CN114891108B - 一种靶向bcma的全人源抗体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向BCMA的全人源抗体及其应用，所述靶向BCMA的全人源抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO.6所示的HCDR3，SEQ ID NO.4所示的HCDR1，SEQ ID NO.5所示的HCDR2，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.3所示的LCDR3，SEQ ID NO.1所示的LCDR1，SEQ ID NO.2所示的LCDR2。所述靶向BCMA的全人源抗体以高亲和力特异性结合BCMA，且与异源抗体相比，所述靶向BCMA的全人源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物及细胞治疗药物开发上有巨大的应用潜力。

Description

一种靶向BCMA的全人源抗体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种靶向BCMA的全人源抗体及其应用，尤其涉及与人BCMA抗原蛋白和细胞膜表面天然状态的BCMA抗原特异性结合的全人源抗体。
背景技术
BCMA全称为B细胞成熟抗原，也称CD269，是III型跨膜蛋白，不含信号肽，含有富含半胱氨酸的胞外域，仅表达在成熟B细胞表面，在T细胞或单核细胞中都不表达，是一种重要的B细胞生物标记物。编码BCMA的基因属于TNF受体超家族成员，所述TNF受体优先在成熟B淋巴细胞中表达，对B细胞发育和自身免疫应答起着重要作用。所述TNF受体特异性结合肿瘤坏死因子（配体）超家族成员13b（TNFSF13B/TALL-1/BAFF），并导致NF-κB和MAPK8/JNK活化。所述TNF受体还与各种TRAF家族成员结合，介导细胞存活和增殖的信号。在多发性骨髓瘤中BCMA的表达增加，促增殖信号增强，最终癌化。因此，在多发性骨髓瘤细胞上BCMA的表达水平显著高于健康的浆细胞。
BCMA是一个极其重要的B细胞生物标志物，广泛存在于多发性骨髓瘤（MM）细胞表面，是MM和其他血液系统恶性肿瘤的热门免疫治疗靶点。多发性骨髓瘤是浆细胞通常无法治愈的恶性肿瘤。
以BCMA为靶点的免疫疗法在临床前及临床研究中疗效显著，尤其是CAR-T技术，能够以非主要组织相容性复合体依赖性方式特异识别肿瘤抗原而发挥强大的抗肿瘤免疫效应。但治疗过程中出现的CRS、脱靶效应等不良反应仍是亟待解决的问题，更有效而安全的靶向BCMA免疫治疗MM的新方法正在研究中。相信未来会有更多的靶向BCMA的新型疗法，通过单独或与其他靶点的联合应用，在MM治疗的临床研究中被验证评估，从而提供选择性更高、耐受性更好的多发性骨髓瘤免疫治疗新途径。
因此，开发能够对BCMA表达的细胞发挥临床有效的细胞毒性、细胞抑制或免疫抑制效应，且对BCMA不表达的细胞无不良影响的全人源抗体，对研发BCMA表达相关的免疫治疗产品，具有非常重要的意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种靶向BCMA的全人源抗体及其应用。本发明中所述靶向BCMA的全人源抗体以高亲和力特异性结合BCMA，且与异源抗体相比，所述靶向BCMA的全人源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物及细胞治疗药物开发上有巨大的应用潜力。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种靶向BCMA的全人源抗体，所述靶向BCMA的全人源抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO.6所示的HCDR3，SEQ ID NO.4所示的HCDR1，SEQID NO.5所示的HCDR2；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO.3所示的LCDR3，SEQ ID NO.1所示的LCDR1，SEQID NO.2所示的LCDR2。
SEQ ID NO.1：SSNIGAGYI。
SEQ ID NO.2：FTG。
SEQ ID NO.3：QSFDRSLGGYV。
SEQ ID NO.4：GGSISSSSYY。
SEQ ID NO.5：ISYSGST。
SEQ ID NO.6：ARDRGDTILDV。
优选地，所述靶向BCMA的全人源抗体为单链抗体。
优选地，所述全人源抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示的序列，和/或所述全人源抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示的序列。
SEQ ID NO.7：
MAQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS。
SEQ ID NO.8：
QSVLTQPPSVSGAPGQTVTISCTGSSSNIGAGYIVNWYQQLPGTAPKLLIYFTGNRPSGVPGRFSGSRSGTSASLAITRLQAEDEADYYCQSFDRSLGGYVFGTATKVTVL。
优选地，所述靶向BCMA的全人源抗体的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.9具有至少90%的序列一致性的序列，例如可以是95%、98%、99%或100%等。
优选地，所述靶向BCMA的全人源抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的序列。
SEQ ID NO.9：
QSVLTQPPSVSGAPGQTVTISCTGSSSNIGAGYIVNWYQQLPGTAPKLLIYFTGNRPSGVPGRFSGSRSGTSASLAITRLQAEDEADYYCQSFDRSLGGYVFGTATKVTVLGSRGGGGSGGGGSGGGGSLEMAQLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSSSYYWGWIRQPPGKGLEWIGSISYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARDRGDTILDVWGQGTMVTVSS。
第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述的靶向BCMA的全人源抗体。
优选地，所述核酸分子包括SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12中任一项所示的核苷酸序列。
在本发明中，编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码所述单链抗体的核苷酸序列如SEQ IDNO.12所示。
SEQ ID NO.10：
atggcccagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagagatcgtggagacaccatactagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtctcttca。
SEQ ID NO.11：
cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctggggccccaggacagacggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaatatcggggcaggttatattgttaactggtaccagcagcttccgggcacagcccccaaactcctcatctattttaccggcaatcggccctcaggagtccctggccgattctctggctccaggtctggcacctcagcctccctggccatcactcggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcctttgacaggagcctgggtggttacgtcttcggaactgcgaccaaggtcaccgtccta。
SEQ ID NO.12：
cagtctgtgttgacgcagccgccctcagtgtctggggccccaggacagacggtcaccatctcctgcactgggagcagctccaatatcggggcaggttatattgttaactggtaccagcagcttccgggcacagcccccaaactcctcatctattttaccggcaatcggccctcaggagtccctggccgattctctggctccaggtctggcacctcagcctccctggccatcactcggctccaggctgaggatgaggctgattattactgccagtcctttgacaggagcctgggtggttacgtcttcggaactgcgaccaaggtcaccgtcctaggttctagaggtggtggtggtagcggcggcggcggctctggtggtggtggatccctcgagatggcccagctgcagctgcaggagtcgggcccaggactggtgaagccttcggagaccctgtccctcacctgcactgtctctggtggctccatcagcagtagtagttactactggggctggatccgccagcccccagggaaggggctggagtggattgggagtatctcctatagtgggagcacctactacaacccgtccctcaagagtcgagtcaccatatccgtagacacgtccaagaaccagttctccctgaagctgagttctgtgaccgccgcagacacggcggtgtactactgcgccagagatcgtggagacaccatactagacgtatggggtcagggtacaatggtcaccgtctcttca。
第三方面，本发明提供一种表达载体，所述表达载体含有第二方面所述的核酸分子。
在本发明中，所述载体包括质粒载体或病毒载体，所述病毒载体包括逆转录病毒或慢病毒。
第四方面，本发明提供一种宿主细胞，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的第三方面所述的表达载体。
第五方面，本发明提供一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的靶向BCMA的全人源抗体，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
第六方面，本发明提供一种用于检测样品中BCMA蛋白的试剂盒，所述试剂盒包括第一方面所述的靶向BCMA的全人源抗体。
第七方面，本发明提供第一方面所述的靶向BCMA的全人源抗体、第四方面所述的宿主细胞或第五方面所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于预防、减轻、改善或抑制疾病或病症的药物中的用途。
优选地，所述疾病或病症选自：癌症和/或自身免疫性疾病。
优选地，所述癌症为浆细胞恶性肿瘤疾病或B细胞恶性肿瘤疾病。
优选地，所述癌症为多发性骨髓瘤。
在本发明中，可以通过向有需要的受试者施用治疗有效量的所述靶向BCMA的全人源抗体、宿主细胞或药物组合物中任意一种或至少两种的组合来消除、抑制或降低BCMA活性，从而预防、减轻、改善或抑制疾病或病症。
本发明所述的数值范围不仅包括上述例举的点值，还包括没有例举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
（1）本发明中所述靶向BCMA的全人源抗体的特异性强，与BCMA阳性细胞系结合，与BCMA阴性细胞系不结合。
（2）本发明中所述靶向BCMA的全人源抗体以高亲和力特异性结合BCMA，与异源抗体相比，所述靶向BCMA的全人源抗体具有更低的免疫原性。
附图说明
图1为本发明从噬菌体抗体库筛选靶向BCMA的全人源抗体的大体流程。
图2为实施例2中所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果。
图3为实施例2中所淘选的部分噬菌体单克隆与293CT-BCMA和293CT细胞结合的流式细胞分析结果。
图4为实施例3中噬菌体单克隆与BCMA阳性的细胞系和BCMA阴性的细胞系的流式细胞分析结果。
图5为实施例4中噬菌体单克隆与多种不同种属的BCMA抗原蛋白和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果。其中，每个测试抗体和对照组对应的柱形图从左至右依次表示与蛋白Human-BCMA-his-Bio、Mouse-BCMA-his，Cyno-BCMA-his、Human-BAFFR-his-Bio、Human-IL10-his-Bio、SA的测试结果。
图6A为实施例5中筛选得到的噬菌体单克隆表达为蛋白抗体后与BCMA过表达细胞系293CT-BCMA结合的情况。
图6B为实施例5中筛选得到的噬菌体单克隆表达为蛋白抗体后与BCMA阳性肿瘤细胞MM.1S的结合情况。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
“抗体”：指由浆细胞（效应B细胞）分泌、被机体免疫系统用来中和外来物质（多肽、病毒或细菌等）的免疫球蛋白。所述外来物质相应地称作抗原。抗体分子的基本结构是由2个相同重链和2个相同轻链组成的4聚体。根据氨基酸序列的保守性差异，将重链和轻链分为位于氨基端的可变区（V）和位于羧基端的恒定区（C）。一条重链的可变区（HCVR，也称为VH）和一条轻链的可变区（LCVR，也称为VL）相互作用形成了抗原结合部位（Fv）。在可变区中，某些区域氨基酸残基的组成和排列次序比可变区内的其它区域（骨架区，FR）更易变化，称为高变区（HVR），高变区实际上是抗体与抗原结合的关键部位。由于这些高变区序列与抗原决定簇互补，故又称为互补决定区（complementarity-determining region，CDR）。重链和轻链均具有三个互补决定区，分别称为HCDR1、HCDR2、HCDR3，和LCDR1、LCDR2、LCDR3。
“鼠源抗体”是由鼠类针对特异抗原产生的抗体，通常指小鼠B淋巴细胞产生的抗体。在大多情况下，所述鼠源抗体为杂交瘤细胞产生的单克隆抗体。本申请的全人源抗体是从人源噬菌体抗体库筛选获得，其相对于鼠源抗体降低了免疫原性，更利于人体的治疗用途。
本申请所述的“全人源抗体或单链抗体”通常是指能够与靶抗原结合的任何形式的抗原结合分子，例如所述抗原结合分子可为蛋白质或多肽，例如抗体及其抗原结合片段、单链ScFv抗体、单域抗体、基于ScFv构建的各种融合物和缀合物，例如ScFv-Fc抗体、免疫缀合物、抗体药物偶联物（ADC）、多/双特异性抗体、嵌合抗原受体（CAR）。
“BCMA”全称为B细胞成熟抗原，也称CD269，是III型跨膜蛋白，不含信号肽，含有富含半胱氨酸的胞外域，仅表达在成熟B细胞表面，在T细胞或单核细胞中都不表达，是一种重要的B细胞生物标记物。编码BCMA的基因属于TNF受体超家族成员，所述TNF受体优先在成熟B淋巴细胞中表达，对B细胞发育和自身免疫应答起着重要作用。所述TNF受体特异性结合肿瘤坏死因子（配体）超家族成员13b（TNFSF13B/TALL-1/BAFF），并导致NF-κB和MAPK8/JNK活化。所述TNF受体还与各种TRAF家族成员结合，介导细胞存活和增殖的信号。在多发性骨髓瘤中BCMA的表达增加，促增殖信号增强，最终癌化。因此，在多发性骨髓瘤细胞上BCMA的表达水平显著高于健康的浆细胞。
提及氨基酸或核苷酸序列时，术语“序列一致性（Sequence identity）”（也称为“序列同一性”）指两氨基酸或核苷酸序列（例如查询序列和参照序列）之间一致性程度的量，一般以百分比表示。通常，在计算两氨基酸或核苷酸序列之间的一致性百分比之前，先进行序列比对（alignment）并引入缺口（gap）（如果有的话）。如果在某个比对位置，两序列中的氨基酸残基或碱基相同，则认为两序列在该位置一致或匹配；两序列中的氨基酸残基或碱基不同，则认为在该位置不一致或错配。在一些算法中，用匹配位置数除以比对窗口中的位置总数以获得序列一致性。在另一些算法中，还将缺口数量和/或缺口长度考虑在内。出于本发明的目的，可以采用公开的比对软件BLAST（可在网页ncbi.nlm.nih.gov找到），通过使用缺省设置来获得最佳序列比对并计算出两氨基酸或核苷酸序列之间的序列一致性。在一些实施方案中，本申请所述“至少90%序列一致性”包括但不限于：至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性的情形。
在一些实施方案中，本申请提供的单链抗体还包括与SEQ ID NO.9所示序列有至少90%序列一致性（例如，至少95%、至少98%、至少99%或甚至100%序列一致性）的氨基酸序列。
本领域技术人员可以理解的是，在本文提供的具体序列基础上，可以通过对少数氨基酸进行替换、删除、添加并验证或筛选所得产物与相应抗原BCMA的结合能力或生物学活性，从而获得本文提供的靶向BCMA抗体的相应变体，这些变体也应包括在本发明的范围内。
本领域技术人员还可以理解的是，在本文提供的具体重链可变区序列基础上，可以通过以BCMA作为抗原筛选抗体轻链库（如人源噬菌体轻链库），从而获得与所述重链可变区匹配并维持BCMA结合能力的轻链可变区。以此方式可获得的抗BCMA抗体分子也包括在本发明的范围内。
在一些实施方案中，本申请的抗原结合分子可以进一步包含转译后修饰。转译后蛋白修饰的示例包括：磷酸化、乙酰化、甲基化、ADP-核糖化、泛素化、糖基化、羰基化、类泛素化、生物素化或加入多肽侧链或疏水基团。因此，经修饰的可溶性多肽可以包含非氨基酸成分，例如类脂、多聚糖或单糖、以及磷酸盐。糖基化的一种优选形式是唾液酸化修饰，将一个或多个唾液酸基团与多肽结合。唾液酸基团改善蛋白质的溶解性和血清半衰期，同时也降低蛋白质可能的免疫遗传性。参见Raju et al. Biochemistry. 2001 31; 40(30):8868-76。
本发明中提及的药物组合物，所使用的“药学上可接受的载体”指可以安全地进行施用的固体或液体稀释剂、填充剂、抗氧化剂或稳定剂等物质，这些物质适合于人和/或动物给药而无过度的不良副反应，同时适合于维持位于其中的药物或活性剂的活力。
“治疗有效量”指足以在受试者体内引起临床医师所期望的生物学或医学反应的活性化合物的量。本申请抗体的“治疗有效量”可由本领域技术人员根据给药途径、受试者的体重、年龄、病情等因素而确定。例如，典型的日剂量范围可以为每kg体重0.01 mg至100mg活性成分。本发明的抗体的施用方式包括但不限于注射，例如通过静脉内、肌内、动脉内、皮下或腹膜内等。
“表位”是指受抗原结合蛋白（例如，抗体）约束的分子的部分。表位可以包含该分子的非相邻的部分（例如在多肽中，在多肽的主要序列上不相邻、但在该多肽的三价和四价结构中彼此足够靠近以被抗原结合蛋白约束的氨基酸残基）。
本申请提供的一种试剂盒，包含一个或多个容器，装有大量编码本申请多肽的基因构建体，及药学上可接受的赋形剂。所述试剂盒也可以包含使用说明。试剂盒上还可以有管理生产、使用或销售药品或生物制品的政府机构所规定形式的通知，该通知表明已获人用药的生产、使用或销售机构许可。
研究概述：
本发明使用全人源噬菌体进行抗体筛选，直接获得全人源的单克隆抗体。与传统杂交瘤技术相比，省却了困难的鼠源抗体人源化步骤，而且全人源抗体比人源化的鼠源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物（包括单抗、双抗或ADC等）、细胞治疗药物（包括CAR-T或CAR-NK等）、检测试剂等应用上有更好的潜力。
在抗体筛选的过程中，发明人发现直接使用重组表达的BCMA蛋白筛选到的抗体克隆，都不能与高表达BCMA的细胞系293CT-BCMA结合。这可能是重组表达的BCMA蛋白抗原与细胞膜表面的天然状态的BCMA由于构象和可及抗原表位有很大的差别所致。为了克服这个问题，发明人使用蛋白/细胞系交替淘选的方法，富集了能同时结合重组表达BCMA蛋白和293CT-BCMA细胞的噬菌体抗体，并从中筛选到了能特异结合细胞膜表面BCMA抗原的单克隆抗体。
具体来说，发明人应用大容量噬菌体抗体库筛选全人源的BCMA特异抗体，并通过ELISA和FACS实验来评估这些抗体在phage水平的特异性。最终，发明人获得了若干特异性良好的全人源抗体克隆。
发明人使用不同的抗体库，经过重组BCMA蛋白淘选和蛋白/细胞交替淘选，总共挑选了184个单克隆进行酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术（FACS）检测初筛，其中38个克隆特异结合BCMA-His-Bio蛋白和BCMA表达阳性细胞293CT-BCMA，而不结合对照蛋白SA和BCMA表达阴性细胞293CT。测序后得到了5种不同的单克隆序列。随后，我们将这5种抗体与多种BCMA阳性（293CT-BCMA，MM.1S）和阴性细胞系（293CT，K562）进行流式细胞分析（FACS）鉴定，与不同种属的BCMA蛋白（Human-BCMA-his-Bio，生物素化的人BCMA蛋白；Mouse-BCMA-his，鼠的BCMA蛋白；Cyno-BCMA-his，食蟹猴的BCMA蛋白），非相关蛋白（Human-BAFFR-his-Bio，生物素化的人BAFFR蛋白；Human-IL10-his-Bio，生物素化的人IL10蛋白；Streptavidin，链霉亲和素蛋白，SA）进行酶联免疫吸附（ELISA）鉴定，其中1个克隆在多个细胞系和多种蛋白抗原上都表现出良好的结合力和特异性。这些克隆的获得为后续开发全人源的BCMA CAR-T产品或者抗体药奠定了基础。总体研发流程如图1所示。在以下实施例中，G1-G10为经过亲和淘选和筛选得到的部分噬菌体单克隆；将筛选得到的阳性噬菌体单克隆进行测序，测序后得到了5种不同的单克隆序列，5种不同的单克隆序列所对应的噬菌体单克隆记为Clone 29、Clone 32、Clone 39、Clone 41和Clone 4；mAb 29、mAb 32、mAb39、mAb 41和mAb 42分别为噬菌体单克隆Clone 29、Clone 32、Clone 39、Clone 41表达的蛋白抗体。
其中，Clone 41的亲和力高于其余克隆，且特异性良好，是本申请要求保护的抗体。经测序后确认，Clone 41的重链可变区包括SEQ ID NO.6所示的HCDR3，SEQ ID NO.4所示的HCDR1，SEQ ID NO.5所示的HCDR2；其轻链可变区包括SEQ ID NO.3所示的LCDR3，SEQID NO.1所示的LCDR1，SEQ ID NO.2所示的LCDR2。Clone 41的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示的序列，Clone 41的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示的序列。利用Clone 41构建的单链抗体，其氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的序列。编码Clone41重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，编码Clone 41轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，编码Clone 41单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
以下结合具体实施例详细说明本发明。
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
以下实施例中所使用的试剂盒材料的来源如表1所示：
表1
Figure 212872DEST_PATH_IMAGE001
实施例1 通过亲和淘选从噬菌体抗体库富集靶向BCMA蛋白的特异抗体克隆
采用合适的负淘选和正淘选策略从噬菌体抗体库中富集所需的特异性抗体克隆。
BCMA蛋白淘选：以BCMA-His作为正淘选蛋白进行多轮淘选，获得富集目的抗体克隆的噬菌体池（pool）。实验步骤简述如下：
（1）将SA磁珠先用封闭液封闭2 h，然后再将靶抗原（BCMA-His）与封闭好的SA磁珠结合；
（2）将噬菌体文库（含5×1012个噬菌体颗粒）和一份干净的SA磁珠一起孵育，以便扣除非特异结合SA磁珠的噬菌体抗体克隆；
（3）孵育后将上清转移到结合了靶抗原的SA磁珠中，继续孵育，使噬菌体和靶抗原结合；
（4）用洗涤液洗涤磁珠，将未结合的噬菌体洗去；
（5）用洗脱液将阳性噬菌体从靶抗原上洗脱下来，加入中和液中和；
（6）以洗脱后的噬菌体重新感染宿主菌XL1-blue，扩增回收的噬菌体；留少量样品梯度稀释，感染宿主菌，涂Amp抗性平板，计算回收噬菌体数量；
（7）重复步骤（1）至（6），通常需要进行2轮淘选，直到观察到噬菌体的回收率（洗脱噬菌体数/投入噬菌体数）有明显上升。
293CT-BCMA/293CT细胞淘选：以BCMA表达阴性的293CT细胞作为负淘选细胞，以BCMA表达阳性的293CT-BCMA细胞作为正淘选细胞进行多轮淘选，以获得富集了目的抗体克隆的噬菌体池。293CT-BCMA/293CT细胞淘选实验步骤如下所示：
（1）将经蛋白淘选后富集了特异性克隆的噬菌体池（含5×1011个噬菌体颗粒）与1×107个负淘选细胞293CT混匀，在旋转混合仪上，室温孵育2 h，让与负淘细胞系结合的抗体克隆与这些细胞充分结合；
（2）以1500 rpm离心5 min，沉淀细胞，将上清转移到新管中，与1×107个293CT-BCMA细胞（BCMA阳性细胞）混匀，在旋转混合仪上，室温结合2 h；
（3）用PBS洗涤细胞6次，每次吸弃上清，重悬后1500 rpm离心5 min，以去除未结合的噬菌体；
（4）用洗脱液将阳性噬菌体从靶抗原上洗脱下来，加入中和液中和；
（5）用洗脱后的噬菌体重新感染宿主菌，扩增回收的噬菌体；留少量样品梯度稀释，感染宿主菌，涂Amp抗性平板，计算回收噬菌体数量；
（6）重复步骤（1）至（5），通常需要进行2至3轮淘选，直到观察到噬菌体的回收率（洗脱噬菌体数/投入噬菌体数）有明显上升。
本实施例中所使用的主要材料和试剂如下所示：
辅助噬菌体KO7；
Biotinylated Human BCMA / TNFRSF17 Protein(hBCMA-bio-his)；
BeaverBeads™ Streptavidin；
High binding ELSIA plate；
封闭液：PBS+3% BSA；
漂洗液：PBS+ 0.1% Tween20；
洗脱液：0.2M Glycine，pH2.2；
中和液：1M Tris，pH9.1。
富集好的噬菌体池可进行下一步的单克隆挑选及ELISA/FACS筛选。使用不同的抗体库，通过3轮蛋白淘选和2轮细胞淘选，每个淘选都观察到了回收率的显著上升，结果如表2所示，表2为蛋白/细胞淘选实验结果，结果证明抗体克隆得到了有效富集。
在实验中采用了蛋白和细胞交替淘选的方法从噬菌体抗体库中富集可以同时结合BCMA蛋白和细胞表面天然状态的BCMA的特异性抗体克隆。表2显示了利用重组BCMA蛋白、293CT-BCMA细胞系和293CT细胞系联合淘选的结果。从回收率来看，所有淘选都得到了富集，可以用于下一步挑选单克隆。
表2
Figure 661171DEST_PATH_IMAGE002
实施例2 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术（FACS）从经富集的噬菌体池筛选特异性克隆
通过亲和淘选步骤富集的噬菌体池中包含各种性质的噬菌体抗体，包括特异克隆、非特异克隆以及阴性克隆。为了获得特异克隆，需要从中分离单克隆，包装成单克隆的噬菌体，并通过酶联免疫检测（ELISA）和流式细胞术（FACS）对大量单克隆进行初筛，从中挑选到同时特异结合BCMA蛋白和BCMA阳性细胞系293CT-BCMA的单克隆。特异结合的阳性单克隆再进一步通过DNA测序确定其中包含的唯一的抗体序列。
在ELISA初筛中，通过链霉亲和素Streptavidin与生物素Biotin的结合，使得生物素化的靶蛋白（BCMA-his-Bio）在反应液中更接近于天然状态的抗原构象。只结合BCMA-his-Bio而不结合对照抗原（Streptavidin，SA）的被认定为特异克隆。FACS初筛使用BCMA高表达的阳性细胞系293CT-BCMA和BCMA阴性的细胞系293CT来进行，只结合细胞293CT-BCMA且不结合293CT细胞的被认定为特异克隆。
通过ELISA和FACS两种初筛，可以获得既能结合重组表达的BCMA蛋白，又能识别细胞表面天然状态BCMA分子的候选抗体，供随后进一步筛选。ELISA初筛实验步骤如下所示：
（1）用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体；
（2）将Strepavidin用PBS稀释到2 μg/mL，以100 μL/孔加入到高结合酶标板中，室温结合2 h；
（3）弃掉包被液，每孔加入250 μL封闭液，4℃封闭过夜；
（4）250 μL漂洗液洗板2次；
（5）将带生物素标签的靶蛋白和对照蛋白用PBS稀释至2 μg/mL，以100 μg/孔加入预包被Strepavidin的酶标板中，室温结合1 h；
（6）250 μL漂洗液洗板2次；
（7）加入100 μL步骤（1）培养好的噬菌体上清到包被好靶抗原的孔，室温结合2 h；
（8）250 μL漂洗液洗板4次；
（9）加入1:2000稀释的mouse anti M13（Anti-M13 Bacteriophage Coat Proteing8p antibody）第一抗体，100 μL/孔，室温孵育45 min；
（10）250 μL漂洗液洗板4次；
（11）加入1:2000稀释的HRP Goat anti-mouse IgG（minimal x-reactivity）Antibody，100 μL/孔，室温孵育45 min；
（12）250 μL漂洗液洗板6次；
（13）加入100 μL TMB显色底物，显色5至10 min；
（14）加入100 μL 2M H2SO4终止反应，在酶标仪上读取结果。
FACS初筛实验步骤如下所示：
（1）用深孔96孔板培养和包装单克隆噬菌体；
（2）将293CT-BCMA细胞和293CT细胞用PBS洗2次，用PBS重悬成1×107/mL浓度，以50 μL分装到96孔深孔板中；
（3）每孔加入50 μL包装好的单克隆噬菌体，混匀后，4℃结合2 h；
（4）200 μL PBS洗涤2次；
（5）加入1:2000稀释的mouse anti M13第一抗体，100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45 min；
（6）200 μL PBS洗涤2次；
（7）加入1:300稀释的FITC horse anti mouse-IgG（H+L），100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45 min；
（8）200 μL PBS洗涤2次；最后用200 μL PBS重悬细胞；
（9）在流式细胞仪上检测样品FITC通道的荧光强度，分析结果。
本实施例中所使用的主要材料和试剂如下所示：
辅助噬菌体KO7；
Streptavidin；
Biotinylated Human BCMA/TNFRSF17 Protein；
High binding ELSIA plate；
Corning 96 Well Clear Round Bottom TC-Treated Microplate；
封闭液：PBS+3% BSA；
漂洗液：PBS+0.1% Tween20；
可溶型单组分TMB底物溶液；
Anti-M13 Bacteriophage Coat Protein g8p antibody；
HRP Goat anti-mouse IgG(minimal x-reactivity) Antibody；
FITC horse anti mouse-IgG(H+L)。
从富集后的噬菌体抗体池随机挑选单克隆，包装成噬菌体后，通过噬菌体ELISA检测单克隆噬菌体与BCMA-His-Bio蛋白（靶抗原）、SA蛋白（对照抗原）的结合，找到BCMA特异的噬菌体抗体克隆。所淘选的部分噬菌体单克隆与靶抗原和对照抗原的酶联免疫吸附测定（ELISA）结果如图2所示。从图中可知，G1-G3和G5-G8号克隆与靶抗原BCMA（BCMA-His-Bio）结合较强，且不与对照抗原链霉亲和素Streptavidin结合，特异性良好，G4，G9和G10克隆与靶抗原BCMA（BCMA-His-Bio）和链霉亲和素Streptavidin都不结合，为阴性克隆。
Negative phage control为阴性对照噬菌体抗体克隆（图中为Negativecontrol），与靶抗原和对照抗原都不结合，anti-M13 phage mouse Ab/anti-mouse HRP Ab为只加第一抗体和第二抗体的阴性抗体对照，anti-mouse HRP Ab为只加第二抗体的阴性抗体对照，它们与靶抗原和对照抗原都不结合，Positive control为靶抗原（BCMA-His-Bio）的阳性抗体对照，与靶抗原结合，与对照抗原不结合。
所淘选的部分噬菌体单克隆与293CT-BCMA和293CT细胞结合的流式细胞分析结果如图3所示。其中G1-G3和G5-G8克隆结合293CT-BCMA细胞，不结合293CT细胞，是特异克隆；其它克隆是阴性克隆（2种细胞都不结合）。
通过ELISA检测和FACS初筛，总共获得38个ELISA和FACS双阳性且特异性良好的克隆，随后将获得的38个双阳性且特异性良好的克隆测序，测序后得到了5种不同的单克隆序列，筛选得到的噬菌体单克隆记为Clone 29、Clone 32、Clone 39、Clone 41和Clone 42，然后将这5个不同序列的噬菌体单克隆进一步通过多细胞系的FACS鉴定和多种抗原的ELISA鉴定，检测候选噬菌体单克隆的结合特异性。
实施例3 采用多个细胞系通过FACS鉴定噬菌体单克隆特异性
用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；另一方面，不同的细胞系上同一抗原的氨基酸序列会有差异（异构体或突变体）或结合的配体不一样，也需要考察所得的抗体能否与各种靶蛋白阳性的细胞都结合。为了进一步分析这些单克隆的特异性和普适性，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过流式细胞术进一步评估初筛噬菌体单克隆的特异性。
在本实施例中，采用多种BCMA阳性的细胞系和多种BCMA阴性的细胞系与所得噬菌体单克隆进行反应，分析所得噬菌体单克隆是否可以结合不同的细胞系上的BCMA抗原，以及是否与其它不表达BCMA的细胞系有任何非特异的结合。通过这个实验，获得了若干具有优良特异性的噬菌体单克隆。本实施例的实验方法参照实施例2中的步骤。
本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：
293CT-BCMA细胞系（BCMA阳性细胞系）；
293CT细胞系（BCMA阴性细胞系）；
MM.1S细胞系（BCMA阳性细胞系）；
K562细胞系（BCMA阴性细胞系）；
其余试剂与FACS初筛相同。
用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析所得单克隆抗体（由噬菌体单克隆表达的蛋白抗体）的特异性，将实施例2筛选得到的单克隆Clone 29、Clone 32、Clone 39、Clone 41和Clone 42在更多的抗原和细胞系上应用流式细胞术进行了鉴定。噬菌体单克隆与BCMA阳性的细胞系和BCMA阴性的细胞系的流式细胞分析结果如图4所示，Negative Control为阴性对照噬菌体抗体克隆。Clone 32、Clone 39、Clone 41和Clone 42与BCMA高表达细胞系293CT-BCMA都结合，与BCMA阳性细胞系MM.1S的结合有强有弱，与2种BCMA阴性细胞系293CT和K562都不结合，特异性良好；Clone 29与阴性细胞系K562有弱结合，为非特异性克隆，不符合实验需要。
实施例4 采用多种非相关抗原通过ELISA鉴定噬菌体单克隆特异性
用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性，只结合靶抗原，而不结合任何无关的抗原；另一方面，抗体能否与不同种属的靶抗原结合，与动物实验的方案设计有关。为了进一步分析所得单克隆的特异性和物种交叉反应，寻找最佳的候选克隆，本实施例通过酶联免疫检测（ELISA）进一步评估初筛噬菌体单克隆的特异性。
在本实施例中，采用人源、鼠源和猴源的BCMA抗原和多种BCMA不相关抗原与单克隆噬菌体抗体进行反应，分析单克隆噬菌体抗体是否可以结合不同种属的BCMA抗原，以及是否与其它BCMA不相关抗原有任何非特异的结合。通过这个实验，获得了若干具有优良特异性的克隆。本实施例的实验方法参照实施例2中ELISA初筛实验。
本实施例所使用的主要样品和试剂如下所示：
Biotinylated Human BCMA/TNFRSF17 Protein, His,Avitag，简称，Human BCMA-his-Bio；
Cynomolgus/Rhesus macaque BCMA / TNFRSF17 Protein, His Tag，简称，Cyno-BCMA-his；
Mouse BCMA/TNFRSF17 Protein, His Tag，简称，Mouse-BCMA-his；
Biotinylated Recombinant human BAFFR Protein，简称，Human-BAFFR-his-Bio；
Biotinylated IL10, his tag，简称，Human-IL10 -his-Bio；
Streptavidin，简称，SA；
HRP mouse anti-his，简称，Anti-his HRP Ab；
其余试剂与ELISA初筛相同。
用于治疗的抗体必须具有非常好的靶点特异性。为了进一步分析这些单克隆抗体的特异性，将实施例2筛选得到的单克隆Clone 29、Clone 32、Clone 39、Clone 41和Clone42在多种抗原应用酶联免疫吸附（ELISA）进行了鉴定。噬菌体单克隆与多种不同种属的BCMA抗原蛋白和非相关抗原的酶联免疫吸附测定分析结果如图5所示，Negative control为阴性对照噬菌体抗体克隆，与靶抗原和对照抗原都不结合，anti-M13 phage mouse Ab/anti-mouse HRP Ab为只加第一抗体和第二抗体的阴性抗体对照，anti-mouse HRP Ab为只加第二抗体的阴性抗体对照，它们与靶抗原和对照抗原都不结合，anti-his HRP Ab为检测抗原标签的阳性对照抗体。其中，图5中，每个测试样品和对照组对应的柱形图从左至右依次表示与蛋白Human-BCMA-his-Bio、Mouse-BCMA-his，Cyno-BCMA-his、Human-BAFFR-his-Bio、Human-IL10-his-Bio、SA的测试结果。
Clone 29与非相关抗原有弱结合，为非特异性克隆，不符合实验需要；Clone 32、Clone 39、Clone 42与Human-BCMA-his-Bio、Mouse-BCMA-his和Cyno-BCMA-his抗原都结合，与3种非相关抗原都不结合，说明这三个特异性克隆，有鼠猴种属交叉，且特异性良好；Clone 41只与Human-BCMA-his-Bio和Cyno-BCMA-his抗原结合，不与Mouse-BCMA-his抗原结合，说明其具有人猴种属交叉，无人鼠种属交叉，且特异性良好。
实施例5 通过FACS检测单克隆抗体与高表达细胞系的结合能力
BCMA抗体分子与抗原间的亲和力大小可能对CAR-T或者抗体药在患者体内发挥杀伤作用及存续时间有着重要影响。本实施例采用了FACS binding方法分析抗体分子的半数有效浓度（Ec50），为研发过程提供重要的信息。FACS binding实验步骤如下所示：
（1）不同浓度抗体的准备：使用PBS将抗BCMA IgG（分别由Clone 29、Clone 32、Clone 39、Clone 41和Clone 42表达）从300 nM，依次5倍稀释，稀释至0.00384 nM共8个浓度，准备检测抗体与过表达细胞系293CT-BCMA和肿瘤阳性细胞MM.1S的结合能力；
（2）将293CT-BCMA细胞或者MM.1S细胞用PBS洗2次，用PBS重悬成1×107/mL浓度，以50 μL分装到96孔深孔板中；
（3）每孔加入50 μL稀释好的抗BCMA IgG，混匀后，4℃结合2 h；
（4）200 μL PBS洗涤2次；
（5）加入1:300稀释的Fluorescein (FITC) AffiniPure Goat Anti-Human IgG，100 μL/孔，吹打混匀后，室温孵育45 min；
（6）200 μL PBS洗涤2次；最后用200 μL PBS重悬细胞；
（7）在流式细胞仪上检测样品FITC通道的荧光强度；
（8）通过使用Graphpad Prism软件分析结合常数。
本实施例中所使用的主要样品和试剂如下所示：
293CT-BCMA细胞系（BCMA阳性细胞系）；
MM.1S细胞系（BCMA阳性细胞系）；
Fluorescein (FITC) AffiniPure Goat Anti-Human IgG, Fcγ fragmentspecific，简称Fluorescein (FITC) AffiniPure Goat Anti-Human IgG。
亲和力系指单个分子与其配体结合的强度，通常可以通过FACS检测与阳性细胞系的结合能力来评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。Ec50值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。如表3及图6A和图6B所示，图6A和图6B为筛选得到的噬菌体单克隆表达为蛋白抗体后与阳性细胞系的结合的流式分析结果，图6A和图6B的纵坐标为阳性细胞结合抗体的FITC通道平均荧光强度值与阴性对照的FITC通道的平均荧光强度值的倍数，图6A为mAb29、mAb 32、mAb 39、mAb 41、mAb 42与BCMA过表达细胞系293CT-BCMA结合的情况，图6B为mAb 29、mAb 32、mAb 39、mAb 41、mAb 42与BCMA阳性肿瘤细胞MM.1S的结合情况，综合两者的binding数据，mAb 41亲和力高于mAb 29、mAb 32、mAb 39和mAb 42。
表3
Figure 972066DEST_PATH_IMAGE003
实施例6 抗BCMA单克隆抗体的亲和力测定
BCMA单克隆抗体与抗原间的亲和力大小可能对CAR-T或者抗体药在患者体内发挥杀伤作用及存续时间有着重要影响，为了确定这一重要性质，本实施例采用了ForteBio公司的Octet分子相互作用技术对其进行了测定。Octet系统所运用的生物膜干涉技术，是一种免标记技术，实时提供高通量的生物分子相互作用信息。该仪器发射白光到传感器表面并收集反射光，不同频率的反射光谱受到生物传感器的光膜层厚度的影响，一些频率的反射光形成了相长干涉（蓝色），而另一些受到了相消干涉（红色）。这些干涉被光谱仪所检测到，并形成一幅干涉光谱，并以干涉光谱的相位位移强度（nm）显示。因此，结合到传感器表面的分子一旦有数量上的增减，光谱仪便会实时地检测到干涉光谱的位移，而这种位移直接反应出传感器表面生物膜的厚度，从中可以获取生物分子相互作用的高质量的数据，从而进行生物分子间相互作用动力学参数测定（Kon、Kdis和KD），为研发过程提供重要的信息。亲和力测定的实验步骤如下所示：
（1）用上样缓冲液（1×PBS，pH7.4，0.01% BSA和0.02% Tween 20）将抗BCMA IgG（将BCMA的ScFv序列与Human IgG4 Fc融合构成）稀释至20 μg/ mL，并在生物传感器上上样，约0.8 nM。
（2）在60 s平衡阶段后，在多种抗原浓度（100至1.563 nM）下监测BCMA抗原（Acro，CD5-H52H5）的结合动力学。在每个浓度下分别进行至160 s结合和300 s解离。
（3）用10 mM Glycine-HCl，pH1.5洗涤3次使芯片再生。
（4）通过使用1:1结合位点模型（Biacore X-100评估软件）分析结合常数。
亲和力系指单个分子与其配体结合的强度，通常通过平衡解离常数（KD）进行测定和报告，平衡解离常数可用于评估两分子间相互作用的强度并对此进行排序。抗体与其抗原的结合是一个可逆的过程，结合反应的速率与反应物的浓度成正比。KD值越小，抗体对其靶标的亲和力越大。亲和力检测结果如表4所示：Clone 29 IgG、Clone 32 IgG、Clone 39IgG、Clone 41 IgG和Clone 42 IgG均可与BCMA抗原结合，且Clone 41 IgG亲和力稍高于其他克隆。
表4
Figure 632855DEST_PATH_IMAGE004
综上，本发明中所述靶向BCMA的全人源抗体的特异性强，与BCMA阳性细胞系结合，与BCMA阴性细胞系不结合。所述靶向BCMA的全人源抗体以高亲和力特异性结合BCMA，且与异源抗体相比，所述靶向BCMA的全人源抗体具有更低的免疫原性，在抗体药物及细胞治疗药物开发上有巨大的应用潜力。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 南京驯鹿医疗技术有限公司
<120> 一种靶向BCMA的全人源抗体及其应用
<130> 2022
<160> 12
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Ile
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Phe Thr Gly
1
<210> 3
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Ser Phe Asp Arg Ser Leu Gly Gly Tyr Val
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 6
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val
1 5 10
<210> 7
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Met Ala Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro
1 5 10 15
Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser
20 25 30
Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly
35 40 45
Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn
50 55 60
Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 8
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Phe Thr Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Ala Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105 110
<210> 9
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Ile Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Phe Thr Gly Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Gly Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Arg Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Arg Ser
85 90 95
Leu Gly Gly Tyr Val Phe Gly Thr Ala Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
100 105 110
Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Leu Glu Met Ala Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
130 135 140
Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly
145 150 155 160
Ser Ile Ser Ser Ser Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro
165 170 175
Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr
180 185 190
Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
195 200 205
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
210 215 220
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly Asp Thr Ile Leu Asp
225 230 235 240
Val Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
245 250
<210> 10
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
atggcccagc tgcagctgca ggagtcgggc ccaggactgg tgaagccttc ggagaccctg 60
tccctcacct gcactgtctc tggtggctcc atcagcagta gtagttacta ctggggctgg 120
atccgccagc ccccagggaa ggggctggag tggattggga gtatctccta tagtgggagc 180
acctactaca acccgtccct caagagtcga gtcaccatat ccgtagacac gtccaagaac 240
cagttctccc tgaagctgag ttctgtgacc gccgcagaca cggcggtgta ctactgcgcc 300
agagatcgtg gagacaccat actagacgta tggggtcagg gtacaatggt caccgtctct 360
tca 363
<210> 11
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc caggacagac ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caatatcggg gcaggttata ttgttaactg gtaccagcag 120
cttccgggca cagcccccaa actcctcatc tattttaccg gcaatcggcc ctcaggagtc 180
cctggccgat tctctggctc caggtctggc acctcagcct ccctggccat cactcggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctttg acaggagcct gggtggttac 300
gtcttcggaa ctgcgaccaa ggtcaccgtc cta 333
<210> 12
<211> 756
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc caggacagac ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcagctc caatatcggg gcaggttata ttgttaactg gtaccagcag 120
cttccgggca cagcccccaa actcctcatc tattttaccg gcaatcggcc ctcaggagtc 180
cctggccgat tctctggctc caggtctggc acctcagcct ccctggccat cactcggctc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctttg acaggagcct gggtggttac 300
gtcttcggaa ctgcgaccaa ggtcaccgtc ctaggttcta gaggtggtgg tggtagcggc 360
ggcggcggct ctggtggtgg tggatccctc gagatggccc agctgcagct gcaggagtcg 420
ggcccaggac tggtgaagcc ttcggagacc ctgtccctca cctgcactgt ctctggtggc 480
tccatcagca gtagtagtta ctactggggc tggatccgcc agcccccagg gaaggggctg 540
gagtggattg ggagtatctc ctatagtggg agcacctact acaacccgtc cctcaagagt 600
cgagtcacca tatccgtaga cacgtccaag aaccagttct ccctgaagct gagttctgtg 660
accgccgcag acacggcggt gtactactgc gccagagatc gtggagacac catactagac 720
gtatggggtc agggtacaat ggtcaccgtc tcttca 756

Claims (12)

1.一种靶向BCMA的全人源抗体，其特征在于，所述靶向BCMA的全人源抗体包括重链可变区和轻链可变区；
所述重链可变区包括SEQ ID NO.6所示的HCDR3，SEQ ID NO.4所示的HCDR1，SEQ IDNO.5所示的HCDR2；
所述轻链可变区包括SEQ ID NO.3所示的LCDR3，SEQ ID NO.1所示的LCDR1，SEQ IDNO.2所示的LCDR2。
2.根据权利要求1所述的靶向BCMA的全人源抗体，其特征在于，所述靶向BCMA的全人源抗体为单链抗体。
3.根据权利要求1所述的靶向BCMA的全人源抗体，其特征在于，所述全人源抗体的重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.7所示的序列，和/或所述全人源抗体的轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示的序列。
4.根据权利要求2所述的靶向BCMA的全人源抗体，其特征在于，所述靶向BCMA的全人源抗体的氨基酸序列包括与SEQ ID NO.9具有至少90%的序列一致性的序列。
5.根据权利要求4所述的靶向BCMA的全人源抗体，其特征在于，所述靶向BCMA的全人源抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示的序列。
6.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-5中任一项所述的靶向BCMA的全人源抗体。
7.根据权利要求6所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括SEQ ID NO.10、SEQID NO.11或SEQ ID NO.12中任一项所示的核苷酸序列。
8.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求6或7所述的核酸分子。
9.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中含有至少一个拷贝的权利要求8所述的表达载体。
10.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-5中任一项所述的靶向BCMA的全人源抗体，以及药学上可接受的载体和/或稀释剂。
11.一种用于检测样品中BCMA蛋白的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-5中任一项所述的靶向BCMA的全人源抗体。
12.权利要求1-5中任一项所述的靶向BCMA的全人源抗体、权利要求9所述的宿主细胞或权利要求10所述的药物组合物中任意一种或至少两种的组合在制备用于预防、减轻、改善或抑制多发性骨髓瘤的药物中的用途。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069847B (zh) * 2023-10-08 2024-07-12 北京奇迈永华生物科技有限公司 靶向bcma抗体及其相关产品和医药用途

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111601825A (zh) * 2018-02-01 2020-08-28 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
CN111944047A (zh) * 2019-05-15 2020-11-17 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的人源化单链抗体及应用
CN112062851A (zh) * 2019-06-11 2020-12-11 南京驯鹿医疗技术有限公司 靶向bcma嵌合抗原受体的抗体及其应用
CN112851814A (zh) * 2020-03-17 2021-05-28 西安宇繁生物科技有限责任公司 一种靶向bcma的全人源单链抗体及其制备方法与应用
CN113786484A (zh) * 2021-06-23 2021-12-14 南京医科大学 抗h5n1型禽流感病毒药物及其应用
CN113840841A (zh) * 2019-05-20 2021-12-24 南京驯鹿医疗技术有限公司 靶向cd19的全人源抗体及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111574628B (zh) * 2017-01-23 2023-08-08 克莱格医学有限公司 靶向bcma的抗体及其应用
CA3074526C (en) * 2018-02-01 2021-08-03 Nanjing Iaso Biotherapeutics Co., Ltd. Chimeric antigen receptor (car) binding to bcma and application thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111601825A (zh) * 2018-02-01 2020-08-28 信达生物制药(苏州)有限公司 全人源的抗b细胞成熟抗原(bcma)单链抗体及其应用
CN111944047A (zh) * 2019-05-15 2020-11-17 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的人源化单链抗体及应用
CN113840841A (zh) * 2019-05-20 2021-12-24 南京驯鹿医疗技术有限公司 靶向cd19的全人源抗体及其应用
CN112062851A (zh) * 2019-06-11 2020-12-11 南京驯鹿医疗技术有限公司 靶向bcma嵌合抗原受体的抗体及其应用
CN112851814A (zh) * 2020-03-17 2021-05-28 西安宇繁生物科技有限责任公司 一种靶向bcma的全人源单链抗体及其制备方法与应用
CN113786484A (zh) * 2021-06-23 2021-12-14 南京医科大学 抗h5n1型禽流感病毒药物及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"A phase 1 study of a novel fully human BCMA-targeting CAR (CT103A) in patients with relapsed/refractory multiple myeloma";DiWang等;《blood》;20210527;第137卷(第21期);第2890-2901页 *
"复发难治性多发性骨髓瘤的免疫治疗";李慧茹等;《癌症进展》;20211231;第19卷(第23期);第2390-2394、2423页 *

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