KR20220061903A - 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 - Google Patents

코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 코로나바이러스 스파이크(spike, S) 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도 {Antibodies specific for coronavirus spike protein and uses thereof}
본 발명은 코로나바이러스 스파이크(spike, S) 단백질에 특이적인 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나 바이러스(coronavirus)는 1937년 닭에서 처음 발견된 뒤 개, 돼지, 조류 등의 동물을 거쳐 1965년에는 사람에게서도 발견되었다. 개기일식 때 태양의 광구가 달에 가려졌을 때 그 둘레에서 하얗게 빛나는 현상인 코로나 현상과 생김새가 비슷하여 이러한 이름이 붙여졌다.
코로나바이러스는 사람과 동물에서 주로 폐렴과 장염을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 간혹 신경계 감염과 간염을 유발하는 것으로도 알려져 있다. 코로나바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약 100-120 nm 크기의 positive sense RNA 바이러스이다. 코로나바이러스는 가장 외각에 있는 spike 단백질 (S), hemagglutinin-esterase (HE) 단백질, transmembrane (M) 단백질, small membrane (E) 단백질 및 nucleocapsid (N) 단백질 등 총 5개의 구조 단백질로 이루어져 있다. 이 중 spike 단백질은 세포 수용체와 결합하는 리간드 역할을 하며, 숙주세포와 바이러스간의 융합을 유도하는 단백질로 가장 변이가 심한 단백질로 알려져 있다.
지금까지 코로나바이러스는 사람에게는 거의 감염되지 않고 주로 개, 돼지, 소 등의 동물에 감염되는 병원균으로 인식되어 왔다. 사람에게 감염될 때에도 호흡기 증상을 유발하는 여러 바이러스 가운데 하나로서 단순한 감기를 유발하거나 어린이에게 위험성이 그리 높지 않은 설사 등의 장 질환을 일으키는 경우가 있을 뿐이었다. 그러나 세계적으로 수백 명이 넘는 사망자와 수천여 명의 환자를 발생시킨 중증 급성 호흡기 증후군(사스; SARS)의 원인균, 중동 호흡기 증후군(메르스;MERS), 및 코로나바이러스 감염증(coronavirus disease 2019; COVID-19)의 원인균이 신종(변종) 코로나바이러스인 것으로 알려지면서 점차적으로 주목 받기 시작하였다.
COVID-19는 2019년 말 중국 후베이 지방의 수도인 우한에서 처음 확인되어 전세계로 확산되어 진행성 팬데믹을 초래한 질환으로, 사스-코로나바이러스-2에 의해 유발되는 감염성 질환이다. 2020년 5월 7일을 기준으로 3.75백만 케이스 이상이 187개국에서 보고되었고, 사망자는 263천명에 이르며, 1.24백만명이 회복되었다. 보편적인 증상은 발열(fever), 기침(cough), 피로(fatigue), 호흡곤란(shortness of breath) 및 후각 및 미각의 상실이다. 대부분의 경우 증상이 경미하나 몇몇은 바이러스성 폐렴(viral pneumonia), 다중기관부전(multi-organ failure) 및 사이토카인 폭풍(cyrokine storm)으로 진행한다. 증상의 발현으로부터 발병까지의 시간은 일반적으로 약 5일이지만 2 내지 14일 사이일 수 있다. 바이러스는 주로 밀접 접촉하는 동안, 때로는 기침, 재채기 및 대화 시 발생하는 비말을 통해 사람 간에 전파된다. 증상 발현 후 처음 3일 동안 가장 전염성이 높으며, 증상이 나타나기 전이나 질환의 말기에라도 전파될 수 있다. 이를 진단하는 표준 방법은 비인두 면봉검사(nasopharyngeal swab)로부터의 실시간 역전사 PCR(real-time reverse transcription polymerase chain reaction; rRT-PCR)을 이용한다.
사스-코로나바이러스-2는 베타 코로나바이러스(Beta coronavirus) 속에 속하는 변종 코로나바이러스로 알려져 있으며, 다양한 코로나바이러스의 1차적인 보유 숙주인 박쥐로부터 유래한 것으로 여겨지며(Antiviral Res., 101:45-56), 그 정확한 감염 경로에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않았다.
한편, 현재까지 개발된 항바이러스제들은 심한 부작용을 나타내고 있으므로, 그 응용에 있어서 많은 주의가 필요하다. 이러한 치료제는 효과적이지 못하며 부작용 또한 나타나고 있는 실정이다. 또한, 아직까지 사스-코로나바이러스-2의 발생을 예방하고 치료하기 위한 감염 억제 효과가 뛰어나고 독성이 적은 우수한 새로운 코로나바이러스 치료제가 없어, 개발의 필요성이 증가하고 있다.
이러한 배경 하에, 본 발명자들은 신규한 사스-코로나바이러스-2 치료제를 개발하기 위해 노력한 결과, SARS-CoV-2 S 단백질의 Receptor Binding Domain (RBD)에 특이적인 신규 항체가 코로나바이러스, 그 중에서도 SARS-CoV-2에 대한 치료 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 항체 또는 상기 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 이용하여, 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 하나의 목적은 상기 항체 또는 상기 결합 단편을 이용하여 코로나바이러스를 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허 문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허 문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명의 하나의 양태는 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
본 발명에서, 용어 "코로나바이러스"는 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하며 구형의 외막을 가지는, 약 80-220 nm 크기의 양성 단일가닥 RNA 바이러스(positive-sense single-stranded RNA virus, ssRNA)를 지칭한다. 코로나바이러스는 가장 외각에 있는 스파이크(S) 단백질, 헤마글루티닌-에스터라제(hemagglutinin-esterase, HE) 단백질, 멤브레인(membrane, M) 단백질, 엔벨로프(envelope, E) 단백질 및 뉴클레오캡시드(nucleocapsid, NP) 단백질 등 5개의 구조 단백질을 포함하는 것으로 알려져 있다(Lai and Homes, 2001. Fields Virology).
일 구현예로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV, SARS-CoV-2 또는 MERS-CoV일 수 있고, 구체적으로 SARS-CoV-2일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 코로나바이러스 스파이크(S) 단백질은 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질의 일부 도메인이 절단된 형태인 스파이크1(spike1, S1)단백질일 수 있으나, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합할 수 있는 코로나바이러스는 제한 없이 포함된다.
본 발명의 용어, "SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2)"는 호흡기 질환인 코로나바이러스감염증-19(COVID-19)를 야기하는 바이러스이다.
SARS-CoV-2는 양성 단일가닥 RNA 바이러스이다. SARS-CoV-2는 분류학적으로 SARS-CoV의 계통(strain)으로, 동물원성 감염증의 기원(zoonotic origins)을 가지며, 박쥐 코로나바이러스와 근접한 유전적 유사성을 갖는 것으로 간주된다. 상기 SARS-CoV-2는 주로 사람들 간의 긴밀한 접촉을 통해 및/또는 기침이나 재채기시 발생하는 비말을 통해 전파되며, 주로 바이러스 외각의 스파이크(S) 단백질이 인간세포 표면에 존재하는 수용체 안지오텐신 전환 효소 2(angiotensin converting enzyme 2, ACE2)에 결합하여 인간세포에 진입하는 것으로 알려져 있다.
SARS-CoV-2는 RNA 의존적 RNA 중합효소 (RNA-dependent RNA polymerase), 스파이크(S), 멤브레인(M), 엔벨로프(E) 및 뉴클레오캡시드(NP) 단백질 및/또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. SARS-CoV-2 구조 단백질 중 스파이크(S) 단백질은 바이러스 입자 표면에 존재하여 숙주세포 침입에 관여하고, S1과 S2로 나누어진다. S1 단백질은 숙주세포의 수용체와 상호작용하는데, S1 단백질 내 존재하는 수용체 결합 도메인(receptor-binding domain, RBD)는 숙주세포 표면에 존재하는 ACE2 수용체와 결합하는 핵심 부위로 알려져 있다. S2 단백질은 숙주세포 세포막과의 융합에 관여한다. 상기 구조에 대한 내용은 Cascella, M., Rajnik, M., Cuomo, A., Dulebohn, S. C., & Di Napoli, R. (2020). Features, Evaluation and Treatment Coronavirus (COVID-19). In StatPearls. Treasure Island (FL)에 상세히 기재되어 있다.
구체적으로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 단편은 SARS-CoV-2의 스파이크(S) 단백질의 일부 도메인이 절단된 형태인 스파이크1(S1)단백질에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 마우스 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체일 수 있다.
그 예로, 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 단편이 인식하는 항원결정부위(에피토프, epitope)는 SARS-CoV-2의 스파이크1(S1) 단백질에 존재하는 결합 도메인(CD)의 일부일 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항체"는 면역학적으로 특정 항원과 반응성을 갖는 면역글로불린 분자를 포함하는, 항원을 특이적으로 인식하는 리간드 역할을 하는 단백질 분자를 의미하며, 다클론 항체, 단일클론 항체, 전체(whole) 항체 및 항체 단편을 모두 포함한다. 또한, 상기 용어는 키메라성 항체(예를 들면, 인간화 뮤린 항체) 및 이가(bivalent) 또는 이중특이성 분자(예를 들어, 이중특이성 항체), 디아바디, 트리아바디 및 테트라바디를 포함한다. 상기 용어는 추가로 FcRn(neonatal Fc receptor)에 대한 결합 기능을 보유한 단쇄 항체, 스캡, 항체 불변 영역의 유도체 및 단백질 스캐폴드에 기초한 인공 항체를 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄(light chain, LC) 및 2개의 전체 길이의 중쇄(heavy chain, HC)를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 상기 전체 항체는 IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG를 포함하며, IgG는 아형(subtype)으로, IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함한다. 일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 IgG 항체일 수 있다.
상기 용어 "단편", "폴리펩타이드의 결합 단편" 및 "항체 단편"은 항체의 항원-결합 활성을 보유하는 본 발명의 항체의 임의의 단편을 지칭하는 것으로 호환적으로 사용된다. 예시적인 항체 단편은 단일 쇄 항체, Fd, Fab, Fab', F(ab')2, dsFv 또는 scFv를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 Fd는 Fab 단편에 포함되어 있는 중쇄 부분을 의미한다. 상기 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 영역(variable region)과 경쇄의 불변 영역(framework region, FR) 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1 도메인)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv(variable fragment)는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체 조각을 의미한다. 이중디설파이드 Fv(dsFv)는 디설파이드 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고, 단쇄 Fv(scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 경쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되어 있다. 이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하며 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 그 예로 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
본 발명에서, 용어 "항원결정부위"는 "에피토프(epitope)"라고도 하며, 항체 또는 항체 단편이 항원에 특이적으로 결합하는 항원의 영역 또는 구역을 지칭한다.
또한, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 카시리비맙(casirivimab, REGN10933), 임데비맙(imdevimab, REGN10987), 및/또는 S309가 결합하는 코로나바이러스 스파이크로부터 유래된 에피토프에 경쟁적으로 결합하는 하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 구현예로, 본 발명에서 제공하는 항체는 단일클론항체일 수 있다.
본 발명에서 용어, "단일클론항체"는 실질적으로 동일한 항체 집단에서 수득한 단일 분자 조성의 항체 분자를 지칭하고, 이러한 단일클론항체는 특정 에피토프에 대해 단일 결합 특이성 및 친화도를 나타낸다.
전형적으로, 면역글로불린은 중쇄 및 경쇄를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역(상기 부위는 도메인으로 또한 알려져 있음)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"이라 함)이라 불리우는 3개의 다변가능한 영역 및 4개의 구조 영역(framework region)을 포함한다. 상기 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 한다. 각각의 사슬의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 불리우고, 또한 특정 CDR이 위치하고 있는 사슬에 의해서 식별된다.
일반적으로, 면역글로불린은 중쇄(heavy chain) 및 경쇄(light chain)를 가지며 각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역(constant region) 및 가변 영역(variable region)을 포함한다. 경쇄 및 중쇄의 가변 영역은, 상보성 결정 영역으로 불리는 3개의 다변가능한 영역(complementarity-determining region, 이하 "CDR"로 명명) 및 4개의 구조 영역(framework region, 이하 "FR"로 명명)을 포함한다. 각 사슬의 CDR은 주로 항원의 에피토프(epitope)에 결합하는 역할을 하며, 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 CDR1, CDR2, CDR3로 명명된다. 또한, 각 사슬의 FR은 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 FR1, FR2, FR3, FR4로 명명될 수 있다.
본 발명에서, 중쇄의 가변영역은 'VH', 경쇄의 가변영역은 'VL'로 명명될 수 있으며, 중쇄의 CDR은 각각 'VH-CDR1', ' VH-CDR2', ' VH-CDR3'으로, 경쇄의 CDR은 각각 'VL-CDR1', 'VL-CDR2', 'VL-CDR3'으로, 중쇄의 FR은 각각 'VH-FR1', 'VH-FR2', 'VH-FR3', 'VH-FR4'로, 경쇄의 FR은 'VL-FR1', 'VL-FR2', 'VL-FR3', 'VL-FR4'로 명명될 수 있다.
일 구현예로, 본 발명의 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 결합 단편은, 서열번호 5 내지 45, 서열번호 87 내지 91, 서열번호 97 내지 115 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 중쇄 가변영역; 및 서열번호 46 내지 86, 서열번호 92 내지 96, 및 서열번호 116 내지 131 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 서열번호 5의 중쇄 가변영역 및 서열번호 46의 경쇄 가변영역; 서열번호 6의 중쇄 가변영역 및 서열번호 47의 경쇄 가변영역; 서열번호 7의 중쇄 가변영역 및 서열번호 48의 경쇄 가변영역; 서열번호 8의 중쇄 가변영역 및 서열번호 49의 경쇄 가변영역; 서열번호 9의 중쇄 가변영역 및 서열번호 50의 경쇄 가변영역; 서열번호 10의 중쇄 가변영역 및 서열번호 51의 경쇄 가변영역; 서열번호 11의 중쇄 가변영역 및 서열번호 52의 경쇄 가변영역; 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 53의 경쇄 가변영역; 서열번호 13의 중쇄 가변영역 및 서열번호 54의 경쇄 가변영역; 서열번호 14의 중쇄 가변영역 및 서열번호 55의 경쇄 가변영역; 서열번호 15의 중쇄 가변영역 및 서열번호 56의 경쇄 가변영역; 서열번호 16의 중쇄 가변영역 및 서열번호 57의 경쇄 가변영역; 서열번호 17의 중쇄 가변영역 및 서열번호 58의 경쇄 가변영역; 서열번호 18의 중쇄 가변영역 및 서열번호 59의 경쇄 가변영역; 서열번호 19의 중쇄 가변영역 및 서열번호 60의 경쇄 가변영역; 서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 61의 경쇄 가변영역; 서열번호 21의 중쇄 가변영역 및 서열번호 62의 경쇄 가변영역; 서열번호 22의 중쇄 가변영역 및 서열번호 63의 경쇄 가변영역; 서열번호 23의 중쇄 가변영역 및 서열번호 64의 경쇄 가변영역; 서열번호 24의 중쇄 가변영역 및 서열번호 65의 경쇄 가변영역; 서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 66의 경쇄 가변영역; 서열번호 26의 중쇄 가변영역 및 서열번호 67의 경쇄 가변영역; 서열번호 27의 중쇄 가변영역 및 서열번호 68의 경쇄 가변영역; 서열번호 28의 중쇄 가변영역 및 서열번호 69의 경쇄 가변영역; 서열번호 29의 중쇄 가변영역 및 서열번호 70의 경쇄 가변영역; 서열번호 30의 중쇄 가변영역 및 서열번호 71의 경쇄 가변영역; 서열번호 31의 중쇄 가변영역 및 서열번호 72의 경쇄 가변영역; 서열번호 32의 중쇄 가변영역 및 서열번호 73의 경쇄 가변영역; 서열번호 33의 중쇄 가변영역 및 서열번호 74의 경쇄 가변영역; 서열번호 34의 중쇄 가변영역 및 서열번호 75의 경쇄 가변영역; 서열번호 35의 중쇄 가변영역 및 서열번호 76의 경쇄 가변영역; 서열번호 36의 중쇄 가변영역 및 서열번호 77의 경쇄 가변영역; 서열번호 37의 중쇄 가변영역 및 서열번호 78의 경쇄 가변영역; 서열번호 38의 중쇄 가변영역 및 서열번호 79의 경쇄 가변영역; 서열번호 39의 중쇄 가변영역 및 서열번호 80의 경쇄 가변영역; 서열번호 40의 중쇄 가변영역 및 서열번호 81의 경쇄 가변영역; 서열번호 41의 중쇄 가변영역 및 서열번호 82의 경쇄 가변영역; 서열번호 42의 중쇄 가변영역 및 서열번호 83의 경쇄 가변영역; 서열번호 43의 중쇄 가변영역 및 서열번호 84의 경쇄 가변영역; 서열번호 44의 중쇄 가변영역 및 서열번호 85의 경쇄 가변영역; 서열번호 45의 중쇄 가변영역 및 서열번호 86의 경쇄 가변영역; 서열번호 87의 중쇄 가변영역 및 서열번호 92의 경쇄 가변영역; 서열번호 88의 중쇄 가변영역 및 서열번호 93의 경쇄 가변영역; 서열번호 89의 중쇄 가변영역 및 서열번호 94의 경쇄 가변영역; 서열번호 90의 중쇄 가변영역 및 서열번호 95의 경쇄 가변영역; 서열번호 91의 중쇄 가변영역 및 서열번호 96의 경쇄 가변영역; 서열번호 100의 중쇄 가변영역 및 서열번호 116의 경쇄 가변영역; 서열번호 101의 중쇄 가변영역 및 서열번호 117의 경쇄 가변영역; 서열번호 102의 중쇄 가변영역 및 서열번호 118의 경쇄 가변영역; 서열번호 103의 중쇄 가변영역 및 서열번호 119의 경쇄 가변영역; 서열번호 104의 중쇄 가변영역 및 서열번호 120의 경쇄 가변영역; 서열번호 105의 중쇄 가변영역 및 서열번호 121의 경쇄 가변영역; 서열번호 106의 중쇄 가변영역 및 서열번호 122의 경쇄 가변영역; 서열번호 107의 중쇄 가변영역 및 서열번호 123의 경쇄 가변영역; 서열번호 108의 중쇄 가변영역 및 서열번호 124의 경쇄 가변영역; 서열번호 109의 중쇄 가변영역 및 서열번호 125의 경쇄 가변영역; 서열번호 110의 중쇄 가변영역 및 서열번호 126의 경쇄 가변영역; 서열번호 111의 중쇄 가변영역 및 서열번호 127의 경쇄 가변영역; 서열번호 112의 중쇄 가변영역 및 서열번호 128의 경쇄 가변영역; 서열번호 113의 중쇄 가변영역 및 서열번호 129의 경쇄 가변영역; 서열번호 114의 중쇄 가변영역 및 서열번호 130의 경쇄 가변영역; 서열번호 115의 중쇄 가변영역 및 서열번호 131의 경쇄 가변영역 중 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2종 이상의 코로나바이러스에 교차반응을 가지는 것일 수 있다. 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV, SARS-CoV-2 또는 MERS-CoV일 수 있으나, 교차반응을 갖는 것이라면 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 상기 2종 이상의 코로나바이러스에 교차반응을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 6 내지 12, 서열번호 14 내지 22, 서열번호 24, 25, 32, 37, 45, 서열번호 87 내지 91, 및 서열번호 97 내지 99 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 중쇄 가변영역; 및 서열번호 47 내지 53, 서열번호 55 내지 63, 서열번호 65, 66, 73, 78, 86, 및 서열번호 92 내지 96중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 서열번호 6의 중쇄 가변영역 및 서열번호 47의 경쇄 가변영역; 서열번호 7의 중쇄 가변영역 및 서열번호 48의 경쇄 가변영역; 서열번호 8의 중쇄 가변영역 및 서열번호 49의 경쇄 가변영역; 서열번호 9의 중쇄 가변영역 및 서열번호 50의 경쇄 가변영역; 서열번호 10의 중쇄 가변영역 및 서열번호 51의 경쇄 가변영역; 서열번호 11의 중쇄 가변영역 및 서열번호 52의 경쇄 가변영역; 서열번호 12의 중쇄 가변영역 및 서열번호 53의 경쇄 가변영역; 서열번호 14의 중쇄 가변영역 및 서열번호 55의 경쇄 가변영역; 서열번호 15의 중쇄 가변영역 및 서열번호 56의 경쇄 가변영역; 서열번호 16의 중쇄 가변영역 및 서열번호 57의 경쇄 가변영역; 서열번호 17의 중쇄 가변영역 및 서열번호 58의 경쇄 가변영역; 서열번호 18의 중쇄 가변영역 및 서열번호 59의 경쇄 가변영역; 서열번호 19의 중쇄 가변영역 및 서열번호 60의 경쇄 가변영역; 서열번호 20의 중쇄 가변영역 및 서열번호 61의 경쇄 가변영역; 서열번호 21의 중쇄 가변영역 및 서열번호 62의 경쇄 가변영역; 서열번호 22의 중쇄 가변영역 및 서열번호 63의 경쇄 가변영역; 서열번호 24의 중쇄 가변영역 및 서열번호 65의 경쇄 가변영역; 서열번호 25의 중쇄 가변영역 및 서열번호 66의 경쇄 가변영역; 서열번호 32의 중쇄 가변영역 및 서열번호 73의 경쇄 가변영역; 서열번호 37의 중쇄 가변영역 및 서열번호 78의 경쇄 가변영역; 서열번호 45의 중쇄 가변영역 및 서열번호 86의 경쇄 가변영역; 서열번호 87의 중쇄 가변영역 및 서열번호 92의 경쇄 가변영역; 서열번호 88의 중쇄 가변영역 및 서열번호 93의 경쇄 가변영역; 서열번호 89의 중쇄 가변영역 및 서열번호 94의 경쇄 가변영역; 서열번호 90의 중쇄 가변영역 및 서열번호 95의 경쇄 가변영역; 서열번호 91의 중쇄 가변영역 및 서열번호 96의 경쇄 가변영역 중 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "인간 항체"는 인간 면역글로불린으로부터 유래하는 분자로서, 상보성 결정영역, 구조 영역을 포함한 항체를 구성하는 모든 아미노산 서열 전체가 인간 면역글로불린의 아미노산 서열로 구성되어 있는 것을 의미한다. 인간 항체는 통상적으로 인간의 질병의 치료에 사용되는데, 이는 3가지 이상의 잠재적인 장점을 가질 수 있다. 먼저, 이는 인간 면역 체계와 보다 양호하게 상호작용하여, 예를 들어 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC) 또는 항체-의존성 세포성 세포독성(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC)에 의하여 목적 세포를 보다 효율적으로 파괴시킬 수 있다. 둘째로, 인간 면역 체계가 상기 항체를 외래의 것으로 인식하지 않는 이점이 있다. 셋째로, 더 적은 양, 보다 적은 빈도의 약물을 투여하였을 때에도 인간 순환계 내 반감기가 천연 발생 항체와 유사하다는 이점이 있다. 따라서 본 발명에 따른 인간 항체들은 코로나바이러스, 그 중에서도 SARS-CoV-2에 대한 예방 또는 치료 효과를 가져 SARS-CoV-2를 치료에 있어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 인간 단일클론항체가 불변 영역을 포함하는 경우, IgG, IgA, IgD, IgE, IgM 유래 또는 이들의 조합(combination) 또는 이들의 혼성(hybrid)에 의한 불변 영역을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "조합(combination)"이란 이량체 또는 다량체를 형성할 때, 동일 기원 단쇄 면역글로불린 불변 영역을 암호화하는 폴리펩타이드가 상이한 기원의 단쇄 폴리펩타이드와 결합을 형성하는 것을 의미한다. 그 예로, IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 불변 영역으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 2개 이상의 불변 영역으로부터 이량체 또는 다량체를 형성할 수 있다.
본 발명에서 용어, "하이브리드(hybrid)"란 단쇄 면역 글로불린 중쇄 불변 영역 내에 2개 이상의 상이한 기원의 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 해당하는 서열이 존재함을 의미하며, 그 예로 IgG, IgA, IgD, IgE 및 IgM의 CH1, CH2, CH3 및 CH4로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1개 내지 4개 도메인으로 이루어진 도메인의 하이브리드가 가능하다.
또한, 본 발명에서 항체 또는 이의 항원 단편 결합은 가변영역 및 불변영역의 유래가 동일하거나 상이할 수 있으며, CDR, 이를 제외한 가변영역 및 불변영역의 유래가 동일 또는 상이할 수 있다.
일 예로, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 단편 결합은 서열번호 139의 중쇄 CDR1; 서열번호 140의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 141의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 142 또는 148의 경쇄 CDR1; 서열번호 143 또는 146의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 144 또는 147의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 서열번호 139의 중쇄 CDR1; 서열번호 140의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 141의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 142의 경쇄 CDR1; 서열번호 143의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 144의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하거나, 서열번호 139의 중쇄 CDR1; 서열번호 140의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 141의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 145의 경쇄 CDR1; 서열번호 146의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 147의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명에서 항체 또는 이의 항원 단편 결합은 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역; 및 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는, 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변영역 및 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변영역을 포함하는 항체를 "M4-4" 또는 "MG1141A"로 명명하였다.
또한, 본 발명의 항체는 서열번호 148, 152 또는 155의 중쇄 FR(Framework region)1; 서열번호 149 또는 156의 중쇄 FR2; 서열번호 150, 153 또는 157의 중쇄 FR3; 및 서열번호 151, 154 또는 158의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 159, 163 또는 166의 경쇄 FR1; 서열번호 160 또는 167의 경쇄 FR2; 서열번호 161, 164 또는 168의 경쇄 FR3; 및 서열번호 162, 165 또는 169의 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 서열번호 148의 중쇄 FR(Framework region)1; 서열번호 149의 중쇄 FR2; 서열번호 150의 중쇄 FR3; 및 서열번호 151의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 159의 경쇄 FR1; 서열번호 160의 경쇄 FR2; 서열번호 161의 경쇄 FR3; 및 서열번호 162의 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, 서열번호 152의 중쇄 FR(Framework region)1; 서열번호 149의 중쇄 FR2; 서열번호 153의 중쇄 FR3; 및 서열번호 154의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 163의 경쇄 FR1; 서열번호 160의 경쇄 FR2; 서열번호 164의 경쇄 FR3; 및 서열번호 165의 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것이거나, 서열번호 155의 중쇄 FR(Framework region)1; 서열번호 156의 중쇄 FR2; 서열번호 157의 중쇄 FR3; 및 서열번호 158의 중쇄 FR4를 포함하는 중쇄 가변영역 및 서열번호 166의 경쇄 FR1; 서열번호 167의 경쇄 FR2; 서열번호 168의 경쇄 FR3; 및 서열번호 169의 경쇄 FR4를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 다른 양태로서, 상기 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 신규 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 공지의 항체 제조기술로 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역된 동물로부터 얻은 B 림프구를 사용하여 하이브리도마를 제조함으로써 수행될 수 있거나(Koeher and Milstein, 1976, Nature, 256:495), 파지 디스플레이(phage display) 기술을 이용함으로써 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
파지 디스플레이 기술을 이용한 항체 라이브러리는 하이브리도마를 제작하지 않고 바로 B 림프구로부터 항체 유전자를 얻어 파지(phage) 표면에 항체를 발현시키는 방법이다. 파지 디스플레이 기술을 이용하면 B-세포 불멸화(immortalization)에 의해 단일클론항체를 생성하는데 관련된 기존의 많은 어려움이 극복될 수 있다. 일반적으로 파지 디스플레이 기술은 1) 파지의 외피 단백질(coat protein) pⅢ(또는 pⅣ) N-말단에 해당하는 유전자 부위에 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 삽입하는 단계; 2) 천연형의 외피 단백질 일부와 상기 무작위 서열의 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 융합 단백질을 발현시키는 단계; 3) 상기 올리고뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드와 결합할 수 있는 수용체 물질을 처리하는 단계; 4) 수용체에 결합된 펩티드-파지 입자들을 낮은 pH나 결합 경쟁력 있는 분자를 이용하여 용출시키는 단계; 5) 패닝(panning)에 의하여 용출된 파지를 숙주 세포 내에서 증폭시키는 단계; 6) 원하는 양을 얻기 위해 상기 방법을 반복하는 단계; 및 7) 패닝에 의해 선별된 파지 클론들의 DNA 서열로부터 활성이 있는 펩티드의 서열을 결정하는 단계로 구성될 수 있다.
본 발명은 또 다른 양태로서, 상기 신규 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 발현 벡터 및 상기 벡터가 도입된 숙주세포를 제공한다.
상기 항체에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명에서 제공하는 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 특별히 이에 제한되지 않으나, 포유류 세포(예를 들어, 사람, 원숭이, 토끼, 래트, 햄스터, 마우스 세포 등), 식물 세포, 효모 세포, 곤충 세포 또는 박테리아 세포(예를 들어, 대장균 등)를 포함하는 진핵 또는 원핵세포에서 상기 폴리뉴클레오티드를 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터가 될 수 있고, 구체적으로는 숙주세포에서 상기 뉴클레오티드가 발현될 수 있도록 적절한 프로모터에 작동가능하도록 연결되며, 적어도 하나의 선별 마커를 포함하는 벡터가 될 수 있다. 그 예로 파지, 플라스미드, 코스미드, 미니-염색체, 바이러스 또는 레트로바이러스벡터 등에 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 형태가 될 수 있다.
상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터는 상기 항체의 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 각각 포함하는 발현 벡터 또는 중쇄 또는 경쇄를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 모두 포함하는 발현 벡터일 수 있다.
본 발명에서 제공하는 상기 발현 벡터가 도입된 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 발현벡터가 도입되어 형질전환된 대장균, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO(중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0(마우스 골수종), 인간 림프아구(human lymphoblastoid), COS, NSO(마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK(베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK(인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6(인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.
본 발명에서 용어, "도입"은 상기 항체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 숙주세포에 전달하는 방법을 의미한다. 이와 같은 도입은 칼슘 포스페이트-DNA 공침전법, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션법, 폴리브렌-매개 형질감염법, 전기충격법, 미세주사법, 리포좀 융합법, 리포펙타민 및 원형질체 융합법 등의 당 분야에 공지된 여러 방법에 의해 수행될 수 있다. 또한, 형질도입은 감염(infection)을 수단으로 하여 바이러스 입자를 사용하여 목적물을 세포 내로 전달시키는 것을 의미한다. 아울러, 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 도입할 수 있다. 본 발명에서 도입은 형질전환과 혼용되어 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, 코로나바이러스 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단방법 또는 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명에서 용어, "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 개체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 개체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것 또는 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위해 개체의 상태를 모니터링 하는 것을 포함한다.
본 발명의 목적상, 상기 진단은 코로나바이러스 감염 질환의 발병 여부를 확인하는 것일 수 있다. 상기 "코로나바이러스 감염 질환"은 코로나바이러스가 숙주가 되는 생물체의 체내에 침입하는 감염에 의해 발병되는 질환을 의미한다. 구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2(사스-코로나바이러스-2) 일 수 있다. 그 예로, 상기 코로나바이러스 감염 질환은 COVID-19일 수 있다.
본 발명의 코로나바이러스 감염 진단용 조성물은 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편 이외의 다른 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 또한, 이 밖에 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합 반응에 필요한 물질, 예를 들어 시약이 더 포함될 수 있다. 또한, 이 결합을 검출하는데 필요한 물질, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 안정화를 위한 물질 등이 더 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 진단용 조성물에 포함되는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 검출을 위해 표지 된 것일 수 있다. 분자 표식에 사용 가능한 다양한 방법들이 당업자에게 잘 알려져 있고, 본 발명의 범주 내에서 고려된다.
본 발명에서 사용될 수 있는 표식 종류의 예로는 효소, 방사성 동위원소, 콜로이드금속, 형광 화합물, 화학발광 화합물 및 생발광 화합물이 있다. 통상적으로 사용되는 표식들은 형광물질(가령, 플루레신, 로다민, 텍사스 레드 등), 효소(가령, 고추냉이 퍼옥시다아제, 베타-갈락토시다아제, 알칼리포스파타 아제), 방사성 동위원소(가령, 32P 또는 125I), 바이오틴, 디곡시게닌, 콜로이드 금속, 화학발광 또는 생발광 화합물(가령, 디옥세탄, 루미놀 또는 아크리디늄)을 포함한다. 효소 또는 바이오티닐기의 공유 결합법, 요오드화법, 인산화법, 바이오틴화법 등과 같은 표식 방법들 역시 잘 알려져 있다.
본 발명의 키트는, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항원의 결합을 검출하는데 필요한 시약, 기구 등이 더 포함될 수 있다.
일 예로, 본 발명의 키트 용기에는 고체 담체가 포함될 수 있다. 본 발명의 항체는 고체 담체에 부착될 수 있고, 이와 같은 고체 담체는 다공성 또는 비다공성, 평면 또는 비평면일 수 있다.
일 예로, 상기 키트는 고체 담체; 분석하고자 하는 검체를 수용하고 버퍼 투입부 및 검체 투입부를 구비하는 검체 패드; 상기 검체 패드에서 유입된 검체에 함유되어 있는 코로나바이러스와 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 컨쥬게이트 패드; 상기 검체에 코로나바이러스가 존재하는지 여부를 검출하는 신호검출부와 분석 물질의 존재 유무와 관계없이 검체가 흡수 패드로 이동하였는지 여부를 확인하는 대조부를 포함하는 신호 검출 패드; 및 신호 검출 반응이 종료된 검체를 흡수하는 흡수 패드를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 예로, 본 발명의 키트는 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 키트 형태일 수 있다. 본 발명의 용어 "ELISA"는 효소면역측정방법이라고도 하며, 항체에 효소를 결합시켜 항원-항체 복합체를 형성함으로써 이의 효소와 기질의 반응을 통해 흡광도를 이용하여 정량하는 방법이다. 상기 ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지 된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지 된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지 된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등을 포함한다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편은 생물학적 시료와 접촉시켜, 반응을 확인하여 생물학적 시료 내 코로나바이러스 존재 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료는 대상의 가래, 침, 혈액, 땀, 폐 세포, 폐 조직의 점액, 호흡기 조직 및 타액으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며 당업자에게 알려진 통상적인 방법으로 준비가 가능하다.
일 예로, 본 발명의 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법은 (a) 본 발명에서 제공하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 접촉으로 형성된, 본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 코로나바이러스 스파이크 단백질의 복합체를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 (b) 단계에서 항체 또는 이의 단편과 코로나바이러스 스파이크 단백질의 복합체는, SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 결합 도메인(CD) 부위 결합체 일 수 있다.
본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 시료 중의 해당 단백질 항원과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 상기 항원-항체 복합체의 검출은 당업계에 공지된 바와 같은 방법, 예를 들어 분광학적, 광화학적, 생물화학적, 면역화학적, 전기적, 흡광적, 화학적 및 기타 방법을 이용하여 검출할 수 있으며, 구체적으로 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 군에서 선택되는 임의의 방법으로 검출할 수 있으며, 웨스턴블랏(western blotting), ELISA, 방사선면역분석법(radioimmunoassay), 방사면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크레로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), 유세포 분석법(fluorescence-activated cell sorting, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등의 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 일 수 있다. 일 예로, 상기 조성물은 COVID-19의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "COVID-19"는 SARS-CoV-2에 감염되어 발생하는 질환을 말한다. 본 발명의 항체는 SARS-CoV-2에 대한 중화능 및 감염 억제능을 나타내므로, 이를 COVID-19의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다.
본 발명에서 용어, "예방"이란 상기 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미할 수 있으며, 상기 "치료"란 상기 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "약학적으로 허용가능한 담체"란 생물체를 자극하지 않고 투여 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체 또는 희석제를 말한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용되는 약학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리 브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액 제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제 및 좌제으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다.
본 발명에서 용어, "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 암의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 항체를 이용하여 코로나바이러스 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
구체적으로, 상기 코로나바이러스는 SARS-CoV-2 일 수 있다.
일 예로, 상기 방법은 상기 항체를 SARS-CoV-2 감염 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 방법은 항체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 약학적 조성물을 코로나바이러스가 감염되거나 감염된 개체에 투여하는 단계를 포함하는 방법일 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 상기에서 설명한 바와 동일하다.
상기 개체는 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 본 발명의 상기 조성물의 투여에 의해 코로나바이러스 감염이 치료되는 개체를 제한없이 포함한다. 이때, 상기 항체는 약학적으로 유효한 양으로 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 이때, 항체는 액제, 산제, 에어로졸, 캡슐제, 장용피 정제 또는 캡슐제 또는 좌제의 형태로 투여할 수 있다. 투여 경로는 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 내 투여, 내피 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비 내 투여, 폐 내 투여, 직장 내 투여 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
상기 방법은 또한 코로나바이러스 감염질환의 예방 또는 치료, 구체적으로는 SARS-CoV-2의 감염질환 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 그 예로, COVID-19의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 상기 항체를 코로나바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 의약품의 제조에 사용하기 위한 용도이다. 상기 의약품은 SARS-CoV-2 감염질환, 예를 들어 COVID-19의 예방 또는 치료에 사용될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 항체 및 SARS-CoV-2 감염의 예방 또는 치료에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.
본 발명의 항체는 코로나바이러스 검출 및 진단에 유용하게 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 코로나바이러스의 중화능을 가지는 바 코로나바이러스 감염질환의 예방 및 치료에도 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 항원을 정제하고 그 산물의 크기 및 순도를 SDS PAGE를 통해 확인한 것이다.
도 2는 Library 스크리닝을 통해 확보한 anti SARS-CoV-2 antibody 발현 및 정제 후 SDS PAGE를 통해 산물의 크기 및 순도를 확인한 것이다. 구체적으로, Non-reduced PAGE를 통해 항체 전체 크기(~150kDa)를 확인하였고, Reduced PAGE를 통해 항체의 중쇄(~50kDa), 경쇄 (~25kDa) 크기를 확인하였다.
도 3은 항원 특이적인 항 COVID-19 항체를 선별하기 위해 sandwich ELISA를 수행한 결과이며, 이를 통해 항원에 특이적 결합을 보이는 항체를 선별하였다.
도 4는 선별된 Anti-SARS-CoV2 항체가 다른 Betacoronavirus인 SARS-CoV, MERS-CoV의 S(S1S2) protein에도 binding을 하는지 실험한 결과를 나타낸 것이다. 도 5는 Humanized 클론의 IgG 발현 및 정제 결과를 SDS-PAGE로 확인한 결과이다. 구체적으로, Non-reduced PAGE를 통해 항체 전체 크기(~150kDa)를 확인하였고, Reduced PAGE를 통해 항체의 중쇄(~50kDa), 경쇄 (~25kDa) 크기를 확인하였다.
도 6는 항원 특이적인 항 COVID-19 humanized 항체를 선별하기 위해 sandwich ELISA를 수행한 결과이다. 구체적으로, humanized 클론 모두 기존과 동일한 결합력을 유지함을 확인한 결과이다.
도 7은 SARS-CoV-2 돌연변이 항원에 대한 humanized 항체의 결합력을 비교한 결과이다. 구체적으로, M4-4, M5-4 두 클론 모두 돌연변이 항원에 대해 wild type 수준 이상의 결합력을 유지함을 확인하였다.
도 8a는 항-SARS-CoV-2 항원에 대한 항체의 결합특성 중 동역학에 대한 결과이다. 구체적으로, humanized 항체인 M4-4는 기존 항체인 M4 대비 10배 이상 높은 해리 상수 값이 측정되었다.
도 8b는 항-SARA-CoV-2 항원에 대한 항체의 결합특성 중 Alpha, Beta, Gamma 돌연변이에 대한 결합력을 평가한 결과이다. 구체적으로, M4-4는 모든 돌연변이에 강한 매우 강한 결합력을 가짐이 확인되었다.
도 9a는 ACE2-HEK293 세포의 ACE2 발현을 유세포 분석기로 관찰한 결과이다.
도 9b는 후보 항체의 SARS-Cov-2 pseudovirus 중화능을 SARS-CoV-2 pseudovirus와 ACE2-HEK293 세포를 이용하여 측정한 결과이다.
도 10a는 HT1080-S 세포의 Spike protein 발현을 유세포 분석기로 관찰한 결과이다.
도 10b는 후보 항체의 ADCC 효능을 ADCC Effector cell과 HT1080-S 세포를 이용하여 측정한 결과이다.
도 10c는 후보 항체의 ADCP 효능을 FcγRIIa-H Effector cell과 HT1080-S 세포를 이용하여 측정한 결과이다.
도 11은 authentic, wild type 항원, alpha, beta, gamma 돌연변이 항원에 대한 항-SARS-CoV-2 항체의 중화 활성을 나타낸 것이다. 구체적으로, M4-4 항체는 모든 경우에서 비교 항체 대비 동등 이상의 중화효능이 관찰되었다.
도 12는 M4-4 항체의 에피토프 비닝 결과이다. 구체적으로, M4-4는 REGN10987, S309, ACE2 수용체와 100% 경쟁할 수 있는 넓은 에피토프에 결합함을 유추할 수 있는 결과이다.
도 13은 M4-4 항체의 에피토프를 simulation docking으로 예측한 결과이다. 구체적으로, 에피토프 예측 데이터와 일치함을 확인하였다.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실험예 1. 재조합 단백질 발현 및 정제
SARS-CoV-2 스파이크 당단백질의 외부 도메인(spike-ECD) 및 RBD(RBD-his)를 인코딩하는 유전자를 합성하고 C-말단 6x 히스티딘 태그가 있는 pCIW 포유류 발현 벡터에 클로닝하였다. RBD-Fc 및 인간 ACE2-Fc를 코딩하는 유전자를 pCIW 벡터에 클로닝하였다. pCIW 포유동물 벡터를 Expi293FTM 세포(카탈로그 번호 A1435101)에 형질전환시켰다. 발현의 분석을 위한 모든 단계는 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 세포배양 5-6일 후, 원심분리에 의해 세포를 수확하고, 상청액을 0.22μm 필터에 통과시켜 세포 파편을 제거하였다. 재조합 단백질의 His-tag 정제를 위해 Ni-NTA 수지를 상등액에 첨가하였다. MabSelect Xtra(Cat. no. 17-5269-02, GE Healthcare)를 Fc 융합 단백질의 protein-A 정제용 수지로 사용하였다. 모든 정제과정은 제조사의 지침에 따라 수행되었다. 용출된 단백질의 완충액은 Zeba Spin Desalting Columns를 사용하여 PBS(phosphate-buffered saline)로 교체하였다. 단백질 농도는 Nanodrop 2000C 분광광도계(Thermo Scientific)를 사용하여 정량화하였다(도 1).
실험예2. SARS-CoV2 spike 단백질에 대한 항체 생산
SARS-CoV2 spkie 단백질에 대한 항체를 생산하기 위해 일반적인 항체 생산 기술들을 사용하였다. 구체적으로 인간 B 세포 유래 라이브러리, 마우스 면역 라이브러리, 인간 도메인 항체 합성 라이브러리를 구축 및 스크리닝하였다. 스크리닝은 통상적으로 이용되는 단일 클론 ELISA 방법을 이용하였다. 단일 클론 ELISA 스크리닝 방법은 spike 단백질에 단일 클론에서 발현된 항체를 섞어 해당 항체가 spike 단백질에 특이적인지 확인하는 방법으로 스크리닝 결과 인간 B 세포 유래 라이브러리에서 41개 (클론 1~41), 마우스 면역 라이브러리에서 5개(클론 M1~M5), 인간 도메인 항체 합성 라이브러리에서 3개(클론 5E9, 6D9, 6H10)의 spike 단백질에 특이적인 클론을 확보하였다. 서열 분석을 통해 확보된 항체의 중쇄, 경쇄 서열을 확인하였다(도 3, 표 1, 표 2, 표 3). 다만, 인간 도메인 항체 합성 라이브러리에서 확보한 클론은 합성 라이브러리 자체가 중쇄 서열로만 이루어진 라이브러리이기 때문에 중쇄 서열 정보만을 포함하였다.
클론 가변영역 아미노산서열 서열번호
1 중쇄 EVQLVQSGAEVQKPGSSVKVSCKASGGTFSSYPISWVRQAPGQGLEWMGKIIPILGIPNYAQRFQGRVTITADKSTGTAYLDLSSLSSEDTAVYYCARAGGYSGYGAHYYMDVWGKGTLVTVSS 5
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSVFGGGTKLTVLG 46
2 중쇄 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNFAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVFYCAKDLYGGPGSSTFDYWGQGTLVTVSS 6
경쇄 DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLPLTFGPGTKVDIKR 47
3 중쇄 QVQLVQSGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNFAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVFYCAKDLYGGPGSSTFDYWGQGTLVTVSS 7
경쇄 AIWMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGNGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR 48
4 중쇄 EDQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNFAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRVEDTAVFYCAKDLYGGPGSSTFDYWGQGTLVTVSS 8
경쇄 DIVMTQTPSSLSASVGDRVTITCQASQDISIYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASILETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYFSYPITFGGGTKVEIKR 49
5 중쇄 EDQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSNFAMSWVRQAPGKGLEWVSGISGSGGSTSYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVFYCAKDLYGGPGSSTFDYWGQGTLVTVSS 9
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASEDITDYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASILETGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQYDGLPLFGPGTKVDIKR 50
6 중쇄 QLQLQESGGGWVQPGRSLRLTCATSGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGITWNSDSIGYADSVKGRFTISRDDAKNSLYLQMDNLRPEDTALYYCVKDSAYRILPYWYFDLWGRGTTVTVSS 10
경쇄 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNYLNWYQQIPGKAPKLLMYAATRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTIYSLQPEDFATYYCQQSFGSPYTFGQGTKLEIKR 51
7 중쇄 EVQLVESGGDLVQPGGSLRISCAASGFAVSNNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIHTDGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGFGELLGSDAFDIWGQGTMVTVSS 11
경쇄 AIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPHTFGPGTKVDIKR 52
8 중쇄 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCVASGFTFRTFEMNWVRQAPGKGLEWVSYISPSGSSIYNADSVKGRFTISRDNARNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSYYGGSAFDIWGQGTMVTVSS 12
경쇄 SYELTQPSSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGWVFGGGTKLTVLG 53
9 중쇄 EVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCVASGFTFRTFEMNWVRQAPGKGLEWVSYISPSGSSIYNADSVKGRFTISRDNARNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSYYGGSAFDIWGQGTTVTVSS 13
경쇄 SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIERNIVNWYQQVPGTAPKLLIYTNSHRPSGVPDRFSGSKSGSAASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDTLNGWVFGGGTKLTVLG 54
10 중쇄 EVQLVQSGGGSVQPGGSLRLSCAASGFTFRTFEMNWVRQAPGKGLEWVSYISPSGSSIYNADSVKGRFTISRDNARNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGSYYGGSAFDIWGQGTMVTVSS 14
경쇄 QSVPTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGRWVFGGGTKLTVLG 55
11 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDHWGQGTLVTVSS 15
경쇄 QSALTQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSKRPSGVPDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCCSYAGSYTWVFGGGTKLTVLG 56
12 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGNGGSTSYAASVQGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 16
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGYVFGTGTKVTVLG 57
13 중쇄 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFRGYAMHWVRQAPGKGLEWVAVISEDGSDEYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 17
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGYVFGTGTELTVLG 58
14 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 18
경쇄 SYELTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGYVFGTGTKVTVLG 59
15 중쇄 QVQLVESGGTLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYAMNWVRQAPGKGLEWVSSVSGRGDTTHYADSVKGRFTISRDNRENKLYLQMHSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 19
경쇄 QAGLTQPPSVSGAPGQRVTMSCTGTTSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGYVFGTGTKVTVLG 60
16 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSDDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 20
경쇄 SYELTQPLSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVLG 61
17 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFSSSYYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 21
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVLG 62
18 중쇄 EVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSDDTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 22
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQDEDEADYYCQSYDSSLSEYVFGTGTKVTVLG 63
19 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 23
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNFGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNDNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQDEDEADYYCQSYDSSLSEYVFGTGTQLTDLG 64
20 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFRTYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSSDDTTYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTTVTVSS 24
경쇄 QSALIQPRSVSGSPGQSVTISCTGTSSNVGVYNYVSWYQQHPGKAPKLIIYDVTKRPSGVPDRFSGSKSGNTGSLTISGLQAEDEADYYSCSYAGSYTWVFGPGTKVTVLS 65
21 중쇄 QVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 25
경쇄 QTVVTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSGVFGGGTKLTVLG 66
22 중쇄 EVQLVESGGGLAQSGGSLRLSCEASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 26
경쇄 SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDYNLSGYVSGTGTKVTVLG 67
23 중쇄 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 27
경쇄 TYELSQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGADYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSGSLAITGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGYVFGTGTKVTVLG 68
24 중쇄 EVQLVESGGAMVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 28
경쇄 QPVLTQPPSVSGAPGQRVTITCTGSGSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGAPDRVSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRTYVFGTGTKVTVLG 69
25 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISKDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 29
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGRVFGGGTKLTVLG 70
26 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 30
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSNLSGYVFGTGTKVTVLG 71
27 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 31
경쇄 SYELMQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLRAYVFGTGTKVTDLG 72
28 중쇄 QVQLVQSGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 32
경쇄 DVVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGITNDLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYDTPPYTFGQGTKLEIKR 73
29 중쇄 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 33
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSTVFGGGTELTVLG 74
30 중쇄 EVQLVETGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 34
경쇄 SYELTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDNSLSGVFGGGTKLTVLG 75
31 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQEGSEKYYVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 35
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQVPGTAPKLLIYGNINRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGSYVFGTGTKVTVLG 76
32 중쇄 QVQLVQSGGGVVQPGGSLRLSCAASGFTFSGYGMNWVRQAPGKGLEWVADIEKDGGERNYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGYYYGSGSYYKPKVVFDYWGQGTLVTVSS 36
경쇄 QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQHLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDGSLSGWVFGGGTKLTVLG 77
33 중쇄 EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTFSSFWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYSVDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHGIYCSGDNCYYFAPTLSSHAFDIWGQGTMVTVSS 37
경쇄 AIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR 78
34 중쇄 QVQLVQSGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGSSWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAIIPGDGYNYPGASDFDYWGQGTLVTVSS 38
경쇄 QPVLTQPPSASGTPGQRVIISCSGSSSNIGSHTVNWYQQLPGTAPKLLIYNNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSADEADYSCAAWDDSLNGYVFGTGTKVTVLG 79
35 중쇄 EVQLLESGGGLVQPGRSLKLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGSSWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAIIPGDGYNYPGASDFDYWGQGTLVTVSS 39
경쇄 QSALTQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVGQRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSSYVFGTGTKVTVLG 80
36 중쇄 QVTLKESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGSSWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAIIPGDGYNYPGASDFDYWGQGTLVTVSS 40
경쇄 SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSDHVVFGGGTQLIILG 81
37 중쇄 QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSGSSWNSGTIGYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTALYYCAIIPGDGYNYPGASDFDYWGQGTTVTVSS 41
경쇄 RPVLTQPPSASGTPGQRATISCSGSSSNIGSNTVNWYRQLPGTAPKLLIHSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCATWDDSLDGWVFGGGTKLTVLG 82
38 중쇄 QVQLVQSGAEVKKPGASVRVSCKASGYTFSSYYTHWVRQAPGQGLEWMGIINPSGGSTIYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARLPRDGVHASDIWGQGTTVTVSS 42
경쇄 QTVVTQEPSVSAAPEQKVTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPKLLIYDNNKRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGTWDSSLSAYVFGTGTKVTVLG 83
39 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYYMGWVRQAPGKGLEWVSLISGSGGSTYYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPPYSFDSMSESDYWGQGTLVTVSS 43
경쇄 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSGSNVENNYVSWYQQLPGTAPKLLIYENNNRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGVWDDSLNHVIFGGGTKLTVLG 84
40 중쇄 QVQLQDSGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYDWSWIRQPPGKGLEWIGDIYNSGSTKYNPSLKSRVTISVDTSKNQLSLKLSSVTAADTAVYYCARRGLGNYDILTGYFENAFDIWGQGTTVTVSS 44
경쇄 EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPRTFGQGTRLEIKR 85
41 중쇄 ETQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYSMNWVRQAPGKGLEWVSYISSSTSTIYYADSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTRLTQLAMIGRGGNAFDIWGQGTMVTVSS 45
경쇄 SYELTQPPSVSVAPGKTARITCGGNNIGSKSVHWYQQKPGQAPVLVVYDDSDRPSGIPERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYYCQVWDSSSVVFGGGTKLTVLG 86
클론 가변영역 아미노산서열 서열번호
M1 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSTYYMGWVRQAPGKGLEWVSLISGSGGSTYYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPPYSFDSMSESDYWGQGTLVTVS 87
경쇄 QSVLTQPPSVSAAPGQKVTISCSGSGSNVENNYVSWYQQLPGTAPKLLIYENNNRPSGIPDRFSGSKSGTSATLGITGLQTGDEADYYCGVWDDSLNHVIFGGGTKLTVLG 92
M2 중쇄 QAYLQQSGAELVRSGASVKLSCTASGFNIKDYYMHWVKQRPEQGLEWIGWIDPENGDTEYAPKFQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLTSEDTAVYYCNEDGNYDYWGQGTTLTVSS 88
경쇄 DVVVTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYAGDSYMNWYQQKPGQPPKLLIYAASNLESGIPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQQSNEDPWTFGGGTKLEIKR 93
M3 중쇄 EVQLLESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYDMSWVRQTPEKRLDWVASISSSGGTYYPDSVKGRFTISRDIARNILYLQMNSLRSEDTAMYYCVRGDYWGQGTTLTVSS 89
경쇄 DIVMTQSHKFMSASVGDRVNITCKASQDVGTAVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVQSEDLADYFCQQYTRYSNTFGGGTKLEIKR 94
M4 중쇄 DVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQTPDKRLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCVRPNDGYFDYWGQGTTLTVSA 90
경쇄 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTDVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKR 95
M5 중쇄 EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQTPDKRLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTTLTVSS 91
경쇄 DVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQQSYSAPYTFGGGTKLEMK 96
클론 가변영역 아미노산서열 서열번호
5E9 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTTYDMGWVRQAPGKGPEWVSLISSGGSNTWYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK EKYPYSDCDY WGQGTLVTVSS 97
6D9 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTDYDMGWVRQAPGKGPEWVSLISGDSGNTWYDDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAK YRGTTKDY WGQGTLVTVSS 98
6H10 중쇄 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTNYYMGWVRQAPGKGPEWVSLISYDGSSTWYDDSVKGRFAISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCAK PDY WGQGTLVTVSS 99
실험예 3. 항체의 발현 및 정제
항-SARS-CoV-2 scFv는 pCIW로 서브클로닝하여 인간 IgG1 형식으로 전환되었다. Expi293FTM 세포는 30 mL Expi293TM 발현 배지에서 2.5 Х 106 cells/mL 농도로 준비했다(37℃, 8% CO2, 125 rpm, 생존율 ≥ 95%). 이들 세포는 30㎍의 DNA(pCLW-항-SARS-CoV-2 중쇄: 15㎍, pcIw-항-SARS-CoV-2 경쇄: 15㎍), OptiProTM SEM 배지 및 ExpiFectamineTM 293 시약으로 구성된 DNA 혼합물로 형질전환시켰다. 발현된 supernatant에 PBS로 세척된 protein A resin 0.1 mL 넣어준 후 4℃에서 하룻밤 인큐베이션 하였다. 정제용 column에 옮긴 후 IgG binding buffer로 resin의 20배 이상 세척하였다. Elution buffer를 이용하여 결합된 IgG를 용출시켰다. 280 nm wavelength를 이용하여 농도를 측정한 후 취합하였다(도 2).
Desalting column 을 1000 g, 2 min간 원심분리를 하여 보존액을 걸러냈다. PBS buffer를 column의 용량에 맞게 넣어준 후 1000 g, 2 min간 원심분리를 하여 column washing을 3회 반복 하였다. 시료를 넣은 후 1000 g, 2 min 간 원심분리하고 280 nm wavelength를 이용하여 농도를 재측정하였다.
실험예 4. ELISA를 통한 IgG Cross-reactivity 확인
IgG1 형태로 전환에 성공한 클론 29종에 대한 cross-reactivity 측정을 위한 ELISA를 진행하였다. ELISA plate에 항원 3 μg/ml, 50 ㎕를 4℃에서 overnight coating 시켰다. 항원은 Recombinant SARS (1-1190) (Beta Lifescience, BLIT-0210), SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1+S2 ECD, His tag) (Sino Biological., 40589-V08B1), MERS-CoV Spike Protein (ECD, aa 1-1297, His Tag) (Sino Biological., 40069-V08B)를 사용하였다. 다음날, ELISA plate의 항원를 제거하고 PBS + tween20 0.05%로 3회 washing 하였다. 항원이 코팅 된 각 well에 PBS +BSA 5% 200 ㎕로 상온에서 1시간 blocking 시켜주었다. 1시간 뒤, PBS + tween 20 0.05%로 3회 washing 해준다. 35종 항체 농도는 300 nM로 희석하여 측정하였다. 희석한 항체 50 ㎕를 각 well에 넣고 상온에서 1시간 binding 시켜주었다. 다시 PBS + tween 20 0.05%로 3회 washing 하였다. Anti-human Fc-HRP (3000: 1) 50 ㎕를 각 well에 넣고 상온에서 1시간 incubating 하였다. PBS + tween 20 0.05%로 3회 washing 하였다. TMB solution 50 ㎕를 각 well에 넣어주고 1-15분 incubating 시켰다. stop solution 50 ㎕를 각 well에 넣어 반응을 중단하였다. ELISA reader기로 발색 정도를 측정하였다.
선별된 IgG의 SARS-CoV-2, SARS-CoV, MERS-CoV에 대한 cross-reactivity 실험 결과 두 개 이상의 코로나바이러스에 cross-reactivity를 가지는 클론을 확인하였다(표 4, 도 4).
Clone SARS-CoV-S1S2 SARS-CoV2-S1S2 MERS-CoV-S1S2
2 2.446 2.4908 2.027 2.027 0.0732 0.0721
3 2.4794 2.5186 1.9015 1.8947 0.07 0.0765
4 2.4746 2.5391 1.9973 1.9937 0.0769 0.0719
5 2.481 2.5269 1.9471 1.9842 0.0773 0.0743
6 0.0838 0.081 0.2018 0.1948 0.0816 0.0842
7 0.7374 0.7917 2.2017 2.2618 0.0759 0.0758
8 1.5787 1.6213 2.2563 2.3055 0.0811 0.0743
10 1.4732 1.6543 2.2592 2.322 0.0824 0.0718
11 1.6712 1.7502 2.189 2.243 0.0896 0.0937
12 1.5002 1.5042 2.2436 2.2271 0.0851 0.0862
13 1.5442 1.5971 2.1301 2.2009 0.0763 0.0754
14 1.7089 1.6739 2.3198 2.2674 0.0795 0.0801
15 1.6942 1.6906 2.2577 2.2371 0.0945 0.0899
16 1.6185 1.6898 2.2151 2.2353 0.072 0.0721
17 1.5754 1.6017 2.1343 2.2118 0.0837 0.087
18 1.6126 1.5299 2.1413 2.2009 0.0814 0.0772
20 1.2254 1.2087 2.375 2.3156 0.1114 0.0909
21 1.7254 1.7082 2.3127 2.2976 0.0822 0.0809
28 0.8419 0.8235 2.2509 2.2324 0.0759 0.0736
33 1.589 1.6232 2.081 2.128 0.1097 0.1014
41 1.8776 1.9265 2.2973 2.3247 0.0892 0.0893
5E9 0.2944 0.2779 0.8921 0.9043 0.4069 0.3855
6D9 0.3894 0.3859 0.9972 0.9911 0.4242 0.3948
6H10 0.4795 0.4939 2.0931 2.0575 0.5794 0.5073
M1 0.2098 0.1506 0.9114 0.8545 0.3014 0.2892
M2 0.2735 0.2355 1.2127 1.1994 0.5101 0.53
M3 2.6159 2.6175 2.2611 2.285 0.0799 0.0732
M4 0.1178 0.1186 1.953 1.9824 0.0779 0.0751
M5 0.0773 0.0777 1.9465 1.9842 0.0837 0.0814
huCCM1 ab 0.0689 0.0709 0.1381 0.1178 0.0698 0.0716
구체적으로, ELISA를 통한 cross-reactivity test를 통해 2,3,4,5,7,8,10,11,12,13,14,15,16,17,18,20,21,28,33,41,M3 (21종) 항체는 SARS-CoV1에도 binding (cut-off O.D. 0.5 이상)하는 것을 확인하였다. 또한, 6H10, M3 항체 (2종)는 MERS-CoV에도 binding (cut-off O.D. 0.5 이상)하는 것을 확인하였다. 이 결과를 통해 anti-SARS-CoV2 항체 중 SARS-CoV 또는 MERS-CoV2에도 cross-reactivity를 보이는 클론을 선별할 수 있었다(도 4).
실험예 5. M4와 M5에 대한 키메라 항체(chimeric antibodies)의 제조
마우스 면역 클론 중 M4, M5 클론에 대하여 Humanization을 진행하였다. M4, M5 항체의 framework region 서열은 mouse germline 서열 IGHV5-6 과 IGKV6-32 서열로 각각 identification 되었다. M4, M5 클론은 HCDR 서열은 동일하고, LCDR 은 다르다. Humanization 을 위하여 일반적인 방법인 CDR-grafting 을 이용하였다. M4, M5 와 가장 높은 상동성을 가지는 인간 framework 을 검색하기 위하여 Igblast search 를 진행하였다. 검색 결과 IGHV3-21 과 IGKV1-39와 가장 상동성이 높음을 확인하였고, M4, M5 의 CDR을 인간 항체 뼈대 IGHV3-21 과 IGKV1-39 각각 grafting 시켰다. Grafting 이 후 framework의 변화로 안정성 및 affinity 감소를 최소화 하고자 항체 구조의 안정성과 CDR 의 canonical structure 를 결정하는 중요 역할을 하는 core residue 를 확인 후 추가 돌연변이를 도입하여 variant 를 디자인 하였다 (표 5).
디자인 완료한 M4, M5 항체의 유전자 서열을 합성하여 insert로 사용하였다(서열번호 132번 내지 138번). 합성한 유전자는 infusion cloning 방법으로 클로닝 되었으며 키메라 항체의 배양 및 정제는 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다(도 5).
클론 가변영역 아미노산 서열 서열번호
M4-1 중쇄
(H original)		 DVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQTPDKRLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCVRPNDGYFDYWGQGTTLTVSA 100
경쇄
(hM4-k2)		 DIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQDVSTDVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKR 116
M4-2 중쇄
(H original)		 DVMLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQTPDKRLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCVRPNDGYFDYWGQGTTLTVSA 101
경쇄
(hM4-k3)		 DIVMTQSPATLSVSPGDRVSISCRASQDVSTDVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKR 117
M4-3 중쇄
(H1)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVSTISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 102
경쇄
(4k original)		 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTDVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKR 118
M4-4 중쇄
(H1)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVSTISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 103
경쇄
(hM4-k2)		 DIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQDVSTDVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKR 119
M4-5 중쇄
(H1)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVSTISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 104
경쇄
(hM4-k3)		 DIVMTQSPATLSVSPGDRVSISCRASQDVSTDVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKR 120
M4-6 중쇄
(H2)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 105
경쇄
(4k original)		 DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTDVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTINSVQAEDLALYYCQQHYSTPWTFGGGTKLEIKR 121
M4-7 중쇄
(H2)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 106
경쇄
(hM4-k2)		 DIVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQDVSTDVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKR 122
M4-8 중쇄
(H2)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 107
경쇄
(hM4-k3)		 DIVMTQSPATLSVSPGDRVSISCRASQDVSTDVAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYSTPWTFGGGTKVEIKR 123
M5-1 중쇄
(H original)		 EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQTPDKRLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTTLTVSS 108
경쇄
(hM5-k1)		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIKR 124
M5-2 중쇄
(H original)		 EVKLVESGGDLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQTPDKRLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNTLYLQMSSLKSEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTTLTVSS 109
경쇄
(hM5-k2)		 DVVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVSNDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIKR 125
M5-3 중쇄
(H1)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVSTISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 110
경쇄
(5k original)		 DVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQQSYSAPYTFGGGTKLEMK 126
M5-4 중쇄
(H1)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVSTISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 111
경쇄
(hM5-k1)		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIKR 127
M5-5 중쇄
(H1)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVSTISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 112
경쇄
(hM5-k2)		 DVVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVSNDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIKR 128
M5-6 중쇄
(H2)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 113
경쇄
(5k original)		 DVVMTQTPKFLLVSAGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGYGTDFTLTINSVQAEDLAVYYCQQSYSAPYTFGGGTKLEMK 129
M5-7 중쇄
(H2)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 114
경쇄
(hM5-k1)		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQSVSNDVAWYQQKPGKAPKLLIYYASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIKR 130
M5-8 중쇄
(H2)		 EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSRGMSWVRQAPGKGLEWVATISFGDIYTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLKAEDTAIYYCARPNDGYFDYWGQGTLVTVSS 115
경쇄
(hM5-k2)		 DVVMTQSPATLSVSPGERATLSCKASQSVSNDVAWYQQKPGQAPRLLIYYASNRYTGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSLQSEDFAVYYCQQSYSAPYTFGGGTKVEIKR 131
실험예 6. Humanized 항체의 Spike protein에 대한 결합력 평가
각각의 humanized 항체가 SARS-CoV2 spike protein에 특이적으로 결합하는지 확인하기 위하여 ELISA를 진행하였다. ELISA plate에 spike protein을 3 μg/ml, 각 well 당 100㎕씩 4℃에 하룻밤 코팅하였다. 다음날, ELISA plate의 spike protein을 제거하고 각 well에 PBS + BSA 2% 200 ㎕로 37℃에서 1시간 blocking 하였다. PBS + tween 20 0.05%로 3회 세척하였다. M4, M5 및 각각의 humanized 항체를 초기 농도(100nM)로부터 PBS로 3배씩 11번 희석하여 최종농도를 0.5pM로 설정한다. 희석한 항체 용액을 100 ㎕를 각 well에 넣고, 37℃에서 1시간 바인딩시켰다. 다시 PBS + tween 20 0.05%로 3회 세척하였다. HRP conjugated anti-Human IgG-Fc antibody (5000:1) 50㎕를 각 well에 넣고 37℃에서 1시간 인큐베이팅 시켰다. PBS + tween 20 0.05%로 4회 세척하였다. TMB solution 50㎕를 각 well에 넣어주고 5분 인큐베이팅 시켰다. Stop solution 50㎕를 각 well에 넣어 반응을 중단하였다. Spike 단백질에 대한 Humanized 클론의 결합력을 평가한 결과 humanization 을 진행한 후에도 모두 기존 M4, M5 수준의 결합력을 유지함을 확인하였다(도 6).
실험예 7. RBD 및 spike protein mutant에 대한 항체의 결합력 평가
M4의 humanized 항체 M4-4와 M5의 humaizaed 항체 M5-4가 RBD, spike protein의 WT뿐만아니라 다양한 mutant에도 결합하는지 확인하기 위해 ELISA를 진행하였다. Mutant는 하기 표 6에 나타낸 9종을 사용하였다.
Mutant 회사 명, 제품번호 Mutant 회사 명, 제품번호
RBD-V367F Sino biologics, 40592-V08H1 RBD-N501Y Sino biologics, 40592-V08H82
RBD-N439K Sino biologics, 40592-V08H14 RBD-A520S Sino biologics, 40592-V08H20
RBD-S477N Sino biologics, 40592-V08H46 RBD-A522S Sino biologics, 40592-V08H21
RBD-T478I Sino biologics, 40592-V08H30 Spike-D614G Sino biologics, 40589-V08B4
RBD-P479S Sino biologics, 40592-V08H57
ELISA plate에 RBD WT 및 mutant들을 각각 3 μg/ml (0.1μM) 100㎕를 4℃에 하룻밤 코팅하였다. Spike protein의 경우 WT 및 mutant를 각각 14ug/ml (0.1 μM) 100㎕를 4℃에 하룻밤 코팅하였다. 다음날, ELISA plate의 WT 및 mutant 를 제거하고 각 well에 PBS + BSA 2% 200 ㎕로 37℃에서 1시간 blocking 하였다. PBS + tween 20 0.05%로 3회 세척하였다. 기존 항체 (S309, REGN 10933+10987 combination)과 M4, M5 및 각각의 humanized 항체를 1nM씩, 100 ㎕를 각 well에 넣고 37℃에서 1시간 바인딩시켰다. 다시 PBS + tween 20 0.05%로 3회 세척하였다. HRP conjugated anti-Human IgG-Fc antibody (5000:1) 50㎕를 각 well에 넣고 37℃에서 1시간 인큐베이팅 시켰다. PBS + tween 20 0.05%로 4회 세척하였다. TMB solution 50㎕를 각 well에 넣어주고 5분 인큐베이팅 시켰다. Stop solution 50㎕를 각 well에 넣어 반응을 중단하였다. Mutant에 대한 M4-4 와 M5-4의 결합력을 평가한 결과, M4-4, M5-4 모두 mutant에 대해 WT RBD 수준 이상의 결합력이 확인되었다. 비교 항체로 사용된 REGN10933와 REGN10987의 경우, 단독으로 처리하였을 때, 각각 Y453F, N439K mutant에 대한 결합력이 50% 이상 감소됨을 확인하였다(도 7).
실험예 8. S 단백질 및 그 변이체에 대한 항체의 결합특성
항-SARS-CoV-2 spike 단백질 항체들이 spike 단백질 및 그 변이체, 알파(영국), 베타(남아프리카) 및 감마(브라질)에 대해 서로 다른 결합특성을 보이는지 확인하기 위하여 항원-항체 결합특성을 확인하였다. 항-S 단백질 항체의 결합 특성 중 동역학은 Biacore T-200 바이오센서(Cytiva)를 사용하여 결정되었다. 항체를 HBS-EP 완충액으로 희석하여 10μg/mL의 농도를 구성하고 SA칩에서 Rmax가 200Ru에 도달할 때까지 10μL/min의 유속으로 고정화하였다. HBS-EP 완충액에 0.3125-20 nM 농도로 희석된 S 단백질을 30 μL/min의 유속으로 결합을 위해 3분 동안, 해리를 위해 30분 동안 항체가 고정화된 SA 칩에 흘려주었다. 다음으로, 10mM 글리신-HCl(pH 1.5)을 30초 동안 반응시켜 항체에 결합된 S 단백질을 세척하였다. Biacore 평가 소프트웨어를 사용하여 항체의 센서그램을 분석하였다. 항원-항체 결합 동역학 측정결과 mouse 항체인 M4 대비 humanized 항체인 M4-4에서 10배 이상 향상된 해리상수 값을 관찰하였다. 이는 비교 항체 REGN10933, REGN10987 대비 약 10배 수준으로 확인되었다(도 8a).
다음으로 알파(영국), 베타(남아프리카) 및 감마(브라질) 변이체의 RBD에 대한 항체의 결합능력을 평가하였다. 이 실험에서는 M4, M4-4, 그리고 비교 항체 (REGN10933, REGN10987 및 REGN mix(REGN10933 + 10987, 1:1 혼합) 항체를 사용하였다. REGN mix는 RBM에 대한 에피토프가 다른 두 항체가 혼합물로 사용될 때 변이체에 대한 작용에서 시너지 효과가 있는지 비교하는데 사용되었다.
RBM-표적 중화 항체인 REGN10933은 원래 RBD 에서와 같이 알파 변이체에 대해 유사한 결합 친화도를 나타냈으나, 베타 및 감마 변이체에서는 REGN10933의 결합이 상당히 감소되었음을 확인하였다. 이와 대조적으로, M4 및 M4-4는 기존 RBD 및 모든 변이체에 대해 유사한 결합 친화도를 나타냈다(도 8b).
이는, 본 발명의 항체가 새로 생성된 SARS-CoV-2 변이체에 결합하는 능력을 유지하고, 다양한 변이 바이러스에 대해서도 결합력을 갖고 중화할 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 9. Pseudovirus 생산
SARS-CoV-2의 전체 길이 스파이크 단백질을 보유하는 슈도바이러스 및 반딧불이 루시퍼라제 리포터 유전자를 보유하는 변이체가 Lenti-X 293T 세포(Takara)에서 생산되었다. 즉, 10 μg의 psPAX2(Addgene), 10 μg의 pLVX-Luciferase 및 10 μg의 SARS-CoV-2 S(코돈 최적화) 발현 플라스미드를 폴리에틸렌이민(질량비 1: 2) Lenti-X 293T 세포에. 형질전환시키고 72시간 후에 상청액을 600xg에서 15분 동안 원심분리한 다음 0.45μm 필터를 통해 여과하고 추가 사용을 위해 -70°C에서 보관하였다. 슈도바이러스 역가는 상대적인 루시페라제 단위를 측정하여 결정하였다.
실험예 10. SARS-CoV-2 pseudovirus를 이용한 중화 분석
ACE2-HEK293 안정 세포주는 10% 소태아 혈청, 항생제-항진균제 칵테일이 포함된 DMEM배지에서 유지되었다. 96-well의 평평한 바닥 플레이트를 10 μg/mL 콜라겐 I으로 코팅하고 5% CO2를 포함하는 대기에서 37°C에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. ACE2-HEK293 세포를 DMEM에 현탁하고 1 Х 105 cells/well로 콜라겐 코팅된 96 well 평평한 바닥 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 항체는 2% FBS 및 항생제-항진균제 칵테일을 포함하는 DMEM으로 10μg/mL(66.67nM)에서부터 3배 연속희석하였다. 항체 희석액을 슈도바이러스와 1:1로 혼합하고 1시간 동안 5% CO2를 포함하는 대기에서 37°C에서 배양하였다. ACE2-HEK293 세포에서 상층액을 제거하고 50 μL의 항체-슈도바이러스 혼합물로 교체하였다. 이후, 세포를 5% CO2를 포함하는 대기에서 37°C에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 50 μL의 감염 배지를 세포에 첨가하고, 세포를 48시간 동안 5% CO2를 함유하는 대기에서 37°C에서 추가로 인큐베이션하였다. 세포를 5X 리포터 용해 완충액(Promega)으로 용해시키고 루시퍼라제 분석 시스템 및 발광계를 사용하여 상대적 루시퍼라제 활성을 결정하였다. 상대적 루시퍼라제 단위를 중화 퍼센트로 변환하고 Prism Software(GraphPad, Prism 8.0)에 맞는 비선형 회귀 곡선으로 플로팅하였다. 그 결과, M4, M5 chimeric 항체 및 인간화를 거친 후보 항체 M4-4,5,7,8 및 M5-4,5,7,8가 REGN10933와 유사한 수준의 중화능을 보이는 것을 확인하였다 (도 9a,b).
실험예 11. SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 발현하는 세포주의 생성
SARS-CoV-2의 스파이크 단백질(HT1080-S)을 발현하는 안정한 세포주를 생성하기 위해, SARS-CoV-2의 pcDNA3.1-스파이크 cDNA를형질주입하였으며 SARS-CoV-2 S 단백질을 발현하는 세포주는 1.5 mg/mL 제네티신으로 선별하였다. SARS-CoV-2 S 단백질의 발현은 항-SARS-CoV-2 항체인 REGN10933을 사용하여 유세포분석기(FACS LSR Fortessa, BD Biosciences)로 확인하였다(도 10a).
실험예 12. Fc 매개 효과의 측정
항-SARS-CoV-2 항체가 Fc 매개 항체 의존성 포식작용을 보이는지 확인하기 위해 ADCC 및 ADCP 효과를 척정하였다. ADCC 분석의 경우, HT1080-S 세포가 target cell로 사용되고 Jurkat-NFAT-Luc/FcγRIIIa가 effector cell로 사용되었다. HT1080-S 세포를 적절한 배지에 18시간 배양하고 ADCC assay 완충용액을 첨가하였다. 그 후, 항체를 희석하여 청가하고 15분간 반응시켰다. Effector cell을 추가하여 18시간 배양한 후, Bio-Glo luciferase assay 시약을 첨가하고 제조사의 지시에 따라 발광성을 측정하였다. 측정된 luminescence 값을 Prism software (Graphpad)를 사용하여 nonlinear regression curve를 그리고 EC50 값을 얻었다. ADCP 분석 역시 이전 기술 내용과 동일하게 측정하였다. 측정 결과, M4, M5 chimeric 항체 및 인간화를 거친 후보 항체 M4-4,5,7,8 및 M5-4,5,7,8가 Reference 항체 (REGN10987, REGN mix)와 유사한 수준의 ADCC 효능을 보이는 것을 확인하였다(도 10b). ADCC 효과뿐만 아니라, M4-4는 단일 Regeneron 항체 또는 Regeneron 항체 칵테일에 필적하는 ADCP 활성을 유도함을 추가적으로 확인하였다(도 10c). 종합하면, 도 10의 데이터는 M4-4가 최대 치료 효능을 매개하기 위해 Fc 매개 항체 효과 기능인 ADCC 및 ADCP를 유도할 가능성이 있음을 보여주었다 (도 10b,c).
실험예 13. SARS-CoV-2 spike 단백질 변이체에 대한 중화능 측정
SARS-CoV-2 스파이크 변이체, 알파(영국), 베타(남아프리카) 및 감마(브라질)에 대한 M4-4의 중화 효능을 평가하기 위해 각 SARS-CoV-2 spike variant를 발현하는 렌티바이러스 시스템을 사용하여 pseudovirus neutralization assays을 수행하였다. M4 및 M4-4는 REGN10987 또는 Regeneron 칵테일(mix)에 필적하는 중화 효능으로 3개의 변이형 바이러스를 중화할 수 있음을 확인하였다. REGN10933은 고농도의 세포에서 베타 또는 감마 변이형 슈도바이러스 감염의 100% 중화를 매개하지 못했다 (도 11).
종합하면, 인간화 SARS-CoV-2 항체인 M4-4는 WT 및 선택된 스파이크 돌연변이 SARS-CoV-2 슈도바이러스 입자를 중화시킬 수 있으며, 중화 효능은 Regeneron 칵테일과 유사함을 확인하였다 (도 11).
실험예 14. 에피토프(epitope) 비닝(binning)
에피토프 비닝은 BLI 시스템(Octet Qke)을 사용하여 3단계로 수행되었다. 단계 1은 항원 고정화를 수반하고; 2단계는 1차 항체 결합을 포함하고, 단계 3은 2차 항체 결합을 포함하였다. 각 단계 사이에 60초의 기준 단계를 설정하여 기준선 신호를 확인하였다. 1단계에서 20μg/mL 정제된 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 또는 RBD His를 1000rpm에서 200초 동안 미리 수화된 안티펜타-His 바이오센서에 고정화하였다. 2단계에서 37.5μg/mL의 서로 다른 1차 결합 Ab가 300초 동안 결합되었다. 3단계에서는 2차 항체 1종(18.75μg/mL)을 150초 동안 결합하여 자가 결합 및 경쟁 정도를 확인하였다. 경쟁의 정도는 백분율로 정의하였다. 고정된 항원에 2차 항체만 결합한 경우를 100%로 정의하였다. 33% 미만의 결합 수준은 완전한 경쟁으로 정의되었으며, 33%와 66% 사이의 수준은 중간 경쟁으로 정의되었으며, 66% 이상의 수준은 비경쟁으로 정의하였다. 비닝 결과 M4-4는 REG10987과 S309의 에프토프와 100% 경쟁하며 부분적으로 REGN10933의 에피토프와도 경쟁함을 확인하였다. 반면, REGN10987과 S309는 REGN10933과 비경쟁 에피토프를 가지는 것으로 관찰되었다(도 12).
이는 M4-4가 REGN10933, REGN10987, S309 대비 더 넓은 영역의 에피토프에 결합할 수 있음을 시사하는 것이다.
더불어, ACE2 수용체의 경쟁적 결합을 확인하기 위해 유사한 실험을 수행하였다. 차이점은 재조합 인간 ACE2 수용체와 재조합 SARS-CoV-2 스파이크 단백질 RBD의 결합 친화도가 mAb와 RBD 사이의 친화도에 비해 약 10-100이라는 것이다. 이에, ACE2 수용체는 2차 항체 결합과 관련된 단계 3에만 사용하였다. M4-4는 ACE2 수용체와도 100% 경쟁하는 것으로 관찰하였다. 이를 통해 M4-4가 ACE2 수용체에 대한 항원의 결합을 100% 방해할 수 있음이 확인되었다 (도 12).
실험예 15. Simulation docking
Schrodinger Suite 내의 BioLuminate는 각각 중쇄 및 경쇄에 대한 템플릿으로 항-PD1(PDB 코드: 6JJP) 및 항-SIRPα 항체(PDB 코드: 6 NMR)의 구조를 사용하여 M4-4의 scFv 상동성 모델링에 사용하였다. M4-4의 scFv 구조를 RBD(PDB 코드: 6M0J)에 도킹하는 것은 BioLuminate56에서 PIPER를 사용하여 수행하였다. RBD 및 CDR 루프의 Lys440과 Thr500 사이의 거리는 에피토프 비닝(binning) 결과를 기반으로 2Å에서 10Å 사이로 제한하였다. BioLuminate는 70,000개의 가능한 단백질-단백질 구성을 가진 30개의 최상의 복합체를 제안하였다. M4-4에 대한 최종 복합체는 클러스터 크기 및 에피토프 비닝 결과와의 일치에 따라 선택하였으며, 이후 에너지 최소화를 수행하였다. Simulation docking 결과로 예측된 RBD에 대한 M4-4의 결합부위는 REGN10933, REGN10987, S309 그리고 ACE2 수용체의 결합을 모두 방해할 수 있는 위치로 나타났다. 이는 비닝 결과와 연결되는 결과로 M4-4의 에피토프를 예측해볼 수 있었다 (도 13).
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> GREEN CROSS CORPORATION Mogam Institute for Biomedical Research <120> Antibodies specific for coronavirus spike protein and uses thereof <130> KPA201207-KR-P1 <150> KR 10-2020-0148064 <151> 2020-11-06 <150> KR 10-2021-0042796 <151> 2021-04-01 <160> 169 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 753 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> SARS Corona virus 2 spike protein RBD domain <400> 1 atgtttgtgt ttctggttct gctgcccctg gtgtcctcta gagtgcagcc tacagagtcc 60 atcgtgcggt tccccaacat caccaatctg tgccctttcg gcgaggtgtt caacgccaca 120 agatttgcca gcgtgtacgc ctggaaccgg aagagaatca gcaactgcgt ggccgactac 180 agcgtgctgt acaatagcgc cagcttcagc accttcaagt gctacggcgt gtcccctacc 240 aagctgaacg acctgtgctt caccaatgtg tacgccgaca gcttcgtgat cagaggcgac 300 gaagttcggc agatcgctcc tggacagaca ggcaagatcg ccgattacaa ctacaagctg 360 cccgacgact tcaccggctg cgtgatcgcc tggaatagca acaacctgga cagcaaagtc 420 ggcggcaact acaactacct gtaccggctg ttccggaagt ccaacctgaa gcctttcgag 480 cgggacatca gcaccgagat ctatcaggcc ggcagcaccc cttgtaatgg 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ttgtgcccgg cccaatgacg ggtattttga ctactggggc caaggtactc 360 tggttacggt tagttcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccc 408 <210> 133 <211> 408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H2 <400> 133 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggaag tccaactggt tgagtccggt ggaggactcg 60 tcaagcccgg tgggtctctc aaactgagtt gtgcggcatc tggcttcact ttctccagtc 120 gaggtatgtc ttgggttcga caagcgccag ggaaagggct ggaatgggtc agtaccatat 180 ctttcgggga catatatacc tattacccgg attctgtgaa aggaaggttt actataagtc 240 gggataatgc aaagaactcc ttgtatcttc aaatgaactc cctgaaagct gaggatactg 300 cagtctacta ttgtgcccgg cccaatgacg ggtattttga ctactggggc caaggtactc 360 tggttacggt tagttcagcc tccaccaagg gcccatcggt cttccccc 408 <210> 134 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hM4-k1 <400> 134 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggata tacagatgac ccagtctccg tctagtctga 60 gcgcgtccgt gggcgatcgg gttactatta cttgcaaggc cagccaggat gtatctacag 120 acgtagcctg gtatcagcaa aaaccaggca aagctcccaa actgcttata tattgggcga 180 gtacccgaca tacgggggtc ccgagcaggt ttagtggttc tgggtccggg acagacttta 240 ctttgaccat tagttccctg cagcccgagg actttgccac ttattactgt cagcagcact 300 atagcacgcc ttggactttc gggggaggta caaaagttga aatcaagcgt acggtggccg 360 ctccaagcgt 370 <210> 135 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hM4-k2 <400> 135 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggata tagtgatgac tcaaagcccg gcgacgcttt 60 ccgtttctcc cggtgagcgg gcaaccttgt catgcaaagc atcccaggat gtttccacgg 120 acgtggcatg gtatcaacaa aagccaggtc aagcgccacg cctccttata tactgggcat 180 caactcgaca caccggggtg ccggacaggt tcagcggaag cgggagcggt acagacttca 240 ctctcaccat tagttcattg cagagcgagg actttgctgt ttactactgc caacaacact 300 atagcacgcc ctggacattc gggggcggaa cgaaagtgga gatcaagcgt acggtggccg 360 ctccaagcgt 370 <210> 136 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hM4-k3 <400> 136 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggata tagtgatgac tcaaagcccg gcgacgcttt 60 ccgtttctcc cggtgaccgg gtaagcttgt catgcagagc atcccaggat gtttccacgg 120 acgtggcatg gtatcaacaa aagccaggtc aaagcccacg cctccttata tactgggcat 180 caactcgaca caccggggtg ccggacaggt tcagcggaag cgggagcggt acagacttca 240 ctctcaccat tagttcattg cagcccgagg actttgctgt ttactactgc caacaacact 300 atagcacgcc ctggacattc gggggcggaa cgaaagtgga gatcaagcgt acggtggccg 360 ctccaagcgt 370 <210> 137 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hM5-k1 <400> 137 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggaca tacagatgac gcagtcaccg tcttcactct 60 ccgccagcgt aggtgaccgg gtcactatta cctgtaaagc ctcccaaagc gtttcaaatg 120 acgtcgcctg gtatcagcag aaaccgggaa aagcgcccaa attgcttata tactacgcca 180 gtaaccgata taccggtgtt ccatcacgct ttagcgggag cggcagtggt actgacttta 240 cattgacaat tagttccctt caacctgagg attttgcaac ttattactgc cagcagagtt 300 attctgcccc ctatacattc ggtgggggga cgaaggtgga gataaagcgt acggtggccg 360 ctccaagcgt 370 <210> 138 <211> 370 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hM5-k2 <400> 138 tgctgtgggt gagtggtacc tgtggggacg ttgtaatgac gcaatctccc gctaccttgt 60 ccgtctcacc aggtgagagg gcaaccctga gttgtaaagc aagtcagtcc gtgtcaaacg 120 atgtcgcctg gtatcaacag aagcccggcc aagctccccg attgcttatc tactacgcaa 180 gtaaccgcta tacaggcgtc ccggatcggt tcacggggag tggcagtggc acggatttca 240 ccctgacaat atcttctctc caaagtgagg actttgcggt gtactactgt cagcagtcat 300 actctgcccc atatactttt ggcggtggga ctaaggttga aattaaacgt acggtggccg 360 ctccaagcgt 370 <210> 139 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR1 of M4, M5, and M4-4 <400> 139 Ser Arg Gly Met Ser 1 5 <210> 140 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR2 of M4, M5, and M4-4 <400> 140 Thr Ile Ser Phe Gly Asp Ile Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-CDR3 of M4, M5, and M4-4 <400> 141 Pro Asn Asp Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 142 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of M4, and M4-4 <400> 142 Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Asp Val Ala 1 5 10 <210> 143 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of M4, and M4-4 <400> 143 Trp Ala Ser Thr Arg His Thr 1 5 <210> 144 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of M4, and M4-4 <400> 144 Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Trp Thr 1 5 <210> 145 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR1 of M5 <400> 145 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 146 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR2 of M5 <400> 146 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 147 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-CDR3 of M5 <400> 147 Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr 1 5 <210> 148 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR1 of M4 <400> 148 Asp Val Met Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 149 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR2 of M4, and M5 <400> 149 Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 150 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 of M4 <400> 150 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Val Arg 20 25 30 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR4 of M4 <400> 151 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ala 1 5 10 <210> 152 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR1 of M5 <400> 152 Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 153 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 of M5 <400> 153 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 154 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR4 of M5 <400> 154 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 155 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR1 of M4-4 <400> 155 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 156 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR2 of M4-4 <400> 156 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 1 5 10 <210> 157 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR3 of M4-4 <400> 157 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 20 25 30 <210> 158 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH-FR4 of M4-4 <400> 158 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 159 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR1 of M4 <400> 159 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys 20 <210> 160 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR2 of M4, and M5 <400> 160 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 161 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 of M4 <400> 161 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 162 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR4 of M4 <400> 162 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 1 5 10 <210> 163 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR1 of M5 <400> 163 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 164 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 of M5 <400> 164 Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Asn Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 165 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR4 of M5 <400> 165 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys 1 5 10 <210> 166 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR1 of M4-4 <400> 166 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 167 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR2 of M4-4 <400> 167 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 168 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR3 of M4-4 <400> 168 Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 169 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL-FR4 of M4-4 <400> 169 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 1 5 10

Claims (17)

  1. 코로나바이러스 스파이크 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 5 내지 45, 서열번호 87 내지 91, 서열번호 97 내지 115 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 중쇄 가변영역; 및 서열번호 46 내지 86, 서열번호 92 내지 96, 및 서열번호 116 내지 131 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 87 내지 91, 및 서열번호 100 내지 115 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 중쇄 가변영역; 및 서열번호 92 내지 96 및 서열번호 116 내지 131 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 코로나바이러스는 SARS-CoV, SARS-CoV-2 또는 MERS-CoV인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 2종 이상의 코로나바이러스에 교차반응을 가지는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 2종 이상의 코로나바이러스에 교차반응을 가지는 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 6 내지 12, 서열번호 14 내지 22, 서열번호 24, 25, 32, 37, 45, 서열번호 87 내지 91, 및 서열번호 97 내지 99 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 중쇄 가변영역; 및 서열번호 47 내지 53, 서열번호 55 내지 63, 서열번호 65, 66, 73, 78, 86, 및 서열번호 92 내지 96, 중 어느 하나의 서열을 포함하는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
    서열번호 139의 중쇄 CDR1; 서열번호 140의 중쇄 CDR2; 및 서열번호 141의 중쇄 CDR3을 포함하는 중쇄 가변영역 및
    서열번호 142 또는 145의 경쇄 CDR1; 서열번호 143 또는 146의 경쇄 CDR2; 및 서열번호 144 또는 147의 경쇄 CDR3을 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 중쇄 가변영역은 서열번호 103의 아미노산 서열로 이루어지고;
    상기 경쇄 가변영역은 서열번호 119의 아미노산 서열로 이루어진 것인, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  10. 제9항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  11. 제10항의 발현 벡터가 도입된 형질전환체.
  12. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염증의 예방 또는 치료 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 약물이 결합된, 항체-약물 결합체.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 조성물.
  16. 제15항의 조성물을 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단용 키트.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원 결합 단편; 또는 이를 포함하는 감염 진단용 조성물; 또는 상기 조성물을 포함하는 키트를 이용하여, 코로나바이러스 감염 의심 개체로부터 분리된 생물학적 시료에 존재하는 코로나바이러스를 검출하는 단계를 포함하는, 코로나바이러스 감염 진단을 위한 정보제공방법.

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