109页。若干逆转录病毒载体使用最小封装信号(psi[Ψ]序列)进行病毒基因组的衣壳化。
在不同实施例中，逆转录病毒核酸包含经修饰的5′LTR和/或3′LTR。LTR中的任一种或两种可以包含一个或多个修饰，包括(但不限于)一个或多个缺失、插入或取代。通常对3′LTR进行修饰，以便通过使病毒变成复制缺陷型(例如病毒不能够完成有效复制，从而不产生感染性病毒粒子(例如复制缺陷型慢病毒子代))来改进慢病毒或逆转录病毒系统的安全性。
在一些实施例中，载体是自失活型(SIN)载体，例如复制缺陷型载体，例如逆转录病毒或慢病毒载体，其中右(3′)LTR增强子-启动子区(称为U3区)已经修饰(例如缺失或取代)以防止病毒转录超过第一轮病毒复制。这是因为右(3′)LTRU3区可以用作左(5′)LTRU3区在病毒复制期间的模板并且因此，U3增强子-启动子的缺乏抑制了病毒复制。在实施例中，对3′LTR进行修饰，使得U5区被去除、改变或经例如外源poly(A)序列置换。3′LTR、5′LTR，或3′与5′LTR可以是经修饰的LTR。
在一些实施例中，5′LTR的U3区经异源启动子置换以在病毒颗粒产生期间驱动病毒基因组转录。可以使用的异源启动子的实例包括例如病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)、巨细胞病毒(CMV)(例如即刻早期)、莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)以及单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子。在一些实施例中，启动子能够以Tat非依赖性方式驱动高水平的转录。在某些实施例中，异源启动子在控制病毒基因组转录方式方面具有额外优势。举例来说，异源启动子可以是诱导型的，使得全部或部分病毒基因组的转录仅在诱导因子存在时发生。诱导因子包括(但不限于)一种或多种化合物或培养宿主细胞的生理条件，如温度或pH。
在一些实施例中，病毒载体包含TAR(反式活化应答)元件，例如位于慢病毒(例如HIV)LTR的R区域中。这种元件与慢病毒反式活化因子(tat)基因元件相互作用以增强病毒复制。然而，这种元件并非必需的，例如在5′LTR的U3区域被异源启动子置换的实施例中。
R区域，例如逆转录病毒LTR内的区域，其始于封端基团的起点(即，转录起点)并且随即在polyA段的起点前终止，可以与U3和U5区域侧接。R区域发挥了在逆转录期间将新生DNA从基因组的一端转移到另一端的作用。
逆转录病毒核酸还可以包含FLAP元件，例如其序列包括逆转录病毒(例如HIV-1或HIV-2)的中心多嘌呤段和中心终止序列(cPPT和CTS)的核酸。适合的FLAP元件描述于美国专利第6,682,907号以及Zennou等人，2000，《细胞(Cell)》，101：173中，所述文献以全文引用的方式并入本文中。在HIV-1逆转录期间，中心多嘌呤段(cPPT)处的正链DNA的中心起始和中心终止序列(CTS)处的中心终止可以引起三链DNA结构的形成：HIV-1中心DNA瓣。在一些实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体主链包含位于编码外源药剂的基因上游或下游的一个或多个FLAP元件。举例来说，在一些实施例中，转移质粒包括FLAP元件，例如从HIV-1衍生或分离的FLAP元件。
在实施例中，逆转录病毒或慢病毒核酸包含一个或多个输出元件，例如顺式作用转录后调节元件，其调节RNA转录物从细胞核向细胞质的输送。RNA输出元件的实例包括(但不限于)人类免疫缺陷病毒(HIV)rev应答元件(RRE)(参见例如Cullen等人，1991，《病毒学杂志》65：1053；以及Cullen等人，1991，《细胞》58：423)，以及乙型肝炎病毒转录后调节元件(HPRE)，所述文献以全文引用的方式并入本文中。一般来说，RNA输出元件定位于基因的3′UTR内，并且可以作为一个或多个拷贝插入。
在一些实施例中，通过将转录后调节元件、聚腺苷酸化位点和转录终止信号中的一个或多个(例如全部)并入载体中来增加异源序列在病毒载体中的表达。多种转录后调节元件可以增加异源核酸在蛋白质中的表达，例如土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE；Zufferey等人，1999，《病毒学杂志》73：2886)；存在于乙型肝炎病毒中的转录后调节元件(HPRE)(Huang等人，《分子和细胞生物学(M0L.Cell.Bi0L.)》，5：3864)；和类似文献(Liu等人，1995，《基因与发育(Genes Dev.)》，9：1766)，所述文献中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸包含转录后调节元件，如WPRE或HPRE。
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸缺乏或不包含转录后调节元件，如WPRE或HPRE。
可以包括引导异源核酸转录物终止和聚腺苷酸化的元件，例如增加外源药剂表达的元件。转录终止信号可以在聚腺苷酸化信号的下游发现。在一些实施例中，载体包含编码外源药剂的多核苷酸3′的聚腺苷酸化序列。polyA位点可以包含引导RNA聚合酶II对新生RNA转录物进行终止和聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列可以通过将polyA尾添加到编码序列的3′端而提升mRNA稳定性，并且因此促成翻译效率增加。可以用于逆转录病毒核酸的polyA信号的说明性实例包括AATAAA、ATTAAA、AGTAAA、牛生长激素polyA序列(BGHpA)、兔β-球蛋白polyA序列(rβgpA)，或另一种适合的异源或内源polyA序列。
在一些实施例中，逆转录病毒或慢病毒载体还包含一个或多个隔离元件，例如本文所描述的隔离元件。
在不同实施例中，载体包含可操作地连接到编码外源药剂的多核苷酸的启动子。载体可以具有一个或多个LTR，其中任一LTR包含一个或多个修饰，如一个或多个核苷酸取代、添加或缺失。载体可以还包含增加转导效率(例如cPPT/FLAP)、病毒封装(例如Psi(Ψ)封装信号，RRE)的更多辅助元件之一，和/或增加外源基因表达的其它元件(例如poly(A)序列)，并且可以任选地包含WPRE或HPRE。
在一些实施例中，慢病毒核酸包含以下中的一个或多个(例如全部)：例如从5′到3′：启动子(例如CMV)、R序列(例如包含TAR)、U5序列(例如用于整合)、PBS序列(例如用于逆转录)、DIS序列(例如用于基因组二聚合)、psi封装信号、部分gag序列、RRE序列(例如用于核输出)、cPPT序列(例如用于核输入)、驱动外源药剂表达的启动子、编码外源药剂的基因、WPRE序列(例如用于有效的转基因表达)、PPT序列(例如用于逆转录)、R序列(例如用于聚腺苷酸化和终止)和U5信号(例如用于整合)。
经工程改造以去除剪接位点的载体
一些慢病毒载体整合了内部活性基因并且具有强剪接和聚腺苷酸化信号，所述信号可能引起异常的并且可能截短的转录物形成。
原癌基因活化机理可以涉及产生嵌合体转录物，所述嵌合转录物来源于插入型突变原基因组中所含的启动子元件或剪接位点与整合所靶向的细胞转录单元的相互作用(Gabriel等人，2009，《自然·医学(Nat Med)》15：1431-1436；Bokhoven等人，《病毒学杂志》83：283-29)。通过始于载体序列的通读转录并进行到侧接的细胞基因(或反之亦然)可以产生包含载体序列和细胞mRNA的嵌合体融合转录物。
在一些实施例中，本文所描述的慢病毒核酸包含慢病毒主链，其中剪接位点中的至少两个已经排除，例如以改进慢病毒载体的安全分布。此类剪接位点的种类和鉴别方法描述于WO2012156839A2中，所述文献全部以引用的方式纳入。
逆转录病毒产生方法
大规模病毒颗粒产生通常适用于实现所期望的病毒效价。通过将转移载体转染到包含病毒结构和/或辅助基因(例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因)或其它逆转录病毒基因的封装细胞系中而可以产生病毒颗粒。
在实施例中，封装载体是缺乏封装信号并且包含编码一种、两种、三种、四种或更多种病毒结构和/或辅助基因的多核苷酸的表达载体或病毒载体。典型地，将封装载体纳入封装细胞中，并且通过转染、转导或感染引入细胞中。逆转录病毒(例如慢病毒)转移载体可以通过转染、转导或感染引入封装细胞系中以产生源细胞或细胞系。封装载体可以通过标准方法引入人类细胞或细胞系中，标准方法包括例如磷酸钙转染、脂质体转染或电穿孔。在一些实施例中，封装载体连同显性可选标记(如新霉素(neomycin)、潮霉素(hygromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、杀稻瘟菌素(blastocidin)、博莱霉素(zeocin)、胸苷激酶(thymidine kinase)、DHFR、Gln合成酶或ADA)一起引入细胞中，接着在适当药物存在下选择并且分离克隆。可选标记基因可以物理方式连接到由封装载体(例如IRES或自裂解病毒肽)编码的基因。
封装细胞系包括不含封装信号、但稳定或瞬时表达可以封装病毒颗粒的病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)的细胞系。可以采用任何适合的细胞系，例如哺乳动物细胞，例如人类细胞。可以使用的适合的细胞系包括例如CHO细胞、BHK细胞、MDCK细胞、C3H10T1/2细胞、FLY细胞、Psi-2细胞、BOSC 23细胞、PA317细胞、WEHI细胞、COS细胞、BSC 1细胞、BSC 40细胞、BMT 10细胞、VERO细胞、W138细胞、MRC5细胞、A549细胞、HT1080细胞、293细胞、293T细胞、B-50细胞、3T3细胞、NIH3T3细胞、HepG2细胞、Saos-2细胞、Huh7细胞、HeLa细胞、W163细胞、211细胞和211A细胞。在实施例中，封装细胞是293细胞、293T细胞或A549细胞。
源细胞系包括能够产生重组逆转录病毒颗粒的细胞系，包含封装细胞系和包含封装信号的转移载体构建体。病毒储备溶液制备方法说明于例如Y.Soneoka等人(1995)《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》23：628-633，和N.R.Landau等人(1992)《病毒学杂志》66：5110-5113种，所述文献以引入的方式并入本文中。感染性病毒颗粒可以从封装细胞中收集，例如通过细胞溶解或收集细胞培养的上清液。任选地，可以富集或纯化所收集的病毒颗粒。
封装质粒和细胞系
在一些实施例中，源细胞包含一个或多个可以封装病毒颗粒的质粒，所述质粒编码病毒结构蛋白和复制酶(例如gag、pol和env)。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体中的至少两种的序列处于同一质粒上。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体的序列处于不同质粒上。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体的序列具有相同的表达信号，例如启动子。在一些实施例中，编码gag、pol和env前体的序列具有不同的表达信号，例如不同的启动子。在一些实施例中，gag、poi和env前体的表达是可诱导的。在一些实施例中，编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒在相同时间或不同时间时转染。在一些实施例中，编码病毒结构蛋白和复制酶的质粒在与封装载体相同的时间或不同的时间转染。
在一些实施例中，源细胞系包含一种或多种稳定整合的病毒结构基因。在一些实施例中，稳定整合的病毒结构基因的表达是可诱导的。
在一些实施例中，在转录水平下调节病毒结构基因的表达。在一些实施例中，在翻译水平下调节病毒结构基因的表达。在一些实施例中，在翻译后水平下调节病毒结构基因的表达。
在一些实施例中，通过四环素(Tet)依赖性系统调节病毒结构基因的表达，其中Tet调节的转录抑制因子(Tet-R)结合到启动子中所包括的DNA序列并且通过空间位阻来抑制转录(Yao等人，1998；Jones等人，2005)。多西环素(dox)添加后，Tet-R释放，从而允许转录。其它适合的多种转录调节启动子、转录因子和小分子诱导剂适于调节病毒结构基因的转录。
在一些实施例中，第三代慢病毒组分、1型人类免疫缺陷病毒(HIV)Rev、Gag/Pol，以及处于Tet调节的启动子控制下并与抗生素抗性盒偶联的包膜分别整合于源细胞基因组中。在一些实施例中，Rev、Gag/Pol和整合于基因组中的包膜蛋白中的每一种在源细胞中仅有一个拷贝。
在一些实施例中，编码外源药剂的核酸(例如编码外源药剂的逆转录病毒核酸)还整合于源细胞基因组中。在一些实施例中，编码外源药剂的核酸在染色体外得到维持。在一些实施例中，编码外源药剂的核酸转染到源细胞中，所述源细胞的基因组中具有稳定整合的Rev、Gag/Pol和包膜蛋白。参见例如Milani等人，《EMBO分子医药(EMBO MolecularMedicine)》，2017，所述文献以全文引用的方式并入本文中。
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸不能经历逆转录。在实施例中，此类核酸能够瞬时表达外源药剂。逆转录病毒或VLP可以包含失去功能的逆转录酶蛋白质，或可以不包含逆转录酶蛋白质。在实施例中，逆转录病毒核酸包含失去功能的引物结合位点(PBS)和/或att位点。在实施例中，一种或多种病毒辅助基因，包括rev、tat、vif、nef、vpr、vpu、vpx和S2或其功能等效物，失去功能或从逆转录病毒核酸中缺失。在实施例中，选自S2、rev和tat的一种或多种辅助基因失去功能或从逆转录病毒核酸中缺失。
封装逆转录病毒核酸的策略
典型地，现代逆转录病毒载体系统是由以下组成：具有顺式作用载体序列的病毒基因组，用于转录、逆转录、整合、翻译和封装病毒RNA到病毒颗粒中，以及(2)生产细胞系，其表达为了产生病毒颗粒所需的反式作用逆转录病毒基因序列(例如gag、pol和env)。通过将顺式作用载体序列与反式作用载体序列完全分离，病毒不能维持复制超过一个感染循环。许多策略可以避免活病毒的产生，例如通过最小化顺式作用序列与反式作用序列之间的重叠以避免重组。
包含缺乏或缺少病毒RNA的序列的病毒载体颗粒可以是从所述序列中去除或排除病毒RNA的结果。在一个实施例中，这可以通过使用gag上的内源封装信号结合位点来实现。替代地，内源封装信号结合位点位于pol上。在这个实施例中，待递送的RNA将包含同源封装信号。在另一个实施例中，位于待递送的RNA上的异源结合域(对于gag来说是异源的)和位于gag或pol上的同源结合位点可以用于确保待递送的RNA的封装。异源序列可以是非病毒序列或其可以是病毒序列，在此情况下，其可以来源于不同病毒。载体颗粒可以用于递送治疗性RNA，在此情况下，功能整合酶和/或逆转录酶不是必需的。这些载体颗粒还可以用于递送所关注的治疗基因，在此情况下，典型地包括pol。
在一个实施例中，改变gag-pol，并且封装信号用对应的封装信号置换。在这个实施例中，颗粒可以将RNA与新封装信号封装在一起。这个方法的优点在于，能够封装缺乏病毒序列的RNA序列，例如RNAi。
替代方法是依赖于待封装的RNA的过度表达。在一个实施例中，待封装的RNA在含有封装信号的任何RNA不存在的情况下过度表达。这可以导致封装治疗性RNA达到显著的水平，并且这种量足以转导细胞并具有生物效应。
在一些实施例中，多核苷酸包含编码病毒gag蛋白质或逆转录病毒gag和pol蛋白质的核苷酸序列，其中gag蛋白质或pol蛋白质包含能够识别RNA序列中的对应序列的异源RNA结合域以促进RNA序列封装到病毒载体颗粒中。
在一些实施例中，异源RNA结合域包含来源于细菌噬菌体鞘蛋白的RNA结合域、Rev蛋白质、U1小核核糖核蛋白颗粒的蛋白质、Nova蛋白质、TF111A蛋白质、TIS11蛋白质、trpRNA结合减弱蛋白质(TRAP)或假尿苷合成酶。
在一些实施例中，本文中的方法包含检测或确认复制胜任型逆转录病毒的不存在。所述方法可以包括评估一种或多种靶基因(例如病毒基因，例如结构或封装基因)的RNA水平，其基因产物在经复制胜任型逆转录病毒(例如γ逆转录病毒或慢病毒)感染的某些细胞中表达，但不存在于用于转导具有异源核酸的细胞的病毒载体中并且不会或预期不会存在和/或表达于不含复制胜任型逆转录病毒的细胞中。如果一种或多种靶基因的RNA水平高于参考值，则可以确定复制胜任型逆转录病毒存在，所述RNA水平可以直接或间接地测得，例如从含有靶基因的阳性对照样品测得。关于进一步的公开内容，参见WO2018023094A1。
编码外源药剂的基因在源细胞中的抑制
源细胞中(过度)表达的蛋白质可以对载体病毒颗粒组装和/或感染性产生间接或直接的影响。外源药剂并入载体病毒颗粒还可以影响载体颗粒的下游处理。
在一些实施例中，使用组织特异性启动子限制外源药剂在源细胞中的表达。在一些实施例中，在真核细胞培养物中使用异源翻译控制系统抑制外源药剂在源细胞中的翻译。更具体地说，逆转录病毒核酸可以包含可操作地连接到编码外源药剂的基因的结合位点，其中结合位点能够与RNA结合蛋白相互作用，以便抑制或阻止外源药剂在源细胞中的翻译。
在一些实施例中，RNA结合蛋白是色氨酸RNA结合减弱蛋白质(TRAP)，例如细菌色氨酸RNA结合减弱蛋白质。使用RNA结合蛋白(例如细菌trp操纵子调节蛋白、色氨酸RNA结合减弱蛋白质TRAP)和其结合的RNA靶标将抑制或阻止转基因在源细胞内的翻译。这个系统称为转基因抑制载体内产生细胞系统或TRIP系统。
在实施例中，RNA结合蛋白的结合位点(例如TRAP结合序列tbs)定位于NOI翻译起始密码子的上游使得来源于内部表达盒的mRNA的翻译受到特异性抑制，同时对载体RNA的产生或稳定性不具有有害的影响。tbs与编码外源药剂的基因的翻译起始密码子之间的核苷酸数目可以是0到12个核苷酸不等。tbs可以定位于内部核糖体进入位点(IRES)下游以抑制编码外源药剂的基因在多顺反子mRNA中的翻译。
杀灭开关系统和扩增
在一些实施例中，多核苷酸或携带编码外源药剂的基因的细胞利用自杀基因(包括诱导型自杀基因)降低直接毒性和/或不可控增殖的风险。在特定方面中，自杀基因对携带外源药剂的宿主细胞不具有免疫原性。自杀基因的实例包括胱天蛋白酶-9、胱天蛋白酶-8或胞嘧啶脱氨酶。胱天蛋白酶-9可以使用特定的二聚合化学诱导剂(CID)活化。
在某些实施例中，载体包含使得靶细胞(例如免疫效应细胞，例如T细胞)容易接受体内负向选择的基因区段。举例来说，转导的细胞可以作为个体的体内状况变化的结果来排除。负向可选表型可以由赋予对所施用药剂(例如化合物)的敏感性的基因的插入产生。负向可选基因在所属领域中是已知的并且尤其包括以下：赋予更昔洛韦(ganciclovir)敏感性的单纯疱疹病毒I型胸苷激酶(HSV-I TK)基因(Wigler等人，《细胞》11：223，1977)；细胞次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT)基因；细胞腺嘌呤磷酸核糖转移酶(APRT)基因和细菌胞嘧啶脱氨酶(Mullen等人，《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)》89：33(1992))。
在一些实施例中，已转导细胞(例如免疫效应细胞，如T细胞)包含多核苷酸，所述多核苷酸还包含能够对负向可选表型的细胞进行体外选择的正向标记。向可选标记可以是一种基因，其在引入靶细胞后表达显性表型，从而允许对携带所述基因的细胞进行正向选择。这种类型的基因尤其包括：赋予潮霉素B抗性的潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)；编码抗生素G418的具有抗性的来自Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或aph)；二氢叶酸还原酶(DHFR)基因；腺苷脱氨酶基因(ADA)；和多药抗性(MDR)基因。
在一个实施例中，正向可选标记与负向可选元件相连接使得负向可选元件的损失必然还伴随着正向可选标记的损失。举例来说，正向和负向可选标记可以融合以使得一者的损失必然导致另一者的损失。产生作为表达产物的多肽的所融合多核苷酸的实例是潮霉素磷酸转移酶胸苷激酶融合基因(HyTK)，所述多肽赋予所期望的上文所描述的正向和负向选择特征。这种基因的表达所产生的多肽赋予潮霉素B抗性以用于体外正向选择和更昔洛韦敏感性以用于体内负向选择。参见Lupton S.D.等人，《分子和细胞生物学(Mol.andCell.Biology)》11：3374-3378，1991。另外，在实施例中，编码嵌合受体的多核苷酸存在于含有融合基因的逆转录病毒载体中，尤其赋予潮霉素B抗性以用于体外正向选择和更昔洛韦敏感性以用于体内负向选择的逆转录病毒载体(例如Lupton，S.D.等人(1991)(同上)中所描述的HyTK逆转录病毒载体)。还参见PCT U59I/08442和PCT/U594/05601的公开案，其描述了由显性正向可选标记与负向可选标记融合而衍生的双官能可选融合基因的用途。
适合的正向可选标记可以来源于选自由hph、nco和gpt组成的群组的基因，并且适合的负向可选标记可以来源于选自由以下组成的群组的基因：胞嘧啶脱氨酶、HSV-I TK、VZV TK、HPRT、APRT和gpt。其它适合的标记是双官能可选融合基因，其中正向可选标记来源于hph或neo，并且负向可选标记来源于胞嘧啶脱氨酶或TK基因或可选标记。
调节慢病毒整合的策略
公开了逆转录病毒和慢病毒核酸，其缺少关键蛋白质/序列或在关键蛋白质/序列方面失去功能以便阻止逆转录病毒或慢病毒基因组整合到靶细胞基因组中。举例来说，缺少构成逆转录病毒整合酶的高度保守性DDE基序的氨基酸中的每一者的病毒核酸(Engelman和Craigie(1992)《病毒学杂志(J.Virol.)》66：6361-6369；Johnson等人(1986)《美国国家科学院院刊》83：7648-7652；Khan等人(1991)《核酸研究》19：851-860)能够产生整合缺陷型逆转录病毒核酸。
举例来说，在一些实施例中，本文中的逆转录病毒核酸包含含有突变的慢病毒整合酶，所述突变引起所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中。在一些实施例中，所述突变是直接影响整合的I型突变，或触发多效性缺陷，从而影响病毒粒子形态发生和/或逆转录的II型突变。I型突变的说明性非限制实例是影响参与整合酶的催化核心域的三个残基中的任一个的那些突变：DX39-58DX35E(HIV-1的整合酶的D64、D116和E152残基)。在一个特定实施例中，引起所述整合酶不能催化病毒基因组整合到细胞基因组中的突变是整合酶的催化核心域的DDE基序的一个或多个氨基酸残基的取代，优选天冬酰胺残基对所述DEE基序的第一天冬氨酸残基的取代。在一些实施例中，逆转录病毒载体不包含整合酶蛋白质。
在一些实施例中，逆转录病毒整合到活性转录单元中。在一些实施例中，逆转录病毒的整合不靠近转录起始位点(基因的5′端)或DNAse1裂解位点。在一些实施例中，逆转录病毒整合并不活化原癌基因或灭活肿瘤抑制基因。在一些实施例中，逆转录病毒不具有遗传毒性。在一些实施例中，慢病毒整合到内含子中。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸以特定拷贝数整合到靶细胞的基因组中。平均拷贝数可以由单个细胞、细胞群或个别细胞集落确定。确定拷贝数的示例性方法包括聚合酶链反应(PCR)和流式细胞测量术。
在一些实施例中，将编码外源药剂的DNA整合到基因组中。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA在染色体外得到维持。在一些实施例中，整合的DNA与编码外源药剂的游离型DNA的比率是至少0.01、0.1、0.5、1.0、2、5、10、100。
在一些实施例中，编码外源药剂的DNA呈线性。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA呈环状。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA的线性拷贝与环状拷贝的比率为至少0.01、0.1、0.5、1.0、2、5、10、100。
在实施例中，编码外源药剂的DNA与1个LTR连成环状。在一些实施例中，编码外源药剂的DNA与2个LTR连成环状。在一些实施例中，编码外源药剂的包含1个LTR的环状DNA与编码外源药剂的包含2个LTR的环状DNA的比率为至少0.1、0.5、1.0、2、5、10、20、50、100。
游离型病毒的维持
在整合不足的逆转录病毒中，逆转录的环状cDNA副产物(例如1-LTR和2-LTR)可以在细胞核中积累而不整合到宿主基因组中(参见
Figure BDA0002963542200000431
R J等人，《自然·医学》2006，12：348-353)。像其它外源DNA一样，那些中间体随后可以相同的频率(例如103至105/细胞)整合到细胞DNA中。
在一些实施例中，游离型逆转录病毒核酸并不复制。游离型病毒DNA可以经修饰以在复制细胞中维持，这通过包括真核复制起点和骨架/基质附着区(S/MAR)以便与核基质缔合。
因此，在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸包含真核复制起点或其变异体。所关注的真核复制起点的实例是如Aladjem等人(《科学(Science)》，1995，270：815-819)所描述的β球蛋白基因的复制起点；如Price等人，《生物化学杂志(Journal ofBiological Chemistry)》，2003，278(22)：19649-59所描述的此前从猴CV-1细胞和人类皮肤成纤维细胞中分离出的与α-卫星序列结合的自主复制序列的共同序列；如McWinney和Leffak(McWinney C.和Leffak M.，《核酸研究》1990，18(5)：1233-42)所描述的人类c-myc启动子区域的复制起点。在实施例中，变异体基本上维持了引发在真核细胞中复制的能力。引发复制的特定序列的能力可以通过任何适合的方法测定，例如基于溴脱氧尿苷并入和密度漂移的自主复制分析(Araujo F.D.等人，同上；Frappier L.等人，同上)。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含骨架/基质附着区(S/MAR)或其变异体，例如长度为数百个碱基对的非共同富AT样DNA元件，其通过周期性附着到细胞核的蛋白质骨架或基质而将真核基因组的核DNA组构到染色质域中。其通常在非编码区(如侧接区、染色质边界区和内含子)中找到。S/MAR区域的实例是如Bode等人(Bode J.等人，《科学》，1992，255：195-7)所描述的人类IFN-γ基因(hIFN-γ大)的1.8kbp S/MAR；如Ramezani(RamezaniA.等人，《血液(Blood)》2003，101：4717-24)所描述的人类IFN-γ基因(hIFN-γ短)的S/MAR的0.7Kbp最小区域；如Mesner L.D.等人，《美国国家科学院院刊》，2003，100：3281-86所描述的人类二氢叶酸还原酶基因(hDHFR)的S/MAR的0.2Kbp最小区域。在实施例中，S/MAR的功能等效变异体是基于已提出的促成S/MAR功能的共同或单独的六组规则而选择的序列(Kramer等人(1996)《基因组学(Genomics)》33，305；Singh等人(1997)《核酸研究》25，1419)。这些规则已经合并到MAR-Wiz计算机程序中，所述程序可自由地在genomecluster.secs.oakland.edu/MAR-Wiz获得。在实施例中，变异体基本上维持与衍生其的S/MAR相同的功能，具体地说，特异性结合到核基质的能力。熟练的技术人员可以确定特定变异体是否能够特异性结合到核基质，例如根据Mesner等人所描述的体外或体内MAR分析(Mesner L.D.等人，同上)。在一些实施例中，如果特定变异体展示了DNA链分离倾向，则特定序列是S/MAR的变异体。基于平衡统计机构的方法，使用特定程序可以确定这个特性。应激诱导的双链体去稳定(SIDD)分析技术“[…]计算所施加的超螺旋应激水平减少为了在沿着DNA序列的每个位置打开双链体所必需的自由能的程度。结果作为SIDD特征曲线显示，其中强去稳定位点表现为深度最小值[…]”，如Bode等人(2005)《分子生物学杂志》358，597中所定义。SIDD算法和数学基础(Bi和Benham(2004)《生物信息学(Bioinformatics)》20，1477)和SIDD分布的分析可以使用可在WebSIDD(www.genomecenter.ucdavis.edu/benham)自由获得的因特网资源执行。因此，在一些实施例中，如果多核苷酸展示与S/MAR类似的SIDD分布，则其视为S/MAR序列的变异体。
融合剂和假型化
本文所描述的融合剂脂质体(例如，逆转录病毒载体)可以包含融合剂，例如内源性融合剂或假型化融合剂。
在一些实施例中，融合剂包含蛋白质(例如，糖蛋白)、脂质或小分子。融合剂可以是例如哺乳动物融合剂或病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白质或哺乳动物蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大一致性)；非哺乳动物蛋白质，如病毒蛋白质或病毒蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大一致性)；原生蛋白质或原生蛋白质衍生物；合成蛋白质；其片段；其变异体；包含一种或多种融合剂或片段的蛋白质融合物，以及其任何组合。在一些实施例中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、II类病毒膜蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其它病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变异体或包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
包括病毒包膜蛋白(env)的融合剂通常决定了可以被融合剂脂质体感染和转化的宿主细胞的范围。在慢病毒(如HIV-1、HIV-2、SIV、FIV和EIV)的情况下，原生env蛋白包括gp41和gp120。在一些实施例中，由本文所描述的源细胞表达的病毒env蛋白在单独的载体上由病毒gag和pol基因编码，如此前已描述。
可以使用的逆转录病毒衍生的env基因的说明性实例包括(但不限于)：MLV包膜、10A1包膜、BAEV、FeLV-B、RD114、SSAV、埃博拉(Ebola)、仙台(Sendai)、禽瘟疫病毒(Fowlplague virus；FPV)和流感病毒包膜。类似地，可以利用编码来自以下病毒的包膜的基因：RNA病毒(例如，小RNA病毒科(Picornaviridae)、杯状病毒科(Calciviridae)、星状病毒科(Astroviridae)、披膜病毒科(Togaviridae)、黄病毒科(Flaviviridae)、冠状病毒科(Coronaviridae)、副粘病毒科(Paramyxoviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、丝状病毒科(Filoviridae)、正粘病毒科(Orthomyxoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、沙粒病毒科(Arenaviridae)、呼肠孤病毒科(Reoviridae)、双RNA病毒科(Birnaviridae)、逆转录病毒科(Retroviridae)的RNA病毒)，以及DNA病毒(嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)、环状病毒科(Circoviridae)、微小病毒科(Parvoviridae)、乳多空病毒科(Papovaviridae)、腺病毒科(Adenoviridae)、疱疹病毒科(Herpesviridae)、痘病毒科(Poxyiridae)和虹彩病毒科(Iridoviridae))。代表性实例包括FeLV、VEE、HFVW、WDSV、SFV、狂犬病、ALV、BIV、BLV、EBV、CAEV、SNV、ChTLV、STLV、MPMV、SMRV、RAV、FuSV、MH2、AEV、AMV、CT10和EIAV。
在一些实施例中，呈现于融合剂脂质体上的包膜蛋白包括(但不限于)以下来源中的任一种：甲型流感(如H1N1、H1N2、H3N2和H5N1(禽流感))、乙型流感、丙型流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、丁型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、轮状病毒、诺瓦克病毒组(Norwalk virus group)的任何病毒、肠溶腺病毒、细小病毒、登革热(Denguefever)病毒、猴痘、单链负义病毒目(Mononegavirales)、狂犬病毒属(Lyssavirus)(如狂犬病病毒)、拉各斯蝙蝠病毒(Lagos bat virus)、莫科拉病毒(Mokola virus)、杜文黑基病毒(Duvenhage virus)、欧洲蝙蝠病毒1与2和澳大利亚蝙蝠病毒、短暂热病毒属(Ephemerovirus)、水泡病毒属(Vesiculovirus)、水泡性口炎病毒(VSV)、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒1型和2型)、水痘带状疱疹、巨细胞病毒、埃-巴二氏病毒(Epstein-Bar virus，EBV)、人类疱疹病毒(HHV)、人类疱疹病毒6型和8型、人类免疫缺陷病毒(HIV)、乳头瘤病毒、鼠γ疱疹病毒、沙粒病毒(如阿根廷出血热病毒、玻利维亚出血热病毒、萨比亚(Sabia)相关的出血热病毒、委内瑞拉出血热病毒、拉沙热病毒(Lassa fever virus)、马丘波病毒(Machupo virus)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、布尼亚病毒科(Bunyaviridiae)(如克里米亚-刚果(Crimean-Congo)出血热病毒)、汉坦病毒(Hantavirus)、导致出血热与肾综合征的病毒、裂谷(RiffValley)热病毒、丝状病毒科(丝状病毒)(包括埃博拉出血热和马堡(Marburg)出血热)、黄病毒科(包括卡依萨努森林病(Kaysanur Forest disease)病毒)、鄂木斯克(Omsk)出血热病毒、导致蜱传脑炎的病毒和副粘病毒科(如亨德拉病毒(Hendra virus)和尼帕病毒(Nipah virus)、重型天花和轻型天花(天花))、甲病毒(alphavirus)(如委内瑞拉马脑炎病毒)、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、SARS相关冠状病毒(SARS-CoV)、西尼罗病毒(West Nile virus)、任何导致脑炎的病毒。
在一些实施例中，本文所描述的源细胞产生融合剂脂质体，例如使用VSV-G糖蛋白假型化的重组逆转录病毒，例如慢病毒。
融合剂脂质体或假型化病毒的一种或多种包膜蛋白通常已被修饰，例如包膜蛋白被来自另一种病毒的包膜蛋白取代。举例来说，HIV可以通过来自例如水泡性口炎病毒G蛋白(VSV-G)包膜蛋白的棒状病毒的融合蛋白假型化，从而允许HIV感染更广泛范围的细胞，因为HIV包膜蛋白(由env基因编码)通常使病毒靶向CD4+呈递细胞。在一些实施例中，慢病毒包膜蛋白通过VSV-G假型化。在一个实施例中，源细胞产生了重组逆转录病毒，例如慢病毒，所述病毒通过VSV-G包膜糖蛋白假型化。
另外，融合剂或病毒包膜蛋白可以被修饰或工程改造以含有多肽序列，所述多肽序列允许转导载体以靶向并感染其正常范围之外的宿主细胞，或更具体地说，将转导局限于一定的细胞或组织类型。举例来说，融合剂或包膜蛋白可以与靶向序列同框接合，如受体配体、抗体(使用抗体或重组抗体型分子的抗原结合部分，如单链抗体)，和其多肽部分或修饰(例如其中糖基化位点存在于靶向序列中)，所述靶向序列当在转导载体包衣上呈现时，促进病毒粒子颗粒定向递送到所关注的靶细胞。此外，包膜蛋白可以还包含调节细胞功能的序列。用转导载体调节细胞功能可以增加或降低混合细胞群中某些细胞类型的转导效率。举例来说，干细胞可以更具体地说用含有包膜序列的配体或结合搭配物转导，所述配体或结合搭配物特异性地结合到干细胞，而非血液或骨髓中找到的其它细胞类型。非限制性实例是干细胞因子(SCF)和Flt-3配体。其它实例包括例如抗体(例如，对一定细胞类型具有特异性的单链抗体)，和基本上任何结合肺、肝脏、胰脏、心脏、内皮细胞、平滑肌、乳房、前列腺、上皮、血管癌等组织的抗原(包括受体)。
示例性融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体包括一种或多种融合剂，例如以促进融合剂脂质体融合到膜，例如细胞膜。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其包膜上包含一种或多种融合剂，以靶向特定细胞或组织类型。融合剂包括(但不限于)：基于蛋白质、基于脂质和基于化学物质的融合剂。在一些实施例中，融合剂脂质体包括作为蛋白质融合剂的第一融合剂和作为脂质融合剂或化学融合剂的第二融合剂。融合剂可以将结合靶细胞表面上的融合剂结合搭配物。在一些实施例中，包含融合剂的融合剂脂质体会将膜整合到靶细胞的脂质双层中。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂中的一种或多种可以包括于融合剂脂质体中。
蛋白质融合剂
在一些实施例中，融合剂是蛋白质融合剂，例如哺乳动物蛋白质或哺乳动物蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大一致性)；非哺乳动物蛋白质，如病毒蛋白质或病毒蛋白质同源物(例如具有50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大一致性)；原生蛋白质或原生蛋白质衍生物；合成蛋白质；其片段；其变异体；包含一种或多种融合剂或片段的蛋白质融合物，以及其任何组合。
在一些实施例中，融合剂引起融合剂脂质体中的脂质与靶细胞中的脂质之间的混合。在一些实施例中，融合剂引起在融合剂脂质体内部与靶细胞的胞质溶胶之间形成一个或多个孔隙。
哺乳动物蛋白质
在一些实施例中，融合剂可以包括哺乳动物蛋白质，参见表1A。哺乳动物融合剂的实例可以包括(但不限于)：SNARE家族蛋白质，如vSNAREs和tSNAREs；合胞素蛋白质，例如合胞素-1(DOI：10.1128/JVI.76.13.6442-6452.2002)和合胞素-2；成肌蛋白(biorxiv.org/content/early/2017/04/02/123158，doi.org/10.1101/123158，doi：10.1096/fj.201600945R，doi：10.1038/nature12343)、肌混合蛋白质(myomixer)(www.nature.com/nature/jourual/v499/n7458/full/nature12343.html，doi：10.1038/nature12343)、肌合并蛋白(myomerger)(science.sciencemag.org/content/early/2017/04/05/science.aam9361，DOI：10.1126/science.aam9361)；FGFRL1(成纤维细胞生长因子受体样1)、Minion(doi.org/10.1101/122697)；甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的同功异型物(例如如US6,099,857A中所公开)；间隙连接蛋白，如连接蛋白43、连接蛋白40、连接蛋白45、连接蛋白32或连接蛋白37(例如如US 2007/0224176中所公开)；Hap2；能够诱导异源细胞之间形成合胞体的任何蛋白质(参见表2)；具有融合剂特性的任何蛋白质(参见表3)；其同源物；其片段；其变异体；以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。在一些实施例中，融合剂是由人类基因组中发现的人类内源逆转录病毒元件(hERV)编码。其它示例性融合剂公开于US 6,099,857A和US 2007/0224176中，其全部内容特此以引用的方式并入。
表1A：人类和非人类融合剂的非限制性实例.
Figure BDA0002963542200000481
表1B：编码具有融合剂特性的蛋白质的基因.
Figure BDA0002963542200000482
表1C：人类融合剂候选物
Figure BDA0002963542200000491
Figure BDA0002963542200000501
在一些实施例中，融合剂脂质体包含产生曲率的蛋白质，例如Epsin1、发动蛋白或包含BAR域的蛋白质。参见例如Kozlov等人，《结构生物学评论(CurrOp StrucBio)》2015；Zimmerberg等人，《自然评论(Nat Rev)》2006；Richard等人，《生物化学杂志(Biochem J)》2011。
非哺乳动物蛋白质
病毒蛋白
在一些实施例中，融合剂可以包括非哺乳动物蛋白质，例如病毒蛋白。在一些实施例中，病毒融合剂是I类病毒膜融合蛋白、II类病毒膜蛋白、III类病毒膜融合蛋白、病毒膜糖蛋白或其它病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变异体或包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
在一些实施例中，I类病毒膜融合蛋白包括(但不限于)杆状病毒F蛋白，例如核型多角体病毒(NPV)属的F蛋白，例如甜菜夜蛾MNPV(Spodoptera exigua MNPV；SeMNPV)F蛋白和舞毒蛾MNPV(Lymantria dispar MNPV；LdMNPV)，以及副粘病毒F蛋白。
在一些实施例中，II类病毒膜蛋白包括(但不限于)蜱传脑炎E(TBEV E)、胜利基森林病毒(Semliki Forest Virus)E1/E2。
在一些实施例中，III类病毒膜融合蛋白包括(但不限于)棒状病毒G(例如水泡性口炎病毒的融合蛋白G(VSV-G))、疱疹病毒糖蛋白B(例如单纯疱疹病毒1(HSV-1)gB))、埃-巴二氏病毒糖蛋白B(EBV gB)、索戈托病毒G(thogotovirus G)、杆状病毒gp64(例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa California)多NPV(AcMNPV)gp64)和博纳病(Borna disease)病毒(BDV)糖蛋白(BDV G)。
其它病毒融合剂的实例(例如膜糖蛋白和病毒融合蛋白)包括(但不限于)：病毒合胞体蛋白，如流感血球凝集素(HA)或突变体，或其融合蛋白；人类免疫缺陷病毒1型包膜蛋白(HIV-1 ENV)、来自HIV结合LFA-1以形成淋巴细胞合胞体的gp120、HIV gp41、HIV gp160或HIV反式转录活化因子(TAT)；病毒糖蛋白VSV-G、来自棒状病毒科的水泡性口炎病毒的病毒糖蛋白；水痘-带状疱疹病毒(VZV)的糖蛋白gB和gH-gL；鼠类白血病病毒(MLV)-10A1；长臂猿白血病病毒糖蛋白(GaLV)；狂犬病、莫科拉(Mokola)、水泡性口炎病毒和披膜病毒中的G型糖蛋白；鼠类肝炎病毒JHM表面突出蛋白；猪呼吸道冠状病毒纤突和膜糖蛋白；禽类传染性支气管炎纤突糖蛋白和其前体；牛肠道冠状病毒纤突蛋白；麻疹病毒的F和H、HN或G基因；犬瘟热病毒、新城疫病毒(Newcastle disease virus)、人类副流感病毒3、猿猴病毒41、仙台病毒和人类呼吸道合胞病毒；人类疱疹病毒1和猴水痘病毒的gH，具有伴随蛋白gL；人、牛和猕猴疱疹病毒gB；弗里德鼠(Friendmurine)白血病病毒和梅森-辉瑞猴病毒的包膜糖蛋白；流行性腮腺炎病毒血球凝集素神经氨酸酶，以及糖蛋白F1和F2；委内瑞拉马脑脊髓炎的膜糖蛋白；副粘病毒F蛋白；SIV gp160蛋白；埃博拉病毒G蛋白；或仙台病毒融合蛋白，或其同源物、其片段、其变异体，以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
非哺乳动物融合剂包括病毒融合剂、其同源物、其片段和包含一种或多种蛋白质或其片段的融合蛋白。病毒融合剂包括I类融合剂、II类融合剂、III类融合剂和IV类融合剂。在实施例中，I类融合剂(例如人类免疫缺陷病毒(HIV)gp41)具有特征性的融合后构形，其具有中心卷绕的卷曲结构的α-螺旋发夹的标志三聚体。I类病毒融合蛋白包括具有中心融合后六螺旋束的蛋白质。I类病毒融合蛋白包括流感HA、副流感F、HIV Env、埃博拉GP、来自正粘病毒的血球凝集素、来自副粘病毒的F蛋白(例如麻疹(Katoh等人，《BMC生物技术(BMC Biotechnology)》2010，10：37))、来自逆转录病毒的ENV蛋白，以及丝状病毒和冠状病毒的融合剂。在实施例中，II类病毒融合剂(如登革热E糖蛋白)的结构标志是β片，其形成细长的胞外域，所述胞外域再折叠以产生发夹三聚体。在实施例中，II类病毒融合剂缺乏中心卷绕的卷曲。II类病毒融合剂可以发现于α病毒(例如E1蛋白)和黄病毒(例如E糖蛋白)中。II类病毒融合剂包括来自胜利基森林病毒、辛比斯(Sinbis)、风疹病毒和登革热病毒的融合剂。在实施例中，III类病毒融合剂(如水泡性口炎病毒G糖蛋白)将I类和II类中发现的结构标志组合。在实施例中，III类病毒融合剂包含α螺旋(例如与I类病毒融合剂一样形成六螺旋束以折叠蛋白质)和在其末端具有两亲性融合肽的β片，使人联想到II类病毒融合剂。III类病毒融合剂可以发现于棒状病毒和疱疹病毒中。在实施例中，IV类病毒融合剂是融合相关的小跨膜(FAST)蛋白(数字对象标识符：10.1038/sj.emboj.7600767，Nesbitt，RaeL.，“使用以多官能FAST蛋白配制的脂质体进行的靶向细胞内治疗性递送(TargetedIntracellular Therapeutic Delivery Using Liposomes Formulated withMultifunctional FAST proteins)”(2012).电子论文和学位论文库(Electronic Thesisand Dissertation Repository).论文388)，其由非包膜呼肠孤病毒编码。在实施例中，IV类病毒融合剂足够小以致其不形成发夹(doi：10.1146/annurev-cellbio-101512-122422，doi：10.1016/j.devcel.2007.12.008)。
可以通过使融合蛋白或靶向蛋白(例如红血球凝集素蛋白)中的氨基酸残基突变来再靶向蛋白质融合剂或病毒包膜蛋白。在一些实施例中，使融合剂随机突变。在一些实施例中，使融合剂被合理地突变。在一些实施例中，使融合剂经历定向演化。在一些实施例中，融合剂被截短并且逆转录病毒载体或VLP中仅使用肽的亚群。举例来说，可以使麻疹红血球凝集素蛋白中的氨基酸残基突变以改变蛋白质的结合特性，从而使融合重定向(doi：10.1038/nbt942，《分子治疗学(Molecular Therapy)》第16卷，第8期，1427-14362008年8月，doi：10.1038/nbt1060，DOI：10.1128/JVI.76.7.3558-3563.2002，DOI：10.1128/JVI.75.17.8016-8020.2001，doi：10.1073pnas.0604993103)。
在一些实施例中，蛋白质融合剂或病毒包膜蛋白是通过以下再靶向i)突变氨基酸驻留于天然融合剂蛋白质序列或病毒包膜蛋白序列中和/或ii)工程改造融合剂蛋白或病毒包膜蛋白以含有允许融合剂或病毒包膜蛋白靶向并且融合或感染其正常范围外的宿主细胞的多肽序列。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其外表面上包含一种或多种融合剂(例如整合到细胞膜中)以靶向特定细胞或组织类型。融合剂包括(但不限于)：基于蛋白质、基于脂质和基于化学物质的融合剂。融合剂可以结合靶细胞表面上的搭配物。在一些实施例中，包含融合剂的融合剂脂质体会将膜整合到靶细胞的脂质双层中。
在一些实施例中，融合剂是副粘病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂是尼帕病毒蛋白F、麻疹病毒F蛋白、树鼩副粘病毒F蛋白、副粘病毒F蛋白、亨德拉病毒F蛋白、亨尼帕病毒F蛋白、麻疹病毒F蛋白、呼吸道病毒F蛋白、仙台病毒F蛋白、腮腺炎病毒F蛋白或禽腮腺炎病毒F蛋白。
在一些实施例中，融合剂是痘病毒科融合剂。
其它示例性融合剂公开于US 9,695,446、US 2004/0028687、US 6,416,997、US 7,329,807、US 2017/0112773、US 2009/0202622、WO 2006/027202和US 2004/0009604中，所述文献的全部的完整内容特此以引用的方式并入。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含表1D的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含与表1D的任何氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码表1D的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含SEQ ID NO：1-56中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含与SEQ ID NO：1-56中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码SEQ ID NO：1-56中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
表1D.副粘病毒F序列群集.第1列：基因库ID，包括病毒的完整基因组序列的基因库ID，所述完整基因组序列是群集的中心序列。第2列：CDS核苷酸，提供了与完整基因组中的基因的CDS对应的核苷酸。第3列：全基因名称，提供了基因的全称，包括基因库ID、病毒物种、病毒株和蛋白质名称。第4列：序列，提供了基因的氨基酸序列。第5列：序列/群集编号，提供了以这个中心序列群集的序列的编号。
Figure BDA0002963542200000541
Figure BDA0002963542200000551
Figure BDA0002963542200000561
Figure BDA0002963542200000571
Figure BDA0002963542200000581
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在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含表2的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含与表2的任何氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码表2的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含SEQ ID NO：57-132中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。举例来说，在一些实施例中，本文所描述的融合剂包含与SEQ ID NO：57-132中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少80％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，本文所描述的核酸序列编码SEQ ID NO：57-132中的任一个中所示的氨基酸序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列，或与所述序列的一部分(例如长度为40、50、60、80、100、200、300、400、500或600个氨基酸的部分)具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的氨基酸序列。
表2.副粘病毒蛋白G、H和HN序列群集.第1列：基因库ID，包括病毒的完整基因组序列的基因库ID，所述完整基因组序列是群集的中心序列。第2列：CDS核苷酸，提供了与完整基因组中的基因的CDS对应的核苷酸。第3列：全基因名称，提供了基因的全称，包括基因库ID、病毒物种、病毒株和蛋白质名称。第4列：序列，提供了基因的氨基酸序列。第5列：序列/群集编号，提供了以这个中心序列群集的序列的编号。
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其它蛋白质
在一些实施例中，融合剂可以包括pH依赖性蛋白、其同源物、其片段以及包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。融合剂可以介导细胞表面或内体中或另一细胞膜结合空间中的膜融合。
在一些实施例中，融合剂包括EFF-1、AFF-1、间隙连接蛋白，例如连接蛋白(如Cn43、GAP43、CX43)(DOI：10.1021/jacs.6b05191)、其它肿瘤连接蛋白、其同源物、其片段、其变异体和包含一种或多种蛋白质或其片段的蛋白质融合物。
脂质融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以包含一种或多种融合脂质，如饱和脂肪酸。在一些实施例中，饱和脂肪酸具有10-14个碳。在一些实施例中，饱和脂肪酸具有更长链的羧酸。在一些实施例中，饱和脂肪酸是单酯。
在一些实施例中，融合剂脂质体可以包含一种或多种不饱和脂肪酸。在一些实施例中，不饱和脂肪酸具有C16与C18之间的不饱和脂肪酸。在一些实施例中，不饱和脂肪酸包括油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油、改性不饱和脂肪酸和其任何组合。
不希望被理论所束缚，在一些实施例中，负曲率脂质促进膜融合。在一些实施例中，融合剂脂质体在膜中包含一种或多种负曲率脂质，例如外源性负曲率脂质。在实施例中，将负曲率脂质或其前体添加到包含源细胞或融合剂脂质体的培养基。在实施例中，源细胞经工程改造以表达或过度表达一种或多种脂质合成基因。负曲率脂质可以是例如二酰甘油(DAG)、胆固醇、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)或脂肪酸(FA)。
不希望被理论所束缚，在一些实施例中，正曲率脂质抑制膜融合。在一些实施例中，融合剂脂质体在膜中包含降低水平的一种或多种正曲率脂质，例如外源性正曲率脂质。在实施例中，通过抑制脂质合成，例如通过源细胞中的脂质合成基因的基因敲除或基因敲落来降低水平。正曲率脂质可以是例如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(PtdIns)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)或单酰基甘油(MAG)。
化学融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用融合化学物质处理。在一些实施例中，融合化学物质为聚乙二醇(PEG)或其衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂诱导两个膜之间的局部脱水，这导致双层的不利分子堆积。在一些实施例中，化学融合剂诱导脂质双层附近区域的脱水，导致两个膜之间的水分子移位并允许两个膜之间相互作用。
在一些实施例中，化学融合剂是阳离子。阳离子的一些非限制性实例包括Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、La3+、Sr3+和H+。
在一些实施例中，化学融合剂通过改变表面极性而结合到靶膜，其改变了水合依赖性膜间排斥。
在一些实施例中，化学融合剂为可溶脂溶性的。一些非限制性实例包括油酰甘油、二油酰甘油、三油酰甘油以及其变异体和衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂是水溶性化学物质。一些非限制性实例包括聚乙二醇、二甲亚砜以及其变异体和衍生物。
在一些实施例中，化学融合剂是有机小分子。非限制性实例包括正己基溴化物。
在一些实施例中，化学融合剂不改变融合剂或靶膜的构成、细胞活力或离子迁移特性。
在一些实施例中，化学融合剂是激素或维生素。一些非限制性实例包括脱落酸、视黄醇(维生素A1)、生育酚(维生素E)以及其变异体和衍生物。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含肌动蛋白和使聚合的肌动蛋白稳定的药剂。不希望被理论所束缚，融合剂脂质体中的稳定的肌动蛋白可以促进与靶细胞的融合。在实施例中，使聚合的肌动蛋白稳定的药剂是选自肌动蛋白、肌球蛋白、生物素-抗生蛋白链菌素、ATP、神经元韦斯考特-奥德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)蛋白(N-WASP)或形成蛋白。参见例如Langmuir.2011年8月16日；27(16)：10061-71和Wen等人，《自然通信(Nat Commun.)》2016年8月31日；7。在实施例中，融合剂脂质体包含外源肌动蛋白，例如野生型肌动蛋白或包含促进聚合的突变的肌动蛋白。在实施例中，融合剂脂质体包含ATP或磷酸肌酸，例如外源ATP或磷酸肌酸。
小分子融合剂
在一些实施例中，融合剂脂质体可以用融合小分子处理。一些非限制性实例包括卤烷、非类固醇消炎药(NSAID)，如美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)和氯丙嗪(chlorpromazine)。
在一些实施例中，小分子融合剂可以胶束状聚集体存在或不含聚集体。
对蛋白质融合剂的修饰
可以通过使融合蛋白或靶向蛋白(例如红血球凝集素蛋白)中的氨基酸残基突变来再靶向蛋白质融合剂或病毒包膜蛋白。在一些实施例中，使融合剂随机突变。在一些实施例中，使融合剂被合理地突变。在一些实施例中，使融合剂经历定向演化。在一些实施例中，融合剂被截短并且逆转录病毒载体或VLP中仅使用肽的亚群。举例来说，可以使麻疹红血球凝集素蛋白中的氨基酸残基突变以改变蛋白质的结合特性，从而使融合重定向(doi：10.1038/nbt942，《分子治疗学》第16卷，第8期，1427-1436 2008年8月，doi：10.1038/nbt1060，DOI：10.1128/JVI.76.7.3558-3563.2002，DOI：10.1128/JVI.75.17.8016-8020.2001，doi：10.1073pnas.0604993103)。
可以通过使靶向部分与融合蛋白或靶向蛋白(例如红血球凝集素蛋白)共价偶联来再靶向蛋白质融合剂。在一些实施例中，通过表达包含与靶向部分连接的融合剂的嵌合蛋白而使融合剂和靶向部分共价偶联。靶标包括靶细胞上所呈现的任何肽(例如受体)。在一些实例中，靶标在靶细胞上的表达水平高于非靶细胞。举例来说，可以使单链可变片段(scFv)与融合剂偶联，以将融合活性再引向呈现scFv结合靶的细胞(doi：10.1038/nbt1060，DOI10.1182/blood-2012-11-468579，doi：10.1038/nmeth.1514，doi：10.1006/mthe.2002.0550，《人类基因疗法(HUMAN GENE THERAPY)》11：817-826，doi：10.1038/nbt942，doi：10.1371/journal.pone.0026381，DOI 10.1186/s12896-015-0142-z)。举例来说，可以使所设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)与融合剂偶联，以将融合活性再引向显示DARPin结合靶的细胞(doi：10.1038/mt.2013.16，doi：10.1038/mt.2010.298，doi：10.4049/jimmunol.1500956)，以及不同DARPin的组合(doi：10.1038/mto.2016.3)。举例来说，可以使受体配体和抗原与融合剂偶联，以将融合活性再引向显示靶受体的细胞(DOI：10.1089/hgtb.2012.054，DOI：10.1128/JVI.76.7.3558-3563.2002)。靶向蛋白还可以包括例如抗体或其抗原结合片段(例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、ScFv抗体片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、由VH和CH1域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体(如sdAb(VL或VH))、纳米抗体或骆驼VHH域)、抗原结合III型纤连蛋白(Fn3)骨架(如纤连蛋白多肽微型抗体)、配体、细胞因子、趋化因子或T细胞受体(TCR)。可以通过使靶向部分与融合蛋白或靶向蛋白(例如红血球凝集素蛋白)非共价偶联来再靶向蛋白质融合剂。举例来说，可以对融合蛋白进行工程改造以结合靶向靶细胞上的抗原的抗体的Fc区，从而将融合活性再引向显示抗体靶标的细胞(DOI：10.1128/JVI.75.17.8016-8020.2001，doi：10.1038/nm1192)。改变和未改变的融合剂可以呈现于相同逆转录病毒载体或VLP上(doi：10.1016/j.biomaterials.2014.01.051)。
靶向部分可以包含例如人类化抗体分子、完整IgA、IgG、IgE或IgM抗体；双特异性或多特异性抗体(例如
Figure BDA0002963542200001231
等)；抗体片段，如Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fd′片段、Fd片段和分离的CDR或其集合；单链Fv；多肽-Fc融合物；单域抗体(例如鲨鱼单域抗体，如IgNAR或其片段)；骆驼抗体；被遮蔽的抗体(例如
Figure BDA0002963542200001232
)；小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)；单链或串联双功能抗体
Figure BDA0002963542200001233
VHH；
Figure BDA0002963542200001234
微型抗体；
Figure BDA0002963542200001241
锚蛋白重复蛋白或
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DART；TCR样抗体；
Figure BDA0002963542200001243
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MicroProteins；
Figure BDA0002963542200001245
以及
Figure BDA0002963542200001246
在实施例中，再靶向融合剂结合靶细胞上的细胞表面标记，例如蛋白质、糖蛋白、受体、细胞表面配体、促效剂、脂质、糖、I类跨膜蛋白、II类跨膜蛋白或III类跨膜蛋白。
融合剂脂质体可以显示未与蛋白质融合剂偶联的靶向部分，以将融合活性再引向与靶向部分结合的细胞，或影响归巢。
添加到融合剂脂质体中的靶向部分可以经调节以具有不同的结合强度。举例来说，具有各种结合强度的scFv和抗体可以用于改变融合剂脂质体针对显示高量或低量的靶抗原的细胞的融合活性(doi：10.1128/JVI.01415-07，doi：10.1038/cgt.2014.25，DOI：10.1002/jgm.1151)。举例来说，具有不同亲和力的DARPin可以用于改变逆转录病毒载体或VLP针对呈现高量或低量靶抗原的细胞的融合活性(doi：10.1038/mt.2010.298)。还可以调节靶向部分以靶向靶配体上的不同区域，这将影响与呈现靶标的细胞的融合速率(doi：10.1093/protein/gzv005)。
在一些实施例中，可以改变蛋白质融合剂以减少免疫应答性，例如如本文所描述。举例来说，蛋白质融合剂可以用减少免疫相互作用的分子(如PEG)装饰(DOI：10.1128/JVI.78.2.912-921.2004)。因此，在一些实施例中，融合剂包含PEG，例如聚乙二醇化多肽。免疫系统靶向的融合剂中的氨基酸残基可以改变成不被免疫系统识别(doi：10.1016/j.virol.2014.01.027，doi：10.1371/journal.pone.0046667)。在一些实施例中，融合剂的蛋白质序列经改变以类似于人类中所发现的氨基酸序列(人类化)。在一些实施例中，融合剂的蛋白质序列被改变为结合MHC复合物的强度较弱的蛋白质序列。在一些实施例中，蛋白质融合剂来源于未感染人类的病毒或生物体(并且人类尚未接种针对其的疫苗)，从而增加患者免疫系统未接触蛋白质融合剂的可能性(例如针对融合剂的体液或细胞介导性适应性免疫应答可以忽略不计)(doi：10.1006/mthe.2002.0550，doi：10.1371/journal.ppat.1005641，doi：10.1038/gt.2011.209，DOI 10.1182/blood-2014-02-558163)。在一些实施例中，可以改变融合剂的糖基化以改变免疫相互作用或减少免疫应答性。不希望被理论所束缚，在一些实施例中，来源于未感染人类的病毒或生物体的蛋白质融合剂在患者中并不具有天然融合靶标，并且因此具有高特异性。
正向靶细胞特异性调节元件
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸包含正向靶细胞特异性调节元件，如组织特异性启动子、组织特异性增强子、组织特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的组织特异性位点、组织特异性mRNA核输出启动位点、组织特异性翻译增强位点或组织特异性翻译后修饰位点。
本文所描述的逆转录病毒核酸可以包含各种区域，例如非翻译区域，如复制起点、选择盒、启动子、增强子、翻译起始信号(Shine Dalgarno序列或Kozak序列)、内含子、聚腺苷酸化序列、5′和3′非翻译区，其与宿主细胞蛋白相互作用以进行转录和翻译并且能够引导、增加、调节或控制可操作地连接的多核苷酸的转录或表达。此类元件的强度和特异性可以不同。视所用载体系统和宿主而定，可以使用任何数目个适合的转录与翻译元件，包括广泛型启动子和诱导型启动子。
在特定实施例中，控制元件能够以细胞特异性方式引导、增加、调节或控制可操作地连接的多核苷酸的转录或表达。在特定实施例中，逆转录病毒核酸包含一个或多个对特定细胞、细胞类型或细胞谱系(例如靶细胞)具有特异性的表达控制序列；即，可操作地连接到对特定细胞、细胞类型或细胞谱系具有特异性的表达控制序列的多核苷酸的表达是在靶细胞中表达，而在非靶细胞中不表达(或表达水平更低)。
在特定实施例中，逆转录病毒核酸可以包括外源、内源或异源控制序列，如启动子和/或增强子。
在实施例中，启动子包含RNA聚合酶所结合的识别位点。RNA聚合酶起始并且转录可操作地连接到启动子的多核苷酸。在特定实施例中，在哺乳动物细胞中可操作的启动子包含位于转录起始位点上游大致25到30个碱基处的富AT区域和/或在转录起点上游70到80个碱基处所发现的另一序列：CNCAAT区域，其中N可以是任何核苷酸。
在实施例中，增强子包含含有能够提供增强的转录的序列并且在一些情况下可以独立于取向(相对于另一种控制序列)发挥作用的DNA区段。增强子可以与启动子和/或其它增强子元件协同地或叠加地发挥作用。在一些实施例中，DNA的启动子/增强子区段含有能够提供启动子与增强子功能的序列。
说明性的广泛型表达控制序列包括(但不限于)：巨细胞病毒(CMV)即刻早期启动子；病毒猿猴病毒40(SV40)(例如早期或晚期)；莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)LTR启动子；劳氏肉瘤病毒(RSV)LTR；单纯疱疹病毒(HSV)(胸苷激酶)启动子；来自牛痘病毒的H5、P7.5和P11启动子；延伸因子1-α(EF1a)启动子；早期生长应答1(EGR1)；铁蛋白H(FerH)；铁蛋白L(FerL)；甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)；真核翻译起始因子4A1(EIF4A1)；热休克70kDa蛋白质5(HSPA5)；热休克蛋白90kDa β成员1(HSP90B1)；热休克蛋白70kDa(HSP70)；β-驱动蛋白(β-KIN)；人类ROSA 26基因座(Irions等人，《自然·生物技术(Nature Biotechnology)》25，1477-1482(2007))；泛素C启动子(UBC)；磷酸甘油酸激酶-1(PGK)启动子；巨细胞病毒增强子/鸡β-肌动蛋白(CAG)启动子；β-肌动蛋白启动子和骨髓增生性肉瘤病毒增强子；负向控制区缺失的、经d1587rev引物结合位点取代(MND)的启动子(Challita等人，《病毒学杂志》69(2)：748-55(1995))。
在一些实施例中，启动子可以与异源基因配对以赋予所述启动子对异源基因的调节功能。在一些实施例中，来自第一基因的启动子的顺式调节元件可以连接到不同基因的启动子的片段以产生具有两种启动子的特性的嵌合启动子。
在一些实施例中，启动子是组织特异性启动子，例如驱动在肝细胞中表达的启动子，例如肝细胞、肝窦内皮细胞、胆管细胞、星形细胞、肝驻留型抗原呈递细胞(例如库普弗细胞)、肝驻留型免疫淋巴细胞(例如T细胞、B细胞或NK细胞)，或门静脉成纤维细胞。下表3中描述了多种适合的肝特异性启动子(例如肝细胞特异性启动子和肝窦内皮细胞启动子)。表3还列举了对肝细胞无特异性的若干广泛型启动子。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包含具有表3的序列的启动子或其转录活性片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的变异体。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包含具有转录因子结合位点的启动子，所述转录因子结合位点来自表3中所列基因的转录起始位点3kb内的区域。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包含表3中所列基因的转录起始位点上游紧邻的2.5kb、2kb、1.5kb、1kb或0.5kb内的区域，或其转录活性片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的变异体。
在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包含具有SEQ ID NO：133-142中的任一个中所示的序列的启动子，或其转录活性片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的变异体。
在一些实施例中，启动子是驱动在肝细胞中表达的启动子，例如肝细胞、肝窦内皮细胞、胆管细胞、星形细胞、肝驻留型抗原呈递细胞(例如库普弗细胞)、肝驻留型免疫淋巴细胞(例如T细胞、B细胞或NK细胞)，或门静脉成纤维细胞。在一些实施例中，本文所描述的融合剂脂质体(例如病毒载体)在其核酸中包含具有SEQ ID NO：133-136或519-525中的任一个中所示的序列的启动子，或其转录活性片段，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的变异体。在一些实施例中，启动子为肝细胞特异性人类(ApoE.HCR-hAAT(hApoE))启动子。在一些实施例中，启动子具有与SEQ ID NO：133中所示的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性的序列。在一些实施例中，启动子具有SEQ ID NO：133中所示的序列。
表3.示例性启动子，例如肝细胞特异性启动子
Figure BDA0002963542200001271
Figure BDA0002963542200001281
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Figure BDA0002963542200001321
Figure BDA0002963542200001331
Figure BDA0002963542200001341
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Figure BDA0002963542200001361
已经描述了肝特异性顺式调节模块(例如启动子)内的各种共同序列。在一些实施例中，肝脏特异性顺式调节模块包含以下中的一种或多种的结合位点：HNF1α、C/EBP、LEF1、FOX、IRF、LEF1/TCF、Tal1β/E47和MyoD。在一些实施例中，肝脏特异性顺式调节模块包含Chuah等人，“通过全基因组计算机模拟分析所鉴别的肝脏特异性转录模块能够对小鼠和非人类灵长类动物进行有效的基因疗法”《分子治疗学》，2014年9月；22(9)：1605-1613的图1和表1中所示的序列，所述文献以全文引用的方式并入本文中，包括其中图1和表1的序列。在一些实施例中，肝脏特异性顺式调节模块包含如Chuah等人(同上)中所描述的HS-CRM1、HS-CRM2、HS-CRM3、HS-CRM4、HS-CRM5、HS-CRM6、HS-CRM7、HS-CRM8、HS-CRM9、HS-CRM10、HS-CRM11、HS-CRM12、HS-CRM13或HS-CRM14的人类序列。可以使用Chuah等人(同上)中所描述的方法鉴别额外细胞特异性启动子和顺式调节元件，例如肝特异性启动子或顺式调节元件。
内部核糖体进入位点(IRES)通常促进内部核糖体直接进入顺反子(蛋白质编码区)的起始密码子，如ATG，从而引起基因发生帽非依赖性翻译。参见例如Jackson等人，(1990)《生化科学趋势(Trends Biochem Sci)》15(12)：477-83，以及Jackson和Kaminski.(1995)《RNA))1(10)：985-1000。在特定的实施例中，载体包括编码一种或多种外源药剂的一种或多种外源基因。在特定实施例中，为了实现多种外源蛋白质药剂中的每一种的高效翻译，多核苷酸序列可以通过一个或多个编码自裂解多肽的IRES序列或多核苷酸序列隔开。
本文中的逆转录病毒核酸还可以包含一个或多个Kozak序列，例如促进mRNA初始结合到核糖体的小亚单元并增加翻译的短核苷酸序列。共同Kozak序列是(GCC)RCCATGG，其中R是嘌呤(A或G)(Kozak，(1986)《细胞》44(2)：283-92，以及Kozak，(1987)《核酸研究》15(20)：8125-48)。
对异源转录因子和诱导剂有应答的启动子
在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含允许外源药剂进行条件表达的元件，例如任何类型的条件表达，包括(但不限于)：诱导型表达；阻抑型表达；细胞类型特异性表达或组织特异性表达。在一些实施例中，为了实现外源药剂的条件表达，通过使细胞、组织或生物体经历引起外源药剂表达或引起外源药剂表达增加或减少的处理或条件来控制表达。
诱导型启动子/系统的说明性实例包括(但不限于)：类固醇诱导型启动子，如用于编码糖皮质激素或雌激素受体的基因的启动子(通过用对应激素处理而可诱导)；金属硫蛋白启动子(通过用各种重金属处理而可诱导)；MX-1启动子(可通过干扰素诱导)；“基因开关”米非司酮(mifepristone)可调节的系统(Sirin等人，2003，《基因(Gene)》，323：67)；二甲氨基二硫代甲酸铜诱导型基因开关(WO 2002/088346)；四环素依赖性调节系统等。
可以通过诱导剂分子的存在或不存在来活化或抑制转基因表达。在一些情况下，诱导剂分子以梯度方式活化或抑制基因表达，并且在一些情况下，诱导剂分子以全有或全无方式活化或抑制基因表达。
常用的诱导型启动子/系统是四环素(Tet)调节的系统。Tet系统是基于两个元件在相应靶细胞中的共表达：(i)与最小启动子融合并连接到所关注基因(例如编码外源药剂的基因)的含有Tet操纵子序列(TetO)重复序列的四环素应答元件；以及(ii)转录反式活化因子(tTA)、Tet抑制因子(TetR)的融合蛋白，和单纯疱疹病毒衍生的VP16蛋白的反式活化域。虽然在最初描述的形式中，转基因表达在缺乏四环素或其强类似物多西环素(Do)的情况下(称为Tet关闭系统)活化，但反式活化因子蛋白质内的四个氨基酸的修饰产生逆tTA(rtTA)，其仅在Dox存在下(Tet开启系统)结合到TetO。在一些实施例中，在反式活化因子中，VP16域已被最小活化域置换，潜在的剪接供体位点和剪接受体位点已被去除，并且蛋白质已得以密码子优化，从而得到改进的反式活化因子变异体rtTA2S-M2，其对Dox的敏感性更高并且基线活性更低。另外，已产生了不同的Tet应答启动子元件，包括TetO中的修饰，为了增强调节而距离相邻操纵子间隔36个核苷酸。其它修饰可以用于进一步减少基本活性并增加表达动态范围。作为实例，pTet-T11(短：TII)变异体显示了高动态范围和低背景活性。
条件表达还可以通过使用位点特异性DNA重组酶来实现。根据某些实施例，逆转录病毒核酸包含至少一个(通常两个)重组位点，所述重组由位点特异性重组酶介导，例如涉及重组反应的切除性或整合性蛋白质、酶、辅因子或相关蛋白质，所述重组反应涉及一个或多个重组位点(例如二个、三个、四个、五个、七个、十个、十二个、十五个、二十个、三十个、五十个等)，所述位点特异性重组酶可以是野生型蛋白质(参见Landy，《生物技术新见(Current Opinion in Biotechnology)》3：699-707(1993))，或其突变体、衍生物(例如含有重组蛋白序列或其片段的融合蛋白)、片段和变异体。重组酶的说明性实例包括(但不限于)：Cre、Int、IHF、Xis、Flp、Fis、Hin、Gin、ΦC31、Cin、Tn3解离酶、TndX、XerC、XerD、TnpX、Hjc、Gin、SpCCE1和ParA。
调节外源药剂表达的核糖开关
本文所提供的一些组合物和方法包括一个或多个核糖开关或包括一个或多个核糖开关的多核苷酸。核糖开关是调节基因表达的细菌中的常见特征并且是实现生物功能的RNA控制的手段。核糖开关可以存在于mRNA的5′非翻译区并且通过诱导或抑制核糖开关活性的小分子配体的结合而可以对基因表达实现调节控制。在一些实施例中，核糖开关控制涉及产生小分子配体的基因产物。核糖开关通常以顺式方式发挥作用，但已经鉴别出以反式方式发挥作用的核糖开关。天然核糖开关由两个域组成：通过三维折叠的RNA结构结合配体的适体域和基于配体的缺乏或存在而诱导或抑制核糖开关活性的功能转换域。因此，核糖开关实现了两个配体敏感性构型，分别代表开启和关闭状态(Garst等人，2011)。功能切换域可以通过调节以下来影响多核苷酸的表达：内部核糖体进入位点、前mRNA剪接供体在逆转录病毒基因构建体中的可及性、翻译、转录终止、转录物降解、miRNA表达或shRNA表达(Dambach和Winkler 2009)。适体和功能切换域可以与原生适体、突变/演化的原生适体或通过筛选随机RNA库而鉴别的全合成适体一样用作允许合成RNA装置来控制基因表达的模块化组件(McKeague等人，2016)。
嘌呤核糖开关家族代表了最大家族之一，其中发现了超过500种序列(Mandal等人，2003；US20080269258；以及WO2006055351)。嘌呤核糖开关共享类似结构，其由三个保守的螺旋元件/茎结构(PI、P2、P3)和中间环/接合元件(Jl-2、L2、J2-3、L3、J3-1)组成。核糖开关的嘌呤家族的适体域由于序列变异而在不同嘌呤化合物(如腺嘌呤、鸟嘌呤、腺苷、鸟苷、脱氧腺苷、脱氧鸟苷等)对其亲和力/调节方面天然地不同(Kim等人，2007)。
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒核酸包含编码可操作地连接到启动子和核糖开关的外源药剂的多核苷酸。核糖开关包括以下中的一种或多种(例如全部)：a.)适体域，例如能够结合核苷类似物抗病毒药物并且对鸟嘌呤或2′-脱氧鸟苷的结合相对于核苷类似物抗病毒药物已减少的适体域；以及b.)功能切换域，例如能够调节外源药剂表达的功能切换域，其中适体域对核苷类似物的结合诱导或抑制了功能切换域的表达调节活性，由此调节外源药剂的表达。在一些实施例中，外源药剂可以是多肽、miRNA或shRNA。举例来说，在一个实施例中，核糖开关可操作地连接到编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸。在本文所提供的非限制性说明性实例中，外源基因编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽。举例来说，核糖开关和编码一种或多种经工程改造的信号传导多肽的靶多核苷酸可以在源细胞基因组、复制不胜任型重组逆转录病毒颗粒、T细胞和/或NK细胞中找到。
适体域可以用作例如模块组件，并且与功能切换域中的任一种组合以影响RNA转录物。在本文公开的任何实施例中，核糖开关可以通过调节以下活性中的任一种来影响RNA转录物：内部核糖体进入位点(IRES)、前mRNA剪接供体的可及性、翻译、转录终止、转录物降解、miRNA表达，或shRNA表达。在一些实施例中，功能切换域可以控制抗IRES对IRES的结合(参见例如Ogawa，《RNA》(2011)，17：478-488，其公开内容以全文引用的方式并入本文)。在本文所公开的实施例中的任一个中，小分子配体的存在或不存在可以导致核糖开关影响RNA转录物。在一些实施例中，核糖开关可以包括核糖核酸酶。具有核糖核酸酶的核糖开关可以抑制或增强靶多核苷酸在小分子配体存在下的转录物降解。在一些实施例中，核糖核酸酶可以是手枪类的核糖核酸酶、锤头类的核糖核酸酶、扭转类的核糖核酸酶、短柄斧类的核糖核酸酶，或HDV(肝炎δ病毒)。
非靶细胞特异性调节元体
在一些实施例中，非靶细胞特异性调节元件或负向TCSRE包含组织特异性miRNA识别序列、组织特异性蛋白酶识别位点、组织特异性泛素连接酶位点、组织特异性转录抑制位点或组织特异性表观遗传抑制位点。
在一些实施例中，非靶细胞包含内源miRNA。逆转录病毒核酸(例如，编码外源药剂的基因)可以包含所述miRNA的识别序列。因此，如果逆转录病毒核酸进入非靶细胞，则miRNA可以下调外源药剂的表达。相对于非靶细胞，这有助于实现针对靶细胞的额外特异性。
在一些实施例中，miRNA是20-22个核苷酸的非编码小RNA，其通常从约70个核苷酸回折RNA前体结构(称为前miRNA)切得。一般来说，miRNA以两种方式中的一种负向调节其靶标，这视miRNA与靶标之间的互补程度而定。首先，通过与编码蛋白质的mRNA序列完全或几乎完全互补而结合的miRNA通常诱导RNA介导的干扰(RNAi)途径。通过结合到其mRNA靶标的3′非翻译区(UTR)内的不完全互补位点来发挥其调节作用的miRNA通常在转录后、明显地在翻译水平下、通过类似于或可能与RNAi途径所用相同的RISC复合物抑制靶基因表达。与翻译控制一致，使用这个机制的miRNA降低了其靶基因的蛋白质水平，但这些基因的mRNA水平受到的影响很小。miRNA(例如，天然存在的miRNA或人工设计的miRNA)可以特异性地靶向任何mRNA序列。举例来说，在一个实施例中，熟练的技术人员可以设计出表达为人类miRNA(例如miR-30或miR-21)初级转录物的短发夹RNA构建体。这个设计向发夹构建体增添了Drosha处理位点并且展示极大地增加基因敲落效率(Pusch等人，2004)。发夹茎由22nt的dsRNA(例如反义链与所期望的标靶完全互补)和来自人类miR的15-19nt环组成。当与不具有微RNA的常规shRNA设计相比时，在发夹的任一侧或两侧添加miR环和miR30侧接序列使得所表达的发夹的Drosha和Dicer处理增加大于10倍。增加的Drosha和Dicer处理转换成更大的siRNA/miRNA产生和所表达发夹的更大效能。
数百种不同的miRNA基因的表达在开发期间并且在所有组织类型中有差异。若干研究已经表明miRNA在广泛范围的生物过程中的重要调节作用，包括发育时序、细胞分化、增殖、细胞凋亡、瘤形成、胰岛素分泌和胆固醇生物合成。(参见Bartel 2004《细胞》116：281-97；Ambros 2004《自然(Nature)》431：350-55；Du等人，2005《发育(Development)》132：4645-52；Chen 2005《新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med.)》353：1768-71；Krutzfeldt等人，2005《自然》438：685-89)。分子分析已表明miRNA在不同组织中具有独特的表达谱。计算方法已用于分析约7,000个预测的人类miRNA靶标的表达。数据表明miRNA表达广泛地促成了许多人体组织中的mRNA表达的组织特异性。(参见Sood等人，2006，《美国国家科学院院刊(PNASUSA)》103(8)：2746-51)。
因此，基于miRNA的方法可以用于将外源药剂的表达局限于靶细胞群，这是通过使用内源微RNA物种使外源药剂在非靶细胞类型中的表达沉默来实现。微RNA通过抑制信使RNA(mRNA)翻译或通过引起mRNA降解来诱导许多生物体的序列特异性转录后基因沉默。参见例如Brown等人，2006《自然·医学》12(5)：585-91，和WO2007/000668，其中的每一个以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含组织特异性miRNA识别序列中的一种或多种(例如多种)。在一些实施例中，组织特异性miRNA识别序列长度为约20-25、21-24或23个核苷酸。在实施例中，组织特异性miRNA识别序列与存在于非靶细胞中的miRNA完全互补。在一些实施例中，外源药剂不包含GFP，例如不包含荧光蛋白，例如不包含报道蛋白。在一些实施例中，非靶细胞不是造血细胞和/或miRNA不存在于造血细胞中。
在一些实施例中，本文中的方法包含外源药剂在靶细胞中的组织特异性表达，包含：使包含编码外源药剂的核苷酸和至少一个组织特异性微RNA(miRNA)靶序列的多个逆转录病毒载体与包含靶细胞和非靶细胞的多个细胞接触，其中外源药剂优先在靶细胞中表达，例如限于靶细胞。
举例而言，逆转录病毒核酸可以包含可操作地连接到核苷酸序列的至少一个miRNA识别序列，所述核苷酸序列在非靶细胞(例如造血祖细胞(HSPC)、造血干细胞(HSC))中具有对应miRNA，其阻止或减少核苷酸序列在非靶细胞中的表达，但不阻止或减少核苷酸序列在靶细胞(例如分化细胞)中的表达。在一些实施例中，逆转录病毒核酸包含miRNA的至少一个miRNA序列靶标，所述miRNA序列靶标以有效量(例如内源miRNA的浓度足以减少或阻止转基因的表达)存在于非靶细胞中，并且包含转基因。在实施例中，这一系统中所用的miRNA在非靶细胞(如HSPC和HSC)中强烈表达，但在例如骨髓和淋巴谱系的分化子代中则不然，从而阻止或减少了转基因在敏感性干细胞群中的表达，同时维持其在靶细胞中的表达和治疗功效。
在一些实施例中，负向TSCRE或NTSCRE包含miRNA识别位点，例如被造血细胞内源性miRNA所结合的miRNA识别位点。下表4中提供了示例性miRNA。在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包含与表4的miRNA互补的序列，或与其具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补。在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包含与内源miRNA(例如表4的miRNA)内的种子序列完全互补的序列。在实施例中，种子序列长度为至少6、7、8、9或10个核苷酸。
在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包含与SEQ IDNO：143-160中的任一个中所示的miRNA互补的序列，或与其具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％互补的序列。在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包含与内源miRNA(例如SEQ ID NO：143-160中的任一个中所示的miRNA)内的种子序列完全互补的序列。在实施例中，种子序列长度为至少6、7、8、9或10个核苷酸。
表4.示例性miRNA序列.
沉默的细胞类型 miRNA名称 成熟的miRNA miRNA序列 SEQ ID NO
造血细胞 miR-142 hsa-miR-142-3p uguaguguuuccuacuuuaugga 143
造血细胞 miR-142 hsa-miR-142-5p cauaaaguagaaagcacuacu 144
造血细胞 mir-181a-2 hsa-miR-181a-5p aacauucaacgcugucggugagu 145
造血细胞 mir-181a-2 hsa-miR-181a-2-3p accacugaccguugacuguacc 146
造血细胞 mir-181b-1 hsa-miR-181b-5p aacauucauugcugucggugggu 147
造血细胞 mir-181b-1 hsa-miR-181b-3p cucacugaacaaugaaugcaa 148
造血细胞 mir-181c hsa-miR-181c-5p aacauucaaccugucggugagu 149
造血细胞 mir-181c hsa-miR-181c-3p aaccaucgaccguugaguggac 150
造血细胞 mir-181a-1 hsa-miR-181a aacauucaacgcugucggugagu 151
造血细胞 mir-181a-1 hsa-miR-181a-3p accaucgaccguugauuguacc 152
造血细胞 mir-181b-2 hsa-miR-181b-5p aacauucauugcugucggugggu 153
造血细胞 mir-181b-2 hsa-miR-181b-2-3p cucacugaucaaugaaugca 154
造血细胞 mir-181d hsa-miR-181d-5p aacauucauuguugucggugggu 155
造血细胞 mir-181d hsa-miR-181d-3p ccaccgggggaugaaugucac 156
造血细胞 miR-223 hsa-miR-223-5p cguguauuugacaagcugaguu 157
造血细胞 miR-223 hsa-miR-223-3p ugucaguuugucaaauacccca 158
pDCs miR-126 hsa-miR-126-5p cauuauuacuuuugguacgcg 159
pDCs miR-126 hsa-miR-126-3p ucguaccgugaguaauaaugcg 160
在一些实施例中，负向TSCRE或NTSCRE包含本文所描述的miRNA的miRNA识别位点。示例性miRNA包括以下文献中所发现的那些miRNA：Griffiths-Jones等人，《核酸研究》2006年1月1日，34；Chen和Lodish，《免疫学研讨文辑(Semin Immunol.)》2005年4月；17(2)：155-65；Chen等人，《科学》2004年1月2日；303(5654)：83-6；Barad等人，《基因组研究(GenomeRes.)》2004年12月；14(12)：2486-2494；Krichevsky等人，《RNA》2003年10月；9(10)：1274-81；Kasashima等人，《生物化学与生物物理学研究通信(Biochem Biophys Res Commun.)》2004年9月17日；322(2)：403-10；Houbaviv等人，《发育的细胞(Dev Cell.)》2003年8月；5(2)：351-8；Lagos-Quintana等人，《当代生物学(Curr Biol.)》2002年4月30日；12(9)：735-9；Calin等人，《美国国家科学院院刊》2004年3月2日；101(9)：2999-3004；Sempere等人，《基因组生物学(Genome Biol)》2004；5(3)：R13；Metzler等人，《基因染色体与癌症(GenesChromosomes Cancer)》2004年2月；39(2)：167-9；Calin等人，《美国国家科学院院刊》2002年11月26日；99(24)：15524-9；Mansfield等人，《自然·遗传学(Nat Genet.)》2004年10月；36(10)：1079-83；Michael等人，《分子癌症研究(Mol Cancer Res.)》2003年10月；1(12)：882-91；以及www.miRNA.org。
在一些实施例中，负向TSCRE或NTSCRE包含选自以下的miRNA的miRNA识别位点：miR-1b、miR-189b、miR-93、miR-125b、miR-130、miR-32、miR-128、miR-22、miR124a、miR-296、miR-143、miR-15、miR-141、miR-143、miR-16、miR-127、miR99a、miR-183、miR-19b、miR-92、miR-9、miR-130b、miR-21、miR-30b、miR-16、miR-142-s、miR-99a、miR-212、miR-30c、miR-213、miR-20、miR-155、miR-152、miR-139、miR-30b、miR-7、miR-30c、miR-18、miR-137、miR-219、miR-1d、miR-178、miR-24、miR-122a、miR-215、miR-142-a、miR-223、miR-142、miR-124a、miR-190、miR-149、miR-193、miR-181、let-7a、miR-132、miR-27a、miR-9*、miR-200b、miR-266、miR-153、miR-135、miR-206、miR-24、miR-19a、miR-199、miR-26a、miR-194、miR-125a、miR-15a、miR-145、miR-133、miR-96、miR-131、miR-124b、miR-151、miR-7b、miR-103和miR-208。
在一些实施例中，核酸(例如融合剂脂质体核酸或逆转录病毒核酸)包含两个或更多个miRNA识别位点。在一些实施例中，两个或更多个miRNA识别位点中的每一个被任何如本文所描述的miRNA识别，如表4中所示的任何miRNA。在一些实施例中，两个或更多个miRNA识别位点中的每一个被SEQ ID NO：143-160中的任一个中所示的miRNA识别。在一些实施例中，两个或更多个miRNA识别位点可以包括2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个miRNA识别位点。两个或更多个miRNA识别位点可以串联定位于核酸中以提供miRNA的多个串联结合位点。
在一些实施例中，两个或更多个miRNA识别位点可以包括至少一个第一miRNA识别位点，例如1、2、3、4、5、6个或更多个第一miRNA识别位点，和至少一个第二miRNA识别位点，例如1、2、3、4、5、6个或更多个第二miRNA识别位点。在一些实施例中，核酸含有两个或更多个第一miRNA识别位点并且所述第一miRNA识别位点中的每一个串联存在于核酸中以提供第一miRNA的多个串联结合位点，和/或核酸含有两个以上第二miRNA识别位点并且所述第二miRNA识别位点中的每一个串联存在于核酸中以提供第二miRNA的多个串联结合位点。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被相同的miRNA识别，并且在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被不同的miRNA识别。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被存在于相同的非靶细胞中的miRNA识别，并且在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点被存在于不同的非靶细胞中的miRNA识别。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点中的一个或两个都被任何如所描述的miRNA识别，例如表4中所示的任何miRNA。在一些实施例中，第一miRNA识别位点和第二miRNA识别位点中的一个或两个被SEQ ID NO：143-160中任一个所示的miRNA识别。
在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)上的miRNA识别位点中的一个或多个与外源药剂以顺式转录。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)上的miRNA识别位点中的一个或多个位于poly A尾序列的下游，例如在poly A尾序列和WPRE之间。在一些实施例中，融合剂脂质体核酸(例如逆转录病毒核酸)上的miRNA识别位点中的一个或多个位于WPRE的下游。
免疫调节
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体或VLP包含升高的CD47。参见例如美国专利第9,050,269号，其以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体或VLP包含升高的补体调节蛋白。参见例如ES2627445T3和US6790641，其中的每一者以全文引用的方式并入本文中。在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体或VLP缺乏MHC蛋白(例如MHC-11类或II类)或包含降低水平的MHC蛋白。参见例如US20170165348，其以全文引用的方式并入本文中。
有时，逆转录病毒载体或VLP被个体的免疫系统识别。在包封的病毒载体颗粒(例如逆转录病毒载体颗粒)的情况下，可以识别病毒包膜表面上所呈现的膜结合蛋白并且可以中和病毒颗粒本身。此外，在感染靶细胞时，病毒包膜与细胞膜整合在一起，并且因此病毒包膜蛋白可以呈现于细胞表面上或与细胞表面保持紧密缔合。因此，免疫系统也可以靶向病毒载体颗粒已感染的细胞。两种作用都可能导致病毒载体递送外源药剂的功效降低。
病毒颗粒包膜通常来源于源细胞的膜。因此，病毒颗粒萌芽于其中的细胞膜上所表达的膜蛋白可以并入病毒包膜中。
免疫调节蛋白CD47
细胞外材料内化到细胞中通常是通过称为胞吞的过程进行(Rabinovitch，1995，《细胞生物学趋势(Trends Cell BioL.)》5(3)：85-7；Silverstein，1995，《细胞生物学趋势》5(3)：141-2；Swanson等人，1995，《细胞生物学趋势》5(3)：89-93；Allen等人，1996，《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》184(2)：627-37)。内吞可以分为两大类：吞噬，其涉及颗粒的摄取；以及胞饮，其涉及流体和溶质的摄取。
基于对缺乏膜受体CD47的基因敲除小鼠的研究，专业吞噬细胞已展示出与非自我和自我的区别(Oldenborg等人，2000，《科学》288(5473)：2051-4)。CD47是Ig超家族的广泛成员，其与巨噬细胞上所发现的免疫抑制受体SIRPα(信号调节蛋白)相互作用(Fujioka等人，1996，《分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》16(12)：6887-99；Veillette等人，1998，《生物化学杂志》273(35)：22719-28；Jiang等人，1999，《生物化学杂志》274(2)：559-62)。虽然CD47-SIRPα相互作用似乎使小鼠的自体巨噬细胞失活，但在一些Rh基因型的人类血细胞上发现CD47严重降低(可能90％)，所述Rh基因型展示很少的贫血迹象或不展示贫血迹象(Mouro-Chanteloup等人，2003，《血液》101(1)：338-344)并且还展示很少的或不展示与吞噬单核细胞的细胞相互作用增强的迹象(Amdt等人，2004，《英国血液学杂志(Br.J.HaematoL.)》125(3)：412-4)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP(例如，半径小于约1μm，小于约400nm或小于约150nm的病毒颗粒)至少包含CD47的生物活性部分，例如在逆转录病毒载体或VLP的暴露表面上。在某些实施例中，逆转录病毒载体(例如慢病毒)或VLP包括脂质包衣。在实施例中，生物活性CD47在逆转录病毒载体或VLP中的量介于约20-250、20-50、50-100、100-150、150-200或200-250个分子/μm2。在一些实施例中，CD47是人类CD47。
本文所描述的方法可以包含规避吞噬细胞对颗粒的吞噬。所述方法可以包括在逆转录病毒载体或VLP中表达至少一种包括CD47的至少生物活性部分的肽，使得当包含CD47的逆转录病毒载体或VLP暴露于吞噬细胞时，病毒颗粒规避吞噬细胞的吞噬，或相较于其它方面类似的未经修饰逆转录病毒载体或VLP展示减少的吞噬。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP在个体中的半衰期相较于其它方面类似的未经修饰逆转录病毒载体或VLP延长。
MHC缺失
主要组织相容性复合物I类(MHC-I)是宿主细胞膜蛋白，其可以并入病毒包膜中并且由于其具有高度多形性质，因此其是身体免疫应答的主要靶标(McDevitt H.O.(2000)《免疫学年鉴(Annu.Rev.Immunol.)》18：1-17)。源细胞的质膜上所暴露的MHC-I分子可以在载体出芽过程中并入病毒颗粒包膜中。来源于源细胞并且并入病毒颗粒中的这些MHC-I分子继而可以转移到靶细胞的质膜上。替代地，由于病毒颗粒倾向于吸附并保持结合到靶细胞膜上，因此MHC-I分子可以与靶细胞膜保持紧密缔合。
外源MHC-I分子存在于或靠近已转导细胞的质膜存在可以诱发个体产生同种异体反应性免疫应答。进行离体基因转移、随后将已转导细胞施用于个体后，或直接体内施用病毒颗粒后，这可以引起免疫介导的已转导细胞的杀灭或吞噬。另外，在携带病毒颗粒的MHC-I体内施用到血流中的情况下，病毒颗粒在达到其靶细胞之前可以通过预先存在的MHC-I特异性抗体中和。
因此，在一些实施例中，对源细胞进行修饰(例如基因工程改造)以减少细胞表面上MHC-I的表达。在实施例中，源细胞包含基因工程改造的对编码β2-微球蛋白(β2M)的基因的破坏。在实施例中，源细胞包含基因工程改造的对编码MHC-I α链的一种或多种基因的破坏。细胞可以包含基因工程改造的对编码β2-微球蛋白的基因的所有拷贝的破坏。细胞可以包含基因工程改造的对编码MHC-I α链的基因的所有拷贝的破坏。细胞可以包含基因工程改造的对编码β2-微球蛋白的基因的破坏和基因工程改造的对编码MHC-I α链的基因的破坏。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP包含数目减少的表面暴露MHC-I分子。可以减少表面暴露的MHC-I分子的数目，以使得对MHC-1的免疫应答降低到治疗上相关的程度。在一些实施例中，被包封的病毒载体颗粒基本上不含表面暴露的MHC-I分子。
HLA-G/E过度表达
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP在其包膜上呈现致耐受性蛋白质，例如ILT-2或ILT-4促效剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其它ILT-2或ILT-4促效剂。在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒(例如其它方面类似于逆转录病毒的未经修饰逆转录病毒)，逆转录病毒载体或VLP的HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4表达增强。
在一些实施例中，逆转录病毒组合物的MHC I类相较于未经修饰的逆转录病毒减少，而逆转录病毒组合物的HLA-G相较于未经修饰的逆转录病毒增加。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的HLA-G或HLA-E表达相较于参考逆转录病毒(例如其它方面类似于逆转录病毒的未经修饰逆转录病毒)增加，例如HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中利用流式细胞测量术(例如FACS)对HLA-G或HLA-E表达进行体外分析。
在一些实施例中，具有HLA-G表达增加的逆转录病毒展现减少的免疫原性，例如在畸胎瘤形成分析中根据减少的免疫细胞浸润所测量。
补体调节蛋白
补体活性通常由多种补体调节蛋白(CRP)控制。这些蛋白质防止假性炎症和宿主组织损伤。一组蛋白质，包括CD55/衰变加速因子(DAF)和CD46/膜辅因子蛋白质(MCP)，抑制经典和旁路途径C3/C5转化酶。包括CD59的另一组蛋白质调节MAC组装。CRP已用于阻止异种移植组织的排斥反应并且也已展示保护病毒和病毒载体免于被补体灭活。
膜驻留的补体控制因子包括例如加速衰减因子(DAF)或CD55、因子H(FH)样蛋白质-1(FHL-1)、C4b结合蛋白(C4BP)、补体受体1(CD35)、膜辅因子蛋白质(MCP)或CD46，以及CD59(保护素)(例如阻止攻膜复合物(MAC)形成并保护细胞免于溶解)。
白蛋白结合蛋白
在一些实施例中，慢病毒结合白蛋白。在一些实施例中，慢病毒的表面上包含结合白蛋白的蛋白质。在一些实施例中，慢病毒的表面上包含白蛋白结合蛋白。在一些实施例中，白蛋白结合蛋白是链球菌白蛋白结合蛋白。在一些实施例中，白蛋白结合蛋白是链球菌白蛋白结合域。
非融合剂蛋白质在慢病毒包膜上的表达
在一些实施例中，慢病毒经工程改造以在其表面上包含一种或多种蛋白质。在一些实施例中，蛋白质影响与个体的免疫相互作用。在一些实施例中，蛋白质影响慢病毒在个体中的药理学。在一些实施例中，蛋白质是受体。在一些实施例中，蛋白质是促效剂。在一些实施例中，蛋白质是信号传导分子。在一些实施例中，慢病毒表面上的蛋白质包含抗CD3抗体(例如OKT3)或IL7。
在一些实施例中，促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白存在于源细胞中，其当从源细胞膜出芽时可以并入逆转录病毒中。促有丝分裂跨膜蛋白和/或基于细胞因子的跨膜蛋白可以作为单独的细胞表面分子在源细胞上表达，而非作为病毒包膜糖蛋白的一部分表达。
在本文所描述的任一方面的一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物基本上无免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP与靶细胞融合以产生接受者细胞。在一些实施例中，评估与一种或多种逆转录病毒载体或VLP融合的接受者细胞的免疫原性。在实施例中，分析接受者细胞的细胞表面上的抗体的存在，例如通过用抗IgM抗体染色来分析。在其它实施例中，通过PBMC细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与周边血液单核细胞(PBMC)一起培育，并且随后评估PBMC对所述细胞的溶解。在其它实施例中，通过自然杀手(NK)细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与NK细胞一起培育，并且随后评估NK细胞对所述细胞的溶解。在其它实施例中，通过CD8+T细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与CD8+T细胞一起培育，并且随后评估CD8+T细胞对所述细胞的溶解。
在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如由其它方面类似于源细胞的未经修饰源细胞或HEK293细胞产生的逆转录病毒载体或VLP)，逆转录病毒载体或VLP包含升高水平的免疫抑制剂(例如免疫抑制蛋白)。在一些实施例中，含量升高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP包含参考细胞中不存在的免疫抑制剂。在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如由其它方面类似于源细胞的未经修饰源细胞或HEK293细胞产生的逆转录病毒载体或VLP)，逆转录病毒载体或VLP包含降低水平的免疫刺激剂(例如免疫刺激性蛋白质)。在一些实施例中，相较于参考逆转录病毒载体或VLP，含量降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP中基本上不存在免疫刺激剂。
在一些实施例中，逆转录病毒载体，或VLP或逆转录病毒载体或VLP所来源的源细胞具有以下特征中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个：
a.MHC I类或MHC II类的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的源细胞或HeLa细胞或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.一种或多种共刺激蛋白的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK细胞或本文所描述参考细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小，所述共刺激蛋白包括(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达，例如抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白(例如CD47)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、杰卡特细胞(Jurkat cell)或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
d.可溶性免疫抑制性细胞因子(例如IL-10)的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达，例如可溶性免疫抑制性细胞因子(例如IL-10)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
e.可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达，例如可溶性免疫抑制蛋白(例如PD-L1)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)大1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或更多倍；
f.可溶性免疫刺激性细胞因子(例如IFN-γ或TNF-a)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的源细胞或HEK293细胞或U-266细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.内源性免疫刺激性抗原(例如Zg16或Hormad1)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或A549细胞或SK-BR-3细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
h.相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，HLA-E或HLA-G的表达，例如本文所描述方法可检测到的表达；
i.表面糖基化分布，例如含有唾液酸，其用以例如抑制NK细胞活化；
j.TCRα/β的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
k.ABO血型的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
l.次要组织相容性抗原(MHA)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
m.线粒体MHA相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更少，或检测不到线粒体MHA。
在实施例中，共刺激蛋白是4-1BB、B7、SLAM、LAG3、HVEM或LIGHT，而参考细胞是HDLM-2。在一些实施例中，共刺激蛋白是BY-H3，而参考细胞是HeLa细胞。在一些实施例中，共刺激蛋白是ICOSL或B7-H4，而参考细胞是SK-BR-3。在一些实施例中，共刺激蛋白是ICOS或OX40，而参考细胞是MOLT-4。在一些实施例中，共刺激蛋白是CD28，而参考细胞是U-266。在一些实施例中，共刺激蛋白是CD30L或CD27，而参考细胞是道迪细胞(Daudi)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物基本上不诱发免疫系统(例如先天免疫系统)的免疫原性应答。在实施例中，可以定量免疫原性应答，例如如本文所描述。在一些实施例中，先天免疫系统的免疫原性应答包含先天免疫细胞的应答，所述先天免疫细胞包括(但不限于)：NK细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞或γ/δ T细胞。在一些实施例中，先天免疫系统的免疫原性应答包含补体系统的应答，所述补体系统包括可溶性血液组分和膜结合组分。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物基本上不诱发免疫系统(例如适应性免疫系统)的免疫原性应答。在一些实施例中，适应性免疫系统的免疫原性应答包含适应性免疫细胞的免疫原性应答，包括(但不限于)T淋巴细胞(例如CD4 T细胞、CD8 T细胞和或γ-δ T细胞)或B淋巴细胞的数目或活性的变化，例如增加。在一些实施例中，适应性免疫系统的免疫原性应答包括增加水平的可溶血液组分，包括(但不限于)细胞因子或抗体(例如IgG、IgM、IgE、IgA或IgD)的数目或活性的变化，例如增加。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物经修饰以具有降低的免疫原性。在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物的免疫原性比参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)的免疫原性小不到5％、10％、20％、30％、40％或50％。
在本文所描述的任一方面的一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其基因组经修饰(例如使用本文所描述的方法修饰)以降低(例如减轻)免疫原性。免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞的以下中的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种或更多种耗竭，例如被基因敲除：
a.MHC I类、MHC II类或MHA；
b.一种或多种共刺激蛋白，包括(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激细胞因子，例如IFN-γ或TNF-a；
d.内源性免疫刺激抗原，例如Zg16或Hormad1；
e.T细胞受体(TCR)；
f.编码ABO血型的基因，例如ABO基因；
g.驱动免疫活化的转录因子，例如NFkB；
h.控制MHC表达的转录因子，例如II类反式活化子(CIITA)、Xbox 5的调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复序列(RFXANK；也称为RFXB)；或
i.TAP蛋白，例如TAP2、TAP1或TAPBP，其减少MHC I类表达。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于具有基因修饰的源细胞，所述基因修饰引起免疫抑制剂的表达增加，例如以下中的一种、两种、三种或更多种(例如其中在基因修饰之前，细胞不表达因子)：
a.抑制巨噬细胞吞噬的表面蛋白，例如CD47；例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，CD47的表达增加；
b.可溶性免疫抑制细胞因子，例如IL-10，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，IL-10的表达增加；
c.可溶性免疫抑制蛋白，例如PD-1、PD-L1、CTLA4或BTLA；例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，免疫抑制蛋白的表达增加；
d.致耐受性蛋白质，例如ILT-2或ILT-4促效剂，例如HLA-E或HLA-G或任何其它内源ILT-2或ILT-4促效剂，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，HLA-E、HLA-G、ILT-2或ILT-4的表达增加；或
e.抑制补体活性的表面蛋白，例如补体调节蛋白，例如结合加速衰减因子(DAF，CD55)的蛋白质，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP、CD46)，例如凸出蛋白(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质；例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，补体调节蛋白的表达增加。
在一些实施例中，增加的表达量比参考逆转录病毒载体或VLP高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于源细胞，所述源细胞经修饰以具有减小的免疫刺激剂表达，例如以下中的一种、二种、三种、四种、五种、六种、七种、八种或更多种：
a.MHC I类或MHC II类的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
b.一种或多种共刺激蛋白的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或本文所描述参考细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小，所述共刺激蛋白包括(但不限于)：LAG3、ICOS-L、ICOS、Ox40L、OX40、CD28、B7、CD30、CD30L 4-1BB、4-1BBL、SLAM、CD27、CD70、HVEM、LIGHT、B7-H3或B7-H4；
c.可溶性免疫刺激性细胞因子(例如IFN-γ或TNF-a)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或U-266细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
d.内源性免疫刺激性抗原(例如Zg16或Hormad1)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HEK293细胞或A549细胞或SK-BR-3细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
e.T细胞受体(TCR)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
f.ABO血型的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
g.驱动免疫活化的转录因子(例如NFkB)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小
h.控制MHC表达的转录因子(例如II类反式活化因子(CIITA)、Xbox 5的调节因子(RFX5)、RFX相关蛋白(RFXAP)或RFX锚蛋白重复(RFXANK；也称为RFXB))的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或杰卡特细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；或
i.减少MHC I类表达的TAP蛋白(例如TAP2、TAP1或TAPBP)的表达相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞、HEK293细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)小50％、40％、30％、20％、15％、10％或5％或更小；
在一些实施例中，来源于使用表达shRNA的慢病毒减少MHC I类表达而经修饰的哺乳动物细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体、VLP或药物组合物的MHC I类表达小于未修饰的逆转录病毒载体或VLP，例如来自尚未修饰的细胞(例如间叶干细胞)的逆转录病毒载体或VLP。在一些实施例中，来源于使用表达HLA-G的慢病毒增加HLA-G表达而经修饰的哺乳动物细胞(例如HEK293)的逆转录病毒载体或VLP的HLA-G表达相较于未修饰的逆转录病毒载体或VLP(例如来自尚未修饰的细胞(例如HEK293))增加。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于基本上无免疫原性的源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述源细胞刺激(例如诱导)T细胞分泌IFN-γ的水平为0pg/mL到＞0pg/mL，例如如通过IFN-γELISPOT分析来进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞来自用免疫抑制剂处理的细胞培养物，例如糖皮质激素(例如地塞米松(dexamethasone))、细胞生长抑制剂(例如甲氨喋呤(methotrexate))、抗体(例如莫罗单抗(Muromonab)-CD3)或免疫亲和素调节剂(例如环孢菌素(Ciclosporin)或雷帕霉素(rapamycin))。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞包含外源药剂，例如治疗剂。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物组合物来源于源细胞，例如哺乳动物细胞，其中所述哺乳动物细胞是重组细胞。
在一些实施例中，逆转录病毒载体、VLP或药物来源于哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞经基因修饰以表达病毒免疫逃避素，例如hCMV US2或US11。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面用聚合物(例如减少免疫原性和免疫介导清除的生物相容性聚合物，例如PEG)进行共价或非共价修饰。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面用唾液酸(例如包含糖聚合物的唾液酸，其含有NK抑制性聚糖抗原决定基)进行共价或非共价修饰。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面经酶(例如糖苷酶，例如α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶)处理以去除ABO血型。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的表面或源细胞的表面经酶处理以产生与接受者的血液类型匹配的ABO血型，例如诱导所述ABO血型的表达。
评估免疫原性的参数
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于基本上无免疫原性或经修饰(例如使用本文所描述的方法修饰以使免疫原性减少)的源细胞，例如哺乳动物细胞。源细胞和逆转录病毒载体或VLP的免疫原性可以通过本文所描述的任何分析来确定。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的体内移植存活期相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)增加，例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP的免疫原性减少，如根据逆转录病毒载体或VLP的一次或多次植入适当动物模型(例如本文所描述的动物模型)之后的体液应答相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)的一次或多次植入适当动物模型(例如本文所描述的动物模型)之后的体液应答的减少所测量。在一些实施例中，体液应答的减少是使用血清样品、根据抗细胞抗体效价(例如抗逆转录病毒或抗VLP抗体效价)测量，例如通过ELISA测量。在一些实施例中，相较于施用未经修饰逆转录病毒载体或VLP的动物的血清样品，施用逆转录病毒载体或VLP的动物的血清样品的抗逆转录病毒或抗VLP抗体效价减小1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施例中，施用逆转录病毒载体或VLP的动物的血清样品的抗逆转录病毒或抗VLP抗体效价增加，例如相对于基线增加1％、2％、5％、10％、20％、30％或40％，例如其中基线是指同一动物在施用逆转录病毒载体或VLP之前的血清样品。
在一些实施例中，所述逆转录病毒载体或VLP使巨噬细胞吞噬减少，例如巨噬细胞吞噬相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中巨噬细胞吞噬的减少是通过分析体外吞噬指数来确定，例如如实例8中所描述。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP在巨噬细胞吞噬的体外分析中当与巨噬细胞一起培育时，具有0、1、10、100或更大的吞噬指数，例如如通过实例8的分析所测量。
在一些实施例中，细胞毒性介导的PBMC对所述源细胞或接受者细胞的细胞溶解减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞，或间叶干细胞)，细胞溶解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如使用实例17的分析。在实施例中，源细胞表达外源HLA-G。
在一些实施例中，NK对源细胞或接受者细胞介导的细胞溶解减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞)，NK介导的细胞溶解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中通过铬释放分析或铕释放分析(例如使用实例18的分析)对NK介导的细胞溶解进行体外分析。
在一些实施例中，CD8+T细胞对源细胞或接受者细胞介导的细胞溶解减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞)，CD8 T细胞介导的细胞溶解减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中通过实例19的分析对CD8 T细胞介导的细胞溶解进行体外分析。
在一些实施例中，源细胞或接受者细胞中的CD4+T细胞增殖和/或活化减少，例如相较于参考细胞(例如其它方面类似于所述源细胞的未经修饰细胞，或接受未经修饰逆转录病毒载体或VLP的接受者细胞)，减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中对CD4 T细胞增殖进行体外分析(例如经修饰或未经修饰的哺乳动物源细胞和CD4+T细胞与CD3/CD28戴诺珠粒(Dynabead)的共培养分析)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得T细胞的IFN-γ分泌减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，T细胞的IFN-γ分泌减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中例如通过IFN-γELISPOT对T细胞的IFN-γ分泌进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得免疫原性细胞因子的分泌减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，免疫原性细胞因子的分泌减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用ELISA或ELISPOT对免疫原性细胞因子的分泌进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得免疫抑制性细胞因子的分泌增加，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，免疫抑制性细胞因子的分泌增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用ELISA或ELISPOT对免疫抑制性细胞因子的分泌进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得HLA-G或HLA-E的表达增加，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，HLA-G或HLA-E的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对HLA-G或HLA-E的表达进行体外分析。在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于经修饰而使HLA-G或HLA-E表达增加的源细胞，例如相较于未经修饰的细胞，HLA-G或HLA-E的表达例如增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对HLA-G或HLA-E的表达进行体外分析。在一些实施例中，来源于HLA-G表达增加的经修饰细胞的逆转录病毒载体或VLP展现减少的免疫原性。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得或引起T细胞抑制剂配体(例如CTLA4、PD1、PD-L1)的表达增加，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，使T细胞抑制剂配体的表达增加1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对T细胞抑制剂配体的表达进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得共刺激配体的表达减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，使共刺激配体的表达减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对共刺激配体的表达进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP使得MHC I类或MHC II类的表达减少，例如相较于参考逆转录病毒载体或VLP(例如来自其它方面类似于所述源细胞的细胞或HeLa细胞的未经修饰逆转录病毒载体或VLP)，使MHC I类或MHC II类的表达减少1％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，其中使用流式细胞测量术(例如FACS)对MHC I类或II类的表达进行体外分析。
在一些实施例中，逆转录病毒载体或VLP来源于基本上无免疫原性的细胞源，例如哺乳动物细胞源。在一些实施例中，免疫原性可以被定量，例如如本文所描述。在一些实施例中，哺乳动物细胞源包含以下特征中的任何一个、全部或组合：
a.其中源细胞是从自体细胞源获得；例如从将接受(例如施用)逆转录病毒载体或VLP的接受者获得的细胞；
b.其中源细胞是从与接受者(例如本文所描述的接受者，其将接受(例如施用)逆转录病毒载体或VLP)匹配(例如性别相似)的同种异体细胞源获得；
c.其中源细胞是从HLA与接受者的HLA匹配(例如在一个或多个等位基因处)的同种异体细胞源获得；
d.其中源细胞是从作为HLA同型接合子的同种异体细胞源获得；
e.其中源细胞是从缺乏MHC I类和II类(或MHC I类和II类水平相较于参考细胞降低)的同种异体细胞源获得；或
f.其中源细胞是从已知基本上无免疫原性的细胞源获得，包括(但不限于)：干细胞、间叶干细胞、诱导型多能干细胞、胚胎干细胞、塞特利氏细胞(sertoli cell)或视网膜色素上皮细胞。
在一些实施例中，待施用逆转录病毒载体或VLP的个体具有或已知具有或经测试具有与逆转录病毒载体或VLP呈反应性的预先存在的抗体(例如IgG或IgM)。在一些实施例中，对逆转录病毒载体或VLP具有反应性的预先存在的抗体在待施用逆转录病毒载体或VLP的个体中不具有可检测到的水平。抗体的测试描述于例如实例13中。
在一些实施例中，已接受逆转录病毒载体或VLP的个体具有或已知具有或经测试具有与逆转录病毒载体或VLP具有反应性的抗体(例如IgG或IgM)。在一些实施例中，接受逆转录病毒载体或VLP(例如至少一次、两次、三次、四次、五次或更多次)的个体中的对逆转录病毒载体或VLP具有反应性的抗体不具有可检测到的水平。在实施例中，抗体水平在两个时间点之间升高不超过1％、2％、5％、10％、20％或50％，第一时间点是在第一次施用逆转录病毒载体或VLP之前，而第二时间点是在一次或多次施用逆转录病毒载体或VLP之后。抗体的测试描述于例如实例14中。
外源药剂
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体、VLP或药物组合物编码外源药剂。
外源蛋白药剂
在一些实施例中，外源药剂包含胞质蛋白，例如在接受者细胞中产生并且定位于接受者细胞的细胞质中的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含分泌性蛋白，例如由接受者细胞产生并分泌的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含核蛋白，例如在接受者细胞中产生并输入接受者细胞的细胞核中的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含细胞器蛋白(例如线粒体蛋白)，例如在接受者细胞中产生并输入接受者细胞的细胞器(例如线粒体)中的蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是野生型蛋白质或突变型蛋白质。在一些实施例中，所述蛋白质是融合或嵌合蛋白。
在一些实施例中，外源药剂由来自以下的基因编码：OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAH、PAL、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LNBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL、GRHPR、HOGA1、LDLR、ACAD8、ACADSB、ACAT1、ACSF3、ASPA、AUH、DNAJC19、ETHE1、FBP1、FTCD、GSS、HIBCH、IDH2、L2HGDH、MLYCD、OPA3、OPLAH、OXCT1、POLG、PPM1K、SERAC1、SLC25A1、SUCLA2、SUCLG1、TAZ、AGK、CLPB、TMEM70、ALDH18A1、OAT、CA5A、GLUD1、GLUL、UMPS、SLC22A5、CPT1A、HADHA、HADH、SLC52A1、SLC52A2、SLC52A3、HADHB、GYS2、PYGL、SLC2A2、ALG1、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、ALG11、ALG12、ALG13、ATP6V0A2、B3GLCT、CHST14、COG1、COG2、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、DOLK、DHDDS、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、G6PC3、GFPT1、GMPPA、GMPPB、MAGT1、MAN1B1、MGAT2、MOGS、MPDU1、MPI、NGLY1、PGM1、PGM3、RFT1、SEC23B、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SSR4、SRD5A3、TMEM165、TRIP11、TUSC3、ALG14、B4GALT1、DDOST、NUS1、RPN2、SEC23A、SLC35A3、ST3GAL3、STT3A、STT3B、AGA、ARSA、ARSB、ASAH1、ATP13A2、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、CTNS、CTSA、CTSD、CTSF、CTSK、DNAJC5、FUCA1、GAA、GALC、GALNS、GLA、GLB1、GM2A、GNPTAB、GNPTG、GNS、GRN、GUSB、HEXA、HEXB、HGSNAT、HYAL1、IDS、IDUA、KCTD7、LAMP2、MAN2B1、MANBA、MCOLN1、MFSD8、NAGA、NAGLU、NEU1、NPC1、NPC2、SGSH、PPT1、PSAP、SLC17A5、SMPD1、SUMF1、TPP1、AHCY、GNMT、MAT1A、GCH1、PCBD1、PTS、QDPR、SPR、DNAJC12、ALDH4A1、PRODH、HPD、GBA、HGD、AMN、CD320、CUBN、GIF、TCN1、TCN2、PREPL、PHGDH、PSAT1、PSPH、AMT、GCSH、GLDC、LIAS、NFU1、SLC6A9、SLC2A1、ATP7A、AP1S1、CP、SLC33A1、PEX7、PHYH、AGPS、GNPAT、ABCD1、ACOX1、PEX1、PEX2、PEX3、PEX5、PEX6、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX26、AMACR、ADA、ADSL、AMPD1、GPHN、MOCOS、MOCS1、PNP、XDH、SUOX、OGDH、SLC25A19、DHTKD1、SLC13A5、FH、DLAT、MPC1、PDHA1、PDHB、PDHX、PDP1、ABCC2、SLCO1B1、SLCO1B3、HFE2、ADAMTS13、PYGM、COL1A2、TNFRSF11B、TSC1、TSC2、DHCR7、PGK1、VLDLR、KYNU、F5、C3、COL4A1、CFH、SLC12A2、GK、SFTPC、CRTAP、P3H1、COL7A1、PKLR、TALDO1、TF、EPCAM、VHL、GC、SERPINA1、ABCC6、F8、F9、ApoB、PCSK9、LDLRAP1、ABCG5、ABCG8、LCAT、SPINK5或GNE。
在一些实施例中，外源药剂是由来自以下的基因编码：OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAL、PAH、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LMBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL、GRHPR、HOGA1或LDLR。在一些实施例中，外源药剂为酶苯丙氨酸裂解酶(PAL)。
在一些实施例中，外源药剂包含下表5的蛋白质。在一些实施例中，外源药剂包含表5的蛋白质中的任一种的野生型人类序列、其功能片段(例如其酶活性片段)或其功能变异体。在一些实施例中，外源药剂包含与表5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列，例如表5的第4列的Uniprot蛋白质寄存编号序列或表5的第5列的氨基酸序列。在一些实施例中，编码外源药剂的有效负载基因编码与表5的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码外源药剂的有效负载基因具有与表5的核酸序列(例如表5的第3列的组装基因寄存编号)具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的核酸序列。
在一些实施例中，外源药剂包含SEQ ID NO：161-518中的任一个中所示的氨基酸序列。在一些实施例中，外源药剂包含SEQ ID NOS：161-518中的任一个中所示的野生型人类序列、其功能片段(例如其酶活性片段)或其功能变异体。在一些实施例中，外源药剂包含与SEQ IDNOS：161-518中的任一个中所示的氨基酸序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码外源药剂的有效负载基因编码与SEQ ID NOS：161-518中的任一个具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列。在一些实施例中，编码外源药剂的有效负载基因编码SEQ ID NOS：161-518中的任一个中所示的氨基酸序列。
表5.第一列列出可以根据本文中的方法和用途递送以治疗第六列中的适应症的外源药剂。表5的每个Uniprot寄存编号以全文引用的方式并入本文中。
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在一些实施例中，蛋白质药剂不是凝血因子，例如不是因子VII或因子IX。在一些实施例中，蛋白质药剂不是报道蛋白，例如荧光蛋白，例如GFP或荧光素酶。在一些蛋白质药剂不是细胞表面受体、NGF受体、半乳糖脑苷脂酶、gp91 phox、IFN-α、TK、GCV和自身免疫抗原、细胞因子、血管生成抑制剂或抗癌剂或其片段或变异体。
隔离元件
在一些实施例中，融合剂脂质体，逆转录病毒或慢病毒载体或VLP还包含一个或多个隔离元件，例如本文所描述的隔离元件。隔离元件可以有助于保护慢病毒表达的序列(例如治疗多肽)以免整合位点效应，所述整合位点效应可以由存在于基因组DNA中的顺式作用元件介导并且导致所转移序列的表达失调(例如位置效应；参见例如Burgess-Beusse等人，2002，《美国国家科学院院刊》99：16433；和Zhan等人，2001，《人类遗传学(Hum.Genet.)》，109：471)或导致与所转移序列相邻的内源序列的表达失调。在一些实施例中，转移载体包含一个或多个隔离元件3′LTR，并且在原病毒整合到宿主基因组中后，原病毒凭借复制3′LTR而在5′LTR和/或3′LTR处包含一个或多个隔离子。适合的隔离子包括(但不限于)鸡β-球蛋白隔离子(参见Chung等人，1993.《细胞》74∶505；Chung等人，1997.N4S 94：575；以及Bell等人，1999.《细胞》98：387，所述文献以引用的方式并入本文中)或来自人类β-球蛋白基因座的隔离子，如鸡HS4。在一些实施例中，隔离子结合CCTCC结合因子(CTCF)。在一些实施例中，隔离子是阻挡型隔离子。在一些实施例中，隔离子是增强子阻断的隔离子。参见例如Emery等人，《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》，2011，以及Browning和Trobridge，《生物医药(Biomedicines)》，2016，两者均以全文引用的方式包括在内。
在一些实施例中，逆转录病毒核酸中的隔离子减少接受者细胞的基因毒性。基因毒性可以如例如以下文献中所描述测量：Cesana等人，“发现以及剖析自失活慢病毒载体的体内基因毒性(Uncovering and dissecting the genotoxicity of self-inactivatinglentiviral vectors in vivo)”，《分子治疗学》，2014年4月；22(4)：774-85.doi：10.1038/mt.2014.3.2014年1月20日电子出版。
细胞来源的融合剂脂质体
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体，其包含：
(a)脂质双层，
(b)被脂质双层包围的内腔(例如包含胞质溶胶)；
(c)外源性或过度表达的融合剂，例如其中融合剂安置于脂质双层中，
其中融合剂脂质体来源于源细胞；并且
其中融合剂脂质体具有部分或完全核灭活(例如核去除)。
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)核酸，例如，包含有效负载基因的核酸；并且
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％；
其中：
(i)当所述多个融合剂脂质体与包含靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，相比于非靶细胞或参考细胞，所述货物存在于多至少10倍的靶细胞中，或
(ii)相比于非靶细胞或参考细胞，所述多个融合剂脂质体以高至少至少50％的速率与靶细胞融合；
其中所述靶细胞是选自肝窦内皮细胞、胆管上皮细胞、星状细胞、肝驻留抗原呈递细胞(例如，库普弗细胞)、肝驻留免疫淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)或门静脉成纤维细胞。
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)包含编码表5的外源药剂的有效负载基因的核酸，
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；并且
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％。
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)包含有效负载基因的核酸，其中所述核酸包含可操作地连接到所述有效负载基因的NTCSRE，其中所述NTCSRE包含非肝细胞特异性miRNA识别序列，例如由存在于造血细胞或浆细胞样树突状细胞(pDC)中的miRNA结合的非肝细胞特异性miRNA识别序列，例如由以比存在于肝细胞中更高水平存在于造血细胞或浆细胞样树突状细胞(pDC)中的miRNA结合，例如由表4的miRNA结合的非肝细胞特异性miRNA识别序列；并且
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；并且
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％。
在一些实施例中，miRNA以比存在于靶细胞(例如，肝细胞，例如本文所描述的肝细胞)中的miRNA的水平高至少10、100、1,000或10,000倍的水平存在于非靶细胞(例如，造血细胞或pDC)中。在一些实施例中，miRNA不可检测地存在于靶细胞(例如，肝细胞)中。在一些实施例中，miRNA不存在于靶细胞(例如，肝细胞)中。
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)包含有效负载基因的核酸，其中所述核酸包含可操作地连接到所述有效负载基因的启动子，其中所述启动子是肝特异性启动子，例如是对肝窦内皮细胞、胆管上皮细胞、星状细胞、肝驻留抗原呈递细胞(例如，库普弗细胞)、肝驻留免疫淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)或门静脉成纤维细胞具有特异性的启动子；
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；并且
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％。
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)包含有效负载基因的核酸，其中所述核酸包含具有表3的序列的启动子，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列；
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；并且
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％；
在一些方面，本公开提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)核酸，其包含：
(i)有效负载基因；
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的NTCSRE，例如其中所述NTCSRE包含非肝细胞特异性miRNA识别序列，例如由表4的miRNA结合的非肝细胞特异性miRNA识别序列，以及
(iii)任选地，可操作地连接到所述有效负载基因的正向靶细胞特异性调节元件，例如正向肝细胞特异性调节元件(例如，肝细胞特异性启动子)，其中所述正向肝细胞特异性调节元件相对于缺乏所述正向靶细胞特异性调节元件视为其它方面类似的融合剂脂质体增加所述有效负载基因在靶细胞中的表达；
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；并且
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％。
在一些实施例中，存在以下中的一个或多个：
i)融合剂脂质体包含细胞生物物质或由其构成；
ii)融合剂脂质体包含去核细胞；
iii)融合剂脂质体包含灭活的细胞核；
iv)所述融合剂脂质体与靶细胞的融合率高于非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例43的分析中；
v)所述融合剂脂质体与靶细胞融合的速率高于其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例43的分析中；
vi)所述融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例43的分析中；
vii)所述融合剂以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如实例27的分析所测量；
viii)所述融合剂脂质体以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含治疗剂，例如如实例89的分析所测量。
ix)融合剂的拷贝数与治疗剂的拷贝数的比率在1,000,000∶1与100,000∶1、100,000∶1与10,000∶1、10,000∶1与1,000∶1、1,000∶1与100∶1、100∶1与50∶1、50∶1与20∶1、20∶1与10∶1、10∶1与5∶1、5∶1与2∶1、2∶1与1∶1、1∶1与1∶2、1∶2与1∶5、1∶5与1∶10、1∶10与1∶20、1∶20与1∶50、1∶50与1∶100、1∶100与1∶1,000、1∶1,000与1∶10,000、1∶10,000与1∶100,000或1∶100,000与1∶1,000,000之间；
x)所述融合剂脂质体包含与源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％内；
xi)所述融合剂脂质体包含与源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例88的分析；
xii)所述融合剂脂质体包含的脂质∶蛋白质的比率在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例41的分析所测量；
xiii)所述融合剂脂质体包含的蛋白质与核酸(例如DNA)的比率在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例42的分析所测量；
xiv)所述融合剂脂质体包含的脂质：核酸(例如DNA)的比率在源细胞中的对应比率的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例92的分析所测量；
xv)所述融合剂脂质体在个体，例如小鼠中具有的半衰期在参考细胞，例如源细胞的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例61的分析；
xvi)所述融合剂脂质体跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％(例如多约11.6％)，例如如使用实例51的分析所测量；
xvii)所述融合剂脂质体在内腔中包含的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例52的分析；
xviii)所述融合剂脂质体包含的代谢活动水平在参考细胞(例如源细胞)中的柠檬酸合成酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例54中所描述；
xix)所述融合剂脂质体包含的呼吸水平(例如耗氧速率)在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例55中所描述；
xx)所述融合剂脂质体包含至多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例56的分析，或其中相比于实例56的分析中的用甲萘醌处理的其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包含低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例56的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包含低至少5％、10％、20％、30％、40％或50％的膜联蛋白-V染色水平，
xxi)所述融合剂脂质体的miRNA含量水平比源细胞的miRNA含量水平大至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例34的分析；
xxii)所述融合剂脂质体的可溶：不可溶蛋白质的比率在源细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在源细胞的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例39的分析；
xxiii)所述融合剂脂质体的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如质谱分析所测量，例如在实例40的分析中；
xxiv)所述融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例50的分析；
xxv)所述融合剂脂质体在向例如小鼠的个体施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼部，例如其中在施用融合剂脂质体的群体中，在24、48或72小时之后，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例65的分析；
xxvi)所述融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例57的分析；
xxvii)所述融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例58的分析。
xxviii)相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例59的分析；
xxix)所述融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例60的分析，或其中所述融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位；
xxx)所述融合剂脂质体能够从血管外渗，例如以源细胞或与源细胞相同类型的细胞的外渗率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例45的分析，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞；
xxxi)所述融合剂脂质体能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障；
xxxii)所述融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例49的分析。
xxxiii)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
xxxiv)所述融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得；
xxxv)所述融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；
xxxvi)所述融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物；
xxxvii)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；
xxxviii)源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间叶干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；或
xxxix)源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
在一些方面，本公开还提供一种融合剂脂质体，其包含：
a)脂质双层和可与水溶液(例如水)混溶的内腔，其中融合剂脂质体来源于源细胞，
b)安置于脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，以及
c)安置于内腔中的细胞器，例如治疗有效数目的细胞器。
在一些实施例中，存在以下中的一个或多个：
i)源细胞是选自内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞、干细胞(例如，间叶干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞)、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；
ii)细胞器是选自高尔基体(Golgi apparatus)、溶酶体、内质网、线粒体、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；
iii)融合剂脂质体的大小大于5μm、10μm、20μm、50μm或100μm；
i)融合剂脂质体或包含多个所述融合剂脂质体的组合物或制剂的密度不在1.08g/ml与1.12g/ml之间，例如所述融合剂脂质体的密度为1.25g/ml+/-0.05，例如如通过实例31的分析所测量；
iv)融合剂脂质体未被循环中的清除系统或肝窦中的库普弗细胞捕获；
v)源细胞不是293细胞；
vi)源细胞未被转化或永生化；
vii)源细胞是使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；
viii)融合剂不是VSVG、SNARE蛋白或分泌性颗粒蛋白；
ix)融合剂脂质体不包含Cre或GFP，例如EGFP；
x)融合剂脂质体还包含除Cre或GFP，例如EGFP以外的外源蛋白
xi)融合剂脂质体例如在内腔中还包含外源核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源蛋白(例如抗体，例如抗体)；或
xii)融合剂脂质体不包含线粒体。
在一些方面，本公开还提供一种融合剂脂质体，其包含：
(a)脂质双层，
(b)被脂质双层包围的内腔(例如包含胞质溶胶)，
(c)外源性或过度表达的融合剂，例如其中融合剂安置于脂质双层中，以及
(d)功能细胞核，
其中融合剂脂质体来源于源细胞。
在一些实施例中，存在以下中的一个或多个：
i)源细胞不是树突状细胞或肿瘤细胞，例如源细胞是选自内皮细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞、干细胞(例如间叶干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞)、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞；
ii)融合剂不是融合糖蛋白；
iii)融合剂为除致育素-β以外的哺乳动物蛋白，
iv)所述融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述；
v)所述融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准；
vi)所述融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得；
vii)所述融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体；或
viii)所述融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物。
在一些方面，本公开还提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的融合剂，
(d)货物；并且
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％；
其中当在内吞作用抑制剂存在下与靶细胞群接触时，和当与未用内吞作用抑制剂处理的参考靶细胞群接触时，相比于参考靶细胞群，多个融合剂脂质体将货物递送到靶细胞群中至少30％数目的细胞中。
在一些方面，本公开还提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，并且其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)包含胞质溶胶的内腔，其中内腔被脂质双层包围；
(c)安置于所述脂质双层中的外源性或过度表达的再靶向融合剂；
(d)货物；并且
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；
其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白的量小于总蛋白的1％；
其中：
(i)当多个融合剂脂质体与包含靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，相比于非靶细胞，所述货物存在于多至少2倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍的靶细胞中，或
(ii)相比于非靶细胞，所述多个融合剂脂质体以高至少至少50％的速率与靶细胞融合。
在一些方面，本公开还提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，并且其中所述多个融合剂脂质体包含：
(a)脂质双层，
(b)被所述脂质双层包围的内腔；
(c)外源性或过度表达的融合剂，其中融合剂安置于脂质双层中；以及
(d)货物；
其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；并且
其中以下中的一个或多个(例如至少2、3、4或5个)：
i)所述融合剂以至少1,000个拷贝的拷贝数存在；
ii)所述融合剂脂质体以至少1,000个拷贝的拷贝数包含治疗剂；
iii)所述融合剂脂质体包含脂质，其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的75％内；
iv)所述融合剂脂质体包含与所述源细胞类似的蛋白质组学组成；
v)所述融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应于胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素的葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)摄取，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的其它方面类似的融合剂脂质体)多至少10％；
vi)所述融合剂脂质体在向例如小鼠的个体施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼部，例如其中在24小时之后，施用的融合剂脂质体群中的至少0.1％或10％的融合剂脂质体存在于靶组织中；或
源细胞是选自嗜中性粒细胞、粒细胞、间叶干细胞、骨髓干细胞、诱导多能干细胞、胚胎干细胞、成髓细胞、成肌细胞、肝细胞或神经元，例如视网膜神经元细胞。
在一些方面，本公开还提供一种药物组合物，其包含本文所描述的融合剂脂质体组合物和药学上可接受的载剂。
在某些方面，本公开还提供一种向个体(例如人类个体)、靶组织或细胞施用融合剂脂质体组合物的方法，所述方法包含向个体施用包含多个本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，由此向个体施用融合剂脂质体组合物。
在某些方面，本公开还提供向个体、靶组织或细胞递送治疗剂(例如多肽、核酸、代谢物、细胞器或亚细胞结构)的方法，所述方法包含向个体施用多个本文所描述的融合剂脂质体、包含多个本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，其中融合剂脂质体组合物以使得治疗剂被递送的量和/或时间施用。
在某些方面，本公开还提供向个体、靶组织或细胞递送功能的方法，所述方法包含向个体施用多个本文所描述的融合剂脂质体、包含多个本文所描述的融合剂脂质体的融合剂脂质体组合物、本文所描述的融合剂脂质体组合物或本文所描述的药物组合物或使靶组织或细胞与其接触，其中融合剂脂质体组合物以使得功能被递送的量和/或时间施用。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)源细胞不是293细胞；
ii)源细胞未被转化或永生化；
iii)源细胞是使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；
iv)融合剂不是VSVG、SNARE蛋白或分泌性颗粒蛋白；
v)治疗剂不是Cre或EGFP；
vi)治疗剂为核酸(例如RNA，例如mRNA、miRNA或siRNA)或外源蛋白(例如抗体，例如抗体)，例如在内腔中；或
vii)融合剂脂质体不包含线粒体。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)源细胞不是293或HEK细胞；
ii)源细胞未被转化或永生化；
iii)源细胞是使用除腺病毒介导的永生化以外的方法来转化或永生化，例如通过自发突变或端粒酶表达来永生化；
iv)融合剂不是病毒融合剂；或
v)融合剂脂质体的大小不在40nm与150nm之间，例如大于150nm、200nm、300nm、400nm或500nm。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)治疗剂是由源细胞表达的可溶性蛋白质；
ii)融合剂不是TAT、TAT-HA2、HA-2、gp41、阿尔茨海默氏β-淀粉样肽(Alzheimer′sbeta-amyloid peptide)、仙台病毒蛋白或两亲性净阴性肽(WAE 11)；
iii)融合剂是哺乳动物融合剂；
iv)融合剂脂质体在其内腔中包含选自酶、抗体或抗病毒多肽的多肽；
v)融合剂脂质体不包含外源性治疗性跨膜蛋白；或
vi)融合剂脂质体不包含CD63或GLUT4，或融合剂脂质体包含小于或等于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％的CD63(例如约0.048％或更少)，例如如根据实例90中所描述的方法所测定。
在实施例中，融合剂脂质体：
i)不包含病毒、无感染性或不在宿主细胞中繁殖；
ii)不是病毒载体
iii)不是VLP(病毒样颗粒)；
iv)不包含病毒结构蛋白，例如衍生自gag的蛋白质，例如病毒衣壳蛋白，例如病毒荚膜蛋白，例如病毒核衣壳蛋白，或其中病毒衣壳蛋白的量为总蛋白的小于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据质谱分析，例如使用实例94的分析；
v)不包含病毒基质蛋白；
vi)不包含病毒非结构蛋白；例如pol或其片段或变异体、病毒逆转录酶蛋白、病毒整合酶蛋白或病毒蛋白酶蛋白。
vii)不包含病毒核酸；例如病毒RNA或病毒DNA；
viii)包含病毒结构蛋白的每个囊泡小于10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝；或
ix)融合剂脂质体不是病毒体。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)小于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％病毒衣壳蛋白(例如约0.05％病毒衣壳蛋白)。在实施例中，病毒衣壳蛋白为兔内源性慢病毒(RELIK)衣壳与亲环素A的复合物。在实施例中，病毒衣壳蛋白：总蛋白比为(或被鉴别为)约0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09或0.1。
在一些实施例中，融合剂脂质体不包含(或被鉴别为不包含)gag蛋白或其片段或变异体，或gag蛋白或其片段或变异体的量为总蛋白的小于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据实例94的分析。
在实施例中，融合剂脂质体上的融合剂的拷贝数与病毒结构蛋白的拷贝数的比为至少1,000,000∶1、100,000∶1、10,000∶1、1,000∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1或1∶1；或在100∶1与50∶1、50∶1与20∶1、20∶1与10∶1、10∶1与5∶1或1∶1之间。在实施例中，融合剂脂质体上的融合剂的拷贝数与病毒基质蛋白的拷贝数的比为至少1,000,000∶1、100.000∶1、10,000∶1、1,000∶1、100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1或1∶1。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)融合剂脂质体不包含水不可混溶的液滴；
ii)融合剂脂质体包含水性内腔和亲水性外部；
iii)融合剂为蛋白质融合剂；或
iv)细胞器是选自线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)融合剂为哺乳动物融合剂或病毒融合剂；
ii)融合剂脂质体不是通过用治疗性或诊断性物质负载融合剂脂质体而制成；
iii)源细胞不负载有治疗性或诊断性物质；
iv)融合剂脂质体不包含小红莓(doxorubicin)、地塞米松(dexamethasone)、环糊精、聚乙二醇、微RNA(例如miR125)、VEGF受体、ICAM-1、E-选择素、氧化铁、荧光蛋白(例如GFP或RFP)、纳米颗粒或RNA酶，或不包含前述中的任一种的外源形式；或
v)融合剂脂质体还包含具有一个或多个翻译后修饰，例如糖基化的外源治疗剂。
在实施例中，融合剂脂质体为单层或多层的。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)融合剂脂质体不是外泌体；
ii)融合剂脂质体是微囊泡；
iii)融合剂脂质体包含非哺乳动物融合剂；
iv)融合剂脂质体已经工程改造以并入融合剂；
v)融合剂脂质体包含外源融合剂；
vi)融合剂脂质体的大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或融合剂脂质体群的平均大小为至少80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
vii)融合剂脂质体包含一个或多个细胞器，例如线粒体、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒；
viii)融合剂脂质体包含细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
ix)融合剂脂质体、或包含多个融合剂脂质体组合物或制剂不具有1.08-1.22g/ml的浮动密度或具有至少1.18-1.25g/ml或1.05-1.12g/ml的密度，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如如Théry等人，“外泌体从细胞培养上清液和生物学流体的分离和表征(Isolationand characterization of exosomes from cell culture supematants and biologicalfluids.)”《细胞生物学实验指南(Curr Protoc Cell Biol.)》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述；
x)相比于源细胞，脂质双层富神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于源细胞，脂质双层不富含(例如耗尽)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
xi)融合剂脂质体包含磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例93的分析中测量时；
xii)相比于源细胞，融合剂脂质体富含PS，例如在融合剂脂质体群中，至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运(Differential fates ofbiomolecules delivered to target cells via extracellular vesicles.)《美国国家科学院院刊》112：E1433-E1442；
xiii)融合剂脂质体基本上不含乙酰胆碱酯酶(AChE)，或含有小于0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单元/μg蛋白质，例如根据实例53的分析；
xiv)融合剂脂质体基本上不含四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白(mitofilin)、同线蛋白-1(syntenin-1)、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1(flotillin-1)、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％、或10％的任何个别外泌体标记蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外泌体标记蛋白，或相比于源细胞脱富集这些蛋白质中的任何一种或多种，或不富集这些蛋白质中的任何一种或多种，例如根据实例90的分析；
xv)融合剂脂质体包含水平低于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/ug总蛋白或低于源细胞中的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，例如比源细胞中以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白水平低了小于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例37的分析；
xvi)融合剂脂质体富集一种或多种内质网蛋白(例如钙联蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白或其任何组合，例如其中钙联蛋白的量为小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联蛋白/μg总蛋白，或其中相比于源细胞，融合剂脂质体包含少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的以ng/μg计的钙联蛋白/总蛋白，例如使用实例38或91的分析，或其中融合剂脂质体中钙联蛋白的平均分数含量为小于约1×10-4、1.5×10-4、2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4、2.3×10-4、2.4×10-4、2.43×10-4、2.5×10-4、2.6×10-4、2.7×10-4、2.8×10-4、2.9×10-4、3×10-4、3.5×10-4或4×10-4，或其中融合剂脂质体包含的钙联蛋白/总蛋白的量比亲本细胞低约70％、75％、80％、85％、88％、90％、95％、99％或更大；
xvii)融合剂脂质体包含外源药剂(例如外源蛋白、mRNA或siRNA)，例如如使用实例35的分析所测量；或
xviii)融合剂脂质体可以通过原子力显微镜固定于云母表面上至少30分钟，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运.《美国国家科学院院刊》112：E1433-E1442。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)融合剂脂质体是外泌体；
ii)融合剂脂质体不是微囊泡；
iii)融合剂脂质体的大小为小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm，或融合剂脂质体群的平均大小为小于80nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm；
iv)融合剂脂质体不包含细胞器；
v)融合剂脂质体不包含细胞骨架或其组分，例如肌动蛋白、Arp2/3、形成蛋白、冠蛋白、肌缩蛋白、角蛋白、肌球蛋白或微管蛋白；
vi)融合剂脂质体，或包含多个融合剂脂质体的组合物或制剂具有1.08-1.22g/ml的浮动密度，例如在蔗糖梯度离心分析中，例如如Théry等人，“外泌体从细胞培养上清液和生物体液的分离和表征”《细胞生物学实验指南》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述；
vii)相比于源细胞，脂质双层富神经酰胺或鞘磷脂或其组合，或相比于源细胞，脂质双层不富含(例如耗尽)糖脂、游离脂肪酸或磷脂酰丝氨酸或其组合；
viii)相对于源细胞，融合剂脂质体不包含或耗尽磷脂酰丝氨酸(PS)或CD40配体或PS和CD40配体两者，例如当在实例93的分析中测量时；
ix)相比于源细胞，融合剂脂质体不富集(例如耗尽)PS，例如在融合剂脂质体群中，小于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％对PS呈阳性，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运.《美国国家科学院院刊》112：E1433-E1442；
x)融合剂脂质体包含乙酰胆碱酯酶(AChE)，例如至少0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000个AChE活性单位/μg蛋白质，例如根据实例53的分析；
xi)融合剂脂质体包含四跨膜蛋白家族蛋白(例如CD63、CD9或CD81)、ESCRT相关蛋白(例如TSG101、CHMP4A-B或VPS4B)、Alix、TSG101、MHCI、MHCII、GP96、辅肌动蛋白-4、线粒体内膜蛋白、同线蛋白-1、TSG101、ADAM10、EHD4、同线蛋白-1、TSG101、EHD1、脂阀结构蛋白-1、热休克70kDa蛋白(HSC70/HSP73、HSP70/HSP72)或其任何组合，或含有大于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、5％、或10％的任何个别外泌体标记蛋白和/或小于0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％或25％的任何所述蛋白的总外泌体标记蛋白，或相比于源细胞富集这些蛋白质中的任何一种或多种，例如根据实例90的分析；
xii)融合剂脂质体包含水平高于500、250、100、50、20、10、5或1ng GAPDH/μg总蛋白或低于源细胞中的GAPDH水平的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)，例如比源细胞中以ng/μg计的GAPDH/总蛋白水平大至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如使用实例37的分析；
xiii)融合剂脂质体不富集(例如，耗尽)一种或多种内质网蛋白(例如钙联蛋白)、一种或多种蛋白酶体蛋白或一种或多种线粒体蛋白或其任何组合，例如其中钙联蛋白的量为小于500、250、100、50、20、10、5或1ng钙联蛋白/μg总蛋白，或其中相比于源细胞，融合剂脂质体包含少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的以ng/μg计的钙联蛋白/总蛋白，例如使用实例91的分析，或其中融合剂脂质体中钙联蛋白的平均分数含量为小于约1×10-4、1.5×10-4、2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4、2.3×10-4、2.4×10-4、2.43×10-4、2.5×10-4、2.6×10-4、2.7×10-4、2.8×10-4、2.9×10-4、3×10-4、3.5×10-4或4×10-4，或其中融合剂脂质体包含的钙联蛋白/总蛋白的量比亲本细胞低约70％、75％、80％、85％、88％、90％、95％、99％或更大；或
xiv)融合剂脂质体可以不通过原子力显微镜固定于云母表面上至少30分钟，例如根据Kanada M等人(2015)通过细胞外囊泡递送到靶细胞的生物分子的差异性命运.《美国国家科学院院刊》112：E1433-E1442。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)融合剂脂质体不包含VLP；
ii)融合剂脂质体不包含病毒；
iii)融合剂脂质体不包含复制胜任型病毒；
iv)融合剂脂质体不包含病毒蛋白，例如病毒结构蛋白，例如衣壳蛋白或病毒基质蛋白；
v)融合剂脂质体不包含来自包膜病毒的衣壳蛋白；
vi)融合剂脂质体不包含核衣壳蛋白；或
vii)融合剂不是病毒融合剂。
在实施例中，融合剂脂质体包含胞质溶胶。
在实施例中，以下中的一个或多个：
i)融合剂脂质体或源细胞在植入到个体体内时不形成畸胎瘤，例如根据实例66的分析；
ii)融合剂脂质体能够进行趋化作用，例如在相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内，例如使用实例46的分析；
iii)融合剂脂质体能够在例如损伤位点处归巢，其中融合剂脂质体或细胞生物物质是来自人类细胞，例如使用实例47的分析，例如其中源细胞是嗜中性粒细胞；或
iv)融合剂脂质体能够进行吞噬作用，例如其中在使用实例48的分析中，可在0.5、1、2、3、4、5或6小时内检测到通过融合剂脂质体的吞噬作用，例如其中源细胞是巨噬细胞。
在实施例中，在向个体(例如人类个体)施用之后，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物保留任何特征中的一、二、三、四、五、六个或更多个持续5天或更短，例如4天或更短、3天或更短、2天或更短、1天或更短，例如约12-72小时。
在实施例中，融合剂脂质体具有以下特征中的一个或多个：
a)包含来自源细胞的一种或多种内源蛋白，例如膜蛋白或胞质蛋白；
b)包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的蛋白质；
c)包含至少1、2、5、10、20、50或100种不同的糖蛋白；
d)融合剂脂质体中至少10质量％、20质量％、30质量％、40质量％、50质量％、60质量％、70质量％、80质量％或90质量％的蛋白质为天然存在的蛋白质；
e)包含至少10、20、50、100、200、500、1000、2000或5000种不同的RNA；或
f)包含至少2、3、4、5、10或20种不同的脂质，例如选自CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG。
在实施例中，融合剂脂质体已被操纵以具有，或融合剂脂质体不是天然存在的细胞并且具有，或其中细胞核不天然地具有以下特性中的一、二、三、四、五个或更多个：
a)部分核灭活导致核功能降低至少50％、60％、70％、80％、90％或更多，例如转录或DNA复制降低或两者均降低，例如其中通过实例25的分析来测量转录并通过实例26的分析来测量DNA复制；
b)融合剂脂质体不能够转录或具有为参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实例25的分析；
c)融合剂脂质体不能够进行核DNA复制或具有为参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实例26的分析；
d)融合剂脂质体缺乏染色质或具有为参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实例33的分析；
e)融合剂脂质体缺乏核膜或具有为参考细胞(例如源细胞或杰卡特细胞(Jurkatcell))的核膜的量的小于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的核膜量，例如根据实例32的分析；
f)融合剂脂质体缺乏功能性核孔复合物或具有降低的核输入或输出活性，例如根据实例32的分析降低了至少50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％，或融合剂脂质体缺乏一种或多种核孔蛋白，例如NUP98或输入蛋白(Importin)7；
g)融合剂脂质体不包含组蛋白或具有为源细胞(例如H1、H2a、H2b、H3或H4)的组蛋白水平的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的组蛋白水平，例如根据实例33的分析；
h)融合剂脂质体包含小于20、10、5、4、3、2或1个染色体；
i)核功能被消除；
i)融合剂脂质体为去核的哺乳动物细胞；
k)通过机械力、通过辐射或通过化学消融将细胞核去除或灭活(例如挤出)；或
1)融合剂脂质体是来自例如在分裂间期或有丝分裂期间完全或部分去除DNA的哺乳动物细胞。
在实施例中，融合剂脂质体包含mtDNA或载体DNA。在实施例中，融合剂脂质体不包含DNA。
在实施例中，源细胞是初级细胞、永生化细胞或细胞系(例如成髓细胞细胞系，例如C2C12)。在实施例中，融合剂脂质体来自具有经修饰的基因组，例如具有降低的免疫原性(例如通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白或MHC复合物)的源细胞。在实施例中，源细胞来自用抗炎性信号处理的细胞培养物。在实施例中，源细胞来自用免疫抑制剂处理的细胞培养物。在实施例中，源细胞为基本上非免疫原性的，例如使用本文所描述的分析。在实施例中，源细胞包含外源药剂，例如治疗剂。在实施例中，源细胞为重组细胞。
在实施例中，融合剂脂质体还包含外源药剂，例如治疗剂，例如蛋白质或核酸(例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA，例如mRNA或miRNA)。在实施例中，外源药剂以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝存在，例如由融合剂脂质体所包含，或以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝/融合剂脂质体的平均水平存在。在实施例中，融合剂脂质体具有改变的(例如提高或降低的)水平的一种或多种内源分子，例如蛋白质或核酸，例如由用siRNA或基因编辑酶处理哺乳动物细胞所致。在实施例中，内源分子以例如至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝(例如由融合剂脂质体所包含的拷贝)的平均水平存在，或以至少或不超过10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000或1,000,000个拷贝/融合剂脂质体的平均水平存在。在实施例中，内源分子(例如RNA或蛋白质)以比其于源细胞中的浓度大至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106、1.0×107、5.0×107或1.0×108的浓度存在。
在实施例中，活性剂是选自蛋白质、蛋白质复合物(例如，包含至少2、3、4、5、10、20或50种蛋白质，例如，至少至少2、3、4、5、10、20或50种不同的蛋白质)多肽、核酸(例如DNA、染色体或RNA，例如mRNA、siRNA或miRNA)或小分子。在实施例中，外源药剂包含位点特异性核酸酶，例如Cas9分子、TALEN或ZFN。
在实施例中，融合剂为病毒融合剂，例如HA、HIV-1ENV、HHV-4、gp120或VSV-G。在实施例中，融合剂为哺乳动物融合剂，例如SNARE、合胞素、成肌蛋白、肌混合蛋白、肌合并蛋白或FGFRL1。在实施例中，融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。在实施例中，融合剂在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。在实施例中，融合剂脂质体在靶细胞的表面处融合到靶细胞。在实施例中，融合剂以溶酶体非依赖性方式促进融合。在实施例中，融合剂是蛋白质融合剂。在实施例中，融合剂为脂质融合剂，例如油酸、单油酸甘油酯、甘油酯、二酰甘油或经改性的不饱和脂肪酸。在实施例中，融合剂为化学融合剂，例如PEG。在实施例中，融合剂为小分子融合剂，例如氟烷，NSAID，如美洛昔康、吡罗昔康、替诺昔康和氯丙嗪。在实施例中，融合剂为重组的。在实施例中，融合剂以生物化学方式并入，例如融合剂以纯化蛋白的形式提供并在允许融合剂与脂质双层缔合的条件下与脂质双层接触。在实施例中，融合剂以生物合成方式并入，例如在允许融合剂与脂质双层结合的条件下在源细胞中表达。
在实施例中，融合剂脂质体结合靶细胞。在实施例中，靶细胞不是HeLa细胞，或靶细胞未被转化或永生化。
在涉及融合剂脂质体组合物的一些实施例中，多个融合剂脂质体是相同的。在一些实施例中，多个融合剂脂质体是不同的。在一些实施例中，多个融合剂脂质体是来自一个或多个源细胞。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的直径在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均直径的10％、20％、30％、40％或50％内。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的体积在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均体积的10％、20％、30％、40％或50％内。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物具有源细胞群的大小分布变化率的10％、50％或90％内的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％的大小分布变化率，例如基于实例29。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的融合剂拷贝数在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均融合剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体中的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体的治疗剂拷贝数在融合剂脂质体组合物中的融合剂脂质体的平均治疗剂拷贝数的10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％内。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个或更多个融合剂脂质体。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物的体积为至少1μl、2μl、5μl、10μl、20μl、50μl、100μl、200μl、500μl、1ml、2ml、5ml或10ml。
在一些实施例中，相比于参考靶细胞群，融合剂脂质体组合物将货物递送到靶细胞群体中至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％数目的细胞中。
在一些实施例中，相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，融合剂脂质体组合物将至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的货物递送到靶细胞群中。在一些实施例中，相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，融合剂脂质体组合物将多至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的货物递送到靶细胞群中。
在一些实施例中，低于10％的货物通过内吞作用进入细胞。
在一些实施例中，内吞作用的抑制剂为溶酶体酸化的抑制剂，例如巴弗洛霉素A1。在一些实施例中，内吞作用的抑制剂为发动蛋白抑制剂，例如Dynasore。
在一些实施例中，靶细胞群在生理pH下(例如在7.3-7.5之间，例如在7.38-7.42之间)。
在一些实施例中，使用内吞作用抑制分析，例如实例81的分析来确定所递送的货物。
在一些实施例中，货物通过发动蛋白非依赖性途径或溶酶体酸化非依赖性途径、巨胞饮非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为巨胞饮抑制剂，例如5-(N-乙基-N-异丙基)胺氯吡脒(EIPA)，例如浓度为25μM)或肌动蛋白非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为肌动蛋白聚合抑制剂，例如Latrunculin B，例如浓度为6μM)进入细胞。
在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体还包含靶向部分。在实施例中，靶向部分被融合剂包含或被独立分子包含。
在一些实施例中，当所述多个融合剂脂质体与包含靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，相比于非靶细胞，货物存在于多至少10倍的靶细胞中。
在一些实施例中，当所述多个融合剂脂质体与包含靶细胞和非靶细胞的细胞群接触时，货物存在于比非靶细胞高至少2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的靶细胞中和/或货物存在于比参考细胞高至少2倍、5倍、10倍、20倍或50倍的靶细胞中。
在一些实施例中，与非靶细胞相比，所述多个融合剂脂质体以高至少50％的速率与靶细胞融合。
在一些实施例中，当与靶细胞群接触时，融合剂脂质体将货物递送到除内体或溶酶体以外的靶细胞位置，例如胞质溶胶。在实施例中，将少于50％、40％、30％、20％或10％的货物递送到内体或溶酶体。
在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体包含外泌体、微囊泡或其组合。
在一些实施例中，所述多个融合剂脂质体的平均大小为至少50nm、100nm、200nm、500nm、1000nm、1200nm、1400nm或1500nm。在其它实施例中，所述多个融合剂脂质体的平均大小为小于100nm、80nm、60nm、40nm或30nm。
在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含哺乳动物融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含病毒融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)为蛋白质融合剂。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含选自以下的序列：尼帕病毒蛋白F、麻疹病毒F蛋白、树鼩副粘病毒F蛋白、副粘病毒F蛋白、亨德拉病毒F蛋白、亨尼帕病毒F蛋白、麻疹病毒F蛋白、呼吸道病毒F蛋白、仙台病毒F蛋白、腮腺炎病毒F蛋白或禽腮腺炎病毒F蛋白或其衍生物。
在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下具有活性。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)在4-5、5-6、6-7、7-8、8-9或9-10的pH下不具有活性。
在一些实施例中，融合剂以至少1、2、5或10个拷贝/融合剂脂质体的拷贝数存在。
在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含尼帕病毒蛋白G、麻疹蛋白H、树鼩副粘病毒H蛋白、副粘病毒G蛋白、副粘病毒H蛋白、副粘病毒HN蛋白、麻疹病毒H蛋白、呼吸道病毒HN蛋白、仙台HN蛋白、腮腺炎病毒HN蛋白、禽腮腺炎病毒HN蛋白或其衍生物。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)包含选自以下的序列：尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒F和H蛋白、树鼩副粘病毒F和H蛋白、副粘病毒F和G蛋白或F和H蛋白或F和HN蛋白、亨德拉病毒F和G蛋白、亨尼帕病毒F和G蛋白、麻疹病毒F和H蛋白、呼吸道病毒F和HN蛋白、仙台病毒F和HN蛋白、腮腺炎病毒F和HN蛋白或禽腮腺炎病毒F和HN蛋白，或其衍生物，或其任何组合。
在一些实施例中，货物包含外源蛋白或外源核酸。在一些实施例中，货物包含或编码胞质蛋白。在一些实施例中，货物包含或编码膜蛋白。在一些实施例中，货物包含治疗剂。在一些实施例中，货物以至少1、2、5、10、20、50、100或200个拷贝/融合剂脂质体(例如至多约1,000个拷贝/融合剂脂质体)的拷贝数存在。在一些实施例中，融合剂(例如再靶向融合剂)的拷贝数与货物的拷贝数的比在1000∶1与1∶1之间、或在500∶1与1∶1之间、或在250∶1与1∶1之间、或在150∶1与1∶1之间、或在100∶1与1∶1之间、或在75∶1与1∶1之间、或在50∶1与1∶1之间、或在25∶1与1∶1之间、或在20∶1与1∶1之间、或在15∶1与1∶1之间、或在10∶1与1∶1之间、或在5∶1与1∶1之间、或在2∶1与1∶1之间、或在1∶1与1∶2之间。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物包含病毒衣壳蛋白或DNA整合多肽。在一些实施例中，货物包含病毒基因组。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物能够将核酸递送到靶细胞，例如以稳定地修饰靶细胞的基因组，例如用于基因疗法。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物不包含病毒核衣壳蛋白，或病毒核衣壳蛋白的量为总蛋白的小于10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％，例如根据质谱分析，例如使用实例94的分析。
在实施例中，融合剂脂质体组合物包含至少105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013、1014或1015个融合剂脂质体。在实施例中，融合剂脂质体组合物包含至少10ml、20ml、50ml、100ml、200ml、500ml、1L、2L、5L、10L、20L或50L。
在实施例中，融合剂脂质体来自哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞具有经修饰的基因组，例如以降低免疫原性(例如通过基因组编辑，例如以去除MHC蛋白或MHC复合物)。在实施例中，源细胞来自用抗炎性信号处理的细胞培养物。在实施例中，方法还包含使步骤a)的源细胞与免疫抑制剂或抗炎信号接触，例如在使细胞核灭活，例如使细胞去核之前或之后。
在一个方面，本文提供一种融合剂脂质体组合物，其包含多个来源于源细胞的融合剂脂质体，其中所述多个融合剂脂质体包含：(a)脂质双层；(b)包含胞质溶胶的内腔，其中所述内腔被所述脂质双层包围(c)安置于所述脂质双层中外源性或过度表达的融合剂；(d)货物；并且其中所述融合剂脂质体不包含细胞核；其中所述融合剂脂质体组合物中的病毒衣壳蛋白质的量低于总蛋白的1％；其中所述多个融合剂脂质体当在内吞作用的抑制剂存在下与靶细胞群接触时并当与不用内吞作用抑制剂处理的参考靶细胞群接触时，相比于参考靶细胞群，将货物递送到至少靶细胞群中30％数目的细胞。
在实施例中，相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，所述融合剂脂质体组合物将货物递送到靶细胞群中至少40％、50％、60％、70％、或80％数目的细胞；或相比于参考靶细胞群或非靶细胞群，其将货物(例如至少40％、50％、60％、70％或80％的货物)递送到靶细胞群。在实施例中，低于10％的货物通过内吞作用进入细胞。在实施例中，所述内吞作用抑制剂为溶酶体酸化抑制剂，例如巴弗洛霉素A1。在实施例中，使用内吞作用抑制分析，例如实例81的分析来确定所递送的货物。在实施例中，货物通过发动蛋白非依赖性途径或溶酶体酸化非依赖性途径、巨胞饮非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为巨胞饮抑制剂，例如5-(N-乙基-N-异丙基)胺氯吡脒(EIPA)，例如浓度为25μM)或肌动蛋白非依赖性途径(例如，其中内吞作用的抑制剂为肌动蛋白聚合抑制剂，例如Latrunculin B，例如浓度为6μM)进入细胞。
融合剂脂质体的组合物可以从培养的细胞，例如经培养的哺乳动物细胞，例如经培养的人类细胞产生。细胞可以为祖细胞或非祖(例如分化的)细胞。细胞可以为初级细胞或细胞系(例如本文所描述的哺乳动物，例如人类细胞系)。在实施例中，经培养的细胞为祖细胞，例如骨髓基质细胞、骨髓源性成年祖细胞(MAPC)、内皮祖细胞(EPC)、胚细胞、在室管膜下区中形成的中间祖细胞、神经干细胞、肌肉干细胞、卫星细胞、肝干细胞、造血干细胞、骨髓基质细胞、表皮干细胞、胚胎干细胞、间质干细胞、脐带干细胞、前体细胞、肌肉前体细胞、成肌细胞、心肌细胞、神经前体细胞、神经胶质前体细胞、神经元前体细胞、成肝细胞。
在一些实施例中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自个体的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、造红细胞组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。
经培养的细胞可以来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞和其组合。融合剂脂质体可以由来自任何真核(例如哺乳动物)器官系统的经培养的细胞产生，例如来自心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰脏、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、脑下垂体、松果体或松果体腺体、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；皮肤系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。在实施例中，细胞来自高度有丝分裂的组织(例如高度有丝分裂的健康组织，如上皮、胚胎组织、骨髓、肠隐窝)。在实施例中，组织样品为高代谢组织(例如骨骼组织、神经组织、心肌细胞)。
在一些实施例中，细胞来自年轻的供体，例如25岁、20岁、18岁、16岁、12岁、10岁、8岁、5岁、1岁或更年幼的供体。在一些实施例中，细胞来自胎儿组织。
在一些实施例中，细胞来源于个体并施用到相同个体或具有类似基因特征(例如MHC匹配的)的个体。
在某些实施例中，细胞具有平均大小为长度大于3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000或10000个核苷酸(例如长度在4,000-10,000个核苷酸之间、长度在6,000-10,000个核苷酸之间)的端粒。
评估靶细胞的融合剂脂质体含量
在一些方面，本公开还提供一种评估个体的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如本文所描述的融合剂脂质体组合物)的个体的生物样品，和进行分析以确定由生物样品中的靶细胞与如本文所描述的融合剂脂质体融合而产生的生物样品的一种或多种特性。在一些方面，本公开提供一种测量与靶细胞的融合的方法，例如如实例72中所描述。在一些实施例中，确定生物样品的一种或多种特性包含确定：融合剂的存在、货物或有效负载水平或与货物或有效负载相关的活性。
在一些方面，本公开提供一种评估个体的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品，和关于融合剂，例如本文所描述的融合剂的存在对生物样品进行测试。在一些情况下，所检测到的融合剂的水平大于(例如，大至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％)在来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体的对应生物样品所观测到的水平。在一些实施例中，个体与施用融合剂脂质体组合物之前是同一个体，并且在一些实施例中，个体是不同的个体。
在一些方面，本公开提供一种评估个体的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品，和关于货物或有效负载(例如如本文所描述的融合剂脂质体所递送)的存在对生物样品进行测试。在一些情况下，所检测到的货物或有效负载的水平大于(例如，大至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％)在来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体的对应生物样品所观测到的水平。在一些实施例中，个体与施用融合剂脂质体组合物之前是同一个体，并且在一些实施例中，个体是不同的个体。
在一些方面，本公开提供一种评估靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与个体的靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品，和关于与融合剂脂质体组合物相关的活性，例如与由融合剂脂质体组合物递送的货物或有效负载相关的活性的改变对生物样品进行测试。在一些情况下，相对于来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体(例如，在施用融合剂脂质体组合物之前的同一个体)的对应生物样品的活性水平，所检测到的活性水平增加例如至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％。在一些情况下，相对于来自尚未接受融合剂脂质体组合物的个体的对应生物样品的活性水平，所检测到的活性水平减小例如至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、2000％、3000％、4000％、5000％、10,000％、50,000％或100,000％。在一些实施例中，个体与施用融合剂脂质体组合物之前是同一个体，并且在一些实施例中，个体是不同的个体。
在一个方面，本公开提供一种评估融合剂脂质体与个体的靶细胞的融合的方法，其包含提供来自已接受融合剂脂质体组合物(例如如本文所描述)的个体的生物样品和评估生物样品中未融合的融合剂脂质体的水平。
在评估个体中引起接受者细胞形成的靶细胞的融合剂脂质体含量(例如例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，所述方法还包含从个体收集生物样品。在实施例中，生物样品包括一个或多个接受者细胞。
在评估个体中靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，所述方法还包含将生物样品中的接受者细胞与生物样品中未融合的融合剂脂质体分离，例如通过离心。在一些实施例中，方法还包含相对于生物样品中未融合的融合剂脂质体富集接受者细胞，例如通过离心。在一些实施例中，方法还包含相对于生物样品中的非靶细胞富集靶细胞，例如通过FACS。
在评估个体中靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，与融合剂脂质体组合物相关的活性是选自代谢物的存在或水平、生物标记的存在或水平(例如蛋白质水平或翻译后修饰，例如磷酸化或分裂)。
在评估个体中靶细胞的融合剂脂质体含量(例如与靶细胞融合的融合剂脂质体)的方法的一些实施例中，与融合剂脂质体组合物相关的活性为免疫原性。在实施例中，靶细胞为CD3+细胞并且生物样品为从个体收集的血液样品。在实施例中，从血液样品富集血细胞，例如使用缓冲氯化铵溶液。在实施例中，将富集的血细胞与抗CD3抗体(例如鼠类抗CD3-FITC抗体)一起培育并选择CD3+细胞，例如通过荧光激活细胞分选术。在实施例中，关于细胞表面上抗体的存在对细胞，例如分选的细胞，例如CD3+细胞进行分析，例如通过用抗IgM抗体染色。在一些实施例中，如果抗体以高于参考水平的水平存在，那么将个体鉴别为具有针对接受者细胞的免疫应答。
在实施例中，通过细胞溶解分析来分析免疫原性。在实施例中，将来自生物样品的接受者细胞与能够溶解其它细胞的免疫效应细胞共培育。在实施例中，免疫效应细胞来自所述个体或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体。例如，在实施例中，通过PBMC细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将来自生物样品的接受者细胞与来自个体的外周血单核细胞(PBMC)或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体的对照PBMC共培育，并且接着评估PBMC对接受者细胞的溶解。在实施例中，通过自然杀手(NK)细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与来自个体的NK细胞或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体的对照NK细胞共培育，并且接着评估NK细胞对接受者细胞的溶解。在实施例中，通过CD8+T细胞溶解分析来评估免疫原性。在实施例中，将接受者细胞与来自个体的CD8+T细胞或来自未施用融合剂脂质体组合物的个体的对照CD8+T细胞共培育，并且接着评估CD8+T细胞对靶细胞的溶解。在一些实施例中，如果细胞溶解以高于参考水平的水平发生，那么将个体鉴别为具有针对接受者细胞的免疫应答。
在一些实施例中，通过接受者细胞的吞噬作用(例如通过巨噬细胞)来分析免疫原性。在实施例中，用于吞噬作用的巨噬细胞未靶向接受者细胞。在实施例中，生物样品为从个体收集的血液样品。在实施例中，从血液样品富集血细胞，例如使用缓冲氯化铵溶液。在实施例中，将富集的血细胞与抗CD3抗体(例如鼠类抗CD3-FITC抗体)一起培育并选择CD3+细胞，例如通过荧光激活细胞分选术。在实施例中，将荧光标记的CD3+细胞与巨噬细胞一起培育并且接着测试巨噬细胞内的细胞内荧光，例如通过流式细胞测量术。在一些实施例中，如果巨噬细胞吞噬作用以高于参考水平的水平发生，那么将个体鉴别为具有针对接受者细胞的免疫应答。
融合剂脂质体的物理和功能特征
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将药剂，例如蛋白质、核酸(例如mRNA)、细胞器或代谢物递送(例如递送)到靶细胞的胞质溶胶。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将药剂递送到靶细胞的胞质溶胶。在一些实施例中，药剂是靶细胞中不存在、突变或水平低于野生型的蛋白质(或编码蛋白质的核酸，例如编码蛋白质的mRNA)。在一些实施例中，靶细胞来自患有遗传病，例如单基因病，例如单基因细胞内蛋白质疾病的个体。在一些实施例中，药剂包含转录因子，例如外源转录因子或内源转录因子。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送一个或多个(例如至少2、3、4、5、10、20或50个)额外转录因子，例如外源转录因子、内源转录因子或其组合。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含多种药剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)(例如能够将其递送到靶细胞)，其中多种药剂中的每一种作用于靶细胞中的途径的步骤，例如其中途径为生物合成途径、分解代谢途径或信号转导级联。在实施例中，多种药剂中的每一种上调所述途径或下调所述途径。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送一种或多种额外药剂(例如包含第二多种药剂)，所述药剂不作用于所述途径的步骤，例如作用于第二途径的步骤。在一些实施例中，融合剂脂质体包含多种药剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)(例如能够将其递送到靶细胞)或方法还包含递送所述多种药剂，多种药剂中的每一种为单一途径的一部分，例如其中所述途径为生物合成途径、分解代谢途径或信号转导级联。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送一种或多种额外药剂(例如包含第二多种药剂)，所述药剂不是单一途径的一部分，例如是第二途径的一部分。
在一些实施例中，靶细胞包含聚集或错误折叠的蛋白质。在一些实施例中，融合剂脂质体能够降低靶细胞中的聚集或错误折叠的蛋白质的水平(例如降低其水平)，或本文的方法包含降低靶细胞中的聚集或错误折叠的蛋白质的水平。
在一些实施例中，药剂是选自转录因子、酶(例如核酶或胞质酶)、介导对DNA的序列特异性修饰的试剂(例如Cas9、ZFN或TALEN)、mRNA(例如编码细胞内蛋白质的mRNA)、细胞器或代谢物。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将药剂，例如蛋白质递送(例如递送)到靶细胞的细胞膜。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将药剂递送到靶细胞的细胞膜。在一些实施例中，递送蛋白质包含将编码蛋白质的核酸(例如mRNA)递送到靶细胞，使得靶细胞产生蛋白质并将其定位到膜。在一些实施例中，融合剂脂质体包含或方法还包含递送蛋白质，并且融合剂脂质体与靶细胞的融合将蛋白质转移到靶细胞的细胞膜。在一些实施例中，药剂包含细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送第二药剂，所述药剂包含或编码第二细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体，并且任选地还包含或编码一个或多个额外细胞表面配体或结合细胞表面受体的抗体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个)。在一些实施例中，第一药剂和第二药剂形成复合物，其中任选地，复合物还包含一个或多个额外细胞表面配体。在一些实施例中，药剂包含或编码细胞表面受体，例如外源细胞表面受体。在一些实施例中，融合剂脂质体还包含或方法还包含递送第二药剂，所述第二药剂包含或编码第二细胞表面受体，并且任选地还包含或编码一个或多个额外细胞表面受体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个细胞表面受体)。
在一些实施例中，第一药剂和第二药剂形成复合物，其中任选地，复合物还包含一个或多个额外细胞表面受体。在一些实施例中，药剂包含或编码抗原或抗原呈递蛋白。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将分泌性药剂，例如分泌性蛋白质递送(例如递送)到目标位点(例如胞外区)，例如通过在允许靶细胞产生和分泌蛋白质的条件下将编码蛋白质的核酸(例如mRNA)递送到靶细胞。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含递送如本文所描述的分泌性药剂。在实施例中，分泌性蛋白是内源或外源的。在实施例中，分泌性蛋白包含蛋白质治疗剂，例如抗体分子、细胞因子或酶。在实施例中，分泌性蛋白包含自分泌信号传导分子或旁分泌信号传导分子。在实施例中，分泌药剂包含分泌性颗粒。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够对靶细胞(例如免疫细胞)重编程(例如重编程)，例如通过递送选自转录因子或mRNA的药剂，或多种所述药剂。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含对靶细胞重编程。在实施例中，重编程包含通过诱导非多巴胺能神经元具有多巴胺能神经元的一个或多个特征，或通过诱导耗尽的T细胞具有非耗尽的T细胞(例如杀手T细胞)的一个或多个特征来诱导胰腺内分泌细胞具有胰腺β细胞的一个或多个特征。在一些实施例中，药剂包含抗原。在一些实施例中，融合剂脂质体包含有包含抗原的第一药剂和包含抗原呈递蛋白的第二药剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够向靶细胞(例如免疫细胞)供给(例如供给)一个或多个细胞表面受体。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含供给一个或多个细胞表面受体。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够修饰(例如修饰)靶肿瘤细胞。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含修饰靶肿瘤细胞。在实施例中，融合剂脂质体包含编码免疫刺激配体、抗原呈递蛋白、肿瘤抑制蛋白或促凋亡蛋白的mRNA。在一些实施例中，融合剂脂质体包含能够降低靶细胞中免疫抑制配体、促有丝分裂信号或生长因子的水平的miRNA。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含免疫调节剂，例如免疫刺激剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够引起(例如引起)靶细胞呈递抗原。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将抗原呈递到靶细胞上。
在一些实施例中，融合剂脂质体促进靶组织中的再生。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含促进靶组织中的再生。在实施例中，靶细胞为心肌细胞(cardiac cell)，例如心肌细胞(cardiomyocyte)(例如休眠心肌细胞)；成肝细胞(例如胆管成肝细胞)；上皮细胞；未处理的T细胞；巨噬细胞(例如肿瘤浸润性巨噬细胞)；或成纤维细胞(例如心肌成纤维细胞)。在实施例中，源细胞为T细胞(例如Treg)、巨噬细胞或心肌细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将核酸递送(例如递送)到靶细胞，例如以稳定地修饰靶细胞的基因组，例如用于基因疗法。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将核酸递送到靶细胞。在一些实施例中，靶细胞具有酶缺陷，例如在酶中包含导致酶活性降低(例如无活性)的突变。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够递送(例如递送)在靶细胞中介导对DNA(例如Cas9、ZFN或TALEN)的序列特异性修饰的试剂。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将试剂递送到靶细胞。在实施例中，靶细胞是肌细胞(例如骨骼肌细胞)、肾细胞或肝细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将核酸递送(例如递送)到靶细胞，例如以暂时修饰靶细胞中的基因表达。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将蛋白质递送(例如递送)到靶细胞，例如以短暂拯救蛋白质缺乏。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将蛋白质递送到靶细胞。在实施例中，蛋白质为膜蛋白(例如膜转运蛋白)、胞质蛋白(例如酶)或分泌蛋白(例如免疫抑制蛋白)。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将细胞器递送(例如递送)到靶细胞，例如其中靶细胞具有缺陷的细胞器网络。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将细胞器递送到靶细胞。在实施例中，源细胞为肝细胞、骨骼肌细胞或神经元。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够将细胞核递送(例如递送)到靶细胞，例如其中靶细胞具有基因突变。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将细胞核递送到靶细胞。在一些实施例中，细胞核是自体的并且包含一个或多个相对于靶细胞的基因变化，例如其包含对DNA(例如Cas9、ZFN或TALEN)的序列特异性修饰，或人工染色体、整合到基因组中的额外基因序列、缺失或其任何组合。在实施例中，自体细胞核的来源是干细胞，例如造血干细胞。在实施例中，靶细胞是肌细胞(例如骨骼肌细胞或心肌细胞)、肝细胞或神经元。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行细胞内分子递送，例如将蛋白质药剂递送到靶细胞。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将分子递送到靶细胞的胞内区。在实施例中，蛋白质药剂为抑制剂。在实施例中，蛋白质药剂包含纳米抗体、scFv、骆驼抗体、肽、大环或小分子。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够引起(例如引起)靶细胞分泌蛋白质，例如治疗蛋白。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含促使靶细胞分泌蛋白质。
在一些实施例中，融合剂脂质体能够分泌(例如分泌)药剂，例如蛋白质。在一些实施例中，药剂(例如分泌药剂)被递送到个体的靶位点。在一些实施例中，药剂是不能以重组方式制备或难以以重组方式制备的蛋白质。在一些实施例中，分泌蛋白质的融合剂脂质体是来自选自MSC或软骨细胞的源细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体在其膜上包含一个或多个细胞表面配体(例如1、2、3、4、5、10、20、50或更多个细胞表面配体)。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含将一个或多个细胞表面配体呈递到靶细胞。在一些实施例中，具有细胞表面配体的融合剂脂质体来自选自嗜中性粒细胞(例如，并且靶细胞为肿瘤浸润性淋巴细胞)、树突状细胞(例如，并且靶细胞为未处理的T细胞)或嗜中性粒细胞(例如，并且靶细胞为肿瘤细胞或病毒感染的细胞)的源细胞。在一些实施例中，融合剂脂质体包含膜复合物，例如包含至少2、3、4或5个蛋白质的复合物，例如同二聚体、异二聚体、同三聚体、异三聚体、同四聚体或异四聚体。在一些实施例中，融合剂脂质体包含抗体，例如毒性抗体，例如融合剂脂质体能够将抗体递送到靶位点，例如通过归巢到靶位点。在一些实施例中，源细胞为NK细胞或嗜中性粒细胞。
在一些实施例中，本文的方法包含引起蛋白质从靶细胞分泌或配体呈递到靶细胞表面上。在一些实施例中，融合剂脂质体能够引起靶细胞的细胞死亡。在一些实施例中，融合剂脂质体来自NK源细胞。
在一些实施例中，融合剂脂质体或靶细胞能够进行吞噬作用(例如吞噬病原体)。类似地，在一些实施例中，本文的方法包含引起吞噬作用。
在一些实施例中，融合剂脂质体感测其局部环境并对其作出反应。在一些实施例中，融合剂脂质体能够感测代谢物、白介素或抗原的水平。
在实施例中，融合剂脂质体能够进行趋化性、外渗或一种或多种代谢活动。在实施例中，代谢代谢活动是选自犬尿氨酸(kVneurinine)、葡糖新生、前列腺素脂肪酸氧化、腺苷代谢、尿素循环和产热呼吸。在一些实施例中，源细胞为嗜中性粒细胞并且融合剂脂质体能够归巢到损伤部位。在一些实施例中，源细胞为巨噬细胞并且融合剂脂质体能够进行吞噬作用。在一些实施例中，源细胞为棕色脂肪组织细胞并且融合剂脂质体能够进行脂解。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含多种药剂(例如至少2、3、4、5、10、20或50种药剂)(例如能够将其递送到靶细胞)。在实施例中，融合剂脂质体包含抑制性核酸(例如siRNA或miRNA)和mRNA。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含膜蛋白或编码膜蛋白的核酸(例如能够将其递送到靶细胞)。在实施例中，融合剂脂质体能够重编程或转分化靶细胞，例如融合剂脂质体包含一种或多种诱导靶细胞重编程或转分化的药剂。
在一些实施例中，个体需要再生。在一些实施例中，个体罹患癌症、自身免疫病、传染病、代谢疾病、神经退化性疾病或遗传病(例如酶缺乏症)。
在一些实施例(例如用于分析货物的非内吞递送的实施例)中，使用以下步骤中的一个或多个(例如全部)来分析货物递送：(a)将30,000个HEK-293T靶细胞置于包含100nM巴弗洛霉素A1的96孔盘的第一孔中，和将类似数目的类似细胞置于缺少巴弗洛霉素A1的96孔盘的第二孔中，(b)在DMEM培养基中在37℃和5％CO2下培养靶细胞四小时，(c)使靶细胞与10μg包含货物的融合剂脂质体接触，(d)在37℃和5％CO2下培育靶细胞和融合剂脂质体24小时，和(e)确定第一孔和第二孔中包含货物的细胞的百分比。步骤(e)可以包含使用显微法，例如使用免疫荧光来检测货物。步骤(e)可以包含间接检测货物，例如检测货物的下游效应，例如报道蛋白的存在。在一些实施例中，如实例81中所描述地进行以上步骤(a)-(e)中的一个或多个。
在一些实施例中，内吞作用的抑制剂(例如氯奎或巴弗洛霉素A1)抑制抑制内体酸化。在一些实施例中，货物递送独立于溶酶体酸化。在一些实施例中，内吞作用的抑制剂(例如Dynasore)抑制发动蛋白。在一些实施例中，货物递送独立于发动蛋白活性。
在一些实施例(例如用于相对于非靶细胞，向靶细胞特异性递送货物的实施例)中，使用以下步骤中的一个或多个(例如全部)来分析货物递送：(a)将30,000个过度表现CD8a和CD8b的HEK-293T靶细胞置于96孔盘的第一孔中，并将不过度表现CD8a和CD8b的30,000个HEK-293T非靶细胞置于96孔盘的第二孔中，(b)在DMEM培养基中在37℃和5％CO2下培养靶细胞四小时，(c)使靶细胞与10μg包含货物的融合剂脂质体接触，(d)在37℃和5％CO2下培育靶细胞和融合剂脂质体24小时，和(e)确定第一孔和第二孔中包含货物的细胞的百分比。步骤(e)可以包含使用显微法，例如使用免疫荧光来检测货物。步骤(e)可以包含间接检测货物，例如检测货物的下游效应，例如报道蛋白的存在。在一些实施例中，如实例72中所描述地进行以上步骤(a)-(e)中的一个或多个。
在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于非靶细胞，例如高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍，例如在实例43的分析中在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合速率高于其它融合剂脂质体，例如高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如在实例43的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体与靶细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率融合，例如在实例54的分析中。在实施例中，靶向融合的量为约30％-70％、35％-65％、40％-60％、45％-55％或45％-50％，例如约48.8％，例如在实例43的分析中。在实施例中，靶向融合的量为约20％-40％、25％-35％或30％-35％，例如约32.2％，例如在实例44的分析中。
在一些实施例中，融合剂以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数存在，例如如实例27的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂被安置于细胞膜中。在实施例中，融合剂脂质体还在内部，例如在细胞质或细胞器中包含融合剂。在一些实施例中，融合剂占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中总蛋白的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、5％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、20％或更大，或约1-30％、5-20％、10-15％、12-15％、13-14％或13.6％，例如如根据实例95中所描述的方法和/或通过质谱分析确定。在实施例中，融合剂占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中的总蛋白的约13.6％。在一些实施例中，融合剂比一种或多种额外的所关注的蛋白质更丰富或更不丰富(或被鉴别为如此)，例如如根据实例95中描述的方法所确定。在一个实施例中，融合剂与EGFP具有(或被鉴别为具有)约140、145、150、151、152、153、154、155、156、157(例如156.9)、158、159、160、165或170的比。在另一实施例中，融合剂与CD63具有(或被鉴别为具有)约2700、2800、2900、2910(例如2912)、2920、2930、2940、2950、2960、2970、2980、2990或3000，或约1000-5000、2000-4000、2500-3500、2900-2930、2910-2915或2912.0的比，例如根据质谱分析。在一个实施例中，融合剂与ARRDC1具有(或被鉴别为具有)约600、610、620、630、640、650、660(例如664.9)、670、680、690或700的比。在另一实施例中，融合剂与GAPDH具有(或被鉴别为具有)约50、55、60、65、70(例如69)、75、80或85，或约1-30％、5-20％、10-15％、12-15％、13-14％或13.6％的比。在另一实施例中，融合剂与CNX具有(或被鉴别为具有)约500、510、520、530、540、550、560(例如558.4)、570、580、590或600，或约300-800、400-700、500-600、520-590、530-580、540-570、550-560或558.4的比，例如根据质谱分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体以至少或不超过10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含治疗剂，例如如通过实例89的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含蛋白质治疗剂，例如如通过实例89的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含核酸治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含DNA治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含RNA治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源蛋白质治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体以至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的拷贝数包含外源核酸(例如DNA或RNA)治疗剂。在一些实施例中，融合剂的拷贝数与治疗剂的拷贝数的比在1,000,000∶1与100,000∶1之间、在100,000∶1与10,000∶1之间、在10,000∶1与1，000∶1之间、在1,000∶1与100∶1之间、在100∶1与50∶1之间、在50∶1与20∶1之间、在20∶1与10∶1之间、在10∶1与5∶1之间、在5∶1与2∶1之间、在2∶1与1∶1之间、在1∶1与1∶2之间、在1∶2与1∶5之间、在1∶5与1∶10之间、在1∶10与1∶20之间、在1∶20与1∶50之间、在1∶50与1∶100之间、在1∶100与1∶1,000之间、在1∶1,000与1∶10,000之间、在1∶10,000与1∶100,000之间或在1∶100,000与1∶1,000,000之间。
在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的蛋白质治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的核酸治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的RNA治疗剂。在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10、50、100、500、1,000、2,000、5,000、10,000、20,000、50,000、100,000、200,000、500,000、1,000,000、5,000,000、10,000,000、50,000,000、100,000,000、500,000,000或1,000,000,000个拷贝的DNA治疗剂。
在一些实施例中，融合剂脂质体向靶细胞递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂脂质体所包含的货物(例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂)。在一些实施例中，与一个或多个靶细胞融合的融合剂脂质体向靶细胞递送平均至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的与一个或多个靶细胞融合的融合剂脂质体所包含的货物(例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂)。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物向靶组织递送至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的融合剂脂质体组合物所包含的货物(例如治疗剂，例如内源性治疗剂或外源性治疗剂)。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含0.00000001mg融合剂到1mg融合剂/mg融合剂脂质体中的总蛋白，例如0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、或0.1-1mg融合剂/mg融合剂脂质体中的总蛋白。在一些实施例中，融合剂脂质体包含0.00000001mg融合剂到5mg融合剂/mg融合剂脂质体中的脂质，例如0.00000001-0.0000001、0.0000001-0.000001、0.000001-0.00001、0.00001-0.0001、0.0001-0.001、0.001-0.01、0.01-0.1、0.1-1或1-5mg融合剂/mg融合剂脂质体中的脂质。
在一些实施例中，货物为蛋白质货物。在实施例中，货物为内源或合成蛋白质货物。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)至少1、2、3、4、5、10、20、50、100或更多个蛋白质货物分子/融合剂脂质体。在一个实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约100、110、120、130、140、150、160、166、170、180、190或200个蛋白质药剂分子/融合剂脂质体，例如如根据实例89中所描述的方法所定量。在一些实施例中，内源或合成蛋白质货物占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中的总蛋白的约0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、1％、5％、10％、15％、20％、25％或更大。在一个实施例中，合成蛋白质货物占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中的总蛋白的约13.6％。在一些实施例中，合成蛋白质货物与VSV-G具有(或被鉴别为具有)约4×10-3、5×10-3、6×10-3(例如6.37×10-3)、7×10-3或8×10-3的比。在实施例中，合成蛋白质货物与CD63具有(或被鉴别为具有)约10、15、16、17、18(例如18.6)、19、20、25或30，或约10-30、15-25、16-19、18-19或18.6的比。在实施例中，合成蛋白质货物与ARRDC1具有(或被鉴别为具有)约2、3、4(例如4.24)、5、6或7的比。在实施例中，合成蛋白质货物与GAPDH具有(或被鉴别为具有)约0.1、0.2、0.3、0.4(例如0.44)、0.5、0.6或0.7的比。在实施例中，合成蛋白质货物与CNX具有(或被鉴别为具有)约1、2、3(例如3.56)、4、5或6的比。在实施例中，合成蛋白质货物与TSG101具有(或被鉴别为具有)约10、15、16、17、18、19(例如19.52)、20、21、22、23、24、25或30的比。
在一些实施例中，融合剂占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中的总蛋白的至少0.5％、1％、5％、10％或更大，例如根据质谱分析。在一个实施例中，融合剂占(或被鉴别为占)融合剂脂质体中的总蛋白的约1-30％、5-20％、10-15％、12-15％、13-14％或13.6％，例如根据质谱分析。在一些实施例中，融合剂比其它所关注的蛋白质更丰富。在实施例中，融合剂与有效负载蛋白(例如EGFP)具有(或被鉴别为具有)约145-170、150-165、155-160、156.9的比，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与CD63具有(或被鉴别为具有)约1000-5000、2000-4000、2500-3500、2900-2930、2910-2915或2912.0的比，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与ARRDC1具有约300-1000、400-900、500-800、600-700、640-690、650-680、660-670或664.9的比，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与GAPDH具有(或被鉴别为具有)约20-120、40-100、50-90、60-80、65-75、68-70或69.0的比，例如根据质谱分析。在实施例中，融合剂与CNX具有约200-900、300-800、400-700、500-600、520-590、530-580、540-570、550-560或558.4的比，例如根据质谱分析。在实施例中，质谱分析为实例95的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的脂质物质的数目为(或被鉴别为)至少300、400、500、550、560或569，或在500-700、550-600或560-580之间，例如使用质谱分析。在实施例中，以源细胞中的对应脂质水平的至少25％的水平(均被标准化为样品内的总脂质水平)存在于融合剂脂质体中的脂质物质的数目为(或被鉴别为)至少300、400、500、530、540或548，或在400-700、500-600、520-570、530-560或540-550之间，例如使用质谱分析。在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的脂质物质相对于源细胞中的总脂质物质的分率为(或被鉴别为)约0.4-1.0、0.5-0.9、0.6-0.8或0.7，或至少0.4、0.5、0.6或0.7，例如使用质谱分析。在一些实施例中，质谱分析是实例87的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的蛋白质物质的数目为(或被鉴别为)至少500、1000、1100、1200、1300、1400、1487、1500或1600，或为(或被鉴别为)在1200-1700、1300-1600、1400-1500、1450-1500或1480-1490之间，例如使用质谱分析。在实施例中，以源细胞中的对应蛋白质水平的至少25％的水平(均被标准化为样品内的总蛋白质水平)存在于融合剂脂质体中的蛋白质物质的数目为(或被鉴别为)至少500、600、700、800、900、950、957、1000或1200，例如使用质谱分析。在一些实施例中，融合剂脂质体和源细胞两者中所存在(例如在其之间共有)的蛋白质物质相对于源细胞中的总蛋白质物质的分率为(或被鉴别为)约0.1-0.6、0.2-0.5、0.3-0.4或0.333，或至少约0.1、0.2、0.3、0.333或0.4，例如使用质谱分析。在实施例中，质谱分析为实例88的分析。
在一些实施例中，CD63以(或被鉴别为以)融合剂脂质体中的总蛋白的量的小于0.048％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％或10％存在，例如根据质谱分析，例如实例90的分析。
在一些实施例中，通过经由过滤器，例如约1-10、2-8、3-7、4-6或5μm的过滤器挤压来产生融合剂脂质体。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约1-5、2-5、3-5、4-5或5μm的平均直径。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)至少1、2、3、4或5μm的平均直径。
在一些实施例中，相比于源细胞，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)：胆固醇酯、游离胆固醇、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、醚连接的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。在一些实施例中，相比于源细胞，融合剂脂质体耗尽(或被鉴别为耗尽)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)：神经酰胺、心磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、醚连接的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和三酰甘油。在一些实施例中，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)前述富集的脂质中的一种或多种并耗尽前述耗尽的脂质中的一种或多种。在一些实施例中，相比于源细胞中的对应水平，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍或10倍的总脂质的百分比形式的富集的脂质。在一些实施例中，融合剂脂质体以源细胞中的对应水平的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的水平包含(或被鉴别为包含)总脂质的百分比形式的耗尽的脂质。在实施例中，脂质富集是通过质谱分析，例如实例97的分析来测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体中的CE脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约2倍和/或融合剂脂质体中的CE脂质水平比亲本细胞中高约5、6、7、8、9或10倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，亲本细胞中的神经酰胺脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2、3、4或5倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的胆固醇水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或融合剂脂质体中的胆固醇水平比亲本细胞中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，亲本细胞中的CL脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高至少约5、10、20、30或40倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的DAG脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2或3倍和/或亲本细胞中的DAG脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PC脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PC脂质水平比融合剂脂质体中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PC O-脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PC O-脂质水平比融合剂脂质体中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体中的PE脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍和/或亲本细胞中的PE脂质水平比融合剂脂质体中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PE O-脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PE O-脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PG脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PG脂质水平比融合剂脂质体中高约2、3、4、5、6、7、8、9或10倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PI脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PI脂质水平比融合剂脂质体中高约3、4、5、6或7倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的PS脂质水平为(或被鉴别为)(或被鉴别为)约相等和/或融合剂脂质体中的PS脂质水平比亲本细胞中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的SM脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或融合剂脂质体中的SM脂质水平比亲本细胞中高约2、2.5或3倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体与融合剂脂质体之间的TAG脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的TAG脂质水平比融合剂脂质体中高约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更大(相对于样品中的总脂质)。
在一些实施例中，相比于外泌体，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)：胆固醇酯、神经酰胺、二酰甘油、溶血磷脂酸酯和磷脂酰乙醇胺，以及三酰甘油。在一些实施例中，相比于外泌体，融合剂脂质体耗尽(或被鉴别为耗尽)以下脂质中的一种或多种(例如至少2、3、4、5种或全部)(相对于样品中的总脂质)：游离胆固醇、己糖基神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、醚连接的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。在一些实施例中，融合剂脂质体富含(或被鉴别为富含)前述富集的脂质中的一种或多种并耗尽前述耗尽的脂质中的一种或多种。在一些实施例中，相比于外泌体中的对应水平，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍或10倍的总脂质的百分比形式的富集的脂质。在一些实施例中，融合剂脂质体以外泌体中的对应水平的小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％或10％的水平包含(或被鉴别为包含)总脂质的百分比形式的耗尽的脂质。在实施例中，脂质富集是通过质谱分析，例如实例97的分析来测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体中的神经酰胺脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约2倍和/或亲本细胞中的神经酰胺脂质水平比融合剂脂质体中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的HexCer脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或亲本细胞与融合剂脂质体中的HexCer脂质水平约相等(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体中的LPA脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约3倍或4倍和/或融合剂脂质体中的LPA脂质水平比亲本细胞中高约1.3、1.4、1.5、1.6、1.7或1.8倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPC脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2倍和/或亲本细胞中的LPC脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPC O-脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约3倍或4倍和/或亲本细胞与融合剂脂质体之间的LPC O-脂质水平约相等(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPE脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或亲本细胞中的LPE脂质水平比融合剂脂质体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPE O-脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约2倍或3倍和/或亲本细胞与融合剂脂质体之间的LPE O-脂质水平约相等(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，外泌体中的LPS脂质水平比(或被鉴别为比)融合剂脂质体中高约3倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体中的PA脂质水平比(或被鉴别为比)外泌体中高约1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或2倍和/或融合剂脂质体中的PA脂质水平比亲本细胞中高约2倍(相对于样品中的总脂质)。在一些实施例中，融合剂脂质体与外泌体之间的PG脂质水平为(或被鉴别为)约相等和/或亲本细胞中的PG脂质水平比融合剂脂质体中高约10、11、12、13、14或15倍(相对于样品中的总脂质)。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含与源细胞基本上类似的脂质组成，或其中CL、Cer、DAG、HexCer、LPA、LPC、LPE、LPG、LPI、LPS、PA、PC、PE、PG、PI、PS、CE、SM和TAG中的一个或多个在源细胞中的对应脂质水平的10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％内。在实施例中，融合剂脂质体的脂质组成与衍生其的细胞类似。在实施例中，如果亲本细胞的任何复制样品中所鉴别的大于或等于约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％的脂质物质存在(或被鉴别为存在)于融合剂脂质体的任何复制样品中，那么融合剂脂质体和亲本细胞具有(或被鉴别为具有)类似脂质组成，例如根据实例87所确定。在实施例中，融合剂脂质体中的所鉴别的脂质的平均水平大于亲本细胞中的对应平均脂质物质水平约10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％(相对于样品中的总脂质)。在一个实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体的脂质组成富含和/或耗尽特定脂质(相对于样品中的总脂质)。
在一些实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体的脂质组成(或被鉴别为)富含和/或耗尽特定脂质，例如如根据实例97中描述的方法所确定。
在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比亲本细胞更大的磷脂酰丝氨酸与总脂质的比。在实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约110％、115％、120％、121％、122％、123％、124％、125％、130％、135％、140％或更大的磷脂酰丝氨酸与总脂质的比。在一些实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含胆固醇酯、游离胆固醇、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、醚连接的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和/或鞘磷脂。在一些实施例中，相对于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽神经酰胺、心磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、醚连接的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和/或三酰甘油。在一些实施例中，相对于外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含胆固醇酯、神经酰胺、二酰甘油、溶血磷脂酸酯、磷脂酰乙醇胺和/或三酰甘油。在一些实施例中，相对于外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽游离胆固醇、己糖基神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、醚连接的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺和/或溶血磷脂酰丝氨酸。
在一些实施例中，融合剂脂质体的心磷脂∶神经酰胺的比在源细胞中的心磷脂∶神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶二酰甘油的比在源细胞中的心磷脂∶二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶己糖基神经酰胺的比在源细胞中的心磷脂：己糖基神经酰胺鹅比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的心磷脂∶溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的心磷脂∶溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的心磷脂∶溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的心磷脂∶溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的心磷脂∶溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的心磷脂∶溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酸酯的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酰胆碱的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酰甘油的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酰肌醇的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶胆固醇酯的比在源细胞中的心磷脂：胆固醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶鞘磷脂的比在源细胞中的心磷脂：鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶三酰甘油的比在源细胞中的心磷脂∶三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶二酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱：己糖基神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰胆碱：溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶磷脂酸酯的比在源细胞中的心磷脂∶磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或心磷脂∶磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶胆固醇酯的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶鞘磷脂的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰胆碱∶三酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰胆碱∶三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶二酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶己糖基神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺：溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％捏；或磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶胆固醇酯的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶鞘磷脂的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰乙醇胺∶三酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰乙醇胺∶三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶二酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶己糖基神经酰胺的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶磷脂酸酯的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶磷脂酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶磷脂酰肌醇的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶胆固醇酯的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸：胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶鞘磷脂的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶鞘磷脂的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或磷脂酰丝氨酸∶三酰甘油的比在源细胞中的磷脂酰丝氨酸∶三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶神经酰胺的比在源细胞中的鞘磷脂∶神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶二酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂∶二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶己糖基神经酰胺的比在源细胞中的鞘磷脂∶己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的鞘磷脂∶溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的鞘磷脂∶溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的鞘磷脂∶溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂∶溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的鞘磷脂∶溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的鞘磷脂∶溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶磷脂酸酯的比在源细胞中的鞘磷脂∶磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶磷脂酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂：磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶磷脂酰肌醇的比在源细胞中的鞘磷脂∶磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶胆固醇酯的比在源细胞中的鞘磷脂∶胆固醇酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或鞘磷脂∶三酰甘油的比在源细胞中的鞘磷脂∶三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶神经酰胺的比在源细胞中的胆固醇酯∶神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶二酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯∶二酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶己糖基神经酰胺的比在源细胞中的胆固醇酯∶己糖基神经酰胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶溶血磷脂酸酯的比在源细胞中的胆固醇酯∶溶血磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶溶血磷脂酰胆碱的比在源细胞中的胆固醇酯∶溶血磷脂酰胆碱的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶溶血磷脂酰乙醇胺的比在源细胞中的胆固醇酯∶溶血磷脂酰乙醇胺的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶溶血磷脂酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯∶溶血磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶溶血磷脂酰肌醇的比在源细胞中的胆固醇酯∶溶血磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶溶血磷脂酰丝氨酸的比在源细胞中的胆固醇酯∶溶血磷脂酰丝氨酸的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶磷脂酸酯的比在源细胞中的胆固醇酯∶磷脂酸酯的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶磷脂酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯∶磷脂酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶磷脂酰肌醇的比在源细胞中的胆固醇酯∶磷脂酰肌醇的比的10％、20％、30％、40％或50％内；或胆固醇酯∶三酰甘油的比在源细胞中的胆固醇酯∶三酰甘油的比的10％、20％、30％、40％或50％内。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含与源细胞类似的蛋白质组学组成，例如使用实例88的分析；在一些实施例中，融合剂脂质体的蛋白质组成与衍生其的亲本细胞类似。在一些实施例中，将多个类别的蛋白质中的每一类别的分数含量确定为来自每一类别的强度信号的总和除以样品中所有鉴别的蛋白质的强度信号的总和，例如如实例88中所描述。在一些实施例中，相对于亲本细胞和/或外泌体，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)不同量的区室特异性蛋白质，例如如根据实例98中所描述的方法所确定。在一些实施例中，相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽内质网蛋白。在一些实施例中，相比于外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽外泌体蛋白。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或鉴别为具有)小于15％、20％或25％的融合剂脂质体中的蛋白质作为外泌体蛋白。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)耗尽线粒体蛋白。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含核蛋白。在一些实施例中，相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体(或被鉴别为)富含核糖体蛋白。在一些实施例中，融合剂脂质体中至少0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％、0.08％、0.09％、0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％8％、9％或10％的蛋白质为核糖体蛋白，或融合剂脂质体中约0.025-0.2％、0.05-0.15％、0.06-1.4％、0.07％-1.3％、0.08％-1.2％、0.09％-1.1％、1％-20％、3％-15％、5％-12.5％、7.5％-11％、或8.5％-10.5％、或9％-10％的蛋白质为核糖体蛋白。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含的脂质∶蛋白质的比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例41的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)大致等于有核细胞的脂质质量∶蛋白质比的脂质质量∶蛋白质比。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)比亲本细胞更大的脂质∶蛋白质比。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)亲本细胞的脂质∶蛋白质比的约110％、115％、120％、125％、130％、131％、132％、132.5％、133％、134％、135％、140％、145％或150％的脂质：蛋白质比。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有(或被鉴别为具有)约100-180、110-170、120-160、130-150、135-145、140-142或141μmol/g的磷脂∶蛋白质比，例如在实例84的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有(或被鉴别为具有)源细胞中的对应比的约60-90％、70-80％或75％的磷脂∶蛋白质比，例如在实例84的分析中。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含的蛋白质∶核酸(例如DNA或RNA)比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例42的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)与亲本细胞类似的蛋白质质量∶DNA质量比。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)亲本细胞的约约85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.2％、99％、100％、101％、102％、103％、104％、105％或110％的蛋白质∶DNA比。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的蛋白质∶DNA比大于源细胞中的对应比，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如如使用实例42的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)约20-35、25-30、26-29、27-28或27.8g/g的蛋白质∶DNA比，例如根据实例85的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)在源细胞中的对应比的约1％、2％、5％、10％或20％内的蛋白质∶DNA比，例如根据实例85的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含的脂质∶核酸(例如DNA)比在源细胞中的对应比的10％、20％、30％、40％或50％内，例如如使用实例92的分析所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)约2.0-6.0、3.0-5.0、3.5-4.5、3.8-4.0或3.92μmol/mg的脂质：DNA比，例如根据实例86的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的脂质：核酸(例如DNA)比大于源细胞中的对应比，例如大至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如如使用实例92的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)比亲本细胞更大的脂质∶DNA比。在实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体包含约105％、110％、115％、120％、125％、130％、135％、140％、145％、150％或更大的脂质∶DNA比。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物在个体(例如小鼠)中的半衰期在参考细胞组合物(例如源细胞)的半衰期的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例61的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物在个体中(例如在小鼠中)的半衰期为至少1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、12小时或24小时，例如在人类个体或小鼠中，例如根据实例61的分析。在实施例中，融合剂脂质体组合物在个体中的半衰期为至少1、2、4、6、12或24小时，例如在实例80的分析中。在一些实施例中，治疗剂在个体中的半衰期比融合剂脂质体组合物的半衰期更长，例如长至少10％、20％、50％、2倍、5倍或10倍。例如，融合剂脂质体可以将治疗剂递送到靶细胞，并且治疗剂可以在融合剂脂质体不再存在或可检测之后存在。
在一些实施例，融合剂脂质体跨膜转运葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在葡萄糖的其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如如使用实例51的分析所测量；在一些实施例中，融合剂脂质体以比用根皮素处理的其它方面类似的融合剂脂质体更高的水平跨膜转运(或被鉴别为转运)葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如在实例73的分析中。在实施例中，相比于用根皮素处理的其它方面类似的融合剂脂质体，未用根皮素处理的融合剂脂质体以高至少1％、2％、3％、5％或10％(并且任选地高至多15％)的水平转运(或被鉴别为不转运)葡萄糖，例如在实例73的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体在内腔中包含的酯酶活性在参考细胞(例如源细胞或小鼠胚胎成纤维细胞)中的酯酶活性的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如使用实例52的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)比未染色对照高至少10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍、2000倍或5000倍的内腔中的酯酶活性，例如根据实例74的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)比源细胞低约10-100倍的内腔中的酯酶活性，例如根据实例74的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)约1E5-1E6、6E5-8E5、6.5E5-7E5或6.83E5外泌体当量的乙酰胆碱酯酶活性，例如根据实例75的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的代谢活性水平(例如柠檬酸合成酶活性)在参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例54中所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的代谢活性水平(例如柠檬酸合成酶活性)为参考细胞(例如源细胞)中的代谢活性水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如如实例54中所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)约1E-2-2E-2、1.3E-2-1.8E-2、1.4E-2-1.7E-2、1.5E-2-1.6E-2、或1.57E-2μmol/μg融合剂脂质体/分钟的柠檬酸合成酶活性，例如根据实例76的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的呼吸水平(例如耗氧速率)，例如基础、非偶联或最大呼吸水平在参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内，例如如实例55中所描述。在一些实施例中，融合剂脂质体包含的呼吸水平(例如耗氧速率)，例如基础、非偶联或最大呼吸水平为参考细胞(例如源细胞)中的呼吸水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如如实例55中所描述。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)约8-15、9-14、10-13、11-12或11.3pmol/分钟/20μg融合剂脂质体的基础呼吸速率，例如根据实例77的分析。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)约8-13、9-12、10-11、10-10.2或10.1pmol/分钟/20μg融合剂脂质体的非偶联呼吸速率，例如根据实例77的分析。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)约15-25、16-24、17-23、18-22、19-21或20pmol/分钟/20μg融合剂脂质体的最大呼吸速率，例如根据实例77的分析。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比非偶联呼吸速率更高的基础呼吸速率，例如高约1％、2％、5％或10％，例如至多约15％，例如根据实例77的分析。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比基础呼吸速率更高的最大呼吸速率，例如高约1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％，例如根据实例77的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体包含最多18,000、17,000、16,000、15,000、14,000、13,000、12,000、11,000或10,000MFI的膜联蛋白-V染色水平，例如使用实例56的分析，或其中相比于实例56的分析中的用甲萘醌处理的其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包含低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平，或其中相比于实例56的分析中的用甲萘醌处理的巨噬细胞的膜联蛋白-V染色水平，融合剂脂质体包含低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的膜联蛋白-V染色水平。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)比用抗霉素A处理的其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白V染色水平低至少约1％、2％、5％或10％的膜联蛋白V染色水平，例如在实例78的分析中。在实施例中，融合剂脂质体包含(或被鉴别为包含)在用抗霉素A处理的其它方面类似的融合剂脂质体的膜联蛋白V染色水平的约1％、2％、5％或10％内的膜联蛋白V染色水平，例如在实例78的分析中。
在一些实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量水平为源细胞的所述miRNA含量水平的至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如根据实例34的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量水平为源细胞的所述miRNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的miRNA含量水平的至多100％)，例如根据实例34的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的总RNA含量水平为源细胞的所述总RNA含量水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大(例如源细胞的总RNA含量水平的至多100％)，例如如根据实例67的分析所测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体的可溶：非可溶蛋白质比在源细胞的所述比的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内，例如在源细胞的所述比的1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如根据实例39的分析。在实施例中，融合剂脂质体具有约0.3-0.8、0.4-0.7或0.5-0.6，例如约0.563的可溶：非可溶蛋白质比，例如根据实例39的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体群具有(或被鉴别为具有)约0.3-0.8、0.4-0.7、0.5-0.6或0.563，或大于约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5的可溶性：不溶性蛋白质质量比。在一些实施例中，融合剂脂质体群具有(或被鉴别为具有)比源细胞更高的可溶性：不溶性蛋白质质量比，例如高至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍或20倍。在实施例中，通过实例71的分析来测定可溶性∶不溶性蛋白质质量比。在实施例中，融合剂脂质体群中的可溶性∶不溶性蛋白质质量比(或被鉴别为)低于亲本细胞。在实施例中，当融合剂脂质体∶亲本细胞比为(或被鉴别为)约3％、4％、5％、6％、7％或8％时，融合剂脂质体群的可溶性∶不溶性比为(或被鉴别为)约等于亲本细胞的可溶性∶不溶性比。
在一些实施例中，融合剂脂质体的LPS水平为源细胞的LPS含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小，例如如根据质谱分析所测量，例如在实例40的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行信号转导，例如传输细胞外信号，例如回应胰岛素的AKT磷酸化，或回应于胰岛素而摄取葡萄糖(例如经标记的葡萄糖，例如2-NBDG)，例如比阴性对照(例如不存在胰岛素的其它方面类似的融合剂脂质体)多至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如使用实例50的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体在向例如小鼠的个体施用时靶向组织，例如肝脏、肺、心脏、脾脏、胰脏、胃肠道、肾脏、睾丸、卵巢、脑、生殖器官、中枢神经系统、外周神经系统、骨骼肌、内皮、内耳或眼部，例如其中在24、48或72小时之后，在施用融合剂脂质体的群体中，至少0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的融合剂脂质体存在于靶组织中，例如根据实例65的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的近分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％，例如根据实例57的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的近分泌信号传导水平为由参考细胞(例如源细胞或骨髓基质细胞(BMSC))诱导的近分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，至多100％)，例如根据实例57的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平比由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％，例如根据实例58的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的旁分泌信号传导水平为由参考细胞(例如源细胞或巨噬细胞)诱导的旁分泌信号传导水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如，至多100％)，例如根据实例58的分析。在一些实施例中，相比于参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)中聚合肌动蛋白的水平，融合剂脂质体以在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％内的水平聚合肌动蛋白，例如根据实例59的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体以随时间推移(例如在至少3、5或24小时内)恒定的水平聚合肌动蛋白(或被鉴别为聚合肌动蛋白)，例如根据实例82的分析。在实施例中，肌动蛋白聚合的水平在5小时时段内改变小于1％、2％、5％、10％或20％，例如根据实例82的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体的膜电位在参考细胞(例如源细胞或C2C12细胞)的膜电位的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％内，例如根据实例60的分析，或其中融合剂脂质体具有约-20mV到-150mV、-20mV到-50mV、-50mV到-100mV或-100mV到-150mV的膜电位，或其中融合剂脂质体具有小于-1mv、-5mv、-10mv、-20mv、-30mv、-40mv、-50mv、-60mv、-70mv、-80mv、-90mv、-100mv的膜电位。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)约-25至-35、-27至-32、-28至-31、-29至-30或-29.6毫伏的膜电位，例如在实例79的分析中。在一些实施例中，融合剂脂质体能够从血管外渗，例如以源细胞的外渗率的至少1％、2％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的速率，例如使用实例45的分析，例如其中源细胞为嗜中性粒细胞、淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或NK细胞。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行趋化，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如使用实例46的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体能够进行吞噬作用，例如相比于参考细胞(例如巨噬细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)，例如使用实例48的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体能够穿过细胞膜，例如内皮细胞膜或血脑屏障；在一些实施例中，融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以比参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)大至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的速率，例如使用实例49的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体能够分泌蛋白质，例如以相比于参考细胞(例如小鼠胚胎成纤维细胞)的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％(例如至多100％)的速率，例如使用实例49的分析。
在一些实施例中，融合剂脂质体不能够转录或具有参考细胞(例如源细胞)的转录活性的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转录活性，例如使用实例25的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体不能够进行核DNA复制或具有参考细胞(例如源细胞)的核DNA复制的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的核DNA复制，例如使用实例26的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体缺乏染色质或具有为参考细胞(例如源细胞)的染色质含量的小于1％、2.5％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的染色质含量，例如使用实例33的分析。
在一些实施例中，通过与参考细胞进行比较来描述融合剂脂质体的特征。在实施例中，参考细胞为源细胞。在实施例中，参考细胞为HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞。在一些实施例中，通过与参考细胞群，例如源细胞群，或HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR 90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞群进行比较来描述融合剂脂质体群的特征。
在一些实施例中，融合剂脂质体符合药物或良好生产规范(GMP)标准。在一些实施例中，融合剂脂质体是根据良好生产规范(GMP)制得。在一些实施例中，融合剂脂质体的病原体水平低于预定参考值，例如基本上不含病原体。在一些实施例中，融合剂脂质体的污染物水平低于预定参考值，例如基本上不含污染物。在一些实施例中，融合剂脂质体具有低免疫原性，例如如本文所描述。
在一些实施例中，通过血清灭活分析(例如检测抗体介导的中和或补体介导的降解的分析)来分析融合剂脂质体组合物的免疫原性。在一些实施例中，融合剂脂质体不被血清灭活，或以低于预定值的水平灭活。在一些实施例中，未用融合剂脂质体处理的个体(例如人类或小鼠)的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在一些实施例中，已接受一次或多次融合剂脂质体施用，例如已接受至少两次融合剂脂质体施用的个体的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在实施例中，接着对暴露于血清的融合剂脂质体测试将货物递送到靶细胞的能力。在一些实施例中，在用血清培育的融合剂脂质体处理之后可检测地包含货物的细胞的百分比为在用不与血清接触的阳性对照融合剂脂质体处理之后可检测地包含货物的细胞的百分比的至少50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施例中，使用实例100的分析来测量血清灭活。
在一些实施例中，通过检测回应于融合剂脂质体的补体活化来分析融合剂脂质体组合物的免疫原性。在一些实施例中，融合剂脂质体并不活化补体，或以低于预定值的水平活化补体。在一些实施例中，未用融合剂脂质体处理的个体(例如人类或小鼠)的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在一些实施例中，已接受一次或多次融合剂脂质体施用，例如已接受至少两次融合剂脂质体施用的个体的血清与测试融合剂脂质体组合物接触。在实施例中，接着例如通过ELISA关于活化的补体因子(例如C3a)对包含血清和融合剂脂质体的组合物进行测试。在一些实施例中，包含本文所描述的修饰(例如相比于参考细胞，补体调节蛋白的水平升高)的融合剂脂质体相比于缺乏修饰的其它方面类似的融合剂脂质体经历降低的补体活化，例如降低至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％。在一些实施例中，使用实例101的分析来测量补体活化。
在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体群不会被血清基本上灭活。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体群对血清灭活具有抗性，例如如根据实例100中所描述的方法所定量。在实施例中，例如根据本文所描述的方法向个体多次施用融合剂脂质体或融合剂脂质体群后，融合剂脂质体或融合剂脂质体群未被血清基本上灭活或对血清灭活具有抗性。在一些实施例中，融合剂脂质体经修饰以具有降低的血清灭活，例如相比于对应的未经修饰的融合剂脂质体，例如在多次施用经修饰的融合剂脂质体后，例如如根据实例100中所描述的方法所定量。
在一些实施例中，融合剂脂质体不基本上诱导补体活性，例如如根据实例101中所描述的方法所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体经修饰以相比于对应的未经修饰的融合剂脂质体诱导降低的补体活性。在实施例中，通过测定补体蛋白(例如DAF，结合衰变加速因子(DAF，CD55)的蛋白质，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)、C4b结合蛋白(C4BP)、补体受体1(CD35)、膜辅因子蛋白(MCP，CD46)、凸出蛋白(CD59)、抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质或调节MAC组装的蛋白质)在细胞中的表达或活性来测量补体活性。
在一些实施例中，源细胞为内皮细胞、成纤维细胞、血细胞(例如巨噬细胞、嗜中性粒细胞、粒细胞、白细胞)、干细胞(例如间质干细胞、脐带干细胞、骨髓干细胞、造血干细胞、诱导多能干细胞，例如衍生自个体的细胞的诱导多能干细胞)、胚胎干细胞(例如来自胚胎卵黄囊、胎盘、脐带、胎儿皮肤、青少年皮肤、血液、骨髓、脂肪组织、造红细胞组织、造血组织的干细胞)、成肌细胞、实质细胞(例如肝细胞)、肺泡细胞、神经元(例如视网膜神经元细胞)、前体细胞(例如视网膜前体细胞、成髓细胞、骨髓前体细胞、胸腺细胞、性母细胞、成巨核细胞、幼巨核细胞、成黑素细胞、成淋巴细胞、骨髓前体细胞、正成红细胞或成血管细胞)、祖细胞(例如心肌祖细胞、卫星细胞、放射状胶质细胞、骨髓基质细胞、胰腺祖细胞、内皮祖细胞、胚细胞)或永生化细胞(例如HeLa、HEK293、HFF-1、MRC-5、WI-38、IMR90、IMR 91、PER.C6、HT-1080或BJ细胞)。在一些实施例中，源细胞不是293细胞、HEK细胞、人类内皮细胞或人类上皮细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞或干细胞。
在一些实施例中，源细胞表达(例如过度表达)ARRDC1或其活性片段或变异体。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有约1-3、1-10、1-100、3-10、4-9、5-8、6-7、15-100、60-200、80-180、100-160、120-140、3-100、4-100、5-100、6-100、15-100、80-100、3-200、4-200、5-200、6-200、15-200、80-200、100-200、120-200、300-1000、400-900、500-800、600-700、640-690、650-680、660-670、100-10,000或约664.9的融合剂∶ARRDC1比，例如根据质谱分析。在一些实施例中，呈总蛋白含量百分比形式的ARRDC1的水平为至少约0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％；0.1％、0.15％、0.2％、0.25％；0.5％、1％、2％、3％、4％、5％；或呈总蛋白含量的百分比形式的ARRDC1的水平为约0.05％-1.5％、0.1％-0.3％、0.05％-0.2％、0.1％-0.2％、0.25％-7.5％、0.5％-1.5％、0.25％-1％、0.5-1％、0.05％-1.5％、10％-30％、5-20％或10-20％，例如根据质谱分析，例如如根据实例99中所描述的方法所测量。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有约100-1,000、100-400、100-500、200-400、200-500、200-1,000、300-400、1,000-10,000、2,000-5,000、3,000-4,000、3,050-3,100、3,060-3,070或约3,064、10,000-100,000、10,000-200,000、10,000-500,000、20,000-500,000、30,000-400,000的融合剂∶TSG101比，例如使用质谱分析，例如实例95的分析。在一些实施例中，融合剂脂质体或融合剂脂质体组合物具有约1-3、1-30、1-20、1-25、1.5-30、10-30、15-25、18-21、19-20、10-300、10-200、15-300、15-200、100-300、100-200、150-300或约19.5的货物∶tsg101比，例如使用质谱分析，例如实例96的分析。在一些实施例中，呈总蛋白含量的百分比形式的TSG101的水平为至少约0.0001％、0.0002％、0.0003％、0.0004％、0.0005％、0.0006％、0.0007％、0.001％、0.002％、0.003％、0.004％、0.005％、0.006％、0.007％；0.01％、0.02％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％、0.07％；或呈总蛋白含量的百分比形式的TSG101的水平为约0.0001-0.001、0.0001-0.002、0.0001-0.01、0.0001-0.1、0.001-0.01、0.002-0.006、0.003-0.005、0.001-0.1、0.01-0.1、0.02-0.06、0.03-0.05或0.004，例如根据质谱分析，例如根据实例99中所描述的方法所测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含货物，例如治疗剂，例如内源治疗剂或外源治疗剂。在一些实施例中，治疗剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。在一些实施例中，治疗剂是除线粒体以外的细胞器，例如选自以下的细胞器：细胞核、高尔基体、溶酶体、内质网、液泡、内体、顶体、自噬体、中心粒、糖酵解酶体、乙醛酸循环体、氢化酶体、黑素体、纺锤剩体、刺丝囊、过氧化体、蛋白酶体、囊泡和应激颗粒。在一些实施例中，细胞器是线粒体。
在一些实施例中，融合剂脂质体通过内吞作用进入靶细胞，例如其中相比于与类似融合剂脂质体接触的经氯奎处理的参考细胞，经由通过途径递送的治疗剂的水平为0.01-0.6、0.01-0.1、0.1-0.3或0.3-0.6，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如使用实例63的分析。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体通过非内吞途径进入，例如融合剂脂质体通过与细胞表面融合而进入靶细胞。在一些实施例中，治疗剂的水平通过非内吞途径输送。
相比于经氯奎处理的参考细胞，对于给定融合剂脂质体为0.1-0.95、0.1-0.2、0.2-0.3、0.3-0.4、0.4-0.5、0.5-0.6、0.6-0.7、0.7-0.8、0.8-0.9、0.9-
0.95，或至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或
更大，例如使用实例62的分析。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％的融合剂脂质体进入细胞质(例如并不进入内体或溶酶体)。在一些实施例中，进入靶细胞的融合剂脂质体组合物中小于90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％或1％的融合剂脂质体进入内体或溶酶体。在一些实施例中，融合剂脂质体通过非内吞途径进入靶细胞，例如其中所递送的治疗剂的水平为经氯奎处理的参考细胞的至少90％、95％、98％或99％，例如使用实例63的分析。在一个实施例中，融合剂脂质体通过发动蛋白介导的途径将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，相比于与类似融合剂脂质体接触的经Dynasore处理的靶细胞，通过发动蛋白介导的途径递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如在实例64的分析中所测量。在一个实施例中，融合剂脂质体通过巨胞饮将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，相比于与类似融合剂脂质体接触的经EIPA处理的靶细胞，通过巨胞饮递送的药剂的水平在0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如在实例64的分析中所测量。在一个实施例中，融合剂脂质体通过肌动蛋白介导的途径将药剂递送到靶细胞。在一个实施例中，相比于与类似融合剂脂质体接触的经Latrunculin B处理的靶细胞，通过肌动蛋白介导的途径递送的药剂的水平在0.01-0.6单位内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大，例如如在实例64的分析中所测量。
在一些实施例中，融合剂脂质体具有＜1、1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3、1.25-1.35或＞1.35g/ml的密度，例如根据实例31的分析。
在一些实施例中，按蛋白质质量计，融合剂脂质体组合物包含小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％源细胞，或小于0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、4％、5％或10％的细胞具有功能性细胞核。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物中至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％的融合剂脂质体包含细胞器，例如线粒体。
在一些实施例中，融合剂脂质体还包含外源治疗剂。在一些实施例中，外源治疗剂是选自以下中的一种或多种：蛋白质，例如酶、跨膜蛋白、受体、抗体；核酸，例如DNA、染色体(例如人类人工染色体)、RNA、mRNA、siRNA、miRNA或小分子。
在实施例中，融合剂脂质体通过内吞作用或非内吞途径进入细胞。
在实施例中，融合剂脂质体组合物在低于4℃的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施例中，融合剂脂质体组合物在低于-20℃的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。在实施例中，融合剂脂质体组合物在低于-80℃的温度下稳定至少1、2、3、6或12小时；1、2、3、4、5或6天；1、2、3或4周；1、2、3或6个月；或1、2、3、4或5年。
在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小在源细胞的大小的约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％内，例如如根据实例28的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小为源细胞的大小的小于约0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％，例如如根据实例28的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)小于亲本细胞的大小。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)在亲本细胞的约50％、60％、65％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％或90％内的大小。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)亲本细胞的大小分布变化率的小于约70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、1％或更小，例如在样品的约90％内。在实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)比亲本细胞小约40％、45％、50％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、65％或70％的大小分布变化率，例如在样品的约90％内。在一些实施例中，融合剂脂质体具有(或被鉴别为具有)大于30、35、40、45、50、55、60、65或70nm直径的平均大小。在实施例中，融合剂脂质体具有约100、110、120、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、140或150nm直径的平均大小。在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小在源细胞的大小的约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％内，例如如根据实例28的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的大小，或融合剂脂质体群的平均大小为源细胞的大小的小于约0.01％-0.05％、0.05％-0.1％、0.1％-0.5％、0.5％-1％、1％-2％、2％-3％、3％-4％、4％-5％、5％-10％、10％-20％、20％-30％、30％-40％、40％-50％、50％-60％、60％-70％、70％-80％或80％-90％，例如如根据实例28的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体直径，或融合剂脂质体群的平均直径为小于约500nm(例如小于约10、50、100、150、200、250、300、350、400或450nm)，例如如根据实例70的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为约80-180、90-170、100-160、110-150、120-140或130nm，例如如根据实例70的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径在约11,000nm与21,000nm之间，例如如根据实例70的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径在约10-22,000nm、12-20,000nm、14-18,720nm、20-16,000nm之间，例如根据实例70的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的体积，或融合剂脂质体群的平均体积为约0.01-0.1μm3、0.02-1μm3、0.03-1μm3、0.04-1μm3、0.05-0.09μm3、0.06-0.08μm3、0.07μm3，例如如根据实例70的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为至少约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm，例如如根据实例30的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为约10nm、20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、150nm、200nm或250nm(例如±20％)，例如如根据实例30的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为至少约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm，例如如根据实例30的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体的直径，或融合剂脂质体群的平均直径为约500nm、750nm、1,000nm、1,500nm、2,000nm、2,500nm、3,000nm、5,000nm、10,000nm或20,000nm(例如±20％)，例如如根据实例30的分析所测量。在实施例中，融合剂脂质体群具有(或被鉴别为具有)以下中的一个或多个：约40-90nm、45-60nm、50-55nm或53nm的10％分位数直径；约70-100nm、80-95nm、85-90nm或88nm的25％分位数直径；约200-250nm、210-240nm、220-230nm或226nm的75％分位数直径；或约4000-5000nm、4300-4600nm、4400-4500nm、4450nm的90％分位数，例如根据实例69的分析。
在实施例中，融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)约35-40、36-39、37-38或37.2ng/mL的GAPDH浓度，例如在实例83的分析中。在实施例中，融合剂脂质体组合物的GAPDH浓度(或被鉴别为)在源细胞的GAPDH浓度的约1％、2％、5％、10％或20％内，例如在实例83的分析中。在实施例中，融合剂脂质体组合物的GAPDH浓度(或被鉴别为)比源细胞的GAPDH浓度低至少约1％、2％、5％、10％或20％，例如在实例83的分析中。在实施例中，融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)小于约30、35、40、45、46、47、48、49、50、55、60、65或70μg GAPDH/g总蛋白质。在实施例中，融合剂脂质体组合物包含(或被鉴别为包含)小于约500、250、100或50μg GAPDH/g总蛋白质。在实施例中，相比于融合剂脂质体组合物，亲本细胞包含(或被鉴别为包含)至少1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、30％、50％或更多的GAPDH/总蛋白质。
在实施例中，融合剂脂质体中钙联蛋白的平均分数含量为(或被鉴别为)小于约1×10-4、1.5×10-4、2×10-4、2.1×10-4、2.2×10-4、2.3×10-4、2.4×10-4、2.43×10-4、2.5×10-4、2.6×10-4、2.7×10-4、2.8×10-4、2.9×10-4、3×10-4、3.5×10-4或4×10-4。在实施例中，融合剂脂质体包含的钙联蛋白/总蛋白质的量比亲本细胞低约70％、75％、80％、85％、88％、90％、95％、99％或更大。
在一些实施例中，融合剂脂质体包含或富集影响膜曲率的脂质(参见例如Thiam等人，《自然综述分子细胞生物学(Nature Reviews Molecular Cell Biology)》，14(12)：775-785，2013)。一些脂质具有较小的亲水性头基和较大的疏水性尾，其通过集中于局部区域而促进融合孔的形成。在一些实施例中，融合剂脂质体包含或富集负曲率脂质，如胆固醇、磷脂酰乙醇胺(PE)、甘油二酯(DAG)、磷脂酸(PA)、脂肪酸(FA)。在一些实施例中，融合剂脂质体不包含、耗尽或具有少量正曲率脂质，如溶血磷脂酰胆碱(LPC)、磷脂酰肌醇(Ptdlns)、溶血磷脂酸(LPA)、溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)、单酰基甘油(MAG)。
在一些实施例中，将脂质添加到融合剂脂质体。在一些实施例中，将脂质添加到培养的源细胞，所述源细胞在形成融合剂脂质体之前或期间将脂质并入到其膜中。在一些实施例中，将脂质以脂质体的形式添加到细胞或融合剂脂质体。在一些实施例中，甲基-β环糊精(mβ-CD)用于富集或耗尽脂质(参见例如Kainu等人，《脂质研究杂志(Journal of LipidResearch)》，51(12)：3533-3541，2010)。
药物组合物和其制备方法
在一些实施例中，向个体施用逆转录病毒载体的一个或多个转导单元。在一些实施例中，向个体施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单元/kg。在一些实施例中，向个体施用至少1、10、100、1000、104、105、106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014个转导单元/靶细胞/ml。
慢病毒的浓缩和纯化
在一些实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体调配物可以通过包含(例如按时间顺序)以下步骤(i)到(vi)中的一个或多个(例如全部)的方法来产生：
(i)培养产生逆转录病毒载体的细胞；
(ii)收获含有逆转录病毒载体的上清液；
(iii)任选地澄清上清液；
(iv)纯化所述逆转录病毒载体，以得到逆转录病毒载体制剂；
(v)任选地对所述逆转录病毒载体制剂进行过滤灭菌；以及
(vi)浓缩所述逆转录病毒载体制剂以产生最终批量产品。
在一些实施例中，所述方法不包含澄清步骤(iii)。在其它实施例中，所述方法包括澄清步骤(iii)。在一些实施例中，使用超滤或切向流过滤(更优选中空纤维超滤)执行步骤(vi)。在一些实施例中，步骤(iv)中的纯化方法是离子交换色谱，更优选地阴离子交换色谱。在一些实施例中，使用0.22μm或0.2μm灭菌过滤器执行步骤(v)中的过滤灭菌。在一些实施例中，通过过滤器澄清来执行步骤(iii)。在一些实施例中，使用选自色谱、超滤/透滤或离心的方法或方法组合执行步骤(iv)。在一些实施例中，色谱法或方法组合是选自离子交换色谱、疏水相互作用色谱、尺寸排阻色谱、亲和色谱、逆相色谱和固定化金属离子亲和色谱。在一些实施例中，离心方法是选自区带离心、等密度离心和沉淀离心。在一些实施例中，超滤/透滤方法是选自切向流透滤、搅拌式细胞透滤和透析。在一些实施例中，所述方法中包括至少一个使核酸降解的步骤以改进纯化。在一些实施例中，所述步骤是核酸酶处理。
在一些实施例中，在过滤之前完成载体的浓缩。在一些实施例中，载体的浓缩是在过滤后进行。在一些实施例中，重复浓缩和过滤步骤。
在某些实施例中，最后的浓缩步骤是在过滤灭菌步骤之后执行。在一些实施例中，所述方法是用于生产适合作为治疗剂施用于人类的临床级配制物的大规模方法。在一些实施例中，过滤灭菌步骤是在浓缩步骤之前进行。在一些实施例中，浓缩步骤是所述方法中的最后步骤，并且过滤灭菌步骤是所述方法中的倒数第二个步骤。在一些实施例中，浓缩步骤是使用超滤进行，优选切向流过滤，更优选中空纤维超滤。在一些实施例中，使用最大孔隙大小为约0.22μm的灭菌过滤器执行过滤灭菌步骤。在另一个优选的实施例中，最大孔隙大小为0.2μm。
在一些实施例中，在过滤灭菌之前，载体浓度小于或等于约4.6×1011个RNA基因组拷贝/ml制剂。适当的浓度水平可以通过使用例如稀释步骤(如果适当)控制载体浓度来实现。因此，在一些实施例中，在过滤灭菌之前将逆转录病毒载体制剂稀释。
可以通过过滤步骤去除细胞碎片和其它杂质来进行澄清。适合的过滤器可以使用纤维素过滤器、再生纤维素纤维、纤维素纤维与无机过滤助剂(例如硅藻土、珍珠岩、烟雾状二氧化硅)的组合、纤维素过滤器与无机过滤助剂和有机树脂的组合，或其任何组合，以及聚合物过滤器(实例包括(但不限于)：尼龙、聚丙烯、聚醚砜)，以实现有效的去除和可接受的回收。可以使用多阶段方法。示例性的两阶段或三阶段方法由以下组成：用一个或多个粗过滤器以去除大沉淀物和细胞碎片，随后抛光标称孔隙大小大于0.2微米，但小于1微米的一个或多个第二阶段过滤器。最佳组合可以是沉淀物大小分布以及其它变量的函数。此外，采用相对较小孔隙大小过滤器或离心的单阶段操作也可以用于澄清。更一般来说，任何澄清方法可接受地用于本发明的澄清步骤中，包括(但不限于)：死端过滤、微滤、离心，或过滤助剂(例如硅藻土)的主体加料与死端或深度过滤的组合，其在后续步骤中提供适合的澄清度的滤液而不使膜和/或树脂积垢。
在一些实施例中，使用深度过滤和膜过滤。就此而言适用的可商购的产品提及于例如WO 03/097797，第20-21页中。可以使用的膜可以由不同材料构成，可以具有不同的孔隙大小，并且可以组合使用。它们可以购自若干个供应商。在一些实施例中，用于澄清的过滤器在1.2μm到0.22μm的范围内。在一些实施例中，用于澄清的过滤器是1.2/0.45μm过滤器或最小平均孔隙大小为0.22μm的不对称过滤器。
在一些实施例中，所述方法使用核酸酶以降解污染性DNA/RNA(即，主要是宿主细胞核酸)。适用于本发明的示例性核酸酶包括攻击并降解DNA和RNA的所有形式(单链、双链线性或环状)的
Figure BDA0002963542200004401
核酸酶(EP 0229866)，或所属领域内常用于从制剂中排除非所需或污染性DNA和/或RNA的目的任何其它DNA酶和/或RNA酶。在优选实施例中，核酸酶是
Figure BDA0002963542200004411
核酸酶，其通过使特定核苷酸之间的内部磷酸二酯键水解而使核酸快速水解，由此减小多核苷酸在含有载体的上清液中的大小。
Figure BDA0002963542200004412
核酸酶可以购自默克集团(Merck KGaA)(代码W214950)。所用核酸酶的浓度优选在1-100单位/ml的范围内。
在一些实施例中，在所述方法期间，对载体悬浮液进行至少一次超滤(当用于缓冲液交换时，有时称为透滤)，例如用于浓缩载体和/或缓冲液交换。用于浓缩载体的方法可以包括任何过滤方法(例如超滤(UF))，其中通过迫使稀释剂穿过过滤器来增加载体浓度，其方式为使得从载体制剂中去除稀释剂，而载体不能穿过过滤器并由此以浓缩形式保留于载体制剂中。UF详细描述于例如《微滤和超滤：原理和应用(Microfiltration andUltrafiltration：Principles andApplications)》，L.Zeman和A.Zydney(Marcel Dekker有限公司，纽约州纽约市，1996)；以及《超滤手册(Ultrafiltration Handbook)》，MunirCheryan(Technomic出版，1986；ISBN第87762-456-9号)。适合的过滤方法是切向流过滤(“TFF”)，如例如名称为“制药方法过滤目录”第177-202页中所描述的MILLIPORE目录(贝德福(Bedford)，马萨诸塞州(Mass.)，1995/96)。TFF广泛用于生物处理产业中，用于细胞收获、澄清、纯化和产物浓缩，包括病毒。系统是由三个不同的过程流构成：进料溶液、渗透液和截留物。取决于应用，可以使用具有不同孔隙大小的过滤器。在一些实施例中，截留物含有产物(慢病毒载体)。所选择的特定超滤膜可以具有足够小的孔隙大小以截留载体，但足够大以有效地清除杂质。视制造商和膜类型而定，逆转录病毒载体的标称分子量截止值(NMWC)在100kDa与1000kDa之间可以是适当的，例如具有300kDa或500kDa NMWC的膜。膜组合物可以是(但不限于)：再生纤维素、聚醚砜、聚砜或其衍生物。膜可以是平板(也称为平筛)或中空纤维。适合的UF是中空纤维UF，例如，使用孔隙大小小于0.1μm的过滤器过滤。产物通常被截留，同时体积可以通过渗透而减小(或在透滤期间通过以与含有缓冲液和杂质的渗透液在渗透侧去除速度相同的速度添加缓冲液而保持恒定)。
TFF在生物制药行业中使用最广泛的两种几何形状是板框(平筛)和中空纤维模块。尽管现在存在多个供应商，包括Spectrum和通用电气医疗集团(GE Healthcare)，但Amicon和Ramicon在二十世纪七十年代早期开发出用于超滤和微滤的中空纤维单元(Cheryan，M.《超滤手册》)。中空纤维模块是由具有致密表皮层的自支撑纤维阵列组成。纤维直径范围为0.5mm-3mm。在某些实施例中，TFF使用中空纤维。在某些实施例中，使用500kDa(0.05μm)孔隙大小的中空纤维。超滤可以包含透滤(DF)。可以通过以等于UF速率的速率向超滤溶液中添加溶剂来去除微溶质。这在恒定的体积下将微物质从溶液中洗去，从而纯化了所截留的载体。
UF/DF可以用于在纯化过程的不同阶段浓缩和/或缓冲交换载体悬浮液。所述方法可以在色谱或其它纯化步骤之后使用DF步骤交换上清液中的缓冲液，但还可以在色谱之前使用。
在一些实施例中，浓缩来自色谱步骤的洗脱液，并通过超滤-透滤进一步纯化。在这个过程中，载体被交换到配制缓冲液中。可以在过滤灭菌步骤之后浓缩到最终所需浓度。在所述灭菌过滤之后，将灭菌过滤的物质通过无菌UF浓缩以产生批量载体产物。
在实施例中，超滤/透滤可以是切向流透滤、搅拌式细胞透滤和透析。
纯化技术倾向于涉及从细胞环境中分离载体颗粒，并且如果需要的话，进一步纯化载体颗粒。多种色谱方法中的一种或多种可以用于这种纯化。离子交换，尤其是阴离子交换，色谱是适合的方法，并且可以使用其它方法。下面给出一些色谱技术的描述。
离子交换色谱利用的事实是，带电物质(如生物分子和病毒载体)可以可逆地结合到固定相(如膜，要不就堆积在柱中)，所述固定相的表面上已固定有带有相反电荷的基团。有两种类型的离子交换剂。阴离子交换剂是固定相，其具有带正电的基团，因此可以结合带负电的物质。阳离子交换剂具有带负电的基团，因此可以结合带正电的物质。培养基的pH值对这具有影响，因为其可以改变物质的电荷。因此，对于如蛋白质的物质，如果pH值高于pI，那么净电荷将为负，而如果低于pI，那么净电荷将为正。
所结合物质的置换(洗脱)可以通过使用适合的缓冲液来实现。因此，通常增加缓冲液的离子浓度，直到缓冲液离子竞争到固定相上的离子位点而使物质置换为止。替代的洗脱方法是改变缓冲液的pH值，直到物质的净电荷不再有利于保持于固定相为止。一个实例是降低pH值，直到物质带有净正电荷并且不再与阴离子交换剂结合为止。
如果杂质不带电荷，或如果它们带有与所需物质相反符号的电荷，但与离子交换剂符号相同的电荷，那么能够实现一定的纯化。这是因为不带电的物质和带有与离子交换剂相同符号的电荷的物质通常不会结合。所结合的物质不同，则结合的强度随各因素而变，如不同物质上的电荷密度和电荷分布。因此，通过施加离子梯度或pH梯度(连续梯度或一系列步骤)，可以从杂质中分别洗脱出所需的物质。
尺寸排阻色谱是一种根据物质大小将其分离的技术。通常，通过使用填充有明确大小的孔隙的颗粒的柱来执行。对于色谱分离，选择具有适当孔隙大小的颗粒，所述适当是就待分离的混合物中的物质大小而言的。当将混合物作为溶液(或在病毒的情况下为悬浮液)施加到柱上，并且随后用缓冲液洗脱时，最大的颗粒将首先洗脱，因为它们被限制(或不)进入孔隙。较小的颗粒稍后会洗脱，因为它们能够进入孔隙并因此通过柱的路径更长。因此，在考虑使用尺寸排阻色谱纯化病毒载体时，可以预期在较小杂质(如蛋白质)之前先洗脱载体。
如蛋白质的物质在其表面上具有疏水区域，所述区域可以可逆地结合到固定相上的弱疏水位点。在盐浓度相对较高的介质中，这种结合得到促进。通常在HIC中，要纯化的样品在高盐环境中与固定相结合。随后通过应用递减的盐浓度的梯度(连续或一系列步骤)来实现洗脱。常用的盐是硫酸铵。具有不同疏水性水平的物质将倾向于在不同的盐浓度下洗脱，因此可以从杂质中纯化目标物质。其它因素(如洗脱介质的pH值、温度和添加剂，如去污剂、离液盐和有机物)也可以影响物质与HIC固定相结合的强度。可以调节或利用这些因素中的一个或多个来优化产物的洗脱和纯化。
病毒载体在其表面上具有疏水部分，如蛋白质，因此HIC可以潜在地用作纯化手段。
像HIC一样，RPC根据疏水性的不同来分离物质。使用疏水性比HIC中所用的更高的固定相。固定相通常由典型为二氧化硅的材料组成，所述材料上结合了疏水部分，如烷基或苯基。替代地，固定相可以是没有连接基团的有机聚合物。将含有待解析物质混合物的样品在极性相对较高以促进结合的水性介质中施加于固定相。随后通过加入有机溶剂(如异丙醇或乙腈)降低水性介质的极性来实现洗脱。通常，使用增加有机溶剂浓度的梯度(连续或一系列步骤)，并按其各自的疏水性顺序洗脱物质。
其它因素，如洗脱介质的pH值和添加剂的使用，也可以影响物质与RPC固定相结合的强度。可以调节或利用这些因素中的一个或多个来优化产物的洗脱和纯化。常见的添加剂是三氟乙酸(TFA)。这抑制样品中的酸性基团(如羧基部分)的电离。它还降低了洗脱介质中的pH，并且这抑制了可能存在于具有二氧化硅基质的固定相表面上的游离硅烷醇基团的电离。TFA是一类称为离子配对剂的添加剂之一。这些与存在于样品中的物质上的携带相反电荷的离子基团相互作用。相互作用倾向于掩盖电荷，增加了物质的疏水性。阴离子离子配对剂(如TFA和五氟丙酸)与物种上带正电的基团相互作用。阳离子配对剂(如三乙胺)与带负电的基团相互作用。
病毒载体在其表面上具有疏水部分，如蛋白质，因此RPC可以潜在地用作纯化手段。
亲和色谱利用的事实是，可以将与生物分子(如蛋白质或核苷酸)特异性结合的某些配体固定在固定相上。经修饰的固定相随后可以用于从混合物中分离出相关的生物分子。高特异性配体的实例是用于纯化靶抗原的抗体和用于纯化酶的酶抑制剂。也可以利用更一般的相互作用，如使用蛋白A配体来分离广泛范围的抗体。
通常，亲和色谱是通过将含有所关注物质的混合物施加到附着有相关配体的固定相上来进行。在适当的条件下，这将引起物质与固定相的结合。随后在施加洗脱介质之前将未结合的组分洗掉。选择洗脱介质以破坏配体与靶物质的结合。通常通过选择适当的离子强度、pH或使用与靶物质竞争配体位点的物质来实现。对于某些所结合的物质，使用离液剂(如尿素)来实现对配体的置换。但是，这可以导致物质的不可逆变性。
病毒载体在其表面上具有如蛋白质的部分，这些部分可能能够与适当的配体特异性结合。这意味着亲和色谱可以潜在地用于其分离。
生物分子，如蛋白质，在其表面上可以具有可以与金属离子形成配位键的给电子部分。这可以促进它们与载有固定金属离子(如Ni2+、Cu2+、Zn2+或Fe3+)的固定相结合。IMAC中使用的固定相具有螯合剂，通常是共价附着在其表面的次氮基乙酸或亚氨基二乙酸，并且是螯合剂固持了金属离子。螯合的金属离子必须有至少一个配位位点可用于与生物分子形成配位键。在生物分子的表面上潜在地存在可能能够与固定的金属离子结合的若干部分。这些包括组氨酸、色氨酸和半胱氨酸残基以及磷酸酯基团。但是，对于蛋白质而言，主要的供体似乎是组氨酸残基的咪唑基。如果原生蛋白在其表面上呈现了适合的供体部分，那么可以使用IMAC对其进行分离。否则，IMAC可以用于分离带有几个连接的组氨酸残基链的重组蛋白。
通常，通过将包含所关注物质的混合物施加于固定相来执行IMAC。在适当的条件下，这将引起物质与固定相的配位键结。随后在施加洗脱介质之前将未结合的组分洗掉。对于洗脱，可以使用递增的盐浓度或递减的pH的梯度(连续的或一系列步骤)。同样常用的程序是应用递增的咪唑浓度的梯度。具有不同供体特性的生物分子，例如在不同环境中具有组氨酸残基的生物分子，能够通过使用梯度洗脱来分离。
病毒载体在其表面上具有能与IMAC固定相结合的部分(如蛋白质)。这意味着IMAC可以潜在地在其分离时使用。
适合的离心技术包括区带离心、等密度超离心和沉淀离心。
过滤器灭菌适用于制药级材料的过程。过滤器灭菌使所得配制物基本上不含污染物。过滤器灭菌后的污染物水平应使得配制物适用于临床使用。过滤器灭菌步骤之后的进一步浓缩(例如通过超滤)可以在无菌条件下进行。在一些实施例中，无菌过滤器的最大孔隙大小为0.22μm。
还可以使用流过式超离心和高速离心以及切向流过滤，对本文的逆转录病毒载体进行浓缩和纯化慢病毒载体的方法。流过式超离心可以用于纯化RNA肿瘤病毒(Toplin等人，《应用微生物学(Applied Microbiology)》15：582-589，1967；Burger等人，《国家癌症研究所杂志(Journal ofthe National Cancer Institute)》45：499-503，1970)。流过式超离心可以用于纯化慢病毒载体。这种方法可以包含以下一个或多个步骤。举例来说，可以使用细胞工厂或生物反应器系统从细胞产生慢病毒载体。可以使用瞬时转染系统，或也可以类似地使用封装或生产细胞系。如果需要，在材料加载到超离心机之前，可以使用预澄清步骤。流过式超离心可以使用连续流或分批沉降进行。用于沉降的材料是例如氯化铯、酒石酸钾和溴化钾，尽管它们都是腐蚀性的，但它们产生的密度高并且粘度低。CsCl经常用于工艺开发，由于可以产生宽的密度梯度(1.0至1.9g/cm3)，因此可以实现高纯度。溴化钾可以在高密度下使用，例如在升高的温度(例如25℃)下使用，这可能与某些蛋白质的稳定性不兼容。蔗糖由于价格便宜、无毒并且可以形成适用于分离大多数蛋白质、亚细胞洗脱份和全细胞的梯度而被广泛使用。通常，最大密度为约1.3g/cm3。蔗糖的渗透势可以对细胞有毒，在这种情况下，可以使用复杂的梯度材料，例如Nycodenz。梯度可以与梯度中的1个或多个步骤一起使用。一个实施例是使用逐步蔗糖梯度。材料的体积可以是每次操作0.5升到超过200升。流速可以是每小时5升到超过25升。适合的操作速度在25,000rpm到40,500rpm之间，从而产生高达122,000×g的力。转子可以所需的体积分率静态卸载。一个实施例是以100ml分率卸载所离心的材料。含有纯化和浓缩的慢病毒载体的分离洗脱份随后可以在所需缓冲液中使用凝胶过滤或尺寸排阻色谱来交换。阴离子或阳离子交换色谱也可以用作缓冲液交换或进一步纯化的替代或附加方法。另外，如果需要，切向流过滤也可以用于缓冲液交换和最终配制。切向流过滤(TFF)也可以用作超速离心或高速离心的替代步骤，其中将执行两步TFF程序。第一步将减少载体上清液的体积，而第二步将用于缓冲液交换、最终配制和材料的部分进一步浓缩。TFF膜的膜大小可以在100与500千道尔顿之间，其中第一TFF步骤的膜大小可以是500千道尔顿，而第二TFF膜的膜大小可以在300到500千道尔顿之间。最终缓冲液应含有允许载体为了长期存储而存储的材料。
在实施例中，所述方法使用含有附着细胞的细胞工厂，或含有悬浮细胞的生物反应器，所述悬浮细胞用载体和辅助构建体转染或转导以产生慢病毒载体。非限制性实例或生物反应器包括Wave生物反应器系统和Xcellerex生物反应器。两者都是一次性系统。但是，也可以使用非一次性系统。构建体可以是本文所描述的构建体，以及其它慢病毒转导载体。替代地，可以对细胞系进行工程改造以产生慢病毒载体，而无需转导或转染。转染后，可以收获慢病毒载体并且过滤以去除颗粒，随后使用连续流高速离心或超离心进行离心。一个优选的实施例是使用高速连续流装置，如JCF-A带状和连续流转子联合高速离心机。还优选将ContifugeStratus离心机用于中等规模的慢病毒载体生产。还适合的是离心速度大于5,000×g RCF并且小于26,000×g RCF的任何连续流离心机。优选地，连续流离心力为约10,500×g到23,500×gRCF，旋转时间在20小时与4小时之间，其中较长的离心时间联合较慢的离心力使用。慢病毒载体可以在较致密材料(非限制性实例是蔗糖，但其它试剂可以用于形成缓冲垫，并且这些试剂在所属领域中是众所周知的)的缓冲垫上离心，使得慢病毒载体不形成无法过滤的聚集体，因为载体直接离心有时会导致病毒载体沉淀。在缓冲垫上进行的连续流离心允许载体避免形成较大聚集体，而且允许载体从产生慢病毒载体的大体积的转染材料中浓缩到高水平。另外，第二个不太致密的蔗糖层可以用于结合慢病毒载体制剂。连续流离心机的流动速率可以在每分钟1ml与100ml之间，但是也可以使用更高和更低的流动速率。调节流动速率以使载体有足够的时间进入离心机的核心，而不会由于高流动速率而损失大量载体。如果需要更高的流动速率，那么可以将从连续流式离心机中流出的物料进行再循环，并再次通过离心机。使用连续流离心浓缩病毒后，可以使用切向流过滤(TFF)来进一步浓缩载体，或者可以将TFF系统简单地用于缓冲液交换。TFF系统的非限制性实例是通用电气医疗集团生产的Xampler滤芯系统。优选的滤芯是MW截止值为500,000MW或更低的那些。优选地，使用MW截止值为300,000MW的滤芯。也可以使用100,000MW截止值的滤芯。体积越大，则可以使用越大的滤芯，并且在最终填充载体制剂之前，所属领域的技术人员容易为这种最终缓冲液交换和/或浓缩步骤找到合适的TFF系统。最终填充制剂可以包含稳定载体的因子，通常使用糖并且是所属领域已知的。
蛋白质含量
在一些实施例中，逆转录病毒颗粒包括各种源细胞基因组来源的蛋白质、外源蛋白质和病毒基因组来源的蛋白质。在一些实施例中，逆转录病毒颗粒所含的源细胞基因组来源的蛋白质相与病毒基因组来源的蛋白质、源细胞基因组来源的蛋白质与外源蛋白质以及外源蛋白质与病毒基因组来源的蛋白质的比率不同。
在一些实施例中，病毒基因组来源的蛋白质是GAG多聚蛋白前体、HIV-1整合酶、POL多聚蛋白前体、衣壳、核衣壳、p17基质、p6、p2、VPR、Vif。
在一些实施例中，源细胞来源的蛋白质是亲环素A、热休克70kD、人类延伸因子-1α(EF-1R)、组蛋白H1、H2A、H3、H4、β-血球蛋白、胰蛋白酶前体、细小蛋白、甘油醛-3-磷酸酯脱氢酶、Lck、泛素、SUMO-1、CD48、同线蛋白-1、核仁磷酸蛋白、异源核核糖核蛋白C1/C2、核仁素、可能的ATP依赖性解螺旋酶DDX48、基质蛋白-3、移行的ERATP酶、GTP结合的核蛋白Ran、异源核核糖核蛋白U、介白素增强子结合因子2、含有非POU域的八聚体结合蛋白、RuvB样2、HSP 90-b、HSP 90-a、延伸因子2、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶、a-烯醇酶、C-1-四氢叶酸合成酶、细胞质、丙酮酸激酶、同功酶M1/M2、泛素活化酶E1、26S蛋白酶调节亚单元S10B、60S酸性核糖体蛋白质P2、60S酸性核糖体蛋白质P0、40S核糖体蛋白质SA、40S核糖体蛋白质S2、40S核糖体蛋白质S3、60S核糖体蛋白质L4、60S核糖体蛋白质L3、40S核糖体蛋白质S3a、40S核糖体蛋白质S7、60S核糖体蛋白质L7a、60S酸性核糖体蛋白质L31、60S核糖体蛋白质L10a、60S核糖体蛋白质L6、26S蛋白酶体非ATP酶调节单元1、微管蛋白b-2链、肌动蛋白、胞浆1、肌动蛋白、主动脉平滑肌、微管蛋白a-广泛链、网格蛋白重链1、组蛋白H2B.b、组蛋白H4、组蛋白H3.1、组蛋白H3.3、组蛋白H2A 8型、26S蛋白酶调节亚单元6A、泛素-4、RuvB样1、26S蛋白酶调节亚单元7、亮氨酰基-tRNA合成酶、胞浆、60S核糖体蛋白质L19、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚单元13、组蛋白H2B.F、U5小核核糖核蛋白200kDa解螺旋酶、聚[ADP-核糖]聚合酶-1、ATP依赖性DNA解螺旋酶II、DNA复制许可因子MCM5、核酸酶敏感元件结合蛋白1、ATP依赖性RNA解螺旋酶A、介白素增强子结合因子3、转录延伸因子B多肽1、加工前mRNA的剪接因子8、含有葡萄球菌核酸酶域的蛋白质1、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、RNA聚合酶II转录亚单元8同源物的介体、核仁RNA解螺旋酶II、内质网素、DnaJ同源物亚家族A成员1、热休克70kDa蛋白质1L、T-复合蛋白1e亚单元、GCN1样蛋白质1、血清铁传递蛋白、果糖二磷酸醛缩酶A、肌苷-5′单磷酸脱氢酶2、26S蛋白酶调节亚单元6B、脂肪酸合成酶、DNA依赖性蛋白激酶催化亚单元、40S核糖体蛋白质S17、60S核糖体蛋白质L7、60S核糖体蛋白质L12、60S核糖体蛋白质L9、40S核糖体蛋白质S8、40S核糖体蛋白质S4 X同功异型物、60S核糖体蛋白质L11、26S蛋白酶体非ATP酶调节亚单元2、外被体a亚单元、组蛋白H2A.z、组蛋白H1.2、胞质动力蛋白重链。参见：Saphire等人，《蛋白质组研究杂志(Journal of Proteome Research)》，2005以及Wheeler等人，《蛋白质组学临床应用(Proteomics Clinical Applications)》，2007。
在一些实施例中，逆转录病毒载体是聚乙二醇化的。
粒度
在一些实施例中，逆转录病毒载体的中值直径在10nm与1000nM、25nm与500nm、40nm与300nm、50nm与250nm、60nm与225nm、70nm与200nm之、80nm与175nm或90nm与150nm之间。
在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的50％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的25％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的20％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的15％以内。在一些实施例中，90％的逆转录病毒载体落入逆转录病毒的中值直径的10％以内。
适应症和用途
本文所描述的融合剂脂质体、逆转录病毒载体、VLP或药物组合物可以施用个体，例如哺乳动物，例如人类。在此类实施例中，个体可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。在一些实施例中，疾病为基因缺陷，例如表5中所列的基因缺陷。在一些实施例中，融合剂脂质体，例如逆转录病毒载体或颗粒，含有编码用于治疗个体的疾病或病状的外源药剂的核酸序列。举例来说，外源药剂为对基因缺陷(例如表5中所列的基因缺陷)具有特异性或可以用于治疗所述基因缺陷的药剂，并且向个体施用融合剂脂质体以治疗个体的基因缺陷。
因此，还提供了施用和使用(如治疗性和预防性使用)所提供的融合剂脂质体(包括所提供的逆转录病毒载体和颗粒，如慢病毒载体和颗粒)和/或包含其的组合物的方法。此类方法和用途包括治疗方法和用途，例如涉及将融合剂脂质体(包括逆转录病毒载体或颗粒，如慢病毒载体或颗粒)或含有其的组合物向患有疾病、病状或病症的个体施用以便递送外源药剂治疗所述疾病、病状或病症。在一些实施例中，融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或颗粒，如慢病毒载体或颗粒)是以实现所述疾病、病状或病症治疗的有效量或剂量施用。本文提供了所提供的任一种融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或颗粒，如慢病毒载体或颗粒)用于此类方法和治疗中以及用于制备药剂以便执行此类治疗方法的用途。在一些实施例中，通过将融合剂脂质体(例如逆转录病毒载体或颗粒，如慢病毒载体或颗粒)或包含其的组合物向患有、已患或怀疑患有所述疾病或病状或病症的个体施用来执行所述方法。在一些实施例中，所述方法借此治疗个体的疾病或病状或病症。本文还提供了任一种所述组合物(如本文所提供的药物组合物)用于治疗疾病、病状或病症的用途，所述疾病、病状或病症与外源药剂所靶向或所提供的特定基因或蛋白质有关。
来自哺乳动物(例如人类)组织的靶细胞包括来自上皮、结缔组织、肌肉或神经组织或细胞，以及其组合的细胞。靶哺乳动物(例如人类)细胞和器官系统包括心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、垂体腺、松果体或松果体腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；外皮系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、横隔膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。在一些实施例中、非靶细胞或器官系统是选自心血管系统(心脏、血管系统)；消化系统(食道、胃、肝脏、胆囊、胰、肠、结肠、直肠和肛门)；内分泌系统(下丘脑、垂体腺、松果体或松果体腺、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺)；排泄系统(肾脏、输尿管、膀胱)；淋巴系统(淋巴、淋巴结、淋巴管、扁桃体、腺样体、胸腺、脾脏)；外皮系统(皮肤、毛发、指甲)；肌肉系统(例如骨骼肌)；神经系统(脑、脊髓、神经)；生殖系统(卵巢、子宫、乳腺、睾丸、输精管、精囊、前列腺)；呼吸系统(咽、喉、气管、支气管、肺、横膈膜)；骨骼系统(骨骼、软骨)和其组合。
本文所描述的药物组合物的施用可以通过口服、吸入、经皮或非经肠(包括静脉内、瘤内、腹膜内、肌肉内、腔内和皮下)施用。融合剂脂质体可以单独施用或被配制成药物组合物。
在实施例中，融合剂脂质体组合物介导对靶细胞的作用，并且所述作用持续至少1、2、3、4、5、6或7天；2、3或4周；或1、2、3、6或12个月。在一些实施例中(例如其中融合剂脂质体组合物包含外源蛋白)，所述作用持续小于1、2、3、4、5、6或7天；2、3或4周；或1、2、3、6或12个月。
在实施例中，将本文所描述的融合剂脂质体组合物离体递送到细胞或组织，例如人类细胞或组织。
可以向个体，例如哺乳动物，例如人类施用本文所描述的融合剂脂质体组合物。在此类实施例中，个体可能处于特定疾病或病状(例如本文所描述的疾病或病状)的风险中，可能具有所述疾病或病状的症状，或可能被诊断患有或鉴别患有所述疾病或病状。
在一些实施例中，融合剂脂质体的来源来自施用了融合剂脂质体组合物的同一个体。在其它实施例中，其为不同的。举例来说，融合剂脂质体和接受者组织的来源可以为自体的(来自同一个体)或异源的(来自不同个体)。在任一情况下，本文所描述的融合剂脂质体组合物的供体组织可以是与接受者组织不同的组织类型。例如，供体组织可以是肌肉组织，而接受者组织可以是结缔组织(例如脂肪组织)。在其它实施例中，供体组织和接受者组织可以是相同或不同的类型，但是来自不同器官系统。
在一些实施例中，融合剂脂质体与抑制膜融合的蛋白质的抑制剂共同施用。举例来说，抑制素(Suppressyn)为抑制细胞-细胞融合的人类蛋白质(Sugimoto等人，“抑制细胞-细胞融合的新颖人类内源性逆转录病毒蛋白(A novel human endogenous retroviralprotein inhibits cell-cell fusion)”《科学报告(Scientific Reports)》3：1462DOI：10.1038/srep01462)。因此，在一些实施例中，融合剂脂质体与抑制素的抑制剂，例如siRNA或抑制抗体共同施用。
本文所描述的组合物还可以用于类似地调节包括但不限于以下的多种其它生物体的细胞或组织功能或生理技能：农场或役用动物(马、牛、猪、鸡等)、宠物或动物园动物(猫、狗、蜥蜴、鸟类、狮子、老虎和熊等)、水产养殖动物(鱼、蟹、虾、牡蛎等)、植物物种(树木、农作物、观赏花卉等)、发酵物种(酵母等)。本文所描述的融合剂脂质体组合物可以由此类非人类来源制成并且向非人类靶细胞或组织或个体施用。
融合剂脂质体组合物对靶标来说可以是自体的、同种异体的或异种的。
其它治疗剂
在一些实施例中，将融合剂脂质体组合物与其它药剂(例如治疗剂)共同施用于个体，例如接受者，例如本文所描述的接受者。在一些实施例中，共同施用的治疗剂是免疫抑制剂，例如糖皮质激素(例如地塞米松)、细胞生长抑制剂(例如甲氨蝶呤)、抗体(例如莫罗单抗-CD3)或免疫亲和素调节剂(例如环孢菌素或雷帕霉素)。在实施例中，免疫抑制剂减少了免疫介导的融合剂脂质体清除。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物与免疫刺激剂，例如佐剂、白介素、细胞因子或趋化因子共同施用。
在一些实施例中，在相同时间施用，例如同时施用融合剂脂质体组合物和免疫抑制剂。在一些实施例中，在施用免疫抑制剂之前施用融合剂脂质体组合物。在一些实施例中，在施用免疫抑制剂之后施用融合剂脂质体组合物。
在一些实施例中，免疫抑制剂是小分子，如布洛芬(ibuprofen)、乙酰胺苯酚(acetaminophen)、环孢灵(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、雷帕霉素、霉酚酸酯(mycophenolate)、环磷酰胺、糖皮质激素、西罗莫司(sirolimus)、硫唑嘌呤(azathriopine)或甲氨蝶呤。
在一些实施例中，免疫抑制剂为抗体分子，包括(但不限于)：莫罗诺单抗(muronomab)(抗CD3)、达利珠单抗(Daclizumab)(抗IL12)、巴利昔单抗(Basiliximab)、英利昔单抗(Infliximab)(抗TNFa)或利妥昔单抗(rituximab)(抗CD20)。
在一些实施例中，相比于融合剂脂质体组合物的单独施用，融合剂脂质体组合物与免疫抑制剂的共同施用使得融合剂脂质体组合物在个体中的持久性增强。在一些实施例中，相比于单独施用时融合剂脂质体组合物的持久性，共同施用的融合剂脂质体组合物的持久性增强至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更长。在一些实施例中，相比于单独施用融合剂脂质体组合物时的生存期，共同施用的融合剂脂质体组合物的持久性增强至少1、2、3、4、5、6、7、10、15、20、25或30天或更久。
在一些实施例中，融合剂脂质体组合物与基因疗法(例如向所关注的组织递送所关注的转基因的基因疗法)组合使用。在一些实施例中，所关注的组织为肝脏。在一些实施例中，所关注的组织不是肝脏。在一些实施例中，融合剂脂质体组合物靶向相同的所关注的转基因以用于肝脏中的表达。不希望被理论所束缚，在肝细胞中表达所关注的转基因可以促进对转基因具有特异性的调节T细胞的系统诱导，从而实现对转基因的免疫耐受性。
实例
提出以下实例以帮助理解本发明，但不希望并且不应解释为以任何方式限制其范围。
实例1.分析非靶细胞以检测逆转录病毒核酸递送的特异性
这个实例描述了通过测量单一细胞的载体拷贝数来定量非靶接受者细胞中的核酸。
在一个实施例中，已处理的小鼠的非靶细胞中的载体拷贝数与未经处理小鼠的那些细胞中的载体拷贝数类似，例如无载体或载体数目类似于阴性对照水平。在一个实施例中，已处理的小鼠的含有载体的非靶细胞的百分比与未经处理小鼠的那些细胞的百分比类似，例如无细胞或细胞数量类似于阴性对照水平。
在这个实例中，非靶接受者细胞是CD11c+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
用如本文所描述产生的逆转录病毒载体或用PBS(阴性对照物)处理小鼠。在处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend目录号：420201)中用Fc阻断(Biolegend目录号：101319)10分钟之后，在4℃下、在黑暗中用鼠类CD11c：APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：117323)或同型对照APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：400230)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次后，在FACSAria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞(San Jose，CA.))上通过运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)加以分析，激光激发为640nm并且在780-/+60nm收集发射，使用同型对照APC-Cy7抗体标记的细胞设定负门。将APC-Cy7阳性细胞分选到培养盘的单一孔中用于载体拷贝数分析。
使用单一细胞嵌套式PCR评估载体拷贝数。使用对载体和内源对照基因具有特异性的引物和探针，通过qPCR进行PCR。通过将载体qPCR信号的量除以内源对照基因qPCR信号的量来确定载体拷贝数。接受载体的细胞的载体拷贝数至少为1.0。通过求取多个细胞的载体拷贝数的平均值来评估整个群体的载体拷贝数。
在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的非靶细胞中的平均载体拷贝数与经媒剂处理的小鼠的平均载体拷贝数类似。在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的接受载体的非靶细胞的百分比与经媒剂处理的小鼠的那些细胞的百分比类似。
实例2.分析非靶细胞以检测外源蛋白药剂递送的特异性
这个实例描述了根据单一细胞中的外源药剂表达来定量非靶接受者细胞中的外源药剂表达。
在一个实施例中，经处理的小鼠的非靶细胞中的外源药剂表达与未经处理的小鼠的那些非靶细胞的表达类似。在一个实施例中，经处理小鼠的表达外源药剂的非靶细胞的百分比与未处理小鼠的那些非靶细胞的百分比类似。
在这个实例中，非靶接受者细胞是CD11c+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。在这个实例中，外源药剂是荧光蛋白并且通过流式细胞测量术测量表达。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过蛋白质的免疫染色来测量。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过显微镜或蛋白质印迹测量。
小鼠用通过本申请所描述的任一种方法产生的具有tdtomato荧光蛋白药剂的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照物)处理。在处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend目录号：420201)中用Fc阻断(Biolegend目录号：101319)10分钟之后，在4℃下、在黑暗中用鼠类CD11c：APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：117323)或同型对照APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：400230)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次之后，在运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上加以分析。使用同型对照APC-Cy7抗体标记的细胞设定CD11c的负门，激光激发640nm并且在780-/+60收集发射。使用从经媒剂处理的小鼠分离的细胞设定tdtomato表达的负门，激光激发552nm并且在585-/+42nm收集发射。
测量呈tdtomato阳性的CD11c+细胞的百分比。在一些实施例中，在来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的细胞中，呈tdtomato阳性的CD11c+细胞的百分比类似。测量CD11c+细胞的中值tdtomato荧光水平。在一些实施例中，在来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的细胞中，CD11c+细胞的中值tdtomato荧光水平类似。
实例3.分析靶细胞以检测逆转录病毒核酸递送的特异性
这个实例描述了通过测量单一细胞的载体拷贝数来定量靶接受者细胞中的核酸。
在一个实施例中，经处理的小鼠的靶细胞的载体拷贝数大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的载体拷贝数。在一个实施例中，经处理的小鼠的含有载体的靶细胞的百分比大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
小鼠经逆转录病毒载体处理并且如上文在实例1中所描述的收集血液样品。使用上文在实例1中所描述的方案，用鼠类CD3：APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：100330)或同型对照物将细胞染色。使用单一细胞嵌套式PCR，如实例1中所描述评估载体拷贝数。
在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的靶细胞中的平均载体拷贝数大于经媒剂处理的小鼠的那些靶细胞中的平均载体拷贝数。在一些实施例中，经逆转录病毒载体处理的小鼠的接受载体的靶细胞的百分比大于经媒剂处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
实例4.分析靶细胞以检测外源蛋白质药剂递送的特异性
这个实例描述了根据外源蛋白质药剂在单一细胞中的表达来定量外源蛋白质药剂在靶接受者细胞中的表达。
在一个实施例中，经处理的小鼠的靶细胞中的外源蛋白质药剂表达大于未经处理的小鼠的那些靶细胞中的外源蛋白质药剂表达。在一个实施例中，经处理的小鼠的表达外源蛋白质药剂的靶细胞的百分比大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。在这个实例中，外源药剂是荧光蛋白并且通过流式细胞测量术测量表达。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过蛋白质的免疫染色来测量。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过显微镜或蛋白质印迹测量。
小鼠经逆转录病毒载体处理并且如上文在实例2中所描述的收集血液样品。细胞用鼠类CD3：APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：100330)或同型对照物染色并且使用实例2中所描述的方案，通过流式细胞测量术加以分析。
测量呈tdtomato阳性的CD3+细胞的百分比。在一些实施例中，经处理小鼠的细胞中的呈tdtomato阳性的CD3+细胞的百分比大于未经处理的小鼠。测量CD3+细胞的中值tdtomato荧光水平。在一些实施例中，经处理小鼠的细胞中的CD3+细胞的中值tdtomato荧光水平大于未经处理的小鼠。
实例5.用HLA-G或HLA-E修饰逆转录病毒载体以降低PBMC细胞溶解介导的细胞毒 性
这个实例描述了来源于经修饰以使由于周边血液单核细胞(PBMC)引起的细胞溶解而导致的细胞毒性减少的细胞的逆转录病毒载体。
在一个实施例中，细胞毒性介导的PBMC对逆转录病毒载体的细胞溶解是逆转录病毒载体的免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
逆转录病毒载体是由以下产生：未修饰的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC空白载体，阴性对照)。
PMBC介导的逆转录病毒载体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学(Hum.Immunol.)》35(2)：85-92；1992以及van Besouw等人，《移植(Transplantation)》70(1)：136-143；2000。从适当供体中分离出PBMC(下文称为效应细胞)，并且在37℃下在圆底96孔盘中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素(proleukin)，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹(Amsterdam，The Netherlands))刺激7天。用二亚乙基三胺五乙酸铕(DTPA)(西格玛(sigma)，美国密苏里州圣路易斯)标记逆转录病毒载体。
在第7天，在以1000∶1-1∶1和1∶1.25-1∶1000范围内的效应子/靶标比率接种之后，通过将63Eu标记的逆转录病毒载体与效应细胞一起在96孔盘中培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24或48小时来进行细胞毒性介导的溶解分析。在培育后，将培养盘离心并且将上清液样品转移到具有低背景荧光的96孔盘(荧光免疫盘，Nunc，丹麦罗斯基勒(Roskilde，Denmark))。
随后，将增强溶液(珀金埃尔默仪器有限公司(PerkinElmer)，荷兰格罗宁根(Groningen，The Netherlands))添加到每个孔。用时间分辨荧光计(Victor 1420多标记计数器，芬兰LKB-Wallac)测量所释放的铕。荧光以每秒计数(CPS)表示。通过将适当数量(1×102-1×108)的逆转录病毒载体与1％曲通(triton)(西格玛-奥德里奇(sigma-aldrich))培育适当的时间来测定靶逆转录病毒载体释放郁的最大百分比。通过在没有效应细胞的情况下培育经标记的靶逆转录病毒载体来测量靶逆转录病毒载体自发释放的铕。随后按照：(自发释放/最大释放)×100％来计算渗漏百分比。细胞毒性介导的溶解百分比如下计算：溶解％＝[(测量的溶解-自发溶解-自发释放)/(最大释放-自发释放)]×100％。通过观察溶解百分比与不同效应子靶标比率的关系来分析数据。
在一个实施例中，相比于NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空白载体，NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体在特定时间点被靶细胞溶解的百分比减小。
实例6.用HLA-G或HLA-E修饰逆转录病毒载体以降低NK裂解活性
这个实例描述了来源于经修饰的细胞源的逆转录病毒载体组合物的产生，所述细胞源经修饰以使细胞毒性介导的NK细胞的细胞溶解减少。在一个实施例中，细胞毒性介导的NK细胞对逆转录病毒载体的细胞溶解是逆转录病毒载体的免疫原性的量度。
逆转录病毒载体是由以下产生：未修饰的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC空白载体，阴性对照)。
NK细胞介导的逆转录病毒载体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学》35(2)：85-92；1992以及van Besouw等人，《移植》70(1)：136-143；2000。根据Crop等人《细胞移植(Cell transplantation)》(20)：1547-1559；2011中的方法从适当供体分离出NK细胞(下文称为效应细胞)，并且在37℃下在圆底96孔盘中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mLIL-2(阿地介白素，ChironBV，荷兰阿姆斯特丹)刺激7天。用二亚乙基三胺五乙酸铕(DTPA)(西格玛，美国密苏里州圣路易斯)标记逆转录病毒载体。如上文在实例5中所描述来进行细胞毒性介导的溶解分析和数据分析。
在一个实施例中，相比于NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空白载体，NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体在特定时间点被靶细胞溶解的百分比减小。
实例7.用HLA-G或HLA-E修饰逆转录病毒载体以使CD8杀手T细胞溶解减少
这个实例描述了来源于经修饰的细胞源的逆转录病毒载体组合物的产生，所述细胞源经修饰以使细胞毒性介导的CD8+T细胞的细胞裂解减少。在一个实施例中，细胞毒性介导的CD8+T细胞对逆转录病毒载体的细胞溶解是逆转录病毒载体的免疫原性的量度。
逆转录病毒载体是由以下产生：未修饰的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC空白载体，阴性对照)。
CD8+T细胞介导的逆转录病毒载体溶解是通过如以下文献中所描述的铕释放分析来测定：Bouma等人《人类免疫学》35(2)：85-92；1992以及van Besouw等人，《移植》70(1)：136-143；2000。根据Crop等人《细胞移植》(20)：1547-1559；2011中的方法从适当供体分离出CD8+T细胞(下文称为效应细胞)，并且在37℃下在圆底96孔盘中用γ照射的同种异体PMBC和200IU/mL IL-2(阿地介白素，Chiron BV，荷兰阿姆斯特丹)刺激7天。用二亚乙基三胺五乙酸铕(DTPA)(西格玛，美国密苏里州圣路易斯)标记逆转录病毒载体。如上文在实例5中所描述来进行细胞毒性介导的溶解分析和数据分析。
在一个实施例中，相比于NMC产生的逆转录病毒载体或NMC空白载体，NMC-HLA-G细胞产生的逆转录病毒载体在特定时间点被靶细胞溶解的百分比减小。
实例8：用CD47修饰逆转录病毒载体以规避巨噬细胞吞噬
这个实例描述了经修饰的逆转录病毒载体规避吞噬的定量。在一个实施例中，经修饰的逆转录病毒载体将规避巨噬细胞的吞噬。
细胞参与吞噬，吞噬颗粒，从而能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。在一些实施例中，慢病毒载体被巨噬细胞吞噬会使其活性减小。在一些实施例中，慢病毒载体的吞噬是逆转录病毒载体的免疫原性的量度。
逆转录病毒载体是由以下细胞产生：缺乏CD47的细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经CD47 cDNA转染的细胞(下文称为NMC-CD47)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC-空白载体，阴性对照)。产生逆转录病毒载体之前，用CSFE标记细胞。
根据以下方案，通过吞噬分析来测定巨噬细胞介导的免疫清除的减少。将巨噬细胞在收获后立即接种于共聚焦玻璃底培养皿中。在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育巨噬细胞1小时以附着。如方案所指示将由NMC、NMC-CD47、NMC-空白载体产生的适当数目个逆转录病毒载体添加到巨噬细胞中，并培育2小时，tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf。
2小时后，轻轻地洗涤培养皿并检查细胞内荧光。通过共聚焦显微镜在488激发下对被吞噬的逆转录病毒颗粒所发出的细胞内荧光进行成像。使用成像软件对吞噬阳性巨噬细胞的数目进行定量。数据被表示为吞噬指数＝(吞噬细胞的总数/计数的巨噬细胞的总数)×(含有吞噬细胞的巨噬细胞的数目/计数的巨噬细胞的总数)×100。
在一个实施例中，当巨噬细胞与来源于NMC-CD47的逆转录病毒载体一起培育时，吞噬指数相对于来源于NMC或NMC-空白载体的那些逆转录病毒载体将减小。
实例9：用补体调节蛋白修饰逆转录病毒载体以规避补体
这个实例描述了使用体外分析定量针对逆转录病毒载体的补体活性。在一些实施例中，本文所描述的经修饰的逆转录病毒载体的补体活性相比于未经修饰的逆转录病毒载体减小。
在这个实例中，评估小鼠血清针对逆转录病毒载体的补体活性。所述实例测量补体C3a的水平，其是所有补体途径的中心节点。通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
在这个实例中，逆转录病毒载体是由以下细胞产生：经编码补体调节蛋白DAF的cDNA转染的HEK293细胞(HEK293-DAF逆转录病毒载体)或不表达互补调节蛋白的HEK 293细胞(HEK293逆转录病毒载体)。在其它实施例中，可以使用其它补体调节蛋白，如结合加速衰减因子的蛋白质(DAF，CD55)，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如凸出蛋白(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质。
从未经处理的小鼠、施用HEK293-DAF逆转录病毒载体的小鼠或施用HEK293逆转录病毒载体的小鼠回收血清。通过收集新鲜全血并使其完全凝结数小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
以使靶细胞群中的50％细胞接受逆转录病毒载体中的外源药剂的剂量测试不同逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可以含有本文所描述的外源药剂中的任一种。本文还描述了用于分析逆转录病毒将外源药剂递送到接受者细胞的许多方法。在这个特定实例中，外源药剂是Cre蛋白(由逆转录病毒核酸编码)并且靶细胞是RPMI8226细胞，所述细胞在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，通过Cre重组后，从GFP表达切换为RFP表达，作为递送的标志。50％的接受者细胞呈RFP阳性时所鉴别的剂量用于进一步实验。在一些实施例中，在所有逆转录病毒载体中，50％的接受者细胞接受外源药剂时所鉴别的剂量是类似的。
将逆转录病毒载体在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中的两倍稀释液(从50％靶细胞接受外源药剂时的逆转录病毒载体的剂量开始)与经相同逆转录病毒载体处理的小鼠或未处理小鼠的血清的1∶10稀释液(分析体积，20μl)混合并在37℃下培育1小时。将样品进一步以1∶500稀释并用于对C3a具有特异性的酶联免疫吸附分析(ELISA)。ELISA为由LifeSpan生物科学公司出售的小鼠补体C3a ELISA试剂盒产品LS-F4210，其测量样品中的C3a的浓度。在从小鼠分离的所有血清当中，比较存在200pg/ml C3a时的逆转录病毒载体的剂量。
在一些实施例中，对于与HEK-293DAF小鼠血清一起培育的HEK293-DAF逆转录病毒载体来说，存在200pg/ml C3a时的逆转录病毒载体的剂量将大于与HEK293小鼠血清一起培育的HEK293逆转录病毒载体，表明经HEK293逆转录病毒载体处理的小鼠中的靶向逆转录病毒载体的补体活性大于HEK293-DAF逆转录病毒载体。在一些实施例中，对于与未经处理小鼠血清一起培育的HEK293-DAF逆转录病毒载体来说，存在200pg/ml C3a时的逆转录病毒载体的剂量将大于与未经处理小鼠血清一起培育的HEK293逆转录病毒载体，表明经HEK293逆转录病毒载体处理的小鼠中的靶向逆转录病毒载体的补体活性大于HEK293-DAF逆转录病毒载体。
实例10：修饰逆转录病毒载体以敲低免疫原性蛋白质，从而减少免疫原性
这个实例描述了来源于经修饰以减少免疫原性分子表达的细胞源的逆转录病毒载体组合物的产生，和所减少的表达的定量。在一个实施例中，逆转录病毒载体可以来源于经修饰以减少免疫原性分子表达的细胞源。
刺激免疫应答的疗法可以降低治疗功效或对接受者产生毒性。因此，免疫原性是安全并且有效的治疗性逆转录病毒载体的重要特性。某些免疫活化剂的表达可以产生免疫应答。MHC I类代表免疫活化剂的一个实例。
逆转录病毒载体是由以下细胞产生：正常表达MHC-1的未经修饰细胞(下文称为NMC，阳性对照)、经编码靶向MHC I类的shRNA的DNA转染的细胞(下文称为NMC-shMHC I类)，以及经编码扰乱的非靶向shRNA载体对照物的DNA转染的细胞(下文称为NMC-载体对照，阴性对照)。在逆转录病毒产生之前，用CSFE标记细胞。
使用流式细胞测量术分析逆转录病毒载体对MHC I类的表达。洗涤适当数目个逆转录病毒载体并且再悬浮于PBS中，与针对MHC I类的荧光偶联单克隆抗体(Harlan Sera-Lab，英国贝尔顿(Belton，UK))的1∶10-1∶4000稀释液一起在冰上保存30分钟。将逆转录病毒载体在PBS中洗涤三次并且再悬浮于PBS中。使用逆转录病毒载体制剂的相同等分试样测定非特异性荧光，所述逆转录病毒载体制剂与适当的荧光偶联同型对照抗体的等效稀释液一起培育。在流式细胞仪(FACSort，百克顿-迪金森公司(Becton-Dickinson))中分析逆转录病毒载体并且用流程分析软件(百克顿-迪金森公司)来分析数据。
对来源于NMC、NMC-shMHC I类和NMC-载体对照的逆转录病毒载体的平均荧光数据进行比较。在一个实施例中，来源于NMC-shMHC I类的逆转录病毒载体对MHC I类的表达低于NMC和NMC-载体对照。
实例11：测量预先存在的血清对逆转录病毒载体的灭活
这个实例描述了使用体外递送分析定量预先存在的血清对逆转录病毒载体的灭活。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是血清灭活。血清对逆转录病毒载体的灭活可能由于抗体介导的中和作用或补体介导的降解作用。在一个实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体的一些接受者在其血清中具有结合到逆转录病毒载体并将逆转录病毒载体灭活的因子。
在这个实例中，评估未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清中是否存在将逆转录病毒载体灭活的因子。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
阴性对照是热灭活的小鼠血清，并且阳性对照是来源于已接受由异种源细胞产生的逆转录病毒载体的多次注射的小鼠的血清。通过收集新鲜全血并使其完全凝结数小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
以靶细胞群中的50％细胞接受逆转录病毒载体中的外源药剂时的剂量测试逆转录病毒载体，如上文在实例9中所描述。
为了评估血清对逆转录病毒载体的灭活，将逆转录病毒载体在正常或热灭活血清(或含有10％热灭活FBS的培养基作为无血清对照)中1∶5稀释并在37℃下培育混合物1小时。在培育之后，将培养基添加到反应物中进行额外的1∶5稀释，并且随后以1∶10比率连续稀释两次。在这个步骤之后，逆转录病毒载体应以50％接受者细胞已接受外源药剂(例如呈RFP阳性)时的预先鉴别剂量存在。
已暴露于血清的逆转录病毒载体随后与靶细胞一起培育。计算接受外源药剂并因此呈RFP阳性的细胞的百分比。在一些实施例中，在已和血清一起培育的逆转录病毒载体样品与来自未经逆转录病毒载体处理的小鼠的热灭活血清之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不窜在血清对逆转录病毒载体的灭活。在一些实施例中，在已和未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清一起培育的逆转录病毒载体样品与无血清对照培育之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活。在一些实施例中，在已与阳性对照血清一起培育的逆转录病毒载体样品中，接受外源药剂的细胞的百分比小于已与未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清一起培育的逆转录病毒载体样品，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活。
实例12：多次施用之后，测量血清对逆转录病毒载体的灭活
这个实例描述了在多次施用逆转录病毒载体后，使用体外递送分析来定量血清对逆转录病毒载体的灭活。在一个实施例中，经修饰的逆转录病毒载体多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用之后，经修饰的逆转录病毒载体(例如通过本文所描述的方法修饰)的血清灭活减少(例如，相比于未经修饰的逆转录病毒载体施用而言减少)。在一个实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体在多次施用之后，不被血清灭活。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是血清灭活。在一个实施例中，逆转录病毒载体的重复注射可以产生抗逆转录病毒载体抗体，例如识别逆转录病毒载体的抗体。在一个实施例中，识别逆转录病毒载体的抗体可以能限制逆转录病毒载体活性或寿命并且介导补体降解的方式结合。
在这个实例中，在一次或多次施用逆转录病毒载体之后检查血清灭活。逆转录病毒载体是通过前述实例中的任何一个产生。在这个实例中，逆转录病毒由以下细胞产生：经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC-空白载体，阴性对照)。在一些实施例中，逆转录病毒载体来源于正表达其它免疫调节蛋白的细胞。
血清取自不同的群组：全身和/或局部注射1、2、3、5或10次媒剂注射剂(逆转录病毒载体未经处理组)、HEK293-HLA-G逆转录病毒载体或HEK293逆转录病毒载体的小鼠。通过收集新鲜全血并使其完全凝结数小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
以靶细胞群中的50％细胞接受逆转录病毒载体中的外源药剂时的剂量测试逆转录病毒载体，如上文在实例9中所描述。
为了评估血清对逆转录病毒载体的灭活，将逆转录病毒载体暴露于血清并与靶细胞一起培育，如上述实例11中所描述。
计算接受外源药剂并因此呈RFP阳性的细胞的百分比。在一些实施例中，在已和血清一起培育的逆转录病毒载体样品与经HEK293-HLA-G逆转录病毒载体处理的小鼠的热灭活血清之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。在一些实施例中，在来自经HEK293-HLA-G逆转录病毒载体处理1、2、3、5或10次的小鼠的已培育的逆转录病毒载体样品之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。在一些实施例中，在已和来自媒剂处理小鼠与经HEK293-HLA-G逆转录病毒载体处理的小鼠的血清一起培育的逆转录病毒载体样品之间，接受外源药剂的细胞的百分比没有差异，表明不存在血清对逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。在一些实施例中，对于来源于HEK293的逆转录病毒载体来说，接受外源药剂的细胞的百分比小于HEK293-HLA-G逆转录病毒载体，表明不存在血清对HEK293-HLA-G逆转录病毒载体的灭活或适应性免疫应答。
实例13：测量对逆转录病毒载体具有反应性的预先存在的IgG和IgM抗体
这个实例描述了使用流式细胞测量术所测量的预先存在的抗逆转录病毒载体抗体效价的定量。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是抗体应答。识别逆转录病毒载体的抗体可以能限制逆转录病毒载体活性或寿命的方式结合。在一个实施例中，本文所描述的逆转录病毒载体的一些接受者将具有结合到并识别逆转录病毒载体的预先存在的抗体。
在这个实例中，使用利用异种源细胞所产生的逆转录病毒载体测试抗逆转录病毒载体抗体效价。在这个实例中，评估未经逆转录病毒载体处理的小鼠是否存在抗逆转录病毒载体抗体。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
阴性对照是IgM和IgG已耗竭的小鼠血清，并且阳性对照是来源于已接受由异种源细胞产生的逆转录病毒载体的多次注射的小鼠的血清。
为了评估结合到逆转录病毒载体的预先存在的抗体的存在，首先通过加热到56℃维持30分钟将未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清去除补体并且随后在含有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和逆转录病毒载体(1×102-1×108个逆转录病毒载体/mL)悬浮液在4℃下培育30分钟并且通过小牛血清缓冲，用PBS洗涤。
通过将逆转录病毒载体与对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分具有特异性的PE偶联山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而使IgM异种反应性抗体染色。值得注意的是，还可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的逆转录病毒载体用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且随后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。
在一个实施例中，阴性对照血清将展示与无血清或单独的次级对照类似的可忽略的荧光。在一个实施例中，阳性对照展示的荧光大于阴性对照，并且大于无血清对照或单独二抗对照。在一个实施例中，在存在免疫原性的情况下，未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清展示的荧光大于阴性对照。在一个实施例中，在不存在免疫原性的情况下，未经逆转录病毒载体处理的小鼠的血清展示的荧光类似于阴性对照。
实例14：逆转录病毒载体多次施用之后，测量IgG和IgM抗体应答
这个实例描述了在多次施用经修饰的逆转录病毒载体后，对经修饰的逆转录病毒载体的体液应答的定量。在一个实施例中，经修饰的逆转录病毒载体多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用之后，经修饰的逆转录病毒载体(例如通过本文所描述的方法修饰)的体液应答减少(例如相比于未经修饰的逆转录病毒载体施用而言减少)。
在一些实施例中，逆转录病毒载体的免疫原性的量度是抗体应答。在一个实施例中，逆转录病毒载体的重复注射可以产生抗逆转录病毒载体抗体，例如识别逆转录病毒载体的抗体。在一个实施例中，识别逆转录病毒载体的抗体可以能限制逆转录病毒载体活性或寿命的方式结合。
在这个实例中，一次或多次施用逆转录病毒载体之后，检查抗逆转录病毒载体抗体效价。逆转录病毒载体是通过前述实例中的任何一个产生。在这个实例中，逆转录病毒由以下细胞产生：未经免疫调节蛋白(NMC)转染的细胞、经HLA-G或HLA-E cDNA转染的细胞(下文称为NMC-HLA-G)，以及经空白载体对照物转染的细胞(下文称为NMC-空白载体，阴性对照)。在一些实施例中，逆转录病毒载体来源于正表达其它免疫调节蛋白的细胞。
血清取自不同的群组：全身和/或局部注射1、2、3、5、10次媒剂注射剂(逆转录病毒载体未经处理组)、NMC逆转录病毒载体、NMC-HLA-G逆转录病毒载体，或NMC-空白载体逆转录病毒载体的小鼠。
为了评估抗逆转录病毒载体抗体的存在和丰度，首先通过加热到56℃维持30分钟将小鼠的血清去除补体并且随后在含有3％FCS和0.1％NaN3的PBS中稀释33％。将等量的血清和逆转录病毒载体(1×102-1×108个逆转录病毒载体/mL)在4℃下培育30分钟并且通过小牛血清缓冲、用PBS洗涤。
通过将逆转录病毒载体与对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分具有特异性的PE偶联山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而使逆转录病毒载体反应性IgM抗体染色。值得注意的是，还可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的逆转录病毒载体用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且随后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。
在一个实施例中，相比于NMC逆转录病毒载体或NMC-空白逆转录病毒载体，NMC-HLA-G逆转录病毒载体在注射之后的抗病毒IgM(或IgG1/2)抗体效价降低(如根据FACS荧光强度所测量)。
实例15：测量IgG和IgM效价(接受者细胞对逆转录病毒载体的抗体应答)
这个实例描述了使用流式细胞测量术定量针对接受者细胞(已与逆转录病毒载体融合的细胞)的抗体效价。在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是抗体应答。识别接受者细胞的抗体可以能够限制细胞活性或寿命的方式结合。在一个实施例中，抗体应答将不靶向接受者细胞，或抗体应答将低于参考水平。
在这个实例中，测试个体(例如人类、大鼠或猴)的抗接受者细胞抗体效价。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
小鼠每日用通过本申请所描述的方法中的任一种产生的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照)处理，历时5天。在最终处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。在用牛血清白蛋白阻断10分钟之后，将细胞在4℃下在黑暗中用鼠类CD3-FITC抗体(赛默飞世尔(ThermoFisher)目录号：11-0032-82)染色30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在使用488nm激光激发并且在530+/-30nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的LSRII(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上分析细胞。分选CD3+细胞。
随后通过将反应混合物与针对小鼠IgM(BD生物科学)的Fc部分的具有特异性的PE结合的山羊抗体一起在4℃下培育45分钟而用IgM抗体对分选的CD3+细胞进行染色。值得注意的是，还可以使用抗小鼠IgG1或IgG2二级抗体。来自所有组的细胞用含有2％FCS的PBS洗涤两次，并且随后在FACS系统(BD生物科学)上进行分析。通过使用对数扩增来收集荧光数据并表示为平均荧光强度。对来自用逆转录病毒载体处理的小鼠和用PBS处理的小鼠的分选CD3细胞计算平均荧光强度。
低平均荧光强度指示针对接受者细胞的低体液应答。预期经PBS处理的小鼠具有低平均荧光强度。在一个实施例中，来自经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的平均荧光强度类似。
实例16：测量吞噬细胞对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了通过吞噬分析来定量巨噬细胞对接受者细胞的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是巨噬细胞应答。巨噬细胞参与吞噬作用，吞噬细胞并且使得能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。在一些实施例中，通过巨噬细胞吞噬接受者细胞将降低接受者细胞的活性。
在一个实施例中，巨噬细胞不靶向接受者细胞。在这个实例中，测试巨噬细胞对个体的接受者细胞的应答。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
小鼠每日用通过本申请所描述的方法中的任一种产生的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照)处理，历时5天。在最终处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。
在用牛血清白蛋白阻断10分钟之后，将细胞在4℃下在黑暗中用鼠类CD3-FITC抗体(赛默飞世尔目录号：11-0032-82)染色30分钟。在用PBS洗涤两次之后，在使用488nm激光激发并且在530+/-30nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的LSR II(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上分析细胞。随后分选CD3+细胞。
根据以下方案进行吞噬分析以评估巨噬细胞介导的免疫清除。将巨噬细胞在收获后立即接种于共聚焦玻璃底培养皿中。在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育巨噬细胞1小时以附着。如方案中所指示，将来源于接受逆转录病毒载体和PBS的小鼠的适当数目个经分选的并且经FITC染色的CD3+细胞添加到巨噬细胞中并培育2小时，例如如VybrantTM吞噬分析试剂盒产品信息插页中所描述(分子探针公司(Molecular Probes)，2001年3月18日修订，见于tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf)。
在2小时之后，轻轻地洗涤培养皿并检查细胞内荧光。为了鉴别巨噬细胞，首先将细胞与Fc受体阻断抗体(eBioscence目录号14-0161-86，克隆体93)一起在冰上培育15分钟，以阻断经标记的mAb与Fc受体的结合，所述Fc受体大量表达于巨噬细胞上。在这个步骤之后，添加抗F4/80-PE(赛默飞世尔目录号12-4801-82，克隆体BM8)和抗CD11b-PerCP-Cy5.5(BD生物科学目录号550993，克隆体M1/70)结合抗体以对巨噬细胞表面抗原进行染色。在4℃下、在黑暗中培育细胞30分钟，随后离心并在PBS中洗涤。随后将细胞再悬浮于PBS中。随后对样品执行流式细胞测量术，并且分别使用533nm和647nm激光激发，通过F4/80-PE和CD11b-PerCP-Cy5.5的阳性荧光信号鉴别巨噬细胞。对巨噬细胞设门之后，根据488nm激光激发来评估被吞噬的接受者细胞所发出的细胞内荧光。使用成像软件对吞噬阳性巨噬细胞的数目进行定量。数据被表示为吞噬指数＝(吞噬细胞的总数/计数的巨噬细胞的总数)×(含有吞噬细胞的巨噬细胞的数目/计数的巨噬细胞的总数)×100。
低吞噬指数表明低吞噬作用和巨噬细胞靶向。预期经PBS处理的小鼠具有低吞噬指数。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的吞噬指数类似。
实例17：测量PBMC对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了用细胞溶解分析来定量PBMC对接受者细胞的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是PBMC应答。在一个实施例中，细胞毒性介导的PBMC对接受者细胞的细胞溶解是免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
在一个实施例中，接受者细胞并不引发PBMC应答。在这个实例中，测试PBMC对个体的接受者细胞的应答。
另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
小鼠每日用通过本申请所描述的方法中的任一种产生的逆转录病毒载体处理或用PBS(阴性对照)处理，历时5天。在最终处理后28天，从接受逆转录病毒载体的小鼠和接受PBS处理的小鼠收集周边血液。将血液收集到含有5μM EDTA的1ml PBS中并立即混合以防止凝血。将试管保持于冰上并且使用缓冲氯化铵(ACK)溶液去除红细胞。细胞在细胞染色缓冲液(Biolegend目录号：420201)中用Fc阻断(Biolegend目录号：101319)10分钟之后，在4℃下、在黑暗中用鼠类CD3：APC-Cy7抗体(Biolegend目录号：100330)或同型对照APC-Cy7(IC：APC-Cy7)抗体(Biolegend目录号：400230)染色30分钟。细胞用PBS洗涤两次之后，使用同型对照APC-Cy7抗体标记的细胞设定负门，在具有640nm激光激发并且在780-/+60nm收集发射、运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上加以分析，随后分选并且收集APC-Cy7阳性细胞。分选的CD3+细胞随后用CellMaskTM绿色质膜染色剂(CMG，赛默飞世尔目录号：C37608)或DMSO(作为阴性对照)标记。
从经逆转录病毒载体或PBS处理的小鼠中分离出CD3+细胞之前的7天，根据Crop等人《细胞移植》(20)：1547-1559；2011中的方法，从经逆转录病毒载体或PBS处理的小鼠中分离出PBMC，并且在37℃下、在圆底96孔培养盘中、在IL-2重组小鼠蛋白(安迪生物公司(R&DSystems)，目录号：402-ML-020)和CD3/CD28珠粒(赛默飞世尔目录号：11456D)存在下刺激7天。在第7天，将刺激的PBMC与CD3+/CMG+或CD3+/DMSO对照细胞共培育1、2、3、4、5、6、8、10、15、20、24、48小时，PBMC∶CD3+/CMG+或PBMC：CD3+/DMSO对照细胞的接种比介于1000∶1-1∶1与1∶1.25-1∶1000范围内。作为阴性对照，一组孔仅接受CD3+/CMG+和CD3+/DMSO对照细胞，不接受PBMC。在培育后，将培养盘离心并处理，以使其被鼠类CD3：APC-Cy7抗体或IC∶APC-Cy7抗体标记，如上所述。用PBS洗涤两次之后，将细胞再悬浮于PBS中，并且在运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(APC-Cy7：640nm激光激发/在780-/+60nm收集的发射，和CMG 561nm激光激发/在585-/+16nm收集的发射)上进行分析。FSC/SSC事件数据将接着首先用于对标记为“细胞”的事件设门。随后利用这个“细胞”门显示事件以根据640nm和561nm激光设定PMT电压，从而分析仅经IC：APC-Cy7/DMSO标记的样品。这个样品还将用于对APC-Cy7和CMG两者的阴性细胞设门。随后使用不接受任何PBMC的CD3+/CMG+细胞对CD3+和CMG+细胞设正门。
通过观察总细胞群中的CD3+/CMG+细胞的百分比来分析数据。当比较处理组时，在PBMC：CD3+/CMG+细胞的任何给定的分析比下，相对较低百分比的CD3+/CMG+细胞指示接受者细胞溶解。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的CD3+/CMG+百分比类似。
实例18：测量NK细胞对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了利用细胞溶解分析来定量自然杀手细胞对接受者细胞的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是自然杀手细胞应答。在一个实施例中，细胞毒性介导的自然杀手细胞对接受者细胞的细胞溶解是免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
在一个实施例中，接受者细胞并不引发自然杀手细胞应答。在这个实例中，测试个体的自然杀手对接受者细胞的应答。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
用逆转录病毒载体处理小鼠，抽取血液样品，并且分选CD3+细胞，如上文在实例17中所描述。分离出NK细胞，与CD3+细胞一起培养，并且根据上文在实例17中所描述的方案、通过FACS来分析，例外为使用NK细胞替代实例17中所用的PBMC细胞。
通过观察总细胞群中的CD3+/CMG+细胞的百分比来分析数据。当比较处理组时，在NK细胞：CD3+/CMG+细胞的任何给定的分析比下，相对较低百分比的CD3+/CMG+细胞指示接受者细胞溶解。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的CD3+/CMG+百分比类似。
实例19：测量CD8 T细胞对逆转录病毒载体接受者细胞的应答
这个实例描述了用细胞溶解分析来定量CD8+T细胞对接受者细胞(与逆转录病毒载体融合的细胞)的应答。
在一些实施例中，接受者细胞的免疫原性的量度是CD8+T细胞应答。在一个实施例中，细胞毒性介导的CD8+T细胞对接受者细胞的细胞溶解是免疫原性的量度，因为溶解将减少(例如抑制或中止)逆转录病毒载体的活性。
在一个实施例中，接受者细胞并不引发CD8+T细胞应答。在这个实例中，测试CD8+T细胞对个体的接受者细胞的应答。另外，所述方案可以适于存在适合的表面标记的任何细胞类型。在这个实例中，靶接受者细胞是CD3+细胞。
用逆转录病毒载体处理小鼠，抽取血液样品，并且分选CD3+细胞，如上文在实例17中所描述。分离出CD8+T细胞，与CD3+细胞一起培养，并且根据上文在实例17中所描述的方案、通过FACS来分析，例外为使用CD8+T细胞替代实例17中所用的PBMC细胞。
通过观察总细胞群中的CD3+/CMG+细胞的百分比来分析数据。当比较处理组时，在CD8+细胞：CD3+/CMG+细胞的任何给定的分析比下，相对较低百分比的CD3+/CMG+细胞指示接受者细胞溶解。在一个实施例中，来源于经逆转录病毒载体处理的小鼠与经PBS处理的小鼠的接受者细胞的CD3+/CMG+百分比类似。
实例20：测量肝特异性启动子活性
这个实例描述了相比于非靶细胞，肝特异性启动子(正向TCSRE)在肝细胞中的活性的测量结果。在这个实例中，非靶细胞为CD11c+细胞。
如Li等人，《免疫学期刊(Journal of Immunology)》2008，2483-2493中所描述的从小鼠收集CD11c+细胞。如Li等人，《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》2010，185-196中所描述的肝细胞来源于小鼠。
分开地培养两种细胞类型并且用如本文所描述产生的逆转录病毒载体处理。用VSV-G假型化逆转录病毒载体，并且在肝特异性启动子(例如表3的肝特异性启动子)的控制下编码tdtomato荧光蛋白质报道子。
在转导之后两天，通过流式细胞测量术测量细胞中的基因表达并且用定量PCR测量细胞中的平均载体拷贝数。将细胞群中每细胞的中值tdtomato基因表达标准化为群载体拷贝数。
在一些实施例中，肝细胞群将具有比CD11c+细胞群大的tdtomato表达与载体拷贝数的比。这将表明肝特异性启动子在肝细胞中具有更多活性。
实例21：测量来自限制性微RNA的表达变化
这个实例描述了相比于造血细胞，造血细胞限制性微RNA(NTCSRE)在肝细胞中的活性的测量结果。在这个实例中，造血细胞为CD11c+细胞。
如Li等人，《免疫学期刊》2008，2483-2493中所描述的从小鼠收集CD11c+细胞。如Li等人，《分子生物学方法》2010，185-196中所描述的肝细胞来源于小鼠。
分开地培养两种细胞类型并且用如本文所描述产生的逆转录病毒载体处理。用VSV-G假型化逆转录病毒载体，并且在广泛活性的启动子和造血细胞限制性微RNA(例如表4的微RNA)的控制下编码tdtomato荧光蛋白质报道子。
在转导之后两天，通过流式细胞测量术测量细胞中的基因表达并且用定量PCR测量细胞中的平均载体拷贝数。将细胞群中每细胞的中值tdtomato基因表达标准化为群载体拷贝数。
在一些实施例中，肝细胞群将具有比CD11c+细胞群大的tdtomato表达与载体拷贝数的比。这将表明造血细胞限制性微RNA降低CD11c+细胞中的表达。
实例22：用具有VSV-G、肝细胞特异性启动子和造血限制性微RNA的tdTomato处理
这个实例描述了根据单一细胞中的外源药剂表达来定量靶接受者细胞和非靶接受者细胞中的外源药剂表达。
在一个实施例中，经处理的小鼠的非靶细胞中的外源药剂表达与未经处理的小鼠的那些非靶细胞的表达类似。在一个实施例中，经处理小鼠的表达外源药剂的非靶细胞的百分比与未处理小鼠的那些非靶细胞的百分比类似。在一个实施例中，经处理的小鼠的靶细胞中的外源蛋白质药剂表达大于未处理的小鼠的那些靶细胞中的外源蛋白质药剂表达。在一个实施例中，经处理的小鼠的表达外源蛋白质药剂的靶细胞的百分比大于未经处理的小鼠的那些靶细胞的百分比。
在这个实例中，非靶细胞为CD11c+细胞。在这个实例中，靶细胞为肝细胞。然而，这种方案可以适于存在适合表面标记并且可以从个体中分离的任何细胞类型。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。在这个实例中，外源药剂是荧光蛋白并且通过流式细胞测量术测量表达。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过蛋白质的免疫染色来测量。在其它实施例中，外源蛋白质药剂的表达可以通过显微镜或蛋白质印迹测量。
用VSV-G假型化的逆转录病毒载体处理小鼠，并且在肝细胞特异性启动子(正向TCSRE)和造血细胞限制性微RNA序列(NTCSRE)的控制下携带tdtomato荧光蛋白药剂。逆转录病毒载体是通过本文所描述的方法中的任一种产生。阴性对照小鼠用PBS处理。
治疗后28天，处死小鼠并且如Li等人，《免疫学期刊》2008，2483-2493中所描述的从小鼠收集CD11c+细胞。如Li等人，《分子生物学方法》2010，185-196中所描述的肝细胞来源于小鼠。经分离细胞中的Tdtomato表达通过流式细胞测量术在运行FACSDivaTM软件(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)的FACS Aria(BD生物科学，加利福尼亚州圣何塞)上分析。使用从媒剂处理的小鼠分离的肝细胞和CD11c+细胞设定tdtomato表达的负门，并且激光激发为552nm并在585-/+42nm收集发射。
测量呈tdtomato阳性的CD11c+细胞的百分比。在一些实施例中，在来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的细胞中，呈tdtomato阳性的CD11c+细胞的百分比类似。测量CD11c+细胞的中值tdtomato荧光水平。在一些实施例中，在来自经处理的小鼠和未经处理的小鼠的细胞中，CD11c+细胞的中值tdtomato荧光水平类似。测量呈tdtomato阳性的肝细胞的百分比。在一些实施例中，经处理小鼠的细胞中的呈tdtomato阳性的肝细胞的百分比将大于未经处理的小鼠。测量肝细胞的中值tdtomato荧光水平。在一些实施例中，经处理小鼠的细胞中的肝细胞的中值tdtomato荧光水平大于未经处理的小鼠。在一些实施例中，tdtomato阳性的肝细胞的百分比将大于来自经处理小鼠的细胞中的tdtomato阳性的CD11c+的百分比。在一些实施例中，肝细胞的中值tdtomato荧光水平将大于来自经处理小鼠的细胞中的CD11c+的荧光水平。
实例23：用VSV-G假型体外处理鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症
这个实例描述了将治疗性转基因体外递送到细胞。在这个实例中，治疗性转基因为鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)。
肝细胞来源于spfash小鼠。如Li等人，《分子生物学方法》2010，185-196中所描述分离肝细胞。所述肝细胞用如本文所描述产生的逆转录病毒载体或用PBS转导。逆转录病毒载体用VSV-G假型化，并且在肝细胞特异性启动子(正向TCSRE)和造血细胞限制性微RNA序列(负向TCSRE)的控制下携带otc基因。
在OTC表达足够时间之后，制备细胞以进行成像。细胞经固定、渗透、阻断并且用抗OTC抗体(例如，abcam目录号ab91418)免疫染色。在免疫染色之后，细胞用结合到AlexaFluor 488的二级抗体(例如，abcam目录号ab150077)进行反向染色。将细胞在维持于37℃和5％CO2下时，在具有63×油浸物镜的Zeiss LSM 710共聚焦显微镜上成像。对AlexaFluor进行488nm激光激发并且在510±15nm下捕获发射。计算每细胞的Alexa Flour平均强度以确定每细胞的OTC表达水平。对于每个组，使至少30-40个细胞成像并分析。
在一些实施例中，用编码OTC基因的逆转录病毒载体处理的肝细胞中的每细胞的OTC表达水平将高于用PBS处理的肝细胞中的OTC表达水平。
实例24：用具有VSV-G假型化逆转录病毒体内处理鸟氨酸氨甲酰基转移酶缺乏症
这个实例描述了将治疗性转基因体内递送到细胞。在这个实例中，治疗性转基因为鸟氨酸氨甲酰基转移酶(otc)。
用VSV-G假型化的逆转录病毒载体处理spfash小鼠，并且在肝细胞特异性启动子(正向TCSRE)和造血细胞限制性微RNA序列(NTCSRE)的控制下携带tdtomato荧光蛋白药剂。逆转录病毒载体是通过本申请案中所描述的方法中的任一种产生。阴性对照小鼠用PBS处理。
在处理后28天，从用逆转录病毒或PBS处理的小鼠获得肝细胞并且染色以进行如先前实例中所描述的OTC表达。在一些实施例中，来源于用编码OTC基因的逆转录病毒载体处理的小鼠的肝细胞中的每细胞的OTC表达水平将高于用PBS处理的肝细胞中的OTC表达水平。
在独立组的小鼠中，在用逆转录病毒或PBS处理后28天，将小鼠喂食1周高蛋白质饮食的时程。测量血液氨含量和尿乳清酸。在一些实施例中，与用PBS处理的小鼠相比，用逆转录病毒处理的小鼠中的血液氨和/或尿乳清酸的含量将更低。小鼠再维持高蛋白饮食28天。在一些实施例中，用逆转录病毒载体处理的组中小鼠将比用PBS处理的组中的小鼠存活整个28天高蛋白饮食时段的更多。在一些实施例中，用逆转录病毒载体处理的组中的小鼠将具有比用PBS处理的组中的小鼠显著更长的存活时间。
实例25：融合剂脂质体中缺乏转录活性
这个实例定量相比于用于融合剂脂质体产生的亲本细胞(例如源细胞)，融合剂脂质体中的转录活性。在一个实施例中，相比于亲本细胞(例如源细胞)，融合剂脂质体中的转录活性将较低或不存在的。
融合剂脂质体为递送治疗剂的基础。可以高效率递送到细胞或局部组织环境的治疗剂(如miRNA、mRNA、蛋白质和/或细胞器)可以用于调节在接受者组织中通常不活跃或在病理性低或高水平下不活跃的途径。在一个实施例中，融合剂脂质体不能转录，或融合剂脂质体的转录活性小于其亲本细胞的观察结果将证实已充分发生了核物质的去除。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。随后在37℃和5％CO2下持续1小时将足够数量的融合剂脂质体和用于产生融合剂脂质体的亲本细胞在6孔低附着多孔盘中接种到含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素和可荧光标记的炔烃-核苷EU的DMEM中。对于阴性对照，也将足够数量的融合剂脂质体和亲本细胞在多孔盘中接种于含有20％胎牛血清、1×青霉素/链霉素但不具有炔烃-核苷EU的DMEM中。
在1小时培育之后，按照制造商的成像试剂盒(赛默飞世尔科技(ThermoFisherScientific))说明书对样品进行处理。将包括阴性对照的细胞和融合剂脂质体样品用1×PBS缓冲液洗涤三次并且再悬浮于1×PBS缓冲液中并通过流式细胞测量术(百克顿-迪金森公司，美国加利福尼亚州圣何塞)，使用488nm氩气激光激发，以及530+/-30nm发射进行分析。BD FACSDiva软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。
在一个实施例中，由于省略了炔烃-核苷EU，阴性对照中如根据530+/-30nm发射所测量的转录活性将为零。在一些实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体的转录活性将为小于约70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更小。
另外参见《美国国家科学院院刊》，2008年10月14日；105(41)：15779-84.doi：10.1073/pnas.0808480105.电子版2008年10月7日。
实例26：缺乏DNA复制或复制活性
这个实例定量融合剂脂质体中的DNA复制。在一个实施例中，相比于细胞，融合剂脂质体将以低速率复制DNA。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。通过并入可荧光标记的核苷酸(赛默飞世尔科技编号C10632)来评估融合剂脂质体和亲本细胞DNA复制活性。在用二甲亚砜制备EdU储备溶液之后，将融合剂脂质体和相等数目的细胞与EdU以10μM的最终浓度一起培育2小时。样品随后使用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且在0.5％清洁剂于1×PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中渗透15分钟。
在渗透之后，将悬浮于含有0.5％洗涤剂的PBS缓冲液中的融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且在21℃下在反应混合液、1×PBS缓冲液、CuSO4(组分F)、叠氮化物-荧光剂488、1×反应缓冲液添加剂中培育30分钟。
用与上文相同地处理但在1×反应混合液中没有叠氮化物-荧光剂488的样品制得融合剂脂质体和细胞DNA复制活性的阴性对照。
随后将细胞和融合剂脂质体样品洗涤并且再悬浮于1×PBS缓冲液中并通过流式细胞测量术分析。用FACS细胞仪(百克顿-迪金森公司美国加利福尼亚州圣何塞)以488nm氩气激光激发进行流式细胞测量术，并且收集530+/-30nm发射光谱。FACS分析软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中叠氮化物-荧光剂488的中值强度来计算相对DNA复制活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来仅选择融合剂脂质体群)。通过从融合剂脂质体的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定融合剂脂质体的标准化荧光强度值。随后将融合剂脂质体样品的标准化相对DNA复制活性相对于对应有有核细胞样品进行标准化，以便产生DNA复制活性的定量测量结果。
在一个实施例中，融合剂脂质体的DNA复制活性低于亲本细胞。
另外参见Salic，2415-2420，doi：10.1073/pnas.0712168105。
实例27：融合剂的定量
这个实例描述每个融合剂脂质体中融合剂的绝对数的定量。
通过前述实例中所描述的方法中的任一种产生融合剂脂质体组合物，除了如前述实例中所描述地对融合剂脂质体进行工程改造以表达用GFP标记的融合剂(VSV-G)。另外，在不存在融合剂(VSV-G)或GFP的情况下对阴性对照融合剂脂质体进行工程改造。
随后如下地分析具有GFP标记的融合剂的融合剂脂质体和一个或多个阴性对照的融合剂的绝对数。连续稀释商业上获得的重组GFP以产生蛋白质浓度的校准曲线。随后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量校准曲线和已知数量的融合剂脂质体的样品的GFP荧光，以计算融合剂脂质体制剂中GFP分子的平均摩尔浓度。随后将摩尔浓度转换为GFP分子的数目并且除以每个样品的融合剂脂质体数目，以获得每个融合剂脂质体的GFP标记的融合剂分子的平均数目，并且因此提供每个融合剂脂质体的融合剂数目的相对估算。
在一个实施例中，相比于其中不存在融合剂或GFP的阴性对照，具有GFP标签的融合剂脂质体中的GFP荧光将更高。在一个实施例中，GFP荧光是相对于存在的融合剂分子的数目。
替代地，根据制造商的说明书使用单一细胞制备系统(富鲁达(Fluidigm))分离个别融合剂脂质体，并且使用可商购的探针组(塔克曼(Taqman))和被设计成基于Ct值定量融合剂或GFP cDNA水平的预混液进行qRT-PCR。通过合成(Amsbio)产生与融合剂基因或GFP基因的克隆片段具有相同序列的RNA标准品，并且随后以连续稀释添加到单一细胞制备系统qRT-PCR实验反应，以建立Ct相对于融合剂或GFP RNA浓度的标准曲线。
将来自融合剂脂质体的Ct值与标准曲线进行比较以确定每个融合剂脂质体的融合剂或GFP RNA的量。
在一个实施例中，相比于其中不存在融合剂或GFP的阴性对照，被工程改造以表达融合剂的融合剂脂质体中的融合剂和GFP RNA将更高。
通过如先前所描述地分析脂质双层结构和如本文其它实例中所描述地通过LC-MS定量脂质双层中的融合剂，可以进一步定量脂质双层中的融合剂。
实例28：测量融合剂脂质体的平均大小
这个实例描述融合剂脂质体平均大小的测量。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用可商购的系统(iZON Science)测量融合剂脂质体以确定平均大小。将系统与软件(根据制造商的说明)和纳米孔一起使用，被设计成分析40nm至10μm尺寸范围内的颗粒。将融合剂脂质体和亲本细胞再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中以达到0.01-0.1μg蛋白质/mL的最终浓度范围。如下表中所指示地调节其它仪器设置：
表6：融合剂脂质体测量参数和设置
测量参数 设置
压力 6
纳米孔类型 NP300
校准样品 CPC400_6P
黄金标准分析 无
捕获助手 无
在分离后的2小时内分析所有融合剂脂质体。在一个实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体的大小将在约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实例29：测量融合剂脂质体的平均大小分布
这个实例描述融合剂脂质体大小分布的测量。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生融合剂脂质体，并且使用如先前实例中所描述的可商购的系统进行测试以确定颗粒的平均大小。在一个实施例中，将以围绕中值为中心的10％、50％和90％的融合剂脂质体的大小阈值与亲本细胞进行比较以评估融合剂脂质体大小分布。
在一个实施例中，融合剂脂质体将在10％、50％或90％的样品内具有亲本细胞的大小分布变化率的小于约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。
实例30：融合剂脂质体的平均体积
这个实例描述测量融合剂脂质体的平均体积。不希望受理论所束缚，改变融合剂脂质体的大小(例如体积)可以使其对于不同的货物装载、治疗设计或应用为通用的。
如先前实例中所描述地制备融合剂脂质体。阳性对照为HEK293细胞或具有已知大小的聚苯乙烯珠粒。阴性对照为穿过36号针大致50次的HEK293细胞。
如先前实例中所描述的用透射式电子显微镜分析用于确定融合剂脂质体的大小。测量融合剂脂质体的直径并且随后计算体积。
在一个实施例中，融合剂脂质体将具有大致50nm或更大直径的平均大小。
实例31：融合剂脂质体的平均密度
通过如Théry等人，《细胞生物学实验指南》2006年4月；第3章：第3.22节中所描述的连续蔗糖梯度离心分析来测量融合剂脂质体密度。如先前实例中所描述地获得融合剂脂质体。
首先，制备蔗糖梯度。分别通过混合4ml HEPES/蔗糖储备溶液和1ml HEPES储备溶液或0.5ml HEPES/蔗糖储备溶液和4.5ml HEPES储备溶液来产生2M和0.25蔗糖溶液。将这两个部分装入关闭所有挡板的梯度仪中，2M蔗糖溶液在具有磁力搅拌棒的近端隔室中，并且0.25M蔗糖溶液在远端隔室中。将梯度仪置于磁性搅拌板上，打开近端与远端隔室之间的挡板并且打开磁性搅拌板。如下制得HEPES储备溶液：2.4g N-2-羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，300H2O，用10N NaOH将pH调节到7.4并且最后用H2O将体积调节到500ml。如下制得HEPES/蔗糖储备溶液：2.4g羟基乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES；最终20mM)，428g无蛋白酶的蔗糖(ICN；最终2.5M)，150ml H2O，用10NNaOH将pH调节到7.4并且最后用H2O将体积调节到500ml。
将融合剂脂质体再悬浮于2ml HEPES/蔗糖储备溶液中并且倒入SW 41离心管的底部。将外管置于SW 41管中，恰好在2ml融合剂脂质体上方。打开外挡板，并且将连续的2M(底部)到0.25M(顶部)蔗糖梯度缓慢倒入融合剂脂质体的顶部上。SW 41管在倒入梯度时降低，以使得管始终略高于液体顶部。
所有具有梯度的管彼此平衡，或与具有相同重量的蔗糖溶液的其它管平衡。将梯度在4℃下在制动器设置于低位的SW 41旋转铲斗转子中以210,000×g离心整夜(≥14小时)。
使用微量移液器从上到下收集十一份1ml洗脱份并且置于用于TLA-100.3转子的3ml管中。将样品放在一旁，并且在96孔盘的单独孔中将50μl的每一份洗脱份用于测量折射率。培养盘用粘性箔覆盖以防止蒸发并且在室温下存储不超过1小时。折射计用于测量10μl到20μl的来自96孔盘中存储的材料的每一份洗脱份的折射率(因此测量蔗糖浓度和密度)。
在可从Beckman网站下载的超速离心目录中可获得将折射率转换为g/ml的表格。
随后制备每一份洗脱份以进行蛋白质含量分析。将两毫升20mM HEPES，pH 7.4添加到每个1ml梯度洗脱份，并且通过上下移液二到三次而混合。每个管的一侧标记有永久性标记，并且将管置于TLA-100.3转子，标记侧朝上。
将具有经稀释的洗脱份的3ml管在110,000×g，4℃下离心1小时。TLA-100.3转子容纳六个管，因此每个梯度进行两次离心，将其它管保持于4℃下知道其可以离心。
从每个3ml管吸出上清液，在集结粒顶部留一滴。集结粒很可能不可见，但可以从管上的标记推断出其位置。将不可见的集结粒再悬浮并且转移到微量离心管。将每个再悬浮的洗脱份的一半用于通过二喹啉甲酸分析进行蛋白质含量分析，描述于另一实例中。这提供跨融合剂脂质体制剂的各个梯度洗脱份的分布。这个分布用于确定融合剂脂质体的平均密度。将另外一半体积的洗脱份存储于-80℃下并且一旦蛋白质分析揭露跨洗脱份的融合剂脂质体分布便用于其它目的(例如功能分析，或通过免疫分离进一步纯化)。
在一个实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体的平均密度将为1.25g/ml+/-0.05标准差。在一个实施例中，融合剂脂质体的平均密度将在1-1.1、1.05-1.15、1.1-1.2、1.15-1.25、1.2-1.3或1.25-1.35范围内。在一个实施例中，融合剂脂质体的平均密度将小于1或大于1.35。
实例32：测量核包膜含量
这个实例描述测量去核的融合剂脂质体中的核包膜含量。核包膜从细胞的细胞质分离DNA。
在一个实施例中，经纯化的融合剂脂质体组合物包含已如本文所描述去核的哺乳动物细胞，如HEK-293T(293[HEK-293](
Figure BDA0002963542200004761
CRL-1573TM)。这个实例描述不同核膜蛋白的定量，作为测量在融合剂脂质体产生之后剩余的完整核膜的量的代替。
在这个实例中，将10×106个HEK-293T和等量的由10×106个HEK-293T制备的融合剂脂质体用3.7％PFA固定15分钟，用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤并且同时渗透，并且随后使用含有1％牛血清白蛋白和0.5％
Figure BDA0002963542200004762
X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4阻断15分钟。在渗透之后，将融合剂脂质体和细胞与不同的一级抗体，例如(抗RanGAP1抗体[EPR3295](Abcam-ab92360)、抗NUP98抗体[EPR6678]-核孔标记(Abcam-ab124980)、抗核孔复合物蛋白抗体[Mab414]-(Abcam-ab24609)、抗输入蛋白7抗体(Abcam-ab213670)一起在4℃下培育12小时，所述一级抗体以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％
Figure BDA0002963542200004763
X-100的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。随后将融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液，pH 7.4洗涤，并且与适当的荧光二级抗体一起在21℃下培育2小时，所述二级抗体检测先前指定的一级抗体，以制造商建议的浓度在含有1％牛血清白蛋白和0.5％清洗涤剂的1×PBS缓冲液，pH 7.4中稀释。随后将融合剂脂质体和细胞用1×PBS缓冲液洗涤，再悬浮于300μL含有1μg/ml Hoechst 33342的1×PBS缓冲液，pH 7.4中，通过20μm FACS管过滤并且通过流式细胞测量术分析。
阴性对照使用相同染色程序产生，但不添加一级抗体。在FACS细胞仪(百克顿-迪金森公司，美国加利福尼亚州圣何塞)上以488nm氩气激光激发进行流式细胞测量术，并且收集530+/-30nm发射光谱。FACS采集软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。相对完整的核膜含量是基于每个样品中荧光的中值强度来计算。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件。
通过从融合剂脂质体的中值荧光强度值减去对应阴性对照样品的中值荧光强度值来确定融合剂脂质体的标准化荧光强度值。随后将融合剂脂质体样品的标准化荧光相对于对应有核细胞样品进行标准化，以产生完整核膜含量的定量测量结果。
在一个实施例中，相比于有核亲本细胞，去核的融合剂脂质体将包含小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％荧光强度或核包膜含量。
实例33：测量染色质水平
这个实例描述测量去核的融合剂脂质体中的染色质。
DNA可以浓缩成染色质以使其在细胞核内适合。在一个实施例中，通过本文所描述的方法中的任一种产生的纯化融合剂脂质体组合物将包含低水平的染色质。
使用具有针对组蛋白H3或组蛋白H4具有特异性的抗体的ELISA分析通过先前所描述的方法中的任一种制备的去核的融合剂脂质体和阳性对照细胞(例如亲本细胞)的染色质含量。组蛋白为染色质的主要蛋白质组分，并且H3和H4为主要的组蛋白。
使用商业试剂盒(例如Abcam组蛋白提取试剂盒(ab113476))或所属领域已知的其它方法从融合剂脂质体制剂和细胞制剂提取组蛋白。将这些等分试样存储在-80℃下直到使用。通过在分析缓冲液的溶液中将纯化的组蛋白(H3或H4)稀释为1ng/μl到50ng/μl来制备标准连续稀释液。分析缓冲液可以来源于由制造商供应的试剂盒(例如Abcam组蛋白H4总定量试剂盒(ab156909)或Abcam组蛋白H3总定量试剂盒(ab115091))。将分析缓冲液添加到涂布有用抗组蛋白H3或抗H4抗体的48孔盘或96孔盘的每个孔，并且将样品或标准对照物添加到孔以使每个孔的总体积达到50μl。随后将培养盘覆盖并且在37℃下培育90到120分钟。
在培育之后，制备结合到与培养盘连接的抗组蛋白抗体的任何组蛋白以进行检测。吸出上清液并且将培养盘用150μl洗涤缓冲液洗涤。随后将包括抗组蛋白H3或抗H4捕获抗体的捕获缓冲液以50μl的体积和1μg/mL的浓度添加到培养盘。随后将培养盘在室温下在定轨振荡器上培育60分钟。
随后，将培养盘吸出并且使用洗涤缓冲液洗涤6次。随后将可被捕获抗体活化的信号报道分子添加到每个孔。将培养盘覆盖并且在室温下培育30分钟。随后将培养盘吸出并且使用洗涤缓冲液洗涤4次。通过添加终止溶液来终止反应。读取培养盘中的每个孔在450nm处的吸光度，并且根据450nm处的吸光度相对于标准样品中组蛋白的浓度的标准曲线计算每个样品中组蛋白的浓度。
在一个实施例中，融合剂脂质体样品将包含有核亲本细胞的组蛋白浓度的小于1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实例34：测量融合剂脂质体中的miRNA含量
这个实例描述融合剂脂质体中的微RNA(miRNA)的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体包含miRNA。
miRNA为控制信使RNA(mRNA)翻译成蛋白质的速率(以及其它活动)的调节元件。在一个实施例中，携带miRNA的融合剂脂质体可以用于将miRNA递送到靶位点。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如先前所描述地制备来自融合剂脂质体或亲本细胞的RNA。至少一个miRNA基因是选自www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/index.shtml处的Sanger Center miRNA Registry。如Chen等人，《核酸研究》，33(20)，2005中所描述地制备miRNA。通过赛默飞世尔(A25576。马萨诸塞州沃尔瑟姆(Waltham，MA))可获得所有TaqMan miRNA分析。
根据制造商的说明书对miRNA cDNA进行qPCR，并且使用实时PCR系统如本文所描述地产生和分析CT值。
在一个实施例中，融合剂脂质体的miRNA含量将为其亲本细胞的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例35：定量融合剂脂质体中的内源RNA或合成RNA的表达
这个实例描述定量具有改变的表达的内源RNA或在融合剂脂质体中表达的合成RNA的水平。
融合剂脂质体或亲本细胞被工程改造以改变介导融合剂脂质体的细胞功能的内源或合成RNA的表达。
转座酶载体(系统生物科学公司(System Biosciences，Inc.))包括嘌呤霉素抗性基因的开放阅读框连同蛋白质药剂的克隆片段的开放阅读框。使用电穿孔器(Amaxa)和293T细胞系特异性核转染试剂盒(龙沙(Lonza))将载体电穿孔到293T中。
在含有20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中用嘌呤霉素选择3-5天后，通过先前实例中所描述的方法中的任一种由稳定表达的细胞系制备融合剂脂质体。
如先前实例中所描述地分离个别融合剂脂质体并且定量每个融合剂脂质体的蛋白质药剂或RNA。
在一个实施例中，融合剂脂质体将具有至少1、2、3、4、5、10、20、50、100、500、103、5.0×103、104、5.0×104、105、5.0×105、106、5.0×106或更多个RNA/融合剂脂质体。
实例36：测量融合剂脂质体中的蛋白质组学组成
这个实例描述定量融合剂脂质体的蛋白质组成。在一个实施例中，融合剂脂质体的蛋白质组成将与衍生其的细胞类似。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。将融合剂脂质体再悬浮于溶解缓冲液(7M脲、2M硫脲、于50mM Tris中的4％(w/v)Chaps，pH 8.0)中并且在室温下在偶尔涡旋的情况下培育15分钟。随后通过在冰浴中超声处理5分钟将混合物溶解并且以13,000RPM短暂离心5分钟。通过比色分析(皮尔斯(Pierce))确定蛋白质含量并且将每个样品的蛋白质转移到新试管中并用50mM Tris pH 8平衡体积。
将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺烷基化30分钟。通过逐渐添加6体积的冷(-20℃)丙酮使蛋白质沉淀，并且在-80℃下培育整夜。用冷(-20℃)甲醇洗涤蛋白质集结粒3次。将蛋白质再悬浮于50mM Tris pH 8.3中。
随后，在消化的前4小时内在37℃下在搅拌下将胰蛋白酶/lysC添加到蛋白质。将样品用50mM Tris pH 8稀释，并且将0.1％脱氧胆酸钠与更多胰蛋白酶/lysC一起添加以在37℃下在搅拌下消化整夜。停止消化并且通过添加2％v/v甲酸来去除脱氧胆酸钠。将样品涡旋并且通过以13,000RPM离心1分钟来清除。通过逆相固相萃取(SPE)来纯化肽并干燥。将样品在20μl的3％DMSO、0.2％甲酸的水溶液中复原并且通过LC-MS分析。
为了进行定量测量，还在仪器上运行蛋白质标准物。将标准肽(皮尔斯(Pierce)，等摩尔，LC-MS级，#88342)稀释到4、8、20、40和100fmol/μl并且通过LC-MS/MS进行分析。对于每种浓度，计算每种蛋白质的5个最佳肽(3个MS/MS过渡/肽)的平均AUC(曲线下面积)以产生标准曲线。
用高分辨率质谱仪(ABSciex，美国加利福尼亚州福斯特市(Foster City，CA，USA))进行采集，所述质谱仪配备有具有25μm iD毛细管的电喷雾接口并且与微超高效液相色谱仪(μUHPLC)(Eksigent，美国加利福尼亚州雷德伍德城(Redwood City，CA，USA))耦接。分析软件用于控制仪器以及进行数据处理和采集。将源电压设置为5.2kV并且维持于225℃下，将气帘气设置为27psi，将气体一设置为12psi并将气体二设置为10psi。对于蛋白质数据库，以信息相关采集(Information Dependent Acquisition；IDA)模式进行采集，并且对于样品，以SWATH采集模式进行采集。在维持于60℃下的0.3μm i.d.，2.7μm颗粒，150mm长的逆相色谱柱(特拉华州威明顿的先进材料技术(Advance Materials Technology，Wilmington，DE))上进行分离。样品通过环路过满注入5μL环路中。对于120分钟(样品)LC梯度，移动相包括以下：流动速率为3μL/分钟的溶剂A(于水中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO v/v)和溶剂B(于EtOH中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO)。
对于蛋白质的绝对定量，使用每种蛋白质的5个最佳肽(3MS/MS离子/肽)的AUC的总和产生标准曲线(5点，R2＞0.99)。为了产生用于样品分析的数据库，对12个样品中的每一个运行DIAUmpire算法并且与输出MGF文件合并到一个数据库中。这个数据库与软件(ABSciex)一起使用，以使用5个过渡/肽和5个肽/蛋白质最大值定量每个样品中的蛋白质。如果计算的评分高于1.5或FDR＜1％，则将肽视为被充分测量。将每个充分测量的肽的AUC的总和绘制于标准曲线上，并且报告为fmol。
随后如下地分析所得蛋白质定量数据，以确定已知类别的蛋白质的蛋白质水平和比例：酶被鉴别为用酶委员会(EC)编号注释的蛋白质；ER相关蛋白被鉴别为具有ER而非线粒体的基因本体(GO；http://www.geneontology.org)细胞区室分类的蛋白质；外泌体相关蛋白被鉴别为具有外泌体而非线粒体的基因本体细胞区室分类的蛋白质；并且线粒体蛋白被鉴别为在MitoCarta数据库中被鉴别为线粒体的蛋白质(Calvo等人，NAR 20151doi：10.1093/nar/gkv1003)。将这些类别中的每一个的摩尔比确定为每类中的所有蛋白质的摩尔量的总和除以每个样品中所有鉴别的蛋白质的摩尔量的总和。
将融合剂脂质体蛋白质组学组成与亲本细胞蛋白质组学组成进行比较。在一个实施例中，当＞50％的鉴别的蛋白质存在于融合剂脂质体中时，在融合剂脂质体与亲本细胞之间观察到类似的蛋白质组学组成，并且在那些鉴别的蛋白质中，水平为亲本细胞中的对应蛋白质水平的＞25％。
实例37：测量融合剂脂质体中的GAPDH
这个分析描述定量融合剂脂质体中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的GAPDH的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于GAPDH的标准可商购的ELISA(ab176642，Abcam)在亲本细胞和融合剂脂质体中测量GAPDH。
以用于测量GAPDH的样品的相同体积，如先前所描述地通过二喹啉甲酸分析来类似地测量总蛋白质水平。在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的GAPDH/总蛋白质的水平将为＜100ng GAPDH/μg总蛋白质。类似地，在实施例中，从亲本细胞到融合剂脂质体的GAPDH水平相对于总蛋白质的降低将为大于10％降低。
在一个实施例中，以ng GAPDH/μg总蛋白质为单位的制剂中的GAPDH含量将为小于500、小于250、小于100、小于50、小于20、小于10、小于5或小于1。
在一个实施例中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg为单位的GAPDH/总蛋白质的降低将为大于1％、大于2.5％、大于5％、大于10％、大于15％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％。
实例38：测量融合剂脂质体中的钙联蛋白
这个分析描述定量融合剂脂质体中的钙联蛋白(CNX)水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的CNX的相对水平。
根据制造商的说明，使用用于钙联蛋白的标准可商购的ELISA(MBS721668，MyBioSource)在起始细胞和制剂中测量钙联蛋白。
以用于测量钙联蛋白的样品的相同体积，如先前所描述地通过二喹啉甲酸分析来类似地测量总蛋白质水平。在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的钙联蛋白/总蛋白质的水平将为＜100ng钙联蛋白/μg总蛋白质。类似地，在实施例中，从亲本细胞到融合剂脂质体的钙联蛋白水平相对于总蛋白质的增加将为大于10％增加。
在一个实施例中，以ng钙联蛋白/μg总蛋白质为单位的制剂中的钙联蛋白含量将为小于500、250、100、50、20、10、5或1。
在一个实施例中，从亲本细胞到制剂的以ng/μg为单位的钙联蛋白/总蛋白质的减少将为大于1％、2.5％、5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
实例39：比较可溶性与不溶性蛋白质质量
这个实例描述定量融合剂脂质体中的可溶性：不溶性蛋白质质量比。在一个实施例中，融合剂脂质体中的可溶性：不溶性蛋白质质量比将与有核细胞类似。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。使用标准二喹啉甲酸分析(BCA)(例如使用可商购的PierceTM BCA蛋白质分析试剂盒，赛默飞世尔产品编号23225)测试融合剂脂质体制剂以确定可溶性：不溶性蛋白质的比。通过将制备的融合剂脂质体或亲本细胞以1×107个细胞或融合剂脂质体/mL的浓度悬浮于PBS中，并且以1600g离心以将融合剂脂质体或细胞制成集结粒来制备可溶性蛋白质样品。以可溶蛋白质洗脱份形式收集上清液。
通过剧烈移液并且在具有2％Triton-X-100的PBS中涡旋来溶解集结粒中的融合剂脂质体或细胞。溶解的洗脱份表示不溶性蛋白质洗脱份。
使用供应的BSA，每孔0到20μg(一式三份)来产生标准曲线。融合剂脂质体或细胞制剂被稀释，使得测量的量在标准范围内。一式三份地分析融合剂脂质体制剂并且使用平均值。将可溶性蛋白质浓度除以不溶性蛋白质浓度以得到可溶性：不溶性蛋白质比。
在一个实施例中，相比于亲本细胞，融合剂脂质体可溶性：不溶性蛋白质比将在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大内。
实例40：测量融合剂脂质体中的LPS
这个实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂多糖(LPS)的水平。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有相比于亲本细胞较低水平的LPS。
LPS是细菌膜的组分和先天免疫应答的强力诱导剂。
如先前实例中所描述，LPS测量是基于质谱分析。
在一个实施例中，融合剂脂质体的脂质含量的小于5％、1％、0.5％、0.01％、0.005％、0.0001％、0.00001％或更小将为LPS。
实例41：融合剂脂质体中的脂质与蛋白质的比
这个实例描述定量融合剂脂质体中的脂质质量与蛋白质质量的比。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有与有核细胞类似的脂质质量与蛋白质质量的比。
总脂质含量计算为在先前实例中概述的脂质组学数据集中鉴别的所有脂质的摩尔含量的总和。通过如本文所描述的二喹啉甲酸分析来测量融合剂脂质体的总蛋白含量。
替代地，脂质与蛋白质的比可以被描述为特定脂质物种与特定蛋白质的比。特定脂质物种是选自先前实例中所产生的脂质组学数据。特定蛋白质是选自先前实例中所产生的蛋白质组学数据。所选脂质物种和蛋白质的不同组合用于定义特定的脂质∶蛋白质比。
实例42：融合剂脂质体中的蛋白质与DNA的比
这个实例描述定量融合剂脂质体中的蛋白质质量与DNA质量的比。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有比细胞大得多的蛋白质质量与DNA质量的比。
如先前实例中所描述地测量融合剂脂质体和细胞的总蛋白质含量。如先前实例中所描述地测量融合剂脂质体和细胞的DNA质量。随后通过将总蛋白质含量除以总DNA含量来确定蛋白质与总核酸的比，以得到典型融合剂脂质体制剂的在给定范围内的比。
替代地，通过使用半定量实时PCR(RT-PCR)将核酸水平定义为特定管家基因，如GAPDH的水平来确定蛋白质与核酸的比。
随后通过将总蛋白含量除以总GAPDH DNA含量来确定蛋白质与GAPDH核酸的比，以定义典型融合剂脂质体制剂的蛋白质∶核酸比的特定范围。
实例43：测量与靶细胞的融合
这个实例描述定量相比于非靶细胞，融合剂脂质体与靶细胞的融合。
在一个实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的融合允许将融合剂脂质体的内腔中携带的货物细胞特异性地递送到接受者细胞的胞质溶胶。如下分析通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体与靶细胞的融合速率。
在这个实例中，融合剂脂质体包含在其质膜上表达成肌蛋白的HEK293T细胞。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为成肌细胞，其表达成肌蛋白和肌混合蛋白二者，并且非靶细胞为成纤维细胞，其既不表达成肌蛋白也不表达肌混合蛋白。预测表达成肌蛋白的融合剂脂质体与表达成肌蛋白和肌混合蛋白两者的靶细胞融合但不与非靶细胞融合(Quinn等人，2017，《自然通信(Nature Communications)》，8，15665.doi.org/10.1038/ncomms15665)(Millay等人，2013，《自然》，499(7458)，301-305.doi.org/10.1038/nature12343)。靶细胞和非靶细胞类型均从小鼠分离并且在CMV启动子下稳定表达“LoxP-stop-Loxp-tdTomato”盒，所述启动子在通过Cre重组后开启tdTomato表达，指示融合。
将靶接受者细胞或非靶接受者细胞接种于黑色的透明底部96孔盘中。靶细胞和非靶细胞均对于不同融合基团进行接种。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白和成肌蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施用融合剂脂质体之后，将细胞盘以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。
从融合剂脂质体应用后四小时开始，对细胞孔成像以阳性地鉴别区域或孔中的RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。
在这个实例中，使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞盘进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nmLED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nmLED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集靶细胞孔和非靶细胞孔的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。每4小时对孔成像以采集融合活性速率的时程数据。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband，W.S.，ImageJ，美国国家卫生研究院(U.S.National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，Maryland，USA)，rsb.info.nih.gov/ij/，1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包括整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。在含有靶接受者细胞或非靶接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中减去RFP阳性细胞的数目(以减去非特异性Loxp重组)。随后在每个时间点将RFP阳性细胞(融合的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未融合的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量接受者细胞群内的融合剂脂质体融合速率。将速率标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。对于靶向融合(融合剂脂质体与所靶向的细胞融合)的速率，从与靶细胞的融合速率减去与非靶细胞的融合速率，以定量靶向融合的速率。
在一个实施例中，融合剂脂质体与靶细胞的平均融合速率将在0.01-4.0RFP/GFP细胞/小时范围内(对于靶细胞融合)，或为非靶接受者细胞与融合剂脂质体的平均融合速率的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。在一个实施例中，未施用融合剂脂质体的组将展示＜0.01RFP/GFP细胞/小时的背景速率。
实例44：递送膜蛋白的体外融合
这个实例描述融合剂脂质体与细胞的体外融合。在一个实施例中，融合剂脂质体与细胞的体外融合使得将活性膜蛋白递送到接受者细胞。
在这个实例中，融合剂脂质体是从表达仙台病毒HVJ-E蛋白的HEK293T细胞产生(Tanaka等人，2015，《基因疗法》，22(2014年10月)，1-8.doi.org/10.1038/gt.2014.12)。在一个实施例中，产生融合剂脂质体以表达膜蛋白GLUT4，其主要发现于肌肉和脂肪组织中并且负责胰岛素调节的葡萄糖向细胞内的转运。如先前实例中所描述的方法种的任一种所描述，由HEK293T细胞制备具有或不具有GLUT4的融合剂脂质体。
随后用表达GLUT4的融合剂脂质体、不表达GLUT4的融合剂脂质体、PBS(阴性对照)或胰岛素(阳性对照)处理肌肉细胞，如C2C12细胞。通过荧光2-脱氧葡萄糖类似物，2-[N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基]-2-脱氧葡萄糖(2-NBDG)的摄取来测量GLUT4对C2C12细胞的活性。使用先前实例中所描述的方法，通过显微镜评估C2C12细胞的荧光。
在一个实施例中，预期相比于用PBS或不表达GLUT4的融合剂脂质体处理的C2C12细胞，用表达GLUT4和胰岛素的融合剂脂质体处理的C2C12细胞展示增加的荧光。
另外参见Yang等人，《先进材料(Advanced Materials)》29，1605604，2017。
实例45：测量从血管的外渗
这个实例描述用体外微流体系统测试的跨内皮单层的融合剂脂质体外渗的定量(J.S Joen等人2013，journals.plos.org/plosone/article？id＝10.1371/journal.pone.0056910)。
细胞从血管系统外渗到周围组织中。不希望受理论束缚，外渗为融合剂脂质体到达血管外组织的一种方式。
系统包括三个可独立寻址的介质通道，所述通道由可以将ECM模拟凝胶注入其中的腔室分隔。简单来说，微流体系统具有模制的PDMS(聚二甲基硅氧烷；Silgard 184；密歇根州的陶氏化学(Dow Chemical，MI))，通过其钻取进入口并且结合到盖玻璃以形成微流体通道。通道截面尺寸为1mm(宽度)×120μm(高度)。为了增强基质黏着，PDMS通道涂布有PDL(聚D-赖氨酸氢溴酸盐；1mg/ml；密苏里州圣路易斯的西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO))溶液。
随后，将I型胶原蛋白(BD生物科学，美国加利福尼亚州圣何塞)溶液(2.0mg/ml)伴以磷酸盐缓冲盐水(PBS；Gibco)和NaOH通过四个单独的填充口注入装置的凝胶区域中，并且培育30分钟以形成水凝胶。当凝胶聚合时，立即将内皮细胞培养基(从如龙沙或西格玛的供应商获得)吸移到通道中以防止凝胶脱水。吸出培养基后，将稀水凝胶(BD科学)溶液(3.0mg/ml)引入到细胞通道中并且使用冷培养基将过量的水凝胶溶液洗掉。
将内皮细胞引入到中间通道中并且使其沉降以形成内皮。在内皮细胞接种后两天，将融合剂脂质体或巨噬细胞(阳性对照)引入到相同通道中，其中内皮细胞已在所述通道中形成完整的单层。引入融合剂脂质体以使其附着并且跨单层转移到凝胶区域中。将培养物保持于37℃和5％CO2下的含湿气培育箱中。融合剂脂质体的GFP表达型式用于使得能够通过荧光显微镜进行活细胞成像。第二天，将细胞固定并在腔室中使用DAPI染色对细胞核染色，并且使用共聚焦显微镜对多个所关注区域成像以确定多少融合剂脂质体穿过了内皮单层。
在一个实施例中，DAPI染色将指示在接种后，融合剂脂质体和阳性对照细胞能够穿过内皮屏障。
实例46：测量趋化性细胞迁移率
这个实例描述融合剂脂质体趋化性的定量。细胞可以通过趋化性而朝向或远离化学梯度移动。在一个实施例中，趋化性将使融合剂脂质体归巢到损伤部位或追踪病原体。如下地分析通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的纯化融合剂脂质体组合物的趋化能力。
根据制造商提供的方案在DMEM培养基(ibidi.com/img/cms/products/labware/channel_slides/S_8032X_Chemotaxis/IN_8032X_Chemotaxis.pdf)中，将足够数量的融合剂脂质体或巨噬细胞(阳性对照)装入显微镜玻片孔中。将融合剂脂质体在37℃和5％CO2下放置1小时以使其附着。在细胞附着后，将DMEM(阴性对照)或含DMEM的MCP1化学引诱剂装载至中心通道的相邻储集器中，并且使用Zeiss倒置宽视野显微镜对融合剂脂质体连续成像2小时。使用ImageJ软件(Rasband，W.S.，ImageJ，美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，http：//rsb.info.nih.gov/ij/，1997-2007)分析图像。用手动追踪插件(FabriceCordelières，Institut Curie，法国(奥赛Orsay，France))获取每个观察到的融合剂脂质体或细胞的迁移协调数据。趋化图和迁移速度是由趋化性和迁移工具(ibidi)确定。
在一个实施例中，融合剂脂质体的平均累积距离和迁移速度将在阳性对照细胞对趋化因子的应答的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。细胞对趋化因子的应答描述于例如Howard E.Gendelman等人，《神经免疫药理学杂志(Journal of Neuroimmune Pharmacology)》，4(1)：47-59，2009中。
实例47：测量归巢潜力
这个实例描述将融合剂脂质体归巢到损伤部位。细胞可以从远端部位迁移和/或积聚于特定部位，例如归巢到部位。通常，位点为损伤部位。在一个实施例中，融合剂脂质体将归巢到，例如迁移到或积聚于损伤部位。
通过使用30G针以2μg/mL的浓度将肌肉内(IM)注射到右胫骨前肌(TA)中而向八周龄C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratories))给药含黑牙蛇毒素(NTX)(精密化学科技公司(Accurate Chemical&Scientific Corp))，一种含肌肉毒素的无菌生理盐水。通过使用化学脱毛剂对区域脱毛45秒，接着用水冲洗3次而制备胫骨前肌(TA)上的皮肤。选择这个浓度以确保肌纤维的最大变性，以及对其卫星细胞、运动神经元轴突和血管的最小损伤。
在NTX注射后的第1天，小鼠接受表达萤火虫荧光素酶的融合剂脂质体或细胞的静脉内注射。通过先前实例所描述的方法中的任一种从稳定表达萤火虫荧光素酶的细胞产生融合剂脂质体。生物发光成像系统(珀金埃尔默(Perkin Elmer))用于在注射后0、1、3、7、21和28处获得生物发光的整个动物图像。
在成像前五分钟，小鼠接受以150mg/kg剂量腹膜内注射的生物发光底物(珀金埃尔默)以使荧光素酶可视化。成像系统被校准以补偿所有装置设置。使用辐射光子(Radiance Photons)测量生物发光信号，并且将总通量用作测量值。通过围绕ROI的信号产生感兴趣区域(ROI)，以得到以光子数/秒计的值。对用NTX处理的TA肌肉和对侧TA肌肉都评估了ROI，并且计算NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子数/秒的比，作为归巢到NTX处理的肌肉的量度。
在一个实施例中，融合剂脂质体和细胞中的NTX处理的TA肌肉与未用NTX处理的TA肌肉之间的光子数/秒的比将大于1，指示表达荧光素酶的融合剂脂质体在损伤处的位点特异性积聚。
参见例如Plant等人，《肌肉神经(Muscle Nerve)》34(5)L 577-85，2006。
实例48：测量吞噬活性
这个实例表明融合剂脂质体的吞噬活性。在一个实施例中，融合剂脂质体具有吞噬活性，例如能够进行吞噬作用。细胞参与吞噬，吞噬颗粒，从而能够封存和破坏外来侵入物，如细菌或死细胞。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的包含来自具有部分或完全核灭活的哺乳动物巨噬细胞的融合剂脂质体的纯化融合剂脂质体组合物能够进行吞噬作用(通过病原体生物粒子所分析)。根据以下方案，通过使用荧光吞噬分析来进行这个评估。
将巨噬细胞(阳性对照)和融合剂脂质体在收获后立即接种于单独的共聚焦玻璃底培养皿中。将巨噬细胞和融合剂脂质体在DMEM+10％FBS+1％P/S中培育1小时以附着。如制造商的方案中所指示地将荧光素标记的大肠杆菌K12和非荧光素标记的大肠杆菌K-12(阴性对照)添加到巨噬细胞/融合剂脂质体，并且培育2小时，tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp06694.pdf。在2小时之后，通过添加锥虫蓝将游离的荧光颗粒淬灭。通过共聚焦显微镜在488激发下对由吞噬颗粒发出的细胞内荧光成像。使用image J软件对吞噬阳性融合剂脂质体的数目进行定量。
在引入生物粒子后2小时，吞噬融合剂脂质体的平均数目为至少30％，并且在阳性对照巨噬细胞中为大于30％。
实例49：测量蛋白质分泌的潜力
这个实例描述由融合剂脂质体的分泌的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体将能够分泌，例如分泌蛋白质。细胞可以通过分泌来处置或排出物质。在一个实施例中，融合剂脂质体将通过分泌在其环境中化学相互作用和通信。
使用来自赛默飞世尔科技的Gaussia荧光素酶快速分析(目录号16158)确定融合剂脂质体以给定速率分泌蛋白质的能力。将通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的小鼠胚胎成纤维细胞(阳性对照)或融合剂脂质体在生长培养基中培育，并通过首先以1600g粒化融合剂脂质体5分钟并且随后收集上清液来每15分钟收集培养基样品。将收集的样品吸移到透明底96孔盘中。随后根据制造商的说明书制备分析缓冲液的工作溶液。
简单来说，将考伦特嗪(colenterazine)，一种荧光素或发光分子与快速分析缓冲液混合并将混合物吸移到含有样品的96孔盘的每个孔中。缺乏细胞或融合剂脂质体的阴性对照孔包括生长培养基或分析缓冲液以确定背景Gaussia荧光素酶信号。另外，制备纯化的Gaussia荧光素酶(Athena Enzyme Systems，目录号0308)的标准曲线以便将每小时发光信号转化为Gaussia荧光素酶分泌的分子。
使用500毫秒积分来分析培养盘的发光。从所有样品减去背景Gaussia荧光素酶信号并且随后计算Gaussia荧光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，那么将其适当稀释并再分析。使用这个分析，确定融合剂脂质体以给定范围内的速率(分子数/小时)分泌Gaussia荧光素酶的能力。
在一个实施例中，融合剂脂质体将能够以阳性对照细胞的1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的速率分泌蛋白质。
实例50：测量信号转导潜力
这个实例描述融合剂脂质体中的信号转导的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体能够进行信号转导。细胞可以通过信号级联(如磷酸化)在称为信号转导的过程中从细胞外环境发送和接收分子信号。通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的包含来自具有部分或完全核灭活的哺乳动物细胞的融合剂脂质体的纯化融合剂脂质体组合物能够进行胰岛素诱导的信号转导。通过测量AKT磷酸化水平，胰岛素受体信号级联中的关键途径和回应于胰岛素的葡萄糖摄取来评估胰岛素诱导的信号转导。
为了测量AKT磷酸化，将细胞，例如小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(阳性对照)和融合剂脂质体接种于48孔盘中并且在37℃和5％CO2下的含湿气培育箱中放置2小时。在细胞粘着后，将胰岛素(例如10nM)或不含胰岛素的阴性对照溶液添加到含有细胞或融合剂脂质体的孔种持续30分钟。在30分钟后，由融合剂脂质体或细胞制得蛋白质溶解物，并且通过蛋白质印迹法测量胰岛素刺激和对照物未刺激的样品中的磷酸化AKT水平。
如在葡萄糖摄取部分中所阐述，通过使用经标记的葡萄糖(2-NBDG)来测量回应于胰岛素或阴性对照溶液的葡萄糖摄取。(S.Galic等人，《分子细胞生物学》25(2)：819-829，2005)。
在一个实施例中，相比于阴性对照，融合剂脂质体将增强AKT磷酸化和回应于胰岛素的葡萄糖摄取至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实例51：测量跨细胞膜转运葡萄糖的能力
这个实例描述2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)的水平的定量，2-NBDG为一种可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取，并且因此测量跨脂质双层的主动转运的荧光葡萄糖类似物。在一个实施例中，这个分析可以用于测量葡萄糖摄取的水平和跨融合剂脂质体的脂质双层的主动转运。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体组合物。随后将足够数量的融合剂脂质体在不含葡萄糖、20％胎牛血清和1×青霉素/链霉素的DMEM中在37℃和5％CO2下培育2小时。在2小时葡萄糖饥饿时段之后，更换培养基以使其包括不含葡萄糖、20％胎牛血清、1×青霉素/链霉的DMEM和20μM 2-NBDG(赛默飞世尔)并且再在37℃和5％CO2下培育2小时。
相同地处理阴性对照融合剂脂质体，除了添加等量的DMSO来代替2-NBDG。
随后将融合剂脂质体用1×PBS洗涤三次并且再悬浮于适当缓冲液中，并转移到96孔成像培养盘中。随后使用GFP光立方体(469/35激发滤光片和525/39发射滤光片)在荧光计中测量2-NBDG荧光，以定量在1小时装载时段内已跨融合剂脂质体膜转运并累积于融合剂脂质体中的2-NBDG的量。
在一个实施例中，相比于阴性(DMSO)对照，经2-NBDG处理的融合剂脂质体中的2-NBDG荧光将更高。用525/39发射滤光片的荧光测量将与存在的2-NBDG分子的数目相关。
实例52：测量胞质溶胶中的酯酶活性
这个实例描述融合剂脂质体中的酯酶活性的定量，作为代谢活性的替代。通过钙黄绿素-AM染色的定量评估来确定融合剂脂质体中的胞质酯酶活性(Bratosin等人，《细胞测量术(Cytometry)》66(1)：78-84，2005)。
膜渗透性染料钙黄绿素-AM(分子探针公司，尤金或美国)制备为10mM的二甲亚砜储备溶液和100mM的PBS缓冲液，pH 7.4的工作溶液。将通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体或阳性对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞悬浮于PBS缓冲液中，并且与钙黄绿素-AM工作溶液(钙黄绿素-AM中的最终浓度：5mM)一起在37℃下在黑暗中培育30分钟，并且随后在PBS缓冲液中稀释以立即进行钙黄绿素荧光保留的流式细胞测量分析。
如(Jacob等人，《细胞测量术(Cytometry)》12(6)：550-558，1991)中所描述，用皂苷将融合剂脂质体和对照亲本小鼠胚胎成纤维细胞实验性透化为零酯酶活性的阴性对照。将融合剂脂质体和细胞在含有0.05％叠氮化钠的1％皂苷于PBS缓冲液，pH 7.4中的溶液中培育15分钟。由于质膜透化的可逆性质，在用于另外染色和洗涤步骤的所有缓冲液中均包括皂苷。在皂苷透化后，将融合剂脂质体和细胞悬浮于含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠PBS缓冲液中并且与钙黄绿素-AM一起培育(37℃在黑暗中持续45分钟)到5mM的最终浓度，用相同的含有0.1％皂苷和0.05％叠氮化钠的PBS缓冲液洗涤三次，并且通过流式细胞测量术进行分析。在FACS细胞仪(百克顿-迪金森公司，美国加利福尼亚州圣何塞)上进行流式细胞测量术分析，在530+/-30nm处收集488nm氩气激光激发和发射。FACS软件用于采集和分析。将光散射通道设定为线性增益，并将荧光通道设定为对数标度，其中在每种条件下分析最少10,000个细胞。基于每个样品中的钙黄绿素-AM的强度计算相对酯酶活性。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来仅选择融合剂脂质体群)。通过减去对应的阴性对照皂苷处理的样品的荧光强度(FI)值来确定融合剂脂质体的FI值。将融合剂脂质体样品的标准化酯酶活性相对于对应的阳性对照细胞样品进行标准化，以产生胞质酯酶活性的定量测量结果。
在一个实施例中，融合剂脂质体制剂相比于阳性对照细胞将具有1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的酯酶活性。
另外参见Bratosin D，Mitrofan L，Palii C，Estaquier J，Montreuil J.使用钙黄绿素-AM的新型荧光分析，用于测定人类红细胞活力和衰老(Novel fluorescence assayusing calcein-AM for the determination of human erythrocyte viability andaging.)《细胞测量术A》2005年7月；66(1)：78-84；以及Jacob BC，Favre M，Bensa JC.用皂苷的膜细胞透化和通过流式细胞测量术的多参数分析(Membrane cell permeabilisationwith saponin and multiparametric analysis by flow cytometry.)《细胞测量术》1991；12：550-558。
实例53：测量融合剂脂质体中的乙酰胆碱酯酶活性
遵循先前描述的程序(Ellman等人，《生化药理学(Biochem.Pharmacol.)》7，88，1961)并遵循制造商的建议使用试剂盒(MAK119，西格玛)测量乙酰胆碱酯酶活性。
简单来说，将融合剂脂质体悬浮于含1.25mM乙酰硫代胆碱的PBS，pH 8中，与含0.1mM5，5-二硫基-双(2-硝基苯甲酸)的PBS，pH 7混合。在室温下进行培育，但在开始光学密度读取之前，将融合剂脂质体和底物溶液在37℃下预温热10分钟。
用盘读取器分光光度计(ELX808，BIO-TEK instruments，美国佛蒙特州威努斯基(Winooski，VT，USA))在450nm处监测吸收变化10分钟。单独地，样品用于通过二喹啉甲酸分析来确定融合剂脂质体的蛋白质含量以进行标准化。使用这个分析，融合剂脂质体被确定为具有＜100AChE活性单位/μg蛋白质。
在一个实施例中，AChE活性单位/μg蛋白质值将小于0.001、0.01、0.1、1、10、100或1000。
实例54：测量代谢活性水平
这个实例描述融合剂脂质体中的柠檬酸合成酶活性的测量的定量。
柠檬酸合成酶为三羧酸(TCA)循环内的一种酶，其催化草酰乙酸(OAA)与乙酰基-CoA之间的反应以产生柠檬酸盐。在乙酰基-CoA水解后，会释放具有硫醇基的CoA(CoA-SH)。硫醇基与化学试剂5，5-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，以形成5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，其为可以分光光度法在412nm处测量的黄色产物(Green 2008)。可商购的试剂盒，如Abcam人类柠檬酸合成酶活性分析试剂盒(产品编号ab119692)提供了执行这个测量所需的所有试剂。
根据制造商的建议进行分析。如下制备融合剂脂质体样品溶解物：收集通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体并将其在提取缓冲液(Abcam)中在冰上溶解20分钟。在离心之后收集上清液，并通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔科技)评估蛋白质含量，并且将制剂保持于冰上直到引发以下定量方案。
简单来说，将融合剂脂质体溶解物样品在提供的微盘孔中的1×培育缓冲液(Abcam)中稀释，其中一组孔仅接受1×培育缓冲液。将板密封并且在室温下在300rpm振荡下培育4小时。随后从孔中吸出缓冲液并添加1×洗涤缓冲液。再次重复这个洗涤步骤。随后，将1×活性溶液添加到每个孔，并且通过每20秒测量412nm处的吸光度持续30分钟，并在读取之间振荡而在微盘读取器上分析培养盘。
从所有孔减去背景值(仅具有1×培育缓冲液的孔)，并且将柠檬酸合成酶活性表示为每微克装载的融合剂脂质体溶解物样品每分钟吸光度的变化(ΔmOD@412nm/分钟/μg蛋白质)。仅使用动力学测量的100-400秒的线性部分来计算活性。
在一个实施例中，融合剂脂质体制剂相比于对照细胞将具有在1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的合成酶活性。
参见例如Green HJ等人，在运动和恢复的连续三天内，人体肌肉中的代谢、酶和转运体反应(Metabolic，enzymatic，and transporter response in human muscle duringthree consecutive days of exercise and recovery.)《美国生理调节、综合和比较生理学杂志(Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol)》295：R1238-R1250，2008。
实例55：测量呼吸水平
这个实例描述融合剂脂质体中的呼吸水平的测量的定量。细胞中的呼吸水平可以为耗氧量的量度，其促进代谢。通过Seahorse细胞外通量分析仪(安捷伦(Agilent))测量融合剂脂质体呼吸的耗氧量(Zhang 2012)。
将通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生的融合剂脂质体或细胞接种于96孔Seahorse微盘(安捷伦)中。将微盘短暂离心以将孔底部的融合剂脂质体和细胞制成集结粒。如下起始耗氧量分析：通过去除生长培养基，用含有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰氨(安捷伦)的低缓冲DMEM基本培养基代替并且在37℃下培育微盘60分钟以使温度和pH平衡。
随后在细胞外通量分析仪(安捷伦)中分析微盘，所述分析仪测量紧贴在附着的融合剂脂质体和细胞周围的培养基中的细胞外氧和pH的变化。在获得稳态耗氧量(基础呼吸速率)和细胞外酸化速率后，将抑制ATP合成酶的寡霉素(5μM)和将线粒体解偶联的质子离子载体FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；2μM)添加到微盘的每个孔，以获得最大耗氧率的值。
最后，添加5μM抗霉素A(线粒体复合物III的抑制剂)以确认呼吸变化主要是由于线粒体呼吸。从所有耗氧量测量结果中减去添加抗霉素A后的最低耗氧率，以去除非线粒体呼吸组分。分析中不包括对寡霉素(耗氧率相比于基础至少降低25％)或FCCP(耗氧率相比于基础至少增加50％)的应答不恰当的细胞样品。随后将融合剂脂质体呼吸水平测量为pmolO2/min/le4融合剂脂质体。
随后将这个呼吸水平标准化为对应的细胞呼吸水平。在一个实施例中，融合剂脂质体相比于各别细胞样品将具有在至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内的呼吸水平。
参见例如Zhang J，Nuebel E，Wisidagama DRR等人测量经培养的细胞，包括人类多能干细胞和分化细胞中的能量代谢(Measuring energy metabolism in culturedcells，including human pluripotent stem cells and differentiated cells.)《自然实验手册(Nature protocols.)》2012；7(6)：10.1038/nprot.2012.048.doi：10.1038/nprot.2012.048。
实例56：测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平
这个实例描述膜联蛋白-V结合到融合剂脂质体表面的水平的定量。
染色细胞可以在细胞表面上显示磷脂酰丝氨酸，其为程序性细胞死亡途径中细胞凋亡的标记。膜联蛋白-V结合到磷脂酰丝氨酸，并且因此，膜联蛋白-V结合为细胞活力的代理。
如本文所描述地产生融合剂脂质体。为了检测凋亡信号，用5％膜联蛋白V荧光剂594(A13203，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)对融合剂脂质体或阳性对照细胞进行染色。每组(详述于下表中)包括用凋亡诱导剂甲萘醌处理的实验组。将甲萘醌以100μM甲萘醌添加4小时。所有样品在流式细胞仪(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上运行，并且用YL1激光在561nm的波长和585/16nm的发射滤光片测量荧光强度。通过比较所有组中的膜联蛋白V的荧光强度来定量细胞外磷脂酰丝氨酸的存在。
阴性对照未染色的融合剂脂质体对膜联蛋白V染色不呈阳性。
在一个实施例中，融合剂脂质体能够回应于甲萘醌上调细胞表面上的磷脂酰丝氨酸显示，指示非甲萘醌刺激的融合剂脂质体未经历凋亡。在一个实施例中，用甲萘醌刺激的阳性对照细胞展现比未用甲萘醌刺激的融合剂脂质体更高水平的膜联蛋白V染色。
表7：膜联蛋白V染色参数
实验组 膜联蛋白V信号的平均荧光强度(和标准差)
未染色的融合剂脂质体(阴性对照) 941(937)
染色的融合剂脂质体 11257(15826)
染色的融合剂脂质体+甲萘醌 18733(17146)
染色的巨噬细胞+甲萘醌(阳性对照) 14301(18142)
实例57：测量近分泌信号传导水平
这个实例描述融合剂脂质体中的近分泌信号传导的定量。
细胞可以通过近分泌信号传导形成细胞接触依赖性信号传导。在一个实施例中，融合剂脂质体中近分泌信号传导的存在将证明融合剂脂质体可以刺激、抑制与其紧邻的细胞并且与所述细胞通信。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种从具有部分或完全核灭活的哺乳动物骨髓基质细胞(BMSC)产生的融合剂脂质体通过巨噬细胞中的近分泌信号传导触发IL-6分泌。将初级巨噬细胞与BMSC共培养。首先将骨髓源性巨噬细胞接种到6孔盘中，并且培育24小时，随后将初级小鼠BMS源性融合剂脂质体或BMSC细胞(阳性对照亲本细胞)置于具有10％FBS的DMEM培养基中的巨噬细胞上。在不同时间点(2、4、6、24小时)收集上清液并通过ELISA分析来分析IL-6分泌。(Chang J.等人，2015)。
在一个实施例中，通过增加培养基中的巨噬细胞分泌的IL-6水平来测量由BMSC融合剂脂质体诱导的近分泌信号传导的水平。在一个实施例中，近分泌信号传导的水平将为由阳性对照骨髓基质细胞(BMSC)诱导的水平的至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
实例58：测量旁分泌值号传导水平
这个实例描述融合剂脂质体中的旁分泌信号传导的定量。
细胞可以通过旁分泌信号传导与局部微环境中的其它细胞通信。在一个实施例中，融合剂脂质体将能够旁进行分泌信号传导，例如以与其局部环境中的细胞通信。在一个实施例中，融合剂脂质体通过以下方案通过旁分泌衍生的分泌在内皮细胞中触发Ca2+信号传导的能力将通过钙指示剂fluo-4AM来测量Ca2+信号传导。
为了制备实验培养盘，将鼠类肺微血管内皮细胞(MPMVEC)接种于0.2％明胶涂布的25mm玻璃底共聚焦培养皿上(80％汇合)。将MPMVEC在室温下在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸(pluronic acid)的ECM中培育30分钟，最终浓度为5μM fluo-4AM(英杰公司(Invitrogen))，以允许装载fluo-4AM。在装载之后，将MPMVEC用含有苯磺唑酮的成像溶液(含有0.25％BSA的ECM)洗涤，以使染料损失降到最低。在装载fluo-4之后，将500μl预温热的实验成像溶液添加到培养盘，并且通过Zeiss共聚焦成像系统对培养盘进行成像。
在单独的试管中，将新鲜分离的鼠类巨噬细胞在培养基(DMEM+10％FBS)中用1μg/ml LPS处理或不用LPS处理(阴性对照)。在刺激后，通过先前实例中所描述的方法中的任一种从巨噬细胞产生融合剂脂质体。
随后在含有2％BSA和0.003％普朗尼克酸的ECM中用cell tracker red CMTPX(英杰公司)标记融合剂脂质体或亲本巨噬细胞(阳性对照)。随后将融合剂脂质体和巨噬细胞洗涤并且再悬浮于实验成像溶液中。将标记的融合剂脂质体和巨噬细胞添加到共聚焦培养盘中的装有fluo-4AM的MPMVEC上。
使用具有氩离子激光源的Zeiss共聚焦成像系统每3秒记录一次绿色和红色荧光信号，持续10-20分钟，其中分别针对fluo-4AM和cell tracker red荧光在488nm和561nm处激发。使用成像软件分析Fluo-4荧光强度变化(Mallilankaraman，K.等人，《可视化实验杂志(J Vis Exp.)》(58)：3511，2011)。从LPS刺激的融合剂脂质体和细胞组中减去阴性对照融合剂脂质体和细胞组中测量的Fluo-4强度水平。
在一个实施例中，相比于阳性对照细胞组，融合剂脂质体，例如活化的融合剂脂质体将诱导至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的Fluo-4荧光强度增加。
实例59：针对迁移率测量使肌动蛋白聚合的能力
这个实例描述融合剂脂质体中的细胞骨架组分(如肌动蛋白)的定量。在一个实施例中，融合剂脂质体包含如肌动蛋白的细胞骨架组分，并且能够进行肌动蛋白聚合。
细胞将肌动蛋白(其为细胞骨架组分)用于运动性和其它细胞质过程。细胞骨架对于产生运动驱动力和协调运动过程至关重要。
如本文所描述地使C2C12细胞去核。将从12.5％和15％Ficoll层获得的融合剂脂质体合并标记为‘轻’，而将来自16-17％层的融合剂脂质体合并并标记为‘中等’。将融合剂脂质体或细胞(亲本C2C12细胞，阳性对照)再悬浮于DMEM+Glutamax+10％胎牛血清(FBS)中，接种于24孔超低附着培养盘(#3473，纽约州康宁的康宁公司(Corning Inc，Corning，NY))中并且在37℃+5％CO2下培育。定期(5.25小时、8.75小时、26.5小时)获取样品并且用165μM若丹明鬼笔环肽染色(阴性对照不染色)，并且在流式细胞仪(#A24858，马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔)上用FC激光YL1(561nm，具有585/16滤光片)测量以测量F-肌动蛋白细胞骨架含量。测量融合剂脂质体以及未染色的融合剂脂质体和染色的亲本C2C12细胞中若丹明鬼笔环肽的荧光强度。
融合剂脂质体荧光强度在所有时间点均大于阴性对照(图1)，并且融合剂脂质体能够以与亲本C2C12细胞类似的速率聚合肌动蛋白。
通过可商购的ELISA系统(Cell Signaling Technology and MyBioSource)，根据制造商的说明书测量其它细胞骨架组分，如下表中所列的那些。
表8：细胞骨架组分
Figure BDA0002963542200004961
随后将100μL适当稀释的溶解物从微孔条带添加到适当的孔中。将微孔用胶带密封并且在37℃下培育2小时。在培育之后，去除密封胶带并且丢弃内含物。每个微孔用200uL的1×洗涤缓冲液洗涤四次。在每次单独洗涤之后，将培养盘在吸水布上敲打，以便从每个孔中去除残留的洗涤溶液。但是，孔在实验期间的任何时候都不是完全干燥的。
随后，将100μl复原的检测抗体(绿色)添加到每个单独的孔中，阴性对照孔除外。随后将孔密封并且在37℃下培育1小时。在培育完成之后重复洗涤程序。将100uL复原的HRP连接的二级抗体(红色)添加到每个孔中。将孔用胶带密封并且在37℃下培育30分钟。随后去除密封胶带并且重复洗涤程序。随后将100μL TMB底物添加到每个孔中。将孔用胶带密封，随后在37℃下培育10分钟。一旦完成这个最终培育，将100μL终止溶液添加到每个孔中并且将培养盘轻轻振荡几秒。
在添加终止溶液的30分钟内进行所述分析的分光光度法分析。用无绒组织擦拭孔的底面并且随后在450nm处读取吸光度。在一个实施例中，已用检测抗体染色的融合剂脂质体样品将在450nm处吸收比阴性对照融合剂脂质体样品更多的光，并且比已用检测抗体染色的细胞样品吸收更少的光。
实例60：测量平均膜电位
这个实例描述融合剂脂质体的线粒体膜电位的定量。在一个实施例中，包含线粒体膜的融合剂脂质体将维持线粒体膜电位。
线粒体代谢活性可以通过线粒体膜电位来测量。使用可商购的染料TMRE定量融合剂脂质体制剂的膜电位，以评估线粒体膜电位(TMRE：四甲基若丹明，乙酯，高氯酸盐，Abcam，目录号T669)。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。在生长培养基(具有10％胎牛血清的无酚红DMEM)中以6等份(未处理和FCCP处理的一式三份)稀释融合剂脂质体或亲本细胞。将样品的一个等分试样与FCCP一起培育，所述FCCP是消除线粒体膜电位并且防止TMRE染色的解偶联剂。对于经FCCP处理的样品，将2μM FCCP添加到样品并且在分析之前培育5分钟。随后用30nM TMRE对融合剂脂质体和亲本细胞进行染色。对于每个样品，还并行地制备未染色的(无TMRE)样品。将样品在37℃下培育30分钟。随后将样品在具有488nm氩激光的流式细胞仪上分析，并且在530+/-30nm处收集激发和发射。
基于TMRE的强度计算膜电位值(以毫伏，mV为单位)。在正向和侧向散射通道中捕获所有事件(替代地，可以应用门来排除小碎屑)。通过从未经处理和经FCCP处理的样品的几何平均值减去未染色的样品的荧光强度的几何平均值来将未经处理和经FCCP处理的样品的荧光强度(FI)值标准化。使用标准化荧光强度值用修正的能斯特方程式(Nernstequation)(参见下文)来计算每种制剂的膜电位状态，所述方程式可以用于基于TMRE荧光来确定融合剂脂质体或细胞的线粒体膜电位(因为TMRE以能斯特方式在线粒体中积聚)。
用下式计算融合剂脂质体或细胞膜电位：(mV)＝-61.5*log(FI未处理-标准化/FIFCCP处理-标准化)。在一个实施例中，对来自C2C12小鼠成肌细胞的融合剂脂质体制剂使用这个分析，融合剂脂质体制剂的膜电位状态将在亲本细胞的约1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大内。在一个实施例中，膜电位的范围为约-20mV到-150mV。
实例61：测量个体中的持久性半衰期
这个实例描述融合剂脂质体半衰期的测量。
融合剂脂质体来源于表达Gaussia荧光素酶的细胞，通过先前实例中所描述的方法中的任一种产生，并且在缓冲溶液中制备纯、1∶2、1∶5和1∶10稀释液。将缺少融合剂脂质体的缓冲溶液用作阴性对照。
将每个剂量静脉内施用至三只八周龄雄性C57BL/6J小鼠(杰克逊实验室)。在静脉内施用融合剂脂质体后1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时从眼眶后静脉收集血液。在实验结束时通过CO2吸入将动物处死。
将血液在室温下离心20分钟。立即将血清样品冷冻于-80℃下直到生物分析。随后，在将样品与Gaussia荧光素酶底物(Nanolight，亚利桑那州派恩托普(Pinetop，AZ))混合后，将每个血液样品用于进行Gaussia荧光素酶活性分析。简单来说，将考伦特嗪，一种荧光素或发光分子与快速分析缓冲液混合并且将混合物吸移到含有血液样品的96孔盘的孔中。缺少血液的阴性对照孔含有分析缓冲液以确定背景Gaussia荧光素酶信号。
另外，制备阳性对照纯化的Gaussia荧光素酶(Athena Enzyme Systems，目录号0308)的标准曲线以便将每小时发光信号转化为Gaussia荧光素酶分泌的分子。使用500毫秒积分来分析培养盘的发光。从所有样品减去背景Gaussia荧光素酶信号并且随后计算Gaussia荧光素酶标准曲线的线性最佳拟合曲线。如果样品读数在标准曲线内不拟合，那么将其适当稀释并再分析。将来自1、2、3、4、5、6、12、24、48和72小时处获取的样品的荧光素酶信号内插到标准曲线。使用一室模型的以下方程式计算消除速率常数ke(h-1)：C(t)＝C0 xe-kext，其中C(t)(ng/mL)为时间t(h)处的融合剂脂质体浓度并且C0为在时间＝0时的融合剂脂质体浓度(ng/mL)。将消除半衰期t1/2，e(h)计算为ln(2)/ke。
在一个实施例中，相比于阴性对照细胞，融合剂脂质体将具有至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的半衰期。
实例62：通过非内吞途径递送融合剂脂质体
这个实例描述通过非内吞途径将融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞的定量。
在一个实施例中，融合剂脂质体将通过融合剂脂质体介导的非内吞途径递送药剂。不希望受理论束缚，在不需要任何内吞作用介导的融合剂脂质体摄取的情况下将融合剂脂质体的内腔中携带的药剂(例如Cre)直接递送到接受者细胞的胞质溶胶将通过融合剂脂质体介导的非内吞途径递送来发生。
在这个实例中，融合剂脂质体在其质膜上包含表达仙台病毒H和F蛋白的HEK293T细胞(Tanaka等人，2015，《基因疗法》，22(2014年10月)，1-8.https://doi.org/10.1038/gt.2014.123)。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和Cre作为递送标记。
如下地对通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体分析通过非内吞途径的Cre递送。将接受者细胞接种到黑色的透明底96孔盘中。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。为了确定通过非内吞途径的Cre递送水平，用内体酸化抑制剂氯奎(30μg/mL)处理接受融合剂脂质体的接受者细胞的平行组。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施用融合剂脂质体之后，将细胞盘以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。随后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送Cre。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化荧光显微镜对细胞培养盘进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nmLED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nmLED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband，W.S.，ImageJ，美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞用于设置阈值，并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次设置阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包括整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受Cre的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群的融合剂脂质体Cre的比例。将水平标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。为了计算通过非内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+CQ)以及在不存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-CQ)。为了确定通过非内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的标准化值，使用以下方程式：[(FusL-CQ)-(FusL+CQ)]/(FusL-CQ)。
在一个实施例中，对于给定融合剂脂质体，通过非内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的平均水平将在经氯奎处理的接受者细胞的0.1-0.95范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例63：通过内吞途径递送融合剂脂质体
这个实例描述通过内吞途径融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞。
在一个实施例中，融合剂脂质体将通过融合剂脂质体介导的内吞途径递送药剂。不希望受理论束缚，在摄取途径具有内吞作用依赖性的情况下将融合剂脂质体的内腔中携带的药剂(例如货物)递送到接受者细胞将通过融合剂脂质体介导的内吞途径递送来发生。
在这个实例中，融合剂脂质体包含微囊泡，所述微囊泡通过将在质膜上表达融合剂蛋白的HEK293T细胞挤出通过2μm过滤器而产生(Lin等人，2016，《生物医学微装置(Biomedical Microdevices)》18(3).doi.org/10.1007/s10544-016-0066-y)(Riedel，Kondor-Koch和Garoff，1984，《欧洲分子生物学学会杂志(The EMBO Journal)》，3(7)，1477-83.从www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6086326检索)。另外，融合剂脂质体表达mTagBFP2荧光蛋白和Cre重组酶。靶细胞为PC3细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，所述启动子在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和Cre作为递送标记。
如下地对通过本文所描述的方法产生的融合剂脂质体分析通过内吞途径的Cre递送。将接受者细胞接种于与待使用的成像系统相容的细胞培养多孔盘中(在这个实例中，将细胞接种于黑色的透明底96孔盘中)。随后，在接种接受者细胞之后24小时，将表达Cre重组酶蛋白并且具有特定融合剂蛋白的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的接受者细胞。为了确定通过内吞途径的Cre递送水平，用内体酸化抑制剂氯奎(30μg/mL)处理接受融合剂脂质体的接受者细胞的平行组。融合剂脂质体的剂量与接种于孔中的接受者细胞的数目相关。在施用融合剂脂质体之后，将细胞盘以400g离心5分钟，以帮助引发融合剂脂质体与接受者细胞之间的接触。随后将细胞培育16小时并且通过成像评估药剂递送Cre。
对细胞进行成像以在视场或孔中阳性鉴别RFP阳性细胞相对于GFP阳性细胞。在这个实例中，使用自动化荧光显微镜对细胞培养盘进行成像。通过首先在DMEM培养基中用Hoechst33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst 33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。在染色之后，将Hoechst培养基用常规DMEM培养基替换。
使用405nmLED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nmLED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来采集不同细胞组的图像。
设定采集设置，以使得RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。
用配备有荧光显微镜的软件或其它软件(Rasband，W.S.，ImageJ，美国国家卫生研究院，美国马里兰州贝塞斯达，1997-2007)进行GFP和RFP阳性孔的分析。使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。在Hoechst阳性细胞上设置总细胞掩码。Hoechst强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为Hoechst阳性细胞的区域。
在总细胞掩码内，通过对显著高于背景的细胞再次取阈值并且将Hoechst(细胞核)掩码扩展到整个细胞区域以包括整个GFP和RFP细胞荧光来鉴别GFP和RFP阳性细胞。
在含有接受者细胞的对照孔中鉴别的RFP阳性细胞的数目用于从含有融合剂脂质体的孔中的RFP阳性细胞的数目减去(以减去非特异性Loxp重组)。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(未接受Cre的接受者细胞)与RFP阳性细胞的总和，以定量递送到接受者细胞群的融合剂脂质体Cre的比例。将水平标准化为施加到接受者细胞的融合剂脂质体的给定剂量。为了计算通过内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+CQ)以及在不存在氯奎的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-CQ)。为了确定通过内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的标准化值，使用以下方程式：(FusL+CQ)/(FusL-CQ)。
在一个实施例中，对于给定融合剂脂质体，通过内吞途径递送的融合剂脂质体Cre的平均水平将在经氯奎处理的接受者细胞的0.01-0.6范围内，或至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。
实例64：通过发动蛋白介导的途径、巨胞饮途径或肌动蛋白介导的途径递送融合 剂脂质体
这个实例描述通过发动蛋白介导的途径融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包含微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过发动蛋白介导的途径递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用发动蛋白抑制剂Dynasore(120μM)处理。为了计算通过发动蛋白介导的途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在Dynasore的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+DS)以及在不存在Dynasore的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-DS)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
这个实例还描述通过巨胞饮将Cre递送到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包含微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过巨胞饮递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用巨胞饮抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)(25μM)处理。为了计算通过巨胞饮递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在EIPA的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+EPIA)以及在不存在EPIA的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-EIPA)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
这个实例描述通过肌动蛋白介导的途径融合剂脂质体递送Cre到接受者细胞。可以如先前实例中所描述地产生包含微囊泡的融合剂脂质体。根据先前实例对融合剂脂质体分析通过巨胞饮递送Cre，除了一组接受融合剂脂质体的接受者细胞用肌动蛋白聚合抑制剂Latrunculin B(6μM)处理。为了计算通过肌动蛋白介导的途径递送的融合剂脂质体Cre的值，确定在存在Latrunculin B的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL+LatB)以及在不存在Latrunculin B的情况下的融合剂脂质体Cre递送的水平(FusL-LatB)。可以如先前实例中所描述地计算所递送的融合剂脂质体Cre的标准化值。
实例65：蛋白质的体内递送
这个实例描述通过融合剂脂质体将治疗剂递送的眼部。
融合剂脂质体使用先前实例中所描述的方法中的任一种来源于造血干细胞和祖细胞并且装载有缺乏小鼠基因敲除的蛋白质。
将融合剂脂质体视网膜下注射到缺乏蛋白质的小鼠右眼中，并且将媒剂对照注射到小鼠左眼中。当小鼠达到2个月大时，对其中的子组进行安乐死。
对收集的视网膜组织进行组织学和H&E染色，以计数小鼠的每个视网膜中拯救的细胞的数目(描述于Sanges等人，《临床调查杂志(The Journal of ClinicalInvestigation)》，126(8)：3104-3116，2016中)。
通过用对PDE6B蛋白具有特异性的抗体进行蛋白质印迹，在从2个月大时安乐死的小鼠收集的视网膜中测量所注射的蛋白质的水平。
在一个实施例中，相比于用媒剂处理的小鼠右眼，施用融合剂脂质体的小鼠左眼将具有存在于视网膜的外核层中的增加数目的细胞核。增加的蛋白质暗示突变的PBE6B蛋白质的互补。
实例66：评估施用融合剂脂质体后的畸胎瘤形成
这个实例描述不存在通过融合剂脂质体形成畸胎瘤。在一个实施例中，融合剂脂质体在向个体施用时将不会导致畸胎瘤形成。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来产生融合剂脂质体。将融合剂脂质体、肿瘤细胞(阳性对照)或媒剂(阴性对照)在PBS中皮下注射到小鼠(12-20周龄)的左侧腹中。在融合剂脂质体、肿瘤细胞或媒剂注射后的八周，通过用测径规测量法测定肿瘤体积而每周分析畸胎瘤(例如肿瘤)生长2-3次。
在一个实施例中，通过测径规测量法，施用融合剂脂质体或媒剂的小鼠将不具有可测量的肿瘤形成，例如畸胎瘤。在一个实施例中，用肿瘤细胞处理的阳性对照动物将展示可观的肿瘤(例如畸胎瘤)大小，如通过卡尺在八周的观察中所测量。
实例67：测量融合剂脂质体和源细胞中的总RNA
这个实例描述定量融合剂脂质体相对于源细胞中的RNA的量的方法。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有与源细胞类似的RNA水平。在这个分析中，通过测量总RNA来确定RNA水平。
通过先前实例中所描述的方法中的任一种来制备融合剂脂质体。如根据融合剂脂质体和源细胞的蛋白质所测量的相同质量的制剂用于分离总RNA(例如使用试剂盒，如Qiagen RNeasy目录号74104)，接着使用标准光谱法测定RNA浓度，以评估RNA的吸光度(例如使用赛默科技NanoDrop)。
在一个实施例中，以蛋白质的质量计，融合剂脂质体中的RNA的浓度将为源细胞的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。
实例68：分离从细胞自由释放的融合微囊泡
这个实例描述分离从细胞自由释放的融合微囊泡。如下地分离融合微囊泡。将9.2×106个HEK-293T(ATCC，目录号CRL-3216)在100mm胶原蛋白涂布的培养皿(康宁)中使用Xfect转染试剂(Takara，目录号631317)反向转染，所述转染试剂在7.5mL完全培养基(补充有GlutaMAX(赛默飞世尔)、10％胎牛血清(赛默飞世尔)和青霉素/链霉素抗生素(赛默飞世尔)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium；DMEM))中具有10μg含有用于VSVg的开放阅读框的pcDNA3.1表达质粒和15μg含有用于具有SV40核定位序列的噬菌体P1 Cre重组酶的开放阅读框的pcDNA3.1表达质粒。在接种后十二小时，小心地添加另外7.5mL完全培养基。通过以200×g离心10分钟而使细胞与培养基分离。收集上清液并且依序以500×g离心10分钟两次、以2,000×g离心15分钟一次、以10,000×g离心30分钟一次以及以70,000×g离心60分钟一次。在最终离心步骤期间将自由释放的融合剂脂质体粒化、再悬浮于PBS中并且以70,000×g再粒化。将最终集结粒再悬浮于PBS中。
另外参见Wubbolts R等人人类B细胞源性外泌体的蛋白质组学和生化分析：对其功能和多囊体形成的潜在影响(Proteomic and Biochemical Analyses of Human BCell-derived Exosomes：Potential Implications for their Function andMultivesicular Body Formation.)《生物化学杂志》278：10963-109722003。
实例69：测量融合剂脂质体的平均大小分布
这个实例描述融合剂脂质体大小分布的测量。
如本文所描述地通过用VSV-G瞬时转染HEK293T、去核并用Ficoll后续分级分离来制备融合剂脂质体。使用实例28的方法测量融合剂脂质体以确定大小分布，如图3中所示。预期融合剂脂质体在90％的样品内可以具有亲本细胞的大小分布变化率的小于约50％、40％、30％、20％、10％、5％或更小。预期在90％的样品内，融合剂脂质体的大小分布变化率可以比亲本细胞小58％。
实例70：融合剂脂质体的平均体积
这个实例描述测量融合剂脂质体的平均体积。改变融合剂脂质体的大小(例如体积)可以使其对于不同的货物装载、治疗设计或应用为通用的。
如本文所描述地通过用VSV-G瞬时转染HEK293T、去核并用Ficoll后续分级分离来制备融合剂脂质体。阳性对照为HEK293T细胞。
如实例28中所描述，通过NTA和共聚焦显微镜的组合的分析用于确定融合剂脂质体的大小。测量融合剂脂质体的直径并计算体积，如图4中所示。预期融合剂脂质体的平均大小可以大于50nm直径。预期融合剂脂质体的平均大小可以为129nm直径。
实例71：比较可溶性与不溶性蛋白质质量
这个实例描述定量融合剂脂质体中的可溶性：不溶性蛋白质质量比。融合剂脂质体中的可溶性：不溶性蛋白质质量比可以在一些情况下与有核细胞类似。
如本文所描述地通过用VSV-G瞬时转染HEK293T、去核并用Ficoll后续分级分离来制备融合剂脂质体。使用标准二喹啉甲酸分析(BCA)(PierceTM BCA蛋白质分析试剂盒，赛默飞世尔产品编号23225)测试融合剂脂质体制剂以确定可溶性∶不溶性蛋白质比。通过将制备的融合剂脂质体或亲本细胞以1×107个细胞或约1mg/mL总融合剂脂质体的浓度悬浮于PBS中并且以1,500×g离心以将细胞制成集结粒，或以16,000×g离心以将融合剂脂质体制成集结粒来制备可溶性蛋白质样品。以可溶蛋白质洗脱份形式收集上清液。
随后将融合剂脂质体或细胞再悬浮于PBS中。这种悬浮液代表不溶性蛋白质洗脱份。
使用供应的BSA产生标准曲线，每孔0到15μg BSA(一式两份)。融合剂脂质体或细胞制剂被稀释，使得所测量的量在标准范围内。一式两份地分析融合剂脂质体制剂并使用平均值。将可溶性蛋白质浓度除以不溶性蛋白质浓度以得到可溶性：不溶性蛋白质比(图5)。
实例72：测量与靶细胞的融合
产生衍生自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达经工程改造的麻疹病毒的红血球凝集素糖蛋白(MvH)和融合蛋白(F)并且含有Cre重组酶蛋白，如本文所描述。MvH经工程改造以消除其天然受体结合，并且通过识别细胞表面抗原的单链抗体(scFv)提供靶细胞特异性，在这种情况下，scFv被设计成靶向CD8，一种用于T细胞受体的共受体。使用对照融合剂脂质体，其衍生自在表面上表达融合剂VSV-G并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞。靶细胞为HEK-293T细胞，其经工程改造以在CMV启动子下表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒，并且经工程改造以过度表现共受体CD8a和CD8b。非靶细胞为相同的HEK-293T细胞，其表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒但没有CD8a/b过度表达。将靶接受者细胞或非靶接受者细胞以30,000个细胞/孔接种于黑色的透明底96孔盘中，并且在37℃和5％CO2下在具有10％胎牛血清的DMEM培养基中培养。在接种接受者细胞之后四到六小时，将表达Cre重组酶蛋白和MvH+F的融合剂脂质体施加到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。将接受者细胞用10μg融合剂脂质体处理并且在37℃和5％CO2下培育24小时。
使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养盘进行成像。通过在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nm LED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔；即，用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞上确立LED强度和积分时间来获得靶细胞和非靶细胞孔的图像。
设定采集设置，以使得Hoescht、RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。通过自动聚焦在Hoescht通道上并且随后使用GFP和RFP通道的已确立的焦平面将焦点设置在每个孔上。用配备有自动荧光显微镜的Gen5软件进行GFP和RFP阳性细胞的分析(https：//www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/)。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。GFP强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为GFP阳性细胞的区域。将相同分析步骤应用于RFP通道。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(不展示递送的接受者细胞)和RFP阳性细胞的总和以定量RFP转化百分比，其描述靶接受者细胞群和非靶接受者细胞群内的融合剂脂质体融合的量。对于靶向融合(融合剂脂质体与靶向接受者细胞的融合)的量，将RFP转化百分比值标准化为作为靶接受者细胞(即，表达CD8)的接受者细胞的百分比，其通过用结合到藻红蛋白(PE)的抗CD8抗体染色而评估并且通过流式细胞测量术进行分析。最后，通过从靶细胞融合量减去非靶细胞融合量来确定靶向融合的绝对量(任何＜0的值均被视为0)。
通过这个分析，当接受者细胞为表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒的靶HEK-293T细胞时，衍生自在表面上表达经工程改造的MvH(CD8)+F并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞的融合剂脂质体展示25.2+/-6.4％的RFP转化百分比，并且观察到这些接受者细胞中的51.1％为CD8阳性的。根据这些结果，针对靶向融合的标准化RFP转化百分比或靶向融合的量被确定为49.3+/-12.7％。当接受者是表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”但不表达CD8的非靶HEK-293T细胞时，相同融合剂脂质体展示0.5+/-0.1％的RFP转化百分比。基于以上，MvH(CD8)+F融合剂脂质体的靶向融合的绝对量被确定为48.8％并且对照VSV-G融合剂脂质体的靶向融合的绝对量被确定为0％(图6)。
实例73：测量跨细胞膜转运葡萄糖的能力
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体跨细胞膜转运葡萄糖的能力，对可以用于监测活细胞中的葡萄糖摄取的2-NBDG(2-(N-(7-硝基苯并-2-氧杂-1，3-二唑-4-基)氨基)-2-脱氧葡萄糖)荧光葡萄糖类似物的水平定量，以评估跨脂质双层的主动转运。来自Biovision公司的可商购的试剂盒(目录号K682)用于根据制造商的说明书进行分析。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心5分钟将40μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮于400μL补充有0.5％胎牛血清的DMEM中。这对于每个样品一式两份地进行，并且将复制品中的一个用4uL根皮素(配备有试剂盒)，一种抑制葡萄糖摄取的天然酚处理，作为葡萄糖摄取抑制的对照。随后将样品在室温下培育1小时。在培育之后，将融合剂脂质体样品粒化并且再悬浮于400uL先前制备的葡萄糖摄取混合液中(关于配方，参见下表12)。将用根皮素预处理的样品再悬浮于具有根皮素的葡萄糖摄取混合液中；将未预处理的样品再悬浮于具有20uL PBS而非根皮素的葡萄糖摄取混合液中。另外，将一个平行组的融合剂脂质体样品再悬浮于仅具有0.5％FBS的DMEM培养基中，作为流式细胞测量术分析的阴性对照。
表12：葡萄糖摄取混合液配方
试剂 体积(μL)
具有0.5％FBS的DMEM培养基 1880
2-NBDG试剂 20
葡萄糖摄取增强剂 100
任选的：根皮素 20
随后将样品在37℃与5％CO2下培育30分钟。在培育至后，将细胞粒化，用1mL的1×分析缓冲液(配备有试剂盒)洗涤一次，再次粒化，并且再悬浮于400uL的1×分析缓冲液中。
随后通过流式细胞测量术分析使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的2-NBDG摄取。2-NBDG用488nm激光激发，并且在513±26nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对2-NBDG呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，2-NBDG阴性对照样品展示对2-NBDG染色呈阳性的事件的＜0.5％。随后评估对2-NBDG荧光呈阳性的门控细胞的2-NBDG的平均荧光强度(F.I.)，以计算经过和未经过根皮素处理的融合剂脂质体的葡萄糖摄取值。
通过这个分析，衍生自表达VSV-G和Cre的HEK-293T细胞的融合剂脂质体在未经根皮素处理的情况下展示631.0+/-l.4的2-NBDG平均F.I.，并且在经根皮素处理的情况下展示565.5+/-4.9的平均F.I.(图7)。
实例74：测量胞质溶胶中的酯酶活性
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自C2C12细胞的融合剂脂质体，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体的胞质溶胶中的酯酶活性，将样品用钙黄绿素AM(BD Pharmigen，目录号564061)染色，钙黄绿素AM是一种荧光素衍生物和非荧光的活体染料，其被动地穿过活细胞的细胞膜并且被胞质酯酶转化为绿色荧光钙黄绿素，所述绿色荧光钙黄绿素被具有完整膜和失活多药耐药蛋白的细胞保留。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心5分钟将20μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮于400μL补充有0.5％胎牛血清的DMEM中。膜渗透性染料钙黄绿素-AM制备为10mM的二甲亚砜储备溶液和1mM的PBS缓冲液，pH 7.4的工作溶液。将VSV-G融合剂脂质体用DMEM培养基中稀释的1μM钙黄绿素-AM溶液染色。将样品在37℃下在黑暗中培育30分钟，并且随后通过离心粒化。在用PBS缓冲液洗涤两次至后，将融合剂脂质体再悬浮于PBS中并且通过流式细胞测量术分析。
使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的钙黄绿素荧光保留。钙黄绿素AM用488nm激光激发，并且在513±26nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对钙黄绿素呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，钙黄绿素阴性对照样品展示对钙黄绿素染色呈阳性的事件的＜0.5％。随后评估对钙黄绿素荧光呈阳性的门控细胞的钙黄绿素的平均荧光强度(F.I.)，以计算融合剂脂质体的胞质溶胶中的酯酶活性的值。
通过这个分析，衍生自C2C12细胞的融合剂脂质体展示631.0+/-1.4的酯酶活性(平均钙黄绿素F.I.)(图8)。
实例75：测量融合剂脂质体中的乙酰胆碱酯酶活性
如本文所描述地产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达胎盘细胞-细胞融合蛋白合胞素-1(Syn1)并且表达Cre重组酶蛋白。使用FluoroCet定量试剂盒(System Biosciences，目录号FCET96A-1)按照制造商的建议测量乙酰胆碱酯酶活性。
简单来说，通过以120,000g超速离心90分钟将融合剂脂质体粒化并且小心地再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。随后，通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书定量融合剂脂质体的总蛋白含量。在对蛋白质浓度进行BCA定量之后，将1000ng总融合剂脂质体蛋白用PBS稀释到60μL的体积，接着添加60μL溶解缓冲液以溶解颗粒。在冰上培育30分钟之后，样品准备好在FluoroCet分析中运行。
在96孔盘的重复孔中，将50μL溶解的融合剂脂质体样品与50μL缓冲液A的工作储备液和50μL缓冲液B的工作储备液混合。并行地，通过在126μL的1×反应缓冲液中吸移2μL所提供的标准品来拟制标准曲线。随后将这个标准溶液连续稀释5×，以制成由2.0E+08、1.0E+08、5.0E+07、2.5E+07、1.25E+07和6.25E+06外泌体当量的乙酰胆碱酯酶活性组成的六点标准曲线。随后将50μL的每种标准液与50μL缓冲液A的工作储备液和50μL缓冲液B的工作储备液在96孔盘的重复孔中混合。将50μL的1×反应缓冲液用作空白。通过轻敲侧面将培养盘混合，接着在室温下在黑暗中培育20分钟。随后立即使用设置于激发：530-570nm和发射：590-600nm的荧光板读取器测量培养盘。在读取前将培养盘振荡30秒。
随后在从空白孔中减去RFU值后，相对于已知外泌体当量的乙酰胆碱酯酶活性标绘相对荧光单位(RFU)。随后计算线性回归线并且方程式用于根据测得的RFU值来确定融合剂脂质体样品的乙酰胆碱酯酶活性(以外泌体当量计)。表13中示出了针对Syn1融合剂脂质体的测得的乙酰胆碱酯酶活性：
表13：融合剂脂质体和对照颗粒中的乙酰胆碱酯酶活性
样品 乙酰胆碱酯酶活性(外泌体当量)
Syn1融合剂脂质体 6.83E+05+/-2.21E+05
实例76：测量代谢活性水平
如本文所描述地产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白。为了确定融合剂脂质体制剂的代谢活性水平，使用提供所有所需试剂的可商购自西格玛(目录号CS0720)的试剂盒来评估柠檬酸合成酶活性。柠檬酸合成酶为三羧酸(TCA)循环内的一种酶，其催化草酰乙酸(OAA)与乙酰基-CoA之间的反应以产生柠檬酸盐。在乙酰基-CoA水解后，会释放具有硫醇基的CoA(CoA-SH)。硫醇基与化学试剂5，5-二硫基双-(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应，以形成5-硫基-2-硝基苯甲酸(TNB)，其具有可以分光光度法在412nm处测量的黄色产物。
根据制造商的建议进行分析。简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，在台式离心机中通过以3000g离心5分钟使400μg融合剂脂质体总蛋白质粒化。通过再次粒化并且再悬浮于冰冷的PBS中，将融合剂脂质体洗涤一次。将融合剂脂质体再次粒化并且去除上清液。将集结粒溶解于具有1×蛋白酶抑制剂的100μL CellLytic M缓冲液中。在通过移液混合之后，将溶解的样品在室温下培育15分钟以完成溶解。随后将样品以12,000g离心10分钟并且将上清液转移到新微量离心管中并存储于-80℃下直到进行后续分析。
为了引发柠檬酸合成酶活性分析，将所有分析溶液在使用之前升温到室温。根据下表14将溶解的融合剂脂质体样品与分析溶液混合：
表14：96孔盘中的柠檬酸合成酶活性测量的反应方案
Figure BDA0002963542200005101
表14中的体积代表96孔盘的单个孔的体积。一式两份地测量样品。将反应的所有组分混合并且吸移到96孔盘的单个孔中。随后在微盘读取器上分析412nm处的吸光度1.5分钟，以测量基线反应。随后，将10μL的10mM OAA溶液添加到每个孔以引发反应。将培养盘在微盘读取器中振荡10秒，随后读取412nm处的吸光度1.5分钟，每10秒测量一次。
为了计算柠檬酸合成酶活性，对每个反应标绘相对于时间的412nm处的吸光度。对于添加OAA之前(内源活性)和之后(总活性)的图的线性范围计算每分钟的吸光度变化。随后通过从样品的总活性减去内源活性来计算柠檬酸合成酶的净活性。随后基于由制造商提供的方程式和常数值，将这个值用于计算柠檬酸合成酶活性。VSV-G融合剂脂质体的所测量的柠檬酸合成酶活性为1.57E-02+/-1.86E-03μmol/μg融合剂脂质体/min。
实例77：测量呼吸水平
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。通过用Seahorse细胞外通量分析仪(安捷伦)测量线粒体耗氧量来确定融合剂脂质体制剂中的呼吸水平。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后通过在台式离心机中以3000g离心5分钟将20μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮(一式四份)于150μL补充有25mM葡萄糖和2mM谷氨酰氨(pH 7.4)的XF分析培养基(安捷伦目录号103575-100)中。随后将再悬浮的样品添加到96孔Seahorse培养盘(安捷伦)的一个孔中。
通过将具有样品的96孔Seahorse培养盘在37℃下培育60分钟以使温度和pH达到平衡来引发耗氧量分析。随后在XF96细胞外通量分析仪(安捷伦)中分析微盘，以测量紧贴在融合剂脂质体周围的培养基中的氧和pH的细胞外通量变化。在获得稳态耗氧量和细胞外酸化率之后，将抑制ATP合成酶的寡霉素(5μM)和解偶联线粒体的质子离子载体FCCP(羰基氰化物4-(三氟甲氧基)苯腙；2μM)通过试剂递送室依次注入微盘的每个孔，以获得最大耗氧率的值。最后，注入5μM抗霉素A(线粒体复合物III的抑制剂)以确认呼吸变化主要是由于线粒体呼吸。从其它三个呼吸率减去抗霉素A呼吸率，以确定基础、解偶联(寡霉素抗性)和最大(FCCP诱导的)线粒体呼吸率。
使用这个分析，根据下表15确定了供体VSV-G融合剂脂质体所展示的基础、解偶联和最大耗氧(呼吸)率。
表15：VSV-G融合剂脂质体的呼吸率
Figure BDA0002963542200005111
实例78：测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体的磷脂酰丝氨酸水平，使用与Alexa Fluor 647染料(目录号A23204)结合的可商购的膜联蛋白V根据制造商的说明书进行膜联蛋白V染色。膜联蛋白V是一种细胞蛋白，其可在暴露于质膜的外叶上时结合磷脂酰丝氨酸；因此，读取与样品结合的膜联蛋白V可以提供样品中的磷脂酰丝氨酸水平的评估。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心(样品一式三份)5分钟使40μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮于400μL补充有2％胎牛血清的DMEM中。用40μM抗霉素A处理一个样品。随后将样品在37℃下培育1小时。在培育之后，随后再次通过离心使样品粒化并且再悬浮于100μL膜联蛋白结合缓冲液(ABB；10mMHEPES、140mM NaCl、2.5mM CaCl2，pH 7.4)中。随后，将5μL与Alexa Fluor 647结合的膜联蛋白V添加到每个样品(除了未进行膜联蛋白V染色的阴性对照)。将样品在室温下培育15分钟，接着添加400μLABB。
随后通过流式细胞测量术分析使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的膜联蛋白V染色。与Alexa Fluor 647结合的膜联蛋白V用638nm激光激发，并且在670±14nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对Alexa Fluor 647(膜联蛋白V)染色呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，未染色的膜联蛋白V阴性对照样品展示＜0.5％的对Alexa Fluor 647染色呈阳性的事件。随后关于总亲本群体的膜联蛋白V阳性事件的百分比(正向/侧向散射门中的融合剂脂质体尺寸化事件)评估对Alexa Fluor 647染色呈阳性的门控事件，并且将这个值用作融合剂脂质体样品中的磷脂酰丝氨酸水平的定量。
通过这个分析，衍生自表达VSV-G和Cre的HEK-293T细胞的融合剂脂质体在未用抗霉素A处理的情况下展示63.3±2.3％的膜联蛋白V阳性融合剂脂质体百分比并且在用抗霉素A处理的情况下展示67.6±5.7％的膜联蛋白V阳性融合剂脂质体百分比。
实例79：测量平均线粒体膜电位
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得如本文所描述的小颗粒融合剂脂质体。为了测量融合剂脂质体的平均线粒体膜电位水平，将线粒体膜电位敏感的可商购的染料四甲基若丹明，乙酯，高氯酸盐(TMRE；Abcam，目录号T669)用于评估线粒体膜电位。为了将TMRE荧光强度(FI)标准化为样品中的线粒体的量，将MitoTracker Green FM染料(MTG；赛默飞世尔，目录号M7514)用于共染色样品，以将TMRE FI标准化为MTG FI并且因此标准化为样品中的线粒体的量。另外，羰基氰化物-对三氟甲氧基苯腙(FCCP；西格玛目录号C2920)用于处理一个平行组的样品，以使线粒体膜电位完全去极化，并且因此允许基于TMRE FI的减小来以毫伏为单位定量线粒体膜电位。
简单来说，首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。随后，通过在台式离心机中以3000g离心(对于未处理和经FCCP处理的复制品，以样品一式四份)5分钟使40μg融合剂脂质体总蛋白粒化，接着再悬浮于100μL补充有2％胎牛血清并且含有最终浓度分别为30nM和200nM的TMRE和MTG染料的DMEM中。一个平行组的融合剂脂质体样品保持未染色，作为阴性对照。将样品在37℃下培育45分钟。在培育之后，通过离心使样品粒化并且再悬浮于400μL含有30nmTMRE的无酚红DMEM培养基中。一组重复样品用20μM FCCP处理5分钟，随后通过流式细胞测量术进行评估。
随后通过流式细胞测量术分析使用Invitrogen Attune NxT声聚焦细胞仪测量样品的膜联蛋白V染色。MTG用488nm激光激发并且在530±30nm处捕获发射。TMRE用561nm激光激发并且在585±16nm处捕获发射。正向和侧向散射门控最初用于捕获融合剂脂质体尺寸化事件和丢弃小碎屑。对MTG和TMRE染色呈阳性的事件是通过门控于最低水平确定的，对于所述最低水平，未染色的对照样品展示＜0.5％的对MTG或TMRE染色呈阳性的事件。随后评估对MTG和TMRE染色呈阳性的门控事件的MTG和TMRE的平均FI。
基于将TMRE FI值标准化为MTG FI值后的TMRE的强度计算膜电位值(以毫伏，mV为单位)。这个TMRE/MTG比值允许将TMRE强度标准化为样品中的线粒体的量。计算未处理和FCCP处理的样品的TMRE/MTG比值，并且用于使用修正的能斯特方程式(参见下文)确定以毫伏为单位的膜电位，所述方程式可以基于TMRE荧光确定线粒体膜电位(因为TMRE以能斯特方式积聚于线粒体中)。用下式计算融合剂脂质体膜电位：(mV)＝-61.5*log(FI(未处理)/FI(FCCP处理))。使用这个方程式，VSV-G融合剂脂质体样品的所计算的线粒体膜电位为-29.6±1.5毫伏。
实例80：测量个体的靶向潜力(BiV-Cre纳米囊泡)
这个实例评估融合剂脂质体靶向特定身体部位的能力。融合剂脂质体使用如本文所描述的方法衍生并且装载有cre重组酶蛋白。
将两个剂量的融合剂脂质体(1×和3×)递送到Loxp荧光素酶(杰克逊实验室，005125)小鼠，通过尾静脉静脉内(I.V.)注射。将小鼠置于加热灯(使用250W(红外)加热灯泡)下约5分钟(或直到小鼠开始过度梳理胡须)以扩张尾静脉。将小鼠置于限制器上并且用70％乙醇擦拭尾巴以更好地观察静脉。
使用结核菌素注射器，静脉内注射200μL的融合剂脂质体1×溶液(8.5e8±1.4e8个颗粒/μL，平均值(SEM)))或3×溶液(2.55e9±1.4e8个颗粒/μL，平均值(SEM))。在完成注射后，移开注射器并向注射部位施加压力。
在融合之后，CRE蛋白易位到细胞核以进行重组，其引起荧光素酶的组成性表达。治疗后三天，通过对区域脱毛(Nair Hair Remover乳膏持续45秒，接着用70％乙醇清洁所述区域)来制备个体的腹侧区域。随后用通过腹膜内施用的D-荧光素(珀金埃尔默，150mg/kg)处理个体。这使得能够通过体内生物发光成像来检测荧光素酶表达。将动物置于体内生物发光成像室(珀金埃尔默)中，所述室装有锥形麻醉器(异氟醚)以防止动物运动。在注射后3-15分钟之间进行光子收集，以观察由D-荧光素药物动力学清除所致的最大生物发光信号。以光子数/秒/平方厘米/弧度记录最大辐射率。使用Living Image Software(珀金埃尔默)中的感兴趣区域(ROI)工具定量整合了区域内的辐射率的总通量并且以光子数/秒为单位报告。
通过在动物的接受者组织中进行生物发光成像来检测通过融合剂脂质体递送蛋白质(Cre重组酶)的证据，如图9A-9B中所示。主要在脾脏和肝脏中可见信号，其在3×组展示最高信号。
在全身成像后，将小鼠颈椎脱臼，并且在安乐死的5分钟内收集肝脏、心脏、肺脏、肾脏、小肠、胰脏和脾脏并成像。通过在动物的提取的接受者组织中进行生物发光成像来检测通过融合剂脂质体向肝脏和脾脏递送蛋白质(Cre重组酶)的证据。这可以见于图10A-10B中。信号在脾脏中最高并且在心脏中最低，其中3×组展示最高显著信号(相比于心脏，p＝0.0004)。
实例81：通过独立于溶酶体酸化的途径递送融合剂脂质体
通常，通过内吞作用来实现复杂的生物货物进入靶细胞。内吞作用需要货物进入内体，内体成熟为酸化的溶酶体。不利的是，通过内吞作用进入细胞的货物可能会被困在内体或溶酶体中并且不能到达细胞质。货物也可能被溶酶体中的酸性条件破坏。一些病毒能够非内吞进入靶细胞；然而，这个过程尚未被完全理解。这个实例表明病毒融合剂可以与病毒的其余部分分离并且在缺乏其它病毒蛋白的融合剂脂质体上赋予非内吞进入。
根据超速离心的标准程序通过Ficoll梯度产生来自HEK-293T细胞的融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达尼帕病毒受体结合G蛋白和融合F蛋白(NivG+F)并且表达Cre重组酶蛋白，以获得小颗粒融合剂脂质体，如本文所描述。为了证实通过非内吞途径将融合剂脂质体递送到接受者细胞，NivG+F融合剂脂质体用于处理接受者HEK-293T细胞，所述细胞被工程改造以在CMV启动子下表达“Loxp-GFP-stop-Loxp-RFP”盒。NivF蛋白为pH非依赖性包膜糖蛋白，已展示其活化和后续融合活性不需要环境酸化(Tamin，2002)。
将接受者细胞以30,000个细胞/孔接种于黑色的透明底96孔盘中。在接种接受者细胞之后四至六小时，将表达Cre重组酶蛋白的NivG+F融合剂脂质体施用到DMEM培养基中的靶接受者细胞或非靶接受者细胞。首先通过二喹啉甲酸分析(BCA，赛默飞世尔，目录号23225)根据制造商的说明书测量融合剂脂质体样品的总蛋白含量。将接受者细胞用10μg融合剂脂质体处理并且在37℃和5％CO2下培育24小时。为了证实通过非内吞途径经由NivG+F融合剂脂质体递送Cre，将一个平行孔的接受NivG+F融合剂脂质体处理的接受者细胞用内体/溶酶体酸化抑制剂巴弗洛霉素A1(Baf； 100nM；西格玛，目录号B1793)共处理。
使用自动显微镜(www.biotek.com/products/imaging-microscopy-automated-cell-imagers/lionheart-fx-automated-live-cell-imager/)对细胞培养盘进行成像。通过在DMEM培养基中用Hoechst 33342染色细胞10分钟来确定给定孔中的总细胞群。Hoechst33342通过插入到DNA中染色细胞核并且因此用于鉴别个别细胞。使用405nm LED和DAPI滤光立方体对Hoechst染色成像。GFP使用465nm LED和GFP滤光立方体成像，而RFP使用523nmLED和RFP滤光立方体成像。通过首先在阳性对照孔上确立LED强度和积分时间来采集靶细胞和非靶细胞孔的图像，所述阳性对照孔含有用编码Cre重组酶的腺病毒而非融合剂脂质体处理的接受者细胞。
设定采集设置，以使得Hoescht、RFP和GFP强度处于最大像素强度值但不饱和。随后使用确立的设置对所关注的孔成像。通过自动聚焦在Hoescht通道上并且随后使用GFP和RFP通道的已确立的焦平面将焦点设置在每个孔上。用配备有自动荧光显微镜的Gen5软件进行GFP和RFP阳性细胞的分析(https：//www.biotek.com/products/software-robotics-software/gen5-microplate-reader-and-imager-software/)。
使用60μm宽的滚球背景减除算法对图像进行预处理。GFP强度显著高于背景强度的细胞为阈值处理的并且排除太小或太大而无法成为GFP阳性细胞的区域。将相同分析步骤应用于RFP通道。随后将RFP阳性细胞(接受Cre的接受者细胞)的数目除以GFP阳性细胞(不展示递送的接受者细胞)和RFP阳性细胞的总和以定量RFP转化百分比，其指示融合剂脂质体与接受者细胞的融合量。
通过这个分析，衍生自在表面上表达NivG+F并且含有Cre重组酶蛋白的HEK-293T细胞的融合剂脂质体展示通过溶酶体非依赖性途径的显著递送，这与通过非内吞途径的进入一致，如通过即使在用Baf共处理接受者细胞以抑制内吞作用介导的摄取时仍由NivG+F融合剂脂质体显著递送Cre货物来证明(图11)。在这种情况下，Baf共处理对货物递送的抑制为23.4％。
实例82：针对迁移率测量使肌动蛋白聚合的能力
如本文所描述，通过收获和制备由HEK-293T细胞产生的融合剂脂质体的标准程序来产生融合剂脂质体，所述细胞在细胞表面上表达来自水泡性口炎病毒的包膜糖蛋白G(VSV-G)。对照颗粒(非融合性融合剂脂质体)是产自经pcDNA3.1空载体反向瞬时转染的HEK-293T细胞。随后使用若丹明鬼笔环肽-流式细胞测量术分析和微管蛋白ELISA分析融合剂脂质体和亲本细胞聚合肌动蛋白(随时间推移)的能力。简单来说，将对应于60μL标准VSV-G融合剂脂质体制剂的大致1×106个融合剂脂质体和用于产生融合剂脂质体的1×105个亲本细胞在1mL完全培养基中完全接种于96孔低附着多孔盘中并且在37℃和5％CO2下培育。在接种后3小时、5小时和24小时定期获取样品。将样品以21,000×g离心10分钟，再悬浮于200μL含4％(v/v)PFA的磷酸盐缓冲盐水中10分钟，用1mL磷酸盐缓冲盐水洗涤，以21,000×g离心10分钟，再次洗涤并且存储于4℃下直到进一步使用。
对于若丹明-鬼笔环肽染色，将样品以21,000×g离心10分钟，并且在100μL含0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水中培育20分钟。在20分钟培育后，将另外100μL含有165μM若丹明-鬼笔环肽的含0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水添加到样品并且进行吸移混合，接收阴性对照和另外100μL 100μL仅含0.1％(v/v)Triton X-100的磷酸盐缓冲盐水。将样品培育45分钟，随后用1mL磷酸盐缓冲盐水洗涤，以21,000×g离心10分钟，再次洗涤并且再悬浮于300μL磷酸盐缓冲盐水中并通过流式细胞仪(Attune，赛默飞世尔)使用561nm激光激发和585+/-16nm滤光片发射进行分析，如下表中所示：
流式细胞仪设置
染料 Attune激光/滤光片 激光波长 发射滤光片(nm)
AF47 YL1 585 585/16
Attune NxT软件用于采集并且FlowJo用于分析。为进行数据采集，将FSC和SSC通道设置在线性轴上，以确定代表细胞或融合剂脂质体的群体。随后对这个群体进行门控，并且仅将这个门内的事件用于以对数标度显示585+/-16nm发射通道中的事件。在每种情况下，收集细胞或融合剂脂质体门内的至少10,000个事件。为进行数据分析，将FSC和SSC通道设置在线性轴上，以确定代表细胞或融合剂脂质体的群体。随后对这个群体进行门控，并且仅将这个门内的事件用于以对数标度显示585+/-16nm发射通道中的事件。阴性对照585+/-16nm发射用于确定直方图上门的放置位置，以使得较少门包括小于1％阳性。使用以上列出的分析标准，亲本细胞分别在3小时、5小时和24小时的时间点展示19.9％、24.8％和82.5％若丹明-鬼笔环肽阳性事件。在3小时、5小时和24小时的时间点，融合剂脂质体分别为44.6％、41.9％和34.9％若丹明-鬼笔环肽(图2)。这个实例表明融合剂脂质体不随时间推移增加肌动蛋白的量，而亲本细胞增加所述量。
实例83：测量融合剂脂质体中的GAPDH
这个实例描述定量融合剂脂质体中的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的GAPDH的相对水平。如实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体。
根据制造商的说明，使用用于GAPDH的标准可商购的ELISA(ab176642，Abcam)在亲本细胞和融合剂脂质体中测量GAPDH。通过二喹啉甲酸分析类似地测量总蛋白水平。所测量的GAPDH和蛋白质水平在下表中示出：
[蛋白质](mg/mL) [GAPDH](ng/mL) GAPDH∶蛋白质(μg/g)
融合剂脂质体 0.82 37.2 45.3
细胞 0.45 50.4 112.0
GAPDH：总蛋白比还展示于图12中。
实例84：融合剂脂质体中的脂质与蛋白质的比
这个实例描述定量融合剂脂质体中的脂质质量与蛋白质质量的比。预期融合剂脂质体可以具有与有核细胞类似的脂质质量与蛋白质质量的比。如本文实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。
使用可商购的磷脂分析试剂盒(MAK122，密苏里州圣路易斯的西格玛)根据制造商的说明书，使用含胆碱的磷脂作为总脂质的子组来计算脂质含量。通过如本文所描述的二喹啉甲酸分析来测量融合剂脂质体的总蛋白含量。所测量的磷脂水平、蛋白质水平和磷脂与蛋白质的比在图13和下表中示出：
磷脂(μM) 蛋白质(g/L) 磷脂∶蛋白质(μmol/g)
融合剂脂质体 115.6 0.82 141.0
细胞 47.9 0.45 106.4
实例85：融合剂脂质体中的蛋白质与DNA的比
这个实例描述定量融合剂脂质体中的蛋白质质量与DNA质量的比。预期融合剂脂质体可以具有比细胞大得多的蛋白质质量与DNA质量的比。如实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体。
通过如本文所描述的二喹啉甲酸来测量融合剂脂质体的总蛋白含量。在使用可商购的分离试剂盒(#69504德国希尔登的凯杰(Qiagen Hilden Germany))根据制造商的说明书提取总DNA之后，通过280nm处的吸收测量融合剂脂质体和细胞的DNA质量。通过将总蛋白质含量除以总DNA含量来确定蛋白质与总核酸的比，以得到典型融合剂脂质体制剂的在给定范围内的比。所测量的蛋白质水平、DNA水平和蛋白质与DNA的比在图14和下表中示出：
[蛋白质](mg/mL) [DNA](ng/μL) 蛋白质∶DNA(g/g)
融合剂脂质体 0.82 29.5 27.8
细胞 0.45 15.9 28.3
实例86：融合剂脂质体中的脂质与DNA的比
这个实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂质与DNA的比。在一个实施例中，与亲本细胞相比，融合剂脂质体将具有更大的脂质与DNA的比。如先前实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体。
这个比被定义为实例41中概述的脂质含量，并且如实例42中所描述地测定核酸含量。所测量的脂质水平、DNA水平和脂质与DNA的比在图15和下表中示出：
[脂质](μM) [DNA](ng/μL) 脂质：DNA(μmol/mg)
融合剂脂质体 115.6 29.5 3.92
细胞 47.9 15.9 3.01
实例87：测量融合剂脂质体中的脂质组成
这个实例描述定量融合剂脂质体的脂质组成。预期融合剂脂质体的脂质组成可以与衍生其的细胞类似。脂质组成影响融合剂脂质体和细胞的重要生物物理学参数，如大小、静电相互作用和胶体特性。
脂质测量是基于质谱分析。如本文所描述地通过在10cm培养皿中瞬时转染VSV-G和GFP，接着在转染后48小时过滤和超速离心条件培养基以获得融合剂脂质体，来制备融合剂脂质体。与条件培养基并行地收获经转染的细胞并且用于进行分析。还从未用VSV-G或GFP转染的细胞收获外泌体。
如(Sampaio等人2011)所描述，由Lipotype股份有限公司(德国德累斯顿(Dresden，Germany))进行基于质谱分析的脂质分析。使用两步氯仿/甲醇程序来提取脂质(Ejsing等人2009)。用含有以下的内部脂质标准混合物加标样品：心磷脂16∶1/15∶0/15∶0/15∶0(CL)、神经酰胺18∶1；2/17∶0(Cer)、二酰甘油17∶0/17∶0(DAG)、己糖基神经酰胺18∶1；2/12∶0(HexCer)、溶血磷脂酸酯17∶0(LPA)、溶血磷脂酰胆碱12∶0(LPC)、溶血磷脂酰乙醇胺17∶1(LPE)、溶血磷脂酰甘油17∶1(LPG)、溶血磷脂酰肌醇17∶1(LPI)、溶血磷脂酰丝氨酸17∶1(LPS)、磷脂酸酯17∶0/17∶0(PA)、磷脂酰胆碱17∶0/17∶0(PC)、磷脂酰乙醇胺17∶0/17∶0(PE)、磷脂酰甘油17∶0/17∶0(PG)、磷脂酰肌醇16∶0/16∶0(PI)、磷脂酰丝氨酸17∶0/17∶0(PS)、胆固醇酯20∶0(CE)、鞘磷脂18∶1；2/12∶0；0(SM)、三酰甘油17∶0/17∶0/17∶0(TAG)和胆固醇D6(Chol)。
在提取之后，将有机相转移到输注培养盘并且在速度真空浓缩器中干燥。将第1步干提取物再悬浮于含7.5mM乙酸铵的氯仿/甲醇/丙醇(1∶2∶4，V∶V∶V)中，并且将第2步干提取物再悬浮于甲胺/氯仿/甲醇的33％乙醇溶液(0.003∶5∶1；V∶V∶V)中。使用具有用于有机溶剂吸移的防液滴控制(Anti Droplet Control)特征的Hamilton Robotics STARlet机器人平台进行所有液体处理步骤。
通过在配备有TriVersa NanoMate离子源(Advion Biosciences)的QExactive质谱仪(赛默科技)上直接输注来分析样品。在单次采集中，以正离子和负离子模式分析样品，其中MS的分辨率为Rm/z＝200＝280000并且MSMS实验的分辨率为Rm/z＝200＝17500。MSMS由包含列表触发，所述列表涵盖以1 Da增量扫描的对应MS质量范围(Surma等人，2015)。将MS和MSMS数据组合，以监测作为铵加合物的CE、DAG和TAG离子；作为乙酸盐加合物的PC、PCO-；和作为去质子化阴离子的CL、PA、PE、PE O-、PG、PI和PS。仅MS用于监测作为去质子化阴离子的LPA、LPE、LPE O-、LPI和LPS；作为乙酸盐加合物的Cer、HexCer、SM、LPC和LPC O-，以及作为乙酰化衍生物的铵加合物的胆固醇(Liebisch等人2006)。
用基于LipidXplorer的内部开发的脂质鉴别软件来分析数据(Herzog等人2011；Herzog等人2012)。使用内部开发的数据管理系统来进行数据后处理和标准化。仅将信噪比＞5，并且信号强度比对应空白样品中高5倍的脂质鉴别视为用于进一步的数据分析。
将融合剂脂质体脂质组成与亲本细胞的脂质组成进行比较，其中将未检测到的脂质物种赋值为零。融合剂脂质体和亲本细胞中所鉴别的脂质物种在下表中示出：
Figure BDA0002963542200005191
如果≥亲本细胞的任何重复样品中所鉴别的脂质物质的70％存在于融合剂脂质体的任何重复样品中，并且在那些所鉴别的脂质中，融合剂脂质体中的平均水平可以为亲本细胞中的对应平均脂质物种水平的＞25％，那么预期融合剂脂质体和亲本细胞可以具有类似的脂质组成。
实例88：测量融合剂脂质体中的蛋白质组学组成
这个实例描述定量融合剂脂质体的蛋白质组成。预期融合剂脂质体的蛋白质组成可以与衍生其的亲本细胞类似。
通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。
将每个样品再悬浮于溶解缓冲液(6M脲、2M硫脲、4％CHAPS、50mM Tris pH 8.0)中，在冰浴上超声处理并穿过小口径注射器。将蛋白质在65℃下用10mM DTT还原15分钟并且在室温下在黑暗中用15mM碘乙酰胺(IAA)烷基化30分钟。用另外的10mM DTT淬灭过量的IAA。随后通过添加8体积冰冷的丙酮+1体积冰冷的甲醇使蛋白质沉淀并且在-80℃下放置整夜。通过离心使沉淀的蛋白质粒化。将剩余的溶解缓冲液用200μl冰冷的甲醇洗涤3次。将蛋白质再悬浮于0.75M脲+50mM Tris pH 8.0+1μg胰蛋白酶/LysC中，并且在搅拌下在37℃下预消化4小时。将另外1μg胰蛋白酶/LysC添加到蛋白质中并且继续消化整夜。将肽通过逆相SPE纯化并且通过LC-MS分析。
溶解每种条件的重复样品并且合并于一个试管中。随后对这个集合体进行与样品相同的制备方案，并且通过LC-MS以信息依赖性采集进行分析，或在如下文所描述的凝胶上分离。
将总共100μg汇集的蛋白质置于2×Laemmli加样缓冲液中并且在12.5％SDS PAGE上分离。用考马斯蓝(Coomassie blue)对蛋白质进行短暂染色，并且将蛋白质通道分成12个部分。随后将每个部分用50％乙腈脱水并且用10mM DTT再水合以进行还原。将凝胶片置于65℃下15分钟，并且在室温下在黑暗中用15mM IAA烷基化30分钟。凝胶另外用50％乙腈脱水并且在37℃下在具有1μg胰蛋白酶/LysC的50mM Tris pH 8中再水合整夜。通过脱水和超声处理从凝胶中提取肽。将肽通过逆相SPE纯化并且通过LC-MS/MS分析(1×IDA/部分)。
用ABSciex TripleTOF 5600(ABSciex，美国加利福尼亚州的福斯特市(FosterCity，CA，USA))进行采集，其配备有具有25μm iD毛细管的电喷雾接口且与Eksigent μUHPLC(Eksigent，美国加利福尼亚州的雷德伍德城(Redwood City，CA，USA))耦接。AnalystTF 1.7软件用于控制仪器以及进行数据处理和采集。对于来自凝胶的12个部分或未分离的集合体，以信息依赖性采集(IDA)模式进行采集。以SWATH采集模式分析样品。对于IDA模式，将源电压设置为5.2kV并且维持在225℃下，将帘气设置于27psi，气体一设置于12psi并且气体二设置于10psi。对于SWATH模式，将源电压设置为5.5kV并且维持在225℃下，将气帘气设置为25psi，将气体一设置于16psi并且将气体二设置于15psi。在维持于60℃下的0.3mmi.d.，2.7μm颗粒，150mm长的逆相HALO C18-ES柱(特拉华州威明顿的先进材料技术)上进行分离。样品通过环路过满注射到5μL环路中。对于60分钟LC梯度，移动相由流动速率为3μL/分钟的溶剂A(于水中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO v/v)和溶剂B(于EtOH中的0.2％v/v甲酸和3％DMSO)组成。
为了产生用于样品分析的离子库，在通过IDA运行生成的wiff文件上运行ProteinPilot软件。在Peakview软件(ABSciex)上使用这个数据库，以使用3个跃迁/肽和15个肽/蛋白质对每个样品中的蛋白质进行定量。为了使定量的蛋白质的数目最大化，在具有相同参数的可公开获得的人类SWATH数据库(Atlas)上定量样品。如果由Peakview计算的得分高于1.5并且FDR＜1％，则将肽视为被充分测量的。使用来自两个数据库的蛋白质名称，将来自每个数据库的定量合并为一个最终定量。通过在相比于每个样品的总信号的平均值时考虑所述样品中的每种蛋白质的总信号，计算每个样品的校正系数。
将融合剂脂质体蛋白质组学组成与亲本细胞蛋白质组学组成进行比较。当＞33％的所鉴别的蛋白质存在于融合剂脂质体中时，在融合剂脂质体与亲本细胞之间观察到类似的蛋白质组学组成，并且在那些所鉴别的蛋白质中，水平为亲本细胞中的对应蛋白质水平的＞25％，如下表中所示。
Figure BDA0002963542200005211
实例89：定量每个融合剂脂质体的内源或合成蛋白水平
这个实例描述定量融合剂脂质体中的内源或合成蛋白货物。在一些情况下，融合剂脂质体可以包含内源或合成蛋白货物。这个实例中所描述的融合剂脂质体或亲本细胞被工程改造以改变内源蛋白的表达或表达介导治疗或新颖细胞功能的合成货物。
通过实例68和87的方法如本文所描述地制备表达GFP的融合剂脂质体和亲本细胞。使用可商购的ELISA试剂盒(ab171581 Abcam英国剑桥(Cambridge，United Kingdom))根据制造商的说明书完成融合剂脂质体中的GFP的定量。使用NanoSight NS300(英国伍斯特郡马尔文的马尔文仪器公司(Malvern Instruments，Malvern，Worcestershire，UnitedKingdom))通过纳米粒子追踪分析来进行融合剂脂质体定量。结果展示于下表中。
浓度(#/mL)
GFP蛋白 4.41×10<sup>13</sup>
融合剂脂质体 2.66×10<sup>11</sup>
GFP：融合剂脂质体 165.8
预期融合剂脂质体可以具有至少1、2、3、4、5、10、20、50、100或更多个蛋白质药剂分子/融合剂脂质体。在一个实施例中，融合剂脂质体将具有166个蛋白质药剂分子/融合剂脂质体。
实例90：测量融合剂脂质体中的外泌体蛋白的标记
这个分析描述定量已知为外泌体的特定标记的蛋白质的比例。
通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。通过实例68和87的方法如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。如本文实例36中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体和外泌体的蛋白质定量。
分析所得的蛋白质定量数据，以确定已知外泌体标记CD63的蛋白质水平和比例。通过将质谱的亮度值加1、通过log10转换并且计算跨重复样本的平均值来计算每组的平均对数强度。结果展示于图16中。
实例91：测量融合剂脂质体中的钙联蛋白
这个分析描述定量融合剂脂质体中的钙联蛋白(CNX)水平，和与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的CNX的相对水平。
如本文实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。使用根据实例36的方法进行的质谱分析来测量钙联蛋白和总蛋白。针对亲本细胞和融合剂脂质体所测定的钙联蛋白信号强度展示于图17中。
在实施例中，使用这个分析，融合剂脂质体中的CNX的平均分数含量(如本文实例36中所描述地计算)将为＜2.43×10-4。
在一个实施例中，从亲本细胞到制剂，以ng/μg为单位的钙联蛋白/总蛋白的减少将大于88％。
实施例92：融合剂脂质体中脂质与DNA的比
这个实例描述定量与亲本细胞相比，融合剂脂质体中的脂质与DNA的比。在一个实施例中，与亲本细胞相比，融合剂脂质体将具有更大的脂质与DNA的比。如先前实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体。
这个比被定义为实例41中概述的脂质含量，并且如实例42中所描述地测定核酸含量。
如图18和下表中所示，发现融合剂脂质体展现比亲本细胞更大的脂质∶DNA比。
[脂质](μM) [DNA](ng/μL) 脂质∶DNA(μmol/mg)
融合剂脂质体 115.6 29.5 3.92
细胞 47.9 15.9 3.01
实例93：分析融合剂脂质体上的表面标记
这个分析描述鉴别融合剂脂质体上的表面标记。
如本文实例68和87中所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例68和87中所描述地通过质谱来测量磷脂酰丝氨酸。融合剂脂质体中相对于总脂质的磷脂酰丝氨酸的量被确定为比亲本细胞中相对于总脂质的磷脂酰丝氨酸的量大121％，如下表中所示。
Figure BDA0002963542200005231
实例94：分析融合剂脂质体中的病毒衣壳蛋白
在这个实例中，分析了样品制剂的组成并评估了衍生自病毒衣壳来源的蛋白质的比例。
通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例36中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体的蛋白质定量。如本文实例36中所描述地计算病毒衣壳蛋白的分数含量，将其在融合剂脂质体样品中取平均值并表示为百分比。
使用这个方法，发现样品含有0.05％病毒衣壳蛋白，如下表中所示。唯一检测到的病毒衣壳蛋白为兔内源性慢病毒(RELIK)衣壳与亲Cyclophilin环素A(PDB 2XGY|B)的复合物。
Figure BDA0002963542200005232
实例95：定量融合剂脂质体中的融合剂蛋白比
这个实例描述定量融合剂脂质体中的融合剂蛋白与总蛋白或其它所关注蛋白的比。其它所关注蛋白可以包括(但不限于)：EGFP、CD63、ARRDC1、GAPDH、钙联蛋白(CNX)和TSG101。通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例36中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体的蛋白质定量。如本文实例36中所描述地计算所有蛋白质的定量，将其在融合剂脂质体样品中取平均值并表示为分数。
如下表中所示，发现融合剂与EGFP的比为156.9，与CD63的比为2912.0，与ARRDC1的比为664.9，与GAPDH的比为69.0，与CNX的比为558.4，并且与TSG101的比为3064.1。
蛋白质 原始MS强度 融合剂：一种或多种蛋白质比
VSV-G 1.29×10<sup>8</sup> N/A
总蛋白 9.46×10<sup>8</sup> 0.136
EGFP 8.22×10<sup>5</sup> 156.9
CD63 4.43×10<sup>4</sup> 2912.0
ARRDC1 1.94×10<sup>5</sup> 664.9
GAPDH 1.87×10<sup>6</sup> 69.0
CNX 2.31×10<sup>5</sup> 558.4
TSG101 4.21×10<sup>4</sup> 3064.1
实例96：定量融合剂脂质体中的内源蛋白与合成蛋白的比
这个实例描述定量融合剂脂质体中的内源或合成蛋白货物相对于总蛋白或其它所关注蛋白。其它所关注蛋白可以包括(但不限于)：VSV-G、CD63、ARRDC1、GAPDH、钙联蛋白(CNX)或TSG101。通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体。如本文实例36中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体的蛋白质定量。如本文实例36中所描述地计算所有蛋白质的定量，将其在融合剂脂质体样品中取平均值并表示为分数。
如下表中所示，发现合成蛋白货物与VSV-G的比为6.37×10-3，与CD63的比为18.6，与ARRDC1的比为4.24，与GAPDH的比为0.44，与CNX的比为3.56，并且与TSG101的比为19.52。
蛋白质 原始MS强度 蛋白质货物：一种或多种蛋白质比
EGFP 8.22×10<sup>5</sup> N/A
总蛋白 9.46×10<sup>8</sup> 8.69×10<sup>-4</sup>
VSV-G 1.29×10<sup>8</sup> 6.37×10<sup>-3</sup>
CD63 4.43×10<sup>4</sup> 18.6
ARRDC1 1.94×10<sup>5</sup> 4.24
GAPDH 1.87×10<sup>6</sup> 0.44
CNX 2.31×10<sup>5</sup> 3.56
TSG101 4.21×10<sup>4</sup> 19.52
实例97：融合剂脂质体中富集的脂质组成
这个实例描述定量融合剂脂质体、亲本细胞和外泌体的脂质组成。预期相对于衍生融合剂脂质体的细胞，融合剂脂质体的脂质组成可以富集和/或耗尽特定脂质。脂质组成影响融合剂脂质体和细胞的重要生物物理学参数，如大小、静电相互作用和胶体特性。
如实例68和87中所描述地测量脂质组成。如本文所描述地通过在10cm培养皿中瞬时转染VSV-G和GFP，接着在转染后48小时过滤和超速离心条件培养基以获得融合剂脂质体，来制备融合剂脂质体。与条件培养基并行地收获经转染的细胞并且用于进行分析。如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。
融合剂脂质体、外泌体和亲本细胞的脂质组成展示于图19A-19B中。相比于亲本细胞，融合剂脂质体富集了胆固醇酯、游离胆固醇、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰丝氨酸、磷脂酸酯、醚连接的磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。相比于亲本细胞，融合剂脂质体耗尽了神经酰胺、心磷脂、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、溶血磷脂酰甘油、溶血磷脂酰肌醇、醚连接的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰肌醇和三酰甘油。相比于外泌体，融合剂脂质体富集了胆固醇酯、神经酰胺、二酰甘油、溶血磷脂酸酯和磷脂酰乙醇胺、三酰甘油。相比于外泌体，融合剂脂质体耗尽了游离胆固醇、己糖基神经酰胺、溶血磷脂酰胆碱、醚连接的溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、醚连接的溶血磷脂酰乙醇胺和溶血磷脂酰丝氨酸。
实例98：测量融合剂脂质体的区室特异性蛋白质组学含量
这个实例描述定量已知来源于融合剂脂质体、融合剂脂质体亲本细胞和外泌体中的特定细胞区室的蛋白质的比例。
通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。通过实例68和87的方法如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。如本文实例36中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体和外泌体的蛋白质定量。分析所得的蛋白质定量数据，以确定已知外泌体、内质网、核糖体、细胞核和线粒体蛋白的蛋白质水平和比例，如由基因本体细胞区室注释术语(外泌体：GO：0070062，内质网：GO：0005783，核糖体：GO：0005840、GO：0022625、GO：0022626、GO：0022627、GO：0044391、GO：0042788、GO：0000313)以证据代码IDA(由直接分析推断)所注释。对于融合剂脂质体样品、外泌体样品和亲本细胞确定每个样品中区室特异性蛋白相对于总蛋白的比率。
如图20中所示，发现相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体耗尽了内质网蛋白。还发现相比于外泌体，融合剂脂质体耗尽了外泌体蛋白。相比于亲本细胞，融合剂脂质体耗尽了线粒体蛋白。相比于亲本细胞，融合剂脂质体富集了核蛋白。相比于亲本细胞和外泌体，融合剂脂质体富集了核糖体蛋白。
实例99：测量融合剂脂质体中的TSG101和ARRDC1含量
这个实例描述定量已知在从细胞释放融合剂脂质体中重要的蛋白质的比例。
通过实例68和87的方法如本文所描述地制备融合剂脂质体和亲本细胞。通过实例68和87的方法如关于融合剂脂质体在本文所描述地制备外泌体，不同之处在于亲本细胞未用VSV-G或GFP转染。如本文实例36中所描述地进行通过质谱分析对融合剂脂质体和外泌体的蛋白质定量。分析所得的蛋白质定量数据，以确定蛋白质TSG101和ARRDC1的蛋白质水平和比例。通过将质谱的亮度值加1、通过log10转换并且计算跨重复样本的平均值来计算每组的平均对数强度。将相对于外泌体或亲本细胞，融合剂脂质体中的TSG101或ARRDC1的总蛋白含量的百分比确定为每个样品的TSG101或ARRDC1的平均对数强度，除以相同样品中所有蛋白质的强度的总和，在重复样本中取平均值并且表示为百分比。
如图21中所示，发现ARRDC1以比亲本细胞或外泌体中更高的水平(呈总蛋白含量的百分比形式)存在于融合剂脂质体中。融合剂脂质体中呈总蛋白含量的百分比形式的ARRDC1水平为至少0.02％。发现TSG101以比亲本细胞或外泌体中更高的水平(呈总蛋白含量的百分比形式)存在于融合剂脂质体中。融合剂脂质体中呈总蛋白含量的百分比形式的TSG101水平为至少0.004％。
实例100：在多次施用之后测量融合剂脂质体的血清灭活
这个实例描述在多次施用融合剂脂质体后，使用体外递送分析来定量融合剂脂质体的血清灭活。预期经修饰的融合剂脂质体(例如通过本文所描述的方法修饰)可以在多次(例如超过一次，例如2次或更多次)施用经修饰的融合剂脂质体后具有降低的(例如相比于施用未经修饰的融合剂脂质体降低的)血清灭活。在一些情况下，在多次施用后，本文所描述的融合剂脂质体不会被血清灭活。
融合剂脂质体的免疫原性的量度为血清灭活。在一个实施例中，重复注射融合剂脂质体可以使得产生抗融合剂脂质体抗体，例如识别融合剂脂质体的抗体。在一个实施例中，识别融合剂脂质体的抗体可以能够限制融合剂脂质体活性或寿命并且介导补体降解的方式结合。
在此实例中，在一次或多次施用融合剂脂质体之后检查血清灭活。通过先前实例中的任一个产生融合剂脂质体。在这个实例中，融合剂脂质体是由以下产生：被慢病毒介导的HLA-G表达修饰的HEK293细胞(下文称为HEK293-HLA-G)，和被慢病毒介导的空载体表达修饰的HEK293(下文称为HEK293)。在一些实施例中，融合剂脂质体来源于表达其它免疫调节蛋白的细胞。
血清取自不同的群组：全身和/或局部注射1、2、3、5、10次媒剂(未用融合剂脂质体处理的组)、HEK293-HLA-G融合剂脂质体或HEK293融合剂脂质体注射液的小鼠。通过收集新鲜全血并且使其完全凝血若干小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
测试融合剂脂质体的剂量，在所述剂量下，接受者群体中50％的细胞接受融合剂脂质体中的有效负载。融合剂脂质体可以通过本文所描述的任何其它实例产生，并且可以含有本文所描述的任何有效负载。本文还描述了许多用于分析融合剂脂质体递送有效负载到接受者细胞的方法。在这个特定实例中，有效负载为Cre蛋白并且接受者细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和递送的Cre(作为标记)。50％的接受者细胞呈RFP阳性时所鉴别的剂量用于进一步实验。在其它实施例中，将50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量用于进一步实验。
为了评估融合剂脂质体的血清灭活，将融合剂脂质体1∶5稀释成正常或热灭活的血清(或含有10％热灭活的FBS的培养基，作为无血清对照)，并且将混合物在37℃下培育1小时。在培育之后，将培养基添加到反应物中进行额外的1∶5稀释，并且随后以1∶10比率连续稀释两次。在这个步骤之后，融合剂脂质体应以先前鉴别的剂量存在，在所述剂量下，50％的接受者细胞接受有效负载(例如为RFP阳性)。预期50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量可以在融合剂脂质体之间是类似的。
随后将已暴露于血清的融合剂脂质体与接受者细胞一起培育。计算接受有效负载并且因此为RFP阳性的细胞的百分比。接受有效负载的细胞的百分比在已与来自用HEK293-HLA-G融合剂脂质体处理的小鼠的血清和热灭活的血清一起培育的融合剂脂质体样品之间可能没有差异，指示不存在融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。接受有效负载的细胞的百分比在从用HEK293-HLA-G融合剂脂质体处理1、2、3、5或10次的小鼠培育的融合剂脂质体样品之间可能没有差异，其将指示不存在融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。在一些情况下，接受有效负载的细胞的百分比在已与来自用媒剂处理的小鼠和来自用HEK293-HLA-G融合剂脂质体处理的小鼠的血清一起培育的融合剂脂质体样品之间没有差异，指示不存在融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。在一些情况下，用HEK293衍生的融合剂脂质体的接受有效负载的细胞的百分比少于HEK293-HLA-G融合剂脂质体，指示不存在HEK293-HLA-G融合剂脂质体的血清灭活或适应性免疫应答。
实例101：测量融合剂脂质体的补体靶向
这个实例描述了使用体外分析定量针对融合剂脂质体的补体活性。预期本文所描述的经修饰的融合剂脂质体可以相比于对应未经修饰的融合剂脂质体诱导降低的补体活性。
在这个实例中，评估小鼠血清针对融合剂脂质体的补体活性。所述实例测量补体C3a的水平，其是所有补体途径的中心节点。值得注意的是，通过对方案进行优化，本文所描述的方法同样可以适用于人类、大鼠、猴。
在这个实例中，通过前述实例中的任一个来产生融合剂脂质体。融合剂脂质体是由以下产生：被慢病毒介导的补体调节蛋白DAF的表达修饰的HEK293细胞(HEK293-DAF融合剂脂质体)或不表达补体调节蛋白的HEK293细胞(HEK293融合剂脂质体)。还可以使用其它补体调节蛋白，如结合加速衰减因子的蛋白质(DAF，CD55)，例如因子H(FH)样蛋白-1(FHL-1)，例如C4b结合蛋白(C4BP)，例如补体受体1(CD35)，例如膜辅因子蛋白(MCP，CD46)，例如凸出蛋白(CD59)，例如抑制经典和旁路补体途径CD/C5转化酶的蛋白质，例如调节MAC组装的蛋白质。
从未经处理的小鼠、施用HEK293-DAF融合剂脂质体的小鼠或施用HEK293融合剂脂质体的小鼠回收血清。通过收集新鲜全血并且使其完全凝血若干小时来从小鼠收集血清。通过离心沉淀凝块，并去除血清上清液。阴性对照为热灭活的小鼠血清。将阴性对照样品在56℃下加热1小时。血清可以等分试样冷冻。
测试不同融合剂脂质体的剂量，在所述剂量下，接受者群体中50％的细胞接受融合剂脂质体中的有效负载。融合剂脂质体可以通过本文所描述的任何其它实例产生，并且可以含有本文所描述的任何有效负载。本文还描述了许多用于分析融合剂脂质体递送有效负载到接受者细胞的方法。在这个特定实例中，有效负载为Cre蛋白并且接受者细胞为RPMI8226细胞，其在CMV启动子下稳定表达“LoxP-GFP-stop-LoxP-RFP”盒，在通过Cre重组后从GFP转换为RFP表达，指示融合和递送的Cre(作为标记)。50％的接受者细胞呈RFP阳性时所鉴别的剂量用于进一步实验。在其它实施例中，将50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量用于进一步实验。在优选实施例中，50％的接受者细胞接受有效负载的所鉴别的剂量为跨融合剂脂质体类似的。
开始于50％的接受者细胞接受有效负载的融合剂脂质体剂量的融合剂脂质体于磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH 7.4)中的两倍稀释液与来自用相同融合剂脂质体处理的小鼠或未处理的小鼠的血清的1∶10稀释液混合(分析体积，20μl)，并且在37℃下培育1小时。将样品进一步以1∶500稀释并用于对C3a具有特异性的酶联免疫吸附分析(ELISA)。ELISA为由LifeSpan生物科学公司出售的小鼠补体C3a ELISA试剂盒产品LS-F4210，其测量样品中的C3a的浓度。跨越从小鼠分离的血清比较存在200pg/ml C3a的融合剂脂质体的剂量。
在一些情况下，相比于与HEK293小鼠血清一起培育的HEK293融合剂脂质体，与HEK-293DAF小鼠血清一起培育的HEK293-DAF融合剂脂质体的存在200pg/ml C3a的融合剂脂质体的剂量更大，指示相比于HEK293-DAF融合剂脂质体，用HEK293融合剂脂质体处理的小鼠中靶向融合剂脂质体的补体活性更大。在一些情况下，相比于与未处理的小鼠血清一起培育的HEK293融合剂脂质体，与未处理的小鼠血清一起培育的HEK293-DAF融合剂脂质体的存在200pg/ml C3a的融合剂脂质体的剂量更大，指示相比于HEK293-DAF融合剂脂质体，用HEK293融合剂脂质体处理的小鼠中靶向融合剂脂质体的补体活性更大。
实例102：使用组织特异性启动子评估转基因表达的特异性和miRNA介导的基因沉 默
这个实例描述了外源药剂在靶人类肝瘤细胞系(HepG2)中的定量以及与非靶(非肝)细胞系的比较。细胞系用以下转导：含有正向TCSRE(例如组织特异性启动子)的慢病毒(LV)，或正向TCSRE和NTCSRE(例如miRNA通过组织特异性miRNA识别序列介导的基因沉默)的组合。靶细胞系和非靶细胞系用所产生的含有正向和负向调节元件的慢病毒颗粒转导并且评估所述细胞系中的转基因表达的效应。
A.miRNA介导的基因调节对转基因表达特异性的影响.
除肝细胞以外，内衬肝血窦的主要细胞群包括分别表达mir-126-3p和mir-142-3p的内皮细胞和库普弗细胞(来源于造血谱系的驻留型巨噬细胞)。这些miRNA在肝细胞中基本上不表达。慢病毒载体被构建成含有增强型绿色荧光蛋白(eGFP)表达盒，所述表达盒处于组成型活性启动子磷酸甘油酸激酶(hPGK，正向TCSRE；参见例如表3，具有或不具有四个串联拷贝，每个序列与作为NTCSRE的mir-142-3p(例如表4)和miR-126-3p(例如表4互补)的控制下。具有NTCSRE的慢病毒载体(LV)构建体命名为hPGK-eGFP+miRT，而不具有NTCSRE的构建体命名为hPGK-eGFP。
由这些hPGK-eGFP+miRT和hPGK-eGFP载体产生的慢病毒(LV)分别用于转导靶人类肝瘤细胞系(HepG2)或人类胚肾细胞系(293LX)、造血起源的人类T细胞系(Molt4.8)和来源于小鼠脑的内皮细胞系(bEND.3)。转导后七天，通过流式细胞测量术测量GFP表达。
如图22A中所示，经hPGK-eGFP LV转导的所有细胞类型中的18％-30％表达GFP。含有mirT序列的LV(hPGK-eGFP+miRT)在非靶细胞中转导之后，在Molt4.8细胞(表达mir-142-3p)中观察到仅0.6％GFP表达，而在bEND.3细胞(表达mir-126-3p)中未观察到表达。观察到293LX细胞中的GFP表达轻度减少，这些miRNA中的一种或两种在所述细胞中可以具有极低的表达水平。在已经含有mirT序列的LV(hPGK-eGFP+miRT)转导的HepG2靶细胞中未观察到对GFP表达的影响。这些结果证明，miRT序列并入慢病毒载体中使得转基因在造血谱系和内皮细胞谱系的细胞中的表达减少至少50倍，而维持肝细胞中的稳定表达。
B.miRNA介导的基因调节和组织特异性启动子对转基因表达的组合影响.
基本上如上文所述产生其它慢病毒载体(LV)，但其使用eGFP或使用编码具有N端flag标签的酶苯丙氨酸氨解酶(PAL)(参见例如表5)的转基因，其处于肝细胞特异性人类(ApoE.HCR-hAAT(hApoE)启动子(例如表3)的控制下，所述启动子与正向TCSRE或组成型活性脾脏病灶形成病毒(SFFV)启动子(例如表3)一样是组织特异性调节启动子。使用所提供的核酸构建体使PAL在肝细胞中的表达代表了所期望的外源药剂在靶细胞中的表达。举例来说，人类肝细胞的内源PAH缺乏可以引起Phe在血液中的毒性积聚，导致苯丙酮尿症(PKU)，一种以重度神经病症和生长发育不良为特征的临床病状。在一些方面中，早期向PKU患者施用PAL已展示可成功地降低血液Phe水平并且缓解症状。
如图22B中所示，在肝细胞特异性启动子(hApoE-eGFP+miRT)的控制下，用含有hPGK-eGFP的LV或含有mirT序列和GFP的LV转导对293LX细胞中的GFP表达产生了＞250倍的抑制作用，而对HepG2细胞基本上没有影响，如流式细胞测量术所测量。
HepG2和293LX细胞用处于SFFV启动子(SFFV-PAL)控制下的含有PAL转基因的LV转导，或用处于hApoE启动子(hApoE-PAL+miRT)控制下的含有PAL转基因以及mirT序列的LV转导。PAL催化苯丙氨酸(Phe)转化为氨和肉桂酸，并且已经作为酶替代疗法用于苯丙氨酸羟化酶(PAH)内在缺乏的患者。根据培养基上清液(SN)中的Phe水平相对于新鲜培养基降低来测量PAL转基因表达特异性。如图22C中所示，通过组成型启动子(SFFV)的表达使得从两种细胞类型收集的SN中的Phe水平大幅度降低。然而，hApoE-PAL+miRT构建体仅使得HepG2细胞中的Phe大幅度减少；从hApoE-PAL+miRT LV转导的293LX细胞收集的SN中的Phe水平与未转导的对照组无法区分。这个结果与以下一致：当用含有正向TSCRE和NTSCRE的LV构建体转导时，示例性转基因PAL在HepG2靶细胞中高度表达，但在非靶293LX细胞中则不然。
使用以下产生额外载体：i)ApoE.HCR-hAAT启动子，其是由人类载脂蛋白E基因合人类α-抗胰蛋白酶启动子的肝对照区域形成的嵌合启动子(Miao等人，《分子治疗学》，2000；PMID：10933977)；II)增强的转甲状腺素蛋白(ET)启动子，一种由肝细胞特异性转录因子结合位点与转甲状腺素蛋白启动子无规组装产生的合成启动子(Vigna等人，《分子治疗学》，2005；PMID：15851015和Brown等人，《血液》，2007；PMID：17726165)；以及iii)TBG启动子，其为基于人类甲状腺激素结合球蛋白和α1-微球蛋白/比库蛋白(Bikunin)增强子的杂合启动子(Yan等人，《基因》，2012；PMID：22820390)。将这些三个启动子克隆到eGFP基因上游的慢病毒骨架质粒(pSF)中。将这些构建体与普遍存在的SFFV盒一起封装到VSVg假型化LV中，并转导到HepG2(人肝细胞系)，原代人类肝细胞和SupT1(人T细胞系，以评估特异性)中。对已转导细胞的图像分析表明，这三种肝细胞特异性启动子在两种肝细胞系中均产生有效并且特异性的表达，但在非肝细胞中却未产生(参见下表)。尽管ApoE和TBG在T细胞上未介导任何可检测的表达，但启动子中的一种ET在T细胞系中仍产生低水平的GFP。为了进一步提高肝细胞特异性，我们为miR142-3p(在造血起源的细胞中表达的miRNA)包括了4×串联靶位点(Brown等，《血液》，2007；PMID：17726165)以及在表达序列的下游的miR126-3p(在大多数内皮细胞中表达的miRNA)(Chiriaco等，《分子治疗学》，2014；PMID：24869932)。用这些新构建体转导的肝细胞和非肝细胞系的图像分析清楚地表明，添加miRNA靶位点会强烈抑制免疫细胞中转基因的表达，从而导致在非肝细胞中完全抑制GFP表达，同时保持在原代和永生化人类肝细胞中均显著表达。
原代人类肝细胞 HepG2 SupT1
pSF-SFFV-eGFP ++++ ++++ +++++
pSF-SFFV-eGFP+1xmiRT +++ ++++ ++
pSF-SFFV-eGFP+4xmiRT +++ ++ +/-
pSF-ApoE-eGFP ++ ++ -
pSF-ET-eGFP +++ ++++ +/-
pSF-TBG-eGFP ++ +++ -
pSF-ApoE-eGFP+4xmiRT ++ + -
pSF-ET-eGFP+4xmiRT ++ ++ -
pSF-TBG-eGFP+4xmiRT + ++ -
C.结论
总之，这些数据支持以下发现：组织特异性启动子与miRNA靶点结合使用可以赋予转基因表达实质的特异性。

Claims (52)

1.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的正向肝细胞特异性调节元件，其中相对于缺乏所述正向肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述正向肝细胞特异性调节元件增加所述有效负载基因在肝细胞中的表达。
2.根据权利要求1所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包含可操作地连接到所述有效负载基因的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE减小所述有效负载基因在非肝细胞中的表达。
3.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的启动子，其中所述启动子是选自Apoa2、Cyp3a4、LP1B、MIR122、血红素结合蛋白、SERPINA1或HLP启动子。
4.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；以及
b)核酸，其包含：
(i)编码外源药剂的有效负载基因；以及
(ii)可操作地连接到所述有效负载基因的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中：
所述NTCSRE是非肝细胞特异性miRNA识别序列、非肝细胞特异性蛋白酶识别位点、非肝细胞特异性泛素连接酶位点、非肝细胞特异性转录抑制位点或非肝细胞特异性表观遗传抑制位点，并且相对于缺乏所述NTCSRE的其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE减小所述有效负载基因在非肝细胞或组织中的表达。
5.根据权利要求4所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包含可操作地连接到所述有效负载基因的正向肝细胞特异性调节元件，其中相对于缺乏所述正向肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述正向肝细胞特异性调节元件增加所述有效负载基因在肝细胞中的表达。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体还包含以下中的一种或两种：
(i)所述脂质双层上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；或
(ii)第一免疫刺激性蛋白质，其不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平存在，任选地其中所述降低的水平为降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
7.根据权利要求1到6中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负载基因为治疗基因缺陷的基因。
8.一种融合剂脂质体，其包含：
a)包含融合剂的脂质双层；
b)核酸，其包含编码外源药剂的有效负载基因，所述有效负载基因用于治疗基因缺陷；以及
c)以下中的一种或两种：
(i)所述脂质双层上的第一外源性或过度表达的免疫抑制蛋白；或
(ii)第一免疫刺激性蛋白质，其不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平(例如，降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％)存在。
9.根据权利要求6到8中任一项所述的融合剂脂质体，其包含(i)和(ii)。
10.根据权利要求6到9中任一项所述的融合剂脂质体，其包含(i)并且还包含所述脂质双层上的第二外源性或过度表达的免疫抑制蛋白。
11.根据权利要求6到10中任一项所述的融合剂脂质体，其包含(ii)并且还包含第二免疫刺激性蛋白质，所述第二免疫刺激性蛋白质不存在或与由其它方面类似的未经修饰的源细胞产生的融合剂脂质体相比，以降低的水平存在，任选地其中所述降低的水平为降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。
12.根据权利要求8到11中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包含可操作地连接到所述有效负载基因的正向肝细胞特异性调节元件，其中相对于缺乏所述正向肝细胞特异性调节元件的其它方面类似的融合剂脂质体，所述正向肝细胞特异性调节元件增加所述有效负载基因在肝细胞中的表达。
13.根据权利要求8到12中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸还包含可操作地连接到所述有效负载基因的非靶细胞特异性调节元件(NTCSRE)，其中相对于缺乏所述NTCSRE的其它方面类似的融合剂脂质体，所述NTCSRE减小所述有效负载基因在非肝细胞或组织中的表达。
14.根据权利要求6到13中任一项所述的融合剂脂质体，其中当向个体施用时，以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体不产生可检测到的抗体应答，或针对所述融合剂脂质体的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
ii)所述融合剂脂质体不产生可检测到的细胞免疫应答，或针对所述融合剂脂质体的细胞免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
iii)所述融合剂脂质体不产生可检测到的先天性免疫应答，或针对所述融合剂脂质体的先天性免疫应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；
iv)被血清灭活的融合剂脂质体小于10％、5％、4％、3％、2％或1％；
v)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的抗体应答，(或针对所述靶细胞的抗体以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在；或
vi)已从所述融合剂脂质体接受所述外源药剂的靶细胞不产生可检测到的细胞免疫应答，或针对所述靶细胞的细胞应答以高于背景水平不到10％、5％、4％、3％、2％或1％的水平存在。
15.根据权利要求14所述的融合剂脂质体，其中所述背景水平是同一个体在施用所述融合剂脂质体之前的对应水平。
16.根据权利要求6到15中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫抑制蛋白是补体调节蛋白或CD47。
17.根据权利要求6到16中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述免疫刺激性蛋白质为MHC I或MHC II蛋白质。
18.根据权利要求1到17中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负载基因是选自OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAH、PAL、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LNBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL、GRHPR、HOGA1、LDLR、ACAD8、ACADSB、ACAT1、ACSF3、ASPA、AUH、DNAJC19、ETHE1、FBP1、FTCD、GSS、HIBCH、IDH2、L2HGDH、MLYCD、OPA3、OPLAH、OXCT1、POLG、PPM1K、SERAC1、SLC25A1、SUCLA2、SUCLG1、TAZ、AGK、CLPB、TMEM70、ALDH18A1、OAT、CA5A、GLUD1、GLUL、UMPS、SLC22A5、CPT1A、HADHA、HADH、SLC52A1、SLC52A2、SLC52A3、HADHB、GYS2、PYGL、SLC2A2、ALG1、ALG2、ALG3、ALG6、ALG8、ALG9、ALG11、ALG12、ALG13、ATP6V0A2、B3GLCT、CHST14、COG1、COG2、COG4、COG5、COG6、COG7、COG8、DOLK、DHDDS、DPAGT1、DPM1、DPM2、DPM3、G6PC3、GFPT1、GMPPA、GMPPB、MAGT1、MAN1B1、MGAT2、MOGS、MPDU1、MPI、NGLY1、PGM1、PGM3、RFT1、SEC23B、SLC35A1、SLC35A2、SLC35C1、SSR4、SRD5A3、TMEM165、TRIP11、TUSC3、ALG14、B4GALT1、DDOST、NUS1、RPN2、SEC23A、SLC35A3、ST3GAL3、STT3A、STT3B、AGA、ARSA、ARSB、ASAH1、ATP13A2、CLN3、CLN5、CLN6、CLN8、CTNS、CTSA、CTSD、CTSF、CTSK、DNAJC5、FUCA1、GAA、GALC、GALNS、GLA、GLB1、GM2A、GNPTAB、GNPTG、GNS、GRN、GUSB、HEXA、HEXB、HGSNAT、HYAL1、IDS、IDUA、KCTD7、LAMP2、MAN2B1、MANBA、MCOLN1、MFSD8、NAGA、NAGLU、NEU1、NPC1、NPC2、SGSH、PPT1、PSAP、SLC17A5、SMPD1、SUMF1、TPP1、AHCY、GNMT、MAT1A、GCH1、PCBD1、PTS、QDPR、SPR、DNAJC12、ALDH4A1、PRODH、HPD、GBA、HGD、AMN、CD320、CUBN、GIF、TCN1、TCN2、PREPL、PHGDH、PSAT1、PSPH、AMT、GCSH、GLDC、LIAS、NFU1、SLC6A9、SLC2A1、ATP7A、AP1S1、CP、SLC33A1、PEX7、PHYH、AGPS、GNPAT、ABCD1、ACOX1、PEX1、PEX2、PEX3、PEX5、PEX6、PEX10、PEX12、PEX13、PEX14、PEX16、PEX19、PEX26、AMACR、ADA、ADSL、AMPD1、GPHN、MOCOS、MOCS1、PNP、XDH、SUOX、OGDH、SLC25A19、DHTKD1、SLC13A5、FH、DLAT、MPC1、PDHA1、PDHB、PDHX、PDP1、ABCC2、SLCO1B1、SLCO1B3、HFE2、ADAMTS13、PYGM、COL1A2、TNFRSF11B、TSC1、TSC2、DHCR7、PGK1、VLDLR、KYNU、F5、C3、COL4A1、CFH、SLC12A2、GK、SFTPC、CRTAP、P3H1、COL7A1、PKLR、TALDO1、TF、EPCAM、VHL、GC、SERPINA1、ABCC6、F8、F9、ApoB、PCSK9、LDLRAP1、ABCG5、ABCG8、LCAT、SPINK5和GNE。
19.根据权利要求1到18中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述有效负载基因编码包含SEQ ID NO:161-518中的任一个中所示的序列的外源药剂、其功能片段或包含具有与SEQID NO:161-518中的任一个中所示的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的氨基酸序列的其功能变异体。
20.根据权利要求1到19中任一项所述的融合剂脂质体，其中以下中的一个或多个：
i)所述融合剂脂质体与肝细胞融合的速率高于与非肝细胞融合的速率，任选地，其中所述速率提高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
ii)所述融合剂脂质体与肝细胞融合的速率高于另一种融合剂脂质体，任选地，其中所述速率提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
iii)所述融合剂脂质体与肝细胞以使得在24、48或72小时之后所述融合剂脂质体中的所述外源药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的肝细胞的速率融合；
iv)所述融合剂脂质体将所述核酸以比递送到非肝细胞的速率更高的速率递送到肝细胞中，任选地，其中所述速率提高至少至少1％、2％、3％、4％、5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；
v)所述融合剂脂质体将所述核酸以比另一种融合剂脂质体更高的速率递送到肝细胞，任选地，其中所述速率提高至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍或100倍；或
vi)所述融合剂脂质体以使得在24、48或72小时之后将所述融合剂脂质体中的药剂递送到至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的靶细胞的速率将所述核酸递送到肝细胞。
21.根据权利要求1到20中任一项所述的融合剂脂质体，其中编码外源药剂的所述有效负载基因是选自OTC、CPS1、NAGS、BCKDHA、BCKDHB、DBT、DLD、MUT、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、MCEE、PCCA、PCCB、UGT1A1、ASS1、PAH、ATP8B1、ABCB11、ABCB4、TJP2、IVD、GCDH、ETFA、ETFB、ETFDH、ASL、D2HGDH、HMGCL、MCCC1、MCCC2、ABCD4、HCFC1、LMBRD1、ARG1、SLC25A15、SLC25A13、ALAD、CPOX、HMBS、PPOX、BTD、HLCS、PC、SLC7A7、CPT2、ACADM、ACADS、ACADVL、AGL、G6PC、GBE1、PHKA1、PHKA2、PHKB、PHKG2、SLC37A4、PMM2、CBS、FAH、TAT、GALT、GALK1、GALE、G6PD、SLC3A1、SLC7A9、MTHFR、MTR、MTRR、ATP7B、HPRT1、HJV、HAMP、JAG1、TTR、AGXT、LIPA、SERPING1、HSD17B4、UROD、HFE、LPL、GRHPR、HOGA1或LDLR。
22.根据权利要求1到21中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂为病毒包膜蛋白。
23.根据权利要求1到22中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包含VSV-G。
24.根据权利要求1到21中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包含选自以下的序列：尼帕病毒(Nipah virus)F和G蛋白、麻疹病毒(measles virus)F和H蛋白、树鼩副粘病毒(tupaia paramyxovirus)F和H蛋白、副粘病毒(paramyxovirus)F和G蛋白或F和H蛋白或F和HN蛋白、亨德拉病毒(Hendra virus)F和G蛋白、亨尼帕病毒(Henipavirus)F和G蛋白、麻疹病毒(Morbilivirus)F和H蛋白、呼吸道病毒(respirovirus)F和HN蛋白、仙台病毒(Sendai virus)F和HN蛋白、腮腺炎病毒(rubulavirus)F和HN蛋白，或禽腮腺炎病毒(avulavirus)F和HN蛋白，或其衍生物，或其任何组合。
25.根据权利要求1到21和24中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂包含长度为至少100个氨基酸的域，所述域与野生型副粘病毒融合剂具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列一致性，任选地，其中所述野生型副粘病毒融合剂示于SEQ ID NO:1-132中的任一个中。
26.根据权利要求25所述的融合剂脂质体，其中所述野生型副粘病毒是尼帕病毒，任选地，其中所述尼帕病毒是亨尼帕病毒。
27.根据权利要求1到26中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂再靶向以用于递送到肝细胞。
28.根据任何权利要求1、2、5、6、7和14到27所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含肝特异性启动子、肝特异性增强子、肝特异性剪接位点、延长RNA或蛋白质半衰期的肝特异性位点、肝特异性mRNA核输出启动位点、肝特异性翻译增强位点或肝特异性翻译后修饰位点。
29.根据权利要求28所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含肝细胞特异性启动子。
30.根据权利要求28或29所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含选自以下的启动子：增强的转甲状腺素蛋白(ET)、Alb、Apoa2、Cyp3a4、LP1B、MIR122、血红素结合蛋白、SERPINA1或HLP启动子。
31.根据权利要求3或权利要求30所述的融合剂脂质体，其中所述启动子具有SEQ IDNO:133-136或519-525中的任一个中所示的序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。
32.根据权利要求28或权利要求29所述的融合剂脂质体，其中所述正向肝特异性调节元件包含ApoE.HCR-hAAT启动子，任选地，其中所述启动子包含SEQ ID NO:133中所示的序列，或与SEQ ID NO:133中所示的所述序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的序列。
33.根据权利要求2、6、7和15到32中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE包含非肝细胞特异性miRNA识别序列、非肝细胞特异性蛋白酶识别位点、非肝细胞特异性泛素连接酶位点、非肝细胞特异性转录抑制位点或非肝细胞特异性表观遗传抑制位点。
34.根据权利要求33所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE包含非肝细胞特异性miRNA识别序列并且所述miRNA识别序列能够被以下中的一个或多个结合：miR-142、mir-181a-2、mir-181b-1、mir-181c、mir-181a-1、mir-181b-2、mir-181d、miR-223或miR-126。
35.根据权利要求33或权利要求34所述的融合剂脂质体，其中所述NTCSRE位于编码所述外源药剂)的已转录区内或在所述已转录区内编码，任选地，其中由所述已转录区产生的RNA包含位于UTR或编码区内的所述miRNA识别序列。
36.根据权利要求1到35中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包含一个或多个隔离元件。
37.根据权利要求36所述的融合剂脂质体，其中所述核酸包含两个隔离元件，任选地，其中所述两个隔离元件包含所述有效负载基因上游的第一隔离元件和所述有效负载基因下游的第二隔离元件，任选地，其中所述第一隔离元件和所述第二隔离元件包含相同或不同的序列。
38.根据权利要求1到37中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述融合剂脂质体为逆转录病毒载体颗粒。
39.根据权利要求1到38中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述核酸能够整合到肝细胞的基因组中。
40.根据权利要求1到39中任一项所述的融合剂脂质体，其中所述肝细胞是选自肝细胞、肝窦内皮细胞、胆管上皮细胞、星状细胞、肝驻留抗原呈递细胞、肝驻留免疫淋巴细胞或门静脉成纤维细胞。
41.一种药物组合物，其包含根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体和药学上可接受的载剂、稀释剂或赋形剂。
42.一种将外源药剂递送到个体的方法，其包含向所述个体施用根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求41所述的药物组合物，从而将所述外源药剂递送到所述个体。
43.一种在个体中调节肝脏或肝细胞功能的方法，其包含使所述个体的所述肝脏或所述肝细胞与根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求41所述的药物组合物接触。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述靶组织或所述靶细胞存在于所述个体中。
45.根据权利要求43或权利要求44所述的方法，其中所述接触是通过向所述个体施用所述融合剂脂质体来实现。
46.一种治疗个体的基因缺陷的方法，其包含向所述个体施用根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求41所述的药物组合物。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述基因缺陷为能够由编码所述外源药剂的所述有效负载基因治疗的基因缺陷。
48.根据权利要求42到47中任一项所述的方法，其中所述个体是人类个体。
49.根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求41所述的药物组合物，其用于治疗具有基因缺陷的个体。
50.一种根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体或根据权利要求41所述的药物组合物的用途，其用于制造供用于治疗具有基因缺陷的个体的药物。
51.根据权利要求49所述使用的融合剂脂质体或药物组合物或根据权利要求50所述的用途，其中所述融合剂脂质体包含编码外源药剂的有效负载基因，所述有效负载基因用于治疗所述基因缺陷。
52.一种制备根据权利要求1到40中任一项所述的融合剂脂质体的方法，其包含：
a)提供包含所述核酸和所述融合剂的细胞；
b)在允许所述融合剂脂质体产生的条件下培养所述细胞，以及
c)从所述细胞中分离、富集或纯化所述融合剂脂质体，从而制备所述融合剂脂质体。
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