CN116964086A - 抗SARS-CoV-2抗体和其用途 - Google Patents

抗SARS-CoV-2抗体和其用途 Download PDF

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Abstract

本文公开了抗SARS‑CoV‑2刺突蛋白抗体和其用于治疗和/或诊断目的的方法。本文还提供了用于产生此类抗体的方法。

Description

抗SARS-CoV-2抗体和其用途
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2020年5月18日提交的美国临时申请第63/026,486号的权益，所述美国临时申请的内容通过引用整体并入本文。
背景技术
严重呼吸道综合征冠状病毒-2(SARS-CoV-2)是一种新型冠状病毒，引起构成了严重的全球健康风险的冠状病毒疾病2019(COVID-19)。其基因组编码至少27种蛋白质，包含15种非结构蛋白、4种结构蛋白和8种辅助蛋白。刺突糖蛋白(S)是一种定位于病毒体的外包膜上的结构蛋白，与人类受体血管紧张素转换酶2(ACE2)结合。SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2的S糖蛋白具有1104至1273个氨基酸，并且含有氨基(N)端S1亚基和羧基(C)端S2亚基。在S1亚基中，跨越约200个残基的受体结合结构域(RBD)由以下两个亚结构域组成：核心亚结构域和外部亚结构域。RBD核心亚结构域负责S三聚体颗粒的形成。病毒进入的第一步被认为是病毒三聚体刺突蛋白与ACE2的结合。
本领域需要鉴定对SARS-CoV-2感染和COVID-19的有效治疗方法。具体地，需要开发能够干扰SARS-CoV-2与靶细胞结合，具体地与ACE2结合的能力的抗体。
发明内容
本公开至少部分地基于对SARS-CoV-2刺突蛋白S的S1亚基具有高结合亲和力和特异性的优良SARS-CoV-2抗体(也被称为抗S1抗体)的开发。在一些情况下，抗S1抗体与S1的受体结合结构域(RBD)结合。在其它实例中，所述抗S1抗体与S1的RBD的外部的区域结合。本文所公开的抗S1抗体显示出阻断S1(例如，RBD)与血管紧张素转换酶2(ACE2)结合的能力，这进而可以抑制SARS-CoV-2有效感染细胞的能力。因此，本文所公开的抗SARS-CoV2抗体预期有效阻断SARS-CoV2进入到宿主细胞中，由此抑制宿主如人类受试者的SARS-CoV2感染。
因此，在一些方面，本公开提供了一种结合S1蛋白的分离的抗体，其中所述抗体与和参考抗体相同的表位结合，或者与所述参考抗体竞争与S1结合。所述参考抗体可以是2020EP53-D06、2020EP54-H01、2020EP54-E12、2020EP54-B12、2020EP54-B02、2020EP54-E10、2020EP60-F05、2020EP60-A12、2020EP61-A08、2020EP61-C12、2020EP64-G10、2020EP66-D03、2020EP64-C08、2020EP66-A07、2020EP71-E04或2020EP75-E02。
在一些实施例中，所述抗S1抗体可以包括：(a)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，其中所述HC CDR1、所述HC CDR2和所述HC CDR3共同与本文所公开的抗体的重链CDR至少80％相同；和/或(b)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，所述LC CDR1、所述LC CDR2和所述LC CDR3共同与本文所公开的抗体的轻链CDR至少80％相同。
在一些实施例中，与所述参考抗体的HC CDR相比，本文所公开的抗S1抗体可以共同含有不超过8个氨基酸残基变异；和/或其中与所述参考抗体的LC CDR相比，所述抗体的LC CDR共同含有不超过8个氨基酸残基变异。
在一些实施例中，本文所公开的抗S1抗体可以包括与所述参考抗体的VH至少85％相同的VH，和/或与所述参考抗体的VL至少85％相同的VL。所述分离的抗体对S1的结合亲和力可以小于10mM。在一些实例中，所述抗S1抗体可以包括与所述参考抗体相同的重链互补决定区(HC CDR)和与所述参考抗体相同的轻链互补决定区(LC CDR)。在具体实例中，所述抗S1抗体可以包括与所述参考抗体相同的VH和与所述参考抗体相同的VL。
本文所公开的任何抗S1抗体可以是人抗体或人源化抗体。所述抗体可以是全长抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，所述抗体可以是全长抗体，所述全长抗体可以是IgG1分子。可替代地，所述抗体可以是单链抗体(scFv)。
另一方面，本公开提供了一种核酸或一组核酸，其共同编码本文所公开的任何抗S1抗体。在一些实施例中，所述核酸或所述一组核酸可以是载体或一组载体，例如表达载体。本文还提供了宿主细胞以及药物组合物，所述宿主细胞包括本文所公开的核酸或一组核酸中的任何核酸，所述药物组合物包括本文所公开的任何抗S1抗体、编码核酸或一组核酸中的任何核酸、或包括所述核酸或所述一组核酸中的任何核酸的宿主细胞以及药学上可接受的载体。
在又另一方面，本公开提供了一种治疗或抑制受试者的冠状病毒感染的方法。所述受试者可能需要此类治疗、预防或抑制。所述冠状病毒可以是严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)或中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)。所述受试者可以患有、可以疑似患有或可以有风险患有与冠状病毒感染相关的疾病。所述疾病可以是COVID-19、SARS或MERS。在特定方面，所述冠状病毒可以是SARS-CoV-2。在一个实例中，所述疾病可以是COVID-19。所述受试者可以是人类患者。
所述方法可以包括向所述有需要的受试者施用有效量的本文所公开的任何抗S1抗体、编码核酸或包括它们的药物组合物。如本文所公开的用于治疗由冠状病毒引起的疾病的药物组合物，如本文所描述的那些，以及本文所公开的任何抗S1抗体在制造用于治疗如本文也公开的任何靶疾病的药物中的用途也在本公开的范围内。
进一步地，本公开提供了一种检测SARS-CoV-2的存在的方法，所述方法包括：(i)使根据权利要求1至12中任一项所述的抗体与疑似含有SARS-CoV-2的S1亚基或包括RBD结构域的片段的样品接触；以及(ii)检测所述抗体与RBD和/或S1的结合。所述抗体可以与可检测标记缀合。在一些实施例中，接触步骤可以通过向受试者施用抗体来进行。在其它实施例中，所述样品可以是从受试者(例如，疑似患有冠状病毒感染，如SARS-CoV2感染的人类患者)获得的生物样品，例如血液样品。
本公开还提供了产生与S1(包含RBD)结合的抗体的方法，所述方法包括：(i)在允许结合所述RBD和/或所述S1的所述抗体表达的条件下培养本文所公开的宿主细胞；以及(ii)从细胞培养物中采集如此产生的所述抗体。
本公开还包含用于抑制或治疗冠状病毒感染或与冠状病毒感染相关的疾病或病状的药物组合物，所述组合物包括任何抗SARS-CoV2抗体或其编码核酸以及药学上可接受的载体，以及此类抗体或编码核酸用于制造用于抑制冠状病毒感染和/或治疗与冠状病毒感染相关的疾病或病状的药物中的用途。
在以下描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。本发明的其它特征或优点从以下附图和若干个实施例的详细说明以及还从所附权利要求中将变得显而易见。
附图说明
以下附图形成本说明书的一部分，并且被包含在内以进一步说明本公开的某些方面，通过参考附图与本文呈现的具体实施例的详细说明的组合可以更好地理解所述方面。
图1示出了SARS-CoV-2刺突蛋白S1的RBD的单链(scFv)结合物的单点筛选ELISA的结果。
图2A-2B示出了在ELISA测试中RBD(图2A)和S1蛋白(图2B)与ACE2的结合。
图3示出了在表达ACE2的CHO-K1细胞中S1蛋白与ACE2的结合活性。
图4示出了SDS-PAGE凝胶，表明经纯化的抗S1抗体的纯度。
图5A-5B示出了抗S1 scFv与RBD(图5A)或S1(图5B)的结合。
图6A-6B示出了2020EP054-E10分别与RBD(图6A)和S1蛋白(图6B)结合的传感器图实例。
图7A-7B示出了抗S1 scFv使用ELISA阻断0.2nM RBD(图7A)或2nM S1(图7B)与ACE2结合的中和活性。
图8示出了如通过FACS测量的抗S1 scFv在阻断CHO-K1细胞中18nM S1与ACE2结合中的中和活性。
图9A-9D示出了使用ELISA进行IgG1抗体与RBD(图9A和C)和S1(图8B和D)的结合。
图10A-10B示出了SPR中分别针对RBD(图10A)和S1(图10B)蛋白的IgG抗体(2020EP54-E10 IgG)的传感器图的实例。
图11示出了ELISA中IgG抗体与S蛋白的结合活性。
图12A-12B示出了使用ELISA进行IgG1抗体与SARS-COV的RBD(图12A)和S1(图12B)的结合。
图13A-13H示出了分别与SARS-COV-2和SARS-COV的RBD和S1蛋白结合的2020EP054-E10(图13A-D)和2020EP054-B12(图13E-H)的SPR传感器图实例。
图14示出了在ELISA中S1蛋白与ACE2结合的IgG抗体中和的实例。
图15示出了在FACS测定中S1蛋白与人ACE2/CHOK1细胞结合的IgG抗体中和的实例。
具体实施方式
本文提供了能够与SARS-CoV-2刺突蛋白S的S1亚基结合的抗体(“抗S1抗体”)。在一些实例中，抗S1抗体更具体地与S1的受体结合结构域(“RBD”)结合(“抗RBD抗体”)。术语“抗S1抗体”包含抗RBD抗体。本文所公开的抗S1抗体显示出对S1的高结合亲和力，并且在一些实例中，对RBD的高结合亲和力。在一些实施例中，抗S1抗体阻断了S1并且在一些情况下的RBD结合ACE2的能力。抗S1抗体也可以抑制SARS-CoV-2病毒与ACE2结合的能力，由此抑制病毒感染细胞的能力。在一些实例中，本文所描述的抗S1抗体可以不与RBD结合，但仍然能够通过变构机制中和病毒感染。此类抗体与直接与RBD结合的其它抗体组合时可以显示出协同效应，这对于参与宿主细胞可能是重要的。
S1是如本文所公开的SARS-CoV-2刺突蛋白S的亚基。S1多肽是本领域已知的。S1的RBD也是本领域已知的。在一个实例中，RBD的序列可以包含S蛋白的氨基酸328-533。
SARS-CoV-2的刺突蛋白被认为是病毒感染细胞的能力所必需的，具体地是通过与ACE2结合。因此，本文所公开的抗S1抗体可以用作治疗剂，用于治疗与SARS-CoV-2相关的疾病，例如COVID-19。另外，本文所公开的抗S1抗体可以用作用于检测SARS-CoV-2，例如SARS-CoV-2阳性细胞的存在的诊断剂。本文所公开的抗体也可以用于研究目的。
I.与S1和其RBD结合的抗体
本公开提供了与SARS-CoV-2刺突蛋白S的S1亚基结合的抗体。在一些实施例中，本文所公开的抗S1抗体能够与RBD结合。因此，本文所公开的抗体可以用于预防、治疗或诊断SARS-CoV-2感染或COVID-19的治疗或诊断目的。如本文所用，术语“抗S1抗体”是指能够与包含RBD多肽的S1多肽结合的任何抗体。抗S1抗体可以结合定位于RBD的表位，或者可以结合定位于RBD的外部的表位。
抗体(可互换地以复数形式使用)是能够通过位于免疫球蛋白分子的可变区的至少一个抗原识别位点来特异性结合靶标(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，术语“抗体”，例如抗S1抗体，包含抗RBD抗体，不仅涵盖完整(例如，全长)多克隆抗体或单克隆抗体，而且涵盖其抗原结合片段(如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链抗体(scFv)、包括抗体部分的融合蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、双功能抗体、单结构域抗体(例如，纳米抗体)、单结构域抗体(例如，仅VH抗体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)以及包括所需特异性的抗原识别位点的免疫球蛋白分子的任何其它经修饰构型，所述经修饰构型包含抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和经共价修饰的抗体。抗体，例如抗半乳凝素-9抗体，包含任何类的抗体，如IgD、IgE、IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定类。根据其重链恒定结构域的抗体氨基酸序列，可以将免疫球蛋白分派为不同类。存在五个主要类别的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类中的几类可以进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
典型的抗体分子包括重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，它们通常参与抗原结合。VH和VL区可以进一步细分为高变区，也称为“互补决定区”(“CDR”)，其散布有更保守的被称为“框架区”(“FR”)的区。每个VH和VL通常由按以下顺序从氨基端到羧基端布置的三个CDR和四个FR构成：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。框架区和CDR的范围可以使用本领域已知的方法，例如通过Kabat定义、Chothia定义、AbM定义和/或接触定义来精确地鉴定，所有所述定义均是本领域熟知的。参见例如，Kabat,E.A.等人,(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)》,第五版,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),NIH公开号91-3242；Chothia等人,(1989)《自然(Nature)》342:877；Chothia,C.等人(1987)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》196:901-917；Al-lazikani等人(1997)《分子生物学杂志》273:927-948；以及Almagro,《分子识别杂志(J.Mol.Recognit.)》17:132-143(2004)。还参见hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/abs。
本文所描述的抗S1抗体可以是全长抗体，其含有两条重链和两条轻链，每条重链和轻链包含可变结构域和恒定结构域。可替代地，抗S1抗体可以是全长抗体的抗原结合片段。涵盖在术语全长抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包含(i)Fab片段—由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段—包含在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,(1989)《自然》341:544-546)；以及(vi)保留功能的分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是这两个结构域可以使用重组方法通过使这两个结构域能够成为单个蛋白链的合成连接子来连接，在所述单个蛋白链中，VL区和VH区配对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv))。参见例如，Bird等人(1988)《科学(Science)》242:423-426；和Huston等人(1988)《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》85:5879-5883。
本文所描述的抗体可以具有合适的来源，例如鼠、大鼠或人。此类抗体是非天然存在的，即在没有人类行为(例如，用所期望的抗原或其片段免疫此类动物或从抗体文库中分离)的情况下将不会在动物中产生。本文所描述的抗体中的任何抗体，例如抗S1抗体，可以是单克隆的或多克隆的。“单克隆抗体”是指同质抗体群，并且“多克隆抗体”是指异质抗体群。这两个术语并不限制抗体的来源或制备抗体的方式。
在一些实施例中，抗S1抗体是人抗体，其可以从人抗体文库中分离或在转基因小鼠中产生。例如，可以通过使用已经被工程化以表达特异性人免疫球蛋白的可商购获得的小鼠来获得完全人抗体。被设计成产生更期望的(例如，完全人抗体)或更稳健的免疫应答的转基因动物也可以用于生成人源化抗体或人抗体。此类技术的实例来自安进公司(Amgen,Inc.)(加利福尼亚州菲蒙市(Fremont,Calif.))的XenomouseTM和来自Medarex公司(新泽西州普林斯顿(Princeton,N.J.))的HuMAb-MouseTM和TC MouseTM。在另一个替代性方案中，可以通过噬菌体展示或酵母技术重组地制备抗体。参见例如美国专利第5,565,332号；第5,580,717号；第5,733,743号；和第6,265,150号；以及Winter等人,(1994)《免疫学年度评论(Annu.Rev.Immunol.)》12:433-455。可替代地，抗体文库展示技术，如本领域已知的噬菌体、酵母展示、哺乳动物细胞展示或mRNA展示技术，可以用于在体外从来自未经免疫的供体的免疫球蛋白可变(V)结构域基因组库产生人抗体和抗体片段。
在其它实施例中，抗S1抗体可以是人源化抗体或嵌合抗体。人源化抗体是指为特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列的抗原结合片段的非人(例如，鼠)抗体的形式。通常，人源化抗体是来自接受者的CDR的残基被来自如小鼠、大鼠或兔等具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)的CDR的残基替代的人免疫球蛋白(接受者抗体)。在一些情况下，一个或多个人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包括既未在受体抗体中发现也未在导入的CDR或框架序列中发现但被包含在内以进一步精化和优化抗体性能的残基。在一些情况下，人源化抗体可以包括至少一个并且通常两个可变结构域中的基本上所有可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些区，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的那些区。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区或结构域(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区或结构域的至少一部分。抗体可以具有如WO 99/58572所描述的修饰的Fc区。其它形式的人源化抗体具有关于原始抗体改变的一个或多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，也称为“源自”来自原始抗体的一个或多个CDR的一个或多个CDR。人源化抗体还可以涉及亲和力成熟。用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如，Queen等人,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,86:10029-10033(1989)。
在一些实施例中，本文所公开的抗S1抗体可以是嵌合抗体。嵌合抗体是指具有来自第一物种的可变区或可变区的一部分和来自第二物种的恒定区的抗体。典型地，在这些嵌合抗体中，轻链和重链的可变区均模仿衍生自哺乳动物(例如，如小鼠、兔和大鼠等非人哺乳动物)中的一个物种的抗体的可变区，而恒定部分与衍生自如人等另一种哺乳动物的抗体中的序列同源。在一些实施例中，可以在可变区和/或恒定区中进行氨基酸修饰。为生产“嵌合抗体”而开发的技术是本领域所熟知的。参见例如，Morrison等人(1984)《美国国家科学院院刊》81,6851；Neuberger等人(1984)《自然》312,604；以及Takeda等人(1984)《自然》314:452。
在一些实施例中，本文所描述的抗S1抗体与对应的靶蛋白(例如S1或RBD)或其表位特异性结合。与蛋白质或表位“特异性结合”的抗体是本领域熟知的术语。如果分子与特定靶蛋白比其与替代性靶标更频繁地、更快速地、持续时间更长地和/或亲和力更大地反应，则所述分子被称为表现出“特异性结合”。如果抗体比其与其它物质亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合，则所述抗体与靶蛋白或表位“特异性结合”。例如，与蛋白质或其中的抗原表位特异性(或优先地)结合的抗体是这样的抗体：所述抗体与这种靶蛋白比其与其它蛋白质或同一抗原中的其它表位亲和力更大地、亲合力更高地、更容易地和/或持续时间更长地结合。利用这个定义还应理解，例如，与第一靶蛋白特异性结合的抗体可以或可以不与第二靶蛋白特异性结合或优先地结合。如此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管其可以包含)排他的结合。在一些实例中，与靶蛋白或其表位“特异性结合”的抗体可以不与其它蛋白或同一抗原中的其它表位结合(即，在常规方法中仅可以检测基线结合活性)。
在一些实施例中，本文所描述的抗S1抗体对靶蛋白(例如，S1或RBD)或其抗原表位具有合适的结合亲和力。如本文所用，“结合亲和力”是指表观缔合常数或KA。KA是解离常数(KD)的倒数。本文所描述的抗S1抗体对S1或RBD的结合亲和力(KD)可以为至少100nM、10nM、1nM、0.1nM或更低。增加的结合亲和力对应于减小的KD。抗体相对于第二抗原对第一抗原的更高亲和力结合可以通过比用于结合第二抗原的KA(或数值KD)更高的用于结合第一抗原的KA(或更小的数值KD)来指示。在此类情况下，所述抗体相对于第二抗原(例如，第二构象或其模拟物中的相同的第一蛋白质；或第二蛋白质)对第一抗原(例如，第一构象或其模拟物中的第一蛋白质)具有特异性。结合亲和力的差异(例如，对于特异性或其它比较)可以为至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、37.5倍、50倍、70倍、80倍、90倍、100倍、500倍、1000倍、10,000倍或105倍。在一些实施例中，任何抗S1抗体可以进一步亲和力成熟以增加抗体对靶抗原或其抗原表位的结合亲和力。
可以通过各种方法来确定结合亲和力(或结合特异性)，包含平衡透析、平衡结合、凝胶过滤、ELISA、表面等离子共振或光谱学(例如，使用荧光测定)。用于评估结合亲和力的示例性条件为处于HBS-P缓冲液(10mM HEPES pH7.4，150mM NaCl，0.005％(v/v)表面活性剂P20)中。这些技术可以用于根据靶蛋白浓度测量结合的结合蛋白的浓度。结合的结合蛋白的浓度([结合(Bound)])通常通过以下等式与游离靶蛋白([游离(Free)])的浓度相关：
[结合]＝[游离]/(Kd+[游离])
然而，并不总是需要对KA进行精确测定，因为有时例如通过功能性测定，例如体外或体内测定中的活性足以获得对亲和力的定量测量、获得对亲和力的定性测量或者获得对亲和力的推断，所述亲和力例如是使用如ELISA或FACS分析等方法确定的、与KA成正比并且因此可以用于比较，如确定更高的亲和力是否例如高2倍。
在一些实施例中，本文所公开的抗S1抗体对于与S1或RBD结合具有低于10nM的EC50值，例如<1nM、<0.5nM或低于0.1nM。如本文所用，EC50值是指与结合测定中提供的50％的S1或RBD结合所需的抗体的最小浓度。IC50也可以指阻断50％的S1或RBD与表达人ACE2的细胞群体结合所需的抗体浓度。EC50值可以使用常规测定和/或本文所公开的测定来确定。参见例如，下文实例。
下文提供了多个示例性抗S1抗体(以粗体指示的CDR是通过Chothia方法确定的(Chothia等人(1992)《分子生物学杂志》,227,776-798、Tomlinson等人(1995)《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》,14,4628-4638和Williams等人(1996)《分子生物学杂志》,264,220-232)。还参见英国剑桥大学剑桥生物医学校区(CambridgeBiomedical Campus,Cambridge,UK)MRC分子生物学实验室(LMB)的抗体的可变序列的比对工具(vbase)的网站。
“表位”是指靶抗原上被抗体识别并结合的位点。位点可以完全由氨基酸组分构成、完全由蛋白质的氨基酸的化学修饰(例如，糖基部分)构成或由其组合构成。重叠表位包含至少一个共同的氨基酸残基。表位可以是线性的，其长度通常为6-15个氨基酸。可替代地，表位可以是构象的。可以通过常规技术，例如表位作图方法(参见例如以下描述)来确定抗体与其结合的表位。和本文所描述的示例性抗体与同一表位结合的抗体可以和示例性抗体与同一表位或基本上重叠的表位(例如，含有少于3个非重叠氨基酸残基、少于2个非重叠氨基酸残基或仅1个非重叠氨基酸残基)完全结合。可以通过本领域熟知的竞争测定来确定两种抗体是否彼此竞争与同源抗原结合。
在一些实例中，抗S1抗体包括与本文所描述的示例性抗体相同的VH和/或VL CDR。两种抗体具有相同的VH和/或VL CDR意味着当通过相同的方法(例如，本领域已知的Kabat方法、Chothia方法、AbM方法、接触方法或IMGT方法)确定时，它们的CDR是相同的。参见例如，bioinf.org.uk/abs/。与本文所描述的示例性抗体相比，此类抗S1抗体可以具有相同的VH、相同的VL或两者。
如本文所公开的示例性抗S1抗体中的任何一种的功能变体也在本公开的范围内。此类功能变体在结构和功能两者上基本上类似于示例性抗体。功能变体包括与示例性抗体基本上相同的VH和VL CDR。例如，其可以在抗体的总CDR区中仅包括至多8个(例如，8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸残基变异，并且以基本上类似的亲和力与相同蛋白质(例如，具有相同顺序的KD值)结合。在一些情况下，功能变体可以具有与示例性抗体相同的重链CDR3，并且任选地具有与示例性抗体相同的轻链CDR3。可替代地或另外地，功能变体可以具有与示例性抗体相同的重链CDR2。与示例性抗体的VH相比，此类抗S1抗体可以包括仅在重链CDR1中具有CDR氨基酸残基变异的VH片段。在一些实例中，抗S1抗体可以进一步包括与示例性抗体具有相同VL CDR3的VL片段，以及任选地相同的VL CDR1或VL CDR2。
可替代地或另外，氨基酸残基变异可以是保守氨基酸残基取代。如本文所用，“保守氨基酸取代”是指不改变进行氨基酸取代的蛋白质的相对电荷或大小特性的氨基酸取代。可以根据用于改变本领域的普通技术人员已知的多肽序列的方法来制备变体，所述方法如编制这种方法的参考文献中发现的，所述参考文献例如，《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)》,J.Sambrook等人编辑,第二版,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York),1989或《当代分子生物学实验指南(Current Protocols in MolecularBiology)》,F.M.Ausubel等人编辑,纽约的约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.,New York)。氨基酸的保守取代包含在以下组中的氨基酸之间进行的取代：(a)M、I、L、V；(b)F、Y、W；(c)K、R、H；(d)A、G；(e)S、T；(f)Q、N；以及(g)E、D。
在一些实施例中，与本文所描述的示例性抗体的VH CDR相比，抗S1抗体可以包括单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的重链CDR。可替代地或另外地，与作为本文所描述的示例性抗体的VL CDR相比，抗S1抗体可以包括单独或共同具有至少80％(例如，85％、90％、95％或98％)序列同一性的轻链CDR。如本文所用，“单独地”意指相对于示例性抗体的对应CDR，抗体的一个CDR共享所指示的序列同一性。“共同地”意指组合的抗体的三个VH或VL CDR相对于组合的示例性抗体的对应三个VH或VL CDR共享所指示的序列同一性。
使用Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)》,87:2264-68,1990的算法来确定两个氨基酸序列的“一致性百分比”，所述算法如Karlin和Altschul,《美国国家科学院院刊》,90:5873-77,1993中那样进行修改。将此类算法并入Altschul等人,《分子生物学杂志》215:403-10,1990的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。可以用XBLAST程序(分值＝50，字长＝3)来执行BLAST蛋白质检索以获得与所关注蛋白质分子同源的氨基酸序列。在两个序列之间存在空位的情况下，可以利用如Altschul等人,《核酸研究(Nucleic Acids Res.)》25(17):3389-3402,1997中描述的带空位的BLAST(GappedBLAST)。当利用BLAST程序和带空位的BLAST程序时，可以使用相应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
在一些实施例中，本文所描述的任何抗S1抗体的重链可以进一步包括重链恒定区(CH)或其一部分(例如，CH1、CH2、CH3或其组合)。重链恒定区可以具有任何合适的来源，例如人、小鼠、大鼠或兔。可替代地或另外地，抗S1抗体的轻链可以进一步包括轻链恒定区(CL)，其可以是本领域已知的任何CL。在一些实例中，CL是κ轻链。在其它实例中，CL是λ轻链。抗体重链和轻链恒定区是本领域熟知的，例如，在伦敦大学学院生物信息学与计算生物学组网站；vbase2网站或international ImMunoGeneTics information/>网站上描述的抗体规则中提供的那些，所述网站中的两个网站均通过引用并入本文。
在一些实施例中，本文所公开的抗S1抗体可以是单链抗体(scFv)。scFv抗体可以包括VH片段和VL片段，所述片段可以通过柔性肽连接子连接。在一些情况下，scFv抗体可以处于VH→VL朝向(N端至C端)。在其它情况下，scFv抗体可以处于VL→VH朝向(N端至C端)。示例性scFv抗S1抗体提供如下(VH-VL朝向；黑体的CDR和下划线的肽连接子)：
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本文所描述的任何抗S1抗体，例如本文所提供的示例性抗S1抗体，可以结合并抑制(例如，降低或消除)SARS-CoV-2与细胞结合或感染细胞，具体地是表达ACE2的细胞的能力。在一些实施例中，如本文所描述的抗S1抗体可以结合并抑制SARS-CoV-2感染细胞的能力至少30％(例如，35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更高，包含其中的任何增量)。本文所描述的抗S1抗体的抑制活性可以通过本领域已知的常规方法，例如通过用于测量Ki,app值的测定来确定。
在一些实例中，抗体的Ki,app值可以通过测量不同浓度的抗体对相关反应程度的抑制作用来确定；将作为抑制剂浓度的函数的伪一阶速率常数(v)的变化拟合到修正的莫里森等式(Morrison equation)(等式1)得到表观Ki值的估计值。对于竞争性抑制剂，可以根据从Ki,app与底物浓度的绘图的线性回归分析中提取的y截距获得Kiapp。
其中A等于vo/E，在抑制剂(I)不存在的情况下酶反应的初始速度(vo)除以总酶浓度(E)。在一些实施例中，本文所描述的抗S1抗体对于靶抗原或抗原表位的Kiapp值可以为1000、500、100、50、40、30、20、10、5pM或更小。
II.抗S1抗体的制备
可以通过本领域已知的任何方法来制备如本文所描述的能够结合S1或RBD的抗体。参见例如，Harlow和Lane,(1998),《抗体：实验室手册(Antibodies:A LaboratoryManual)》,纽约的冷泉港实验室。在一些实施例中，抗体可以通过常规杂交瘤技术产生。可替代地，可以从合适的文库(例如，人抗体文库)中鉴定抗S1抗体。
在一些情况下，按照实例1中展示的筛选策略，可以从人抗体文库中获得高亲和力的完全人S1或RBD结合物。这种策略允许最大化文库多样性以覆盖S1或RBD。
在需要时，可以对关注(例如，由杂交瘤细胞系产生或从抗体文库中分离)的抗体(单克隆或多克隆抗体)进行测序，并且然后可以将多核苷酸序列克隆到载体中以供表达或传播。可以在载体中将对所关注抗体进行编码的序列维持在宿主细胞中并且然后可以使宿主细胞扩增并冷冻以供将来使用。在替代性方案中，多核苷酸序列可以用于基因操纵以例如使抗体人源化或改善亲和力(亲和力成熟)或抗体的其它特性。例如，如果抗体来自非人类来源并且将用于人类的临床试验和治疗，则可以将恒定区工程化成更类似于人恒定区以避免免疫应答。可替代地或另外地，可以期望对抗体序列进行遗传操纵以获得对靶抗原更大的亲和力和/或特异性以及在阻断S1与ACE2结合方面更大的功效。对本领域技术人员而言将显而易见的是，可以对抗体进行一种或多种多核苷酸改变并且在所述改变下仍维持其对靶抗原的结合特异性。
可替代地，可以通过常规实践从合适的抗体文库中分离出能够与如本文所描述的靶抗原(S1或RBD分子)结合的抗体。抗体文库可以用于通过常规筛选过程鉴定与靶抗原(RBD和/或S1)结合的蛋白质。在选择过程中，用靶抗原或其片段探测多肽组分，并且如果多肽组分与靶标结合，通常通过保留在载体上来鉴定抗体文库成员。保留的展示文库成员从载体中回收并进行分析。所述分析可以包含扩增和随后在相似或不相似条件下的选择。例如，正选择和负选择可以交替。所述分析还可以包含确定多肽组分的氨基酸序列和多肽组分的纯化，用于详细的表征。
存在本领域已知的用于鉴定和分离能够与本文所描述的靶抗原结合的抗体的多种常规方法，包含噬菌体展示、酵母展示、核糖体展示或哺乳动物展示技术。
可以经由常规方法制备完整抗体(全长抗体)的抗原结合片段。例如，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子来产生F(ab')2片段，并且可以通过使F(ab')2片段的二硫桥键还原来生成Fab片段。
可以通过例如常规重组技术来产生如人源化抗体、嵌合抗体、单链抗体和双特异性抗体等基因工程化抗体。在一个实例中，使用常规程序(例如，通过使用能够与对单克隆抗体的重链和轻链进行编码的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)可以容易地分离和测序编码对靶抗原具有特异性的单克隆抗体的DNA。一经分离，可以将DNA放置于一个或多个表达载体中，然后将所述表达载体转染到如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不以其它方式产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞等宿主细胞中，以获得重组宿主细胞中单克隆抗体的合成。参见例如，PCT公开第WO 87/04462号。然后可以例如通过用编码序列取代代替同源鼠类序列的人重链和轻链恒定结构域(Morrison等人,(1984)《美国国家科学院院刊》81:6851)或者通过使非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或一部分与免疫球蛋白编码序列共价连接来对DNA进行修饰。以所述方式，可以制备具有靶抗原的结合特异性的经基因工程化的抗体，如“嵌合”抗体或“杂合”抗体。
为生产“嵌合抗体”而开发的技术是本领域所熟知的。参见例如，Morrison等人(1984)《美国国家科学院院刊》81,6851；Neuberger等人(1984)《自然》312,604；以及Takeda等人(1984)《自然》314:452。
用于构建人源化抗体的方法也是本领域熟知的。参见例如，Queen等人,《美国国家科学院院刊》,86:10029-10033(1989)。在一个实例中，按照本领域已知的方法对亲本非人抗体的VH和VL可变区进行三维分子建模分析。接下来，使用相同的分子建模分析来鉴定被预测对形成正确CDR结构具有重要性的框架氨基酸残基。平行地，使用亲本VH和VL序列作为搜索查询来从任何抗体基因数据库中鉴别具有与亲本非人抗体的氨基酸序列同源的氨基酸序列的人VH链和人VL链。然后选择人VH受体基因和人VL受体基因。
可以用来自亲本非人抗体或其功能变体的CDR区替代所选人受体基因内的CDR区。在必要时，可以使用在亲本链的框架区内被预测在与CDR区相互作用时具有重要性的残基(参见以上描述)来取代人受体基因中的对应残基。
可以通过连接编码重链可变区的核苷酸序列和编码轻链可变区的核苷酸序列来通过重组技术制备单链抗体。优选地，在两个可变区之间并入柔性连接子。可替代地，所描述的用于产生单链抗体的技术(美国专利第4,946,778号和第4,704,692号)可以适用于产生噬菌体展示、酵母展示、哺乳动物细胞展示或mRNA展示scFv文库并且可以按照常规程序从所述文库中鉴别对S1具有特异性的scFv克隆体。可以对阳性克隆进行进一步筛选，以鉴定那些阻断S1与ACE2结合的能力的克隆。
可以使用本领域所熟知的方法来对按照本领域所熟知的方法获得的和本文所描述的抗体进行表征。例如，一种方法是鉴别与抗原结合的表位或“表位作图。”存在多种本领域已知的用于映射和表征蛋白质上的表位位置的方法，所述方法包含解决抗体-抗原络合物的晶体结构、竞争测定、基因片段表达测定和基于合成肽的测定，如例如在以下文献的第11章中所描述的：Harlow和Lane,“使用抗体(Using Antibodies)”,《实验室手册》,纽约冷泉港的冷泉港实验室出版社(Spring Harbor Laboratory Press),1999。在另外一个实例中，表位作图可以用于确定与抗体结合的序列。表位可以是线性表位(即，含在单个氨基酸区段中)或由不一定含在单个区段中的氨基酸的三维相互作用形成的构象表位(一级结构线性序列)。可以对不同长度(例如，至少4-6个氨基酸长)的肽进行分离或合成(例如，重组)并且用于与抗体的结合测定。在另一个实例中，可以通过使用衍生自靶抗原序列的重叠肽并确定抗体的结合来在全身筛选中确定与抗体结合的表位。根据基因片段表达测定，随机地或通过特异性遗传构建体使编码靶抗原的开放阅读框片段化并且确定抗原的表达片段与待测试抗体的反应性。例如，基因片段可以通过PCR产生并且然后在存在放射性氨基酸的情况下在体外转录并翻译成蛋白质。然后通过免疫沉淀和凝胶电泳来确定抗体与放射性标记的抗原片段的结合。也可以通过使用在噬菌体颗粒表面展示的随机肽序列的大型文库(噬菌体文库)来鉴别某些表位。
可替代地，可以在简单的结合测定中测试重叠肽片段的限定文库与测试抗体的结合。在另外一个实例中，可以执行抗原结合结构域的诱变、结构域交换实验和丙氨酸扫描诱变以鉴别表位结合所需的、足够的和/或必需的残基。例如，可以使用靶抗原的突变体执行结构域交换实验，其中S1的各种片段已经被来自密切相关但抗原性不同的蛋白质的序列替代(交换)。通过评估抗体与突变的S1的结合，可以评估特定抗原片段对抗体结合的重要性。
可替代地，可以使用已知的与相同抗原结合的其它抗体来执行竞争测定以确定抗体是否结合了与其它抗体相同的表位。竞争测定是本领域技术人员所熟知的。
在一些实例中，通过重组技术制备抗S1抗体，如下所例示。
可以将对如本文所描述的抗S1抗体的重链和轻链进行编码的核酸克隆到一个表达载体中，每个核苷酸序列与适合的启动子可操作地连接。在一个实例中，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列中的每个核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。可替代地，对重链和轻链进行编码的核苷酸序列可以与单个启动子可操作地连接，使得重链和轻链两者均从同一启动子表达。在必要时，可以在对重链和轻链进行编码的序列之间插入内部核糖体进入位点(IRES)。
在一些实例中，将对抗体的两条链进行编码的核苷酸序列克隆到两个载体中，所述载体可以被引入到相同或不同的细胞中。当在不同的细胞中表达这两条链时，其中的每条链均可以从表达这种链的宿主细胞中分离，并且分离的重链和轻链可以混合并在允许形成抗体的合适条件下温育。
通常，可以使用本领域已知的方法将对抗体的一条或所有链进行编码的核酸序列克隆到合适的表达载体中、与合适的启动子可操作地连接。例如，可以在合适条件下使核苷酸序列和载体与限制酶相接触，以在每个分子上产生可以彼此配对并且用连接酶连接在一起的互补端。可替代地，可以将合成核酸连接子与基因的末端连接。这些合成连接子含有对应于载体中的特定限制性位点的核酸序列。表达载体/启动子的选择将取决于用于产生抗体的宿主细胞的类型。
可以使用各种启动子来表达本文所描述的抗体，所述启动子包含但不限于巨细胞病毒(CMV)中间早期启动子、如劳斯肉瘤(Rous sarcoma)病毒LTR、HIV-LTR、HTLV-1LTR等病毒LTR、猿猴病毒40(SV40)早期启动子、大肠杆菌(E.coli)lac UV5启动子和单纯性疱疹tk病毒启动子。
还可以使用可调节的启动子。这些可调节的启动子包含使用来自大肠杆菌的阻遏物作为转录调制剂对携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子的转录进行调节的那些启动子[Brown,M.等人,《细胞(Cell)》,49:603-612(1987)]、使用四环素阻遏物(tetR)的那些启动子[Gossen,M.和Bujard,H.,《美国国家科学院院刊》89:5547-5551(1992)；Yao,F等人,《人类基因疗法(Human Gene Therapy)》,9:1939-1950(1998)；Shockelt,P.等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995)]。其它系统包含FK506二聚体、使用雄二醇(astradiol)的VP16或p65、RU486、二元酚murislerone(diphenol murislerone)或雷帕霉素(rapamycin)。诱导型系统可从英杰公司(Invitrogen)、克隆技术公司(Clontech)和阿瑞雅德公司(Ariad)获得。
可以使用包含具有操纵子的阻遏物的可调节启动子。在一个实施例中，来自大肠杆菌的lac阻遏物可以充当转录调节剂来调节来自携带lac操纵子的哺乳动物细胞启动子的转录[M.Brown等人,《细胞》,49:603-612(1987)；Gossen和Bujard(1992)；M.Gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)]，所述携带有lac操纵基因的哺乳动物细胞启动子将四环素阻遏物(tetR)与转录激活子(VP 16)组合，以产生tetR-哺乳动物细胞转录激活子融合蛋白tTa(tetR-VP 16)，携带有tetO的哺乳动物启动子衍生自人巨细胞病毒(hCMV)主要立即早期启动子以用于产生tetR-tet操纵基因系统来控制哺乳动物细胞中的基因表达。在一个实施例中，使用四环素诱导型开关。当四环素操纵基因适当地定位在CMVIE启动子的TATA元件下游时，四环素阻遏物(tetR)而非tetR-哺乳动物细胞转录因子融合衍生物可以单独用作强效反式调节剂来调节哺乳动物细胞中的基因表达(Yao等人,《人类基因疗法》,10(16):1392-1399(2003))。这个四环素诱导型开关的一个特别的优点是其不需要使用四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白来实现其可调节作用，在一些情况下，所述四环素阻遏物-哺乳动物细胞反式激活子或阻遏物融合蛋白可能对细胞有毒(Gossen等人,《美国国家科学院院刊》,89:5547-5551(1992)；Shockett等人,《美国国家科学院院刊》,92:6522-6526(1995))。
另外，载体可以含有例如，以下中的一些或全部：可选择标志物基因，如用于在哺乳动物细胞中选择稳定或瞬时转染子的新霉素基因；用于高水平转录的来自人CMV的立即早期基因的增强子/启动子序列；用于mRNA稳定性的来自SV40的转录终止和RNA加工信号；用于适当的附加型复制的SV40多瘤复制起点和ColE1；内部核糖体结合位点(IRES)；通用多克隆位点；以及用于正义和反义RNA的体外转录的T7和SP6 RNA启动子。用于产生含有转基因的载体的合适的载体和方法是本领域熟知并且可获得的。
可用于实践本文所描述的方法的聚腺苷酸化信号的实例包含但不限于人胶原蛋白I聚腺苷酸化信号、人胶原蛋白II聚腺苷酸化信号和SV40聚腺苷酸化信号。
可以将包括对抗体中的任何抗体进行编码的核酸的一个或多个载体(例如，表达载体)引入到合适的宿主细胞中以用于产生抗体。可以在合适的条件下培养宿主细胞以用于表达抗体或其任何多肽链。可以通过常规方法，例如亲和力纯化通过培养的细胞(例如，来自细胞或培养上清液)来回收这种抗体或其多肽链。如果有必要，可以在合适的条件下在允许产生抗体的合适时间段内温育抗体的多肽链。
在一些实施例中，用于制备也如本文所描述的抗S1抗体的方法涉及对如本文所述的抗体的重链和轻链进行编码的重组表达载体。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将重组表达载体引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可以选择并在允许表达形成抗体的这两条多肽链的合适条件下培养阳性转化体宿主细胞，这两条多肽链可以从细胞或从培养基中回收。在必要时，可以在允许形成抗体的合适条件下培育从宿主细胞中回收的这两条链。
在一个实例中，提供了两种重组表达载体，一种重组表达载体编码抗S1抗体的重链并且另一种重组表达载体编码抗S1抗体的轻链。可以通过常规方法，例如磷酸钙介导的转染将这两种重组表达载体都引入到合适的宿主细胞(例如，dhfr-CHO细胞)中。可替代地，可以将表达载体中的每种表达载体均引入到合适的宿主细胞中。可以选择并在允许表达抗体的多肽链的合适条件下培养阳性转化体。在将这两种表达载体引入到相同的宿主细胞中时，可以从宿主细胞或从培养基中回收其中产生的抗体。如果有必要，可以从宿主细胞或从培养基中回收多肽链，并且然后在允许形成抗体的合适条件下温育多肽链。当将这两种表达载体引入到不同的宿主细胞中时，所述两种表达载体中的每种表达载体可以从对应的宿主细胞或从对应的培养基中回收。然后可以在合适的条件下温育这两条多肽链以用于形成抗体。
使用标准分子生物学技术来制备重组表达载体、转染宿主细胞、选择转化体、培养宿主细胞以及从培养基中回收抗体。例如，可以用蛋白质A或蛋白质G偶联基质通过亲和色谱法来分离一些抗体。
编码如本文所描述的抗S1抗体的重链、轻链或两者的任何核酸，含有此类核酸的载体(例如，表达载体)；以及包括载体的宿主细胞都在本公开的范围内。
III.抗S1抗体的应用
本文所公开的任何抗S1抗体可以用于治疗、诊断和/或研究目的，所有这些都在本公开的范围内。
药物组合物
如本文所描述，抗体以及编码核酸或核酸组、包括所述核酸的载体或包括所述载体的宿主细胞可以与药学上可接受的载体(赋形剂)混合，以形成用于治疗靶疾病的药物组合物。“可接受的”意指载体必须与组合物的活性成分相容(并且优选地，能够稳定活性成分)并且对待治疗的受试者无害。药学上可接受的赋形剂(载体)包含缓冲液，所述缓冲液是本领域熟知的。参见例如，《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science andPractice of Pharmacy)》,第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯与威尔金斯公司(Lippincott Williams and Wilkins),K.E.Hoover编辑。
用于本发明方法的药物组合物可以包括冻干调配物或水溶液形式的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂。《雷明顿：药学科学与实践》,第20版,(2000),利平科特·威廉姆斯与威尔金斯公司,K.E.Hoover编辑。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包含抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲铵；苯扎氯銨；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟苯甲酸烷基酯，如对羟苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3'-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包含葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(例如，Zn蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
在一些实例中，本文所描述的药物组合物包括含有抗体(或编码核酸)的脂质体，所述脂质体可以通过本领域已知的方法制备，如以下文献中所描述的方法：Epstein等人,《美国国家科学院院刊》82:3688(1985)；Hwang等人,《美国国家科学院院刊》77:4030(1980)；以及美国专利第4,485,045号和第4,544,545号。美国专利第5,013,556号公开了具有增强的循环时间的脂质体。可以用包括磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物来通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。通过具有限定孔径的过滤器将脂质体挤出以产生具有期望直径的脂质体。
还可以将抗体或一种或多种编码核酸包埋在例如通过凝聚法技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)中、胶状药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中、或粗乳液中。这种技术是本领域已知的，参见例如，《雷明顿：药学科学与实践》第20版马克出版公司(Mack Publishing)(2000)。
在其它实例中，可以以持续释放格式调配本文所描述的药物组合物。持续释放制剂的合适的实例包含含有抗体的固体疏水性聚合物的半渗透基质，所述基质呈成型制品，例如薄膜或微胶囊的形式。持续释放基质的实例包含聚酯、水凝胶(例如，聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利第3,773,919号)、L-谷氨酸和7-乙基-L-谷氨酸盐的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球)等可降解的乳酸-乙醇酸共聚物、乙酸异丁酸蔗糖酯和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。
用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这通过例如无菌过滤膜过滤而容易地实现。通常将治疗性抗体组合物放置在具有无菌进口端的容器中，例如，具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶中。
本文所描述的药物组合物可以采用单位剂型，如片剂、丸剂、胶囊剂、粉剂、颗粒剂、溶液或悬浮液或栓剂，以用于口服、肠胃外或直肠施用或者通过吸入或吹入施用。
为了制备如片剂等固体组合物，可以将主要活性成分与药物载体例如常规压片成分(如玉米淀粉、乳糖、蔗糖、山梨醇、滑石、硬脂酸、硬脂酸镁、磷酸二钙或树胶)和如水等其它药物稀释剂混合，以形成含有本发明的化合物的均相混合物固体预调配组合物或其药学上可接受的无毒盐。在称这些预调配组合物均相时，这意味着活性成分均匀地分散在整个组合物中，使得组合物可以容易地细分成等效单位剂型，如片剂、丸剂和胶囊剂。然后将这个固体预调配组合物细分成上述类型的单位剂型，所述单位剂型含有0.1至约500mg本发明的活性成分。可以包覆或以其它方式配混新组合物的片剂或丸剂以提供给出延长作用的优点的剂型。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量组分和外剂量组分，后者在前者之上采用包膜的形式。这两种组分可以通过肠溶层分开，所述肠溶层用来抵抗胃中的崩解并且允许内组分完整地传递进入十二指肠或被延迟释放。多种材料可以用于这种肠溶层或包衣，这种材料包含多种聚合酸以及聚合酸与如虫胶、十六醇和乙酸纤维素等此类材料的混合物。
合适的表面活性剂具体地包含非离子剂，如聚氧乙烯山梨聚糖(例如，TweenTM 20、40、60、80或85)和其它山梨聚糖(例如，SpanTM 20、40、60、80或85)。具有表面活性剂的组合物将方便地包括0.05与5％之间的表面活性剂，并且可以介于0.1与2.5％之间。应当理解，如果有必要，可以添加其它成分，例如甘露醇或其它药学上可接受的媒剂。
可以使用如IntralipidTM、LiposynTM、InfonutrolTM、LipofundinTM和LipiphysanTM等可商购获得的脂肪乳剂来制备合适的乳剂。活性成分可以溶解在预混合的乳剂组合物中，或者可替代地，活性成分可以溶解在油(例如大豆油、红花油、棉籽油、芝麻油、玉米油或杏仁油)和在与磷脂(例如卵磷脂(egg phospholipid)、大豆磷脂或大豆卵磷脂(soybeanlecithin))和水混合形成的乳剂中。应当理解，可以添加其它成分，例如甘油或葡萄糖，以调整乳剂的张力。合适的乳剂通常含有高达20％的油，例如，介于5与20％之间。脂肪乳剂可以包括介于0.1与1.0μm之间、具体地0.1与0.5μm之间的脂肪滴，并且pH范围为5.5到8.0。
乳剂组合物可以是通过将抗体与IntralipidTM或其组分(大豆油、卵磷脂、甘油和水)混合而制备的那些乳剂组合物。
用于吸入或吹入的药物组合物包含药学上可接受的水性或有机溶剂或其混合物中的溶液和悬浮液以及粉末。液体或固体组合物可以含有如上文所列出的合适的药学上可接受的赋形剂。在一些实施例中，通过口服或鼻腔呼吸途径施用组合物以产生局部或全身作用。
可以通过使用气体来雾化优选地无菌的药学上可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置中呼吸雾化溶液，或者雾化装置可以附着到面罩、帐篷或间歇正压呼吸机。可以从以适当方式递送调配物的装置优选地通过口服或鼻腔施用溶液、悬浮液或粉末组合物。
治疗应用
为了实践本文所公开的方法，可以通过合适的途径向需要治疗的受试者(例如，人)施用有效量的本文所描述的药物组合物，所述合适的途径如静脉内施用(例如，如团注或通过一段时间内的连续输注)、通过肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、吸入或局部途径。包含喷射雾化器和超声雾化器的用于液体调配物的可商购获得的雾化器可用于施用。液体调配物可以直接雾化并且冻干粉可以在重构之后雾化。可替代地，本文所描述的抗体可以使用碳氟化合物调配物和计量吸入器来雾化或者作为冻干粉和研磨粉吸入。
要通过本文所描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人。哺乳动物包含但不限于家畜、运动动物(sport animal)、宠物、灵长类动物、马、狗、猫、小鼠和大鼠。受试者可能患有以冠状病毒感染为特征的靶疾病/病症，或处于患有所述疾病/病症的风险，或疑似患有所述疾病/病症。所述冠状病毒可以是SARS-CoV-2、严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)或中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)。所述冠状病毒也可以是人类冠状病毒229E、NL63、OC43或HKU1。在一个实例中，所述冠状病毒为SARS-CoV-2。靶疾病/病症可以是SARS、MERS或COVID-19。在一个实例中，靶疾病/病症是COVID-19。
患有冠状病毒感染或疑似患有所述感染的受试者可以通过常规医学检查，例如实验室测试、器官功能测试或CT扫描来鉴定。在一个实例中，受试者患有SARS-CoV-2感染或疑似患有此类感染。
疑似患有任何此类靶疾病/病症的受试者可能显示出所述疾病/病症的一种或多种症状。有风险患有疾病/病症的受试者可以是具有所述疾病/病症的风险因素中的一种或多种风险因素的受试者。
如本文所用，“有效量”是指单独地或与一种或多种其它活性剂组合地赋予受试者治疗效果所需的每种活性剂的量。确定抗体的量是否达到治疗效果对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。如本领域的技术人员所认识到的，有效量有所不同，这取决于正在治疗的特定病状、病状的严重程度、包含年龄、身体状况、大小、性别和体重在内的个体患者参数、治疗持续时间、同时疗法的性质(如果有的话)、具体施用途径和在健康从业者的知识和专业技能内的相似因素。这些因素是本领域的普通技术人员所熟知的并且可以仅通过常规实验来解决。通常优选使用个别组分或其组合的最大剂量，也就是说，根据合理的医学判断的最高安全剂量。
如半衰期等经验性考虑通常将有助于确定剂量。例如，可以使用如人源化抗体或完全人抗体等与人免疫系统相容的抗体来延长抗体的半衰期并防止抗体受到宿主的免疫系统的攻击。施用频率可以在治疗过程中确定并进行调整，并且通常但不一定是基于靶疾病/病症的治疗和/或抑制和/或改善和/或延迟。可替代地，抗体的持续连续释放调配物可以是适当的。用于实现缓释的各种调配物和装置是本领域已知的。
在一个实例中，可以在已经给予了抗体的一次或多次施用的个体中凭经验确定如本文所描述的抗体的剂量。给予个体递增剂量的激动剂。为了评估激动剂的功效，可以遵循疾病/病症的指标。
通常，对于本文所描述的任何抗体的施用，初始候选剂量可以为约2mg/kg。出于本公开的目的，典型的日剂量的范围根据上述因素可以为约0.1μg/kg到3μg/kg、到30μg/kg、到300μg/kg、到3mg/kg、到30mg/kg、到100mg/kg或更多中的任何剂量。对于在若干天或更长时间内的重复施用，根据病状持续治疗，直至出现期望的症状抑制或直至达到足以减轻靶疾病或病症或其症状的治疗水平。示例性给药方案包括施用约2mg/kg的初始剂量，之后施用约1mg/kg抗体的每周维持剂量或者之后每隔一周施用约1mg/kg的维持剂量。然而，根据从业者希望实现的药代动力学衰变模式，其它剂量方案可能是有用的。例如，设想每周给药一到四次。在一些实施例中，可以使用的剂量范围为约3μg/mg到约2mg/kg(如约3μg/mg、约10μg/mg、约30μg/mg、约100μg/mg、约300μg/mg、约1mg/kg和约2mg/kg)。在一些实施例中，给药频率为每周一次、每2周一次、每4周一次、每5周一次、每6周一次、每7周一次、每8周一次、每9周一次或每10周一次；或每月一次、每2个月一次或每3个月一次或更久一次。通过常规技术和测定，容易地监测这一疗法的进展。给药方案(包含使用的抗体)可以随时间推移而变化。
在一些实施例中，对于正常体重的成年患者，可以施用的给药范围为从约0.3到5.00mg/kg。在一些实例中，本文所描述的抗S1抗体的剂量可以为10mg/kg。特定的给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定个体和所述个体的病史以及个别药剂的性质(如药剂的半衰期和本领域所熟知的其它考虑)。
出于本公开的目的，如本文所描述的抗体的适当剂量将取决于所采用的特异性抗体、抗体和/或非抗体肽(或其组合物)、疾病/病症的类型和严重程度、抗体是否出于预防或治疗目的而施用、既往疗法、患者的临床病史和对激动剂的应答、以及主治医生的判定。临床医生通常将施用抗体，直至达到实现期望结果的剂量。在一些实施例中，期望的结果是肿瘤微环境中抗肿瘤免疫应答的增加。确定剂量是否产生期望结果的方法对于本领域的技术人员而言将会是显而易见的。一种或多种抗体的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如受者的生理状况、施用的目的是治疗性的还是预防性的以及熟练从业者已知的其它因素。抗体的施用可以在预选时间段内基本上是连续的，或者可以例如在发展靶疾病或病症之前、期间或之后采用一系列间隔剂量。
如本文所用，术语“治疗”是指向受试者施加或施用包含一种或多种活性剂的组合物，所述受试者患有靶疾病或病症、疾病/病症的症状或对疾病/症状有易感性，其目的是治疗、治愈、减轻、缓解、改变、补救、改善、改进或影响病症、疾病的症状或对疾病或病症的易感性。
减轻靶疾病/病症包含延迟疾病的发展或进展或者降低疾病严重程度或延长生存期。减轻疾病或延长生存期不一定需要治愈结果。如本文所用，“延迟”靶疾病或病症的发展意指推迟、阻碍、减缓、放缓、稳定和/或延缓疾病的进展。这种延迟可以具有不同的时间长度，这取决于疾病的历史和/或正在治疗的个体。“延迟”或减轻疾病的发展或者延迟疾病的发作的方法是降低在给定时间帧内发展疾病的一种或多种症状的可能性和/或与不使用所述方法相比在给定时间帧内降低症状的程度的方法。这种比较通常是基于临床研究，使用足以给出统计学上显著的结果的许多受试者。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的初始表现和/或后续进展。疾病的发展可以是可检测到的并且可以使用如本领域熟知的标准临床技术进行评估。然而，发展还指可能无法检测到的进展。出于本公开的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包含发生、复发和发作。如本文所用，靶疾病或病症的“发作”或“发生”包含初始发作和/或复发。
根据要治疗的疾病的类型或疾病的位点，可以使用医学领域的普通技术人员已知的常规方法来向受试者施用药物组合物。这种组合物还可以通过其它常规途径施用，例如口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、颊、阴道或通过植入式储药器施用。如本文所用，术语“肠胃外”包含皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内和颅内注射或输注技术。另外，可以通过可注射的贮库施用途径向受试者施用组合物，如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或可生物降解材料和方法。在一些实例中，眼内或玻璃体内施用药物组合物。
可注射组合物可以含有各种载体，如植物油、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺、乳酸乙酯、碳酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、乙醇和多元醇(甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)。对于静脉内注射，可以通过滴注方法施用水溶性抗体，由此输注含有抗体和生理学上可接受的赋形剂的药物调配物。生理学上可接受的赋形剂可以包含例如5％葡萄糖、0.9％盐水、林格氏溶液(Ringer's solution)或其它合适的赋形剂。肌肉内制剂(例如，抗体的合适的可溶性盐形式的无菌调配物)可以在如注射用水、0.9％盐水或5％葡萄糖溶液等药物赋形剂中溶解和施用。
在一个实施例中，通过位点特异性或靶向局部递送技术施用抗体。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包含抗体的各种可植入贮库源或局部递送导管(例如，输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜包裹物、分流器和支架或其它可植入装置)；位点特异性载体；直接注射或直接应用。参见例如，PCT公开第WO 00/53211号和美国专利第5,981,568号。
也可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在例如以下文献中进行了描述：Findeis等人,《生物技术趋势(Trends Biotechnol.)》(1993)11:202；Chiou等人,《基因治疗学：直接基因转移的方法和应用(Gene Therapeutics:Methods And Applications Of Direct Gene Transfer)》(J.A.Wolff编)(1994)；Wu等人,《生物化学期刊(J.Biol.Chem.)》(1988)263:621；Wu等人,《生物化学期刊》(1994)269:542；Zenke等人,《美国国家科学院院刊》(1990)87:3655；Wu等人,《生物化学期刊》(1991)266:338。
对于基因疗法方案中的局部施用，在约100ng到约200mg DNA的范围内施用含有多核苷酸(例如，编码本文所描述的抗体的多核苷酸)的治疗组合物。在一些实施例中，在基因疗法方案期间还可以使用约500ng至约50mg、约1μg至约2mg、约5μg至约500μg和约20μg至约100μg或更高的浓度范围的DNA。
本文所描述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送媒剂来递送。基因递送媒剂可以是病毒或非病毒来源的(通常参见Jolly,《癌症基因疗法(Cancer Gene Therapy)》(1994)1:51；Kimura,《人类基因疗法》(1994)5:845；Connelly,《人类基因疗法》(1995)1:185；以及Kaplitt,《自然遗传学(Nature Genetics)》(1994)6:148)。这种编码序列的表达可以使用内源哺乳动物或异源启动子和/或增强子来诱导。编码序列的表达可以是构成的或调节的。
用于递送期望多核苷酸并在期望细胞中表达的基于病毒的载体是本领域所熟知的。示例性基于病毒的媒剂包含但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公开第WO 90/07936号；第WO 94/03622号；第WO 93/25698号；第WO 93/25234号；第WO 93/11230号；第WO93/10218号；第WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号和第4,777,127号；英国专利第2,200,651号；以及欧洲专利第0 345 242号)；基于α病毒的载体(例如，辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒(ATCC VR-67；ATCC VR-1247)、罗斯河病毒(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCC VR 1249；ATCC VR-532))；以及腺相关病毒(AAV)载体(参见例如，PCT公开第WO 94/12649号、第WO 93/03769号；第WO 93/19191号；第WO 94/28938号；第WO 95/11984号和第WO 95/00655号)。也可以采用如Curiel,《人类基因疗法》(1992)3:147中所描述的施用与杀伤的腺病毒连接的DNA。
也可以采用非病毒递送媒剂和方法，其包含但不限于单独与杀伤的腺病毒连接或不连接的聚阳离子浓缩DNA(参见例如，Curiel,《人类基因疗法》(1992)3:147)；配体连接的DNA(参见例如，Wu,《生物化学期刊》(1989)264:16985)；真核细胞递送媒剂细胞(参见例如，美国专利第5,814,482号；PCT公开第WO 95/07994号；第WO 96/17072号；第WO 95/30763号；和第WO 97/42338号)以及核酸电荷中和或与细胞膜的融合。也可以采用裸DNA。示例性裸DNA引入方法在PCT公开第WO 90/11092号和美国专利第5,580,859号中进行了描述。可以充当基因递送媒剂的脂质体在中美国专利第5,422,120号；PCT公开第WO 95/13796号；第WO94/23697号；第WO 91/14445号；以及欧洲专利第0524968号进行了描述。另外的方法在Philip,《分子与细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)》(1994)14:2411和Woffendin,《美国国家科学院院刊》(1994)91:1581中进行了描述。
本文所描述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、定时和重复，将取决于特定受试者和所述受试者的病史。
在一些实施例中，可以向需要治疗的受试者施用多于一种抗体或抗体与另一种合适的治疗剂的组合。抗体还可以结合用于增强和/或补充药剂的有效性的其它药剂使用。
可以通过本领域熟知的方法对靶疾病/病症的治疗功效进行评估。
诊断应用
本文所述公开的任何抗S1抗体也可以用于检测样品中的SARS-CoV2的S蛋白或SARS-CoV2病毒的存在。在一些情况下，样品可以是生物样品，如从疑似患有SARS-CoV2感染的受试者(例如，人类受试者)获得的血液样品。
为了执行本文所公开的方法，本文所公开的任何抗S1抗体可以与疑似含有SARS-CoV2病毒或其S蛋白的样品接触。一般而言，术语“接触(contacting)”或“接触(incontact)”是指在足以形成样品中的抗S1抗体与靶抗原之间的复合物(如果有的话)的合适条件下，将本文所公开的抗S1抗体与疑似含有靶抗原的样品接触合适的时段。在一些实施例中，接触是通过毛细管作用进行的，其中样品移动穿过载体膜的表面。如此形成的抗体-抗原复合物，如果有的话，可以通过常规方法确定。温育之后检测到此类抗体-抗原复合物表明样品中存在靶抗原。当需要时，可以定量抗体-抗原复合物的量，所述量指示样品中靶抗原的水平。
在一些实施例中，样品中本文所公开的靶抗原(即，SARS-CoV2病毒或其S蛋白)可以使用本文所公开的任何抗S1抗体通过免疫测定进行检测或定量。免疫测定的实例包含但不限于免疫印迹测定(例如，蛋白质印迹)、免疫组织化学分析、流式细胞术测定、免疫荧光测定(IF)、酶联免疫吸附测定(ELISA)(例如，夹心ELISA)、放射免疫测定、基于电化学发光的检测测定、磁性免疫测定、侧向流动测定和相关技术。用于检测样品中的靶抗原的另外的合适的免疫测定对本领域技术人员来说将是显而易见的。
在一些实例中，如本文所描述的抗S1抗体可以与可检测标记缀合，所述可检测标记可以是能够直接或间接释放可检测信号的任何试剂。此类可检测信号的存在或信号强度表明样品中的靶抗原的存在或数量。可替代地，对抗S1具有特异性或对靶抗原具有特异性的次级抗体可以用于本文所公开的方法中。例如，当所述方法中使用的抗S1抗体是全长抗体时，次级抗体可以与抗S1抗体的恒定区结合。在其它情况下，次级抗体可以与靶抗原的不同于抗S1抗体的结合表位的表位结合。本文所公开的任何次级抗体可以与可检测标记缀合。
本领域已知的任何合适的可检测标记可以用于本文所描述的测定方法。在一些实施例中，可检测标记可以是直接释放可检测信号的标记。实例包含荧光标记或染料。荧光标记包括荧光团，所述荧光团是可以在光激发后重新发射光的荧光化学化合物。荧光标记的实例包含但不限于呫吨衍生物(例如，荧光素、罗丹明、俄勒冈绿、曙红和德克萨斯红)、花青衍生物(例如，花青、吲哚碳花青、氧碳花青、硫碳花青和部花青)、方酸衍生物和经环取代的方酸(例如，Seta和Square染料)、方酸轮烷衍生物如SeTau染料、萘衍生物(例如，丹磺酰和氟硅酸钠衍生物)、香豆素衍生物、噁二唑衍生物(例如，吡啶基噁唑、硝基苯并噁二唑和苯并噁二唑)、蒽衍生物(例如，蒽醌，包含DRAQ5、DRAQ7和CyTRAK橙)、芘衍生物如级联蓝、噁嗪衍生物(例如，尼罗红、尼罗蓝、甲酚紫和噁嗪170)、吖啶衍生物(例如，脯氨酸、吖啶橙和吖啶黄)、芳基次甲基衍生物(例如，金胺、结晶紫和孔雀石绿)和四吡咯衍生物(例如，卟吩、酞菁和胆红素)。染料可以是包括发色团的分子，所述发色团负责染料的颜色。在一些实例中，可检测标记可以是异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白(PE)、生物素、别藻蓝蛋白(APC)或488。
在一些实施例中，可检测标记可以是间接释放可检测信号的分子，例如，通过将试剂转化为直接释放可检测信号的产物。在一些实例中，此类可检测标记可以是能够由无色底物产生有色产物的酶(例如，β-半乳糖苷酶、HRP或AP)。
用于COVID-19或检测SARS-CoV2感染的试剂盒
本公开还提供了用于治疗或缓解靶疾病，如本文所描述的SARS-CoV-2感染或COVID-19的试剂盒。本公开还提供了用于检测样品中的SARS-CoV2或其S蛋白存在的试剂盒。此类试剂盒可以包含一个或多个包括抗S1抗体的容器，例如本文所描述的容器中的任何容器。在一些情况下，抗S1抗体可以与第二种治疗剂共同使用。
在一些实施例中，试剂盒可以包括用于根据本文所描述的任何方法使用的说明书。包含的说明书可以包括对施用用于治疗、延迟发作或减轻如本文所描述的那些靶疾病等靶疾病的抗S1抗体以及任选地第二治疗剂的描述。试剂盒可以进一步包括对基于鉴定所述个体是否患有靶疾病，例如应用如本文所描述的诊断方法来选择适于治疗的个体的描述。在仍其它实施例中，说明书包括对向处于靶疾病风险中的个体施用抗体的描述。
与抗S1抗体的使用相关的说明书通常包含关于用于预期治疗的剂量、给药方案和施用途径的信息。容器可以是单位剂量、散装包装(例如，多剂量包装)或亚单位剂量。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的说明书)也是可接受的。标签或包装插页表明组合物用于抑制SARS-CoV2感染或治疗COVID-19。
可替代地，所述试剂盒可以包括对检测或定量如本文所公开的样品中的SARS-CoV2或其S蛋白的描述。本发明的试剂盒中提供的说明书通常是在标签或包装插页(例如，包含在试剂盒中的纸张)上的书面说明，但机器可读说明书(例如，磁性或光学存储盘上携带的或通过试剂盒中提供的互联网地址获得的说明书)也是可接受的。
本文所公开的试剂盒采用合适的包装。合适的包装包含但不限于小瓶、瓶、广口瓶、软包装(例如，密封的密拉(Mylar)或塑料袋)等。还设想了与具体装置(如吸入器、鼻腔施用装置(例如，雾化器)或输注装置(如微型泵))组合使用的包装。试剂盒可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。容器也可以具有无菌进口端(例如，容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小瓶)。组合物中的至少一种活性剂是抗S1抗体，如本文所描述的那些。
试剂盒可以任选地提供如缓冲液等另外的组分以及解释性信息。通常，试剂盒包括容器和在容器上或与容器相关的标签或一个或多个包装插页。在一些实施例中，本发明提供了包括上文所描述的试剂盒的内容物的制品。
通用技术
除非另有指示，否则本公开的实践将采用在本领域技术范围内的常规分子生物学(包含重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术。此类技术在以下文献中充分解释：如《分子克隆：实验室手册》,第二版(Sambrook等人,1989)冷泉港出版社；《寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)》(M.J.Gait编辑,1984)；《分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)》,胡玛纳出版社(Humana Press)；《细胞生物学：实验室手册(Cell Biology:A Laboratory Notebook)》(J.E.Cellis编辑,1989)学术出版社(Academic Press)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编辑,1987)；《细胞和组织培养简介(Introduction to Cell and Tissue Culture)》(J.P.Mather和P.E.Roberts,1998),普莱纽姆出版社(Plenum Press)；《细胞和组织培养：实验室程序(Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures》(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,1993-8)约翰·威利父子出版公司；《酶学方法(Methods inEnzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.))；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir and C.C.Blackwell编辑)；《哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,1987)；《当代分子生物学实验指南》(F.M.Ausubel等人编辑1987)；《PCR：聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编辑,1994)；《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编辑,1991)；《精编分子生物学实验指南(Short Protocols in Molecular Biology)》(约翰·威利父子出版公司,1999)；《免疫生物学(Immunobiology)》(C.A.Janeway和P.Travers,1997)；《抗体》(P.Finch,1997)；《抗体：实用方法(Antibodies:a practical approach)》(D.Catty.编辑,IRL出版社,1988-1989)；《单克隆抗体：实用方法(Monoclonal antibodies:a practicalapproach)》(P.Shepherd和C.Dean编辑,牛津大学出版社(Oxford University Press),2000)；《使用抗体：实验室手册(Using antibodies:a laboratory manual)》(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社,1999)；《抗体》(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,哈伍德学术出版社(Harwood Academic Publishers),1995)；《DNA克隆：实用方法(DNA Cloning:Apractical Approach)》,第I卷和第II卷(D.N.Glover编辑1985)；《核酸杂交(Nucleic AcidHybridization)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,1985)；《转录和翻译(Transcriptionand Translation)》(B.D.Hames和S.J.Higgins编辑,1984)；《动物细胞培养(Animal CellCulture)》(R.I.Freshney编辑,1986)；《固定化细胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes)》(lRL出版社,1986)；以及B.Perbal,《分子克隆实用指南(A practical Guide ToMolecular Cloning)》(1984)；F.M.Ausubel等人(编辑)。
无需进一步详细阐述，相信本领域的技术人员可以基于以上描述在最大程度上利用本发明。因此，以下具体实施例应被解释为仅是说明性的，并且不以任何方式限制本公开的其余部分。出于本文所提及的目的或主题，本文所引用的所有出版物均通过引用并入。
SARS-CoV-2的序列
>SARS-CoV-2刺突蛋白
MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVT
WFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNV
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>SARS-CoV-2-RBD(328-533)-Fc
RFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL
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>SARS-CoV-2-RBD(328-533)-His
RFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDL
CFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLY
RLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLGSHHHHHH—(SEQ ID NO:50)
实例1：筛选抗SARS-CoV-2抗体
天然人抗体文库由多个供体的骨髓单核细胞(MNC)和原初健康供体和自身免疫性疾病患者的外周血单核细胞(PBMC)构建。RT-PCR用于捕获VH结构域和VL结构域两者的全部免疫球蛋白组库。然后通过VH和VL改组构建scFv文库。文库大小预测为1012-13。进一步修饰scFv文库，使其在N端具有体外转录和翻译信号，并且在C端添加flag标签，用于mRNA展示的选择。
然后使用mRNA展示技术用上文所构建的scFv文库鉴定SARS-CoV-2S1蛋白结合物和RBD结合物(图1)。简言之，首先将DNA文库转录成mRNA文库，并且然后通过嘌呤霉素连接子共价偶联将其翻译成mRNA-scFv融合文库。所述文库被纯化并转化为mRNA/cDNA融合文库，类似于已知的程序(美国专利第6,258,558号，所述美国专利的相关公开内容出于其中引用的主题和目的通过引用并入)。mRNA展示文库首先用人和小鼠IgG(阴性蛋白)进行反向选择，以去除非特异性结合物，随后针对溶液中的重组RBD-Fc或S1-Fc蛋白进行选择，并且然后用G蛋白磁珠捕获。通过pH剥离来洗脱结合物以回收所有结合物，或者通过用重组ACE2进行表位定向洗脱来回收可能阻断RBD和ACE2相互作用的结合物。每轮通过PCR扩增来回收并富集RBD和S1结合物。在筛选之前，对每个靶标完成了五轮选择和富集。
实例2：与SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白结合的抗体
在上文所描述的五轮选择之后，将富集的文库克隆到细菌周质表达载体pET22b中，并且转化到TOP10感受态细胞中。每个scFv分子被工程化为具有C端标志和6xHIS标签，用于纯化和测定检测。汇集来自TOP10细胞的克隆，制备miniprep DNA，并且随后转化到细菌Rosetta II菌株中用于表达。挑取单个克隆，在96孔板中用0.1mM IPTG生长和诱导，以便进行表达。在30℃下诱导16-24小时之后收集上清液。
开发了RBD和S1结合筛选ELISA，分别用于鉴定单独的抗RBD和S1 scFv。简言之简言之，384孔板分别用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的人Fc和人RBD或S1蛋白固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块(superblock)封闭1小时。将50μL上清液添加到Fc和RBD或S1固定化的孔中，并且通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:5000稀释的抗Flag HRP来检测RBD(图2A)或S1(图2B)结合活性。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用25μL TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加25μL 2N硫酸停止显影。用BIOTEK读板仪在OD450 nm下读取板，并且用Excel条形图分析结合和选择性。
实例3：SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白与细胞内的ACE2的结合
通过将ACE2慢病毒构建体转导到CHO-K1细胞中，随后进行G418药物选择，产生ACE2重组细胞系。分选表达高水平ACE2的细胞并将其用于细胞中和测定。重组RBD和S1蛋白直接与Alexa Fluor 647缀合。确定了S1蛋白与表达ACE2的CHO-K1细胞结合的EC50(图3)。对阳性结合细胞计数进行计数，并且在Prism 8.1软件中绘图。
实例4：抗体表达和纯化以及Tm的确定
从甘油储备液板中挑选特异性抗SARS-CoV-2ScFv克隆，并且在具有透气膜的汤姆逊24孔板中的5mL培养物中生长过夜。除非另有说明，这种培养物和下文所描述的所有后续培养物在37℃下生长，并且以225RPM在还添加有1:5000稀释的消泡剂-204的TerrificBroth Complete加100μg/mL羧苄青霉素和34μg/mL氯霉素中振荡。然后通过将1:100稀释的起始培养物添加到指定的生产培养物(125mL Thomson Ultra Yield烧瓶中的50mL培养物、250mL Ultra Yield Thomson烧瓶中的100mL培养物或500mL Ultra Yield Thomson烧瓶中的250mL培养物)中，将这种过夜起始培养物用于接种较大的培养物，并且生长至OD600为0.5-0.8。此时，用最终浓度为0.25mM的IPTG诱导培养物，并且在30℃下温育过夜。第二天，将培养物以5000×g旋转1小时以沉淀细胞。
为了纯化，使用每1mL上清液3μL GE Ni Sepharose Excel树脂。使用一次性10mL或20mL BioRad Econo-Pac柱。用至少20柱体积(CV)缓冲液A(1xPBS，pH7.4)平衡树脂。通过在相同的填充树脂床上将流速控制为1毫升/分钟或倾倒两次利用重力流来纯化过滤灭菌的上清液。然后将柱用以下缓冲液洗涤：10CV缓冲液A、20CV缓冲液B(1xPBS，pH 7.4和20mM咪唑)。对于250mL表达培养物纯化，将抗体结合的柱依次用20CV缓冲液A和20CV缓冲液B洗涤。将蛋白质用洗脱缓冲液C(1xPBS pH 7.4和500mM咪唑)洗脱。级分在Bradford测定上运行(100μL稀释的Bradford溶液+10μL样品)。汇集具有亮蓝色的级分。通过A280延伸系数测量蛋白质浓度，并且使用SDS-PAGE凝胶分析经纯化的抗体的纯度(图4)。在一些情况下，ScFv抗体按照标准方案通过flag标签亲和纯化进一步纯化。大多数经纯化的ScFv具有>90％的纯度以及合理的产率。
所选scFv抗体被转化成IgG1格式。具体地，通过PCR扩增重链和轻链的可变区，并且随后将其在载体pCDNA3.4中组装到人IgG1的框架中。在哺乳动物细胞中产生抗体之前，对构建体进行序列确认。然后根据标准方案，在游离型系统(英杰公司(Invitrogen))中的ExpiHEK293-F细胞中瞬时表达抗体。细胞在上述条件下生长7天，然后采集。通过离心收集上清液，并且通过0.2μm PES膜过滤。通过MabSelect PrismA蛋白A树脂(通用电气医疗集团(GE Health))纯化抗体。将蛋白质用100mM Gly pH2.5+150mM NaCl洗脱，并且用20mM柠檬酸盐pH 5.0+300mM NaCl快速中和。将抗体浓缩并将缓冲液交换至1xPBS，pH 7.4。如通过SDS-PAGE分析检测的，经纯化的IgG1抗体的纯度>90％。
对于热稳定性分析，每个样品和对照至少一式两份地制备，以确保结果是可复制的。首先在Excel中设计板图，这样每个样品的准确位置可以与用于运行和分析样品的软件相匹配。在水中制备蛋白质热偏移染料的新鲜稀释液(1000x)至8x。实验使用生达公司(LifeTech)的微安光学96孔板或8帽形条。按列出的顺序添加以下试剂：第1：5μL蛋白质热偏移缓冲液，第2：样品：在水中稀释至0.4mg/mL的12.5μL样品，12.5μL缓冲液中无蛋白质用作阴性对照，并且含有2.0μL蛋白质热偏移对照蛋白的10.5μL水用作阳性对照，第3：2.5μL稀释的热偏移染料8x，总体积为20μL/孔。热偏移染料一旦添加，就上下移液10x。一旦用微安光学膜盖密封，然后将板或条以1000RPM旋转1分钟。然后将板或条放入由赛默飞世尔公司(hermo Fisher)生产的Quant Studio 3仪器中，运行前述方法。步骤1：100％斜变速率至25.0°，时间2分钟，以及最后步骤2：1％斜变速率至99.0℃，时间2分钟。然后使用QuantStudio设计与分析软件和蛋白质热偏移软件1.3分析样品和随后的Tm(并计算Tm)。
下表1示出了scFv抗体的Tm的实例。
表1.示例性scFv抗体的解链温度
ScFv Tm(℃)
2020EP53-D06 69.3
2020EP54-H01 55.1
2020EP54-E12 55.3
2020EP54-B02 63.6
2020EP54-E10 61.8
2020EP60-F05 72.9
2020EP66-A07 59.7
2020EP64-C08 54.5
实例5：使用ELISA进行scFv抗体与SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白的结合
开发了ELISA测定来确定抗RBD和S1抗体的EC50。简言之，384孔板用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2ug/mL的人RBD或S1蛋白固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块封闭1小时。将经纯化的抗RBD或抗S1 scFv从200nM连续稀释2倍至0，共16个点。将25μL添加到RBD或S1固定化的孔中，并且通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:5000稀释的抗Flag HRP来检测RBD或S1结合。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用20ul TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加20ul 2N硫酸停止显影。在OD450nmBiotek读板仪处读取板，并且然后在Prism 8.1软件中绘图。使用ELISA测定测试了scFv抗体的实例与RBD(图5A)和S1(图5B)的结合。
下表2中示出了scFv与RBD结合的EC50(NB＝无结合)。
表2.示例性scFv抗体与RBD结合的EC50
实例6：SPR中scFv抗体与SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白的结合
使用Biacore T200通过表面等离子共振(SPR)技术评估抗RBD和抗S1蛋白抗体的动力学分析。用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，在抗人Fc传感器芯片上的1XHBSP缓冲液中，在流动池2上以10微升/分钟的流速捕获1μg/mL的RBD或S1蛋白，持续60秒。以30微升/分钟的流速将两倍连续稀释的纯化scFv抗体注射到参考流动池1和RBD或S1蛋白捕获的流动池2两者上，持续150秒，随后洗涤300秒。然后用Biacore再生缓冲液(3M MgCl2)以30微升/分钟的流速使流动池再生，持续30秒。在96孔板中对每个抗体的300-0nM的八个浓度点进行测定。用Biacore T200评估软件3000分析动力学数据。特异性结合应答单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的。图6示出了2020EP054-E10分别与RBD(图6A)和S1蛋白(图6B)结合的传感器图实例。下表3中示出了2020EP54-E10 scFv结合动力学。
表3. 2020EP54-E10 scFv结合动力学
Ka(1/毫秒) Kd(1/秒) Kd(M)
RBD 4.770E+5 9.059E-4 1.899E-9
S1 3.158E+5 0.001059 3.352E-9
下表4中示出了scFv的结合动力学。
表4.示例性scFv抗体的结合动力学
实例7：ELISA中scFvs对SARS-CoV-2与ACE2的RBD和S1结合的中和活性
为了评估scFv结合物的中和活性，开发了使用ACE2的抗RBD或S1竞争ELISA。384孔板用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的人ACE2固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块封闭1小时。将25μL连续稀释的纯化的抗RBD或抗S1 scFv与RBD或S1的EC80温育30分钟，并且然后添加到人ACE2蛋白固定化的孔中，随后通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:5000稀释的抗Flag HRP来检测RBD或S1与ACE2的结合活性。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nm Biotek读板仪处读取板，并且然后在Prism 8.1软件中绘图。计算IC50。图7示出了RBD(图7A)和S1(图7B)蛋白分别与ACE2相互作用的中和活性实例。
下表5和6中示出了结合的IC50值。
表5.示例性scFv与RBD-ACE2结合的IC50值
RBD-ACE2 2020EP54-B12 2020EP054-E10 2020EP054-E12
IC50(nM) 8.64 <1 6.69
表6.与S1-ACE2结合的示例性scFv的IC50值
S1-ACE2 2020EP54-B12 2020EP054-E10 2020EP054-E12
IC50(nM) 6.05 4.94 8.57
2020EP54-C08 2020EP054-H01 2020EP054-H09
IC50(nM) 94.2 38.41118.3
实例8：通过FACS，ScFv对SARS-CoV-2与ACE2/CHOK1的S1结合的中和活性
为了测试抗RBD或S1 scFv中和以及阻断人ACE2细胞结合活性，开发了FACS测定。简言之，重组RBD和S1与AF647缀合。通过将连续稀释的AF647缀合的RBD或S1与表达重组人ACE2的CHOK1细胞系或表达内源性ACE2的HepG2细胞系结合来确定EC50。将50μL连续稀释的纯化的抗RBD或抗S1 scFv与RBD-AF647或S1-AF647的EC80温育30分钟，并且然后添加到人ACE2/CHOK1或HepG2细胞系中，随后通过振荡在4℃下温育1小时。将细胞洗涤，通过Attune流式细胞仪检测RBD和S1与人ACE2细胞的结合活性，然后在Prism 8.1软件中绘图。计算IC50。图8示出了ScFv抗体对与ACE2/CHOK1细胞的S1相互作用的中和活性的实例。下表7中示出了IC50值。
表7.示例性scFv抗体的IC50值
S1-ACE2/CHKO1 2020EP54-E10 2020EP054-E12 2020EP054-B12
IC50(nM) 4.69 6.58 5.41
实例9：ELISA中IgG1抗体与SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白的结合
为了确定抗RBD或S1纯化的IgG的EC50，384孔板用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的RBD或S1蛋白固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块封闭1小时。将经纯化的抗RBD或抗S1 IgG从200nM连续稀释2倍至0，共16个点。将25μL添加到RBD或S1固定化的孔中，并且通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:10000稀释的抗人Fc HRP来检测RBD或S1结合。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nm Biotek读板仪处读取板，并且然后在Prism 8.1软件中绘图。图9示出了在ELISA中IgG抗体分别与RBD(图9A和C)和S1(图9B和D)蛋白的结合活性。下表8和9中示出了EC50值。
表8.用于与RBD结合的示例性抗体的EC50值
RBD 2020EP054-E10 2020EP054-E12 2020EP054-B12 2020EP054-H01
EC50(nM) 0.080 0.053 0.045 0.101
表9.用于与S1结合的示例性抗体的EC50值
S1 2020EP054-E10 2020EP054-E12 2020EP054-B12 2020EP054-H01
EC50(nM) 0.084 0.103 0.045 0.101
实例10：SPR中IgG1抗体与SARS-CoV-2的RBD和S1蛋白的结合
用Biacore T200通过SPR技术评估RBD或S1 IgG的动力学分析。用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。开发了1:1动力学测定来评估SARS-CoV-2IgG。简言之，将抗人Fc固定在CM5芯片上以实现高密度。对于每个循环，在抗人Fc传感器芯片上的1xHBSP缓冲液中，在流动池2上以10微升/分钟的流速捕获1μg/mL的SARS-CoV-2IgG，持续60秒。以30微升/分钟的流速将2倍连续稀释的HIS标记的RBD或S1注射到参考流动池1和SARS-CoV-2IgG捕获的流动池2两者上，持续150秒，随后洗涤300秒。然后用抗人Fc再生缓冲液以30微升/分钟的流速使流动池再生，持续60秒。在96孔板中对每个样品的300-0nM的八个浓度点进行测定。用Biacore T200评估软件3000分析IgG与RBD或S1结合的动力学。特异性结合应答单位是从IgG捕获的流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的。图10示出了SPR中分别针对RBD(图10A)和S1(图10B)蛋白的IgG抗体(2020EP54-E10 IgG)的传感器图的实例。下表10中示出了动力学参数。
表10.用于与RBD和S1结合的示例性IgG抗体的动力学参数
Ka(1/毫秒) Kd(1/秒) Kd(M)
RBD 1.456E+6 8.070E-4 5.544E-10
S1 2.169E+5 4.980E-4 2.296E-9
实例11：ELISA中IgG1抗体与SARS-CoV-2的S蛋白的结合
为了确定抗RBD或S1纯化的IgG与SARS-COV-2的S蛋白的结合EC50，384孔板用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的S蛋白(义翘神州公司(SinoBiologics))固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块封闭1小时。将经纯化的抗RBD或抗S1 IgG从200nM连续稀释2倍至0，共16个点。将25μL添加到S蛋白固定化的孔中，并且通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:10000稀释的抗人Fc HRP来检测RBD或S1结合。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nm Biotek读板仪处读取板，并且然后在Prism 8.1软件中绘图。图11示出了ELISA中IgG抗体与S蛋白的结合活性。
下表11中示出了EC50值。
表11.示例性IgG抗体与S蛋白的结合活性的EC50值
实例12：ELISA中IgG1抗体与SARS-COV的RBD和S蛋白的结合
为了确定SARS-CoV-2的抗RBD或S1蛋白的经纯化的IgG是否也与SARS-CoV的蛋白结合，384孔板用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的SARS-COV的RBD或S1蛋白(ACRO生物科学公司)固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块封闭1小时。将经纯化的抗RBD或抗S1 IgG从200nM连续稀释2倍至0，共16个点。将25μL添加到RBD或S1固定化的孔中，并且通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:10000稀释的抗人Fc HRP来检测RBD或S1结合。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nm Biotek读板仪处读取板，并且然后在Prism 8.1软件中绘图。图12示出了在ELISA中IgG抗体分别与SARS-COV的RBD(图12A)和S1(图12B)蛋白的结合活性。
下表12和13中示出了EC50值(NB-无结合)。
表12.示例性IgG与SARS-COV的RBD的结合活性的EC50值
表13.IgG与SARS-COV的S1的结合活性的EC50值
实例13：SPR中IgG抗体与SARS-CoV的RBD和S1蛋白的结合
使用Biacore T200通过表面等离子共振(SPR)技术评估SARS-COV-2抗体的抗RBD和抗S1蛋白的与SARS-COV的蛋白的交叉结合动力学分析。用Biacore T200控制软件2.0版运行测定。对于每个循环，蛋白质A传感器芯片上的1XHBSP缓冲液中，在流动池2上以10微升/分钟的流速捕获1μg/mL的抗RBD或抗S1蛋白IgG抗体，持续60秒。以30微升/分钟的流速将两倍连续稀释的经纯化的SARS-COV-2和SARS-COV的RBD或S1蛋白注射到参考流动池1和IgG捕获的流动池2两者上，持续150秒，随后洗涤300秒。然后用甘氨酸pH 2.0缓冲液以30微升/分钟的流速使流动池再生，持续60秒。在96孔板中对每个抗体的300-0nM的八个浓度点进行测定。用Biacore T200评估软件3000分析动力学数据。特异性结合应答单位是从靶流动池2减去与参考流动池1的结合而得到的。图13示出了分别与SARS-COV-2和SARS-COV的RBD和S1蛋白结合的2020EP054-E10(图13A-D)和2020EP054-B12(图13E-H)的传感器图实例。下表14中示出了结合动力学。
表14.示例性抗体与SARS-COV-2和SARS-COV的RBD和S1蛋白的结合动力学
实例14：ELISA中IgG1抗体对SARS-CoV-2与ACE2的RBD和S1结合的中和活性
用RBD或S1与ACE2结合的竞争性ELISA来评估抗RBD或S1 IgG中和活性。简言之，384孔板用总体积为每孔25μL的在1x PBS中的最终浓度为2μg/mL的人ACE2/His标签固定。将板在4℃下温育过夜，随后用每孔80μL超级块封闭1小时。将25μL连续稀释的经纯化的IgG与EC80浓度的RBD或S1混合，并且温育30分钟，然后添加到ACE2固定化的孔中，并且通过振荡温育1小时。通过添加25μL在1x PBST中以1:10000稀释的抗人Fc HRP来检测RBD或S1结合。在每个步骤之间，在板洗涤器中用1XPBST将板洗涤3次。然后用20μL TMB底物将板显影5分钟，并且通过添加20μL 2N硫酸停止显影。在OD450 nm Biotek读板仪处读取板，并且然后在Prism 8.1软件中绘图。图14示出了在ELISA中S1蛋白与ACE2结合的IgG抗体中和的实例。
下表15中示出了IC50值。
表15.用于抑制S1蛋白与ACE2结合的示例性抗体的IC50值
S1 2020EP54-E10 2020EP054-E12 hACE2-Fc
IC50(nM) 0.774 3.79 26.98
实例15：通过FACS，针对与ACE2/CHO-K1结合的RBD和S1的IgG1抗体的中和活性
为了测试抗RBD或S1 IgG抗体中和以及阻断人ACE2细胞结合活性，开发了FACS测定。简言之，重组RBD和S1与AF647缀合。通过将连续稀释的AF647缀合的RBD或S1与表达重组人ACE2的CHOK1细胞系结合来确定EC50。将50μL连续稀释的纯化的抗RBD或抗S1 IgG抗体与RBD-AF647或S1-AF647的EC80温育30分钟，并且然后添加到人ACE2/CHOK1中，随后通过振荡在4℃下温育1小时。将细胞洗涤，通过Attune流式细胞仪检测RBD和S1与人ACE2细胞的结合活性，然后在Prism 8.1软件中绘图。计算IC50。图15示出了在FACS测定中S1蛋白与人ACE2/CHOK1细胞结合的IgG抗体中和的实例。
下表中示出了IC50值。
表16.用于抑制S1蛋白与ACE2/CHO-K1结合的示例性抗体的IC50值
S1-ACE2/CHO-K1 2020EP54-E10 2020EP054-E12 hACE2-Fc
IC50(nM) 2.712 1.90 5.23
其它实施例
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合来组合。本说明书中公开的每个特征可以被用于相同、等效或类似目的的替代性特征替换掉。因此，除非另有明确说明，否则所公开的每个特征仅是一系列等效或类似特征的实例。
通过以上描述，本领域的技术人员可以很容易地确定本发明的实质特性，并且在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改以使其适于各种用途和条件。因此，其它实施例也在权利要求范围内。
等效形式
尽管本文已经描述和展示了若干个发明实施例，但本领域普通技术人员将容易想到用于执行本文所描述的功能和/或获得这些结果和/或这些优点中的一个或多个优点的各种其它装置和/或结构，并且此类变型和/或修改中的每一个被认为是在本文所描述的发明实施例的范围内。更一般地，本领域的技术人员将容易地理解，本文所描述的所有参数、尺寸、材料和构型意味着示例性的，并且实际参数、尺寸、材料和/或构型将取决于使用本发明教导的一种或多种具体应用。仅使用常规实验，本领域的技术人员将认识到或能够确定本文所描述的具体本发明实施例的许多等效物。因此，应理解，前述实施例仅以实例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等效物的范围内，可以以不同于具体描述的和要求保护的方式来实践本发明实施例。本公开的本发明实施例涉及本文所描述的每个单独的特征、系统、物品、材料、试剂盒和/或方法。另外，如果两个或更多个这样的特征、系统、物品、材料、成套工具和/或方法的任何组合并不相互矛盾，则这样的特征、系统、物品、材料、成套工具和/或方法被包含在本公开的本发明范围内。
本文中定义和使用的所有定义都应当理解为对字典定义的控制、通过引用并入的文件中的定义和/或定义术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请相对于各自所引用的主题而并入本文，在一些情况下，其可能涵盖整个文件。
除非明确相反指出，否则本说明书和权利要求中使用的不定冠词“一个(a)”和“一种(an)”应理解为表示“至少一个”。
如本文在说明书中和权利要求中使用的，短语“和/或”应当理解为意指这样结合的要素中的“任一个或两个”，所述要素即在一些情况下共同存在而在其它情况下分开存在的要素。用“和/或”列出的多个要素应以相同的方式解释，即，如此结合的要素中的“一个或多个”。除了通过“和/或”从句具体标识的要素之外，还可以任选地存在其它要素，而无论是与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，当与如“包括”等开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以仅指A(任选地包含除B以外的要素)；在另一个实施例中，仅指B(任选地包含除A以外的要素)；在又另一个实施例中，指A和B两者(任选地包含其它要素)；等。
如本文在本说明书和权利要求中所使用的，“或”应被理解为具有与如上所定义的“和/或”相同的含义。例如，当将列表中的项分开时，“或”或“和/或”应被解释为包含性的，即包含许多要素或要素列表中的至少一个要素，但还包含多于一个要素以及任选地另外的未列出的项。仅仅明确地指示相反的术语，如“...中的仅一个”或“...中的恰好一个”或者在权利要求中使用时，“由...组成”将指代包含多个要素或要素列表中的恰好一个要素。一般而言，当之前有排他性术语，如“任一个”、“……之一”、“……中的仅一个”、或“……中的恰好一个”时，如本文所使用，术语“或”应当仅被解释为指示排他性替代品(即，“一个或另一个而不是两个”)。当在权利要求中使用时，“基本上由…组成”应当具有如在专利法领域中所使用的普通含义。
如在本说明书和权利要求中所使用的，关于一个或多个要素的清单的短语“至少一个”应被理解为是指选自要素清单中的任一个或多个要素的至少一个要素、但不一定包含要素清单内具体列出的每一个要素的至少一个、并且不排除要素清单中要素的任何组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”所指代的要素列表内具体标识的要素之外的要素，无论与具体标识的那些要素相关还是不相关。因此，作为非限制性实例，在一个实施例中，“A和B中的至少一个”(或等效地，“A或B中的至少一个”，或等效地“A和/或B中的至少一个”)可以指任选地包含多于一个A，不存在B(并且任选地包含除B以外的元素)的至少一个；在另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个B，不存在A(并且任选地包含除A以外的元素)的至少一个；在又另一个实施例中，可以指任选地包含多于一个A的至少一个，以及任选地包含多于一个B(以及任选地包含其它元素)的至少一个；等。
还应当理解，除非明确相反地指出，否则在本文要求保护的包含多于一个步骤或动作的任何方法中，方法的步骤或动作的顺序不一定限于叙述方法的步骤或动作的顺序。
序列表
<110> 艾佩斯瑞生物制药公司（Elpis Biopharmaceuticals）
<120> 抗SARS-CoV-2抗体和其用途
<130> 112139-0024-7003WO00
<140> 尚未指定
<141> 与此同时
<150> US 63/026,486
<151> 2020-05-18
<160> 50
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Glu Asp Gly Tyr Asn Tyr Ile Ser Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 2
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Arg Gly Asn Asp Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ile Asp Val Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 3
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 4
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 4
Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ala
20 25 30
Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Met Tyr
35 40 45
Glu Asp Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Gly Gly
65 70 75 80
Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Arg Gly Pro Glu
85 90 95
Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 5
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 5
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Thr Gly Phe Ile Val Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Thr Leu Gly Asn Asp Tyr Gly Asp Tyr Gly Thr Asp Tyr Trp Gly Gln
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 6
Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Ser Cys Ser Gly Asp Arg Leu Gly Gln Lys Tyr Thr
20 25 30
Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Ile Met Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ile Gln Ser Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Gly Ser Asp His
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 7
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 7
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Thr Arg Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 8
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Val
85 90 95
Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 9
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Phe Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Asp Ser Ser Ser Trp Lys Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
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<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 10
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Ile
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 11
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Asp Thr Ala Thr Tyr Ala Gln Asn Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Arg Met Thr Ala Asp Glu Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Ser Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Asp Tyr Lys Val Gly
100 105 110
Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
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<210> 12
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 12
Ala Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 13
<211> 127
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Arg Val Ala Leu Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Tyr Asp
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 14
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 14
Ser Ser Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Tyr Val
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ile Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Asn Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Asp Pro Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 15
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 16
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Glu Gln Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 17
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Asn Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<220>
<223> 合成
<400> 18
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val
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Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 20
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr
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Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
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Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<210> 21
<211> 105
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 21
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Arg Gly Asn Asp Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys His Val Trp Asp Ile Asp Val Val Phe
85 90 95
Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 22
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
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Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
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65 70 75 80
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<211> 110
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 23
Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
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Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Arg Thr Ala Pro Lys Leu Leu
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Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 24
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
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Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Thr Val Ser Ser
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 25
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro Lys Val Leu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 26
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 27
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Thr Ile Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ser
20 25 30
Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Met Val Met Tyr
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Gln Asp Asp Gln Arg Pro Ser Gly Thr Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Arg Ala Thr
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Ser Val
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Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
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<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Asp Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
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Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 29
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser
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<210> 30
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 30
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
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Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Pro Arg Asp Tyr Arg Ala Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 31
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 31
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Gly Gln Asp Ile Asp Thr Ser
20 25 30
Val Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Gly Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Thr Phe Ser Thr Ser Val
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 32
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 32
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Glu Asp Gly Tyr Asn Tyr Ile Ser Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu Thr Ala Arg Ile Thr Cys
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Arg Gly Asn Asp Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Gln Val Trp Asp Ile Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 33
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 33
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Lys Gly Arg Gly Trp Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Asn Phe Met Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
130 135 140
Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly
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Asp Lys Tyr Ala Cys Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val
165 170 175
Leu Val Met Tyr Glu Asp Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Ala Arg
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Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Val Glu Gly Gly Asp Glu Gly Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser
210 215 220
Arg Gly Pro Glu Val Ile Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235 240
<210> 34
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 34
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Val Thr Gly Phe Ile Val Ser Ser Asn
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Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
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Ser Val Ile Tyr Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
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Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala
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Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
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Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser
130 135 140
Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Ser Cys Ser Gly Asp
145 150 155 160
Arg Leu Gly Gln Lys Tyr Thr Ser Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln
165 170 175
Ser Pro Val Leu Ile Met Tyr Gln Asp Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile
180 185 190
Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Gly Ile Gln Ser Met Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val
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Trp Asp Ser Gly Ser Asp His Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 35
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 35
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Val Thr Arg Val Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val
130 135 140
Ala Pro Gly Lys Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly
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Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
165 170 175
Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg
195 200 205
Val Glu Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser
210 215 220
Ser Ser Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235
<210> 36
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 36
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Phe Asn Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
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Ala Arg Trp Asp Ser Ser Ser Trp Lys Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser
130 135 140
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser
145 150 155 160
Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
165 170 175
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val
180 185 190
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr
195 200 205
Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Tyr Asp Asn Leu Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
225 230 235 240
Lys
<210> 37
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
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Ala Arg Ser Thr Ser Tyr Tyr Asp Ser Arg Gly Asp Tyr Lys Val Gly
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ile
130 135 140
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Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
165 170 175
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp
180 185 190
Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp
210 215 220
Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro Leu Thr Phe
225 230 235 240
Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245
<210> 38
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 38
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Ala Arg Val Ala Leu Gly Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Tyr Asp
100 105 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ser
130 135 140
Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala
145 150 155 160
Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Tyr Val Phe Trp
165 170 175
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Ile Leu Val Ile Tyr Gln Asp
180 185 190
Asn Arg Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser
195 200 205
Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Asp Pro Ala Met Asp Glu
210 215 220
Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val Phe Gly
225 230 235 240
Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 39
<211> 238
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 39
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Gly Leu Glu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
115 120 125
Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Leu Ser Val
130 135 140
Ser Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro
145 150 155 160
Glu Gln Tyr Ala Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val
165 170 175
Leu Val Ile Tyr Lys Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg
180 185 190
Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly
195 200 205
Val Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser
210 215 220
Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
225 230 235
<210> 40
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 40
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Asn Pro Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Glu Ser Gly Asn Tyr Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Tyr Thr Phe
100 105 110
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Val Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Leu Ser Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Ala Arg Ile
145 150 155 160
Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Asn Val His Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Tyr Asp Ser Asp
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 41
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Glu Tyr Ser Tyr Gly Ser Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly
145 150 155 160
Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
165 170 175
Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly
180 185 190
Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu
195 200 205
Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln
210 215 220
Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys
225 230 235 240
Leu Thr Val Leu
<210> 42
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 42
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Gly Glu Asp Gly Tyr Asn Tyr Ile Ser Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Arg Ser Ser Tyr Glu Leu Thr Gln
130 135 140
Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Glu Thr Ala Arg Ile Thr Cys
145 150 155 160
Arg Gly Asn Asp Ile Gly Ser Lys Ser Val His Trp Tyr Gln Gln Lys
165 170 175
Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Leu Tyr Tyr Asp Ser Asp Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala
195 200 205
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Glu Ala Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys His Val Trp Asp Ile Asp Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
225 230 235 240
Thr Val Leu
<210> 43
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 43
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Gly Ser Phe Ser Gly Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile Asn His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Gly Pro Pro Leu Trp Asn Tyr Gly Lys Gly Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Pro Val Leu Thr Gln Pro Pro
130 135 140
Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly
145 150 155 160
Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu
165 170 175
Pro Arg Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro
180 185 190
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala
195 200 205
Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 44
<211> 241
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 44
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Arg Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Ser Tyr Gly Gly Asn Gln Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr
130 135 140
Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Asp Ser Asn Ile
145 150 155 160
Gly Thr Asn Thr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Thr Ala Pro
165 170 175
Lys Val Leu Ile Tyr Ser Thr His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp
180 185 190
Arg Phe Ser Ala Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser
195 200 205
Gly Leu Gln Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Trp Asp
210 215 220
Val Ser Leu Asn Ala Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val
225 230 235 240
Leu
<210> 45
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Gly Gly Asp Gly Tyr Asn Tyr Asp Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Tyr Glu Leu
130 135 140
Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Thr Ile
145 150 155 160
Thr Cys Ser Gly Glu Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Ser Phe Trp Tyr Gln
165 170 175
Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Met Val Met Tyr Gln Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Pro Ser Gly Thr Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Arg Ala Thr Asp Glu Ala Asp
210 215 220
Tyr Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Asn Ser Ala Ser Val Phe Gly Ser Gly
225 230 235 240
Thr Lys Leu Thr Val Leu
245
<210> 46
<211> 252
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 46
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Lys Asp Arg Ala Tyr Tyr Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ser Val
130 135 140
Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln Arg Val Thr
145 150 155 160
Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val
165 170 175
His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
180 185 190
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser
195 200 205
Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu Gln Ala Glu
210 215 220
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly
225 230 235 240
Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
245 250
<210> 47
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 47
Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Pro Arg Asp Tyr Arg Ala Gln Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
130 135 140
Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg
145 150 155 160
Ala Gly Gln Asp Ile Asp Thr Ser Val Asn Trp Tyr Gln Leu Lys Pro
165 170 175
Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Ala Ser Ser Ser Leu Gln Thr
180 185 190
Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ala Glu Phe Thr
195 200 205
Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys
210 215 220
Gln Gln Thr Phe Ser Thr Ser Val Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val
225 230 235 240
Glu Ile Lys
<210> 48
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 48
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 49
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 49
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
1 5 10 15
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
20 25 30
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
35 40 45
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
50 55 60
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
65 70 75 80
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
85 90 95
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
100 105 110
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
115 120 125
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
130 135 140
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
145 150 155 160
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
165 170 175
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
180 185 190
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Asp Lys
195 200 205
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
210 215 220
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
225 230 235 240
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
245 250 255
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
260 265 270
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
275 280 285
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
290 295 300
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
305 310 315 320
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
325 330 335
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
340 345 350
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
355 360 365
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
370 375 380
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
385 390 395 400
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
405 410 415
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
420 425 430
Lys
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 50
Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn
1 5 10 15
Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser
20 25 30
Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser
35 40 45
Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys
50 55 60
Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val
65 70 75 80
Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr
85 90 95
Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn
100 105 110
Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu
115 120 125
Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu
130 135 140
Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn
145 150 155 160
Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val
165 170 175
Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His
180 185 190
Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Gly Ser
195 200 205
His His His His His His
210

Claims (29)

1.一种与SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基结合的分离的抗体，其中所述抗体与和参考抗体相同的表位结合，或者与所述参考抗体竞争与所述S1亚基结合，并且其中所述参考抗体选自由以下组成的组：2020EP53-D06、2020EP54-H01、2020EP54-E12、2020EP54-B12、2020EP54-B02、2020EP54-E10、2020EP60-F05、2020EP60-A12、2020EP61-A08、2020EP61-C12、2020EP64-G10、2020EP66-D03、2020EP64-C08、2020EP66-A07、2020EP71-E04和2020EP75-E02。
2.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述表位定位于所述S1亚基的受体结合结构域(RBD)中。
3.根据权利要求1所述的分离的抗体，其中所述表位定位于所述S1亚基的RBD的外部。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包括：
(a)重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HCCDR3)，其中所述HC CDR1、所述HC CDR2和所述HC CDR3共同与所述参考抗体的重链CDR至少80％相同；和/或
(b)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LCCDR3)，其中所述LC CDR1、所述LC CDR2和所述LC CDR3共同与所述参考抗体的轻链CDR至少80％相同。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分离的抗体，其中与所述参考抗体的HC CDR相比，所述抗体的HC CDR共同含有不超过8个氨基酸残基变异；和/或其中与所述参考抗体的LC CDR相比，所述抗体的LC CDR共同含有不超过8个氨基酸残基变异。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体包括与所述参考抗体的VH至少85％相同的VH，和/或与所述参考抗体的VL至少85％相同的VL。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体对S1的结合亲和力小于10nM。
8.根据权利要求1所述的分离的抗体，其包括与所述参考抗体相同的重链互补决定区(HC CDR)和与所述参考抗体相同的轻链互补决定区(LC CDR)。
9.根据权利要求8所述的分离的抗体，其包括与所述参考抗体相同的VH和与所述参考抗体相同的VL。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是人抗体或人源化抗体。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是全长抗体或其抗原结合片段。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分离的抗体，其中所述抗体是单链抗体(scFv)。
13.根据权利要求11所述的分离的抗体，其中所述抗体是全长抗体，所述全长抗体是IgG1分子。
14.一种核酸或一组核酸，其共同编码根据权利要求1至13中任一项所述的抗体。
15.根据权利要求14所述的核酸或一组核酸，其是载体或一组载体。
16.根据权利要求15所述的核酸或一组核酸，其中所述载体是表达载体。
17.一种宿主细胞，其包括根据权利要求14至16中任一项所述的核酸或一组核酸。
18.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至13中任一项所述的抗体或根据权利要求14至16中任一项所述的一种或多种核酸以及药学上可接受的载体。
19.一种治疗或抑制受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的根据权利要求18所述的药物组合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述冠状病毒选自由以下组成的组：严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)、严重急性呼吸道综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸道综合征冠状病毒(MERS-CoV)。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述冠状病毒是SARS-CoV-2。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述受试者患有、疑似患有或有风险患有选自由以下组成的组的疾病：COVID-19、SARS和MERS。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述疾病是COVID-19。
24.根据权利要求19至23中任一项所述的方法，其中所述受试者是人类患者。
25.一种检测SARS-CoV-2的存在的方法，所述方法包括：
(i)使根据权利要求1至13中任一项所述的抗体与疑似含有SARS-CoV-2病毒的S1蛋白或其包括RBD的片段的样品接触；以及
(ii)检测所述抗体与所述S1蛋白或所述包括所述RBD的片段的结合。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述抗体与可检测标记缀合。
27.根据权利要求25或权利要求26所述的方法，其中所述样品是从疑似患有SARS-CoV-2感染的受试者获得的生物样品。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述生物样品是血液样品。
29.一种产生与SARS-CoV-2刺突蛋白的S1亚基结合的抗体的方法，所述方法包括：
(i)在允许与所述S1亚基结合的所述抗体表达的条件下培养根据权利要求17所述的宿主细胞；以及
(ii)从细胞培养物中采集如此产生的所述抗体。
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