KR102160061B1 - Bcma에 결합하는 키메릭 항원 수용체(car) 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 출원은 BCMA-결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 함유하는 BCMA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 키메릭 항원 수용체 (CAR)를 제공한다. 본 출원은 또한 BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는데 CAR의 적용을 제공한다.

Description

BCMA에 결합하는 키메릭 항원 수용체(CAR) 및 그의 용도
본 출원은 생물의학 분야, 특히 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 키메릭 항원 수용체에 관한 것이다.
CD269 또는 TNFRSF17로도 알려진 B-세포 성숙 항원 (B-cell maturation antigen: BCMA)은 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 수용체 패밀리의 구성원이다. BCMA가 B-세포 활성화 인자 수용체 (B-cell activating factor receptor: BAFF) 및 B-세포 증식 유도 리간드 (B-cell proliferation-inducing ligand: APRIL)와 결합하여 상이한 발달 단계에서 B 세포의 생존을 촉진 할 수 있음이 보고된 바 있다. 비정상적인 신호전달은 B 세포의 비정상적인 증식을 초래하여 자가 면역 질환(autoimmune diseases) 및 종양형성(tumorigenesis)을 초래할 수 있다 (Rickert, et al., Immunological Reviews, 2011, Vol. 244 : 115-133 참조).
키메릭 항원 수용체 (CAR)는 인간 백혈구 항원-비의존적 방식으로 세포 표면 항원을 식별하도록 설계된 항원 수용체이다. CAR-발현 T 세포 (CAR-T)로 환자를 치료하려는 시도는 일부 진전이 있었다 (Molecular Therapy, 2010, 18 : 4, 666-668; Blood, 2008, 112 : 2261-2271).
B-세포 악성 종양(B-cell malignancies), 특히 다발성 골수종(multiple myelomas)에서 치료 표적으로서 사용되는 BCMA의 효과를 고려할 때, BCMA에 작용함으로써 치료 목표를 달성하기 위한 새로운 세포 치료법을 개발하는 것이 당업계에서 시급하다.
본 출원은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 키메릭 항원 수용체 및 그의 적용을 제공한다. 본 출원에서 제공되는 BCMA 키메릭 항원 수용체는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: 1) BCMA 단백질에 대한 높은 친화력; 2) CAR로 제조된 CAR-T 세포에서 안정적으로 발현될 수 있는 CAR; 3) CAR로 제조된 CAR-T 세포에서 더 높은 CAR 양성 속도; 4) CAR에 의해 촉진되는 사이토카인의 방출; 5) BCMA의 발현과 관련된 질병 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
일 관점에서, 본 출원은 BCMA-결합 도메인, 막관통 도메인(transmembrane domain), 공동자극 도메인(costimulatory domain) 및 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로, 상기 BCMA-결합 도메인은 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(heavy chain complementary determining region 1: HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(heavy chain complementary determining region 2: HCDR2) 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(heavy chain complementary determining region 3: HCDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체를 제공한다.
일부 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(light chain complementary determining region 1: LCDR1), 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(light chain complementary determining region 2: LCDR2) 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(light chain complementary determining region 3: LCDR3)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변영역(heavy chain cariable region)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 15의 경쇄가변영역(light chain variable region)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 단일쇄(single-chain) 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)의 막관통 도메인(transmembrane domain)은 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄(chain), CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성되는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 막관통 도메인(transmembrane domain)은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)의 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성되는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래된 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 서열번호 29 또는 31의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)의 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)은 CD3ζ에서 유래된 신호전달 도메인(signal transduction domain)을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 BCMA-결합 도메인을 막관통 도메인(transmembrane domain)에 연결하는 힌지 부위(hinge region)를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 힌지 부위(hinge region)는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 또한 신호(signal) 펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 신호(signal) 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 또한 절단(cleaving) 펩타이드에 연결된다. 일부 구현예에서, 상기 절단(cleaving) 펩타이드는 T2A 펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 절단(cleaving) 펩타이드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 서열번호 49 또는 51의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 관점에서, 본 출원은 추가로 본 출원의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 관점에서, 본 출원은 또한 서열번호 50 또는 52의 핵산서열을 포함하는 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.
다른 관점에서, 본 출원은 또한 본 출원의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid), 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터에서 선택된다.
다른 관점에서, 본 출원은 또한 본 출원의 키메릭 항원 수용체(CAR), 핵산 분자 또는 벡터를 함유하는 면역 효과기 세포(immune effector cell)를 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 면역 효과기 세포(immune effector cell)는 T 림프구 및 자연 살해 (natural killer: NK) 세포에서 선택된다.
다른 관점에서, 본 출원은 또한 본 출원의 벡터를 면역 효과기 세포(immune effector cell) 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역 효과기 세포(immune effector cell)의 제조방법을 제공한다.
다른 관점에서, 본 출원은 본 출원의 면역 효과기 세포(immune effector cell)를 함유하는 조성물을 추가로 제공한다.
다른 관점에서, 본 출원은 BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는 데 사용되는 약물의 제조에 있어서, 키메릭 항원 수용체(CAR), 핵산 분자, 벡터 또는 면역 효과기 세포(immune effector cell)의 용도를 추가로 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태는 암 또는 악성 종양이다.
본 출원의 다른 관점 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 본 출원의 예시적인 실시예는 다음의 상세한 설명에서 도시되고 설명된다. 본 출원의 내용은 해당 기술 분야 당업자에 의해 실현될 수 있는 바와 같이, 본 출원과 관련된 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 개시된 특정 실시예를 수정할 수 있게 한다. 따라서, 본 출원의 도면 및 명세서의 설명은 단지 예시적인 것이며 제한적인 것이 아니다.
도 1A는 본 출원의 CAR의 구조를 도시한다.
도 1B는 GFP 신호의 평가를 통한 본 출원의 CAR의 발현 수준을 나타낸다.
도 2A는 본 출원의 CAR 플라스미드로 T 세포를 일시적으로 형질 감염시키는 과정의 개략도를 도시한다.
도 2B는 본 출원의 CAR 플라스미드로 일시적으로 형질 감염된 T 세포에서의 CAR 분자의 발현을 나타낸다.
도 3은 본 출원의 CAR 플라스미드로 일시적으로 형질 감염된 T 세포에서의 CAR 분자의 발현을 보여준다.
도 4는 렌티바이러스(lentivirus)로 포장된(packed) 본 출원의 CAR 플라스미드에 대한 생물학적 역가 검정의 결과를 보여준다.
도 5는 본 출원의 CAR-T 세포의 성장을 보여준다.
도 6은 본 출원의 CAR-T 세포의 CAR 분자가 BCMA 단백질과 결합하는 능력의 결과를 보여준다.
도 7은 본 출원의 CAR-T 세포에 대한 CD107a 탈과립 시험의 FACS 분석 결과를 보여준다.
도 8은 본 출원의 CAR-T 세포를 상이한 표적 세포와 배양 한 후 수득 된 CD107a 탈과립 시험의 결과를 보여준다.
도 9는 본 발명의 CAR-T 세포를 BCMA 단백질 경쟁 조건 하에서 상이한 표적 세포와 배양한 후 수득된 CD107a 탈과립 시험의 결과를 보여준다.
도 10은 본 출원의 CAR-T 세포를 표적 세포와 함께 인큐베이션한 후 수득 된 사이토카인-방출 분석의 결과를 보여준다.
도 11은 본 출원의 상이한 공여자로부터의 CAR-T 세포의 기능 분석 결과를 보여준다.
도 12는 본 출원의 CAR-T 세포의 표적 세포에 대한 시험 관내 사멸 효과를 보여준다.
도 13은 본 출원의 CAR-T 세포의 종양 사멸 효과에 대한 종양 보유 마우스 모델 실험의 결과를 보여준다.
도 14 및 도 15는 본 출원의 CAR-T 세포로 투여된 종양 보유 마우스 모델에서 사이토 카인의 변화를 보여준다.
도 16은 본 출원의 CAR-T 세포와 함께 투여된 종양 보유 마우스의 말초 혈액에서 CAR 카피 수(copy numbers)의 변화를 도시한다.
도 17은 본 출원의 CAR-T 세포의 치료 효과에 대한 평가가 필요한 대상체의 신체에 대한 평가를 보여준다.
도 18은 본 출원의 대상체의 생체 내 말초 혈액에서의 CAR 카피 수(copy numbers)의 변화를 나타낸다.
이하, 본 출원의 본 발명의 실시예가 특정 예를 통해 설명될 것이다. 당업자는 본 명세서의 개시로부터 본 출원 발명의 다른 장점 및 효과를 쉽게 이해할 수 있다. 본 출원의 CAR는 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있고, CAR로 제조된 CAR-T 세포는 CAR는 안정적으로 발현할 수 있으며, CAR로 제조된 CAR-T 세포는 더 높은 CAR 양성 속도를 갖는다. 또한, CAR는 사이토카인의 방출을 촉진할 수 있고, BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는데 사용될 수 있다.
당업계의 기술 내에서 통상적인 화학, 생화학, 유기 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 기술, 유전학, 면역학 및 세포 생물학의 방법은 달리 명시되지 않는 한 본 출원을 구현하기 위해 채택된다. 이러한 방법에 대한 설명은 예를 들어 Sambrook 등의 Molecular Cloning에서 찾을 수 있다: 실험실 매뉴얼 (2001 년 제 3 판); Sambrook, 등, Molecular Cloning : 실험실 매뉴얼 (2nd Edition, 1989); Maniatis 등, Molecular Cloning : 실험실 매뉴얼 (1982); Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 2008 년 7 월에 업데이트 됨); 분자 생물학의 짧은 프로토콜 : 분자 생물학, Greene Pub.Associates 및 Wiley-Interscience의 현재 프로토콜로부터의 방법의 개요 Glover, DNA Cloning : 실용적 접근, vol.I & II (IRL Press, Oxford, 1985); Anand, 복잡한 게놈 분석 기법, (Academic Press, New York, 1992); 전사 및 번역 (B.Hames & S.Higgins, Eds., 1984); Perbal, 분자 클로닝에 대한 실용 가이드 (1984); Harlow and Lane, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1998) 면역학의 현재 프로토콜 Q.E. Coligan, A.M.Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M.Shevach and W.Strober, eds., 1991); 면역학의 연례 검토; 면역학의 발전과 같은 정기 간행물 및 논문.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어의 의미는 당업자가 일반적으로 이해하는 것과 동일하다. 본 출원의 목적상, 다음의 용어가 정의된다.
본 출원에서, 용어 "키메릭 항원 수용체 (CAR)"는 일반적으로 항원 및 하나 이상의 세포 내 도메인과 결합하는 능력을 갖는 세포 외 도메인을 함유하는 융합 단백질을 지칭한다. CAR는 키메릭 항원 수용체 T 세포 (CAR-T)의 핵심 부분이며, 항원 (예를 들어, 종양 관련 항원 (TAA)) 결합 도메인, 막 관통 도메인, 공동 자극 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 본 출원에서, CAR는 항체의 항원 (예를 들어 BCMA) 특이성에 기초하여 T 세포 수용체-활성화 세포 내 도메인과 조합될 수 있다. 유전자가 변형된 CAR-발현 T 세포는 표적 항원-발현 악성 세포를 특이적으로 식별하고 제거할 수 있다. CAR 및 CAR-T 세포의 설명은, 예를 들어 Sadelain M, Brentjens R, Rivi`ere I에서 찾을 수 있다. 키메릭 항원 수용체 디자인의 기본 원리. 암 Discov. 2013; 3 (4) : 388-398; 거북이 CJ, Hudecek M, Jensen MC, Riddell SR. 항암 요법을 위한 조작된 T 세포. Curr Opin Immunol. 2012; 24 (5) : 633-639; Dotti G, Gottschalk S, Savoldo B, Brenner MK. 키메라 항원 수용체-발현 T 세포를 사용한 요법의 설계 및 개발. Immunol Rev. 2014; 257 (1) : 107-126; WO2013154760 및 WO2016014789.
본 출원에서, 용어 "BCMA"및 "B-세포 성숙 항원"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 일반적으로 TNFRSF17 유전자에 의해 암호화된 단백질을 지칭한다. BCMA 단백질은 종양 괴사 인자 수용체 패밀리의 구성원이다. 본 출원에서, BCMA는 GenBank 수탁 번호가 BAB60895.1 인 인간 BCMA 일 수 있다. BCMA는 III 형 막 관통 단백질이며, 세포 외 도메인 (ECD)은 리간드-결합 모티프를 형성하는 TNFR 패밀리의 구성원을 특징으로 하는 시스테인-풍부 도메인 (CRD)을 보유한다. B-세포 바이오 마커로서, BCMA는 종양 세포 (예컨대, 다발성 골수종 세포)에서 발현되거나 또는 종양 세포 (예를 들어, 다발성 골수종의 악성 형질 세포) 표면에 위치된다. 또한, BCMA 단백질은 본 출원의 임의의 항체와 결합할 수 있는 BCMA의 단편, 예컨대 세포 외 도메인 및 그의 단편, 예컨대 결합 도메인, 막 통과 도메인, 공동 자극 도메인, 세포 내 신호전달 도메인 및 단편을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "BCMA-결합 도메인(BCMA-binding domain)"은 일반적으로 BCMA 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 도메인을 지칭한다. 예를 들어, BCMA-결합 도메인은 B 세포 또는 이의 단편에서 발현 된 인간 BCMA 폴리펩타이드 및 항-BCMA 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 특이적으로 결합할 수 있는 키메라 항원 수용체를 함유할 수 있다. 본 출원에 사용된 용어 "결합 도메인(binding domain)", "세포 외 도메인(extracellular domain)", "세포 외 결합 도메인(extracellular binding domain)", "항원-특이적 결합 도메인(antigen-specific binding domain)" 및 "세포 외 항원-특이적 결합 도메인(extracellular antigen-specific biding domain)"은 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 표적 항원 (예를 들어 BCMA)에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 CAR 도메인 또는 단편을 지칭한다. BCMA-결합 도메인은 천연 공급원, 합성 공급원, 반합성 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "항체(antibody)"는 일반적으로 특정 항원을 특이적으로 확인 및/또는 중화시키는 능력을 갖는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항체는 디설파이드(disulfide) 결합을 통해 서로 연결된 2 개 이상의 중쇄 (H) 및 2 개의 경쇄 (L)로 구성된 면역 글로불린을 포함할 수 있으며, 이의 항원 결합 부위를 함유하는 임의의 분자를 포함한다. 용어 "항체"는 인간 항체, 인간화 항체, 키메릭 항체, 단일 도메인 항체 (예: dAb), 단일 사슬 항체 (예: scFv) 및 항원 결합 항체 단편 (예: Fab, Fab '및 (Fab)) 2 개 조각)을 포함하지만 이에 국한되지 않는 단일 클론 항체, 항체 단편 또는 항체 유도체를 포함한다. 용어 "항체"는 추가로 원핵 세포에서 발현된 항체, 당화되지 않은 항체, 및 임의의 항원-결합 항체 단편 및 이의 유도체와 같은 모든 재조합 형태의 항체를 포함한다. 각각의 중쇄(heavy chain)는 중쇄가변영역 (heavy chain variable region: VH) 및 중쇄불변영역(heavy chain constant region)으로 구성될 수 있다. 각각의 경쇄(light chain)는 경쇄가변영역 (light chain variable region: VL) 및 경쇄불변영역(light chain constant region)으로 구성될 수 있다. VH 및 VL은 프레임 워크 영역 (framework regions: FR)으로 알려진 보다 보존된 영역에 흩어져있는 CDR(complementary determining regions)로 알려진 초 가변 영역(hypervariable regions)으로 추가로 분할될 수 있다. VH 및 VL 각각은 3 개의 CDR 및 4 개의 FR로 구성될 수 있으며, 이는 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4의 순서에 따라 아미노 말단에서 카르복실 말단으로 배열될 수 있다. 항원과 상호 작용하는 결합 도메인은 중쇄(heavy chains) 및 경쇄(light chains)의 가변 영역(variable regions)에 포함된다. 항체의 불변 영역(Constant regions)은 숙주 조직(host tissue)에 대한 면역글로불린의 결합 또는 면역계의 다양한 세포 (효과기(effector) 세포와 같은) 및 고전적 보체 시스템의 제 1 성분 (Clq)을 포함하는 인자를 매개할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "항원-결합 분자(antigen-binding molecule)"는 일반적으로 표적 항원과 결합할 수 있는 항원-결합 영역 또는 항원-결합 부분을 함유하는 분자를 지칭한다. 예를 들어, 항원-결합 분자는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 본 출원에서, 표적 항원이 B-세포 성숙 항원 (BCMA)이면, BCMA와 결합할 수 있는 항원 결합 분자는 BCMA 결합 분자로도 불린다. 항원-결합 분자는 예를 들어 항체 및 이의 항원-결합 단편, scFv(예컨대 scFv-Fc 항체, 면역 접합체, 항체-약물 접합체 (ADC), 다중 특이적/이중 특이적 항체 및 키메릭 항원 수용체 (CAR))를 기반으로 구성된 다양한 융합 및 접합체와 같은 단일 쇄 scFv 항체를 포함한다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 항체의 항원-결합 부분은 일반적으로 "상보적 결정 영역(complementary determining regions)" 또는 "CDR"로부터의 아미노산 잔기를 함유한다. 일부 경우에, "BCMA-결합 분자" 및 "본 출원의 항체"또는 "항-BCMA 항체"는 상황에 따라 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "단일 사슬 항체 단편(single-chain antibody fragment)"은 C-펩타이드를 통해 연결된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에 의해 형성된 항체일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "막 통과 도메인(transmembrane domain)"은 일반적으로 세포막을 통과하고 세포 내 신호전달 도메인에 연결되어 신호전달의 역할을 하는 CAR의 도메인을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "공 자극 도메인(costimulatory domain)"은 일반적으로 림프구의 항원에 대한 효과적인 반응에 필요한 세포 표면 분자인 면역 자극 분자를 제공할 수 있는 세포 내 도메인을 지칭한다. 상기 기재된 공동 자극 도메인(costimulatory domain)은 CD28의 공동 자극 도메인을 포함할 수 있고, OX40 및 4-1BB의 공동 자극 도메인과 같은 TNF 수용체 패밀리의 공동 자극 도메인을 포함할 수 도있다.
본 출원에서, 용어 "힌지 부위(hinge region)"는 일반적으로 항원-결합 영역과 면역 세포 Fc 수용체 (FcR)-결합 영역 사이의 연결 영역을 지칭한다.
본 출원에서, 용어 "HA-태그(tag)"는 일반적으로 인간 인플루엔자 헤마글 루티닌(hemagglutinin) 항원에 기초한 단백질 태그(tag)를 지칭하고, 그의 화학적 성질은 인간 인플루엔자 헤마글루티닌(hemagglutinin) 아미노산 98-106으로부터 유래 된 짧은 아미노산 서열이다. HA-태그(tag) 서열을 표적 단백질의 한 말단에 결합시키기 위해 분자 생물학 방법을 채택한 후, 항-HA-태그(tag) 특이적 항체를 사용하여 재조합 단백질과 결합시킬 수 있으며, 이는 면역 조직 화학 (IHC), 웨스턴 블로 팅 (Western Blotting) 등과 같은 실험 수행에 유리하다 (Schembri, Laura 등, HA 태그가 절단되어 세포 자멸사 동안 면역 반응성을 상실 함) Nature Methods. 2007 년 2 월, 4 (2) ) : 107-108).
본 출원에서, 용어 "세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)"은 일반적으로 세포 내부에 위치하고 신호를 전달할 수 있는 도메인을 지칭한다. 본 출원에서, 세포 내 신호전달 도메인은 신호를 세포 내로 전달할 수 있다. 예를 들어, 세포 내 신호전달 도메인은 키메라 항원 수용체의 세포 내 신호전달 도메인이다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 세포 내 신호전달 도메인은 CD3ζ 세포 내 도메인, CD28 세포 내 도메인, CD28 세포 내 도메인, 4-1BB 세포 내 도메인 및 OX40 세포 내 도메인으로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "신호 펩타이드(signal peptide)"는 일반적으로 단백질 전달을 안내하기 위한 펩타이드 사슬을 지칭한다. 일부 실시 양태에서, 신호 펩타이드는 5 내지 30 개의 아미노산 길이를 갖는 짧은 펩타이드 쇄일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "절단 펩타이드(cleaving peptide)"는 단백질 절단 기능을 구현할 수 있는 폴리펩타이드의 유형을 지칭한다. 예를 들어, 절단 펩타이드는 단백질 분해 효소 가수 분해보다는 리보솜 스키핑(ribosome skipping)에 의해 단백질 절단을 달성할 수 있다. 예를 들어, 상기 절단 펩타이드는 T2A, F2A, P2A 등을 포함할 수 있는 2A 펩타이드를 절단할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "마커 검출 신호(marker detection signal)"는 일반적으로 특정 마커의 역할을 수행하고 검출 가능한 신호를 방출할 수 있는 공지된 기능 및 서열을 갖는 유전자, 단백질 또는 다른 분자를 지칭한다. 마커 검출 신호는 GFP, RFP, YFP 등과 같은 형광 단백질일 수 있다. 상기 마커 검출 신호는 EGFRt일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "EGFRt"는 일반적으로 절단된 인간 표피 성장 인자 수용체 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자를 지칭한다. EGFRt는 막-말단 EGF-결합 도메인 및 세포질 신호전달 꼬리(tail)가 부족하지만, 항-EGFR 항체에 의해 확인된 세포 외 에피토프를 유지한다. EGFRt는 유전자 변형 세포 및 추적 마커의 기능을 가진 비 면역 원성 선택 도구로 사용될 수 있다. 본 출원에서, EGFRt는 CAR-T 세포에 대한 마커 분자로서 기능할 수 있다. 상기 EGFRt는 필요한 경우 신체의 CAR-T 세포에 대한 세툭시 맙-매개(cetuximab-mediated) ADCC 경로를 제거할 수 있다 (US8802374B2 참조).
본 출원에서, 용어 "코작 서열(Kozak sequence)"은 일반적으로 진핵 생물의 mRNA에서 공통적인 (gcc) gccRccAUGG 서열을 지칭한다. 코작 서열은 번역 과정을 개시하는데 중요한 역할을하며, 리보솜에 의해 번역 개시 부위로 확인된다 (코작 서열에서 첫 번째인 신규 사이런트 베타-탈라사미아 돌연변이(novel silent beta-thalassaemia mutation), De Angioletti M 등 참조) Br J Haematol. 2004, 124 (2) : 224-31.).
본 출원에서, 용어 "분리된(isolated)"은 일반적으로 항체가 자연 환경에서 이의 성분으로부터 분리되었음을 의미한다. 일부 실시 양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (SDS-PAGE, 등전점 전기영동 (isoelectric focusing: IEF) 또는 모세관 전기영동법(capillary electrophoresis)과 같은)과 크로마토그래피 (이온 교환 또는 역상 HPLC와 같은)에 의해 결정되는 95 % 또는 99 % 이상의 순도를 갖도록 정제된다. 항체 순도를 평가하는 방법의 개요는 Flatman, S. 등, J.Chrom.B 848 (2007) 79-87에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, 용어 "핵산 분자(nucleic acid molecule)"는 일반적으로 임의의 길이로 분리된 뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드, 또는 그의 유사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, 본 출원의 핵산 분자는 자연 환경으로부터 분리될 수 있다: (1) 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동 분리와 같은 정제; (4) 화학 합성과 같은 합성. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다. 본 출원에서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하기 위한 핵산은 합성 올리고뉴클레오티드의 제한 단편 조작(restriction fragment operation) 또는 SOE PCR의 적용을 포함하지만 이에 제한하지 않고, 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 제조될 수 있다. 구체적인 적용은 Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; and Ausube, et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing 및 Wiley-Interscience, New York N.Y., 1993에서 찾을 수 있다.
본 출원에서, "벡터"는 일반적으로 적합한 숙주에서 자가-복제될 수 있는 핵산 분자를 지칭하고, 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 및/또는 숙주 세포 사이의 세포 간 물질로 전달하는데 사용된다. 벡터는 세포 내로 DNA 또는 RNA를 삽입하는데 주로 사용되는 벡터, DNA 또는 RNA를 복제하는데 주로 사용되는 벡터, 및 DNA 또는 RNA의 전사 및/또는 번역의 발현에 주로 사용되는 벡터를 포함할 수 있다. 벡터는 앞서 언급한 다양한 기능을 갖는 벡터를 추가로 포함한다. 벡터는 적합한 숙주 세포로 도입될 때 폴리펩타이드로 전사되고 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드일 수 있다. 일반적으로, 벡터를 함유하는 적합한 숙주 세포가 배양될 때, 이들 벡터는 바람직한 발현 생성물을 생성할 수 있다. 본 출원에서, 벡터는 하나 이상 유형의 핵산 분자를 함유할 수 있다. 또한, 벡터는 다른 유전자, 예를 들어 벡터가 적합한 숙주 세포에서 및 적절한 조건 하에서 선택될 수 있게하는 마커 유전자를 함유 할 수 있다. 또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게하는 발현 조절 요소를 함유할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터(promoter), 리보솜-결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 조절 서열은 조절 가능한 요소이다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5 '비-전사 서열 및 5'및 3 '비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5 '비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 본 출원의 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터로부터 선택될 수 있다. 본 출원의 플라스미드, 레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터는 CAR를 함유할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "플라스미드(plasmid)"는 일반적으로 박테리아, 사카로미케스강(saccharomycetes) 등과 같은 유기체에서 염색체 또는 뉴클레오티드 이외의 DNA 분자를 지칭한다. 세포질에 존재할 수 있는 플라스미드는 자기 복제 능력을 가지므로, 그에 대한 일정한 카피 수는 자손 세포에 유지될 수 있고 운반된 유전 정보가 발현될 수 있다. 플라스미드는 유전자 공학 연구에서 유전자의 벡터로 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "레트로바이러스 벡터(retroviral vector)"는 일반적으로 외인성 유전자를 클로닝 및 발현할 수 있지만 증식 능력을 갖기 위해 자체 포장될 수 없는 비리온(virion)을 지칭한다. 이러한 바이러스의 대부분에는 역전사 효소가 있다. 레트로바이러스는 최소한 세 가지 유형의 유전자로 구성된다: 바이러스 코어 및 구조를 형성하는 단백질 유전자를 포함한 gag; 역전사 효소를 위한 유전자를 포함하는 pol 및 유전자 형성 바이러스 코트를 포함하는 env. 레트로바이러스 벡터 자체의 게놈 및 그에 의해 운반되는 외인성 유전자는 레트로바이러스 형질 감염을 통해 숙주 세포의 게놈에 랜덤하고 안정적으로 통합될 수 있으며, 예를 들어 CAR 분자는 숙주 세포 내로 통합될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "렌티바이러스 벡터(lentiviral vector)"는 일반적으로 레트로바이러스에 속하는 이배체(diploid) RNA 바이러스 벡터를 지칭한다. 렌티바이러스 벡터는 게놈에 생물학적 안전성을 제공하기 위해 렌티바이러스의 게놈에서 다수의 바이러스 활성-관련 서열 구조를 제거하고, 이 게놈 프레임워크(genome framework)에 실험에 필요한 표적 신사의 서열 및 발현 구조를 도입함으로써 제조된 벡터이다. 레트로바이러스 벡터 자체의 게놈 및 그에 의해 운반되는 외인성 유전자는 렌티바이러스 벡터 형질 감염을 통해 숙주 세포의 게놈에 무작위로 안정적으로 통합될 수 있으며, 예를 들어 CAR 분자는 숙주 세포 내로 통합될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "전이인자(transposon)"는 일반적으로 전위효소(transposase) 유전자를 함유하는 개별 DNA 단편을 지칭한다. 플랭킹(flanking) 서열은 전이효소-결합 부위를 함유하는 TIR (Terminal Inverted Repeats)이다. 전이효소는 TIR과 결합하여 전이인자를 새로운 부위로 옮길 수 있다. 본 출원의 전이이자는 CAR-운반 플라스미드 (전이인자) 및 전이효소-운반 플라스미드로 구성된 이중 성분 시스템이다. 전이인자는 전기 형질도입(electric transduction) 또는 다른 방법에 의해 표적 세포로 도입될 수 있다. 예를 들어 두 성분은 먼저 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로 전기 천공(electroporated )되고, CAR (전이인자)을 절단한 다음 표적 세포 (예를 들어 T 세포)의 게놈에서 TA 디뉴클레오티드 서열에 통합시키기 위하여, 발현된 전이효소는 CAR의 양쪽에서 말단 반전 반복 (terminal inverted repeats: TIR)에 작용한다. 전위(transposition) 및 안정적인 게놈 통합이 완료된 후, CAR 단백질은 표적 세포의 표면에서 발현 될 수있다 (Cheng Zhang, Jun Liu, Jiang F Zhong, et al. Engineering CAR-T 세포 참조. Biomarker Research. 2017, 5:22).
본 출원에서, 용어 "유전자 편집(gene editing)"은 일반적으로 표적화된 게놈의 부위 지향적 변형을 위한 기술을 지칭한다. 유전자 편집에는 징크 핑거 뉴클레아제 (zinc finger nucleases: ZFN), 탈렌 (transcription activator like effector nucleases: TALEN)와 크리스퍼(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/CRISPR 관련(Cas9, CRISPR/Cas9) 등과 같은 전사활성화인자(transcription activator)를 기반으로 하는 기술이 포함될 수 있다. 유전자 편집은 게놈의 특정 위치에서 유전자 물질을 추가, 제거 또는 변경함으로써 게놈에 대해 매우 효율적인 표적 변형을 달성할 수 있다. 본 출원의 유전자 편집은 유전자 편집 기술 (예컨대 CRISPR-Cas9)에 의해 CAR 분자를 수용자 세포의 게놈 내로 도입하는 것을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 용어 "면역 효과기 세포(immune effector cell)"는 일반적으로 외래 항원을 제거하고 면역 반응에서 효과기 기능을 수행하는 데 관여하는 면역 세포를 지칭한다. 예를 들어, 일부 실시 양태에서, 면역 효과기 세포는 세포질, 세포 독성 T 세포, NK 세포, APSC다능성(pluripotent) 세포, 비만 세포 등일 수 있다.
본 출원에서, 용어 "약학적으로 허용되는 보조제(pharmaceutically acceptable adjuvant)"는 일반적으로 제조 특성을 향상시키기 위한 약학적으로 허용되는 제제 벡터, 용액 또는 첨가제를 지칭한다. 이러한 첨가제는 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 출원에서, 용어 "암(cancer)"은 일반적으로 세포 증식을 제어하기위한 메커니즘의 이상에 의해 야기되는 질병을 지칭한다. 본 출원에서, 암으로 알려진 과증식성(hyperproliferative) 질환은 유방, 호흡기, 뇌, 생식 기관, 소화관, 요도, 눈, 간, 피부, 머리 및 목, 갑상선에서 발생하는 암과 이의 원격전이(distant metastases)와 같은 고형 종양을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 이러한 질병에는 림프종, 육종 및 백혈병이 포함된다. 유방암의 예는 침윤성 유관암(invasive ductal carcinoma), 침윤성 소엽암(invasive lobular carcinoma), 관상피내암(ductal carcinoma in situ: DCIS) 및 소엽성 상피내암(lobular carcinoma in situ" LCIS)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 호흡기 암의 예는 소세포 폐암(small cell lung cancer), 비소세포폐암(non-small cell lung cancer), 기관지 선종(bronchial adenoma) 및 가슴막폐모세포종(pleuropulmonary blastoma)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 뇌암의 예는 뇌 줄기(brain stem) 및 시신경교종(hypothalamic gliomas), 소뇌(cerebellar) 및 뇌성 성상 세포종(cerebral astrocytomas), 수모세포종(medulloblastoma), 뇌실막세포종(ependymoma) 및 신경 외배엽(neuroectodermal) 및 송과치종양(pineal tumors)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 남성 생식기 신생물(neoplasms)에는 전립선 암 및 고환암이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 여성 생식기 신생물은 자궁내막암(endometrial cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 난소암(ovarian cancer), 질암(vaginal cancer), 외음부암(vulvar cancer) 및 자궁암(hysteroma)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 위장관 종양에는 항문암(anal cancer), 결장암(colon cancer), 대장암(colorectal cancer), 식도암(esophageal cancer), 담낭암(gallbladder cancer), 위암(stomach cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 직장암(rectal cancer), 소장암(small intestine cancer) 및 침샘암(salivary gland cancer)이 포함 되나 이에 제한되지 않는다. 요도 종양에는 방광암(bladder cancer), 음경암(penile cancer), 신장암종(renal carcinoma), 신장 골반 암(renal pelvic carcinoma), 요관암(ureteral cancer) 및 요도암(urethral cancer)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 안암에는 안내 흑색 종(intraocular melanoma) 및 망막모세포종(retinoblastoma)이 포함 되나 이에 제한되지는 않는다. 간암의 예는 간세포 암종 (섬유 모세포 변이를 갖거나 갖지 않는 간세포 암종), 담관암 (염내 담관암) 및 복합 간세포 담관암 종을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 피부암은 편평상피암(squamous-cell carcinoma), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 악성 흑색종(malignant melanoma), 머켈세포암종(Merkel cell carcinoma) 및 비흑색종 피부암(non-melanoma skin cancers)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 두 경부암은 후두(laryngeal)/하인두(hypopharyngeal)/비인두암(nasopharyngeal)/구강인두(oropharyngeal) 암종뿐만 아니라 입술 및 구강암을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 림프종은 AIDS- 관련 림프종, 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 피부 T-세포 림프종(cutaneous T-cell lymphoma), 호지킨병(Hodgkin's disease) 및 중추신경계 림프종(central nervous system lymphoma)을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 육종에는 연조직육종(soft tissue sarcoma), 골육종(osteosarcoma), 악성섬유성 조직 구종(malignant fibrous histiocytoma), 림프육종(lymphosarcoma) 및 횡문근육종(rhabdomyosarcoma)이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 백혈병에는 급성골수성백혈병(acute myeloid leukemia), 급성림프구성백혈병(acute lymphocytic leukemia), 만성림프구성백혈병(chronic lymphocytic leukemia), 만성골수성백혈병(chronic myelocytic leukemia) 및 털세포백혈병(hairy cell leukemia)이 포함 되나 이에 제한되지 않는다.
"및/또는(and/or)"이라는 용어는 선택사항 중 하나 또는 선택사항 둘 다로서 이해되어야 한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "포함하다(comprise)" 또는 "포함하다(include)"는 설명된 요소, 정수(integers) 또는 단계를 포함하도록 의도되지만 다른 요소, 정수 또는 단계를 배제하지는 않는다. 본 출원에서, 용어 "포함하다(comprise)"또는 "포함하다(include)"가 사용될 때, 달리 명시되지 않는 한, 요소, 정수 또는 단계로 구성된 경우를 포함한다. 예를 들어, 특정 서열의 항체 가변 영역을 "포함하는" 것과 관련하여, 특정 서열로 구성된 항체 가변 영역을 포함하는 것으로 의도된다.
본 출원에서, "약(about)"이라는 용어는 일반적으로 특정 값의 위 또는 아래에서 0.5 % -10 % 범위 내의 변화를 지칭하고, 예를 들어 0.5 %, 1 %, 1.5 %, 2 %, 2.5 %, 3 %, 3.5 %, 4 %, 4.5 %, 5 %, 5.5 %, 6 %, 6.5 %, 7 %, 7.5 % 범위 내의 변동 , 8 %, 8.5 %, 9 %, 9.5 % 또는 10 %가 지정된 값보다 높거나 낮다.
키메릭 항원 수용체
본 출원에서, CAR는 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 세포 외 도메인(extracellular domain), 막관통 도메인(transmembrane domain), 세포 내 공동자극 도메인(costimulatory domain) 및 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 함유할 수 있다. 본 출원에서, CAR의 세포 외 도메인은 본 출원의 단일쇄 항체 단편 (scFv)을 함유할 수 있다. 예를 들어, 단일쇄 항체 단편은 힌지(hinge) 영역 (예컨대, CD8 힌지)을 통해 막관통 도메인(transmembrane domain)에 연결될 수 있다. 본 출원에서, CAR는 면역 효과기 세포 (예를 들어 T 세포)를 형질도입하는데 사용될 수 있고, 세포 표면에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 출원은 또한 키메릭 항원 수용체를 발현하는 T 세포뿐만 아니라 B-세포 관련 질환을 치료하기위한 약물의 제조에서 T 세포 및/또는 CAR의 용도를 제공할 수 있다.
본 출원에서, 키메릭 항원 수용체 (CAR)는 BCMA-결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 함유할 수 있다.
본 출원에서, CMA-결합 도메인은 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함하며, 상기 항체는 서열번호 9 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(heavy chain complementary determining region 1: HCDR1), 중쇄 CDR2(heavy chain complementary determining region 2: HCDR2) 및 중쇄 CDR3(heavy chain complementary determining region 3: HCDR3); 상기 항체는 서열번호 17 내지 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(light chain complementary determining region 1: LCDR1), 경쇄 CDR2(light chain complementary determining region 2: LCDR2) 및 경쇄 CDR3(light chain complementary determining region 3: LCDR3)을 포함한다. 본 출원에서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain cariable region)을 포함한다. 본 출원에서, 상기 항체는 서열번호 15의 경쇄 가변 영역(light chain variable region)을 포함한다.
본 출원에서, 상기 항체는 단일쇄(single-chain) 항체 단편이다. 일부 구현예에서, 상기 항체는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 상기 단일쇄 항체 단편은 서열번호 43의 서열을 갖는 scFv0026을 포함할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 단일쇄 항체 단편은 서열번호 43의 서열을 갖는 scFv0026일 수 있다. 단일쇄 항체 단편 (scFv0026)의 LCDR 1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 표시되며; VL의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되고; HCDR 1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되며; VH의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시된다.
본 출원의 CAR는 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄(chain), CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성되는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 막관통 도메인(transmembrane domain)은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어, 본 출원의 막관통 도메인은 서열번호 27의 서열을 갖는 CD8a의 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
본 출원에서, 상기 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성되는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래된 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 서열번호 29 또는 31의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 CAR는 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)은 CD3ζ에서 유래된 신호전달 도메인(signal transduction domain)을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 CAR는 항체와 막관통 도메인을 연결하는 힌지 부위(hinge region)를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 힌지 부위(hinge region)는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 본 출원의 CAR는 N 말단에 위치될 수 있는 HA-태그(tag)를 포함할 수 있다. 본 출원에서, HA-태그(tag)는 서열번호 5로 나타낸 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 항-HA 항체는 본 출원의 CAR의 발현을 분석하고 기능성 연구를 위해 CAR-T 세포를 풍부하게하기 위해 CAR과 특이적으로 결합하기 위해 사용될 수 있다.
본 출원의 CAR는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 신호 펩타이드에 연결될 수 있다. 예를 들어, 신호 펩타이드는 서열번호 3으로 나타낸 서열을 갖는 CD8a 신호 펩타이드일 수 있다. 예를 들어, CAR0037, CAR0085 및 CAR0087은 CD8a 신호 펩타이드에 연결될 수 있다.
본 출원에서, 상기 CAR는 추가로 절단(cleaving) 펩타이드에 연결될 수 있고, 상기 절단(cleaving) 펩타이드는 T2A 펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 절단(cleaving) 펩타이드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 절단 펩타이드는 서열번호 35에 나타낸 서열을 갖는 T2A일 수 있다. 예를 들어, CAR0037 및 CAR0087은 절단 펩타이드 T2A에 연결될 수 있다.
본 출원에서, 상기 CAR는 CAR의 C 말단에 위치될 수 있는 마커 검출 신호에 추가로 연결될 수 있다. 본 출원에서, 상기 마커 검출 신호는 형광 단백질일 수 있으며, 이는 GFP, RFP 및 YFP로 구성된 그룹에서 선택될 수 있다. 본 출원에서, CAR 분자의 발현은 GFP 신호를 검출함으로써 간접적으로 분석될 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR는 서열번호 37로 나타낸 마커 검출 신호 서열을 갖는 CAR0037을 포함할 수 있다. 본 출원에서, 상기 마커 검출 신호는 EGFRt일 수 있다. 예를 들어, CAR0087은 서열번호 39로 나타낸 서열로 마커 검출 신호에 연결될 수 있다.
본 출원에서, 상기 CAR는 서열번호 1로 나타낸 코작(Kozak) 서열에 연결될 수 있다. 본 출원에서, 상기 CAR는 CAR의 N 말단에 위치할 수 있는 코작 서열에 연결될 수 있다. 예를 들어, CAR0037, CAR0085 또는 CAR0087은 서열번호 1로 나타낸 코작 서열에 연결될 수 있다.
본 출원에서, 상기 CAR는 서열번호 49 또는 51의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR는 서열번호 49로 나타낸 서열을 갖는 CAR0037로부터 선택될 수 있다. 다른 예로서, 상기 CAR는 서열번호 51로 나타낸 서열을 갖는 CAR0085로부터 선택될 수 있으며; 상기 CAR는 서열번호 51로 나타낸 서열을 갖는 CAR0087로부터 선택될 수 있다.
특정 실시 양태에서, 본 출원의 CAR는 이의 N 말단으로부터 BCMA-결합 도메인, 막관통 도메인, 공동자극 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인을 순서대로 함유할 수 있다. 상기 CAR는 서열번호 43으로 나타낸 서열을 갖는 BCMA-결합 도메인을 포함할 수 있고, 상기 BCMA-결합 도메인은 서열번호 9 내지 11로 나타낸 서열을 갖는 HCDR 1 내지 3을 순서대로 함유할 수 있으며, 상기 BCMA-결합 도메인은 서열번호 17-19로 나타낸 서열을 갖는 LCDR 1-3을 순서대로 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 LCDR 1-3 및 HCDR 1-3을 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다. 상기 BCMA-결합 도메인은 서열번호 7로 나타낸 서열을 갖는 중쇄 가변 영역을 함유할 수 있으며; 상기 BCMA-결합 도메인은 또한 서열번호 15로 나타낸 서열을 갖는 경쇄 가변 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 경쇄 가변 영역 및 중쇄 가변 영역을 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다. C-펩타이드는 또한 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이에 포함될 수 있으며, 이는 서열번호 23으로 나타낸 서열을 갖는다. 예를 들어, 상기 CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 C-펩타이드를 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다. 막관통 도메인은 CD8a로부터 유래된 막관통 도메인을 포함할 수 있고, 서열번호 27로 나타낸 서열을 갖는다. 예를 들어, CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 막관통 도메인을 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다. 공동자극 도메인은 서열번호 29로 나타낸 서열과 함께 CD28로부터 유도된 공동자극 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 공동자극 도메인을 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다. 세포 내 신호전달 도메인은 서열번호 33으로 나타낸 서열과 함께 CD3ζ로부터 유도된 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 세포 내 신호전달 도메인을 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다.
상기 CAR는 BCMA-결합 도메인의 C 말단 및 막관통 도메인의 N 말단에 위치할 수 있는 힌지 영역을 포함할 수 있으며, 힌지 영역은 서열번호 25로 나타낸 서열을 갖는다. 예를 들어, CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 힌지 영역을 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다.
상기 CAR는 BCMA-결합 도메인의 N 말단에 위치될 수 있는 HA-태그(tag)에 연결될 수 있으며, HA-태그(tag)는 서열번호 5로 나타낸 서열을 갖는다. 예를 들어, 상기 CAR는 CAR0037 또는 CAR0037과 동일한 HA-태그(tag)를 갖는 본 출원의 CAR를 포함할 수 있다.
상기 CAR는 또한 CAR의 N 말단에 위치될 수 있는 신호 펩타이드에 연결될 수 있고, 신호 펩타이드는 서열번호 3으로 나타낸 서열을 갖는다.
상기 CAR는 또한 T2A와 같은 절단 펩타이드에 연결될 수 있다. 절단 펩타이드는 세포 내 신호전달 도메인의 C 말단에 위치할 수 있고, 절단 펩타이드는 서열번호 35로 나타낸 서열을 갖는다. 상기 CAR는 또한 CAR의 C 말단 (또는 절단 펩타이드)에 위치할 수 있는 마커 검출 신호에 연결될 수 있다. 상기 마커 검출 신호는 GFP, RFP 및 YFP로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있고, 마커 검출 신호는 서열번호 37로 나타낸 서열을 갖는다.
예를 들어, 본 출원의 CAR는 CAR0037일 수 있고, 그의 LCDR 1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 표시되며; 이의 VL의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되고; HCDR 1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되며; 이의 VH의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되며; VH와 VL 사이의 C- 펩타이드의 서열은 서열번호 23으로 표시되며; 이의 힌지 영역은 서열번호 25로 표시되며; 막관통 도메인은 서열번호 27로 표시되며; 그의 공동자극 도메인은 서열번호 29로 나타낸 CD28 공동자극 도메인이고; 그것의 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인은 서열번호 33으로 표시되며; CAR0043은 또한 서열번호 35로 나타낸 절단 펩타이드 및 서열번호 37로 나타낸 GFP 마커 검출 신호를 함유할 수 있으며; CAR0037은 또한 서열번호 1로 나타낸 코작(KOZAK) 서열, 서열번호 3으로 나타낸 CD8a 신호 펩타이드 및 서열번호 5로 나타낸 HA-태그(tag)를 함유할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 CAR는 CAR0085일 수 있고, 이의 LCDR 1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 표시되며; 이의 VL의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되고; HCDR 1 내지 3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 표시되며; 이의 VH의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고; VH와 VL 사이의 C-펩타이드의 서열은 서열번호 23으로 나타내며; 이의 힌지 영역은 서열번호 25로 표시되며; 막관통 도메인은 서열번호 27로 표시되며; 그의 공동자극 도메인은 서열번호 31로 나타낸 4-1BB 공동자극 도메인이고; 이의 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인은 서열번호 33으로 표시되며; CAR0085는 또한 서열번호 1로 나타낸 코작(KOZAK) 서열 및 서열번호 3으로 나타낸 CD8a 신호 펩타이드를 함유할 수 있다.
예를 들어, 본 출원의 CAR는 CAR0087일 수 있고, 그것의 LCDR 1-3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 17, 서열번호 18 및 서열번호 19로 표시되며; 이의 VL의 아미노산 서열은 서열번호 15로 표시되고; HCDR 1 내지 3의 아미노산 서열은 각각 서열번호 9, 서열번호 10 및 서열번호 11로 나타내고; 이의 VH의 아미노산 서열은 서열번호 7로 표시되고; VH와 VL 사이의 C-펩타이드의 서열은 서열번호 23으로 나타내며; 이의 힌지 영역은 서열번호 25로 표시되며; 막관통 도메인은 서열번호 27로 표시되며; 그의 공동자극 도메인은 서열번호 31로 나타낸 4-1BB 공동자극 도메인이고; 이의 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인은 서열번호 33으로 표시되며; CAR0085는 또한 서열번호 35로 나타낸 절단 펩타이드 및 서열번호 39로 나타낸 EGFRt 마커 검출 신호를 함유할 수 있고; CAR0087은 또한 서열번호 1로 나타낸 코작(KOZAK) 서열 및 서열번호 3으로 나타낸 CD8a 신호 펩타이드를 함유할 수 있다.
또한, 본 출원에 포함된 단백질, 폴리펩타이드 및/또는 아미노산 서열은 적어도 단백질 또는 폴리펩타이드와 동일하거나 유사한 기능을 갖는 기능성 변이체(functional variants) 또는 상동체를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 출원에서, 기능적 변이체(functional variants)는 상기 단백질 및/또는 폴리펩타이드의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산을 치환, 결실 또는 첨가함으로써 수득되는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다 (예를 들어, 구체적으로 할 수 있는 항체) BCMA 또는 이의 단편과 결합한다). 예를 들어, 기능적 변이체(functional variants)는 1에서 30, 1에서 20 또는 1에서 10 또는 1, 2, 3, 4 또는 5와 같은 하나 이상의 아미노산의 치환, 결실 및/또는 삽입으로 인해 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 기능적 변이체(functional variants)는 변형되지 않은 단백질 또는 폴리펩타이드 (치환, 결실 또는 첨가)의 생물학적 특성을 실질적으로 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 기능적 변이체(functional variants)는 원래 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 (항원 결합 능력과 같은)의 적어도 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 100 %로 유지될 수 있다. 예를 들어, 치환은 보수적인 것일 수 있다.
본 출원에서, 상동체는 상기 단백질 및/또는 폴리펩타이드와 아미노산 서열 상동성이 약 85 % 이상(예컨대, 약 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % 또는 그 이상 )인 단백질 또는 폴리펩타이드(예를 들어 BCMA 또는 이의 단편과 특이적으로 결합할 수 있는 항체)일 수 있다.
본 출원에서, 상동성은 일반적으로 둘 이상의 서열 사이의 유사성, 유사성 또는 상관성을 지칭한다. "서열 상동성 백분율(sequence homology percentage)"은 다음 방법에 의해 계산될 수 있다: 동일한 핵산 염기 (A, T, C, G 및 I와 같은) 또는 동일한 아미노산 잔기 (예: Ala, Pro)를 갖는 위치의 수를 결정하기 위해 비교 윈도우에서 비교될 2 개의 비교 서열 , Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)를 두 위치에서 일치시켜 일치하는 위치 수를 얻고; 그 다음, 매칭 위치의 수를 비교 윈도우의 총 위치 수로 나눈 값 (즉, 윈도우 크기); 및 그 결과에 100을 곱하여 서열 상동성 백분율을 수득한다. 서열 상동성 백분율을 결정하기위한 비교는 예를 들어 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 당업자는 앞서 비교된 서열 범위 또는 표적 서열 영역 내에서 최대 비교를 구현하는데 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여 서열 비교를 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 상동성은 또한 다음 방법에 의해 결정될 수 있다: FASTA 및 BLAST. FASTA 알고리즘에 대한 설명은 W. R. Pearson과 D. J. Lipman, 미국 국립 과학원 (Proc. Natl. Acad. Sci.), 85 : 2444-2448, 1988; 및 D. J. Lipman 및 W. R. Pearson, Science, 227 : 1435-1441, 1989에 의한 "신속하고 민감한 단백질 유사성 검색"에서 찾을 수 있다. BLAST 알고리즘에 대한 설명은 S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers 및 D. Lipman, Journal of Molecular Biology, 215 : 403-410, 1990의 "기본 로컬 정렬 검색 도구"에서 찾을 수 있다.
핵산, 벡터, 세포, 제조방법 및 조성물
다른 관점에서, 본 출원은 본 출원의 CAR를 코딩할 수 있는 분리된 핵산 분자를 제공한다. 본 출원의 CAR를 암호화하는 분리된 핵산 분자는 서열번호 50 또는 서열번호 52로 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 변이체(functional variants)를 포함할 수 있다. 본 출원의 핵산 분자는 분리될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 다음 방법에 의해 생성 또는 합성될 수 있다: (1) 중합 효소 연쇄 반응 (PCR) 증폭과 같은 in-vitro 증폭; (2) 클로닝 및 재조합; (3) 절단(digestion) 및 겔 전기영동 분리와 같은 정제; 또는 (4) 화학 합성과 같은 합성. 일부 구현예에서, 분리된 핵산 분자는 재조합 DNA 기술에 의해 제조된다.
다른 관점에서, 본 출원은 핵산 분자를 포함할 수 있는 벡터를 제공한다. 본 출원에서, 벡터는 플라스미드, 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 본 출원의 렌티바이러스 벡터는 CAR를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 출원의 렌티바이러스 벡터는 서열번호 50 및/또는 서열번호 52로 나타낸 뉴클레오티드 서열 또는 이의 기능적 변이체(functional variants)를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 다른 유전자, 예를 들어 벡터가 적합한 숙주 세포에서 및 적절한 조건 하에서 선택될 수 있게하는 마커 유전자를 포함할 수 있다. 또한, 벡터는 코딩 영역이 적합한 숙주에서 정확하게 발현될 수 있게하는 발현 제어 요소를 포함할 수 있다. 이러한 조절 요소는 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위(ribosome-binding site), 인핸서(enhancer) 및 유전자 전사(transcription) 또는 mRNA 번역(translation)을 조절하기 위한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 발현 조절 서열은 조절 가능한 요소이다. 발현 조절 서열의 특정 구조는 종 또는 세포 유형의 기능에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 TATA 박스(box), 캡핑된(capped) 서열, CAAT 서열 등과 같은 전사 개시 및 번역 개시에 각각 참여하는 5 '비-전사 서열 및 5'및 3 '비-번역 서열을 함유한다. 예를 들어, 5 '비-전사 발현 조절 서열은 기능적으로 연결된 핵산을 전사 및 조절하기위한 프로모터 서열을 포함할 수 있는 프로모터 영역을 포함할 수 있다. 본 출원의 하나 이상의 핵산 분자는 발현 조절 요소에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 상기 벡터는 예를 들어, 플라스미드(plasmids), 코스미드(cosmids), 바이러스, 박테리오파지(bacteriophages) 또는 예를 들어 유전 공학에 일반적으로 사용되는 다른 벡터를 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 벡터 scFv 플라스미드 및/또는 CAR 플라스미드를 포함하는 발현 벡터이다.
일부 실시 양태에서, 바이러스 관련 벡터는 벡터 scFv 플라스미드 및/또는 CAR 플라스미드를 포함할 수 있는 렌티바이러스 벡터일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 핵산 scFv0008 분자를 포함할 수 있는 벡터 scFv 플라스미드 PXL0008 및/또는 핵산 CAR0009 분자를 포함할 수 있는 CAR 플라스미드 PXL0009를 포함할 수 있는 렌티바이러스 LV0002일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 핵산 scFv0008 분자를 포함할 수 있는 벡터 scFv 플라스미드 PXL0008 및/또는 핵산 CAR0041 분자를 포함할 수 있는 CAR 플라스미드 PXL0041을 포함할 수 있는 렌티바이러스 LV0011일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 핵산 scFv0026을 포함할 수 있는 벡터 scFv 플라스미드 PXL0026 및/또는 핵산 CAR0037을 포함할 수 있는 CAR 플라스미드 PXL0037을 포함할 수 있는 렌티바이러스 LV0007일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 핵산 scFv0026을 포함할 수 있는 벡터 scFv 플라스미드 PXL0026 및/또는 핵산 CAR0085를 포함할 수 있는 CAR 플라스미드 PXL0085를 포함할 수 있는 렌티바이러스 LV0020일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 핵산 scFv0026을 포함할 수 있는 벡터 scFv 플라스미드 PXL0026 및/또는 핵산 CAR0087을 포함할 수 있는 CAR 플라스미드 PXL0087을 포함할 수 있는 렌티바이러스 LV0021일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 바이러스 관련 벡터는 또한 레트로바이러스 벡터를 포함할 수 있으며, 이는 scFv 플라스미드 및/또는 CAR 플라스미드를 포함할 수 있다.
다른 관점에서, 본 출원은 CAR, 핵산 분자 또는 본 출원의 벡터를 포함할 수 있는 면역 효과기 세포를 제공한다. 본 출원에서, 면역 효과기 세포는 포유 동물 세포일 수 있다. 본 출원에서, 면역 효과기 세포는 T 림프구 및 자연 살해 (NK) 세포로부터 선택될 수 있다.
본 출원에서, T 림프구는 흉선 세포, 천연 T 림프구, 미성숙 T 림프구, 성숙한 T 림프구, 휴지 T 림프구 또는 활성화된 T 림프구를 포함할 수 있다. T 세포는 보조(helper) T 세포 1 (Th1) 또는 보조(helper) T 세포 2 (Th2)와 같은 보조(helper) T 세포 (Th)일 수 있다. T 림프구는 CD4 + 보조(helper) T 세포 (HTL; CD4 + T 세포), 세포 독성 T 세포 (CTL; CD8 + T 세포), 종양 침윤성 세포 독성 T 세포 (TIL; CD8 + T 세포), CD4 + / CD8 + T 세포, CD4- / CD8-T 세포 또는 임의의 다른 T 림프구 아형일 수 있다. 일부 실시 양태에서, T 림프구는 미접촉(naive) T 세포 (TN 세포)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, T 림프구는 중앙 기억(central memory) T 세포 (Tcm 세포)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, T 림프구는 효과기(effector) T 세포 (TEM 세포)일 수 있다. 일부 실시 양태에서, T 림프구는 NK T 세포일 수 있다. 본 출원에서, T 림프구는 말초 혈액 세포, 제대혈 세포 및/또는 백혈구로부터 유래될 수 있다.
본 출원에서, T 림프구는 TCM 세포일 수 있으며, 이는 CD45RO +/CD62L +의 특성을 가질 수 있다. T 림프구는 CD45RO +/CD62L-의 특성을 가질 수 있는 TEM 세포일 수 있다. T 림프구는 CD45RO-/CD62L +의 특성을 가질 수 있는 TN 세포일 수 있다. T 림프구는 NK1.1 +, NK1.1-, CD4 +, CD4-, CD8 + 및 CD8-으로 세분될 수 있는 NK T 세포일 수 있다. 활성화된 후, NK T 세포는 다수의 인터페론 -γ, IL-4 (인터루킨 4) 및 과립구-대식세포 집락 자극 인자(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)를 생성할 수 있다. 또한, NK T 세포는 또한 일부 사이토카인(cytokines) 및 화학 주성 인자(chemotactic factors) (IL-2, IL-13, IL-17, IL-21 및 종양 괴사 인자 -α)를 생성할 수 있다.
다른 관점에서, 본 출원은 본 출원의 벡터를 면역 효과기 세포 내로 도입하는 단계를 포함할 수 있는 면역 효과기 세포의 제조방법을 제공한다. 예를 들어, 본 출원의 벡터는 T 림프구 또는 자연 살해 (NK) 세포와 같은 면역 효과기 세포 내로 도입될 수 있다. 일부 실시 양태에서, 각각의 유형의 또는 각각의 세포는 본 출원의 하나 또는 하나의 유형의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 실시 양태에서, 각각의 유형의 또는 각각의 세포는 본 출원의 다수의 (예를 들어 2 개 이상) 또는 다수의 유형 (예를 들어 2 개 이상의 유형)의 벡터를 포함할 수 있다. 본 출원에서, 본 출원의 벡터는 필요할 때 당업계에 공지된 방법에 의해 면역 효과기 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 면역 효과기 세포는 레트로바이러스 벡터에 의해 형질 감염되어 CAR 분자를 운반하는 바이러스 게놈을 숙주 게놈에 통합시켜 표적 유전자의 장기적이고 안정적인 발현을 보장할 수 있다. 다른 예를 들어, 전이인자(transposon)는 CAR 운반 플라스미드(transposon) 및 전이효소 운반 플라스미드를 표적 세포 내로 도입하는데 이용될 수 있다. 다른 예를 들어, CAR 분자는 유전자 편집방법 (예컨대 CRISPR / Cas9)에 의해 게놈에 첨가될 수 있다. 본 출원에서, 본 출원의 CAR 분자 운반 벡터는 전기천공법, 리포펙타민 (lipofectamine 2000, Invitrogen) 등과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
다른 관점에서, 본 출원은 면역 효과기 세포 및 약제학적으로 허용되는 보조제를 함유할 수 있는 조성물을 제공한다.
제약상 허용되는 보조제는 완충제, 산화 방지제, 보존제, 저분자량 폴리펩타이드, 단백질, 친수성 중합체, 아미노산, 당, 킬레이트 제, 반대 이온, 금속 착물 및/또는 비이 온성 계면 활성제를 포함할 수 있다.
본 출원에서, 조성물은 경구 투여, 정맥 내 투여 (예: 정맥 내 주사, IV), 근육 내 투여 (예: 근육 내 주사, IM), 종양 부위에서의 원내 투여, 흡입, 직장 투여, 질 투여, 경피 투여 또는 피하 저장소 투여가 될 수 있다.
본 출원의 조성물은 치료 유효량의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 함유할 수 있다. 치료 유효량은 질환 (예: 암) 및/또는 그 질환 또는 발병 위험이있는 대상체에서 질환 (예: 암) 및/또는 이의 임의의 합병증을 예방 및/또는 치료 (적어도 부분적으로 치료)하는데 필요한 용량이다.
제약 용도
다른 관점에서, 본 출원은 BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는데 사용되는 약물의 제조에서 CAR, 핵산 분자, 벡터 또는 면역 효과기 세포의 용도를 제공한다.
본 출원에서, BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태는 암 또는 악성 종양일 수 있다. 일부 실시 양태에서, 암 또는 악성 종양은 다발성 골수종과 같은 형질 세포 악성 종양으로부터 선택될 수 있고, 또한 호지킨 림프종(Hodgkin's lymphoma) 및 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)과 같은 B- 세포 악성 종양으로부터 선택될 수 있다.
다른 관점에서, 본 출원은 CAR, 핵산 분자, 벡터 또는 면역 효과기 세포를 제공하여 BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료한다.
다른 관점에서, 본 출원은 CAR, 핵산 분자, 벡터 또는 면역 효과기 세포를 특허에 투여하는 것을 포함하여 BCMA의 발현과 관련된 질환 또는 상태를 치료하는 방법을 제공한다.
임의의 이론에 제한되지 않고, 하기 실시 예는 본 발명의 범위를 제한하기보다는 본 출원의 키메릭 항원 수용체, 벡터, 세포 및 조성물의 작동 방식을 설명하기 위한 것일 뿐이다.
실시예
실시예 1: 재조합 렌티바이러스 벡터의 제조
하기 뉴클레오티드 서열을 먼저 인공적으로 합성하였다: 코작(KOZAK) (서열번호 2의 뉴클레오티드 서열), CD8α 신호 펩타이드 (서열번호 4의 뉴클레오티드 서열), HA-태그 (서열번호 6의 뉴클레오티드 서열), scFv0026 (서열번호 44의 뉴클레오티드 서열), CD28 공동자극 인자 (서열번호 30의 뉴클레오티드 서열), 4-1BB 공동자극 도메인 (서열번호 32의 뉴클레오티드 서열), CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인 (서열번호 34의 뉴클레오티드 서열), T2A 절단 펩타이드 (서열번호 36의 뉴클레오티드 서열), GFP (서열번호 38의 뉴클레오티드 서열) 및 EGFRt (서열번호 40의 뉴클레오티드 서열).
한편, scFv0008 분자를 대조군으로서 구축하고, scFv0008 분자의 아미노산 서열을 서열번호 41 (US9034324, 서열 번호 3 및 서열 번호 4 참조)로 나타내었다.
HA-태그(tag)는 CAR 분자의 N 말단에 위치하고, CD8a 신호 펩타이드에 직접 연결되었다. CAR 분자가 세포 표면상에서 발현될 때, HA-태그(tag)는 CAR 분자를 검출하거나 CAR-T 세포의 농축을위한 태그로서 작용할 수 있다. 또한, GFP는 CAR 분자의 가장 C 말단에 위치하고, T2A 절단 펩타이드에 직접 연결되었다. CAR 분자 및 GFP 단백질은 T2A 절단 후에 동일한 양으로 형성될 수 있다 (Szymczak 등, 단일 자기 절단 2A 펩타이드 기반 레트로바이러스 벡터를 사용하여 생체 내 다중 유전자 결핍의 보정 참조). 생명 공학, 2004. 22 : p. 589). 따라서, CAR 분자의 발현과정 (도 1B에 도시됨)은 GFP 신호를 검출함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 도 1B는 탐지 과정을 구체적으로 보여준다: 렌티바이러스 입자 (1) 세포막 융합에 의해 세포로 도입되는 것 (2) 제거되는 패키지 (3) 그런 다음 역전사(reverse transcription) (4) 수행 중; 통합(integration) (5), 전사(transcription) (6) 및 번역(translation) (7) 수행 중; 및 절단 (8)은 T2A 절단 펩타이드에 의해 수행된다. 형질도입 효율은 GFP (9)의 발현에 의해 평가될 수 있고, scFv 및 BCMA 단백질의 결합 효율은 BCMA-Fc (10)에 의해 연구될 수 있고, 항-HA 항체는 CAR의 발현을 분석하고 기능성 분석을 위해 CAR-T 세포를 풍부하게하는 데 사용될 수 있다 (11).
GFP 단백질을 검출함으로써, CAR 분자의 발현은 또한 다른 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, CAR 분자의 발현이 PE 신호에 의해 반영될 수 있도록 CAR 분자를 표시하기 위해 적절한 양의 비오티닐화된(biotinylated) BCMA 및 PE 스트렙트아비딘(streptavidin)이 사용될 수 있다. 다른 예에서, 적절한 양의 비오티닐화된(biotinylated) 항-HA 단일클론 항체 (비오티닐화된 항-HA mAb) 및 PE 스트렙트아비딘(streptavidin)을 사용하여 CAR 분자를 검출할 수 있다.
본 출원에 사용된 scFv 분자 함유 플라스미드, CAR 분자 함유 플라스미드 및 이에 상응하는 렌티바이러스는 표 1에 제시되어 있다.
렌티바이러스 벡터의 유형
No scFv 플라스미드 scFv 분자 CAR 플라스미드 CAR 분자 렌티바이러스
1 PXL0008 scFv0008 PXL0009 CAR0009 LV0002
2 PXL0008 scFv0008 PXL0041 CAR0041 LV0011
3 PXL0026 scFv0026 PXL0037 CAR0037 LV0007
4 PXL0026 scFv0026 PXL0085 CAR0085 LV0020
5 PXL0026 scFv0026 PXL0087 CAR0087 LV0021
하기 CAR 플라스미드를 제조하였다 (도 1A 참조).
렌티바이러스 벡터 PLVX-EF1alpha-IRES-Puro를 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 벡터 단편을 회수 하였다. 후보 scFv 플라스미드 PXL0026 (서열번호 44의 뉴클레오티드 서열)을 PCR에 의해 증폭시키고, 확장(extension) PCR을 이용하여 5 '말단에서 NotI 제한 효소 절단 부위 (보호 염기 함유), CD8a 신호 펩타이드, HA- 태그를 첨가하고; 힌지 영역, 막관통 도메인, CD28 공동자극 인자 및 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인의 유전자 합성 후 PCR 증폭을 수행 하였고; 플라스미드 pMy-BirA-T2A-eGFP로부터 T2A 절단 펩타이드 및 eGFP를 PCR 증폭에 의해 MluI 제한 효소 절단 부위 및 3 '말단상의 보호 염기에 의해 수득 하였고; 그런 다음 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 및 3'말단에 MluI 제한 효소 절단 부위를 갖는 PCR 단편을 오버랩 PCR에 의해 수득하고, 수득된 단편을 NotI 및 MluI로 이중 분해하여 회수하였다. PXL0037로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 T4 결찰을 통해 구축되었다 (CAR0037의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 50으로 나타냄).
PXL0085로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 유사한 방법으로 수득되었다. 렌티 바이러스 벡터 PLVX-EF1alpha-IRES-Puro를 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 벡터 단편을 회수하였다. 후보 scFv 플라스미드 PXL0026을 PCR에 의해 증폭시키고, 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 (보호 염기를 함유 함), 연장 PCR에 의한 CD8a 신호 펩타이드를 첨가하고; 힌지 영역, 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 인자 (서열번호 32의 뉴클레오티드 서열) 및 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인의 유전자 합성 및 PCR 증폭이 수행되었고; 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 및 3'말단에 MluI 제한 효소 절단 부위를 갖는 PCR 단편을 오버랩 PCR에 의해 사멸시키고, 수득된 단편을 NotI 및 MluI로 이중 소화하고, 단편 회복되었다. PXL0085로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 T4 결찰을 통해 구축되었다 (CAR0085의 CAR 분자 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52로 나타냄).
PXL0087로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 유사한 방법으로 수득되었다. 렌티바이러스 벡터 PLVX-EF1alpha-IRES-Puro를 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 벡터 단편을 회수하였다. 후보 scFv 플라스미드 PXL0026을 PCR에 의해 증폭시키고, 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 (보호 염기 함유), 연장 PCR에 의한 CD8a 신호 펩타이드를 첨가하였고; 힌지 영역, 막관통 도메인, 4-1BB 공동자극 인자 (서열번호 32의 뉴클레오티드 서열), CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인, T2A 절단 펩타이드 및 EGFRt (서열번호 40의 뉴클레오티드 서열)의 유전자 합성 및 PC 증폭이 수행되었고; 이어서 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 및 3'말단에 MluI 제한 효소 절단 부위를 갖는 PCR 단편을 오버랩 PCR에 의해 사멸시키고, 수득 된 단편을 NotI 및 MluI로 이중 소화시키고, 단편이 회수되었다. PXL0087로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 T4 결찰(ligation)을 통해 구축되었다 (CAR0087의 CAR 분자 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 52로 나타냄).
한편, scFv 플라스미드 PXL0008을 함유하는 CAR 플라스미드를 대조군으로서 구축하였다.
PXL0041로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 동일한 방법으로 수득되었다 (CAR0041의 CAR 분자 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 48로 나타냄). 렌티바이러스 벡터 PLVX-EF1alpha-IRES-Puro를 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 벡터 단편을 회수하였다. 후보 scFv 플라스미드 PXL0008 (서열번호 42의 뉴클레오티드 서열)을 PCR에 의해 증폭시키고, 확장(extension) PCR을 이용하여 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 (보호 염기 함유), CD8a 신호 펩타이드, HA-태드(tag)를 첨가 하였고; 힌지 영역, 막관통 도메인, CD28 공동자극 인자 및 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인의 유전자 합성 후 PCR 증폭을 수행하였고; T2A 절단 펩타이드 및 GFP는 플라스미드 pMy-BirA-T2A-eGFP로부터 PCR 증폭에 의해 MluI 제한 효소 절단 부위 및 3 '말단상의 보호 염기를 사용하여 수득하였고; 이어서 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 및 3'말단에 MluI 제한 효소 절단 부위를 갖는 PCR 단편을 오버랩 PCR에 의해 수득하고, 수득 된 단편을 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 단편이 회수되었다. PXL0041로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 T4 결찰(ligation)을 통해 구축되었다 (CAR0041의 CAR 분자 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 48로 나타냄).
PXL0009로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 유사한 방법으로 수득되었다. 렌티바이러스 벡터 PLVX-EF1alpha-IRES-Puro를 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 벡터 단편을 회수하였다. 후보 scFv 플라스미드 PXL0008을 PCR에 의해 증폭시키고, 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 (보호(protective) 염기를 함유 함), CD8a 신호 펩타이드를 첨가하고; 힌지 (higne)영역, 막관통 도메인, CD28 공동자극 인자 및 CD3ζ 세포 내 신호전달 도메인의 유전자 합성 및 PCR 증폭이 수행되었고; 5 '말단에 NotI 제한 효소 절단 부위 및 3'말단에 MluI 제한 효소 절단 부위를 갖는 PCR 단편은 오버랩 PCR에 의해 사멸되었고, 상기 수득된 단편을 NotI 및 MluI로 이중 분해하고, 단편을 회수하였다. PXL0009로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드는 T4 결찰(ligation)을 통해 구축되었다 (CAR0009의 CAR 분자 부분의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 46으로 나타냄).
실시예 2: 일시적으로 형질 감염된 293T 세포 샘플에서 CAR 분자의 발현
도 2A에 도시된 바와 같이, 실시예 1에서 제조된 CAR 플라스미드 PXL0009, PXL0041 및 PXL0037을 형질 감염 시약으로서 PEI를 사용하여 293T 세포에 일시적으로 형질 감염시켜, PXL0009-293T 세포, PXL0041-293T 세포 및 PXL0037-293T 세포가 각각 획득되었다. 일시적 형질 감염 후 72 시간에, PXL0009-293T 세포, PXL0041-293T 세포 및 PXL0037-293T 세포를 사용하여 후보 CAR 분자의 발현 능력을 평가하였다. 도 2A에서, 1은 플라스미드 및 형질 감염 시약을 나타내고, 2는 일시적 형질 감염을 나타내고, 3은 발현 및 T2A 절단 펩타이드 절단을 나타낸다.
CAR 분자의 발현을 실시예 1의 방법을 이용하여 평가하였다. 구체적으로, 비오티닐화된(biotinylated) BCMA의 용량은 고정된 농도의 과도한 PE 스트렙트아비딘(streptavidin)의 존재하에 구배 희석에 의해 변화되어 PE 신호의 변화 (도 2b에 도시 됨)가 얻어졌다. X 축은 세포에서 발현된 GFP 단백질 신호를 나타내고, Y 축은 구배 희석된 비오티닐화된(biotinylated) BCMA 및 정량의 PE 스트렙트아비딘(streptavidin)을 사용하여 표시된 CAR 분자에 의해 얻어진 PE 신호를 나타낸다.
구배 희석된 비오티닐화된(biotinylated) BCMA 단백질 (295.86 nM 내지 3.79 pM)을 사용하여 후보 CAR 플라스미드로 일시적으로 형질 감염된 293T 세포를 분석하여 PE 신호 변화 곡선 (도 9)을 수득하였다. 곡선 맞춤(curve fitting)에 의해 계산된 세포 표면상의 CAR 분자의 BCMA 단백질 결합에 대한 EC50 값을 표 2에 나타내었다.
GFP 단백질을 검출을 이용한 CAR 분자의 발현 결과
샘플 GFP% BCMA 500 ng으로 표시된 CAR의 백분율(%) CAR%:
GFP%		 EC50 (nM)
PXL0037-293T 38.5 9.2 0.24 0.64
PXL0041-293T 41.8 16.1 0.39 0.30
PXL0009-293T N/A 18.0 N/A 1.59
유사하게, 일시적 형질 감염 후 72 시간에 293T 세포 샘플에서, CAR 분자는 비오티닐화된(biotinylated) 항-HA 단일클론 항체 (항-HA mAb) 및 PE 스트렙트아비딘(streptavidin)을 사용한 다음, GFP 양성 속도 (GFP %)를 사용하여 마킹되었고, CAR 양성 속도 (CAR %) 및 이들의 비는 유세포 분석에 의해 수득되었다. 이의 결과는 표 3에 나타내었다.
CAR 분자의 발현에 대한 유세포 분석(Flow Cytometry) 결과
샘플 GFP% 500 ng의 항-HA mAb로 표시된 CAR의 백분율(%) CAR% : GFP%
PXL0037-293T 35.9 29.4 0.82
PXL0041-293T 43.1 18.8 0.44
PXL0009-293T N/A N/A N/A
PXL0009는 GFP 단백질 및 HA 태그(tag)를 코딩하는 유전자를 포함하지 않는 CAR 분자를 정상적으로 발현할 수 있는 잘 알려진 기준 플라스미드이고, 이의 서열은 서열번호 45로 표시되었다. 세포 샘플에서 GFP 신호를 검출할 수 없었고, 비오티닐화된(biotinylated) 항-HA 단일클론 항체 (비오티닐화 항-HA mAb)와 CAR의 결합에 대한 PE 신호도 검출할 수 없었다. 따라서, PXL0009-293T 세포 샘플은 유세포 분석을 위한 대조군 샘플로서 사용될 수 있다. PXL0009, PXL0041 및 PXL0037과 달리, 기준 플라스미드는 GFP 단백질 및 HATAG를 코딩할 수 있어서, GFP 신호는 PXL0041-293T 세포 샘플에서 검출될 수 있고, 바이오티닐화 BCMA 단백질 또는 바이오티닐화 항-HA 단일클론에 대해 검출될 수 있다.
결과는 비오티닐화된 BCMA 단백질 또는 비오티닐화된 항-HA 단일클론 항체 (비오티닐화된 항-HA mAb)와 CAR의 GFP 신호 및 결합 (PE 신호) 둘 다가 PXL0037-293T 세포 샘플에서 검출될 수 있음을 보여 주었고, PXL0037 플라스미드에 의해 코딩된 CAR 분자가 세포상에서 발현될 수 있고 BCMA 단백질과 정상적으로 결합할 수 있음을 입증한다.
실시예 3: 렌틴바이러스로 형질도입된 293T 세포 샘플에서 CAR 분자의 발현
3.1. 렌티바이러스 패키징(Packaging of Lentiviruses)
셔틀 플라스미드(shuttle plasmid)를 사용하여 실시예 1에서 제조된 PXL0009, PXL0041 및 PXL0037로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드 및 다른 패키징 플라스미드를 동시에 293T 세포에 동시 형질 감염시켜, 렌티바이러스를 세포에 패키징하였다. 구체적인 단계는 다음과 같다.
10 cm 배양 접시에 렌티바이러스 패키징을 예로 들어, 293T 세포를 6 x 104 cells/cm2의 밀도로 10 %의 FBS를 함유하는 DMEM 배지에 접종하고, 37 °C, 5 % CO2의 환경 및 3일 동안 포화 습도에서 배양하고, 형질주입(transfection)을 수행하였다. 형질주입 전에, 각각의 EP 튜브에서 500 μl의 opti-MEM으로 3 μg의 렌티바이러스 보조(helper) 벡터 PSPAX2를 포함하는 2개의 EP 튜브를 제조하였고, 렌티바이러스 보조(helper) 벡터 pMD2.G 2개 및 실시예 1에서 제조된 벡터 5μg (PXL0009, PXL0041 또는 PXL0037로 번호가 매겨진 CAR 플라스미드)를 하나의 튜브에 첨가하고 혼합 용액을 완전히 혼합하여 플라스미드를 함유하는 튜브를 수득하였으며; 1 mg/ml 농도의 PEI 30 μl를 다른 튜브에 첨가하고 혼합 용액을 완전히 혼합하였다. 이어서, 다른 튜브에 PEI를 함유하는 용액을 플라스미드를 함유하는 튜브에 적가하고, 얻어진 용액을 혼합하고, 실온에서 30분 방치 후에, 생성된 용액을 상기 언급 된 293T 세포에 균일하게 적가하였다. 형질주입 24 시간 후, 배지를 10 %의 FBS를 함유하는 6 ml의 DMEM 배지로 변경하였다.
72시간 후, 상층액을 수집하고 원심분리 튜브에 첨가한 후, 4 ℃에서 3000g에서 10분 동안 원심분리하고, 상층액을 0.45 μm 필터로 여과한 후 정제 할 준비가 되었다.
상층액을 4 ℃에서 4 시간 동안 27000g에서 초원심분리기로 원심분리 하였다. 상층액을 제거하고, 침전물을 100 ㎕의 사전 냉각된 PBS로 재혼탁(resuspended)한 다음, 입자가 존재하지 않을 때까지 혼합 용액을 혼합하였다. 수득한 용액을 4 ℃에서 밤새 두었다. 그런 다음 바이러스 현탁액을 꺼내서 분배하였다. 렌티바이러스 LV0002 (CAR 플라스미드 PXL0009에 해당), LV0011 (CAR 플라스미드 PXL0041에 해당) 및 LV0007 (CAR 플라스미드 PXL0037에 해당)을 각각 얻었다.
3.2. 렌티바이러스의 패키징(packaging) 효율 평가
렌티바이러스 패키징 공정에서 수득된 상층액에서 형질도입 활성을 갖는 바이러스 역가 (생물학적 역가)를 검출함으로써, 렌티바이러스의 패키징 효율을 평가하였다. 구체적인 분석 단계는 다음과 같다.
293T 세포를 1x105 cells/웰(well)의 양으로 6-웰(well) 플레이트에 접종하고, 37 ℃, 5 % CO2 및 포화 습도의 FBS에 10 %의 FBS를 함유하는 500 μl의 DMEM 배지로 배양하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 상기 언급 된 상층액 100 μl, 50 μl, 25 μl 및 12.5 μl를 취하여 렌티바이러스 형질도입을 위해 6-웰(well) 플레이트 (각 샘플 부피에 대해 2 개의 웰(well))에 첨가하였다. 렌티바이러스 형질도입 후, 세포를 37 ℃, 5 % CO2 및 포화 습도의 환경에서 계속 배양하였다. 렌티바이러스 형질도입 72 시간 후, 293T 세포를 분해하고 유세포 분석을 위해 재혼탁(resuspended)시켰다.
CAR 분자-암호화 유전자 및 GFP 단백질-암호화 유전자 둘 모두가 LV0007에서 운반되었기 때문에, CAR 분자 및 GFP 단백질 둘다는 LV0007로 형질도입된 293T 세포에서 발현될 수 있었다. 유세포 분석을 통해 293T 세포에서 GFP 형광 신호를 검출함으로써, 상층액 내의 렌티바이러스 생물학적 역가 (GFP 역 가로 지칭 됨)가 계산될 수 있다:
생물학적 역가(TU/ml)=(GFP 양성 속도 Х 293T 세포 수)/바이러스 샘플 부피
또는, LV0007-형질 도인된 293T 세포에 비오티닐화된 BCMA 및 PE-스트렙트아비딘으로 표시하고, CAR 양성 속도 (CAR 역가로 지칭 됨)를 유세포 분석법을 통해 검출하였다:
생물학적 역가(TU/ml)=(CAR 양성률Х293T 세포 수)/바이러스 샘플 부피
상기 패키징 공정에서 수득된 상층액에 대한 생물학적 역가 분석 결과는 도 4 및 표 4에 나타내었다.
표 4는 렌티바이러스 패키징에 대한 상층액의 생물학적 역가 데이터를 보여 주었다. "GFP 역가"는 일반적으로 GFP 신호를 통해 검출될 바이러스가 형질도입된 293T 세포에서 GFP 양성률을 검출함으로써 계산된 역가를 지칭하고; "CAR 역가"는 일반적으로 비오티닐화된 BCMA 및 PE-스트렙트아타비딘으로 검출될 바이러스가 형질도입된 293T 세포에서 CAR 양성 속도를 검출함으로써 계산된 역가를 지칭한다.
렌티바이러스 패키징에 대한 생물학적 역가 분석 결과
샘플 CAR 역가 (TU/ml) GFP 역가 (TU/ml)
LV0002 1.52E+05 N/A
LV0007 8.73E+05 1.05E+06
LV0011 4.68E+05 5.38E+05
실시예 4: CAR-T 세포의 제조
1 일째에, 건강한 공여자로부터 약 65 ml의 말초 혈액을 수집하고, 분리를 위해 Ficoll을 사용하여 PBMC를 얻었고, 그런 다음 CD3 MicroBeads를 사용하여 T 세포를 분류했다. 수득된 T 세포는 CD3/CD28 다이나비드(Dynabeads)를 사용하여 추가로 활성화시켰다. 활성화 후 약 24 시간 (2 일째)에, 실시예 3에서 제조된 렌티바이러스 LV0007 및 LV0011을 형질도입 동안 각각 약 1.5 x 106 cells/ml의 T 세포 밀도로 형질도입 (MOI = 4)에 각각 첨가하였다. 3 일째에, 형질도입된 세포는 새로운 배지로 새로 고쳐졌다. 이후에, 계수는 매일 수행되었으며, 세포 밀도는 0.6 x 106 cells/ml 및 2.0 x 106 cells/ml 사이에서 유지되었고, 세포의 성장 곡선을 플롯팅(plotted) 하였다.
세포 배양 6 일째에, CAR 세포 양성률 (CAR %), GFP 양성률 (GFP %) 및 CD4 / CD8 비가 유세포 분석에 의해 검출되었다. 10 일째에, CAR-T 세포의 기능을 in-vitro에서 평가하였다.
앞서 언급한 공정에 따라, LV0007-CAR-T 및 LV0011-CAR-T 세포를 수득하였고, 공여자의 T 세포를 대조군으로 채택하였다. CAR-T 세포에 대한 상기 언급된 제조 공정을 표 5에 요약하였다.
CAR-T 세포의 제조공정
Time Event 데이터
Day 1 건강한 기증자로부터 말초 혈액 수집 65 ml
Ficoll 분리를 통한 PBMC 확보 2.05Υ108 cells
CD3 MicroBeads 분류로 T 세포 수득 9.16Υ107 cells
CD3/CD28 다이나비드에 의한 활성화 시간 ~24h
CAR-T 세포 배지 조건 CTS OpTmizer, 1% CTS 면역세포 SR,
50-200 IU/ml IL-2, 1% L-Glu
Day 2 T 세포의 렌티바이러스 형질도입 MOI = 4, 세포 농도 = 1.4Υ106　cells/ml;
렌티바이러스를 첨가하지 않는 것을 제외하고, T 세포 대조군에 대한 다른 조작은 CAR-T 세포군에 대한 것과 동일함
Day 6 CAR 양성율(positive rate)의 결정 데이터는 표 6과 같음
Day 10 CD107a 탈과립(degranulation) 시험 데이터는 표 8 및 도 10과 같음
LV0007-CAR-T 세포 그룹, LV0011-CAR-T 세포 그룹 및 T세포 조절 그룹의 성장곡선은 다음과 같다. 세포 배양 6 일째에 유세포 분석에 의해 수득된 CAR 양성 속도와 같은 데이터를 표 6에 나타내었다.
유세포 분석에 의한 CAR 양성율(positive rate) 분석 결과
샘플 CAR% CAR MFI CD8% CD4에서 CAR% CD8에서 CAR%
LV0007-CAR-T 56.3 25.1 35.6 54.0 56.5
LV0011-CAR-T 62.8 30.7 37.6 58.3 68.5
T 세포 N/A N/A 29.6 N/A N/A
실시예 5: BCMA 단백질과 CAR 분자의 결합에 대한 데이터
더 나아가, 실시예 4에서 제조된 CAR-T상에서 BCMA 단백질과 결합하는 CAR 분자의 능력은 구배 희석된 비오티닐화 BCMA 단백질을 사용하여 정량 농도로 과도한 PE 스트렙트아비딘의 존재하에 CAR 분자(실시예 2의 방법과 동일)를 표시함으로써 검출되었다. 결과는 도 6 및 표 7에 나타내었다.
BCMA 단백질과 CAR 분자의 결합 결과
샘플 EC50
LV0007-CAR-T 6.00
LV0011-CAR-T 0.31
앞선 데이터에 따르면, T 세포상에서 발현된 후보 CAR 분자는 일반적으로 BCMA 단백질에 결합할 수 있다. 그러나, 상이한 배치로 제조된 세포 샘플에 대해 결정된 EC50 값 사이에는 상당한 차이가 있었다. 이러한 차이는 상이한 세포 유형, 샘플 제조 방법 및 배치로 인해 세포 표면에 발현된 CAR 분자의 상이한 밀도에 의해 야기될 수 있다.
실시예 6: CD107a 탈과립(Degranulation) 시험
6.1. CD107a 탈과립(Degranulation) 시험
CAR-T 세포의 생물학적 효능은 CD107a 탈과립화 시험에 의해 in-vitro에서 평가되었다. CD107a는 세포 내 미세소포(microvesicle)의 마커이다. 그랜자임(granzyme)이 로딩된 미세소포에 세포막이 융합되면, 세포막상의 CD107a의 양이 증가한다. 따라서, 모네신 (Monesin) (BioLegend로부터 구입)을 사용하여 CD107a 회수가 차단되면, 미세소포 방출의 강도가 정량적으로 반영될 수 있다. CAR-T가 표적 세포상의 표적 항원에 의해 자극된 후, 그랜자임이 방출된다. T 세포의 활성화는 유세포 분석을 통한 CD107a의 증가를 검출함으로써 결정될 수 있다.
먼저, 실시예 4에서 수득한 CAR-T 세포 (LV0007-CAR-T 세포 또는 LV0011-CAR-T 세포), 표적 세포 U266과 함께, 모네신 및 CD107a 항체를 3 내지 6 시간 동안 인큐베이션하였고, CAR-T 세포 및 표적 세포는 5 Х 105 cells/ml의 동일한 세포 밀도를 가졌다. 이어서, 샘플에 CD8 및 PD1 항체를 마킹한 후, 유세포 분석을 수행하였다. CAR-T 세포 중 CAR 양성세포는 공동 발현된 GFP를 검출함으로써 분석되는 반면, 대조군으로서 LV0011-CAR-T 세포 중 CAR 양성세포는 비오티닐화된 BCMA-Fc 및 PE 스트렙트아비딘에 의해 표시되었다. 시험에서, K562 세포를 음성 대조군으로서 CAR-T 세포와 공동 배양하였고, 양성 대조군은 CAR-T 세포를 활성화시키기 위해 표적세포 대신 칵테일(cocktail)을 사용하였다.
LV0007-CAR-T 세포를 예로 들면, 유세포 분석 결과가 도 7에 도시되어 있다.
LV0007-CAR-T 및 U266이 공동 배양된 세포 샘플에 대해, P1 게이트(gate)가 FSC:SSC 산점도(scatter plot)에서 선택되었고, 좌측 하단의 세포 잔해물이 제거되었으며; P1 게이트(gate)의 세포에서, CD8:PD1은 CD8+/PD1- 세포 집단 (Q3)을 얻기 위해 PD1은 추가로 분석될 수 있고; CD8+/PD1- 세포 집단에서, GFP:CD107a를 다시 분석하여 CD8+/PD1-/CAR+ 및 CD8+/PD1-/CAR- 각각의 세포 집단에서 발현하는 CD107a의 비율을 수득할 수 있었다 (CAR 양성 세포는 공동 발현 된 GFP 신호에 의해 표시됨).
LV0007-CAR-T 및 K562가 공동 배양된 세포 샘플에서, 세포를 FSC:SSC 산점도(scatter plot)에서 집단 P1 및 집단 P2로 나누었고, 상기 집단 P2의 세포에서 CD8이 거의 발현되지 않았으며, 따라서 K562 세포일 수 있고; P1 게이트의 세포에 대해, CD8:PD1을 추가로 분석할 수 있으며; CD8+/PD1- 세포 집단 (Q3)에서, GFP:CD107a는 CD8+/PD1-/CAR+ 및 CD8+/PD1-/CAR- 각각에서 발현하는 CD107a의 비율을 얻기 위해 다시 분석될 수 있다.
6.2. CD107a 탈과립(Degranulation) 시험 데이터
실시예 6의 섹션 6.1의 시험 조작에 따르면, CAR-T 세포 샘플 (LV0007-CAR-T 또는 LV0011-CAR-T 세포)을 표적세포 U266 (BCMA- 양성)과 3시간 동안 공동 배양한 다음, 유세포 분석을 수행하였다. 세포 샘플에 대한 CD107a 탈과립 시험 데이터 결과를 표 8 및 도 8에 나타내었으며, 표 8 및 도 8은 CD8+/PD1-/CAR+ 세포 소집단(subpopulation) 및 CD8+/PD1-/CAR- 세포 소집단(subpopulation)에서 CD107a- 발현 양성 세포의 비를 보여 주었다.
다른 세포 소집단(subpopulation)에서 CD107a-발현 양성 세포의 비율
샘플 CD8+/PD1-/CAR+ 소집단 CD8+/PD1-/CAR- 소집단
K562 U266 K562 U266
LV0007-CAR-T 0.97 25.10 1.01 3.91
LV0011-CAR-T 2.01 10.70 2.71 3.33
T 세포 N/A N/A 0.64 1.09
표 8 및 도 8에 나타낸 바와 같이, U266과 배양된 CAR-T 샘플에서, CD8+/PD1-/CAR + 세포 소집단의 CD107a 값은 CAR-T 세포가 특이적으로 활성화된 것을 반영할 수 있고; K562와 함께 배양된 CAR-T 샘플에서, CD8+/PD1-/CAR+ 세포 소집단의 CD107a 값은 CAR-T 세포가 비특이적으로 활성화된 상황을 반영할 수 있다. U266과 함께 배양된 CAR-T 샘플로부터 CD8+/PD1-/CAR+ 세포 소집단의 CD107a 값을 비교함으로써, LV0007-CAR-T 세포의 CD8+/PD1-/CAR+ 소집단은 BCMA-양성 세포(U266)에 의해 특이적으로 활성화될 수 있다고 사료되었으며, LV0007-CAR-T 세포에 대한 활성화는 대조군으로서 LV0011-CAR-T 세포에 대한 활성화보다 강력하였다.
6.3. BCMA 단백질 경쟁(competition) 조건 하의 CD107a 탈과립(degranulation) 시험 데이터
또한, 다발성 골수종 (MM) 세포 표면에 발현된 BCMA 단백질의 세포 외 부분이 γ-세크레타제(secretase)에 의해 절단될 수 있으므로, 가용성 BCMA (sBCMA)가 형성될 수 있다. 가용성 BCMA의 함량은 MM 환자의 혈청에서 증가될 수 있었고, 그 농도는 종양의 악성 정도와 양의 상관 관계가 있었다. 따라서, CAR-T 세포를 표적세포와 공동 배양한 경우, 1 μg/ml의 BCMA 단백질을 배지에 첨가하여 CAR-T 세포 활성화에 대한 가용성 BCMA의 효과를 평가하였다.
BCMA 단백질 경쟁 조건하에서 CAR-T 세포 샘플에 대한 CD107a 탈과립 시험 결과가 표 9 및 도 9에 나타내어져 있다. 도 9에 나타낸 된 바와 같이, U266 세포에 의한 CAR-T 세포의 활성화는 LV0007 형질도입된 세포 샘플에서 BCMA 단백질에 의해 경쟁적으로 억제되지 않았으며; 대조군으로서 LV0011-CAR-T 세포 샘플의 활성화는 유의하게 억제되었다.
BCMA 단백질 경쟁(competition) 조건 하의 CD107a 탈과립(degranulation) 시험 데이터
샘플 CD8+/PD1-/CAR+ 소집단 CD8+/PD1-/CAR- 소집단
U266 및 BCMA U266 U266 및 BCMA U266
LV0007-CAR-T 72.46 39.61 7.51 2.95
LV0011-CAR-T 21.18 67.05 7.54 8.97
T 세포 N/A N/A 0.00 8.58
실시예 7: 사이토카인 방출의 측정
사이토카인 방출 측정 실험에서, 결정될 CAR-T 세포 (5Х105 세포, 100 μl) 및 표적세포 (5Х105 세포, 100 μl)를 RPMI-1640 배지에서 24 시간 동안 공동 배양한 후, 세포 배양 상층액을 수집하고, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF-β, IFN-β 및 다른 인자의 분비를 CBA 방법에 의해 측정하였다.
CAR-T 세포 샘플을 표 10 및 도 10에 각각 CAR-T 세포 샘플을 각각 표적세포와 함께 배양한 후 수득된 사이토카인 방출의 분석 결과를 나타내었다. 도 10에 도시된 사이토카인의 방출량은 샘플에서 검출된 최대 값에 대한 백분율이다. 표 10 및 도 10에 나타낸 바와 같이, BCMA-양성 표적세포 U266 (+ U226)에 의해 자극된 LV0007-CAR-T 세포에 의해 분비된 TNF-β, IFN-γ 및 IL-2의 양은 모두 크게 증가했다. BCMA-음성 K562 (+K562)에 의해 자극된 LV0007-CAR-T에 의해 분비된 TNF-β, IFN-γ 및 IL-2의 양은 증가하지 않았다.
사이토카인 방출의 측정 결과
샘플 IL-2 IL-17A IL-4 IL-6 IL-10 IFN-γ TNF-α
LV0011-CAR-T 44.72 4.61 14.12 10.83 5.85 277.35 569.91
LV0011-CAR-T +U226 8181.1 343.74 160.77 31.82 47.66 4847.04 3265.38
LV0011-CAR-T +K562 117.31 4.1 3.04 126.72 0.45 4.25 942.7
LV007-CAR-T 1487.07 36.95 20.63 17.46 15.15 1248.25 986.38
LV0007-CAR-T +U226 8181.1 443.26 96.62 43.42 48.17 3555.68 7658.65
LV0007-CAR-T +K562 1652.22 18.65 5 279.96 10.6 1438.33 19.54
T 7.03 N/A 8.17 8.35 3.82 171.96 315.4
T+U226 N/A N/A N/A 5.29 2.47 21.85 83.8
T+K562 N/A N/A N/A 55.54 N/A N/A 123.2
실시예 8: 상이한 공여자로부터의 CAR-T 세포의 기능
LV0002-CAR-T 세포 및 LV0021-CAR-T 세포는 실시예 3에서 제조된 렌티바이러스 LV0002 및 LV0021을 실시예 4와 유사한 실험 방법을 사용하여 CAR-T 세포로 형질도입하여 제조하고, CAR-T 세포를 제조하기 위해 상기 LV0021 바이러스 (4-1BB의 공동자극 인자를 갖는 PXL0087 플라스미드에 의해 코딩된 CAR 분자에 상응 함) 및 CD28의 공동자극 인자를 갖는 PLV0009 플라스미드에 의해 코딩된 CAR 분자에 상응하는 LV0002 바이러스를 상이한 공여자로부터 T 세포를 형질도입하였다. LV0002 바이러스로 형질도입된 공여자 1의 T 세포는 LV0002-D01-CAR-T 세포로 명명되었고, LV0002 바이러스로 형질도입된 공여자 1의 T 세포는 LV0002-D02-CAR-T 세포로 명명되었고, LV0002 바이러스로 형질도입된 공여자 3의 T 세포는 LV0002-D03-CAR-T 세포로 명명되었으며; LV0021 바이러스로 형질도입된 공여자 1의 T 세포는 LV0021-D01-CAR-T 세포로 명명되었고, LV0021 바이러스로 형질도입된 공여자 2의 T 세포는 LV0021-D01-CAR-T 세포로 명명되었고, 공여자 3의 T 세포는 LV0021 바이러스는 LV0021-D03-CAR-T 세포로 명명되었다. 한편, 공여자 자신으로부터의 T 세포는 대조군으로서 채택되었으며, 공여자 1로부터 오는 T 세포는 T 세포-D01로 명명되었고, 공여자 2로부터 나오는 T 세포는 T 세포-D02로 명명되었고, 공여자 3으로부터 나오는 T 세포는 T 세포-D03으로 명명되었다. 이들 CAR-T 세포의 기능은 또한 실시예 6에서 CD107a 탈과립화 시험을 사용하여 분석하였다. 결과는 표 11 및 도 11에 나타내었다.
데이터는 2 개의 상이한 공여자로부터의 LV0021-CAR-T 세포에 대한 결과가 유사하다는 것을 보여주었고 즉, 두 공여자의 LV0021-CAR-T 세포는 BCMA-양성 U266 세포에의해 특이적으로 자극되어 CD107a를 생성할 수 있으며, BCMA-음성 K562 세포의 자극하에 생성된 CD107a 값은 자극 없음 (blank)하에 생성된 값과 유사하였다. 대조군으로서의 LV0002-CAR-T 세포는 U266 세포의 자극 하에서 더 많은 CD107a를 생산할 수 있으며, 이는 상이한 scFv 및 그들에 대한 공동자극 인자에 기인할 수있다. 또한, LV0002-CAR-T 세포는 자극이 없는 조건 (blank) 및 K562 세포 자극의 조건 둘 다에서 더 높은 CD107a 값을 가질 수 있다. 또한, CD107a를 생산하는 LV0021-CAR-T의 능력에 대한 유리 BCMA 단백질의 효과는 미미한 반면, CD107a를 생산하는 LV0002-CAR-T의 능력에 대한 유리 BCMA 단백질의 효과는 크다.
상이한 공여자로부터의 CAR-T 세포의 기능 비교
공여자 샘플 CD8+/PD1-/CAR+ subpopulation
U266 U266 및 BCMA K562 Blank 대조군
공여자 1 LV0021-D01-CAR-T 35.2 31.1 9.10 2.34
T 세포-D01 1.43 1.47 0.02 0.01
공여자 2 LV0021-D02-CAR-T 56.3 43.6 3.91 7.13
LV0002-D02-CAR-T 74.3 43.3 30.0 39.2
T 세포-D02 4.29 4.24 1.15 1.01
공여자 3 LV0021-D03-CAR-T 79.6 72.5 6.62 12.6
T 세포-D03 2.25 3.01 0.86 0.55
실시예 9: 표적세포에서 CAR-T의 in-vitro 사멸 분석(killing assay)
실시예 8에서 제조된 CAR-T 세포 LV0021-D02-CAR-T를 칼세인(calcein)-AM 형광법에 의해 수행된 in-vitro 사멸 기능 분석(killing function assay)에 사용하였다. 이 분석의 단계는 다음과 같다. 5Х105 BCMA-양성 U266 세포 및 BCMA-음성 K562 세포를 각각 취하여 PBS + 4 % FBS 용액에 재현탁시켜, 밀도 1Х106 cells/ml의 세포 현탁액을 제조하였다. U266 세포 및 K562 세포는 각각 25 μM의 칼세인(calcein)-AM으로 표시되었다. 표시된 U266 및 K562 세포를 웰(cell)당 5000 세포의 양에 따라 U-bottom 96-웰 플레이트에 각각 접종하고; 이어서, 대조군으로서 평가될 CAR-T 세포 또는 T 세포를 각각 50:1, 25:1 및 5:1의 효과기 세포/표적세포 비에 따라 상응하는 웰(well)에 첨가하였고 (E : T 값), 각 웰(well)의 용액 부피는 200 μl였다. 또한, 효과기 세포 대신 PBS 용액을 U266 또는 K562 세포에 첨가하여 분석을 위한 음성 대조군으로 사용하였고; 효과기 세포 대신에 세포 용해 용액을 U266 또는 K562 세포에 첨가하여 분석을 위한 양성 대조군으로서 제공하였다. 그런 다음, U-bottom 96-웰 플레이트를 37 ℃에서 3 시간 동안 암실에서 배양하고, 상층액을 형광분석을 위해 각 웰(well)로부터 피펫팅 (세포를 피펫팅하지 않음)시켰다 (여기(excitation) 파장: 485/20 nm 방출 파장 : 530/25 nm). 효과기 세포에 의해 사멸되고 칼세인(calcein)-AM을 방출하기 위해 용해된 표적세포 (U266 또는 K562)의 상대적인 비율은 다음 식에 의해 계산될 수 있다 :
Figure 112020030883907-pct00001
상기 Ftest는 표적세포 및 분석될 T/CAR-T 세포를 함유하는 복수(replicate) 웰에 대한 평균 형광값, Fspont는 표적세포 및 PBS를 함유하는 복수(replicate) 웰에 대한 평균 형광값, 및 Fmax는 표적세포 및 용해 용액을 함유하는 복수(replicate) 웰에 대한 평균 형광값이었다.
LV0021-D02-CAR-T 샘플을 예로 들어, 표적세포에 대한 CAR-T 세포의 사멸 효과 in vitro 시험을 도 12에 도시하였다. CAR-T 세포는 BCMA-양성 U266 세포에 대해 강한 사멸 효과를 가졌고, E:T 값이 증가함에 따라 사멸 효과가 향상되었으며, 더 높은 비율의 U266 세포가 용해되어 칼세인-AM을 방출하는 것으로 나타났다. 대조적으로, CAR-T 세포는 BCMA-음성 K562 세포에 대해 부정적 사멸 효과(poor killing effect)를 가졌다. 또한, T 세포는 U266 세포에 대해 어느 정도의 비특이적 사멸 효과를 가졌으며, 비특이적 사멸 효과는 E:T 값이 증가함에 따라 변하지 않을 것이다. 따라서, CAR-T 세포는 현저한 BCMA-특이적 사멸 효과를 가졌다.
실시예 10: 종양 동물모델에서의 종양 억제 분석
실시예 8에서 제조된 공여자 2로부터 유래된 CAR-T 세포 (LV0021-D02-CAR-T)를 동물모델 실험에 사용하였다. LV0021-CAR-T 세포는 XL103-07로 명명되었다. 한편, 공여자 2로부터 유래한 T 세포 (T cell-D02)를 대조군 T 세포로 지정하였다. 증식하는 U266 세포를 마우스 당 2Х106 세포의 양으로 면역 결핍 NSG 마우스에 피하 주사하여 U266 피하 종양모델을 생성하였다. 종양 크기가 100-150 mm3에 도달하면, 종양을 갖는 마우스를 표 12에 따라 5 개의 그룹으로 나누고, CAR-T 세포 (XL103-07), 대조군 T 세포 (T 세포 -D02), PBS 또는 7.5 %의 DMSO, 23 %의 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 32.5 %의 화합물 전해질 용액(compound electrolyte solution), 35 %의 글루코스 주사 및 2 %의 정상 식염수를 함유하는 세포 동결 보존 배지를 각각 종양 보유 마우스에 주사하였다. 그룹핑(grouping) 및 투여 요법은 표 12에 제시되었다.
동물모델 시험을 위한 그룹핑 방법
그룹 번호 CAR-T 정도 투여 방법 투여 용량 투여 주기
1 5 PBS 대조군 I.V. 100 μl 단일 투여
2 5 대조군 T 세포 I.V. 10Υ106 cells/animal 단일 투여
3 5 CAR-T 세포
(낮은 용량 그룹)		 I.V. 2Υ106 cells/animal 단일 투여
4 5 CAR-T 세포
(높은 용량 그룹)		 I.V. 10Υ106 cells/animal 단일 투여
5 5 세포 동결보존 배지 I.V. 100 μl 단일 투여
마우스에 연속적으로 먹이를 공급하고, 마우스의 종양 크기, 마우스 무게 및 생존 상태를 기록하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다. 마우스 모델 실험의 결과는 고용량군과 저용량군 모두 CAR-T 세포의 단일 투여 후 우수한 종양-사멸 효과를 나타냈으며, 투여 19 일 후, 종양은 완전히 사라졌다. 반대로, 대조군 T 세포, PBS 또는 세포 동결보존 배지를 투여한 마우스의 종양은 계속 성장하였다.
실시예 11: 종양 동물모델에서 사이토카인 분석
실시예 10에서와 동일한 CAR-T 세포 XL103-07을 사용하여 마우스 투여 약물의 말초 혈장에서 사이토카인 (IFNγ, IL2, IL10, IL7, IL6 및 TNF-α)의 변화를 세포계 비즈 배열(cytometric beads array) 방법 (구체적인 방법은 BD TM CBA 플렉스 세트 시약 및 BD FACS 어레이 TM 바이오 분석기에서 찾을 수 있음)을 이용하여 검출 하였다. 종양 마우스를 3 개의 그룹으로 나누었다: 대조군 T 세포 그룹, XL103-07 고용량 그룹 및 XL103-07 저용량 그룹, 및 각 그룹에 5 마리의 종양 마우스가 존재하였다. XL103-07-H는 고용량군을 나타내며, 용량은 10Х106 세포 (XL103-07 세포)/동물; XL103-07-L은 저용량군을 나타내며, 용량은 2Х106 세포 (XL103-07 세포)/동물이었다.
IFNγ 및 IL2에 대한 결과는 도 14에 나타내었다. 결과는 저용량군 마우스에서 IFNγ 및 IL2의 피크가 각각 10 일 및 7 일에 나타났으며; 고용량 그룹에서 IFNγ 및 IL2의 피크는 각각 3-7 일 및 3 일에 나타났으며, 이때 피크 출현 시간은 저용량 그룹의 피크보다 빨랐다. 대조군 T 세포 그룹의 수준은 명백한 변화없이 낮았다.
IL10, IL7, IL6 및 TNF-α에 대한 결과는 도 15에 나타내었다. 도 15에 나타낸 바와 같이, 모든 사이토카인 수준이 낮았고 대조군 T 세포 그룹과 비교하여 명백한 변화가 없음을 보여주었다.
실시예 12: 종양 동물모델에서 CAR 분자의 카피 수(Copy Numbers)의 변화에 대한 분석
정량적 PCR 방법으로, 실시예 10의 종양 마우스 동물모델의 말초 혈액 세포의 게놈 DNA에서 XL103-07의 CAR 분자의 DNA 카피 수의 변화가 검출되고 증식 상황 생쥐에서 CAR-T 세포의 수를 분석하였다. 그 결과를 도 16에 나타내었다. 유사하게, 종양을 갖는 마우스를 3 개의 그룹으로 나누었다: 대조군 T 세포 그룹, XL103-07 고용량 그룹 및 XL103-07 저용량 그룹, 및 각 그룹에 5 개의 종양 보유 마우스가 존재하였다. XL103-07-H는 고용량군을 나타내고, 용량은 10Х106 세포 (XL103-07 세포)/동물; XL103-07-L은 저용량 그룹을 나타내고, 용량은 2Х106 세포 (XL103-07 세포) / 동물이었다.
결과는 대조군 T 세포 그룹과 비교하여, 고용량 그룹에 대한 CAR 카피 수가 3 일에 증가하기 시작하였고, 피크는 10 일에 달성되고 15 일까지 유지되었다. 반대로, Mock-T 및 다른 대조군에서는 증식이 없었다. 이는 CAR-T 세포가 종양 사멸 과정에서 대량으로 증식되었음을 나타낸다.
실시예 13: 탐색적 임상연구
플라스미드 PXL0085의 안정적인 생산 공정 후, 렌티바이러스 벡터 LV0020 및 CAR-T 세포는 제약 연구에 의해 얻어졌고, 안전성, 내성 및 예비효과를 조사하고 PK/PD 특성을 조사하기위한 탐색적 임상 연구를 수행하였다. 이 연구에서는 실험 샘플 준비, 연구자 및 연구 기관, 실험 계획, 윤리적 검토 및 사전동의 절차, 등록 심사, 대상의 진단 및 치료, 부작용의 보고와 치료, 수집(collection) 및 실험 데이터 등의 통계 분석을 GCP 원칙을 따랐습니다.
재발성/불응성 다발성 골수종을 갖는 총 5 명의 피험자 (각각 001, 002, 004, 005 및 007로 번호가 매겨 짐)가 등록되어 임상 연구에 처리되었다. 치료 효과는 국제 골수종 실무 그룹 (International Myeloma Working Group: IMWG) 2016에서 권장하는 다발성 골수종에 대한 반응 기준에 따라 평가되었다. 5 명의 대상에 대한 최상의 전체 반응률은 100 %에 도달하였다. 피험자 3 명은 완전히 반응하고, 1 명의 피험자는 부분적으로 반응하고, 한 피험자는 최소 반응을 보였으며, PR 및 MR 피험자의 반응은 지속적으로 향상되었다 (도 17).
실시예 14: 대상체에서 CAR의 DNA 카피 수(Copy Numbers)에 대한 분석
CAR-T 세포의 약동학적 특성을 평가하기 위해, droplet digital PCR 방법 (Bio-Rad QX200 설명 참조)을 사용하여 실시예 13의 5 명의 대상체의 말초 혈액에서 CAR의 DNA 카피 수를 검출하였다. 결과는 도 18에 도시되어 있다. 투여 후, 생성물은 생체 내에서 빠르게 증식하였고, 투여 후 60 일에 여전히 검출될 수 있었다. 대부분의 대상체에서 CAR-T의 피크까지의 시간은 대략 10 일이었고, 대상체 001에서 CAR-T의 피크까지의 시간은 17 일이었다.
실시예 15: 대상체에서의 약동학적 분석
R 3.5.0 소프트웨어의 NonCompart 패키지를 사용하여, 실시예 14에서 CAR의 DNA 카피 수의 변화를 추가로 분석하고 약동학 관련 파라미터를 계산하였다. 그 결과를 표 13에 나타냈다. 표 13에서, T0은 0이 아닌 농도가 처음 관찰된 시간을 나타내고, 약물의 최고 농도 (Cmax)는 약물 농도의 최대 피크를 나타내고, 피크 타임taime to peak) (Tmax)은 약물의 피크 농도에 도달하는 데 필요한 시간을 나타내며, AUC (0-28)는 0 일부터 28 일까지 곡선 아래의 적분 면적을 나타내고, AUC (0-CLST)는 0부터 최종 관측 시간까지의 곡선 아래 적분 면적을 나타낸다.
약동학 연구 및 분석
대상체 번호 T0 (day) 약물의 최고 농도 (Cmax)
(카피 수/μg DNA)		 피크 시간
(Tmax)
(day)		 AUC (0-28) AUC (0-CLST)
001 1 148182 17 2449678 5004465
002 2 91250 10 1050197 1389729
004 0 56500 10 420084.9 417261.2
005 1 10725 10 142147.7 92527.47
007 1 54250 12 493486.2 251114
결과는 제 1 투약 그룹의 평균 Cmax가 (98644 ± 5000) 카피 수/μg DNA이고 평균 AUC (0-28)가 (1306653.3 ± 100000)이고; 제 2 투약 그룹은 평균 Cmax (32487.5 ± 2000) 카피 수/μg DNA 및 평균 AUC (0-28) (317816.95 ± 150000)을 가졌다.
앞서 언급한 상세한 설명은 청구범위의 범위를 제한하려는 것이 아니라 설명적이고 예시적인 방식으로 제공된다. 지금까지, 본 출원에 예시된 실시 예들의 다양한 변형이 당업자에게 명백하며 첨부된 청구범위 및 그 등가의 실시예의 범위 내에 유지된다.
<110> NANJING IASO BIOTHERAPEUTICS CO., LTD. INNOVENT BIOLOGICS (SUZHOU) CO., LTD. <120> CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR (CAR) BINDING TO BCMA, AND USES THEREOF <130> Pi20-B024 <160> 52 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KOZAK <400> 1 Ala Ala Thr 1 <210> 2 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KOZAK <400> 2 gccgccacc 9 <210> 3 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a signal peptide <400> 3 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro 20 <210> 4 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD8a signal peptide <400> 4 atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60 ccc 63 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-tag <400> 5 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala 1 5 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-tag <400> 6 tacccatacg atgttccaga ttacgct 27 <210> 7 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 7 Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser 20 25 30 Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Met Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 8 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60 acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agtagtagtt actactgggg ctggatccgc 120 cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggagtatct cctatagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagat 300 cgtggagaca 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ggcaagggcc tgaagtggat gggctggatc 540 aacaccgaga caagagagcc cgcctacgcc tacgacttcc ggggcagatt cgccttcagc 600 ctggaaacca gcgccagcac cgcctacctg cagatcaaca acctgaagta cgaggacacc 660 gccacctact tttgcgccct ggactacagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc 720 agcgtgaccg tgtccagctt cgtgcccgtg ttcctgcccg ccaaacctac caccacccct 780 gcccctagac ctcccacccc agccccaaca atcgccagcc agcctctgtc tctgcggccc 840 gaagcctgta gacctgctgc cggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga cttcgcctgc 900 gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct gagcctggtg 960 atcaccctgt actgcaacca ccggaacaga agcaagcgga gccggctgct gcacagcgac 1020 tacatgaaca tgaccccaag acggcctggc cccacccgga agcactacca gccttacgcc 1080 cctcccagag acttcgccgc ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagatc cgccgacgcc 1140 cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg cagacgggaa 1200 gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc cgggaccccg agatgggcgg aaagcccaga 1260 cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac gaactgcaga aagacaagat ggccgaggcc 1320 tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg aggcgcggca agggccacga tggcctgtac 1380 cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca ggccctgccc 1440 cccaga 1446 <210> 47 <211> 491 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR0041 <400> 47 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser 1 5 10 15 Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys 20 25 30 Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu Gly Ser His Leu Ile His Trp 35 40 45 Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala 50 55 60 Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 65 70 75 80 Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val 85 90 95 Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly 100 105 110 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys 115 120 125 Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln 130 135 140 Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys 145 150 155 160 Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp 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tttggcggag gcaccaaact ggaaatcaag 360 ggcagcacca gcggctccgg caagcctggc tctggcgagg gcagcacaaa gggacagatt 420 cagctggtgc agagcggccc tgagctgaag aaacccggcg agacagtgaa gatcagctgc 480 aaggcctccg gctacacctt caccgactac agcatcaact gggtgaaaag agcccctggc 540 aagggcctga agtggatggg ctggatcaac accgagacaa gagagcccgc ctacgcctac 600 gacttccggg gcagattcgc cttcagcctg gaaaccagcg ccagcaccgc ctacctgcag 660 atcaacaacc tgaagtacga ggacaccgcc acctactttt gcgccctgga ctacagctac 720 gccatggact actggggcca gggcaccagc gtgaccgtgt ccagcttcgt gcccgtgttc 780 ctgcccgcca aacctaccac cacccctgcc cctagacctc ccaccccagc cccaacaatc 840 gccagccagc ctctgtctct gcggcccgaa gcctgtagac ctgctgccgg cggagccgtg 900 cacaccagag gcctggactt cgcctgcgac atctacatct gggcccctct ggccggcacc 960 tgtggcgtgc tgctgctgag cctggtgatc accctgtact gcaaccaccg gaacagaagc 1020 aagcggagcc ggctgctgca cagcgactac atgaacatga ccccaagacg gcctggcccc 1080 acccggaagc actaccagcc ttacgcccct cccagagact tcgccgccta ccggtccaga 1140 gtgaagttca gcagatccgc cgacgcccct gcctaccagc agggacagaa ccagctgtac 1200 aacgagctga acctgggcag acgggaagag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggccgg 1260 gaccccgaga tgggcggaaa gcccagacgg aagaaccccc aggaaggcct gtataacgaa 1320 ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg cgagcggagg 1380 cgcggcaagg gccacgatgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa ggacacctac 1440 gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc aga 1473 <210> 49 <211> 488 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR0037 <400> 49 Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser 1 5 10 15 Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 25 30 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys 35 40 45 Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln 50 55 60 Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 65 70 75 80 Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val 100 105 110 Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 115 120 125 Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu 130 135 140 Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly 145 150 155 160 Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro 165 170 175 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr 180 185 190 Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr 195 200 205 Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp 210 215 220 Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp 225 230 235 240 Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val 245 250 255 Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr 260 265 270 Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala 275 280 285 Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe 290 295 300 Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val 305 310 315 320 Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg 325 330 335 Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro 340 345 350 Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro 355 360 365 Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala 370 375 380 Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu 385 390 395 400 Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly 405 410 415 Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu 420 425 430 Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser 435 440 445 Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly 450 455 460 Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu 465 470 475 480 His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 <210> 50 <211> 1464 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR0037 <400> 50 tacccatacg atgttccaga ttacgctgac atccagatga cccagtctcc atcctccctg 60 tctgcatctg taggagacag agtcaccatc acttgccggg caagtcagag cattagcagc 120 tatttaaatt ggtatcagca gaaaccaggg aaagccccta agctcctgat ctatgctgca 180 tccagtttgc aaagtggggt cccatcaagg ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc 240 actctcacca tcagcagtct gcaacctgaa gattttgcaa cttactactg tcagcaaaaa 300 tacgacctcc tcacttttgg cggagggacc aaggttgaga tcaaaggcag caccagcggc 360 tccggcaagc ctggctctgg cgagggcagc acaaagggac agctgcagct gcaggagtcg 420 ggcccaggac tggtgaagcc ttcggagacc ctgtccctca cctgcactgt ctctggtggc 480 tccatcagca gtagtagtta ctactggggc tggatccgcc agcccccagg gaaggggctg 540 gagtggattg ggagtatctc ctatagtggg agcacctact acaacccgtc cctcaagagt 600 cgagtcacca tatccgtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagttctgtg 660 accgccgcag acacggcggt gtactactgc gccagagatc gtggagacac catactagac 720 gtatggggtc agggtacaat ggtcaccgtc agctcattcg tgcccgtgtt cctgcccgcc 780 aaacctacca ccacccctgc ccctagacct cccaccccag ccccaacaat cgccagccag 840 cctctgtctc tgcggcccga agcctgtaga cctgctgccg gcggagccgt gcacaccaga 900 ggcctggact tcgcctgcga catctacatc tgggcccctc tggccggcac ctgtggcgtg 960 ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac tgcaaccacc ggaacagaag caagcggagc 1020 cggctgctgc acagcgacta catgaacatg accccaagac ggcctggccc cacccggaag 1080 cactaccagc cttacgcccc tcccagagac ttcgccgcct accggtccag agtgaagttc 1140 agcagatccg ccgacgcccc tgcctaccag cagggacaga accagctgta caacgagctg 1200 aacctgggca gacgggaaga gtacgacgtg ctggacaagc ggagaggccg ggaccccgag 1260 atgggcggaa agcccagacg gaagaacccc caggaaggcc tgtataacga actgcagaaa 1320 gacaagatgg ccgaggccta cagcgagatc ggcatgaagg gcgagcggag gcgcggcaag 1380 ggccacgatg gcctgtacca gggcctgagc accgccacca aggacaccta cgacgccctg 1440 cacatgcagg ccctgccccc caga 1464 <210> 51 <211> 480 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR0085 <400> 51 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Tyr Asp Leu Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser 100 105 110 Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Leu Gln Leu 115 120 125 Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu 130 135 140 Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp 145 150 155 160 Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser 165 170 175 Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg 180 185 190 Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu 195 200 205 Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp 210 215 220 Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr 225 230 235 240 Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr 245 250 255 Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro 260 265 270 Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val 275 280 285 His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro 290 295 300 Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu 305 310 315 320 Tyr Cys Asn His Arg Asn Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile 325 330 335 Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp 340 345 350 Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu 355 360 365 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 370 375 380 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 385 390 395 400 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 405 410 415 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 420 425 430 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 435 440 445 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 450 455 460 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 465 470 475 480 <210> 52 <211> 1440 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAR0085 <400> 52 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg caacttacta ctgtcagcaa aaatacgacc tcctcacttt tggcggaggg 300 accaaggttg agatcaaagg cagcaccagc ggctccggca agcctggctc tggcgagggc 360 agcacaaagg gacagctgca gctgcaggag tcgggcccag gactggtgaa gccttcggag 420 accctgtccc tcacctgcac tgtctctggt ggctccatca gcagtagtag ttactactgg 480 ggctggatcc gccagccccc agggaagggg ctggagtgga ttgggagtat ctcctatagt 540 gggagcacct actacaaccc gtccctcaag agtcgagtca ccatatccgt agacacgtcc 600 aagaaccagt tctccctgaa gctgagttct gtgaccgccg cagacacggc ggtgtactac 660 tgcgccagag atcgtggaga caccatacta gacgtatggg gtcagggtac aatggtcacc 720 gtcagctcat tcgtgcccgt gttcctgccc gccaaaccta ccaccacccc tgcccctaga 780 cctcccaccc cagccccaac aatcgccagc cagcctctgt ctctgcggcc cgaagcctgt 840 agacctgctg ccggcggagc cgtgcacacc agaggcctgg acttcgcctg cgacatctac 900 atctgggccc ctctggccgg cacctgtggc gtgctgctgc tgagcctggt gatcaccctg 960 tactgcaacc accggaacaa acggggcaga aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca 1020 tttatgagac cagtacaaac tactcaagag gaagatggct gtagctgccg atttccagaa 1080 gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg aagttcagca gatccgccga cgcccctgcc 1140 taccagcagg gacagaacca gctgtacaac gagctgaacc tgggcagacg ggaagagtac 1200 gacgtgctgg acaagcggag aggccgggac cccgagatgg gcggaaagcc cagacggaag 1260 aacccccagg aaggcctgta taacgaactg cagaaagaca agatggccga ggcctacagc 1320 gagatcggca tgaagggcga gcggaggcgc ggcaagggcc acgatggcct gtaccagggc 1380 ctgagcaccg ccaccaagga cacctacgac gccctgcaca tgcaggccct gccccccaga 1440 1440

Claims (30)

  1. BCMA-결합 도메인, 막관통 도메인(transmembrane domain), 공동자극 도메인(costimulatory domain) 및 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)을 포함하는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)로,
    상기 BCMA-결합 도메인은 BCMA와 특이적으로 결합할 수 있는 항체 또는 이의 단편을 포함하며,
    상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR1(heavy chain complementary determining region 1: HCDR1), 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR2(heavy chain complementary determining region 2: HCDR2) 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 CDR3(heavy chain complementary determining region 3: HCDR3) 및
    서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR1(light chain complementary determining region 1: LCDR1), 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR2(light chain complementary determining region 2: LCDR2) 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 CDR3(light chain complementary determining region 3: LCDR3)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(heavy chain cariable region)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  4. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 15의 경쇄 가변 영역(light chain variable region)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  5. 제1항에 있어서, 상기 항체는 단일쇄(single-chain) 항체 단편인 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  6. 제1항에 있어서, 상기 항체는 서열번호 43의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  7. 제1항에 있어서, 막관통 도메인(transmembrane domain)은 T 세포 수용체의 α, β 또는 ζ 쇄(chain), CD28, CD3e, CD45, CD4, CD5, CD8a, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137 및 CD154로 구성되는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래된 막관통 도메인(transmembrane domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  8. 제1항에 있어서, 상기 막관통 도메인(transmembrane domain)은 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  9. 제1항에 있어서, 상기 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 CD28, 4-1BB, OX-40 및 ICOS로 구성되는 그룹에서 선택된 단백질로부터 유래된 공동자극 도메인(costimulatory domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  10. 제1항에 있어서, 상기 공동자극 도메인(costimulatory domain)은 서열번호 29 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  11. 제1항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)은 CD3ζ에서 유래된 신호전달 도메인(signal transduction domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  12. 제1항에 있어서, 상기 세포 내 신호전달 도메인(intracellular signal transduction domain)은 서열번호 33의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  13. 제1항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 BCMA-결합 도메인을 막관통 도메인(transmembrane domain)에 연결하는 힌지 부위(hinge region)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  14. 제13항에 있어서, 상기 힌지 부위(hinge region)는 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  15. 제1항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 추가로 신호(signal) 펩타이드에 연결되는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  16. 제15항에 있어서, 상기 신호(signal) 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  17. 제1항에 있어서, 상기 키메릭 항원 수용체(CAR)는 추가로 절단(cleaving) 펩타이드에 연결되는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  18. 제17항에 있어서, 상기 절단(cleaving) 펩타이드는 T2A 펩타이드 유래 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  19. 제17항에 있어서, 상기 절단(cleaving) 펩타이드는 서열번호 35의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  20. 제1항에 있어서, 서열번호 49 또는 51의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키메릭 항원 수용체(CAR).
  21. 제1항의 키메릭 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
  22. 제21항에 있어서, 서열번호 50 또는 52의 핵산서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  23. 제21항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  24. 제23항에 있어서, 상기 벡터는 플라스미드(plasmid), 레트로바이러스(retroviral) 벡터 및 렌티바이러스(lentiviral) 벡터에서 선택되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  25. 제1항 또는 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항의 키메릭 항원 수용체(CAR), 제21항 또는 제22항의 핵산 분자, 또는 제23항 또는 제24항의 벡터를 포함하는 면역 효과기 세포(immune effector cell).
  26. 제25항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포(immune effector cell)는 T 림프구 및 자연 살해 (natural killer: NK) 세포에서 선택되는 것을 특징으로 하는 면역 효과기 세포(immune effector cell).
  27. 제23항의 벡터를 분리된 면역 효과기 세포(immune effector cell) 내로 도입하는 단계를 포함하는 면역 효과기 세포(immune effector cell)의 제조방법.
  28. 제25항의 면역 효과기 세포(immune effector cell)를 포함하는 암 또는 악성 종양 치료용 조성물.
  29. 삭제
  30. 삭제
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