KR20220144797A - 종양 면역-억제 인자에 대해 불응성인 조작된 모노클로날 항체의 조성물 및 용도 - Google Patents

종양 면역-억제 인자에 대해 불응성인 조작된 모노클로날 항체의 조성물 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20220144797A
KR20220144797A KR1020227026554A KR20227026554A KR20220144797A KR 20220144797 A KR20220144797 A KR 20220144797A KR 1020227026554 A KR1020227026554 A KR 1020227026554A KR 20227026554 A KR20227026554 A KR 20227026554A KR 20220144797 A KR20220144797 A KR 20220144797A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
ser
val
leu
thr
lys
Prior art date
Application number
KR1020227026554A
Other languages
English (en)
Inventor
니콜라스 씨. 니콜레이드스
루이지 그라쏘
제임스 브래드포드 클라인
Original Assignee
나브로겐 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 나브로겐 인코포레이티드 filed Critical 나브로겐 인코포레이티드
Publication of KR20220144797A publication Critical patent/KR20220144797A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2887—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD20
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0693—Tumour cells; Cancer cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5011—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing antineoplastic activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2300/00—Mixtures or combinations of active ingredients, wherein at least one active ingredient is fully defined in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

CA125/MUC16 단백질은 체액성 면역, 특히 항체의 서브세트에 대한 직접 결합을 통해 매개되는 항체-매개 체액성 면역의 억제자인 것으로 밝혀졌다. CA125 결합을 감소시켰거나 제거하였지만 부모 항체의 항원 특이성은 유지되는 항체 변이체를 생성할 수 있다. 이는 CA125가 상승된 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. CA125-불응성 항체가 개발되고 치료에 사용된다. 추가적으로, CA125의 존재 하에서 체액성 면역을 강화시키는 단백질이 체액성 면역의 억제에 대항하기 위해 사용될 수 있다.

Description

종양 면역-억제 인자에 대해 불응성인 조작된 모노클로날 항체의 조성물 및 용도
본 발명은 체액성 면역 및 체액성 면역 종양학 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 성장 및 다른 체액성 면역-억제 질환을 저해하는 데 있어서 항체-기반 치료 효능을 개선하기 위해 CA125/MUC16 단백질의 면역-억제 효과를 극복할 수 있는 제제(agent)의 방법 및 조성물에 관한 것이다.
체액성 면역은 척추동물 숙주 유기체가 이상조절되고(dysregulated) 형질전환된 숙주 세포를 감시하고 방어하는 주요 메카니즘이다. 암 생물학에서, 억제된 세포-매개 면역을 극복할 수 있는 면역 체크포인트 저해제가 종양의 서브세트에 대항해 활성화된 CD8+ T-세포 사멸을 촉발하는 데 있어서 강력한 효과를 입증했다(문헌[Hodi FS, et al. N Engl J Med 363:711-723, 2010]). 몇몇의 상업적으로 승인된 치료 항체가 체액-매개된 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 및 보체 의존 세포독성(CDC)을 통해 이들의 종양-사멸 효과를 나타내는 것으로 보고되었다(문헌[DiLillo DJ, Ravetech JV, Cancer Immunol Res 3:704-713, 2015]; 문헌[Ruck T, et al. Int J Mol Sci. 16:16414―16439, 2015]; 문헌[Pelaia C, et al. Biomed Res Int 4839230:1-9, 2018]). 최근의 번역 결과는 종양이 체액성 면역 경로를 억제할 수 있는 인자를 생성하여 차례로 ADCC 및 CDC를 통한 종양-사멸 효과를 억제하는 것으로 나타났다(문헌[Vergote I, et al. J Clin Oncol 34:2271-2278]; 문헌[Kline JB, et al. J Clin Oncol 5:15, 2018]; 문헌[Wang W et al. Cytogenet Genome Res 152:169-179, 2017]; 문헌[Kline JB et al. Eur J Immunol. 48:1872-1882, 2018]).
항체-매개 체액성 면역 반응은 결과적으로 세포 표면에 어느 정도 근접한 항원 에피토프 상에 항체를 위치시키는 항체-세포 표면 항원 결합의 조정에 의해 지배받는다. 일단 결합되면, 항체는 각각 자연 살해(NK) 또는 수지상/골수성/단핵구 세포 상 Fc-감마 활성 수용체 FCGR3A 및 FCGR2A와 결합하여(ADCC에 참여하는 임의의 세포는 여기에서 "면역-효과기 세포"로 지칭됨), ADCC를 개시할뿐 아니라 C1q 보체 개시 단백질과 결합하여 고전적 보체 CDC 경로를 통해 항체-결합된 세포의 표적 세포 사멸을 유도할 수 있다(문헌[Reuschenbach M, et al. Cancer Immunol Immunother 58:1535-1544, 2009]). 이러한 메카니즘은 이들로 국한되는 것은 아니나 리툭시맙, 트라스투주맙, 세툭시맙, 알렘투주맙뿐 아니라 다수의 실험 항체와 같은 치료 항체의 항-종양 효과에 있어서 핵심적인 것으로 드러났다(문헌[Zhou X, et al. Oncologist 13:954-966, 2008]; 문헌[Hsu YF, et al. Mol Cancer 9:-8, 2010]; 문헌[Spiridon CI, et al. Clin Cancer Res 8:1720-1730, 2002]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol 48:1872-1882, 2018]). 마찬가지로, 체액성 면역 반응은 면역-매개 표적 세포 사멸 활성뿐 아니라 항증식성이 있는 IgM 클래스의 항체를 주로 생성하는 무통성 질환을 지난 환자 및 백신에 대해 반응하여 이상조절 또는 형질전환된 세포를 표적으로 삼기 위해 환자 자신의 면역계 내에서 발생하는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Staff C, et al. J Clin Immunol 32:855-865]; 문헌[Branden S, et al. Cancer Res 63:7995-8005, 2003]). 그러나, 많은 암 환자들이 종양-발현된 항원에 대한 자가항체를 생성하는 것으로 밝혀져 있지만, 이들의 존재가 종양 세포에 의해 배치되어진 전반적인 항체 수준 및/또는 체액성 면역-억제 메카니즘으로 인해 종양 성장을 제어하기에 충분하지 않다.
여러 보고서에 따르면, 종양 생성 단백질 MUC16/CA125는 IgG1, IgG3 및 IgM 유형의 서브세트와의 직접적인 결합을 통해 체액성 면역 반응을 억제할 수 있고, 이는 결과적으로 Fc 영역 구조를 교란시켜, IgG1 및 IgG3 유형 항체가 면역-효과기 세포 상의 Fc-감마 활성화 수용체 FCGR2A(또한 CD32a로 지칭됨) 및 FCGR3A(또한 CD16a로 지칭됨)와 결합하는 것 및/또는 3가지 모든 항체 부류가 C1q를 비롯한 보체-매개 단백질과 결합하는 것을 덜 효과적으로 만드는 것으로 밝혀져 있다(문헌[Pantankar MS, et.al. Gyncol Oncol 99:704-713, 2005]; 문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. J. Clin. Oncol. 5:15, 2018]; 문헌[Wang W, et al. Cytogenet Genome Res 152:169-179, 2017]; 문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol. 48:1872-1882, 2018]). 약리학적 활성을 위한 면역-효과기 메카니즘에 의존하는 항-암 항체의 임상 연구는 혈청 CA125 수준의 상승과 임상 성과의 감소와의 연관성을 나타냈다. 특히, 이는 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종 환자에서 상업적으로 승인된 리툭시맙 항체의 임상 연구 경우에 보고되어 있다. CA125 수준이 정상 범위에 있을 때, 리툭시맙과 화학요법[CHOP(시클로포스파미드, 독소루비신(히드록시다우노마이신), 빈크리스틴(Oncovin®), 및 프레드니솔론)]으로 치료받은 소포 림프종 환자의 5년 무진행 생존율(PFS)은, 통계적으로 유의하게 더 나쁜 임상 결과를 보인 정상 범위 초과의 환자와 대조적으로 31.4% 개선되었다(문헌[Prochazka V, et al. Int J Hematol 96:58-64, 2012]). CA125/MUC16(본원에서 CA125로 지칭됨), 및 유사한 종양-생성 또는 종양-유도 단백질에 의해 매개되는 체액성 면역-억제가, 암 환자와 체액성 면역-억제가 그러한 단백질의 존재에 의해 활성인 다른 질환의 환자에 있어서 극복될 수 있는 도구 및 제제를 개발할 필요가 당업계에 지속적으로 존재한다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 암 환자 또는 염증성 질환 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 인간 C3B 또는 C4B 보체 단백질은 암 환자 또는 염증성 질환 환자에게 투여된다. 투여된 단백질은 리툭시맙과 같은 특정 치료 항체의 효과 또는 자가항체의 효과를 강화시킨다. 보체 단백질은 예를 들어 전장 인간 보체 프로단백질(proprotein) C3B 또는 C4B, 인간 보체 단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해(proteolytic) 단편, 또는 IgG에 결합할 수 있는 인간 보체 단백질 C3B 또는 C4B의 부분일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드가 제공된다. 상기 서열 내 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 상기 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환은, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드의 면역-억제 단백질과의 결합을, 상기 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환이 없는 단리된 단백질 또는 폴리펩티드의 결합에 비해, 감소시키거나 제거한다.
본 발명의 또다른 양태는 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 발현하는 질환이 있는 환자를 치료하는 방법이다. 단백질 또는 폴리펩티드가 환자에 투여된다. 단백질 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함한다. 서열 내 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 상기 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환은, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드의 면역-억제 단백질과의 결합을, 상기 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환이 없는 단리된 단백질 또는 폴리펩티드의 결합에 비해, 감소시키거나 제거한다.
본 발명의 또한 또다른 양태는 항체와의 결합에 대해 CA125를 발현하는 종양을 모니터링하는 방법이다. 환자로부터 단리된 체액 샘플은 인간 C3B 또는 C4B 보체 단백질과 그리고 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 단백질 또는 폴리펩티드와 접촉된다. 서열 내 1, 2 또는 3개의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환된다. 상기 1, 2 또는 3개의 아미노산 치환은, 단리된 단백질 또는 폴리펩티드의 면역-억제 단백질과의 결합을, 상기 1, 2, 또는 3개의 아미노산 치환이 없는 단리된 단백질 또는 폴리펩티드에 비해, 감소시키거나 제거한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 결합된 CA125가 검출된다.
또한 본 발명의 또 다른 양태는 항-CD20 항체 및 인간 보체 단백질 C3B 또는 C4B를 포함하는 조합물이다. 인간 보체 단백질의 형태는 예를 들어 전장 인간 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B, 인간 보체 단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편, 또는 IgG에 결합할 수 있는 인간 보체 단백질 C3B 또는 C4B의 부분일 수 있다. 조합은 투여 전에 용기에서 형성될 수 있다. 대안적으로, 각 성분은 생체 내에서 조합물이 형성되도록 일정 기간 내에서 개별적으로 투여될 수 있다. 전형적으로, 2개가 1주, 3일, 2일, 24시간, 12시간, 6시간, 3시간, 1시간 내에 투여된다.
본 발명의 한 양태는 면역억제를 극복하기 위해 CA125-면역억제 치료 항체와 조합되어 첨가/이용될 수 있는 인간 C3B(SEQ ID NO: 1) 또는 C4B(SEQ ID NO: 2)의 항체 결합 서열을 함유하는 전장 또는 단편을 포함하는 재조합 단백질(본원에서 인핸서 단백질로서 지칭됨)이다.
본 발명의 또 다른 양태는 성숙한 항체 또는 항체 항원-결합 단편 또는 Fab 도메인에 대한 CA125 결합을 결국 감소시키는 하나 이상의 코돈이 변형되어진 유전적으로 변형된 리툭시맙 단백질을 인코딩하는 핵산 벡터이다. 특히 항체 중쇄(SEQ ID NO: 3) 내 영역에 대한 변형이다. 여기에는 단일로 또는 아미노산 치환의 조합으로서 아미노산 AVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSAASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPP (SEQ ID NO: 3)을 변경하는 코돈이 포함되지만, 이로 국한되지 않는다. 핵산 벡터는, 유전적으로 변형된 단백질이 세포 내로 트랜스펙션될 때 핵산으로부터 발현되도록 다른 요소에 대해 적절한 위치에서 유전적으로 변형된 리툭시맙 단백질을 인코딩할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 109에서 N에서 D로, 코돈 131에서 P에서 S로, 및 코돈 136에서 S에서 Y로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 5)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 4)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 109에서 N에서 D로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 8)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 7)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 131에서 P에서 S로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 10)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 9)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 136에서 S에서 Y로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 12)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 11)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 109에서 N에서 D로, 및 코돈 131에서 P에서 S로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 14)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 13)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 109에서 N에서 D로, 및 코돈 136에서 S에서 Y로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 16)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 15)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 131에서 P에서 S로 및 코돈 136에서 S에서 Y로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 18)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 17)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 107에서 Y에서 C로, 및 코돈 122에서 A에서 T로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 20)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 19)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 107에서 Y에서 C로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 22)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 21)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 122에서 A에서 T로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 24)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 23)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 108에서 F에서 L로, 및 코돈 130에서 F에서 Y로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 26)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 25)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 108에서 F에서 L로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 28)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 27)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 130에서 F에서 Y로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 30)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 29)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 103에서 G에서 C로, 및 코돈 134에서 P에서 S로, 코돈 169에서 S에서 T로, 및 코돈 196에서 S에서 R로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 32)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 31)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 103에서 G에서 C로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 34)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 33)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 134에서 P에서 S로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 36)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 35)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 102에서 Y에서 F로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 38)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 37)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 코돈 167에서 L에서 Q로 아미노산이 변경된 전장 리툭시맙 중쇄(SEQ ID NO: 40)를 인코딩하는 핵산 벡터(SEQ ID NO: 39)이다. 중쇄는 재조합 세포 숙주에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동발현되어 완전히 기능하는 CD20-결합 항체를 생성할 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 발현하는 질환이 있는 환자를 치료하는 방법이다. 변이체 리툭시맙 항체(본원에서 RTX-MT로 지칭됨)가 환자에게 투여된다. 항체는 CD20+ 표적 세포에 결합하고, 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존 세포독성(CDC)과 같은 체액성 면역 반응을 유도하여 표적 세포를 사멸시킨다.
본 발명의 또 다른 양태는 인간 단백질 CA125 및 CD20을 발현하는 인간 암 세포주이다. 인간 암 세포주는 자연적으로 CD20을 발현하지 않는 인간 난소 암 세포주일 수 있다. 이것은 CD20을 인코딩하는 발현 벡터로 세포주 OVCAR3의 세포를 형질도입함으로써 제조될 수 있다. 다른 인간 암 세포주가, 체액성 면역-억제된 항체를 식별할 때 사용하기 위해 이러한 변형된 세포주를 제조하는 데 사용될 수 있다.
또한 또 다른 양태에서, 본 발명은 CD20에 결합하는 후보 항체를 스크리닝하는 방법이다. 후보 항체는 인간 단백질 CA125 및 CD20을 발현하는 인간 암 세포주와 접촉된다. 이어서, 후보 항체에 의해 개시된 인간 암 세포주의 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존 세포독성(CDC)이 결정된다.
또한 또 다른 본 발명의 양태는 환자에서 CA125를 발현하는 종양을 테스트하고 치료하는 방법이다. 환자로부터 단리된 체액 샘플(성분 (a))이 SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체(성분 (b))와 접촉된다. 성분 (a)는 또한, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함하고, 여기서 상기 서열 내의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환된 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드(성분 c)와 접촉되는데, 상기 1개, 2개 또는 3개의 치환된 아미노산 잔기는, 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환이 없는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드에 비해, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드의 면역-억제 단백질과의 결합을 감소시키거나 제거한다. 체액 샘플(성분 (a))에서 CA125가 성분 (b)에 결합하나 성분 (c)에는 결합하지 않는 것으로 결정되는 경우, 환자는 성분 (c)로 치료된다. 체액 샘플에서 CA125가 성분 (b) 및/또는 성분 (c)에 결합하는 것으로 결정되는 경우, 환자는 전장 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B, IgG에 결합할 수 있는 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편, 또는 IgG에 결합할 수 있는 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 부분으로 치료된다.
본 명세서를 판독할 때 당업자에게 명백할 본 발명의 이들 및 다른 양태는 암뿐만이 아니라 비종양 질환을 포함한 CA125 면역-억제된 질환에서 및 비-CA125 상승 질환 유형에서 항-CD20 항체-매개된 체액성 면역 반응을 개선하는 데 사용하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다.
도 1a 내지 도 1d. 영향받은(affected) 리툭시맙 항체(Ab)에 대한 CA125 결합을 차단할 수 있는 잠재적인 단백질을 식별하기 위한 스크리닝 방법. (도 1a) 영향받은 항체에 대한 CA125의 면역-억제 효과를 극복할 수 있는 잠재적인 인핸서 단백질의 스크리닝 방법의 개략도. (도 1b) CA125 결합을 차단하고 리툭시맙 효과기 활성의 CA125 면역-억제를 극복하는 인핸서 단백질의 식별. 간략히, 96-웰 ELISA 플레이트를, 15 KU/mL의 인간 CA125 또는 1-10 μg/mL의 인간 혈청 알부민(HSA)와 함께 또는 없이 1-5 μg/mL의 리툭시맙으로 코팅하고, 이전에 기술된 바와 같이 1-2.5 μg/mL의 비오틴화(biotinylation) 인간 C1q 단백질로 프로빙하였다(문헌[Kline JB, et al. Eur J Immunol. 48:1872-1882, 2018]). 도시된 바와 같이, CA125는 리툭시맙 단독 또는 HSA의 존재 하에서 인큐베이션할 때와 대조적으로 리툭시맙에 대한 C1q 결합을 감소시켰다. 다음으로, IgG1 항체에 결합하는 것으로 이전에 보고되어있던 다수의 단백질을 이용하여 임의의 단백질이 C1q 결합의 CA125 억제를 극복할 수 있는지 여부를 결정하였다. 도 1c에 도시된 바와 같이, 인간 보체 단백질 C4B(SEQ ID NO: 2)가 테스트된 다른 것(나타내지 않음)과 대조적으로 CA125의 저해 효과를 차단할 수 있었다. 마찬가지로, C3B(SEQ ID NO: 1)는 유사한 효과를 지녔다. 이 효과가 면역-효과기 기능을 회복할 수 있는지 결정하기 위해, C4B 단백질을, 리툭시맙 및 Daudi 세포를 이용한 보체 의존 세포독성(CDC) 어세이에서 이용하여 이전에 기술된 바와 같이 CDC 어세이에서 C4B 활성을 테스트하였다(문헌[Kline JB et al. Eur J Immunol. 48:1872-1882, 2018]). 간략히, 5,000개의 Daudi 세포를 2.5 μg/mL 리툭시맙 단독, 15 KU/mL CA125 또는 10 μg/mL HSA과 함께, 5 μg/mL C4B의 유무 하에 인큐베이션하였다. 다음으로, 1000 유닛의 토끼 보체(Bio-Rad)를 각 웰에 첨가하고, 배양물을 1.5시간 동안 인큐베이션한 다음 Cell Titer-Glo(Promega)를 이용하여 세포 생존에 대해 정량화하고, 제조업체 권장 사항에 따라 Varioskan 발광 플레이트 판독기 상에서 정량화했다. 신호 강도는 CDC 사멸 후 살아있는 세포를 나타낸다. (도 1c) CA125는 리툭시맙-매개된 CDC 활성에서 유의미한 억제를 지녔다(P < 0.00015). C4B의 첨가는 CA125 억제를 유의미하게 극복할 수 있었다(P = 0.00004). C3B(SEQ ID NO; 1) 단백질로 유사한 효과가 관찰되었다. 이들 데이터는 C3B 및/또는 C4B 단백질이 CA125 면역-억제 효과를 역전시키고 인핸서 단백질로서 작용하는 데 사용될 수 있다는 증거를 제공한다. (도 1d) RTX-WT에 결합하는 CA125에 대한 C3B의 경쟁이 도시된다; 방법은 도 1b에 대해 설명된 바와 동일하다.
도 2a 및 도 2b. C3B/C4B 인핸서 단백질은 리툭시맙에 대한 CA125 결합을 차단함으로써 CA125 면역-억제를 극복한다. C4B가 CA125에 의한 리툭시맙 면역 억제를 구출하는 메커니즘을 밝히기 위해, ELISA 어세이를 이용해 CA125-리툭시맙 결합을 모니터링하였다. 간단히 말하면, 96-웰 ELISA 플레이트를 음성 대조군으로서 사용된 15 KU/mL의 가용성 CA125 또는 인간 혈청 알부민(HSA)으로 코팅하고, 5 μg/mL C4B의 유무 하에 2.5 μg/mL의 비오틴화 리툭시맙으로 프로빙하여 CA125 결합에 대해 테스트하였다. 프로빙 후, 웰을 세척하고, 스트렙타비딘-HRP(서양 고추냉이 과산화효소; Jackson Immunologicals)으로 2차 프로빙하고, 비색 TMB(3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘) 기질(Pierce)을 이용하여 정량화하였다. 반응을 0.1 N H2SO4을 이용하여 중단시키고, 웰은 450 nm에서 Varioskan 플레이트 판독기를 이용하여 정량화하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, C4B는 CA125에 대한 리툭시맙 결합을 유의미하게 차단할 수 있다(P = 0.000017). 실험은 최소 삼중 웰을 나타낸다. C4B 단백질은 IgG1-유형 항체의 상보성 결정 영역 3(CDR3)과 프레임워크 4(FW4) 사이의 영역에 결합하는 것으로 밝혀져 있으며, 이는 이것의 CA125 결합에 대한 경쟁이 상기 영역 내에 있을 수 있음을 시사한다. CA125 결합이 경쇄, 중쇄 또는 양쪽 면역글로불린 사슬 모두에서 발생하는지 확인하기 위해, CA125 비영향(unaffected) 항체 퍼투주맙(PTZ)으로부터의 경쇄 및 중쇄를 이용하여 키메라 리툭시맙(RTX) 항체를 생성하고(문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060]), 이어서 CA125 결합에 대해 각각을 테스트하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 리툭시맙 중쇄(RTX-hc/PTZ-lc) 키메라는 여전히 CA125에 유의미하게 결합할 수 있고(P < 0.0009), 이는 CA125가 CDR3-FW4 영역 내에서 리툭시맙 중쇄에 결합함을 시사한다. CA125 결합이 리툭시맙 경쇄(PTZ-hc/RTX-lc) 키메라로는 관찰되지 않았다. C4B의 경우와 유사한 방법을 이용하여, C3B 단백질(SEQ ID NO: 1)은 CA125에 대한 리툭시맙 결합과 경쟁하였고(P < 0.0001), Fab 결합 단백질 L이 경쟁적으로 억제하지 않았기 때문에 특이적인 것으로 나타났으며(도 1d 참조), 이는 CA125 결합이 리툭시맙 Fab 도메인 내에 위치되고, C3B/C4B 단백질이 CA125 면역-억제 효과를 역전시키고 인핸서 단백질로서 작용하는 데 사용될 수 있다는 발견을 뒷받침한다.
도 3a 및 도 3b. CA125 결합이 감소된 리툭시맙 변이체의 생성. (도 3a) CDR3-FW4 및 CH1 영역 내 하나 이상의 잔기(SEQ ID NO: 3)가 CA125 결합에 요구되는지 여부를 확인하기 위해, CDR3-FW4 영역의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 50)과 상보적인 프라이머(SEQ ID NO: 48 및 49)을 이용한 PCR 생성물의 무작위 돌연변이유발을 통해 CDR3-FW4를 인코딩하는 잔기들 사이에 리툭시맙 중쇄 변이체의 라이브러리를 생성했다. 재조합 중쇄를 이어서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 공동-트랜스펙션하고, 96-웰 플레이트 내 HEK293 세포에서 일시적으로 발현시켰다. 배양 상청액을, 프로브로서 마우스 항-인간 IgG-HRP 항체를 이용한 ELISA를 통해 항체 생성에 대해 스크리닝하였다. 이어서 양성 클론 상청액을 ELISA를 이용하여 CD20 결합에 대해 테스트하였고, 여기서 리툭시맙-결합 펩티드 Rp1-L(문헌[Favoino et al., Int J Mol Sci. 20:1920, 2019])을 이용하여 웰을 코팅하고, 리툭시맙 돌연변이체(RTX-MT)로 프로빙하고, 마우스 항-인간 IgG-HRP로 이차적으로 프로빙하고, 상술된 바와 같이 TMB 기질을 이용하여 정량화하였다. 이어서, 부모 리툭시맙 항체(RTX-WT)와 마찬가지로 또는 더 우수하게 CD20에 결합하는 클론을 상술한 바와 같이 ELISA를 통해 CA125 결합에 대해 테스트하였다. CD20에 결합하고 CA125 결합이 감소된 것으로 보이는 다수의 클론을 동정하였다. 이들 클론의 서열을 정렬하여 통상 돌연변이된 아미노산을 확인하였다(도 3b). 이들 클론의 서브세트를 이어서 확장하여 정제된 항체를 생성하고 CD20 및 CA125 결합에 대해 다시 테스트하였다.
도 4. 무작위 라이브러리 일차 스크린으로부터 동정된 가장 강한 CD20 결합 및 가장 감소된 CA125 결합을 가진 돌연변이체 리툭시맙(RTX-MT) 클론을 선택하고 추가로 분석하였다. 이들 항체 각각을 비오틴화하고 ELISA를 통해 CD20 및 CA125 결합에 대해 다시 테스트하였다. 간략히 말하면, 항체를 제조업체 지침에 따라 EZ-Link™ Sulfo-NHS-Biotin(ThermoScientific)을 이용하여 비오틴화하였다. 비오틴화 항체는 Nanodrop에 의해 정량화되고 항-IgG ELISA 포획 어세이를 이용하여 신호 강도에 대해 검증하여 각 항체에 대한 신호 강도가 측정되었다. CD20 및 CA125 결합을 다시 테스트하기 위해, 96-웰 플레이트를 10 μg/mL의 리툭시맙-결합 펩티드 또는 15 KU/mL의 CA125로 코팅하고, 각 비오틴화 RTX-MT 항체 또는 부모 항체(RTX-MT)를 이용하여 삼중으로 프로빙하였다. 웰을 세척한 다음 스트렙타비딘-HRP로 이차 프로빙하고, 상술된 바와 같이 TMB 기질을 이용하여 450 nm에서 Varioskan 플레이트 판독기 상에서 정량화하였다. CD20 대 CA125 결합의 비율이 부모 및 RTX-MT 클론의 경우에서 비교되었고, CA125 결합의 감소 백분율을 계산하였다. CA125에서 20% 감소보다 더 큰 임의의 신호는 양성으로 간주되었다. 이들 기준 5개의 클론을 이용하여, 야생형 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)를 발현하는 모든 클론을 추가 분석을 위해 선택했다. 클론 148(SEQ ID NO: 37 및 38); 클론 164(SEQ ID NO: 31 및 32); 클론 166(SEQ ID NO: 4 및 5); 클론 198(SEQ ID NO: 19 및 20) 및 클론 199(SEQ ID NO: 25 및 26).
도 5. 도 4에 기술된 바와 같은 선택된 RTX-MT 항체는 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 및 CDC 기능 스크린에서 테스트되었다. 인간 CD20-발현 Daudi 세포가 두 어세이 모두에 이용되었다. CDC는 상술된 바와 같이 수행되었다. ADCC 활성은 이전에 기술된 바와 같은 방법을 이용하여 측정되었다(문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060]). 도시된 바와 같이, CA125는 부모 항체에 대한 CDC 활성의 유의미한 억제를 지닌 반면(32% 감소; P = 0.001), 여기서 테스트된 모든 RTX-MT 클론은 CA125 면역-억제에 대해 보다 불응성인 것으로 밝혀졌다(< 15% CDC 억제; P < 0.01). 유사한 효과가 ADCC에 대해 관찰되었다. 특히, 클론 164, 166 및 198이 부모 항체보다 CA125 면역-억제에 대략 3 내지 4배 더 불응성이었고, 다른 클론도 또한 그 정도가 덜하지만 더 불응성인 것으로 밝혀졌다. 모든 경우에서, 이들 클론은 영향받은 도메인에서 여러 돌연변이를 가졌다. 1 또는 2개의 아미노산이 CA125 면역-억제를 극복하기에 충분한지 여부를 결정하기 위해, 단일 또는 이중 돌연변이 클론을 각 클론으로부터 생성하고, CA125 결합 및 면역-효과기 기능에 대해 다시 테스트하였다.
도 6a 및 도 6b. 영향받은 도메인 내 단일 및 이중 돌연변이는 CA125 결합을 감소시키고, CA125 불응성 리툭시맙 항체를 생성하기에 충분하다. 클론 148, 164, 166, 198 및 199로부터 유래된 단일 및 이중 RTX-MT 항체를 CD20 및 CA125 ELISA 결합 어세이(도 6a)뿐 아니라 CD16a 및 C1q 결합 어세이에 이용하여 단일 또는 이중 돌연변이가 CA125 결합 및 면역-억제를 감소시키기에 충분한지 결정하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, 클론 112-134 (SEQ ID NO: 13 및 14, 코돈 109에서 N에서 D로 및 코돈 131에서 P에서 S로의 아미노산 변경), 클론 133(SEQ ID NO: 29 및 30, 코돈 130에서 F에서 Y로의 아미노산 변경), 클론 106(SEQ ID NO: 33 및 34, 코돈 103에서 G에서 C로의 아미노산 변경), 및 클론 137(SEQ ID NO: 35 및 36, 코돈 134에서 P에서 S로의 아미노산 변경)은 CA125에 대한 결합이 가장 유의미하게 감소되었고(P < 0.0055), 이것들은 부모 항체와 같이 CD20 결합을 유지하였다. 2개의 가장 불응성인 클론, 112-134 및 133이 CD16a-비오틴 및 C1q-비오틴 결합 어세이에 이용되었다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 클론 112-134 및 133은 각각 CD16a-비오틴 결합에서 75% 및 62.5% 개선되었고, 둘 모두 부모 항체에 비해 C1q-비오틴 결합에서 70% 개선이 있었다.
도 7a 내지 도 7d. RTX-MT 클론 166 변이체 돌연변이의 특성화. 단일 또는 이중 돌연변이 N109D, P131S, S136Y, N109D+P131S, N109D+S136Y, P131S+S136Y뿐 아니라 삼중 돌연변이체 RTX-MT 클론 166(N109D+P131S+S136Y)을 CA125의 존재 하에서 Fc 수용체 결합에 대해 비교하였다(도 7a). 데이터는 CA125가 없는 결합(no CA125) 대비 CA125가 있는 결합의 백분율로서 플롯팅된다. 도시된 바와 같이, 적어도 N109D 돌연변이를 보유하는 RTX-MT는 CA125의 존재 하에서 부모 RTX와 비교하여 CD16a Fc 수용체에 대한 더 높은 결합을 가졌다. 단일 돌연변이체 RTX-MT N109D, P131S, 및 S136Y를 CA125의 존재 하에서 C1q 결합에 대해 비교하였다(도 7b). 데이터는 CA125가 없는 결합 대비 CA125가 있는 결합의 퍼센트로서 플롯팅된다. RTX-MT N109D는 CA125에 의해 영향을 가장 덜 받아, 부모 리툭시맙(RTX)의 경우 <65%인 것에 비해 ~90%의 C1q 결합을 유지하는 것으로 밝혀졌다. CD20 리툭시맙-결합 펩티드에 대한 항체 결합을, ELISA 어세이를 이용하여 측정하여 CD20 결합이 N109D 돌연변이에 의해 영향받는지 여부를 확인하였다(도 7c). 도시된 바와 같이, RTX-MT N109D CD20 결합은 부모 리툭시맙(RTX)과 비슷하였다(P > 0.21). RTX-MT N109D에 대한 CA125 결합의 ELISA 분석은 이것이 부모 리툭시맙(RTX)과 비교할 때 유의미하게 감소되었음을 보여주었다(50% 감소, P < 0.00009)(도 7d). 각 실험에서 유사한 양의 항체를 사용하였는지 보장하기 위해, ELISA 어세이에 항체 입력 양을 포획하기 위해 항-인간 IgG 코팅된 웰이 포함되었다. 도 7c 및 도 7d에 도시된 바와 같이, 각 항체 입력 양은 유사하였다(사각형 마커의 라인). 모든 실험에서, 퍼투주맙(PTZ)을 음성 대조군으로서 이용하였다. 스튜던트 T-테스트를 이용한 대표적인 P 값은 * < 0.05, ** < 0.01, *** < 0.001, **** < 0.0001이다.
도 8a 내지 도 8d. RTX N109D CD20 결합의 특성화. 부모 리툭시맙(RTX WT) 및 RTX N109D를 AlexaFluor 488 염료에 직접 컨쥬게이션하고 0.78 내지 100 nM 범위의 농도로 살아있는 CD20 발현(Ramos) 및 CD20 null(Jurkat) 세포를 염색하는 데 사용하였다. 도 8a 및 도 8b는 각각 두 항체의 CD20-양성 세포와의 특이적 결합을 보여주나 CD20-null 세포와는 그렇지 않다. 도 8c 및 도 8d는 1-부위 포화 결합의 비선형 회귀 분석을 이용하여 평형에서 수용체 부위의 절반에 결합된 항체의 농도로서 결합 친화도(Kd)의 외삽을 보여주었다.
도 9a 및 도 9b. RTX N109D 대 부모 리툭시맙(RTX)에 의한 보체-매개 사멸(CDC)의 비교. CA125를 발현하는 CD20-양성 세포를, 보체의 존재 하에서 각 항체로 표적화하였다(도 8a). 도시된 바와 같이, RTX N109D는 부모 리툭시맙과 비교하여 CA125-양성 세포에 대항해 우수한 CDC 활성을 지녔다. CDC 효과가 특이적임을 입증하기 위해, CA125를 발현하는 CD20-양성 및 CD20-음성 세포를 RTX N109D CDC 활성에 대해 테스트하였다(도 9b). 도시된 바와 같이, RTX N109D CDC 사멸은 CD20-발현 세포에 대해 특이적이었다. 스튜던트 T-테스트를 이용한 대표적인 P 값은 * < 0.05, ** < 0.01, *** < 0.001, **** < 0.0001이다.
도 10a 내지 도 10c. RTX-MT N109D 및 부모 리툭시맙(RTX)에 의한 Fc-감마 수용체 CD16a 활성에 대한 CA125 면역-억제의 비교. ELISA 결합 어세이는 RTX-MT N109D가 부모 리툭시맙(< 60%, P < 0.0001)과 비교해 CA125 억제된 CD16a 수용체 결합에 대해 불응성(> 90% Fc 수용체 결합)임을 보여준다(도 10a). Jurkat CD16a 수용체 어세이는, RTX-MT N109D가 부모 리툭시맙과 비교해 CA125 억제된 CD16a 수용체 활성화(P < 0.0001)에 대해 불응성임을 보여준다(도 10b). 일차 인간 PBMC 및 Daudi 표적 세포를 이용한 ADCC 검정은 RTX MT N109D가 CA125 억제된 ADCC에 대해 불응성임을 보여준다(P < 0.01)(도 10c). 스튜던트 T-테스트를 이용한 대표적인 P 값은 * <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001이다.
본 발명자들은 CA125의 리툭시맙에 대한 결합을 차단할 수 있는 제제(인핸서 단백질로서 지칭됨)를 발견하였다. 이것들은 CA125 결합 및 그의 면역억제 활성에 중요한 리툭시맙 항체 내 영역을 맵핑하는데 사용되었다. 더욱이, CA125의 체액성 면역억제 효과에 불응성인 변형된 항체 단백질을 생성하기 위해 CA125 결합에 있어서 중요한 리툭시맙 항체의 특정 영역 내에서 유전 공학을 이용하였다. 이것들은 CA125 수준이 정상 범위 내에 있는 환자뿐 아니라 CA125가 상승된 암을 포함한 질환에서 CD20+ 세포를 치료하는 데 이용될 수 있다.
본 발명자들은 CA125와 결합하는 것으로 보이는 IgG1-유형 항체의 영역(영향받은 도메인) 내에서 잔기를 변형시켰고; 상기 변형된 잔기가 CA125-면역억제된 항체를 CA125 면역-억제에 불응성으로 만든다. 이들 CA125-불응성 항체는 잠재적으로 CA125 단백질에 의한 체액성 면역-억제를 극복할 수 있다. 이것들은 암뿐 아니라 다른 CA125 면역-억제 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 임의의 특정 이론 또는 작용 메카니즘에 제한되기를 원하지 않지만, 본 출원인은 CA125 단백질이 특정 항체의 특정 잔기와 결합하고 보통 면역-효과기 세포 및/또는 보체에 의해 매개되는 항체-매개 체액성 면역 반응을 파괴한다고 생각한다. 이러한 파괴는 C1q-항체(고전적인 항체-보체) 복합체 및/또는 NK 및 골수 세포와 같은, 그러나 이로 제한되는 것은 아닌 면역-효과기 세포 상 Fc-감마 활성화 수용체와의 항체 결합의 억제를 포함하고; 이들 파괴로 각각 보체 의존 세포독성(CDC) 및 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC)의 다운스트림 저해가 초래된다.
본원에서 기재된 방법은 체액성 면역-억제를 극복하기 위해 추가적인 CA125-불응성 항체(CD20-표적화 항체인지 아닌지 간에)를 개발하는데 사용될 수 있다. 영향받은 부모 항체에 부정적으로 영향을 미치는 ADCC 및/또는 CDC를 포함한 체액성 면역 반응에 대한 CA125의 저해 효과(들)를 회피할 수 있는 변형된 항체는 전임 및 인간 테스트에 사용될 수 있다.
본원에서 기재된 방법 및 조성물은 적어도 두 카테고리로 나뉠 수 있다. 하나의 카테고리에서, CA125의 존재 하에서 부모 항체와 비교하여, Fc-감마 활성화 수용체 CD16a 또는 CD32a, 또는 C1q 보체 단백질의 RTX-MT 항체에 대한 결합을 모니터링하는 분자 어세이를 이용하여 측정되는 바 ADCC 및/또는 CDC에 대한 CA125 억제를 극복하는 데 있어서 최대 효과를 결정하기 위해 (RTX-MT로 지칭되는) 하나 이상의 아미노산 변경을 함유하는 변형된 중쇄가 테스트된다. 또 다른 카테고리에서, C3B(SEQ ID: 1) 또는 C4B 단백질(SEQ ID: 2)이, 세포 생존력 어세이를 이용하여 결정되는 바 ADCC 및/또는 CDC에 대한 CA125 억제를 극복하는 데 있어서 최대 효과를 결정하기 위해, 부모 또는 RTX-MT 항체와 조합되어 테스트된다. 항체가 CA125를 발현하는 CD20 항원-양성 표적 세포에, 또는 외인적으로 CA125를 비-CA125 발현 세포에 C3B 또는 C4B 단백질과 함께 첨가될 수 있고, 면역 효과기 세포(NK, 수지상/골수형/단핵구 세포, 말초 혈액 단핵 세포 또는 ADCC 수용체 세포주)의 첨가에 의해ADCC 활성이 측정될 수 있다. 대안적으로, 인간 또는 토끼 보체가 CDC 활성을 모니터링하는 데 사용될 수 있다. 어느 어세이에서든, 세포 생존력이 C3B 또는 C4B 단백질의 존재 또는 부재 하 부모 항체 대 RTX-MT 항체로 처리된 세포들 사이에서 비교되어, RTX-MT 및/또는 C3B 또는 C4B의 조합물이 CA125-매개된 체액성 면역 억제를 유의미하게 차단할 수 있는지 결정된다. CA125는 표적 세포로부터 생성될 수 있거나, 세포 배양물에 외인적으로 첨가될 수 있다. 세포 생존력은 당업자가 사용한 각종 방법들을 활용하여 결정될 수 있다.
치료적 적용을 위해, C3B 또는 C4B 단백질이 다른 진료 표준(standard-of-care) 제제와 함께 또는 없이 부모 RTX-WT 또는 RTX-MT 항체와 조합되어 투여될 수 있다. 이것들은 리툭시맙 항체의 투여 이전, 동안 또는 이후에 투여될 수 있다.
조성물이 방법을 수행하는 과정에서 형성될 수 있다. 조성물은 리툭시맙 중쇄 돌연변이체 라이브러리 스크린으로부터 식별된 RTX(SEQ ID NO: 3)의 영향받은 도메인 내 변경된 아미노산과 단백질의 조합물 또는 예를 들어 부모 RTX-WT 또는 RTX-MT 항체에 첨가되어 면역-효과기 활성을 증강시킬 수 있는 기타 인핸서 단백질의 조합물일 수 있다. 본원에서 기재된 항체 및/또는 인핸서 단백질(즉, C3B 및 C4B 단백질의 항체 결합 도메인을 함유하는 단백질)의 임의의 선택이 투여 이전 또는 이후에 조성물로서 형성될 수 있다.
CA125 면역-억제에 민감한 몇몇의 항체가 공지되어 있지만, 본원에 기재된 바와 같이 SEQ ID NO: 3에 나타낸 RTX의 영향받은 도메인을 변형하는 것에 의한 조성물을 개발하는 방법이, CA125에 의해 동적 구조가 변경되어 억제된 체액성 면역 반응이 초래되는 임의의 항체의 경우에 유용하다.
항체 또는 단백질의 "동적 구조"는 주어진 시점에서의 항체의 3차원 구조로, 여기서 상기 시점은 항체의 또 다른 단백질 또는 제제와의 결합할 때와 일치하고, 이 시점 이전의 항체의 구조는 다른 단백질 또는 제제와 항체의 결합에 반응해 이 시점 이후 다른 구조로 변화되어진다. C3B 및 C4B와 같은 인핸서 단백질의 존재 하에서 이러한 변화가 모니터링될 수 있다. 상기 단백질의 항체에 대한 결합 및 이것의 동적 구조에 영향을 미치는 효과는 항체의 CDR 도메인에 대한 합텐 결합의 경우에 보고되어 있으며, 이는 결국 이들의 Fc 도메인을 알로스테릭하게 변경시켜, Fc 수용체를 포함하는 Fc 결합 단백질과의 Fc 도메인의 결합을 감소시킨다(문헌[Janda A, et al. Front Microbiol 7:22, 2016]). 이전 연구에서 또한 항체가 이의 항원에 결합될 때 (FAB')2 도메인의 동적 구조가 영향을 받는다는 것을 밝혀냈다(문헌[Werner TC, et al. Proc Natl Acad Sci 69:795-799, 1972]). 최근, Kline 등은 여러 인간화 모노클로날 IgG1-유형 항체가 유사한 아미노산 구조를 갖지만, 이에 결합하는 CA125의 능력에 있어서는 상당한 차이가 존재한다고 보고했다(문헌[Kline JB et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]).
종양이 숙주 면역 방어를 회피하기 위해 다양한 경로를 활용한다는 증거가 늘어나고, 염증성 및 감염성 질환뿐 아니라 다양한 암 유형에 대항하는 항체-기반 접근법이 계속해서 추구되고 있다는 사실에 비추어 볼 때, 영향받은 항체의 체액성 면역-억제를 극복할 수 있는 방법들을 정의하도록 변형될 수 있는 영향받은 항체 내의 영역뿐 아니라 C3B 및 C4B와 같은 제제를 식별하는 것이 중요하다. 이들 제제 또는 변형된 항체 조성물 및 방법은 결국 CA125에 의한 면역 억제를 극복할 수 있고 환자 스크리닝에 유용할 수 있는 단서 항체의 선별을 가능하게 한다. 예를 들어, 테스트 항체가 CA125에 의해 영향받는 것으로 밝혀지면, CD20-양성 암 환자를 사전 스크리닝하여, CA125가 상승했는지 여부를 확인할 수 있다. 그런 환자의 경우에서는, 체액 반응에 대한 CA125의 저해 작용을 극복할 수 있는 최적화된 RTX-MT를 이용할 수 있다. 대안적으로, 종양 세포 사멸을 향상시키기 위해 부모 RTX-WT 또는 RTX-MT 항체와 함께 C3B 또는 C4B와 같은 인핸서 단백질을 이용할 수 있다.
항체 동적 구조에 영향을 미치고 세포 표면 표적 항원에 결합시 다운스트림 면역-효과기 기능(들)을 억제할 수 있는 CA125의 존재 하 항-CD20 항체의 동적 구조를 스크리닝하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 방법은 SEQ ID NO: 3 내 포함된 영향받은 도메인의 무작위 돌연변이유발을 통해 리툭시맙 부모 항체로부터 변형된 중쇄를 제조하고, 이것들을 리툭시맙 면역글로불린 경쇄(SEQ ID NO: 6)를 또한 발현하는 세포주에서 발현시키고, 감소된 CA125 결합 또는 ADCC 또는 CDC 면역-효과기 활성을 가진 단백질을 동정하기 위해 스크리닝하는 단계를 포함한다. 추가적으로, 부모 리툭시맙은 다른 단백질과 함께 스크리닝되어 그의 면역-효과기 활성을 CA125의 존재 하에서 향상시킬 수 있는 단백질 또는 기타 제제를 식별할 수 있다. 도 1a-1d는 CA125의 존재 하에서 리툭시맙과 단백질을 조합하여 부모 항체에 대한 CA125 결합을 차단할 수 있고/있거나 그의 ADCC 또는 CDC 활성을 향상시킬 수 있는 것을 식별하는 예를 제공한다.
일 구현예에서, CA125를 자연적으로 발현하는 인간 난소 암 세포가 인간 CD20 인코딩 발현 구축물로 형질도입되어, CD20 표적화 항체의 CA125 면역-억제에 대해 스크리닝하는 데 사용될 수 있는 CA125-양성 및 CD20-양성 세포를 개발한다. 다른 암 세포 유형이 세포주, 특히 난소암 세포와 같은 상피 세포에서 유래된 암을 만드는 데 사용될 수 있다. 일단 그러한 세포주는 OVCAR이다.
일부 구현예에서, RTX-MT는 영향받은 도메인(SEQ ID NO: 3) 내 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하고, ADCC 또는 CDC의 CA125 체액성 면역 억제를 극복하는 RTX-MT 항체의 능력에 대해 테스트된다.
CA125 체액성 면역-억제를 극복하는 데 효과적인 RTX-MT 항체 단독, 또는 부모 또는 RTX-MT 항체와 조합된 인핸서 단백질의 능력을 측정하는 한 방법에서, 항체는 CA125 직접 결합, 및/또는 ELISA 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 통해 CA125의 존재 하에서 CD16a 또는 C1q 단백질의 결합 능력에 대해 테스트된다.
일부 구현예에서, ADCC 또는 CDC를 이용하여 CA125에 의한 체액성 면역 억제를 극복하는 것에 대한 RTX-MT의 효과를 측정하는 데 기능적 방법이 사용된다. 용어 "효과"는 일반적으로 제제가 단독의 시험 항체와 인큐베이션될 때 CA125가 있는 항체와 비교시 ADCC 또는 CDC 표적 세포 사멸에 있어서 10% 이상의 변화를 지칭한다. 이것은 사용된 제제 및 항체에 따라 또한 적어도 5 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 또는 75 %의 변화를 나타낼 수 있다.
동봉된 설명의 양태들과 관련된 다양한 용어 및 전문 용어가 이 문헌의 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐 사용된다. 이러한 용어는 달리 구체적으로 표시되지 않는 한 해당 기술 분야에서 이들의 통상적인 의미로 주어져야 한다. 기타 구체적으로 정의된 용어는 제공된 정의와 일치하는 방식으로 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 또한 내용이 달리 명확하게 명시되지 않는 한 복수의 언급도 포함한다. 예를 들어, "세포"는 둘 이상의 세포들의 조합 등을 포함할 수 있다. "프로브"에 대한 언급은 당업자에 의해 공지된 임의의 분석 방법을 통해 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 테스트 항체, 인핸서 단백질 또는 독립적인 프로브를 포함할 수 있다.
양, 기간 등과 같은 정량화된 값을 언급할 때 사용되는 용어 "약"은 개시된 방법을 수행하기에 적절한, 특정 값에서 ±9% 이하의 변동을 포괄하도록 의도된다. 달리 지시되지 않는 한, 명세서 및 청구범위에서 사용된 분자량, 몰 농도, 반응 조건, 백분율 등과 같은 시약의 양을 표현하는 모든 값은 모든 경우에서 용어 "약"에 의해 정량화되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 지시되지 않는 한, 하기의 명세서 및 열거된 청구범위에서 기재된 수치값은 본 발명에 의해 수득되고자 하는 조성물 제제 및/또는 방법의 원하는 특성에 따라 좌우될 수 있는 근사치이다. 최소한, 적용 범위를 제한하려는 시도가 아닌, 각 수치값은 적어도 보고된 유효 숫자에 의해 그리고 당업자에게 공지된 통상적인 반올림 방법에 의해 평가되어야 한다.
본원에서 이용된 용어 "항체"는 넓은 의미로 의도되고, 면역글로불린(또한 "Ig"로 지칭됨) 또는 항체 분자, 예컨대 폴리클로날 항체(또한 pAb로 지칭됨), 모노클로날 항체(또한 mAb로 지칭됨), 예컨대 뮤린, 인간, 인간화 및 키메라 mAb, 이중특이적 항체(또한 BSP로 지칭됨) 및 항체 단편을 포함한다. 일반적으로, 항체는 특정 항원에 결합하는 단백질 또는 폴리펩티드 사슬이다. 항원은 주어진 항체에 의해 특이적으로 인식되는 구조이다. 표준 항체는 디술파이드 및 수소 결합의 복합체를 통해 늘어선 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄로 구성된 글리코실화 단백질의 헤테로-테트라머를 포함한다. 용어 "이의 디술파이드 가교"는 당업자에 의해 통상 공지되어 있는, 중쇄 힌지 영역 내 함유된 디술파이드 가교를 지칭한다. 각 중쇄는 가변 도메인(가변 영역)(VH) 다음 다수의 불변 도메인(또한 Fc 도메인으로 지칭됨)을 가진다. 각 경쇄는 가변 도메인(VL) 및 불변 도메인을 갖고; 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고 경쇄 VL은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 임의의 종의 항체 경쇄는 불변 도메인 내 아미노산 서열을 기반으로 한 2가지 독특한 유형 중 하나, 즉 카파(κ) 및 람다(λ)로 지정된다.
면역글로불린은 Fc 도메인의 유형에 따라 클래스 또는 이소타입, 즉 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM으로 분류되며, 이는 중쇄 불변 도메인 내 포함된 서열에 따라 좌우된다. IgA 및 IgG 이소타입은 이소타입 IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4과 같은 서브클래스로 추가로 구성된다.
면역글로불린 VL 또는 VH 영역은 보고된 서열 가변성을 기반으로 상보성 결정 영역(CDR)로서도 지칭되는 3개의 "항원 결합 부위"에 의해 중단된 "프레임워크"(FW) 영역으로 이루어진다(문헌[Wu TT, Kabat EA. J Exp Med 132:211-250, 1970]). 일반적으로, 항원-결합 부위는 중쇄 내에 위치된 3개(CDRH1, CDRH2, CDRH3) 및 경쇄 가변 도메인 내 3개(CDRL1, CDRL2, CDRL3)가 있는 6개의 CDR로 이루어진다(문헌[Kabat EA, et al. 5th Ed. PHS, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991]).
"특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란, 다른 항원에 대한 것보다 더 큰 친화도로 항원(항체 자체 내 포함된 서열 포함)에 대한 항체 또는 항원-결합 단편의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 특정 항체 또는 항원-결합 단편은 약 5x10-8 M 이하의 평형 해리 상수 KD로 표적 항원에 결합한다.
용어 "항체 동적 구조"는 항체 체액 기능에 영향을 미칠 수 있는 구조의 임의의 변화를 의미한다(즉, Fc 수용체 또는 C1q 결합 등).
용어 "모노클로날 항체(mAb)"는 이것을 생산하는 방법이 아닌 임의의 진핵 또는 원핵 세포 클론 또는 파아지 클론을 포함하는 단일 세포 클론으로부터 유래된 항체를 지칭한다. 따라서, 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 국한되는 것이 아니라 재조합 방법을 또한 포함할 수 있다.
"Fab 도메인"은 당업자에게 공지된 N-말단부터 항체 힌지 디술파이드 영역의 임의의 항체 서열을 지칭한다.
"Fc 도메인"은 당업자에게 공지된 C-말단 내지 및 항체 힌지 디술파이드 영역을 포함하는 임의의 항체 서열을 지칭한다.
"영향받은 도메인"은 SEQ ID NO: 3 내 식별된 리툭시맙 중쇄에 위치된 영역(SEQ ID NO: 45)을 지칭한다.
"항원"은 항체 또는 항체 단편이 특이적으로 결합하는 존재이다. 이는 관심 항체 또는 단백질에 대한 결합을 포함한다.
용어 "부모 항체"는 SEQ ID NO: 6 및 SEQ ID NO: 47를 포함하는 리툭시맙 항체를 지칭한다.
용어 "RTX-MT"는 영향받은 도메인(SEQ ID NO: 3) 내 하나 이상의 아미노산 변경을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 6으로 구성된 항체를 지칭한다.
용어 "CA125-불응성"은 특히 CA125의 존재 하에서 부모 리툭시맙 항체보다 더 나은 ADCC 및/또는 CDC를 갖는 RTX-MT 항체를 지칭한다.
용어 "제제" 또는 "인핸서 단백질"은 C3B(SEQ ID NO:1) 및 C4B(SEQ ID NO:2) 단백질을 포함하여, 영향받은 항체 또는 부모 항체에 대한 CA125 결합을 차단하거나 감소시킬 수 있는 임의의 단백질을 지칭한다.
용어 "영향받은 항체"는 체액성 면역 기능이 CA125에 의해 감소된 항체를 지칭한다.
용어 "리툭시맙"은 FDA 승인된 항체[FDA 참조 ID: 4274293(월드 와이드 웹 주소: accessdata.fda.gov/drugsatfda_docs/label/2018/103705s5450lbl.pdf)] 또는 SEQ ID NO: 39, 40, 41, 42, 43, 44를 인코딩하는 CDR 서열을 함유하는 임의의 항체를 지칭한다.
용어 "CD20"은 B-세포에 의해 발현된 인간 세포 표면 단백질을 지칭하며 리툭시맙이 특이적으로 결합한 표적 항원이다.
용어 "CA125"는 MUC16 유전자(HGNC: 15582; OMIM: 606154)에 의해 생성된 유전자 생성물을 지칭하고, 이는 가용성 및 막-결합 형태로 발견된다. 항체에 결합하고 결합된 항체 체액성 면역 기능에 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다(문헌[Kline JB, et al. Oncotarget 8:52045-52060, 2017]).
용어 "암", "악성", "이상조절된" 및 "종양"은 당업계에 잘 공지되어 있고, 이상조절된 세포로도 지칭되는, 유사 기원의 정상 세포 유형과 형태학적 특징이 상이하고 조절되지 않은(unregulated) 세포 성장을 가진 세포의 존재를 지칭한다. 악성은 이환율 및/또는 사망률을 야기할 수 있는 암 세포를 지칭한다. 사용된 바와 같이 "암 및 종양"은 전악성 및 악성 유형을 포함한다.
사용된 바와 같이, 용어 "가용성"은 세포의 세포막에 부착되지 않은 단백질 또는 비단백질 제제를 지칭한다. 예를 들어, 가용성인 제제는, 정상 또는 암 세포에서 종양을 포함하는 세포의 혈청, 전혈, 혈장, 소변 또는 미세유체를 포함한 생물학적 유체로 흘리거나, 분비되거나 또는 내보낼 수 있다.
사용된 바와 같이, 특정 단백질 또는 비단백질 제제, 예컨대 인핸서 단백질 또는 RTX-MT 항체 및 CA125의 "수준"은 단백질 및/또는 비단백질 제제 수준을 시험관 내 또는 생체 내에서 측정하도록 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용하여 결정된 제제의 수준 또는 수준들을 지칭한다. 이러한 방법에는 겔 전기영동, 모세관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 박막 크로마토그래피(TLC), 과확산 크로마토그래피, 유체 또는 겔 침전 반응, 흡수 분광법, 비색 어세이, 분광 광도 어세이, 유세포분석, 면역확산(단일 또는 이중), 용액 상 어세이, 면역전기영동, 웨스턴 블롯팅, 방사면역어세이(RIA), 효소-연결 면역흡착 어세이(ELISA), 면역형광 어세이, 형광 공명 에너지 전달(FRET), Forster 광명 에너지 전달, 전기화학발광 면역어세이 등이 포함된다. 일 구현예에서, CA125의 수준은 보다 상세히 설명된 바와 같이 프로브-기반 기술을 이용하여 결정된다.
용어 "체액성 면역-억제 또는 체액성 면역 억제"는 CA125에 의해 직접 결합되고 이의 동적 구조가 변경된 임의의 항체, 항체 단편 또는 이중특이적 항체(BSP)를 지칭한다. CA125는 정상의 주변 상피 세포로부터 림프종에 의해 유도되고(문헌[Sanusi et al. Perit Dial Int. 21:495―500, 2001]), 특정 항체를 결합할 수 있고, 이의 동적 구조를 변경하여 ADCC, CDC, 옵소닌작용, 내재화 및/또는 PK, PD 및 PL 프로파일을 포함하는 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "이중특이적 항체(BSP)"는 둘 이상의 상이한 항원을 결합할 수 있는 임의의 항체를 지칭한다. BSP는 적어도 2개의 전장 항체들, 전장 항체 및 단일 사슬 항체, 또는 2개의 단일 사슬 항체들을 포함할 수 있으나, 이들로 제한되는 것은 아니고, 여기서 각각은 상이한 항원들에, 또는 동일한 항원에 대해 상이한 에피토프에 결합할 수 있다.
용어 "항체 의존 세포성 세포독성(ADCC)"은 항체가 세포의 표면 상 항원에 결합한 다음 항체의 Fc 도메인 내 서열들을 통해 면역-효과기 세포와 결합하고 결국 결합된 세포를 사멸할 수 있는 독소의 방출을 이끌 수 있는 시험관 내 또는 생체 내 과정을 지칭한다.
용어 "보체 의존 세포독성(CDC)"은 항체가 진핵 또는 원핵 세포의 표면 상 항원에 결합한 다음 항체의 Fc 도메인 내 서열을 통해 C1q 단백질과 결합하여 결국 결합된 세포를 사멸할 수 있는 고전적인 보체 캐스케이드(cascade)의 개시를 이끌 수 있는 시험관 내 또는 생체 내 과정을 지칭한다.
용어 "옵소닌작용"은 항체가 세포의 효면 상 항원에 결합한 다음 이것의 Fc 도메인 내 서열을 통해 면역 세포와 결합하여 결국 면역 세포가 항체 결합된 세포를 삼키고, 소비하고 궁극적으로 사멸시키는 과정을 지칭한다.
용어 "약동학적(pharmacokinetic; PK)"이란, 대상에 투여시 항체가 이것의 정상-상태 농도를 유지하는 시간을 지칭한다.
용어 "약력학적(pharmacodynamic; PD)"은 항체-기반 약물의 생화학적 및 생리학적 효과 및 이것의 작용 메카니즘에 대한 연구를 지칭하며, 여기에는 이들이 대상에 투여시 이들의 생화학적 구조와 이들의 작용 및 효과의 상호관계가 포함된다.
용어 "약리학적(PL)"은 시험관 내 또는 생체 내 질환 세포를 관리하거나 사멸시키는 것에 대한 항체가 갖는 공지된 효과를 지칭한다.
용어 "샘플"은 대상으로부터 단리된 유사한 유체, 세포 또는 조직뿐 아니라 대상 내 존재하는 유체, 세포 또는 조직의 집합을 지칭한다. 유체는 세포 및 오르가노이드 배양 배지, 소변, 타액, 세척액 등을 포함해 대상 또는 생물학적 공급원과 접촉된 액체 용액을 포함하는 생물학적 유체를 포함할 수 있다.
사용된 바와 같이 용어 "대조군 샘플"은 예를 들어 그 부모 세포와 상이한 세포 또는 특정 암 유형에 걸리지 않은 건강한 대상으로부터의 샘플을 포함한 임의의 임상적으로 또는 비임상적으로 관련된 대조군 샘플을 지칭한다.
용어 "대조군 수준"은, 시험관 내 어세이에서 사용되거나 대상으로부터 유래된 샘플에서 동일 제제의 수준과 비교하는 데 사용되는 단백질 또는 비단백질 제제의 허용되거나 미리 결정된 수준을 지칭한다.
사용된 바와 같이, 대조군 설정에서 항체의 신호 대 인핸서 단백질의 존재 또는 부재 하 CA125에 의해 결합되는 것 사이의 "차이"는 일반적으로 당업자가 통상 사용하는 통계적 방법을 이용하여 결정될 수 있는 임의의 차이이며, 대조군과 비교하여 최소 10% 이상의 차이이다. 이것은 사용된 항체 및 프로브에 따라 또한 적어도 5 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 또는 75 %의 변화를 나타낼 수 있다.
용어 "저해하다" 또는 "의 저해"는 통계적으로 측정가능한 양만큼 감소시키거나 완전히 방지시키는 것을 의미한다.
기술된 방법에 따라 사용되는 항체, 항체 함유 모이어티(즉, BSP 등) 또는 인핸서 단백질의 문맥에서 용어 "기능적"은, 항체 및/또는 인핸서 단백질이 각각 영향받은 항체에 대한 CA125 결합을 감소 또는 차단시킬 수 있고/있거나 부모 항체 단독보다 시험관 내 생체 내에서 더 잘 표적 세포를 죽일 수 있다는 점을 지시한다.
용어 "표적 세포"는 특정 항체 또는 항체 함유 모이어티에 대한 항원을 발현하는 진핵 또는 원핵 세포 또는 세포들의 집단을 지칭한다.
용어 "약학적으로 허용되는"이란, 약리학적뿐 아니라 독성학적 측면에서 환자에게 투여하기에 허용가능한 물질을 지칭하며, 당업자에게 공지된 접근법을 사용하여 제조된다. 이것들은 연방 또는 주 정부의 규제 기관에서 승인되거나 미국 약전 또는 일반적으로 동물 및 인간에 사용하기에 인정되는 기타 약전에 등재된 제제를 포함한다. 용어 "약학적으로 적합한 성분"은 항암제와 함께 투여되는 약학적으로 허용되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 매트릭스 비히클을 지칭한다. "약학적으로 허용되는 담체"는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않고 숙주에 무독성인 매트릭스를 지칭한다.
용어 "유효량" 및 "치료적으로 유효한"은 상호교환하여 사용되고, 약학적 제제를 향상된 임상적 결과를 환자에서 내놓기에 충분한 양으로 투여하는 문맥에서 사용된다. 유효량의 제제는 "유효 요법"에서 본원에 기재된 방법에 따라 투여된다. 용어 "유효 요법"은 특정 암 환자에게 향상된 임상 결과를 달성하기에 적절한 제제의 양 및 투여 빈도의 조합을 지칭한다. 향상된 효능은, 유효 요법의 임상적 결과를 향상시킬 수 있는 부모 화합물 또는 제제보다 이환율을 더 잘 극복할 수 있는 제제를 환자에게 투여시 개선된 임상 결과이다. 본원의 맥락에서와 같이, 유효량은 인핸서 단백질 없이 부모 항체 또는 항체 치료와 비교하여 효능 또는 차이를 입증하는 데 요구되는 RTX-MT 및/또는 인핸서 단백질의 양을 지칭한다.
용어 "환자" 및 "대상"은 치료제 치료를 받는 수의학 대상을 포함하는 인간 및 기타 비인간 동물을 지칭하는 데 상호교환하여 사용된다. 용어 "비인간 동물"은 모든 척추동물을 포함한다. 일 구현예에서, 대상은 인간이다.
"치료제"는 전형적으로 바람직하지 않은 오염물이 실질적으로 없다. 이는 제제가 통상적으로 약 50% w/w(중량/중량) 이상 순수할뿐 아니라 간섭(interfering) 단백질 및 오염물이 실질적으로 없는 것을 의미한다.
용어 "면역-효과기 세포"는 항체-결합된 표적 세포에 결합 시 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 또는 포식작용(옵소닌작용)을 부여할 수 있는 NK, 골수 단핵구, 수지상 세포를 포함하나, 이들로 국한되는 것은 아닌 임의의 세포를 지칭한다. 세포는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 형태로 혼합물로 존재하거나 정제될 수 있다.
염증성 질환은 자가면역 질환뿐 아니라 류마티스 관절염, 다발혈관염이 있는 육아종증, 특발성 혈소판감소성 자반증, 보통천포창, 중증근육무력증 및 엡스타인-바 바이러스 양성 점막 피부 궤양을 포함한다.
용어 "이상조절된 세포"는 부모 세포에 비해 비정상인 것으로 간주되는 임의의 세포를 지칭한다. 이것들은 형질전환된 세포, 악성 세포, 바이러스 감염된 세포, 자가조절을 통해 자율적으로 성장하는 세포, 또는 원핵 병원체를 포함한다.
용어 "체액 반응"은 테스트 항체에 의한 표적 세포 내로의 항체의 ADCC, CDC 또는 내재화를 지칭한다.
용어 "스크리닝"은 영향받은 항체 또는 항체-함유 모이어티(즉, BSP, ADC, 단일 사슬 항체, 항체 단편 등)의 존재 하에서 CA125에 결합할 수 있는 단백질을 테스트하고, ADCC 또는 CDC 사멸 모니터링으로 향상된 생물학적 반응을 찾는 것을 지칭할 수 있다. 상기 용어는 많은 수의 테스트 요소를 분석하여 테스트 요소 중 특정한 속성을 가진 요소를 결정하는 다른 문맥에서 사용될 수 있다. 마찬가지로, 이는 특정 속성을 가진 샘플에 대한 환자 샘플의 검정을 참조하는 데 사용될 수 있다.
용어 "유의미한(하게)"은 스튜던트 T-테스트를 포함한 임의의 수의 프로그램에 의해 결정된 바와 같은 P값이 0.05 미만인 통계적 결과를 지칭한다.
치료적 인핸서 단백질 및 변형된 리툭시맙 항체의 조성물; 및 CA125-매개 체액성 면역 억제를 개발하고 극복하는 방법.
인핸서 단백질(제제) 및 기타 화학 또는 생물학 제제는 영향받은 부모 및 RTX-MT 항체에 의한 체액성 면역 반응의 CA125의 억제를 효과적으로 차단할 수 있다. 일부 구현예에서, 최적의 인핸서 단백질 및 RTX-MT 항체를 식별하는 방법은 영향받은 도메인(SEQ ID NO: 3)에서 하나 이상의 아미노산 변경을 함유하는 RTX-MT 항체를 생성하고, CD20-발현 표적 세포에 대항해 ADCC 또는 CDC 사멸을 매개하는데 사용되어질 때 유의미하게 개선된 생물학적 활성을 갖는 RTX-MT 항체의 능력에 대해 테스트하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, RTX-MT 항체는 하나 이상의 아미노산 변경으로 이루어진다. 다른 구현예에서, RTX-MT 항체는 둘 이상의 아미노산 변경으로 이루어진다. 최적의 아미노산 변경은 RTX-MT 항체, CA125 및 CD20-발현 표적 세포의 존재 하에서, 기능적 ADCC 또는 CDC 사멸 어세이를 이용해 결정될 수 있다. 예는 도 1a에 개략적으로 도시된다. CA125에 의한 체액성 면역-억제를 유의하게 극복할 수 있는 CA125-불응성 RTX-MT 항체의 식별은 당업자에 의해 통상 사용되는 ADCC 또는 CDC 사멸 어세이를 사용함으로써 확인된다.
또한 또 다른 구현예에서, RTX-MT 항체는 부모 RTX 항체와 유사하거나 더 큰 결합 친화도를 가진다.
CA125-불응성 RTX-MT 항체를 확인하기 위한 일부 방법에서, 표적 세포가 CD20 및 CA125를 자연적으로 또는 재조합적으로 발현하는 표적 세포의 배양물에 항체가 첨가된다. RTX-MT 대 부모 항체의 존재 하 체액 반응을 비교하기 위한 배양은 표준 ADCC 또는 CDC 사멸 어세이를 이용하여 모니터링될 수 있다. 적어도 10%의 변화가 전형적으로 ADCC 및/또는 CDC 기능에 대한 의미있는 효과로서 간주된다. 활용된 항체 및 어세이에 따라, 의미있는 효과는 또한 적어도 5 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 70 %, 또는 75 %의 변화로서 정의될 수 있다. 표적 세포주는 CA125를 자연적으로 발현하고 인간 CD20 발현 구축물로 형질도입된 조작된 암 세포일 수 있다.
또한, CA125-불응성 RTX-MT 항체로 암 대상을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 예를 들어, 환자는 이들로 국한되는 것은 아니지만, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 소포림프종, 대세포 림프종 또는 만성 림프성 백혈병과 같은 CD20-발현 암이 있을 수 있다. 몇몇의 보고에 따르면, 그러한 암이 있는 환자에서 CA125 발현은 상승했고, 리툭시맙은 CA125 혈청 수준이 정상 범위보다 높은 환자에게서 덜 효과적이었던 것으로 보고되어왔다. 이러한 경우에, RTX-MT 항체가 바람직한 존재일 수 있다.
RTX-MT 항체로 대상을 치료하는 방법의 일부 구현예에서, CA125를 발현하는 CD20+ 암이 있는 환자는 RTX-MT 항체 단독으로 치료될 수 있거나, 진료 표준 요법과 조합하여 치료될 수 있다. 본원에서 기재된 CA125-발현 암이 있는 대상의 치료 방법의 일부 구현예에서, RTX-MT 항체가 정상 범위를 넘는 기준선 CA125 수준을 가진 대상에 투여된다. 본원에 기재된 CA125-발현 암이 있는 대상의 치료 방법의 일부 구현예에서, 이 방법은 RTX-MT 항체를 단독으로 투여하는 것을 포함한다. 또한 또 다른 구현예에서, RTX-MT 항체는 화학요법과 조합하여 투여된다. 화학요법은 대상이 치료될 때에 특정 암 징조에 대한 진료 표준으로 간주되는 임의의 화학요법제일 수 있다. 본원에 기재된 치료 방법에서, CA125 발현 수준은 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 결정될 수 있고, 당업자에 의해 정상 범위 이내 또는 초과로 정의될 수 있다.
본원에 기재된 치료 방법의 일부 구현예에서, RTX-MT 항체는 영향받은 도메인(SEQ ID NO: 3)에서 하나의 아미노산 변경으로 이루어진다. RTX-MT 항체는 CA125-발현, CD20-양성(CD20+) 암이 있는 환자에게 투여된다. CA125를 생성하는 것으로 공지된 예의 CD20-양성 암은 호지킨 및 비호지킨 림프종, 소포림프종, 대세포 림프종 및 만성 림프구성 백혈병이다. 제한없이, 중피종, 난소, 유방, 폐, 결장직장, 위장관, 자궁내막 및 췌장 암을 포함하는 기타 암도 또한 이러한 치료를 받을 수 있다.
본 방법은 수술(예를 들어, 부피감소 수술), 방사선, 표적 요법, 화학요법, 면역요법, 성장 인자 저해제 또는 항-혈관신생 인자의 사용과 같은 다른 치료 수단과 조합될 수 있다. RTX-MT 항체 또는 부모 항체 + 인핸서 제제가 수술, 화학요법 또는 방사선 요법 치료를 받는 환자에게 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 환자는 RTX-MT 항체 또는 부모 항체 + 인핸서 제제의 투여 이전 또는 이후에 적어도 1시간 및 최대 수개월까지, 예를 들면 진료 표준 요법의 투여 이전 또는 이후에 적어도 1시간, 5시간, 12시간, 1일, 1주, 1개월, 또는 3개월까지 수술, 화학요법, 또는 방사선 요법을 받을 수 있다. 본원에서 제공된 치료 방법의 일부 구현예는 치료적 유효량의 화학요법 + 영향받은 항체, 예컨대 종양-특이적 항원에 대한 항-CD20 항체를 인핸서 단백질에 더하여 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
본원에서 기재된 치료 방법의 일부 구현예에서, 대상은 암에 의해 발현된 항원에 특이적인 영향받은 항체 및 인핸서 단백질을 투여하기 전에 종양의 일차 외과적 절제술, 상기 암의 치료를 위한 일차 화학요법을 받았을 수 있다.
본원에서 기재된 치료 방법의 일부 구현예에서, 대상은 불응성 항체 또는 부모 항체 + 인핸서 단백질(여기서 항체는 암에 의해 발현된 항원에 특이적이고, 인핸서 단백질은 CA125와 같은 체액성 면역-억제 단백질을 특이적으로 차단할 수 있음)을 투여하기 전에 종양의 일차 외과적 절제술, 암 치료를 위한 일차 화학요법을 받았을 수 있다.
본원에서 기재된 치료 방법에 따른 RTX-MT 항체 및/또는 인핸서 단백질의 투여는 당업계에 공지된 임의의 수단에 의해 행해질 수 있다. 전형적으로, 항체는 정맥내로 주입된다.
또한 또 다른 구현예에서, CD20항원에 대한 항체의 결합을 지시할 수 있는 CDR 서열을 포함하는 치료 항체가 사용될 수 있다: SEQ ID NO: 41(GYTFTSYN)은 CDRH1, SEQ ID NO: 42(IYPGNGDT)은 CDRH2, SEQ ID NO: 43(ARSTYYGGDWYFNV)은 CDRH3, SEQ ID NO: 44(SSSVSY)는 CDRL1, SEQ ID NO: 45(ATS)는 CDRL2로 및 SEQ ID NO: 46(QQWTSNPPT)는 CDRL3로 IMGT®(the international ImMunoGeneTics information system®)에 따라 번호가 매겨지고 영향받은 도메인(SEQ ID NO: 3)과 돌연변이를 가짐. 항체는 CD20-양성 질환 징조에, 그리고 여기서 CA125가 정상 범위를 초과하는 경우에 인핸서 단백질과 함께 동시에 또는 단독으로 투여될 수 있다. 인핸서 단백질의 용량 수준은 임상적으로 결정된 최대 허용 용량(MTD)만큼 높을 수 있거나 MTD 미만 수준일 수 있다. 인핸서 단백질의 투여는 항체의 투여 이전, 동시 또는 이후일 수 있다. 치료는 수술뿐 아니라 진료 표준에 따른 치료를 포함할 수 있다. 인핸서 단백질 또는 기타 화학적 또는 생물학적 강화제(enhancing agent)가 항체와 나란히, 항체와 조합하여 또는 항체와 별도로 투여될 수 있다. 이것은 예를 들어 경구, 피내, 피하, 근육내, 또는 정맥내 투여될 수 있다.
필요하다고 간주한 경우 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비강내, 경막외 및 경구 경로를 포함하는 다양한 전달 시스템이 RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질을 투여하는 데 사용될 수 있다. 이것들은 예를 들어 주입 또는 일시 주사(bolus injection)에 의해, 전신 또는 국소 접근으로 상피 또는 점막 피부 내벽(예, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해, 투여될 수 있다.
RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질은 주사기, 카테터, 좌약 또는 임의의 이식가능한 매트릭스 또는 장치를 통한 주사에 의해 투여될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 사용하기 위한 RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질 및 이의 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액, 용액 등과 같은 임의의 허용가능한 투여 형태로 경구 투여될 수 있다.
RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질의 적합한 투여 방법은 효과적인 치료에 적합한 최종 농도로 정맥내 주사 및 복강내 투여를 포함하나, 이로 국한되는 것은 아니다.
다른 약물들과 조합된 RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질은 치료적으로 또는 예방학적으로 유효한 양의 치료제(들) 및 하나 이상의 약학적으로 허용되는 또는 적합한 성분을 포함하는 약학적 조성물로서 투여될 수 있다.
암 또는 비종양성 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 치료제의 양은 표준 임상 기술에 의해 결정될 수 있다. 추가적으로, 시험관 내 어세이는 RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질에 요구되는 최적의 투여 범위를 확인하는 데 도움이 되도록 선택적으로 활용될 수 있다. 유효 용량은 시험관 내 또는 동물 모델 테스트 시스템으로부터 유래된 RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질의 용량-반응 곡선에서 외삽될 수 있다.
예를 들어, RTX-MT 항체 또는 인핸서 단백질의 독성 및 치료 효능은 LD50(집단의 50%에 치명적인 용량) 및 ED50(집단의 50%에서 치료적으로 유효한 용량) 값을 결정하기 위한 표준 약학적 절차에 의해 세포 배양물 또는 실험 동물에서 결정될 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량 비율이 치료 지수이고, 비율 LD50/ED50로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 보이는 제제가 적합하다. 제제가 독성 부작용을 나타내는 경우, 이환 조직 부위에 제제를 표적으로 하는 전달 시스템을 사용하여 비-CD20-발현 세포에 대한 잠재적인 손상을 최소화하고 이로써 부작용을 감소시킬 수 있다.
핵산 벡터는 예를 들어 플라스미드, 바이러스, 또는 서브바이러스일 수 있다. 바람직하게, 핵산은 효과적인 복제 기원을 가짐으로써 원하는 숙주 세포에서 유지되지만, 일부 상황에서는 일시적인 발현이 바람직할 수 있다. 전형적으로, 숙주 세포에서 적절한 부속 단백질 및 발현 벡터 상 발현 제어 서열을 필요로 하는, 돌연변이 항체를 발현시키는 것이 바람직할 것이다. 종종, 다량의 항체 또는 항체 부분을 생성하기 위해, 항체 전부 또는 일부를 발현하는 안정한 세포주가 형성될 것이다. 항체 부분은 예를 들어 전체 경쇄 또는 중쇄일 수 있다.
투여 및 투여 스케쥴은 대상의 요구, 크기 및 상태에 따라 달라질 수 있는 활성 약물 농도에 따라 달라질 수 있다.
실시예 1 - 영향받은 항체의 CA125 면역-억제를 극복할 수 있는 단백질에 대한 스크리닝 및 CA125 항체 결합의 맵핑
도 1a 내지 도 1d는 영향받은 항체의 CA125 면역-억제 효과를 차단할 수 있는 단백질을 확인하기 위한 스크리닝 방법 및 결과, 및 CA125가 결합할 수 있는 영향받은 항체 상 영역을 맵핑하기 위한 이들의 결합의 용도를 나타낸다.
인핸서 단백질은 영향받은 항체에 대한 CA125의 면역-억제 효과를 차단하고; 상기 영향받은 항체는 리툭시맙이다. 스크리닝 어세이는 96-웰 플레이트 ELISA를 포함하고, 여기서 웰은 CA125 단백질과 함께 또는 그렇지 않고 리툭시맙으로 코팅된 다음 웰은 C3B 또는 C4B 단백질의 유무 하 비오틴화 인간 CD16a로 프로빙되고 CD16a 결합에 대해 측정된다. 이전 연구에 따르면, CA125는 영향받은 항체에 대한 CD16a 또는 C1q 단백질 결합의 효과를 억제할 수 있다. 도 1b에 도시된 바와 같이, RTX 함유 웰은 CD16a 및 C1q 단백질 양자 모두에 결합하는 반면, RTX+CA125를 가진 웰은 어느 하나의 단백질의 결합이 현저히 감소되었다. 다음으로, C4B 단백질(SEQ ID NO: 2)이 RTX+CA125 함유 웰에 첨가되었다. 리툭시맙+CA125를 함유하는 웰에 C4B의 첨가는 CD16a 및 C1q 결합을 회복시켰다. 이 효과가 기능적인 성과를 도모한다는 것을 확인하기 위해, 인간 CD20-양성 Daudi 세포를, 외인적으로 첨가된 CA125의 존재 또는 부재 하에서 RTX로 처리하고, 하기에 기재된 바와 같이 ADCC 또는 CDC 활성에 대해 스크리닝하였다. 도 1c에 도시된 바와 같이, CA125는 CDC 활성을 억제하였다. 다음으로, C4B가 유사 배양물에 첨가되었고, 이것이 RTX+CA125로 처리된 웰에서 CDC 활성을 회복할 수 있음을 확인하였다. 이 효과는 C4B가 CA125가 아닌 RTX 항체와 결합한 결과인 것으로 보이는데, ELISA를 통한 직접 결합 어세이에 따르면 비오틴화 C4B가 CA125가 아닌 RTX로 코팅된 웰에 결합할 수 있다는 점을 발견했기 때문이다(도시되지 않음). 유사 효과가 C3B에 대해 관찰되었고, 데이터 서브세트가 도 1d에 제공된다.
ADCC 리포터 바이오어세이 코어 키트(Reporter Bioassay Core Kit)의 일부인 Jurkat-Luc 효과기 세포를 이용하여 CD16A 활성화 어세이를 수행하고, 공급업체(Promega)에 의해 권고되는 바 대로 분석하였다. 간략히 말하면, 2x104개의 표적 세포를, 검정색 불투명 96 웰 플레이트에 어세이 버퍼(RPMI+L-글루타민+1% 초저 Ig 혈청)(Gibco)에서 삼중으로 밤새 시딩하였다. 다음날, 1x105개의 Jurkat-Luc 효과기 세포를 5:1의 효과기 표적 비율을 위해 어세이 버퍼의 웰에 첨가하였다. 항체, 효과기 및 표적 세포를 16시간 동안 37℃/5%CO2에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 10분 동안 실온에서 평형화하였다. 50 마이크로리터의 Bio-glo 시약(Promega)을 웰에 첨가하고, Varioskan LUX 플레이트 판독기(ThermoFisher)를 이용하여 발광을 정량화하였다.
CA125의 존재 하에서 CD20과 경쟁하는 RTX의 경쟁을 하기와 같이 수행하였다. 간단히 말하면, ELISA 플레이트를 밤새 4℃에서 0.05 M 카르보네이트 버퍼, pH 9.5에서 희석된 항원으로 코팅되었다. 코팅된 항원은 10 μg/mL에서의 CD20/MS4A1 선형 펩티드(문헌[Rp1-L; Favoino et al., Int J Mol Sci. 2019 Apr; 20(8): 1920])였다. 플레이트를 실온에서 1시간 동안 5% BSA를 함유하는 0.05 M 포스페이트 버퍼, pH7.2(PBS)로 차단한 다음, PBS로 2회 세척하였다. 비오틴화 RTX(EZ-link Sulfo-NHS-LC-Biotin, ThermoFisher에 의함) 또는 음성 대조군 혈청 알부민(HSA)을 실온에서 1시간 동안 5 μg/mL로 PBS 중 플레이트에 첨가했다. 일부 반응에서 10 μg/mL 비표지 RTX(2-배 과잉) 또는 30 KU/mL의 CA125를 첨가함으로써 경쟁을 수행하였다. 웰을 PBS로 3회 세척한 후 실온에서 1시간 동안 PBS/BSA에서 스트렙타비딘-HRP를 첨가하였다. 세척 후, 반응을, 75 μL의 TMB 기질(Pierce)을 첨가함으로써 최대 10분 동안 전개하고, 75 μL 0.1 N H2SO4를 첨가함으로써 중단하였다. 450 nm에서 흡광도를 Varioskan 플레이트 판독기(ThermoFisher)에서 측정하였다.
이전 보고서는 CA125가 영향받은 항체의 Fab 도메인에 결합할 수 있음을 보여주었다(문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]; 문헌[Nicolaides NC, et al. Cancer Biol Ther 13:1-22, 2018]). C3B 및 C4B는 이전에 IgG1-유형 항체의 Fab 도메인에 결합하는 것으로 보고되어 있었다(문헌[Campbell RD et al. Biochem J 189:67-80, 1980]; 문헌[Sahu A and Pangburn MK J Biol Chem 269:28997-29002, 1994]).
C3B 및/또는 C4B가 CA125 면역-억제를, 리툭시맙에 결합하는 이의 능력 차단을 통해 차단할 수 있는지 결정하기 위해, ELISA를 이용한 경쟁적 결합 어세이를 수행하였다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 비오틴화 리툭시맙은 이전에 보고된 바와 같이 CA125에 결합할 수 있었다(문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]). 재조합 C4B 단백질의 첨가는 CA125와의 리툭시맙의 결합을 차단할 수 있었고, 이로써 CA125 면역-억제 효과가 감소되는 것이 CA125와 영향받은 항체의 결합 저해를 통한 것임을 확인하였다. 유사 효과가 C3B로 관찰되었다(도 1d). 대조적으로, 다른 IgG 결합 단백질, 예컨대 단백질 L은 CA125 결합을 차단하지 않아, C3B 및 C4B 효과의 특이성을 입증하였다(도 1d). 항체의 Fab 도메인에 대한 C3B 또는 C4B 결합이 보고되어 있지만, 이것이 결합하는 면역글로불린 도메인(경쇄, 중쇄 또는 양자 모두)의 결정은 모호했다. CA125가 리툭시맙의 경쇄, 중쇄 또는 양쪽 면역글로불린 사슬 모두에 결합하는지 더 잘 정의하기 위해, 비영향 항체 퍼투주맙(PTZ)의 경쇄 및 중쇄를 이용한 키메라 항체를(문헌[Kline JB, et al. OncoTarget 8:52045-52060, 2017]) 리툭시맙의 중쇄 및 경쇄와 조합하여 키메라 항체를 생성하였다. 이들 항체를 이어서 비오틴화하고 CA125 결합에 대해 테스트하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 리툭시맙 중쇄를 함유하는 키메라 항체(RTX-hc/PTZ-lc)는 여전히 CA125에 결합할 수 있는 반면, 경쇄를 함유하는 키메라(PTZ-hc/RTX-lc)는 그렇지 못하여, CDR3 및 잔기 N 말단 내지 디술파이드 힌지 영역을 함유하는 영역 내 중쇄에 대한 CA125의 추정적인 결합으로 다듬었다. 또한, 리툭시맙-CA125 상호작용은 중쇄의 CH1 도메인에 결합하는 보체 단백질 C3B에 의해 경쟁될 수 있으나(도 1d), 경쇄 가변 도메인에 결합하는 단백질 L에 의해서는 경쟁될 수 없다. 이들 데이터는 CA125 결합 부위가 리툭시맙 중쇄 내 위치되고, C3B(SEQ ID NO: 1)가 CA125 면역억제 효과를 역전시키는데 사용될 수 있다는 증거를 제공한다.
실시예 2 - CA125-불응성 리툭시맙 항체의 생성 및 CA125 결합에 대해 요구되는 중요한 잔기 확인
C3B 및 C4B 단백질은 각각 항체의 CDR3-프레임워크 4(CDR3-FW4) 및 CH1 영역에 결합하는 것으로 나타났으며, 도 1 및 도 2에 도시된 결과는 이들 단백질이 부모 리툭시맙(RTX-WT)과의 CA125 결합을 경쟁한다는 것을 나타내는데, 이는 CA125가 CDR3-FW4 및 CH1 영역에 결합할 수 있음을 시사한다. RTX-WT 중쇄도 또한 CA125 결합에 충분하기 때문에, 본 발명자들은 특정 잔기 또는 잔기들이 리툭시맙 중쇄에 대한 CA125 결합에 필요한지 여부를 결정하도록 시도하기 위해 무작위 돌연변이유발 라이브러리 접근법을 적용하였다. 본 발명자들은 당업자에 의해 통상 사용되는 무작위 돌연변이유발 PCR 방법을 활용하여 영향받은 도메인 CDR3-FWR4 및 CH1(SEQ ID NO: 3) 내 돌연변이된 잔기를 가진 리툭시맙 중쇄의 라이브러리를 생성한 다음 이것들을 진핵생물 발현 벡터를 이용하여 HEK293 세포에서 리툭시맙 경쇄(SEQ ID NO: 6)와 조합하여 재조합적으로 발현시켰다. 1000개 초과의 클론의 라이브러리를 제조하였다. CDR3 이내의 돌연변이가 CD20 항원 결합에 부정적으로 영향을 끼칠 수 있으므로, 배양 상청액을 항체 생성 및 ELISA를 통한 CD20 결합에 대해 스크리닝하였다. 200개 초과의 리툭시맙 클론을 이어서 CA125 결합에 대해 분석하였고, 5개가 부모 항체와 유사하거나 더 큰 CD20 결합을 유지하고, CA125 결합은 현저히 감소된 것으로 알아냈다. 이어서, 이들 클론으로부터 중쇄를 시퀀싱하여, 모두가 표적화된 영역 내에 돌연변이가 있음을 밝혀냈다. 모든 클론은 다중 돌연변이를 가졌고, 일부는 도 3에서 도시된 바와 같이 중복 돌연변이된 아미노산을 가졌다. 도 4에서 도시된 바와 같이, 클론 148(SEQ ID NO: 37 및 38), 164(SEQ ID NO: 31 및 32), 166(SEQ ID NO: 4 및 5), 198(SEQ ID NO: 19 및 20) 및 199(SEQ ID NO: 25 및 26)가 가장 강력한 CD20 결합 및 감소된 CA125 결합을 가졌다. 본 발명자들은 이들 클론을 확장하고, 이들의 특정 RTX-MT 항체를 정제하고, 이것들을 기능적 ADCC 및 CDC 어세이에서 테스트하였다. 도 5에서 도시된 바와 같이, 클론 164(SEQ ID NOS: 31 및 32), 166(SEQ ID NO: 4 및 5) 및 198(SEQ ID NO: 19 및 20)이 가장 CA125에 대해 불응성이었다. 이들 RTX-MT 항체는 이제 전임상 및 임상 테스트에 준비가 되어 있다. 이들 항체 내 하나 이상의 돌연변이가 감소된 CA125 결합을 위해 필요한지 여부를 추가로 설명하기 위해, 본 발명자들은 단일 또는 이중 돌연변이를 리툭시맙 중쇄 내에서 조작하고 CA125 결합에 대해 다시 스크리닝하였다. 도 6a에 도시된 바와 같이, RTX-MT 클론 112-134 (SEQ ID NO: 13 및 14, 코돈 109에서 N에서 D로 및 코돈 131에서 P에서 S로의 아미노산 변경), 클론 133(SEQ ID NO: 29 및 30, 코돈 130에서 F에서 Y로의 아미노산 변경), 클론 106(SEQ ID NO: 33 및 34, 코돈 103에서 G에서 C로의 아미노산 변경), 및 클론 137(SEQ ID NO: 35 및 36, 코돈 134에서 P에서 S로의 아미노산 변경)은 CA125에 대한 감소된 결합(P < 0.0055)을 보였으나, 여전히 이들의 부모 항체와 같이 CD20 결합을 유지하였다. RTX-MT 클론 112-134 및 133은 부모 항체와 비교시 CA125의 존재 하에서 개선된 CD16a-비오틴 및 C1q-비오틴 결합을 나타냈는데(도 6b), 이는 항체에 대한 CA125 또는 이의 부족한 결합과 항체 면역-효과기 복합체 형성 및 기능 사이의 연관성을 입증한다.
모든 아미노산 변경 또는 이들의 조합이 관찰된 CA125-불응성 표현형에 대해 필요한지 여부가 명확하지 않기 때문에, RTX-MT 클론 166 유래의 돌연변이를 추가로 연구하였다. 서열 분석에 따르면, RTX-MT 클론 166은 3개의 아미노산 변경을 가졌다(코돈 109에서 N에서 D로, 코돈 131에서 P에서 S로, 및 코돈 136에서 S에서 Y로(SEQ ID NO: 5)). 관찰된 표현형에 대한 각 돌연변이의 기여를 연구하기 위해, 각각이 RTX-MT 클론 166에서 발견된 3개의 아미노산 변경 중 하나뿐 아니라 이중 돌연변이의 조합을 갖는 추가적인 RTX-MT 변이체를 조작하였다. 이들 새로운 RTX-MT 변이체(N109D, P131S, S136Y, N109D+P131S, N109D+S136Y 및 P131S+S136Y로 명명됨)의 분석은 N109D(코돈 109에서 N에서 D로의 아미노산 변경)의 존재가 C1q 결합(도 7b)뿐 아니라 Fc 수용체의 CA125-매개 억제에 대한 감수성의 감소(도 7a)와 연관되었음을 시사하였다. 항-HER2 항체 퍼투주맙(PTZ)을 CA125-불응성 대조군 항체로서 이용하였다. 추가 테스트에서, N109D 변이체(여기서 RTX-MT 또는 RTX N109D로 지칭)가 부모 RTX와 유사한 수준에서 CD20과 결합하는 것으로 나타났으며(도 7c), 중요하게는 이것의 CA125와의 결합이 50% 현저히 감소되었다(도 7d). 종합적으로, 이들 결과는 돌연변이 N109D(코돈 109에서 N에서 D로의 변경)은 CA125에 대한 RTX N109D 감수성을 감소시키기에 충분함을 나타낸다.
RTX N109D를 CA125-불응성 RTX-MT 변이체의 예로 이용하고 추가로 특성화하였다. 이것의 CD20에 대한 결합을, 확실히 부모 RTX의 CD20 결합과 비교하기 위해 대체 어세이로써 분석하였다. 항체 평형 해리 상수(Kd)의 측정을 항원-양성(Ramos) 및 항원-음성(Jurkat) 세포주의 면역염색을 포함하는 세포-기반 형광 어세이를 이용함으로써 수행하였다. 이 어세이에서, 세포는 0.78 내지 100 nM 범위의 488-표지된 항체의 2-배 농도 적정으로 염색된다. 간단히 말하면, 세포는 완전한 RPMI 중 현탁액에서 성장된다. 생존율이 >85%인 융합(confluent) 배양물을 800 RPM에서 6분 동안 원심분리하고, 세포 펠릿을 50-mL 튜브에 4 mL의 Animal-Free Blocker(Vector Laboratories SP-5035)에 재현탁하여 세포를 세척한다. 세포를 다시 원심분리하고, 100만/mL으로 Animal-Free Blocker에서 재현탁한다. 샘플을 얼음 상 20분 동안 인큐베이션하여 임의의 비특이적 결합 부위를 차단한다. 이어서, 세포(200 mL/200만 세포/웰)를 V-바닥, 폴리프로필렌 96-웰 마이크로플레이트(Corning 3363)에 옮기고, 2분 동안 벤치탑 원심분리기에서 1,500 RPM으로 원심분리한다. 상청액을 제거하고, 세포를 90 mL/웰의 Animal-Free Blocker에서 재현탁한다. 각 조건을 이중 웰에서 테스트한다. 희석된 488-표지된 항체(10 μL/웰)를 상응하는 웰에 첨가하고, 샘플을 매 20분마다 혼합하면서 얼음 상 1시간 동안 인큐베이션한다. 이어서, 샘플을 4회 100 μL/웰의 Animal-Free Blocker를 이용하여 세척하고, 각 세척 후 2분 동안 1,500 RPM으로 원심분리한다. 마지막 세척 후, 세포를 10분 동안 100 μL/샘플의 10% 포르말린(LabChem, LC146702)으로 고정한다. 샘플을 다시 원심분리한 다음 세포를 100 μL/웰의 Animal-Free Blocker에서 재현탁하고, 검정색 마이크로플레이트(Greiner Bio-One, 655086)로 옮긴다. 각 샘플에 대해서 494 nm 여기/519 nm 방출에서의 형광을 Varioskan LUX 플레이트 판독기를 이용함으로써 측정하였다. 항원-음성 세포에 대한 비특이적 백그라운드 결합을, 항원-양성 세포로부터의 결합 신호에서 차감한다. 차감된 값을 GraphPad Prism 버전 8.4에서 "1 부위와의 포화 결합"에 대한 비선형 회귀 분석을 이용하여 플롯팅한다. 모델은 평형에서 수용체 부위의 절반에 결합하는 리간드 농도인 Kd를 결정한다.
이 결합 어세이를 이용하여, RTX N109D는 용량-의존적 방식으로 CD20-양성 Ramos 세포에 결합하는 반면, 이것은 CD20-음성 Jurkat 세포에 결합하지 않아, 부모 리툭시맙(RTX)와 유사한 표적 세포 특이성의 보유를 확인했다(도 8a 및 도 8b). 더욱이, RTX 및 RTX N109D에 대한 측정된 친화도/Kd는 각각 20.6 및 30.5 nM였다(도 8c 및 도 8d). RTX N109D 친화도의 작은 하락이 예상되었고, 이는 다른 어세이를 이용한 이전의 CD20 결합 데이터와 일치하였지만(도 7c), 전반적인 RTX N109D는 부모 리툭시맙과 비슷한 CD20-특이적 결합 및 친화도를 보였다.
CA125가 부모 리툭시맙에 대한 C1q 결합을 저해하여 CDC 활성 감소를 초래하기 때문에, RTX N109D에 의해 매개된 CDC에 대한 CA125의 효과를 조사하였다. 이전에 나타낸 바와 같이, RTX N109D에 대한 C1q 결합은 부모 리툭시맙(RTX)에 비해 증가하였다(도 7b). C1q 결합의 이러한 증가는 면역억제성 CA125 및 CD20을 발현하는 표적 세포를 이용해 RTX와 비교할 때 RTX N109D에 의해 매개되는 CDC 활성을 향상시킨 반면(도 9a), CA125-양성이지만 CD20-음성 세포를 이용할 때에는 유의미한 사멸이 관찰되지 않았다(도 9b).
CA125는 부모 리툭시맙의 Fc 수용체와의 결합뿐 아니라 이것의 시그널링 활성화를 저해하고 후속해서 ADCC 활성을 감소시켰기 때문에, 본 발명자들은 이러한 면역억제 효과가 RTX N109D를 이용할 때 줄어들었는지 여부를 조사하였다. 분석에 따르면, RTX N109D는 Fc 수용체에 결합할뿐 아니라 CA125를 발현하는 표적 세포에서 이것의 시그널링을 부모 리툭시맙(RTX)보다 유의하게 더 높은 수준에서 활성화시키는 것으로 나타났지만, CA125-음성 세포를 이용할 때 유의한 차이는 관찰되지 않았다(도 10a 및 도 10b). CA125-불응성 대조군 항체로서 PTZ를 이용하였다. 향상된 Fc 수용체 상호작용 및 활성화의 중요한 결과는, RTX N109D가 부모 리툭시맙(RTX)보다 면역억제 CA125의 존재 하에서 표적 세포에 대해 보다 강력한 Fc 수용체-의존 세포독성 활성(ADCC)를 매개할 수 있다는 점이었다(도 10c).
이들 데이터는 CA125-불응성 항체를 생성하기 위해 리툭시맙 중쇄의 영향받은 영역(SEQ ID NO: 3) 내 잔기를 변형시키는 것이 CA125 면역억제 단백질의 존재 하에서 CD20-양성 세포 사멸을 개선시킬 수 있음을 입증한다.
이 문서에 인용된 모든 참고 문헌은 본원에 명시적으로 포함된다.
서열 식별(모든 서열은 N 내지 C로, RTX-MT 아미노산 서열의 경우, 아미노산 변경은 볼드체로 표시됨)
SEQ ID NO: 1 C3B
Figure pct00001
SEQ ID NO: 2 C4B
Figure pct00002
SEQ ID NO: 3 (힌지까지의 리툭시맙 중쇄의 잔기)
Figure pct00003
SEQ ID NO: 4
Figure pct00004
SEQ ID NO: 5 코돈 109에서 N에서 D, 코돈 131에서 P에서 S, 및 코돈 136에서 S에서 Y로의 아미노산 변경
Figure pct00005
SEQ ID NO: 6
Figure pct00006
SEQ ID NO: 7
Figure pct00007
SEQ ID NO: 8 코돈 109에서 N에서 D로의 아미노산 변경
Figure pct00008
SEQ ID NO: 9
Figure pct00009
SEQ ID NO: 10 코돈 131에서 P에서 S로의 아미노산 변경
Figure pct00010
SEQ ID NO: 11
Figure pct00011
SEQ ID NO: 12 코돈 136에서 S에서 Y로의 아미노산 변경
Figure pct00012
SEQ ID NO: 13
Figure pct00013
SEQ ID NO: 14 코돈 109에서 N에서 D, 및 코돈 131에서 P에서 S로의 아미노산 변경
Figure pct00014
SEQ ID NO: 15
Figure pct00015
SEQ ID NO: 16 코돈 109에서 N에서 D, 및 코돈 136에서 S에서 Y로의 아미노산 변경
Figure pct00016
SEQ ID NO: 17
Figure pct00017
SEQ ID NO: 18 코돈 131에서 P에서 S 및 코돈 136에서 S에서 Y로의 아미노산 변경
Figure pct00018
SEQ ID NO: 19
Figure pct00019
SEQ ID NO: 20 코돈 107에서 Y에서 C, 및 코돈 122에서 A에서 T로의 아미노산 변경
Figure pct00020
SEQ ID NO: 21
Figure pct00021
SEQ ID NO: 22 코돈 107에서 Y에서 C로의 아미노산 변경
Figure pct00022
SEQ ID NO: 23
Figure pct00023
SEQ ID NO: 24 코돈 122에서 A에서 T로의 아미노산 변경
Figure pct00024
SEQ ID NO: 25
Figure pct00025
SEQ ID NO: 26 코돈 108에서 F에서 L 및 코돈 130에서 F에서 Y로의 아미노산 변경
Figure pct00026
SEQ ID NO: 27
Figure pct00027
SEQ ID NO: 28 코돈 108에서 F에서 L로의 아미노산 변경
Figure pct00028
SEQ ID NO: 29
Figure pct00029
SEQ ID NO: 30 코돈 130에서 F에서 Y로의 아미노산 변경
Figure pct00030
SEQ ID NO: 31
Figure pct00031
SEQ ID NO: 32 코돈 103에서 G에서 C, 코돈 134에서 P에서 S, 코돈 169에서 S에서 T, 및 코돈 196에서 S에서 R로의 아미노산 변경
Figure pct00032
SEQ ID NO: 33
Figure pct00033
SEQ ID NO: 34 코돈 103에서 G에서 C로의 아미노산 변경
Figure pct00034
SEQ ID NO: 35
Figure pct00035
SEQ ID NO: 36 코돈 134에서 P에서 S로의 아미노산 변경
Figure pct00036
SEQ ID NO: 37
Figure pct00037
SEQ ID NO: 38 코돈 102에서 Y에서 F로의 아미노산 변경
Figure pct00038
SEQ ID NO: 39
Figure pct00039
SEQ ID NO: 40 코돈 167에서 L에서 Q로의 아미노산 변경
Figure pct00040
SEQ ID NO: 41 (CDRH1)
Figure pct00041
SEQ ID NO: 42 (CDRH2)
Figure pct00042
SEQ ID NO: 43 (CDRH3)
Figure pct00043
SEQ ID NO: 44 (CDRL1)
Figure pct00044
SEQ ID NO: 45 (CDRL2)
Figure pct00045
SEQ ID NO: 46 (CDRL3)
Figure pct00046
SEQ ID NO: 47 (리툭시맙 중쇄 야생형)
Figure pct00047
SEQ ID NO: 48 무작위 돌연변이유발 PCR을 위한 정방향 프라이머
Figure pct00048
SEQ ID NO: 49 무작위 돌연변이유발 PCR을 위한 역방향 프라이머
Figure pct00049
SEQ ID NO: 50 (리툭시맙 중쇄 야생형을 인코딩하는 핵산)
Figure pct00050
SEQUENCE LISTING <110> Grasso, Luigi Niicolaides, Nicholas Kline, James Bradford <120> COMPOSITION AND USE OF ENGINEERED MONOCLONAL ANTIBODIES REFRACTORY TO TUMOR IMMUNO-SUPPRESSIVE FACTORS <130> 008966.00005 <160> 50 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 1663 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Pro Thr Ser Gly Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Thr His 1 5 10 15 Leu Pro Leu Ala Leu Gly Ser Pro Met Tyr Ser Ile Ile Thr Pro Asn 20 25 30 Ile Leu Arg Leu Glu Ser Glu Glu Thr Met Val Leu Glu Ala His Asp 35 40 45 Ala Gln Gly Asp Val Pro Val Thr Val Thr Val His Asp Phe Pro Gly 50 55 60 Lys Lys Leu Val Leu Ser Ser Glu Lys Thr Val Leu Thr Pro Ala Thr 65 70 75 80 Asn His Met Gly Asn Val Thr Phe Thr Ile Pro Ala Asn Arg Glu Phe 85 90 95 Lys Ser Glu Lys Gly Arg Asn Lys Phe Val Thr Val Gln Ala Thr Phe 100 105 110 Gly Thr Gln Val Val Glu Lys Val Val Leu Val Ser Leu Gln Ser Gly 115 120 125 Tyr Leu Phe Ile Gln Thr Asp Lys Thr Ile Tyr Thr Pro Gly Ser Thr 130 135 140 Val Leu Tyr Arg Ile Phe Thr Val Asn His Lys Leu Leu Pro Val Gly 145 150 155 160 Arg Thr Val Met Val Asn Ile Glu Asn Pro Glu Gly Ile Pro Val Lys 165 170 175 Gln Asp Ser Leu Ser Ser Gln Asn Gln Leu Gly Val Leu Pro Leu Ser 180 185 190 Trp Asp Ile Pro Glu Leu Val Asn Met Gly Gln Trp Lys Ile Arg Ala 195 200 205 Tyr Tyr Glu Asn Ser Pro Gln Gln Val Phe Ser Thr Glu Phe Glu Val 210 215 220 Lys Glu Tyr Val Leu Pro Ser Phe Glu Val Ile Val Glu Pro Thr Glu 225 230 235 240 Lys Phe Tyr Tyr Ile Tyr Asn Glu Lys Gly Leu Glu Val Thr Ile Thr 245 250 255 Ala Arg Phe Leu Tyr Gly Lys Lys Val Glu Gly Thr Ala Phe Val Ile 260 265 270 Phe Gly Ile Gln Asp Gly Glu Gln Arg Ile Ser Leu Pro Glu Ser Leu 275 280 285 Lys Arg Ile Pro Ile Glu Asp Gly Ser Gly Glu Val Val Leu Ser Arg 290 295 300 Lys Val Leu Leu Asp Gly Val Gln Asn Pro Arg Ala Glu Asp Leu Val 305 310 315 320 Gly Lys Ser Leu Tyr Val Ser Ala Thr Val Ile Leu His Ser Gly Ser 325 330 335 Asp Met Val Gln Ala Glu Arg Ser Gly Ile Pro Ile Val Thr Ser Pro 340 345 350 Tyr Gln Ile His Phe Thr Lys Thr Pro Lys Tyr Phe Lys Pro Gly Met 355 360 365 Pro Phe Asp Leu Met Val Phe Val Thr Asn Pro Asp Gly Ser Pro Ala 370 375 380 Tyr Arg Val Pro Val Ala Val Gln Gly Glu Asp Thr Val Gln Ser Leu 385 390 395 400 Thr Gln Gly Asp Gly Val Ala Lys Leu Ser Ile Asn Thr His Pro Ser 405 410 415 Gln Lys Pro Leu Ser Ile Thr Val Arg Thr Lys Lys Gln Glu Leu Ser 420 425 430 Glu Ala Glu Gln Ala Thr Arg Thr Met Gln Ala Leu Pro Tyr Ser Thr 435 440 445 Val Gly Asn Ser Asn Asn Tyr Leu His Leu Ser Val Leu Arg Thr Glu 450 455 460 Leu Arg Pro Gly Glu Thr Leu Asn Val Asn Phe Leu Leu Arg Met Asp 465 470 475 480 Arg Ala His Glu Ala Lys Ile Arg Tyr Tyr Thr Tyr Leu Ile Met Asn 485 490 495 Lys Gly Arg Leu Leu Lys Ala Gly Arg Gln Val Arg Glu Pro Gly Gln 500 505 510 Asp Leu Val Val Leu Pro Leu Ser Ile Thr Thr Asp Phe Ile Pro Ser 515 520 525 Phe Arg Leu Val Ala Tyr Tyr Thr Leu Ile Gly Ala Ser Gly Gln Arg 530 535 540 Glu Val Val Ala Asp Ser Val Trp Val Asp Val Lys Asp Ser Cys Val 545 550 555 560 Gly Ser Leu Val Val Lys Ser Gly Gln Ser Glu Asp Arg Gln Pro Val 565 570 575 Pro Gly Gln Gln Met Thr Leu Lys Ile Glu Gly Asp His Gly Ala Arg 580 585 590 Val Val Leu Val Ala Val Asp Lys Gly Val Phe Val Leu Asn Lys Lys 595 600 605 Asn Lys Leu Thr Gln Ser Lys Ile Trp Asp Val Val Glu Lys Ala Asp 610 615 620 Ile Gly Cys Thr Pro Gly Ser Gly Lys Asp Tyr Ala Gly Val Phe Ser 625 630 635 640 Asp Ala Gly Leu Thr Phe Thr Ser Ser Ser Gly Gln Gln Thr Ala Gln 645 650 655 Arg Ala Glu Leu Gln Cys Pro Gln Pro Ala Ala Arg Arg Arg Arg Ser 660 665 670 Val Gln Leu Thr Glu Lys Arg Met Asp Lys Val Gly Lys Tyr Pro Lys 675 680 685 Glu Leu Arg Lys Cys Cys Glu Asp Gly Met Arg Glu Asn Pro Met Arg 690 695 700 Phe Ser Cys Gln Arg Arg Thr Arg Phe Ile Ser Leu Gly Glu Ala Cys 705 710 715 720 Lys Lys Val Phe Leu Asp Cys Cys Asn Tyr Ile Thr Glu Leu Arg Arg 725 730 735 Gln His Ala Arg Ala Ser His Leu Gly Leu Ala Arg Ser Asn Leu Asp 740 745 750 Glu Asp Ile Ile Ala Glu Glu Asn Ile Val Ser Arg Ser Glu Phe Pro 755 760 765 Glu Ser Trp Leu Trp Asn Val Glu Asp Leu Lys Glu Pro Pro Lys Asn 770 775 780 Gly Ile Ser Thr Lys Leu Met Asn Ile Phe Leu Lys Asp Ser Ile Thr 785 790 795 800 Thr Trp Glu Ile Leu Ala Val Ser Met Ser Asp Lys Lys Gly Ile Cys 805 810 815 Val Ala Asp Pro Phe Glu Val Thr Val Met Gln Asp Phe Phe Ile Asp 820 825 830 Leu Arg Leu Pro Tyr Ser Val Val Arg Asn Glu Gln Val Glu Ile Arg 835 840 845 Ala Val Leu Tyr Asn Tyr Arg Gln Asn Gln Glu Leu Lys Val Arg Val 850 855 860 Glu Leu Leu His Asn Pro Ala Phe Cys Ser Leu Ala Thr Thr Lys Arg 865 870 875 880 Arg His Gln Gln Thr Val Thr Ile Pro Pro Lys Ser Ser Leu Ser Val 885 890 895 Pro Tyr Val Ile Val Pro Leu Lys Thr Gly Leu Gln Glu Val Glu Val 900 905 910 Lys Ala Ala Val Tyr His His Phe Ile Ser Asp Gly Val Arg Lys Ser 915 920 925 Leu Lys Val Val Pro Glu Gly Ile Arg Met Asn Lys Thr Val Ala Val 930 935 940 Arg Thr Leu Asp Pro Glu Arg Leu Gly Arg Glu Gly Val Gln Lys Glu 945 950 955 960 Asp Ile Pro Pro Ala Asp Leu Ser Asp Gln Val Pro Asp Thr Glu Ser 965 970 975 Glu Thr Arg Ile Leu Leu Gln Gly Thr Pro Val Ala Gln Met Thr Glu 980 985 990 Asp Ala Val Asp Ala Glu Arg Leu Lys His Leu Ile Val Thr Pro Ser 995 1000 1005 Gly Cys Gly Glu Gln Asn Met Ile Gly Met Thr Pro Thr Val Ile Ala 1010 1015 1020 Val His Tyr Leu Asp Glu Thr Glu Gln Trp Glu Lys Phe Gly Leu Glu 1025 1030 1035 1040 Lys Arg Gln Gly Ala Leu Glu Leu Ile Lys Lys Gly Tyr Thr Gln Gln 1045 1050 1055 Leu Ala Phe Arg Gln Pro Ser Ser Ala Phe Ala Ala Phe Val Lys Arg 1060 1065 1070 Ala Pro Ser Thr Trp Leu Thr Ala Tyr Val Val Lys Val Phe Ser Leu 1075 1080 1085 Ala Val Asn Leu Ile Ala Ile Asp Ser Gln Val Leu Cys Gly Ala Val 1090 1095 1100 Lys Trp Leu Ile Leu Glu Lys Gln Lys Pro Asp Gly Val Phe Gln Glu 1105 1110 1115 1120 Asp Ala Pro Val Ile His Gln Glu Met Ile Gly Gly Leu Arg Asn Asn 1125 1130 1135 Asn Glu Lys Asp Met Ala Leu Thr Ala Phe Val Leu Ile Ser Leu Gln 1140 1145 1150 Glu Ala Lys Asp Ile Cys Glu Glu Gln Val Asn Ser Leu Pro Gly Ser 1155 1160 1165 Ile Thr Lys Ala Gly Asp Phe Leu Glu Ala Asn Tyr Met Asn Leu Gln 1170 1175 1180 Arg Ser Tyr Thr Val Ala Ile Ala Gly Tyr Ala Leu Ala Gln Met Gly 1185 1190 1195 1200 Arg Leu Lys Gly Pro Leu Leu Asn Lys Phe Leu Thr Thr Ala Lys Asp 1205 1210 1215 Lys Asn Arg Trp Glu Asp Pro Gly Lys Gln Leu Tyr Asn Val Glu Ala 1220 1225 1230 Thr Ser Tyr Ala Leu Leu Ala Leu Leu Gln Leu Lys Asp Phe Asp Phe 1235 1240 1245 Val Pro Pro Val Val Arg Trp Leu Asn Glu Gln Arg Tyr Tyr Gly Gly 1250 1255 1260 Gly Tyr Gly Ser Thr Gln Ala Thr Phe Met Val Phe Gln Ala Leu Ala 1265 1270 1275 1280 Gln Tyr Gln Lys Asp Ala Pro Asp His Gln Glu Leu Asn Leu Asp Val 1285 1290 1295 Ser Leu Gln Leu Pro Ser Arg Ser Ser Lys Ile Thr His Arg Ile His 1300 1305 1310 Trp Glu Ser Ala Ser Leu Leu Arg Ser Glu Glu Thr Lys Glu Asn Glu 1315 1320 1325 Gly Phe Thr Val Thr Ala Glu Gly Lys Gly Gln Gly Thr Leu Ser Val 1330 1335 1340 Val Thr Met Tyr His Ala Lys Ala Lys Asp Gln Leu Thr Cys Asn Lys 1345 1350 1355 1360 Phe Asp Leu Lys Val Thr Ile Lys Pro Ala Pro Glu Thr Glu Lys Arg 1365 1370 1375 Pro Gln Asp Ala Lys Asn Thr Met Ile Leu Glu Ile Cys Thr Arg Tyr 1380 1385 1390 Arg Gly Asp Gln Asp Ala Thr Met Ser Ile Leu Asp Ile Ser Met Met 1395 1400 1405 Thr Gly Phe Ala Pro Asp Thr Asp Asp Leu Lys Gln Leu Ala Asn Gly 1410 1415 1420 Val Asp Arg Tyr Ile Ser Lys Tyr Glu Leu Asp Lys Ala Phe Ser Asp 1425 1430 1435 1440 Arg Asn Thr Leu Ile Ile Tyr Leu Asp Lys Val Ser His Ser Glu Asp 1445 1450 1455 Asp Cys Leu Ala Phe Lys Val His Gln Tyr Phe Asn Val Glu Leu Ile 1460 1465 1470 Gln Pro Gly Ala Val Lys Val Tyr Ala Tyr Tyr Asn Leu Glu Glu Ser 1475 1480 1485 Cys Thr Arg Phe Tyr His Pro Glu Lys Glu Asp Gly Lys Leu Asn Lys 1490 1495 1500 Leu Cys Arg Asp Glu Leu Cys Arg Cys Ala Glu Glu Asn Cys Phe Ile 1505 1510 1515 1520 Gln Lys Ser Asp Asp Lys Val Thr Leu Glu Glu Arg Leu Asp Lys Ala 1525 1530 1535 Cys Glu Pro Gly Val Asp Tyr Val Tyr Lys Thr Arg Leu Val Lys Val 1540 1545 1550 Gln Leu Ser Asn Asp Phe Asp Glu Tyr Ile Met Ala Ile Glu Gln Thr 1555 1560 1565 Ile Lys Ser Gly Ser Asp Glu Val Gln Val Gly Gln Gln Arg Thr Phe 1570 1575 1580 Ile Ser Pro Ile Lys Cys Arg Glu Ala Leu Lys Leu Glu Glu Lys Lys 1585 1590 1595 1600 His Tyr Leu Met Trp Gly Leu Ser Ser Asp Phe Trp Gly Glu Lys Pro 1605 1610 1615 Asn Leu Ser Tyr Ile Ile Gly Lys Asp Thr Trp Val Glu His Trp Pro 1620 1625 1630 Glu Glu Asp Glu Cys Gln Asp Glu Glu Asn Gln Lys Gln Cys Gln Asp 1635 1640 1645 Leu Gly Ala Phe Thr Glu Ser Met Val Val Phe Gly Cys Pro Asn 1650 1655 1660 <210> 2 <211> 1744 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Leu Leu Trp Gly Leu Ile Trp Ala Ser Ser Phe Phe Thr Leu 1 5 10 15 Ser Leu Gln Lys Pro Arg Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Val Val His 20 25 30 Leu Gly Val Pro Leu Ser Val Gly Val Gln Leu Gln Asp Val Pro Arg 35 40 45 Gly Gln Val Val Lys Gly Ser Val Phe Leu Arg Asn Pro Ser Arg Asn 50 55 60 Asn Val Pro Cys Ser Pro Lys Val Asp Phe Thr Leu Ser Ser Glu Arg 65 70 75 80 Asp Phe Ala Leu Leu Ser Leu Gln Val Pro Leu Lys Asp Ala Lys Ser 85 90 95 Cys Gly Leu His Gln Leu Leu Arg Gly Pro Glu Val Gln Leu Val Ala 100 105 110 His Ser Pro Trp Leu Lys Asp Ser Leu Ser Arg Thr Thr Asn Ile Gln 115 120 125 Gly Ile Asn Leu Leu Phe Ser Ser Arg Arg Gly His Leu Phe Leu Gln 130 135 140 Thr Asp Gln Pro Ile Tyr Asn Pro Gly Gln Arg Val Arg Tyr Arg Val 145 150 155 160 Phe Ala Leu Asp Gln Lys Met Arg Pro Ser Thr Asp Thr Ile Thr Val 165 170 175 Met Val Glu Asn Ser His Gly Leu Arg Val Arg Lys Lys Glu Val Tyr 180 185 190 Met Pro Ser Ser Ile Phe Gln Asp Asp Phe Val Ile Pro Asp Ile Ser 195 200 205 Glu Pro Gly Thr Trp Lys Ile Ser Ala Arg Phe Ser Asp Gly Leu Glu 210 215 220 Ser Asn Ser Ser Thr Gln Phe Glu Val Lys Lys Tyr Val Leu Pro Asn 225 230 235 240 Phe Glu Val Lys Ile Thr Pro Gly Lys Pro Tyr Ile Leu Thr Val Pro 245 250 255 Gly His Leu Asp Glu Met Gln Leu Asp Ile Gln Ala Arg Tyr Ile Tyr 260 265 270 Gly Lys Pro Val Gln Gly Val Ala Tyr Val Arg Phe Gly Leu Leu Asp 275 280 285 Glu Asp Gly Lys Lys Thr Phe Phe Arg Gly Leu Glu Ser Gln Thr Lys 290 295 300 Leu Val Asn Gly Gln Ser His Ile Ser Leu Ser Lys Ala Glu Phe Gln 305 310 315 320 Asp Ala Leu Glu Lys Leu Asn Met Gly Ile Thr Asp Leu Gln Gly Leu 325 330 335 Arg Leu Tyr Val Ala Ala Ala Ile Ile Glu Ser Pro Gly Gly Glu Met 340 345 350 Glu Glu Ala Glu Leu Thr Ser Trp Tyr Phe Val Ser Ser Pro Phe Ser 355 360 365 Leu Asp Leu Ser Lys Thr Lys Arg His Leu Val Pro Gly Ala Pro Phe 370 375 380 Leu Leu Gln Ala Leu Val Arg Glu Met Ser Gly Ser Pro Ala Ser Gly 385 390 395 400 Ile Pro Val Lys Val Ser Ala Thr Val Ser Ser Pro Gly Ser Val Pro 405 410 415 Glu Val Gln Asp Ile Gln Gln Asn Thr Asp Gly Ser Gly Gln Val Ser 420 425 430 Ile Pro Ile Ile Ile Pro Gln Thr Ile Ser Glu Leu Gln Leu Ser Val 435 440 445 Ser Ala Gly Ser Pro His Pro Ala Ile Ala Arg Leu Thr Val Ala Ala 450 455 460 Pro Pro Ser Gly Gly Pro Gly Phe Leu Ser Ile Glu Arg Pro Asp Ser 465 470 475 480 Arg Pro Pro Arg Val Gly Asp Thr Leu Asn Leu Asn Leu Arg Ala Val 485 490 495 Gly Ser Gly Ala Thr Phe Ser His Tyr Tyr Tyr Met Ile Leu Ser Arg 500 505 510 Gly Gln Ile Val Phe Met Asn Arg Glu Pro Lys Arg Thr Leu Thr Ser 515 520 525 Val Ser Val Phe Val Asp His His Leu Ala Pro Ser Phe Tyr Phe Val 530 535 540 Ala Phe Tyr Tyr His Gly Asp His Pro Val Ala Asn Ser Leu Arg Val 545 550 555 560 Asp Val Gln Ala Gly Ala Cys Glu Gly Lys Leu Glu Leu Ser Val Asp 565 570 575 Gly Ala Lys Gln Tyr Arg Asn Gly Glu Ser Val Lys Leu His Leu Glu 580 585 590 Thr Asp Ser Leu Ala Leu Val Ala Leu Gly Ala Leu Asp Thr Ala Leu 595 600 605 Tyr Ala Ala Gly Ser Lys Ser His Lys Pro Leu Asn Met Gly Lys Val 610 615 620 Phe Glu Ala Met Asn Ser Tyr Asp Leu Gly Cys Gly Pro Gly Gly Gly 625 630 635 640 Asp Ser Ala Leu Gln Val Phe Gln Ala Ala Gly Leu Ala Phe Ser Asp 645 650 655 Gly Asp Gln Trp Thr Leu Ser Arg Lys Arg Leu Ser Cys Pro Lys Glu 660 665 670 Lys Thr Thr Arg Lys Lys Arg Asn Val Asn Phe Gln Lys Ala Ile Asn 675 680 685 Glu Lys Leu Gly Gln Tyr Ala Ser Pro Thr Ala Lys Arg Cys Cys Gln 690 695 700 Asp Gly Val Thr Arg Leu Pro Met Met Arg Ser Cys Glu Gln Arg Ala 705 710 715 720 Ala Arg Val Gln Gln Pro Asp Cys Arg Glu Pro Phe Leu Ser Cys Cys 725 730 735 Gln Phe Ala Glu Ser Leu Arg Lys Lys Ser Arg Asp Lys Gly Gln Ala 740 745 750 Gly Leu Gln Arg Ala Leu Glu Ile Leu Gln Glu Glu Asp Leu Ile Asp 755 760 765 Glu Asp Asp Ile Pro Val Arg Ser Phe Phe Pro Glu Asn Trp Leu Trp 770 775 780 Arg Val Glu Thr Val Asp Arg Phe Gln Ile Leu Thr Leu Trp Leu Pro 785 790 795 800 Asp Ser Leu Thr Thr Trp Glu Ile His Gly Leu Ser Leu Ser Lys Thr 805 810 815 Lys Gly Leu Cys Val Ala Thr Pro Val Gln Leu Arg Val Phe Arg Glu 820 825 830 Phe His Leu His Leu Arg Leu Pro Met Ser Val Arg Arg Phe Glu Gln 835 840 845 Leu Glu Leu Arg Pro Val Leu Tyr Asn Tyr Leu Asp Lys Asn Leu Thr 850 855 860 Val Ser Val His Val Ser Pro Val Glu Gly Leu Cys Leu Ala Gly Gly 865 870 875 880 Gly Gly Leu Ala Gln Gln Val Leu Val Pro Ala Gly Ser Ala Arg Pro 885 890 895 Val Ala Phe Ser Val Val Pro Thr Ala Ala Thr Ala Val Ser Leu Lys 900 905 910 Val Val Ala Arg Gly Ser Phe Glu Phe Pro Val Gly Asp Ala Val Ser 915 920 925 Lys Val Leu Gln Ile Glu Lys Glu Gly Ala Ile His Arg Glu Glu Leu 930 935 940 Val Tyr Glu Leu Asn Pro Leu Asp His Arg Gly Arg Thr Leu Glu Ile 945 950 955 960 Pro Gly Asn Ser Asp Pro Asn Met Ile Pro Asp Gly Asp Phe Asn Ser 965 970 975 Tyr Val Arg Val Thr Ala Ser Asp Pro Leu Asp Thr Leu Gly Ser Glu 980 985 990 Gly Ala Leu Ser Pro Gly Gly Val Ala Ser Leu Leu Arg Leu Pro Arg 995 1000 1005 Gly Cys Gly Glu Gln Thr Met Ile Tyr Leu Ala Pro Thr Leu Ala Ala 1010 1015 1020 Ser Arg Tyr Leu Asp Lys Thr Glu Gln Trp Ser Thr Leu Pro Pro Glu 1025 1030 1035 1040 Thr Lys Asp His Ala Val Asp Leu Ile Gln Lys Gly Tyr Met Arg Ile 1045 1050 1055 Gln Gln Phe Arg Lys Ala Asp Gly Ser Tyr Ala Ala Trp Leu Ser Arg 1060 1065 1070 Gly Ser Ser Thr Trp Leu Thr Ala Phe Val Leu Lys Val Leu Ser Leu 1075 1080 1085 Ala Gln Glu Gln Val Gly Gly Ser Pro Glu Lys Leu Gln Glu Thr Ser 1090 1095 1100 Asn Trp Leu Leu Ser Gln Gln Gln Ala Asp Gly Ser Phe Gln Asp Leu 1105 1110 1115 1120 Ser Pro Val Ile His Arg Ser Met Gln Gly Gly Leu Val Gly Asn Asp 1125 1130 1135 Glu Thr Val Ala Leu Thr Ala Phe Val Thr Ile Ala Leu His His Gly 1140 1145 1150 Leu Ala Val Phe Gln Asp Glu Gly Ala Glu Pro Leu Lys Gln Arg Val 1155 1160 1165 Glu Ala Ser Ile Ser Lys Ala Ser Ser Phe Leu Gly Glu Lys Ala Ser 1170 1175 1180 Ala Gly Leu Leu Gly Ala His Ala Ala Ala Ile Thr Ala Tyr Ala Leu 1185 1190 1195 1200 Thr Leu Thr Lys Ala Pro Ala Asp Leu Arg Gly Val Ala His Asn Asn 1205 1210 1215 Leu Met Ala Met Ala Gln Glu Thr Gly Asp Asn Leu Tyr Trp Gly Ser 1220 1225 1230 Val Thr Gly Ser Gln Ser Asn Ala Val Ser Pro Thr Pro Ala Pro Arg 1235 1240 1245 Asn Pro Ser Asp Pro Met Pro Gln Ala Pro Ala Leu Trp Ile Glu Thr 1250 1255 1260 Thr Ala Tyr Ala Leu Leu His Leu Leu Leu His Glu Gly Lys Ala Glu 1265 1270 1275 1280 Met Ala Asp Gln Ala Ala Ala Trp Leu Thr Arg Gln Gly Ser Phe Gln 1285 1290 1295 Gly Gly Phe Arg Ser Thr Gln Asp Thr Val Ile Ala Leu Asp Ala Leu 1300 1305 1310 Ser Ala Tyr Trp Ile Ala Ser His Thr Thr Glu Glu Arg Gly Leu Asn 1315 1320 1325 Val Thr Leu Ser Ser Thr Gly Arg Asn Gly Phe Lys Ser His Ala Leu 1330 1335 1340 Gln Leu Asn Asn Arg Gln Ile Arg Gly Leu Glu Glu Glu Leu Gln Phe 1345 1350 1355 1360 Ser Leu Gly Ser Lys Ile Asn Val Lys Val Gly Gly Asn Ser Lys Gly 1365 1370 1375 Thr Leu Lys Val Leu Arg Thr Tyr Asn Val Leu Asp Met Lys Asn Thr 1380 1385 1390 Thr Cys Gln Asp Leu Gln Ile Glu Val Thr Val Lys Gly His Val Glu 1395 1400 1405 Tyr Thr Met Glu Ala Asn Glu Asp Tyr Glu Asp Tyr Glu Tyr Asp Glu 1410 1415 1420 Leu Pro Ala Lys Asp Asp Pro Asp Ala Pro Leu Gln Pro Val Thr Pro 1425 1430 1435 1440 Leu Gln Leu Phe Glu Gly Arg Arg Asn Arg Arg Arg Arg Glu Ala Pro 1445 1450 1455 Lys Val Val Glu Glu Gln Glu Ser Arg Val His Tyr Thr Val Cys Ile 1460 1465 1470 Trp Arg Asn Gly Lys Val Gly Leu Ser Gly Met Ala Ile Ala Asp Val 1475 1480 1485 Thr Leu Leu Ser Gly Phe His Ala Leu Arg Ala Asp Leu Glu Lys Leu 1490 1495 1500 Thr Ser Leu Ser Asp Arg Tyr Val Ser His Phe Glu Thr Glu Gly Pro 1505 1510 1515 1520 His Val Leu Leu Tyr Phe Asp Ser Val Pro Thr Ser Arg Glu Cys Val 1525 1530 1535 Gly Phe Glu Ala Val Gln Glu Val Pro Val Gly Leu Val Gln Pro Ala 1540 1545 1550 Ser Ala Thr Leu Tyr Asp Tyr Tyr Asn Pro Glu Arg Arg Cys Ser Val 1555 1560 1565 Phe Tyr Gly Ala Pro Ser Lys Ser Arg Leu Leu Ala Thr Leu Cys Ser 1570 1575 1580 Ala Glu Val Cys Gln Cys Ala Glu Gly Lys Cys Pro Arg Gln Arg Arg 1585 1590 1595 1600 Ala Leu Glu Arg Gly Leu Gln Asp Glu Asp Gly Tyr Arg Met Lys Phe 1605 1610 1615 Ala Cys Tyr Tyr Pro Arg Val Glu Tyr Gly Phe Gln Val Lys Val Leu 1620 1625 1630 Arg Glu Asp Ser Arg Ala Ala Phe Arg Leu Phe Glu Thr Lys Ile Thr 1635 1640 1645 Gln Val Leu His Phe Thr Lys Asp Val Lys Ala Ala Ala Asn Gln Met 1650 1655 1660 Arg Asn Phe Leu Val Arg Ala Ser Cys Arg Leu Arg Leu Glu Pro Gly 1665 1670 1675 1680 Lys Glu Tyr Leu Ile Met Gly Leu Asp Gly Ala Thr Tyr Asp Leu Glu 1685 1690 1695 Gly His Pro Gln Tyr Leu Leu Asp Ser Asn Ser Trp Ile Glu Glu Met 1700 1705 1710 Pro Ser Glu Arg Leu Cys Arg Ser Thr Arg Gln Arg Ala Ala Cys Ala 1715 1720 1725 Gln Leu Asn Asp Phe Leu Gln Glu Tyr Gly Thr Gln Gly Cys Gln Val 1730 1735 1740 <210> 3 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rituximab heavy chain wild type <400> 3 Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr 1 5 10 15 Phe Asn Val Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser 20 25 30 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 35 40 45 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 50 55 60 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 65 70 75 80 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 85 90 95 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 100 105 110 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 115 120 125 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro 130 135 140 <210> 4 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 4 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gtgattggta cttcgacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc tccctggcac cctcctacaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 5 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ser Leu Ala Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 6 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 6 Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile 20 25 30 His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr 35 40 45 Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110 Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr 115 120 125 Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys 130 135 140 Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu 145 150 155 160 Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser 165 170 175 Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala 180 185 190 Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe 195 200 205 Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 7 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 7 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcgacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 8 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 8 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 9 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 9 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc tccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 10 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 10 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ser Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 11 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 11 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctacaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 12 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 12 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 13 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 13 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcgacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc tccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 14 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ser Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 15 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 15 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcgacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctacaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 16 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 16 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 17 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 17 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc tccctggcac cctcctacaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 18 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mutant heavy chain <400> 18 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Ser Leu Ala Pro Ser Tyr Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 19 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 19 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggtg cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccacatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 20 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 20 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Cys Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Thr Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 21 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 21 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggtg cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 22 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 22 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Cys Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 23 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 23 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccacatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 24 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 24 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Thr Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 25 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 25 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactatggcg gcgattggta cttaaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtctac cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 26 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 26 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Leu Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 27 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 27 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttaaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 28 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 28 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Leu Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 29 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 29 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtctac cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 30 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 30 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Tyr Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 31 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 31 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactactgcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcat cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggta aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccaccggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagccgctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaa 1353 <210> 32 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 32 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Cys Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Thr Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Arg Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 33 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 33 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactactgcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 34 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 34 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Cys Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 35 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 35 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcat cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 36 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 36 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Ser Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 37 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 37 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tacttcggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 38 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 38 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 39 <211> 1353 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> encoding mutant heavy chain <400> 39 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccca gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353 <210> 40 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> heavy chain mutant <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Gln Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 41 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (0)...(0) <223> CDRH1 <400> 41 Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn 1 5 <210> 42 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (0)...(0) <223> CDRH2 <400> 42 Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr 1 5 <210> 43 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (0)...(0) <223> CDRH3 <400> 43 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val 1 5 10 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (0)...(0) <223> CDRL1 <400> 44 Ser Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 45 <211> 3 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (0)...(0) <223> CDRL2 <400> 45 Ala Thr Ser 1 <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> DOMAIN <222> (0)...(0) <223> CDRL3 <400> 46 Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr 1 5 <210> 47 <211> 451 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> rituximab heavy chain wild type <400> 47 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly 100 105 110 Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser 115 120 125 Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala 130 135 140 Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val 145 150 155 160 Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala 165 170 175 Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val 180 185 190 Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 195 200 205 Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys 210 215 220 Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly 225 230 235 240 Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met 245 250 255 Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His 260 265 270 Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val 275 280 285 His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr 290 295 300 Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320 Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile 325 330 335 Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val 340 345 350 Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 355 360 365 Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu 370 375 380 Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400 Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val 405 410 415 Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met 420 425 430 His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser 435 440 445 Pro Gly Lys 450 <210> 48 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 48 cgccgtgtat tactgtgct 19 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 49 ggtgggcatg tgtgagttt 19 <210> 50 <211> 1353 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 50 caagtgcagc tgcagcagcc gggtgcagaa ctcgtgaagc caggggcctc agtgaagatg 60 tcctgcaaag ccagcggcta caccttcacc tcctacaaca tgcactgggt caagcaaact 120 cctggacgcg gacttgagtg gattggtgct atctaccccg gaaacggcga caccagctac 180 aatcagaagt ttaaggggaa ggccactctg actgccgaca agtcgtcctc gacggcgtac 240 atgcagctga gctcgctgac ctccgaggac tccgccgtgt attactgtgc tcggtccacc 300 tactacggcg gcgattggta cttcaacgtc tggggagccg gaaccactgt gaccgtgtca 360 gccgcatcca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420 gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480 tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540 tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagctt gggcacccag 600 acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660 cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720 ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc 780 cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac 840 tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac 900 aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc 960 aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc 1020 tccaaagcca aagggcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat 1080 gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac 1140 atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc 1200 gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tatagcaagc tcaccgtgga caagagcagg 1260 tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac 1320 acgcagaaga gcctctccct gtctcccggg aaa 1353

Claims (37)

  1. SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드로서, 상기 서열 내의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환되고, 상기 1개, 2개 또는 3개의 치환된 아미노산 잔기가 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드의 면역-억제 단백질과의 결합을 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환이 없는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 감소시키거나 제거하는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 전장 항체인, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  3. 제1항에 있어서, 이중특이적 항체인, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  4. 제1항에 있어서, 면역-억제 단백질이 CA125/MUC16인, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  5. 제1항에 있어서, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드:
    a. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 5를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    b. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 8을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    c. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 10을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    d. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 12를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    e. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 14를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    f. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 16을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    g. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 18을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    h. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 20을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    i. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 22를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    j. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 24를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    k. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 26을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    l. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 28를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    m. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 30을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    n. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 32를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    o. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 34를 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    p. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 36을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체;
    q. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 38을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체; 및
    r. SEQ ID NO: 6에 따른 경쇄 및 SEQ ID: 40을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체.
  6. 제1항에 있어서, IgG 이소타입 항체의 면역글로불린 경쇄 및 면역글로불린 중쇄로 이루어진 단백질인, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  7. 제1항에 있어서, 전장 IgG 이소타입 항체인, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  8. 제1항에 있어서, IgG 이소타입 항체의 항원-결합 단편 또는 Fab 도메인인, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  9. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기가 SEQ ID NO: 47에 나타낸 바와 같은 리툭시맙 IgG1 중쇄의 위치 102, 103, 107, 108, 109, 122, 130, 131, 134, 136, 151, 161, 167, 169, 189, 196, 201, 및 214로부터 선택되는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  10. 제1항에 있어서, > 1 nM 또는 < 400 nM인 친화도/Kd로 CD20에 결합하는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  11. 제1항에 있어서, > 10 nM 또는 < 50 nM인 친화도/Kd로 CD20에 결합하는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  12. 제1항에 있어서, CD20에 대한 SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드의 친화도/Kd의 ± 50 %인 친화도로 CD20에 결합하는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  13. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기가 SEQ ID NO: 47에 나타낸 바와 같은 리툭시맙 중쇄의 영역 CDR3에서의 위치로부터 선택되는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  14. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기가 SEQ ID NO: 47에 나타낸 바와 같은 리툭시맙의 프레임워크 영역 4에서의 위치로부터 선택되는, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드.
  15. 제1항의 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 벡터.
  16. 제1항의 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제15항의 핵산 벡터를 포함하고, 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 안정한 세포주.
  18. 건강한 인간 집단과 비교하여 상승된 수준의 CA125를 발현하는 질환이 있는 환자를 치료하는 방법으로서,
    제1항의 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 질환이 암인, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 질환이 염증성 질환인, 방법.
  21. 제19항에 있어서, 암이 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 소포림프종, 대세포 림프종, 광범위 큰 B 세포 림프종, 만성 림프성 백혈병 및 다발 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 암 환자 또는 염증성 질환 환자를 치료하는 방법으로서,
    암 환자 또는 염증성 질환 환자에게 하기로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는, 방법:
    (a) 전장 인간 보체 프로단백질(proprotein) C3B 또는 C4B,
    (b) IgG에 결합할 수 있는 인간 보체 단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해(proteolytic) 단편, 또는
    (c) IgG에 결합할 수 있는 인간 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 부분.
  23. 제22항에 있어서, 폴리펩티드가 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  24. 제22항에 있어서, 암 환자 또는 염증 질환 환자가 대조군인 정상 인간 집단과 비교하여 상승된 CA125 수준을 발현하는, 방법.
  25. 제22항에 있어서, 폴리펩티드가 항-CD20 항체와 조합되어 투여되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서, 항-CD20 항체가 리툭시맙인, 방법.
  27. 제22항에 있어서, 환자가 암 환자이고, 추가로 하기를 포함하는, 방법:
    암 환자에게 종양을 표적으로 하는 항체를 투여하는 단계로서, 항체에 의해 매개되는 체액성 면역 반응은 폴리펩티드의 부재 하에서 CA125에 의해 억제되는, 단계.
  28. 제22항에 있어서, 환자가 암 환자이고, 환자는 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, 소포림프종, 대세포 림프종, 광범위 큰 B 세포 림프종, 만성 림프성 백혈병 및 다발 골수종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암이 있는, 방법.
  29. (a) 항-CD20 항체, 및 (b) 전장 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B, IgG에 결합할 수 있는 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편, 또는 IgG에 결합할 수 있는 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 부분을 포함하는 조합물.
  30. 제29항에 있어서, 항-CD20 항체가 리툭시맙인, 조합물.
  31. 제29항에 있어서, 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편을 포함하고, 상기 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편은 C3B 잔기 23-1663, C3B 잔기 23-667, C3B 잔기 569-667, C3B 잔기 672-1663, C3B 잔기 672-748, C3B 잔기 672-747, C3B 잔기 749-1663, C3B 잔기 749-954, C3B 잔기 955-1303, C3B 잔기 955-1001, C3B 잔기 1002-1303, C3B 잔기 1304-1320, C3B 잔기 1321-1663, C4B 잔기 20-675, C4B 잔기 676-679, C4B 잔기 680-1446, C4B 잔기 680-756, C4B 잔기 757-1446, C4B 잔기 957-1336, C4B 잔기 1447-1453, 및 C4B 잔기 1454-1744로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조합물.
  32. 인간 단백질 CA125 및 CD20을 발현하는 인간 암 세포주.
  33. 제32항에 있어서, 인간 난소 암 세포주인, 인간 암 세포주.
  34. 제33항에 있어서, CD20을 인코딩하는 발현 벡터로 세포주 OVCAR3의 세포를 형질도입함으로써 제조되는, 인간 암 세포주.
  35. CD20에 결합하는 후보 항체를 스크리닝하는 방법으로서,
    a. 후보 항체를, 제36항의 인간 암 세포주와 접촉시키는 단계; 및
    b. 후보 항체에 의해 개시되는 인간 암 세포주의 항체 의존 세포성 세포독성(ADCC) 또는 보체 의존 세포독성(CDC)을 결정하는 단계.
  36. 환자에서 CA125를 발현하는 종양을 테스트 및 치료하는 방법으로서,
    (a) 환자로부터 단리된 체액 샘플;을
    (b) SEQ ID NO: 3의 아미노산 서열을 포함하는 항체와 접촉시키고; (a)를 (c) SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 서열을 포함하는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드로서, 여기서 상기 서열 내의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 잔기는 SEQ ID NO: 3에 나타낸 것과 상이한 아미노산 잔기로 치환되고, 상기 1개, 2개 또는 3개의 치환된 아미노산 잔기가 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드의 면역-억제 단백질과의 결합을 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환이 없는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드에 비해 감소시키거나 제거하는 면역-억제 불응성 단백질 또는 폴리펩티드와 접촉시키는 단계; 및
    체액 샘플에서 CA125가 (b)에 결합하나 (c)에 결합하지 않는 것으로 결정하고 (c)로 환자를 치료하거나;
    체액 샘플에서 CA125가 (b) 및/또는 (c)에 결합하는 것으로 결정하고, 환자를 전장 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B, IgG에 결합할 수 있는 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편, 또는 IgG에 결합할 수 있는 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 부분으로 치료하는 단계.
  37. 제22항 또는 제36항에 있어서, 보체 프로단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편이 투여되고, 상기 보체 단백질 C3B 또는 C4B의 천연 발생 단백질분해 단편은 C3B 잔기 23-1663, C3B 잔기 23-667, C3B 잔기 569-667, C3B 잔기 672-1663, C3B 잔기 672-748, C3B 잔기 672-747, C3B 잔기 749-1663, C3B 잔기 749-954, C3B 잔기 955-1303, C3B 잔기 955-1001, C3B 잔기 1002-1303, C3B 잔기 1304-1320, C3B 잔기 1321-1663, C4B 잔기 20-675, C4B 잔기 676-679, C4B 잔기 680-1446, C4B 잔기 680-756, C4B 잔기 757-1446, C4B 잔기 957-1336, C4B 잔기 1447-1453, C4B 잔기 1454-1744로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
KR1020227026554A 2019-12-31 2020-12-29 종양 면역-억제 인자에 대해 불응성인 조작된 모노클로날 항체의 조성물 및 용도 KR20220144797A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962955477P 2019-12-31 2019-12-31
US62/955,477 2019-12-31
PCT/US2020/067345 WO2021138346A1 (en) 2019-12-31 2020-12-29 Composition and use of engineered monoclonal antibodies refractory to tumor immuno-suppressive factors

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220144797A true KR20220144797A (ko) 2022-10-27

Family

ID=76687271

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227026554A KR20220144797A (ko) 2019-12-31 2020-12-29 종양 면역-억제 인자에 대해 불응성인 조작된 모노클로날 항체의 조성물 및 용도

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20230203182A1 (ko)
EP (1) EP4085075A4 (ko)
JP (1) JP7437511B2 (ko)
KR (1) KR20220144797A (ko)
CN (1) CN114901698A (ko)
AU (1) AU2020419050A1 (ko)
BR (1) BR112022012872A2 (ko)
CA (1) CA3165514A1 (ko)
IL (1) IL294257A (ko)
MX (1) MX2022008137A (ko)
WO (1) WO2021138346A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2024040024A1 (en) * 2022-08-15 2024-02-22 Navrogen, Inc. Fc-ENGINEERED MONOCLONAL ANTIBODIES REFRACTORY TO TUMOR IMMUNOSUPPRESSIVE ICAM-1/CD54

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9382327B2 (en) * 2006-10-10 2016-07-05 Vaccinex, Inc. Anti-CD20 antibodies and methods of use
ES2651170T3 (es) * 2010-09-21 2018-01-24 Altor Bioscience Corporation Moléculas de fusión solubles multímeras de IL-15 y métodos para elaborar y usar las mismas
WO2013109279A2 (en) * 2012-01-19 2013-07-25 Therapeutic Proteins Inc. Stabilization of the anti-cd20 antibody rituximab
US20140004037A1 (en) 2012-01-19 2014-01-02 Therapeutic Proteins, Inc. Stabilization of the anti-cd20 antibody rituximab
US20150141620A1 (en) * 2012-06-01 2015-05-21 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods related to rituximab
CN105753986B (zh) 2016-04-24 2019-12-10 赵磊 一类抗cd20靶向抗体及用途

Also Published As

Publication number Publication date
MX2022008137A (es) 2022-10-03
CN114901698A (zh) 2022-08-12
AU2020419050A1 (en) 2022-08-25
JP7437511B2 (ja) 2024-02-22
IL294257A (en) 2022-08-01
CA3165514A1 (en) 2021-07-08
EP4085075A4 (en) 2024-04-03
EP4085075A1 (en) 2022-11-09
US20230203182A1 (en) 2023-06-29
JP2023508706A (ja) 2023-03-03
BR112022012872A2 (pt) 2022-09-06
WO2021138346A1 (en) 2021-07-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2750705C1 (ru) Антитела против TIGIT и их применение
EP3535298B1 (en) Antibodies to pd-1 and uses thereof
KR102366076B1 (ko) 종양 괴사 인자-유사 리간드 1a 특이적 항체 및 그의 조성물 및 용도
JP2023099088A (ja) 活性化可能抗ｐｄｌ１抗体、およびその使用方法
EP2718322B1 (en) Therapeutic antibodies
ES2726040T3 (es) Antagonistas de PCSK9
ES2426816T3 (es) Regiones Fc variantes
KR20200064096A (ko) 항체, 활성화 가능한 항체, 이중특이적 항체 및 이중특이적 활성화 가능한 항체 및 이들의 사용 방법
US20220081480A1 (en) Anti-tim-3 antibodies
US11851460B2 (en) PD1 binding agents
CN113896797A (zh) 双特异性抗体及其用途
CN112996812A (zh) 新颖激动性抗tnfr2抗体分子
EP2935330B1 (en) Anti-notch3 antibodies
JP7436711B2 (ja) 抗ｓｉｒｐ－アルファ抗体
KR20210087029A (ko) 신규한 길항작용 항 tnfr2 항체 분자
CA3232799A1 (en) Methods of treating multiple myeloma
KR20150047602A (ko) 인슐린 유사 성장 인자 1(igf-1)을 증강 또는 억제시키는 모노클로날 항체
CN117098548A (zh) 抗b7-h3抗体及其用途
KR20220144797A (ko) 종양 면역-억제 인자에 대해 불응성인 조작된 모노클로날 항체의 조성물 및 용도
US11655300B2 (en) Colony stimulating factor 1 receptor (CSF1R) antibodies and immunoconjugates thereof
JP2022553927A (ja) Ｉｌｔ－２阻害剤での癌の処置
CN117098773A (zh) 特异于冠状病毒刺突蛋白的抗体及其用途
KR20220061903A (ko) 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도