JP7437511B2 - 腫瘍免疫抑制因子に不応性の操作されたモノクローナル抗体の組成物及び使用 - Google Patents

Description

発明の技術分野
本発明は、体液性免疫及び体液性癌免疫学の分野に関する。具体的には、ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６タンパク質の免疫抑制効果を克服して、癌の成長及び他の体液性免疫抑制疾患を阻害する際に抗体ベースの治療の有効性を改善することができる方法及び薬剤の組成物に関する。

発明の背景
体液性免疫は、脊椎動物の宿主生物が、調節不全及び形質転換宿主細胞を監視し、防御する主要な機構である。癌生物学において、抑制された細胞媒介性免疫を克服できる免疫チェックポイント阻害剤は、腫瘍のサブセットに対する活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞殺傷を引き起こすのに強力な効果を示した（Ｈｏｄｉ ＦＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３：７１１－７２３，２０１０（非特許文献1））。いくつかの商業的に承認された治療用抗体は、体液性抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を介して、腫瘍殺傷効果を示すことが報告されている（ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ，Ｒａｖｅｔｅｃｈ ＪＶ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３：７０４－７１３，２０１５（非特許文献2）；Ｒｕｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．１６：１６４１４－１６４３９，２０１５（非特許文献3）；Ｐｅｌａｉａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ４８３９２３０：１－９，２０１８（非特許文献4））。最近の変質の発見は、腫瘍が体液性免疫経路を抑制し、次いでＡＤＣＣ及びＣＤＣを介する腫瘍殺傷効果を抑制する因子を産生することを示している（Ｖｅｒｇｏｔｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：２２７１－２２７８（非特許文献5）；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：１５，２０１８（非特許文献6）；Ｗａｎｇ Ｗ ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５２：１６９－１７９，２０１７（非特許文献7）；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８（非特許文献8））。

抗体媒介性体液性免疫応答は、抗体と細胞表面の抗原との会合が調整されることで細胞表面に特定の近接性で抗原エピトープ上に抗体を配置することによって制御される。結合すると、抗体は、それぞれ、ナチュラルキラー（ＮＫ）又は樹状／骨髄性／単球細胞（本明細書において、ＡＤＣＣに関与する任意の細胞は「免疫エフェクター細胞」と称される）上のＦｃ－γ活性化受容体ＦＣＧＲ３Ａ及びＦＣＧＲ２Ａと会合して、ＡＤＣＣを開始し、またＣ１ｑ補体開始タンパク質と会合して古典的な補体ＣＤＣ経路を介して抗体結合細胞の標的細胞死を引き起こす可能性がある（Ｒｅｕｓｃｈｅｎｂａｃｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５８：１５３５－１５４４，２００９（非特許文献9））。これらの機構は、リツキシマブ、トラスツズマブ、セツキシマブ、アレムツズマブ等であるが、これらに限定されない治療用抗体、及び多くの実験的抗体の抗腫瘍効果において重要であることが示されている（Ｚｈｏｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １３：９５４－９６６，２００８（非特許文献10）；Ｈｓｕ ＹＦ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９：－８，２０１０（非特許文献11）；Ｓｐｉｒｉｄｏｎ ＣＩ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：１７２０－１７３０，２００２（非特許文献12）；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ４８：１８７２－１８８２，２０１８）。同様に、体液性免疫応答は、ワクチン及び緩慢進行性疾患を有するものに応答して、調節不全又は形質転換細胞を標的とする患者自身の免疫システム内で起こり、抗増殖性及び免疫媒介性標的細胞殺傷活性を伴う主にＩｇＭクラスの抗体を産生することが示されている（Ｓｔａｆｆ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：８５５－８６５（非特許文献13）；Ｂｒａｎｄｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：７９９５－８００５，２００３（非特許文献14））。その上、多くの癌患者が腫瘍発現抗原に対する自己抗体を産生することが見出されているが、それらの存在は、おそらく全体的な抗体レベル及び／又は腫瘍細胞によって展開される体液性免疫抑制機構に起因して、腫瘍の成長を制御するのに十分ではない。

いくつかの報告によると、腫瘍産生タンパク質ＭＵＣ１６／ＣＡ１２５は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＭ型の抗体のサブセットに直接結合することで体液性免疫応答を抑制し得、続いてＦｃ領域の構造を乱し、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３型抗体の効果を低下させて、免疫エフェクター細胞上のＦｃ－γ活性化受容体ＦＣＧＲ２Ａ（ＣＤ３２ａとも称される）及びＦＣＧＲ３Ａ（ＣＤ１６ａとも称される）と会合し、及び／又は３つすべての抗体クラスの効果を低下させて、Ｃ１ｑを含む補体媒介性タンパク質と会合する（Ｐａｎｔａｎｋａｒ ＭＳ，ｅｔ．ａｌ．Ｇｙｎｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ９９：７０４－７１３，２００５（非特許文献15）；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７（非特許文献16）；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．５：１５，２０１８；Ｗａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５２：１６９－１７９，２０１７；Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８）。薬理活性を免疫エフェクター機構に依存する抗癌抗体の臨床研究では、血清ＣＡ１２５レベルの上昇と臨床転帰の低下との関連が示されている。特に、これはホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫の患者における商業的に承認されたリツキシマブ抗体の臨床試験で報告されている。リツキシマブ＋化学療法［ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン（ヒドロキシダウノマイシン）、ビンクリスチン（Ｏｎｃｏｖｉｎ（登録商標））、及びプレドニゾロン）］で治療された濾胞性リンパ腫の患者は、ＣＡ１２５レベルが正常範囲であった場合、５年の無増悪生存期間（ＰＦＳ）で３１．４％の改善を有していたのとは対照的に（Ｐｒｏｃｈａｚｋａ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ９６：５８－６４，２０１２（非特許文献17））、正常範囲を上回る患者は、統計的に臨床転帰が顕著に悪かった。ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６（本明細書ではＣＡ１２５と称される）、並びに癌患者及びそのようなタンパク質の存在によって体液性免疫抑制が活性である他の疾患における同様の腫瘍産生又は誘発タンパク質により介される体液性免疫抑制を克服することができるツール及び薬剤を開発することが、当該技術分野において引き続き必要である。

Ｈｏｄｉ ＦＳ，ｅｔ ａｌ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３６３：７１１－７２３，２０１０ ＤｉＬｉｌｌｏ ＤＪ，Ｒａｖｅｔｅｃｈ ＪＶ，Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ ３：７０４－７１３，２０１５ Ｒｕｃｋ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．１６：１６４１４－１６４３９，２０１５ Ｐｅｌａｉａ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｒｅｓ Ｉｎｔ ４８３９２３０：１－９，２０１８ Ｖｅｒｇｏｔｅ Ｉ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ３４：２２７１－２２７８ Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ５：１５，２０１８ Ｗａｎｇ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ １５２：１６９－１７９，２０１７ Ｋｌｉｎｅ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８ Ｒｅｕｓｃｈｅｎｂａｃｈ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５８：１５３５－１５４４，２００９ Ｚｈｏｕ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ １３：９５４－９６６，２００８ Ｈｓｕ ＹＦ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｎｃｅｒ ９：－８，２０１０ Ｓｐｉｒｉｄｏｎ ＣＩ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８：１７２０－１７３０，２００２ Ｓｔａｆｆ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：８５５－８６５ Ｂｒａｎｄｅｎ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３：７９９５－８００５，２００３ Ｐａｎｔａｎｋａｒ ＭＳ，ｅｔ．ａｌ．Ｇｙｎｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ９９：７０４－７１３，２００５ Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７ Ｐｒｏｃｈａｚｋａ Ｖ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ ９６：５８－６４，２０１２

本発明の一態様によれば、癌患者又は炎症性疾患を有する患者を治療する方法が提供される。ヒトＣ３Ｂ又はＣ４Ｂ補体タンパク質は、癌患者又は炎症性疾患を有する患者に投与される。投与されたタンパク質は、リツキシマブ等の特定の治療用抗体の効果又は自己抗体の効果を高める。補体タンパク質は、例えば、全長のヒト補体プロタンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂ、ヒト補体タンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片、あるいはＩｇＧに結合することができるヒト補体タンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂの一部であり得る。

本発明の別の態様によれば、配列番号：３のアミノ酸残基配列を含むタンパク質又はポリペプチドが提供される。当該配列中の１、２、又は３つのアミノ酸残基は、配列番号：３に示されるものとは異なるアミノ酸残基で置換されている。１、２、又は３つのアミノ酸置換は、１、２、又は３つのアミノ酸置換のない単離されたタンパク質又はポリペプチドの結合と比較して、免疫抑制タンパク質への単離されたタンパク質又はポリペプチドの結合を低減又は排除する。

本発明の別の態様は、健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する疾患を有する患者を治療する方法である。タンパク質又はポリペプチドが患者に投与される。タンパク質又はポリペプチドは、配列番号：３のアミノ酸残基配列を含む。配列中の１、２、又は３つのアミノ酸残基は、配列番号：３に示されているものとは異なるアミノ酸残基で置換されている。１、２、又は３つのアミノ酸置換は、１、２、又は３つのアミノ酸置換のない単離されたタンパク質又はポリペプチドの結合と比較して、免疫抑制タンパク質への単離されたタンパク質又はポリペプチドの結合を低減又は排除する。

本発明の更に別の態様は、抗体に結合するＣＡ１２５を発現する腫瘍を監視するための方法である。患者から単離された体液サンプルを、ヒトＣ３Ｂ又はＣ４Ｂ補体タンパク質と、及び配列番号：３のアミノ酸残基配列を含むタンパク質又はポリペプチドと接触させる。配列中の１、２、又は３つのアミノ酸残基は、配列番号：３に示されているものとは異なるアミノ酸残基で置換されている。１、２、又は３つのアミノ酸置換は、１、２、又は３つのアミノ酸置換のない単離されたタンパク質又はポリペプチドと比較して、免疫抑制タンパク質への単離されたタンパク質又はポリペプチドの結合を低減又は排除する。タンパク質又はポリペプチドに結合したＣＡ１２５が検出される。

本発明の更に別の態様は、抗ＣＤ２０抗体とヒト補体タンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂとを含む、組み合わせである。ヒト補体タンパク質の形態は、例えば、全長のヒト補体プロタンパク質Ｃ３ＢもしくはＣ４Ｂ、ヒト補体タンパク質Ｃ３ＢもしくはＣ４Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片、又はＩｇＧに結合することができるヒト補体タンパク質Ｃ３ＢもしくはＣ４Ｂの一部であり得る。組み合わせは、投与前に容器内で形成することができる。あるいは、各構成要素は、ある期間内に別々に投与されて、組み合わせがインビボで形成され得る。通常、２つは、１週間、３日、２日、２４時間、１２時間、６時間、３時間、１時間以内に投与される。

本発明の一態様は、ヒトＣ３Ｂ（配列番号：１）又はＣ４Ｂ（配列番号：２）補体タンパク質の抗体結合配列を含む全長又は断片を含む組換えタンパク質であり、これらはＣＡ１２５免疫抑制治療用抗体で組み合わせて添加／使用されて、その免疫抑制を克服することができる（本明細書ではエンハンサータンパク質と呼ばれる）。

本発明の別の態様は、１つ又は複数のコドンが修飾され、次に成熟抗体又は抗体抗原結合断片若しくはＦａｂドメインへのＣＡ１２５結合を減少させる、遺伝子組換えリツキシマブタンパク質をコードする核酸ベクターである。特に、抗体重鎖（配列番号：３）内の領域への修飾である。これらには、単独で、又はアミノ酸置換との組み合わせのいずれかで、アミノ酸、ＡＶＹＹＣＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶＷＧＡＧＴＴＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰ（配列番号：３）を変更するコドンが含まれるが、これらに限定されない。核酸ベクターは、他の要素に対して適切な位置で遺伝子組換えリツキシマブタンパク質をコードして、遺伝子組換えタンパク質が細胞にトランスフェクトされた時に核酸から発現され得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：４）であり、コドン１０９でＮからＤ、コドン１３１でＰからＳ、及びコドン１３６でＳからＹのアミノ酸変化を伴う（配列番号：５）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：７）であり、コドン１０９でＮからＤのアミノ酸変化を伴う（配列番号：８）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：９）であり、コドン１３１でＰからＳのアミノ酸変化を伴う（配列番号：１０）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：１１）であり、コドン１３６でＳからＹのアミノ酸変化を伴う（配列番号：１２）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：１３）であり、コドン１０９でＮからＤ及びコドン１３１でＰからＳのアミノ酸変化を伴う（配列番号：１４）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：１５）であり、コドン１０９でＮからＤ及びコドン１３６でＳからＹのアミノ酸変化を伴う（配列番号：１６）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：１７）であり、１３１でＰからＳ及び１３６でＳからＹのアミノ酸変化を伴う（配列番号：１８）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：１９）であり、コドン１０７でＹからＣ及びコドン１２２でＡからＴのアミノ酸変化を伴う（配列番号：２０）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：２１）であり、コドン１０７でＹからＣのアミノ酸変化を伴う（配列番号：２２）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：２３）であり、コドン１２２でＡからＴのアミノ酸変化を伴う（配列番号：２４）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：２５）であり、コドン１０８でＦからＬ及びコドン１３０でＦからＹのアミノ酸変化を伴う（配列番号：２６）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：２７）であり、コドン１０８でＦからＬのアミノ酸変化を伴う（配列番号：２８）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：２９）であり、コドン１３０でＦからＹのアミノ酸変化を伴う（配列番号：３０）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：３１）であり、コドン１０３でＧからＣ、コドン１３４でＰからＳ、コドン１６９でＳからＴ、及びコドン１９６でＳからＲのアミノ酸変化を伴う（配列番号：３２）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：３３）であり、コドン１０３でＧからＣのアミノ酸変化を伴う（配列番号：３４）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：３５）であり、コドン１３４でＰからＳのアミノ酸変化を伴う（配列番号：３６）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：３７）であり、コドン１０２でＹからＦのアミノ酸変化を伴う（配列番号：３８）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、全長リツキシマブ重鎖をコードする核酸ベクター（配列番号：３９）であり、コドン１６７でＬからＱのアミノ酸変化を伴う（配列番号：４０）。重鎖は、組換え細胞宿主においてリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）と共発現されて、完全に機能するＣＤ２０結合抗体が生じ得る。

本発明の別の態様は、健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する疾患を有する患者を治療する方法である。バリアントリツキシマブ抗体（本明細書ではＲＴＸ－ＭＴと呼ばれる）が患者に投与される。抗体はＣＤ２０＋標的細胞に結合し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）等の体液性免疫応答を誘発して、標的細胞を殺す。

本発明の別の態様は、ヒトタンパク質ＣＡ１２５及びＣＤ２０を発現するヒト癌細胞株である。ヒト癌細胞株は、ＣＤ２０を自然に発現しないヒト卵巣癌細胞株であり得る。これはＣＤ２０をコードする発現ベクターを細胞株ＯＶＣＡＲ３の細胞に形質導入することによって作製され得る。他のヒト癌細胞株を使用して、体液性免疫抑制抗体の同定に使用するためのそのような改変細胞株を作製することができる。

更に別の態様では、本発明は、ＣＤ２０に結合する候補抗体をスクリーニングする方法である。候補抗体が、ヒトタンパク質ＣＡ１２５及びＣＤ２０を発現するヒト癌細胞株と接触する。次いで、候補抗体によって開始されたヒト癌細胞株の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）が決定される。

本発明の更に別の態様は、患者においてＣＡ１２５を発現する腫瘍を試験し、治療するための方法である。患者から単離された体液サンプル（構成要素（ａ））を、配列番号：３のアミノ酸配列を含む抗体（構成要素（ｂ））と接触させる。構成要素（ａ）はまた、配列番号：３のアミノ酸残基配列を含む免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと接触し、ここで、当該配列中の１、２、又は３つのアミノ酸残基は、配列番号：３に示されるものと異なるアミノ酸残基で置換されており（構成要素ｃ）、１、２、又は３つの置換アミノ酸残基は、１、２、又は３つのアミノ酸置換のない免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと比較して、免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの免疫抑制タンパク質への結合を、減少させるか又は排除する。体液サンプル（構成要素（ａ））中のＣＡ１２５が構成要素（ｂ）に結合するが、構成要素（ｃ）には結合しないと判断された場合、患者は構成要素（ｃ）で治療される。体液サンプル中のＣＡ１２５が構成要素（ｂ）及び／又は構成要素（ｃ）に結合すると決定された場合、患者は、全長補体プロタンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂ、ＩｇＧに結合できる補体プロタンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片あるいはＩｇＧに結合できる補体プロタンパク質Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂの一部で治療される。

本明細書を読むと当業者には明らかである本発明のこれら及び他の態様は、癌、並びに非腫瘍性疾患、及び非ＣＡ１２５上昇疾患タイプを含む、ＣＡ１２５免疫抑制疾患における抗ＣＤ２０抗体媒介体液性免疫応答を改善するのに使用するための方法及び組成物を当技術分野に提供する。
[本発明1001]
配列番号：3のアミノ酸残基配列を含む免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドであって、前記配列中の1、2、又は3つのアミノ酸残基が、配列番号：3に示されるものと異なるアミノ酸残基で置換されており、前記1、2、又は3つの置換アミノ酸残基が、1、2、又は3つのアミノ酸置換のない免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと比較して、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの免疫抑制タンパク質への結合を、減少させるか又は排除する、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1002]
全長抗体である、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1003]
二重特異性抗体である、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1004]
前記免疫抑制タンパク質が、ＣＡ125／ＭＵＣ16である、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1005]
a. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：5を含む重鎖を含む抗体、
b. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：8を含む重鎖を含む抗体、
c. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：10を含む重鎖を含む抗体、
d. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：12を含む重鎖を含む抗体、
e. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：14を含む重鎖を含む抗体、
f. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：16を含む重鎖を含む抗体、
g. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：18を含む重鎖を含む抗体、
h. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：20を含む重鎖を含む抗体、
i. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：22を含む重鎖を含む抗体、
j. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：24を含む重鎖を含む抗体、
k. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：26を含む重鎖を含む抗体、
l. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：28を含む重鎖を含む抗体、
m. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：30を含む重鎖を含む抗体、
n. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：32を含む重鎖を含む抗体、
o. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：34を含む重鎖を含む抗体、
p. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：36を含む重鎖を含む抗体、
q. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：38を含む重鎖を含む抗体、並びに
r. 配列番号：6に従う軽鎖及び配列番号：40を含む重鎖を含む抗体
からなる群から選択される、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1006]
ＩｇＧアイソタイプ抗体の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖からなるタンパク質である、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1007]
全長ＩｇＧアイソタイプ抗体である、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1008]
ＩｇＧアイソタイプ抗体の抗原結合断片又はＦａｂドメインである、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1009]
前記アミノ酸残基が、配列番号：47に示されるリツキシマブＩｇＧ1重鎖の位置102、103、107、108、109、122、130、131、134、136、151、161、167、169、189、196、201、及び214から選択される、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1010]
＞1ｎＭ又は＜400ｎＭである親和性／Ｋｄで、ＣＤ20に結合する、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1011]
＞10ｎＭ又は＜50ｎＭである親和性／Ｋｄで、ＣＤ20に結合する、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1012]
配列番号：3のアミノ酸残基配列を含む前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの、ＣＤ20に対する親和性／Ｋｄの±50％である親和性で、ＣＤ20に結合する、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1013]
前記アミノ酸残基が、配列番号：47に示されるリツキシマブ重鎖の領域ＣＤＲ3の位置から選択される、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1014]
前記アミノ酸残基が、配列番号：47に示されるリツキシマブのフレームワーク領域4の位置から選択される、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
[本発明1015]
本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドをコードする、核酸ベクター。
[本発明1016]
本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
[本発明1017]
本発明1015の核酸ベクターを含み、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドを発現する、安定細胞株。
[本発明1018]
健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ125を発現する、疾患を有する患者を治療する方法であって、
前記患者に、本発明1001の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドを投与する工程
を含む、前記方法。
[本発明1019]
前記疾患が、癌である、本発明1018の方法。
[本発明1020]
前記疾患が、炎症性疾患である、本発明1018の方法。
[本発明1021]
前記癌が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、本発明1019の方法。
[本発明1022]
癌患者又は炎症性疾患を有する患者を治療する方法であって、
前記癌患者又は前記炎症性疾患を有する患者に、
（ａ）全長のヒト補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂ、
（ｂ）ＩｇＧに結合できるヒト補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片、又は
（ｃ）ＩｇＧに結合できるヒト補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂの一部
からなる群から選択されるポリペプチドを投与する工程
を含む、前記方法。
[本発明1023]
前記ポリペプチドが、配列番号：1又は配列番号：2に示されるアミノ酸配列を含む、本発明1022の方法。
[本発明1024]
前記癌患者又は前記炎症性疾患を有する患者が、対照の正常なヒト集団と比較して高いＣＡ125レベルを発現する、本発明1022の方法。
[本発明1025]
前記ポリペプチドが、抗ＣＤ20抗体と組み合わせて投与される、本発明1022の方法。
[本発明1026]
前記抗ＣＤ20抗体がリツキシマブである、本発明1025の方法。
[本発明1027]
前記患者が癌患者であり、
前記方法が、前記癌患者に腫瘍を標的とする抗体を投与する工程を更に含み、前記抗体によって介される体液性免疫応答が、前記ポリペプチドの不在下でＣＡ125によって抑制される、本発明1022の方法。
[本発明1028]
前記患者が癌患者であり、前記患者が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される癌を有する、本発明1022の方法。
[本発明1029]
（ａ）抗ＣＤ20抗体と、（ｂ）全長補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂ、ＩｇＧに結合できる補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片、又はＩｇＧに結合できる補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂの一部とを含む、組み合わせ。
[本発明1030]
前記抗ＣＤ20抗体がリツキシマブである、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1031]
前記組み合わせが、補体プロタンパク質Ｃ3Ｂ又はＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片を含み、前記補体プロタンパク質Ｃ3Ｂ又はＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片が、Ｃ3Ｂ残基23～1663、Ｃ3Ｂ残基23～667、Ｃ3Ｂ残基569～667、Ｃ3Ｂ残基672～1663、Ｃ3Ｂ残基672～748、Ｃ3Ｂ残基672～747、Ｃ3Ｂ残基749～1663、Ｃ3Ｂ残基749～954、Ｃ3Ｂ残基955～1303、Ｃ3Ｂ残基955～1001、Ｃ3Ｂ残基1002～1303、Ｃ3Ｂ残基1304～1320、Ｃ3Ｂ残基1321～1663、Ｃ4Ｂ残基20～675、Ｃ4Ｂ残基676～679、Ｃ4Ｂ残基680～1446、Ｃ4Ｂ残基680～756、Ｃ4Ｂ残基757～1446、Ｃ4Ｂ残基957～1336、Ｃ4Ｂ残基1447～1453、及びＣ4Ｂ残基1454～1744からなる群から選択される、本発明1029の組み合わせ。
[本発明1032]
ヒトタンパク質ＣＡ125及びＣＤ20を発現する、ヒト癌細胞株。
[本発明1033]
ヒト卵巣癌細胞株である、本発明1032のヒト癌細胞株。
[本発明1034]
ＣＤ20をコードする発現ベクターを細胞株ＯＶＣＡＲ3の細胞に形質導入することによって作製される、本発明1033のヒト癌細胞株。
[本発明1035]
ＣＤ20に結合する候補抗体をスクリーニングする方法であって、
a. 候補抗体を本発明1036のヒト癌細胞株と接触させる工程、及び
b. 前記候補抗体によって開始された前記ヒト癌細胞株の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を決定する工程
を含む、前記方法。
[本発明1036]
患者においてＣＡ125を発現する腫瘍を試験及び治療するための方法であって、
（ａ）患者から単離された体液サンプルを（ｂ）配列番号：3のアミノ酸配列を含む抗体と接触させ、（ａ）を（ｃ）配列番号：3のアミノ酸残基配列を含む免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと接触させる工程であって、前記配列中の1、2、又は3つのアミノ酸残基が、配列番号：3に示されるものと異なるアミノ酸残基で置換されており、前記1、2、又は3つの置換アミノ酸残基が、1、2、又は3つのアミノ酸置換のない免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと比較して、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの免疫抑制タンパク質への結合を、減少させるか又は排除する、工程、並びに
前記体液サンプル中のＣＡ125が（ｂ）に結合するが（ｃ）には結合しないことを決定し、前記患者を（ｃ）で治療する工程、又は
前記体液サンプル中のＣＡ125が（ｂ）及び／又は（ｃ）に結合することを決定し、前記患者を、全長補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂ、ＩｇＧに結合できる補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片、又はＩｇＧに結合できる補体プロタンパク質Ｃ3ＢもしくはＣ4Ｂの一部で治療する工程
を含む、前記方法。
[本発明1037]
前記補体プロタンパク質Ｃ3Ｂ又はＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片が投与され、前記補体タンパク質Ｃ3Ｂ又はＣ4Ｂの天然に存在するタンパク質分解断片が、Ｃ3Ｂ残基23～1663、Ｃ3Ｂ残基23～667、Ｃ3Ｂ残基569～667、Ｃ3Ｂ残基672～1663、Ｃ3Ｂ残基672～748、Ｃ3Ｂ残基672～747、Ｃ3Ｂ残基749～1663、Ｃ3Ｂ残基749～954、Ｃ3Ｂ残基955～1303、Ｃ3Ｂ残基955～1001、Ｃ3Ｂ残基1002～1303、Ｃ3Ｂ残基1304～1320、Ｃ3Ｂ残基1321～1663、Ｃ4Ｂ残基20～675、Ｃ4Ｂ残基676～679、Ｃ4Ｂ残基680～1446、Ｃ4Ｂ残基680～756、Ｃ4Ｂ残基757～1446、Ｃ4Ｂ残基957～1336、Ｃ4Ｂ残基1447～1453、Ｃ4Ｂ残基1454～1744からなる群から選択される、本発明1022又は1036の方法。

影響を受けたリツキシマブ抗体（Ａｂ）へのＣＡ１２５の結合を阻害できる潜在的なタンパク質を同定するためのスクリーニング方法の図である。図１Ａは、影響を受けた抗体に対するＣＡ１２５の免疫抑制効果を克服することができる潜在的なエンハンサータンパク質をスクリーニングする方法の概略図である。 影響を受けたリツキシマブ抗体（Ａｂ）へのＣＡ１２５の結合を阻害できる潜在的なタンパク質を同定するためのスクリーニング方法の図である。図１Ｂは、ＣＡ１２５結合を阻害し、リツキシマブエフェクター活性のＣＡ１２５免疫抑制を克服するエンハンサータンパク質の同定の図である。簡単に説明すると、以前に記載されたように、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、１５ＫＵ／ｍＬのヒトＣＡ１２５又は１～１０μｇ／ｍＬのヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含むか又は含まない１～５μｇ／ｍＬリツキシマブでコーティングし、１～２．５μｇ／ｍＬビオチン化ヒトＣ１ｑタンパク質でプローブした（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８）。示されているように、ＣＡ１２５は、リツキシマブ単独又はＨＳＡの存在下でインキュベートした場合とは対照的に、リツキシマブへのＣ１ｑ結合を減少させた。次に、ＩｇＧ１抗体に結合することが以前に報告されている多くのタンパク質を使用して、Ｃ１ｑ結合のＣＡ１２５抑制を克服できるタンパク質があるかどうかを決定した。図１Ｃに示されるように、ヒト補体タンパク質Ｃ４Ｂ（配列番号：２）は、試験された他のもの（図示せず）とは対照的に、ＣＡ１２５の阻害効果を遮断することができた。同様に、Ｃ３Ｂ（配列番号：１）も同様の効果を有していた。この効果が免疫エフェクター機能を回復できるかどうかを決定するために、Ｃ４Ｂタンパク質をリツキシマブ及びＤａｕｄｉ細胞を使用した補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイで使用して、前述のようにＣＤＣアッセイでＣ４Ｂ活性を試験した（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４８：１８７２－１８８２，２０１８）。簡単に説明すると、５，０００個のＤａｕｄｉ細胞を２．５μｇ／ｍＬリツキシマブ単独、１５ＫＵ／ｍＬのＣＡ１２５又は１０μｇ／ｍＬのＨＳＡで、５μｇ／ｍＬのＣ４Ｂが存在する場合、又は存在しない場合でインキュベートした。次に、１０００単位のウサギ補体（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を各ウェルに添加し、培養物を１．５時間インキュベートした後、Ｃｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して細胞生存率を定量し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ発光プレートリーダで製造業者の推奨に従って定量した。信号強度は、ＣＤＣ殺傷後の生細胞を指す。 影響を受けたリツキシマブ抗体（Ａｂ）へのＣＡ１２５の結合を阻害できる潜在的なタンパク質を同定するためのスクリーニング方法の図である。図１Ｃは、ＣＡ１２５が、リツキシマブを介したＣＤＣ活性を有意に抑制したことを示す図である（Ｐ＜０．０００１５）。Ｃ４Ｂの追加は、ＣＡ１２５抑制を大幅に克服することができた（Ｐ＝０．００００４）。同様の効果がＣ３Ｂ（配列番号：１）タンパク質で観察された。これらのデータは、Ｃ３Ｂ及び／又はＣ４Ｂタンパク質を使用して、ＣＡ１２５免疫抑制効果を逆転させ、エンハンサータンパク質として機能できるという証拠を提供する。 影響を受けたリツキシマブ抗体（Ａｂ）へのＣＡ１２５の結合を阻害できる潜在的なタンパク質を同定するためのスクリーニング方法の図である。図１Ｄは、ＲＴＸ－ＷＴへのＣＡ１２５の結合に対するＣ３Ｂの競合を示す図である。方法は図１Ｂで説明したものと同じである。 図２Ａ～図２Ｂは、Ｃ３Ｂ／Ｃ４Ｂエンハンサータンパク質が、リツキシマブへのＣＡ１２５の結合を阻害することにより、ＣＡ１２５の免疫抑制を克服することを示す図である。Ｃ４ＢがＣＡ１２５によるリツキシマブ免疫抑制を救済する機構を明らかにするために、ＥＬＩＳＡアッセイを使用してＣＡ１２５－リツキシマブ結合を監視した。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを陰性対照として１５ＫＵ／ｍＬの可溶性ＣＡ１２５又はヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）でコーティングし、２．５μｇ／ｍＬのビオチン化リツキシマブで、５μｇ／ｍＬのＣ４Ｂが存在する場合、又は存在しない場合でプローブすることによって、ＣＡ１２５結合を試験した。プローブ後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン－ＨＲＰ（ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で二次的プローブをし、比色分析ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して定量した。０．１ＮのＨ_２ＳＯ_４を使用して反応を停止し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎプレートリーダを使用して４５０ｎｍでウェルを定量した。図２Ａは、Ｃ４ＢがＣＡ１２５へのリツキシマブの結合を有意に阻止することができたことを示す図である（Ｐ＝０．００００１７）。実験は、３つのウェル最小を表す。Ｃ４Ｂタンパク質は、ＩｇＧ１型抗体の相補性決定領域３（ＣＤＲ３）とフレームワーク４（ＦＷ４）との間の領域に結合することが示されており、ＣＡ１２５結合の競合がこの領域内にあり得ることを示唆している。ＣＡ１２５結合が軽鎖、重鎖、又は両方の免疫グロブリン鎖で発生するかどうかを決定するために、ＣＡ１２５非影響抗体ペルツズマブ（ＰＴＺ）からの軽鎖及び重鎖を使用してキメラリツキシマブ（ＲＴＸ）抗体を生成し（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０）、次に、ＣＡ１２５結合についてそれぞれ試験した。図２Ｂは、リツキシマブ重鎖（ＲＴＸ－ｈｃ／ＰＴＺ－ｌｃ）キメラが依然としてＣＡ１２５に有意に結合することができ（Ｐ＜０．０００９）、ＣＡ１２５がＣＤＲ３－ＦＷ４領域内のリツキシマブ重鎖に結合することを示唆する図である。リツキシマブ軽鎖（ＰＴＺ－ｈｃ／ＲＴＸ－ｌｃ）キメラではＣＡ１２５結合は観察されなかった。Ｃ４Ｂと同様の方法を使用して、Ｃ３Ｂタンパク質（配列番号：１）はＣＡ１２５へのリツキシマブ結合と競合し（Ｐ＜０．０００１）、Ｆａｂ結合タンパク質Ｌは競合的に阻害しなかったため（図１Ｄを参照）、特異的であると思われ、ＣＡ１２５結合がリツキシマブＦａｂドメイン内にあり、Ｃ３Ｂ／Ｃ４Ｂタンパク質を使用してＣＡ１２５免疫抑制効果を逆転させ、エンハンサータンパク質として機能できるという発見を支持している。 ＣＡ１２５結合が減少したリツキシマブバリアントの生成の図である。図３Ａは、ＣＤＲ３－ＦＷ４及びＣＨ１領域（配列番号：３）内の１つ又は複数の残基がＣＡ１２５結合に必要かどうかを判断するために、ＣＤＲ３－ＦＷ４領域のヌクレオチド配列（配列番号：５０）に相補的なプライマー（配列番号：４８及び４９）を使用して、ＰＣＲ産物のランダム変異誘発を介する、ＣＤＲ３－ＦＷ４をコードする残基間のリツキシマブ重鎖バリアントのライブラリの生成を示す図である。次に、組換え重鎖をリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）でコトランスフェクトし、９６ウェルプレートのＨＥＫ２９３細胞で一過性に発現させた。培養物上清を、プローブとしてマウス抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰ抗体を使用するＥＬＩＳＡを介して抗体産生についてスクリーニングした。次いで、リツキシマブ結合ペプチドＲｐ１－Ｌ（Ｆａｖｏｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０：１９２０，２０１９）を使用してウェルをコーティングし、リツキシマブ変異体（ＲＴＸ－ＭＴ）でプローブし、マウス抗ヒトＩｇＧ－ＨＲＰで二次的プローブし、上記のようにＴＭＢ基質を使用して定量する、ＥＬＩＳＡを使用して、ＣＤ２０結合について、陽性クローン上清を試験した。次に、ＣＤ２０に結合した、親リツキシマブ抗体（ＲＴＸ－ＷＴ）と同等又はより優れたクローンを、上記のようにＥＬＩＳＡを介してＣＡ１２５結合について試験した。ＣＤ２０に結合し、ＣＡ１２５結合が減少しているように見える多くのクローンが同定された。 ＣＡ１２５結合が減少したリツキシマブバリアントの生成の図である。図３Ｂは、これらのクローンの配列を整列させて、一般的に変異したアミノ酸を同定した図である。次に、これらのクローンのサブセットを拡大して精製抗体を生成し、ＣＤ２０及びＣＡ１２５の結合について再試験した。 図3B-1の続きの図である。 ランダム化されたライブラリの一次スクリーニングから同定された、最も強力なＣＤ２０結合及び最も減少したＣＡ１２５結合を有する変異リツキシマブ（ＲＴＸ－ＭＴ）クローンが選択され、更に分析した図である。これらの抗体のそれぞれをビオチン化し、ＥＬＩＳＡを介してＣＤ２０及びＣＡ１２５の結合について再試験した。簡単に説明すると、抗体は、ＥＺ－Ｌｉｎｋ（商標）Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－Ｂｉｏｔｉｎ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の指示に従ってビオチン化された。ビオチン化抗体は、Ｎａｎｏｄｒｏｐで定量し、抗ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ捕捉アッセイを使用してシグナル強度を検証して、各抗体のシグナル強度を測定した。ＣＤ２０及びＣＡ１２５の結合を再試験するために、９６ウェルプレートを１０μｇ／ｍＬのリツキシマブ結合ペプチド又は１５ＫＵ／ｍＬのＣＡ１２５でコーティングし、各ビオチン化ＲＴＸ－ＭＴ抗体又は親抗体（ＲＴＸ－ＭＴ）を３連でプローブした。ウェルを洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰで二次的プローブし、Ｖａｒｉｏｓｋａｎプレートリーダで上記のようにＴＭＢ基質を使用して４５０ｎｍで定量した。ＣＤ２０とＣＡ１２５との結合の比率を、親及びＲＴＸ－ＭＴクローンについて比較し、ＣＡ１２５結合の減少率を計算した。ＣＡ１２５の２０％を超える減少のシグナルは、陽性と見なされた。これらの基準を使用して、すべて野生型リツキシマブ軽鎖（配列番号：６）を発現する５つのクローンを更なる分析のために選択した。クローン１４８（配列番号：３７及び３８）；クローン１６４（配列番号：３１及び３２）；クローン１６６（配列番号：４及び５）；クローン１９８（配列番号：１９及び２０）及びクローン１９９（配列番号：２５及び２６）。 図４に記載されているように選択されたＲＴＸ－ＭＴ抗体を、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及びＣＤＣ機能スクリーニングで試験した図である。ヒトＣＤ２０を発現するＤａｕｄｉ細胞を両方のアッセイに使用した。ＣＤＣは上記のように実施した。ＡＤＣＣ活性は、前述の方法を使用して測定した（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０）。示されているように、ＣＡ１２５は親抗体に対するＣＤＣ活性の有意な抑制（３２％減少；Ｐ＝０．００１）を示したが、ここで試験されたすべてのＲＴＸ－ＭＴクローンはＣＡ１２５免疫抑制に対してより不応性であることが見出された（≦１５％ＣＤＣ抑制；Ｐ＜０．０１）。同様の効果がＡＤＣＣで観察された。特に、クローン１６４、１６６、及び１９８は、親抗体よりもＣＡ１２５免疫抑制に対して約３～４倍不応性であったが、これらより程度は低いが、他のクローンもまた、より不応性であることが見出された。すべての場合において、これらのクローンは影響を受けたドメインに複数の変異を有していた。１つ又は２つのアミノ酸がＣＡ１２５免疫抑制を克服するのに十分であるかどうかを決定するために、単一又は二重の変異クローンを各クローンから生成し、ＣＡ１２５結合及び免疫エフェクター機能について再試験した。 図６Ａ～図６Ｂは、影響を受けたドメイン内の単一及び二重の変異が、ＣＡ１２５結合を減らし、ＣＡ１２５不応性リツキシマブ抗体を生成するのに十分であることを示す図である。クローン１４８、１６４、１６６、１９８、及び１９９に由来する単一及び二重ＲＴＸ－ＭＴ抗体を、ＣＤ２０及びＣＡ１２５ ＥＬＩＳＡ結合アッセイ（図６Ａ）、並びにＣＤ１６ａ及びＣ１ｑ結合アッセイで使用して、単一又は二重変異がＣＡ１２５の結合及び免疫抑制を低減するのに十分であるかどうかを決定した。図６Ａは、クローン１１２－１３４（コドン１０９でＮからＤ及びコドン１３１でＰからＳのアミノ酸変化、配列番号：１３及び１４）、クローン１３３（コドン１３０でＦからＹのアミノ酸変化、配列番号：２９及び３０）、クローン１０６（コドン１０３でＧからＣのアミノ酸酸変化、配列番号：３３及び３４）、及びクローン１３７（コドン１３４でＰからＳのアミノ酸変化、配列番号：３５及び３６）が、ＣＡ１２５への結合が最も有意に減少し（Ｐ＜０．００５５）、それらは親抗体のようにＣＤ２０結合を保持することを示す図である。ＣＤ１６ａ－ビオチン及びＣ１ｑ－ビオチン結合アッセイでは、最も不応性の２つのクローン１１２－１３４及び１３３を使用した。図６Ｂは、親抗体と比較して、クローン１１２－１３４及び１３３が、ＣＤ１６ａ－ビオチン結合において、それぞれ７５％及び６２．５％改善し、両方ともＣ１ｑ－ビオチン結合が７０％改善したことを示す図である。 ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６バリアント変異の特性決定の図である。図７Ａは、単一又は二重変異Ｎ１０９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、Ｓ１３６Ｙ、Ｎ１０９Ｄ＋Ｐ１３１Ｓ、Ｎ１０９Ｄ＋Ｓ１３６Ｙ、Ｐ１３１Ｓ＋Ｓ１３６Ｙ、及び三重変異ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６（Ｎ１０９Ｄ＋Ｐ１３１Ｓ＋Ｓ１３６Ｙ）を、ＣＡ１２５の存在下のＦｃ受容体結合について比較した図である。データは、ＣＡ１２５が存在する場合及びＣＡ１２５が存在しない場合の結合の百分率としてプロットされる。示されているように、少なくともＮ１０９Ｄ変異を有するＲＴＸ－ＭＴは、親ＲＴＸと比較して、ＣＡ１２５の存在下でＣＤ１６ａ Ｆｃ受容体への結合がより高かった。 ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６バリアント変異の特性決定の図である。図７Ｂは、単一変異ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、及びＳ１３６Ｙを、ＣＡ１２５の存在下のＣ１ｑ結合について比較した図である。データは、ＣＡ１２５が存在する場合及びＣＡ１２５が存在しない場合の結合の百分率としてプロットされる。ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄは、親リツキシマブ（ＲＴＸ）の６５％未満と比較して、Ｃ１ｑ結合の約９０％を保持するＣＡ１２５による影響が最も少ないことが見出された。 ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６バリアント変異の特性決定の図である。図７Ｃは、ＣＤ２０リツキシマブ結合ペプチドに対する抗体結合をＥＬＩＳＡアッセイを使用して測定して、ＣＤ２０結合がＮ１０９Ｄ変異によって影響を受けたかどうかの決定の図である。示されているように、ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄ ＣＤ２０の結合は、親リツキシマブ（ＲＴＸ）と同等であった（Ｐ＞０．２１）。 ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６バリアント変異の特性決定の図である。図７Ｄは、ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄに結合するＣＡ１２５のＥＬＩＳＡ分析は、親リツキシマブ（ＲＴＸ）と比較して有意に減少したことを示すことを表す図である（５０％減少、Ｐ＜０．００００９）。各実験で同量の抗体が使用されたことを確認するために、ＥＬＩＳＡアッセイには、抗体の入力量を取得するための抗ヒトＩｇＧコーティングウェルが含まれていた。図７Ｃ及び７Ｄに示すように、各抗体入力の量は類似していた（四角いマーカを有する線）。すべての実験で、ペルツズマブ（ＰＴＺ）を陰性対照として使用した。スチューデントのＴ検定を使用した代表的なＰ値は、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１である。 ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄ ＣＤ２０結合の特性決定の図である。親リツキシマブ（ＲＴＸ ＷＴ）及びＲＴＸ Ｎ１０９Ｄは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８色素に直接結合し、０．７８～１００ｎＭの濃度でＣＤ２０発現（Ｒａｍｏｓ）生細胞及びＣＤ２０ヌル（Ｊｕｒｋａｔ）生細胞を染色するために使用された。図８Ａは、ＣＤ２０陽性細胞に対する両方の抗体の特異的結合を示しているが、ＣＤ２０ヌル細胞に対する特異的結合を示していないことを表す図である。図８Ｂは、ＣＤ２０陽性細胞に対する両方の抗体の特異的結合を示しているが、ＣＤ２０ヌル細胞に対する特異的結合を示していないことを表す図である。図８Ｃは、１部位飽和結合の非線形回帰分析を使用して、平衡状態で受容体部位の半分に結合した抗体の濃度としての結合親和性（Ｋｄ）の外挿を示す図である。図８Ｄは、１部位飽和結合の非線形回帰分析を使用して、平衡状態で受容体部位の半分に結合した抗体の濃度としての結合親和性（Ｋｄ）の外挿を示す図である。 ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄ及び親リツキシマブ（ＲＴＸ）による補体媒介殺傷（ＣＤＣ）の比較を示す図である。図８Ａは、ＣＡ１２５を発現するＣＤ２０陽性細胞は、補体の存在下で各抗体の標的にされたことを示す図である。示されているように、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄは、親リツキシマブと比較して、ＣＡ１２５陽性細胞に対して優れたＣＤＣ活性を有している。図９Ｂは、ＣＤＣ効果が特異的であることを示すために、ＣＡ１２５を発現するＣＤ２０陽性及びＣＤ２０陰性細胞を、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄ ＣＤＣ活性について試験した図である。示されているように、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄ ＣＤＣの殺傷はＣＤ２０発現細胞に特異的であった。スチューデントのＴ検定を使用した代表的なＰ値は、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１である。 ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄ及び親リツキシマブ（ＲＴＸ）によるＦｃ－γ受容体ＣＤ１６ａ活性に対するＣＡ１２５免疫抑制の比較の図である。図１０Ａは、ＥＬＩＳＡ結合アッセイが、ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄが親リツキシマブ（＜６０％、Ｐ＜０．０００１）と比較してＣＡ１２５抑制ＣＤ１６ａ受容体結合に対して不応性（＞９０％Ｆｃ受容体結合）であることを示している図である。 ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄ及び親リツキシマブ（ＲＴＸ）によるＦｃ－γ受容体ＣＤ１６ａ活性に対するＣＡ１２５免疫抑制の比較の図である。図１０Ｂは、Ｊｕｒｋａｔ ＣＤ１６ａレポーターアッセイが、ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄが親リツキシマブと比較してＣＡ１２５抑制ＣＤ１６ａ受容体活性化に不応性であることを示していることを表す図である（Ｐ＜０．０００１）。 ＲＴＸ－ＭＴ Ｎ１０９Ｄ及び親リツキシマブ（ＲＴＸ）によるＦｃ－γ受容体ＣＤ１６ａ活性に対するＣＡ１２５免疫抑制の比較の図である。図１０Ｃは、初代ヒトＰＢＭＣ及びＤａｕｄｉ標的細胞を使用したＡＤＣＣアッセイが、ＲＴＸ ＭＴ Ｎ１０９ＤがＣＡ１２５抑制ＡＤＣＣに対して不応性であることを示していることを表す図である（Ｐ＜０．０１）。スチューデントのＴ検定を使用した代表的なＰ値は、＊＜０．０５、＊＊＜０．０１、＊＊＊＜０．００１、＊＊＊＊＜０．０００１である。

発明の詳細な説明
本発明者等は、ＣＡ１２５のリツキシマブへの結合を阻害できる薬剤（エンハンサータンパク質と呼ばれる）を発見した。本発明者等は、それらを使用して、ＣＡ１２５結合及びその免疫抑制活性に重要なリツキシマブ抗体内の領域をマッピングした。更に、ＣＡ１２５結合に重要なリツキシマブ抗体の特定の領域内で遺伝子操作を使用して、ＣＡ１２５の体液性免疫抑制効果に不応性の修飾抗体タンパク質を生成した。これらは、ＣＡ１２５が上昇している癌を含む疾患において、及びＣＡ１２５レベルが正常範囲内にある患者において、ＣＤ２０^＋細胞の治療に使用できる。

ＣＡ１２５に結合すると思われるＩｇＧ１タイプの抗体の領域（影響を受けたドメイン）内の残基を修飾し、修飾された残基は、ＣＡ１２５免疫抑制された抗体を、ＣＡ１２５免疫抑制に不応性にする。これらのＣＡ１２５不応性抗体は、ＣＡ１２５タンパク質による体液性免疫抑制を克服できる可能性がある。これらは、癌及び他のＣＡ１２５免疫抑制疾患の治療に使用できる。任意の特定の理論又は作用機構に限定されることを望まないが、出願人等は、ＣＡ１２５タンパク質が、特定の抗体の特定の残基と会合し、通常、免疫エフェクター細胞及び／又は補体によって介される抗体媒介性体液性免疫応答を妨害すると考えている。これらの妨害には、Ｃ１ｑ抗体（古典的な抗体補体）複合体並びに／あるいはＮＫ細胞及び骨髄系細胞等であるがこれらに限定されない免疫エフェクター細胞上のＦｃ－γ活性化受容体への抗体の結合の抑制が含まれ、これらの妨害は、それぞれ補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の下流阻害をもたらす。

本明細書で説明する方法は、体液性免疫抑制を克服するために、追加のＣＡ１２５不応性抗体（ＣＤ２０標的抗体であるかどうかにかかわらない）を開発するために使用できる。影響を受けた親抗体に悪影響を与えるＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを含む体液性免疫応答に対するＣＡ１２５の阻害効果（複数可）を回避することができる修飾抗体は、前臨床及びヒトの試験に使用することができる。

本明細書で説明する方法及び組成物は、少なくとも２つのカテゴリに分類できる。１つのカテゴリでは、１つ又は複数のアミノ酸変化を含む修飾重鎖（ＲＴＸ－ＭＴと呼ばれる）を試験して、ＣＡ１２５の存在下の親抗体と比較して、Ｆｃ－γ活性化受容体ＣＤ１６ａ又はＣＤ３２ａ又はＣ１ｑ補体タンパク質のＲＴＸ－ＭＴ抗体への結合を監視する分子アッセイを使用して測定されるように、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣに対するＣＡ１２５抑制を克服する最大の効果を決定する。別のカテゴリでは、Ｃ３Ｂ（配列番号：１）又はＣ４Ｂタンパク質（配列番号：２）を親又はＲＴＸ－ＭＴ抗体と組み合わせて試験して、細胞生存アッセイを使用して決定されたＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣに対するＣＡ１２５抑制を克服する最大の効果を決定する。抗体は、ＣＡ１２５を発現するＣＤ２０抗原陽性標的細胞に添加されるか、又はＣ３Ｂ又はＣ４Ｂタンパク質を有する非ＣＡ１２５発現細胞にＣＡ１２５が外因的に添加され、免疫エフェクター細胞（ＮＫ、樹状／骨髄／単球細胞、末梢血単核細胞、又はＡＤＣＣレポーター細胞株）の添加によりＡＤＣＣ活性について測定され得る。あるいは、ヒト又はウサギの補体を使用して、ＣＤＣ活性を監視することができる。いずれのアッセイでも、Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂタンパク質の有無にかかわらず親抗体及びＲＴＸ－ＭＴ抗体で処理した細胞間で細胞生存率を比較して、どのＲＴＸ－ＭＴ並びに／あるいはＣ３Ｂ又はＣ４Ｂの組み合わせがＣＡ１２５を介した体液性免疫抑制を有意に阻害できるかを決定する。ＣＡ１２５は、標的細胞から産生されるか、又は細胞培養物に外因的に添加され得る。細胞生存率は、当業者によって使用される様々な方法を用いて決定され得る。

治療用途の場合、Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂタンパク質は、他の標準治療薬剤の有無にかかわらず、親ＲＴＸ－ＷＴ又はＲＴＸ－ＭＴ抗体と組み合わせて投与され得る。それらは、リツキシマブ抗体の投与前、投与中、又は投与後に投与することができる。

組成物は、方法を実施する過程で形成され得る。それらは、リツキシマブ重鎖変異体ライブラリスクリーニングから同定されたＲＴＸの影響を受けたドメイン（配列番号：３）内の変更されたアミノ酸、又は例えば、免疫エフェクター活性を増強するための親ＲＴＸ－ＷＴ又はＲＴＸ－ＭＴ抗体に加えることができる他のエンハンサータンパク質とのタンパク質の組み合わせであり得る。本明細書に記載の抗体及び／又はエンハンサータンパク質（すなわち、Ｃ３Ｂ及びＣ４Ｂタンパク質の抗体結合ドメインを含むタンパク質）の任意の選択は、投与の前又は後に、組成物として形成され得る。

ＣＡ１２５免疫抑制に感受性のあるいくつかの抗体が知られているが、ここで説明するように配列番号：３に示すＲＴＸの影響を受けたドメインを変更することによって組成物を開発する方法は、体液性免疫応答の抑制を導くＣＡ１２５によって、動的構造が変更される抗体に有用である。

抗体又はタンパク質の「動的構造」は、所与の時点における抗体の三次元構造であり、そのような時点は、別のタンパク質又は薬剤との抗体の会合と一致し、この時点の前の抗体の構造は、抗体が別のタンパク質又は薬剤と会合したことに応じて、この時点以降、異なる構造に変化している。Ｃ３Ｂ及びＣ４Ｂ等のエンハンサータンパク質の存在下でこの変化を監視できる。抗体に結合し、その動的構造に影響を与えるタンパク質の効果は、ハプテンが抗体のＣＤＲドメインに結合することで、それらのＦｃドメインをアロステリックに改変し、それによってＦｃ受容体を含むＦｃ結合タンパク質とのＦｃドメインの会合を低減させる場合が報告されている（Ｊａｎｄａ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ７：２２，２０１６）。以前の研究では、（ＦＡＢ’）_２ドメインの動的構造は、抗体がその抗原に結合した時に影響を受けることも示されている（Ｗｅｒｎｅｒ ＴＣ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ６９：７９５－７９９，１９７２）。最近では、Ｋｌｉｎｅ ｅｔ ａｌが、いくつかのヒト化モノクローナルＩｇＧ１型抗体は類似のアミノ酸構造を有するが、ＣＡ１２５がそれらに結合する能力に大きな違いがあることを報告した（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）。

腫瘍が宿主の免疫防御を回避するために様々な経路を利用するという証拠が増えていること、及び抗体ベースの手法が様々なタイプの癌並びに炎症性及び感染性疾患に対して追求され続けているという事実に照らして、Ｃ３Ｂ及びＣ４Ｂ等の薬剤並びに修飾することができる影響を受けた抗体内の領域を同定して、影響を受けた抗体の体液性免疫抑制を克服することができる方法を定義することが重要である。これらの薬剤又は修飾された抗体組成物及び方法は次に、ＣＡ１２５による免疫抑制を克服し、患者のスクリーニングに有用であり得るリード抗体の選択を可能にする。例えば、試験抗体がＣＡ１２５の影響を受けていることが分かった場合、ＣＤ２０陽性癌の患者を事前にスクリーニングして、高レベルのＣＡ１２５を有するかどうかを決定することができる。高レベルのＣＡ１２５を有する患者には、体液性応答に対するＣＡ１２５による抑制効果を克服できる最適化されたＲＴＸ－ＭＴを使用することができる。あるいは、Ｃ３Ｂ又はＣ４Ｂ等のエンハンサータンパク質を親ＲＴＸ－ＷＴ又はＲＴＸ－ＭＴ抗体と一緒に使用して、腫瘍細胞殺傷を増強することができる。

抗体の動的構造に影響を与え、その細胞表面の標的抗原に結合するとその下流の免疫エフェクター機能（複数可）を抑制することができる、ＣＡ１２５の存在下で抗ＣＤ２０抗体の動的構造をスクリーニングするための組成物及び方法を提供する。この方法は、配列番号：３内に含まれる影響を受けたドメインのランダム変異誘発を介してリツキシマブ親抗体から修飾重鎖を作製し、リツキシマブ免疫グロブリン軽鎖（配列番号：６）も発現する細胞株でそれらを発現し、スクリーニングして、低下したＣＡ１２５結合又はＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ免疫エフェクター活性を有するタンパク質を同定する工程を含む。更に、親リツキシマブを他のタンパク質と一緒にスクリーニングして、ＣＡ１２５の存在下でその免疫エフェクター活性を増強する可能性のあるタンパク質又は他の薬剤を同定することができる。図１Ａ～１Ｄは、ＣＡ１２５の存在下でタンパク質をリツキシマブと組み合わせて、親抗体へのＣＡ１２５の結合を阻害し、並びに／あるいはそのＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を増強することができるものを同定する一例を提供する。

一実施形態では、ＣＡ１２５を自然に発現するヒト卵巣癌細胞に、発現構築物をコードするヒトＣＤ２０を形質導入して、ＣＤ２０標的化抗体のＣＡ１２５免疫抑制をスクリーニングするために使用できるＣＡ１２５陽性及びＣＤ２０陽性細胞を開発する。他の種類の癌細胞を使用して細胞株を作製することができ、特に卵巣癌細胞のような上皮細胞に由来する癌を使用することができる。以前のそのような細胞株はＯＶＣＡＲである。

いくつかの実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴは、影響を受けたドメイン（配列番号：３）内の１つ又は複数のアミノ酸変化を含み、ＡＤＣＣ又はＣＤＣのＣＡ１２５体液性免疫抑制を克服するＲＴＸ－ＭＴ抗体の能力について試験される。

親又はＲＴＸ－ＭＴ抗体と組み合わせたエンハンサータンパク質の能力、又はＲＴＸ－ＭＴ抗体のみを測定するための１つの方法では、ＣＡ１２５の体液性免疫抑制を克服するのに効果的であり、抗体は直接ＣＡ１２５結合に関して、並びに／あるいはＥＬＩＳＡ又は当技術分野で知られている他の方法を介して、ＣＡ１２５の存在下でＣＤ１６ａ又はＣ１ｑタンパク質に結合する能力に関して試験される。

いくつかの実施形態では、機能的方法を使用して、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを使用するＣＡ１２５による体液性免疫抑制を克服することに対するＲＴＸ－ＭＴの効果を測定する。「効果」という用語は、一般に、ＣＡ１２５を有する抗体と比較して、薬剤が試験抗体のみとインキュベートされた場合のＡＤＣＣ又はＣＤＣ標的細胞殺傷の１０％以上の変化を指す。使用される抗体及び薬剤に応じて、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化を指す場合もある。

本明細書に含まれる態様に関連する様々な用語及び用語法が、本書の明細書及び特許請求の範囲全体で使用されている。そのような用語は、特に明記しない限り、当該技術分野においてそれらの通常の意味を与えられるべきである。他の具体的に定義された用語は、提供された定義と一致する様式で解釈されるべきである。

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」の単数形はまた、内容が明確に別段の指示をしない限り、複数形の参照を含む。例として、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組み合わせ等を含み得る。「プローブ」への言及は、当業者によって知られている任意の分析方法を介して体液性免疫応答を監視するための試験抗体、エンハンサータンパク質、又は独立したプローブを含み得る。

量、期間等の定量化された値を指す時に使用される「約」という用語は、開示された方法を実行するために変動が適切であるように、指定された値から最大±９％の変動を包含することを意味する。特に明記しない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される分子量、モル濃度、反応条件、百分率等の試薬の量を表すすべての値は、すべての場合において「約」という用語によって定量化されると理解されるべきである。したがって、反対の指示がない限り、以下の明細書及び記載された特許請求の範囲に記載の数値は、本発明によって得られることが求められる組成剤の所望の特性及び／又は方法に応じて変化し得る近似値である。少なくとも、及び本出願の範囲を制限しようとするのではなく、各数値は、報告された有効数字によって、及び当業者に知られている通常の丸め方法によって少なくとも評価されるべきである。

本明細書で使用される「抗体」という用語は、広い意味で意味され、免疫グロブリン（「Ｉｇ」とも言及される）、又はポリクローナル抗体（ｐＡｂとも言及される）、マウス、ヒト、ヒト化、及びキメラ化ｍＡｂを含むモノクローナル抗体（ｍＡｂとも言及される）、二重特異性抗体（ＢＳＰとも言及される）、及び抗体断片を含む抗体分子を含む。一般に、抗体は特定の抗原に結合するタンパク質又はポリペプチド鎖である。抗原は、所与の抗体によって特異的に認識される構造である。標準的な抗体は、ジスルフィド結合と水素結合の複合体を介して裏打ちされた２つの軽鎖及び２つの重鎖で構成されるヘテロテトラマーグリコシル化タンパク質を含む。「そのジスルフィド架橋」という用語は、当業者によって一般に知られている、重鎖ヒンジ領域内に含まれるジスルフィド架橋を指す。各重鎖には、可変ドメイン（可変領域）（ＶＨ）と、それに続く多数の定常ドメイン（Ｆｃドメインと呼ばれる）がある。各軽鎖には、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメインがあり、軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと整列し、軽鎖ＶＬは重鎖の可変ドメインと整列する。任意の種の抗体軽鎖は、定常ドメイン内のアミノ酸配列、すなわちカッパ（κ）及びラムダ（λ）に基づいて、２つの異なるタイプのうちの１つに割り当てられる。

免疫グロブリンは、Ｆｃドメインのタイプ、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭに応じて、クラス又はアイソタイプに分類され、これらは、重鎖定常ドメイン内に含まれる配列に依存する。ＩｇＡ及びＩｇＧアイソタイプは、アイソタイプＩｇＡ_１、ＩｇＡ_２、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３及びＩｇＧ_４として更にサブクラスで構成される。

免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ領域は、報告されている配列の変動性に基づいて相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される３つの「抗原結合部位」によって中断された「フレームワーク」（ＦＷ）領域からなる（Ｗｕ ＴＴ，Ｋａｂａｔ ＥＡ．Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－２５０，１９７０）。一般に、抗原結合部位は６つのＣＤＲで構成され、３つは重鎖（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３）内にあり、３つは軽鎖（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３）内にある可変ドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＡ，ｅｔ ａｌ．５ｔｈ Ｅｄ．ＰＨＳ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。

「特異的結合」又は「特異的に結合する」とは、抗体又は抗原結合断片が、他の抗原よりも高い親和性で抗原（抗体自体に含まれる配列を含む）に結合することを指す。典型的には、特定の抗体又は抗原結合断片は、約５×１０^－８Ｍ以下の平衡解離定数Ｋ_Ｄで標的抗原に結合する。

「抗体の動的構造」という用語は、抗体の体液性機能（すなわち、Ｆｃ受容体又はＣ１ｑ結合等）に影響を与える可能性のある構造の任意の変化を指す。

「モノクローナル抗体（ｍＡｂ）」という用語は、真核生物又は原核生物の細胞クローン、又はファージクローンを含む単一の細胞クローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。したがって、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されず、組換え法も含み得る。

「Ｆａｂドメイン」は、当業者に知られている、抗体ヒンジジスルフィド領域のＮ末端の任意の抗体配列を指す。

「Ｆｃドメイン」は、当業者に知られている、抗体ヒンジジスルフィド領域のＣ末端にあり、それを含む任意の抗体配列を指す。

「影響を受けたドメイン」は、配列番号：３内で同定されたリツキシマブ重鎖（配列番号：４５）上に位置する領域を指す。

「抗原」は、抗体又は抗体断片が特異的に結合する実体である。これには、目的の抗体又はタンパク質への結合が含まれる。

「親抗体」という用語は、配列番号：６及び配列番号：４７から構成されるリツキシマブ抗体を指す。

「ＲＴＸ－ＭＴ」という用語は、配列番号：６と、影響を受けたドメイン（配列番号：３）内に１つ又は複数のアミノ酸変化を含む重鎖と、とから構成される抗体を指す。

「ＣＡ１２５不応性」という用語は、特にＣＡ１２５の存在下で、親リツキシマブ抗体よりも優れたＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣを有するＲＴＸ－ＭＴ抗体を指す。

「薬剤」又は「エンハンサータンパク質」という用語は、Ｃ３Ｂ（配列番号：１）及びＣ４Ｂ（配列番号：２）タンパク質を含む、影響を受けた抗体又は親抗体へのＣＡ１２５結合を遮断又は低減することができる任意のタンパク質を指す。

「影響を受けた抗体」という用語は、体液性免疫機能がＣＡ１２５によって低下する抗体を指す。

「リツキシマブ」という用語は、ＦＤＡが承認した抗体［ＦＤＡ参照ＩＤ：４２７４２９３（ワールドワイドウェブアドレス：ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｓａｔｆｄａ＿ｄｏｃｓ／ｌａｂｅｌ／２０１８／１０３７０５ｓ５４５０ｌｂｌ．ｐｄｆ）］又は配列番号：３９、４０、４１、４２、４３、４４をコードするＣＤＲ配列を含む任意の抗体を指す。

「ＣＤ２０」という用語は、Ｂ細胞によって発現されるヒト細胞表面タンパク質を指し、リツキシマブが特異的に結合する標的抗原である。

「ＣＡ１２５」という用語は、ＭＵＣ１６遺伝子（ＨＧＮＣ：１５５８２；ＯＭＩＭ：６０６１５４）によって産生される遺伝子産物を指し、可溶性及び膜結合型で見られる。抗体に結合し、結合した抗体の体液性免疫機能に影響を与えることが報告されている（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）。

「癌」、「悪性」、「調節不全」、及び「腫瘍」という用語は当該技術分野でよく知られており、調節不全細胞とも称される、同様の起源の正常な細胞型とは異なる未制御の細胞成長及び形態学的特徴を有する細胞の存在を指す。悪性とは、病的状態及び／又は死亡を引き起こす可能性のある癌細胞を指す。使用される場合、「癌及び腫瘍」には、前癌性及び悪性のタイプが含まれる。

使用される場合、「可溶性」という用語は、細胞の細胞膜に付着していないタンパク質又は非タンパク質剤を指す。例えば、可溶性の薬剤は、正常又は癌性の細胞から、血清、全血、血漿、尿、又は腫瘍を含む細胞の微小流体を含む生体液に放出、分泌、又は輸出され得る。

エンハンサータンパク質又はＲＴＸ－ＭＴ抗体及びＣＡ１２５を含む使用される特定のタンパク質又は非タンパク質剤の「レベル」は、インビトロ又はインビボでのタンパク質及び／又は非タンパク質剤レベルの測定のための当技術分野で知られている任意の方法を使用して決定される薬剤の１つ又は複数のレベルを指す。このような方法には、ゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、高拡散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィ、流体又はゲル内沈降反応、吸収分光法、比色分析法、分光光度分析法、フローサイトメトリ、免疫拡散法（単一又は二重）、液相アッセイ、免疫電気泳動法、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、フェルスター共鳴エネルギー移動、電気化学発光免疫測定法等が含まれる。一実施形態では、ＣＡ１２５のレベルは、より詳細に説明されるように、プローブベースの技術を使用して決定される。

「体液性免疫抑制（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｏ－ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）又は体液性免疫抑制（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）」という用語は、ＣＡ１２５によって直接結合され、動的構造が改変される任意の抗体、抗体断片、又は二重特異性抗体（ＢＳＰ）を指す。ＣＡ１２５は、正常な周囲の上皮細胞からのリンパ腫によって誘発され（Ｓａｎｕｓｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｅｒｉｔ Ｄｉａｌ Ｉｎｔ．２１：４９５－５００，２００１）、特定の抗体に結合し、その動的構造を変化させ、したがってＡＤＣＣ、ＣＤＣ、オプソニン化、内在化及び／又はＰＫ、ＰＤ及びＰＬプロファイルを含む生物学的活性に影響を与えることが報告されている。

「二重特異性抗体（ＢＳＰ）」という用語は、２つ以上の異なる抗原に結合することができる任意の抗体を指す。ＢＳＰは、限定されないが少なくとも２つの全長抗体、全長抗体及び一本鎖抗体、又は２つの一本鎖抗体を含むことができ、各々が異なる抗原又は同じ抗原上の異なるエピトープに結合する。

「抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）」という用語は、抗体が細胞表面の抗原に結合し、次に抗体のＦｃドメイン内の配列を介して免疫－エフェクター細胞と会合することができ、その結果、毒素を放出し、結合した細胞を殺傷し得るインビトロ又はインビボプロセスを指す。

「補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）」という用語は、抗体が真核細胞又は原核細胞表面上の抗原に結合し、次に抗体のＦｃドメイン内の配列を介してＣ１ｑタンパク質と会合することができ、その結果、古典的補体カスケードが開始されて結合した細胞を殺傷し得るインビトロ又はインビボプロセスを指す。

「オプソニン化」という用語は、抗体が細胞表面上の抗原に結合し、次にそのＦｃドメイン内の配列を介して免疫細胞と会合することができ、その結果、免疫細胞の貪食、消化、及び最終的には抗体結合細胞を殺傷するプロセスを指す。

「薬物動態（ＰＫ）」という用語は、対象に投与された時に抗体がその定常状態濃度を維持する時間を指す。

「薬力学的（ＰＤ）」という用語は、抗体ベースの薬物の生化学的及び生理学的効果とその作用（複数可）メカニズムの研究を指し、対象に投与された時のそれらの作用及び効果とそれらの生化学的構造との相関を含む。

「薬理学的（ＰＬ）」という用語は、抗体がインビトロ又はインビボで疾患細胞を管理する又は殺傷するのに及ぼす既知の効果を指す。

「サンプル」という用語は、対象から単離された類似の液体、細胞又は組織、並びに対象内に存在する液体、細胞又は組織、の集合を指す。液体は、細胞及びオルガノイド培地、尿、唾液、洗浄液等を含む、対象又は生物学的供給源と接触した液体溶液を含む生体液を含み得る。

使用される場合、「対照サンプル」という用語は、例えば、特定の癌型に罹患していない健康な対象からの試料又はその親細胞とは異なる細胞を含む、臨床的又は非臨床的に関連する任意の対照サンプルを指す。

「対照レベル」という用語は、対象に由来するサンプル中の同じ薬剤のレベルと比較するために使用される、又はインビトロアッセイで使用される、タンパク質又は非タンパク質剤の許容又は所定のレベルを指す。

使用される場合、対照設定の抗体と、エンハンサータンパク質の存在下又は不在下でＣＡ１２５により結合している抗体とのシグナル間の「差」は、一般に、当業者によって一般的に使用される統計的方法を使用して決定され得る任意の差であり、対照と比較して少なくとも１０％以上の差である。使用される抗体及びプローブに応じて、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化を指す場合もある。

「阻害する」又は「の阻害」という用語は、統計的に測定可能な量だけ低減すること、又は完全に防ぐことを意味する。

記載された方法に従って使用される抗体、抗体含有部分（すなわち、ＢＳＰ等）、又はエンハンサータンパク質の文脈における「機能的」という用語は、親抗体単独よりも、影響を受けた抗体それぞれに対するＣＡ１２５結合を低減又は遮断し、並びに／あるいはインビトロ又はインビボで標的細胞を殺傷することができることを示す。

「標的細胞」という用語は、特定の抗体又は抗体含有部分に対する抗原を発現する真核胞若しくは原核細胞又は細胞集団を指す。

「薬学的に許容される」という用語は、薬理学的及び毒物学的側面から患者に投与することが許容され、当業者に知られている手法を使用して製造される物質を指す。これらには、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認された、あるいは米国薬局方又はその他の一般的に認められている動物及びヒトでの使用のための薬局方に記載されている薬剤が含まれる。「薬学的に適合性のある成分」という用語は、抗癌剤を投与するのに用いられる薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、賦形剤又はマトリックスビヒクルを指す。「薬学的に許容される担体」とは、活性成分（複数可）の生物学的活性の有効性を妨げず、宿主に対して無毒であるマトリックスを指す。

「有効量」及び「治療上有効」という用語は交換可能に使用され、患者において増強された臨床転帰をもたらすのに十分な量で医薬品を投与することに関連して使用される。有効量の薬剤は、「効果的なレジメン」において、本明細書に記載されている方法に従って投与される。「効果的なレジメン」という用語は、特定の癌の患者の臨床転帰の増強を達成するのに適切な薬剤の量及び投薬頻度の組み合わせを指す。増強された有効性は、患者が、親化合物よりも病的状態をよりよく克服することができる薬剤、又は効果的なレジメンの臨床転帰を増強することができる薬剤を投与された場合の改善された臨床転帰である。ここでの文脈のように、有効量は、親抗体又はエンハンサータンパク質なしの抗体治療と比較した場合に有効性又は差異を示すために必要なＲＴＸ－ＭＴ及び／又はエンハンサータンパク質の量を指す。

「患者」及び「対象」という用語は、治療剤治療を受けるヒト及び獣医学的対象を含む他の非ヒト動物を指すために交換可能に使用される。「非ヒト動物」という用語には、すべての脊椎動物が含まれる。一実施形態では、対象はヒトである。

「治療剤」は、通常、望ましくない汚染物質を実質的に含まない。これは、薬剤が通常、少なくとも約５０％ｗ／ｗ（重量／重量）純粋であり、並びに妨害タンパク質及び汚染物質を実質的に含まないことを意味する。

「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗体結合標的細胞への結合時に抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は食作用（オプソニン化）をもたらす可能性のある、ＮＫ、骨髄、単球、樹状細胞を含むが、これらに限定されない任意の細胞を指す。細胞は、精製されるか、又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の形態の混合で存在し得る。

炎症性疾患には、自己免疫疾患、並びに関節リウマチ、多発血管炎性肉芽腫症、特発性血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、及びエプスタインバーウイルス陽性粘膜皮膚潰瘍が含まれる。

「調節不全細胞」という用語は、親細胞に対して異常であるとみなされる任意の細胞を指す。これらには、形質転換細胞、悪性細胞、ウイルス感染細胞、自己調節を介した自律的に成長する細胞、又は原核生物の病原体が含まれる。

「体液性応答」という用語は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、又は試験抗体による標的細胞への抗体の内在化を指す。

「スクリーニング」という用語は、影響を受けた抗体又は抗体含有部分（すなわち、ＢＳＰ、ＡＤＣ、一本鎖抗体、抗体断片等）の存在下でＣＡ１２５に結合することができるタンパク質の試験、及びＡＤＣＣ又はＣＤＣの殺傷を監視する増強された生物学的応答を調べることを指す。この用語は、多数の試験要素が分析されて、その中から特定の特性を有する試験要素を決定する他の状況で使用され得る。同様に、特定の特性を有する患者の患者試料のアッセイを指すために使用することができる。

「有意（に）」という用語は、スチューデントのＴ検定を含む任意の数のプログラムによって決定されたＰ値が０．０５未満である統計結果を指す。

治療的エンハンサータンパク質及び修飾リツキシマブ抗体の組成物、並びにＣＡ１２５を介した体液性免疫抑制を開発及び克服するための方法
エンハンサータンパク質（薬剤）及びその他の化学的又は生物学的薬剤は、影響を受けた親抗体及びＲＴＸ－ＭＴ抗体による体液性免疫応答のＣＡ１２５による抑制を効果的に阻害できる。いくつかの実施形態では。最適なエンハンサータンパク質及びＲＴＸ－ＭＴ抗体を同定する方法には、影響を受けたドメイン（配列番号：３）に１つ又は複数のアミノ酸変化を含むＲＴＸ－ＭＴ抗体を生成することと、ＲＴＸ－ＭＴ抗体が、ＣＤ２０を発現する標的細胞に対するＡＤＣＣ又はＣＤＣ殺傷を媒介するために使用される場合に、大幅に改善された生物学的活性を有するＲＴＸ－ＭＴ抗体の能力を試験することと、とが含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴ抗体は、１つのアミノ酸の変化からなる。他の実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴ抗体は、２つ以上のアミノ酸変化からなる。最適なアミノ酸の変化は、ＲＴＸ－ＭＴ抗体、ＣＡ１２５、及びＣＤ２０を発現する標的細胞の存在下で機能的なＡＤＣＣ又はＣＤＣキリングアッセイを使用して決定することができる。例を図１Ａに概略的に示す。ＣＡ１２５による体液性免疫抑制を有意に克服することができるＣＡ１２５不応性ＲＴＸ－ＭＴ抗体の同定は、当業者によって一般的に使用されるＡＤＣＣ又はＣＤＣキリングアッセイを使用することによって同定される。

更に別の実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴ抗体は、親ＲＴＸ抗体と同等又はそれを超える結合親和性を有する。

ＣＡ１２５不応性ＲＴＸ－ＭＴ抗体を同定するためのいくつかの方法では、抗体は、標的細胞が自然に又は組換え的にＣＤ２０及びＣＡ１２５を発現する標的細胞の培養物に添加される。ＲＴＸ－ＭＴと親抗体の存在下で体液性応答を比較するための培養は、標準のＡＤＣＣ又はＣＤＣキリングアッセイを使用して監視することができる。少なくとも１０％の変化は、典型的には、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣ機能に対する有意義な効果であるとみなされる。用いられる抗体及びアッセイに応じて、有意義な効果はまた、少なくとも５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、又は７５％の変化として定義され得る。標的細胞株は、ＣＡ１２５を自然に発現し、ヒトＣＤ２０発現構築物を形質導入される操作された癌細胞である可能性がある。

ＣＡ１２５不応性ＲＴＸ－ＭＴ抗体を用いて癌対象を治療する方法も本明細書で提供される。例えば、患者は、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、又は慢性リンパ性白血病等であるがこれらに限定されないＣＤ２０を発現する癌を有する可能性がある。いくつかの報告では、このような癌の患者でＣＡ１２５の発現が上昇していることがわかり、リツキシマブは、ＣＡ１２５の血清レベルが正常範囲を超えている患者では効果が低いと報告されている。このような場合、ＲＴＸ－ＭＴ抗体が望ましい実体であり得る。

ＲＴＸ－ＭＴ抗体で対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、ＣＡ１２５を発現するＣＤ２０^＋癌を有する患者は、ＲＴＸ－ＭＴ抗体単独で、又は標準治療の療法と組み合わせて治療され得る。本明細書に記載のＣＡ１２５発現癌を有する対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴ抗体が対象に投与され、ここで対象は正常範囲を上回るベースラインＣＡ１２５レベルを有する。本明細書に記載のＣＡ１２５発現癌を有する対象を治療する方法のいくつかの実施形態では、方法は、ＲＴＸ－ＭＴ抗体単独を投与することに関与する。更に別の実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴ抗体は、化学療法と組み合わせて投与される。化学療法は、対象が治療される時点における特定の癌の適応症に対する標準治療と見なされる任意の化学療法剤であり得る。本明細書に記載の治療方法において、ＣＡ１２５発現レベルは、当該技術分野で既知の任意の手段によって決定され、当業者によって正常範囲内又はそれを上回ると定義され得る。

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、ＲＴＸ－ＭＴ抗体は、影響を受けたドメイン（配列番号：３）における１つのアミノ酸変化からなる。ＲＴＸ－ＭＴ抗体は、ＣＡ１２５を発現するＣＤ２０陽性（ＣＤ２０^＋）の癌患者に投与される。ＣＡ１２５を産生することが知られている例示的なＣＤ２０陽性の癌は、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞リンパ腫、及び慢性リンパ性白血病である。中皮腫、卵巣癌、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、胃腸癌、子宮内膜癌、及び膵臓癌を含むがこれらに限定されない他の癌もまた、上記治療に適している可能性がある。

本発明の方法は、外科手術（例えば、減量手術）、放射線、標的療法、化学療法、免疫療法、増殖因子阻害剤の使用、又は抗血管新生因子等の他の治療手段と組み合わせることができる。ＲＴＸ－ＭＴ抗体又は親抗体＋エンハンサー薬剤を、手術、化学療法、又は放射線療法の治療を受けている患者に同時に投与することができる。あるいは、患者は、ＲＴＸ－ＭＴ抗体又は親抗体＋エンハンサー薬剤の投与の前又は後に、手術、化学療法、又は放射線療法を受けることができ、標準治療の療法を施す前又は後の、少なくとも１時間から最大数ヶ月まで、例えば、少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１ヶ月、又は３ヶ月まで受けることができる。本明細書に提供される治療方法のいくつかの実施形態は、エンハンサータンパク質に加えて、治療有効量の化学療法＋ＣＤ２０抗体等の腫瘍特異的抗原に対して影響を受けた抗体を対象に投与することを含む。

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、対象は、当該癌によって発現された抗原に特異的な影響を受けた抗体及びエンハンサータンパク質を投与する前に、腫瘍に対する一次外科的切除、癌の治療のための一次化学療法を受けた可能性がある。

本明細書に記載の治療方法のいくつかの実施形態では、対象は、不応性抗体又は親抗体＋エンハンサータンパク質を投与する前に、腫瘍の一次外科的切除、癌の治療のための一次化学療法を受けた可能性があり、ここで当該癌によって発現される抗原に特異的な抗体、及びエンハンサータンパク質は、ＣＡ１２５等の体液性免疫抑制タンパク質を特異的に阻害することができる。

本明細書に記載の治療方法に従ったＲＴＸ－ＭＴ抗体及び／又はエンハンサータンパク質の投与は、当技術分野で知られている任意の手段によるものであり得る。通常、抗体は静脈内に注入される。

更に別の実施形態では、抗体のＣＤ２０抗原への結合を指示することができるＣＤＲ配列を含む治療用抗体：ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））に従って番号を付けられた、ＣＤＲＨ１としての配列番号：４１（ＧＹＴＦＴＳＹＮ）、ＣＤＲＨ２としての配列番号：４２（ＩＹＰＧＮＧＤＴ）、ＣＤＲＨ３としての配列番号：４３（ＡＲＳＴＹＹＧＧＤＷＹＦＮＶ）、ＣＤＲＬ１としての配列番号：４４（ＳＳＳＶＳＹ）、ＣＤＲＬ２としての配列番号：４５（ＡＴＳ）、及びＣＤＲＬ３としての配列番号：４６（ＱＱＷＴＳＮＰＰＴ）が使用され得、影響を受けたドメイン（配列番号：３）に変異を有する。抗体は、ＣＤ２０陽性疾患の適応症、及びエンハンサータンパク質との同時投与において、又は単独で、ＣＡ１２５が正常範囲を上回る場合に投与することができる。エンハンサータンパク質の用量レベルは、臨床的に決定された最大耐用量（ＭＴＤ）又はＭＴＤより低いレベルと同じくらいの高さである可能性がある。エンハンサータンパク質の投与は、抗体の投与の前、同時、又は後であり得る。治療には、手術及び標準治療による治療が含まれ得る。エンハンサータンパク質又は他の化学的若しくは生物学的エンハンサー薬剤は、抗体と一緒に、組み合わせて、又は抗体とは別に投与することができる。これは、例えば、経口、皮内、皮下、筋肉内、又は静脈内に投与され得る。

必要に応じて、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路を含む、ＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質を投与するための様々な送達システムが使用され得る。これらは、例えば、注入又はボーラス注射によって、全身的又は局所的手法を介して、上皮又は粘膜皮膚内層（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜等）を介した吸収によって投与され得る。

ＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質は、注射器、カテーテル、坐剤、又は任意の移植可能なマトリックス若しくはデバイスを介した注射によって投与することができる。

本明細書に記載される使用のためのＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質及びその医薬組成物は、カプセル、錠剤、水性懸濁液、溶液等の任意の許容可能な剤形で経口投与することができる。

ＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質の好適な投与方法には、効果的な治療に好適な最終濃度における静脈内注射及び腹腔内投与が含まれるが、これらに限定されない。

他の薬物と組み合わせたＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質は、治療的又は予防的に有効な量の治療剤（複数可）及び１つ又は複数の薬学的に許容される又は適合性のある成分を含む医薬組成物として投与することができる。

癌又は非腫瘍性疾患の治療又は予防に有効な治療剤の量は、標準的な臨床技術によって決定することができる。更に、インビトロアッセイを任意選択で用いて、ＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質に必要な最適な投与量範囲を同定するのを助けることができる。有効量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られたＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質の用量応答曲線から推定することができる。

例えば、ＲＴＸ－ＭＴ抗体又はエンハンサータンパク質の毒性及び治療有効性は、ＬＤ_５０（集団の５０％に対する致死用量）及びＥＤ_５０（集団の５０％で治療的に有効な用量）値を決定するための標準的な薬学的手順によって、細胞培養又は実験動物で決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ_５０／ＥＤ_５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す薬剤が好適である。薬剤が毒性の副作用を示す場合、影響を受けた組織の部位に薬剤を標的とする送達系を使用して、非ＣＤ２０発現細胞への潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減することができる。

核酸ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス、又はサブウイルスであり得る。好ましくは、核酸は、効果的な複製起点を有することによって所望の宿主細胞内に維持されるが、状況によっては、一過性の発現が望まれる場合がある。典型的には、変異抗体を発現させることが望ましく、ベクター上の発現制御配列及び宿主細胞内の適切なアクセサリータンパク質を必要とする。多くの場合、抗体又は抗体部分を大量に生産するために、抗体の全部又は一部を発現する安定した細胞株が形成される。抗体部分は、例えば、全体の軽鎖又は重鎖であり得る。

投与及び投与スケジュールは、対象の必要性、大きさ、及び状態に依存し得る活性薬物濃度に応じて変化し得る。

実施例１－影響を受けた抗体のＣＡ１２５免疫抑制を克服できるタンパク質のスクリーニング及びＣＡ１２５抗体結合のマッピング
図１Ａ～１Ｄは、影響を受けた抗体のＣＡ１２５免疫抑制効果を阻害できるタンパク質を同定するためのスクリーニング方法及び結果、並びにＣＡ１２５が結合できる影響を受けた抗体のマップ領域へのそれらの結合の使用を示している。

エンハンサータンパク質は、影響を受けた抗体に対するＣＡ１２５の免疫抑制効果を阻害する。影響を受けた抗体はリツキシマブである。スクリーニングアッセイには、９６ウェルプレートＥＬＩＳＡが含まれ、これにより、ウェルはＣＡ１２５タンパク質を有する場合又は有さない場合で、リツキシマブでコーティングされ、次いでウェルはＣ３Ｂ又はＣ４Ｂタンパク質を有する場合又は有さない場合で、ビオチン化ヒトＣＤ１６ａでプローブされ、ＣＤ１６ａ結合を測定する。以前の研究では、ＣＡ１２５が、影響を受けた抗体に結合するＣＤ１６ａ又はＣ１ｑタンパク質の影響を抑制できることが示されている。図１Ｂに示すように、ＲＴＸを含むウェルはＣＤ１６ａ及びＣ１ｑの両方のタンパク質に結合したが、ＲＴＸ＋ＣＡ１２５を含むウェルではどちらのタンパク質の結合も大幅に減少した。次に、Ｃ４Ｂタンパク質（配列番号：２）をＲＴＸ＋ＣＡ１２５を含むウェルに添加した。リツキシマブ＋ＣＡ１２５を含むウェルにＣ４Ｂを添加すると、ＣＤ１６ａ及びＣ１ｑの結合が回復した。この効果が機能的な結果をもたらすことを確認するために、ヒトＣＤ２０陽性Ｄａｕｄｉ細胞を、外因的ＣＡ１２５添加を有する又は有さないＲＴＸで処理し、以下に説明するようにＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性についてスクリーニングした。図１Ｃに示すように、ＣＡ１２５はＣＤＣ活性を抑制した。次に、Ｃ４Ｂを同様の培養に添加し、ＲＴＸ＋ＣＡ１２５で処理したウェルでＣＤＣ活性を回復できたことを発見した。ＥＬＩＳＡによる直接結合アッセイで、ビオチン化Ｃ４ＢがＲＴＸでコーティングされたウェルに結合できるが、ＣＡ１２５には結合できないことがわかったため（図示せず）、この効果は、ＣＡ１２５ではなくＲＴＸ抗体へのＣ４Ｂ結合の結果であるように思われる。同様の効果がＣ３Ｂでも観察され、データのサブセットが図１Ｄに提供される。

ＣＤ１６Ａ活性化アッセイは、ＡＤＣＣ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｃｏｒｅ Ｋｉｔの一部であり、販売業者（Ｐｒｏｍｅｇａ）の推奨に従ってアッセイされるＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃエフェクター細胞を使用して実施した。簡単に説明すると、２ｘ１０^４の標的細胞を、アッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ＋Ｌ－グルタミン＋１％超低Ｉｇ血清）（Ｇｉｂｃｏ）に３連で、黒色の不透明な９６ウェルプレートに一晩播種した。翌日、１ｘ１０^５のＪｕｒｋａｔ－Ｌｕｃエフェクター細胞を、エフェクター標的比が５：１になるようにアッセイ緩衝液のウェルに添加した。抗体、エフェクター、及び標的細胞を３７℃／５％ＣＯ_２で１６時間インキュベートした。プレートを室温で１０分間平衡化した。５０マイクロリットルのＢｉｏ－ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）をウェルに添加し、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸプレートリーダ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して発光を定量した。

ＣＡ１２５の存在下のＣＤ２０へのＲＴＸ結合の競合は、次のように実行した。簡単に説明すると、ＥＬＩＳＡプレートを０．０５Ｍカルボナート緩衝液（ｐＨ９．５）で希釈した抗原で４℃で一晩コーティングした。コーティングされた抗原は、ＣＤ２０／ＭＳ４Ａ１直鎖ペプチド（Ｒｐ１－Ｌ；Ｆａｖｏｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１９Ａｐｒ；２０（８）：１９２０）１０μｇ／ｍＬであった。プレートを、５％ＢＳＡを含む０．０５Ｍホスファート緩衝液、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で室温で１時間ブロックし、次いでＰＢＳで２回洗浄した。ビオチン化ＲＴＸ（ＥＺ－ｌｉｎｋ Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ－ＬＣ－Ｂｉｏｔｉｎ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒによる）又はネガティブ対照ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をＰＢＳ中プレートに５μｇ／ｍＬ、室温で１時間添加した。いくつかの反応において、１０μｇ／ｍＬの非標識ＲＴＸ（２倍過剰）又は３０ＫＵ／ｍＬのＣＡ１２５を添加することによって、競合を行った。ウェルをＰＢＳで３回洗浄した後、ＰＢＳ／ＢＳＡ中のストレプトアビジン－ＨＲＰを室温で１時間添加した。洗浄後、７５μＬのＴＭＢ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加することにより最大１０分間反応が進行し、７５μＬの０．１ＮのＨ_２ＳＯ_４を添加することにより停止させた。Ｖａｒｉｏｓｋａｎプレートリーダ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で４５０ｎｍの吸光度を測定した。

以前の報告は、ＣＡ１２５は影響を受けた抗体のＦａｂドメインに結合できることが示されている（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７；Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ ＮＣ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ １３：１－２２，２０１８）。Ｃ３Ｂ及びＣ４Ｂは、ＩｇＧ１型抗体のＦａｂドメインに結合することが以前に報告されている（Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＲＤ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ １８９：６７－８０，１９８０；Ｓａｈｕ Ａ ａｎｄ Ｐａｎｇｂｕｒｎ ＭＫ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２６９：２８９９７－２９００２，１９９４）。

Ｃ３Ｂ及び／又はＣ４Ｂが、リツキシマブに結合するＣＡ１２５の能力を阻害することによってＣＡ１２５免疫抑制を阻害できるかどうかを判断するために、ＥＬＩＳＡを使用した競合結合アッセイを実施した。図２Ａに示すように、ビオチン化リツキシマブは、以前に報告されたようにＣＡ１２５に結合することができた（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）。組換えＣ４Ｂタンパク質の添加は、リツキシマブのＣＡ１２５への結合を阻害することができ、それにより、ＣＡ１２５の免疫抑制効果の低下は、影響を受けた抗体へのＣＡ１２５の結合の阻害によるものであることが確認された。同様の効果がＣ３Ｂでも観察された（図１Ｄ）。対照的に、タンパク質Ｌ等の他のＩｇＧ結合タンパク質はＣＡ１２５結合を阻害せず、Ｃ３Ｂ及びＣ４Ｂ効果の特異性を示している（図１Ｄ）。抗体のＦａｂドメインへのＣ３Ｂ又はＣ４Ｂの結合が報告されているが、それが結合する免疫グロブリンドメインの決定（軽鎖又は重鎖、あるいはその両方）はあいまいであった。ＣＡ１２５がリツキシマブの軽鎖、重鎖、又は両方の免疫グロブリン鎖に結合するかどうかをより明確にするために、影響を受けていない抗体ペルツズマブ（ＰＴＺ）の軽鎖及び重鎖を使用するキメラ抗体（Ｋｌｉｎｅ ＪＢ，ｅｔ ａｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔ ８：５２０４５－５２０６０，２０１７）を、リツキシマブの重鎖及び軽鎖と組み合わせて、キメラ抗体を作製した。次に、これらの抗体をビオチン化し、ＣＡ１２５結合について試験した。図２Ｂに示すように、リツキシマブ重鎖を含むキメラ抗体（ＲＴＸ－ｈｃ／ＰＴＺ－ｌｃ）は依然としてＣＡ１２５に結合できたが、軽鎖を含むキメラ（ＰＴＺ－ｈｃ／ＲＴＸ－ｌｃ）は結合できず、これにより、ＣＤＲ３及びジスルフィドヒンジ領域のＮ末端残基を含む領域内の重鎖へのＣＡ１２５の推定上の結合を減じた。更に、リツキシマブ－ＣＡ１２５相互作用は、重鎖のＣＨ１ドメインに結合する補体タンパク質Ｃ３Ｂ（図１Ｄ）と競合する可能性があるが、軽鎖可変ドメインに結合するタンパク質Ｌとは競合しない。これらのデータは、ＣＡ１２５結合部位がリツキシマブ重鎖内に位置し、Ｃ３Ｂ（配列番号：１）を使用してＣＡ１２５免疫抑制効果を逆転させることができるという証拠を提供する。

実施例２－ＣＡ１２５結合及びＣＡ１２５不応性リツキシマブ抗体の生成に必要な重要な残基の同定
Ｃ３Ｂ及びＣ４Ｂタンパク質は、それぞれ抗体のＣＤＲ３フレームワーク４（ＣＤＲ３－ＦＷ４）及びＣＨ１領域に結合することが示されており、図１及び２に示す結果は、これらのタンパク質が親リツキシマブ（ＲＴＸ－ＷＴ）へのＣＡ１２５結合と競合することを示し、ＣＡ１２５がＣＤＲ３－ＦＷ４及びＣＨ１領域に結合する可能性があることを示唆している。ＲＴＸ－ＷＴ重鎖もＣＡ１２５結合に十分であるため、ランダム変異誘発ライブラリ手法を適用して、ＣＡ１２５がリツキシマブ重鎖に結合するために特定の残基（複数可）が必要かどうかの決定を試みた。影響を受けたドメインＣＤＲ３－ＦＷＲ４及びＣＨ１（配列番号：３）内に変異残基を有するリツキシマブ重鎖のライブラリを作成するために当業者によって一般的に使用されるランダム変異誘発ＰＣＲ法を採用し、次いでそれらを真核生物発現ベクターを使用したＨＥＫ２９３細胞のリツキシマブ軽鎖（配列番号：６）との組み合わせにおいて組換えで発現させた。１０００を超えるクローンのライブラリを生成した。ＣＤＲ３内の変異はＣＤ２０抗原結合に悪影響を与える可能性があるため、培養上清を抗体産生及びＣＤ２０結合についてＥＬＩＳＡでスクリーニングした。次に、２００を超えるリツキシマブクローンのＣＡ１２５結合を分析したところ、５つが親抗体と同等又はそれを超えるＣＤ２０結合を保持し、ＣＡ１２５結合が有意に減少していることがわかった。次に、これらのクローンの重鎖の配列が決定され、すべてが標的領域内に変異を有していることが見出された。図３に示すように、すべてのクローンには複数の変異があり、一部は重複する変異アミノ酸を有していた。図４に示すように、クローン１４８（配列番号：３７及び３８）、１６４（配列番号：３１及び３２）、１６６（配列番号：４及び５）、１９８（配列番号：１９及び２０）及び１９９（配列番号：２５及び２６）は、最も強力なＣＤ２０結合を有し、ＣＡ１２５結合が減少した。これらのクローンを拡張し、特異的ＲＴＸ－ＭＴ抗体を精製し、機能的ＡＤＣＣ及びＣＤＣアッセイで試験した。図５に示されるように、クローン１６４（配列番号：３１及び３２）、１６６（配列番号：４及び５）及び１９８（配列番号：１９及び２０）は、ＣＡ１２５に対して最も不応性であった。これらのＲＴＸ－ＭＴ抗体は、現在、前臨床及び臨床試験の準備ができている。これらの抗体内の１つ又は複数の変異がＣＡ１２５結合の減少に必要かどうかを更に詳しく説明するために、リツキシマブ重鎖への単一又は二重変異を操作し、ＣＡ１２５結合について再スクリーニングした。図６Ａに示すように、ＲＴＸ－ＭＴクローン１１２－１３４（コドン１０９でＮからＤ及びコドン１３１でＰからＳのアミノ酸変化、配列番号：１３及び１４）、クローン１３３（コドン１３０でＦからＹのアミノ酸変化、配列番号：２９及び３０）、クローン１０６（コドン１０３でＧからＣのアミノ酸変化、配列番号：３３及び３４）、及びクローン１３７（コドン１３４でＰからＳへのアミノ酸変化、配列番号：３５及び３６）は、親抗体のようにＣＤ２０結合を保持しながら、ＣＡ１２５への結合の低下を示した（Ｐ＜０．００５５）。ＲＴＸ－ＭＴクローン１１２－１３４及び１３３は、親抗体と比較して、ＣＡ１２５の存在下でＣＤ１６ａ－ビオチン及びＣ１ｑ－ビオチン結合の改善を示し（図６Ｂ）、ＣＡ１２５間の関係又は抗体及び抗体免疫エフェクター複合体の形成と機能への結合の欠如を裏付けている。

すべてのアミノ酸変化又はそれらの組み合わせが観察されたＣＡ１２５不応性表現型に必要かどうかは明らかではなかったため、ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６に由来する変異を更に研究した。配列分析は、ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６が３つのアミノ酸変化を有することを示した（コドン１０９でＮからＤ、コドン１３１でＰからＳ、及びコドン１３６でＳからＹ（配列番号：５））。観察された表現型への各変異の寄与を研究するために、ＲＴＸ－ＭＴクローン１６６に見られる３つのアミノ酸変化の１つと二重変異の組み合わせをそれぞれ有する追加のＲＴＸ－ＭＴバリアントを操作した。これらの新しいＲＴＸ－ＭＴバリアント（Ｎ１０９Ｄ、Ｐ１３１Ｓ、Ｓ１３６Ｙ、Ｎ１０９Ｄ＋Ｐ１３１Ｓ、Ｎ１０９Ｄ＋Ｓ１３６Ｙ、及びＰ１３１Ｓ＋Ｓ１３６Ｙと称される）の分析は、Ｎ１０９Ｄ変異（コドン１０９のＮからＤのアミノ酸の変化）は、ＣＡ１２５を介したＦｃ受容体の抑制（図７Ａ）及びＣ１ｑ結合（図７Ｂ）に対する感受性の低下と相関していた。抗ＨＥＲ２抗体ペルツズマブ（ＰＴＺ）をＣＡ１２５不応性対照抗体として使用した。更に試験すると、Ｎ１０９Ｄバリアント（以下、ＲＴＸ－ＭＴ又はＲＴＸ Ｎ１０９Ｄと呼ぶ）は、親ＲＴＸに匹敵するレベルでＣＤ２０に結合し（図７Ｃ）、重要なことに、ＣＡ１２５へのその結合は５０％有意に減少した（図７Ｄ）ことを示した。全体として、これらの結果は、変異Ｎ１０９Ｄ（コドン１０９でＮからＤに変化）が、ＣＡ１２５に対するＲＴＸ Ｎ１０９Ｄの感度を低下させるのに十分であることを示している。

ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄは、ＣＡ１２５不応性ＲＴＸ－ＭＴバリアントの一例として使用され、更に特性決定した。ＣＤ２０への結合は、親ＲＴＸのＣＤ２０結合との比較可能性を確認するための代替アッセイによって分析した。抗体平衡解離定数（Ｋｄ）の測定は、抗原陽性（Ｒａｍｏｓ）及び抗原陰性（Ｊｕｒｋａｔ）細胞株の免疫染色に関与する細胞ベースの蛍光アッセイを使用して実施した。このアッセイでは、０．７８～１００ｎＭの範囲の４８８標識抗体の２倍濃度滴定で細胞を染色する。簡単に説明すると、細胞は完全なＲＰＭＩで懸濁状態で成長する。生存率が８５％を超えるコンフルエントな培養物を８００ＲＰＭで６分間遠心分離し、細胞ペレットを５０ｍＬチューブ内の４ｍＬのＡｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＳＰ－５０３５）に再懸濁して、細胞を洗浄する。細胞を再度遠心分離し、Ａｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｅｒに１０，０００，０００／ｍＬで再懸濁する。サンプルを氷上で２０分間インキュベートして、非特異的結合部位をブロックする。次に、細胞（２００ｍＬ／２，０００，０００細胞／ウェル）をＶ底のポリプロピレン９６ウェルマイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ３３６３）に移し、ベンチトップ遠心分離機で１，５００ＲＰＭで２分間遠心分離する。上清を除去し、細胞を９０ｍＬ／ウェルのＡｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｅｒに再懸濁する。各条件を、重複したウェルで試験する。希釈された４８８標識抗体（１０μＬ／ウェル）を対応するウェルに添加し、２０分ごとに混合しながらサンプルを氷上で１時間インキュベートする。次に、１００μＬ／ウェルのＡｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｅｒを使用して、細胞を４回洗浄し、各洗浄後に１，５００ＲＰＭで２分間遠心分離する。最後の洗浄後、細胞を１００μＬ／サンプルの１０％ホルマリン（ＬａｂＣｈｅｍ，ＬＣ１４６７０２）で１０分間固定する。サンプルを再度遠心分離した後、細胞を１００μＬ／ウェルのＡｎｉｍａｌ－Ｆｒｅｅ Ｂｌｏｃｋｅｒで、黒いマイクロプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ，６５５０８６）に移す。Ｖａｒｉｏｓｋａｎ ＬＵＸプレートリーダを使用することによって、各サンプルの４９４ｎｍ励起／５１９ｎｍ発光における蛍光を測定した。抗原陰性細胞への非特異的バックグラウンド結合は、抗原陽性細胞からの結合シグナルから差し引かれる。減算された値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン８．４の「１つの部位との飽和結合」の非線形回帰分析を使用してプロットする。モデルは、平衡状態で受容体部位の半分に結合するリガンド濃度としてＫｄを決定する。

この結合アッセイを使用して、ＲＴＸ Ｎ１０９ＤはＣＤ２０陽性Ｒａｍｏｓ細胞に用量依存様式で結合し、一方、ＣＤ２０陰性のＪｕｒｋａｔ細胞には結合しなかったが、親リツキシマブ（ＲＴＸ）と同様の標的細胞特異性の保持が確認された（図８Ａ～８Ｂ）。更に、ＲＴＸ及びＲＴＸ Ｎ１０９Ｄの測定された親和性／Ｋｄは、それぞれ２０．６及び３０．５ｎＭであった（図８Ｃ～８Ｄ）。ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄ親和性のわずかな低下が予想され、異なるアッセイを使用した以前のＣＤ２０結合データと一致していたが（図７Ｃ）、全体的なＲＴＸ Ｎ１０９Ｄは、親リツキシマブに匹敵するＣＤ２０特異的結合及び親和性を示した。

ＣＡ１２５は親リツキシマブへのＣ１ｑ結合を阻害し、ＣＤＣ活性の低下をもたらすため、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄによって介されるＣＤＣに対するＣＡ１２５の影響を調査した。前に示したように、ＲＴＸ Ｎ１０９ＤへのＣ１ｑ結合は、親リツキシマブ（ＲＴＸ）と比較して増加した（図７Ｂ）。このＣ１ｑ結合の増加により、免疫抑制性ＣＡ１２５及びＣＤ２０を発現する標的細胞を使用したＲＴＸと比較して、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄによって介されるＣＤＣ活性が増強され（図９Ａ）、ＣＡ１２５陽性であるがＣＤ２０陰性の細胞を使用した場合、有意な殺傷は認められなかった（図９Ｂ）。

ＣＡ１２５は、親リツキシマブのＦｃ受容体への結合、及びそのシグナル伝達の活性化を阻害し、とそれに続いてＡＤＣＣ活性を低下させるため、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄを使用した場合にこの免疫抑制効果が低下するかどうかを調べた。分析は、ＲＴＸ Ｎ１０９ＤがＦｃ受容体に結合し、ＣＡ１２５を発現する標的細胞において、親リツキシマブ（ＲＴＸ）よりもそのシグナル伝達を有意に高いレベルで活性化することを示し、一方、ＣＡ１２５陰性細胞を使用した場合に有意差は認められなかった（図１０Ａ～１０Ｂ）。ＰＴＺはＣＡ１２５不応性対照抗体として使用した。強化されたＦｃ受容体相互作用及び活性化の重要な結果は、ＲＴＸ Ｎ１０９Ｄが、親リツキシマブ（ＲＴＸ）よりも免疫抑制性ＣＡ１２５の存在下で、標的細胞に対してより強力なＦｃ受容体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を媒介できたことであった（図１０Ｃ）。

これらのデータは、リツキシマブ重鎖の影響を受けた領域（配列番号：３）内の残基を修飾してＣＡ１２５不応性抗体を生成することが、ＣＡ１２５免疫抑制タンパク質の存在下でＣＤ２０陽性細胞殺傷を改善する可能性があることを示している。

本文書で引用されているすべての参照は、本明細書に明示的に組み込まれている。

配列の同定（ＲＴＸ－ＭＴアミノ酸配列の場合、ＮからＣのすべての配列であり、アミノ酸の変化は太字で示されている）

Claims (16)

1. 配列番号：３のアミノ酸残基配列を含む免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドであって、前記配列中の１つのアミノ酸残基が、配列番号：３に示されるものと異なるアミノ酸残基で置換されており、前記１つの置換アミノ酸残基が、１つのアミノ酸置換のない免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと比較して、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの免疫抑制タンパク質への結合を、減少させるか又は排除し、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドが、配列番号：６に従う軽鎖及び配列番号：８を含む重鎖を含む抗ＣＤ２０抗体であり、前記免疫抑制タンパク質がＣＡ１２５／ＭＵＣ１６である、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
2. 全長抗体である、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
3. 二重特異性抗体である、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
4. ＩｇＧアイソタイプ抗体の免疫グロブリン軽鎖及び免疫グロブリン重鎖からなるタンパク質である、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
5. ＞１ｎＭ又は＜４００ｎＭである親和性／Ｋｄで、ＣＤ２０に結合する、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
6. ＞１０ｎＭ又は＜５０ｎＭである親和性／Ｋｄで、ＣＤ２０に結合する、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
7. 配列番号：３のアミノ酸残基配列を含む前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの、ＣＤ２０に対する親和性／Ｋｄの±５０％である親和性で、ＣＤ２０に結合する、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド。
8. 請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドをコードする、核酸ベクター。
9. 請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
10. 請求項８に記載の核酸ベクターを含み、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドを発現する、安定細胞株。
11. 健康なヒト集団と比較して高いレベルのＣＡ１２５を発現する、疾患を有する患者を治療するための、請求項１に記載の免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドを含む医薬。
12. 前記疾患が、癌である、請求項１１に記載の医薬。
13. 前記疾患が、炎症性疾患である、請求項１１に記載の医薬。
14. 前記癌が、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、濾胞性リンパ腫、大細胞型リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、慢性リンパ性白血病、及び多発性骨髄腫からなる群から選択される、請求項１２に記載の医薬。
15. 患者においてＣＡ１２５を発現する腫瘍を試験及び治療するための方法における使用のための医薬であって、
    前記方法が、
    （ａ）前記患者から単離された体液サンプル
    を、
    （ｂ）配列番号：３のアミノ酸配列を含む抗体
    と接触させ、かつ（ａ）を
    （ｃ）配列番号：３のアミノ酸残基配列を含む免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドであって、前記配列中の１つのアミノ酸残基が、配列番号：３に示されるものと異なるアミノ酸残基で置換されており、前記１つの置換アミノ酸残基が、１つのアミノ酸置換のない免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドと比較して、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドの免疫抑制タンパク質への結合を、減少させるか又は排除し、前記免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチドが、配列番号：６に従う軽鎖及び配列番号：８を含む重鎖を含む抗ＣＤ２０抗体であり、前記免疫抑制タンパク質がＣＡ１２５／ＭＵＣ１６である、免疫抑制不応性タンパク質又はポリペプチド
    と接触させる工程、並びに
    前記体液サンプル中のＣＡ１２５が（ｂ）に結合するが（ｃ）には結合しないことを決定し、前記患者を（ｃ）で治療する工程、
    を含み、かつ
    前記医薬が（ｃ）を含む、
    医薬。
16. 前記患者がＣＡ１２５の血清レベルについて試験されている、請求項11に記載の医薬。

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