TW202342498A - 經修飾副黏液病毒科融合醣蛋白 - Google Patents
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Abstract
本文提供摻有變異體尼帕病毒F (Nipah Virus F，NiV-F)包膜醣蛋白或用該醣蛋白假型化之脂質粒子，諸如慢病毒粒子，且在一些態樣中亦提供附著醣蛋白(G)蛋白，諸如NiV-G蛋白或其生物活性部分或變異體。亦提供編碼變異體NiV-F之多核苷酸及用於製備含有變異體NiV-F蛋白之脂質粒子(諸如慢病毒粒子)之生產細胞，以及用於製備及使用該等脂質粒子(諸如慢病毒粒子)之方法。
Description
本揭示案係關於變異體尼帕病毒F (Nipah Virus F，NiV-F)包膜醣蛋白，及摻有此類變異體醣蛋白或用此類變異體醣蛋白假型化之脂質粒子，諸如慢病毒粒子，且在一些態樣中亦關於醣蛋白(G)蛋白，諸如NiV-G蛋白或其生物活性部分或變異體。本揭示案亦提供編碼變異體NiV-F之多核苷酸及用於製備含有變異體NiV-F蛋白之脂質粒子(諸如慢病毒粒子)之生產細胞，以及用於製備及使用該等脂質粒子(諸如慢病毒粒子)之方法。
脂質粒子，包括基於病毒之粒子，如病毒樣粒子及病毒載體，諸如慢病毒粒子，通常用於將外源劑遞送至細胞。對於各種粒子，諸如慢病毒載體粒子，可藉由用異源包膜蛋白或經修飾包膜蛋白進行假型化來改變宿主範圍。具有某些異源或經修飾假型包膜蛋白之粒子的有效製備及產生可能並不總是有效的，諸如歸因於包膜蛋白對所產生之慢病毒載體粒子之低效價的影響。需要改良之脂質粒子，包括病毒樣粒子及病毒載體，其能夠以更高效價且以所需細胞之有效轉導效率產生。所提供之揭示內容解決此需求。
本文提供一種脂質粒子，該脂質粒子包含：(a)脂質雙層；(b)副黏液病毒醣蛋白(G蛋白)或其生物活性部分；及(c)包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾細胞質尾包含：(i)來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白；(ii)經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或(iii)包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質，其中該G蛋白或其生物活性部分及該變異體NiV-F蛋白暴露於該脂質雙層之外部。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
本文提供一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：(a)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(b)包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾細胞質尾包含：(i)來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白；(ii)經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或(iii)包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質，其中該G蛋白或其生物活性部分及該變異體NiV-F蛋白暴露於脂質雙層之外部。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白在G蛋白與靶細胞上之靶分子結合後展現與靶細胞之融合活性。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經修飾細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由經修飾細胞質尾之序列組成之經修飾F1，該細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F自N端至C端依序包含細胞外結構域、跨膜結構域及經修飾細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F之細胞外結構域及跨膜結構域來自野生型NiV-F或其生物活性變異體。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F之細胞外結構域及跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列，或與SEQ ID NO:2展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F之細胞外結構域及跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾為經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾為經截短NiV-G細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒細胞質尾之C端處或附近具有23個或約23個胺基酸殘基之缺失。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾為SEQ ID NO:27所示之經截短NiV-F細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之序列，或與SEQ ID NO:306展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F為嵌合蛋白且經修飾細胞質尾包含來自另一病毒之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為正核糖核酸病毒界(Kingdom Orthornavirae)之成員。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒科、彈狀病毒科、沙粒病毒科或反轉錄病毒科之成員。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒科之成員。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為亨德拉病毒(Hendra virus)、雪松病毒(Cedar virus)、犬瘟熱病毒、副流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或仙台病毒(Sendai virus)。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為麻疹病毒且醣蛋白為麻疹病毒融合(F)蛋白(MvF)。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短MvF細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有至多32個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短MvF細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有26個或約26個或至多26個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:307所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:307展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為新城疫病毒(NDV)且醣蛋白為NDV F蛋白。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有至多25個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有17個或約17個或至多17個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:147所示之異源細胞質尾。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:308所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:308展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 308所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有20個或約20個或至多20個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:150所示之異源細胞質尾。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:309所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:309展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-G包含SEQ ID NO:309所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為亨德拉病毒(HeV)且醣蛋白為HeV F蛋白。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短HeV F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 58所示之野生型HeV F細胞質尾之C端處或附近具有至多26個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源細胞質尾為經截短HeV F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 58所示之野生型HeV F細胞質尾之C端處或附近具有22個或約22個或至多22個連續胺基酸殘基之缺失。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:80所示之異源細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:310所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:310展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 310所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包括用來自另一副黏液病毒之附著蛋白之細胞質尾或其經截短部分置換NiV-F細胞質尾之附著模體。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，副黏液病毒為尼帕病毒、亨德拉病毒或麻疹病毒。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，附著蛋白為G蛋白、H蛋白或HN蛋白。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO: 210-222中之任一者所示之異源細胞質尾。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，脂質粒子進一步包含經修飾胞外域，該經修飾胞外域包含經修飾蛋白酶裂解位點。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾裂解位點包括用SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾裂解位點包括用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點。
本文提供一種脂質粒子，該脂質粒子包含：(a)脂質雙層；(b)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(c)包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點：(i)用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或(ii)用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
本文提供一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：(a)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(b)包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點：(i)用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或(ii)用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:329) VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該裂解序列為組織蛋白酶L裂解位點。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，置換裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點且蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，置換裂解序列包含經修飾弗林蛋白酶裂解位點且蛋白水解裂解形式為弗林蛋白酶裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，置換係在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:320所示之胺基酸序列或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式中。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，弗林蛋白酶裂解序列如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，來自另一副黏液病毒之經修飾裂解位點如SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:239展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸1-26)之成熟形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，與野生型NiV-F之信號序列相比，變異體NiV-F包含異源信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F由多核苷酸序列編碼，與野生型NiV-F之經編碼信號序列相比，該多核苷酸序列包含編碼異源信號序列之序列。
本文提供一種脂質粒子，該脂質粒子包含：(a)脂質雙層；(b)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(c)變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列或由包含編碼異源信號序列之序列的多核苷酸序列編碼。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
本文提供一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：(a)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(b)變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列或由包含編碼異源信號序列之序列的多核苷酸序列編碼。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列來自另一病毒或為哺乳動物信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒，視情況為亨尼帕病毒(henipavirus)。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列為HevF信號序列、CevF信號序列、HPIV2信號序列、MevF信號序列、NDV-F信號序列或SevF信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 340-345中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為副流感病毒且異源信號序列為人類副流感病毒2 (HPIV2)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 342所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 251所示之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒(Cocal virus)、伊波拉病毒(Ebola virus)、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為水疱性口炎病毒(VSV)且異源信號序列為VSV G醣蛋白(VSV-G)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 352所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，哺乳動物信號序列為來自人類蛋白質之信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，與野生型NiV-F之跨膜結構域相比，變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
本文提供一種脂質粒子，該脂質粒子包含：(a)脂質雙層；(b)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(c)變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
本文提供一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：(a)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(b)變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，跨膜結構域為來自亨德拉病毒之異源跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 361所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1所示之位置的編號，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 359、360、362或363中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，粒子進一步包含超融合突變。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入超融合突變。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，超融合突變為N64Q、N67Q、N99Q、N414Q及/或N464Q中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，一或多個突變係選自由以下組成之群：N64Q、N67Q、N99Q、N414Q、N464Q、N67Q/N99Q、N67Q/N414Q、N67Q/N464Q、N99Q/N414Q、N99Q/N464Q、N414Q/N464Q、N67Q/N99Q/N414Q、N67Q/N414Q/ N464Q、N99Q/N414Q/N464Q或N67Q/N99Q/N414Q/N464Q、N64Q/N99Q、N64Q/N99Q/N464Q、N64Q/N67Q/N99Q及N64Q/N67Q/N99Q/N464Q。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入超融合突變。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，超融合突變為R109L、Q393L或R109L與Q393L中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。
本文提供一種脂質粒子，該脂質粒子包含：(a)脂質雙層；(b)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(c)變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變：在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入之突變；及/或在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
本文提供一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：(a)副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及(b)變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變：在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入之突變；及/或在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，粒子包含突變N67Q、N99Q、N414Q或N464Q或其任何組合；及/或突變R109L或Q393L或其組合。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，超融合突變係在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列中。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:247所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:247展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 247所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:292所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白為NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分，其展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白質之NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域附接至G蛋白之C端。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞係選自由以下組成之群：腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞係選自由以下組成之群：CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞、CD30+肺上皮細胞。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞為肝細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域結合至選自由ASGR1、ASGR2及TM4SF組成之群的細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞為T細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域結合至選自由CD3、CD4或CD8組成之群的細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域為抗體或抗原結合片段、單結構域抗體或DARPin。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體，該單結構域抗體為VHH或為單鏈可變片段(scFv)。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域經由連接子附接至G蛋白。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，連接子為肽連接子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，肽連接子之長度為2至65個胺基酸。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，肽連接子為可撓性連接子，該可撓性連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，肽連接子係選自：(GGS)n，其中n為1至10；(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10；或(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，粒子為複製缺陷的。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，藉由包括用編碼Gag-pol、Rev、Tat及變異體NiVG及F蛋白之包裝質體轉導生產細胞之方法來製備粒子。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，粒子進一步包含病毒核酸。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，病毒核酸包含以下核酸序列中之一或多者(例如，全部)：5' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3結構域)、Psi包裝元件(Psi)、中央聚嘌呤束(cPPT)/中央終止序列(CTS) (例如，DNA瓣)、聚A尾序列、轉錄後調控元件(例如，WPRE)、Rev反應元件(RRE)及3' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3)。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，粒子不含病毒基因體DNA。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，以與參考粒子製劑相比具有增加之效價的製劑形式產生粒子，該參考粒子製劑以類似方式產生，但摻有SEQ ID NO: 1所示之全長NiV-F蛋白，視情況其中脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，以與參考粒子製劑相比具有增加之效價的製劑形式產生粒子，該參考粒子製劑以類似方式產生，但摻有包含SEQ ID NO:303所示之序列或由編碼SEQ ID NO:302所示之序列之多核苷酸編碼的經截短NiV-F蛋白，視情況其中脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，效價增加等於或大於1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，效價增加約2.0倍或大於約2.0倍。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，效價增加約3.0倍或大於約3.0倍。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，效價增加約4.0倍或大於約4.0倍。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，效價增加約5.0倍或大於約5.0倍。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，粒子進一步包含用於遞送至靶細胞之外源劑。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源劑存在於內腔中。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源劑為蛋白質或核酸，視情況其中核酸為DNA或RNA。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源劑為編碼用於遞送至靶細胞之貨物的核酸。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源劑為治療劑或診斷劑或者編碼治療劑或診斷劑。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源劑編碼膜蛋白，視情況其中該膜蛋白為用於靶向由疾病或疾患表現或與疾病或疾患相關之細胞的抗原受體。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，膜蛋白為嵌合抗原受體(CAR)。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞為T細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源劑為包含用於校正遺傳缺陷、視情況靶細胞中之遺傳缺陷之有效負荷基因的核酸，視情況其中該遺傳缺陷與肝臟細胞或肝細胞相關。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白與靶細胞上之細胞表面分子的結合介導粒子與靶細胞之融合及外源劑向靶細胞之遞送。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，向等於或大於10%、20%、30%、40%、50%、60%之靶細胞遞送外源劑。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源細胞向靶細胞之遞送與參考粒子製劑相比有所增加，該參考粒子製劑以類似方式產生，但其中NiV-F蛋白為SEQ ID NO: 1所示之全長NiV-F蛋白，視情況其中脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，外源細胞向靶細胞之遞送與參考粒子製劑相比有所增加，該參考粒子製劑以類似方式產生，但其中F蛋白為包含SEQ ID NO:303所示之序列或由編碼SEQ ID NO:302所示之序列之多核苷酸編碼的經截短NiV-F，視情況其中脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，向靶細胞之遞送增加等於或大於1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
本文提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，其中該經修飾細胞質尾包含：(i)來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白；(ii)經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或(iii)包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經修飾細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由經修飾細胞質尾之序列組成之經修飾F1，該細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F自N端至C端依序包含細胞外結構域、跨膜結構域及經修飾細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F之細胞外結構域及跨膜結構域來自野生型NiV-F或其生物活性變異體。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F之細胞外結構域及跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列，或與SEQ ID NO:2展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F之細胞外結構域及跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO: 80、133、147及150中之任一者所示之異源細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307、308、309及310中之任一者所示之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經修飾細胞質尾為SEQ ID NO: 27中之任一者所示之經截短NiV-F細胞質尾。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 306中之任一者所示之胺基酸序列。
本文提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點：(i)用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或(ii)用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該裂解序列為組織蛋白酶L裂解位點；其中該置換係在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:320所示之胺基酸序列或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式中。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，弗林蛋白酶裂解序列如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，來自另一副黏液病毒之經修飾裂解位點如SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:239展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸1-26)之成熟形式。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列。
本文提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列來自另一病毒或為哺乳動物信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒，視情況為亨尼帕病毒。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列為HevF信號序列、CevF信號序列、HPIV2信號序列、MevF信號序列、NDV-F信號序列或SevF信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 340-345中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為副流感病毒且異源信號序列為人類副流感病毒2 (HPIV2)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 342所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 251所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒、伊波拉病毒、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，另一病毒為水疱性口炎病毒(VSV)且異源信號序列為VSV G醣蛋白(VSV-G)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 352所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，哺乳動物信號序列為來自人類蛋白質之信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。
本文提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，跨膜結構域為來自亨德拉病毒之異源跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 361所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1所示之位置的編號，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 359、360、362或363中之任一者所示。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
本文提供一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變：在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67及/或99之N-糖基化位點處引入之突變；及/或在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:247所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:247展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 247所示之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:292所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，核酸序列為第一核酸序列且多核苷酸進一步包含編碼副黏液病毒融合(G)蛋白分子或其生物活性部分或其功能活性變異體之第二核酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，多核苷酸展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，蛋白質之NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域附接至G蛋白之C端。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞係選自由以下組成之群：腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞係選自由以下組成之群：CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞、CD30+肺上皮細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞為肝細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域結合至選自由ASGR1、ASGR2及TM4SF組成之群的細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，靶細胞為T細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域結合至選自由CD3、CD4或CD8組成之群的細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域為抗體或抗原結合片段、單結構域抗體或DARPin。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體，該單結構域抗體為VHH或為單鏈可變片段(scFv)。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，結合結構域經由連接子附接至G蛋白。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，連接子為肽連接子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，肽連接子之長度為2至65個胺基酸。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，肽連接子為可撓性連接子，該可撓性連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，肽連接子係選自：(GGS)n，其中n為1至10；(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10；或(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，多核苷酸包含IRES或編碼第一核酸序列與第二核酸序列之間的連接肽之序列，視情況其中該連接肽為自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽，視情況為T2A肽。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，多核苷酸進一步包含至少一個操作性地連接之啟動子以控制核酸之表現，視情況控制第一核酸序列及第二核酸序列之表現。
本文提供一種包含任何所提供之多核苷酸的載體。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，載體為哺乳動物載體、病毒載體或人工染色體，視情況其中該人工染色體為細菌人工染色體(BAC)。
本文提供一種包含任何所提供之多核苷酸的質體。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，質體進一步包含一或多種編碼用於慢病毒產生之蛋白質的核酸。
本文提供一種包含任何所提供之核苷酸或載體或質體之細胞。
本文提供一種製造包含變異體尼帕病毒F蛋白及視情況存在之副黏液病毒G蛋白之脂質粒子的方法，該方法包括a)提供包含任何所提供之實施例之多核苷酸或任何所提供之實施例之載體或任何所提供之實施例之質體的細胞；b)在允許產生脂質粒子之條件下培養該細胞，及c)自該細胞中分離、富集或純化該脂質粒子，從而製造該脂質粒子。
本文提供一種製造假型慢病毒載體之方法，該方法包括：a)提供包含慢病毒核酸及任何所提供之實施例之多核苷酸或任何所提供之實施例之載體或任何所提供之實施例之質體的生產細胞；b)在允許產生該慢病毒載體之條件下培養該細胞，及c)自該細胞中分離、富集或純化該慢病毒載體，從而製造該假型慢病毒載體。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，在步驟(b)之前，該方法進一步包括向細胞提供編碼亨尼帕病毒F蛋白分子或其生物活性部分之多核苷酸。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，細胞為包含病毒核酸、視情況反轉錄病毒核酸或慢病毒核酸之生產細胞，且靶向脂質粒子為病毒粒子或病毒樣粒子，視情況為反轉錄病毒粒子或反轉錄病毒樣粒子，視情況為慢病毒粒子或慢病毒樣粒子。
本文提供一種包含任何所提供之多核苷酸、載體或質體之生產細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，生產細胞進一步包含副黏液病毒G蛋白或其生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，生產細胞展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G為蛋白質之功能活性變異體或其生物活性部分，該功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，細胞進一步包含病毒核酸，視情況其中該病毒核酸為慢病毒核酸。
本文提供一種藉由任何所提供之方法或生產細胞產生之脂質粒子或假型慢病毒載體。
本文提供一種包含複數個任何所提供之脂質粒子或複數個任何所提供之慢病毒載體的組合物。
在任何所提供之實施例中之一些實施例中，組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
本文提供一種轉導細胞之方法，該方法包括用任何所提供之慢病毒載體或者包含任何所提供之慢病毒載體或任何所提供之複數個慢病毒載體的任何所提供之組合物轉導細胞。
本文提供一種將外源劑遞送至個體(例如，人類個體)之方法，該方法包括向該個體投與任何所提供之脂質粒子或慢病毒載體、或包含任何所提供之脂質粒子或任何所提供之慢病毒載體的任何所提供之組合物、或包含慢病毒載體或複數個慢病毒載體的任何所提供之組合物，其中脂質粒子或慢病毒載體包含該外源劑。
本文提供將外源劑遞送至靶細胞之方法，該方法使靶細胞與任何所提供之脂質粒子或慢病毒載體或任何所提供之組合物或複數個慢病毒載體接觸，其中該脂質粒子或該慢病毒載體包含該外源劑。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，該接觸用慢病毒載體或脂質粒子轉導細胞。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，在個體中活體內進行接觸。
本文提供一種治療個體(例如，人類個體)之疾病或病症之方法，該方法包括向該個體投與任何所提供之脂質粒子或任何所提供之慢病毒載體或任何所提供之組合物。
本文提供一種將哺乳動物細胞與脂質粒子融合之方法，該方法包括向個體投與任何所提供之脂質粒子或慢病毒載體或任何所提供之組合物。在任何所提供之實施例中之一些實施例中，哺乳動物細胞與脂質粒子之融合將外源劑遞送至個體(例如，人類個體)。
相關申請案之交叉引用
本申請案主張2021年12月17日提交之題為「MODIFIED PARAMYXOVIRIDAE FUSION GLYCOPROTEINS」之美國臨時專利申請案第63/291,323號及2022年9月21日提交之題為「MODIFIED PARAMYXOVIRIDAE FUSION GLYCOPROTEINS」之美國臨時專利申請案第63/408,821號的優先權，各臨時專利申請案出於所有目的以全文引用之方式併入本文中。
對電子序列表之引用
本申請案與電子格式之序列表一起提交。序列表以名為18615_2004541.XML之文件形式提供，創建於2022年12月14日，大小為786,990字節。序列表電子格式之資訊以全文引用之方式併入。
本文提供變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)。在一些實施例中，任何所提供之脂質粒子含有嵌入脂質雙層中之變異體病毒融合(F)蛋白分子或其生物活性部分。在一些實施例中，變異體F蛋白來自副黏液病毒、亨德拉(HeV)或尼帕(NiV)病毒，或為其生物活性部分或為其變異體或突變體。在特定實施例中，變異體F蛋白來自尼帕(NiV)病毒。天然地，融合(F)及附著醣蛋白(G)介導副黏液病毒(諸如尼帕病毒)進入細胞。在一些實施例中，如本文所提供之變異體F蛋白(諸如變異體NiV-F蛋白)與NiV-G蛋白之組合能夠介導所提供之脂質粒子(例如，慢病毒載體)進入細胞。
F蛋白，諸如尼帕病毒F蛋白，亦稱為NiV-F，為I類融合蛋白，該融合蛋白具有與許多家族之融合蛋白(例如，HIV-1 gp41或流感病毒血凝素[HA])共同之結構及功能特徵，諸如具有疏水融合肽及兩個七肽重複區之胞外域(White JM等人 2008. Crit Rev Biochem Mol Biol 43:189-219)。F蛋白作為非活性前驅體F
0合成，且藉由蛋白水解裂解成兩個二硫鍵連接之次單元F
1及F
2而活化(Moll M.等人 2004. J. Virol. 78(18): 9705-9712)。
G蛋白為亨尼帕病毒(例如，尼帕病毒或亨德拉病毒)之附著蛋白，其為含有N端細胞質尾、跨膜結構域、細胞外莖及球狀頭之II型跨膜醣蛋白(Liu, Q.等人 2015. Journal of Virology, 89(3):1838-1850)。附著蛋白NiV-G識別受體EphrinB2及EphrinB3。受體與NiV-G之結合會觸發一系列構形變化，最終引起NiV-F之觸發，此暴露NiV-F之融合肽，從而允許另一系列之構形變化，其引起病毒-細胞膜融合(Stone J.A.等人 2016. J Virol. 90(23): 10762-10773)。先前將EphrinB2鑑定為主要NiV受體(Negrete等人, 2005)，以及將ephrinB3鑑定為替代受體(Negrete等人, 2006)。野生型NiV-G對ephrinB2及B3具有高親和力，親和結合常數(Kd)在皮莫耳範圍內(Negrete等人, 2006) (分別對於細胞表面表現之ephrinB2及B3，Kd = 0.06 nM及0.58 nM)。
在所提供之實施例之態樣中，本文所提供之脂質粒子可經工程改造以表現變異體F蛋白分子或其生物活性部分；及NiV-G蛋白，其中該變異體F蛋白及該NiV-G蛋白兩者均嵌入脂質粒子之脂質雙層中。在一些實施例中，脂質粒子可為病毒樣粒子、病毒或病毒載體，諸如慢病毒載體。在一些實施例中，本文提供一種用變異體NiV-F蛋白(諸如任何所提供之變異體NiV-F蛋白)與G蛋白之組合假型化之慢病毒載體。
在一些實施例中，NiV-G蛋白可進一步連接至靶向部分，諸如抗原結合結構域，以促進脂質粒子特異性靶向靶分子以與所需靶細胞融合。在一些實施例中，結合結構域為結合至靶細胞上之細胞表面分子之任何結構域。在一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體(sdAb)。在一些實施例中，結合結構域為單鏈可變片段(scFv)。結合結構域可直接或間接連接至G蛋白。在特定實施例中，結合結構域連接至G蛋白或其生物活性部分之C端(C端胺基酸)。連接可經由肽連接子，諸如可撓性肽連接子。
因此，所提供之實施例包括如下實施例：其中NiV-G蛋白可重新靶向任何所需細胞類型以特異性靶向脂質粒子(例如，慢病毒載體)，且在一些情況下特異性遞送至其中所含之轉殖基因或異源蛋白之靶細胞。
在所提供之實施例中，脂質粒子含有封閉內腔或空腔之脂質雙層及含有經修飾細胞質尾結構域、莖結構域、頭結構域之變異體NiV-F蛋白，其中細胞質尾之至少一部分不為尼帕F醣蛋白之部分。
可藉由對NiV-F及NiV-G中之一或兩者中之突變進行工程改造來改良脂質粒子之轉導效率。先前已描述若干此類突變(參見例如Lee等人, 2011, Trends in Microbiology)。此可用於例如維持NiV-G對ephrinB2及/或B3之特異性及皮莫耳親和力。另外，已鑑定完全消除ephrinB2及B3結合，但不影響此NiV-G與NiV-F之締合的NiV-G中之突變(Aguilar等人,
J Biol Chem. 2009;284(3):1628-1635；Weise等人,
J Virol. 2010;84(15):7634-764；Negrete等人,
J Virol. 2007;81(19):10804-10814；Negrete等人,
PLoS Pathog. 2006；Guillaume等人,
J. Virol2006, 80 (15) 7546-7554)。在一些情況下，改良脂質粒子靶向之方法可藉由結合分子與G蛋白(例如，Niv-G，包括具有消除Ephrin B2及Ephrin B3結合之突變的Niv-G)之融合來達成。此允許改變G蛋白向性，從而允許經由添加針對不同細胞表面分子之結合分子來靶向並非ephrinB2+之其他所需細胞類型。因此，在所提供之態樣中，NiV-G蛋白可進一步含有減少或消除與Ephrin B2及/B3之結合的突變。在一些實施例中，突變可包括突變E501A、W504A、Q530A及E533A中之一或多者，參考SEQ ID NO:5所示之野生型NiV-G之編號。
含有變異體NiV-F之所提供之脂質粒子，諸如慢病毒載體，展現優於可用之包膜假型粒子之優勢。舉例而言，VSV-G為最常見之用於假型化之包膜醣蛋白，但其廣泛向性對於特異性靶細胞遞送通常並不理想或不可取，諸如基因療法或外源蛋白遞送所需要的。此外，儘管替代性包膜蛋白可能展現降低之向性或可能適合連接至結合結構域以重新定向靶向所需靶細胞，但含有此類包膜蛋白之慢病毒載體製劑之效價可能過低而無法進行有效轉導。因此，需要替代性方法。
本文發現，當在慢病毒載體上假型化時，某些變異體NiV-F蛋白提供展現高效價之慢病毒載體。此外，在所提供之態樣中，效價優於其他較短之NiV-F細胞質結構域截短，包括先前已鑑定為能夠提供具有高效價之慢病毒載體之彼等(Bender等人 2016, 12:e1005641)。舉例而言，儘管已發現NiV-F之某些細胞質截短會增加慢病毒製劑之效價，但本文之發現證明特定較長細胞質尾截短之優越性及/或作為嵌合NiV-F之某些變異體NiV-F之優選性，該嵌合NiV-F具有全部或部分由異源病毒或蛋白質之細胞質尾組成之細胞質尾。特別地，本文發現如本文所提供之某些變異體NiV-F蛋白引起慢病毒製劑之效價提高。最後，將變異體NiV-F蛋白與G蛋白(例如，NiV-G或其生物活性部分或變異體)組合會保留慢病毒載體之高融合活性，且在一些情況下亦將轉殖基因或其他外源劑遞送至靶細胞。
亦提供脂質粒子，諸如靶向脂質粒子，其另外含有一或多種外源劑，諸如用於將診斷劑或治療劑遞送至細胞，包括在向個體活體內投與之後。本文亦提供靶向脂質粒子之方法及用途，諸如在診斷及治療方法中。亦提供多核苷酸，用於工程改造、製備及產生靶向脂質非細胞粒子之方法，含有粒子之組合物，以及含有粒子及用於使用、產生及投與粒子之套組及裝置。
本申請案中提及之所有出版物，包括專利文獻、科學文章及數據庫，出於所有目的以全文引用之方式併入，程度如同各個別出版物個別地以引用之方式併入一般。若本文所闡述之定義與以引用之方式併入本文中之專利、申請案、公開申請案及其他出版物中闡述之定義相反或其他方面不一致，則本文所闡述之定義優先於以引用之方式併入本文中之定義。
本文所用之章節標題僅用於組織目的且不應解釋為限制所述主題。
I. 定義
除非另有定義，否則本文所用之所有技術術語、記法以及其他技術及科學術語或專門名詞意欲具有與一般熟習所主張之主題所屬技術者通常理解之含義相同的含義。在一些情況下，為清楚起見及/或便於參考，本文中定義具有通常所理解之含義的術語，且本文中包括此類定義不一定解釋為表示與此項技術中一般理解之內容存在實質性差異。
除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語、字首語及縮寫皆具有與一般熟習本發明所屬技術者通常所理解之含義相同的含義。除非另有指示，否則化學及生物化學名稱之縮寫及符號係按照IUPAC-IUB命名法。除非另有指示，否則所有數值範圍包括界定該範圍之值以及其間之所有整數值。
如本文所用，冠詞「一個」及「一種」係指冠詞之語法對象中之一者或多於一者(亦即，至少一者)。舉例而言，「一個要素」意指一個要素或多於一個要素。
如本文所用，術語「約」將由一般熟習此項技術者所理解且將在一定程度上視其所用之情形而變化。如本文所用，當提及諸如量、持續時間等可量測值時，「約」意欲涵蓋指定值±20%或±10%之變化，更佳為±5%，甚至更佳為±1%，且甚至更佳為±0.1%，此係因為此類變化適於執行所揭示之方法。
如本文所用，「脂質粒子」係指含有封閉內腔或空腔之兩親性脂質雙層之任何生物或合成粒子。典型地，脂質粒子不含核。此類脂質粒子包括但不限於病毒粒子(例如，慢病毒粒子)、病毒樣粒子、病毒載體(例如，慢病毒載體)外泌體、無核細胞、各種囊泡(諸如微囊泡、膜囊泡、細胞外膜囊泡、質膜囊泡、巨大質膜囊泡)、凋亡體、有絲分裂粒子、核紅細胞(pyrenocyte)或溶酶體。在一些實施例中，脂質粒子可為融合體。在一些實施例中，脂質粒子不為血小板。在一些實施例中，融合體來源於源細胞。脂質粒子亦可包括外源劑或編碼外源劑之核酸，其可存在於脂質粒子之內腔中。
術語「病毒載體粒子」及「病毒載體」在本文中可互換使用，且係指用於將外源劑(例如，非病毒或外源核酸)轉移至受體細胞或靶細胞中且除至少一種非結構病毒基因體組分或其功能片段(亦即，聚合酶、整合酶、蛋白酶或其他非結構組分)以外亦含有一或多種病毒結構蛋白的載體。因此，病毒載體含有待轉移至細胞中之外源劑，諸如包括非病毒編碼序列之異源核酸。病毒載體之實例為反轉錄病毒載體，諸如慢病毒載體。
術語「反轉錄病毒載體」係指含有反轉錄病毒核酸或來源於反轉錄病毒之病毒載體。反轉錄病毒載體粒子包括以下組分：載體基因體(反轉錄病毒核酸)、包裹核酸之核衣殼及包圍核衣殼之膜包膜。典型地，反轉錄病毒載體含有足以允許在包裝組分存在下將RNA基因體包裝至能夠感染靶細胞之病毒粒子中的反轉錄病毒遺傳資訊。靶細胞之感染可包括反轉錄及整合至靶細胞基因體中。反轉錄病毒載體可為重組反轉錄病毒載體，其為復制缺陷的且缺乏複製所必需之基因，諸如功能性gag-pol及/或env基因及/或複製所必需之其他基因。反轉錄病毒載體亦可為自失活(SIN)載體。
如本文所用，「慢病毒載體」或LV係指含有慢病毒核酸或來源於慢病毒之病毒載體。慢病毒載體粒子包括以下組分：載體基因體(慢病毒核酸)、包裹核酸之核衣殼及包圍核衣殼之膜。典型地，慢病毒載體含有足以允許在包裝組分存在下將RNA基因體包裝至能夠感染靶細胞之病毒粒子中的慢病毒遺傳資訊。靶細胞之感染可包括反轉錄及整合至靶細胞基因體中。慢病毒載體可為重組慢病毒載體，其為復制缺陷的且缺乏複製所必需之基因，諸如功能性gag-pol及/或env基因及/或複製所必需之其他基因。慢病毒載體亦可為自失活(SIN)載體。
如本文所用，「反轉錄病毒核酸」係指含有單獨或與輔助細胞、輔助病毒或輔助質體組合包裝至反轉錄病毒載體中之至少最低序列要求的核酸。在「慢病毒核酸」之情況下，核酸係指單獨或與輔助細胞、輔助病毒或輔助質體組合包裝至慢病毒載體中之至少最低序列要求。在一些實施例中，病毒核酸包含5' LTR (例如，促進整合)、U3 (例如，活化病毒基因體RNA轉錄)、R (例如，Tat結合區)、U5、3' LTR (例如，促進整合)、包裝位點(例如，psi (Ψ))、RRE (例如，結合至Rev且促進核輸出)中之一或多者(例如，全部)。病毒核酸可包含RNA (例如，當為病毒體之一部分時)或DNA (例如，當引入源細胞中時或在受體細胞中反轉錄後)。在一些實施例中，使用包含gag、pol及env中之一或多者(例如，全部)的輔助細胞、輔助病毒或輔助質體包裝病毒核酸。
如本文所用，「融合體」係指含有封閉內腔或空腔之兩親性脂質雙層及與兩親性脂質雙層相互作用之融合原的脂質粒子。在一些實施例中，融合體為膜封閉製劑。在一些實施例中，融合體來源於源細胞。融合體亦可包括外源劑或編碼外源劑之核酸，其可存在於融合體之內腔中。
如本文所用，「融合體組合物」係指包含一或多種融合體之組合物。
如本文所用，「融合原」係指在兩個膜封閉內腔之間建立相互作用之劑或分子。在實施例中，融合原促進膜融合。在其他實施例中，融合原在兩個內腔(例如，反轉錄病毒載體之內腔與靶細胞之細胞質)之間建立連接，例如，孔。在一些實施例中，融合原包含兩種或更多種蛋白質之複合物，例如，其中無一蛋白質單獨具有融合活性。在一些實施例中，融合原包含靶向結構域。融合原之實例包括副黏液病毒F及G蛋白，諸如來自尼帕病毒(NiV)之彼等及其生物活性部分或變異體，包括所述任一者。
如本文所用，「重新靶向之融合原」，諸如重新靶向之G蛋白，係指包含靶向部分之融合原，該融合原之序列不為天然存在之融合原形式之一部分，其中該靶向部分靶向或結合所需細胞類型上之分子。在實施例中，融合原包含與天然存在之融合原形式中之靶向部分不同的靶向部分。在實施例中，天然存在之融合原形式缺乏靶向結構域，且重新靶向之融合原包含天然存在之融合原形式中不存在之靶向部分。在實施例中，融合原經修飾以包含靶向部分。在一些此類實施例中，靶向部分附接至融合原(例如，G蛋白)可為直接的或間接地經由連接子，諸如肽連接子。在實施例中，融合原包含相對於天然存在之融合原形式在靶向部分之外部，例如在跨膜結構域、融合活性結構域或細胞質結構域中之一或多個序列改變。
如本文所用，「靶細胞」係指希望靶向脂質粒子向其遞送外源劑之類型的細胞。在實施例中，靶細胞為特定組織類型或類別之細胞，例如免疫效應細胞，例如T細胞。在一些實施例中，靶細胞為患病細胞，例如，癌細胞。在一些實施例中，融合原，例如重新靶向之融合原，促使外源劑與非靶細胞相比優先遞送至靶細胞。
如本文所用，「非靶細胞」係指不希望靶向脂質粒子向其遞送外源劑之類型的細胞。在一些實施例中，非靶細胞為特定組織類型或類別之細胞。在一些實施例中，非靶細胞為非患病細胞，例如，非癌細胞。在一些實施例中，融合原，例如重新靶向之融合原，促使外源劑與靶細胞相比較少遞送至非靶細胞。
如本文所用，「生物活性部分」，諸如關於諸如G蛋白或F蛋白之蛋白質，係指展現或保留蛋白質全長之活性或特性之一部分蛋白質。舉例而言，當F蛋白之生物活性部分及G蛋白各自嵌入脂質雙層中時，該兩者聯合保留融合活性。當G蛋白之生物活性部分及F蛋白各自嵌入脂質雙層中時，該兩者聯合保留融合活性。保留之活性可包括全長或野生型F蛋白或G蛋白之活性的10%-150%或更高。F及G蛋白之生物活性部分之實例包括具有細胞質結構域截短之蛋白質，諸如所述具有經截短細胞質尾之變異體NiV-F中之任一者。
如本文所用，關於肽、多肽或抗體序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」及「同源性」定義為在比對序列及必要時引入空位以達成最大序列一致性百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分之後，候選序列中與特定肽或多肽序列中之胺基酸殘基相同之胺基酸殘基的百分比。可依此項技術中之技能範圍內之各種方式達成用於確定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對，例如，使用公開可用之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或MEGALIGN (DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於量測比對之適當參數，包括在所比較之序列全長上達成最大比對所需之任何演算法。
胺基酸取代可包括但不限於用另一胺基酸置換多肽中之一個胺基酸。示例性取代示於表1中。可將胺基酸取代引入所關注之抗體中且針對所需活性篩選產物，例如，保留/改良之結合。
表 1
| 原始殘基 | 示例性取代 |
| Ala (A) | Val；Leu；Ile |
| Arg (R) | Lys；Gln；Asn |
| Asn (N) | Gln；His；Asp；Lys；Arg |
| Asp (D) | Glu；Asn |
| Cys (C) | Ser；Ala |
| Gln (Q) | Asn；Glu |
| Glu (E) | Asp；Gln |
| Gly (G) | Ala |
| His (H) | Asn；Gln；Lys；Arg |
| Ile (I) | Leu；Val；Met；Ala；Phe；正白胺酸 |
| Leu (L) | 正白胺酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe |
| Lys (K) | Arg；Gln；Asn |
| Met (M) | Leu；Phe；Ile |
| Phe (F) | Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr |
| Pro (P) | Ala |
| Ser (S) | Thr |
| Thr (T) | Val；Ser |
| Trp (W) | Tyr；Phe |
| Tyr (Y) | Trp；Phe；Thr；Ser |
| Val (V) | Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正白胺酸 |
可根據共同側鏈特性對胺基酸進行分組：
(1) 疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2) 中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3) 酸性：Asp、Glu；
(4) 鹼性：His、Lys、Arg；
(5) 影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；
(6) 芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別中之一類之成員換成另一類。
關於蛋白質位置之術語「對應於」，諸如核苷酸或胺基酸位置「對應於」所揭示之序列(諸如序列表中所列)中之核苷酸或胺基酸位置的敘述，係指基於結構序列比對或使用標準比對演算法(諸如GAP演算法)與所揭示之序列比對後鑑定之核苷酸或胺基酸位置。舉例而言，相似序列(例如，片段或種類變異體)之相應殘基可藉由結構比對方法與參考序列比對來確定。藉由比對序列，熟習此項技術者可鑑定相應殘基，例如，使用保守及相同之胺基酸殘基作為向導。
如本文所用，術語「經分離」係指已與典型地在自然界中發現或產生之至少一些組分分離之分子。舉例而言，當多肽與產生其之細胞之至少一些組分分離時，該多肽稱作「經分離」。在多肽在表現後由細胞分泌之情況下，將含有多肽之上清液與產生其之細胞物理分離應視為「分離」多肽。類似地，當多核苷酸不為典型地在自然界中發現之較大多核苷酸(例如，在DNA多核苷酸之情況下為基因體DNA或粒線體DNA)之一部分，或者與產生其之細胞之至少一些組分分離(例如，在RNA多核苷酸之情況下)時，多核苷酸稱作「經分離」。因此，宿主細胞內之載體中所含之DNA多核苷酸可稱作「經分離」。
如本文所用，術語「有效量」意指足以顯著及正向改變待治療之症狀及/或疾患(例如，提供正向臨床反應)之醫藥組合物的量。用於醫藥組合物中之活性成分之有效量將隨所治療之特定疾患、疾患之嚴重程度、治療之持續時間、並行療法之性質、所採用之特定活性成分、所利用之特定醫藥學上可接受之賦形劑及/或載體，以及主治醫師之知識及專業技能下之類似因素而變化。
如本文所用，關於脂質粒子(諸如病毒載體)之「外源劑」係指既不包含於相應野生型病毒或由相應野生型源細胞製成之融合體中亦不由其編碼之劑。在一些實施例中，外源劑並不天然存在，諸如具有相對於天然存在之蛋白質發生改變(例如，藉由插入、缺失或取代)之序列的蛋白質或核酸。在一些實施例中，外源劑並不天然存在於源細胞中。在一些實施例中，外源劑天然存在於源細胞中，但對病毒而言為外源的。在一些實施例中，外源劑並不天然存在於受體細胞中。在一些實施例中，外源劑天然存在於受體細胞中，但不以所需水準或在所需時間存在。在一些實施例中，外源劑包含RNA或蛋白質。
如本文所用，「啟動子」係指順式調控DNA序列，當其可操作地連接至基因編碼序列時，驅動基因轉錄。啟動子可包含轉錄因子結合位點。在一些實施例中，啟動子與一或多個遠離基因之增強子協同工作。
如本文所用，組合物係指兩種或更多種產物、物質或化合物之任何混合物，包括細胞。組合物可為溶液、懸浮液、液體、粉末、糊劑、水性的、非水性的或其任何組合。
如本文所用，術語「醫藥學上可接受」係指不消除化合物之生物活性或特性，且相對無毒之材料，諸如載劑或稀釋劑，亦即，該材料可向個體投與，而不會引起不合需要之生物作用或以有害方式與含有其之組合物之任何組分相互作用。
如本文所用，術語「醫藥組合物」係指至少一種本發明化合物與其他化學組分之混合物，該等化學組分諸如載劑、穩定劑、稀釋劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑及/或賦形劑。醫藥組合物有助於向生物體投與化合物。此項技術中存在多種投與化合物之技術，包括但不限於靜脈內、經口、氣霧劑、非經腸、經眼、經肺及局部投與。
如本文所用，「疾病」或「病症」係指需要及/或希望治療之疾患。
如本文所用，術語「治療(treat)」、「治療(treating)」或「治療(treatment)」係指改善疾病或病症，例如，減緩或阻止或減少疾病或病症之發展或減少其至少一種臨床症狀。出於本揭示案之目的，改善疾病或病症可包括獲得有益或所需之臨床結果，包括但不限於以下任一者或多者：減輕一或多種症狀、減小疾病程度、預防或延緩疾病擴散(例如轉移，例如轉移至肺或淋巴結)、預防或延緩疾病復發、延緩或減緩疾病進展、改善疾病狀態、抑制疾病或疾病進展、抑制或減緩疾病或其進展、阻止其發展、及緩解(無論為部分的抑或完全的)。
術語「個人」及「個體」在本文中可互換使用以指代動物；例如，哺乳動物。術語患者包括人類及獸醫學個體。在一些實施例中，提供治療哺乳動物之方法，該等哺乳動物包括但不限於人、囓齒動物、猿猴、貓、犬、馬、牛、豬、綿羊、山羊、哺乳動物實驗室動物、哺乳動物農場動物、哺乳動物運動動物及哺乳動物寵物。個體可為男性或女性，且可為任何適合之年齡，包括嬰兒、幼年、青少年、成年及老年個體。在一些實例中，「個人」或「個體」係指需要治療疾病或病症之個人或個體。在一些實施例中，接受治療之個體可為患者，指定已將個體鑑定為患有與治療相關之病症或處於患上病症之足夠風險下的事實。在特定實施例中，個體為人類，諸如人類患者。
II. 變異體尼帕 F 醣蛋白
本文提供變異體尼帕病毒融合(NiV-F)蛋白，及含有其之脂質粒子(例如，慢病毒載體)。在一些實施例中，與SEQ ID NO:1所示之野生型NiV-F或其缺乏信號肽(亦即，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基1-26)之成熟形式相比，藉由胺基酸殘基之胺基酸置換(取代)、插入或缺失中之一或多者對Niv-F蛋白進行修飾。在一些實施例中，變異體NiV-F蛋白含有來自另一病毒，諸如另一副黏液病毒之連續胺基酸殘基之交換。在一些實施例中，細胞質尾、跨膜結構域及/或胞外域經修飾(例如，藉由胺基酸之一或多個胺基酸取代、插入或缺失)。在一些實施例中，胞外域經修飾以改變(例如，改良)蛋白酶裂解及/或增加融合性。
本文亦提供用任何所提供之變異體NiV-F蛋白假型化之病毒粒子或病毒樣粒子，諸如慢病毒粒子或慢病毒樣粒子。本文亦提供編碼變異體NiV-F蛋白之多核苷酸，在一些態樣中，其可與產生脂質粒子(例如，慢病毒粒子)之方法相結合使用，該脂質粒子含有嵌入其脂質雙層中之所述變異體NiV-F。在一些實施例中，變異體NiV-F暴露於脂質雙層之表面上，諸如暴露於慢病毒粒子之表面上。在一些實施例中，任何所提供之脂質粒子(例如，慢病毒載體)亦可含有G蛋白，諸如NiV-G蛋白，諸如全長NiV-G蛋白或其生物活性部分或其變異體。舉例而言，本文亦提供用任何所提供之變異體NiV-F蛋白及NiV-G蛋白，諸如全長NiV-G蛋白或其生物活性部分或變異體假型化之病毒粒子或病毒樣粒子，諸如慢病毒粒子或慢病毒樣粒子。示例性NiV-G蛋白在章節III中進一步描述。
在一些實施例中，變異體NiV-F蛋白安置於脂質雙層中。在一些實施例中，膜為漿細胞膜。在一些實施例中，脂質粒子為反轉錄病毒載體，諸如慢病毒載體。在一些實施例中，病毒載體，諸如反轉錄病毒載體(例如，慢病毒載體)用變異體NiV-F蛋白假型化。
在一些實施例中，變異體NiV-F蛋白展現融合活性。在一些實施例中，變異體NiV-F促進脂質粒子(例如，慢病毒載體)與膜之融合。亨尼帕病毒之F蛋白，包括本文所提供之NiV-F及變異體NiV-F蛋白，經編碼為含有信號肽(例如，對於原生NiV-F，信號肽對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基1-26)之F0前驅體。信號肽裂解後，將成熟F0 (例如，缺乏信號肽之SEQ ID NO:1)轉運至細胞表面，接著內吞且由組織蛋白酶L裂解(例如，在對應於SEQ ID NO:1之胺基酸109-110之間的胺基酸之胺基酸之間)成成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸110-546)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基27-109)。F1及F2次單元由二硫鍵締合且再循環返回至細胞表面。F1次單元含有位於F1次單元之N端處之融合肽結構域(例如，對於原生NiV-F，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸110-129)，在此處該融合肽結構域能夠插入細胞膜中以驅動融合。在特定情況下，藉由F蛋白與G蛋白(例如，本文所提供之NiV-G)之締合來阻斷融合活性，直至G與靶分子嚙合，從而使其與F解離並暴露融合肽以介導膜融合。對於野生型NiV-F，F蛋白具有SEQ ID NO:364所示之序列。在一些實例中，野生型F蛋白裂解成包含SEQ ID NO:366所示之序列的F1次單元及包含SEQ ID NO: 365所示之序列的F2次單元。在一些實施例中，所提供之脂質粒子之變異體NiV-F包括F0前驅體或其含有F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式，諸如在裂解位點處蛋白水解裂解(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸109-110之間的胺基酸之胺基酸之間)後產生可由二硫鍵連接之兩條鏈。
在一些實施例中，變異體NiV-F蛋白為變異體F
0前驅體或為其含有由二硫鍵連接之F1及F2次單元之蛋白水解裂解型式。因此，應理解，本文提及變異體NiV-F之特定序列(SEQ ID NO)典型地係指F
0前驅體序列，而且應理解為包括蛋白水解裂解形式或其含有兩條裂解鏈F1及F2之序列。在一些實施例中，變異體NiV-F含有組織蛋白酶L裂解位點(例如，VGDVR (SEQ ID NO:339)，諸如NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311))且蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。在一些實施例中，組織蛋白酶L裂解產物包括藉由在精胺酸或離胺酸殘基之後，諸如在對應於參考SEQ ID NO:1之NiV-F蛋白之位置109處裂解而發生之裂解所形成的兩條鏈(F1及F2)。在一些實施例中，變異體NiV-F含有如本文所述之經修飾裂解序列，諸如經修飾弗林蛋白酶裂解序列，且蛋白水解裂解形式為弗林蛋白酶裂解產物。編碼核酸亦可編碼具有序列MVVILDKRCY CNLLILILMI SECSVG (例如，SEQ ID NO:3)之信號肽序列。
在一些實施例中，本文所提供之變異體NiV-F蛋白保留由組織蛋白酶L裂解之裂解位點(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸109-110之間的裂解位點)。在一些實施例中，本文所提供之變異體NiV-F蛋白在原生組織蛋白酶L裂解位點(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸109-110之間的裂解位點)處或附近經修飾以改良NiV-F之裂解及其在脂質粒子表面上之表現。
在一些實施例中，本文所提供之變異體NiV-F蛋白包含F1次單元或其融合部分。在一些實施例中，F1次單元為F0前驅體之蛋白水解裂解部分。在一些實施例中，F0前驅體為非活性的。在一些實施例中，F0前驅體之裂解形成二硫鍵連接之F1+F2異二聚體。在一些實施例中，裂解暴露融合肽且產生成熟F蛋白。在一些實施例中，裂解在單個鹼性殘基處或周圍發生。在一些實施例中，裂解在對應於NiV-F蛋白之位置109之精胺酸或離胺酸殘基處發生，參考SEQ ID NO:1 (亦參見SEQ ID NO: 311所示之NiV-F裂解位點序列)。在一些實施例中，本文所提供之變異體NiV-F蛋白含有暴露於脂質雙層外部之N端疏水融合肽結構域。
在一些實施例中，脂質粒子進一步含有來自副黏液病毒之G蛋白，諸如尼帕醣蛋白(NiV-G)以促進變異體NiV-F蛋白之融合活性。示例性G蛋白在以下章節III.B中描述。在一些實施例中，變異體NiV-F蛋白及G蛋白(例如，NiV-G或其變異體或生物活性部分)均安置於脂質雙層中。已報導來自各種種類之亨尼帕病毒F蛋白展現與來自其他種類之G蛋白之相容性以觸發融合(Brandel-Tretheway等人 Journal of Virology. 2019. 93(13):e00577-19)。在所提供之脂質粒子(例如，慢病毒載體)之一些態樣中，F蛋白與G蛋白異源，亦即，F及G蛋白或生物活性部分來自不同亨尼帕病毒種類。舉例而言，G蛋白來自亨德拉病毒且變異體F蛋白為所述變異體NiV-F。在其他態樣中，F蛋白可為含有來自不同種類之亨尼帕病毒之F蛋白區域的嵌合F蛋白。在一些實施例中，將F蛋白之胺基酸殘基區域自一個種類之亨尼帕病毒切換至另一個種類可促使與包含胺基酸插入之種類之G蛋白融合。(Brandel-Tretheway等人 2019)。在一些情況下，嵌合F蛋白含有來自一種亨尼帕病毒種類之細胞外結構域及來自不同亨尼帕病毒種類之跨膜及/或細胞質結構域。舉例而言，F蛋白含有亨德拉病毒之細胞外結構域及尼帕病毒之跨膜/細胞質結構域。
在本文所提供之描述之態樣中，F蛋白序列可在本文中揭示為包括N端信號序列之表現序列。應理解，由於此類N端信號序列通常以共轉譯方式或轉譯後裂解，因此亦預期本文所揭示之所有F蛋白序列之成熟蛋白質序列缺乏N端信號序列。
在一些實施例中，與參考脂質粒子製劑(例如，參考慢病毒載體)進入相同靶細胞之效價相比，脂質粒子在諸如藉由轉導引入靶細胞(例如，轉導之細胞)後之效價增加。在一些實施例中，參考脂質粒子(例如，參考慢病毒載體)為類似製劑，不同之處在於脂質粒子摻有全長原生NiV-F野生型序列(例如，SEQ ID NO:1所示)。在一些實施例中，參考脂質粒子(例如，參考慢病毒載體)為類似製劑，不同之處在於脂質粒子摻有與全長NiV-F相比具有22個N端胺基酸之細胞質尾截短的經截短NiV-F，諸如SEQ ID NO: 302所示之經截短NiV-F或其缺乏SEQ ID NO:303所示之信號肽的成熟形式。在一些實施例中，參考脂質粒子(例如，參考慢病毒載體)及所提供之脂質粒子亦摻有相同NiV-G蛋白(例如，章節III中所述之任一者)。在一些實施例中，NiV-G為全長原生NiV-G野生型序列(例如，SEQ ID NO:304所示)。在一些實施例中，NiV-G為含有胺基酸取代E501 A、W504A、Q530A及/或E533A以減少與Ephrin B2及B3之結合的全長NiV-G序列(例如SEQ ID NO:305所示)。在一些實施例中，NiV-G為具有34個C端胺基酸殘基之細胞質尾截短的經截短NiV-G且與全長NiV-G相比含有胺基酸取代E501 A、W504A、Q530A、E533A，諸如SEQ ID NO:301所示之經截短NiV-G。在一些實施例中，與參考脂質粒子(例如，參考慢病毒載體)之效價相比，效價與參考慢病毒粒子製劑相比增加等於或大於5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%、125%、150%、200%、300%、400%、500%或更多。在一些實例中，與參考脂質粒子(例如，參考慢病毒載體)之效價相比，效價增加等於或大於1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、30倍或更多倍。在一些實施例中，靶細胞(例如，轉導之細胞)中脂質粒子之效價大於1 x 10
6個轉導單位(TU)/mL或約1 x 10
6TU/mL。舉例而言，靶細胞(例如，轉導之細胞)中脂質粒子之效價大於2 x 10
6TU/mL或約2 x 10
6TU/mL、大於3 x 10
6TU/mL或約3 x 10
6TU/mL、大於4 x 10
6TU/mL或約4 x 10
6TU/mL、大於5 x 10
6TU/mL或約5 x 10
6TU/mL、大於6 x 10
6TU/mL或約6 x 10
6TU/mL、大於7 x 10
6TU/mL或約7 x 10
6TU/mL、大於8 x 10
6TU/mL或約8 x 10
6TU/mL、大於9 x 10
6TU/mL或約9 x 10
6TU/mL、或大於1 x 10
7TU/mL或約1 x 10
7TU/mL。
可採用任何用於評估或定量效價之技術。用於定量效價之可用技術之非限制性實例包括病毒粒子數確定及藉由空斑檢定測得之效價。舉例而言，可藉由量測A260處之吸光度來確定基於病毒之粒子之數目。類似地，亦可藉由使用單株抗體之粒子特異性蛋白質之定量免疫螢光或藉由空斑檢定來確定感染單位(亦即，基於病毒之粒子)之效價。在一些實施例中，計算效價之方法包括空斑檢定，其中使基於病毒之粒子之滴定物在細胞單層上生長且在數天至數週後對空斑之數目進行計數。在一些實施例中，可使用終點稀釋(TCID
50)方法來確定效價，該方法確定感染/轉導50%之細胞培養物時的病毒稀釋度，且因此一般可確定一定範圍(諸如一個對數)內之效價。
以下小節提供本文所提供之示例性變異體NiV-F蛋白之描述。
A. 變異體 NiV-F 細胞質尾
在一些實施例中，變異體NiV-F包含經修飾NiV-F細胞質尾，其中含有經截短NiV-F細胞質尾、一或多個調控Niv-F內吞運輸及暴露於組織蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)之修飾，或NiV-F之全部或一部分細胞質尾與以下之交換：(i)來自相關副黏液病毒F蛋白之細胞質尾或其經截短部分，(ii)來自相關G/H蛋白之細胞質尾或其經截短部分，(iii)來自其他病毒融合原之細胞質尾，或(iv)來自HIV-1包膜(gp41)或其他反轉錄病毒相關細胞蛋白之細胞質尾。在一些實施例中，本文所述之變異體NiV-F之細胞質尾中之任何所提供之修飾可與如本文所述之胞外域、跨膜結構域或信號序列之修飾組合。
1. 經截短尼帕 F 蛋白細胞質尾
在一些實施例中，變異體NiV-F包含經修飾細胞質尾，其與全長NiV-F相比包含經截短細胞質尾。舉例而言，與SEQ ID NO:1所示之野生型NiV-F之原生細胞質尾(其中原生細胞質尾如SEQ ID NO:1之胺基酸519-546所示)相比，本文之變異體NiV-F蛋白在其細胞質尾中經截短。在一些實施例中，經修飾細胞質尾為經截短NiV-F細胞質尾，其在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F細胞質尾之C端處或附近具有一個胺基酸或多於一個連續胺基酸殘基之缺失。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有經修飾細胞質尾，其中至少一部分原生細胞質尾(例如，SEQ ID NO:1之胺基酸519-546，如SEQ ID NO:4所示)為經截短的。在一些實施例中，細胞質尾為長度為至少1個胺基酸之其經截短部分。在一些實施例中，細胞質尾為長度為至少5個胺基酸之其經截短部分。在一些實施例中，其經截短部分之長度為1-5個或約1-5個、5-20個或約5-20個、5-10個或約5-10個、1-15個或約1-15個、1-10個或約1-10個、1-20個或約1-20個、1-25個或約1-25個、1-26個或約1-26個、1-27個或約1-27個胺基酸。在一些實施例中，其經截短部分之長度為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個胺基酸。在一些實施例中，變異體NiV-F為由經修飾細胞質尾(經截短細胞質尾)序列組成之序列，該細胞質尾序列直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列(下文亦稱為NiV-F骨架ΔCT，含有野生型NiV-G之胞外域及跨膜結構域)之C端。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有呈經截短NiV細胞質尾之細胞質尾。在一些實施例中，經截短NiV細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型NiV-F細胞質尾之C端處或附近具有至多28個、至多27個、至多26個、至多25個、至多24個、至多23個、至多22個、至多21個、至多20個、至多19個、至多18個、至多17個、至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多 8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，變異體NiV-F由其中經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端的序列組成。在一些實施例中，細胞質尾為SEQ ID NO: 5-31中之任一者所示之經截短尼帕病毒細胞質尾。在一些實施例中，變異體NiV-F由其中SEQ ID NO: 5-31中之任一者所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端的序列組成。
在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 5-31中之任一者所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，經修飾細胞質尾為經截短NiV-F細胞質尾，其在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短部分在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23、24、25、26或27個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經修飾細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23個或約23個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經修飾細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有24個或約24個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經修飾細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有25個或約25個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經修飾細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有26個或約26個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經修飾細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有27個或約27個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。
在一些實施例中，變異體NiV-F細胞質尾具有缺失，該缺失不為在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近27個或約27個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，變異體NiV-F細胞質尾具有缺失，該缺失不為在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近25個或約25個胺基酸殘基之缺失。變異體NiV-F細胞質尾具有缺失，該缺失不為在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近22個或約22個胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，變異體NiV-F細胞質尾具有缺失，該缺失不為在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近18個或約18個胺基酸殘基之缺失。變異體NiV-F細胞質尾具有缺失，該缺失不為在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近15個或約15個胺基酸殘基之缺失。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有1個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:5所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:5所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:5所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有2個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:6所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:6所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:6所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有3個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:7所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:7所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:7所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有4個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:8所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:8所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:8所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有5個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:9所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:9所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:9所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有6個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:10所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:10所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:10所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有7個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:11所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:11所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:11所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有8個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:12所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:12所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:12所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有9個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:13所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:13所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:13所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有10個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:14所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:14所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:14所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有11個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:15所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:15所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:15所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有12個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:16所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:16所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:16所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有13個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:17所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:17所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:17所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有14個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:18所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:18所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:18所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有15個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:19所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:19所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:19所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有16個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:20所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:20所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:20所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有17個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:21所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:21所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:21所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有18個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:22所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:22所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:22所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有19個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:23所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:23所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:23所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有20個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:24所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:24所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:24所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有21個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:25所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:25所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:25所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有22個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:26所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:26所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:26所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:27所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:27所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:27所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有24個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:28所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:28所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:28所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有25個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:29所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:29所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:29所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有26個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:30所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:30所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:30所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有27個胺基酸之細胞質尾缺失。在一些實施例中，經截短NiV-F細胞質尾如SEQ ID NO:31所示。在一些實施例中，SEQ ID NO:31所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:31所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:27所示之細胞質尾。在一些實施例中，其經截短部分直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:27所示之經截短細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經截短F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:306展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 306所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元如SEQ ID NO:306之胺基酸84-497所示，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:306之胺基酸1-83所示。
在一些實施例中，含有經截短細胞質尾之變異體NiV-F可進一步含有本文所述之一或多個修飾(例如，胺基酸取代/置換、插入或缺失)。在一些實施例中，含有經截短細胞質尾之變異體NiV-F可進一步含有如本文所述之胞外域、跨膜結構域或信號序列中之任何所提供之修飾。
2. 經修飾尼帕 F 蛋白內吞模體
在一些實施例中，變異體NiV-F包含經修飾細胞質尾，其包含來自相同尼帕病毒之醣蛋白之突變細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有經修飾細胞質尾，其中至少一部分原生細胞質尾(例如，SEQ ID 3)為其來自尼帕病毒之醣蛋白之突變部分。在一些實施例中，細胞質尾為長度為至少6個胺基酸之其突變部分。在一些實施例中，其突變部分之長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸。在一些實施例中，其突變部分直接連接至SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示之序列之C端。
在一些實施例中，細胞質尾為SEQ ID NO: 35-51中之任一者所示之突變尼帕病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 35-51中之任一者所示之細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有突變細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 35-51中之任一者所示之突變細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，含有突變細胞質尾之變異體NiV-F可進一步含有本文所述之一或多個修飾(例如，胺基酸取代/置換、插入或缺失)。在一些實施例中，含有突變細胞質尾之變異體NiV-F可進一步含有如本文所述之胞外域、跨膜結構域或信號序列中之任何所提供之修飾。
3. 嵌合尼帕 F 蛋白細胞質尾
在一些實施例中，變異體NiV-F包含經修飾細胞質尾，其包含來自另一病毒之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，另一病毒為正核糖核酸病毒界之成員。在一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒科、彈狀病毒科、沙粒病毒科或反轉錄病毒科之成員。在一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒科之成員。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有經修飾細胞質尾，其中至少一部分原生細胞質尾(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸519-546；如SEQ ID NO. 4所示)由來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分置換。在一些實施例中，置換之細胞質尾為長度為至少5個胺基酸之異源細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，置換之異源細胞質尾或其經截短部分之長度為5-180个或约5-180個胺基酸，諸如長度為5-150個或約5-150個、5-100個或約5-100個、5-75個或約5-75個、5-50個或約5-50個、5-40個或約5-40個、5-30個或約5-30個、5-20個或約5-20個、5-10個或約5-10個、10-150個或約10-150個、10-100個或約10-100個、10-75個或約10-75個、10-50個或約10-50個、10-40個或約10-40個、10-30個或約10-30個、10-20個或約10-20個、20-150個或約20-150個、20-100個或約20-100個、20-75個或約20-75個、20-50個或約20-50個、20-40個或約20-40個、20-30個或約20-30個、30-150個或約30-150個、30-100個或約30-100個、30-75個或約30-75個、30-50個或約30-50個、30-40個或約30-40個、40-150個或約40-150個、40-100個或約40-100個、40-75個或約40-75個、40-50個或約40-50個、50-150個或約50-150個、50-100個或約50-100個、50-75個或約50-75個、75-150個或約75-150個、75-100個或約75-100個、或100-150個或約100-150個胺基酸。在一些實施例中，置換之異源細胞質尾或其經截短部分之長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40個胺基酸。
在一些實施例中，異源細胞質尾或其經截短部分直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。
在一些實施例中，異源細胞質尾為來自另一病毒，諸如副黏液病毒、反轉錄病毒、絲狀病毒、彈狀病毒或沙粒病毒之醣蛋白之細胞質尾或其經截短部分。
在一些實施例中，病毒為除尼帕病毒以外之副黏液病毒。舉例而言，病毒為麻疹病毒、蝙蝠副黏液病毒、雪松病毒、犬瘟熱病毒、仙台病毒、亨德拉病毒、人類副流感病毒或新城疫病毒。在一些實施例中，置換之異源細胞質尾為另一病毒之原生細胞質尾或原生細胞質尾之經截短部分。在一些實施例中，置換之異源尾如SEQ ID NO: 58-169中之任一者所示。在一些實施例中，SEQ ID NO: 58-169中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 58-169中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，病毒為反轉錄病毒。舉例而言，病毒可為狒狒包膜病毒(BaEV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、鼠類白血病病毒或人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)。在一些實施例中，病毒為絲狀病毒。舉例而言，病毒可為伊波拉病毒(EboV)。在一些實施例中，病毒為彈狀病毒。舉例而言，病毒可為科卡爾水疱病毒(Cocal)或水疱性口炎病毒(VSV)。在一些實施例中，病毒為沙粒病毒。舉例而言，病毒可為淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)。在一些實施例中，置換之異源細胞質尾為另一病毒之原生細胞質尾或原生細胞質尾之經截短部分，諸如SEQ ID NO: 170-193中之任一者所示。在一些實施例中，SEQ ID NO: 170-193中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 170-193中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為來自病毒感染相關蛋白，諸如反轉錄病毒相關細胞蛋白之細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，蛋白質為CD63。在一些實施例中，置換之異源細胞質尾為病毒相關蛋白之原生細胞質尾或原生細胞質尾之經截短部分，諸如SEQ ID NO: 194-201所示。在一些實施例中，SEQ ID NO: 194-201所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之N端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 194-201中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，含有包括來自另一病毒蛋白或病毒相關蛋白之全部或一部分細胞質尾之經修飾細胞質尾的變異體NiV-F可進一步含有本文所述之一或多個修飾(例如，胺基酸取代/置換、插入或缺失)。在一些實施例中，含有經截短細胞質尾之變異體NiV-F可進一步含有如本文所述之胞外域、跨膜結構域或信號序列中之任何所提供之修飾。
a. 副黏液病毒
副黏液病毒融合蛋白(F)連同附著病毒醣蛋白一起存在於病毒脂質包膜中，視種類而定，該附著病毒醣蛋白標記為HN、H或G中之任一者。F醣蛋白為在完整三聚體中具有三個相同次單元之I類融合蛋白，其中此等次單元中每一者之裂解為功能所需的。經由附著病毒醣蛋白在靶表面處結合後，經蛋白水解處理之F醣蛋白經歷不可逆之構形變化，從而促進病毒膜與靶膜之融合。經由F醣蛋白之融合產生允許將病毒核酸遞送至靶內腔中(亦即，遞送至靶細胞中)之孔。
在一些實施例中，異源細胞質尾或其經截短部分來自副黏液病毒。在一些實施例中，副黏液病毒為亨德拉病毒、雪松病毒、犬瘟熱病毒、人類副流感病毒1、人類副流感病毒2、麻疹病毒、新城疫病毒或仙台病毒。
1) 亨德拉病毒
在一些實施例中，副黏液病毒附著醣蛋白為亨德拉病毒F蛋白(HeV-F)。亨尼帕病毒，亦即，亨德拉病毒及尼帕病毒以及雪松病毒(CedV)、庫馬西病毒(Kumasi virus，KV)及墨江病毒(Mòjiāng virus，MojV)之F蛋白，經編碼為含有信號肽(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基1-26)之F
0前驅體。信號肽裂解後，將成熟F
0轉運至細胞表面，接著內吞且由組織蛋白酶L裂解(例如，在SEQ ID NO:1之胺基酸109-110之間)成成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸110-546)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基27-109)。F1及F2次單元由二硫鍵締合且再循環返回至細胞表面。F1次單元含有位於F1次單元之N端處之融合肽結構域(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸110-129)，在此處該融合肽結構域能夠插入細胞膜中以驅動融合。在特定情況下，藉由F蛋白與G蛋白之締合來阻斷融合活性，直至G與靶分子嚙合，從而使其與F解離並暴露融合肽以介導膜融合。
在不同亨尼帕病毒種類當中，F蛋白之序列及活性為高度保守的。舉例而言，NiV及HeV病毒之F蛋白共享89%胺基酸序列一致性。此外，在一些情況下，亨尼帕病毒F蛋白展現與來自其他種類之G蛋白的相容性以觸發融合(Brandel-Tretheway等人 Journal of Virology. 2019. 93(13):e00577-19)。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有異源細胞質尾，該異源細胞質尾為來自亨德拉病毒之醣蛋白之細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，異源細胞質尾置換NiV-F之至少一部分原生細胞質尾(例如，SEQ ID NO:4)。在一些實施例中，異源尾為亨德拉病毒之原生細胞質尾之5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，亨德拉病毒之原生細胞質尾如SEQ ID NO:58所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 59-81中之任一者所示之亨德拉病毒細胞質尾之經截短部分。在一些實施例中，SEQ ID NO: 59-81中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 59-81中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有呈經截短HeV-F細胞質尾之異源細胞質尾。在一些實施例中，經截短HeV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 58所示之野生型HeV-F細胞質尾之C端處或附近具有至多23個、至多22個、至多21個、至多20個、至多19個、至多18個、至多17個、至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短Hev-G細胞質尾在SEQ ID NO: 58所示之野生型HeV-F細胞質尾之N端處或附近具有22個或約22個或至多22個連續胺基酸殘基之缺失。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:80所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:80所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:80所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:80展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 80所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:310所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:310展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 310所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:384所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:384展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 384所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元如SEQ ID NO:384之胺基酸84-498所示，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:384之胺基酸1-83所示。
2) 麻疹病毒
在一些實施例中，副黏液病毒附著醣蛋白為麻疹F蛋白(MV-F)。如上文所述，麻疹F蛋白(亦即，副黏液病毒F蛋白)為具有對應於融合前、融合中間及融合後髮夾結構之三種構形狀態的三聚I類融合蛋白。已觀測到髮夾之形成使得病毒膜及靶膜並置且因此融合。MV-F蛋白經編碼為含有信號肽(例如，對應於SEQ ID NO: 137之胺基酸殘基1-23)之前驅體F
0。將成熟蛋白質轉運至表面並裂解(例如，在SEQ ID NO:137之胺基酸112與113之間)以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO: 137之胺基酸殘基113-550)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 137之胺基酸殘基24-112)。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有異源細胞質尾，該異源細胞質尾為來自麻疹病毒之醣蛋白之細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，異源細胞質尾置換NiV-F之至少一部分原生細胞質尾(例如，SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，異源尾為麻疹病毒之原生細胞質尾之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，麻疹病毒之原生細胞質尾如SEQ ID NO:125所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 126-140中之任一者所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 126-140中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 126-140中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 126所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 126所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 126所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 127所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 127所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 127所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 128所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 128所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 128所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 129所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 129所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 129所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 130所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 130所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 130所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 131所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 131所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 131所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 132所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 132所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 132所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 133所示之經截短麻疹病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 133所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 133所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有呈經截短MvF細胞質尾之異源細胞質尾。在一些實施例中，經截短MvF細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有至多32個、至多31個、至多30個、至多29個、至多28個、至多27個、至多26個、至多25個、至多24個、至多23個、至多22個、至多21個、至多20個、至多19個、至多18個、至多17個、至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短MvF細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有26個或約26個或至多26個連續胺基酸殘基之缺失。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:126所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:126所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:127所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:127所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:128所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:128所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:129所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:129所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:130所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:130所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:131所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:131所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:132所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:132所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:126所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:126展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 126所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:127所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:127展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 127所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:128所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:128展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 128所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:129所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:129展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 129所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:130所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:130展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 130所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:131所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:131展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 131所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO: 132所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 132展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 132所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO: 133所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 133展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 133所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:307所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:307展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元如SEQ ID NO:307之胺基酸84-499所示，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:307之胺基酸1-83所示。
3) 新城疫病毒
在一些實施例中，副黏液病毒附著醣蛋白為新城疫病毒F蛋白(NDV-F)。如上文所述，新城疫病毒F蛋白(亦即，副黏液病毒F蛋白)為具有對應於融合前、融合中間及融合後髮夾結構之三種構形狀態的三聚I類融合蛋白。已觀測到髮夾之形成使得病毒膜及靶膜並置且因此融合。NDV-F蛋白經編碼為含有信號肽(例如，對應於SEQ ID NO: 253之胺基酸殘基1-31)之前驅體F0。將成熟蛋白質轉運至表面並裂解(例如，在SEQ ID NO:253之胺基酸116與117之間)以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO: 253之胺基酸殘基117-553)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 253之胺基酸殘基32-116)。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有異源細胞質尾，該異源細胞質尾為來自新城疫病毒之醣蛋白之細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，異源細胞質尾置換NiV-F之至少一部分原生細胞質尾(例如，SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，異源尾為新城疫病毒之原生細胞質尾之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，新城疫病毒之原生細胞質尾如SEQ ID NO:141所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 140-155中之任一者所示之經截短新城疫病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 140-155中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 140-155中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 147所示之經截短新城疫病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 147所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 147所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 148所示之經截短新城疫病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 148所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 148所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 149所示之經截短新城疫病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 149所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 149所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 150所示之經截短新城疫病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 150所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 150所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 151所示之經截短新城疫病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 151所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 151所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有呈經截短NDV-F細胞質尾之異源細胞質尾。在一些實施例中，經截短NDV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV-F細胞質尾之C端處或附近具有至多25個、至多24個、至多23個、至多22個、至多21個、至多20個、至多19個、至多18個、至多17個、至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短NDV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV-F細胞質尾之C端處或附近具有20個或約20個或至多20個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短NDV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV-F細胞質尾之C端處或附近具有17個或約17個或至多17個連續胺基酸殘基之缺失。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:147所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:147所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:308所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:308展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 308所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元如SEQ ID NO:308之胺基酸84-501所示，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:308之胺基酸1-83所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:150所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:150所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:147所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:147展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 147所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:148所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:148展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 148所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:149所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:149展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 149所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:150所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:150展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 150所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:151所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:151展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 151所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 309所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 309展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 309所示之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有經截短細胞質尾之經截短F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元如SEQ ID NO:308之胺基酸84-498所示，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:308之胺基酸1-83所示。
4) 雪松病毒
在一些實施例中，副黏液病毒附著醣蛋白為雪松病毒F蛋白(CedV-F)。在一些實施例中，變異體NiV-F含有異源細胞質尾，該異源細胞質尾為來自雪松病毒之醣蛋白之細胞質尾或其經截短部分。在一些實施例中，異源細胞質尾置換NiV-F之至少一部分原生細胞質尾(例如，SEQ ID NO: 4)。在一些實施例中，異源尾為雪松病毒之原生細胞質尾之1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25或26個胺基酸之連續序列。在一些實施例中，雪松病毒之原生細胞質尾如SEQ ID NO: 96所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 96-110中之任一者所示之經截短雪松病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 96-110中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 96-110中之任一者所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，異源細胞質尾為SEQ ID NO: 109所示之經截短雪松病毒細胞質尾。在一些實施例中，SEQ ID NO: 109所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 109所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有呈經截短CedV-F細胞質尾之異源細胞質尾。在一些實施例中，經截短CedV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 96所示之野生型CedV-F細胞質尾之C端處或附近具有至多25個、至多24個、至多23個、至多22個、至多21個、至多20個、至多19個、至多18個、至多17個、至多16個、至多15個、至多14個、至多13個、至多12個、至多11個、至多10個、至多9個、至多8個、至多7個、至多6個、至多5個、至多4個、至多3個、至多2個或至多1個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短CedV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 96所示之野生型CedV-F細胞質尾之C端處或附近具有20個或約20個或至多20個連續胺基酸殘基之缺失。在一些實施例中，經截短CedV-F細胞質尾在SEQ ID NO: 96所示之野生型CedV-F細胞質尾之C端處或附近具有17個或約17個或至多17個連續胺基酸殘基之缺失。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO:109所示之異源細胞質尾。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有異源細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO:109所示之異源細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F具有異源細胞質尾，該異源細胞質尾包含SEQ ID NO:109所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:109展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有包含SEQ ID NO: 109所示之胺基酸序列的異源細胞質尾。
B. 變異體 NiV-F 胞外域
在一些實施例中，變異體NiV-F包含經修飾NiV-F胞外域，其中含有NiV-F之N-聚醣突變、穩定六聚NiV-F三聚體之間的相互作用之突變，及/或對蛋白酶(例如組織蛋白酶，諸如組織蛋白酶L)裂解位點進行工程改造以改良活性F加工之突變。在一些實施例中，本文所述之變異體NiV-F之胞外域中之任何所提供之修飾可與如本文所述之細胞質尾、跨膜結構域或異源信號序列之修飾組合。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有工程改造之胞外域，其中用於加工活性F蛋白之蛋白酶裂解位點係藉由一或多個胺基酸取代進行工程改造。在一些實施例中，野生型NiV-F組織蛋白酶L裂解位點NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)經含有弗林蛋白酶共有裂解序列R-X-R/K-R (SEQ ID NO:312)之經修飾裂解位點置換，其中X為任何胺基酸。在一些實施例中，裂解序列為以下SEQ ID NO中之任一者所示之裂解序列：NNTHDSRRHKR/FAGV (SEQ ID NO:313)、NNTHDLVRHKR/FAGV (SEQ ID NO: 314)、NNTHDLVRHKR/FAGV (SEQ ID NO: 315)、NNTHDLVRHRR/FAGV (SEQ ID NO: 316)、NNTHDLVRH RR/LAGV (SEQ ID NO: 317)、NNGHDSRRHKR/FAGV (SEQ ID NO: 318)、NNGHDLVRHKR/FAGV (SEQ ID NO: 319)、NNGHDLVRHKR/LAGV (SEQ ID NO: 320)、NNGHDLVRHRR/FAGV (SEQ ID NO: 321)、NNGHDLVRHRR/LAGV (SEQ ID NO: 322)、QNTHDSRRHKR/FAGV (SEQ ID NO: 323)、QNTHDLVRH KR/FAGV (SEQ ID NO: 324)、QNTHDLVRHKR/LAGV (SEQ ID NO: 325)、QNTHDLVRHRR/FAGV (SEQ ID NO: 326)、QNTHDLVRHRR/LAGV (SEQ ID NO:327)，其中「/」記號用於指示序列內之裂解位點。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠在裂解位點處由弗林蛋白酶裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，在裂解位點後以殘基「FAGV…」或「LAGV…」開頭直至成熟變異體F0序列之細胞質尾之C端殘基的序列)及F2 (例如，對應於信號序列裂解成成熟變異體F0序列之序列QNTHDLVR-X-R/K-R後之成熟N端殘基的序列)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基NNTHDLVGDVRLAGV (對應於SEQ ID NO:1之殘基99-113)經由SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸殘基組成的經修飾裂解位點置換，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏SEQ ID NO:1之胺基酸殘基1-26)之成熟形式。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠在裂解位點處由弗林蛋白酶裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基110-546，其中胺基酸110-113為如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸FAGV或LAGV)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸27-109之序列，其中胺基酸殘基106-109經諸如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸殘基R-X-R/K-R置換)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:302所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基NNTHDLVGDVRLAGV (對應於SEQ ID NO:302之殘基99-113)經SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸殘基置換，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏SEQ ID NO:302之胺基酸殘基1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基NNTHDLVGDVRLAGV (對應於SEQ ID NO:303之殘基73-87)經SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸殘基置換。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠在裂解位點處由弗林蛋白酶裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:302之胺基酸殘基110-524，其中胺基酸110-113為如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸FAGV或LAGV)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 302之胺基酸27-109之序列，其中胺基酸殘基106-109經諸如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之胺基酸殘基R-X-R/K-R置換)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠在裂解位點處由弗林蛋白酶裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:224-238中之任一者之胺基酸殘基110-524)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 224-238中之任一者之胺基酸27-109之序列)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 385-399中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 385-399中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 385-399中之任一者所示之裂解位點。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 385-399中之任一者所示之胺基酸序列。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠在裂解位點處由弗林蛋白酶裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:385-399中之任一者之胺基酸殘基84-498)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 385-399中之任一者之胺基酸1-83之序列)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F含有工程改造之胞外域，其中用於加工活性F蛋白之組織蛋白酶L裂解位點係藉由用來自另一病毒之蛋白酶位點置換蛋白酶位點VGDVR (SEQ ID NO:329)進行工程改造。在一些實施例中，蛋白酶位點來自正核糖核酸病毒界之病毒。在一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒科、彈狀病毒科、沙粒病毒科或反轉錄病毒科之成員。在一些實施例中，另一病毒為副黏液病毒科之成員。在一些實施例中，另一病毒為亨德拉病毒、雪松病毒、犬瘟熱病毒、副流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或仙台病毒。
在一些實施例中，包含蛋白酶位點VGDVR (SEQ ID NO:339)之野生型NiV-F組織蛋白酶L裂解位點經來自另一病毒之經修飾裂解位點置換。在一些實施例中，裂解序列為以下SEQ ID NO中之任一者所示之裂解序列：VGDVK (SEQ ID NO:329)、RNHNR (SEQ ID NO: 330)、RRHKR (SEQ ID NO: 331)、RRQKR (SEQ ID NO: 332)、GRQGR (SEQ ID NO: 333)、TRQKR (SEQ ID NO: 334)、EIQSR (SEQ ID NO: 335)、VPQSR (SEQ ID NO: 336)、NPQSR (SEQ ID NO: 337)、PRTKR (SEQ ID NO: 338)。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基VGDVR (對應於SEQ ID NO:1之殘基105-109)經由SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之胺基酸殘基組成的經修飾裂解位點置換，或為其缺乏信號肽(例如，SEQ ID NO:1之胺基酸殘基1-26)之成熟形式。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠由用於使裂解位點裂解之蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸殘基110-546)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 1之胺基酸27-109之序列，其中胺基酸殘基105-109經SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之胺基酸殘基置換)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:302所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基VGDVR (對應於SEQ ID NO:302之殘基105-109)經SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之胺基酸殘基置換，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏SEQ ID NO: 302之胺基酸殘基1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基VGDVR (對應於SEQ ID NO:303之殘基79-83)經SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之胺基酸殘基置換。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠由用於使裂解位點裂解之蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:302之胺基酸殘基110-524)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 302之胺基酸27-109之序列，其中胺基酸殘基105-109經SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之胺基酸殘基置換)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠由用於使裂解位點裂解之蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:239-248中之任一者之胺基酸殘基110-524)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 239-248中之任一者之胺基酸27-109之序列)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 400-409中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 400-409中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 2385-399中之任一者所示之裂解位點。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 400-409中之任一者所示之胺基酸序列。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠由用於使裂解位點裂解之蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)裂解以產生成熟融合次單元F1 (例如，對應於SEQ ID NO:400-409中之任一者之胺基酸殘基84-498)及F2 (例如，對應於SEQ ID NO: 400-409中之任一者之胺基酸1-83之序列)。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含裂解序列VGDVK (SEQ ID NO:329)。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基VGDVR (對應於SEQ ID NO:1之殘基105-109)經胺基酸殘基VGDVK (SEQ ID NO:329)置換，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸殘基1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:302所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基VGDVR (對應於SEQ ID NO:302之殘基105-109)經胺基酸殘基VGDVK (SEQ ID NO:329)置換，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸殘基1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列，其中胺基酸殘基VGDVR (對應於SEQ ID NO:302之殘基79-83)經胺基酸殘基VGDVK (SEQ ID NO:329)置換。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且含有裂解位點VGDVK，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠由用於使裂解位點裂解之蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)裂解以產生如SEQ ID NO:239之胺基酸殘基110-524所示之成熟融合次單元F1及如SEQ ID NO: 239之胺基酸27-109所示之F2。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 400所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 400展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且含有裂解位點VGDVK。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 400所示之胺基酸序列。在變異體NiV-F含有經修飾裂解位點之實施例中，含有經修飾裂解位點之成熟變異體F0序列能夠由用於使裂解位點裂解之蛋白酶(例如，組織蛋白酶L)裂解以產生如SEQ ID NO: 400之胺基酸殘基84-498所示之成熟融合次單元F1及如SEQ ID NO:400之胺基酸1-83所示之F2。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
C. 超融合修飾
在一些實施例中，變異體NiV-F包含超融合突變，使得具有變異體NiV-F之脂質粒子展示超融合表型。舉例而言，產生超融合MeV之特徵性突變已知與中樞神經系統感染有關(Angius等人 J Virol. 2019;93(4))。融合活性包括F蛋白與如章節III.B.中所述之G蛋白聯合之活性，以促進或有助於兩個膜內腔之融合，諸如在其脂質雙層中嵌入變異體尼帕F醣蛋白之脂質粒子的內腔，以及靶細胞之細胞質，例如含有由變異體醣蛋白識別或結合之表面受體或分子的細胞。在一些實施例中，F蛋白及G蛋白來自相同副黏液病毒種類(例如，NiV-G及NiV-F)。在一些實施例中，F蛋白及G蛋白來自不同副黏液病毒種類(例如NiV-G及HeV-F)。在一些實施例中，超融合突變係在F蛋白之細胞質結構域中。在一些實施例中，SEQ ID NO:4所示之原生或野生型NiV-F細胞質結構域經來自病毒蛋白之超融合變異體置換。在一些實施例中，SEQ ID NO:4所示之原生或野生型NiV-F細胞質結構域經超融合突變修飾。不希望受理論約束，觀測到細胞質尾內之一些特定殘基可調節NiV-F之融合活性。在一些態樣中，多元殘基KRR (例如，對應於SEQ ID NO: 1之殘基521-523)之突變使細胞間融合增加多達5.5倍(Lee等人, J Virol 81(9), 2007)。在一些實施例中，細胞質結構域含有K1A突變，使得離胺酸(例如，對應於SEQ ID NO: 1之位置521)取代丙胺酸。
在一些實施例中，超融合細胞質結構域如SEQ ID NO:53所示。在一些實施例中，超融合細胞質結構域如SEQ ID NO:54所示。在一些實施例中，超融合細胞質結構域如SEQ ID NO:55所示。在一些實施例中，超融合細胞質結構域如SEQ ID NO:56所示。
在一些實施例中，SEQ ID NO: 53-56中之任一者所示之超融合細胞質結構域直接連接至SEQ ID NO: 2所示之序列之C端。在一些實施例中，變異體Niv-F蛋白包含含有超融合細胞質結構域之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由其中SEQ ID NO: 53-56中之任一者所示之超融合細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端(一起為經修飾F1次單元)之序列組成的經修飾F1，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
在一些實施例中，超融合突變係針對糖基化之F蛋白殘基。在一些實施例中，SEQ ID NO:1或2所示之原生或野生型NiV-F或其功能變異體或生物活性部分(例如，SEQ ID NO: 302或SEQ ID NO:303)藉由超融合突變為嵌有N-聚醣之胺基酸進行修飾。不希望受理論約束，觀測到副黏液病毒F蛋白之N-連接糖基化殘基之調節引起F蛋白之構形變化，此可能導致超融合性。在一些實施例中，變異體NiV-F參考SEQ ID NO:1之編號在一或多個位置64、67、99、414及/或464處包含至麩醯胺(Q)或其保守胺基酸之突變。在一些實施例中，胺基酸取代為絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)、天冬醯胺(R)或麩醯胺(Q)。
在一些實施例中，突變為N64Q、N67Q、N99Q、N414Q及/或N464Q中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。在一些實施例中，突變為N64Q、N67Q、N99Q、N414Q、N464Q、N67Q/N99Q、N67Q/N414Q、N67Q/N464Q、N99Q/N414Q、N99Q/N464Q、N414Q/N464Q、N67Q/N99Q/N414Q、N67Q/N414Q/ N464Q、N99Q/N414Q/N464Q或N67Q/N99Q/N414Q/N464Q。在一些實施例中，突變為N64Q/N99Q、N64Q/N99Q/N464Q、N64Q/N67Q/N99Q或N64Q/N67Q/ N99Q/N464Q。在一些實施例中，突變係在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 302或SEQ ID NO:303所示之序列中。
在一些實施例中，突變為N67Q、N99Q、N414Q及/或N464Q中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。在一些實施例中，突變為N67Q、N99Q、N414Q、N464Q、N67Q/N99Q、N67Q/N414Q、N67Q/N464Q、N99Q/N414Q、N99Q/N464Q、N414Q/N464Q、N67Q/N99Q/N414Q、N67Q/N414Q/N464Q、N99Q/N414Q/N464Q或N67Q/N99Q/N414Q/N464Q。在一些實施例中，突變係在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 302或SEQ ID NO:303所示之序列中。
在一些實施例中，超融合變異體NiV-F由編碼SEQ ID NO: 273-280中之任一者所示之序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 273-280中之任一者所示之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 273-280中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO:273-280中之任一者之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 273-280中之任一者之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，超融合變異體NiV-F由編碼SEQ ID NO: 274所示之序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 274所示之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 274展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO: 274中之任一者之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 274之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，超融合變異體NiV由編碼SEQ ID NO: 457-464中之任一者所示之序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 457-464中之任一者所示之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 457-464中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO: 457-464中之任一者之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 457-464中之任一者之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，超融合變異體NiV由編碼SEQ ID NO: 290所示之序列的多核苷酸編碼。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 290所示之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 290展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO: 290之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 290之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，超融合變異體NiV-F如SEQ ID NO:273所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:274所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:275所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:276所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:277所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:278所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:279所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:280所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在任何實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F由SEQ ID NO: 273-280中之任一者之F1及F2次單元組成。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 410-416中之任一者所示之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 410-416中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO:410-416中之任一者之胺基酸殘基84-498的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 410-416中之任一者之胺基酸1-83的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，超融合突變係針對在維持六聚體穩定性中發揮功能之F蛋白殘基。在一些實施例中，SEQ ID NO: 1或2所示之原生或野生型NiV-F或其功能變異體或生物活性部分(例如，SEQ ID NO: 302或SEQ ID NO:303)藉由超融合突變為涉及於六聚體穩定性之胺基酸進行修飾。不希望受理論約束，觀測到副黏液病毒F蛋白之次單元穩定性之調節引起F蛋白之構形變化或時間變化，此可能導致超融合性。在一些實施例中，變異體NiV-F參考SEQ ID NO:1之編號在位置109及/或303中之一或多處包含至白胺酸(L)或其保守胺基酸之突變。在一些實施例中，胺基酸取代為白胺酸(L)、異白胺酸(I)、纈胺酸(V)、苯丙胺酸(F)、麩醯胺(Q)、蘇胺酸(T)或酪胺酸(Y)。在一些實施例中，突變為R109L、Q393L或R109L與Q393L，參考SEQ ID NO:1所示之編號。在一些實施例中，突變係在SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO: 302或SEQ ID NO:303所示之序列中。
在一些實施例中，超融合變異體NiV-F由編碼SEQ ID NO: 291-293中之任一者所示之序列的多核苷酸編碼。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 291-293中之任一者所示之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 291-293中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO:291-293中之任一者之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 291-293中之任一者之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，超融合變異體NiV-F如SEQ ID NO:291所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV如SEQ ID NO:292所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，超融合變異體NiV-F如SEQ ID NO:293所示或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在任何實施例中之一些實施例中，變異體NiV-F由SEQ ID NO: 291-293中之任一者之F1及F2次單元組成。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 417-419中之任一者所示之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 417-419中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合突變之胺基酸序列。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO:417-419中之任一者之胺基酸殘基84-498的F1及對應於SEQ ID NO: 417-419中之任一者之胺基酸1-83的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示之原生或野生型NiV-F含有來自病毒蛋白之超融合變異體。在一些實施例中，SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示之原生或野生型NiV-F含有來自亨德拉F蛋白之超融合變異體。
在一些實施例中，變異體NiV-F由編碼如SEQ ID NO: 281-283中之任一者或SEQ ID NO: 294-296中之任一者所示之蛋白質的多核苷酸編碼。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 281-283或294-296中之任一者所示之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。在一些實施例中，變異體NiV-F包含與SEQ ID NO: 283-285、294-296中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性且含有超融合變異體之胺基酸序列，或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式。
D. 異源信號肽
在一些實施例中，變異體NiV-F多肽由包含編碼異源信號肽序列之序列的核苷酸序列編碼。在一些實施例中，經編碼之變異體NiV-F多肽含有異源信號肽。因此，在一些實施例中，本文所提供之變異體NiV-F多肽可揭示為經表現或編碼之序列，包括異源N端信號序列。應理解，由於此類異源N端信號序列通常以共轉譯方式或轉譯後裂解，因此亦預期本文所揭示之F蛋白序列之成熟蛋白質序列缺乏N端信號序列。在一些實施例中，本文所述之任何所提供之變異體NiV-F蛋白，包括胞外域、細胞質尾及/或跨膜結構域中之任何所含修飾，可包括如本文所述之異源信號序列。
在一些實施例中，編碼NiV-F或變異體NiV-F之序列中之SEQ ID NO:3所示之原生或野生型NiV-F信號肽，諸如所述任一者，經來自病毒蛋白或哺乳動物蛋白之異源信號序列置換。在一些實施例中，信號序列來自與慢病毒粒子出芽相關之其他病毒融合原或其他細胞蛋白。在一些實施例中，用異源信號序列或肽修飾變異體NiV-F可使得在細胞表面處病毒出芽位點之表現改良。
在一些實施例中，異源信號序列為來自副黏液病毒，諸如亨尼帕病毒之信號序列。在一些實施例中，異源信號序列來自亨德拉病毒，諸如SEQ ID NO:340所示之HeVF信號序列。在一些實施例中，異源信號序列來自雪松病毒，諸如SEQ ID NO:341所示之CeVF信號序列。在一些實施例中，異源信號序列來自人類副流感病毒2 (HPIV2)，諸如SEQ ID NO:342所示之HPIV-2信號序列。在一些實施例中，異源信號序列來自麻疹病毒，諸如SEQ ID NO:343所示之MevF信號序列。在一些實施例中，異源信號序列來自仙台病毒，諸如SEQ ID NO:345所示之SevF信號序列。
在一些實施例中，異源信號序列為來自非副黏液病毒之病毒的信號序列。在一些實施例中，異源信號序列為來自HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒、伊波拉病毒、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒之信號序列。在一些實施例中，異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。在一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。
在一些實施例中，異源信號序列為來自哺乳動物蛋白質之信號序列。在一些實施例中，哺乳動物蛋白質為人類蛋白質。在一些實施例中，異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。在一些實施例中，異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含編碼SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列的核苷酸序列或由該核苷酸序列編碼，其中信號序列(胺基酸1-26)經SEQ ID NO: 340-358中之任一者所示之異源信號序列置換。在一些實施例中，變異體NiV-F包含編碼SEQ ID NO:302所示之胺基酸序列的核苷酸序列或由該核苷酸序列編碼，其中信號序列(胺基酸1-26)經SEQ ID NO: 340-358中之任一者所示之異源信號置換。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:249-267中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 249-267中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 249所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 249展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:249-267中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:249-267中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之NiV-F在加工時含有F1及F2次單元，其中F1次單元對應於SEQ ID NO:249-267中之任一者之胺基酸殘基110-524且F2次單元對應於SEQ ID NO: 249-267中之任一者之胺基酸27-109。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO 249所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO 249展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之NiV-F在加工時含有F1及F2次單元，其中F1次單元對應於SEQ ID NO 249之胺基酸殘基110-524且F2次單元對應於SEQ ID NO 249中之任一者之胺基酸27-109。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO 261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO 261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，經編碼之NiV-F在加工時含有F1及F2次單元，其中F1次單元對應於SEQ ID NO 261之胺基酸殘基110-524且F2次單元對應於SEQ ID NO 261中之任一者之胺基酸27-109。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
E. 異源或經修飾跨膜結構域
在一些實施例中，變異體NiV-F多肽包含異源或經修飾跨膜結構域。在一些實施例中，NiV-F之原生或野生型跨膜(例如，對應於SEQ ID NO:1之胺基酸488-518)由經修飾或異源跨膜結構域置換。
在一些實施例中，異源跨膜結構域為來自另一副黏液病毒，諸如亨尼帕病毒之跨膜。在一些實施例中，異源跨膜結構域來自亨德拉病毒。在一些實施例中，置換之跨膜結構域為具有SEQ ID NO:361所示之序列的異源跨膜結構域。
在一些實施例中，跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有一或多個來自S490A、Y498A、S504A或I516V之胺基酸置換(取代)，對應於SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:302所示之位置的編號。在一些實施例中，置換之跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，其具有SEQ ID NO:359、SEQ ID NO:360、SEQ ID NO:362或SEQ ID NO:363所示之序列。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:1所示之胺基酸序列，其中跨膜結構域(胺基酸488-518)經SEQ ID NO: 359-363中之任一者所示之異源或經修飾跨膜結構域置換。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:302所示之胺基酸序列，其中跨膜結構域(胺基酸488-518)經SEQ ID NO: 359-363中之任一者所示之異源或經修飾跨膜結構域置換。在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列，其中跨膜結構域(胺基酸462-492)經SEQ ID NO: 359-363中之任一者所示之異源或經修飾跨膜結構域置換。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO:268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO:268-272中之任一者之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 268-272中之任一者之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 270所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 270展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO: 270之胺基酸殘基110-524的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 270之胺基酸27-109的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 277、284、285、420或421中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 277、284、285、420或421中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在實施例中，變異體NiV-F含有對應於SEQ ID NO: 277、284、285、420或421中之任一者之胺基酸殘基84-498的F1次單元及對應於SEQ ID NO: 277、284、285、420或421中之任一者之胺基酸1-83的F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
F. 組合變異體尼帕 F 醣蛋白
在一些實施例中，變異體NiV-F包含本文(包括章節II.A-E中)所述之各種修飾策略之組合。在一些實施例中，個別F變異體之修飾(例如，經截短、經修飾或嵌合NiV-F尾、經修飾胞外域、超融合修飾(包括糖基化修飾)、信號序列修飾及/或異源或經修飾跨膜結構域)與NiV-F蛋白內之另一個修飾或其他修飾組合。在一些實施例中，個別F變異體之修飾與針對NiV-F蛋白內之不同基因座之另一個修飾或其他修飾組合。
在一些實施例中，個別NiV-F細胞質尾變異體進一步包含任何胞外域或跨膜結構域中之修飾。在一些實施例中，個別NiV-F細胞質尾變異體進一步包含異源信號肽。在一些實施例中，個別NiV-F細胞質尾變異體進一步包含超融合修飾，諸如糖基化突變或六聚體穩定突變。
在一些實施例中，將修飾(例如，修飾或截短)組合可對所得假型粒子效價產生累加效應。
在一些實施例中，變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 57、58、297-300、367-378或423-456中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 57、58、297-300、367-378或423-456中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。在一些實施例中，變異體NiV-F具有SEQ ID NO: 57、58、297-300、367-378或423-456中之任一者所示之序列。在一些實施例中，經編碼之NiV-F在加工時含有F1及F2次單元。在一些實施例中，F1及F2次單元由二硫鍵締合且在脂質粒子，例如慢病毒載體之表面上表現。
G. 編碼變異體 NiV-F 之多核苷酸
本文提供包含編碼本文所述之變異體NiV-F蛋白之核酸序列的多核苷酸。多核苷酸可包括編碼上文所述之任何變異體NiV-F蛋白之核苷酸序列。在一些實施例中，多核苷酸可為合成核酸。亦提供含有任何所提供之多核苷酸的表現載體。
在任何實施例中之一些實施例中，天然或合成核酸之表現典型地藉由將編碼所關注基因之核酸可操作地連接至啟動子且將構築體摻入表現載體中來達成。在一些實施例中，載體可適合於在真核生物中復制及整合。在一些實施例中，選殖載體含有轉錄及轉譯終止子、起始序列及可用於表現所需核酸序列之啟動子。在任何實施例中之一些實施例中，質體包含適合於在細胞中表現之啟動子。
在一些實施例中，多核苷酸含有至少一個啟動子，其操作性地連接以控制變異體NiV-F蛋白之表現。對於變異體NiV-F蛋白之表現 ，各啟動子中之至少一個模組用於定位RNA合成之起始位點。對此最知名之實例為TATA盒，但在一些缺乏TATA盒之啟動子，諸如哺乳動物末端去氧核苷酸轉移酶基因之啟動子及SV40基因之啟動子中，覆蓋起始位點本身之離散元件有助於固定起始位置。
在一些實施例中，額外啟動子元件，例如增強子，調控轉錄起始之頻率。在一些實施例中，額外啟動子元件位於起始位點上游30-110 bp之區域中，儘管最近已顯示許多啟動子亦含有起始位點下游之功能元件。在一些實施例中，啟動子元件之間的間距通常為靈活的，因此當元件相對於彼此倒置或移動時啟動子功能得以保留。在一些實施例中，對於胸苷激酶(tk)啟動子，啟動子元件之間的間隔可在活性開始下降之前增至50 bp間隔。在一些實施例中，取決於啟動子，個別元件可協同或獨立地發揮功能以活化轉錄。
啟動子可為與基因或多核苷酸序列天然相關之啟動子，如可藉由分離位於編碼區段及/或外顯子上游之5'非編碼序列獲得。此種啟動子可稱作「內源性的」。類似地，增強子可為與多核苷酸序列天然相關之增強子，位於彼序列之下游或上游。或者，藉由將編碼多核苷酸區段置於重組或異源啟動子之控制下將獲得某些優勢，該啟動子係指在其天然環境中通常不與多核苷酸序列相關之啟動子。重組或異源增強子亦係指在其天然環境中通常不與多核苷酸序列相關之增強子。此類啟動子或增強子可包括其他基因之啟動子或增強子，及自任何其他原核、病毒或真核細胞分離之啟動子或增強子，及非「天然存在」之啟動子或增強子，亦即，含有不同轉錄調控區之不同元件，及/或改變表現之突變。除以合成方式產生啟動子及增強子之核酸序列以外，亦可與本文所揭示之組合物相結合使用重組選殖及/或核酸擴增技術(包括PCR)產生序列(美國專利第4,683,202號及第5,928,906號)。
在一些實施例中，適合之啟動子為即刻早期巨細胞病毒(CMV)啟動子序列。在一些實施例中，啟動子序列為強組成型啟動子序列，該啟動子序列能夠驅動與其操作性地連接之任何多核苷酸序列之高水準表現。在一些實施例中，適合之啟動子為延伸生長因子la (EF-l a)。在一些實施例中，亦可使用其他組成型啟動子序列，包括但不限於猿猴病毒40 (SV40)早期啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)、人類免疫缺陷病毒(HIV)長末端重複(LTR)啟動子、MoMuLV啟動子、禽白血病病毒啟動子、艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)即刻早期啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)啟動子，以及人類基因啟動子，諸如但不限於肌動蛋白啟動子、肌凝蛋白啟動子、血紅蛋白啟動子及肌酸激酶啟動子。在一些實施例中，適合之啟動子為CAG啟動子，視情況其中該CAG啟動子包含(C)巨細胞病毒(CMV)早期增強子元件，(A)雞β-肌動蛋白基因之啟動子、第一外顯子及第一內含子，及(G)兔β-球蛋白基因之剪接接受體。
在一些實施例中，啟動子為可誘導型啟動子。在一些實施例中，可誘導型啟動子提供分子開關，該分子開關能夠在需要此種表現時開啟與其操作性地連接之多核苷酸序列之表現，或者在不需要表現時關閉表現。在一些實施例中，可誘導型啟動子包括金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。
在一些實施例中，外源控制之可誘導型啟動子可用於調控變異體NiV-F蛋白之表現。舉例而言，可使用輻射可誘導型啟動子、熱可誘導型啟動子及/或藥物可誘導型啟動子來選擇性地驅動例如靶向區域中之轉殖基因表現。在此類實施例中，可藉由投與外源誘導源來調控轉殖基因表現之位置、持續時間及水準。
在一些實施例中，使用藥物可誘導型啟動子調控變異體NiV-F蛋白之表現。舉例而言，在一些情況下，啟動子、增強子或反式活化子包含Lac操縱子序列、四環素操縱子序列、半乳糖操縱子序列、多西環素(doxycycline)操縱子序列、雷帕黴素(rapamycin)操縱子序列、他莫昔芬(tamoxifen)操縱子序列或激素反應性操縱子序列，或其類似物。在一些情況下，可誘導型啟動子包含四環素反應元件(TRE)。在一些實施例中，可誘導型啟動子包含雌激素反應元件(ERE)，其可在他莫昔芬存在下活化基因表現。在一些情況下，藥物可誘導型元件，諸如TRE，可與所選啟動子組合，以在諸如多西環素之藥物存在下增強轉錄。在一些實施例中，藥物可誘導型啟動子為小分子可誘導型啟動子。
可修飾任何所提供之多核苷酸以移除CpG模體及/或使密碼子最佳化以便在特定物種，諸如人、犬、貓、馬、羊、牛等物種中進行轉譯。在一些實施例中，將多核苷酸針對人類密碼子使用進行最佳化(亦即，人類密碼子最佳化)。在一些實施例中，修飾多核苷酸以移除CpG模體。在其他實施例中，修飾所提供之多核苷酸以移除CpG模體且進行密碼子最佳化，諸如人類密碼子最佳化。密碼子最佳化及CpG模體偵測及修飾之方法為熟知的。典型地，多核苷酸最佳化增強轉殖基因表現，增加轉殖基因穩定性且保留經編碼多肽之胺基酸序列。
為評估變異體NiV-F蛋白之表現，待引入細胞中之表現載體亦可含有可選擇標誌基因或報告基因或兩者以促進表現粒子，例如病毒粒子之鑑定及選擇。在其他實施例中，可選擇標誌可攜帶於單獨DNA片段上且用於共轉染程序。可選擇標誌及報告基因兩者均可側接有適當調控序列，以實現在宿主細胞中之表現。有用之可選擇標誌在此項技術中為已知的且包括例如抗生素抗性基因，諸如neo及類似基因。
報告基因用於鑑定潛在轉染之細胞及評價調控序列之功能性。編碼可易於檢定之蛋白質之報告基因為熟知的。一般而言，報告基因為不存在於受體生物體或組織中或不由受體生物體或組織表現之基因，且其編碼之蛋白質的表現係由一些可易於偵測之特性，例如酶促活性來證明。在將DNA引入受體細胞之後的適合時間檢定報告基因之表現。
適合之報告基因可包括編碼螢光素酶、β-半乳糖苷酶、氯黴素乙醯轉移酶、分泌型鹼性磷酸酶或綠色螢光蛋白基因之基因(參見例如Ui-Tei等人, 2000, FEBS Lett. 479:79-82)。適合之表現系統為熟知的且可使用熟知之技術製備或商購獲得。可使用獨特之內部限制性位點或藉由部分消化非獨特之限制性位點來產生內部缺失構築體。接著可將構築體轉染至展示高水準之所需多核苷酸及/或多肽表現的細胞中。一般而言，將具有顯示報告基因之最高表現水準的最小5'側翼區域之構築體鑑定為啟動子。此類啟動子區域可連接至報告基因且用於評價試劑調節啟動子驅動之轉錄的能力。
III. 含有變異體 NiV-F 醣蛋白之脂質粒子及生產方法
本文提供一種脂質粒子，其包含脂質雙層、由脂質雙層包圍之內腔及變異體NiV-F蛋白，諸如所述任一者，其中變異體NiV-F嵌入脂質雙層內。在一些實施例中，脂質粒子可另外含有用於遞送至細胞之外源劑(例如，治療劑)。在一些實施例中，將脂質粒子引入個體之細胞中。亦提供將任何所提供之脂質粒子遞送至細胞之方法。
在一些實施例中，所提供之脂質粒子展現融合活性，該融合活性由變異體NiV-F連同任何所提供之G蛋白介導，此促進脂質粒子及靶細胞膜之兩個內腔的合併或融合。因此，所提供之脂質粒子為融合體。在一些實施例中，融合體包含源自天然之兩親性脂質雙層，其中變異體NiV-F作為融合原。在一些實施例中，融合體包含(a)脂質雙層；(b)由脂質雙層包圍之內腔(例如，包含細胞溶膠)；及(c)相對於源細胞而言外源性或過表現之融合原。在一些實施例中，變異體NiV-F安置於脂質雙層中。在一些實施例中，融合體包含若干不同類型之脂質，例如兩親性脂質，諸如磷脂。
在一些實施例中，脂質粒子包括源自天然之兩親性脂質雙層，其封閉內腔或空腔。在一些實施例中，脂質粒子包含脂質雙層作為最外表面。在一些實施例中，脂質雙層封閉內腔。在一些實施例中，內腔為水性的。在一些實施例中，內腔與脂質雙層內部之親水性頭基接觸。在一些實施例中，內腔為細胞溶膠。在一些實施例中，細胞溶質含有存在於源細胞中之細胞組分。在一些實施例中，細胞溶質不含存在於源細胞中之組分。在一些實施例中，內腔為空腔。在一些實施例中，空腔含有水性環境。在一些實施例中，空腔不含水性環境。
在一些態樣中，脂質雙層在產生含脂質粒子之過程中來源於源細胞。用於產生含脂質粒子之示例性方法在章節III.A.3中提供。在一些實施例中，脂質雙層包括產生脂質雙層之細胞的膜組分，例如，磷脂、膜蛋白等。在一些實施例中，脂質雙層包括細胞溶質，其包括在產生微囊泡之細胞中發現之組分，例如，溶質、蛋白質、核酸等，但並非細胞之所有組分，例如，該等組分缺乏細胞核。在一些實施例中，脂質雙層視為外泌體樣的。脂質雙層之大小可不同，且在一些情況下具有30至300 nm範圍內之直徑，諸如30至150 nm，且包括40至100 nm。
在一些實施例中，脂質雙層為病毒包膜。在一些實施例中，病毒包膜獲自源細胞。在一些實施例中，病毒包膜由來自源細胞質膜之病毒衣殼獲得。在一些實施例中，脂質雙層獲自除宿主細胞之質膜以外的膜。在一些實施例中，病毒包膜脂質雙層嵌有病毒蛋白，包括如本文所述之病毒醣蛋白，諸如變異體NiV-F蛋白，且在一些態樣中亦包括諸如NiV-G蛋白之蛋白質。
在其他態樣中，脂質雙層包括合成脂質複合物。在一些實施例中，合成脂質複合物為脂質體。在一些實施例中，脂質雙層為囊泡結構，其特徵在於磷脂質雙層膜及內部水性介質。在一些實施例中，脂質雙層具有由水性介質分隔之多個脂質層。在一些實施例中，當磷脂懸浮於過量水溶液中時，脂質雙層自發形成。在一些實例中，脂質組分在形成閉合結構之前進行自重排且在脂質雙層之間截留水及溶解之溶質。
在一些實施例中，變異體NiV-F蛋白及G蛋白(例如，NiV-G)，諸如所述任一者，包括相對於源細胞而言外源性或過表現之任一者，安置於脂質雙層中。在所提供之實施例中，變異體NiV-F蛋白及G蛋白(例如，NiV-G蛋白)暴露於脂質粒子(例如，慢病毒載體)之脂質雙層之外表面上。
在一些實施例中，脂質粒子包含若干不同類型之脂質。在一些實施例中，脂質為兩親性脂質。在一些實施例中，兩親性脂質为磷脂。在一些實施例中，磷脂包括磷脂醯膽鹼、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯肌醇及磷脂醯絲胺酸。在一些實施例中，脂質包括磷脂，諸如磷酸膽鹼及磷酸肌醇。在一些實施例中，脂質包括DMPC、DOPC及DSPC。
在一些實施例中，雙層可包含一或多種相同或不同類型之脂質。在一些實施例中，源細胞包括選自以下之細胞：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
在一些實施例中，脂質粒子可為病毒粒子、病毒樣粒子、奈米粒子、囊泡、外泌體、樹枝狀聚合物、慢病毒、病毒載體、無核細胞、微囊泡、膜囊泡、細胞外膜囊泡、質膜囊泡、巨大質膜囊泡、凋亡體、有絲分裂粒子、核紅細胞、溶酶體、另一種膜封閉囊泡或慢病毒載體、基於病毒之粒子、病毒樣粒子(VLP)或基於細胞之粒子。
在特定實施例中，脂質粒子為源自病毒的。在一些實施例中，脂質粒子可為基於病毒之粒子，諸如病毒載體粒子(例如，慢病毒載體粒子)或病毒樣粒子(例如，慢病毒樣粒子)。在一些實施例中，脂質雙層為病毒包膜。在一些實施例中，病毒包膜獲自宿主細胞。在一些實施例中，病毒包膜由來自源細胞質膜之病毒衣殼獲得。在一些實施例中，脂質雙層獲自除宿主細胞之質膜以外的膜。在一些實施例中，病毒包膜脂質雙層嵌有病毒蛋白，包括病毒醣蛋白。
在特定實施例中，脂質粒子並非源自病毒的。在一些實施例中，脂質粒子可為奈米粒子、囊泡、外泌體、樹枝狀聚合物、無核細胞、微囊泡、膜囊泡、細胞外膜囊泡、質膜囊泡、巨大質膜囊泡、凋亡體、有絲分裂粒子、核紅細胞、溶酶體、另一種膜封閉囊泡或源自細胞之粒子。
在一些實施例中，脂質雙層包括脂質雙層所來源之宿主細胞的膜組分，例如，磷脂、膜蛋白等。在一些實施例中，脂質雙層包括細胞溶質，其包括在媒劑所來源之細胞中發現之組分，例如，溶質、蛋白質、核酸等，但並非細胞之所有組分，例如，缺乏細胞核。在一些實施例中，脂質雙層視為外泌體樣的。脂質雙層之大小可不同，且在一些情況下具有30至300 nm範圍內之直徑，諸如30至150 nm，且包括40至100 nm。
在特定實施例中，外源劑，諸如多核苷酸或多肽，封裝於脂質粒子之內腔內。所提供之脂質粒子之實施例可具有促進有效負荷(諸如所需轉殖基因或外源劑)遞送至靶細胞之各種特性。外源劑可為多核苷酸或多肽。在一些實施例中，向個體，例如哺乳動物，例如人類投與本文所提供之脂質粒子。在此類實施例中，個體可能處於特定疾病或疾患之風險下，可能具有特定疾病或疾患之症狀，或可能經診斷患有或鑑定為患有特定疾病或疾患。在一個實施例中，個體患有癌症。在一個實施例中，個體患有感染性疾病。在一些實施例中，脂質粒子含有編碼用於治療疾病或疾患之外源劑或多肽外源劑之核酸序列(多核苷酸)。
脂質粒子可包括球形粒子或可包括細長或不規則形狀之粒子。
在一些實施例中，可評估粒子組合物之一或多種與其尺寸相關之特徵，包括直徑、其高於及低於直徑平均值(均值)或中值之變化範圍、變異係數、多分散性指數或組合物中粒度之其他量度。可使用各種粒子表徵方法，包括但不限於雷射繞射、動態光散射(DLS；亦稱為光子相關光譜法)或影像分析，諸如顯微術或自動化影像分析。
在一些實施例中，所提供之脂質粒子之直徑或組合物中粒子之平均(均值)直徑小於約3 μm、小於約2 μm、小於約1 μm、小於約900 nm、小於約800 nm、小於約700 nm、小於約600 nm、小於約500 m、小於約400 nm、小於約300、小於約200 nm、小於約150 nm、小於約100 nm、小於約50 nm或小於約20 nm。在一些實施例中，脂質粒子之直徑或組合物中粒子之平均(均值)直徑小於約400 nm。在另一個實施例中，脂質粒子之直徑或組合物中粒子之平均(均值)直徑小於約150 nm。在一些實施例中，脂質粒子之直徑或組合物中粒子之平均(均值)直徑介於2 μm與1 μm或約2 μm與約1 μm之間，介於1 μm與900 nm或約1 μm與約900 nm之間，介於900 nm與800 nm或約900 nm與約800 nm之間，介於800與700 nm或約800與約700 nm之間，介於700 nm與600 nm或約700 nm與約600 nm之間，介於600 nm與500 nm或約600 nm與約500 nm之間，介於500 nm與400 nm或約500 nm與約400 nm之間，介於400 nm與300 nm或約400 nm與約300 nm之間，介於300 nm與200 nm或約300 nm與約200 nm之間，介於200與100 nm或約200與約100 nm之間，介於100與50 nm或約100與約50 nm之間，或者介於20 nm與50 nm或約20 nm與約50 nm之間。
在一些實施例中，粒子組合物中之中值粒徑介於10 nm與1000 nM或約10 nm與約1000 nM之間，介於25 nm與500 nm或約25 nm與約500 nm之間，介於40 nm與300 nm或約40 nm與約300 nm之間，介於50 nm與250 nm或約50 nm與約250 nm之間，介於60 nm與225 nm或約60 nm與約225 nm之間，介於70 nm與200 nm或約70 nm與約200 nm之間，介於80 nm與175 nm或約80 nm與約175 nm之間，或者介於90 nm與150 nm或約90 nm與約150 nm之間。
在一些實施例中，組合物中90%之脂質粒子處於脂質粒子中值直徑之50%以內。在一些實施例中，組合物中90%之脂質粒子處於脂質粒子中值直徑之25%以內。在一些實施例中，組合物中90%之脂質粒子處於中值直徑之20%以內。在一些實施例中，組合物中90%之脂質粒子處於脂質粒子中值直徑之15%以內。在一些實施例中，組合物中90%之脂質粒子處於脂質粒子中值直徑之10%以內。
在一些實施例中，組合物中75%之脂質粒子處於脂質粒子平均直徑+/- 2或+/- 1 St Dev標準偏差(St Dev)以內。在一些實施例中，組合物中80%之脂質粒子處於脂質粒子平均直徑+/- 2 St Dev或+/- 1 St Dev以內。在一些實施例中，組合物中85%之脂質粒子處於脂質粒子平均直徑+/- 2 St Dev或+/- 1 St Dev以內。在一些實施例中，組合物中90%之脂質粒子處於脂質粒子平均直徑+/- 2 St Dev或+/- 1 St Dev以內。在一些實施例中，組合物中95%之脂質粒子處於脂質粒子平均直徑+/- 2 St Dev或+/- 1 St Dev以內。
在一些實施例中，脂質粒子具有約100nm至約2微米之平均流體動力學半徑，例如，藉由動態光散射(DLS)所确定。在一些實施例中，脂質粒子之平均流體動力學半徑介於2 μm與1 μm或約2 μm與約1 μm之間，介於1 μm與900 nm或約1 μm與約900 nm之間，介於900 nm與800 nm或約900 nm與約800 nm之間，介於800與700 nm或約800與約700 nm之間，介於700 nm與600 nm或約700 nm與約600 nm之間，介於600 nm與500 nm或約600 nm與約500 nm之間，介於500 nm與400 nm或約500 nm與約400 nm之間，介於400 nm與300 nm或約400 nm與約300 nm之間，介於300 nm與200 nm或約300 nm與約200 nm之間，介於200與100 nm或約200與約100 nm之間，介於100與50 nm或約100與約50 nm之間，或者介於20 nm與50 nm或約20 nm與約50 nm之間。
在一些實施例中，脂質粒子具有約100 nm至約2微米之平均幾何半徑，例如，藉由多角度光散射所确定。在一些實施例中，脂質粒子之平均幾何半徑介於2 μm與1 μm或約2 μm與約1 μm之間，介於1 μm與900 nm或約1 μm與約900 nm之間，介於900 nm與800 nm或約900 nm與約800 nm之間，介於800與700 nm或約800與約700 nm之間，介於700 nm與600 nm或約700 nm與約600 nm之間，介於600 nm與500 nm或約600 nm與約500 nm之間，介於500 nm與400 nm或約500 nm與約400 nm之間，介於400 nm與300 nm或約400 nm與約300 nm之間，介於300 nm與200 nm或約300 nm與約200 nm之間，介於200與100 nm或約200與約100 nm之間，介於100與50 nm或約100與約50 nm之間，或者介於20 nm與50 nm或約20 nm與約50 nm之間。
在一些實施例中，脂質粒子組合物之變異係數(COV) (亦即，標準偏差除以均值)小於30%或約30%，小於25%或約25%，小於20%或約20% ，小於15%或約15%，小於10%或約10%，或小於5%或約5%。
在一些實施例中，所提供之脂質粒子組合物以其多分散性指數為特徵，該指數為粒子尺寸分佈之量度，其中介於1 (最大分散)與0 (所有粒子之尺寸相同)之間的值為可能的。在一些實施例中，本文所提供之脂質粒子組合物之多分散性指數介於0.05與0.7或約0.05與約0.7之間，介於0.05與0.6或約0.05與約0.6之間，介於0.05與0.5或約0.05與約0.5之間，介於0.05與0.4或約0.05與約0.4之間，介於0.05與0.3或約0.05與約0.3之間，介於0.05與0.2或約0.05與約0.2之間，介於0.05與0.1或約0.05與約0.1之間，介於0.1與0.7或約0.1與約0.7之間，介於0.1與0.6或約0.1與約0.6之間，介於0.1與0.5或約0.1與約0.5之間，介於0.1與0.4或約0.1與約0.4之間，介於0.1與0.3或約0.1與約0.3之間，介於0.1與0.2或約0.1與約0.2之間，介於0.2與0.7或約0.2與約0.7之間，介於0.2與0.6或約0.2與約0.6之間，介於0.2與0.5或約0.2與約0.5之間，介於0.2與0.4或約0.2與約0.4之間，介於0.2與0.3或約0.2與約0.3之間，介於0.3與0.7或約0.3與約0.7之間，介於0.3與0.6或約0.3與約0.6之間，介於0.3與0.5或約0.3與約0.5之間，介於0.3與0.4或約0.3與約0.4之間，介於0.4與0.7或約0.4與約0.7之間，介於0.4與0.6或約0.4與約0.6之間，介於0.4與0.5或約0.4與約0.5之間，介於0.5與0.7或約0.5與約0.7之間，介於0.5與0.6或約0.5與約0.6之間，或者介於0.6與0.7或約0.6與約0.7之間。在一些實施例中，多分散性指數小於0.05或約0.05，小於0.1或約0.1，小於0.15或約0.15，小於0.2或約0.2，小於0.25或約0.25，小於0.3或約0.3，小於0.4或約0.4，小於0.5或約0.5，小於0.6或約0.6，或小於0.7或約0.7。各種脂質粒子為已知的，其中任一者可根據所提供之實施例產生。脂質粒子之非限制性實例包括以下國際公開PCT申請案號中所述之任一者，或含有以下國際公開PCT申請案號中所述之特徵：WO 2017/095946、WO 2017/095944、WO 2017/095940、WO 2019/157319、WO 2018/208728、WO 2019/113512、WO 2019/161281、WO 2020/102578、WO 2019/222403、WO 2020/014209、WO 2020/102485、WO 2020/102499、WO 2020/102503、WO 2013/148327、WO 2017/182585、WO 2011/058052或WO 2017/068077，各申請案以全文引用之方式併入。
所提供之脂質粒子之特徵在以下小節中描述。
A. 基於病毒之粒子
本文提供來源於病毒之基於病毒之粒子，包括來源於反轉錄病毒或慢病毒之彼等，其包含變異體NiV-F，諸如章節II中所描述，且在一些情況下亦包含所述G蛋白(例如，NiV-G)。在一些實施例中，脂質粒子之兩親性脂質雙層為或包含病毒包膜。在一些實施例中，脂質粒子之兩親性脂質雙層為或包含來源於生產細胞之脂質。在一些實施例中，病毒包膜可包含融合原，例如，對於病毒而言內源性之融合原或假型融合原。在一些實施例中，脂質粒子之內腔或空腔包含病毒核酸，例如反轉錄病毒核酸，例如慢病毒核酸。在一些實施例中，病毒核酸可為病毒基因體。在一些實施例中，脂質粒子進一步包含一或多種病毒非結構蛋白，例如，在其空腔或內腔中。在一些實施例中，基於病毒之粒子為或包含病毒樣粒子(VLP)。在一些實施例中，VLP不包含任何病毒遺傳物質。在一些實施例中，基於病毒之粒子不含任何源自病毒之核酸或病毒蛋白，諸如病毒結構蛋白。
將外源劑引入宿主細胞之生物學方法包括使用DNA及RNA載體。DNA及RNA載體亦可用於容納及遞送多核苷酸及多肽。病毒載體及病毒樣粒子以及尤其反轉錄病毒載體已成為將基因插入哺乳動物細胞(例如，人類細胞)中之最廣泛使用之方法。其他病毒載體及病毒樣粒子可來源於慢病毒、痘病毒、單純疱疹病毒I、腺病毒及腺相關病毒，及類似物。參見例如美國專利第5,350,674號及第5,585,362號。用於產生包含載體及/或外源酸之細胞的方法在此項技術中為熟知的。參見例如Sambrook等人, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York。
在一些實施例中，兩親性脂質之病毒粒子或病毒樣粒子雙層為或包含來源於受感染宿主細胞之脂質。在一些實施例中，脂質雙層為病毒包膜。在一些實施例中，病毒粒子或病毒樣粒子包膜獲自宿主細胞。在一些實施例中，病毒粒子或病毒樣粒子包膜由來自源細胞質膜之病毒衣殼獲得。在一些實施例中，脂質雙層獲自除宿主細胞之質膜以外的膜。在一些實施例中，病毒粒子或病毒樣粒子包膜脂質雙層嵌有病毒蛋白，包括病毒醣蛋白，包括變異體NiV-F。
在一些實施例中，向個體投與病毒粒子或病毒樣粒子，例如反轉錄病毒粒子或反轉錄病毒樣粒子之一或多個轉導單位。在一些實施例中，向個體每公斤投與至少1、10、100、1000、10
4、10
5、10
6、10
7、10
8、10
9、10
10、10
11、10
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13或10
14個轉導單位。在一些實施例中，向個體每個靶細胞或每毫升血液之每個靶細胞投與至少1、10、100、1000、10
4、10
5、10
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14個轉導單位。
1. 病毒載體粒子
在一些實施例中，脂質粒子為或包含病毒或病毒載體，例如反轉錄病毒或反轉錄病毒載體，例如慢病毒或慢病毒載體。在一些實施例中，病毒或病毒載體為重組的。舉例而言，病毒粒子可稱作重組病毒及/或重組病毒載體，其可互換使用。在一些實施例中，脂質粒子為重組慢病毒載體粒子。
在一些實施例中，脂質粒子包含脂質雙層，該脂質雙層包含含有包膜之反轉錄病毒載體。舉例而言，在一些實施例中，兩親性脂質雙層為或包含病毒包膜。病毒包膜可包含融合原，例如，諸如章節II中所述之變異體NiV-F，且在一些情況下亦包含諸如章節III.B中所述之G蛋白(例如，NiV-G)，該融合原對於病毒而言為內源性的或為假型融合原。在一些實施例中，病毒載體之內腔或空腔包含病毒核酸，例如反轉錄病毒核酸，例如慢病毒核酸。病毒核酸可為病毒基因體。在一些實施例中，病毒載體可進一步包含一或多種病毒非結構蛋白，例如，在其空腔或內腔中。在一些實施例中，基於病毒之載體粒子為慢病毒。在一些實施例中，慢病毒載體粒子為人類免疫缺陷病毒1 (HIV-1)。
在一些態樣中，病毒載體粒子在可包裝之多核苷酸之數目方面受限制。在一些實施例中，可修飾編碼待包裝多肽之核苷酸，使得其保留功能活性，其中編碼區中之核苷酸少於編碼野生型肽之核苷酸。此類修飾可包括截短或其他缺失。在一些實施例中，可自同一啟動子表現多於一種多肽，使得其為融合多肽。在一些實施例中，待包裝之插入物大小(亦即，病毒基因體或其部分；或所述異源多核苷酸)之長度可介於500-1000、1000-2000、2000-3000、3000-4000、4000-5000、5000-6000、6000-7000或7000-8000個核苷酸之間。在一些實施例中，插入物之長度可超過8000個核苷酸，諸如9000、10,000或11,000個核苷酸。
在一些實施例中，病毒載體粒子，諸如反轉錄病毒載體粒子，包含gag聚蛋白、聚合酶(例如，pol)、整合酶(例如，功能性或非功能性變異體)、蛋白酶及融合原中之一或多者。在一些實施例中，脂質粒子進一步包含rev。在一些實施例中，前述蛋白質中之一或多者編碼於反轉錄病毒基因體中(亦即，如上文所述之插入物)，且在一些實施例中，前述蛋白質中之一或多者反式提供，例如，由輔助細胞、輔助病毒或輔助質體提供。在一些實施例中，脂質粒子核酸(例如，反轉錄病毒核酸)包含以下核酸序列中之一或多者：5' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3結構域)、Psi包裝元件(Psi)、操作性地連接至有效負荷基因之中央聚嘌呤束(cPPT)啟動子、有效負荷基因(視情況在開放閱讀框之前包含內含子)、聚A尾序列、WPRE及3' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3)。在一些實施例中，脂質粒子核酸進一步包含反轉錄病毒順式作用RNA包裝元件及cPPT/CTS元件。在一些實施例中，脂質粒子核酸進一步包含一或多個絕緣子元件。在一些實施例中，識別位點位於聚A尾序列與WPRE之間。
在一些實施例中，脂質粒子包含由自組裝成衣殼之病毒蛋白形成之超分子復合物。在一些實施例中，脂質粒子為來源於病毒衣殼之病毒粒子。在一些實施例中，脂質粒子為來源於病毒核衣殼之病毒粒子。在一些實施例中，脂質粒子包含源自核衣殼之粒子，其保留包裝核酸之特性。
在一些實施例中，脂質粒子在表現過程中包裝來自攜帶一或多種病毒核酸(例如，反轉錄病毒核酸)之宿主細胞的核酸。在一些實施例中，核酸不編碼涉及於病毒複製之任何基因。在特定實施例中，脂質粒子為基於病毒之粒子，例如反轉錄病毒粒子，諸如慢病毒粒子，其為複製缺陷的。
在一些情況下，脂質粒子為在形態上無法與野生型感染性病毒區分之病毒粒子。在一些實施例中，病毒粒子呈現整個病毒蛋白質體作為抗原。在一些實施例中，病毒粒子僅呈現蛋白質體之一部分作為抗原。
在一些實施例中，反轉錄病毒核酸包含以下一或多者(例如，全部)：5'啟動子(例如，以控制整個包裝之RNA之表現)、5' LTR (例如，包括R (聚腺苷酸化尾信號)及/或包括引子活化信號之U5)、引子結合位點、psi包裝信號、用於核輸出之RRE元件、控制轉殖基因表現之直接在轉殖基因上游之啟動子、轉殖基因(或其他外源劑元件)、聚嘌呤束及3' LTR (例如，包括突變之U3、R及U5)。在一些實施例中，反轉錄病毒核酸進一步包含cPPT、WPRE及/或絕緣子元件中之一或多者。
反轉錄病毒典型地藉由將其基因體RNA反轉錄成線性雙股DNA複本且隨後將其基因體DNA共價整合至宿主基因體中來複製。適用於特定實施例中之說明性反轉錄病毒包括但不限於：莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，M-MuLV)、莫洛尼鼠類肉瘤病毒(Moloney murine sarcoma virus，MoMSV)、哈維鼠類肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus，HaMuSV)、鼠類乳腺腫瘤病毒(MuMTV)、長臂猿白血病病毒(GaLV)、貓白血病病毒(FLV)、泡沫病毒、弗里德鼠類白血病病毒(Friend murine leukemia virus)、鼠類幹細胞病毒(MSCV)及勞斯肉瘤病毒(RSV)及慢病毒。
在一些實施例中，反轉錄病毒為γ反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為ε反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為α反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為β反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為δ反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為慢病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為泡沫反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒為內源反轉錄病毒。
說明性慢病毒包括但不限於：HIV (人類免疫缺陷病毒；包括1型HIV及2型HIV)；維斯納-梅迪病毒(visna-maedi virus，VMV)；山羊關節炎-腦炎病毒(CAEV)；馬感染性貧血病毒(EIAV)；貓免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。在一些實施例中，使用基於HIV之載體骨架(亦即，HIV順式作用序列元件)。
病毒載體可包含核酸分子(例如，轉移質體)，該核酸分子包括源自病毒之核酸元件，該等核酸元件典型地有助於核酸分子(例如，包括編碼外源劑之核酸)轉移或整合至細胞基因體中或轉移或整合至介導核酸轉移之病毒粒子。病毒載體粒子典型地將包括各種病毒組分且有時亦包括除核酸以外之宿主細胞組分。病毒載體可包含能夠將核酸(例如，編碼外源劑之核酸)轉移至細胞中或轉移至經轉移之核酸(例如，呈裸DNA形式)之病毒或病毒粒子。病毒載體及轉移質體可包含主要來源於病毒之結構及/或功能遺傳元件。反轉錄病毒載體可包含含有主要來源於反轉錄病毒之結構及功能遺傳元件或其部分之病毒載體或質體。慢病毒載體可包含含有主要來源於慢病毒之結構及功能遺傳元件或其部分(包括LTR)之病毒載體或質體。
在實施例中，慢病毒載體(例如，慢病毒表現載體)可包含慢病毒轉移質體(例如，呈裸DNA形式)或感染性慢病毒粒子。關於諸如選殖位點、啟動子、調控元件、異源核酸等之元件，應理解，此等元件之序列可呈RNA形式存在於慢病毒粒子中且可呈DNA形式存在於DNA質體中。
在本文所述之一些載體中，與相應野生型病毒相比，有助於複製或為複製所必需之一或多個蛋白質編碼區之至少一部分可不存在。此使得病毒載體為複製缺陷的。在一些實施例中，載體能夠轉導靶非分裂宿主細胞及/或將其基因體整合至宿主基因體中。
野生型反轉錄病毒基因體之結構通常包含5'長末端重複(LTR)及3' LTR，位於其之間或其內有使得基因體能夠包裝之包裝信號、引子結合位點、使得能夠整合至宿主細胞基因體中之整合位點，及編碼促進病毒粒子組裝之包裝組分之gag、pol及env基因。更複雜之反轉錄病毒具有額外特徵，諸如HIV中之rev及RRE序列，其使得整合原病毒之RNA轉錄物自細胞核有效輸出至受感染靶細胞之細胞質。在原病毒中，病毒基因之兩個末端側接有稱為長末端重複(LTR)之區域。LTR涉及於原病毒整合及轉錄。LTR亦用作增強子-啟動子序列且可控制病毒基因之表現。反轉錄病毒RNA藉助位於病毒基因體5'末端之psi序列進行包殼。
LTR自身典型地為相似(例如，一致)之序列，其可分成三種元件，稱為U3、R及U5。U3來源於RNA之3'末端獨有之序列。R來源於在RNA之兩個末端重複之序列，且U5來源於RNA之5'末端獨有之序列。在不同反轉錄病毒當中，三種元件之大小可顯著不同。
對於病毒基因體，轉錄起始位點典型地處於一個LTR中U3與R之間的邊界，且聚(A)添加(終止)位點處於另一個LTR中R與U5之間的邊界。U3含有原病毒之大部分轉錄控制元件，其包括對細胞及在一些情形下病毒轉錄活化蛋白有反應之啟動子及多個增強子序列。一些反轉錄病毒包含編碼涉及於基因表現調控之蛋白質之以下基因中之任一者或多者：tot、rev、tax及rex。關於結構基因gag、pol及env自身，gag編碼病毒之內部結構蛋白。Gag蛋白以蛋白水解方式處理成成熟蛋白質MA (基質)、CA (衣殼)及NC (核衣殼)。pol基因編碼反轉錄酶(RT)，其含有介導基因體複製之DNA聚合酶、相關RNase H及整合酶(IN)。env基因編碼病毒體之表面(SU)醣蛋白及跨膜(TM)蛋白，其形成與細胞受體蛋白特異性相互作用之複合物。此相互作用會促進感染，例如，藉由病毒膜與細胞膜之融合。
在複製缺陷性反轉錄病毒載體基因體中，gag、pol及env可能不存在或無功能。RNA之兩個末端之R區域典型地為重複序列。U5及U3分別代表RNA基因體之5'末端及3'末端之獨特序列。
反轉錄病毒亦可含有編碼除gag、pol及env以外之蛋白質之額外基因。額外基因之實例包括(在HIV中) vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev及nef中之一或多者。EIAV具有(尤其)額外基因S2。由額外基因編碼之蛋白質具有各種功能，其中一些功能可能與細胞蛋白質所提供之功能重複。舉例而言，在EIAV中，tat充當病毒LTR之轉錄活化子(Derse及Newbold 1993 Virology 194:530-6；Maury等人 1994 Virology 200:632-42)。其結合至稱作TAR之穩定莖環RNA二級結構。Rev經由rev反應元件(RRE)調控及協調病毒基因之表現(Martarano等人 1994 J. Virol. 68:3102-11)。據信此兩種蛋白質之作用機制與靈長類動物病毒中之類似機制廣泛相似。另外，已鑑定EIAV蛋白Ttm，其由 tat之第一個外顯子編碼，該外顯子在跨膜蛋白之起始處剪接至env編碼序列。
除蛋白酶、反轉錄酶及整合酶以外，非靈長類動物慢病毒亦含有第四種pol基因產物，其編碼dUTPase。該基因產物可在此等慢病毒感染某些非分裂或緩慢分裂細胞類型之能力中起作用。
在實施例中，重組慢病毒載體(RLV)為具有足以允許在包裝組分存在下將RNA基因體包裝至能夠感染靶細胞之病毒粒子中之反轉錄病毒遺傳資訊的載體。靶細胞之感染可包括反轉錄並整合至靶細胞基因體中。RLV典型地攜帶欲由載體遞送至靶細胞之非病毒編碼序列，諸如編碼如本文所述之外源劑之核酸。在實施例中，RLV不能獨立複製以在靶細胞內產生感染性反轉錄病毒粒子。通常，RLV缺乏功能性gag-pol及/或env基因及/或涉及於複製之其他基因。載體可配置為分裂內含子載體，例如，如PCT專利申請案WO 99/15683中所述，該專利申請案以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，慢病毒載體包含最小病毒基因體，例如，病毒載體已經操縱以移除非必需元件且保留必需元件，以提供將所關注之核苷酸序列感染、轉導及遞送至靶宿主細胞所需之功能性，例如，如WO 98/17815中所述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
最小慢病毒基因體可包含例如(5')R-U5-一或多個第一核苷酸序列-U3-R(3')。然而，用於在源細胞內產生慢病毒基因體之質體載體亦可包括可操作連接至慢病毒基因體之轉錄調控控制序列以引導基因體在源細胞中之轉錄。此等調控序列可包含與所轉錄之反轉錄病毒序列相關之天然序列，例如5' U3區，或其可包含異源啟動子，諸如另一病毒啟動子，例如CMV啟動子。一些慢病毒基因體包含促進有效病毒產生之額外序列。舉例而言，在HIV之情況下，可包括rev及RRE序列。替代地或組合地，可使用密碼子最佳化，例如，編碼外源劑之基因可為密碼子最佳化的，例如，如WO 01/79518中所述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。亦可使用執行與rev/RRE系統相似或相同功能之替代序列。舉例而言，在梅森輝瑞猴病毒(Mason Pfizer monkey virus)中發現rev/RRE系統之功能類似物。此稱為CTE且在基因體中包含RRE型序列，據信該序列與受感染細胞中之因子相互作用。細胞因子可視為rev類似物。因此，CTE可用作rev/RRE系統之替代物。另外，HTLV-I之Rex蛋白可在功能上替代HIV-I之Rev蛋白。Rev及Rex與IRE-BP具有類似作用。
在一些實施例中，反轉錄病毒核酸(例如慢病毒核酸，例如靈長類動物或非靈長類動物慢病毒核酸) (1)包含缺失之gag基因，其中gag中之缺失移除gag編碼序列之約核苷酸350或354下游之一或多個核苷酸；(2)具有反轉錄病毒核酸中缺少之一或多個輔助基因；(3)缺乏tat基因但包括5' LTR之末端與gag之ATG之間的前導序列；及(4) (1)、(2)及(3)之組合。在一個實施例中，慢病毒載體包含所有特徵(1)及(2)及(3)。此策略在WO 99/32646中更詳細地描述，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，靈長類動物慢病毒最小系統不需要HIV/SIV額外基因vif、vpr、vpx、vpu、tat、rev及nef用於載體產生或用於分裂細胞及非分裂細胞之轉導。在一些實施例中，EIAV最小載體系統不需要S2用於載體產生或用於分裂細胞及非分裂細胞之轉導。
額外基因之缺失可允許產生不含與慢病毒(例如，HIV)感染疾病相關之基因的載體。特別地，tat與疾病相關。其次，額外基因之缺失允許載體包裝更多異源DNA。第三，可刪除功能未知之基因，諸如S2，由此降低引起不良影響之風險。最小慢病毒載體之實例在WO 99/32646及WO 98/17815中揭示。
在一些實施例中，反轉錄病毒核酸至少不含tat及S2 (若其為EIAV載體系統)，且可能亦不含vif、vpr、vpx、vpu及nef。在一些實施例中，反轉錄病毒核酸亦不含rev、RRE或兩者。
在一些實施例中，反轉錄病毒核酸包含vpx。Vpx多肽結合至SAMHD1限制因子並誘導其降解，從而降解細胞質中之游離dNTP。因此，隨著Vpx降解SAMHD1且反轉錄活性增加，細胞質中游離dNTP之濃度增加，由此促進反轉錄病毒基因體之反轉錄及整合至靶細胞基因體中。
不同細胞對特定密碼子之使用不同。此密碼子偏倚對應於細胞類型中特定tRNA相對豐度之偏倚。藉由改變序列中之密碼子以使其適於與相應tRNA之相對豐度相匹配，有可能增加表現。出於同樣原因，有可能藉由有意選擇已知在特定細胞類型中罕見之相應tRNA之密碼子來降低表現。因此，可獲得額外程度之轉譯控制。密碼子最佳化之額外描述見於例如WO 99/41397中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
許多病毒，包括HIV及其他慢病毒，使用大量罕用密碼子，且藉由改變此等密碼子以對應於常用之哺乳動物密碼子，可達成包裝組分在哺乳動物生產細胞中之表現增加。
在一些實施例中，密碼子最佳化具有許多其他優點。在一些實施例中，由於序列改變，編碼包裝組分之核苷酸序列可具有自其中減少或消除之RNA不穩定性序列(INS)。同時，包裝組分之胺基酸序列編碼序列得以保留，使得由序列編碼之病毒組分保持相同，或至少足夠相似，使得包裝組分之功能不受損。在一些實施例中，密碼子最佳化亦克服Rev/RRE對輸出之要求，促使最佳化之序列與Rev無關。在一些實施例中，密碼子最佳化亦減少載體系統內不同構築體之間(例如，gag-pol與env開放閱讀框中之重疊區域之間)的同源重組。在一些實施例中，密碼子最佳化使得病毒效價增加及/或安全性改良。
在一些實施例中，僅與INS相關之密碼子為密碼子最佳化的。在其他實施例中，除包含gag-pol之框移位點之序列之外，序列整體為密碼子最佳化的。
gag-pol基因包含編碼gag-pol蛋白之兩個重疊閱讀框。兩種蛋白質之表現均取決於轉譯期間之框移。此種框移為轉譯期間核糖體「滑移」之結果。據信此種滑移至少部分由核糖體停滯之RNA二級結構引起。此類二級結構存在於gag-pol基因中之框移位點下游。對於HIV，重疊區域自gag起點(其中核苷酸(nt) 1為gag ATG之A)下游之核苷酸1222延伸至gag之末端(nt 1503)。因此，跨越框移位點及兩個閱讀框之重疊區域的281 bp片段較佳不為密碼子最佳化的。在一些實施例中，保留此片段將能夠更有效地表現gag-pol蛋白。對於EIAV，重疊起點為nt 1262 (其中核苷酸1為gag ATG之A)。重疊終點為nt 1461。為確保框移位點及gag-pol重疊得以保留，野生型序列可保留nt 1156至1465。
在一些實施例中，可自最佳密碼子使用進行推導，例如，以適應便利之限制性位點，且可將保守胺基酸變化引入gag-pol蛋白中。
在一些實施例中，密碼子最佳化係基於哺乳動物系統中密碼子使用率低之密碼子。可改變第三鹼基且有時改變第二及第三鹼基。
在一些實施例中，由於遺傳密碼之簡併性質，應了解，技術人員可獲得許多gag-pol序列。此外，描述許多反轉錄病毒變異體，其可用作產生密碼子最佳化之gag-pol序列的起點。慢病毒基因體可能變化相當大。舉例而言，存在許多仍具有功能之HIV-I準種。EIAV同樣如此。此等變異體可用於增強轉導過程之特定部分。可在洛斯阿拉莫斯國家實驗室(Los Alamos National Laboratory)維護之HIV數據庫中找到HIV-I變異體之實例。可在國家衛生研究院(National Institutes of Health)維護之NCBI數據庫中找到EIAV選殖之細節。
根據經驗確定病毒序列之適當密碼子最佳化在技術人員之水準內。可針對任何反轉錄病毒，例如EIAV、FIV、BIV、CAEV、VMR、SIV、HIV-I及HIV-2使用密碼子最佳化序列(包括gag-pol序列)之策略。另外，此方法可用於增加來自HTLV-I、HTLV-2、HFV、HSRV及人類內源性反轉錄病毒(HERV)、MLV及其他反轉錄病毒之基因的表現。
在實施例中，反轉錄病毒載體包含包裝信號，其包含載體中仍保留env序列之gag的255至360個核苷酸，或剪接供體突變、gag及env缺失之特定組合中之gag的約40個核苷酸。在一些實施例中，反轉錄病毒載體包括包含一或多個缺失之gag序列，例如，gag序列包含約360個可來源於N端之核苷酸。
在一些實施例中，反轉錄病毒載體、輔助細胞、輔助病毒或輔助質體可包含反轉錄病毒結構蛋白及輔助蛋白，例如，gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef蛋白或其他反轉錄病毒蛋白。在一些實施例中，反轉錄病毒蛋白來源於相同反轉錄病毒。在一些實施例中，反轉錄病毒蛋白來源於多於一種反轉錄病毒，例如，2、3、4種或更多種反轉錄病毒。
在一些實施例中，gag及pol編碼序列一般組織為原生慢病毒中之Gag-Pol前驅體。gag序列編碼55-kD Gag前驅體蛋白，亦稱為p55。p55在成熟過程中由病毒編碼之蛋白酶(pol基因之產物)裂解成四種較小蛋白質，指定為MA (基質[p17])、CA (衣殼[p24])、NC (核衣殼[p9])及p6。pol前驅體蛋白由病毒編碼之蛋白酶自Gag裂解，且進一步消化以分離蛋白酶(p10)、RT (p50)、RNase H (p15)及整合酶(p31)活性。
在一些實施例中，慢病毒載體為整合缺陷的。在一些實施例中，pol為整合酶缺陷的，諸如由於整合酶基因中之突變而編碼。舉例而言，pol編碼序列可含有整合酶中之失活突變，諸如藉由涉及於催化活性之一或多個胺基酸之突變，亦即，天冬胺酸64、天冬胺酸116及/或麩胺酸152中之一或多者之突變。在一些實施例中，整合酶突變為D64V突變。在一些實施例中，整合酶中之突變允許將病毒RNA包裝至慢病毒中。在一些實施例中，整合酶中之突變允許將病毒蛋白包裝至慢病毒中。在一些實施例中，整合酶中之突變降低插入誘變之可能性。在一些實施例中，整合酶中之突變降低產生有復制能力之重組體(RCR)的可能性(Wanisch等人 2009. Mol Ther. 1798:1316-1332)。在一些實施例中，原生Gag-Pol序列可用於輔助載體(例如，輔助質體或輔助病毒)中，或可進行修飾。此等修飾包括嵌合Gag-Pol，其中Gag及Pol序列獲自不同病毒(例如，不同種類、亞種、毒株、分枝等)，及/或其中序列已經修飾以改良轉錄及/或轉譯，及/或減少重組。
在一些實施例中，反轉錄病毒核酸包括編碼gag蛋白之150-250個(例如，168個)核苷酸部分之多核苷酸，其(i)包括突變之INS1抑制序列，該序列相對於野生型INS1減少RNA核輸出之限制，(ii)含有引起框移及過早終止之兩個核苷酸插入，及/或(iii)不包括gag之INS2、INS3及INS4抑制序列。
在一些實施例中，本文所述之載體為包含反轉錄病毒(例如，慢病毒)序列及非慢病毒序列兩者之雜交載體。在一些實施例中，雜交載體包含用於反轉錄、複製、整合及/或包裝之反轉錄病毒(例如，慢病毒)序列。
根據某些特定實施例，大部分或所有病毒載體骨架序列來源於慢病毒，例如，HIV-l。然而，應理解，可使用或組合許多不同來源之反轉錄病毒及/或慢病毒序列，且可在不損害轉移載體執行本文所述功能之能力的情況下適應某些慢病毒序列中之眾多取代及改變。多種慢病毒載體描述於Naldini等人, (l996a、l996b及1998)；Zufferey等人, (1997)；Dull等人, 1998；美國專利第6,013,516號及第5,994,136號中，其中許多載體可適於產生反轉錄病毒核酸。
在原病毒之每一端，典型地發現長末端重複(LTR)。LTR典型地包含位於反轉錄病毒核酸之末端的結構域，在其天然序列背景下，該結構域為正向重複且含有U3、R及U5區域。LTR一般促進反轉錄病毒基因之表現(例如，基因轉錄物之促進、起始及聚腺苷酸化)及病毒複製。LTR可包含眾多調控信號，包括轉錄控制元件、聚腺苷酸化信號及用於病毒基因體複製及整合之序列。病毒LTR典型地分為三個區域，稱為U3、R及U5。U3區域典型地含有增強子及啟動子元件。U5區域典型地為引子結合位點與R區域之間的序列且可含有聚腺苷酸化序列。R (重複)區域可側接有U3及U5區域。LTR典型地由U3、R及U5區域組成且可出現於病毒基因體之5'及3'末端。在一些實施例中，與5' LTR相鄰的為用於基因體反轉錄之序列(tRNA引子結合位點)及用於將病毒RNA有效包裝至粒子中之序列(Psi位點)。
在一些實施例中，包裝信號可包含位於反轉錄病毒基因體內之序列，其介導病毒RNA插入病毒衣殼或粒子中，參見例如Clever等人, 1995. J. of Virology, 第69卷, 第4號; 第2101-2109頁。若干反轉錄病毒載體使用最小包裝信號(psi [Y]序列)用於病毒基因體之包殼。
在各種實施例中，反轉錄病毒核酸包含經修飾之5' LTR及/或3' LTR。LTR中之任一者或兩者可包含一或多個修飾，包括但不限於一或多個缺失、插入或取代。通常對3' LTR進行修飾以改良慢病毒或反轉錄病毒系統之安全性，此係藉由促使病毒具有複製缺陷，例如，病毒不能完全有效地複製，從而不會產生感染性病毒體(例如，複製缺陷慢病毒子代)。
在一些實施例中，載體為自失活(SIN)載體，例如復制缺陷載體，例如反轉錄病毒或慢病毒載體，其中右(3') LTR增強子-啟動子區域，稱為U3區域，已經修飾(例如，藉由缺失或取代)以防止病毒轉錄超過第一輪病毒複製。在一些態樣中，本文提供一種無復制能力(本文中亦稱作複製缺陷)之載體粒子，其在不存在包裝細胞之情況下不能參與復制(亦即，病毒載體粒子不自轉導之細胞產生)。在一些態樣中，此係因為右(3') LTR U3區域可在病毒複製期間用作左(5') LTR U3區域之模板，且因此U3增強子-啟動子之缺乏會抑制病毒複製。在實施例中，3' LTR經修飾以移除、改變或置換U5區域，例如，用外源聚(A)序列置換。3' LTR、5' LTR或3'及5' LTR兩者可為經修飾之LTR。對病毒載體，亦即反轉錄病毒或慢病毒載體進行其他修飾以促使該載體無複製能力在此項技術中為已知的。
在一些實施例中，5' LTR之U3區域經異源啟動子置換以在病毒粒子產生期間驅動病毒基因體之轉錄。可使用之異源啟動子之實例包括例如病毒性猿猴病毒40 (SV40) (例如，早期或晚期)、巨細胞病毒(CMV) (例如，即刻早期)、莫洛尼鼠類白血病病毒(MoMLV)、勞斯肉瘤病毒(RSV)及單純疱疹病毒(HSV) (胸苷激酶)啟動子。在一些實施例中，啟動子能夠以不依賴於Tat之方式驅動高水準之轉錄。在某些實施例中，異源啟動子對控制病毒基因體轉錄之方式具有額外優勢。舉例而言，異源啟動子可為可誘導的，使得全部或部分病毒基因體之轉錄僅在誘導因子存在時發生。誘導因子包括但不限於一或多種化合物或培養宿主細胞之生理條件，諸如溫度或pH。
在一些實施例中，病毒載體包含TAR (反式活化反應)元件，例如，位於慢病毒(例如，HIV) LTR之R區域中。此元件與慢病毒反式活化子(tat)遺傳元件相互作用以增強病毒複製。然而，此元件並非必需的，例如，在其中5' LTR之U3區域由異源啟動子置換之實施例中。
R區域，例如在反轉錄病毒LTR內在封端基團起點(亦即，轉錄起點)開始且緊接在聚A束起點之前結束之區域，可側接有U3及U5區域。R區域在新生DNA自基因體之一個末端轉移至另一個末端之反轉錄期間起作用。
反轉錄病毒核酸亦可包含FLAP元件，例如，其序列包括反轉錄病毒(例如，HIV-l或HIV-2)之中央聚嘌呤束及中央終止序列(cPPT及CTS)的核酸。適合之FLAP元件描述於美國專利第6,682,907號及Zennou等人, 2000, Cell, 101:173中，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。在HIV-l反轉錄期間，正股DNA在中央聚嘌呤束(cPPT)處之中央起始及在中央終止序列(CTS)處之中央終止可形成三股DNA結構：HIV-l中央DNA瓣。在一些實施例中，反轉錄病毒或慢病毒載體骨架包含編碼外源劑之基因上游或下游之一或多個FLAP元件。舉例而言，在一些實施例中，轉移質體包括FLAP元件，例如，來源於或分離自HIV-L之FLAP元件。
在實施例中，反轉錄病毒或慢病毒核酸包含一或多個輸出元件，例如，順式作用轉錄後調控元件，其調控RNA轉錄物自細胞核至細胞質之轉運。RNA輸出元件之實例包括但不限於人類免疫缺陷病毒(HIV) rev反應元件(RRE) (參見例如Cullen等人, 1991. J. Virol. 65: 1053；及Cullen等人, 1991. Cell 58: 423)及B型肝炎病毒轉錄後調控元件(HPRE)，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。一般而言，RNA輸出元件置於基因之3' UTR內且可作為一或多個複本插入。
在一些實施例中，藉由將轉錄後調控元件、聚腺苷酸化位點及轉錄終止信號中之一或多者(例如，全部)摻入載體中來增加病毒載體中之異源序列(例如，編碼外源劑之核酸)的表現。多種轉錄後調控元件可增加異源核酸在蛋白質上之表現，例如，土撥鼠肝炎病毒轉錄後調控元件(WPRE；Zufferey等人, 1999, J. Virol., 73:2886)；存在於B型肝炎病毒(HPRE)中之轉錄後調控元件(Huang等人, Mol. Cell. Biol., 5:3864)；及類似元件(Liu等人, 1995, Genes Dev., 9:1766)，各文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，本文所述之反轉錄病毒核酸包含轉錄後調控元件，諸如WPRE或HPRE。
在一些實施例中，本文所述之反轉錄病毒核酸缺乏或不包含轉錄後調控元件，諸如WPRE或HPRE。
可包括引導異源核酸轉錄物之終止及聚腺苷酸化之元件，例如，以增加外源劑之表現。轉錄終止信號可在聚腺苷酸化信號之下游發現。在一些實施例中，載體包含編碼外源劑之多核苷酸3'之聚腺苷酸化序列。聚A位點可包含引導RNA聚合酶II對新生RNA轉錄物之終止及聚腺苷酸化的DNA序列。聚腺苷酸化序列可藉由在編碼序列之3'末端添加聚A尾來促進mRNA之穩定性，且因此有助於提高轉譯效率。可用於反轉錄病毒核酸中之聚A信號之說明性實例包括AATAAA、ATT AAA、AGTAAA、牛生長激素聚A序列(BGHpA)、兔b-球蛋白聚A序列(rPgpA)或另一種適合之異源或內源聚A序列。
在一些實施例中，反轉錄病毒或慢病毒載體進一步包含一或多個絕緣子元件，例如，本文所述之絕緣子元件。
在各種實施例中，載體包含可操作連接至編碼外源劑之多核苷酸之啟動子。載體可具有一或多個LTR，其中任一個LTR包含一或多個修飾，諸如一或多個核苷酸取代、添加或缺失。載體可進一步包含一或多個增加轉導效率之輔助元件(例如，cPPT/FLAP)、病毒包裝(例如，Psi (Y)包裝信號、RRE)及/或增加外源基因表現之其他元件(例如，聚(A)序列)，且可視情況包含WPRE或HPRE。
在一些實施例中，慢病毒核酸包含以下一或多者(例如，全部)，例如自5'至3'：啟動子(例如，CMV)、R序列(例如，包含TAR)、U5序列(例如，用於整合)、PBS序列(例如，用於反轉錄)、DIS序列(例如，用於基因體二聚化)、psi包裝信號、部分gag序列、RRE序列(例如，用於核輸出)、cPPT序列(例如，用於核輸入)、驅動外源劑表現之啟動子、編碼外源劑之基因、WPRE序列(例如，用於有效轉殖基因表現)、PPT序列(例如，用於反轉錄)、R序列(例如，用於聚腺苷酸化及終止)及U5信號(例如，用於整合)。
2. 病毒樣粒子
在一些實施例中，基於病毒之粒子為來源於病毒之病毒樣脂質粒子(VLP)。在一些實施例中，病毒包膜可包含融合原，例如對於病毒而言內源性之融合原或假型融合原，例如章節II中所述之變異體NiV-F，且在一些情況下亦包含G蛋白(例如，NiV-G)，諸如以下章節III.B中所述。VLP包括來源於反轉錄病毒或慢病毒之彼等。儘管VLP模擬原生病毒體結構，但其缺乏在宿主細胞內獨立復制所必需之病毒基因體資訊。因此，在一些態樣中，VLP為非感染性的。在特定實施例中，VLP不含病毒基因體。在一些實施例中，VLP之兩親性脂質雙層為或包含病毒包膜。在一些實施例中，脂質粒子之兩親性脂質雙層為或包含來源於細胞之脂質。在一些實施例中，VLP含有至少一種類型之來自病毒之結構蛋白。在大多數情況下，此蛋白質將形成蛋白質衣殼。在一些情況下，衣殼亦將包裹於脂質雙層中，該脂質雙層源於已釋放組裝之VLP (例如，包含人類免疫缺陷病毒結構蛋白，諸如GAG之VLP)的細胞。在一些實施例中，VLP進一步包含靶向部分作為脂質雙層內之包膜蛋白。
在一些實施例中，載體媒劑粒子包含由自組裝成衣殼之病毒蛋白形成之超分子復合物。在一些實施例中，載體媒劑粒子為來源於病毒衣殼蛋白之病毒樣粒子。在一些實施例中，載體媒劑粒子為來源於病毒核衣殼蛋白之病毒樣粒子。在一些實施例中，載體媒劑粒子包含源自核衣殼之蛋白，其保留包裝核酸之特性。在一些實施例中，基於病毒之粒子，諸如病毒樣粒子，僅包含來自病毒基因體之蛋白質當中之病毒結構醣蛋白。在一些實施例中，載體媒劑粒子不含病毒基因體。
在一些實施例中，載體媒劑粒子在表現過程中包裝來自宿主細胞之核酸，諸如編碼外源劑之核酸。在一些實施例中，核酸不編碼涉及於病毒複製之任何基因。在特定實施例中，載體媒劑粒子為複製缺陷之病毒樣粒子，例如反轉錄病毒樣粒子，諸如慢病毒樣粒子。
在一些實施例中，載體媒劑粒子為病毒樣粒子，其包含不含或缺乏病毒RNA之序列，此可能為自序列中移除或消除病毒RNA之結果。在一些實施例中，此可藉由使用gag上之內源包裝信號結合位點來達成。在一些實施例中，內源包裝信號結合位點在pol上。在一些實施例中，待遞送之RNA將含有同源包裝信號。在一些實施例中，位於待遞送之RNA上之異源結合結構域(其與gag異源)及位於gag或pol上之同源結合位點可用於確保待遞送之RNA的包裝。在一些實施例中，異源序列可為非病毒的或其可為病毒的，在此種情況下其可來源於不同病毒。在一些實施例中，載體粒子可用於遞送治療性RNA，在此種情況下不需要功能性整合酶及/或反轉錄酶。在一些實施例中，載體粒子亦可用於遞送所關注之治療基因，在此種情況下典型地包括pol。
在一些實施例中，VLP包含由自組裝成衣殼之病毒蛋白形成之超分子復合物。在一些實施例中，VLP來源於病毒衣殼。在一些實施例中，VLP來源於病毒核衣殼。在一些實施例中，VLP源自核衣殼且保留包裝核酸之特性。在一些實施例中，VLP僅包括病毒結構醣蛋白。在一些實施例中，VLP不含病毒基因體。
3. 產生基於病毒之粒子的方法
大規模病毒粒子產生通常可用於達成所需病毒效價。可藉由將轉移載體轉染至包含病毒結構及/或輔助基因之包裝細胞株中來產生病毒粒子，該等基因為例如gag、pol、env、tat、rev、vif、vpr、vpu、vpx或nef基因或其他反轉錄病毒基因。
在一些實施例中，可在多種細胞培養系統中產生病毒載體粒子，該等系統包括細菌、哺乳動物細胞株、昆蟲細胞株、酵母及植物細胞。描述用於產生病毒載體粒子之示例性方法。
在一些實施例中，用於產生病毒載體，亦即重組病毒載體，諸如無復制能力之慢病毒載體的元件包含於包裝細胞株中或存在於包裝載體上。在一些實施例中，病毒載體可包括經由一或多種包裝載體遞送至包裝細胞株之包裝元件rev、gag及pol。
在實施例中，包裝載體為表現載體或病毒載體，其缺乏包裝信號且包含編碼一個、兩個、三個、四個或更多個病毒結構及/或輔助基因之多核苷酸。典型地，包裝載體包含於包裝細胞中，且經由轉染、轉導或感染引入細胞中。可經由轉染、轉導或感染將反轉錄病毒(例如，慢病毒)轉移載體引入包裝細胞株中，以產生源細胞或細胞株。可藉由標準方法將包裝載體引入人類細胞或細胞株中，該等方法包括例如磷酸鈣轉染、脂轉染或電穿孔。在一些實施例中，將包裝載體與顯性可選擇標誌一起引入細胞中，該可選擇標誌為諸如新黴素(neomycin)、潮黴素(hygromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、殺稻瘟菌素(blastocidin)、吉歐黴素(zeocin)、胸苷激酶、DHFR、Gln合成酶或ADA，繼而在適當藥物存在下進行選擇且分離殖株。可選擇標誌基因可物理連接至由包裝載體，例如由IRES或自裂解病毒肽編碼之基因。在一些實施例中，包裝載體為包裝質體。
生產細胞株(亦稱為包裝細胞株)包括不含包裝信號，但穩定或瞬時表現病毒結構蛋白及可包裝病毒粒子之複製酶(例如，gag、pol及env)的細胞株。可採用任何適合之細胞株，例如哺乳動物細胞，例如人類細胞。可使用之適合細胞株包括例如CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211 A細胞。在實施例中，包裝細胞為293細胞、293T細胞或A549細胞。
在一些實施例中，生產細胞(亦即，源細胞株)包括能夠產生重組反轉錄病毒粒子之細胞株，其包含包裝細胞株及包含包裝信號之轉移載體構築體。製備病毒儲備溶液之方法由例如Y. Soneoka等人 (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633及N. R. Landau等人 (1992) J. Virol. 66:5110-5113說明，該等文獻以引用之方式併入本文中。可例如藉由細胞溶解或收集細胞培養物之上清液，自包裝細胞中收集感染性病毒粒子。視情況，可富集或純化收集之病毒粒子。
在一些實施例中，源細胞包含一或多種編碼病毒結構蛋白及復制酶(例如，gag、pol及env)之質體，其可包裝病毒粒子(亦即，包裝質體)。在一些實施例中，編碼gag、pol及env前驅體中之至少兩者之序列在同一質體上。在一些實施例中，編碼gag、pol及env前驅體之序列在不同質體上。在一些實施例中，編碼gag、pol及env前驅體之序列具有相同表現信號，例如，啟動子。在一些實施例中，編碼gag、pol及env前驅體之序列具有不同表現信號，例如，不同啟動子。在一些實施例中，gag、pol及env前驅體之表現為可誘導的。在一些實施例中，在相同時間或不同時間轉染編碼病毒結構蛋白及復制酶之質體。在一些實施例中，在與包裝載體相同之時間或不同之時間轉染編碼病毒結構蛋白及復制酶之質體。
在一些實施例中，源細胞株包含一或多種穩定整合之病毒結構基因。在一些實施例中，穩定整合之病毒結構基因之表現為可誘導的。
在一些實施例中，在轉錄水準上調控病毒結構基因之表現。在一些實施例中，在轉譯水準上調控病毒結構基因之表現。在一些實施例中，在轉譯後水準上調控病毒結構基因之表現。
在一些實施例中，由四環素(Tet)依賴性系統調控病毒結構基因之表現，其中Tet調控之轉錄抑制子(Tet-R)結合至啟動子中包含之DNA序列且藉由空間位阻抑制轉錄(Yao等人, 1998；Jones等人, 2005)。添加多西環素(dox)後，釋放Tet-R，從而允許轉錄。多種其他適合之轉錄調控啟動子、轉錄因子及小分子誘導劑適用於調控病毒結構基因之轉錄。
在一些實施例中，將第三代慢病毒組分、人類免疫缺陷病毒1型(HIV) Rev、Gag/Pol及在Tet調控之啟動子控制下且與抗生素抗性卡匣偶合之包膜獨立地整合至源細胞基因體中。在一些實施例中，源細胞僅具有整合至基因體中之Rev、Gag/Pol及包膜蛋白中之每一者的一個複本。
在一些實施例中，亦將編碼外源劑之核酸(例如，編碼外源劑之反轉錄病毒核酸)整合至源細胞基因體中。在一些實施例中，編碼外源劑之核酸保持游離。在一些實施例中，將編碼外源劑之核酸轉染至在基因體中具有穩定整合之Rev、Gag/Pol及包膜蛋白之源細胞中。參見例如Milani等人 EMBO Molecular Medicine, 2017，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，本文所述之反轉錄病毒核酸不能進行反轉錄。在實施例中，此種核酸能夠瞬時表現外源劑。反轉錄病毒或VLP可能包含失能之反轉錄酶蛋白，或可能不包含反轉錄酶蛋白。在實施例中，反轉錄病毒核酸包含失能之引子結合位點(PBS)及/或att位點。在實施例中，一或多種病毒輔助基因，包括rev、tat、vif、nef、vpr、vpu、vpx及S2或其功能等效物，在反轉錄病毒核酸中失能或不存在。在實施例中，一或多種選自S2、rev及tat之輔助基因在反轉錄病毒核酸中失能或不存在。
典型地，現代反轉錄病毒載體系統包括帶有順式作用載體序列以用於將病毒RNA轉錄、反轉錄、整合、轉譯及包裝至病毒粒子中之病毒基因體，及(2)表現產生病毒粒子所需之反式作用反轉錄病毒基因序列(例如，gag、pol及env)之生產細胞株。藉由完全分離順式作用及反式作用載體序列，病毒無法維持複製超過一個感染週期。可藉由許多策略避免活病毒之產生，例如，藉由使順式作用序列與反式作用序列之間的重疊最小化以避免重組。
包含不含或缺乏病毒RNA之序列的病毒樣粒子(VLP)，諸如章節III.2中所述，可為自序列中移除或消除病毒RNA之結果。類似於病毒載體粒子，諸如章節III.1中所述，VLP含有由宿主細胞(亦即，生產細胞或源細胞)脂質雙層以及至少一種病毒結構蛋白製成之病毒外包膜。在一些實施例中，病毒結構蛋白係指有助於病毒核心或衣殼結構之任何病毒蛋白或其片段。
一般而言，對於慢病毒載體粒子，gag前驅體蛋白之表現單獨介導載體組裝及釋放。在一些態樣中，已證明gag蛋白或其片段組裝成類似於病毒核心之結構。在一個實施例中，此可藉由使用gag上之內源包裝信號結合位點來達成。或者，內源包裝信號結合位點在pol上。在此實施例中，待遞送之RNA將含有同源包裝信號。在另一個實施例中，位於待遞送之RNA上之異源結合結構域(其與gag異源)及位於gag或pol上之同源結合位點可用於確保待遞送之RNA的包裝。異源序列可為非病毒的，或其可為病毒的，在此種情況下，其可來源於不同病毒。VLP可用於遞送治療性RNA，在此種情況下不需要功能性整合酶及/或反轉錄酶。此等VLP亦可用於遞送所關注之治療基因，在此種情況下典型地包括pol。
在一個實施例中，改變gag-pol，且包裝信號經相應包裝信號置換。在此實施例中，粒子可用新包裝信號包裝RNA。此種方法之優點在於可能包裝不含病毒序列之RNA序列，例如，RNAi。
替代性方法係依賴於待包裝之RNA之過表現。在一個實施例中，在不存在含有包裝信號之任何RNA之情況下過表現待包裝之RNA。此可能得以包裝顯著水準之治療性RNA，且此量足以轉導細胞且具有生物作用。
在一些實施例中，多核苷酸包含編碼病毒gag蛋白或反轉錄病毒gag及pol蛋白之核苷酸序列，其中gag蛋白或pol蛋白包含能夠識別RNA序列中之相應序列以有助於將RNA序列包裝至病毒載體粒子中的異源RNA結合結構域。在一些實施例中，異源RNA結合結構域包含來源於噬菌體外殼蛋白、Rev蛋白、U 1小核糖核蛋白粒子之蛋白、Nova蛋白、TF111 A蛋白、TIS 11蛋白、trp RNA結合衰減蛋白(TRAP)或假尿苷合成酶之RNA結合結構域。
在一些實施例中，gag蛋白為聚蛋白。在一些實施例中，gag蛋白為包含MA多肽、CA多肽及NC多肽之聚蛋白；ii)一或多個外源多肽(諸如章節II.C.2中所述)；及iii)一或多個異源蛋白酶裂解位點，其中一或多個異源蛋白酶裂解位點中之至少一者介於gag聚蛋白與一或多個外源多肽之間。
在一些實施例中，gag聚蛋白之MA、CA及NC部分可屬於此項技術中已知之任何反轉錄病毒。舉例而言，在一些實施例中，gag聚蛋白為α反轉錄病毒、β反轉錄病毒、γ反轉錄病毒、δ反轉錄病毒、ε反轉錄病毒或泡沫病毒之gag聚蛋白。在一些實施例中，gag聚蛋白為人類免疫缺陷病毒之gag聚蛋白。
在一些實施例中，gag聚蛋白為包含MA多肽、CA多肽、p2多肽、NC多肽、pi多肽及p6多肽之人類免疫缺陷病毒(HIV) gag聚蛋白。在一些實施例中，gag聚蛋白包含一或多個異源蛋白酶裂解位點，其介於以下一或多者之間：i) MA多肽與CA多肽；ii) CA多肽與p2多肽；iii) p2多肽與NC多肽；iv) NC多肽與pi多肽；及v) pi多肽與p6多肽。在一些實施例中，gag聚蛋白可包含：MA-異源蛋白酶裂解位點-CA-異源蛋白酶裂解位點-p2-異源蛋白酶裂解位點-NC-pl-p6。在一些實施例中，異源蛋白酶裂解位點為TEV蛋白酶裂解位點：ENLYFQS，其中裂解在Gin與Ser之間發生。
在一些實施例中，藉由核心蛋白與病毒基因體內之獨特包殼序列(例如，具有莖環結構之UTR)的結合來啟動基於病毒之載體粒子(亦即，VLP)之組裝。在一些實施例中，核心與包殼序列之相互作用促進寡聚化。
在一些實施例中，用於產生VLP之源細胞包含一或多種編碼病毒結構蛋白(例如，gag、pol)之質體，其可包裝病毒粒子(亦即，包裝質體)。在一些實施例中，編碼gag及pol前驅體中之至少兩者之序列在同一質體上。在一些實施例中，編碼gag及pol前驅體之序列在不同質體上。在一些實施例中，編碼gag及pol前驅體之序列具有相同表現信號，例如，啟動子。在一些實施例中，編碼gag及pol前驅體之序列具有不同表現信號，例如，不同啟動子。在一些實施例中，gag及pol前驅體之表現為可誘導的。
在一些實施例中，VLP或任何基於病毒之粒子的形成，諸如上文所述，可藉由此項技術中已知之任何適合之技術來偵測。此類技術之實例包括例如電子顯微術、動態光散射、選擇性層析分離及/或密度梯度離心。
B. G 蛋白
在一些實施例中，脂質粒子包括暴露於靶向脂質粒子表面上之包膜蛋白。在一些實施例中，包膜蛋白含有亨尼帕病毒包膜附著醣蛋白G (G蛋白)或其生物活性部分。在一些實施例中，可藉由連接至靶向部分，諸如結合至靶細胞之結合分子(例如抗體或抗原結合片段，例如sdAb或scFv)重新靶向G蛋白。在一些實施例中，本文所提供之G蛋白及變異體NiV-F蛋白一起展現對靶細胞之融合活性，諸如將外源劑或核酸外源劑遞送至靶細胞。
附著G蛋白為II型跨膜醣蛋白，其含有N端細胞質尾(例如，對應於SEQ ID NO:304之胺基酸1-49)、跨膜結構域(例如，對應於SEQ ID NO:304之胺基酸50-70)及含有細胞外莖(例如，對應於SEQ ID NO:304之胺基酸71-187)及球狀頭(對應於SEQ ID NO:304之胺基酸188-602)之細胞外結構域。N端細胞質結構域在脂質雙層之內腔內，且C端部分為暴露於脂質雙層外部之細胞外結構域。已顯示C端區域中之莖區域(例如，對應於SEQ ID NO: 304之胺基酸71-187)涉及於與F蛋白之相互作用及F蛋白融合之觸發(Liu等人 2015 J of Virology 89:1838)。在野生型G蛋白中，球狀頭介導受體與亨尼帕病毒進入受體Ephrin B2及Ephrin B3之結合，但對於膜融合而言並非必要的(Brandel-Tretheway等人 Journal of Virology. 2019. 93(13)e00577-19)。在本文之一些實施例中，藉由G蛋白或其生物活性片段(例如，細胞質截短)與sdAb可變結構域之連接而改變G蛋白之向性。G蛋白與結合配偶體之結合可觸發由相容性F蛋白或其生物活性部分介導之融合。本文所揭示之G蛋白序列主要揭示為包括轉譯開始所需之N端甲硫胺酸的表現序列。由於此類N端甲硫胺酸通常以共轉譯方式或轉譯後裂解，因此亦預期本文所揭示之所有G蛋白序列之成熟蛋白質序列缺乏N端甲硫胺酸。
G醣蛋白在亨尼帕病毒種類之間高度保守。舉例而言，NiV及HeV病毒之G蛋白共享79%胺基酸一致性。研究已顯示如由異型融合活化所證明在不同種類之G蛋白與F蛋白之間具有高度相容性(Brandel-Tretheway等人 Journal of Virology. 2019)。如所描述，脂質粒子可含有來自不同種類之異源G及F蛋白。在特定實施例中，F蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分與所提供之G蛋白(諸如下文所闡述之任一者)聯合保留融合活性。融合活性包括變異體F蛋白與G蛋白聯合之活性，以促進或有助於兩個膜內腔之融合，諸如本文所提供之脂質粒子(例如具有嵌入其脂質雙層中，諸如暴露於其表面上之G蛋白及變異體F蛋白)之內腔，以及靶細胞之細胞質，例如含有由G蛋白識別或結合之表面受體或分子的細胞。
表2中提供示例性亨尼帕病毒G蛋白序列。
表 2. 亨尼帕病毒蛋白G序列簇。第1欄，Genbank ID包括作為簇之質心序列的病毒全基因體序列之Genbank ID。第2欄，CDS之核苷酸提供對應於全基因體中基因之CDS的核苷酸。第3欄，全基因名提供包括Genbank ID、病毒種類、毒株及蛋白質名稱之全名。第4欄，序列提供基因之胺基酸序列。第5欄，序列數/簇提供與此質心序列簇集之序列數。第6欄提供所述序列之SEQ ID編號。
| Genbank ID | CDS 之核苷酸 | 全序列ID | 序列 | SEQ ID NO |
| AF017149 | 8913-10727 | gb:AF017149|生物體：亨德拉病毒|毒株名稱：未知-AF017149|蛋白質名稱：醣蛋白|基因符號：G | MMADSKLVSLNNNLSGKIKDQGKVIKNYYGTMDIKKINDGLLDSKILGAFNTVIALLGSIIIIVMNIMIIQNYTRTTDNQALIKESLQSVQQQIKALTDKIGTEIGPKVSLIDTSSTITIPANIGLLGSKISQSTSSINENVNDKCKFTLPPLKIHECNISCPNPLPFREYRPISQGVSDLVGLPNQICLQKTTSTILKPRLISYTLPINTREGVCITDPLLAVDNGFFAYSHLEKIGSCTRGIAKQRIIGVGEVLDRGDKVPSMFMTNVWTPPNPSTIHHCSSTYHEDFYYTLCAVSHVGDPILNSTSWTESLSLIRLAVRPKSDSGDYNQKYIAITKVERGKYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLPRTEFQYNDSNCPIIHCKYSKAENCRLSMGVNSKSHYILRSGLLKYNLSLGGDIILQFIEIADNRLTIGSPSKIYNSLGQPVFYQASYSWDTMIKLGDVDTVDPLRVQWRNNSVISRPGQSQCPRFNVCPEVCWEGTYNDAFLIDRLNWVSAGVYLNSNQTAENPVFAVFKDNEILYQVPLAEDDTNAQKTITDCFLLENVIWCISLVEIYDTGDSVIRPKLFAVKIPAQCSES | 379 |
| AF212302 | 8943-10751 | gb:AF212302|生物體：尼帕病毒|毒株名稱：未知-AF212302|蛋白質名稱：附著醣蛋白|基因符號：G | MPAENKKVRFENTTSDKGKIPSKVIKSYYGTMDIKKINEGLLDSKILSAFNTVIALLGSIVIIVMNIMIIQNYTRSTDNQAVIKDALQGIQQQIKGLADKIGTEIGPKVSLIDTSSTITIPANIGLLGSKISQSTASINENVNEKCKFTLPPLKIHECNISCPNPLPFREYRPQTEGVSNLVGLPNNICLQKTSNQILKPKLISYTLPVVGQSGTCITDPLLAMDEGYFAYSHLERIGSCSRGVSKQRIIGVGEVLDRGDEVPSLFMTNVWTPPNPNTVYHCSAVYNNEFYYVLCAVSTVGDPILNSTYWSGSLMMTRLAVKPKSNGGGYNQHQLALRSIEKGRYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLVRTEFKYNDSNCPITKCQYSKPENCRLSMGIRPNSHYILRSGLLKYNLSDGENPKVVFIEISDQRLSIGSPSKIYDSLGQPVFYQASFSWDTMIKFGDVLTVNPLVVNWRNNTVISRPGQSQCPRFNTCPEICWEGVYNDAFLIDRINWISAGVFLDSNQTAENPVFTVFKDNEILYRAQLASEDTNAQKTITNCFLLKNKIWCISLVEIYDTGDNVIRPKLFAVKIPEQCT | 304 |
| JQ001776 | 8170-10275 | gb:JQ001776:8170-10275|生物體：雪松病毒|毒株名稱：CG1a|蛋白質名稱：附著醣蛋白|基因符號：G | MLSQLQKNYLDNSNQQGDKMNNPDKKLSVNFNPLELDKGQKDLNKSYYVKNKNYNVSNLLNESLHDIKFCIYCIFSLLIIITIINIITISIVITRLKVHEENNGMESPNLQSIQDSLSSLTNMINTEITPRIGILVTATSVTLSSSINYVGTKTNQLVNELKDYITKSCGFKVPELKLHECNISCADPKISKSAMYSTNAYAELAGPPKIFCKSVSKDPDFRLKQIDYVIPVQQDRSICMNNPLLDISDGFFTYIHYEGINSCKKSDSFKVLLSHGEIVDRGDYRPSLYLLSSHYHPYSMQVINCVPVTCNQSSFVFCHISNNTKTLDNSDYSSDEYYITYFNGIDRPKTKKIPINNMTADNRYIHFTFSGGGGVCLGEEFIIPVTTVINTDVFTHDYCESFNCSVQTGKSLKEICSESLRSPTNSSRYNLNGIMIISQNNMTDFKIQLNGITYNKLSFGSPGRLSKTLGQVLYYQSSMSWDTYLKAGFVEKWKPFTPNWMNNTVISRPNQGNCPRYHKCPEICYGGTYNDIAPLDLGKDMYVSVILDSDQLAENPEITVFNSTTILYKERVSKDELNTRSTTTSCFLFLDEPWCISVLETNRFNGKSIRPEIYSYKIPKYC | 380 |
| NC_025256 | 9117-11015 | gb:NC_025256:9117-11015|生物體：蝙蝠副黏液病毒Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009|毒株名稱：BatPV/Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009|蛋白質名稱：醣蛋白|基因符號：G | MPQKTVEFINMNSPLERGVSTLSDKKTLNQSKITKQGYFGLGSHSERNWKKQKNQNDHYMTVSTMILEILVVLGIMFNLIVLTMVYYQNDNINQRMAELTSNITVLNLNLNQLTNKIQREIIPRITLIDTATTITIPSAITYILATLTTRISELLPSINQKCEFKTPTLVLNDCRINCTPPLNPSDGVKMSSLATNLVAHGPSPCRNFSSVPTIYYYRIPGLYNRTALDERCILNPRLTISSTKFAYVHSEYDKNCTRGFKYYELMTFGEILEGPEKEPRMFSRSFYSPTNAVNYHSCTPIVTVNEGYFLCLECTSSDPLYKANLSNSTFHLVILRHNKDEKIVSMPSFNLSTDQEYVQIIPAEGGGTAESGNLYFPCIGRLLHKRVTHPLCKKSNCSRTDDESCLKSYYNQGSPQHQVVNCLIRIRNAQRDNPTWDVITVDLTNTYPGSRSRIFGSFSKPMLYQSSVSWHTLLQVAEITDLDKYQLDWLDTPYISRPGGSECPFGNYCPTVCWEGTYNDVYSLTPNNDLFVTVYLKSEQVAENPYFAIFSRDQILKEFPLDAWISSARTTTISCFMFNNEIWCIAALEITRLNDDIIRPIYYSFWLPTDCRTPYPHTGKMTRVPLRSTYNY | 381 |
| NC_025352 | 8716-11257 | gb:NC_025352:8716-11257|生物體：墨江病毒|毒株名稱：Tongguan1|蛋白質名稱：附著醣蛋白|基因符號：G | MATNRDNTITSAEVSQEDKVKKYYGVETAEKVADSISGNKVFILMNTLLILTGAIITITLNITNLTAAKSQQNMLKIIQDDVNAKLEMFVNLDQLVKGEIKPKVSLINTAVSVSIPGQISNLQTKFLQKYVYLEESITKQCTCNPLSGIFPTSGPTYPPTDKPDDDTTDDDKVDTTIKPIEYPKPDGCNRTGDHFTMEPGANFYTVPNLGPASSNSDECYTNPSFSIGSSIYMFSQEIRKTDCTAGEILSIQIVLGRIVDKGQQGPQASPLLVWAVPNPKIINSCAVAAGDEMGWVLCSVTLTAASGEPIPHMFDGFWLYKLEPDTEVVSYRITGYAYLLDKQYDSVFIGKGGGIQKGNDLYFQMYGLSRNRQSFKALCEHGSCLGTGGGGYQVLCDRAVMSFGSEESLITNAYLKVNDLASGKPVIIGQTFPPSDSYKGSNGRMYTIGDKYGLYLAPSSWNRYLRFGITPDISVRSTTWLKSQDPIMKILSTCTNTDRDMCPEICNTRGYQDIFPLSEDSEYYTYIGITPNNGGTKNFVAVRDSDGHIASIDILQNYYSITSATISCFMYKDEIWCIAITEGKKQKDNPQRIYAHSYKIRQMCYNMKSATVTVGNAKNITIRRY | 382 |
在一些實施例中，G蛋白具有SEQ ID NO: 304、379、380、381或382中之任一者所示之序列或為其功能活性變異體或生物活性部分，該功能活性變異體或生物活性部分具有與SEQ ID NO: 304、379、380、381或382中之任一者至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、至少84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、至少87%或約87%、至少88%或約88%、至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、至少96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%一致之序列。
在特定實施例中，G蛋白或功能活性變異體或生物活性部分為與亨尼帕病毒F蛋白(諸如本文所述之變異體NiV-F蛋白)聯合保留融合活性之蛋白質。融合活性包括G蛋白與亨尼帕病毒F蛋白聯合之活性，以促進或有助於兩個膜內腔之融合，諸如在其脂質雙層中嵌入亨尼帕病毒F及G蛋白之靶向脂質粒子之內腔，以及靶細胞之細胞質，例如含有由靶向包膜蛋白識別或結合之表面受體或分子的細胞。在一些實施例中，F蛋白及G蛋白來自相同亨尼帕病毒種類(例如，NiV-G及NiV-F)。
在一些實施例中，G蛋白為突變體G蛋白，其為含有一或多個胺基酸突變，諸如一或多個胺基酸插入、缺失、取代或截短之功能活性變異體或生物活性部分。在一些實施例中，本文所述之突變涉及與參考G蛋白序列相比之胺基酸插入、缺失、取代或截短。在一些實施例中，參考G蛋白序列為G蛋白或其生物活性部分之野生型序列。在一些實施例中，功能活性變異體或其生物活性部分為野生型亨德拉(HeV)病毒G蛋白、野生型尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、野生型雪松(CedPV)病毒G蛋白、野生型墨江病毒G蛋白、野生型蝙蝠副黏液病毒G蛋白之突變體或其生物活性部分。在一些實施例中，野生型G蛋白具有SEQ ID NO: 304、379、380、381或382中之任一者所示之序列。
在一些實施例中，G蛋白為突變體G蛋白，其為生物活性部分，該生物活性部分為野生型亨德拉(HeV)病毒G蛋白、野生型尼帕(NiV)病毒G蛋白(NiV-G)、野生型雪松(CedPV)病毒G蛋白、野生型墨江病毒G蛋白、野生型蝙蝠副黏液病毒G蛋白之N端及/或C端經截短片段。在特定實施例中，截短為全部或一部分細胞質結構域之N端截短。在一些實施例中，突變體G蛋白為生物活性部分，其為經截短的且在野生型G蛋白，諸如SEQ ID NO: 304、379、380、381或382中之任一者所述之野生型G蛋白之N端處或附近缺乏至多49個連續胺基酸殘基。在一些實施例中，突變體G蛋白為經截短的且在野生型G蛋白之N端處缺乏至多49個連續胺基酸，諸如至多49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、30、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個連續胺基酸。
在一些實施例中，G蛋白為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白，或為其功能活性變異體或生物活性部分。在一些實施例中，G蛋白為具有SEQ ID NO:304所示之序列的NiV-G蛋白，或為其功能變異體或生物活性部分，該功能變異體或生物活性部分具有與SEQ ID NO:304具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、至少84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、至少87%或約87%、至少88%或約88%、至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
在一些實施例中，G蛋白為突變體NiV-G蛋白，其為野生型NiV-G之生物活性部分。在一些實施例中，生物活性部分為N端截短之片段。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多5個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多10個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多15個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多20個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多25個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多30個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多35個連續胺基酸殘基，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白(亦稱為變異體NiV-G)含有N端甲硫胺酸。
在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白為經截短的且在野生型NiV-G蛋白之N端處或附近缺乏至多胺基酸34，諸如與SEQ ID NO: 304所示之野生型NiV-G相比。在一些實施例中，突變體NiV-G蛋白(亦稱為變異體NiV-G)含有N端甲硫胺酸。在一些實施例中，與SEQ ID NO:304所示之野生型NiV-G相比，突變體NiV-G蛋白缺乏胺基酸2-34。
在一些實施例中，G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分結合至Ephrin B2或Ephrin B3。在一些實施例中，G蛋白為突變體G蛋白，諸如所述經截短G蛋白且保留與Ephrin B2或B3之結合。提及保留與Ephrin B2或B3之結合包括與相應野生型G蛋白(諸如SEQ ID NO: 304、379、380、381或382所示)之結合水準或程度類似之結合，諸如野生型G蛋白之結合的至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。
在一些實施例中，G蛋白或其生物部分為突變體G蛋白，其展現對野生型G蛋白之原生結合配偶體之結合降低。在一些實施例中，突變體G蛋白或其生物活性部分為野生型Niv-G之突變體，且展現與原生結合配偶體Ephrin B2或Ephrin B3中之一或兩者的結合降低。在一些實施例中，突變體G蛋白或生物活性部分，諸如突變體NiV-G蛋白，展現與原生結合配偶體之結合降低。在一些實施例中，與Ephrin B2或Ephrin B3之結合降低為降低大於5%或約5%、10%或約10%、15%或約15%、20%或約20%、25%或約25%、30%或約30%、40%或約40%、50%或約50%、60%或約60%、70%或約70%、80%或約80%、90%或約90%、或100%或約100%。
在一些實施例中，突變可提高轉導效率。在一些實施例中，突變允許特異性靶向並非Ephrin B2或Ephrin B3之其他所需細胞類型。在一些實施例中，突變導致至少部分不能結合至少一種天然受體，由此降低與Ephrin B2或Ephrin B3中之至少一者的結合。在一些實施例中，本文所述之突變干擾天然受體識別。
在一些實施例中，G蛋白在涉及於與Ephrin B2及Ephrin B3中之一或兩者相互作用之殘基中含有一或多個胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代對應於突變E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:304所示之編號。在一些實施例中，G蛋白為含有一或多個選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群之胺基酸取代的突變體G蛋白，參考SEQ ID NO:304所示之編號。在一些實施例中，G蛋白為含有一或多個選自由參考SEQ ID NO:304之E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群之胺基酸取代的突變體G蛋白，且為其含有N端截短之生物活性部分。
在特定實施例中，G蛋白具有SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或為保留結合及/或融合活性之其功能活性變異體或其生物活性部分。在一些實施例中，功能活性變異體包含與SEQ ID NO: 301具有至少80%或約80%、至少85%或約85%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列，且與所述變異體NiV-F蛋白聯合保留融合活性。
提及保留融合活性包括脂質粒子(例如，慢病毒載體)之活性，該脂質粒子含有所述變異體NiV-F蛋白或F蛋白之生物活性部分或功能活性變異體(與G蛋白，諸如所述NiV-G蛋白聯合)，該活性介於參考脂質粒子(例如，慢病毒載體)之結合水準或程度的10%與150%或約10%與約150%之間或更高，該參考脂質粒子為類似的，諸如含有相同變異體NiV-F，但含有相應野生型G蛋白，諸如SEQ ID NO: 304所示。舉例而言，保留融合活性之脂質粒子(例如，慢病毒載體)具有至少或至少約10%的參考脂質粒子之融合活性水準或程度，該參考脂質粒子為類似的(諸如含有相同變異體NiV-F)，但含有相應野生型G蛋白，諸如至少或至少約15%之融合活性水準或程度、至少或至少約20%之融合活性水準或程度、至少或至少約25%之融合活性水準或程度、至少或至少約30%之融合活性水準或程度、至少或至少約35%之融合活性水準或程度、至少或至少約40%之融合活性水準或程度、至少或至少約45%之融合活性水準或程度、至少或至少約50%之融合活性水準或程度、至少或至少約55%之融合活性水準或程度、至少或至少約60%之融合活性水準或程度、至少或至少約65%之融合活性水準或程度、至少或至少約70%之融合活性水準或程度、至少或至少約75%之融合活性水準或程度、至少或至少約80%之融合活性水準或程度、至少或至少約85%之融合活性水準或程度、至少或至少約90%之融合活性水準或程度、至少或至少約95%之融合活性水準或程度、至少或至少約100%之融合活性水準或程度、或至少或至少約120%之融合活性水準或程度。
1. 重新靶向之 G 蛋白
在一些實施例中，G蛋白(諸如NiV-G)進一步附接或連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶分子，諸如細胞表面標誌。舉例而言，在一些態樣中提供一種靶向脂質粒子(例如，靶向慢病毒載體)，其包括重新靶向之G蛋白，該G蛋白含有附接至結合結構域之任何所提供之G蛋白，其中該重新靶向之G蛋白暴露於靶向脂質粒子(例如，靶向慢病毒載體)之表面上。
在一些實施例中，靶向包膜蛋白含有本文所提供之G蛋白。
在一些實施例中，G蛋白為章節III.B中所提供之彼等G蛋白中之任一者，包括具有細胞質結構域修飾之NiV-G蛋白、經截短NiV-G細胞質尾或經修飾NiV-G細胞質尾。
在一些實施例中，結合結構域可為結合至靶細胞上之細胞表面分子之任何劑。在一些實施例中，結合結構域可為抗體或抗體部分或片段。在一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體(sdAb)。在一些實施例中，結合結構域為單鏈可變片段(scFv)。結合結構域可直接或間接連接至G蛋白。在特定實施例中，結合結構域連接至G蛋白或其生物活性部分之C端(C端胺基酸)。連接可經由肽連接子，諸如可撓性肽連接子。
可調節結合結構域以具有不同結合強度。舉例而言，具有各種結合強度之scFv及抗體可用於改變嵌合附著蛋白對展示高或低量靶抗原之細胞的融合活性。舉例而言，具有不同親和力之DARPin可用於改變對展示高或低量靶抗原之細胞的融合活性。亦可調節結合結構域以靶向標靶配位體上之不同區域，此將影響與展示標靶之細胞的融合率。
結合結構域可包含人源化抗體分子、完整IgA、IgG、IgE或IgM抗體；雙特異性或多特異性抗體(例如，Zybodies®等)；抗體片段，諸如Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fd'片段、Fd片段及經分離之CDR或其組；單鏈Fv；多肽-Fc融合體；單結構域抗體(例如鯊魚單結構域抗體，諸如IgNAR或其片段)；駱駝抗體；掩蔽抗體(例如，Probodies®)；小型模組化免疫藥物(「SMIPsTM」)；單鏈或串聯微型雙功能抗體(TandAb®)；VHH；Anticalins®；Nanobodies®；微型抗體；BiTE®；錨蛋白重複蛋白或DARPINs®；Avimers®；DART；TCR樣抗體；Adnectins®；Affilins®；Trans-bodies®；Affibodies®；TrimerX®；微量蛋白；Fynomers®；Centyrins®；及KALBITOR®。靶向部分亦可包括抗體或其抗原結合片段(例如，Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗體片段、二硫鍵連接之Fv (sdFv)、由VH及CH1結構域組成之Fd片段、線性抗體、單結構域抗體(諸如sdAb (VL或VH))、奈米抗體或駱駝科VHH結構域)、抗原結合纖連蛋白III型(Fn3)支架(諸如纖連蛋白多肽微型抗體)、配位體、細胞介素、趨化介素或T細胞受體(TCR)。
在一些實施例中，結合結構域為單鏈分子。在一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體。在一些實施例中，結合結構域為單鏈可變片段。在特定實施例中，結合結構域含有人類或人源化抗體可變序列。
在一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體。在一些實施例中，單結構域抗體可為人類或人源化的。在一些實施例中，單結構域抗體或其部分為天然存在的。在一些實施例中，單結構域抗體或其部分為合成的。
在一些實施例中，單結構域抗體為其互補決定區為單結構域多肽之一部分的抗體。在一些實施例中，單結構域抗體為僅重鏈抗體可變結構域。在一些實施例中，單結構域抗體不包括輕鏈。
在一些實施例中，不含輕鏈之重鏈抗體稱作VHH。在一些實施例中，單結構域抗體具有12-15 kDa之分子量。在一些實施例中，單結構域抗體包括駱駝科抗體或鯊魚抗體。在一些實施例中，單結構域抗體分子來源於駱駝科物種中，例如駱駝、美洲駝、單峰駱駝、羊駝、駱馬及原駝中產生之抗體。在一些實施例中，單結構域抗體稱作免疫球蛋白新抗原受體(IgNAR)且來源於軟骨魚。在一些實施例中，藉由將人類或小鼠IgG之二聚可變結構域分裂成單體且將關鍵殘基駱駝化來產生單結構域抗體。
在一些實施例中，可自噬菌體展示文庫中產生單結構域抗體。在一些實施例中，噬菌體展示文庫係自用各種抗原免疫之駱駝科動物之VHH庫產生，如Arbabi等人,
FEBS Letters,414, 521-526 (1997)；Lauwereys等人,
EMBO J.,17, 3512-3520 (1998)；Decanniere等人,
Structure,7, 361-370 (1999)中所述。在一些實施例中，所產生之噬菌體展示文庫包含未免疫之駱駝科動物之抗體片段。在一些實施例中，藉由將多樣性引入一或多個支架中以合成方式產生單結構域抗體及人類單結構域抗體文庫。
本文所提供之G蛋白及結合至靶細胞上之細胞表面分子的結合結構域。在一些實施例中，結合結構域為單結構域抗體(sdAb)。在一些實施例中，結合結構域為單鏈可變片段(scFv)。結合結構域可直接或間接連接至G蛋白。在特定實施例中，結合結構域連接至G蛋白或其生物活性部分之C端(C端胺基酸)。連接可經由肽連接子，諸如可撓性肽連接子。
在一些實施例中，結合結構域之C端附接至G蛋白或其生物活性部分之C端。在一些實施例中，結合結構域之N端暴露於脂質雙層之外表面上。在一些實施例中，結合結構域之N端結合至靶細胞之細胞表面分子。在一些實施例中，結合結構域特異性結合至存在於靶細胞上之細胞表面分子。在一些實施例中，細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。在一些實施例中，結合結構域為如上文所述之任何結合結構域之一。
在一些實施例中，結合結構域(例如，sdAb或如本文所述之任何結合結構域之一)結合至細胞之細胞表面抗原。在一些實施例中，細胞表面抗原為一種類型之細胞所特有的。在一些實施例中，細胞表面抗原為一種以上類型之細胞所特有的。
在一些實施例中，靶細胞之細胞表面分子為抗原或其部分。在一些實施例中，單結構域抗體或其部分為具有能夠選擇性結合至特定抗原之單一單體結構域抗原結合/識別結構域的抗體。在一些實施例中，單結構域抗體結合存在於靶細胞上之抗原。
示例性細胞包括多形核細胞(亦稱為PMN、PML、PMNL或粒細胞)、幹細胞、胚胎幹細胞、神經幹細胞、間葉幹細胞(MSC)、造血幹細胞(HSC)、人類肌原性幹細胞、源自肌肉之幹細胞(MuStem)、胚胎幹細胞(ES或ESC)、角膜緣上皮幹細胞、心肌原性幹細胞、心肌細胞、祖細胞、免疫效應細胞、淋巴細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、自然殺手細胞、T細胞、細胞毒性T淋巴細胞、同種異體細胞、常駐心臟細胞、誘導多能幹細胞(iPS)、源自脂肪或表型修飾之幹細胞或祖細胞、CD133+細胞、醛去氫酶陽性細胞(ALDH+)、臍帶血(UCB)細胞、外周血幹細胞(PBSC)、神經元、神經祖細胞、胰臟β細胞、神經膠細胞或肝細胞。
在一些實施例中，靶細胞為靶組織之細胞。靶組織可包括肝、肺、心、脾、胰臟、胃腸道、腎、睪丸、卵巢、腦、生殖器官、中樞神經系統、周圍神經系統、骨骼肌、內皮、內耳或眼睛。
在一些實施例中，靶細胞為肌肉細胞(例如，骨骼肌細胞)、腎細胞、肝臟細胞(例如，肝細胞)或心臟細胞(例如，心肌細胞)。在一些實施例中，靶細胞為心臟細胞，例如心肌細胞(例如，靜止心肌細胞)、肝母細胞(例如，膽管肝母細胞)、上皮細胞、T細胞(例如，原初T細胞)、巨噬細胞(例如，腫瘤浸潤巨噬細胞)或纖維母細胞(例如，心臟纖維母細胞)。
在一些實施例中，靶細胞為腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。在一些實施例中，靶細胞為CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞或CD30+肺上皮細胞。
在一些實施例中，靶細胞為抗原呈現細胞、MHC II+類細胞、專職抗原呈現細胞、非典型抗原呈現細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、髓樣樹突狀細胞、漿細胞樣樹突狀細胞、CD11c+細胞、CD11b+細胞、脾細胞、B細胞、肝細胞、內皮細胞或非癌細胞。
在一些實施例中，結合結構域(例如，sdAb)可變結構域結合細胞表面分子或抗原。在一些實施例中，細胞表面分子為ASGR1、ASGR2、TM4SF5、CD8、CD4或低密度脂蛋白受體(LDL-R)。在一些實施例中，細胞表面分子為ASGR1。在一些實施例中，細胞表面分子為ASGR2。在一些實施例中，細胞表面分子為TM4SF5。在一些實施例中，細胞表面分子為CD8。在一些實施例中，細胞表面分子為CD4。在一些實施例中，細胞表面分子為LDL-R。
在一些實施例中，G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分直接連接至其結合結構域及/或可變結構域。在一些實施例中，靶向包膜蛋白為具有以下結構之融合蛋白：(N'-單結構域抗體-C')-(C'-G蛋白-N')。
在一些實施例中，G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分經由連接子間接連接至其結合結構域及/或可變結構域。在一些實施例中，連接子為肽連接子。在一些實施例中，連接子為化學連接子。
在一些實施例中，連接子為肽連接子且靶向包膜蛋白為含有經由肽連接子連接至sdAb可變結構域之G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分的融合蛋白。在一些實施例中，靶向包膜蛋白為具有以下結構之融合蛋白：(N'-單結構域抗體-C')-連接子-(C'-G蛋白-N')。
在一些實施例中，肽連接子之長度為至多65個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子包含或包含約2至65個胺基酸、2至60個胺基酸、2至56個胺基酸、2至52個胺基酸、2至48個胺基酸、2至44個胺基酸、2至40個胺基酸、2至36個胺基酸、2至32個胺基酸、2至28個胺基酸、2至24個胺基酸、2至20個胺基酸、2至18個胺基酸、2至14個胺基酸、2至12個胺基酸、2至10個胺基酸、2至8個胺基酸、2至6個胺基酸、6至65個胺基酸、6至60個胺基酸、6至56個胺基酸、6至52個胺基酸、6至48個胺基酸、6至44個胺基酸、6至40個胺基酸、6至36個胺基酸、6至32個胺基酸、6至28個胺基酸、6至24個胺基酸、6至20個胺基酸、6至18個胺基酸、6至14個胺基酸、6至12個胺基酸、6至10個胺基酸、6至8個胺基酸、8至65個胺基酸、8至60個胺基酸、8至56個胺基酸、8至52個胺基酸、8至48個胺基酸、8至44個胺基酸、8至40個胺基酸、8至36個胺基酸、8至32個胺基酸、8至28個胺基酸、8至24個胺基酸、8至20個胺基酸、8至18個胺基酸、8至14個胺基酸、8至12個胺基酸、8至10個胺基酸、10至65個胺基酸、10至60個胺基酸、10至56個胺基酸、10至52個胺基酸、10至48個胺基酸、10至44個胺基酸、10至40個胺基酸、10至36個胺基酸、10至32個胺基酸、10至28個胺基酸、10至24個胺基酸、10至20個胺基酸、10至18個胺基酸、10至14個胺基酸、10至12個胺基酸、12至65個胺基酸、12至60個胺基酸、12至56個胺基酸、12至52個胺基酸、12至48個胺基酸、12至44個胺基酸、12至40個胺基酸、12至36個胺基酸、12至32個胺基酸、12至28個胺基酸、12至24個胺基酸、12至20個胺基酸、12至18個胺基酸、12至14個胺基酸、14至65個胺基酸、14至60個胺基酸、14至56個胺基酸、14至52個胺基酸、14至48個胺基酸、14至44個胺基酸、14至40個胺基酸、14至36個胺基酸、14至32個胺基酸、14至28個胺基酸、14至24個胺基酸、14至20個胺基酸、14至18個胺基酸、18至65個胺基酸、18至60個胺基酸、18至56個胺基酸、18至52個胺基酸、18至48個胺基酸、18至44個胺基酸、18至40個胺基酸、18至36個胺基酸、18至32個胺基酸、18至28個胺基酸、18至24個胺基酸、18至20個胺基酸、20至65個胺基酸、20至60個胺基酸、20至56個胺基酸、20至52個胺基酸、20至48個胺基酸、20至44個胺基酸、20至40個胺基酸、20至36個胺基酸、20至32個胺基酸、20至28個胺基酸、20至26個胺基酸、20至24個胺基酸、24至65個胺基酸、24至60個胺基酸、24至56個胺基酸、24至52個胺基酸、24至48個胺基酸、24至44個胺基酸、24至40個胺基酸、24至36個胺基酸、24至32個胺基酸、24至30個胺基酸、24至28個胺基酸、28至65個胺基酸、28至60個胺基酸、28至56個胺基酸、28至52個胺基酸、28至48個胺基酸、28至44個胺基酸、28至40個胺基酸、28至36個胺基酸、28至34個胺基酸、28至32個胺基酸、32至65個胺基酸、32至60個胺基酸、32至56個胺基酸、32至52個胺基酸、32至48個胺基酸、32至44個胺基酸、32至40個胺基酸、32至38個胺基酸、32至36個胺基酸、36至65個胺基酸、36至60個胺基酸、36至56個胺基酸、36至52個胺基酸、36至48個胺基酸、36至44個胺基酸、36至40個胺基酸、40至65個胺基酸、40至60個胺基酸、40至56個胺基酸、40至52個胺基酸、40至48個胺基酸、40至44個胺基酸、44至65個胺基酸、44至60個胺基酸、44至56個胺基酸、44至52個胺基酸、44至48個胺基酸、48至65個胺基酸、48至60個胺基酸、48至56個胺基酸、48至52個胺基酸、50至65個胺基酸、50至60個胺基酸、50至56個胺基酸、50至52個胺基酸、54至65個胺基酸、54至60個胺基酸、54至56個胺基酸、58至65個胺基酸、58至60個胺基酸或60至65個胺基酸。在一些實施例中，肽連接子為多肽，其長度為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64或65個胺基酸。
在特定實施例中，連接子為可撓性肽連接子。在一些此類實施例中，連接子為1-20個胺基酸，諸如主要由甘胺酸組成之1-20個胺基酸。在一些實施例中，連接子為1-20個胺基酸，諸如主要由甘胺酸及絲胺酸組成之1-20個胺基酸。在一些實施例中，連接子為含有胺基酸甘胺酸及絲胺酸之可撓性肽連接子，稱作GS-連接子。在一些實施例中，肽連接子包括序列GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。在一些實施例中，多肽連接子具有序列(GGS)n，其中n為1至10。在一些實施例中，多肽連接子具有序列(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10。在一些實施例中，多肽連接子具有序列(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。
C. 外源劑
在一些實施例中，如本文所述之脂質粒子或包含所述脂質粒子之醫藥組合物含有外源劑。在一些實施例中，脂質粒子或包含本文所述之脂質粒子之醫藥組合物含有編碼外源劑之核酸。在一些實施例中，脂質粒子含有外源劑。在一些實施例中，脂質粒子含有編碼外源劑之核酸。提及編碼外源劑之核酸之編碼序列在本文中亦稱作有效負荷基因。在一些實施例中，外源劑或編碼外源劑之核酸存在於脂質粒子之內腔中。
在一些實施例中，外源劑為蛋白質或核酸(例如DNA、染色體(例如人類人工染色體)、RNA，例如mRNA或miRNA)。在一些實施例中，外源劑包含或編碼膜蛋白。在一些實施例中，外源劑包含或編碼治療劑。在一些實施例中，治療劑係選自以下一或多者：蛋白質，例如，酶、跨膜蛋白、受體或抗體；核酸，例如，DNA、染色體(例如人類人工染色體)、RNA、mRNA、siRNA或miRNA；或小分子。
在一些實施例中，脂質粒子或醫藥組合物向靶細胞遞送至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之由脂質粒子包含之外源劑(例如，包含或編碼治療劑之外源劑)。在一些實施例中，與靶細胞接觸(例如，融合)之脂質粒子(例如，融合體)向靶細胞遞送平均至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之由與靶細胞接觸(例如，融合)之脂質粒子(例如，融合體)包含之外源劑(例如，包含或編碼治療劑之外源劑)。在一些實施例中，脂質粒子組合物向靶組織遞送至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%或99%之由脂質粒子組合物包含之外源劑(例如，包含或編碼治療劑之外源劑)。
在一些實施例中，外源劑不在脂質粒子所來源之細胞中天然表現。在一些實施例中，外源劑在脂質粒子所來源之細胞中天然表現。在一些實施例中，經由在脂質粒子所來源之細胞中表現(例如，自經由轉染、轉導或電穿孔引入之DNA或mRNA表現)將外源劑負載至脂質粒子中。在一些實施例中，自整合至基因體中或保持游離之DNA表現外源劑。在一些實施例中，外源劑之表現為組成型的。在一些實施例中，外源劑之表現為誘導型的。在一些實施例中，在產生脂質粒子之前即刻誘導外源劑之表現。在一些實施例中，與融合原之表現同時誘導外源劑之表現。
在一些實施例中，經由電穿孔至脂質粒子本身或脂質粒子所來源之細胞中將外源劑負載至脂質粒子中。在一些實施例中，經由轉染(例如，編碼外源劑之DNA或mRNA之轉染)至脂質粒子本身或脂質粒子所來源之細胞中將外源劑負載至脂質粒子中。
在一些實施例中，外源劑可包括一或多種核酸序列、一或多種多肽、核酸序列及/或多肽之組合、一或多種細胞器及其任何組合。在一些實施例中，外源劑可包括一或多種細胞組分。在一些實施例中，外源劑包括一或多種細胞溶質及/或細胞核組分。
在一些實施例中，脂質粒子含有外源劑，其為核酸或含有編碼外源劑之核酸。在一些實施例中，核酸操作性地連接至「陽性靶細胞特異性調控元件」(或陽性TCSRE)。在一些實施例中，陽性TCSRE為功能性核酸序列。在一些實施例中，陽性TCSRE包含啟動子或增強子。在一些實施例中，TCSRE為增加靶細胞中外源劑之水準的核酸序列。在一些實施例中，陽性靶細胞特異性調控元件包含T細胞特異性啟動子、T細胞特異性增強子、T細胞特異性剪接位點、延長RNA或蛋白質半衰期之T細胞特異性位點、T細胞特異性mRNA核輸出啟動位點、T細胞特異性轉譯增強位點或T細胞特異性轉譯後修飾位點。在一些實施例中，T細胞特異性啟動子為以全文引用之方式併入本文中之Immgen consortium中所述之啟動子，例如，T細胞特異性啟動子為IL2RA (CD25)、LRRC32、FOXP3或IKZF2啟動子。在一些實施例中，T細胞特異性啟動子或增強子為Schmidt等人, Blood. 2014年4月24日;123(17):e68-78中所述之啟動子或增強子，該文獻以全文引用之方式併入本文中。在一些實施例中，T細胞特異性啟動子為任何前述啟動子之轉錄活性片段。在一些實施例中，T細胞特異性啟動子為與任何前述啟動子具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之變異體。
在一些實施例中，脂質粒子含有外源劑，其為核酸或含有編碼外源劑之核酸。在一些實施例中，核酸操作性地連接至「陰性靶細胞特異性調控元件」(或陰性TCSRE)。在一些實施例中，陰性TCSRE為功能性核酸序列。在一些實施例中，陰性TCSRE為引起非靶細胞中之脂質粒子抑制降解之miRNA識別位點。在一些實施例中，外源劑操作性地連接至「非靶細胞特異性調控元件」(或NTCSRE)。在一些實施例中，NTCSRE包含與靶細胞相比降低非靶細胞中之外源劑水準之核酸序列。在一些實施例中，NTCSRE包含非靶細胞特異性miRNA識別序列、非靶細胞特異性蛋白酶識別位點、非靶細胞特異性泛素連接酶位點、非靶細胞特異性轉錄抑制位點或非靶細胞特異性表觀遺傳抑制位點。在一些實施例中，NTCSRE包含組織特異性miRNA識別序列、組織特異性蛋白酶識別位點、組織特異性泛素連接酶位點、組織特異性轉錄抑制位點或組織特異性表觀遺傳抑制位點。在一些實施例中，NTCSRE包含非靶細胞特異性miRNA識別序列、非靶細胞特異性蛋白酶識別位點、非靶細胞特異性泛素連接酶位點、非靶細胞特異性轉錄抑制位點或非靶細胞特異性表觀遺傳抑制位點。在一些實施例中，NTCSRE包含非靶細胞特異性miRNA識別序列且miRNA識別序列能夠由miR3 1、miR363或miR29c中之一或多者結合。在一些實施例中，NTCSRE位於編碼外源劑之轉錄區內或在該轉錄區內編碼，視情況其中由轉錄區產生之RNA包含UTR或編碼區內之miRNA識別序列。
1. 核酸
在一些實施例中，外源劑可包括核酸。舉例而言，外源劑可包含增強內源蛋白表現之RNA，或抑制內源蛋白之蛋白質表現之siRNA或miRNA。舉例而言，內源蛋白可調節靶細胞之結構或功能。在一些實施例中，外源劑可包括編碼調節靶細胞中之結構或功能之工程改造蛋白質的核酸。在一些實施例中，外源劑為靶向調節靶細胞中之結構或功能之轉錄活化子的核酸。
在一些實施例中，本文所述之脂質粒子包含核酸，例如，RNA或DNA。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些實施例中，核酸為、包含或由一或多個核酸類似物組成。在一些實施例中，核酸具有編碼功能基因產物，諸如RNA或蛋白質之核苷酸序列。在一些實施例中，核酸包括一或多個內含子。在一些實施例中，藉由以下一或多種方式產生核酸：自天然來源分離，基於互補模板藉由聚合進行酶促合成(活體內或活體外)，在重組細胞或系統中繁殖，及化學合成。在一些實施例中，核酸之長度為至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、1 10、120、130、140、150、160、170、180、190、20、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000個或更多個殘基。在一些實施例中，核酸為部分或全部單股的；在一些實施例中，核酸為部分或全部雙股的。在一些實施例中，核酸具有包含至少一個元件之核苷酸序列，該至少一個元件編碼多肽或為編碼多肽之序列的補體。核酸可包括變異體，例如，與參考核酸具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%之總體序列一致性。在一些實施例中，變異體核酸不與參考核酸共享至少一個特徵序列元件。在一些實施例中，變異體核酸共享參考核酸之一或多種生物活性。在一些實施例中，核酸變異體具有與參考一致之核酸序列，但在特定位置處有少量序列改變。在一些實施例中，與參考相比，變異體中少於約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%或約2%之殘基經取代、插入或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異體核酸包含約10個、約9個、約8個、約7個、約6個、約5個、約4個、約3個、約2個或約1個經取代之殘基。在一些實施例中，相對於參考，變異體核酸包含極少(例如，少於約5個、約4個、約3個、約2個或約1個)數目之經取代、插入或缺失之參與特定生物活性之功能性殘基。在一些實施例中，與參考相比，變異體核酸包含不超過約15個、約12個、約9個、約3個或約1個添加或缺失，且在一些實施例中，不包含添加或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異體核酸包含少於約27個、約24個、約21個、約18個、約15個、約12個、約9個、約6個、約3個或少於約9個、約6個、約3個或約2個添加或缺失。
在一些實施例中，外源劑包括核酸，例如，DNA、nDNA (核DNA)、mtDNA (粒線體DNA)、蛋白質編碼DNA、基因、操縱子、染色體、基因體、轉座子、反轉錄轉座子、病毒基因體、內含子、外顯子、經修飾之DNA、mRNA (信使RNA)、tRNA (轉移RNA)、經修飾之RNA、微小RNA、siRNA (小干擾RNA)、tmRNA (轉移信使RNA)、rRNA (核糖體RNA)、mtRNA (粒線體RNA)、snRNA (小核RNA)、小核仁RNA (snoRNA)、SmY RNA (mRNA反式剪接RNA)、gRNA (向導RNA)、TERC (端粒酶RNA組分)、aRNA (反義RNA)、cis-NAT (順式天然反義轉錄物)、CRISPR RNA (crRNA)、IncRNA (長非編碼RNA)、piRNA (piwi相互作用RNA)、shRNA (短髮夾RNA)、tasiRNA (反式作用siRNA)、eRNA (增強子RNA)、衛星RNA、pcRNA (蛋白質編碼RNA)、dsRNA (雙股RNA)、RNAi (干擾RNA)、circRNA (環狀RNA)、重編程RNA、適體及其任何組合。在一些實施例中，核酸為野生型核酸。在一些實施例中，蛋白質為突變體核酸。在一些實施例中，核酸為多個核酸序列之融合體或嵌合體。
在實施例中，核酸編碼一或多種(例如，兩種或更多種)針對一或多種RNA標靶之抑制性RNA分子。抑制性RNA分子可為例如miRNA或shRNA。在一些實施例中，抑制性分子可為miRNA之前驅體，諸如Pri-miRNA或Pre-miRNA，或shRNA之前驅體。在一些實施例中，抑制性分子可為源自人工之miRNA或shRNA。在其他實施例中，抑制性RNA分子可為加工至siRNA中或加工成siRNA本身之dsRNA (經轉錄或人工引入)。在一些實施例中，抑制性RNA分子可為miRNA或shRNA，其具有自然界中未發現之序列，或具有至少一個自然界中未發現之功能區段，或具有自然界中未發現之功能區段之組合。在說明性實施例中，至少一個或所有抑制性RNA分子為miR-l55。在一些實施例中，本文所述之反轉錄病毒載體編碼兩種或更多種針對一或多種RNA標靶之抑制性RNA分子。在一些實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子可針對不同標靶。在其他實施例中，兩種或更多種抑制性RNA分子針對同一標靶。在一些實施例中，外源劑包含shRNA。shRNA (短髮夾RNA)可包含由單個自互補RNA股形成之雙股結構。shRNA構築體可包含與靶基因之編碼序列或非編碼序列之一部分一致的核苷酸序列。亦可使用相對於靶序列具有插入、缺失及單點突變之RNA序列。在抑制性RNA與靶基因部分之間可使用大於90%序列一致性或甚至100%序列一致性。在某些實施例中，shRNA之雙鏈體形成部分之長度為至少20、2 1或22個核苷酸，例如，大小對應於Dicer依賴性裂解產生之RNA產物。在某些實施例中，shRNA構築體之長度為至少25、50、100、200、300或400個鹼基。在某些實施例中，shRNA構築體之長度為400-800個鹼基。shRNA構築體對環序列及環大小之變化具有高容許度。在實施例中，編碼siRNA、miRNA、shRNA或核酶之反轉錄病毒載體包含一或多個調控序列，諸如強組成型pol III，例如，人類U6 snRNA啟動子、小鼠U6 snRNA啟動子、人類及小鼠H l RNA啟動子及人類tRNA-val啟動子，或強組成型pol II啟動子。
2. 多肽
在一些實施例中，脂質粒子含有編碼蛋白質外源劑之核酸(亦稱作「編碼外源劑之有效負荷基因」)。在一些實施例中，本文所述之脂質粒子包含外源劑，其為蛋白質或包含蛋白質。
在一些實施例中，蛋白質可包括除胺基酸以外之部分(例如，可為醣蛋白、蛋白聚醣等)及/或可依其他方式加工或修飾。在一些實施例中，蛋白質有時可包括一個以上多肽鏈，例如，由一或多個二硫鍵連接或以其他方式締合。
在一些實施例中，蛋白質可含有L-胺基酸、D-胺基酸或兩者，且可含有多種胺基酸修飾或類似物中之任一者。在一些實施例中，蛋白質可包含天然胺基酸、非天然胺基酸、合成胺基酸及其組合。在一些實施例中，蛋白質為抗體、抗體片段、其生物活性部分及/或其特徵部分。在一些實施例中，多肽可包括其變異體，例如，與參考多肽具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%或99%之總體序列一致性。在一些實施例中，變異體多肽不與參考多肽共享至少一個特徵序列元件。在一些實施例中，變異體多肽共享參考多肽之一或多種生物活性。在一些實施例中，多肽變異體具有與參考一致之胺基酸序列，但在特定位置處有少量序列改變。在一些實施例中，與參考相比，變異體中少於約20%、約15%、約10%、約9%、約8%、約7%、約6%、約5%、約4%、約3%或約2%之殘基經取代、插入或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異體多肽包含約10個、約9個、約8個、約7個、約6個、約5個、約4個、約3個、約2個或約1個經取代之殘基。在一些實施例中，相對於參考，變異體多肽包含極少(例如，少於約5個、約4個、約3個、約2個或約1個)數目之經取代、插入或缺失之參與特定生物活性之功能性殘基。在一些實施例中，與參考相比，變異體多肽包含不超過約5個、約4個、約3個、約2個或約1個添加或缺失，且在一些實施例中，不包含添加或缺失。在一些實施例中，與參考相比，變異體多肽包含少於約25個、約20個、約19個、約18個、約17個、約16個、約15個、約14個、約13個、約10個、約9個、約8個、約7個、約6個且通常少於約5個、約4個、約3個或約2個添加或缺失。在一些實施例中，蛋白質包括多肽，例如，酶、結構多肽、信號傳導多肽、調控多肽、轉運多肽、感覺多肽、運動多肽、防禦多肽、儲存多肽、轉錄因子、抗體、細胞介素、激素、分解代謝多肽、合成代謝多肽、蛋白水解多肽、代謝多肽、激酶、轉移酶、水解酶、溶解酶、異構酶、連接酶、酶調節因子多肽、蛋白結合多肽、脂質結合多肽、膜融合多肽、細胞分化多肽、表觀遺傳多肽、細胞死亡多肽、核轉運多肽、核酸結合多肽、重編程多肽、DNA編輯多肽、DNA修復多肽、DNA重組多肽、轉座酶多肽、DNA整合多肽、靶向核酸內切酶(例如，鋅指核酸酶、轉錄活化子樣核酸酶(TALEN)、cas9及其同源物)、重組酶及其任何組合。在一些實施例中，蛋白質靶向細胞中之蛋白質以進行降解。在一些實施例中，蛋白質藉由將蛋白質定位於蛋白酶體來靶向細胞中之蛋白質以進行降解。在一些實施例中，蛋白質為野生型蛋白。在一些實施例中，蛋白質為突變體蛋白。
示例性蛋白質外源劑在以下小節中描述。在一些實施例中，本文所提供之脂質粒子可包括此類外源劑中之任一者。在特定實施例中，脂質粒子含有編碼此類外源劑中之任一者之核酸。
a. 細胞溶質蛋白
在一些實施例中，外源劑包含細胞溶質蛋白，例如，在受體細胞中產生且定位至受體細胞細胞質之蛋白質。在一些實施例中，外源劑包含分泌蛋白，例如，由受體細胞產生及分泌之蛋白質。在一些實施例中，外源劑包含核蛋白，例如，在受體細胞中產生且輸入受體細胞核中之蛋白質。在一些實施例中，外源劑包含細胞器蛋白(例如，粒線體蛋白)，例如，在受體細胞中產生且輸入受體細胞之細胞器(例如，粒線體)中之蛋白質。在一些實施例中，蛋白質為野生型蛋白或突變體蛋白。在一些實施例中，蛋白質為融合蛋白或嵌合蛋白。
b. 膜蛋白
在一些實施例中，外源劑包含膜蛋白。在一些實施例中，膜蛋白包含嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體、整合素、離子通道、成孔蛋白、Toll樣受體、介白素受體、細胞黏附蛋白或轉運蛋白。
1) 嵌合抗原受體(CAR)
在一些實施例中，本文所述之有效負荷基因編碼包含抗原結合結構域之嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，本文所述之外源劑包含含有抗原結合結構域之嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，有效負荷為或包含含有抗原結合結構域之嵌合抗原受體(CAR)。在一些實施例中，CAR為或包含第一代CAR，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域及信號傳導結構域(例如，一個、兩個或三個信號傳導結構域)。在一些實施例中，CAR包含第三代CAR，其包含抗原結合結構域、跨膜結構域及至少三個信號傳導結構域。在一些實施例中，第四代CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域、三個或四個信號傳導結構域及在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之結構域。在一些實施例中，抗原結合結構域為或包含scFv或Fab。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向細胞類型所特有之抗原。在一些實施例中，抗原結合結構域靶向贅瘤細胞所特有之抗原。在一些實施例中，贅瘤細胞所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道連接受體、酶連接受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶、組胺酸激酶相關受體、表皮生長因子受體(EGFR) (包括ErbB1/EGFR、ErbB2/HER2、ErbB3/HER3及ErbB4/HER4)、纖維母細胞生長因子受體(FGFR) (包括FGF1、FGF2、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、FGF7、FGF18及FGF21)、血管內皮生長因子受體(VEGFR) (包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D及PIGF)、RET受體及Eph受體家族(包括EphA1、EphA2、EphA3、EphA4、EphA5、EphA6、EphA7、EphA8、EphA9、EphA10、EphB1、EphB2、EphB3、EphB4及EphB6)、CXCR1、CXCR2、CXCR3、CXCR4、CXCR6、CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR8、CFTR、CIC-1、CIC-2、CIC-4、CIC-5、CIC-7、CIC-Ka、CIC-Kb、斑萎蛋白(Bestrophin)、TMEM16A、GABA受體、甘胺酸受體、ABC轉運子、NAV1.1、NAV1.2、NAV1.3、NAV1.4、NAV1.5、NAV1.6、NAV1.7、NAV1.8、NAV1.9、鞘胺醇-1磷酸受體(S1P1R)、NMDA通道、跨膜蛋白、多次跨膜蛋白、T細胞受體模體、T細胞α鏈、T細胞β鏈、T細胞γ鏈、T細胞δ鏈、CCR7、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD11b、CD11c、CD16、CD19、CD20、CD21、CD22、CD25、CD28、CD34、CD35、CD40、CD45RA、CD45RO、CD52、CD56、CD62L、CD68、CD80、CD95、CD117、CD127、CD133、CD137 (4-1 BB)、CD163、F4/80、IL-4Ra、Sca-1、CTLA-4、GITR、GARP、LAP、顆粒酶B、LFA-1、轉鐵蛋白受體、NKp46、穿孔蛋白、CD4+、Th1、Th2、Th17、Th40、Th22、Th9、Tfh、規範Treg、FoxP3+、Tr1、Th3、Treg17、T
REG、CDCP1、NT5E、EpCAM、CEA、gpA33、黏蛋白(Mucin)、TAG-72、碳酸酐酶IX、PSMA、葉酸結合蛋白、神經節苷脂(例如，CD2、CD3、GM2)、Lewis-γ
2、VEGF、VEGFR 1/2/3、αVβ3、α5β1、ErbB1/EGFR、ErbB1/HER2、ErB3、c-MET、IGF1R、EphA3、TRAIL-R1、TRAIL-R2、RANKL、FAP、生腱蛋白(Tenascin)、PDL-1、BAFF、HDAC、ABL、FLT3、KIT、MET、RET、IL-1β、ALK、RANKL、mTOR、CTLA-4、IL-6、IL-6R、JAK3、BRAF、PTCH、滑蛋白(Smoothened)、PIGF、ANPEP、TIMP1、PLAUR、PTPRJ、LTBR或ANTXR1、葉酸受體α (FRa)、ERBB2 (Her2/neu)、EphA2、IL-13Ra2、表皮生長因子受體(EGFR)、間皮素(Mesothelin)、TSHR、CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、CLL-1、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、BCMA、MUC16 (CA125)、L1CAM、LeY、MSLN、IL13Rα1、L1-CAM、Tn Ag、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、ROR1、FLT3、FAP、TAG72、CD38、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、介白素-11受體a (IL-11Ra)、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、血小板源性生長因子受體-β (PDGFR-β)、SSEA-4、CD20、MUC1、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-1受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、o-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、聚唾液酸、PLACl、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-la、MAGE-A1、豆莢蛋白(legumain)、HPV E6、E7、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、主要組織相容性複合物I類相關基因蛋白(MR1)、尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化子受體(uPAR)、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺癌相關蛋白(prostein)、存活素(survivin)、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8 (Galectin 8)、MelanA/ MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷裂點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白B1 (Cyclin B1)、MYCN、RhoC、TRP-2、CYPIB I、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶反轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、新抗原、CD133、CD15、CD184、CD24、CD56、CD26、CD29、CD44、HLA-A、HLA-B、HLA-C、(HLA-A,B,C) CD49f、CD151 CD340、CD200、tkrA、trkB或trkC或其抗原片段或抗原部分。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向T細胞所特有之抗原。在一些實施例中，T細胞所特有之抗原係選自T細胞所特有之細胞表面受體、膜轉運蛋白(例如主動或被動轉運蛋白，諸如離子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受體、膜酶及/或細胞黏附蛋白。在一些實施例中，T細胞所特有之抗原可為G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶、組胺酸激酶相關受體、AKT1、AKT2、AKT3、ATF2、BCL10、CALM1、CD3D (CD3δ)、CD3E (CD3ε)、CD3G (CD3γ)、CD4、CD8、CD28、CD45、CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2)、CD247 (CD3ζ)、CTLA4 (CD152)、ELK1、ERK1 (MAPK3)、ERK2、FOS、FYN、GRAP2 (GADS)、GRB2、HLA-DRA、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HRAS、IKBKA (CHUK)、IKBKB、IKBKE、IKBKG (NEMO)、IL2、ITPR1、ITK、JUN、KRAS2、LAT、LCK、MAP2K1 (MEK1)、MAP2K2 (MEK2)、MAP2K3 (MKK3)、MAP2K4 (MKK4)、MAP2K6 (MKK6)、MAP2K7 (MKK7)、MAP3K1 (MEKK1)、MAP3K3、MAP3K4、MAP3K5、MAP3K8、MAP3K14 (NIK)、MAPK8 (JNK1)、MAPK9 (JNK2)、MAPK10 (JNK3)、MAPK11 (p38β)、MAPK12 (p38γ)、MAPK13 (p38δ)、MAPK14 (p38α)、NCK、NFAT1、NFAT2、NFKB1、NFKB2、NFKBIA、NRAS、PAK1、PAK2、PAK3、PAK4、PIK3C2B、PIK3C3 (VPS34)、PIK3CA、PIK3CB、PIK3CD、PIK3R1、PKCA、PKCB、PKCM、PKCQ、PLCY1、PRF1 (穿孔蛋白)、PTEN、RAC1、RAF1、RELA、SDF1、SHP2、SLP76、SOS、SRC、TBK1、TCRA、TEC、TRAF6、VAV1、VAV2或ZAP70。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向病症所特有之抗原。在一些實施例中，抗原結合結構域靶向自體免疫或發炎性病症所特有之抗原。在一些實施例中，自體免疫或發炎性病症係選自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡、關節炎、免疫複合物腎小球腎炎、古德巴斯德症(goodpasture)、眼色素層炎、肝炎、全身性硬化或硬皮症、I型糖尿病、多發性硬化、冷凝集素疾病、尋常天疱瘡、格雷氏病(Grave's disease)、自體免疫溶血性貧血、A型血友病、原發性休格倫氏症候群(Primary Sjogren's Syndrome)、血栓性血小板減少性紫癜、視神經脊髓炎、伊凡氏症候群(Evan's syndrome)、IgM介導之神經病變、冷凝球蛋白血症、皮肌炎、特發性血小板減少症、僵直性脊椎炎、大疱性類天疱瘡、獲得性血管水腫、慢性蕁麻疹性抗磷脂脫髓鞘性多神經病變及自體免疫血小板減少症或嗜中性球減少症或純紅血球再生不良，而同種免疫疾病之示例性非限制性實例包括來自以下之同種致敏(參見例如Blazar等人, 2015, Am. J. Transplant, 15(4):931-41)或異種致敏：造血或實體器官移植、輸血、具有胎兒同種致敏之妊娠、新生同種免疫血小板減少症、新生兒溶血病、對外來抗原之致敏(諸如可藉由替代用酶或蛋白質替代療法治療之遺傳性或獲得性缺陷病症來進行)、血液產品及基因療法。在一些實施例中，自體免疫或發炎性病症所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道連接受體、酶連接受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。在一些實施例中，CAR抗原結合結構域結合至B細胞、漿細胞、漿母細胞上表現之配位體、CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干擾素受體、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3γ、CD5或CD2。參見US 2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，該等文獻之內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向衰老細胞所特有之抗原，例如，尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化子受體(uPAR)。在一些實施例中，CAR可用於治療或預防以衰老細胞異常累積為特徵之病症，例如，肝及肺纖維化、動脈粥樣硬化、糖尿病及骨關節炎。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向感染性疾病所特有之抗原。在一些實施例中，其中感染性疾病係選自HIV、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類疱疹病毒、人類疱疹病毒8 (HHV-8，卡波西氏肉瘤相關疱疹病毒(Kaposi sarcoma-associated herpes virus，KSHV))、人類T-親淋巴性病毒-1 (HTLV-1)、默克細胞多瘤病毒(Merkel cell polyomavirus，MCV)、猿猴病毒40 (SV40)、愛潑斯坦-巴爾病毒(Eptstein-Barr virus)、CMV、人類乳頭瘤病毒。在一些實施例中，感染性疾病所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道連接受體、酶連接受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶、組胺酸激酶相關受體、HIV Env、gpl20或HIV-1 Env上CD4誘導之抗原決定基。
在一些實施例中，CAR跨膜結構域包含T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能變異體之至少跨膜區。在一些實施例中，跨膜結構域包含CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS及FGFR2B或其功能變異體之至少跨膜區。
在一些實施例中，CAR包含至少一個選自以下一或多者之信號傳導結構域：B7-1/CD80；B7-2/CD86；B7-H1/PD-L1；B7-H2；B7-H3；B7-H4；B7-H6；B7-H7；BTLA/CD272；CD28；CTLA-4；Gi24/VISTA/B7-H5；ICOS/CD278；PD-1；PD-L2/B7-DC；PDCD6；4-1BB/TNFSF9/CD137；4-1BB配位體/TNFSF9；BAFF/BLyS/TNFSF13B；BAFF R/TNFRSF13C；CD27/TNFRSF7；CD27配位體/TNFSF7；CD30/TNFRSF8；CD30配位體/TNFSF8；CD40/TNFRSF5；CD40/TNFSF5；CD40配位體/TNFSF5；DR3/TNFRSF25；GITR/TNFRSF18；GITR配位體/TNFSF18；HVEM/TNFRSF14；LIGHT/TNFSF14；淋巴毒素-α/TNF-β；OX40/TNFRSF4；OX40配位體/TNFSF4；RELT/TNFRSF19L；TACI/TNFRSF13B；TL1A/TNFSF15；TNF-α；TNF RII/TNFRSF1B)；2B4/CD244/ SLAMF4；BLAME/SLAMF8；CD2；CD2F-10/SLAMF9；CD48/SLAMF2；CD58/LFA-3；CD84/SLAMF5；CD229/SLAMF3；CRACC/SLAMF7；NTB-A/ SLAMF6；SLAM/CD150；CD2；CD7；CD53；CD82/Kai-1；CD90/Thy1；CD96；CD160；CD200；CD300a/LMIR1；HLA I類；HLA-DR；Ikaros；整合素α4/CD49d；整合素α4 β1；整合素α4 β7/LPAM-1；LAG-3；TCL1A；TCL1B；CRTAM；DAP12；Dectin-1/CLEC7A；DPPIV/CD26；EphB6；TIM-1/KIM-1/HAVCR；TIM-4；TSLP；TSLP R；淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)；NKG2C、CD3ζ結構域、基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體或其功能片段。
在一些實施例中，CAR包含CD3ζ結構域或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；及(ii) CD28結構域、或4-1BB結構域、或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；(ii) CD28結構域或其功能變異體；及(iii) 4-1BB結構域、或CD134結構域、或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；(ii) CD28結構域、或4-1BB結構域、或其功能變異體，及/或(iii) 4-1BB結構域、或CD134結構域、或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；(ii) CD28結構域或其功能變異體；(iii) 4-1BB結構域、或CD134結構域、或其功能變異體；及(iv)細胞介素或共刺激配位體轉殖基因。
在一些實施例中，CAR進一步包含一或多個間隔子，例如，其中該間隔子為抗原結合結構域與跨膜結構域之間的第一間隔子。在一些實施例中，第一間隔子包括免疫球蛋白恆定區或其變異體或經修飾型式之至少一部分。在一些實施例中，間隔子為跨膜結構域與信號傳導結構域之間的第二間隔子。在一些實施例中，第二間隔子為寡肽，例如，其中該寡肽包含甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
在一些實施例中，外源劑為或包含CAR，例如，第一代CAR或編碼第一代CAR之核酸。在一些實施例中，第一代CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域及信號傳導結構域。在一些實施例中，信號傳導結構域在T細胞活化期間介導下游信號傳導。
在一些實施例中，外源劑為或包含第二代CAR或編碼第二代CAR之核酸。在一些實施例中，第二代CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域及兩個信號傳導結構域。在一些實施例中，信號傳導結構域在T細胞活化期間介導下游信號傳導。在一些實施例中，信號傳導結構域為共刺激結構域。在一些實施例中，共刺激結構域在T細胞活化期間增強細胞介素產生、CAR T細胞增殖及或CAR T細胞持久性。
在一些實施例中，外源劑為或包含第三代CAR或編碼第三代CAR之核酸。在一些實施例中，第三代CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域及至少三個信號傳導結構域。在一些實施例中，信號傳導結構域在T細胞活化期間介導下游信號傳導。在一些實施例中，信號傳導結構域為共刺激結構域。在一些實施例中，共刺激結構域在T細胞活化期間增強細胞介素產生、CAR T細胞增殖及或CAR T細胞持久性。在一些實施例中，第三代CAR包含至少兩個共刺激結構域。在一些實施例中，至少兩個共刺激結構域不相同。
在一些實施例中，外源劑為或包含第四代CAR或編碼第四代CAR之核酸。在一些實施例中，第四代CAR包含抗原結合結構域、跨膜結構域及至少兩個、三個或四個信號傳導結構域。在一些實施例中，信號傳導結構域在T細胞活化期間介導下游信號傳導。在一些實施例中，信號傳導結構域為共刺激結構域。在一些實施例中，共刺激結構域在T細胞活化期間增強細胞介素產生、CAR T細胞增殖及或CAR T細胞持久性。
在一些實施例中，第一代、第二代、第三代或第四代CAR進一步包含在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之結構域。在一些實施例中，細胞介素基因對於包含CAR之靶細胞為內源或外源的，該CAR包含在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之結構域。在一些實施例中，細胞介素基因編碼促炎細胞介素。在一些實施例中，細胞介素基因編碼IL-1、IL-2、IL-9、IL-12、IL-18、TNF或IFN-γ或其功能片段。在一些實施例中，在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之結構域為或包含轉錄因子或其功能結構域或片段。在一些實施例中，在CAR之成功信號傳導後誘導細胞介素基因表現之結構域為或包含轉錄因子或其功能結構域或片段。在一些實施例中，轉錄因子或其功能結構域或片段為或包含活化T細胞核因子(NFAT)、NF-kB或其功能結構域或片段。參見例如Zhang. C.等人, Engineering CAR-T cells. Biomarker Research. 5:22 (2017)；WO 2016126608；Sha, H.等人 Chimaeric antigen receptor T-cell therapy for tumour immunotherapy. Bioscience Reports 2017年1月27日, 37 (1)。
在一些實施例中，CAR抗原結合結構域為或包含抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，CAR抗原結合結構域為或包含scFv或Fab。在一些實施例中，CAR抗原結合結構域包含以下抗體之scFv或Fab片段：T細胞α鏈抗體；T細胞β鏈抗體；T細胞γ鏈抗體；T細胞δ鏈抗體；CCR7抗體；CD3抗體；CD4抗體；CD5抗體；CD7抗體；CD8抗體；CD11b抗體；CD11c抗體；CD16抗體；CD19抗體；CD20抗體；CD21抗體；CD22抗體；CD25抗體；CD28抗體；CD34抗體；CD35抗體；CD40抗體；CD45RA抗體；CD45RO抗體；CD52抗體；CD56抗體；CD62L抗體；CD68抗體；CD80抗體；CD95抗體；CD117抗體；CD127抗體；CD133抗體；CD137 (4-1 BB)抗體；CD163抗體；F4/80抗體；IL-4Ra抗體；Sca-1抗體；CTLA-4抗體；GITR抗體GARP抗體；LAP抗體；顆粒酶B抗體；LFA-1抗體；MR1抗體；uPAR抗體；或轉鐵蛋白受體抗體。
在一些實施例中，抗原結合結構域結合至細胞之細胞表面抗原。在一些實施例中，細胞表面抗原為一種類型之細胞所特有的。在一些實施例中，細胞表面抗原為一種以上類型之細胞所特有的。
在一些實施例中，CAR抗原結合結構域結合T細胞所特有之細胞表面抗原。在一些實施例中，T細胞所特有之抗原可為T細胞所特有之細胞表面受體、膜轉運蛋白(例如主動或被動轉運蛋白，諸如離子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受體、膜酶及/或細胞黏附蛋白。在一些實施例中，T細胞所特有之抗原可為G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。
在一些實施例中，T細胞所特有之抗原可為T細胞受體。在一些實施例中，T細胞受體可為AKT1；AKT2；AKT3；ATF2；BCL10；CALM1；CD3D (CD3δ)；CD3E (CD3ε)；CD3G (CD3γ)；CD4；CD8；CD28；CD45；CD80 (B7-1)；CD86 (B7-2)；CD247 (CD3ζ)；CTLA4 (CD152)；ELK1；ERK1 (MAPK3)；ERK2；FOS；FYN；GRAP2 (GADS)；GRB2；HLA-DRA；HLA-DRB1；HLA-DRB3；HLA-DRB4；HLA-DRB5；HRAS；IKBKA (CHUK)；IKBKB；IKBKE；IKBKG (NEMO)；IL2；ITPR1；ITK；JUN；KRAS2；LAT；LCK；MAP2K1 (MEK1)；MAP2K2 (MEK2)；MAP2K3 (MKK3)；MAP2K4 (MKK4)；MAP2K6 (MKK6)；MAP2K7 (MKK7)；MAP3K1 (MEKK1)；MAP3K3；MAP3K4；MAP3K5；MAP3K8；MAP3K14 (NIK)；MAPK8 (JNK1)；MAPK9 (JNK2)；MAPK10 (JNK3)；MAPK11 (p38β)；MAPK12 (p38γ)；MAPK13 (p38δ)；MAPK14 (p38α)；NCK；NFAT1；NFAT2；NFKB1；NFKB2；NFKBIA；NRAS；PAK1；PAK2；PAK3；PAK4；PIK3C2B；PIK3C3 (VPS34)；PIK3CA；PIK3CB；PIK3CD；PIK3R1；PKCA；PKCB；PKCM；PKCQ；PLCY1；PRF1 (穿孔蛋白)；PTEN；RAC1；RAF1；RELA；SDF1；SHP2；SLP76；SOS；SRC；TBK1；TCRA；TEC；TRAF6；VAV1；VAV2；或ZAP70。
在一些實施例中，CAR包含信號傳導結構域，其為共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含第二共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含至少兩個共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含至少三個共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含選自以下一或多者之共刺激結構域：CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體。
在一些實施例中，CAR包含CD3ζ結構域或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；及(ii) CD28結構域、或4-1BB結構域、或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；(ii) CD28結構域或其功能變異體；及(iii) 4-1BB結構域、或CD134結構域、或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；(ii) CD28結構域、或4-1BB結構域、或其功能變異體，及/或(iii) 4-1BB結構域、或CD134結構域、或其功能變異體。在一些實施例中，CAR包含(i) CD3ζ結構域、或基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、或其功能變異體；(ii) CD28結構域或其功能變異體；(iii) 4-1BB結構域、或CD134結構域、或其功能變異體；及(iv)細胞介素或共刺激配位體轉殖基因。
在某些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含連接至CD3 (例如，CD3-ζ)細胞內結構域之CD28跨膜及信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含連接至CD3ζ細胞內結構域之嵌合CD28及CD137 (4-1BB，TNFRSF9)共刺激結構域。
在一些實施例中，CAR在細胞質部分中包含一或多個，例如兩個或更多個共刺激結構域及活化結構域，例如，初級活化結構域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28及4-1BB之細胞內組分。
在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括4-1BB信號傳導結構域及CD3-ζ信號傳導結構域之細胞內組分。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括CD28信號傳導結構域及CD3ζ信號傳導結構域之細胞內組分。
在一些實施例中，CAR包含結合至抗原(例如，腫瘤抗原)之細胞外抗原結合結構域(例如抗體或抗體片段，諸如scFv)、間隔子(例如含有鉸鏈結構域，諸如本文所述之任一者)、跨膜結構域(例如本文所述之任一者)及細胞內信號傳導結構域(例如任何細胞內信號傳導結構域，諸如本文所述之初級信號傳導結構域或共刺激信號傳導結構域)。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域為或包括初級細胞質信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域另外包括共刺激分子之細胞內信號傳導結構域(例如，共刺激結構域)。
在一些實施例中，CAR含有一或多個結構域，其將提供對所需抗原(例如，腫瘤抗原)之特異性的抗原或配位體結合結構域(例如，抗體或抗體片段)與細胞內信號傳導結構域組合。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域為刺激或活化細胞內結構域部分，諸如T細胞刺激或活化結構域，從而提供初級活化信號或初級信號。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域含有或另外含有共刺激信號傳導結構域以促進效應功能。在一些實施例中，嵌合受體當基因工程改造至免疫細胞中時可調節T細胞活性，且在一些情況下可調節T細胞分化或體內平衡，從而使得基因工程改造之細胞在活體內具有改良之壽命、存活及/或持久性，諸如用於過繼細胞治療方法。
示例性抗原受體(包括CAR)及將此類受體工程改造及引入細胞中之方法，包括例如W0200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、W02013/123061、美國專利申請公開案第US2002131960號、第US2013287748號、第US20130149337號、美國專利第6,451,995號、第7,446,190號、第8,252,592號、第8,339,645號、第8,398,282號、第7,446,179號、第6,410,319號、第7,070,995號、第7,265,209號、第7,354,762號、第7,446,191號、第8,324,353號及第8,479,118號以及歐洲專利申請案第EP2537416號中所述之彼等，及/或Sadelain等人, Cancer Discov. 2013年4月; 3(4): 388-398；Davila等人 (2013) PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle等人, Curr. Opin. Immunol., 2012年10月; 24(5): 633-39；Wu等人, Cancer, 2012年3月 18(2): 160-75所述之彼等。在一些態樣中，抗原受體包括如美國專利第7,446,190號中所述之CAR及WO/2014055668中所述之彼等。CAR之實例包括如前述公開案中之任一者所揭示之CAR，諸如WO2014031687；US 8,339,645；US 7,446,179；US 2013/0149337；US 7,446,190；US 8,389,282；Kochenderfer等人, (2013) Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276；Wang等人 (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；及Brentjens等人, Sci Transl Med. 2013 5(177)。亦參見WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、US 7,446,190及US 8,389,282。重組受體(諸如CAR)一般包括細胞外抗原結合結構域，諸如抗體分子之一部分，一般為抗體之可變重(VH)鏈區及/或可變輕(VL)鏈區，例如，scFv抗體片段。在一些實施例中，CAR分子之抗原結合結構域包含抗體、抗體片段、scFv、Fv、Fab、(Fab')
2、單結構域抗體(SdAb)、VH或VL結構域，或駱駝科VHH結構域。
在一些實施例中，CAR抗原結合結構域為或包含抗體或其抗原結合部分。在一些實施例中，CAR抗原結合結構域為或包含scFv或Fab。在一些實施例中，CAR抗原結合結構域包含以下抗體之scFv或Fab片段：CD19抗體；CD22抗體；T細胞α鏈抗體；T細胞β鏈抗體；T細胞γ鏈抗體；T細胞δ鏈抗體；CCR7抗體；CD3抗體；CD4抗體；CD5抗體；CD7抗體；CD8抗體；CD11b抗體；CD11c抗體；CD16抗體；CD20抗體；CD21抗體；CD25抗體；CD28抗體；CD34抗體；CD35抗體；CD40抗體；CD45RA抗體；CD45RO抗體；CD52抗體；CD56抗體；CD62L抗體；CD68抗體；CD80抗體；CD95抗體；CD117抗體；CD127抗體；CD133抗體；CD137 (4-1 BB)抗體；CD163抗體；F4/80抗體；IL-4Ra抗體；Sca-1抗體；CTLA-4抗體；GITR抗體GARP抗體；LAP抗體；顆粒酶B抗體；LFA-1抗體；MR1抗體；uPAR抗體；或轉鐵蛋白受體抗體。
在一些實施例中，CAR包含信號傳導結構域，其為共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含第二共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含至少兩個共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含至少三個共刺激結構域。在一些實施例中，CAR包含選自以下一或多者之共刺激結構域：CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體。在一些實施例中，若CAR包含兩個或更多個共刺激結構域，則兩個共刺激結構域為不同的。在一些實施例中，若CAR包含兩個或更多個共刺激結構域，則兩個共刺激結構域為相同的。
表 3中描述CAR之示例性組分之實例。在所提供之態樣中，CAR中各組分之序列可包括表3中所列之任何組合。
| 表3：CAR組分及示例性序列 | ||
| 組分 | 序列 | SEQ ID NO |
| 細胞外結合結構域 | ||
| 抗CD19 scFv (FMC63) | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 239 |
| 抗CD19 scFv (FMC63) | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 240 |
| 間隔子( 例如鉸鏈) | ||
| IgG4鉸鏈 | ESKYGPPCPPCP | 241 |
| CD8鉸鏈 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPE | 242 |
| CD28 | IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP | 243 |
| 跨膜 | ||
| CD8 | ACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC | 244 |
| CD28 | FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | 245 |
| CD28 | FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | 246 |
| 共刺激結構域 | ||
| CD28 | RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS | 247 |
| 4-1BB | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL | 248 |
| 初級信號傳導結構域 | ||
| CD3ζ | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 249 |
| CD3ζ | RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 250 |
在一些實施例中，CAR進一步包含一或多個間隔子，例如，其中該間隔子為抗原結合結構域與跨膜結構域之間的第一間隔子。在一些實施例中，第一間隔子包括免疫球蛋白恆定區或其變異體或經修飾型式之至少一部分。在一些實施例中，間隔子為跨膜結構域與信號傳導結構域之間的第二間隔子。在一些實施例中，第二間隔子為寡肽，例如，其中該寡肽包含甘胺酸-絲胺酸雙聯體。
除本文所述之CAR以外，多種嵌合抗原受體及編碼嵌合抗原受體之核苷酸序列在此項技術中為已知的且將適用於如本文所述之活體內及活體外靶細胞之融合體遞送及重編程。參見例如WO2013040557；WO2012079000；WO2016030414；Smith T等人, Nature Nanotechnology. 2017. DOI: 10.1038/ NNANO.2017.57，該等文獻之揭示內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，受體靶向之抗原為多肽。在一些實施例中，其為碳水化合物或其他分子。在一些實施例中，與正常或非靶向細胞或組織相比，抗原在疾病或疾患之細胞，例如腫瘤或致病細胞上選擇性表現或過表現。在其他實施例中，抗原在正常細胞上表現及/或在工程改造之細胞上表現。
在一些實施例中，受體靶向之抗原包括與B細胞惡性病相關之抗原，諸如許多已知B細胞標誌中之任一者。在一些實施例中，受體靶向之抗原為CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD47、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些實施例中，CAR結合至CD19。在一些實施例中，CAR結合至CD22。在一些實施例中，CAR結合至CD19及CD22。在一些實施例中，CAR係選自由第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR及第四代CAR組成之群。在一些實施例中，CAR包括結合至單一靶抗原之單一結合結構域。在一些實施例中，CAR包括結合至一種以上靶抗原，例如2種、3種或更多種靶抗原之單一結合結構域。在一些實施例中，CAR包括兩個結合結構域，使得各結合結構域結合至不同靶抗原。在一些實施例中，CAR包括兩個結合結構域，使得各結合結構域結合至相同靶抗原。示例性CAR (包括CD19特異性、CD22特異性及CD19/CD22雙特異性CAR)之詳細描述可見於WO2012/079000、WO2016/149578及WO2020/014482中，包括序列表及圖式之揭示內容以全文引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，嵌合抗原受體包括含有抗體或抗體片段之細胞外部分。在一些態樣中，嵌合抗原受體包括含有抗體或片段之細胞外部分及細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，抗體或片段包括scFv。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向之抗原為CD19。在一些態樣中，重組受體(例如，CAR)之抗原結合結構域及抗原結合結構域結合，諸如特異性結合或特異性識別CD19，諸如人類CD19。在一些實施例中，scFv含有來源於對CD19具有特異性之抗體或抗體片段的VH及VL。在一些實施例中，結合CD19之抗體或抗體片段為源自小鼠之抗體，諸如FMC63及SJ25C1。在一些實施例中，抗體或抗體片段為人類抗體，例如，如美國專利公開案第US 2016/0152723號中所述。
在一些實施例中，抗原為CD19。在一些實施例中，scFv含有來源於對CD 19具有特異性之抗體或抗體片段的VH及VL。在一些實施例中，結合CD 19之抗體或抗體片段為源自小鼠之抗體，諸如FMC63及SJ25C1。在一些實施例中，抗體或抗體片段為人類抗體，例如，如美國專利公開案第US 2016/0152723號中所述。
在一些實施例中，scFv來源於FMC63。FMC63一般係指針對表現人類來源之CD19之Naim-1及Naim-16細胞產生的小鼠單株IgGl 抗體(Fing, N. R.等人 (1987). Leucocyte typing III. 302)。
在一些實施例中，重組受體(例如，CAR)之抗體部分進一步包括跨膜結構域與細胞外抗原結合結構域之間的間隔子。在一些實施例中，間隔子包括至少一部分免疫球蛋白恆定區，諸如鉸鏈區，例如IgG4鉸鏈區，及/或CH1/CL及/或Fc區。在一些實施例中，恆定區或部分屬於人類IgG，諸如IgG4或IgGl。在一些態樣中，恆定區之部分用作抗原識別組分(例如，scFv)與跨膜結構域之間的間隔區。與不存在間隔子之情況相比，間隔子之長度可提供在抗原結合後增加之細胞反應性。示例性間隔子包括但不限於Hudecek等人 (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153，WO2014031687，美國專利第8,822,647號或公開申請案第US 2014/0271635號中所述之彼等。在一些實施例中，恆定區或部分屬於人類IgG，諸如IgG4或IgGl。
在一些實施例中，抗原受體包含直接或間接連接至細胞外結構域之細胞內結構域。在一些實施例中，嵌合抗原受體包括連接細胞外結構域及細胞內信號傳導結構域之跨膜結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含IT AM。舉例而言，在一些態樣中，抗原識別結構域(例如，細胞外結構域)一般連接至一或多種細胞內信號傳導組分，諸如模擬經由抗原受體複合物(在CAR之情況下，諸如TCR複合物)之活化及/或經由另一種細胞表面受體之信號的信號傳導組分。在一些實施例中，嵌合受體包含在細胞外結構域(例如，scFv)與細胞內信號傳導結構域之間連接或融合之跨膜結構域。因此，在一些實施例中，抗原結合組分(例如，抗體)連接至一或多個跨膜及細胞內信號傳導結構域。
在一個實施例中，使用天然與受體(例如，CAR)中之結構域之一相關之跨膜結構域。在一些情況下，藉由胺基酸取代選擇或修飾跨膜結構域，以避免此類結構域與相同或不同表面膜蛋白之跨膜結構域結合，從而使得與受體複合物之其他成員的相互作用最小化。
在一些實施例中，CAR跨膜結構域包含T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能變異體之至少跨膜區。在一些實施例中，跨膜結構域包含CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS及FGFR2B或其功能變異體之至少跨膜區。在一些實施例中，跨膜結構域來源於天然來源或合成來源。在來源為天然之情況下，在一些態樣中，結構域來源於任何膜結合或跨膜蛋白。跨膜區包括來源於T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD 134、CD 137、CD 154 (亦即，包含其至少跨膜區)之彼等。或者，在一些實施例中，跨膜結構域為合成的。在一些態樣中，合成跨膜結構域主要包含疏水性殘基，諸如白胺酸及纈胺酸。在一些態樣中，苯丙胺酸、色胺酸及纈胺酸之三聯體將存在於合成跨膜結構域之每一端。在一些實施例中，連接係經由連接子、間隔子及/或跨膜結構域。在一些態樣中，跨膜結構域含有CD28之跨膜部分。
在一些實施例中，細胞外結構域及跨膜結構域可直接或間接連接。在一些實施例中，細胞外結構域及跨膜由間隔子連接，諸如本文所述之任何間隔子。在一些實施例中，受體含有跨膜結構域所來源之分子之細胞外部分，諸如CD28細胞外部分。
細胞內信號傳導結構域為模擬或近似經由天然抗原受體之信號、經由此種受體與共刺激受體組合之信號及/或經由單獨共刺激受體之信號的彼等。在一些實施例中，存在短寡肽或多肽連接子，例如長度介於2個與10個胺基酸之間的連接子，諸如含有甘胺酸及絲胺酸之連接子，例如甘胺酸-絲胺酸雙聯體，且在CAR之跨膜結構域與細胞質信號傳導結構域之間形成連接。
在一些態樣中，將T細胞活化描述為由兩類細胞質信號傳導序列介導：經由TCR啟動抗原依賴性初級活化之彼等(初級細胞質信號傳導序列)，及以抗原非依賴性方式起作用以提供二級或共刺激信號之彼等(二級細胞質信號傳導序列)。在一些態樣中，CAR包括此類信號傳導組分中之一或兩者。
受體(例如，CAR)一般包括至少一種細胞內信號轉導組分。在一些態樣中，CAR包括調控TCR複合物之初級活化之初級細胞質信號傳導序列。以刺激方式起作用之初級細胞質信號傳導序列可含有信號傳導模體，稱為基於酪胺酸之免疫受體活化模體或IT AM。含有初級細胞質信號傳導序列之IT AM之實例包括來源於CD3ζ鏈、FcRγ、CD3γ、CD3δ及CD3ε之彼等。在一些實施例中，CAR中之細胞質信號傳導分子含有細胞質信號傳導結構域、其部分或來源於CD3ζ之序列。
在一些實施例中，受體包括TCR複合物之細胞內組分，諸如介導T細胞活化及細胞毒性之TCR CD3鏈，例如，CD3ζ鏈。因此，在一些態樣中，抗原結合部分連接至一或多個細胞信號傳導模組。在一些實施例中，細胞信號傳導模組包括CD3跨膜結構域、CD3細胞內信號傳導結構域及/或其他CD跨膜結構域。在一些實施例中，細胞內組分為或包括CD3-ζ細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞內組分為或包括來自Fc受體γ鏈之信號傳導結構域。在一些實施例中，受體(例如，CAR)包括細胞內信號傳導結構域且進一步包括一或多種額外分子，諸如CD8、CD4、CD25或CD 16之一部分，諸如跨膜結構域及/或鉸鏈部分。舉例而言，在一些態樣中，CAR或其他嵌合受體為CD3-ζ (CD3-z)或Fc受體與CD8、CD4、CD25或CD16之一的一部分之嵌合分子。
在一些實施例中，在連接CAR或其他嵌合受體後，受體之細胞質結構域或細胞內信號傳導結構域活化免疫細胞，例如經工程改造以表現CAR之T細胞的至少一種正常效應功能或反應。舉例而言，在一些背景下，CAR誘導T細胞之功能，諸如細胞溶解活性或T輔助活性，諸如細胞介素或其他因子之分泌。在一些實施例中，舉例而言，使用抗原受體組分或共刺激分子之細胞內信號傳導結構域之經截短部分替代完整免疫刺激鏈，條件為其轉導效應功能信號。在一些實施例中，一或多個細胞內信號傳導結構域包括T細胞受體(TCR)之細胞質序列，且在一些態樣中亦包括在天然背景下與此類受體協同作用以在抗原受體嚙合後啟動信號轉導之輔受體的彼等。
在天然TCR之背景下，完全活化一般不僅需要經由TCR之信號傳導，而且需要共刺激信號。因此，在一些實施例中，為促進完全活化，CAR中亦包括用於產生二級或共刺激信號之組分。在其他實施例中，CAR不包括用於產生共刺激信號之組分。在一些態樣中，額外CAR在同一細胞中表現且提供用於產生二級或共刺激信號之組分。
在一些實施例中，嵌合抗原受體含有T細胞共刺激分子之細胞內結構域。在一些實施例中，CAR包括共刺激受體之信號傳導結構域及/或跨膜部分，諸如CD28、4-1BB、OX40、DAP10及ICOS。在一些態樣中，相同CAR包括活化組分及共刺激組分。在一些實施例中，嵌合抗原受體含有來源於T細胞共刺激分子或其功能變異體之細胞內結構域，諸如在跨膜結構域與細胞內信號傳導結構域之間。在一些態樣中，T細胞共刺激分子為CD28或41BB。在一些態樣中，T細胞共刺激分子為41BB。
在一些實施例中，活化結構域包括於一個CAR內，而共刺激組分由識別另一個抗原之另一個CAR提供。在一些實施例中，CAR包括活化或刺激CAR、共刺激CAR，兩者均在同一細胞上表現(參見WO2014/055668)。在一些態樣中，細胞包括一或多個刺激或活化CAR及/或共刺激CAR。在一些實施例中，細胞進一步包括抑制性CAR (iCAR，參見Fedorov等人, Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013年12月))，諸如識別與疾病或疾患相關及/或對於疾病或疾患特定之抗原以外之抗原的CAR，從而藉由抑制性CAR與其配位體之結合來減少或抑制經由疾病靶向CAR遞送之活化信號，例如，以減少脫靶效應。
在某些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含連接至CD3 (例如，CD3-ζ)細胞內結構域之CD28跨膜及信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包含連接至CD3ζ細胞內結構域之嵌合CD28及CD137 (4-1BB，TNFRSF9)共刺激結構域。
在一些實施例中，CAR在細胞質部分中包含一或多個，例如兩個或更多個共刺激結構域及活化結構域，例如，初級活化結構域。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28及4-1BB之細胞內組分。
在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括4-1BB信號傳導結構域及CD3-ζ信號傳導結構域之細胞內組分。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域包括CD28信號傳導結構域及CD3ζ信號傳導結構域之細胞內組分。
在一些實施例中，CD19特異性CAR包括抗CD19單鏈抗體片段(scFv)、跨膜結構域(諸如來源於人類CD8α之跨膜結構域)、4-1BB (CD137)共刺激信號傳導結構域及CD3ζ信號傳導結構域。在一些實施例中，CD22特異性CAR包括抗CD22 scFv、跨膜結構域(諸如來源於人類CD8α之跨膜結構域)、4-1BB (CD137)共刺激信號傳導結構域及CD3ζ信號傳導結構域。在一些實施例中，CD19/CD22雙特異性CAR包括抗CD19 scFv、抗CD22 scFv、跨膜結構域(例如來源於人類CD8α之跨膜結構域)、4-1BB (CD137)共刺激信號傳導結構域及CD3ζ信號傳導結構域。
在一些實施例中，CAR包含由T細胞攜帶之商業CAR構築體。基於商業CAR-T細胞之療法之非限制性實例包括佈瑞基奧侖塞(brexucabtagene autoleucel，TECARTUS®)、阿基崙賽(axicabtagene ciloleucel，YESCARTA®)、艾基維侖塞(idecabtagene vicleucel，ABECMA®)、利基邁崙賽(lisocabtagene maraleucel，BREYANZI®)、替沙崙賽(tisagenlecleucel，KYMRIAH®)、來自Cartesian Therapeutics之Descartes-08及Descartes-11、來自Novartis之CTL110、來自Poseida Therapeutics之P-BMCA-101、來自Autolus Limited之AUTO4、來自Cellectis之UCARTCS、來自Precision Biosciences之PBCAR19B及PBCAR269A、來自Fate Therapeutics之FT819及來自Clyad Oncology之CYAD-211。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向自體免疫或發炎性病症所特有之抗原。在一些實施例中，ABD結合與自體免疫或發炎性病症相關之抗原。在一些情況下，抗原係由與自體免疫或發炎性病症相關之細胞表現。在一些實施例中，自體免疫或發炎性病症係選自慢性移植物抗宿主病(GVHD)、狼瘡、關節炎、免疫複合物腎小球腎炎、古德巴斯德症候群、眼色素層炎、肝炎、全身性硬化或硬皮症、I型糖尿病、多發性硬化、冷凝集素疾病、尋常天疱瘡、格雷氏病、自體免疫溶血性貧血、A型血友病、原發性休格倫氏症候群、血栓性血小板減少性紫癜、視神經脊髓炎、伊凡氏症候群、IgM介導之神經病變、冷凝球蛋白血症、皮肌炎、特發性血小板減少症、僵直性脊椎炎、大疱性類天疱瘡、獲得性血管水腫、慢性蕁麻疹性抗磷脂脫髓鞘性多神經病變及自體免疫血小板減少症或嗜中性球減少症或純紅血球再生不良，而同種免疫疾病之示例性非限制性實例包括來自以下之同種致敏(參見例如Blazar等人, 2015, Am. J. Transplant, 15(4):931-41)或異種致敏：造血或實體器官移植、輸血、具有胎兒同種致敏之妊娠、新生同種免疫血小板減少症、新生兒溶血病、對外來抗原之致敏(諸如可藉由替代用酶或蛋白質替代療法治療之遺傳性或獲得性缺陷病症來進行)、血液產品及基因療法。在一些實施例中，自體免疫或發炎性病症所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道連接受體、酶連接受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。
在一些實施例中，CAR之抗原結合結構域結合至在B細胞、漿細胞或漿母細胞上表現之配位體。在一些實施例中，CAR之抗原結合結構域結合至CD10、CD19、CD20、CD22、CD24、CD27、CD38、CD45R、CD138、CD319、BCMA、CD28、TNF、干擾素受體、GM-CSF、ZAP-70、LFA-1、CD3 γ、CD5或CD2。參見例如US 2003/0077249；WO 2017/058753；WO 2017/058850，該等文獻之內容以引用之方式併入本文中。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向衰老細胞所特有之抗原，例如，尿激酶型纖維蛋白溶酶原活化子受體(uPAR)。在一些實施例中，ABD結合與衰老細胞相關之抗原。在一些情況下，抗原係由衰老細胞表現。在一些實施例中，CAR可用於治療或預防以衰老細胞異常累積為特徵之病症，例如，肝及肺纖維化、動脈粥樣硬化、糖尿病及骨關節炎。
在一些實施例中，抗原結合結構域靶向感染性疾病所特有之抗原。在一些實施例中，ABD結合與感染性疾病相關之抗原。在一些情況下，抗原係由感染性疾病侵襲之細胞表現。在一些實施例中，其中感染性疾病係選自HIV、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、人類疱疹病毒、人類疱疹病毒8 (HHV-8，卡波西氏肉瘤相關疱疹病毒(KSHV))、人類T-親淋巴性病毒-1 (HTLV-1)、默克細胞多瘤病毒(MCV)、猿猴病毒40 (SV40)、愛潑斯坦-巴爾病毒、CMV、人類乳頭瘤病毒。在一些實施例中，感染性疾病所特有之抗原係選自細胞表面受體、離子通道連接受體、酶連接受體、G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶、組胺酸激酶相關受體、HIV Env、gpl20或HIV-1 Env上CD4誘導之抗原決定基。
在一些實施例中，抗原結合結構域結合至細胞之細胞表面抗原。在一些實施例中，細胞表面抗原為特定或特異性細胞類型所特有的(例如，由其表現)。在一些實施例中，細胞表面抗原為一種以上類型之細胞所特有的。
在一些實施例中，CAR抗原結合結構域結合T細胞所特有之細胞表面抗原，諸如T細胞上之細胞表面抗原。在一些實施例中，T細胞所特有之抗原可為T細胞所特有之細胞表面受體、膜轉運蛋白(例如主動或被動轉運蛋白，諸如離子通道蛋白、成孔蛋白等)、跨膜受體、膜酶及/或細胞黏附蛋白。在一些實施例中，T細胞所特有之抗原可為G蛋白偶合受體、受體酪胺酸激酶、酪胺酸激酶相關受體、受體樣酪胺酸磷酸酶、受體絲胺酸/蘇胺酸激酶、受體鳥苷酸環化酶或組胺酸激酶相關受體。
在一些實施例中，CAR包含結合至抗原(例如，腫瘤抗原)之細胞外抗原結合結構域(例如抗體或抗體片段，諸如scFv)、間隔子(例如含有鉸鏈結構域，諸如本文所述之任一者)、跨膜結構域(例如本文所述之任一者)及細胞內信號傳導結構域(例如任何細胞內信號傳導結構域，諸如本文所述之初級信號傳導結構域或共刺激信號傳導結構域)。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域為或包括初級細胞質信號傳導結構域。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域另外包括共刺激分子之細胞內信號傳導結構域(例如，共刺激結構域)。
在一些實施例中，抗原受體進一步包括標誌及/或表現CAR或其他抗原受體之細胞進一步包括替代性標誌，諸如細胞表面標誌，其可用於確認細胞之轉導或工程改造以表現受體。在一些態樣中，標誌包括CD34、NGFR或表皮生長因子受體之全部或部分(例如，經截短形式)，諸如此種細胞表面受體(例如，tEGFR)之經截短型式。在一些實施例中，編碼標誌之核酸可操作地連接至編碼連接子序列，諸如可裂解連接子序列，例如T2A之多核苷酸。舉例而言，標誌及視情況存在之連接子序列可為公開專利申請案第WO2014031687號中所揭示之任一者。舉例而言，標誌可為經截短之EGFR (tEGFR)，其視情況連接至連接子序列，諸如T2A可裂解連接子序列。
在一些實施例中，標誌為不天然存在於T細胞上或不天然存在於T細胞表面上之分子，例如細胞表面蛋白，或其一部分。在一些實施例中，分子為非自身分子，例如非自身蛋白，亦即，不由細胞將過繼轉移至其中之宿主之免疫系統識別為「自身」的分子。
在一些實施例中，標誌不提供治療功能及/或不產生除用作基因工程標誌以外之作用，例如，用於選擇成功工程改造之細胞。在其他實施例中，標誌可為治療性分子或以其他方式發揮一些所需作用之分子，諸如活體內遭遇之細胞的配位體，諸如在過繼轉移及遭遇配位體後增強及/或減弱細胞反應之共刺激或免疫檢查點分子。
在一些情況下，CAR稱作第一代、第二代及/或第三代CAR。在一些態樣中，第一代CAR為在抗原結合後僅提供CD3鏈誘導信號之CAR；在一些態樣中，第二代CAR為提供此種信號及共刺激信號之CAR，諸如包括來自共刺激受體(諸如CD28或CD 137)之細胞內信號傳導結構域之CAR；在一些態樣中，第三代CAR包括不同共刺激受體之多個共刺激結構域。
舉例而言，在一些實施例中，CAR含有抗體，例如抗體片段，作為或含有CD28或其功能變異體之跨膜部分之跨膜結構域，及含有CD28或其功能變異體之信號傳導部分及CD3ζ或其功能變異體之信號傳導部分之細胞內信號傳導結構域。在一些實施例中，CAR含有抗體，例如抗體片段，作為或含有CD28或其功能變異體之跨膜部分之跨膜結構域，及含有4-IBB或其功能變異體之信號傳導部分及CD3ζ或其功能變異體之信號傳導部分之細胞內信號傳導結構域。在一些此類實施例中，受體進一步包括含有Ig分子(諸如人類Ig分子)之一部分的間隔子，諸如Ig鉸鏈，例如IgG4鉸鏈，諸如僅鉸鏈間隔子。
在一些態樣中，間隔子僅含有IgG之鉸鏈區，諸如僅IgG4或IgGl之鉸鏈。在其他實施例中，間隔子為或含有Ig鉸鏈，例如源自IgG4之鉸鏈，視情況連接至CH2及/或CH3結構域。在一些實施例中，間隔子為連接至CH2及CH3結構域之Ig鉸鏈，例如IgG4鉸鏈。在一些實施例中，間隔子為僅連接至CH3結構域之Ig鉸鏈，例如IgG4鉸鏈。在一些實施例中，間隔子為或包含富含甘胺酸-絲胺酸之序列或其他可撓性連接子，諸如已知可撓性連接子。
舉例而言，在一些實施例中，CAR包括抗體，諸如抗體片段，包括scFv；間隔子，諸如含有免疫球蛋白分子之一部分的間隔子，諸如重鏈分子之鉸鏈區及/或一或多個恆定區，諸如含有Ig鉸鏈之間隔子；含有全部或一部分源自CD28之跨膜結構域的跨膜結構域、源自CD28之細胞內信號傳導結構域及CD3ζ信號傳導結構域。在一些實施例中，CAR包括抗體或片段，諸如scFv；間隔子，諸如含有Ig鉸鏈之間隔子中之任一者；源自CD28之跨膜結構域、源自4-1BB之細胞內信號傳導結構域及源自CD3ζ之信號傳導結構域。
由向個體投與之細胞表現之重組受體(諸如CAR)一般識別或特異性結合至在所治療之疾病或疾患或其細胞中表現、與其相關及/或對於其特定之分子。在與分子，例如抗原特異性結合後，受體一般將免疫刺激信號，諸如ITAM轉導之信號遞送至細胞中，從而促進針對疾病或疾患之免疫反應。舉例而言，在一些實施例中，細胞表現特異性結合至由疾病或疾患之細胞或組織或與疾病或疾患相關之細胞或組織表現之抗原的CAR。
在一些實施例中，將包含CAR或編碼CAR之核酸(例如，DNA、gDNA、cDNA、RNA、pre-MRNA、mRNA、miRNA、siRNA等)之脂質粒子遞送至靶細胞。在一些實施例中，靶細胞為效應細胞，例如，表現一或多種Fc受體且介導一或多種效應功能之免疫系統之細胞。在一些實施例中，靶細胞可包括但可不限於以下一或多者：單核細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、樹突狀細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、血小板、大顆粒淋巴細胞、蘭格漢氏細胞(Langerhans' cell)、自然殺手(NK )細胞、T淋巴細胞(例如，T細胞)、γδT細胞、B淋巴細胞(例如，B細胞)，且可來自任何生物體，包括但不限於人、小鼠、大鼠、兔及猴。
在某些實施例中，外源劑為CAR。CAR (亦稱為嵌合免疫受體、嵌合T細胞受體或人工T細胞受體)為已經工程改造以賦予宿主細胞(例如，T細胞)靶向特定蛋白質之新能力的受體蛋白。受體為嵌合的，此係因為其將抗原結合功能及T細胞活化功能組合至單一受體中。所提供之粒子可用於在宿主細胞(例如，T細胞)中表現一或多種CAR以用於針對各種靶抗原之基於細胞之療法中。在此等實施例中，CAR可包含特異性結合靶抗原之細胞外結合結構域(亦稱作「結合子」)、跨膜結構域及細胞內信號傳導結構域。在某些實施例中，CAR可進一步包含一或多個額外元件，包括一或多個信號肽、一或多個細胞外鉸鏈結構域及/或一或多個細胞內共刺激結構域。結構域可直接彼此相鄰，或可存在連接結構域之一或多個胺基酸。編碼CAR之核苷酸序列可來源於哺乳動物序列，例如，小鼠序列、靈長類動物序列、人類序列或其組合。在編碼CAR之核苷酸序列為非人類之情況下，CAR之序列可經人源化。編碼CAR之核苷酸序列亦可經密碼子最佳化以用於在哺乳動物細胞(例如，人類細胞)中表現。在此等實施例中之任一者中，編碼CAR之核苷酸序列可與本文所揭示之核苷酸序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)。序列變異可歸因於密碼子最佳化、人源化、基於限制酶之選殖瘢痕及/或連接功能結構域之額外胺基酸殘基等。
在某些實施例中，CAR可在N端包含信號肽。信號肽之非限制性實例包括CD8α信號肽、IgK信號肽及粒細胞-巨噬細胞群落刺激因子受體次單元α (GMCSFR-α，亦稱為群落刺激因子2受體次單元α (CSF2RA))信號肽及其變異體，其胺基酸序列在下
表 4中提供。
表 4. 信號肽之示例性序列
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| 465 | MALPVTALLLPLALLLHAARP | CD8α信號肽 |
| 466 | METDTLLLWVLLLWVPGSTG | IgK信號肽 |
| 167 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP | GMCSFR-α (CSF2RA)信號肽 |
在某些實施例中，CAR之細胞外結合結構域可包含特異性針對一種靶抗原或多種靶抗原之一或多種抗體。抗體可為抗體片段(例如，scFv)或單結構域抗體片段(例如，VHH)。在某些實施例中，scFv可包含由連接子連接之抗體重鏈可變區(V
H)及輕鏈可變區(V
L)。V
H及V
L可按任一次序連接，亦即，V
H-連接子-V
L或V
L-連接子-V
H。連接子之非限制性實例包括Whitlow連接子、(G
4S)
n(n可為正整數，例如1、2、3、4、5、6等)連接子及其變異體。在某些實施例中，抗原可為在腫瘤細胞上排他性或優先表現之抗原，或為自體免疫或發炎性疾病所特有之抗原。示例性靶抗原包括但不限於CD5、CD19、CD20、CD22、CD23、CD30、CD70、κ、λ及B細胞成熟劑(BCMA)、G蛋白偶合受體家族C群5成員D (GPRC5D) (與白血病相關)；CS1/SLAMF7、CD38、CD138、GPRC5D、TACI及BCMA (與骨髓瘤相關)；GD2、HER2、EGFR、EGFRvIII、B7H3、PSMA、PSCA、CAIX、CD171、CEA、CSPG4、EPHA2、FAP、FRα、IL-13Rα、間皮素、MUC1、MUC16及ROR1 (與實體腫瘤相關)。在此等實施例中之任一者中，CAR之細胞外結合結構域可經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現或具有變異體序列以增加細胞外結合結構域之功能。
在某些實施例中，CAR可包含鉸鏈結構域，亦稱作間隔子。術語「鉸鏈」及「間隔子」在本揭示案中可互換使用。鉸鏈結構域之非限制性實例包括CD8α鉸鏈結構域、CD28鉸鏈結構域、IgG4鉸鏈結構域、IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域及其變異體，其胺基酸序列在下
表 5中提供。
表 5. 鉸鏈結構域之示例性序列
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| 468 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD | CD8α鉸鏈結構域 |
| 469 | IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP | CD28鉸鏈結構域 |
| 470 | AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP | CD28鉸鏈結構域 |
| 471 | ESKYGPPCPPCP | IgG4鉸鏈結構域 |
| 472 | ESKYGPPCPSCP | IgG4鉸鏈結構域 |
| 473 | ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK | IgG4鉸鏈-CH2-CH3結構域 |
在某些實施例中，CAR之跨膜結構域可包含T細胞受體之α、β或ζ鏈、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154或其功能變異體之跨膜區，包括此等序列中之每一者之人類型式。在其他實施例中，跨膜結構域可包含CD8α、CD8β、4-1BB/CD137、CD28、CD34、CD4、FcεRIγ、CD16、OX40/CD134、CD3ζ、CD3ε、CD3γ、CD3δ、TCRα、TCRβ、TCRζ、CD32、CD64、CD64、CD45、CD5、CD9、CD22、CD37、CD80、CD86、CD40、CD40L/CD154、VEGFR2、FAS及FGFR2B或其功能變異體之跨膜區，包括此等序列中之每一者之人類型式。
表 6提供數個示例性跨膜結構域之胺基酸序列。
表 6. 跨膜結構域之示例性序列
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| 473 | IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC | CD8α跨膜結構域 |
| 474 | FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | CD28跨膜結構域 |
| 475 | MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | CD28跨膜結構域 |
在某些實施例中，CAR之細胞內信號傳導結構域及/或細胞內共刺激結構域可包含一或多個選自以下之信號傳導結構域：B7-1/CD80、B7-2/CD86、B7-H1/PD-L1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-H7、BTLA/CD272、CD28、CTLA-4、Gi24/VISTA/B7-H5、ICOS/CD278、PD-1、PD-L2/B7-DC、PDCD6、4-1BB/TNFSF9/CD137、4-1BB配位體/TNFSF9、BAFF/BLyS/TNFSF13B、BAFF R/TNFRSF13C、CD27/TNFRSF7、CD27配位體/TNFSF7、CD30/TNFRSF8、CD30配位體/TNFSF8、CD40/TNFRSF5、CD40/TNFSF5、CD40配位體/TNFSF5、DR3/TNFRSF25、GITR/TNFRSF18、GITR配位體/TNFSF18、HVEM/TNFRSF14、LIGHT/TNFSF14、淋巴毒素-α/TNFβ、OX40/TNFRSF4、OX40配位體/TNFSF4、RELT/TNFRSF19L、TACI/TNFRSF13B、TL1A/TNFSF15、TNFα、TNF RII/TNFRSF1B、2B4/CD244/SLAMF4、BLAME/SLAMF8、CD2、CD2F-10/ SLAMF9、CD48/SLAMF2、CD58/LFA-3、CD84/SLAMF5、CD229/SLAMF3、CRACC/SLAMF7、NTB-A/SLAMF6、SLAM/CD150、CD2、CD7、CD53、CD82/Kai-1、CD90/Thy1、CD96、CD160、CD200、CD300a/LMIR1、HLA I類、HLA-DR、Ikaros、整合素α4/CD49d、整合素α4 β1、整合素α4 β7/LPAM-1、LAG-3、TCL1A、TCL1B、CRTAM、DAP12、Dectin-1/CLEC7A、DPPIV/CD26、EphB6、TIM-1/KIM-1/HAVCR、TIM-4、TSLP、TSLP R、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、NKG2C、CD3ζ、基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)、CD27、CD28、4-1BB、CD134/OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴細胞功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、與CD83特異性結合之配位體及其功能變異體，包括此等序列中之每一者之人類型式。在一些實施例中，細胞內信號傳導結構域及/或細胞內共刺激結構域包含一或多個選自CD3ζ結構域、ITAM、CD28結構域、4-1BB結構域或其功能變異體之信號傳導結構域。
表 7提供數個示例性細胞內共刺激及/或信號傳導結構域之胺基酸序列。在某些實施例中，如在下文所述之替沙崙賽之情況下，SEQ ID NO:99之CD3ζ信號傳導結構域可在胺基酸位置518處具有突變，例如麩醯胺(Q)至離胺酸(K)突變(參見SEQ ID NO:478)。
表 7. 細胞內共刺激及 / 或信號傳導結構域之示例性序列
A) CD19 CAR
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| 476 | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL | 4-1BB共刺激結構域 |
| 477 | RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS | CD28共刺激結構域 |
| 478 | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3ζ信號傳導結構域 |
| 479 | RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3ζ信號傳導結構域(在位置14處具有Q至K突變) |
在一些實施例中，CAR為CD19 CAR (「CD19-CAR」)。在一些實施例中，CD19 CAR可包含串聯之信號肽、特異性結合CD19之細胞外結合結構域、鉸鏈結構域、跨膜結構域、細胞內共刺激結構域及/或細胞內信號傳導結構域。
在一些實施例中，CD19 CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞外結合結構域特異性針對CD19，例如，人類CD19。CD19 CAR之細胞外結合結構域可經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現或具有變異體序列以增加細胞外結合結構域之功能。在一些實施例中，細胞外結合結構域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞外結合結構域包含來源於FMC63單株抗體(FMC63)之scFv，其包含由連接子連接之FMC63重鏈可變區(V
H)及輕鏈可變區(V
L)。FMC63及所得scFv已描述於Nicholson等人, Mol. Immun. 34(16-17):1157-1165 (1997)及PCT申請公開案第WO2018/213337號中，該等文獻中之每一者之全部內容以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，完整的源自FMC63之scFv (亦稱作FMC63 scFv)及其不同部分之胺基酸序列在下
表 10中提供。在一些實施例中，CD19特異性scFv包含SEQ ID NO:479、480或486所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:479、480或486所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，CD19特異性scFv可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 482-483及487-489所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD19特異性scFv可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 482-484所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD19特異性scFv可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 487-489所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，CD19特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，CD19 CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，連接scFv之V
H及V
L部分之連接子為具有SEQ ID NO:485所示之胺基酸序列之Whitlow連接子。在一些實施例中，Whitlow連接子可由不同連接子，例如具有SEQ ID NO:491所示之胺基酸序列之3xG
4S連接子替代，此產生具有SEQ ID NO:490所示之胺基酸序列的不同源自FMC63之scFv。在此等實施例中之某些實施例中，CD19特異性scFv包含SEQ ID NO:490所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:490所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
表 8. 抗 CD19 scFv 及組分之示例性序列
| SEQ ID NO: | 胺基酸序列 | 描述 |
| 480 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗CD19 FMC63 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 481 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈可變區 |
| 482 | QDISKY | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈CDR1 |
| 483 | HTS | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈CDR2 |
| 484 | QQGNTLPYT | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈CDR3 |
| 485 | GSTSGSGKPGSGEGSTKG | Whitlow連接子 |
| 486 | EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈可變區 |
| 487 | GVSLPDYG | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈CDR1 |
| 488 | IWGSETT | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈CDR2 |
| 489 | AKHYYYGGSYAMDY | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈CDR3 |
| 490 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗CD19 FMC63 scFv完整序列，具有3xG 4S連接子 |
| 491 | GGGGSGGGGSGGGGS | 3xG 4S連接子 |
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞外結合結構域來源於特異性針對CD19之抗體，包括例如SJ25C1 (Bejcek等人, Cancer Res. 55:2346-2351 (1995))、HD37 (Pezutto等人, J. Immunol. 138(9):2793-2799 (1987))、4G7 (Meeker等人, Hybridoma 3:305-320 (1984))、B43 (Bejcek (1995))、BLY3 (Bejcek (1995))、B4 (Freedman等人, 70:418-427 (1987))、B4 HB12b (Kansas及Tedder, J. Immunol. 147:4094-4102 (1991)；Yazawa等人, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:15178-15183 (2005)；Herbst等人, J. Pharmacol. Exp. Ther. 335:213-222 (2010))、BU12 (Callard等人, J. Immunology, 148(10): 2983-2987 (1992))及CLB-CD19 (De Rie Cell. Immunol. 118:368-381(1989))。在此等實施例中之任一者中，CD19 CAR之細胞外結合結構域可包含抗體中之任一者之V
H、V
L及/或一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之鉸鏈結構域包含CD8α鉸鏈結構域，例如，人類CD8α鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含CD28鉸鏈結構域，例如，人類CD28鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD28鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈結構域，例如，人類IgG4鉸鏈結構域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域，例如，人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域包含SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之跨膜結構域包含CD8α跨膜結構域，例如，人類CD8α跨膜結構域。在一些實施例中，CD8α跨膜結構域包含SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域，例如，人類CD28跨膜結構域。在一些實施例中，CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞內共刺激結構域包含4-1BB共刺激結構域。4-1BB (亦稱為CD137)將強效共刺激信號傳輸至T細胞，從而促進T淋巴細胞之分化並增強其長期存活。在一些實施例中，4-1BB共刺激結構域為人類的。在一些實施例中，4-1BB共刺激結構域包含SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，細胞內共刺激結構域包含CD28共刺激結構域。CD28為T細胞上之另一個共刺激分子。在一些實施例中，CD28共刺激結構域為人類的。在一些實施例中，CD28共刺激結構域包含SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，CD19 CAR之細胞內共刺激結構域包含所述4-1BB共刺激結構域及CD28共刺激結構域。
在一些實施例中，CD19 CAR之細胞內信號傳導結構域包含CD3 zeta (ζ)信號傳導結構域。CD3ζ與T細胞受體(TCR)締合以產生信號且含有基於酪胺酸之免疫受體活化模體(ITAM)。CD3ζ信號傳導結構域係指來自ζ鏈之細胞質結構域且足以在功能上傳輸T細胞活化所必需之初始信號的胺基酸殘基。在一些實施例中，CD3ζ信號傳導結構域為人類的。在一些實施例中，CD3ζ信號傳導結構域包含SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，有效負荷劑為CD19 CAR，包括例如包含以下之CD19 CAR：具有SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:490所示之序列之CD19特異性scFv、SEQ ID NO:468之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。在此等實施例中之任一者中，CD19 CAR可另外包含所述信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，有效負荷劑為CD19 CAR，包括例如包含以下之CD19 CAR：具有SEQ ID NO:274或SEQ ID NO:490所示之序列之CD19特異性scFv、SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472之IgG4鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。在此等實施例中之任一者中，CD19 CAR可另外包含所述信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，有效負荷劑為CD19 CAR，包括例如包含以下之CD19 CAR：具有SEQ ID NO:480或SEQ ID NO:490所示之序列之CD19特異性scFv、SEQ ID NO:469之CD28鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:477之CD28共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。在此等實施例中之任一者中，CD19 CAR可另外包含所述信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，有效負荷劑為如由以下編碼之CD19 CAR：SEQ ID NO:492所示之序列，或與SEQ ID NO:492所示之核苷酸序列(參見
表 9)至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。經編碼之CD19 CAR具有SEQ ID NO:493所示之相應胺基酸序列，或與SEQ ID NO:493所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)，具有以下組分：CD8α信號肽、FMC63 scFv (V
L-Whitlow連接子-V
H)、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。
在一些實施例中，有效負荷劑為CD19 CAR之市售實施例。CD19 CAR之市售實施例之非限制性實例包括替沙崙賽、利基邁崙賽、阿基崙賽及佈瑞基奧侖塞。
在一些實施例中，CAR為替沙崙賽或其部分。替沙崙賽包含具有以下組分之CD19 CAR：CD8α信號肽、FMC63 scFv (V
L-3xG
4S連接子-V
H)、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。替沙崙賽中CD19 CAR之核苷酸及胺基酸序列在
表 9中提供，且序列之注解在
表 10中提供。
在一些實施例中，CAR為利基邁崙賽或其部分。利基邁崙賽包含具有以下組分之CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信號肽、FMC63 scFv (V
L-Whitlow連接子-V
H)、IgG4鉸鏈結構域、CD28跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。利基邁崙賽中CD19 CAR之核苷酸及胺基酸序列在
表 7中提供，且序列之注解在
表 11中提供。
在一些實施例中，CAR為阿基崙賽或其部分。阿基崙賽包含具有以下組分之CD19 CAR：GMCSFR-α或CSF2RA信號肽、FMC63 scFv (V
L-Whitlow連接子-V
H)、CD28鉸鏈結構域、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。阿基崙賽中CD19 CAR之核苷酸及胺基酸序列在
表 9中提供，且序列之注解在
表 12中提供。
在一些實施例中，CAR為佈瑞基奧侖塞或其部分。佈瑞基奧侖塞包含具有以下組分之CD19 CAR：GMCSFR-α信號肽、FMC63 scFv、CD28鉸鏈結構域、CD28跨膜結構域、CD28共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。
在一些實施例中，CAR由以下編碼：SEQ ID NO: 494、496或498所示之序列，或與SEQ ID NO: 494、496或498所示之核苷酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。經編碼之CD19 CAR分別具有SEQ ID NO: 495、497或499所示之相應胺基酸序列，或分別與SEQ ID NO: 495、497或499所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)。
表 9. CD19 CAR 之示例性序列
表 10. 替沙崙賽 CD19 CAR 序列之注解
表 11. 利基邁崙賽 CD19 CAR 序列之注解
表 12. 阿基崙賽 CD19 CAR 序列之注解
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| 492 | atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc | 示例性CD19 CAR核苷酸序列 |
| 493 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 示例性CD19 CAR胺基酸序列 |
| 494 | atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc | 替沙崙賽CD19 CAR核苷酸序列 |
| 495 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 替沙崙賽CD19 CAR胺基酸序列 |
| 496 | atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgaatctaagtacggaccgccctgccccccttgccctatgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg | 利基邁崙賽CD19 CAR核苷酸序列 |
| 497 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 利基邁崙賽CD19 CAR胺基酸序列 |
| 498 | atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc | 阿基崙賽CD19 CAR核苷酸序列 |
| 499 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 阿基崙賽CD19 CAR胺基酸序列 |
| 特徵 | 核苷酸序列位置 | 胺基酸序列位置 |
| CD8α信號肽 | 1-63 | 1-21 |
| FMC63 scFv (V L-3xG 4S連接子-V H) | 64-789 | 22-263 |
| CD8α鉸鏈結構域 | 790-924 | 264-308 |
| CD8α跨膜結構域 | 925-996 | 309-332 |
| 4-1BB共刺激結構域 | 997-1122 | 333-374 |
| CD3ζ信號傳導結構域 | 1123-1458 | 375-486 |
| 特徵 | 核苷酸序列位置 | 胺基酸序列位置 |
| GMCSFR-α信號肽 | 1-66 | 1-22 |
| FMC63 scFv (V L-Whitlow連接子-V H) | 67-801 | 23-267 |
| IgG4鉸鏈結構域 | 802-837 | 268-279 |
| CD28跨膜結構域 | 838-921 | 280-307 |
| 4-1BB共刺激結構域 | 922-1047 | 308-349 |
| CD3ζ信號傳導結構域 | 1048-1383 | 350-461 |
| 特徵 | 核苷酸序列位置 | 胺基酸序列位置 |
| CSF2RA信號肽 | 1-66 | 1-22 |
| FMC63 scFv (V L-Whitlow連接子-V H) | 67-801 | 23-267 |
| CD28鉸鏈結構域 | 802-927 | 268-309 |
| CD28跨膜結構域 | 928-1008 | 310-336 |
| CD28共刺激結構域 | 1009-1131 | 337-377 |
| CD3ζ信號傳導結構域 | 1132-1467 | 378-489 |
在一些實施例中，CAR由以下編碼：SEQ ID NO: 494、496、498所示之序列，或與SEQ ID NO: 494、496、498所示之核苷酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。經編碼之CD19 CAR分別具有SEQ ID NO: 495、497、499所示之相應胺基酸序列，分別與SEQ ID NO: 495、497、499所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)。
B) CD20 CAR
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR (「CD20-CAR」)。CD20為早在前B期即在B細胞表面上且以逐漸增加直至B細胞成熟之水準以及在大多數B細胞贅瘤之細胞上發現之抗原。CD20陽性細胞有時亦在霍奇金氏病(Hodgkins disease)、骨髓瘤及胸腺瘤之病例中發現。在一些實施例中，CD20 CAR可包含串聯之信號肽、特異性結合CD20之細胞外結合結構域、鉸鏈結構域、跨膜結構域、細胞內共刺激結構域及/或細胞內信號傳導結構域。
在一些實施例中，CD20 CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞外結合結構域特異性針對CD20，例如，人類CD20。CD20 CAR之細胞外結合結構域可經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現或具有變異體序列以增加細胞外結合結構域之功能。在一些實施例中，細胞外結合結構域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞外結合結構域來源於特異性針對CD20之抗體，包括例如Leu16、IF5、1.5.3、利妥昔單抗(rituximab)、奧妥珠單抗(obinutuzumab)、替伊莫單抗(ibritumomab)、奧法木單抗(ofatumumab)、托西莫單抗(tositumumab)、奧尼妥單抗(odronextamab)、維妥珠單抗(veltuzumab)、烏妥昔單抗(ublituximab)及奧瑞珠單抗(ocrelizumab)。在此等實施例中之任一者中，CD20 CAR之細胞外結合結構域可包含抗體中之任一者之V
H、V
L及/或一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞外結合結構域包含來源於Leu16單株抗體之scFv，其包含由連接子連接之Leu16重鏈可變區(V
H)及輕鏈可變區(V
L)。參見Wu等人，Protein Engineering. 14(12):1025-1033 (2001)。在一些實施例中，連接子為3xG
4S連接子。在其他實施例中，連接子為如本文所述之Whitlow連接子。在一些實施例中，完整的源自Leu16之scFv (亦稱作Leu16 scFv)及其不同部分之胺基酸序列在下
表 13中提供。在一些實施例中，CD20特異性scFv包含SEQ ID NO:500、504或505所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:500、504或505所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，CD20特異性scFv可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 502-504、506, 507及508所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD20特異性scFv可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 502-504所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD20特異性scFv可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 506、507及508所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，CD20特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，CD20 CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
表 13. 抗 CD20 scFv 及組分之示例性序列
| SEQ ID NO: | 胺基酸序列 | 描述 |
| 500 | DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS | 抗CD20 Leu16 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 501 | DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈可變區 |
| 502 | RASSSVNYMD | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈CDR1 |
| 503 | ATSNLAS | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈CDR2 |
| 504 | QQWSFNPPT | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈CDR3 |
| 505 | EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈 |
| 506 | SYNMH | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈CDR1 |
| 507 | AIYPGNGDTSYNQKFKG | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈CDR2 |
| 508 | SNYYGSSYWFFDV | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈CDR3 |
在一些實施例中，CD20 CAR之鉸鏈結構域包含CD8α鉸鏈結構域，例如，人類CD8α鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含CD28鉸鏈結構域，例如，人類CD28鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD28鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈結構域，例如，人類IgG4鉸鏈結構域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域，例如，人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域。
在一些實施例中，CD20 CAR之跨膜結構域包含CD8α跨膜結構域，例如，人類CD8α跨膜結構域。在一些實施例中，CD8α跨膜結構域包含SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域，例如，人類CD28跨膜結構域。在一些實施例中，CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞內共刺激結構域包含4-1BB共刺激結構域，例如，人類4-1BB共刺激結構域。在一些實施例中，4-1BB共刺激結構域包含SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，細胞內共刺激結構域包含CD28共刺激結構域，例如，人類CD28共刺激結構域。在一些實施例中，CD28共刺激結構域包含SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD20 CAR之細胞內信號傳導結構域包含CD3 zeta (ζ)信號傳導結構域，例如，人類CD3ζ信號傳導結構域。在一些實施例中，CD3ζ信號傳導結構域包含SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR，包括例如包含以下之CD20 CAR：具有SEQ ID NO: 500所示之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:468之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR，包括例如包含以下之CD20 CAR：具有SEQ ID NO: 500所示之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:469之CD28鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR，包括例如包含以下之CD20 CAR：具有SEQ ID NO: 500所示之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472之IgG4鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR，包括例如包含以下之CD20 CAR：具有SEQ ID NO: 500所示之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:468之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR，包括例如包含以下之CD20 CAR：具有SEQ ID NO: 500所示之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:469之CD28鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD20 CAR，包括例如包含以下之CD20 CAR：具有SEQ ID NO: 500所示之序列之CD20特異性scFv、SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472之IgG4鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
C) CD22 CAR
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR (「CD22-CAR」)。CD22為主要在成熟B細胞表面上發現之跨膜蛋白，其用作B細胞受體(BCR)信號傳導之抑制性受體。CD22在60-70%之B細胞淋巴瘤及白血病(例如，B-慢性淋巴細胞白血病、毛細胞白血病、急性淋巴細胞白血病(ALL)及伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma))中表現且不存在於B細胞發育早期階段之細胞表面上或幹細胞上。在一些實施例中，CD22 CAR可包含串聯之信號肽、特異性結合CD22之細胞外結合結構域、鉸鏈結構域、跨膜結構域、細胞內共刺激結構域及/或細胞內信號傳導結構域。
在一些實施例中，CD22 CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域特異性針對CD22，例如，人類CD22。CD22 CAR之細胞外結合結構域可經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現或具有變異體序列以增加細胞外結合結構域之功能。在一些實施例中，細胞外結合結構域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域來源於特異性針對CD22之抗體，包括例如SM03、伊妥珠單抗(inotuzumab)、依帕珠單抗(epratuzumab)、莫妥莫單抗(moxetumomab)及匹那妥珠單抗(pinatuzumab)。在此等實施例中之任一者中，CD22 CAR之細胞外結合結構域可包含抗體中之任一者之V
H、V
L及/或一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域包含來源於m971單株抗體(m971)之scFv，其包含由連接子連接之m971重鏈可變區(V
H)及輕鏈可變區(V
L)。在一些實施例中，連接子為3xG
4S連接子。在其他實施例中，可替代地使用Whitlow連接子。在一些實施例中，完整的源自m971之scFv (亦稱作m971 scFv)及其不同部分之胺基酸序列在下
表 14中提供。在一些實施例中，CD22特異性scFv包含SEQ ID NO:509、510或514所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:509、510或514所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 511-513及515-517所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 511-513所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 515-517所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域包含來源於m971-L7之scFv，m971-L7為m971之親和力成熟變異體，其具有與親本抗體m971相比顯著改良之CD22結合親和力(自約2 nM改良至小於50 pM)。在一些實施例中，來源於m971-L7之scFv包含由3xG
4S連接子連接之m971-L7之V
H及V
L。在其他實施例中，可替代地使用Whitlow連接子。在一些實施例中，完整的源自m971-L7之scFv (亦稱作m971-L7 scFv)及其不同部分之胺基酸序列在下
表 12中提供。在一些實施例中，CD22特異性scFv包含SEQ ID NO:518、519或523所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:518、519或523所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 520-522及524-526所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 520-522所示之胺基酸序列。在一些實施例中，CD22特異性scFv可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 524-526所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，CD22特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
表 14. 抗 CD22 scFv 及組分之示例性序列
| SEQ ID NO: | 胺基酸序列 | 描述 |
| 509 | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971 scFv完整序列，具有3xG 4S連接子 |
| 510 | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS | 抗CD22 m971 scFv重鏈可變區 |
| 511 | GDSVSSNSAA | 抗CD22 m971 scFv重鏈CDR1 |
| 512 | TYYRSKWYN | 抗CD22 m971 scFv重鏈CDR2 |
| 513 | AREVTGDLEDAFDI | 抗CD22 m971 scFv重鏈CDR3 |
| 514 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971 scFv輕鏈 |
| 515 | QTIWSY | 抗CD22 m971 scFv輕鏈CDR1 |
| 516 | AAS | 抗CD22 m971 scFv輕鏈CDR2 |
| 517 | QQSYSIPQT | 抗CD22 m971 scFv輕鏈CDR3 |
| 518 | QVQLQQSGPGMVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYAVSMKSRITINPDTNKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYRQRPGEAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971-L7 scFv完整序列，具有3xG 4S連接子 |
| 519 | QVQLQQSGPGMVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYAVSMKSRITINPDTNKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈可變區 |
| 520 | GDSVSSNSVA | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈CDR1 |
| 521 | TYYRSTWYN | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈CDR2 |
| 522 | AREVTGDLEDAFDI | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈CDR3 |
| 523 | DIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYRQRPGEAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈可變區 |
| 524 | QTIWSY | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈CDR1 |
| 525 | AAS | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈CDR2 |
| 526 | QQSYSIPQT | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈CDR3 |
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞外結合結構域包含免疫毒素HA22或BL22。免疫毒素BL22及HA22為治療劑，其包含特異性針對融合至細菌毒素之CD22之scFv，且因此可結合至表現CD22之癌細胞之表面並殺傷癌細胞。BL22包含抗CD22抗體RFB4之dsFv，其融合至假單胞菌(
Pseudomonas)外毒素A之38-kDa經截短形式(Bang等人, Clin. Cancer Res., 11:1545-50 (2005))。HA22 (CAT8015，莫妥莫單抗帕蘇托(moxetumomab pasudotox))為BL22之突變之更高親和力型式(Ho等人, J. Biol. Chem., 280(1): 607-17 (2005))。特異性針對CD22之HA22及BL22之抗原結合結構域之適合序列揭示於例如美國專利第7,541,034號、第7,355,012號及第7,982,011號中，該等專利特此以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，CD22 CAR之鉸鏈結構域包含CD8α鉸鏈結構域，例如，人類CD8α鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含CD28鉸鏈結構域，例如，人類CD28鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD28鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈結構域，例如，人類IgG4鉸鏈結構域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域，例如，人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域。
在一些實施例中，CD22 CAR之跨膜結構域包含CD8α跨膜結構域，例如，人類CD8α跨膜結構域。在一些實施例中，CD8α跨膜結構域包含SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域，例如，人類CD28跨膜結構域。在一些實施例中，CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞內共刺激結構域包含4-1BB共刺激結構域，例如，人類4-1BB共刺激結構域。在一些實施例中，4-1BB共刺激結構域包含SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，細胞內共刺激結構域包含CD28共刺激結構域，例如，人類CD28共刺激結構域。在一些實施例中，CD28共刺激結構域包含SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CD22 CAR之細胞內信號傳導結構域包含CD3 zeta (ζ)信號傳導結構域，例如，人類CD3ζ信號傳導結構域。在一些實施例中，CD3ζ信號傳導結構域包含SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR，包括例如包含以下之CD22 CAR：具有SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:518所示之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:473之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR，包括例如包含以下之CD22 CAR：具有SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:518所示之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:469之CD28鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR，包括例如包含以下之CD22 CAR：具有SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:518所示之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472之IgG4鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR，包括例如包含以下之CD22 CAR：具有SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:518所示之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:468之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR，包括例如包含以下之CD22 CAR：具有SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:518所示之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:469之CD28鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:270之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
在一些實施例中，CAR為CD22 CAR，包括例如包含以下之CD22 CAR：具有SEQ ID NO:509或SEQ ID NO:518所示之序列之CD22特異性scFv、SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472之IgG4鉸鏈結構域、SEQ ID NO:474之CD28跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。
D) BCMA CAR
在一些實施例中，CAR為BCMA CAR (「BCMA-CAR」)。BCMA為在B細胞譜系之細胞上表現之腫瘤壞死家族受體(TNFR)成員，且在終末分化B細胞或成熟B淋巴細胞上具有最高表現。BCMA涉及於介導漿細胞之存活以維持長期體液免疫。最近，BCMA之表現與許多癌症，諸如多發性骨髓瘤、霍奇金氏淋巴瘤及非霍奇金氏淋巴瘤、各種白血病及神經膠母細胞瘤相關聯。在一些實施例中，BCMA CAR可包含串聯之信號肽、特異性結合BCMA之細胞外結合結構域、鉸鏈結構域、跨膜結構域、細胞內共刺激結構域及/或細胞內信號傳導結構域。
在一些實施例中，BCMA CAR之信號肽包含CD8α信號肽。在一些實施例中，CD8α信號肽包含SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:465所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含IgK信號肽。在一些實施例中，IgK信號肽包含SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:466所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，信號肽包含GMCSFR-α或CSF2RA信號肽。在一些實施例中，GMCSFR-α或CSF2RA信號肽包含SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:467所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域特異性針對BCMA，例如，人類BCMA。BCMA CAR之細胞外結合結構域可經密碼子最佳化以用於在宿主細胞中表現或具有變異體序列以增加細胞外結合結構域之功能。
在一些實施例中，細胞外結合結構域包含免疫球蛋白分子之免疫原性活性部分，例如，scFv。在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域來源於特異性針對BCMA之抗體，包括例如貝蘭他單抗(belantamab)、埃那妥單抗(erlanatamab)、特立妥單抗(teclistamab)、LCAR-B38M及西達基(ciltacabtagene)。在此等實施例中之任一者中，BCMA CAR之細胞外結合結構域可包含抗體中之任一者之V
H、V
L及/或一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如Carpenter等人, Clin. Cancer Res. 19(8):2048-2060 (2013)中所述之來源於鼠類單株抗體C11D5.3之scFv。亦參見PCT申請公開案第WO2010/104949號。源自C11D5.3之scFv可包含由Whitlow連接子連接之C11D5.3重鏈可變區(V
H)及輕鏈可變區(V
L)，其胺基酸序列在下
表 15中提供。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域包含SEQ ID NO:527、528或532所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:527、528或532所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 529-531及533-535所示之胺基酸序列。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 529-531所示之胺基酸序列。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 533-535所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，BCMA特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如Carpenter等人, Clin. Cancer Res. 19(8):2048-2060 (2013)及PCT申請公開案第WO2010/104949號中所述之來源於另一種鼠類單株抗體C12A3.2之scFv，其胺基酸序列亦在下
表 15中提供。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域包含SEQ ID NO:536、537或541所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:536、537或541所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 529-530及542-544所示之胺基酸序列。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 529-530所示之胺基酸序列。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 542-544所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，BCMA特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含對人類BCMA具有高度特異性之鼠類單株抗體，在Friedman等人, Hum. Gene Ther. 29(5):585-601 (2018))中稱作BB2121。亦參見PCT申請公開案第WO2012163805號。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如Zhao等人, J. Hematol. Oncol. 11(1):141 (2018)中所述之可結合至BCMA之兩個抗原決定基之兩個重鏈(VHH)之單一可變片段，亦稱作LCAR-B38M。亦參見PCT申請公開案第WO2018/028647號。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如Lam等人, Nat. Commun. 11(1):283 (2020)中所述之完全人類重鏈可變結構域(FHVH)，亦稱作FHVH33。亦參見PCT申請公開案第WO2019/006072號。FHVH33及其CDR之胺基酸序列在下
表 15中提供。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域包含SEQ ID NO:545所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:545所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 546-548所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如美國專利第11,026,975 B2號中所述之來源於CT103A (或CAR0085)之scFv，其胺基酸序列在下
表 17中提供。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域包含SEQ ID NO:549、550或554所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:549、550或554所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含一或多個CDR，其具有SEQ ID NO: 551-553及555-557所示之胺基酸序列。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含具有一或多個CDR之輕鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 551-553所示之胺基酸序列。在一些實施例中，BCMA特異性細胞外結合結構域可包含具有一或多個CDR之重鏈，該一或多個CDR具有SEQ ID NO: 555-557所示之胺基酸序列。在此等實施例中之任一者中，BCMA特異性scFv可包含一或多個CDR，其包含一或多個胺基酸取代，或包含與所鑑定之序列中之任一者至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之序列。在一些實施例中，BCMA CAR之細胞外結合結構域包含如本文所述之一或多個CDR或由其組成。
另外，針對BCMA之CAR及結合子已描述於美國申請公開案第2020/0246381 A1號及第2020/0339699 A1號中，該等公開案中之每一者之全部內容以引用之方式併入本文中。
表 15. 抗 BCMA 結合子及組分之示例性序列
| SEQ ID NO: | 胺基酸序列 | 描述 |
| 527 | DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗BCMA C11D5.3 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 528 | DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIK | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈可變區 |
| 529 | RASESVSVIGAHLIH | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈CDR1 |
| 530 | LASNLET | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈CDR2 |
| 531 | LQSRIFPRT | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈CDR3 |
| 532 | QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈可變區 |
| 533 | DYSIN | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈CDR1 |
| 534 | WINTETREPAYAYDFRG | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈CDR2 |
| 535 | DYSYAMDY | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈CDR3 |
| 536 | DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS | 抗BCMA C12A3.2 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 537 | DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈可變區 |
| 538 | RASESVTILGSHLIY | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈CDR1 |
| 539 | LASNVQT | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈CDR2 |
| 540 | LQSRTIPRT | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈CDR3 |
| 541 | QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈可變區 |
| 542 | HYSMN | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈CDR1 |
| 543 | RINTESGVPIYADDFKG | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈CDR2 |
| 544 | DYLYSLDF | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈CDR3 |
| 545 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGDYIYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGTGANSSLADYRGQGTLVTVSS | 抗BCMA FHVH33完整序列 |
| 546 | GFTFSSYA | 抗BCMA FHVH33 CDR1 |
| 547 | ISGSGDYI | 抗BCMA FHVH33 CDR2 |
| 548 | AKEGTGANSSLADY | 抗BCMA FHVH33 CDR3 |
| 549 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS | 抗BCMA CT103A scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 550 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIK | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈可變區 |
| 551 | QSISSY | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈CDR1 |
| 552 | AAS | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈CDR2 |
| 553 | QQKYDLLT | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈CDR3 |
| 554 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS | 抗BCMA CT103A scFv重鏈可變區 |
| 555 | GGSISSSSYY | 抗BCMA CT103A scFv重鏈CDR1 |
| 556 | ISYSGST | 抗BCMA CT103A scFv重鏈CDR2 |
| 557 | ARDRGDTILDV | 抗BCMA CT103A scFv重鏈CDR3 |
在一些實施例中，BCMA CAR之鉸鏈結構域包含CD8α鉸鏈結構域，例如，人類CD8α鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD8α鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:468所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含CD28鉸鏈結構域，例如，人類CD28鉸鏈結構域。在一些實施例中，CD28鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:469所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈結構域，例如，人類IgG4鉸鏈結構域。在一些實施例中，IgG4鉸鏈結構域包含SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:471或SEQ ID NO:472所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，鉸鏈結構域包含IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域，例如，人類IgG4鉸鏈-Ch2-Ch3結構域。
在一些實施例中，BCMA CAR之跨膜結構域包含CD8α跨膜結構域，例如，人類CD8α跨膜結構域。在一些實施例中，CD8α跨膜結構域包含SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:473所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，跨膜結構域包含CD28跨膜結構域，例如，人類CD28跨膜結構域。在一些實施例中，CD28跨膜結構域包含SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:474所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞內共刺激結構域包含4-1BB共刺激結構域，例如，人類4-1BB共刺激結構域。在一些實施例中，4-1BB共刺激結構域包含SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:476所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。在一些實施例中，細胞內共刺激結構域包含CD28共刺激結構域，例如，人類CD28共刺激結構域。在一些實施例中，CD28共刺激結構域包含SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:477所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，BCMA CAR之細胞內信號傳導結構域包含CD3 zeta (ζ)信號傳導結構域，例如，人類CD3ζ信號傳導結構域。在一些實施例中，CD3ζ信號傳導結構域包含SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:478所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)之胺基酸序列，或由其組成。
在一些實施例中，CAR為BCMA CAR，包括例如包含以下之BCMA CAR：所述BCMA特異性細胞外結合結構域中之任一者、SEQ ID NO:468之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:476之4-1BB共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。在此等實施例中之任一者中，BCMA CAR可另外包含所述信號肽(例如，CD8α信號肽)。
在一些實施例中，CAR為BCMA CAR，包括例如包含以下之BCMA CAR：所述BCMA特異性細胞外結合結構域中之任一者、SEQ ID NO:468之CD8α鉸鏈結構域、SEQ ID NO:473之CD8α跨膜結構域、SEQ ID NO:477之CD28共刺激結構域、SEQ ID NO:478之CD3ζ信號傳導結構域，及/或其變異體(亦即，具有與所揭示之序列至少80%一致，例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、或至少99%一致之序列)。在此等實施例中之任一者中，BCMA CAR可另外包含如所述信號肽。
在一些實施例中，CAR為如SEQ ID NO:558所示之BCMA CAR，或與SEQ ID NO:558所示之核苷酸序列(參見
表 16)至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)。經編碼之BCMA CAR具有SEQ ID NO:559所示之相應胺基酸序列，或與SEQ ID NO:559所示之胺基酸序列至少80%一致(例如，至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%一致)，具有以下組分：CD8α信號肽、CT103A scFv (V
L-Whitlow連接子-V
H)、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。
在一些實施例中，CAR為BCMA CAR之市售實施例，包括例如艾基維侖塞(ide-cel，亦稱為bb2121)。在一些實施例中，CAR為艾基維侖塞或其部分。艾基維侖塞包含具有以下組分之BCMA CAR：BB2121結合子、CD8α鉸鏈結構域、CD8α跨膜結構域、4-1BB共刺激結構域及CD3ζ信號傳導結構域。
表 16. BCMA CAR 之示例性序列
3. 基因體修飾酶
| SEQ ID NO: | 序列 | 描述 |
| 558 | atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaaaatacgacctcctcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaaggcagcaccagcggctccggcaagcctggctctggcgagggcagcacaaagggacagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagagatcgtggagacaccatactagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtcagctcattcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctaccaccacccctgcccctagacctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcggagccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga | 示例性BCMA CAR核苷酸序列 |
| 559 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 示例性BCMA CAR胺基酸序列 |
在一些實施例中，外源劑為或包含基因體編輯技術。在一些實施例中，外源劑為或包含與基因體編輯技術相關之異源蛋白。可包括與基因編輯技術相關之多種劑中之任一者作為外源劑及/或異源蛋白，諸如用於將基因編輯機制遞送至細胞。在一些實施例中，基因編輯技術可包括涉及核酸酶、切口酶、歸巢酶、整合酶、轉座酶、重組酶及/或反轉錄酶活性之系統。在一些實施例中，基因編輯技術可用於基因之敲除或敲低。在一些實施例中，基因編輯技術可用於將DNA敲入或整合至基因體區域中。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白介導單股斷裂(SSB)。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白介導雙股斷裂(DSB)，包括與非同源末端連接(NHEJ)或同源定向修復(HDR)相結合。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白不介導SSB。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白不介導DSB。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白可用於DNA鹼基編輯或先導編輯。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白可用於經由位點特異性靶向元件(PASTE)之可編程添加。
在一些實施例中，外源劑為用於基因編輯方法之核酸酶。在一些實施例中，核酸酶為鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)或CRISPR相關蛋白核酸酶(Cas)。在一些實施例中，Cas蛋白係選自由Cas3、Cas9、Cas10、Cas12及Cas13組成之群。在一些實施例中，Cas為來自普雷沃菌(Prevotella)、新弗朗西斯菌(Francisella novicida)、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)、毛螺菌科細菌(Lachnospiraceae bacterium)或弗朗西斯菌(Francisella bacteria)之Cas12a (亦稱為cpf1)。在一些實施例中，Cas為來自釀膿鏈球菌(
Streptococcus pyogenes)之Cas9。在一些實施例中，Cas為來自釀膿鏈球菌之Cas9 (SpCas)。在一些實施例中，Cas9來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (SaCas9)。在一些實施例中，Cas9來自腦膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis) (NmeCas9)。在一些實施例中，Cas9來自空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni) (CjCas9)。在一些實施例中，Cas9來自嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilis) (StCas9)。在一些實施例中，Cas為來自普雷沃菌或弗朗西斯菌之Cas12a (亦稱為cpf1)，或者Cas為來自例如芽孢桿菌之Cas12b，視情況為外村尚芽孢桿菌(
Bacillus hisashii)。在一些實施例中，Cas為來自普雷沃菌、新弗朗西斯菌、胺基酸球菌屬、毛螺菌科細菌或弗朗西斯菌之Cas12a (亦稱為cpf1)。在任何實施例中之一些實施例中，Cas為Cas3、Cas13、CasMini或此項技術中已知之任何其他Cas蛋白。參見例如Wang等人, Biosensors and Bioelectronics (165) 1: 2020，及Wu等人 Nature Reviews Chemistry (4) 441: 2020。在一些實施例中，Cas9核酸酶可為來自任何細菌種類之Cas9或其功能片段。參見例如Makarova等人 Nature Reviews, Microbiology, 9: 467-477 (2011)，包括補充資訊，特此以全文引用之方式併入。
在一些實施例中，核酸酶之遞送係藉由所提供之編碼核酸酶(例如，Cas)之載體進行。
在一些實施例中，所提供之病毒載體粒子含有核酸酶蛋白且核酸酶蛋白直接遞送至靶細胞。遞送核酸酶蛋白之方法包括例如Cai等人 Elife, 2014, 3:e01911及國際專利公開案第WO2017068077號中所述之彼等。舉例而言，所提供之病毒載體粒子包含一或多種Cas蛋白，諸如Cas9。在一些實施例中，核酸酶蛋白(例如Cas，諸如Cas 9)經工程改造為具有病毒結構蛋白(例如，GAG)之嵌合核酸酶蛋白，用於包裝至病毒載體粒子(例如，慢病毒載體粒子)中。舉例而言，嵌合Cas9蛋白與結構性GAG蛋白之融合體可包裝於慢病毒載體粒子內。在一些實施例中，融合蛋白為(i)病毒結構蛋白(例如GAG)與(ii)核酸酶蛋白(例如Cas蛋白，諸如Cas 9)之間的可裂解融合蛋白。
在一些實施例中，Cas為野生型Cas9，其可位點特異性裂解雙股DNA，從而活化雙股斷裂(DSB)修復機制。DSB可藉由細胞非同源末端連接(NHEJ)路徑來修復(Overballe-Petersen等人, 2013, Proc Natl Acad Sci USA, 第110卷: 19860-19865)，從而進行破壞靶向基因座之插入及/或缺失(插入缺失)。或者，若提供與靶向基因座具有同源性之供體模板，則DSB可藉由同源定向修復(HDR)路徑來修復，從而允許進行精確置換突變(Overballe-Petersen等人, 2013, Proc Natl Acad Sci USA, 第110卷: 19860-19865；Gong等人, 2005, Nat. Struct Mol Biol, 第12卷: 304-312)。在一些實施例中，Cas為僅具有切口酶活性之突變體形式，稱為Cas9 D10A。此意謂Cas9D10A僅裂解一個DNA股，且不活化NHEJ。相反，當提供同源修復模板時，僅經由高保真HDR路徑進行DNA修復，從而減少插入缺失突變(Cong等人, 2013, Science, 第339卷: 819-823；Jinek等人, 2012, Science, 第337卷: 816-821；Qi等人, 2013 Cell, 第152卷: 1173-1183)。當基因座由經設計以產生相鄰DNA缺口之成對Cas9複合物靶向時，Cas9D10A在標靶特異性方面甚至更具吸引力(Ran等人, 2013, Cell, 第154卷: 1380-1389)。在一些實施例中，Cas為核酸酶缺陷Cas9 (Qi等人, 2013 Cell, 第152卷: 1173-1183)。舉例而言，HNH結構域中之突變H840A及RuvC結構域中之突變D10A使裂解活性失活，但不阻止DNA結合。因此，此變異體可用於以序列特異性方式靶向基因體之任何區域而無需裂解。相反，藉由與各種效應結構域融合，dCas9可用作基因緘默或活化工具。此外，藉由將向導RNA或Cas9蛋白與螢光團或螢光蛋白偶合，dCas9可用作可視化工具。在一些實施例中，Cas蛋白包含一或多個突變，使得Cas蛋白轉化為能夠僅裂解雙股DNA分子之一股的切口酶(例如，SSB)。在一些實施例中，Cas蛋白係選自由以下組成之群：Cas3、Cas4、Cas5、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas9、Cas10、Cas12、Cas12a (Cpf1)、Cas12b (C2c1)、Cas12c (C2c3)、Cas12d (CasY)、Cas12e (CasX)、Cas12f (C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k (C2c5)、Cas13、Cas13a (C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d、C2c4、C2c8、C2c9、Cmr5、Cse1、Cse2、Csf1、Csm2、Csn2、Csx10、Csx11、Csy1、Csy2、Csy3及Mad7。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9。在一些實施例中，Cas9來自選自由釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌、腦膜炎奈瑟球菌、空腸彎曲桿菌及嗜熱鏈球菌組成之群的細菌。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌且在RuvC I、RuvC II或RuvC III模體中包含一或多個突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌且在RuvC I模體中包含D10A突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌且在HNH催化結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌且在HNH催化結構域中包含一或多個選自由H840A、H854A及H863A組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌且在HNH催化結構域中包含H840A突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌且包含選自由D10A、H840A、H854A及H863A組成之群的突變。
在一些實施例中，Cas蛋白係選自由Cas3、Cas9、Cas10、Cas12及Cas13組成之群。在特定實施例中，核酸酶為Cas核酸酶，諸如Cas9。在一些實施例中，CRISPR/Cas之遞送可用於經由單個gRNA在特定靶基因中引入單點突變(缺失或插入)。相反，使用一對gRNA引導之Cas9核酸酶，亦可能誘導大缺失或基因體重排，諸如倒位或易位。在一些實施例中，能夠誘導DSB之一或多種劑(例如，異源蛋白)包含Cas9或其功能片段，及第一向導RNA，例如第一sgRNA，及第二向導RNA，例如第二sgRNA。在一些實施例中，向導RNA，例如第一向導RNA或第二向導RNA，結合至重組核酸酶且將重組核酸酶靶向靶基因內之特定位置，諸如靶基因之有義股或反義股內之位置，該位置為或包括裂解位點。在一些實施例中，重組核酸酶為來自任何細菌種類之Cas蛋白，或為其功能片段。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas9可為來自任何細菌種類之Cas9或其功能片段。參見例如Makarova等人 Nature Reviews, Microbiology, 9: 467-477 (2011)，包括補充資訊，特此以全文引用之方式併入。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)。在一些實施例中，Cas9來自金黃色葡萄球菌(SaCas9)。在一些實施例中，Cas9來自腦膜炎奈瑟球菌(NmeCas9)。在一些實施例中，Cas9來自空腸彎曲桿菌(CjCas9)。在一些實施例中，Cas9來自嗜熱鏈球菌(StCas9)。
在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且在RuvC催化結構域或HNH催化結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，RuvC催化結構域或HNH催化結構域中之一或多個突變使該結構域之催化活性失活。在一些實施例中，重組核酸酶具有RuvC活性但不具有HNH活性。在一些實施例中，重組核酸酶不具有RuvC活性但具有HNH活性。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由D10A、H840A、H854A及H863A組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且在RuvC I、RuvC II或RuvC III模體中包含一或多個突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且在RuvC I模體中包含突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且在RuvC I模體中包含D10A突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且在HNH催化結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，HNH催化結構域中之一或多個突變係選自由H840A、H854A及H863A組成之群。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且在HNH催化結構域中包含H840A突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含H840A突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含D10A突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由N497A、R661A、Q695A及Q926A組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由R780A、K810A、K855A、H982A、K1003A、R1060A及K848A組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由N692A、M694A、Q695A及H698A組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由M495V、Y515N、K526E及R661Q組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由F539S、M763I及K890N組成之群的突變。在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SpCas9)且包含一或多個選自由E480K、E543D、E1219V、A262T、S409I、M694I、E108G、S217A組成之群的突變。
在一些實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(SaCas9)。在一些實施例中，SaCas9為野生型SaCas9。在一些實施例中，SaCas9在REC3結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，SaCas9在REC1結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，SaCas9包含一或多個選自由N260D、N260Q、N260E、Q414A、Q414L組成之群的突變。在一些實施例中，SaCas9在識別葉中包含一或多個突變。在一些實施例中，SaCas9包含一或多個選自由R245A、N413A、N419A組成之群的突變。在一些實施例中，SaCas9在RuvC-III結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，SaCas9包含R654A突變。
在一些實施例中，Cas蛋白為Cas12。在一些實施例中，Cas蛋白為Cas12a (亦即，cpf1)。在一些實施例中，Cas12a來自由新弗朗西斯菌U112 (FnCas12a)、胺基酸球菌屬BV3L6 (AsCas12a)、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi) AAX11_00205 (Mb3Cas12a)、毛螺菌科細菌ND2006 (LbCas12a)、硫微螺菌屬(Thiomicrospira sp.) Xs5 (TsCas12a)、牛眼莫拉氏菌AAX08_00205 (Mb2Cas12a)及丁酸弧菌屬(Butyrivibrio) NC3005 (BsCas12a)組成之群。在一些實施例中，Cas12a識別富含T之5'原間隔子相鄰模體(PAM)。在一些實施例中，Cas12a處理其自身之crRNA而無需反式活化crRNA (tracrRNA)。在一些實施例中，Cas12a處理RNase及DNase活性。在一些實施例中，Cas12a為由Cas12a之N端及C端片段組成之分裂Cas12a平台。在一些實施例中，分裂Cas12a平台來自毛螺菌科細菌。
在一些實施例中，脂質粒子進一步包含多核苷酸本身，亦即，不編碼異源蛋白之多核苷酸。在一些實施例中，多核苷酸本身與基因編輯系統相關。舉例而言，脂質粒子可包含向導RNA (gRNA)，諸如單向導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)包含向導RNA，例如單向導RNA (sgRNA)，或與向導RNA組合使用，用於在裂解位點處誘導DSB。在一些實施例中，一或多種劑包含多於一種向導RNA，例如第一sgRNA及第二sgRNA，或與多於一種向導RNA組合使用，用於經由各股上之SSB在裂解位點處誘導DSB。在一些實施例中，一或多種劑(例如，異源蛋白)可與供體模板，例如單股DNA寡核苷酸(ssODN)組合使用，用於HDR介導之供體模板整合至靶基因中，諸如在靶向序列處。在一些實施例中，一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)可與供體模板(例如，ssODN)及向導RNA (例如，sgRNA)組合使用，用於HDR介導之供體模板整合至靶基因中，諸如在靶向序列處。在一些實施例中，一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)可與供體模板(例如，ssODN)及第一向導RNA (例如，第一sgRNA)及第二向導RNA (例如，第二sgRNA)組合使用，用於HDR介導之供體模板整合至靶基因中，諸如在靶向序列處。
在特定實施例中，基因體修飾劑為Cas蛋白，諸如Cas9。在一些實施例中，CRISPR/Cas之遞送可用於經由單個gRNA在特定靶基因中引入單點突變(缺失或插入)。相反，使用一對gRNA引導之Cas9核酸酶，亦可能誘導大缺失或基因體重排，諸如倒位或易位。在一些實施例中，CRISPR/Cas9系統之dCas9型式可用於靶向蛋白質結構域以進行轉錄調控、表觀遺傳修飾及特定基因體基因座之顯微可視化。
在一些實施例中，基因體修飾劑(例如，Cas9)藉由與向導RNA (例如，sgRNA)相互作用而靶向裂解位點，該向導RNA與緊接在原間隔子相鄰模體(PAM)序列之前的DNA序列雜交。一般而言，向導RNA (例如，sgRNA)為包含如下序列(例如，crRNA序列)之任何核苷酸序列：其與靶基因序列具有足夠互補性以在裂解位點處與靶基因序列雜交且引導重組核酸酶與包括裂解位點之靶基因部分的序列特異性結合。不一定需要完全互補性(100%)，只要有足夠互補性以引起雜交且促進複合物(例如，CRISPR複合物)形成即可，該複合物包括重組核酸酶(例如，Cas9)及向導RNA (例如，sgRNA)。在一些實施例中，裂解位點位於靶基因內與向導RNA (例如，sgRNA)之序列同源之位點處。在一些實施例中，裂解位點位於PAM序列上游約3個核苷酸處。在一些實施例中，裂解位點位於向導RNA與PAM序列之間的接合點上游約3個核苷酸處。在一些實施例中，裂解位點位於PAM序列上游3個核苷酸處。在一些實施例中，裂解位點位於PAM序列上游4個核苷酸處。
在一些實施例中，能夠誘導DSB之一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)包含融合蛋白，該融合蛋白包含DNA結合結構域及DNA裂解結構域。在一些實施例中，DNA裂解結構域為或包含重組核酸酶。在一些實施例中，融合蛋白為包含DNA結合結構域及DNA裂解結構域之TALEN。在一些實施例中，DNA結合結構域為轉錄活化子樣(TAL)效應子DNA結合結構域。在一些實施例中，TAL效應子DNA結合結構域來自黃單胞菌屬細菌。在一些實施例中，DNA裂解結構域為Fokl核酸酶結構域。在一些實施例中，TAL效應子DNA結合結構域經工程改造以靶向特定靶序列，例如，包括裂解位點之靶基因部分。
在一些實施例中，融合蛋白為包含鋅指DNA結合結構域及DNA裂解結構域之鋅指核酸酶(ZFN)。在一些實施例中，DNA裂解結構域為Fokl核酸酶結構域。在一些實施例中，鋅指DNA結合結構域經工程改造以靶向特定靶序列，例如，包括裂解位點之靶基因部分，諸如靶向序列。
在一些實施例中，所提供之脂質粒子可用於遞送外源劑之方法，該方法涉及向細胞中引入一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)，該一或多種劑能夠在細胞中之內源靶基因之有義股內之裂解位點處誘導SSB且在反義股內之裂解位點處誘導SSB。
在一些實施例中，有義股中之裂解位點距與反義股中之裂解位點互補之核苷酸少於400個、少於350個、少於300個、少於250個、少於200個、少於175個、少於150個、少於125個、少於100個、少於90個、少於80個、少於75個、少於70個、少於65個、少於60個、少於55個、少於50個、少於45個、少於40個或少於35個核苷酸。在一些實施例中，反義股中之裂解位點距與有義股中之裂解位點互補之核苷酸少於400個、少於350個、少於300個、少於250個、少於200個、少於175個、少於150個、少於125個、少於100個、少於90個、少於80個、少於75個、少於70個、少於65個、少於60個、少於55個、少於50個、少於45個、少於40個或少於35個核苷酸。在一些實施例中，有義股中之裂解位點距與反義股中之裂解位點互補之核苷酸介於20個與400個、20個與350個、20個與300個、20個與250個、20個與200個、20個與150個、20個與125個、20個與100個、20個與90個、20個與80個、20個與70個、30個與400個、30個與350個、30個與300個、30個與250個、30個與200個、30個與150個、30個與125個、30個與100個、30個與90個、30個與80個、30個與70個、40個與400個、40個與350個、40個與300個、40個與250個、40個與200個、40個與150個、40個與125個、40個與100個、40個與90個、40個與80個或40個與70個核苷酸之間。在一些實施例中，反義股中之裂解位點距與有義股中之裂解位點互補之核苷酸介於20個與400個、20個與350個、20個與300個、20個與250個、20個與200個、20個與150個、20個與125個、20個與100個、20個與90個、20個與80個、20個與70個、30個與400個、30個與350個、30個與300個、30個與250個、30個與200個、30個與150個、30個與125個、30個與100個、30個與90個、30個與80個、30個與70個、40個與400個、40個與350個、40個與300個、40個與250個、40個與200個、40個與150個、40個與125個、40個與100個、40個與90個、40個與80個或40個與70個核苷酸之間。
在一些實施例中，能夠在有義股內之裂解位點處誘導SSB且在反義股內之裂解位點處誘導SSB之一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)包含重組核酸酶。在一些實施例中，重組核酸酶包括在有義股中誘導SSB之重組核酸酶及在反義股中誘導SSB之重組核酸酶，且該兩種重組核酸酶均稱作重組核酸酶。因此，在一些實施例中，該方法涉及向細胞中引入包含重組核酸酶之一或多種劑(例如，一或多種外源劑及/或異源蛋白)，用於在細胞中之內源靶基因內之有義股中之裂解位點處誘導SSB且在反義股中之裂解位點處誘導SSB。儘管在一些實施例中，描述「一種」、「該」重組核酸酶在反義股中誘導SSB、在有義股中誘導 SSB，但應理解，此包括使用兩種相同重組核酸酶之情況，使得其中一種重組核酸酶在有義股中誘導SSB且另一種重組核酸酶在反義股中誘導SSB。在一些實施例中，誘導SSB之重組核酸酶缺乏藉由裂解雙股DNA之兩股來誘導DSB之能力。
在一些實施例中，能夠誘導SSB之一或多種劑包含重組核酸酶及第一向導RNA (例如，第一sgRNA)及第二向導RNA (例如，第二sgRNA)。
在一些實施例中，基因體修飾劑為Cas蛋白、轉錄活化子樣效應子核酸酶(TALEN)或鋅指核酸酶(ZFN)。在一些實施例中，重組核酸酶為Cas核酸酶。在一些實施例中，重組核酸酶為TALEN。在一些實施例中，重組核酸酶為ZFN。
在一些實施例中，能夠在有義股內之裂解位點處誘導SSB且在反義股內之裂解位點處誘導SSB之一或多種劑包含融合蛋白，該融合蛋白包含DNA結合結構域及DNA裂解結構域。在一些實施例中，DNA裂解結構域為或包含重組核酸酶。在一些實施例中，融合蛋白為包含DNA結合結構域及DNA裂解結構域之TALEN。在一些實施例中，DNA結合結構域為轉錄活化子樣(TAL)效應子DNA結合結構域。在一些實施例中，TAL效應子DNA結合結構域來自黃單胞菌屬細菌。在一些實施例中，DNA裂解結構域為Fokl核酸酶結構域。在一些實施例中，TAL效應子DNA結合結構域經工程改造以靶向特定靶序列，例如，包括裂解位點之靶基因部分。在一些實施例中，融合蛋白為包含鋅指DNA結合結構域及DNA裂解結構域之鋅指核酸酶(ZFN)。在一些實施例中，DNA裂解結構域為Fokl核酸酶結構域。在一些實施例中，鋅指DNA結合結構域經工程改造以靶向特定靶序列，例如，包括裂解位點之靶基因部分，諸如靶向序列。
在一些實施例中，能夠在有義股內之裂解位點處誘導SSB且在反義股內之裂解位點處誘導SSB之一或多種劑涉及使用CRISPR/Cas基因編輯系統。在一些實施例中，一或多種劑包含重組核酸酶。
在一些實施例中，基因體修飾劑為Cas蛋白。在一些實施例中，Cas蛋白包含一或多個突變，使得Cas蛋白轉化為缺乏裂解雙股DNA分子之兩股之能力的切口酶。在一些實施例中，Cas蛋白包含一或多個突變，使得Cas蛋白轉化為能夠僅裂解雙股DNA分子之一股的切口酶。舉例而言，通常能夠誘導雙股斷裂之Cas9可藉由使兩個Cas9催化結構域之一突變而轉化為能夠誘導單股斷裂之Cas9切口酶：RuvC結構域，其包含RuvC I、RuvC II及RuvC III模體，或NHN結構域。在一些實施例中，Cas蛋白在RuvC催化結構域或HNH催化結構域中包含一或多個突變。在一些實施例中，基因體修飾蛋白為已經修飾以具有切口酶活性之重組核酸酶。在一些實施例中，重組核酸酶裂解與向導RNA (例如，sgRNA)雜交之股，但不裂解與向導RNA (例如，sgRNA)雜交之股互補的股。在一些實施例中，重組核酸酶不裂解與向導RNA (例如，sgRNA)雜交之股，但裂解與向導RNA (例如，sgRNA)雜交之股互補的股。
在一些實施例中，脂質粒子進一步包含向導RNA (gRNA)，諸如單向導RNA (sgRNA)。因此，在一些實施例中，異源劑包含向導RNA (gRNA)。在一些實施例中，gRNA為單向導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，基因體修飾蛋白(例如，Cas9)藉由與向導RNA，例如第一向導RNA (諸如第一sgRNA)或第二向導RNA (諸如第二sgRNA)相互作用而靶向裂解位點，該向導RNA與有義股或反義股上緊接在原間隔子相鄰模體(PAM)序列之前的DNA序列雜交。
在一些實施例中，基因體修飾劑(例如，Cas9)藉由與第一向導RNA (例如，第一sgRNA)相互作用而靶向有義股上之裂解位點，該第一向導RNA與有義股上緊接在PAM序列之前的序列雜交。在一些實施例中，基因體修飾劑(例如，Cas9)藉由與第二向導RNA (例如，第二sgRNA)相互作用而靶向反義股上之裂解位點，該第二向導RNA與反義股上緊接在PAM序列之前的序列雜交。
在一些實施例中，對所關注之靶基因之有義股具有特異性之第一向導RNA (例如，第一sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之有義股內之裂解位點處誘導SSB。在一些實施例中，對所關注之靶基因之反義股具有特異性之第一向導RNA (例如，第一sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之反義股內之裂解位點處誘導SSB。
在一些實施例中，對所關注之靶基因之有義股具有特異性之第二向導RNA (例如，第二sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之有義股內之裂解位點處誘導SSB。在一些實施例中，對所關注之靶基因之反義股具有特異性之第二向導RNA (例如，第二sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之反義股內之裂解位點處誘導SSB。
在一些實施例中，對所關注之靶基因之有義股具有特異性之第一向導RNA (例如，第一sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之有義股內之裂解位點處誘導SSB；且對所關注之靶基因之反義股具有特異性之第二向導RNA (例如，第二sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之反義股內之裂解位點處誘導SSB。
在一些實施例中，對所關注之靶基因之反義股具有特異性之第一向導RNA (例如，第一sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之反義股內之裂解位點處誘導SSB；且對所關注之靶基因之有義股具有特異性之第二向導RNA (例如，第二sgNA)用於靶向重組核酸酶(例如，Cas9)，以在靶基因之有義股內之裂解位點處誘導SSB。一般而言，向導RNA，例如第一向導RNA (諸如第一sgRNA)或第二向導RNA (諸如第二sgRNA)，為包含如下序列(例如，crRNA序列)之任何核苷酸序列：其與靶基因序列具有足夠互補性以在裂解位點處與靶基因序列雜交且引導重組核酸酶與包括裂解位點之靶基因部分的序列特異性結合。不一定需要完全互補性(100%)，只要有足夠互補性以引起雜交且促進複合物(例如，CRISPR複合物)形成即可，該複合物包括重組核酸酶(例如，Cas9)及向導RNA，例如第一向導RNA (諸如第一sgRNA)或第二向導RNA (諸如第二sgRNA)。
在一些實施例中，裂解位點位於靶基因內與向導RNA (例如，sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，有義股之裂解位點位於靶基因之有義股內與第一向導RNA (例如，第一sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，反義股之裂解位點位於靶基因之反義股內與第一向導RNA (例如，第一sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，有義股之裂解位點位於靶基因之有義股內與第二向導RNA (例如，第二sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，反義股之裂解位點位於靶基因之反義股內與第二向導RNA (例如，第二sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，有義股之裂解位點位於靶基因之有義股內與第一向導RNA (例如，第一sgRNA)內所包含之序列同源之位點處；且反義股之裂解位點位於靶基因之反義股內與第二向導RNA (例如，第二sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，反義股之裂解位點位於靶基因之反義股內與第一向導RNA (例如，第一sgRNA)內所包含之序列同源之位點處；且有義股之裂解位點位於靶基因之有義股內與第二向導RNA (例如，第二sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。在一些實施例中，反義股之裂解位點位於靶基因之反義股內與第二向導RNA (例如，第二sgRNA)內所包含之序列同源之位點處；且有義股之裂解位點位於靶基因之有義股內與第一向導RNA (例如，第一sgRNA)內所包含之序列同源之位點處。
在一些實施例中，有義股包含靶向序列，且靶向序列包括SNP及原間隔子相鄰模體(PAM)序列。在一些實施例中，有義股包含靶向序列，且靶向序列包括SNP及原間隔子相鄰模體(PAM)序列；且反義股包含與靶向序列互補之序列且包括PAM序列。在一些實施例中，反義股包含靶向序列，且靶向序列包括SNP及原間隔子相鄰模體(PAM)序列。在一些實施例中，反義股包含靶向序列，且靶向序列包括SNP及原間隔子相鄰模體(PAM)序列；且有義股包含與靶向序列互補之序列且包括PAM序列。
在一些實施例中，有義股及/或反義股上之裂解位點位於PAM序列上游約3個核苷酸處。在一些實施例中，有義股及/或反義股上之裂解位點位於向導RNA與PAM序列之間的接合點上游約3個核苷酸處。在一些實施例中，有義股及/或反義股上之裂解位點位於PAM序列上游3個核苷酸處。在一些實施例中，有義股及/或反義股上之裂解位點位於PAM序列上游4個核苷酸處。
在一些實施例中，由重組核酸酶識別之PAM序列在有義股中。在一些實施例中，由重組核酸酶識別之PAM序列在反義股中。在一些實施例中，由重組核酸酶識別之PAM序列在有義股中且在反義股中。在一些實施例中，有義股上之PAM序列及反義股上之PAM序列面向外。在一些實施例中，有義股上之PAM序列及反義股上之PAM序列包含相同核酸序列，其可為本文所揭示之任何PAM序列。在一些實施例中，有義股上之PAM序列及反義股上之PAM序列各自包含不同核酸序列，其中每一者可為本文所揭示之PAM序列中之任一者。
在一些實施例中，由重組核酸酶(例如，Cas9)識別之PAM序列取決於特定重組核酸酶及其來自之細菌種類而不同。
用於設計向導RNA (例如，sgRNA)及其示例性靶向序列(例如，crRNA序列)之方法可包括例如國際PCT公開案第WO2015/161276號、第WO2017/193107號及第WO2017/093969號中所述之彼等。示例性向導RNA結構，包括特定結構域，描述於WO2015/161276中，例如，其中之圖1A-1G中。由於向導RNA為RNA分子，因此其將包含鹼基尿嘧啶(U)，而編碼向導RNA分子之任何DNA將包含鹼基胸腺嘧啶(T)。在一些實施例中，向導RNA (例如，sgRNA)包含CRISPR靶向RNA序列(crRNA)及反式活化crRNA序列(tracrRNA)。在一些實施例中，第一向導RNA (例如，第一sgRNA)及第二向導RNA (例如，第二sgRNA)各自包含crRNA及tracrRNA。在一些實施例中，向導RNA (例如，sgRNA)為自5'至3'包含crRNA序列及tracrRNA序列之RNA。在一些實施例中，第一向導RNA (例如，第一sgRNA)及第二向導RNA (例如，第二sgRNA)中之每一者為自5'至3'包含crRNA序列及tracrRNA序列之RNA。在一些實施例中，crRNA及tracrRNA不天然地一起出現於同一序列中。
在一些實施例中，crRNA包含與包括裂解位點之靶基因部分同源，例如至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源，或100%同源之核苷酸序列。在一些實施例中，crRNA包含與包括裂解位點之靶基因部分100%同源之核苷酸序列。在一些實施例中，包括裂解位點之靶基因部分為包括裂解位點之靶基因有義股部分。在一些實施例中，包括裂解位點之靶基因部分為包括裂解位點之靶基因反義股部分。
在一些實施例中，sgRNA包含與靶基因中包括裂解位點之序列同源之crRNA序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含與靶基因有義股中包括裂解位點之序列同源的crRNA序列；及/或第二sgRNA包含靶基因反義股中與包括裂解位點之序列同源的crRNA序列。在一些實施例中，第一sgRNA包含與靶基因反義股中包括裂解位點之序列同源的crRNA序列；及/或第二sgRNA包含靶基因有義股中與包括裂解位點之序列同源的crRNA序列。
在一些實施例中，crRNA序列與靶基因中包括裂解位點之序列具有100%序列一致性。在一些實施例中，第一sgRNA之crRNA序列與靶基因有義股中包括裂解位點之序列具有100%序列一致性；及/或第二sgRNA之crRNA序列與靶基因反義股中包括裂解位點之序列具有100%序列一致性。在一些實施例中，第一sgRNA之crRNA序列與靶基因反義股中包括裂解位點之序列具有100%序列一致性；及/或第二sgRNA之crRNA序列與靶基因有義股中包括裂解位點之序列具有100%序列一致性。
關於選擇crRNA序列之指南可見於例如Fu Y等人, Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808)及Sternberg SH等人, Nature 2014 (doi: 10.1038/ nature13011)中。將crRNA序列置於向導RNA (例如，sgRNA)結構內之實例包括WO2015/161276中，例如其中之圖1A-1G中所述之彼等。
提及「crRNA」應理解為亦包括各自獨立地提及第一sgRNA之crRNA及第二sgRNA之crRNA。因此，提及「crRNA」之實施例應理解為獨立地提及(i) crRNA、(ii)第一sgRNA之crRNA及(iii)第二sgRNA之crRNA的實施例。在一些實施例中，crRNA之長度為15-27個核苷酸，亦即，crRNA之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸。在一些實施例中，crRNA之長度為18-22個核苷酸。在一些實施例中，crRNA之長度為19-21個核苷酸。在一些實施例中，crRNA之長度為20個核苷酸。
在一些實施例中，crRNA與包括裂解位點之靶基因部分同源。在一些實施例中，crRNA與包括裂解位點之靶基因有義股部分同源。在一些實施例中，crRNA與包括裂解位點之靶基因反義股部分同源。在一些實施例中，第一sgRNA之crRNA與包括裂解位點之靶基因有義股部分同源；且第二sgRNA之crRNA與包括裂解位點之靶基因反義股部分同源。
在一些實施例中，crRNA與包括裂解位點之靶基因反義股部分同源。在一些實施例中，crRNA與包括裂解位點之靶基因有義股部分同源。在一些實施例中，第一sgRNA之crRNA與包括裂解位點之靶基因反義股部分同源；且第二sgRNA之crRNA與包括裂解位點之靶基因有義股部分同源。
在一些實施例中，crRNA與包括裂解位點之靶基因部分同源，且長度為15-27個核苷酸，亦即，crRNA之長度為15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27個核苷酸。在一些實施例中，包括裂解位點之靶基因部分在有義股上。在一些實施例中，包括裂解位點之靶基因部分在反義股上。
在一些實施例中，crRNA與靶基因之有義股或反義股中包括裂解位點且緊接在PAM序列上游之部分(亦即，序列)同源。
在一些實施例中，tracrRNA序列可為或包含在此項技術中已知之任何CRISPR/Cas9系統中使用之tracrRNA的任何序列。提及「tracrRNA」應理解為亦包括各自獨立地提及第一sgRNA之tracrRNA及第二sgRNA之tracrRNA。因此，提及「tracrRNA」之實施例應理解為獨立地提及(i) tracrRNA、(ii)第一sgRNA之tracrRNA及(iii)第二sgRNA之tracrRNA的實施例。示例性CRISPR/ Cas9系統、sgRNA、crRNA及tracrRNA及其製造過程及用途包括例如國際PCT公開案第WO2015/161276號、第WO2017/193107號及第WO2017/093969號中所述之彼等，及例如美國專利申請公開案第20150232882號、第20150203872號、第20150184139號、第20150079681號、第20150073041號、第20150056705號、第20150031134號、第20150020223號、第20140357530號、第20140335620號、第20140310830號、第20140273234號、第20140273232號、第20140273231號、第20140256046號、第20140248702號、第20140242700號、第20140242699號、第20140242664號、第20140234972號、第20140227787號、第20140189896號、第20140186958號、第20140186919號、第20140186843號、第20140179770號、第20140179006號、第20140170753號、第20140093913號及第20140080216號中所述之彼等。
在一些實施例中，異源蛋白與鹼基編輯相關。鹼基編輯器(BE)典型地為Cas (「CRISPR相關」)結構域及核鹼基修飾結構域(例如天然或進化之去胺酶，諸如包括APOBEC1 (「載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽1」)之胞苷去胺酶、CDA (「胞苷去胺酶」)及AID (「活化誘導之胞苷去胺酶」))結構域之融合體。在一些情況下，鹼基編輯器亦可包括改變細胞DNA修復過程之蛋白質或結構域，以提高由此產生之單核苷酸變化之效率及/或穩定性。
在一些態樣中，當前可用之鹼基編輯器包括將標靶C • G轉化為T • A之胞苷鹼基編輯器(例如，BE4)及將標靶A • T轉化為G • C之腺嘌呤鹼基編輯器(例如，ABE7.10)。在一些態樣中，首先與鹼基編輯器(BE)系統相結合證明Cas9靶向去胺，該系統經設計以誘導鹼基變化而不引入雙股DNA斷裂。此外，與失活Cas9 (dCas9)融合之大鼠去胺酶APOBEC1 (rAPOBEC1)用於在sgRNA之PAM上游成功地將胞苷轉化為胸苷。在一些態樣中，此第一個BE系統藉由將dCas9更改為「切口酶」Cas9 D10A進行最佳化，該切口酶將與去胺基胞苷相對之股切口。不受理論約束，預期此會啟動長補丁鹼基切除修復(BER)，其中去胺基股優先用於模板化修復以產生U:A鹼基對，接著在DNA複製期間將其轉化為T:A。
在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白為或編碼鹼基編輯器(例如，核鹼基編輯器)。在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白為核鹼基編輯器，其含有無催化活性之第一DNA結合蛋白結構域、具有鹼基編輯活性之結構域及具有切口酶活性之第二DNA結合蛋白結構域，其中DNA結合蛋白質結構域在單個融合蛋白上表現或獨立地表現(例如，在獨立表現載體上)。在一些實施例中，鹼基編輯器為融合蛋白，其包含具有鹼基編輯活性之結構域(例如，胞苷去胺酶或腺苷去胺酶)及兩個核酸可編程DNA結合蛋白結構域(napDNAbp)，第一個napDNAbp包含切口酶活性且第二個napDNAbp無催化活性，其中至少兩個napDNAbp由連接子連接。在一些實施例中，鹼基編輯器為融合蛋白，其包含具有切口酶活性(nCas；nCas9)之CRISPR-Cas (例如，Cas9)之DNA結構域、具有核酸可編程DNA結合活性(dCas；例如dCas9)之CRISPR-Cas蛋白(例如，Cas9)之無催化活性結構域及去胺酶結構域，其中dCas經由連接子連接至nCas，且dCas緊鄰去胺酶結構域。在一些實施例中，鹼基編輯器為腺嘌呤至胸腺嘧啶或「ATBE」(或胸腺嘧啶至腺嘌呤或「TABE」)顛換鹼基編輯器。示例性鹼基編輯器及鹼基編輯器系統包括專利公開案第US20220127622號、第US20210079366號、第US20200248169號、第US20210093667號、第US20210071163號、第WO2020181202號、第WO2021158921號、第WO2019126709號、第WO2020181178號、第WO2020181195號、第WO2020214842號、第WO2020181193號中所述之任一者，該等公開案特此以全文併入。
在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白用於靶引發反轉錄(TPRT)或「引發編輯」。在一些實施例中，引發編輯介導人類細胞中之靶向插入、缺失、所有12種可能之鹼基至鹼基轉化及其組合，而不需要DSB或供體DNA模板。
引發編輯為基因體編輯方法，該方法使用核酸可編程DNA結合蛋白(「napDNAbp」)與聚合酶(亦即，以融合蛋白形式或以其他方式與napDNAbp反式提供)協同工作，將新遺傳資訊直接寫入指定DNA位點中，其中引發編輯系統用引發編輯(PE)向導RNA (「PEgRNA」)進行編程，該RNA經由工程改造至向導RNA上(例如在5'或3'末端，或在向導RNA之內部部分)之延伸(DNA或RNA)來指定靶位點且以置換DNA股之形式模板化所需編輯之合成。含有所需編輯之置換股(例如，單核鹼基取代)與待編輯之靶位點之內源股共享相同序列(不同之處在於其包括所需編輯)。經由DNA修復及/或複製機制，靶位點之內源股由新合成之含有所需編輯之置換股置換。在一些情況下，引發編輯可視為「搜索與置換」基因體編輯技術，此係因為引發編輯器搜索並定位待編輯之所需靶位點，且編碼同時替代相應靶位點內源DNA股安裝之含有所需編輯之置換股。舉例而言，引發編輯可適於進行基於CRISPR/Cas之精確基因體編輯以避開雙股斷裂。在一些實施例中，異源蛋白為或編碼Cas蛋白-反轉錄酶融合體或相關系統，以用向導RNA靶向特定DNA序列，在靶位點處產生單股切口，且使用切口DNA作為引子用於與向導RNA整合之工程改造之反轉錄酶模板的反轉錄。在一些實施例中，引發編輯蛋白與兩個引發編輯向導RNA (pegRNA)配對，該等向導RNA模板化基因體DNA之相對股上之互補DNA瓣的合成，從而用pegRNA編碼之序列置換PE誘導之切口位點之間的內源DNA序列。
在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白為或編碼引子編輯器，其為反轉錄酶或此項技術中已知之任何DNA聚合酶。因此，在一個態樣中，引發編輯器可包含Cas9 (或等效napDNAbp)，其經編程以藉由將其與專用向導RNA (亦即，PEgRNA)相關聯來靶向DNA序列，該向導RNA含有與靶DNA中之互補原間隔子黏接之間隔子序列。此類方法包括Anzalone等人(doi.org/10.1038/ s41586-019-1711-4)或PCT公開案第WO2020191248號、第WO2021226558號或第WO2022067130號中所揭示之任何方法，該等文獻特此以全文併入。
在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白用於經由位點特異性靶向元件(PASTE)之可編程添加。在一些態樣中，PASTE為經由與反轉錄酶及絲胺酸整合酶融合之CRISPR-Cas9切口酶引導基因體插入之平台。如Ioannidi等人(doi.org/10.1101/2021.11.01.466786)中所述，PASTE不產生雙股斷裂，但允許整合大至約36 kb之序列。在一些實施例中，絲胺酸整合酶可為此項技術中已知之任一者。在一些實施例中，絲胺酸整合酶具有足夠正交性，使得PASTE可用於多重基因整合，在至少兩個基因體基因座處同時整合至少兩個不同基因。在一些實施例中，PASTE具有與同源定向修復或基於非同源末端連接之整合相當或更好之編輯效率，在非分裂細胞中具有活性且可偵測到更少脫靶事件。
在一些實施例中，外源劑及/或異源蛋白為或編碼一或多種具有選自由以下組成之群之活性的多肽：核酸酶活性(例如，可編程核酸酶活性)；切口酶活性(例如，可編程切口酶活性)；歸巢活性(例如，可編程DNA結合活性)；核酸聚合酶活性(例如，DNA聚合酶或RNA聚合酶活性)；整合酶活性；重組酶活性；或鹼基編輯活性(例如，胞苷去胺酶或腺苷去胺酶活性)。
在一些實施例中，核酸酶之遞送係藉由所提供之編碼核酸酶(例如，Cas)之載體進行。
在一些實施例中，所提供之脂質粒子含有核酸酶蛋白且核酸酶蛋白直接遞送至靶細胞。遞送核酸酶蛋白之方法包括例如Cai等人 Elife, 2014, 3:e01911及國際專利公開案第WO2017068077號中所述之彼等。舉例而言，所提供之脂質粒子包含一或多種Cas蛋白，諸如Cas9。在一些實施例中，核酸酶蛋白(例如Cas，諸如Cas 9)經工程改造為具有病毒結構蛋白(例如，GAG)之嵌合核酸酶蛋白，用於包裝至脂質粒子(例如，慢病毒載體粒子、VLP或奈米囊泡(gesicle))中。舉例而言，嵌合Cas9蛋白與結構性GAG蛋白之融合體可包裝於脂質粒子內。在一些實施例中，融合蛋白為(i)病毒結構蛋白(例如GAG)與(ii)核酸酶蛋白(例如Cas蛋白，諸如Cas9)之間的可裂解融合蛋白。在一些實施例中，融合蛋白為(i)病毒基質(MA)蛋白與(ii)核酸酶蛋白(例如Cas蛋白，諸如Cas9)之間的可裂解融合蛋白。在一些實施例中，粒子含有緊接在gag起始密碼子下游之核酸酶蛋白(例如Cas蛋白，諸如Cas 9)。
在一些實施例中，所提供之脂質粒子含有編碼Cas核酸酶(例如，Cas9)之mRNA。在一些實施例中，所提供之脂質粒子含有向導RNA (gRNA)，諸如單引導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，CRISPR/Cas9系統之dCas9型式可用於靶向蛋白質結構域以進行轉錄調控、表觀遺傳修飾及特定基因體基因座之顯微可視化。
在一些實施例中，所提供之含有Cas核酸酶(例如，Cas9)之病毒粒子(例如，慢病毒粒子)進一步包含一或多種用於靶向所需靶基因之CRISPR-Cas系統向導RNA或與其進一步複合。在一些實施例中，CRISPR向導RNA有效地封裝於含有CAS之病毒粒子中。在一些實施例中，所提供之病毒粒子(例如，慢病毒粒子)進一步包含靶向核酸或與靶向核酸進一步複合。
4. 小分子
在一些實施例中，外源劑包括小分子，例如，離子(例如，Ca
2+、C1-、Fe
2+)、碳水化合物、脂質、活性氧類、活性氮類、類異戊二烯、信號傳導分子、血基質、多肽輔因子、受電子化合物、供電子化合物、代謝物、配位體及其任何組合。在一些實施例中，小分子為與細胞中之標靶相互作用之藥物。在一些實施例中，小分子靶向細胞中之蛋白質以進行降解。在一些實施例中，小分子藉由將蛋白質定位於蛋白酶體來靶向細胞中之蛋白質以進行降解。在一些實施例中，彼小分子為蛋白水解靶向嵌合體分子(PROTAC)。
在一些實施例中，外源劑包括蛋白質、核酸或代謝物之混合物，例如，多種多肽、多種核酸、多種小分子；核酸、多肽及小分子之組合；核糖核蛋白複合物(例如，Cas9-gRNA複合物)；多種轉錄因子、多種表觀遺傳因子、重編程因子(例如，Oct4、Sox2、cMyc及Klf4)；多個調控RNA；及其任何組合。
IV. 醫藥組合物
亦提供包含本文中含有變異體NiV-F或編碼變異體NiV-F之多核苷酸之脂質粒子的組合物，包括醫藥組合物及調配物。醫藥組合物可包括含有所述變異體NiV-F之脂質粒子中之任一者。
在一些態樣中，本揭示案亦提供包含本文所述之組合物及醫藥學上可接受之載劑的醫藥組合物。
術語「醫藥調配物」係指如下製劑：其形式允許其中所含之活性成分之生物活性有效，且不含對該調配物將投與之個體具有不可接受之毒性的額外組分。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外之成分，其對個體無毒。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩沖劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
在一些態樣中，載劑之選擇部分地由特定脂質粒子及/或投與方法確定。因此，存在多種適合之調配物。舉例而言，醫藥組合物可含有防腐劑。適合之防腐劑可包括例如對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鈉及苯扎氯銨(benzalkonium chloride)。在一些態樣中，使用兩種或更多種防腐劑之混合物。防腐劑或其混合物典型地以組合物總重量之約0.0001%至約2%之量存在。載體例如由Remington's Pharmaceutical Sciences 第16版, Osol, A.編 (1980)描述。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對接受者無毒，且包括但不限於：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲銨；氯化六甲雙銨(hexamethonium chloride)；苯扎氯銨；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，諸如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽抗衡離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如，Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。
在一些實施例中，脂質粒子符合醫藥或良好製造規範(GMP)標準。在一些實施例中，脂質粒子係根據良好製造規範(GMP)製得。在一些實施例中，脂質粒子具有低於預定參考值之病原體水準，例如，實質上不含病原體。在一些實施例中，脂質粒子具有低於預定參考值之污染物水準，例如，實質上不含污染物。在一些實施例中，脂質粒子具有低免疫原性。
在一些實施例中，本文所述之醫藥組合物之調配物可藉由藥理學技術中已知或以後開發之任何方法來製備。在一些實施例中，製備方法包括將活性成分與載劑或一或多種其他輔助成分締合之步驟，接著在必要時或需要時將產品成形或包裝成所需單劑量或多劑量單位。
在一些實施例中，「單位劑量」為包含預定量之活性成分之醫藥組合物的離散量。在一些實施例中，活性成分之量一般等於將向個體投與之活性成分之劑量或此種劑量之適宜分數，諸如此種劑量之二分之一或三分之一。在一些實施例中，單位劑型可為單個日劑量或多個日劑量(例如，每天約1至4次或更多次)之一。在一些實施例中，當使用多個日劑量時，單位劑型對於各劑量可相同或不同。
在一些實施例中，含有變異體NiV-F之脂質粒子為病毒載體或病毒樣粒子(例如，章節III)。在一些實施例中，本文所提供之組合物可調配成基因體複本(GC)之劑量單位。已描述用於確定GC之適合方法，且包括例如M. Lock等人, Hu Gene Therapy Methods, Hum Gene Ther Methods 25(2):115-25. 2014中所述之qPCR或數位液滴PCR (ddPCR)，該文獻以引用之方式併入本文中。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
4至約10
10GC單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
9至約10
15GC單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
5至約10
9GC單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
6至約10
9GC單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
9至約10
12GC單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
12至約10
14GC單位，包括端值。在一些實施例中，投與劑量為約1.0×10
9GC單位、5.0×10
9GC單位、1.0×10
10GC單位、5.0×10
10GC單位、1.0×10
11GC單位、5.0×10
11GC單位、1.0×10
12GC單位、5.0×10
12GC單位或1.0×10
13GC單位、5.0×10
13GC單位、1.0×10
14GC單位、5.0×10
14GC單位或1.0×10
15GC單位。
在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
4至約10
10感染單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
9至約10
15感染單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
5至約10
9感染單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
6至約10
9感染單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
9至約10
12感染單位，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
12至約10
14感染單位，包括端值。在一些實施例中，投與劑量為約1.0×10
9感染單位、5.0×10
9感染單位、1.0×10
10感染單位、5.0×10
10感染單位、1.0×10
11感染單位、5.0×10
11感染單位、1.0×10
12感染單位、5.0×10
12感染單位或1.0×10
13感染單位、5.0×10
13感染單位、1.0×10
14感染單位、5.0×10
14感染單位或1.0×10
15感染單位。可用於定量感染單位之技術在此項技術中為常規的，且包括病毒粒子數確定、螢光顯微術及藉由空斑檢定之效價。舉例而言，可藉由量測A260處之吸光度來確定腺病毒粒子之數目。類似地，亦可藉由使用單株抗體進行載體特異性蛋白質之定量免疫螢光或藉由空斑檢定來確定感染單位。
在一些實施例中，計算感染單位之方法包括空斑檢定，其中使病毒之滴定物在細胞單層上生長且在數天至數週後對空斑之數目進行計數。舉例而言，藉由諸如空斑檢定，例如評估細胞病變效應(CPE)之檢定來確定感染效價。在一些實施例中，藉由在覆蓋有瓊脂糖之單層細胞，諸如HFF細胞上連續稀釋病毒來進行CPE檢定。在培育一段時間以達成細胞病變效應，諸如約3至28天，一般7至10天後，可固定細胞且確定可視化為空斑之缺失細胞的病灶。在一些實施例中，可使用終點稀釋(TCID50)方法來確定感染效價，該方法確定感染50%之細胞培養物時的病毒稀釋度，且因此一般可確定一定範圍(諸如一個對數)內之效價。
在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
4至約10
10空斑形成單位(pfu)，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約109至約10
15pfu，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
5至約10
9pfu，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
6至約10
9pfu，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
9至約10
12pfu，包括端值。在一些實施例中，病毒載體或病毒樣粒子之投與劑量為約10
12至約10
14pfu，包括端值。在一些實施例中，投與劑量為約1.0×10
9pfu、5.0×10
9pfu、1.0×10
10pfu、5.0×10
10pfu、1.0×10
11pfu、5.0×10
11pfu、1.0×10
12pfu、5.0×10
12pfu或1.0×10
13pfu、5.0×10
13pfu、1.0×10
14pfu、5.0×10
14pfu或1.0×10
15pfu。
在一些實施例中，個體將接受單次注射。在一些實施例中，可按每天/每週/每月之時間間隔重複投與無限期及/或直至已確立治療功效。如本文所闡述，可藉由評價本文所述之症狀及臨床參數及/或藉由偵測所需反應來確定治療功效。
媒劑提供之脂質粒子之所需確切量將因個體而異，此取決於個體之物種、年齡、體重及一般狀況、所使用之特定多核酸、多肽或載體、其投與模式等。鑒於本文中之教義，一般熟習此項技術者僅使用常規實驗可確定適當量。
在一些實施例中，組合物作為無菌液體製劑提供，例如等張水溶液、懸浮液、乳液、分散液或黏性組合物，其在一些態樣中可經緩衝至選定之pH。液體製劑通常比凝膠、其他黏性組合物及固體組合物更易製備。另外，液體組合物在某種程度上更便於投與，尤其藉由注射。另一方面，可在適當黏度範圍內調配黏性組合物以提供與特定組織之更長接觸時間。液體或黏性組合物可包含載劑，其可為含有例如水、鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇)及其適合混合物之溶劑或分散介質。
可藉由將脂質粒子摻入溶劑中，諸如與適合之載劑、稀釋劑或賦形劑，諸如無菌水、生理鹽水、葡萄糖、右旋糖或類似物混合來製備無菌可注射溶液。亦可凍乾組合物。取決於投與途徑及所需製劑，組合物可含有輔助物質，諸如濕潤劑、分散劑或乳化劑(例如，甲基纖維素)、pH緩衝劑、膠凝劑或黏度增強劑、防腐劑、調味劑、著色劑及類似物。在一些態樣中，可查閱標准文本來製備適合之製劑。
可注射劑可按習用形式製備，如液體溶液或懸浮液，適合於在注射前將懸浮液溶解於液體中之固體形式，或乳液。如本文所用，「非經腸投與」包括皮內、鼻內、皮下、肌內、腹膜內、靜脈內及氣管內途徑，以及緩慢釋放或持續釋放系統以維持恆定劑量。
可添加增強組合物之穩定性及無菌性之各種添加劑，包括抗微生物防腐劑、抗氧化劑、螯合劑及緩沖劑。可由各種抗細菌劑及抗真菌劑，例如對羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸及類似物確保防止微生物之作用。可藉由使用延遲吸收劑，例如單硬脂酸鋁及明膠來延長可注射醫藥形式之吸收。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體之固體疏水聚合物之半透性基質，該等基質為成形物品之形式，例如，薄膜或微膠囊。
在一些實施例中，媒劑調配物可包含冷凍保護劑。如本文所用，術語「冷凍保護劑」係指一或多種劑，當與給定物質組合時，有助於減少或消除冷凍時對彼物質造成之損害。在一些實施例中，冷凍保護劑與載體媒劑組合以在冷凍期間穩定該等載體媒劑。在一些態樣中，在-20℃與-80℃之間冷凍儲存RNA可有利於多核苷酸之長期(例如，36個月)穩定性。在一些實施例中，RNA種類為mRNA。在一些實施例中，冷凍保護劑包含於媒劑調配物中以經由冷凍/解凍循環及在冷凍儲存條件下穩定多核苷酸。所提供之實施例之冷凍保護劑可包括但不限於蔗糖、海藻糖、乳糖、甘油、右旋糖、棉子糖及/或甘露糖醇。海藻糖由食品藥物管理局(Food and Drug Administration)列為公認安全(GRAS)的，且通常用於商業醫藥調配物中。
用於活體內投與之調配物一般為無菌的。無菌可容易地例如藉由經無菌濾膜過濾來實現。
V. 使用方法
在一些實施例中，本文所提供之脂質粒子(例如，假型慢病毒載體)或含有其之醫藥組合物可向個體，例如哺乳動物，例如人類投與。在此類實施例中，個體可能處於特定疾病或疾患之風險下，可能具有特定疾病或疾患之症狀，或可能經診斷患有或鑑定為患有特定疾病或疾患。在一個實施例中，個體患有癌症。在一個實施例中，個體患有感染性疾病。在一些實施例中，脂質粒子，諸如靶向脂質粒子，含有編碼用於治療個體之疾病或疾患之外源劑的核酸序列。舉例而言，外源劑為靶向或特異性針對贅瘤細胞蛋白質之外源劑，且向個體投與脂質粒子以治療個體之腫瘤或癌症。在另一個實例中，外源劑為炎性介體或免疫分子，諸如細胞介素，且向個體投與脂質粒子以治療需要調節(例如，增加)免疫反應之任何疾患，諸如癌症或感染性疾病。在一些實施例中，以有效量或有效劑量投與脂質粒子以實現疾病、疾患或病症之治療。本文提供任何所提供之脂質粒子在此類方法及治療中之用途，及在製備藥劑以實施此類治療方法中之用途。在一些實施例中，藉由向患有、已患有或疑似患有疾病或疾患或病症之個體投與脂質粒子或包含其之組合物來實施該等方法。在一些實施例中，該等方法由此治療個體之疾病或疾患或病症。本文亦提供任何組合物(諸如本文所提供之醫藥組合物)用於治療與外源劑靶向或提供之特定基因或蛋白質相關之疾病、疾患或病症之用途。
在一些實施例中，所提供之方法或用途涉及醫藥組合物之投與，包括經口、吸入、經皮或非經腸(包括靜脈內、瘤內、腹膜內、肌內、結內、腔內及皮下)投與。在一些實施例中，脂質粒子可單獨投與或調配成醫藥組合物。在一些實施例中，可向個體，例如哺乳動物，例如人類投與本文所述之脂質粒子或組合物。在任何實施例中之一些實施例中，個體可能處於特定疾病或疾患(例如，本文所述之疾病或疾患)之風險下，可能具有特定疾病或疾患之症狀，或可能經診斷患有或鑑定為患有特定疾病或疾患。在一些實施例中，疾病為疾病或病症。
在一些實施例中，脂質粒子可按單位劑量組合物之形式投與，諸如單位劑量經口、非經腸、經皮或吸入組合物。在一些實施例中，組合物係藉由混合製備且適於經口、吸入、經皮或非經腸投與，且因此可為錠劑、膠囊、經口液體製劑、粉末、顆粒、口含錠、可重構粉末、可注射劑及可輸注溶液或懸浮液或栓劑或氣霧劑之形式。
在一些實施例中，投與方案可影響有效量之構成。在一些實施例中，可在疾病診斷之前或之後向個體投與治療調配物。在一些實施例中，可每天或依序投與數個分開之劑量以及交錯之劑量，或可連續輸注該劑量，或可為團注。在一些實施例中，可按治療或預防情況之緊急性所指示按比例增加或減少治療調配物之劑量。
在一些實施例中，可使用已知程序以有效預防或治療疾病之劑量及時間段，向個體，較佳為哺乳動物，更佳為人類投與本發明之組合物。在一些實施例中，達成治療作用所必需之治療化合物之有效量可根據諸如以下之因素而變化：所採用之特定化合物之活性；投與時間；化合物之排泄速率；治療之持續時間；與該化合物組合使用之其他藥物、化合物或材料；所治療個體之疾病或病症狀態、年齡、性別、體重、狀況、一般健康狀況及既往病史；及醫學技術中熟知之類似因素。在一些實施例中，可調整劑量方案以提供最佳治療反應。在一些實施例中，可每天投與數個分開之劑量，或可按治療情況之緊急性所指示按比例減少劑量。一般熟習此項技術者將能夠研究相關因素且在無過度實驗之情況下確定治療化合物之有效量。
在一些實施例中，可按每天數次之頻率向個體投與化合物，或可按較低頻率投與，諸如每天一次、每週一次、每兩週一次、每月一次或甚至更低頻率，諸如每數月一次或甚至每年一次或更低頻率。在一些實施例中，每天給藥之化合物之量可在非限制性實例中每天、每隔一天、每2天、每3天、每4天或每5天投與。在一些實施例中，對於每隔一天投與，可在星期一開始每天5 mg之劑量且在星期三投與第一個後續每天5 mg之劑量，在星期五投與第二個後續每天5 mg之劑量，等等。劑量之頻率將為技術人員顯而易見且將取決於許多因素，諸如但不限於所治療疾病之類型及嚴重程度、動物之類型及年齡等。
在一些實施例中，可改變本發明之醫藥組合物中之活性成分的劑量水準以獲得對於特定個體、組合物及投藥模式有效達成所需治療反應而對個體無毒之活性成分的量。
一般熟習此項技術之醫生，例如醫師或獸醫，可容易地確定及開出所需醫藥組合物之有效量。在一些實施例中，醫師或獸醫可按低於達成所需治療作用所需之水準開始醫藥組合物中所採用之本發明化合物之劑量，且逐漸增加劑量直至達成所需作用。
在一些實施例中，尤其有利的是將化合物調配成劑量單位形式以便於投與及劑量均勻。在一些實施例中，如本文所用之劑量單位形式係指適合作為用於待治療個體之單位劑量之物理離散單位；各單位含有預定量之治療化合物，該預定量經計算以與所需醫藥媒劑締合產生所需治療作用。在一些實施例中，本發明之劑量單位形式由以下因素決定且直接取決於以下因素：(a)治療化合物之獨特特徵及欲達成之特定治療作用，及(b)混配/調配此種治療化合物用於治療個體疾病之技術中固有之限制。
在一些實施例中，術語「容器」包括用於容納醫藥組合物之任何貯器。在一些實施例中，容器為含有醫藥組合物之包裝。在其他實施例中，容器不為含有醫藥組合物之包裝，亦即，容器為貯器，諸如含有包裝之醫藥組合物或未包裝之醫藥組合物及關於醫藥組合物之使用說明書的盒或小瓶。應理解，關於醫藥組合物之使用說明書可包含於含有醫藥組合物之包裝上，且因此說明書與包裝產品形成增強之功能關係。在一些實施例中，說明書可含有關於化合物執行其預期功能之能力的資訊，例如，治療或預防個體之疾病，或向個體遞送成像劑或診斷劑。
在一些實施例中，本文所揭示之任何組合物之投與途徑包括經口、經鼻、直腸、非經腸、舌下、經皮、經黏膜(例如，舌下、經舌、(經)頰、(經)尿道、陰道(例如，經陰道及陰道周圍)、鼻(內)及(經)直腸)、膀胱內、肺內、十二指腸內、胃內、鞘內、皮下、肌內、皮內、動脈內、靜脈內、支氣管內、吸入及局部投與。
在任何實施例中之一些實施例中，適合之組合物及劑型包括例如錠劑、膠囊、囊片、丸劑、凝膠帽、喉錠、分散液、懸浮液、溶液、糖漿、顆粒、珠粒、經皮貼片、凝膠、粉末、團粒、搪糊、口含錠、乳膏、糊劑、膏藥、洗劑、圓片、栓劑、用於經鼻或經口投與之液體噴霧、用於吸入之干粉或霧化調配物、用於膀胱內投與之組合物及調配物，及類似物。
在一些實施例中，包含外源劑或貨物之脂質粒子組合物可用於將此種外源劑或貨物遞送至細胞組織或個體。在一些實施例中，藉由投與本文所述之脂質粒子組合物遞送貨物可改變細胞蛋白質表現水準。在某些實施例中，所投與之組合物引導(經由細胞中之表現、細胞中之遞送或細胞內之誘導)一或多種貨物(例如，多肽或mRNA)之上調，其提供在多肽所遞送之細胞中實質上不存在或降低之功能活性。在一些實施例中，缺失之功能活性本質上可為酶促的、結構的或調控的。在一些實施例中，所投與之組合物引導一或多種多肽之上調，其增加(例如，協同地)在多肽上調之細胞中存在但實質上缺乏之功能活性。在任何實施例中之一些實施例中，所投與之組合物引導(經由細胞中之表現、細胞中之遞送或細胞內之誘導)一或多種貨物(例如，多肽、siRNA或miRNA)之下調，其抑制在多肽、siRNA或miRNA所遞送之細胞中存在或上調之功能活性。在任何實施例中之一些實施例中，上調之功能活性本質上可為酶促的、結構的或調控的。在一些實施例中，所投與之組合物引導一或多種多肽之下調，其減少(例如，協同地)在多肽下調之細胞中存在或上調之功能活性。在一些實施例中，所投與之組合物引導某些功能活性之上調及其他功能活性之下調。
在任何實施例中之一些實施例中，脂質粒子組合物(例如，包含粒線體或DNA之脂質粒子組合物)介導對靶細胞之作用，且該作用持續至少1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。在一些實施例中(例如，其中脂質粒子組合物包含外源蛋白)，作用持續小於1、2、3、4、5、6或7天，2、3或4週，或1、2、3、6或12個月。
在任何實施例中之一些實施例中，將本文所述之脂質粒子組合物離體遞送至細胞或組織，例如，人類細胞或組織。在實施例中，組合物改良離體細胞或組織之功能，例如，改良細胞存活力、呼吸作用或其他功能(例如，本文所述之另一種功能)。
在一些實施例中，將組合物遞送至處於受傷狀態(例如，來自創傷、疾病、缺氧、局部缺血或其他損傷)之離體組織。
在一些實施例中，將組合物遞送至離體移植物(例如，組織外植體或用於移植之組織，例如人類靜脈、肌肉骨骼移植物(諸如骨或肌腱)、角膜、皮膚、心臟瓣膜、神經；或分離或培養之器官，例如欲移植至人體內之器官，例如人類心臟、肝、肺、腎、胰臟、腸、胸腺、眼)。在一些實施例中，在移植之前、期間及/或之後將組合物遞送至組織或器官。
在一些實施例中，將組合物遞送、投與或接觸細胞，例如，細胞製劑。在一些實施例中，細胞製劑可為細胞治療製劑(旨在向人類個體投與之細胞製劑)。在實施例中，細胞製劑包含表現嵌合抗原受體(CAR)，例如表現重組CAR之細胞。表現CAR之細胞可為例如T細胞、自然殺手(NK)細胞、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、調控性T細胞。在實施例中，細胞製劑為神經幹細胞製劑。在實施例中，細胞製劑為間葉幹細胞(MSC)製劑。在實施例中，細胞製劑為造血幹細胞(HSC)製劑。在實施例中，細胞製劑為胰島細胞製劑。
在一些實施例中，可向個體，例如哺乳動物，例如人類投與本文所述之脂質粒子組合物。在此類實施例中，個體可能處於特定疾病或疾患(例如，本文所述之疾病或疾患)之風險下，可能具有特定疾病或疾患之症狀，或可能經診斷患有或鑑定為患有特定疾病或疾患。
在一些實施例中，脂質粒子之來源來自脂質粒子組合物所投與之同一個體。在其他實施例中，來源為不同的。在一些實施例中，脂質粒子及受體組織之來源可為自體的(來自同一個體)或異源的(來自不同個體)。在一些實施例中，本文所述之脂質粒子組合物之供體組織可為與受體組織不同之組織類型。在一些實施例中，供體組織可為肌肉組織且受體組織可為結締組織(例如，脂肪組織)。在其他實施例中，供體組織及受體組織可為相同或不同類型，但來自不同器官系統。
在一些實施例中，可向患有癌症、自體免疫疾病、感染性疾病、代謝性疾病、神經退化性疾病或遺傳疾病(例如，酶缺乏症)之個體投與本文所述之脂質粒子組合物。在一些實施例中，個體需要再生。
在一些實施例中，將脂質粒子與抑制膜融合之蛋白質抑制劑共同投與。舉例而言，抑制素(Suppressyn)為抑制細胞-細胞融合之人類蛋白質(Sugimoto等人, 「A novel human endogenous retroviral protein inhibits cell-cell fusion」 Scientific Reports 3: 1462 (DOI: 10.1038/srep01462))。在一些實施例中，將脂質粒子與抑制素抑制劑，例如siRNA或抑制性抗體共同投與。
VI. 示例性實施例
所提供之實施例為：
1. 一種脂質粒子，該脂質粒子包含：
(a) 脂質雙層；
(b) 副黏液病毒醣蛋白(G蛋白)或其生物活性部分；及
(c) 包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾細胞質尾包含：
(i) 來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白；
(ii) 經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或
(iii) 包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質，
其中該G蛋白或其生物活性部分及該變異體NiV-F蛋白暴露於該脂質雙層之外部。
2. 如實施例1之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
3. 如實施例2之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
4. 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：
(a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(b) 包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾細胞質尾包含：
(i) 來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白；
(ii) 經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或
(iii) 包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質，
其中該G蛋白或其生物活性部分及該變異體NiV-F蛋白暴露於該脂質雙層之外部。
5. 如實施例1至4中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白在該G蛋白與靶細胞上之靶分子結合後展現與該靶細胞之融合活性。
6. 如實施例1至5中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
7. 如實施例6之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
8. 如實施例1至7中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體Niv-F蛋白包含含有該經修飾細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由該經修飾細胞質尾之序列組成之經修飾F1，該細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
9. 如實施例1至8中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F自N端至C端依序包含細胞外結構域、跨膜結構域及該經修飾細胞質尾。
10. 如實施例1至6中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域來自野生型NiV-F或其生物活性變異體。
11. 如實施例1至7中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列，或與SEQ ID NO:2展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
12. 如實施例1至11中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列。
13. 如實施例1至12中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾為經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失。
14. 如實施例1至13中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該經修飾細胞質尾為經截短NiV-G細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒細胞質尾之C端處或附近具有23個或約23個胺基酸殘基之缺失。
15. 如實施例1至14中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾為SEQ ID NO:27所示之經截短NiV-F細胞質尾。
16. 如實施例1至14中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之序列，或與SEQ ID NO:306展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
17. 如實施例1至16中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之序列。
18. 如實施例1至12中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白且該經修飾細胞質尾包含來自另一病毒之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分。
19. 如實施例1至12及18中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為正核糖核酸病毒界之成員。
20. 如實施例1至12、18及19中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為副黏液病毒科、彈狀病毒科、沙粒病毒科或反轉錄病毒科之成員。
21. 如實施例1至12及18至20中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為副黏液病毒科之成員。
22. 如實施例21之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為亨德拉病毒、雪松病毒、犬瘟熱病毒、副流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或仙台病毒。
23. 如實施例1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為麻疹病毒且該醣蛋白為麻疹病毒融合(F)蛋白(MvF)。
24. 如實施例1至12及18至23中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短MvF細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有至多32個連續胺基酸殘基之缺失。
25. 如實施例1至12及18至24中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短MvF細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有26個或約26個或至多26個連續胺基酸殘基之缺失。
26. 如實施例1至12及18至25中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾。
27. 如實施例1至12及18至25中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:307所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:307展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
28. 如實施例1至12及18至27中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307所示之胺基酸序列。
29. 如實施例1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為新城疫病毒(NDV)且該醣蛋白為NDV F蛋白。
30. 如實施例1至12、18至22及29中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有至多25個連續胺基酸殘基之缺失。
31. 如實施例1至12、18至22、29及30中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有17個或約17個或至多17個連續胺基酸殘基之缺失。
32. 如實施例1至12及18至22及29至31中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:147所示之異源細胞質尾。
33. 如實施例1至12、18至22及29至32中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:308所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:308展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
34. 如實施例1至12、18至22及29至33中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 308所示之胺基酸序列。
35. 如實施例1至12、18至22、29及30中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有20個或約20個或至多20個連續胺基酸殘基之缺失。
36. 如實施例1至12及18至22及29、30及35中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:150所示之異源細胞質尾。
37. 如實施例1至12、18至22、29、30、35及36中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:309所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:309展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
38. 如實施例1至12、18至22、29、30及35至37中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-G包含SEQ ID NO:309所示之胺基酸序列。
39. 如實施例1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為亨德拉病毒(HeV)且該醣蛋白為HeV F蛋白。
40. 如實施例1至12、18至22及39中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短HeV F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 58所示之野生型HeV F細胞質尾之C端處或附近具有至多26個連續胺基酸殘基之缺失。
41. 如實施例1至12、18至22、39及40中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短HeV F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 58所示之野生型HeV F細胞質尾之C端處或附近具有22個或約22個或至多22個連續胺基酸殘基之缺失。
42. 如實施例1至12、18至22及39至41中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:80所示之異源細胞質尾。
43. 如實施例1至12、18至22及39至41中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:310所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:310展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
44. 如實施例1至12、18至22及39至43中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 310所示之胺基酸序列。
45. 如實施例1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包括用來自另一副黏液病毒之附著蛋白之細胞質尾或其經截短部分置換該NiV-F細胞質尾之附著模體。
46. 如實施例45之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該副黏液病毒為尼帕病毒、亨德拉病毒或麻疹病毒。
47. 如實施例45或實施例46之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該附著蛋白為G蛋白、H蛋白或HN蛋白。
48. 如實施例45至47中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO: 210-222中之任一者所示之異源細胞質尾。
49. 如實施例1至48中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該脂質粒子或假型慢病毒粒子進一步包含經修飾胞外域，該經修飾胞外域包含經修飾蛋白酶裂解位點。
50. 如實施例49之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾裂解位點包括用SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)。
51. 如實施例49之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾裂解位點包括用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點。
52. 一種脂質粒子，該脂質粒子包含：
(a) 脂質雙層；
(b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(c) 包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點：
(i) 用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或
(ii) 用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點。
53. 如實施例52之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
54. 如實施例53之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
55. 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：
(a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(b) 包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點：
(i) 用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或
(ii) 用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:329) VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該裂解序列為組織蛋白酶L裂解位點。
56. 如實施例49至55中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
57. 如實施例52或實施例56之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該置換裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點且該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
58. 如實施例52或實施例56之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該置換裂解序列包含經修飾弗林蛋白酶裂解位點且該蛋白水解裂解形式為弗林蛋白酶裂解產物。
59. 如實施例49至58中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該置換係在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:320所示之胺基酸序列或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式中。
60. 如實施例50、51及53至59中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該弗林蛋白酶裂解序列如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示。
61. 如實施例50、51及53至60中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
62. 如實施例50、52及53至60中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解位點如SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示。
63. 如實施例50、52、53至60及62中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
64. 如實施例50、51、53至60、62及63中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:239展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸1-26)之成熟形式。
65. 如實施例50、51、53至60、62、63及64中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列。
66. 如實施例1至65中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中與野生型NiV-F之信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列。
67. 如實施例1至66中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F由多核苷酸序列編碼，與野生型NiV-F之經編碼信號序列相比，該多核苷酸序列包含編碼異源信號序列之序列。
68. 一種脂質粒子，該脂質粒子包含：
(a) 脂質雙層；
(b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(c) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列或由包含編碼異源信號序列之序列的多核苷酸序列編碼。
69. 如實施例68之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
70. 如實施例69之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
71. 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：
(a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(b) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列或由包含編碼異源信號序列之序列的多核苷酸序列編碼。
72. 如實施例68至71中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
73. 如實施例72之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
74. 如實施例68至73中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列來自另一病毒或為哺乳動物信號序列。
75. 如實施例74之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為副黏液病毒，視情況為亨尼帕病毒。
76. 如實施例66至75中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列為HevF信號序列、CevF信號序列、HPIV2信號序列、MevF信號序列、NDV-F信號序列或SevF信號序列。
77. 如實施例66至76中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 340-345中之任一者所示。
78. 如實施例66至77中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為副流感病毒且該異源信號序列為人類副流感病毒2 (HPIV2)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 342所示。
79. 如實施例66至78中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
80. 如實施例66至79中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
81. 如實施例66至80中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 251所示之胺基酸序列。
82. 如實施例66至74中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒、伊波拉病毒、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒。
83. 如實施例66至74及82中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。
84. 如實施例66至74、82及83中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。
85. 如實施例66至74及82至84中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為水疱性口炎病毒(VSV)且該異源信號序列為VSV G醣蛋白(VSV-G)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 352所示。
86. 如實施例66至74及82至85中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
87. 如實施例66至74及82至86中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
88. 如實施例66至74及82至87中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列。
89. 如實施例66至74中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該哺乳動物信號序列為來自人類蛋白質之信號序列。
90. 如實施例66至74及89中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。
91. 如實施例66至74、89及90中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。
92. 如實施例1至91中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中與野生型NiV-F之跨膜結構域相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
93. 一種脂質粒子，該脂質粒子包含：
(a) 脂質雙層；
(b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(c) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
94. 如實施例93之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
95. 如實施例94之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
96. 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：
(a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(b) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
97. 如實施例93至96中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
98. 如實施例97之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
99. 如實施例93至98中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該跨膜結構域為來自亨德拉病毒之異源跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 361所示。
100. 如實施例93至99中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1所示之位置的編號，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 359、360、362或363中之任一者所示。
101. 如實施例93至100中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
102. 如實施例1至101中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該脂質粒子或假型慢病毒粒子進一步包含超融合突變。
103. 如實施例102之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入該超融合突變。
104. 如實施例102或103之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該超融合突變為N64Q、N67Q、N99Q、N414Q及/或N464Q中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。
105. 如實施例104之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該一或多個突變係選自由以下組成之群：N64Q、N67Q、N99Q、N414Q、N464Q、N67Q/N99Q、N67Q/N414Q、N67Q/N464Q、N99Q/N414Q、N99Q/N464Q、N414Q/N464Q、N67Q/N99Q/N414Q、N67Q/N414Q/N464Q、N99Q/N414Q/N464Q或N67Q/N99Q/ N414Q/N464Q、N64Q/N99Q、N64Q/N99Q/N464Q、N64Q/N67Q/N99Q及N64Q/ N67Q/N99Q/N464Q。
106. 如實施例102之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入該超融合突變。
107. 如實施例102或106之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該超融合突變為R109L、Q393L或R109L與Q393L中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。
108. 一種脂質粒子，該脂質粒子包含：
(a) 脂質雙層；
(b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(c) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變：
在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入之突變；及/或
在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
109. 如實施例106、107或108中任一項之脂質粒子，其中在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393之六聚體穩定性位點處引入該超融合突變，視情況其中該突變為取代Q393L。
110. 如實施例108或實施例109之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
111. 如實施例110之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
112. 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含：
(a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及
(b) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變：
在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入之突變；及/或
在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
113. 如實施例108至112中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
114. 如實施例113之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
115. 如實施例102至114中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體包含：
突變N67Q、N99Q、N414Q或N464Q或其任何組合；及/或
突變R109L或Q393L或其組合。
116. 如實施例102至115中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該超融合突變係在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列中。
117. 如實施例1至116中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:247所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:247展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
118. 如實施例1至117中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 247所示之胺基酸序列。
119. 如實施例1至116中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:292所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
120. 如實施例1至116或119中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。
121. 如實施例1至120中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。
122. 如實施例1至121中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。
123. 如實施例1至122中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
124. 如實施例1至123中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白為NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分，其展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。
125. 如實施例124之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中蛋白質之該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
126. 如實施例124或實施例125之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
127. 如實施例122至126中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
128. 如實施例122至127中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
129. 如實施例122至128中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。
130. 如實施例129之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域附接至該G蛋白之C端。
131. 如實施例129或實施例130之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。
132. 如實施例129至131中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。
133. 如實施例129至132中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞、CD30+肺上皮細胞。
134. 如實施例129至133中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞為肝細胞。
135. 如實施例129至133及134中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域結合至選自由ASGR1、ASGR2及TM4SF組成之群的細胞表面分子。
136. 如實施例129至133中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞為T細胞。
137. 如實施例129至133及136中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域結合至選自由CD3、CD4或CD8組成之群的細胞表面分子。
138. 如實施例129至137中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域為抗體或抗原結合片段、單結構域抗體或DARPin。
139. 如實施例129至138中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域為單結構域抗體，該單結構域抗體為VHH或為單鏈可變片段(scFv)。
140. 如實施例129至139中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域經由連接子附接至該G蛋白。
141. 如實施例140之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該連接子為肽連接子。
142. 如實施例141之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該肽連接子之長度為2至65個胺基酸。
143. 如實施例141或實施例142之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該肽連接子為可撓性連接子，該可撓性連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。
144. 如實施例141至143中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該肽連接子係選自：(GGS)n，其中n為1至10；(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10；或(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。
145. 如實施例1至144中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體為複製缺陷的。
146. 如實施例1至145中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體係藉由包括用編碼Gag-pol、Rev、Tat及該變異體NiVG及該F蛋白之包裝質體轉導生產細胞之方法來製備。
147. 如實施例1至146中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該粒子進一步包含病毒核酸。
148. 如實施例147之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該病毒核酸包含以下核酸序列中之一或多者(例如，全部)：5' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3結構域)、Psi包裝元件(Psi)、中央聚嘌呤束(cPPT)/中央終止序列(CTS) (例如，DNA瓣)、聚A尾序列、轉錄後調控元件(例如，WPRE)、Rev反應元件(RRE)及3' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3)。
149. 如實施例1至147中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該粒子不含病毒基因體DNA。
150. 如實施例1至149中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該粒子以與參考粒子製劑相比具有增加之效價的製劑形式產生，該參考粒子製劑以類似方式產生，但摻有SEQ ID NO: 1所示之全長NiV-F蛋白，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
151. 如實施例1至150中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該粒子以與參考粒子製劑相比具有增加之效價的製劑形式產生，該參考粒子製劑以類似方式產生，但摻有包含SEQ ID NO:303所示之序列或由編碼SEQ ID NO:302所示之序列之多核苷酸編碼的經截短NiV-F蛋白，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
152. 如實施例150或實施例151之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加等於或大於1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
153. 如實施例150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約2.0倍或大於約2.0倍。
154. 如實施例150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約3.0倍或大於約3.0倍。
155. 如實施例150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約4.0倍或大於約4.0倍。
156. 如實施例150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約5.0倍或大於約5.0倍。
157. 如實施例1至156中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該脂質粒子或假型慢病毒粒子進一步包含用於遞送至靶細胞之外源劑。
158. 如實施例157之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑存在於內腔中。
159. 如實施例157或實施例158之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑為蛋白質或核酸，視情況其中該核酸為DNA或RNA。
160. 如實施例157至159中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑為編碼用於遞送至該靶細胞之貨物的核酸。
161. 如實施例157至160中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該外源劑為或編碼治療劑或診斷劑。
162. 如實施例157至161中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑編碼膜蛋白，視情況其中該膜蛋白為用於靶向由疾病或疾患表現或與疾病或疾患相關之細胞的抗原受體。
163. 如實施例162之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該膜蛋白為嵌合抗原受體(CAR)。
164. 如實施例157至163中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞為T細胞。
165. 如實施例157至161中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該外源劑為包含用於校正遺傳缺陷、視情況該靶細胞中之遺傳缺陷之有效負荷基因的核酸，視情況其中該遺傳缺陷與肝臟細胞或肝細胞相關。
166. 如實施例157至165中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該G蛋白與該靶細胞上之細胞表面分子的結合介導該粒子與該靶細胞之融合及該外源劑向該靶細胞之遞送。
167. 如實施例157至166中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中向等於或大於10%、20%、30%、40%、50%、60%之該等靶細胞遞送該外源劑。
168. 如實施例157至167中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該外源細胞向該靶細胞之遞送與參考粒子製劑相比有所增加，該參考粒子製劑以類似方式產生，但其中該NiV-F蛋白為SEQ ID NO: 1所示之全長NiV-F蛋白，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
169. 如實施例157至167中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源細胞向該靶細胞之遞送與參考粒子製劑相比有所增加，該參考粒子製劑以類似方式產生，但其中該F蛋白為包含SEQ ID NO:303所示之序列或由編碼SEQ ID NO:302所示之序列之多核苷酸編碼的經截短NiV-F，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
170. 如實施例157至169中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中向該靶細胞之該遞送增加等於或大於1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
171. 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，其中該經修飾細胞質尾包含：
(i) 來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白；
(ii) 經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或
(iii) 包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質。
172. 如實施例171之多核苷酸，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
173. 如實施例172之多核苷酸，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
174. 如實施例171至173中任一項之多核苷酸，其中該變異體Niv-F蛋白包含含有該經修飾細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由該經修飾細胞質尾之序列組成之經修飾F1，該細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
175. 如實施例171至174中任一項之多核苷酸，其中該變異體NiV-F自N端至C端依序包含細胞外結構域、跨膜結構域及該經修飾細胞質尾。
176. 如實施例175之多核苷酸，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域來自野生型NiV-F或其生物活性變異體。
177. 如實施例175或實施例176之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列，或與SEQ ID NO:2展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
178. 如實施例175至177中任一項之多核苷酸，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列。
179. 如實施例174至179中任一項之多核苷酸，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO: 80、133、147及150中之任一者所示之異源細胞質尾。
180. 如實施例174至179中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307、308、309及310中之任一者所示之胺基酸序列。
181. 如實施例174至178中任一項之多核苷酸，其中該經修飾細胞質尾為SEQ ID NO: 27中之任一者所示之經截短NiV-F細胞質尾。
182. 如實施例174至178及181中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 306中之任一者所示之胺基酸序列。
183. 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點：
(i) 用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或
(ii) 用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該裂解序列為組織蛋白酶L裂解位點；
其中該置換係在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:320所示之胺基酸序列或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式中。
184. 如實施例183之多核苷酸，其中該弗林蛋白酶裂解序列如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示。
185. 如實施例183或實施例184之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
186. 如實施例183之多核苷酸，其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解位點如SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示。
187. 如實施例183或實施例186之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
188. 如實施例183、實施例186或實施例187之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:239展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸1-26)之成熟形式。
189. 如實施例183及186至188中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列。
190. 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列。
191. 如實施例190之多核苷酸，其中該異源信號序列來自另一病毒或為哺乳動物信號序列。
192. 如實施例191之多核苷酸，其中該另一病毒為副黏液病毒，視情況為亨尼帕病毒。
193. 如實施例190至192中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列為HevF信號序列、CevF信號序列、HPIV2信號序列、MevF信號序列、NDV-F信號序列或SevF信號序列。
194. 如實施例190至193中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 340-345中之任一者所示。
195. 如實施例190至191中任一項之多核苷酸，其中該另一病毒為副流感病毒且該異源信號序列為人類副流感病毒2 (HPIV2)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 342所示。
196. 如實施例190、191及195中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
197. 如實施例190、191、195及196中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 251所示之胺基酸序列。
198. 如實施例190至191中任一項之多核苷酸，其中該另一病毒為HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒、伊波拉病毒、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒。
199. 如實施例190至191及198中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。
200. 如實施例190至192、198及199中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。
201. 如實施例190至191及198至199中任一項之多核苷酸，其中該另一病毒為水疱性口炎病毒(VSV)且該異源信號序列為VSV G醣蛋白(VSV-G)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 352所示。
202. 如實施例190至191及198至201中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
203. 如實施例190至191及198至202中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列。
204. 如實施例190至191中任一項之多核苷酸，其中該哺乳動物信號序列為來自人類蛋白質之信號序列。
205. 如實施例190至191及204中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。
206. 如實施例190至192、204及205中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。
207. 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
208. 如實施例207之多核苷酸，其中該跨膜結構域為來自亨德拉病毒之異源跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 361所示。
209. 如實施例207或實施例208之多核苷酸，其中該跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1所示之位置的編號，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 359、360、362或363中之任一者所示。
210. 如實施例207至209中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
211. 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變：
在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67及/或99之N-糖基化位點處引入之突變；及/或
在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
212. 如實施例211之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:247所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:247展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
213. 如實施例211或實施例212之多核苷酸，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 247所示之胺基酸序列。
214. 如實施例211至213中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:292所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
215. 如實施例211至214中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。
216. 如實施例171至215中任一項之多核苷酸，其中該核酸序列為第一核酸序列且該多核苷酸進一步包含編碼副黏液病毒融合(G)蛋白分子或其生物活性部分或其功能活性變異體之第二核酸序列。
217. 如實施例216之多核苷酸，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。
218. 如實施例216或實施例217之多核苷酸，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。
219. 如實施例216至218中任一項之多核苷酸，其中該G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
220. 如實施例216至219中任一項之多核苷酸，該多核苷酸展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。
221. 如實施例220之多核苷酸，其中蛋白質之該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
222. 如實施例220或實施例221之多核苷酸，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
223. 如實施例216至222中任一項之多核苷酸，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
224. 如實施例216至223中任一項之多核苷酸，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
225. 如實施例216至224中任一項之多核苷酸，其中該G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。
226. 如實施例225之多核苷酸，其中該結合結構域附接至該G蛋白之C端。
227. 如實施例225或實施例226之多核苷酸，其中該細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。
228. 如實施例225至227中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。
229. 如實施例225至228中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞、CD30+肺上皮細胞。
230. 如實施例225至229中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞為肝細胞。
231. 如實施例225至230中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域結合至選自由ASGR1、ASGR2及TM4SF組成之群的細胞表面分子。
232. 如實施例225至229中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞為T細胞。
233. 如實施例225至229及232中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域結合至選自由CD3、CD4或CD8組成之群的細胞表面分子。
234. 如實施例225至233中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域為抗體或抗原結合片段、單結構域抗體或DARPin。
235. 如實施例225至234中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域為單結構域抗體，該單結構域抗體為VHH或為單鏈可變片段(scFv)。
236. 如實施例225至235中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域經由連接子附接至該G蛋白。
237. 如實施例236之多核苷酸，其中該連接子為肽連接子。
238. 如實施例237之多核苷酸，其中該肽連接子之長度為2至65個胺基酸。
239. 如實施例237或實施例238之多核苷酸，其中該肽連接子為可撓性連接子，該可撓性連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。
240. 如實施例237至239中任一項之多核苷酸，其中該肽連接子係選自：(GGS)n，其中n為1至10；(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10；或(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。
241. 如實施例216至240中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含IRES或編碼該第一核酸序列與該第二核酸序列之間的連接肽之序列，視情況其中該連接肽為自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽，視情況為T2A肽。
242. 如實施例171至241中任一項之多核苷酸，該多核苷酸進一步包含至少一個操作性地連接之啟動子以控制該核酸之表現，視情況控制該第一核酸序列及該第二核酸序列之表現。
243. 一種載體，該載體包含如實施例171至242中任一項之多核苷酸。
244. 如實施例243之載體，其中該載體為哺乳動物載體、病毒載體或人工染色體，視情況其中該人工染色體為細菌人工染色體(BAC)。
245. 一種質體，該質體包含如實施例171至242中任一項之多核苷酸。
246. 如實施例245之質體，該質體進一步包含一或多種編碼用於慢病毒產生之蛋白質的核酸。
247. 一種細胞，該細胞包含如實施例171至242中任一項之多核苷酸、或如實施例243或實施例244之載體、或如實施例245或246之質體。
248. 一種製造包含變異體尼帕病毒F蛋白及視情況存在之副黏液病毒G蛋白之脂質粒子的方法，該方法包括：
a) 提供包含如實施例171至242中任一項之多核苷酸、或如實施例243或實施例244之載體、或如實施例245或實施例246之質體的細胞；
b) 在允許產生脂質粒子之條件下培養該細胞，及
c) 自該細胞中分離、富集或純化該脂質粒子，從而製造該脂質粒子。
249. 一種製造假型慢病毒載體之方法，該方法包括：
a) 提供包含慢病毒核酸及如實施例171至242中任一項之多核苷酸、或如實施例243或實施例244之載體、或如實施例245或實施例246之質體的生產細胞；
b) 在允許產生該慢病毒載體之條件下培養該細胞，及
c) 自該細胞中分離、富集或純化該慢病毒載體，從而製造該假型慢病毒載體。
250. 如實施例248或實施例249之方法，其中在步驟(b)之前，該方法進一步包括向該細胞提供編碼亨尼帕病毒F蛋白分子或其生物活性部分之多核苷酸。
251. 如實施例248至250中任一項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
252. 如實施例248至251中任一項之方法，其中該細胞為包含病毒核酸、視情況反轉錄病毒核酸或慢病毒核酸之生產細胞，且該脂質粒子為病毒粒子或病毒樣粒子，視情況為反轉錄病毒粒子或反轉錄病毒樣粒子，視情況為慢病毒粒子或慢病毒樣粒子。
253. 一種生產細胞，該生產細胞包含如實施例171至242中任一項之多核苷酸、或如實施例243或實施例244之載體、或如實施例245或實施例246之質體。
254. 如實施例253之生產細胞，該生產細胞進一步包含編碼副黏液病毒G蛋白或其生物活性部分之核酸。
255. 如實施例254之生產細胞，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。
256. 如實施例254或實施例255之生產細胞，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。
257. 如實施例254至256中任一項之生產細胞，其中該G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
258. 如實施例254至257中任一項之生產細胞，該生產細胞展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。
259. 如實施例258之生產細胞，其中該NiV-G為蛋白質功能活性變異體或其生物活性部分，其包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
260. 如實施例258或實施例259之生產細胞，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
261. 如實施例253至260中任一項之生產細胞，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
262. 如實施例254至261中任一項之生產細胞，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
263. 如實施例254至262中任一項之生產細胞，其中該G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。
264. 如實施例253至263中任一項之生產細胞，其中該細胞進一步包含病毒核酸，視情況其中該病毒核酸為慢病毒核酸。
265. 一種脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體係藉由如實施例244至248中任一項之方法或自如實施例253至264中任一項之生產細胞產生。
266. 一種組合物，該組合物包含如實施例1至170及265中任一項之複數個脂質粒子或複數個慢病毒載體。
267. 如實施例266之組合物，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
268. 一種轉導細胞之方法，該方法包括用如實施例1至170及165中任一項之慢病毒載體或包含如實施例166或實施例167之慢病毒載體或複數個慢病毒載體之組合物轉導細胞。
269. 一種將外源劑遞送至個體(例如，人類個體)之方法，該方法包括向該個體投與如實施例1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體、或包含如實施例1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體之組合物、或如實施例266或實施例267之包含慢病毒載體或複數個慢病毒載體之組合物，其中脂質粒子或慢病毒載體包含該外源劑。
270. 一種將外源劑遞送至靶細胞之方法，該方法包括使靶細胞與如實施例1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體、或包含如實施例1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體之組合物、或如實施例266或實施例267之包含慢病毒載體或複數個慢病毒載體之組合物接觸，其中該脂質粒子或慢病毒載體包含該外源劑。
271. 如實施例270之方法，其中該接觸用慢病毒載體或該脂質粒子轉導該細胞。
272. 如實施例270或實施例271之方法，其中該接觸係在個體中活體內進行。
273. 一種治療個體(例如，人類個體)之疾病或病症之方法，該方法包括向該個體投與如實施例中任一項之脂質粒子、或如實施例1至170及265中任一項之慢病毒載體、或如實施例266或實施例267之組合物。
274. 一種將哺乳動物細胞與脂質粒子融合之方法，該方法包括向該個體投與如實施例1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體或如實施例266或實施例267之組合物。
275. 如實施例274之方法，其中該哺乳動物細胞與該脂質粒子之該融合將外源劑遞送至個體(例如，人類個體)。
VII. 實例
包括以下實例僅用於說明目的且不欲限制本發明之範疇。
实例 1 NiV-F 之最佳化引起靶向之融合原效價增加
本實例描述用經修飾融合F蛋白(F蛋白)假型化之慢病毒之產生及評估。為作比較，對照NiV-F蛋白包括含有以下之NiV-F：(1)全長細胞質尾(如SEQ ID NO:4所示)，其中NiV-F序列之完整序列包括信號肽如SEQ ID NO:1所示或對於不含信號肽之成熟序列如SEQ ID NO:1之胺基酸殘基27-546所示；或(2)缺乏22個連續胺基酸之經截短細胞質結構域(如SEQ ID NO:26所示)，其中對照NiV-F序列之完整序列包括信號肽如SEQ ID NO:302所示或對於不含信號肽之成熟序列如SEQ ID NO:303所示。
A. NiV-F 變異體之產生 1. NiV-F 細胞質尾
產生示例性經截短NiV-F蛋白構築體，該等構築體含有NiV-F之跨膜及胞外域以及經截短NiV-F細胞質尾，或其中該細胞質尾來源於另一副黏液病毒之F蛋白。
a. NiV-F截短及缺失
產生示例性經截短NiV-F蛋白構築體，其中產生一系列經截短細胞質尾突變體，該等突變體缺乏NiV-F之細胞質尾之至多27個連續C端胺基酸(參見表E1「細胞質尾截短」)。另外，亦產生示例性經截短NiV-F蛋白構築體，該等構築體在膜近端多元區、基於酪胺酸之內吞模體或高電荷區中缺乏至多22個不連續間插胺基酸(參見表E1「結構域缺失」)。各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域為相同的且如SEQ ID NO:2所示。
產生之經截短NiV-G細胞質尾變異體列於表E1中。
b. NiV-F內吞模體變異體
| 表E1：NiV-F截短及缺失 | ||
| SEQ ID NO | 名稱/描述 | 細胞質尾序列 |
| 參考對照 | ||
| 4 | NivF_CT-28 (全長) | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 26 | NivF_CT-6 | EKKRNT |
| 細胞質尾截短 | ||
| 5 | NivF_CT-27 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIG |
| 6 | NivF_CT-26 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYI |
| 7 | NivF_CT-25 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYY |
| 8 | NivF_CT-24 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLY |
| 9 | NivF_CT-23 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDL |
| 10 | NivF_CT-22 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGD |
| 11 | NivF_CT-21 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSG |
| 12 | NivF_CT-20 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSS |
| 13 | NivF_CT-19 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTS |
| 14 | NivF_CT-18 | EKKRNTYSRLEDRRVRPT |
| 15 | NivF_CT-17 | EKKRNTYSRLEDRRVRP |
| 16 | NivF_CT-16 | EKKRNTYSRLEDRRVR |
| 17 | NivF_CT-15 | EKKRNTYSRLEDRRV |
| 18 | NivF_CT-14 | EKKRNTYSRLEDRR |
| 19 | NivF_CT-13 | EKKRNTYSRLEDR |
| 20 | NivF_CT-12 | EKKRNTYSRLED |
| 21 | NivF_CT-11 | EKKRNTYSRLE |
| 22 | NivF_CT-10 | EKKRNTYSRL |
| 23 | NivF_CT-9 | EKKRNTYSR |
| 24 | NivF_CT-8 | EKKRNTYS |
| 25 | NivF_CT-7 | EKKRNTY |
| 26 | NivF_CT-6 | EKKRNT |
| 27 | NivF_CT-5 | EKKRN |
| 28 | NivF_CT-4 | EKKR |
| 29 | NivF_CT-3 | EKK |
| 30 | NivF_CT-2 | EK |
| 31 | NivF_CT-1 | E |
| 結構域缺失 | ||
| 32 | 缺失膜近端多元區 | EYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 33 | 缺失基於酪胺酸之內吞模體 | EKKRNTEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 34 | 缺失高電荷區 | EKKRNTYSRLRVRPTSSGDLYYIGT |
產生示例性突變NiV-F蛋白，其中在NiV-F細胞質尾之內吞模體中進行胺基酸取代及缺失，參考SEQ ID NO:4所示之編號。各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域與SEQ ID NO:2所示相同。
產生之NiV-F細胞質尾突變體列於表E2中。
c. 嵌合F蛋白構築體
| 表E2：NiV-F細胞質尾突變體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 細胞質尾序列 |
| 35 | YSRL | EKYSRL |
| 36 | YSRL | EKKYSRL |
| 37 | NIvF_CT-6_AU1 | EKKRNTDTYRYI |
| 38 | NIvF_CT-6_HA | EKKRNTYPYDVPDYA |
| 39 | DKQTLL | EKDKQTLL |
| 40 | DKQTLL | EDKQTLL |
| 41 | DKQTLL | EKKRNTDKQTLL |
| 42 | DKQTLL | EKKRNTDKQTLLEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 43 | NPVY | EKNPVY |
| 44 | FDNPVY | EKFDNPVY |
| 45 | NPVY | EKKRNTNPVY |
| 46 | FDNPVY | EKKRNTFDNPVY |
| 47 | NPVY | EKKRNTNPVYEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 48 | FDNPVY | EKKRNTFDNPVYEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 49 | YFIPIN | EKYFIPIN |
| 50 | YFIPIN | EKKRNTYFIPIN |
| 51 | YFIPIN | EKKRNTYFIPINEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
產生示例性嵌合F蛋白構築體，其中進行一系列交換以用另一病毒或蛋白質之細胞質尾或其經截短細胞質尾置換原生NiV-F細胞質尾。產生之一系列嵌合F蛋白含有來自另一副黏液病毒、另一種來自正核糖核酸病毒界之病毒、水疱性口炎病毒(VSV)或與反轉錄病毒相關之蛋白質(亦即，HIV-1 gp41或反轉錄病毒相關細胞蛋白CD29)之另一個結構域的細胞質尾或其經截短細胞質尾。各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域與SEQ ID NO:2所示相同。
產生之NiV-F嵌合細胞質尾變異體列於表E3中。
| 表E3：NiV-F嵌合細胞質尾突變體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 細胞質尾序列 |
| I. 副黏液病毒交換 | ||
| 亨德拉病毒 | ||
| 58 | HeVF_CT_28_FL | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYIGT |
| 59 | HeVF_CT_27 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYIG |
| 60 | HeVF_CT_26 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYI |
| 61 | HeVF_CT_25 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYY |
| 62 | HeVF_CT_24 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLY |
| 63 | HeVF_CT_23 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDL |
| 64 | HeVF_CT_22 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGD |
| 65 | HeVF_CT_21 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNG |
| 66 | HeVF_CT_20 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSN |
| 67 | HeVF_CT_19 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVS |
| 68 | HeVF_CT_18 | EKKRGNYSRLDDRQVRPV |
| 69 | HeVF_CT_17 | EKKRGNYSRLDDRQVRP |
| 70 | HeVF_CT_16 | EKKRGNYSRLDDRQVR |
| 71 | HeVF_CT_15 | EKKRGNYSRLDDRQV |
| 72 | HeVF_CT_14 | EKKRGNYSRLDDRQ |
| 73 | HeVF_CT_13 | EKKRGNYSRLDDR |
| 74 | HeVF_CT_12 | EKKRGNYSRLDD |
| 75 | HeVF_CT_11 | EKKRGNYSRLD |
| 76 | HeVF_CT_10 | EKKRGNYSRL |
| 77 | HeVF_CT_9 | EKKRGNYSR |
| 78 | HeVF_CT_8 | EKKRGNYS |
| 79 | HeVF_CT_7 | EKKRGNY |
| 80 | HeVF_CT_6 | EKKRGN |
| 81 | HeVF_CT_5 | EKKRG |
| 蝙蝠副黏液病毒 | ||
| 82 | BatPVF_CT_47_FL | RRYNKYTPLINSDPSSRRSTIQDVYIIPNPGEHSIRSAARSIDRDRD |
| 83 | BatPVF_CT_14 | RRYNKYTPLINSDP |
| 84 | BatPVF_CT_13 | RRYNKYTPLINSD |
| 85 | BatPVF_CT_12 | RRYNKYTPLINS |
| 86 | BatPVF_CT_11 | RRYNKYTPLIN |
| 87 | BatPVF_CT_10 | RRYNKYTPLI |
| 88 | BatPVF_CT_9 | RRYNKYTPL |
| 89 | BatPVF_CT_8 | RRYNKYTP |
| 90 | BatPVF_CT_7 | RRYNKYT |
| 91 | BatPVF_CT_6 | RRYNKY |
| 92 | BatPVF_CT_5 | RRYNK |
| 93 | BatPVF_CT_4 | RRYN |
| 94 | BatPVF_CT_3 | RRY |
| 95 | BatPVF_CT_2 | RR |
| 雪松病毒 | ||
| 96 | CeVF_CT_29_FL | DDPDYYNDYKRERINGKASKSNNIYYVGD |
| 97 | CeVF_CT_14 | DDPDYYNDYKRERI |
| 98 | CeVF_CT_13 | DDPDYYNDYKRER |
| 99 | CeVF_CT_12 | DDPDYYNDYKRE |
| 100 | CeVF_CT_11 | DDPDYYNDYKR |
| 101 | CeVF_CT_10 | DDPDYYNDYK |
| 102 | CeVF_CT_9 | DDPDYYNDY |
| 103 | CeVF_CT_8 | DDPDYYND |
| 104 | CeVF_CT_7 | DDPDYYN |
| 105 | CeVF_CT_6 | DDPDYY |
| 106 | CeVF_CT_5 | DDPDY |
| 107 | CeVF_CT_4 | DDPD |
| 108 | CeVF_CT_3 | DDP |
| 109 | CeVF_CT_2 | DD |
| 110 | CeVF_CT_1 | D |
| 人類副流感病毒 | ||
| 111 | HPIV2F_CT_38_FL | KLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS |
| 112 | HPIV2F_CT_14 | KLVSQIHQFRSLAA |
| 113 | HPIV2F_CT_13 | KLVSQIHQFRSLA |
| 114 | HPIV2F_CT_12 | KLVSQIHQFRSL |
| 115 | HPIV2F_CT_11 | KLVSQIHQFRS |
| 116 | HPIV2F_CT_10 | KLVSQIHQFR |
| 117 | HPIV2F_CT_9 | KLVSQIHQF |
| 118 | HPIV2F_CT_8 | KLVSQIHQ |
| 119 | HPIV2F_CT_7 | KLVSQIH |
| 120 | HPIV2F_CT_6 | KLVSQI |
| 121 | HPIV2F_CT_5 | KLVSQ |
| 122 | HPIV2F_CT_4 | KLVS |
| 123 | HPIV2F_CT_3 | KLV |
| 124 | HPIV2F_CT_2 | KL |
| 麻疹病毒 | ||
| 125 | MeaslesF_CT_33_FL | RGRCNKKGEQVGMSRPGLKPDLTGTSKSYVRSL |
| 126 | MeaslesF_CT_14 | RGRCNKKGEQVGMS |
| 127 | MeaslesF_CT_13 | RGRCNKKGEQVGM |
| 128 | MeaslesF_CT_12 | RGRCNKKGEQVG |
| 129 | MeaslesF_CT_11 | RGRCNKKGEQV |
| 130 | MeaslesF_CT_10 | RGRCNKKGEQ |
| 131 | MeaslesF_CT_9 | RGRCNKKGE |
| 132 | MeaslesF_CT_8 | RGRCNKKG |
| 133 | MeaslesF_CT_7 | RGRCNKK |
| 134 | MeaslesF_CT_6 | RGRCNK |
| 135 | MeaslesF_CT_5 | RGRCN |
| 136 | MeaslesF_CT_4 | RGRC |
| 138 | MeaslesF_CT_3 | RGR |
| 139 | MeaslesF_CT_2 | RG |
| 140 | MeaslesF_CT_1 | R |
| 新城疫病毒 | ||
| 141 | NDVF_CT_26_FL | KQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM |
| 142 | NDVF_CT_14 | KQKAQQKTLLWLGN |
| 143 | NDVF_CT_13 | KQKAQQKTLLWLG |
| 144 | NDVF_CT_12 | KQKAQQKTLLWL |
| 145 | NDVF_CT_11 | KQKAQQKTLLW |
| 146 | NDVF_CT_10 | KQKAQQKTLL |
| 147 | NDVF_CT_9 | KQKAQQKTL |
| 148 | NDVF_CT_8 | KQKAQQKT |
| 149 | NDVF_CT_7 | KQKAQQK |
| 150 | NDVF_CT_6 | KQKAQQ |
| 151 | NDVF_CT_5 | KQKAQ |
| 152 | NDVF_CT_4 | KQKA |
| 153 | NDVF_CT_3 | KQK |
| 154 | NDVF_CT_2 | KQ |
| 155 | NDVF_CT_1 | K |
| 仙台病毒 | ||
| 156 | SeVF_CT_42_FL | RLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR |
| 157 | SeVF_CT_14 | RLRRSMLMGNPDDR |
| 158 | SeVF_CT_13 | RLRRSMLMGNPDD |
| 159 | SeVF_CT_12 | RLRRSMLMGNPD |
| 160 | SeVF_CT_11 | RLRRSMLMGNP |
| 161 | SeVF_CT_10 | RLRRSMLMGN |
| 162 | SeVF_CT_9 | RLRRSMLMG |
| 163 | SeVF_CT_8 | RLRRSMLM |
| 164 | SeVF_CT_7 | RLRRSML |
| 165 | SeVF_CT_6 | RLRRSM |
| 166 | SeVF_CT_5 | RLRRS |
| 167 | SeVF_CT_4 | RLRR |
| 168 | SeVF_CT_3 | RLR |
| 169 | SeVF_CT_2 | RL |
| II. 其他病毒 | ||
| 170 | BaEVwt_CT | NRLTAFINDKLNIIHAMVLTQQYQVLRTDEEAQD |
| 171 | Cocal_CT | RYRYQGSNNKRIYNDIEMSRFRK |
| 172 | EboV-GP_CT | CKFVF |
| 173 | GaLV_CT | KLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL |
| 174 | GaLV-RLess_CT | KLVQFINDRISAVKIL |
| 175 | LCMV_GP_CT | THRHIKGGSCPKPHRLTNKGICSCGAFKVPGVKTVWKRR |
| 176 | MLV-A-RLess_CT | RLVQFVKDRISVVQAL |
| 177 | BaEVRLess_CT | NRLTAFINDKLNIIHA |
| 178 | MLV-A_CT | RLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP |
| 179 | VSV-G_CT | RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK |
| III. HIV | ||
| 180 | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1-LLP3-LLP2-gp41-CT-N_FL | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL |
| 181 | HIV-1_gp41_LLP1-LLP3-LLP2-gp41-CT-N | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE |
| 182 | HIV-1_gp41_LLP3-LLP2-gp41-CT-N | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVA |
| 183 | HIV-1_gp41_LLP2-gp41-CT-N | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELL |
| 184 | HIV-1_gp41_gp41-CT-N | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGS |
| 185 | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1-LLP3-LLP2 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL |
| 186 | HIV-1_gp41_LLP1-LLP3-LLP2 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE |
| 187 | HIV-1_gp41_LLP3-LLP2 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVA |
| 188 | HIV-1_gp41_LLP2 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELL |
| 189 | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1-LLP3 | WEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL |
| 190 | HIV-1_gp41_LLP1-LLP3 | WEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE |
| 191 | HIV-1_gp41_LLP3 | WEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVA |
| 192 | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1 | RVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL |
| 193 | HIV-1_gp41_LLP1 | RVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE |
| IV. 反轉錄病毒相關細胞蛋白 | ||
| 194 | CD29_CT | KLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK |
| 195 | CD29_CT | EKKRNTKLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK |
| 196 | CD63_CT_1至11 | AVEGGMKCVK |
| 197 | CD63_CT_73至81 | CGACKENYC |
| 198 | CD63_CT_225至238 | VEYGSRISKVLCC |
| 199 | CD63_CT_1至11 | EKKRNTAVEGGMKCVK |
| 200 | CD63_CT_73至81 | EKKRNTCGACKENYC |
| 201 | CD63_CT_225至238 | EKKRNTVEYGSRISKVLCC |
產生額外示例性嵌合F蛋白構築體，其中原生NiV-F細胞質尾附加有另一病毒之細胞質尾或其經截短細胞質尾。產生之一系列嵌合F蛋白含有來自另一副黏液病毒、另一種來自正核糖核酸病毒界之病毒或來自水疱性口炎病毒(VSV)之至少一部分細胞質尾或其經截短細胞質尾。各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域與SEQ ID NO:2所示相同。作為對照，產生含有全長細胞質尾(如SEQ ID NO:4所示)之NiV-F；對照NiV-F序列之完整序列包括信號肽如SEQ ID NO:1所示或對於不含信號肽之成熟序列如SEQ ID NO:1之胺基酸殘基27-546所示。
產生之NiV-F嵌合細胞質尾變異體列於表E4中。
| 表E4：NiV-F嵌合細胞質尾變異體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 細胞質尾序列 |
| 202 | VSV-G_CT | EKKRNTRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK |
| 203 | BaEVRLess_CT | EKKRNTNRLTAFINDKLNIIHA |
| 204 | Cocal_CT | EKKRNTRYRYQGSNNKRIYNDIEMSRFRK |
| 205 | EboV-GP_CT | EKKRNTCKFVF |
| 206 | GaLV_CT | EKKRNTKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL |
| 207 | GaLV-RLess_CT | EKKRNTKLVQFINDRISAVKIL |
| 208 | MLV-A_CT | EKKRNTRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP |
| 209 | MLV-A-RLess_CT | EKKRNTRLVQFVKDRISVVQAL |
產生示例性嵌合F蛋白構築體，其中進行一系列交換以用來自另一副黏液病毒之附著蛋白(亦即，G、H或HN蛋白)之細胞質尾或經截短細胞質尾置換原生NiV-F細胞質尾之附著模體。各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域與SEQ ID NO:2所示相同。
產生之NiV-F嵌合細胞質尾變異體列於表E5中。
2. NiV-F 胞外域
| 表E5：NiV-F嵌合細胞質尾變異體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 細胞質尾序列 |
| 210 | 尼帕_病毒 | KSDLLGENIKKM |
| 211 | 亨德拉_病毒 | KSDLLGDNIKKM |
| 212 | 麻疹_病毒 | RDIMLHERNIVIRSGM |
| 213 | 尼帕_病毒 | KSD |
| 214 | 麻疹_病毒 | RDI |
| 215 | 尼帕_病毒 | KSDLLG |
| 216 | 麻疹_病毒 | RDIMLH |
| 217 | 尼帕_病毒 | EKKRKSDLLGENIKKM |
| 218 | 麻疹_病毒 | EKKRRDIMLHERNIVIRSGM |
| 219 | 亨德拉_病毒 | EKKRNTKSDLLGDNIKKM |
| 220 | 麻疹_病毒 | EKKRNTRDIMLHERNIVIRSGM |
| 221 | 亨德拉_病毒 | EKKRNTYSRLKSDLLGDNIKKM |
| 222 | 麻疹_病毒 | EKKRNTYSRLRDIMLHERNIVIRSGM |
產生示例性經截短NiV-F蛋白構築體，該等構築體含有NiV-F之跨膜及細胞質尾以及突變之NiV-F胞外域。
a. 蛋白酶位點修飾
一般而言，尼帕F蛋白之胞外域受組織蛋白酶L裂解，產生活性形式(F1+F2)。產生示例性嵌合F蛋白構築體，其中此裂解位點NNTHDLVGDVR LAGV (SEQ ID NO:311)經修飾以包括弗林蛋白酶之識別位點，弗林蛋白酶為鈣依賴性絲胺酸內切蛋白酶，該內切蛋白酶在一些情況下與組織蛋白酶L相比可能有差異表現。
產生額外示例性嵌合F蛋白，其中進行一系列交換以用來自另一病毒之胞外域之蛋白酶位點置換原生NiV-F細胞質尾之蛋白酶位點。產生之一系列嵌合F蛋白含有來自另一副黏液病毒之蛋白酶位點或其經截短模體。
亦產生具有蛋白酶位點修飾之變異體NiV-F蛋白以含有SEQ ID NO:26所示之經截短細胞質尾，該細胞質尾缺乏SEQ ID NO:4所示之野生型原生NiV-F之全長細胞質尾之22個連續C端胺基酸。各產生之構築體之細胞質結構域及跨膜結構域與SEQ ID NO:328所示相同且如下：
SEQ ID 328：YVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT
產生之NiV-F嵌合蛋白酶位點變異體列於表E6中。
b. 信號序列修飾
| 表E6：NiV-F嵌合蛋白酶位點突變體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 全長序列 |
| I. 弗林蛋白酶修飾 | ||
| 224 | NNTHDSRRHKR/FAGV (SEQ ID NO: 313) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDSRRHKRFAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
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| 235 | QNTHDLVRHKR/FAGV | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVRHKRFAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
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| 238 | QNTHDLVRHRR/LAGV (SEQ ID NO: 327) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVRHRRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 239 | 亨德拉病毒 VGDV K(SEQ ID NO:329) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDV KLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 240 | 麻疹不可裂解控制位點 RNHNR (SEQ ID NO: 330) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLRNHNRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 241 | 麻疹/犬瘟熱病毒 RRHKR (SEQ ID NO:331) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLRRHKRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 242 | 新城疫病毒(強毒) RRQKR (SEQ ID NO: 332) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLRRQKRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 243 | 新城疫病毒(無毒) GRQGR (SEQ ID NO: 333) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLGRQGRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 244 | PIV2 TRQKR (SEQ ID NO: 334) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLTRQKRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 245 | PIV4 EIQSR (SEQ ID NO: 335) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLEIQSRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 246 | 仙台病毒 VPQSR (SEQ ID NO: 336) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVPQSRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 247 | PIV1 NPQSR (SEQ ID NO: 337) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLNPQSRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 248 | PIV3 PRTKR (SEQ ID NO: 338) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLPRTKRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
產生示例性變異體NiV-F蛋白構築體，其中信號序列經修飾以用另一病毒或蛋白質之異源信號序列置換原生NiV-F信號序列。產生之一系列變異體NiV-F蛋白含有來自不同副黏液病毒之信號序列，諸如亨德拉病毒、雪松病毒、人類副流感病毒2 (HPIV2)、麻疹病毒或仙台病毒；來自另一病毒之信號序列，諸如HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒、伊波拉病毒、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒；或人類蛋白質之信號序列。
亦產生具有異源信號序列之變異體NiV-F蛋白以含有SEQ ID NO:26所示之經截短細胞質尾，該細胞質尾缺乏SEQ ID NO:4所示之野生型原生NiV-F之全長細胞質尾之22個連續C端胺基酸。各產生之構築體之胞外域、細胞質結構域及跨膜結構域與SEQ ID NO: 303所示相同。
產生之NiV-F嵌合信號序列變異體列於表E7中。
3. NiV-F 跨膜結構域
| 表E7：NiV-F嵌合信號序列突變體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 全長序列 |
| I. 病毒信號序列 | ||
| 249 | HevF_信號_序列 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 250 | CevF_信號_序列 | MSNKRTTVLIIISYTLFYLNNAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 251 | HPIV2_信號_序列 | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 252 | MevF_信號_序列 | MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGQILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 253 | NDV-F_信號_序列 | MRSRSSTRIPVPLMLIIRIALTLSCIRLTSSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 254 | SevF_信號_序列 | MTAYIQRSQCISTSLLVVLTTLVSCQIILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 255 | HIV1-Env_信號_序列 | MRVKGIRKNYQHLWRWGIMLLGMLMICSAADILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 256 | BaEV_信號_序列 | MGFTTKIIFLYNLVLVYAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 257 | Cocal_信號_序列 | MNFLLLTFIVLPLCSHAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 258 | EboV_信號_序列 | MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 259 | GaLV_信號_序列 | MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 260 | MLV-A_信號_序列 | MARSTLSKPLKNKVNPRGPLIPLILLMLRGVSTASPILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 261 | VSVG_信號_序列 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 262 | 催乳素_信號_序列 | MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAPILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 263 | IgGk-L_信號_序列 | METPAQLLFLLLLWLPDTTGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 264 | 白蛋白_信號_序列 | MKWVTFISLLFLFSSAYSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 265 | CD5_信號_序列 | MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGRLILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 266 | 胰蛋白酶原_信號_序列 | MNPLLILTFVAAALAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 267 | IL2_信號_序列 | MYRMQLLSCIALSLALVTNSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
一般而言，尼帕F蛋白之跨膜可參與調控內吞運輸及裂解位點暴露於可用之組織蛋白酶-L蛋白酶。產生示例性變異體NiV-F蛋白構築體，其中跨膜結構域如下所示進行修飾。
產生示例性變異體NiV-F蛋白，其中進行一系列交換以用來自另一病毒之異源跨膜結構域置換原生NiV-F之跨膜結構域(對應於SEQ ID NO:1之胺基酸488-518)。在替代或額外策略中，產生具有經修飾跨膜結構域之變異體NiV-F蛋白，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:302所示之位置的編號。
產生之一系列變異體NiV F蛋白含有來自另一副黏液病毒，諸如亨尼帕病毒之跨膜結構域。亦產生具有異源或經修飾跨膜結構域之變異體NiV-F蛋白以含有SEQ ID NO:26所示之經截短細胞質尾，該細胞質尾缺乏SEQ ID NO:4所示之野生型原生NiV-F之全長細胞質尾之22個連續C端胺基酸。具體地，藉由用異源或經修飾跨膜結構域置換對應於SEQ ID NO:302之胺基酸殘基488-518之跨膜結構域來產生示例性變異體NiV-F。
產生之NiV-F嵌合跨膜結構域變異體列於表E8中。
4. 超融合修飾
| 表E8：NiV-F嵌合跨膜結構域突變體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 全長序列 |
| 268 | NivF_TM_S490A_dec_融合性 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLIAMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 269 | NivF_TM_Y498A_dec_融合性 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILAVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 270 | HevF_TM_FL | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRNT |
| 271 | NivF_TM_HevF_S504A | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 272 | NivF_TM_HevF_I516V | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFVIVEKKRNT |
一般而言，病毒F蛋白引導病毒及細胞膜之融合，從而將核衣殼(及/或其內容物)遞送至細胞質中。尼帕病毒之F蛋白為I類病毒融合蛋白，具有至少三種確定之結構狀態：融合前原生狀態、髮夾前中間狀態及融合後髮夾狀態。不希望受理論約束，據信F蛋白亦在病毒表面處與G蛋白相互作用，因此一旦G蛋白結合至其同源細胞受體，F蛋白即經歷構形變化。接著，F蛋白之髮夾形成允許疏水融合肽(SEQ ID NO: 1之胺基酸110-134)嵌入靶細胞膜中。此外，受感染細胞上之F蛋白表現亦促使合胞體形成，此係因為鄰近細胞可成為細胞融合之標靶。
產生示例性嵌合F蛋白，其中引入一系列超融合突變。產生之一系列嵌合F蛋白在細胞質尾或細胞外結構域中之任一者中含有超融合突變。
產生選定之示例性突變NiV-F蛋白，其中如上文所述之經截短NiV-F蛋白在NiV-F細胞質尾之融合模體周圍(見於參考SEQ ID NO:3所示之編號之位置1-10)進一步突變。各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域與SEQ ID NO:2所示相同。作為對照，產生含有全長細胞質尾(如SEQ ID NO:3所示)之NiV-F；對照NiV-F序列之完整序列如SEQ ID NO:1所示。
病毒F蛋白(包括尼帕F蛋白)之融合特性可由許多結構因素來調節，包括糖基化位點之位置。已知與六聚體穩定性有關之胺基酸突變亦可改變後續融合潛力，此係因為尼帕F蛋白之融合前構形已由X射線晶體學揭露為所謂的「計時器六聚體組裝(hexamer-of-timers assembly)」。產生進一步示例性突變之NiV-F蛋白，其中如上文所述之原生NiV-F蛋白或變異體NiV-F在N-糖基化位點(關於SEQ ID NO:1之胺基酸位置64、67、99及/或464)處或與F蛋白六聚體穩定性有關之位置(亦即，相較於SEQ ID NO:1之Q393L及/或R109L)處進行突變或進一步突變。
亦產生嵌合F蛋白，其中細胞質尾來源於另一種已知參與融合之副黏液病毒之F蛋白，該融合係在受感染靶細胞之質膜處或經由合胞體形成。具體地，示例性超融合亨德拉病毒細胞質尾經工程改造為具有超融合突變，使得各產生之構築體之細胞外結構域(胞外域)及跨膜結構域為相同的且如SEQ ID NO:2所示。
產生之NiV-F細胞質尾突變體列於表E9中。
5. 組合變異體
| 表E9：NiV-F融合突變體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱 | 序列(細胞質尾或全長) |
| 細胞質尾突變 | ||
| 53 | CT-06_K1A | EAKRNT |
| 54 | CT-02_YSRL_K1A | EAYSRL |
| 55 | CT-28_K1A (全長) | EAKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 56 | CT-10_K1A | EAKRNTYSRL |
| N-聚醣突變 | ||
| 273 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F3) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 274 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F5) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 275 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F4F5) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDQTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 276 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F2F4F5) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDQTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 278 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F2F3) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 279 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F2F5) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 280 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F3F5) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 290 | NivF_超融合_突變_N聚醣(F2F3F5) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 457 | F1F2_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPQVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 458 | F1F2F3_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIP QVS QMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYK QNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 459 | F1F2F3F5_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIP QVS QMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYK QNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSM QQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 460 | F1F3_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIP QVS NMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYK QNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSM NQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 461 | F1F2F5_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIP QVS QMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYK NNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSM QQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 462 | F1F3F5_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIP QVS NMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYK NNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSM QQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 463 | F1F5_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIP QVS NMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYK NNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSM QQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 464 | F2F3F5_CT06 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 六聚體穩定性突變 | ||
| 291 | NivF_超融合_突變_六聚體穩定性(R109L) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVLLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 292 | NivF_超融合_突變_六聚體穩定性(Q393L) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 293 | NivF_超融合_突變_六聚體穩定性(R109L_Q393L) | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVLLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 294 | NivF_超融合_突變_亨德拉F | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYIGT |
| 295 | NivF_超融合_突變_亨德拉F (HevF_CT-06) | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGN |
| 296 | NivF_超融合_突變_亨德拉F (HevF_CT-10) | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGNYSRL |
| 281 | HevF488NivF_全長 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT |
| 282 | HevF488NivF_CT-06 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGN |
| 283 | HevF488NivF_CT-10 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRL |
進一步示例性NiV-F蛋白構築體作為上文所述之各種修飾策略之組合而產生。在此，將個別NiV-F變異體之修飾與NiV-F蛋白內不同基因座之其他修飾組合。舉例而言，產生個別NiV-F細胞質尾變異體以如上文所述在胞外域中亦具有信號序列修飾。在另一個實例中，產生個別NiV-F細胞質尾變異體以如上文所述經截短且在胞外域或跨膜結構域中之任一者中亦具有修飾。在一些態樣中，將修飾或截短組合可對所得假型粒子效價產生累加效應。
另外，產生含有來自另一病毒之細胞質尾或經截短細胞質尾(如實例A.1.C中所述)之示例性嵌合F蛋白構築體，以進一步含有上文所述(包括章節II. F.中)之各種其他修飾策略之組合。此處，將個別嵌合F蛋白構築體之修飾與F蛋白內不同基因座之其他修飾組合。舉例而言，產生個別嵌合F細胞質尾變異體以如上文所述在胞外域中亦具有信號序列修飾。在另一個實例中，產生個別嵌合F變異體以如上文所述經截短且在胞外域或跨膜結構域中之任一者中亦具有修飾。在一些態樣中，將修飾或截短組合可對所得假型粒子效價產生累加效應。
示例性產生之組合變異體列於下表E10中。
实例 2 使用重新靶向之 NiV-G 產生 NiV-F 假型慢病毒載體
| 表E10：組合變異體 | ||
| SEQ ID NO | 名稱/描述 | 全長序列 |
| 58 | F3F5_Q393L_CT-06_K1A | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEAKRNT |
| 57 | F3F5_Q393L_CT-10_K1A | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEAKRNTYSRL |
| 297 | VSVG_信號_序列_MeaslesF_CT_3 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVRGR |
| 298 | IL2_信號_序列_MeaslesF_CT_3 | MYRMQLLSCIALSLALVTNSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVRGR |
| 299 | F3F5_VSVG_信號_序列_MeaslesF_CT_3 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 300 | F3F5_HevF488NivF_CT-06 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 367 | F5_Q393L | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 368 | F5_Q393L_VGDVK | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 369 | F5_VGDVK | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 370 | Q393L_VGDVK | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 371 | F5_Q393L_HPIV2_信號_序列 | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 372 | F5_Q393L_VSVG_信號_序列 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 373 | F5_Q393L_NDVF_CT_6 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 374 | F5_Q393L_HeVF_CT_6 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRGN |
| 375 | F5_Q393L_NDVF_CT_6 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 376 | F5_Q393L_VGDVK_HeVF_CT_6 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRGN |
| 377 | F5_NDVF_CT_6 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 378 | Q393L_NDVF_CT_6 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 423 | HPIV2_信號_序列_CT_6_Q393L | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 424 | VSVG_信號_序列_CT_6_Q393L | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 425 | VGDVK (HeV)_HPIV2_信號_序列_CT_6_Q393L | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 426 | VGDVK (HeV)_VSVG_信號_序列_CT_6_Q393L | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT |
| 427 | NDVF_CT_6_Q393L | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 428 | VGDVK (HeV)_NDVF_CT_6_Q393L | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 429 | HPIV2_信號_序列-NDVF_CT_6_Q393L | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 430 | VSVG_信號_序列_NDVF_CT_6_Q393L | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 431 | VGDVK (HeV)_HPIV2_信號_序列_NDVF_CT_6_Q393L | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
| 432 | VGDVK (HeV)_VSVG_信號_序列_NDVF_CT_6_Q393L | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ |
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上文所述之變異體NiV-F構築體與重新靶向之NiV-G構築體一起用於假型慢病毒粒子，該重新靶向之NiV-G構築體經格式化為含有針對細胞表面蛋白之結合序列(例如，針對CD8之scFv)之重新靶向融合原。對示例性結合序列進行密碼子最佳化，接著次選殖至pCAGGS載體中，用於將結合模態融合至NiV-G序列(SEQ ID NO 301)之C端。
次選殖後，將重新靶向之NiV-G蛋白構築體與以下物質一起轉染至Lenti-X 293 (HEK 293)細胞中：含有編碼上文實例1中所述之示例性變異體NiV-F序列之一的核苷酸序列之載體，用於含有空骨架、HIV-1 pol、HIV-1 gag、HIV-1 Rev、HIV-1 Tat、AmpR啟動子及SV40啟動子之載體生產之包裝質體，及含有在SFFV啟動子pLenti-SFFV-eGFP控制下之增強型綠色螢光蛋白(eGFP)之慢病毒載體。
將黏附性Lenti-X 293細胞以約0.8 x 10
5個細胞/mL之密度接種至含有0.5 mL生長培養基之24孔板中。鋪板後18-24小時，使用聚乙烯亞胺(PET) TransIT®-293轉染試劑(Mirus Bio, Madison, WI USA)根據製造商方案轉染細胞。簡言之，藉由將3:1比率之TransIT®-293轉染試劑:經純化質體DNA混合且在室溫下培育來製備轉染試劑/DNA複合物。使用ViaFlo設備(Integra, Konstanz, Germany)將轉染試劑/DNA複合物在單個轉移步驟中等分至接種之Lenti-X293細胞中。轉染後24-72小時，收集粗慢病毒。
藉由流式細胞術監測GFP表現來評估產生之假型慢病毒製劑對受體靶細胞之轉導效率。將轉導效率與如上文所述假型化但具有編碼NiVF Δ22 (SEQ ID NO:302；Bender等人2016 PLoS Pathol 12(6):e1005641)之NiV-F序列之參考慢病毒進行比較。
將各自用變異體NiV-F構築體及針對CD8之重新靶向之NiV-G之一假型化的粗NiV-G慢病毒(LV)製劑藉由單點稀釋轉導至受體SupT1細胞(ATCC編號CRL-1942；對CD4及CD8兩者呈陽性之人類T細胞淋巴母細胞株，CD4+CD8+)中，繼而藉由流式細胞術分析經轉導之細胞的GFP表現。由GFP陽性(GFP+)細胞%確定特定效價。在一些情況下，對多點稀釋進行效價測定，且在對照條件下對顯示約20-30% GFP+細胞之彼等進行流式細胞術。
在用代表性變異體NiV-F細胞質尾構築體假型化之LV轉導受體細胞後，示例性結果描述於下
表 E11(細胞質尾修飾，0.02 LV稀釋度)及
表 E12(細胞外或跨膜結構域修飾，0.2 LV稀釋度)中。如所示，觀測到與用重新靶向之對照NiV-G構築體假型化之慢病毒相比，如由GFP+細胞所確定，許多含有經修飾細胞質尾之示例性變異體NiV-F構築體引起效價增加。
| 表E11：細胞質尾修飾 | ||
| SEQ ID NO | 平均% GFP陽性細胞(0.02 LV稀釋度) | 標準偏差 |
| SEQ ID NO 27 | 35.35938 | 4.211251 |
| 超融合突變 | ||
| SEQ ID NO 32 | 20.75 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 33 | 16.5 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 34 | 0.7 | 0 |
| SEQ ID NO 53 | 10.05 | 3.416138 |
| SEQ ID NO 54 | 0.275 | 0.095743 |
| SEQ ID NO 55 | 0.5 | 0.216025 |
| SEQ ID NO 56 | 0.5 | 0.141421 |
| NiV-F截短 | ||
| SEQ ID NO 4 | 0.575 | 0.492443 |
| SEQ ID NO 5 | 1.2 | 0 |
| SEQ ID NO 6 | 1.2 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 7 | 0.35 | 0.129099 |
| SEQ ID NO 8 | 3.05 | 0.777817 |
| SEQ ID NO 10 | 2.1 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 11 | 2.5 | 0.565685 |
| SEQ ID NO 12 | 1.2 | 0.469042 |
| SEQ ID NO 13 | 2.35 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 14 | 2.65 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 15 | 2.2 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 16 | 2.4 | 0 |
| SEQ ID NO 17 | 2.8 | 2.124461 |
| SEQ ID NO 18 | 1.85 | 1.609348 |
| SEQ ID NO 19 | 2.325 | 1.8246 |
| SEQ ID NO 20 | 2.55 | 1.443376 |
| SEQ ID NO 21 | 2.075 | 1.466004 |
| SEQ ID NO 22 | 0.625 | 0.189297 |
| SEQ ID NO 23 | 25.15 | 3.960219 |
| SEQ ID NO 24 | 24 | 5.238957 |
| SEQ ID NO 25 | 9.875 | 3.637192 |
| SEQ ID NO 26 | 22.775 | 8.461826 |
| SEQ ID NO 28 | 8.925 | 1.86257 |
| SEQ ID NO 29 | 3.65 | 2.456963 |
| SEQ ID NO 30 | 16 | 5.621981 |
| SEQ ID NO 31 | 21.7 | 2.105548 |
| SEQ ID NO 32 | 20.75 | 0.353553 |
| HeV-F截短 | ||
| SEQ ID NO 58 | 0.9 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 59 | n/a | n/a |
| SEQ ID NO 60 | n/a | n/a |
| SEQ ID NO 61 | 0.45 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 62 | 3.15 | 1.343503 |
| SEQ ID NO 63 | 1.55 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 64 | 0.3 | 0 |
| SEQ ID NO 65 | 0.75 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 66 | 0.85 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 67 | 0.8 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 68 | 0.1 | 0 |
| SEQ ID NO 69 | 1.15 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 74 | 3.5 | 3.236253 |
| SEQ ID NO 75 | 1.125 | 0.403113 |
| SEQ ID NO 76 | 0.525 | 0.170783 |
| SEQ ID NO 77 | 26.35 | 7.808756 |
| SEQ ID NO 78 | 27.45 | 7.105632 |
| SEQ ID NO 79 | 10.7 | 4.75114 |
| SEQ ID NO 80 | 30.475 | 5.416872 |
| SEQ ID NO 81 | 19.6 | 6.925797 |
| MeV-F截短 | ||
| SEQ ID NO 125 | 9.7 | 0.424264 |
| SEQ ID NO 126 | 57.425 | 9.033041 |
| SEQ ID NO 127 | 58.525 | 7.647821 |
| SEQ ID NO 128 | 58.525 | 7.431633 |
| SEQ ID NO 129 | 61.425 | 8.137721 |
| SEQ ID NO 130 | 59.7 | 9.007404 |
| SEQ ID NO 131 | 56.5 | 7.107273 |
| SEQ ID NO 132 | 51.5 | 9.920685 |
| SEQ ID NO 133 | 47.525 | 11.20844 |
| SEQ ID NO 134 | 26.175 | 7.205727 |
| SEQ ID NO 135 | 9.2 | 4.33359 |
| SEQ ID NO 136 | 6.35 | 2.441994 |
| SEQ ID NO 138 | 17.15 | 1.343503 |
| SEQ ID NO 139 | 18.8 | 2.828427 |
| SEQ ID NO 140 | 17.65 | 2.616295 |
| CeV-F截短 | ||
| SEQ ID NO 96 | 0.65 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 97 | 0.375 | 0.275379 |
| SEQ ID NO 98 | 1.75 | 1.744515 |
| SEQ ID NO 99 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 100 | 1.925 | 1.906786 |
| SEQ ID NO 101 | 1.5 | 1.462874 |
| SEQ ID NO 102 | 0.55 | 0.369685 |
| SEQ ID NO 103 | 4.35 | 2.564501 |
| SEQ ID NO 104 | 5.5 | 2.586503 |
| SEQ ID NO 105 | 1.425 | 1.364734 |
| SEQ ID NO 106 | 12.7 | 7.748118 |
| SEQ ID NO 107 | 16 | 6.837641 |
| SEQ ID NO 108 | 28.95 | 4.030509 |
| SEQ ID NO 109 | 40.65 | 3.040559 |
| SEQ ID NO 110 | 31.65 | 4.879037 |
| NDV-F截短 | ||
| SEQ ID NO 141 | 0.15 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 142 | 3.525 | 2.183842 |
| SEQ ID NO 143 | 0.6 | 0.355903 |
| SEQ ID NO 144 | 1.8 | 1.134313 |
| SEQ ID NO 145 | 2.225 | 1.034005 |
| SEQ ID NO 146 | 10 | 3.580503 |
| SEQ ID NO 147 | 59.675 | 6.053856 |
| SEQ ID NO 148 | 62.2 | 6.678822 |
| SEQ ID NO 149 | 63.05 | 9.081299 |
| SEQ ID NO 150 | 64.2 | 9.49807 |
| SEQ ID NO 151 | 50.25 | 10.21943 |
| SEQ ID NO 152 | 11.475 | 2.027108 |
| SEQ ID NO 153 | 12.95 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 154 | 21.1 | 1.272792 |
| SEQ ID NO 155 | 16.55 | 4.737615 |
| HPIV-2-F截短 | ||
| SEQ ID NO 111 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 112 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 113 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 114 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 115 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 116 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 117 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 118 | 0.55 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 119 | 0.5 | 0 |
| SEQ ID NO 120 | 0.2 | 0 |
| SEQ ID NO 121 | 2.25 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 122 | 2.05 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 123 | 10.15 | 1.202082 |
| SEQ ID NO 124 | 11.15 | 2.616295 |
| 仙台-F截短 | ||
| SEQ ID NO 156 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 157 | 13.9 | 0.848528 |
| SEQ ID NO 158 | 9.25 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 159 | 5.9 | 0.565685 |
| SEQ ID NO 160 | 2.75 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 161 | 3.8 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 162 | 2.85 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 163 | 3.75 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 164 | 9.75 | 3.606245 |
| SEQ ID NO 165 | 11.15 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 166 | 12.65 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 167 | 5.15 | 1.767767 |
| SEQ ID NO 168 | 3.6 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 169 | 6.7 | 0.707107 |
| 蝙蝠PV-F截短 | ||
| SEQ ID NO 82 | 1.9 | 0 |
| SEQ ID NO 83 | 5.2 | 2.404163 |
| SEQ ID NO 84 | 1.7 | 0 |
| SEQ ID NO 85 | 3.65 | 0.636396 |
| SEQ ID NO 86 | 2.85 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 87 | 0.95 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 88 | 2.1 | 0 |
| SEQ ID NO 89 | 10.05 | 4.313351 |
| SEQ ID NO 90 | 16.35 | 2.757716 |
| SEQ ID NO 91 | 7 | 0.424264 |
| SEQ ID NO 92 | 28.05 | 9.828784 |
| SEQ ID NO 93 | 7.65 | 1.06066 |
| SEQ ID NO 94 | 6.3 | 1.272792 |
| SEQ ID NO 95 | 11.35 | 1.626346 |
| 副黏液病毒附著蛋白 | ||
| SEQ ID NO 210 | 64.5 | 15.69777 |
| SEQ ID NO 211 | 49.85 | 6.29325 |
| SEQ ID NO 212 | 0.65 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 213 | 21.6 | 3.676955 |
| SEQ ID NO 214 | 13.7 | 2.969848 |
| SEQ ID NO 215 | 9.4 | 0.707107 |
| SEQ ID NO 216 | 0.35 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 217 | 20.65 | 2.192031 |
| SEQ ID NO 218 | 12.4 | 0 |
| SEQ ID NO 219 | 9.15 | 2.05061 |
| SEQ ID NO 220 | 2.8 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 221 | 1.3 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 222 | 0 | 0 |
| 病毒醣蛋白CT交換 | ||
| SEQ ID NO 170 | 0.35 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 171 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 172 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 173 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 174 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 175 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 176 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 177 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 178 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 179 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 202 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 203 | 20.45 | 1.06066 |
| SEQ ID NO 204 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 205 | 1.4 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 206 | 0.05 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 207 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 208 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 209 | 0.75 | 0.070711 |
| 反轉錄病毒相關蛋白CT交換 | ||
| SEQ ID NO 194 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 195 | 0.05 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 196 | 0.95 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 197 | 7.45 | 0.636396 |
| SEQ ID NO 198 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 199 | 15 | 1.272792 |
| SEQ ID NO 200 | 28.4 | 3.818377 |
| SEQ ID NO 201 | 21.1 | 4.666905 |
| HIV-1 gp41 CT結構域 | ||
| SEQ ID NO 180 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 185 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 186 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 187 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 188 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 189 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 190 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 191 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 192 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 193 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 286 | 0.25 | 0.070711 |
| 內吞(YSRL)變異體 | ||
| SEQ ID NO 35 | 7.225 | 2.045116 |
| SEQ ID NO 36 | 5.675 | 3.540598 |
| SEQ ID NO 37 | 5.95 | 2.29855 |
| SEQ ID NO 38 | 45.5 | 14.20868 |
| SEQ ID NO 39 | 5.175 | 1.687947 |
| SEQ ID NO 40 | 10.225 | 6.693965 |
| SEQ ID NO 41 | 23.5 | 7.544093 |
| SEQ ID NO 42 | 18.525 | 5.309347 |
| SEQ ID NO 43 | 13.725 | 5.145467 |
| SEQ ID NO 44 | 5.225 | 0.960469 |
| SEQ ID NO 45 | 6.85 | 1.953629 |
| SEQ ID NO 46 | 7.35 | 1.652271 |
| SEQ ID NO 48 | 31.675 | 12.16535 |
| SEQ ID NO 49 | 3.225 | 2.311385 |
| SEQ ID NO 50 | 18.25 | 6.324819 |
| SEQ ID NO 47 | 15.05 | 1.909188 |
| SEQ ID NO 51 | 17.6 | 1.414214 |
| 表E12：細胞外或跨膜結構域修飾 | ||
| SEQ ID NO | 平均% GFP陽性細胞(0.02 LV稀釋度) | 標準偏差 |
| SEQ ID NO 27 | 35.35938 | 4.211251 |
| N-聚醣突變體 | ||
| SEQ ID NO 273 | 33.875 | 8.974919 |
| SEQ ID NO 274 | 49.35 | 5.303301 |
| SEQ ID NO 275 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 276 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 278 | 16.375 | 10.42221 |
| SEQ ID NO 279 | 34 | 9.701546 |
| SEQ ID NO 280 | 8.05 | 2.369951 |
| SEQ ID NO 290 | 1.35 | 0.602771 |
| 六聚體穩定突變體 | ||
| SEQ ID NO 291 | 9.4 | 3.073543 |
| SEQ ID NO 292 | 33.6 | 10.27975 |
| SEQ ID NO 293 | 13.05 | 10.91253 |
| 亨德拉F交換 | ||
| SEQ ID NO 294 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 295 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 296 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 281 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 282 | 0.05 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 283 | 0 | 0 |
| 蛋白酶位點突變 | ||
| SEQ ID NO 224 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 225 | 26.45 | 1.626346 |
| SEQ ID NO 226 | 13.95 | 1.202082 |
| SEQ ID NO 227 | 16.1 | 1.979899 |
| SEQ ID NO 228 | 17.7 | 0.424264 |
| SEQ ID NO 229 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 230 | 1.15 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 231 | 0.6 | 0 |
| SEQ ID NO 232 | 0.7 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 233 | 0.5 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 234 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 235 | 3.3 | 1.697056 |
| SEQ ID NO 236 | 1.25 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 237 | 1.6 | 0.565685 |
| SEQ ID NO 238 | 1.1 | 0 |
| SEQ ID NO 239 | 52.4 | 13.85929 |
| SEQ ID NO 240 | 4.3 | 0.848528 |
| SEQ ID NO 241 | 0.4 | 0.282843 |
| SEQ ID NO 242 | 3.95 | 0.919239 |
| SEQ ID NO 243 | 0.2 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 244 | 5.15 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 245 | 1.25 | 0.353553 |
| SEQ ID NO 246 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 247 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 248 | 0.25 | 0.070711 |
| 信號序列突變體 | ||
| SEQ ID NO 249 | 36.4 | 7.353911 |
| SEQ ID NO 250 | 30.15 | 3.181981 |
| SEQ ID NO 251 | 25.3 | 5.798276 |
| SEQ ID NO252 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 253 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 254 | 0.1 | 0 |
| SEQ ID NO 255 | 4.05 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 256 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 257 | 8.95 | 0.212132 |
| SEQ ID NO 258 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 259 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 260 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 261 | 40.05 | 8.555992 |
| SEQ ID NO 262 | 32.2 | 6.646804 |
| SEQ ID NO 263 | 21.8 | 4.384062 |
| SEQ ID NO 264 | 31.3 | 1.838478 |
| SEQ ID NO 265 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 266 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 267 | 21.95 | 3.040559 |
| 跨膜結構域突變體 | ||
| SEQ ID NO 268 | 0.7 | 0.141421 |
| SEQ ID NO 269 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 270 | 36.95 | 5.020458 |
| SEQ ID NO 271 | 29.5 | 9.899495 |
| SEQ ID NO 272 | 30.55 | 3.040559 |
| 組合變異體 | ||
| SEQ ID NO 56 | 0.05 | 0.070711 |
| SEQ ID NO 57 | 0 | 0 |
| SEQ ID NO 297 | 12.7 | 3.394113 |
| SEQ ID NO 298 | 5.4 | 0.707107 |
| SEQ ID NO 299 | 8.5 | 1.414214 |
| SEQ ID NO 300 | 0.05 | 0.070711 |
舉例而言，與人類T細胞上含有NiV-F經截短尾之示例性構築體相比，用含有來源於另一副黏液病毒(諸如麻疹)之示例性經截短細胞質尾之嵌合NiV-F構築體假型化之慢病毒轉導之細胞使得對NiV-CD8
scFv親和結合子之效價增加(
圖 2)。因此，結果指示一些細胞質尾修飾可更普遍地增加效價，而其他修飾可為結合子/融合原特異性的。
總之，結果證明用某些變異體NiV-F構築體假型化之慢病毒製劑增加受體細胞中之效價。
與對照NiV-F相比效價提高之經修飾NiV-F細胞質尾構築體列於
表 E13中。
表 E13 ：提高效價之代表性 NiV-F 構築體
| 名稱/ 描述 | SEQ ID NO NiV-G 構築體 |
| NivF_CT-5 | 306 |
| MeaslesF_CT_7 | 307 |
| NDVF_CT_9 | 308 |
| NDVF_CT_6 | 309 |
| HeVF_CT_6 | 310 |
| 尼帕_病毒 | 210 |
| NivF_超融合_突變_N聚醣(F5) | 274 |
| NivF_超融合_突變_六聚體穩定性(Q393L) | 292 |
| NivF_蛋白酶_位點_修飾_其他副黏液病毒 | 239 |
| HPIV2_信號_序列 | 251 |
| VSVG_信號_序列 | 261 |
| F5_VGDVK | 369 |
| F5_Q393L_VSVG_信號_序列 | 372 |
本發明之範疇不欲限於特定揭示之實施例，提供該等實施例以例如說明本發明之各個態樣。所述組合物及方法之各種修改自本文中之描述及教義將變得顯而易見。此類變化可在不脫離本揭示案之真正範疇及精神之情況下實施且意欲處於本揭示案之範疇內。
VIII. 序列
| SEQ ID NO | 序列 | 描述 |
| 1 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | 含信號序列之Uniprot Q9IH63 |
| 2 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIV | NiV-F骨架ΔCT |
| 3 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVG | 信號肽 |
| 4 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | NivF_CT-28 (全長) |
| 5 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIG | NivF_CT-27 |
| 6 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYI | NivF_CT-26 |
| 7 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYY | NivF_CT-25 |
| 8 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLY | NivF_CT-24 |
| 9 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDL | NivF_CT-23 |
| 10 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGD | NivF_CT-22 |
| 11 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSSG | NivF_CT-21 |
| 12 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTSS | NivF_CT-20 |
| 13 | EKKRNTYSRLEDRRVRPTS | NivF_CT-19 |
| 14 | EKKRNTYSRLEDRRVRPT | NivF_CT-18 |
| 15 | EKKRNTYSRLEDRRVRP | NivF_CT-17 |
| 16 | EKKRNTYSRLEDRRVR | NivF_CT-16 |
| 17 | EKKRNTYSRLEDRRV | NivF_CT-15 |
| 18 | EKKRNTYSRLEDRR | NivF_CT-14 |
| 19 | EKKRNTYSRLEDR | NivF_CT-13 |
| 20 | EKKRNTYSRLED | NivF_CT-12 |
| 21 | EKKRNTYSRLE | NivF_CT-11 |
| 22 | EKKRNTYSRL | NivF_CT-10 |
| 23 | EKKRNTYSR | NivF_CT-9 |
| 24 | EKKRNTYS | NivF_CT-8 |
| 25 | EKKRNTY | NivF_CT-7 |
| 26 | EKKRNT | NivF_CT-06 |
| 27 | EKKRN | NivF_CT-5 |
| 28 | EKKR | NivF_CT-4 |
| 29 | EKK | NivF_CT-3 |
| 30 | EK | NivF_CT-2 |
| 31 | E | NivF_CT-1 |
| 32 | EYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | YSRL |
| 33 | EKKRNTEDRRVRPTSSGDLYYIGT | YSRL |
| 34 | EKKRNTYSRLRVRPTSSGDLYYIGT | YSRL |
| 35 | EKYSRL | YSRL |
| 36 | EKKYSRL | YSRL |
| 37 | EKKRNTDTYRYI | NIvF_CT-6_AU1 |
| 38 | EKKRNTYPYDVPDYA | NIvF_CT-6_HA |
| 39 | EKDKQTLL | DKQTLL |
| 40 | EDKQTLL | DKQTLL |
| 41 | EKKRNTDKQTLL | DKQTLL |
| 42 | EKKRNTDKQTLLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | DKQTLL |
| 43 | EKNPVY | NPVY |
| 44 | EKFDNPVY | FDNPVY |
| 45 | EKKRNTNPVY | NPVY |
| 46 | EKKRNTFDNPVY | FDNPVY |
| 47 | EKKRNTNPVYEDRRVRPTSSGDLYYIGT | NPVY |
| 48 | EKKRNTFDNPVYEDRRVRPTSSGDLYYIGT | FDNPVY |
| 49 | EKYFIPIN | YFIPIN |
| 50 | EKKRNTYFIPIN | YFIPIN |
| 51 | EKKRNTYFIPINEDRRVRPTSSGDLYYIGT | YFIPIN |
| 52 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYIGT | HeVF_CT_28_FL |
| 53 | EAKRNT | CT-06_K1A |
| 54 | EAYSRL | CT-02_YSRL_K1A |
| 55 | EAKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | CT-28_K1A |
| 56 | EAKRNTYSRL | CT-10_K1A |
| 57 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEAKRNTYSRL | F3F5_Q393L_CT-10_K1A |
| 58 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEAKRNT | F3F5_Q393L_CT-06_K1A |
| 59 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYIG | HeVF_CT_27 |
| 60 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYI | HeVF_CT_26 |
| 61 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYY | HeVF_CT_25 |
| 62 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLY | HeVF_CT_24 |
| 63 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDL | HeVF_CT_23 |
| 64 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGD | HeVF_CT_22 |
| 65 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSNG | HeVF_CT_21 |
| 66 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVSN | HeVF_CT_20 |
| 67 | EKKRGNYSRLDDRQVRPVS | HeVF_CT_19 |
| 68 | EKKRGNYSRLDDRQVRPV | HeVF_CT_18 |
| 69 | EKKRGNYSRLDDRQVRP | HeVF_CT_17 |
| 70 | EKKRGNYSRLDDRQVR | HeVF_CT_16 |
| 71 | EKKRGNYSRLDDRQV | HeVF_CT_15 |
| 72 | EKKRGNYSRLDDRQ | HeVF_CT_14 |
| 73 | EKKRGNYSRLDDR | HeVF_CT_13 |
| 74 | EKKRGNYSRLDD | HeVF_CT_12 |
| 75 | EKKRGNYSRLD | HeVF_CT_11 |
| 76 | EKKRGNYSRL | HeVF_CT_10 |
| 77 | EKKRGNYSR | HeVF_CT_9 |
| 78 | EKKRGNYS | HeVF_CT_8 |
| 79 | EKKRGNY | HeVF_CT_7 |
| 80 | EKKRGN | HeVF_CT_6 |
| 81 | EKKRG | HeVF_CT_5 |
| 82 | RRYNKYTPLINSDPSSRRSTIQDVYIIPNPGEHSIRSAARSIDRDRD | BatPVF_CT_47_FL |
| 83 | RRYNKYTPLINSDP | BatPVF_CT_14 |
| 84 | RRYNKYTPLINSD | BatPVF_CT_13 |
| 85 | RRYNKYTPLINS | BatPVF_CT_12 |
| 86 | RRYNKYTPLIN | BatPVF_CT_11 |
| 87 | RRYNKYTPLI | BatPVF_CT_10 |
| 88 | RRYNKYTPL | BatPVF_CT_9 |
| 89 | RRYNKYTP | BatPVF_CT_8 |
| 90 | RRYNKYT | BatPVF_CT_7 |
| 91 | RRYNKY | BatPVF_CT_6 |
| 92 | RRYNK | BatPVF_CT_5 |
| 93 | RRYN | BatPVF_CT_4 |
| 94 | RRY | BatPVF_CT_3 |
| 95 | RR | BatPVF_CT_2 |
| 96 | DDPDYYNDYKRERINGKASKSNNIYYVGD | CeVF_CT_29_FL |
| 97 | DDPDYYNDYKRERI | CeVF_CT_14 |
| 98 | DDPDYYNDYKRER | CeVF_CT_13 |
| 99 | DDPDYYNDYKRE | CeVF_CT_12 |
| 100 | DDPDYYNDYKR | CeVF_CT_11 |
| 101 | DDPDYYNDYK | CeVF_CT_10 |
| 102 | DDPDYYNDY | CeVF_CT_9 |
| 103 | DDPDYYND | CeVF_CT_8 |
| 104 | DDPDYYN | CeVF_CT_7 |
| 105 | DDPDYY | CeVF_CT_6 |
| 106 | DDPDY | CeVF_CT_5 |
| 107 | DDPD | CeVF_CT_4 |
| 108 | DDP | CeVF_CT_3 |
| 109 | DD | CeVF_CT_2 |
| 110 | D | CeVF_CT_1 |
| 111 | KLVSQIHQFRSLAATTMFHRENPAFFSKNNHGNIYGIS | HPIV2F_CT_38_FL |
| 112 | KLVSQIHQFRSLAA | HPIV2F_CT_14 |
| 113 | KLVSQIHQFRSLA | HPIV2F_CT_13 |
| 114 | KLVSQIHQFRSL | HPIV2F_CT_12 |
| 115 | KLVSQIHQFRS | HPIV2F_CT_11 |
| 116 | KLVSQIHQFR | HPIV2F_CT_10 |
| 117 | KLVSQIHQF | HPIV2F_CT_9 |
| 118 | KLVSQIHQ | HPIV2F_CT_8 |
| 119 | KLVSQIH | HPIV2F_CT_7 |
| 120 | KLVSQI | HPIV2F_CT_6 |
| 121 | KLVSQ | HPIV2F_CT_5 |
| 122 | KLVS | HPIV2F_CT_4 |
| 123 | KLV | HPIV2F_CT_3 |
| 124 | KL | HPIV2F_CT_2 |
| 125 | RGRCNKKGEQVGMSRPGLKPDLTGTSKSYVRSL | MeaslesF_CT_33_FL |
| 126 | RGRCNKKGEQVGMS | MeaslesF_CT_14 |
| 127 | RGRCNKKGEQVGM | MeaslesF_CT_13 |
| 128 | RGRCNKKGEQVG | MeaslesF_CT_12 |
| 129 | RGRCNKKGEQV | MeaslesF_CT_11 |
| 130 | RGRCNKKGEQ | MeaslesF_CT_10 |
| 131 | RGRCNKKGE | MeaslesF_CT_9 |
| 132 | RGRCNKKG | MeaslesF_CT_8 |
| 133 | RGRCNKK | MeaslesF_CT_7 |
| 134 | RGRCNK | MeaslesF_CT_6 |
| 135 | RGRCN | MeaslesF_CT_5 |
| 136 | RGRC | MeaslesF_CT_4 |
| 137 | MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGQIHWGNLSKIGVVGIGSASYKVMTRSSHQSLVIKLMPNITLLNNCTRVEIAEYRRLLRTVLEPIRDALNAMTQNIRPVQSVASSRRHKRFAGVVLAGAALGVATAAQITAGIALHQSMLNSQAIDNLRASLETTNQAIEAIRQAGQEMILAVQGVQDYINNELIPSMNQLSCDLIGQKLGLKLLRYYTEILSLFGPSLRDPISAEISIQALSYALGGDINKVLEKLGYSGGDLLGILESRGIKARITHVDTESYFIVLSIAYPTLSEIKGVIVHRLEGVSYNIGSQEWYTTVPKYVATQGYLISNFDESSCTFMPEGTVCSQNALYPMSPLLQECLRGSTKSCARTLVSGSFGNRFILSQGNLIANCASILCKCYTTGTIINQDPDKILTYIAADHCPVVEVNGVTIQVGSRRYPDAVYLHRIDLGPPISLERLDVGTNLGNAIAKLEDAKELLESSDQILRSMKGLSSTSIVYILIAVCLGGLIGIPALICCCRGRCNKKGEQVGMSRPGLKPDLTGTSKSYVRSL | 完整MV-F |
| 138 | RGR | MeaslesF_CT_3 |
| 139 | RG | MeaslesF_CT_2 |
| 140 | R | MeaslesF_CT_1 |
| 141 | KQKAQQKTLLWLGNNTLDQMRATTKM | NDVF_CT_26_FL |
| 142 | KQKAQQKTLLWLGN | NDVF_CT_14 |
| 143 | KQKAQQKTLLWLG | NDVF_CT_13 |
| 144 | KQKAQQKTLLWL | NDVF_CT_12 |
| 145 | KQKAQQKTLLW | NDVF_CT_11 |
| 146 | KQKAQQKTLL | NDVF_CT_10 |
| 147 | KQKAQQKTL | NDVF_CT_9 |
| 148 | KQKAQQKT | NDVF_CT_8 |
| 149 | KQKAQQK | NDVF_CT_7 |
| 150 | KQKAQQ | NDVF_CT_6 |
| 151 | KQKAQ | NDVF_CT_5 |
| 152 | KQKA | NDVF_CT_4 |
| 153 | KQK | NDVF_CT_3 |
| 154 | KQ | NDVF_CT_2 |
| 155 | K | NDVF_CT_1 |
| 156 | RLRRSMLMGNPDDRIPRDTYTLEPKIRHMYTNGGFDAMAEKR | SeVF_CT_42_FL |
| 157 | RLRRSMLMGNPDDR | SeVF_CT_14 |
| 158 | RLRRSMLMGNPDD | SeVF_CT_13 |
| 159 | RLRRSMLMGNPD | SeVF_CT_12 |
| 160 | RLRRSMLMGNP | SeVF_CT_11 |
| 161 | RLRRSMLMGN | SeVF_CT_10 |
| 162 | RLRRSMLMG | SeVF_CT_9 |
| 163 | RLRRSMLM | SeVF_CT_8 |
| 164 | RLRRSML | SeVF_CT_7 |
| 165 | RLRRSM | SeVF_CT_6 |
| 166 | RLRRS | SeVF_CT_5 |
| 167 | RLRR | SeVF_CT_4 |
| 168 | RLR | SeVF_CT_3 |
| 169 | RL | SeVF_CT_2 |
| 170 | NRLTAFINDKLNIIHAMVLTQQYQVLRTDEEAQD | BaEVwt_CT |
| 171 | RYRYQGSNNKRIYNDIEMSRFRK | Cocal_CT |
| 172 | CKFVF | EboV-GP_CT |
| 173 | KLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL | GaLV_CT |
| 174 | KLVQFINDRISAVKIL | GaLV-RLess_CT |
| 175 | THRHIKGGSCPKPHRLTNKGICSCGAFKVPGVKTVWKRR | LCMV_GP_CT |
| 176 | RLVQFVKDRISVVQAL | MLV-A-RLess_CT |
| 177 | NRLTAFINDKLNIIHA | BaEVRLess_CT |
| 178 | RLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP | MLV-A_CT |
| 179 | RVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK | VSV-G_CT |
| 180 | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1-LLP3-LLP2-gp41-CT-N_FL |
| 181 | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE | HIV-1_gp41_LLP1-LLP3-LLP2-gp41-CT-N |
| 182 | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVA | HIV-1_gp41_LLP3-LLP2-gp41-CT-N |
| 183 | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGSLALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELL | HIV-1_gp41_LLP2-gp41-CT-N |
| 184 | NRVRQGYSPLSFQTHLPIPRGPDRPEGIEEEGGERDRDRSIRLVNGS | HIV-1_gp41_gp41-CT-N |
| 185 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1-LLP3-LLP2 |
| 186 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE | HIV-1_gp41_LLP1-LLP3-LLP2 |
| 187 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELLGRRGWEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVA | HIV-1_gp41_LLP3-LLP2 |
| 188 | LALIWDDLRSLCLFSYHRLRDLLLIVTRIVELL | HIV-1_gp41_LLP2 |
| 189 | WEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1-LLP3 |
| 190 | WEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVAEGTDRVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE | HIV-1_gp41_LLP1-LLP3 |
| 191 | WEALKYWWNLLQYWSQELKNSAVNLLNATAIAVA | HIV-1_gp41_LLP3 |
| 192 | RVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLERILL | HIV-1_gp41_LLIR-LLP1 |
| 193 | RVIEVLQAAYRAIRHIPRRIRQGLE | HIV-1_gp41_LLP1 |
| 194 | KLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK | CD29_CT |
| 195 | EKKRNTKLLMIIHDRREFAKFEKEKMNAKWDTGENPIYKSAVTTVVNPKYEGK | CD29_CT |
| 196 | AVEGGMKCVK | CD63_CT_1至11 |
| 197 | CGACKENYC | CD63_CT_73至81 |
| 198 | VEYGSRISKVLCC | CD63_CT_225至238 |
| 199 | EKKRNTAVEGGMKCVK | CD63_CT_1至11 |
| 200 | EKKRNTCGACKENYC | CD63_CT_73至81 |
| 201 | EKKRNTVEYGSRISKVLCC | CD63_CT_225至238 |
| 202 | EKKRNTRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK | VSV-G_CT |
| 203 | EKKRNTNRLTAFINDKLNIIHA | BaEVRLess_CT |
| 204 | EKKRNTRYRYQGSNNKRIYNDIEMSRFRK | Cocal_CT |
| 205 | EKKRNTCKFVF | EboV-GP_CT |
| 206 | EKKRNTKLVQFINDRISAVKILVLRQKYQALENEGNL | GaLV_CT |
| 207 | EKKRNTKLVQFINDRISAVKIL | GaLV-RLess_CT |
| 208 | EKKRNTRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP | MLV-A_CT |
| 209 | EKKRNTRLVQFVKDRISVVQAL | MLV-A-RLess_CT |
| 210 | KSDLLGENIKKM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 211 | KSDLLGDNIKKM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 212 | RDIMLHERNIVIRSGM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 213 | KSD | 副黏液病毒_附著_CT |
| 214 | RDI | 副黏液病毒_附著_CT |
| 215 | KSDLLG | 副黏液病毒_附著_CT |
| 216 | RDIMLH | 副黏液病毒_附著_CT |
| 217 | EKKRKSDLLGENIKKM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 218 | EKKRRDIMLHERNIVIRSGM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 219 | EKKRNTKSDLLGDNIKKM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 220 | EKKRNTRDIMLHERNIVIRSGM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 221 | EKKRNTYSRLKSDLLGDNIKKM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 222 | EKKRNTYSRLRDIMLHERNIVIRSGM | 副黏液病毒_附著_CT |
| 223 | LISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | NIV CT及TM |
| 224 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDSRRHKRFAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NNTHDSRRHKR/FAGV |
| 225 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVRHKRFAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NNTHDLVRHKR/FAGV |
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| 249 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | HevF_信號_序列 |
| 250 | MSNKRTTVLIIISYTLFYLNNAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | CevF_信號_序列 |
| 251 | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | HPIV2_信號_序列 |
| 252 | MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGQILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | MevF_信號_序列 |
| 253 | MRSRSSTRIPVPLMLIIRIALTLSCIRLTSSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NDV-F_信號_序列 |
| 254 | MTAYIQRSQCISTSLLVVLTTLVSCQIILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | SevF_信號_序列 |
| 255 | MRVKGIRKNYQHLWRWGIMLLGMLMICSAADILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | HIV1-Env_信號_序列 |
| 256 | MGFTTKIIFLYNLVLVYAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | BaEV_信號_序列 |
| 257 | MNFLLLTFIVLPLCSHAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | Cocal_信號_序列 |
| 258 | MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSIILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | EboV_信號_序列 |
| 259 | MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | GaLV_信號_序列 |
| 260 | MARSTLSKPLKNKVNPRGPLIPLILLMLRGVSTASPILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | MLV-A_信號_序列 |
| 261 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | VSVG_信號_序列 |
| 262 | MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAPILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | 催乳素_信號_序列 |
| 263 | METPAQLLFLLLLWLPDTTGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | IgGk-L_信號_序列 |
| 264 | MKWVTFISLLFLFSSAYSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | 白蛋白_信號_序列 |
| 265 | MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGRLILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | CD5_信號_序列 |
| 266 | MNPLLILTFVAAALAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | 胰蛋白酶原_信號_序列 |
| 267 | MYRMQLLSCIALSLALVTNSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | IL2_信號_序列 |
| 268 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLIAMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NivF_TM_S490A_dec_融合性 |
| 269 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILAVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NivF_TM_Y498A_dec_融合性 |
| 270 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRNT | HevF_TM_FL |
| 271 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFIIVEKKRNT | NivF_TM_HevF_S504A |
| 272 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFVIVEKKRNT | NivF_TM_HevF_I516V |
| 273 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F3 |
| 274 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F5 |
| 275 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDQTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F4F5 |
| 276 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDQTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F2F4F5 |
| 277 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLIAMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NivF_TM_S490A_dec_融合性 |
| 278 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F2F3 |
| 279 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F2F5 |
| 280 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F3F5 |
| 281 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | FL017HevF488NivF_全長 |
| 282 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGN | FL018HevF488NivF_CT-06 |
| 283 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRL | FL019HevF488NivF_CT-10 |
| 284 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILAVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | NivF_TM_Y498A_dec_融合性 |
| 285 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRNT | HevF_TM_FL |
| 286 | GGGGS | 連接子 |
| 287 | GGGGGS | 連接子 |
| 288 | (GGGGS)n | 連接子 |
| 289 | (GGGGGS)n | 連接子 |
| 290 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSQMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F2F3F5 |
| 291 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVLLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | R109L |
| 292 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | Q393L |
| 293 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVLLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | R109L_Q393L |
| 294 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGNYSRLDDRQVRPVSNGDLYYIGT | FL012 HevF_全長 |
| 295 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGN | FL_013HevF_CT-06 |
| 296 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLGILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIVEKKRGNYSRL | FL014 HevF_CT-10 |
| 297 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVRGR | FL057_CT060 |
| 298 | MYRMQLLSCIALSLALVTNSILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVRGR | FL063_CT060 |
| 299 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKQNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | FL007_FL057_CT060 |
| 300 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGITRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNVSKCTGTVMENYKSRLTGILSPIKGAIELYNNNTHDLVGDVKLAGVVMAGIAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDQISCKQTELALDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSIAGQIVYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYVQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFVLIRNTLISNIEVKYCLITKKSVICNQDYATPMTASVRECLTGSTDKCPRELVVSSHVPRFALSGGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCTTVVLGNIIISLGKYLGSINYNSESIAVGPPVYTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQKILDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | FL007_FL018 |
| 301 | MKKINE GLLDSKILSA FNTVIALLGS IVIIVMNIMI IQNYTRSTDN QAVIKDALQG IQQQIKGLAD KIGTEIGPKV SLIDTSSTIT IPANIGLLGS KISQSTASIN ENVNEKCKFT LPPLKIHECN ISCPNPLPFR EYRPQTEGVS NLVGLPNNIC LQKTSNQILK PKLISYTLPV VGQSGTCITD PLLAMDEGYF AYSHLERIGS CSRGVSKQRI IGVGEVLDRG DEVPSLFMTN VWTPPNPNTV YHCSAVYNNE FYYVLCAVST VGDPILNSTY WSGSLMMTRL AVKPKSNGGG YNQHQLALRS IEKGRYDKVM PYGPSGIKQG DTLYFPAVGF LVRTEFKYND SNCPITKCQY SKPENCRLSM GIRPNSHYIL RSGLLKYNLS DGENPKVVFI EISDQRLSIG SPSKIYDSLG QPVFYQASFS WDTMIKFGDV LTVNPLVVNW RNNTVISRPG QSQCPRFNTC PAICAEGVYN DAFLIDRINW ISAGVFLDSN ATAANPVFTV FKDNEILYRA QLASEDTNAQ KTITNCFLLK NKIWCISLVE IYDTGDNVIR PKLFAVKIPE QC | (E501 A、W504A、Q530A、E533A) NiV G蛋白(Gc Δ 34) |
| 302 | MVVILDKRCY CNLLILILMI SECSVGILHY EKLSKIGLVK GVTRKYKIKS NPLTKDIVIK MIPNVSNMSQ CTGSVMENYK TRLNGILTPI KGALEIYKNN THDLVGDVRL AGVIMAGVAI GIATAAQITA GVALYEAMKN ADNINKLKSS IESTNEAVVK LQETAEKTVY VLTALQDYIN TNLVPTIDKI SCKQTELSLD LALSKYLSDL LFVFGPNLQD PVSNSMTIQA ISQAFGGNYE TLLRTLGYAT EDFDDLLESD SITGQIIYVD LSSYYIIVRV YFPILTEIQQ AYIQELLPVS FNNDNSEWIS IVPNFILVRN TLISNIEIGF CLITKRSVIC NQDYATPMTN NMRECLTGST EKCPRELVVS SHVPRFALSN GVLFANCISV TCQCQTTGRA ISQSGEQTLL MIDNTTCPTA VLGNVIISLG KYLGSVNYNS EGIAIGPPVF TDKVDISSQI SSMNQSLQQS KDYIKEAQRL LDTVNPSLIS MLSMIILYVL SIASLCIGLI TFISFIIVEK KRNT | 在細胞質尾處(FcΔ22) (含信號序列) |
| 303 | ILHY EKLSKIGLVK GVTRKYKIKS NPLTKDIVIK MIPNVSNMSQ CTGSVMENYK TRLNGILTPI KGALEIYKNN THDLVGDVRL AGVIMAGVAI GIATAAQITA GVALYEAMKN ADNINKLKSS IESTNEAVVK LQETAEKTVY VLTALQDYIN TNLVPTIDKI SCKQTELSLD LALSKYLSDL LFVFGPNLQD PVSNSMTIQA ISQAFGGNYE TLLRTLGYAT EDFDDLLESD SITGQIIYVD LSSYYIIVRV YFPILTEIQQ AYIQELLPVS FNNDNSEWIS IVPNFILVRN TLISNIEIGF CLITKRSVIC NQDYATPMTN NMRECLTGST EKCPRELVVS SHVPRFALSN GVLFANCISV TCQCQTTGRA ISQSGEQTLL MIDNTTCPTA VLGNVIISLG KYLGSVNYNS EGIAIGPPVF TDKVDISSQI SSMNQSLQQS KDYIKEAQRL LDTVNPSLIS MLSMIILYVL SIASLCIGLI TFISFIIVEK KRNT | 在細胞質尾處經截短之成熟NiV融合醣蛋白(FcΔ22) |
| 304 | MPAENKKVRFENTTSDKGKIPSKVIKSYYGTMDIKKINEGLLDSKILSAFNTVIALLGSIVIIVMNIMIIQNYTRSTDNQAVIKDALQGIQQQIKGLADKIGTEIGPKVSLIDTSSTITIPANIGLLGSKISQSTASINENVNEKCKFTLPPLKIHECNISCPNPLPFREYRPQTEGVSNLVGLPNNICLQKTSNQILKPKLISYTLPVVGQSGTCITDPLLAMDEGYFAYSHLERIGSCSRGVSKQRIIGVGEVLDRGDEVPSLFMTNVWTPPNPNTVYHCSAVYNNEFYYVLCAVSTVGDPILNSTYWSGSLMMTRLAVKPKSNGGGYNQHQLALRSIEKGRYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLVRTEFKYNDSNCPITKCQYSKPENCRLSMGIRPNSHYILRSGLLKYNLSDGENPKVVFIEISDQRLSIGSPSKIYDSLGQPVFYQASFSWDTMIKFGDVLTVNPLVVNWRNNTVISRPGQSQCPRFNTCPEICWEGVYNDAFLIDRINWISAGVFLDSNQTAENPVFTVFKDNEILYRAQLASEDTNAQKTITNCFLLKNKIWCISLVEIYDTGDNVIRPKLFAVKIPEQCT | gb:AF212302|生物體：尼帕病毒|毒株名稱：未知-AF212302|蛋白質名稱：附著醣蛋白|基因符號：G Uniprot Q9IH62 |
| 305 | MPAENKKVRFENTTSDKGKIPSKVIKSYYGTMDIKKINEGLLDSKILSAFNTVIALLGSIVIIVMNIMIIQNYTRSTDNQAVIKDALQGIQQQIKGLADKIGTEIGPKVSLIDTSSTITIPANIGLLGSKISQSTASINENVNEKCKFTLPPLKIHECNISCPNPLPFREYRPQTEGVSNLVGLPNNICLQKTSNQILKPKLISYTLPVVGQSGTCITDPLLAMDEGYFAYSHLERIGSCSRGVSKQRIIGVGEVLDRGDEVPSLFMTNVWTPPNPNTVYHCSAVYNNEFYYVLCAVSTVGDPILNSTYWSGSLMMTRLAVKPKSNGGGYNQHQLALRSIEKGRYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLVRTEFKYNDSNCPITKCQYSKPENCRLSMGIRPNSHYILRSGLLKYNLSDGENPKVVFIEISDQRLSIGSPSKIYDSLGQPVFYQASFSWDTMIKFGDVLTVNPLVVNWRNNTVISRPGQSQCPRFNTCPAICAEGVYNDAFLIDRINWISAGVFLDSNATAANPVFTVFKDNEILYRAQLASEDTNAQKTITNCFLLKNKIWCISLVEIYDTGDNVIRPKLFAVKIPEQCT | 具有(E501 A、W504A、Q530A、E533A)之全長NiVG |
| 306 | ILHY EKLSKIGLVK GVTRKYKIKS NPLTKDIVIK MIPNVSNMSQ CTGSVMENYK TRLNGILTPI KGALEIYKNN THDLVGDVRL AGVIMAGVAI GIATAAQITA GVALYEAMKN ADNINKLKSS IESTNEAVVK LQETAEKTVY VLTALQDYIN TNLVPTIDKI SCKQTELSLD LALSKYLSDL LFVFGPNLQD PVSNSMTIQA ISQAFGGNYE TLLRTLGYAT EDFDDLLESD SITGQIIYVD LSSYYIIVRV YFPILTEIQQ AYIQELLPVS FNNDNSEWIS IVPNFILVRN TLISNIEIGF CLITKRSVIC NQDYATPMTN NMRECLTGST EKCPRELVVS SHVPRFALSN GVLFANCISV TCQCQTTGRA ISQSGEQTLL MIDNTTCPTA VLGNVIISLG KYLGSVNYNS EGIAIGPPVF TDKVDISSQI SSMNQSLQQS KDYIKEAQRL LDTVNPSLIS MLSMIILYVL SIASLCIGLI TFISFIIVEK KRN | 成熟NiV-F CT_5 |
| 307 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIV RGRCNKK | 成熟MeaslesF_CT_7 |
| 308 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQKTL | 成熟NDVF_CT_9 |
| 309 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIV KQKAQQ | 成熟NDVF_CT_6 |
| 310 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRGN | 成熟HeVF_CT_6 |
| 311 | NNTHDLVGDVRLAGV | NiV-F裂解位點 |
| 312 | R-X-R/K-R，X為任何胺基酸 | 弗林蛋白酶裂解序列 |
| 313 | NNTHDSRRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 314 | NNTHDLVRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 315 | NNTHDLVRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 316 | NNTHDLVRHRR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 317 | NNTHDLVRHRR/LAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 318 | NNGHDSRRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 319 | NNGHDLVRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 320 | NNGHDLVRHKR/LAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 321 | NNGHDLVRHRR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 322 | NNGHDLVRHRR/LAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 323 | QNTHDSRRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 324 | QNTHDLVRHKR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 325 | QNTHDLVRHKR/LAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 326 | QNTHDLVRHRR/FAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 327 | QNTHDLVRHRR/LAGV | 經修飾蛋白酶位點 |
| 328 | LISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | 經修飾蛋白酶位點 |
| 329 | VGDVK | 經修飾蛋白酶位點 |
| 330 | RNHNR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 331 | RRHKR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 332 | RRQKR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 333 | GRQGR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 334 | TRQKR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 335 | EIQSR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 336 | VPQSR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 337 | NPQSR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 338 | PRTKR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 339 | VGDVR | 經修飾蛋白酶位點 |
| 340 | MATQEVRLKCLLCGIIVLVLSLEGLG | HevF_信號_序列 |
| 341 | MSNKRTTVLIIISYTLFYLNNA | CevF_信號_序列 |
| 342 | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDA | HPIV2_信號_序列 |
| 343 | MGLKVNVSAIFMAVLLTLQTPTGQ | MevF_信號_序列 |
| 344 | MRSRSSTRIPVPLMLIIRIALTLSCIRLTSS | NDV-F_信號_序列 |
| 345 | MTAYIQRSQCISTSLLVVLTTLVSCQI | SevF_信號_序列 |
| 346 | MRVKGIRKNYQHLWRWGIMLLGMLMICSAAD | HIV1-Env_信號_序列 |
| 347 | MGFTTKIIFLYNLVLVYA | BaEV_信號_序列 |
| 348 | MNFLLLTFIVLPLCSHA | Cocal_信號_序列 |
| 349 | MGVTGILQLPRDRFKRTSFFLWVIILFQRTFSI | EboV_信號_序列 |
| 350 | MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTS | GaLV_信號_序列 |
| 351 | MARSTLSKPLKNKVNPRGPLIPLILLMLRGVSTASP | MLV-A_信號_序列 |
| 352 | MKCLLYLAFLFIGVNCI | VSVG_信號_序列 |
| 353 | MNIKGSPWKGSLLLLLVSNLLLCQSVAP | 催乳素_信號_序列 |
| 354 | METPAQLLFLLLLWLPDTTG | IgGk-L_信號_序列 |
| 355 | MKWVTFISLLFLFSSAYS | 白蛋白_信號_序列 |
| 356 | MPMGSLQPLATLYLLGMLVASCLGRL | CD5_信號_序列 |
| 357 | MNPLLILTFVAAALA | 胰蛋白酶原_信號_序列 |
| 358 | MYRMQLLSCIALSLALVTNS | IL2_信號_序列 |
| 359 | LIAMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIV | NivF_TM_S490A |
| 360 | LISMLSMIILAVLSIASLCIGLITFISFIIV | NivF_TM_Y498A |
| 361 | LISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFISFVIV | HevF_TM_FL |
| 362 | LISMLSMIILYVLSIAALCIGLITFIIVIV | NivF_TM_HevF_S504A |
| 363 | LISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFVIV | NivF_TM_HevF_I516V |
| 364 | ILHY EKLSKIGLVK GVTRKYKIKS NPLTKDIVIK MIPNVSNMSQ CTGSVMENYK TRLNGILTPI KGALEIYKNN THDLVGDVRL AGVIMAGVAI GIATAAQITA GVALYEAMKN ADNINKLKSS IESTNEAVVK LQETAEKTVY VLTALQDYIN TNLVPTIDKI SCKQTELSLD LALSKYLSDL LFVFGPNLQD PVSNSMTIQA ISQAFGGNYE TLLRTLGYAT EDFDDLLESD SITGQIIYVD LSSYYIIVRV YFPILTEIQQ AYIQELLPVS FNNDNSEWIS IVPNFILVRN TLISNIEIGF CLITKRSVIC NQDYATPMTN NMRECLTGST EKCPRELVVS SHVPRFALSN GVLFANCISV TCQCQTTGRA ISQSGEQTLL MIDNTTCPTA VLGNVIISLG KYLGSVNYNS EGIAIGPPVF TDKVDISSQI SSMNQSLQQS KDYIKEAQRL LDTVNPSLIS MLSMIILYVL SIASLCIGLI TFISFIIVEK KRNTYSRLED RRVRPTSSGD LYYIGT | 尼帕病毒NiV-F F0 (aa 27-546) |
| 365 | ILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVR | 尼帕病毒NiV-F F2 (SEQ ID NO:1之aa 27-109) |
| 366 | LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNTYSRLEDRRVRPTSSGDLYYIGT | 尼帕病毒NiV F F1 (aa 110-546) |
| 367 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F3F5_Q393L_CT-06_K1A |
| 368 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F3F5_Q393L_CT-10_K1A |
| 369 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | VSVG_信號_序列_MeaslesF_CT_3 |
| 370 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | IL2_信號_序列_MeaslesF_CT_3 |
| 371 | MHHLHPMIVCIFVMYTGIVGSDAILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F3F5_VSVG_信號_序列_MeaslesF_CT_3 |
| 372 | MKCLLYLAFLFIGVNCILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRNT | F3F5_HevF488NivF_CT-06 |
| 373 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ | F5_Q393L |
| 374 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRGN | F5_Q393L_VGDVK |
| 375 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ | F5_VGDVK |
| 376 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVKLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVEKKRGN | Q393L_VGDVK |
| 377 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMQQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ | F5_Q393L_HPIV2_信號_序列 |
| 378 | MVVILDKRCYCNLLILILMISECSVGILHYEKLSKIGLVKGVTRKYKIKSNPLTKDIVIKMIPNVSNMSQCTGSVMENYKTRLNGILTPIKGALEIYKNNTHDLVGDVRLAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCLCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIVKQKAQQ | F5_Q393L_VSVG_信號_序列 |
| 379 | MMADSKLVSLNNNLSGKIKDQGKVIKNYYGTMDIKKINDGLLDSKILGAFNTVIALLGSIIIIVMNIMIIQNYTRTTDNQALIKESLQSVQQQIKALTDKIGTEIGPKVSLIDTSSTITIPANIGLLGSKISQSTSSINENVNDKCKFTLPPLKIHECNISCPNPLPFREYRPISQGVSDLVGLPNQICLQKTTSTILKPRLISYTLPINTREGVCITDPLLAVDNGFFAYSHLEKIGSCTRGIAKQRIIGVGEVLDRGDKVPSMFMTNVWTPPNPSTIHHCSSTYHEDFYYTLCAVSHVGDPILNSTSWTESLSLIRLAVRPKSDSGDYNQKYIAITKVERGKYDKVMPYGPSGIKQGDTLYFPAVGFLPRTEFQYNDSNCPIIHCKYSKAENCRLSMGVNSKSHYILRSGLLKYNLSLGGDIILQFIEIADNRLTIGSPSKIYNSLGQPVFYQASYSWDTMIKLGDVDTVDPLRVQWRNNSVISRPGQSQCPRFNVCPEVCWEGTYNDAFLIDRLNWVSAGVYLNSNQTAENPVFAVFKDNEILYQVPLAEDDTNAQKTITDCFLLENVIWCISLVEIYDTGDSVIRPKLFAVKIPAQCSES | 亨德拉病毒G蛋白Uniprot O89343 |
| 380 | MLSQLQKNYLDNSNQQGDKMNNPDKKLSVNFNPLELDKGQKDLNKSYYVKNKNYNVSNLLNESLHDIKFCIYCIFSLLIIITIINIITISIVITRLKVHEENNGMESPNLQSIQDSLSSLTNMINTEITPRIGILVTATSVTLSSSINYVGTKTNQLVNELKDYITKSCGFKVPELKLHECNISCADPKISKSAMYSTNAYAELAGPPKIFCKSVSKDPDFRLKQIDYVIPVQQDRSICMNNPLLDISDGFFTYIHYEGINSCKKSDSFKVLLSHGEIVDRGDYRPSLYLLSSHYHPYSMQVINCVPVTCNQSSFVFCHISNNTKTLDNSDYSSDEYYITYFNGIDRPKTKKIPINNMTADNRYIHFTFSGGGGVCLGEEFIIPVTTVINTDVFTHDYCESFNCSVQTGKSLKEICSESLRSPTNSSRYNLNGIMIISQNNMTDFKIQLNGITYNKLSFGSPGRLSKTLGQVLYYQSSMSWDTYLKAGFVEKWKPFTPNWMNNTVISRPNQGNCPRYHKCPEICYGGTYNDIAPLDLGKDMYVSVILDSDQLAENPEITVFNSTTILYKERVSKDELNTRSTTTSCFLFLDEPWCISVLETNRFNGKSIRPEIYSYKIPKYC | gb:JQ001776:8170-10275|生物體：雪松病毒|毒株名稱：CG1a|蛋白質名稱：附著醣蛋白|基因符號：G |
| 381 | MPQKTVEFINMNSPLERGVSTLSDKKTLNQSKITKQGYFGLGSHSERNWKKQKNQNDHYMTVSTMILEILVVLGIMFNLIVLTMVYYQNDNINQRMAELTSNITVLNLNLNQLTNKIQREIIPRITLIDTATTITIPSAITYILATLTTRISELLPSINQKCEFKTPTLVLNDCRINCTPPLNPSDGVKMSSLATNLVAHGPSPCRNFSSVPTIYYYRIPGLYNRTALDERCILNPRLTISSTKFAYVHSEYDKNCTRGFKYYELMTFGEILEGPEKEPRMFSRSFYSPTNAVNYHSCTPIVTVNEGYFLCLECTSSDPLYKANLSNSTFHLVILRHNKDEKIVSMPSFNLSTDQEYVQIIPAEGGGTAESGNLYFPCIGRLLHKRVTHPLCKKSNCSRTDDESCLKSYYNQGSPQHQVVNCLIRIRNAQRDNPTWDVITVDLTNTYPGSRSRIFGSFSKPMLYQSSVSWHTLLQVAEITDLDKYQLDWLDTPYISRPGGSECPFGNYCPTVCWEGTYNDVYSLTPNNDLFVTVYLKSEQVAENPYFAIFSRDQILKEFPLDAWISSARTTTISCFMFNNEIWCIAALEITRLNDDIIRPIYYSFWLPTDCRTPYPHTGKMTRVPLRSTYNY | gb:NC_025256:9117-11015|生物體：蝙蝠副黏液病毒Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009|毒株名稱：BatPV/Eid_hel/GH-M74a/GHA/2009|蛋白質名稱：醣蛋白|基因符號：G |
| 382 | MATNRDNTITSAEVSQEDKVKKYYGVETAEKVADSISGNKVFILMNTLLILTGAIITITLNITNLTAAKSQQNMLKIIQDDVNAKLEMFVNLDQLVKGEIKPKVSLINTAVSVSIPGQISNLQTKFLQKYVYLEESITKQCTCNPLSGIFPTSGPTYPPTDKPDDDTTDDDKVDTTIKPIEYPKPDGCNRTGDHFTMEPGANFYTVPNLGPASSNSDECYTNPSFSIGSSIYMFSQEIRKTDCTAGEILSIQIVLGRIVDKGQQGPQASPLLVWAVPNPKIINSCAVAAGDEMGWVLCSVTLTAASGEPIPHMFDGFWLYKLEPDTEVVSYRITGYAYLLDKQYDSVFIGKGGGIQKGNDLYFQMYGLSRNRQSFKALCEHGSCLGTGGGGYQVLCDRAVMSFGSEESLITNAYLKVNDLASGKPVIIGQTFPPSDSYKGSNGRMYTIGDKYGLYLAPSSWNRYLRFGITPDISVRSTTWLKSQDPIMKILSTCTNTDRDMCPEICNTRGYQDIFPLSEDSEYYTYIGITPNNGGTKNFVAVRDSDGHIASIDILQNYYSITSATISCFMYKDEIWCIAITEGKKQKDNPQRIYAHSYKIRQMCYNMKSATVTVGNAKNITIRRY | gb:NC_025352:8716-11257|生物體：墨江病毒|毒株名稱：Tongguan1|蛋白質名稱：附著醣蛋白|基因符號：G |
| 383 | LAGVIMAGVAIGIATAAQITAGVALYEAMKNADNINKLKSSIESTNEAVVKLQETAEKTVYVLTALQDYINTNLVPTIDKISCKQTELSLDLALSKYLSDLLFVFGPNLQDPVSNSMTIQAISQAFGGNYETLLRTLGYATEDFDDLLESDSITGQIIYVDLSSYYIIVRVYFPILTEIQQAYIQELLPVSFNNDNSEWISIVPNFILVRNTLISNIEIGFCLITKRSVICNQDYATPMTNNMRECLTGSTEKCPRELVVSSHVPRFALSNGVLFANCISVTCQCQTTGRAISQSGEQTLLMIDNTTCPTAVLGNVIISLGKYLGSVNYNSEGIAIGPPVFTDKVDISSQISSMNQSLQQSKDYIKEAQRLLDTVNPSLISMLSMIILYVLSIASLCIGLITFISFIIV | 尼帕病毒NiV F F1 ΔCT |
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| 466 | METDTLLLWVLLLWVPGSTG | IgK信號肽 |
| 467 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP | GMCSFR-α (CSF2RA)信號肽 |
| 468 | TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD | CD8α鉸鏈結構域 |
| 469 | IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP | CD28鉸鏈結構域 |
| 470 | AAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP | CD28鉸鏈結構域 |
| 471 | ESKYGPPCPPCP | IgG4鉸鏈結構域 |
| 472 | ESKYGPPCPSCP | IgG4鉸鏈結構域 |
| 473 | IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC | CD8α跨膜結構域 |
| 474 | FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | CD28跨膜結構域 |
| 475 | MFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV | CD28跨膜結構域 |
| 476 | KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL | 4-1BB共刺激結構域 |
| 477 | RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS | CD28共刺激結構域 |
| 478 | RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3ζ信號傳導結構域 |
| 479 | RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | CD3ζ信號傳導結構域(在位置14處具有Q至K突變) |
| 480 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗CD19 FMC63 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 481 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈可變區 |
| 482 | QDISKY | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈CDR1 |
| 483 | HTS | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈CDR2 |
| 484 | QQGNTLPYT | 抗CD19 FMC63 scFv輕鏈CDR3 |
| 485 | GSTSGSGKPGSGEGSTKG | Whitlow連接子 |
| 486 | EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈可變區 |
| 487 | GVSLPDYG | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈CDR1 |
| 488 | IWGSETT | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈CDR2 |
| 489 | AKHYYYGGSYAMDY | 抗CD19 FMC63 scFv重鏈CDR3 |
| 490 | DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗CD19 FMC63 scFv完整序列，具有3xG 4S連接子 |
| 491 | GGGGSGGGGSGGGGS | 3xG 4S連接子 |
| 492 | atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc | 示例性CD19 CAR核苷酸序列 |
| 493 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 示例性CD19 CAR胺基酸序列 |
| 494 | atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggaccaagctggagatcacaggtggcggtggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggccaaggaacctcagtcaccgtctcctcaaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtacaagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc | 替沙崙賽CD19 CAR核苷酸序列 |
| 495 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGGGGSGGGGSGGGGSEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 替沙崙賽CD19 CAR胺基酸序列 |
| 496 | atgctgctgctggtgaccagcctgctgctgtgcgagctgccccaccccgcctttctgctgatccccgacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgaccgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaactggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacaccagccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggcaccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccacctacttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaagctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcgagggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctggtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagcctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctggaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgccctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttcctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgccaagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggcaccagcgtgaccgtgagcagcgaatctaagtacggaccgccctgccccccttgccctatgttctgggtgctggtggtggtcggaggcgtgctggcctgctacagcctgctggtcaccgtggccttcatcatcttttgggtgaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgcgggtgaagttcagcagaagcgccgacgcccctgcctaccagcagggccagaatcagctgtacaacgagctgaacctgggcagaagggaagagtacgacgtcctggataagcggagaggccgggaccctgagatgggcggcaagcctcggcggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcggggcaagggccacgacggcctgtatcagggcctgtccaccgccaccaaggatacctacgacgccctgcacatgcaggccctgcccccaagg | 利基邁崙賽CD19 CAR核苷酸序列 |
| 497 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSESKYGPPCPPCPMFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 利基邁崙賽CD19 CAR胺基酸序列 |
| 498 | atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgatcccagacatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcaccatcagttgcagggcaagtcaggacattagtaaatatttaaattggtatcagcagaaaccagatggaactgttaaactcctgatctaccatacatcaagattacactcaggagtcccatcaaggttcagtggcagtgggtctggaacagattattctctcaccattagcaacctggagcaagaagatattgccacttacttttgccaacagggtaatacgcttccgtacacgttcggaggggggactaagttggaaataacaggctccacctctggatccggcaagcccggatctggcgagggatccaccaagggcgaggtgaaactgcaggagtcaggacctggcctggtggcgccctcacagagcctgtccgtcacatgcactgtctcaggggtctcattacccgactatggtgtaagctggattcgccagcctccacgaaagggtctggagtggctgggagtaatatggggtagtgaaaccacatactataattcagctctcaaatccagactgaccatcatcaaggacaactccaagagccaagttttcttaaaaatgaacagtctgcaaactgatgacacagccatttactactgtgccaaacattattactacggtggtagctatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtcaccgtctcctcagcggccgcaattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc | 阿基崙賽CD19 CAR核苷酸序列 |
| 499 | MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 阿基崙賽CD19 CAR胺基酸序列 |
| 500 | DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS | 抗CD20 Leu16 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 501 | DIVLTQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVNYMDWYQKKPGSSPKPWIYATSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWSFNPPTFGGGTKLEIK | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈可變區 |
| 502 | RASSSVNYMD | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈CDR1 |
| 503 | ATSNLAS | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈CDR2 |
| 504 | QQWSFNPPT | 抗CD20 Leu16 scFv輕鏈CDR3 |
| 505 | EVQLQQSGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGQGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSADYYCARSNYYGSSYWFFDVWGAGTTVTVSS | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈 |
| 506 | SYNMH | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈CDR1 |
| 507 | AIYPGNGDTSYNQKFKG | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈CDR2 |
| 508 | SNYYGSSYWFFDV | 抗CD20 Leu16 scFv重鏈CDR3 |
| 509 | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971 scFv完整序列，具有3xG 4S連接子 |
| 510 | QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSAAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYNDYAVSVKSRITINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS | 抗CD22 m971 scFv重鏈可變區 |
| 511 | GDSVSSNSAA | 抗CD22 m971 scFv重鏈CDR1 |
| 512 | TYYRSKWYN | 抗CD22 m971 scFv重鏈CDR2 |
| 513 | AREVTGDLEDAFDI | 抗CD22 m971 scFv重鏈CDR3 |
| 514 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYQQRPGKAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971 scFv輕鏈 |
| 515 | QTIWSY | 抗CD22 m971 scFv輕鏈CDR1 |
| 516 | AAS | 抗CD22 m971 scFv輕鏈CDR2 |
| 517 | QQSYSIPQT | 抗CD22 m971 scFv輕鏈CDR3 |
| 518 | QVQLQQSGPGMVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYAVSMKSRITINPDTNKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYRQRPGEAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971-L7 scFv完整序列，具有3xG 4S連接子 |
| 519 | QVQLQQSGPGMVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSVAWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSTWYNDYAVSMKSRITINPDTNKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCAREVTGDLEDAFDIWGQGTMVTVSS | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈可變區 |
| 520 | GDSVSSNSVA | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈CDR1 |
| 521 | TYYRSTWYN | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈CDR2 |
| 522 | AREVTGDLEDAFDI | 抗CD22 m971-L7 scFv重鏈CDR3 |
| 523 | DIQMIQSPSSLSASVGDRVTITCRASQTIWSYLNWYRQRPGEAPNLLIYAASSLQSGVPSRFSGRGSGTDFTLTISSLQAEDFATYYCQQSYSIPQTFGQGTKLEIK | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈可變區 |
| 524 | QTIWSY | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈CDR1 |
| 525 | AAS | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈CDR2 |
| 526 | QQSYSIPQT | 抗CD22 m971-L7 scFv輕鏈CDR3 |
| 527 | DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗BCMA C11D5.3 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 528 | DIVLTQSPASLAMSLGKRATISCRASESVSVIGAHLIHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLETGVPARFSGSGSGTDFTLTIDPVEEDDVAIYSCLQSRIFPRTFGGGTKLEIK | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈可變區 |
| 529 | RASESVSVIGAHLIH | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈CDR1 |
| 530 | LASNLET | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈CDR2 |
| 531 | LQSRIFPRT | 抗BCMA C11D5.3 scFv輕鏈CDR3 |
| 532 | QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSINWVKRAPGKGLKWMGWINTETREPAYAYDFRGRFAFSLETSASTAYLQINNLKYEDTATYFCALDYSYAMDYWGQGTSVTVSS | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈可變區 |
| 533 | DYSIN | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈CDR1 |
| 534 | WINTETREPAYAYDFRG | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈CDR2 |
| 535 | DYSYAMDY | 抗BCMA C11D5.3 scFv重鏈CDR3 |
| 536 | DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS | 抗BCMA C12A3.2 scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 537 | DIVLTQSPPSLAMSLGKRATISCRASESVTILGSHLIYWYQQKPGQPPTLLIQLASNVQTGVPARFSGSGSRTDFTLTIDPVEEDDVAVYYCLQSRTIPRTFGGGTKLEIK | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈可變區 |
| 538 | RASESVTILGSHLIY | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈CDR1 |
| 539 | LASNVQT | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈CDR2 |
| 540 | LQSRTIPRT | 抗BCMA C12A3.2 scFv輕鏈CDR3 |
| 541 | QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFRHYSMNWVKQAPGKGLKWMGRINTESGVPIYADDFKGRFAFSVETSASTAYLVINNLKDEDTASYFCSNDYLYSLDFWGQGTALTVSS | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈可變區 |
| 542 | HYSMN | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈CDR1 |
| 543 | RINTESGVPIYADDFKG | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈CDR2 |
| 544 | DYLYSLDF | 抗BCMA C12A3.2 scFv重鏈CDR3 |
| 545 | EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSGDYIYYADSVKGRFTISRDISKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKEGTGANSSLADYRGQGTLVTVSS | 抗BCMA FHVH33完整序列 |
| 546 | GFTFSSYA | 抗BCMA FHVH33 CDR1 |
| 547 | ISGSGDYI | 抗BCMA FHVH33 CDR2 |
| 548 | AKEGTGANSSLADY | 抗BCMA FHVH33 CDR3 |
| 549 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS | 抗BCMA CT103A scFv完整序列，具有Whitlow連接子 |
| 550 | DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIK | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈可變區 |
| 551 | QSISSY | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈CDR1 |
| 552 | AAS | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈CDR2 |
| 553 | QQKYDLLT | 抗BCMA CT103A scFv輕鏈CDR3 |
| 554 | QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS | 抗BCMA CT103A scFv重鏈可變區 |
| 555 | GGSISSSSYY | 抗BCMA CT103A scFv重鏈CDR1 |
| 556 | ISYSGST | 抗BCMA CT103A scFv重鏈CDR2 |
| 557 | ARDRGDTILDV | 抗BCMA CT103A scFv重鏈CDR3 |
| 558 | atggccttaccagtgaccgccttgctcctgccgctggccttgctgctccacgccgccaggccggacatccagatgacccagtctccatcctccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggcaagtcagagcattagcagctatttaaattggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccagtttgcaaagtggggtcccatcaaggttcagtggcagtggatctgggacagatttcactctcaccatcagcagtctgcaacctgaagattttgcaacttactactgtcagcaaaaatacgacctcctcacttttggcggagggaccaaggttgagatcaaaggcagcaccagcggctccggcaagcctggctctggcgagggcagcacaaagggacagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagagatcgtggagacaccatactagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtcagctcattcgtgcccgtgttcctgcccgccaaacctaccaccacccctgcccctagacctcccaccccagccccaacaatcgccagccagcctctgtctctgcggcccgaagcctgtagacctgctgccggcggagccgtgcacaccagaggcctggacttcgcctgcgacatctacatctgggcccctctggccggcacctgtggcgtgctgctgctgagcctggtgatcaccctgtactgcaaccaccggaacaaacggggcagaaagaaactcctgtatatattcaaacaaccatttatgagaccagtacaaactactcaagaggaagatggctgtagctgccgatttccagaagaagaagaaggaggatgtgaactgagagtgaagttcagcagatccgccgacgcccctgcctaccagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaacctgggcagacgggaagagtacgacgtgctggacaagcggagaggccgggaccccgagatgggcggaaagcccagacggaagaacccccaggaaggcctgtataacgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggcatgaagggcgagcggaggcgcggcaagggccacgatggcctgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggacacctacgacgccctgcacatgcaggccctgccccccaga | 示例性BCMA CAR核苷酸序列 |
| 559 | MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQKYDLLTFGGGTKVEIKGSTSGSGKPGSGEGSTKGQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSSFVPVFLPAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNHRNKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR | 示例性BCMA CAR胺基酸序列 |
圖 1描繪具有標註之細胞外、跨膜(TM)及細胞質結構域之尼帕病毒F (NiV-F)醣蛋白。
圖 2描繪用示例性嵌合NiV-F構築體假型化之慢病毒脂質粒子之效價，該等構築體含有來源於另一副黏液病毒之經截短細胞質尾。
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Claims (275)
- 一種脂質粒子，該脂質粒子包含： (a) 脂質雙層； (b) 副黏液病毒醣蛋白(G蛋白)或其生物活性部分；及 (c) 包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F (Nipah virus F)醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾細胞質尾包含： (i) 來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白； (ii) 經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或 (iii) 包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質， 其中該G蛋白或其生物活性部分及該變異體NiV-F蛋白暴露於該脂質雙層之外部。
- 如請求項1之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
- 如請求項2之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
- 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含： (a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (b) 包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾細胞質尾包含： (i) 來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白； (ii) 經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或 (iii) 包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質， 其中該G蛋白或其生物活性部分及該變異體NiV-F蛋白暴露於該脂質雙層之外部。
- 如請求項1至4中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白在該G蛋白與靶細胞上之靶分子結合後展現與該靶細胞之融合活性。
- 如請求項1至5中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
- 如請求項6之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
- 如請求項1至7中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體Niv-F蛋白包含含有該經修飾細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由該經修飾細胞質尾之序列組成之經修飾F1，該細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
- 如請求項1至8中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F自N端至C端依序包含細胞外結構域、跨膜結構域及該經修飾細胞質尾。
- 如請求項1至6中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域來自野生型NiV-F或其生物活性變異體。
- 如請求項1至7中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列，或與SEQ ID NO:2展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至11中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列。
- 如請求項1至12中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾為經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型尼帕病毒F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至13中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該經修飾細胞質尾為經截短NiV-G細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 4所示之野生型尼帕病毒細胞質尾之C端處或附近具有23個或約23個胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至14中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾為SEQ ID NO:27所示之經截短NiV-F細胞質尾。
- 如請求項1至14中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之序列，或與SEQ ID NO:306展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至16中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:306所示之序列。
- 如請求項1至12中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白且該經修飾細胞質尾包含來自另一病毒之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分。
- 如請求項1至12及18中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為正核糖核酸病毒界(Kingdom Orthornavirae)之成員。
- 如請求項1至12、18及19中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為副黏液病毒科、彈狀病毒科、沙粒病毒科或反轉錄病毒科之成員。
- 如請求項1至12及18至20中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為副黏液病毒科之成員。
- 如請求項21之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為亨德拉病毒(Hendra virus)、雪松病毒(Cedar virus)、犬瘟熱病毒、副流感病毒、麻疹病毒、新城疫病毒或仙台病毒(Sendai virus)。
- 如請求項1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為麻疹病毒且該醣蛋白為麻疹病毒融合(F)蛋白(MvF)。
- 如請求項1至12及18至23中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短MvF細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有至多32個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12及18至24中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短MvF細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 125所示之野生型MvF細胞質尾之C端處或附近具有26個或約26個或至多26個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12及18至25中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:133所示之異源細胞質尾。
- 如請求項1至12及18至25中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:307所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:307展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至12及18至27中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為新城疫病毒(NDV)且該醣蛋白為NDV F蛋白。
- 如請求項1至12、18至22及29中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有至多25個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12、18至22、29及30中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有17個或約17個或至多17個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12及18至22及29至31中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:147所示之異源細胞質尾。
- 如請求項1至12、18至22及29至32中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:308所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:308展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至12、18至22及29至33中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 308所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至12、18至22、29及30中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短NDV F蛋白細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 141所示之野生型NDV F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有20個或約20個或至多20個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12及18至22及29、30及35中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:150所示之異源細胞質尾。
- 如請求項1至12、18至22、29、30、35及36中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:309所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:309展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至12、18至22、29、30及35至37中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-G包含SEQ ID NO:309所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該另一病毒為亨德拉病毒(HeV)且該醣蛋白為HeV F蛋白。
- 如請求項1至12、18至22及39中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短HeV F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 59所示之野生型HeV F細胞質尾之C端處或附近具有至多26個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12、18至22、39及40中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該異源細胞質尾為經截短HeV F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO: 59所示之野生型HeV F細胞質尾之C端處或附近具有22個或約22個或至多22個連續胺基酸殘基之缺失。
- 如請求項1至12、18至22及39至41中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO:80所示之異源細胞質尾。
- 如請求項1至12、18至22及39至41中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:310所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:310展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至12、18至22及39至43中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 310所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至12及18至22中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包括用來自另一副黏液病毒之附著蛋白之細胞質尾或其經截短部分置換該NiV-F細胞質尾之附著模體。
- 如請求項45之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該副黏液病毒為尼帕病毒、亨德拉病毒或麻疹病毒。
- 如請求項45或請求項46之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該附著蛋白為G蛋白、H蛋白或HN蛋白。
- 如請求項45至47中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO: 210-222中之任一者所示之異源細胞質尾。
- 如請求項1至48中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該脂質粒子或假型慢病毒粒子進一步包含經修飾胞外域，該經修飾胞外域包含經修飾蛋白酶裂解位點。
- 如請求項49之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾裂解位點包括用SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示之經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)。
- 如請求項49之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該經修飾裂解位點包括用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點。
- 一種脂質粒子，該脂質粒子包含： (a) 脂質雙層； (b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (c) 包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點： (i) 用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或 (ii) 用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點。
- 如請求項52之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
- 如請求項53之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
- 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含： (a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (b) 包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點： (i) 用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或 (ii) 用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:329) VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該裂解序列為組織蛋白酶L裂解位點。
- 如請求項49至55中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
- 如請求項52或請求項56之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該置換裂解序列包含組織蛋白酶L裂解位點且該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
- 如請求項52或請求項56之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該置換裂解序列包含經修飾弗林蛋白酶裂解位點且該蛋白水解裂解形式為弗林蛋白酶裂解產物。
- 如請求項49至58中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該置換係在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:320所示之胺基酸序列或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式中。
- 如請求項50、51及53至59中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該弗林蛋白酶裂解序列如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示。
- 如請求項50、51及53至60中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
- 如請求項50、52及53至60中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解位點如SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示。
- 如請求項50、52、53至60及62中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
- 如請求項50、51、53至60、62及63中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:239展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸1-26)之成熟形式。
- 如請求項50、51、53至60、62、63及64中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至65中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中與野生型NiV-F之信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列。
- 如請求項1至66中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F由多核苷酸序列編碼，與野生型NiV-F之經編碼信號序列相比，該多核苷酸序列包含編碼異源信號序列之序列。
- 一種脂質粒子，該脂質粒子包含： (a) 脂質雙層； (b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (c) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列或由包含編碼異源信號序列之序列的多核苷酸序列編碼。
- 如請求項68之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
- 如請求項69之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
- 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含： (a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (b) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列或由包含編碼異源信號序列之序列的多核苷酸序列編碼。
- 如請求項68至71中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
- 如請求項72之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
- 如請求項68至73中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列來自另一病毒或為哺乳動物信號序列。
- 如請求項74之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為副黏液病毒，視情況為亨尼帕病毒(henipavirus)。
- 如請求項66至75中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列為HevF信號序列、CevF信號序列、HPIV2信號序列、MevF信號序列、NDV-F信號序列或SevF信號序列。
- 如請求項66至76中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 340-345中之任一者所示。
- 如請求項66至77中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為副流感病毒且該異源信號序列為人類副流感病毒2 (HPIV2)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 342所示。
- 如請求項66至78中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項66至79中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項66至80中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 251所示之胺基酸序列。
- 如請求項66至74中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒(Cocal virus)、伊波拉病毒(Ebola virus)、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒。
- 如請求項66至74及82中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。
- 如請求項66至74、82及83中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。
- 如請求項66至74及82至84中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該另一病毒為水疱性口炎病毒(VSV)且該異源信號序列為VSV G醣蛋白(VSV-G)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 352所示。
- 如請求項66至74及82至85中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項66至74及82至86中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F由編碼變異體NiV-F之核苷酸序列編碼，該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
- 如請求項66至74及82至87中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列。
- 如請求項66至74中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該哺乳動物信號序列為來自人類蛋白質之信號序列。
- 如請求項66至74及89中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。
- 如請求項66至74、89及90中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。
- 如請求項1至91中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中與野生型NiV-F之跨膜結構域相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
- 一種脂質粒子，該脂質粒子包含： (a) 脂質雙層； (b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (c) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
- 如請求項93之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
- 如請求項94之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
- 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含： (a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (b) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
- 如請求項93至96中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
- 如請求項97之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
- 如請求項93至98中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該跨膜結構域為來自亨德拉病毒之異源跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 361所示。
- 如請求項93至99中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1所示之位置的編號，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 359、360、362或363中之任一者所示。
- 如請求項93至100中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
- 如請求項1至101中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該脂質粒子或假型慢病毒粒子進一步包含超融合突變。
- 如請求項102之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入該超融合突變。
- 如請求項102或103之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該超融合突變為N64Q、N67Q、N99Q、N414Q及/或N464Q中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。
- 如請求項104之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該一或多個突變係選自由以下組成之群：N64Q、N67Q、N99Q、N414Q、N464Q、N67Q/N99Q、N67Q/N414Q、N67Q/N464Q、N99Q/N414Q、N99Q/N464Q、N414Q/N464Q、N67Q/N99Q/N414Q、N67Q/N414Q/N464Q、N99Q/N414Q/ N464Q或N67Q/N99Q/N414Q/N464Q、N64Q/N99Q、N64Q/N99Q/N464Q、N64Q/N67Q/N99Q及N64Q/N67Q/N99Q/N464Q。
- 如請求項102之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入該超融合突變。
- 如請求項102或106之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該超融合突變為R109L、Q393L或R109L與Q393L中之一或多者，參考SEQ ID NO:1所示之編號。
- 一種脂質粒子，該脂質粒子包含： (a) 脂質雙層； (b) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (c) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變： 在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入之突變；及/或 在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
- 如請求項106、107或108中任一項之脂質粒子，其中在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393之六聚體穩定性位點處引入該超融合突變，視情況其中該突變為取代Q393L。
- 如請求項108或請求項109之脂質粒子，其中該脂質雙層來源於用於產生反轉錄病毒載體或反轉錄病毒樣粒子、視情況慢病毒載體或慢病毒樣粒子之宿主細胞的膜。
- 如請求項110之脂質粒子，其中該宿主細胞係選自由以下組成之群：CHO細胞、BHK細胞、MDCK細胞、C3H 10T1/2細胞、FLY細胞、Psi-2細胞、BOSC 23細胞、PA317細胞、WEHI細胞、COS細胞、BSC 1細胞、BSC 40細胞、BMT 10細胞、VERO細胞、W138細胞、MRC5細胞、A549細胞、HT1080細胞、293細胞、293T細胞、B-50細胞、3T3細胞、NIH3T3細胞、HepG2細胞、Saos-2細胞、Huh7細胞、HeLa細胞、W163細胞、211細胞及211A細胞。
- 一種假型慢病毒粒子，該假型慢病毒粒子包含： (a) 副黏液病毒醣蛋白(G)或其生物活性部分；及 (b) 變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變： 在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67、99、414及/或464之N-糖基化位點處引入之突變；及/或 在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
- 如請求項108至112中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
- 如請求項113之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
- 如請求項102至114中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體包含： 突變N67Q、N99Q、N414Q或N464Q或其任何組合；及/或 突變R109L或Q393L或其組合。
- 如請求項102至115中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該超融合突變係在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:302或SEQ ID NO:303所示之胺基酸序列中。
- 如請求項1至116中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:247所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:247展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至117中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 247所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至116中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO:292所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項1至116或119中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。
- 如請求項1至120中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。
- 如請求項1至121中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。
- 如請求項1至122中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
- 如請求項1至123中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白為NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分，其展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。
- 如請求項124之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中蛋白質之該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
- 如請求項124或請求項125之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
- 如請求項122至126中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項122至127中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
- 如請求項122至128中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。
- 如請求項129之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域附接至該G蛋白之C端。
- 如請求項129或請求項130之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。
- 如請求項129至131中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。
- 如請求項129至132中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞、CD30+肺上皮細胞。
- 如請求項129至133中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞為肝細胞。
- 如請求項129至133及134中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域結合至選自由ASGR1、ASGR2及TM4SF組成之群的細胞表面分子。
- 如請求項129至133中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞為T細胞。
- 如請求項129至133及136中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域結合至選自由CD3、CD4或CD8組成之群的細胞表面分子。
- 如請求項129至137中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域為抗體或抗原結合片段、單結構域抗體或DARPin。
- 如請求項129至138中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域為單結構域抗體，該單結構域抗體為VHH或為單鏈可變片段(scFv)。
- 如請求項129至139中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該結合結構域經由連接子附接至該G蛋白。
- 如請求項140之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該連接子為肽連接子。
- 如請求項141之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該肽連接子之長度為2至65個胺基酸。
- 如請求項141或請求項142之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該肽連接子為可撓性連接子，該可撓性連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。
- 如請求項141至143中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該肽連接子係選自：(GGS)n，其中n為1至10；(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10；或(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。
- 如請求項1至144中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體為複製缺陷的。
- 如請求項1至145中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體係藉由包括用編碼Gag-pol、Rev、Tat及該變異體NiVG及該F蛋白之包裝質體轉導生產細胞之方法來製備。
- 如請求項1至146中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該粒子進一步包含病毒核酸。
- 如請求項147之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該病毒核酸包含以下核酸序列中之一或多者(例如，全部)：5' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3結構域)、Psi包裝元件(Psi)、中央聚嘌呤束(cPPT)/中央終止序列(CTS) (例如，DNA瓣)、聚A尾序列、轉錄後調控元件(例如，WPRE)、Rev反應元件(RRE)及3' LTR (例如，包含U5且缺乏功能性U3)。
- 如請求項1至147中任一項之脂質粒子或假型慢病毒載體，其中該粒子不含病毒基因體DNA。
- 如請求項1至149中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該粒子以與參考粒子製劑相比具有增加之效價的製劑形式產生，該參考粒子製劑以類似方式產生，但摻有SEQ ID NO: 1所示之全長NiV-F蛋白，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
- 如請求項1至150中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該粒子以與參考粒子製劑相比具有增加之效價的製劑形式產生，該參考粒子製劑以類似方式產生，但摻有包含SEQ ID NO:303所示之序列或由編碼SEQ ID NO:302所示之序列之多核苷酸編碼的經截短NiV-F蛋白，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
- 如請求項150或請求項151之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加等於或大於1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
- 如請求項150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約2.0倍或大於約2.0倍。
- 如請求項150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約3.0倍或大於約3.0倍。
- 如請求項150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約4.0倍或大於約4.0倍。
- 如請求項150至152中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該效價增加約5.0倍或大於約5.0倍。
- 如請求項1至156中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，該脂質粒子或假型慢病毒粒子進一步包含用於遞送至靶細胞之外源劑。
- 如請求項157之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑存在於內腔中。
- 如請求項157或請求項158之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑為蛋白質或核酸，視情況其中該核酸為DNA或RNA。
- 如請求項157至159中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑為編碼用於遞送至該靶細胞之貨物的核酸。
- 如請求項157至160中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該外源劑為或編碼治療劑或診斷劑。
- 如請求項157至161中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源劑編碼膜蛋白，視情況其中該膜蛋白為用於靶向由疾病或疾患表現或與疾病或疾患相關之細胞的抗原受體。
- 如請求項162之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該膜蛋白為嵌合抗原受體(CAR)。
- 如請求項157至163中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該靶細胞為T細胞。
- 如請求項157至161中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該外源劑為包含用於校正遺傳缺陷、視情況該靶細胞中之遺傳缺陷之有效負荷基因的核酸，視情況其中該遺傳缺陷與肝臟細胞或肝細胞相關。
- 如請求項157至165中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該G蛋白與該靶細胞上之細胞表面分子的結合介導該粒子與該靶細胞之融合及該外源劑向該靶細胞之遞送。
- 如請求項157至166中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中向等於或大於10%、20%、30%、40%、50%、60%之該等靶細胞遞送該外源劑。
- 如請求項157至167中任一項之脂質粒子或慢病毒載體，其中該外源細胞向該靶細胞之遞送與參考粒子製劑相比有所增加，該參考粒子製劑以類似方式產生，但其中該NiV-F蛋白為SEQ ID NO: 1所示之全長NiV-F蛋白，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
- 如請求項157至167中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該外源細胞向該靶細胞之遞送與參考粒子製劑相比有所增加，該參考粒子製劑以類似方式產生，但其中該F蛋白為包含SEQ ID NO:303所示之序列或由編碼SEQ ID NO:302所示之序列之多核苷酸編碼的經截短NiV-F，視情況其中該脂質粒子或假型慢病毒粒子為慢病毒載體。
- 如請求項157至169中任一項之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中向該靶細胞之該遞送增加等於或大於1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、2倍、2.5倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍或更多倍。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼包含經修飾細胞質尾之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，其中該經修飾細胞質尾包含： (i) 來自另一病毒或病毒相關蛋白之醣蛋白之異源細胞質尾或其經截短部分，其中該變異體NiV-F為嵌合蛋白； (ii) 經截短NiV-F細胞質尾，該細胞質尾在SEQ ID NO:4所示之野生型NiV-F蛋白細胞質尾之C端處或附近具有23至27個連續胺基酸殘基之缺失，前提條件為該經截短NiV-F不具有25個連續胺基酸之缺失；及/或 (iii) 包含經修飾內吞模體之經修飾NiV-F細胞質。
- 如請求項171之多核苷酸，其中該變異體NiV-F蛋白包含F0前驅體或為其包含F1及F2次單元之蛋白水解裂解形式。
- 如請求項172之多核苷酸，其中該蛋白水解裂解形式為組織蛋白酶L裂解產物。
- 如請求項171至173中任一項之多核苷酸，其中該變異體Niv-F蛋白包含含有該經修飾細胞質尾之經修飾F1次單元及F2次單元，其中(1)該F1次單元為由該經修飾細胞質尾之序列組成之經修飾F1，該細胞質尾直接連接至SEQ ID NO:383所示之序列之C端，及(2)該F2次單元如SEQ ID NO:365所示。
- 如請求項171至174中任一項之多核苷酸，其中該變異體NiV-F自N端至C端依序包含細胞外結構域、跨膜結構域及該經修飾細胞質尾。
- 如請求項175之多核苷酸，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域來自野生型NiV-F或其生物活性變異體。
- 如請求項175或請求項176之脂質粒子或假型慢病毒粒子，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列，或與SEQ ID NO:2展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項175至177中任一項之多核苷酸，其中該變異體NiV-F之該細胞外結構域及該跨膜結構域包含SEQ ID NO:2所示之序列。
- 如請求項174至178中任一項之多核苷酸，其中該經修飾細胞質尾包含SEQ ID NO: 80、133、147及150中之任一者所示之異源細胞質尾。
- 如請求項174至179中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 307、308、309及310中之任一者所示之胺基酸序列。
- 如請求項174至178中任一項之多核苷酸，其中該經修飾細胞質尾為SEQ ID NO: 27中之任一者所示之經截短NiV-F細胞質尾。
- 如請求項174至178及181中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 306中之任一者所示之胺基酸序列。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼包含經修飾胞外域之變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，其中該經修飾胞外域包含選自以下之經修飾裂解位點： (i) 用經修飾弗林蛋白酶裂解序列置換裂解序列NNTHDLVGDVRLAGV (SEQ ID NO:311)；或 (ii) 用來自另一副黏液病毒之經修飾裂解序列置換裂解序列VGDVR (SEQ ID NO:339)，視情況其中該裂解序列為組織蛋白酶L裂解位點； 其中該置換係在SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:320所示之胺基酸序列或其缺乏信號肽(胺基酸1-26)之成熟形式中。
- 如請求項183之多核苷酸，其中該弗林蛋白酶裂解序列如SEQ ID NO: 313-327中之任一者所示。
- 如請求項183或請求項184之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 224-238中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 224-238中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
- 如請求項183之多核苷酸，其中該來自另一副黏液病毒之經修飾裂解位點如SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示。
- 如請求項183或請求項186之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239-248中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 239-248中之任一者展現至少85%或約至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列且分別含有SEQ ID NO: 329-338中之任一者所示之裂解位點，或為其缺乏信號肽(例如，缺乏胺基酸1-26)之成熟形式。
- 如請求項183、請求項186或請求項187之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:239所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:239展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列，或為其缺乏信號肽(例如，胺基酸1-26)之成熟形式。
- 如請求項183及186至188中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 239所示之胺基酸序列。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，與NiV-F之野生型信號序列相比，該變異體NiV-F包含異源信號序列。
- 如請求項190之多核苷酸，其中該異源信號序列來自另一病毒或為哺乳動物信號序列。
- 如請求項191之多核苷酸，其中該另一病毒為副黏液病毒，視情況為亨尼帕病毒。
- 如請求項190至192中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列為HevF信號序列、CevF信號序列、HPIV2信號序列、MevF信號序列、NDV-F信號序列或SevF信號序列。
- 如請求項190至193中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 340-345中之任一者所示。
- 如請求項190至191中任一項之多核苷酸，其中該另一病毒為副流感病毒且該異源信號序列為人類副流感病毒2 (HPIV2)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 342所示。
- 如請求項190、191及195中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:251所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:251展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項190、191、195及196中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 251所示之胺基酸序列。
- 如請求項190至191中任一項之多核苷酸，其中該另一病毒為HIV-1、狒狒內源性反轉錄病毒、科卡爾病毒、伊波拉病毒、長臂猿白血病病毒、鼠類白血病病毒或水疱性口炎病毒。
- 如請求項190至191及198中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列為HIV1-Env信號序列、BaEV信號序列、Cocal信號序列、EboV信號序列、GaLV信號序列、MLV-A信號序列或VSVG信號序列。
- 如請求項190至192、198及199中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 346-352中之任一者所示。
- 如請求項190至191及198至199中任一項之多核苷酸，其中該另一病毒為水疱性口炎病毒(VSV)且該異源信號序列為VSV G醣蛋白(VSV-G)信號序列，視情況如SEQ ID NO: 352所示。
- 如請求項190至191及198至201中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:261所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:261展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項190至191及198至202中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 261所示之胺基酸序列。
- 如請求項190至191中任一項之多核苷酸，其中該哺乳動物信號序列為來自人類蛋白質之信號序列。
- 如請求項190至191及204中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列為催乳素信號序列、IgGk-L信號序列、白蛋白信號序列、CD5信號序列、胰蛋白酶原信號序列或IL2信號序列。
- 如請求項190至192、204及205中任一項之多核苷酸，其中該異源信號序列如SEQ ID NO: 353-358中之任一者所示。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，與野生型NiV-F相比，該變異體NiV-F包含異源或經修飾跨膜結構域。
- 如請求項207之多核苷酸，其中該跨膜結構域為來自亨德拉病毒之異源跨膜結構域，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 361所示。
- 如請求項207或請求項208之多核苷酸，其中該跨膜結構域為經修飾跨膜結構域，該經修飾跨膜結構域含有胺基酸置換S490A、Y498A、S504A或I516V，對應於SEQ ID NO:1所示之位置的編號，視情況其中該跨膜結構域如SEQ ID NO: 359、360、362或363中之任一者所示。
- 如請求項207至209中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 268-272中之任一者所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO: 268-272中之任一者展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之序列。
- 一種多核苷酸，該多核苷酸包含編碼變異體尼帕病毒F醣蛋白(NiV-F)之核酸分子，該變異體NiV-F包含選自以下之超融合突變： 在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置64、67及/或99之N-糖基化位點處引入之突變；及/或 在相對於SEQ ID NO. 1之胺基酸位置393及/或109之六聚體穩定性位點處引入之突變。
- 如請求項211之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:247所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:247展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項211或請求項212之多核苷酸，其中該變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 247所示之胺基酸序列。
- 如請求項211至213中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO:292所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:292展現至少85%序列一致性、至少86%序列一致性、至少87%序列一致性、至少88%序列一致性、至少89%序列一致性、至少90%序列一致性、至少91%序列一致性、至少92%序列一致性、至少93%序列一致性、至少94%序列一致性、至少95%序列一致性、至少96%序列一致性、至少97%序列一致性、至少98%序列一致性或至少99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項211至214中任一項之多核苷酸，其中該經編碼之變異體NiV-F包含SEQ ID NO: 292所示之胺基酸序列。
- 如請求項171至215中任一項之多核苷酸，其中該核酸序列為第一核酸序列且該多核苷酸進一步包含編碼副黏液病毒融合(G)蛋白分子或其生物活性部分或其功能活性變異體之第二核酸序列。
- 如請求項216之多核苷酸，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。
- 如請求項216或請求項217之多核苷酸，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。
- 如請求項216至218中任一項之多核苷酸，其中該G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
- 如請求項216至219中任一項之多核苷酸，該多核苷酸展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。
- 如請求項220之多核苷酸，其中蛋白質之該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
- 如請求項220或請求項221之多核苷酸，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
- 如請求項216至222中任一項之多核苷酸，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項216至223中任一項之多核苷酸，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
- 如請求項216至224中任一項之多核苷酸，其中該G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。
- 如請求項225之多核苷酸，其中該結合結構域附接至該G蛋白之C端。
- 如請求項225或請求項226之多核苷酸，其中該細胞表面分子為蛋白質、聚醣、脂質或低分子量分子。
- 如請求項225至227中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：腫瘤浸潤淋巴細胞、T細胞、贅瘤細胞或腫瘤細胞、病毒感染之細胞、幹細胞、中樞神經系統(CNS)細胞、造血幹細胞(HSC)、肝細胞或完全分化之細胞。
- 如請求項225至228中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞係選自由以下組成之群：CD3+ T細胞、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、肝細胞、造血幹細胞、CD34+造血幹細胞、CD105+造血幹細胞、CD117+造血幹細胞、CD105+內皮細胞、B細胞、CD20+ B細胞、CD19+ B細胞、癌細胞、CD133+癌細胞、EpCAM+癌細胞、CD19+癌細胞、Her2/Neu+癌細胞、GluA2+神經元、GluA4+神經元、NKG2D+自然殺手細胞、SLC1A3+星狀細胞、SLC7A10+脂肪細胞、CD30+肺上皮細胞。
- 如請求項225至229中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞為肝細胞。
- 如請求項225至230中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域結合至選自由ASGR1、ASGR2及TM4SF組成之群的細胞表面分子。
- 如請求項225至229中任一項之多核苷酸，其中該靶細胞為T細胞。
- 如請求項225至229及232中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域結合至選自由CD3、CD4或CD8組成之群的細胞表面分子。
- 如請求項225至233中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域為抗體或抗原結合片段、單結構域抗體或DARPin。
- 如請求項225至234中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域為單結構域抗體，該單結構域抗體為VHH或為單鏈可變片段(scFv)。
- 如請求項225至235中任一項之多核苷酸，其中該結合結構域經由連接子附接至該G蛋白。
- 如請求項236之多核苷酸，其中該連接子為肽連接子。
- 如請求項237之多核苷酸，其中該肽連接子之長度為2至65個胺基酸。
- 如請求項237或請求項238之多核苷酸，其中該肽連接子為可撓性連接子，該可撓性連接子包含GS、GGS、GGGGS (SEQ ID NO:287)、GGGGGS (SEQ ID NO:288)或其組合。
- 如請求項237至239中任一項之多核苷酸，其中該肽連接子係選自：(GGS)n，其中n為1至10；(GGGGS)n (SEQ ID NO:289)，其中n為1至10；或(GGGGGS)n (SEQ ID NO:290)，其中n為1至6。
- 如請求項216至240中任一項之多核苷酸，其中該多核苷酸包含IRES或編碼該第一核酸序列與該第二核酸序列之間的連接肽之序列，視情況其中該連接肽為自裂解肽或引起核糖體跳躍之肽，視情況為T2A肽。
- 如請求項171至241中任一項之多核苷酸，該多核苷酸進一步包含至少一個操作性地連接之啟動子以控制該核酸之表現，視情況控制該第一核酸序列及該第二核酸序列之表現。
- 一種載體，該載體包含如請求項171至242中任一項之多核苷酸。
- 如請求項243之載體，其中該載體為哺乳動物載體、病毒載體或人工染色體，視情況其中該人工染色體為細菌人工染色體(BAC)。
- 一種質體，該質體包含如請求項171至242中任一項之多核苷酸。
- 如請求項245之質體，該質體進一步包含一或多種編碼用於慢病毒產生之蛋白質的核酸。
- 一種細胞，該細胞包含如請求項171至242中任一項之多核苷酸、或如請求項243或請求項244之載體、或如請求項245或246之質體。
- 一種製造包含變異體尼帕病毒F蛋白及視情況存在之副黏液病毒G蛋白之脂質粒子的方法，該方法包括： a) 提供包含如請求項171至242中任一項之多核苷酸、或如請求項243或請求項244之載體、或如請求項245或請求項246之質體的細胞； b) 在允許產生脂質粒子之條件下培養該細胞，及 c) 自該細胞中分離、富集或純化該脂質粒子，從而製造該脂質粒子。
- 一種製造假型慢病毒載體之方法，該方法包括： a) 提供包含慢病毒核酸及如請求項171至242中任一項之多核苷酸、或如請求項243或請求項244之載體、或如請求項245或請求項246之質體的生產細胞； b) 在允許產生該慢病毒載體之條件下培養該細胞，及 c) 自該細胞中分離、富集或純化該慢病毒載體，從而製造該假型慢病毒載體。
- 如請求項248或請求項249之方法，其中在步驟(b)之前，該方法進一步包括向該細胞提供編碼亨尼帕病毒F蛋白分子或其生物活性部分之多核苷酸。
- 如請求項248至250中任一項之方法，其中該細胞為哺乳動物細胞。
- 如請求項248至251中任一項之方法，其中該細胞為包含病毒核酸、視情況反轉錄病毒核酸或慢病毒核酸之生產細胞，且該脂質粒子為病毒粒子或病毒樣粒子，視情況為反轉錄病毒粒子或反轉錄病毒樣粒子，視情況為慢病毒粒子或慢病毒樣粒子。
- 一種生產細胞，該生產細胞包含如請求項171至242中任一項之多核苷酸、或如請求項243或請求項244之載體、或如請求項245或請求項246之質體。
- 如請求項253之生產細胞，該生產細胞進一步包含編碼副黏液病毒G蛋白或其生物活性部分之核酸。
- 如請求項254之生產細胞，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型尼帕病毒G (NiV-G)蛋白或亨德拉病毒G蛋白或為其功能活性變異體或生物活性部分。
- 如請求項254或請求項255之生產細胞，其中該G蛋白或其生物活性部分為野生型NiV-G蛋白或其功能活性變異體或生物活性部分。
- 如請求項254至256中任一項之生產細胞，其中該G蛋白為經截短之野生型NiV-G之生物活性部分，其中該G蛋白在SEQ ID NO:305所示之野生型NiV-G之N端處或附近缺乏至多34個連續胺基酸。
- 如請求項254至257中任一項之生產細胞，該生產細胞展現與Ephrin B2或Ephrin B3之結合減少。
- 如請求項258之生產細胞，其中該NiV-G為蛋白質功能活性變異體或其生物活性部分，其包含：一或多個對應於選自由E501A、W504A、Q530A及E533A組成之群的胺基酸取代之胺基酸取代，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
- 如請求項258或請求項259之生產細胞，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含胺基酸取代E501A、W504A、Q530A及E533A，參考SEQ ID NO:305所示之編號。
- 如請求項253至260中任一項之生產細胞，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列，或與SEQ ID NO:301具有至少80%或約80%、至少81%或約81%、至少82%或約82%、至少83%或約83%、84%或約84%、至少85%或約85%、至少86%或約86%、或至少87%或約87%、至少88%或約88%、或至少89%或約89%、至少90%或約90%、至少91%或約91%、至少92%或約92%、至少93%或約93%、至少94%或約94%、至少95%或約95%、96%或約96%、至少97%或約97%、至少98%或約98%、或至少99%或約99%序列一致性之胺基酸序列。
- 如請求項254至261中任一項之生產細胞，其中該NiV-G功能活性變異體或其生物活性部分包含SEQ ID NO: 301所示之胺基酸序列。
- 如請求項254至262中任一項之生產細胞，其中該G蛋白連接至結合結構域，該結合結構域結合至靶細胞上之靶細胞表面分子。
- 如請求項253至263中任一項之生產細胞，其中該細胞進一步包含病毒核酸，視情況其中該病毒核酸為慢病毒核酸。
- 一種脂質粒子或假型慢病毒載體，該脂質粒子或假型慢病毒載體係藉由如請求項244至248中任一項之方法或自如請求項253至264中任一項之生產細胞產生。
- 一種組合物，該組合物包含如請求項1至170及265中任一項之複數個脂質粒子或複數個慢病毒載體。
- 如請求項266之組合物，該組合物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
- 一種轉導細胞之方法，該方法包括用如請求項1至170及165中任一項之慢病毒載體或包含如請求項166或請求項167之慢病毒載體或複數個慢病毒載體之組合物轉導細胞。
- 一種將外源劑遞送至個體(例如，人類個體)之方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體、或包含如請求項1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體之組合物、或如請求項266或請求項267之包含慢病毒載體或複數個慢病毒載體之組合物，其中脂質粒子或慢病毒載體包含該外源劑。
- 一種將外源劑遞送至靶細胞之方法，該方法包括使靶細胞與如請求項1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體、或包含如請求項1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體之組合物、或如請求項266或請求項267之包含慢病毒載體或複數個慢病毒載體之組合物接觸，其中該脂質粒子或慢病毒載體包含該外源劑。
- 如請求項270之方法，其中該接觸用慢病毒載體或該脂質粒子轉導該細胞。
- 如請求項270或請求項271之方法，其中該接觸係在個體中活體內進行。
- 一種治療個體(例如，人類個體)之疾病或病症之方法，該方法包括向該個體投與如請求項中任一項之脂質粒子、或如請求項1至170及265中任一項之慢病毒載體、或如請求項266或請求項267之組合物。
- 一種將哺乳動物細胞與脂質粒子融合之方法，該方法包括向該個體投與如請求項1至170及265中任一項之脂質粒子或慢病毒載體或如請求項266或請求項267之組合物。
- 如請求項274之方法，其中該哺乳動物細胞與該脂質粒子之該融合將外源劑遞送至個體(例如，人類個體)。
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