JP2022534135A - Ｃｄ１９を標的とする完全ヒト抗体およびその応用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＣＤ１９を標的とする完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片を提供する。また、本発明は、当該完全ヒト抗体からの一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を用いて構築したキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。当該完全ヒト抗体とＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の構築に用いられる。前記ＣＡＲ－Ｔ細胞は、マウス抗体を使用するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、人体との適合性がより良いであり、それらの体内での長期の増殖および生存に有益である。【選択図】図１

Description

本発明は、ＣＤ１９を標的とする完全ヒト抗体に関し、さらに当該完全ヒト抗体の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関する。当該完全ヒト抗体、そのｓｃＦｖおよびＣＡＲは、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔ細胞の構築に用いられる。

近年、細胞免疫療法技術、特にキメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）技術は、飛躍的に進歩している。２０１７年、ＮｏｖａｒｔｉｓのＫｙｍｒｉａｈ（Ｔｉｓａｇｅｎｌｅｃｌｅｕｃｅｌ）およびＫｉｔｅ ＰｈａｒｍａのＹｅｓｃａｒｔａは、それぞれ米国ＦＤＡにより承認されて市販されている。Ｋｙｍｒｉａｈは、世界初の承認されたＣＡＲ－Ｔ治療製品であり、３～２５歳の急性リンパ性白血病患者および再発性または難治性びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する成人患者の治療に用いられる。Ｙｅｓｃａｒｔａは、世界で承認された２番目の市販ＣＡＲ－Ｔ製品であり、成人の再発性または難治性のＢ細胞リンパ腫および非ホジキンリンパ腫の治療に使用されている。図１は、一般的に使用されるＣＡＲの分子構造を示す概略図である。
ＣＡＲ－Ｔという技術は、手術、化学療法、放射線療法などの従来の治療法とはまったく異なる治療原理を持ち、難治性および再発性の血液腫瘍性疾患に対して革新的な治療効果をもたらすため、腫瘍治療の新時代を切り開いた。現在、世界中で多数のＣＡＲ－Ｔ臨床試験が実施されており、その中で中国と米国が最も多くの関連臨床試験を行っている国である。

ＣＡＲ－Ｔ療法で広く使用されている標的の１つとして、ＣＤ１９はＢリンパ球腫瘍を適応症とする。現在市販されている製品および研究されている製品において、ＣＤ１９は、治療効果が明確で、副作用が制御可能であるため、その製品が最も多い。臨床研究の深まりに伴い、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ治療の短期的な効果は非常に良好であるが、時間が経つにつれて、患者の約５０％が再発することを示す証拠は、ますます増えている。再発には多くの原因があるが、主にＣＤ１９抗原の陰性再発と陽性再発に分けられる。ＣＤ１９抗原陽性再発では、患者の体内でのＣＡＲ－Ｔ細胞の生存時間が短いことが主な理由である。既存のＣＡＲ－Ｔ注入患者に対する研究によると、人体はＣＡＲ－Ｔで使用される異種抗体に対する抗抗体（ＡＤＡ）またはキラーＴリンパ球（ＣＴＬ）を産生することは、一部の患者で体内のＣＡＲ－Ｔ細胞が急速に排除される主な原因であると考えられる。

現在、市販されている２つの製品と臨床試験中のほとんどの製品は、ＣＤ１９抗原を認識するために異種抗体を使用している。例えば、ＫｙｍｒｉａｈおよびＹｅｓｃａｒｔａは、いずれもマウス抗体を用い、南京伝奇のＬＣＡＲ－Ｂ３８Ｍはアルパカ抗体を用いている。完全ヒト抗体は、異種抗体よりも低い免疫原性を有するため、抗体医薬品開発の分野において主な方向となっている。同様に、完全ヒト抗体をＣＡＲ－Ｔ製品に適用することは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の免疫原性を低下させ、ヒトにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞の生存時間を延長し、ＣＡＲ－Ｔ製品の長期治療効果を高めることができる。したがって、完全ヒトＣＤ１９抗体の開発は、次世代においてより長期の存続期間を有し、よりよい長期治療効果を有するＣＡＲ－Ｔ製品を開発するには、非常に重要な意味を有する。

本発明の一態様は、ＣＤ１９を標的とする完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片であって、前記完全ヒト抗体は、軽鎖可変領域がＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、
（１）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＡＧＹＤであり、
ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＥＮＴであり、
ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＲＶであり、
ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＮＳＷであり、
ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＤＤＳＤＴであり、
ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＱＳＴＹＩＹＧＧＹＹＤＴである組合せ、および、
（２）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＮＮＡであり、
ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＹＤＤであり、
ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶであり、
ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＳＹＷであり、
ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＧＤＳＤＴであり、
ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＬＳＹＳＷＳＳＷＹＷＤＦである組合せからなる群から選ばれる１つである、完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片を提供する。

いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すアミノ酸配列を含み、
あるいは、
前記軽鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、前記一本鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７または１０に示すアミノ酸配列を含む。

本発明の他の１つの態様は、ＣＤ１９を標的とする一本鎖抗体を含むＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体であって、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域がＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、
（１）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＡＧＹＤであり、
ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＥＮＴであり、
ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＲＶであり、
ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＮＳＷであり、
ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＤＤＳＤＴであり、
ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＱＳＴＹＩＹＧＧＹＹＤＴである組合せ、および、
（２）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＮＮＡであり、
ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＹＤＤであり、
ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶであり、
ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＳＹＷであり、
ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＧＤＳＤＴであり、
ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＬＳＹＳＷＳＳＷＹＷＤＦである組合せからなる群から選ばれる１つである、キメラ抗原受容体を提供する。

いくつかの実施形態において、前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すアミノ酸配列を含み、
あるいは、
前記軽鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記一本鎖抗体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７または１０に示すアミノ酸配列を含む。

本発明のもう１つの態様は、前記のキメラ抗原受容体を発現する改変Ｔ細胞を提供する。
本発明の他の１つの態様は、前記のＴ細胞を含む、ＣＤ１９を細胞表面に発現する腫瘍を治療する薬物を提供する。

本発明のもう１つの態様は、前記の完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片をコードする、単離核酸分子を提供する。

いくつかの実施形態において、前記完全ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すヌクレオチド配列を含み、かつ、重鎖可変領域をコードする配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列を含み、あるいは、
前記完全ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列を含み、かつ、重鎖可変領域をコードする配列が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態において、前記一本鎖抗体をコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示すヌクレオチド配列を含む。

本発明のもう１つの態様は、前記の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。

いくつかの実施形態において、前記発現ベクターは、さらに上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）またはトランケートされたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）のコード配列をさらに含む。

本発明による完全ヒト抗体は、マウス抗体またはヒト化マウス抗体よりも免疫原性が低く、抗体薬物またはＣＡＲ－Ｔへの応用においてより優れた可能性を有する。マウス抗体を使用するＣＡＲ－Ｔ細胞と比較して、本発明による完全ヒト抗体を使用して構築したＣＡＲ－Ｔ細胞は、人体との適合性が高く、それらの体内での長期増殖および生存に有益である。

細胞表面に発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の構造の模式図である。ＣＡＲは、特定の標的抗原（例えば、ＣＤ１９）に結合するための通常一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）の形とする細胞外結合領域、細胞膜と細胞外結合領域の間のヒンジ領域、細胞外結合領域の結合シグナルを伝達し、かつ細胞を活性化するための細胞質ドメインを含む。 本発明のファージ抗体ライブラリーからＣＤ１９を標的とする特異的抗体をスクリーニングする一般的手順を示す図である。 異なるｓｇＲＮＡでＲａｊｉ細胞をノックアウトして得られた細胞クローンのフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 パニングされたファージモノクローンの標的抗原、対照抗原との酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す図である。コントロール１は、ＦＭＣ－６３（ヒト化マウス抗ヒトＣＤ１９ファージ抗体クローン）であり、コントロール２は、非ＣＤ１９結合ｓｃＦｖファージ抗体クローンである。 一部のファージモノクローンのＲａｊｉ及びＲａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞への結合のフローサイトメトリー分析結果を示す図である。 選別されたファージモノクローンの複数の異なるＣＤ１９陽性および陰性細胞株への結合のフローサイトメトリー分析結果（ＭＦＩ値）を示す図である。コントロール１は、ＦＭＣ－６３（ヒト化マウス抗ヒトＣＤ１９ファージ抗体クローン）であり、コントロール２は、陰性対照のファージ抗体クローンである。 ＦＭＣ－６３抗体の＃６２、＃７８、ＦＭＣ－６３ファージとの競合結合試験結果を示す図である。 レポーター遺伝子法でＣＡＲ分子を選別する試験原理を示す概略図である。 ルシフェラーゼが産生する化学発光の強度で表される、様々な標的細胞によるレポーター遺伝子法により構築されたＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化を示す図である。 レポーター遺伝子法で使用された５種類の標的細胞の表面でのＣＤ１９発現状況を示す図である。 異なる標的細胞によるＣＡＲ－Ｔ細胞のＣＤ１０７ａ脱顆粒作用の結果を示す図である。 ＣＡＲ－Ｔ細胞による複数の標的細胞（Ｎａｌｍ－６、Ｒｅｈ、Ｊｖｍ－２、Ｊｅｋｏ－１、Ｂｖ１７３、Ｋ５６２－ＣＤ１９、Ｋ５６２、Ｔｈｐ－１およびＳｋｍ－１）の殺傷結果を示す図である。 マイトマイシンで処理されたＲａｊｉ細胞でＣＡＲ－Ｔを２回刺激した後の、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＮａｌｍ－６、Ｒｅｈ、Ｓｋｍ－１、およびＴｈｐ－１細胞の殺傷状況を示す図である。 ＦＭＣ－６３、＃６２および＃７８ ｓｃＦｖのＣＤ１９抗原との親和力測定プロセスの概略図である。 ＦＭＣ－６３、＃６２および＃７８ｓｃＦｖのＣＤ１９抗原との親和力測定の動的結合曲線およびＫＤ、ｋｏｎ、ｋｄｉｓパラメーターを示す図である。 ＃７８抗体のメンブレンプロテオームアレイ（ＭＰＡ）試験結果を示す図である。

特に明記しない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。

抗体とは、形質細胞（エフェクターＢ細胞）によって分泌され、体の免疫系によって異物（ポリペプチド、ウイルス、細菌など）を中和する免疫グロブリンを意味する。当該異物は、それに応じて抗原と呼ばれる。抗体分子の基本構造は、２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖からなる４量体である。アミノ酸配列の保存性の違いによって、重鎖と軽鎖はアミノ末端の可変領域（Ｖ）とカルボキシ末端の定常領域（Ｃ）に分けられる。１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域は相互作用して抗原結合部位（Ｆｖ）を形成する。可変領域において、アミノ酸残基の組成と配列は、可変領域の他の領域（フレームワーク領域、ＦＲ）よりも変化しやすい特定の領域は、高可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる。高可変領域は実際に抗体と抗原が結合する重要な部位である。これらの高可変領域は、配列が抗原決定基と相補的であるため、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ－ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）とも呼ばれる。重鎖と軽鎖には、それぞれＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３およびＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３と呼ばれる３つの相補性決定領域がある。

一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ ｃｈａｉｎ 断片 ｖａｒｉａｂｌｅ，ｓｃＦｖ）は、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域を短ペプチドによりペプチド鎖に接続して構成されている。ｓｃＦｖは、正しく折り畳むことにより、重鎖と軽鎖の可変領域が非共有結合を介して相互作用してＦｖセグメントを形成するため、抗原に対する親和活性をよく保持できる。

マウス抗体は、特異的抗原に対してマウスによって産生される抗体であり、通常、マウスＢリンパ球によって産生される抗体を指す。多くの場合、当該マウス抗体はハイブリドーマ細胞によって産生されるモノクローン抗体である。本発明における完全ヒト抗体は、ヒトファージ抗体ライブラリーからスクリーニングして得られたものであり、マウス抗体と比較して免疫原性がより低下し、ヒトの治療的使用により有利である。

キメラＴ細胞受容体、キメラ免疫受容体とも呼ばれるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、免疫エフェクター細胞に所望の特異性、例えば、特定の腫瘍抗原に結合する能力を付与することができる遺伝子工学によるタンパク質受容体分子である。キメラ抗原受容体は、通常、細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナルドメインからなる。多くの場合、抗原結合ドメインは、特定の抗原の認識と結合を担うｓｃＦｖ配列である。細胞内シグナルドメインは通常、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）、例えば、ＣＤ３ζ分子由来シグナル伝達ドメインを含み、免疫エフェクター細胞を活性化させ、殺傷効果を果たす。さらに、キメラ抗原受容体はまた、アミノ末端に新生タンパク質の細胞内局在化に関与するシグナルペプチドを含み得、および抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にヒンジ領域を含み得る。シグナル伝達ドメインに加えて、細胞内シグナルドメインはまた、例えば、４－１ＢＢ分子に由来する共刺激ドメインを含み得る。

ＣＡＲ－Ｔ細胞とは、ＣＡＲを発現するＴ細胞を指し、通常、ＣＡＲをコードする発現ベクターをＴ細胞に形質導入することによって得られる。一般的に使用される発現ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、レンチウイルス発現ベクターがある。キメラ抗原受容体改変Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）は、主要組織適合性複合体によって限定されず、特異的に標的殺滅活性および持続的な増幅能力を有する。

ＣＤ１９は、Ｂリンパ球の表面にあるマーカー分子であり、Ｂ細胞の活性化と増殖を調節する役割を果たす。ＣＤ１９が正常なＢ細胞だけでなく、多くの悪性Ｂ細胞腫瘍にも発現されることは、臨床的にＢ細胞関連腫瘍を治療するＣＤ１９を標的とするＣＡＲ－Ｔのベースである。

研究の概要

大容量のファージ抗体ライブラリーを使用して完全ヒトＣＤ１９特異的抗体をスクリーニングし、機能的試験によってこれらの抗体による腫瘍細胞殺滅のＣＡＲ－Ｔレベルでの有効性と安全性を評価した。最終的に、優れた特異性と有効性を備えた完全ヒト抗体クローンをいくつか入手した。これらの完全ヒト抗体を、引き続き試験を通じてさらに評価し、最適な候補クローンを選択してＣＤ１９ＣＡＲ－Ｔ製品を開発することに用いられる。

異なる抗体ライブラリーを使用し、組換えＣＤ１９タンパク質パニングとタンパク質／細胞交互パニングを経って、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による予備スクリーニングのために合計８９４個のモノクローンを選択し、そのうち１７６個のクローンはＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏタンパク質に特異的に結合するが対照タンパク質ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏ（タンパク質パニング／ＥＬＩＳＡ予備スクリーニング）には結合しない。シークエンシングして７９種類の異なるモノクローン配列を得た。続いて、これらのモノクローンのＣＤ１９陽性細胞株ＲａｊｉおよびＣＤ１９ノックアウトＲａｊｉ細胞株（Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ）への結合をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で測定し、細胞表面のＣＤ１９抗原に特異的に結合できるモノクローン抗体を１３種類スクリーニングした。これらの１３種類の抗体に対して、さらに複数種類のＣＤ１９陽性細胞株（Ｒａｊｉ、ＪＶＭ－２、Ｋ５６２－ＣＤ１９）および陰性細胞株（Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ、Ｊｕｒｋａｔ、Ｋ５６２）を使用してフローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）によってさらに同定され、そのうち２つのクローン（＃６２および＃７８）は、複数の細胞株で良好な特異性を示した。当該２つのクローン（＃６２および＃７８）をＣＡＲ－Ｔ形態に構築し、インビトロ機能試験を行った。その結果、これらのクローンは、ＣＡＲ－ＴレベルでＣＤ１９陽性細胞株によってＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化させ、ＣＤ１０７ａタンパク質（ＣＡＲ－Ｔ細胞が殺傷機能を開始するマーカーである）を発現し、かつ、ＣＤ１９陰性細胞株を殺さずにＣＤ１９陽性細胞株を特異的に殺すことができ、対照マウスモノクローン抗体ＦＭＣ６３ ＣＡＲ－Ｔと類似する活性と特異性を持っていることを表明した。これらのクローンの取得と初期的機能検証は、完全ヒトＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ製品のその後の開発の基礎であった。プロジェクト全体のプロセスを図２に示す。

前記の２つのクローンのシークエンシング結果は、以下の通りである。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１ ＃６２ ｓｃＦｖ ＤＮＡ配列：７６５ｂｐ
ＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２ ＃６２ ＶＬ ＤＮＡ配列：３３９ｂｐ
ＣＡＧＴＣＴＧＴＣＧＴＧＡＣＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＡＧＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＧＧＣＡＧＧＴＴＡＴＧＡＴＧＴＡＣＡＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＡＧＧＡＡＣＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＡＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＣＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＣＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＧＡＣＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＧＴＧＧＴＴＧＧＡＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＣＴＧＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３ ＃６２ ＶＨ ＤＮＡ配列：３６９ｂｐ
ＡＴＧＧＣＣＧＡＡＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＧＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＧＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＡＣＴＣＣＴＧＧＡＴＣＧＧＡＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＡＣＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＴＧＡＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＡＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＣＡＧＴＣＴＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴＡＣＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＣＧＡＴＡＣＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４ ＃７８ ｓｃＦｖ ＤＮＡ配列：７５３ｂｐ
ＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴＴＣＴＡＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５ ＃７８ ＶＬ ＤＮＡ配列：３３３ｂｐ
ＣＡＧＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＣＣＡＣＣＣＴＣＧＧＴＧＴＣＴＧＡＡＧＣＣＣＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＣＴＣＣＡＡＣＡＴＣＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＣＴＧＴＡＡＧＣＴＧＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＣＣＣＡＡＡＣＴＣＣＴＣＡＴＣＴＡＴＴＡＴＧＡＴＧＡＴＣＴＧＣＴＣＣＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＣＣＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＡＣＣＴＣＡＧＣＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＡＴＣＡＧＴＧＧＧＣＴＣＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＧＧＧＡＴＧＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＴＧＧＴＴＧＧＧＴＧＴＴＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＣＴＡＧＧＴ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６ ＃７８ ＶＨ ＤＮＡ配列：３６３ｂｐ
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＡＧＡＧＧＴＧＡＡＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＴＡＡＧＧＧＴＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＴＴＴＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＣＧＧＣＴＧＧＧＴＧＣＧＣＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＡＡＡＧＧＣＣＴＧＧＡＧＴＧＧＡＴＧＧＧＧＡＴＣＡＴＣＴＡＴＣＣＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＴＡＣＣＡＧＡＴＡＣＡＧＣＣＣＧＴＣＣＴＴＣＣＡＡＧＧＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＣＡＡＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＧＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＧＧＡＣＡＣＣＧＣＣＡＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＴＣＴＴＡＣＴＣＴＴＧＧＴＣＴＴＣＴＴＧＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＴＡＣＴＣＴＧＧＴＧＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７＃ ６２ ｓｃＦｖアミノ酸配列：２５５ａａ
ＱＳＶＶＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＲＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧＳＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＭＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＳＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＬＩＹＰＤＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＳＡＩＮＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＱＳＴＹＩＹＧＧＹＹＤＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８ ＃６２ ＶＬアミノ酸配列：１１３ａａ
ＱＳＶＶＴＱＰＰＳＶＳＧＡＰＧＱＲＶＴＩＳＣＴＧＳＳＳＮＩＧＡＧＹＤＶＨＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＥＮＴＮＲＰＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＴＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＲＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬＧ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９ ＃６２ ＶＨアミノ酸配列：１２３ａａ
ＭＡＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＮＳＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＬＩＹＰＤＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＳＡＩＮＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＱＳＴＹＩＹＧＧＹＹＤＴＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０ ＃７８ ｓｃＦｖアミノ酸配列：２５１ａａ
ＱＡＶＬＴＱＰＰＳＶＳＥＡＰＲＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＳＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧＳＲＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＬＳＹＳＷＳＳＷＹＷＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１ ＃７８ ＶＬアミノ酸配列：１１１ａａ
ＱＡＶＬＴＱＰＰＳＶＳＥＡＰＲＱＲＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＡＶＳＷＹＱＱＬＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＤＤＬＬＰＳＧＶＳＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＳＬＡＩＳＧＬＱＳＥＤＥＡＤＹＹＣＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶＦＧＧＧＴＫＶＴＶＬＧ

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２ ＃７８ ＶＨアミノ酸配列：１２１ａａ
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＥＳＬＫＩＳＣＫＧＳＧＹＳＦＴＳＹＷＩＧＷＶＲＱＭＰＧＫＧＬＥＷＭＧＩＩＹＰＧＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧＱＶＴＩＳＡＤＫＳＩＳＴＡＹＬＱＷＳＳＬＫＡＳＤＴＡＭＹＹＣＡＲＬＳＹＳＷＳＳＷＹＷＤＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ

対応する抗原決定基のアミノ酸配列は、下記の表に示す。

以下、具体的な実施例を照らして本発明を詳しく説明する。
実施例１ ＣＤ１９ノックアウトされた細胞株Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏの構築
ファージ抗体ライブラリー（天然ライブラリーおよび半合成ライブラリーを含む完全ヒト抗体ライブラリー）から特異的モノクローン抗体をパニングするために、当該ファージ抗体ライブラリーを、それぞれ標的抗原を発現する細胞および発現しない細胞と接触させ、結合状況によって特異的抗体をパニングまたは同定することができる。好ましくは、標的抗原をコードする遺伝子がノックアウトされた細胞を構築する。このように、一対の細胞の相違点は、主にこのノックアウトされた遺伝子にある。この一対の細胞は、モノクローン抗体の結合特異性の同定とアフィニティーパニングに重要な役割を果たす。したがって、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を採用し、ＣＤ１９を高度に発現するＲａｊｉ細胞におけるＣＤ１９遺伝子をノックアウトし、かつ、モノクローンスクリーニングによってＣＤ１９陰性のモノクローン化Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞を取得した。

概要的な試験手順は次のとおりである。
（１）複数種類のｓｇＲＮＡ配列（ｓｇＲＮＡ１～ｓｇＲＮＡ６）の設計およびプライマー合成、
（２）ＰＣＲによるｓｇＲＮＡ転写テンプレートの調製、
（３）ｓｇＲＮＡ逆転写およびカラム精製、
（４）ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ ＲＮＰエレクトロポレートしたＲａｊｉ細胞、
（５）ＦＡＣＳによる異なるｓｇＲＮＡの遺伝子のノックアウト効率検出、ノックアウト効率の高い細胞プールの選択、限界希釈法によるモノクローンの分離、
（６）モノクローンのＦＡＣＳ同定およびノックアウト効率の分子生物学的同定、
（７）Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞バンクの構築と保存。

主な素材と試薬：
ｓｇＲＮＡ調製用ｏｌｉｇｏＤＮＡ：Ｓａｎｇｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｓｈａｎｇｈａｉ） Ｃｏ．Ｌｔｄ．
ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔＡｉｄ Ｔ７高収率転写キット，Ｔｈｅｒｍｏ，Ｋ０４４１
ＴｒｕｅＣｕｔ^TM Ｃａｓ９タンパク質ｖ２，ｔｈｅｒｍｏ，Ａ３６４９８
ＰＥ抗ヒトＣＤ１９抗体，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，３０２２５４

試験結果：
図３に示したように、ｓｇＲＮＡ５の細胞ＣＤ１９ノックアウト効率は、最も高く、ＣＤ１９の７５．４％がノックアウトされた。したがって、ｓｇＲＮＡ５エレクトロポレートした細胞プールを選択してモノクローンスクリーニングを行った。限界希釈法により当該細胞プールからモノクローンを分離し、モノクローンを増幅した後、ＦＡＣＳによってこれらのモノクローンのＣＤ１９発現を検出した。検出結果は、表２に示し、番号Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ－１、１１、１４クローンでは、ＣＤ１９発現が基本的に検出されず、ノックアウトに成功したモノクローンであると考えられる。これらの３つのクローンを培養して凍結保存した。その後の研究ではクローン１を使用した。

実施例２ アフィニティーパニングによるファージ抗体ライブラリーからＣＤ１９タンパク質を標的とする特異的抗体クローンの濃縮
適切なネガティブパニング及びポジティブパニングストラテジーを用いて、ファージ抗体ライブラリーから所望する特異的抗体クローンを濃縮した。

ファージ抗体ライブラリーの構築
半合成ファージ抗体ライブラリーを構築し、天然ライブラリーと共に使用した。これにより、ＣＤ１９高親和力抗体クローンを欠く可能性があるという天然ライブラリーの問題を解決した。ＣＤ１９は、ヒトにおいてＢリンパ球により正常に発現される抗原である。このような抗原に対して、体は、クローニングおよびスクリーニングメカニズムを利用して、ＣＤ１９抗体を発現するＢ細胞を発達過程に不活性化させ、正常な体内でこのような抗原に対する高親和力抗体の欠如をもたらす。クローニングおよびスクリーニングは、体の正常の自己認識および自己防御メカニズムである。しかし、ファージ抗体ライブラリーの最も一般的な形態は、健康なヒトリンパ球における抗体遺伝子を直接クローニングすることによって構築される天然ライブラリーであり、ＣＤ１９のようなヒトに通常存在する抗原に対する抗体クローンがない可能性が高い。このことを考慮して、抗体ライブラリーを構築する際に、天然ライブラリーだけでなく、半合成抗体ライブラリーも構築した。半合成抗体ライブラリーは、天然抗体配列からの軽鎖および重鎖ＦＲ１－ＦＲ３と人工的に設計された重鎖ＣＤＲ３からなり、抗体の多様性を大幅に高め、通常存在する抗原（例えばＣＤ１９）に対する高親和力を有する抗体をスクリーニングする可能性を高める。

ＣＤ１９タンパク質パニング
ネガティブパニングタンパク質としてＢＣＭＡ－Ｆｃを使用し、ポジティブパニングタンパク質としてＣＤ１９－Ｆｃを使用し、複数ラウンドのパニングを実行し、標的抗体クローンを濃縮したファージプール（ｐｏｏｌ）を得た。試験手順は次のように簡単に説明する。
（１）Ｆｃタグ付き標的抗原（ＣＤ１９－Ｆｃ）または対照抗原（ＢＣＭＡ－Ｆｃ）を高結合９６ウェルＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、ＥＬＩＳＡプレートをブロッキング溶液でブロックした。
（２）Ｆｃタグまたはブロッキング液成分に非特異的に結合したファージ抗体クローンを差し引くために、ファージライブラリー（１ｘ１０^１２個のファージ粒子を含む）を加え、対照抗原とコンインキュベートした。
（３）インキュベートした後、上清を標的抗原でコーティングされたプレートに移し、ファージを標的抗原に結合させるように引き続きインキュベートした。
（４）固体担体の表面を洗浄液で洗浄して、結合していないファージを除去した。
（５）溶離液で標的抗原から陽性ファージを溶離した。
（６）溶離したファージで再び宿主細菌ＸＬ１－ｂｌｕｅを感染し、回収されたファージを増幅した。少量のサンプルを勾配希釈して宿主細菌を感染し、Ａｍｐ耐性プレートに塗り、回収されたファージの量を計算した。
（７）ステップ（１）～（６）を繰り返し、通常、ファージの回収率（溶離されたファージの数／投与されたファージの数）が大幅に増やすと観察されるまでは、３～４ラウンドのパニングが必要である。
濃縮されたファージプールは、その後のモノクローンスクリーニングおよびＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳ同定に用いられた。

Ｒａｊｉ／Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞パニング
ネガティブパニングセルとして実施例１で調製したＲａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞を使用し、ポジティブパニングタンパク質としてＲａｊｉ細胞を使用し、複数ラウンドのパニングを実行し、標的抗体クローンを濃縮したファージプールを得た。

試験手順は次のように簡単に説明する。
（１）タンパク質パニングによって特異的クローンが濃縮されたファージプール（１ｘ１０^１２個のファージ粒子を含む）を１ｘ１０^７個のネガティブパニング細胞Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏと均一に混合し、ロータリーミキサーで、室温で２時間インキュベートしてネガティブパニング細胞株に結合している抗体クローンをこれらの細胞に十分に結合させる。
（２）１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、細胞を沈殿し、上清を新しいチューブに移し、５ｘ１０^６個のＲａｊｉ細胞（ＣＤ１９陽性細胞）と均一に混合し、ロータリーミキサーで、室温で２時間結合した。
（３）ＰＢＳで細胞を６回洗浄し、毎回上清を吸引して廃棄し、再懸濁して、結合していないファージを除去するように１５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
（４）溶離液で標的抗原から陽性ファージを溶離した。
（５）溶離したファージで再び宿主細菌を感染し、回収されたファージを増幅した。少量のサンプルを勾配希釈して宿主細菌を感染し、Ａｍｐ耐性プレートに塗り、回収されたファージの量を計算した。
（６）ステップ（１）～（５）を繰り返し、通常、ファージ回収率（溶離されたファージの数／投与されたファージの数）が大幅に増やすと観察されるまでは、３～４ラウンドのパニングが必要である。
濃縮されたファージプールは、その後のモノクローンスクリーニングおよびＥＬＩＳＡ／ＦＡＣＳ同定に用いられる。

主な素材と試薬：
天然ライブラリーおよび半合成ライブラリーを含む完全ヒトファージ抗体ライブラリー
ヘルパーファージＫＯ７、Ｔｈｅｒｍｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８３１１０１９；
ヒトＣＤ１９ （２０－２９１）タンパク質、Ｆｃタグ，ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＣＤ９－Ｈ５２５１；
ヒトＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７タンパク質、Ｆｃタグ，ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍ、ＢＣ７－Ｈ５２５４；
高結合ＥＬＳＩＡプレート、Ｃｏｓｔａｒ、＃３５９０
ブロッキング液：ＰＢＳ＋３％ＢＳＡ
リンス液：ＰＢＳ＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０
溶離液：１ｍｇ／ｍＬ トリプシン（Ｔｒｙｐｓｉｎ） ｉｎ ＰＢＳ

試験結果：
異なる抗体ライブラリーを使用して、３ラウンドのタンパク質パニングを行った。各パニングで回収率の明らかな増加が観察されたこと（表３）は、抗体クローンが効果的に濃縮されたことを検証した。

３ラウンドのパニングの後、さまざまな抗体ライブラリーが濃縮されていることが分かった（３ラウンド目の回収率は前のラウンドよりも大幅に高くなった）。しかし、その後のＦＡＣＳ試験では、これらのファージプールから選択したクローンはいずれも、ＣＤ１９抗原を高度に発現するＲａｊｉ細胞株に結合できなかった。つまり、細胞表面の天然状態のＣＤ１９抗原を認識できなかった。したがって、その後の試験では、タンパク質と細胞を交互にパニングする方法を使用して、他のファージ抗体ライブラリーから特異的抗体クローンを単離した。表４は、組換えＣＤ１９タンパク質とＲａｊｉ／Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞株を使用したジョイントパニングの結果を示した。回収率から判断すると、５つのパニングは、すべて濃縮され、次のステップでモノクローンをスクリーニングするために用いられる。

実施例３ 酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）を使用した、濃縮ファージプールからの特異的クローンのスクリーニング
目的と原理：アフィニティーパニングステップによって濃縮されたファージプールには、特異的なクローン、非特異的なクローンおよびネガティブクローンなどのさまざまなファージ抗体が含まれている。特異的なクローンを得るには、そこからモノクローンを分離し、それをモノクローンファージにパッケージ化し、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によってたくさんのモノクローンの予備スクリーニングを行い、ＣＤ１９タンパク質に特異的に結合するモノクローンを選択した。これらのＥＬＩＳＡ特異的クローンに対して、さらにフローサイトメトリーを使用してスクリーニングを行い、細胞表面の天然状態のＣＤ１９分子に結合できるかどうかを判断した。特異的モノクローンは、ＤＮＡシークエンシングによって、その中に含まれる一本鎖抗体配列を決定することができる。

ＥＬＩＳＡ予備スクリーニングでは、ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）とビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）の結合により、ビオチン化標的タンパク質（ＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）と対照タンパク質（ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）は、反応液中で天然状態の抗原のコンフォメーションにより近くなる。ＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏのみに結合し、ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏおよびストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）には結合しないものは、特異的クローンとみなされる。ＦＡＣＳ予備スクリーニングでは、ＣＤ１９発現の高い細胞株であるＲａｊｉとＣＤ１９分子をノックアウトしたＲａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏを用いて行った。Ｒａｊｉ細胞のみに結合し、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞に結合しないものは、特異的クローンとみなされる。ＥＬＩＳＡとＦＡＣＳという２つの予備スクリーニングを通じて、組換え発現されたＣＤ１９タンパク質に結合できるだけでなく、細胞表面の天然状態のＣＤ１９分子を認識できる候補抗体を得られ、引き続きスクリーニングに用いられた。

ＥＬＩＳＡ試験の概要的な手順：
（１）９６ディープウェルプレートでモノクローンファージを培養し、パッケージングした。
（２）ＳｔｒｅｐａｖｉｄｉｎをＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、高結合マイクロタイタープレートに１００μＬ／ウェルにて加え、室温で２時間結合した。
（３）コーティング液を廃棄し、各ウェルにブロッキング液２５０μＬを加え、４℃で一晩ブロッキングした。
（４）リンス液２５０μＬでプレートを２回洗浄した。
（５）ビオチンタグ付き標的タンパク質、及び対照タンパク質をＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈し、Ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎでプレコートされたマイクロタイタープレートに１００μｇ／ウェルにて加え、室温で１時間結合した。
（６）リンス液２５０μＬでプレートを２回洗浄した。
（７）ステップ（１）で培養したファージ上清１００μＬを標的抗原、対照抗原でコーティングされたウェルに加え、室温で２時間結合した。
（８）リンス液２５０μＬでプレートを４回洗浄した。
（９）１：２０００に希釈したマウス抗Ｍ１３一次抗体を１００μＬ／ウェルになるように加え、室温で４５ｍｉｎインキュベートした。
（１０）リンス液２５０μＬでプレートを４回洗浄した。
（１１）１：１０００に希釈したＨＲＰロバ抗ヒトＩｇＧを１００μＬ／ウェルになるように加え、室温で４５ｍｉｎインキュベートした。
（１２）リンス液２５０μＬでプレートを６回洗浄した。
（１３）ＴＭＢ発色基質１００μＬを加え、５～１０ｍｉｎ発色させた。
（１４）２Ｍ Ｈ_２ＳＯ_４ １００μＬを加えて反応を終了させ、マイクロプレートリーダーで結果を読み取った。

ＦＡＣＳ予備スクリーニング試験の概要的なステップ：
（１）９６ディープウェルプレートでモノクローンファージを培養し、パッケージングした。
（２）Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで濃度１ｘ１０^７／ｍＬになるように再懸濁し、９６ディープウェルプレートに５０μＬを分注した。
（３）パッケージ化されたモノクローンファージ５０μＬ（１Ｅ１１ ｐｆｕ／ｍＬ）を各ウェルに加え、均一に混合し、４℃で２時間結合した。
（４）ＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄した。
（５）１：２０００に希釈したマウス抗Ｍ１３一次抗体１００μＬ／ウェルを加え、ピペッティングで均一に混合した後、室温で４５ｍｉｎインキュベートした。
（６）ＰＢＳ ２００μＬで２回洗浄した。
（７）１：３００に希釈したＦＩＴＣ馬抗マウス－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ） １００μＬ／ウェルを加え、ピペッティングで混合後、室温で４５ｍｉｎインキュベートした。
（８）２００μＬ ＰＢＳで２回洗浄し、最後にＰＢＳ ２００μＬで細胞を再懸濁させた。
（９）フローサイトメーターでサンプルのＦＩＴＣチャネルの蛍光強度を検出し、結果を分析した。

主な素材と試薬：
ヘルパーファージ ＫＯ７，Ｔｈｅｒｍｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，１８３１１０１９
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ，Ｐｉｅｒｃｅ，２１１２５
ビオチン化ヒトＣＤ１９，Ｆｃタグ，超高感度（１級アミン標識），ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＣＤ９－Ｈ８２５９；
ビオチン化ヒトＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７タンパク質，Ｆｃタグ，Ａｖｉタグ（Ａｖｉｔａｇ^TM），ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，ＢＣ７－Ｈ８２Ｆ０；
高結合ＥＬＳＩＡプレート，Ｃｏｓｔａｒ，＃３５９０
コーニング９６ウェルクリア丸底ＴＣ処理されたマイクロプレート，Ｃｏｓｔａｒ，＃３７９９
ブロッキング液：ＰＢＳ＋３％ ＢＳＡ
リンス液：ＰＢＳ＋０．１％ Ｔｗｅｅｎ２０
可溶性一液型ＴＭＢ基質溶液：Ｔｉａｎｇｅｎ、ＰＡ－１０７－０２
抗Ｍ１３バクテリオファージコートタンパク質ｇ８ｐ抗体，ａｂｃａｍ，ａｂ９２２５
ＨＲＰヤギ抗マウスＩｇＧ（最小の交叉反応性）抗体，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，４０５３０６
ＦＩＴＣ馬抗マウス－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｖｅｃｔｏｒ，ＦＩ２０００

試験結果：
ファージ抗体プールから濃縮されたモノクローンをランダムに選択し、ファージにパッケージングした後、モノクローンファージのＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏタンパク質、ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏタンパク質への結合をファージＥＬＩＳＡによって検出し、ＣＤ１９特異的ファージ抗体クローンを見出した。一部のクローンのＥＬＩＳＡ結果を図４に示した。コントロール１は、ＦＭＣ－６３（ヒト化マウス抗ヒトＣＤ１９ファージ抗体クローン）であり、コントロール２は、非ＣＤ１９結合ｓｃＦｖファージ抗体クローンであった。図４からわかるように、＃１、＃４、＃６２、＃７８のクローンは、標的抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）への結合が良好であり、かつ、対照抗原ＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）およびストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）に結合せず、特異性が良好であった。＃５８および＃５９のクローンは、標的抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）、非関連抗原ＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）およびストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）のいずれとも結合せず、陰性クローンであった。＃７９および＃８１のクローンは、標的抗原ＣＤ１９（ＣＤ１９－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）に結合できるが、対照抗原ＢＣＭＡ（ＢＣＭＡ－ｈＦｃ－Ｂｉｏ）にも結合できるため、非特異的クローンであった。

一部のクローンのＦＡＣＳ予備スクリーニングの結果を図５に示した。矢印で示した＃６２のクローンはＲａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏに結合しないが、Ｒａｊｉ細胞に結合するため、特異的クローンであった。他のクローンは非特異的（２種類の細胞とも結合できる）または陰性クローン（２種類の細胞とも結合しない）であった。ＥＬＩＳＡ検出とＦＡＣＳ予備スクリーニングによって、合計１３つの特異的クローンを得た。

実施例４．複数の細胞株を用いるＦＡＣＳによるモノクローン特異性の同定
試験目的および原理：治療に使用される抗体は、標的抗原のみに結合し、非関連抗原には結合しない標的特異性が非常に優れると要求されている。一方、異なる細胞株上の同一抗原のアミノ酸配列は異なる（異性体または変異体）か、または結合するリガンドが異なることもあるため、抗体がさまざまな標的タンパク質陽性細胞に結合できるか否かを調べる必要がある。これらのモノクローン抗体の特異性と普遍性をさらに分析し、最適な候補クローンを見つけるために、フローサイトメトリーによって予備スクリーニングされたクローンの特異性をさらに評価した。この試験において、複数のＣＤ１９陽性細胞株及び複数のＣＤ１９陰性細胞株を用いて、これらのモノクローンファージ抗体と反応させ、これらのクローンが異なる細胞株におけるＣＤ１９抗原に結合できるがどうか、及びＣＤ１９を発現しない他の細胞株に対する任意の非特異的結合を有するかどうかを分析した。この試験により、特異性に優れたクローンをいくつか得た。これらのクローンを、ＣＡＲ－Ｔ形態の構築に使用し、ＣＡＲ－Ｔ機能試験を通じてさらにスクリーニングする。

試験方法：ＦＡＣＳ予備スクリーニングと同じであった。
主なサンプルおよび試薬：
Ｒａｊｉ細胞株、ＣＤ１９陽性細胞株；
Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞株、ＣＤ１９陰性細胞株；
ＪＶＭ２、ＣＤ１９陽性細胞株；
Ｊｕｒｋａｔ、ＣＤ１９陰性細胞株；
Ｋ５６２－ＣＤ１９、ＣＤ１９陽性細胞株；
Ｋ５６２、ＣＤ１９陰性細胞株；
他の試薬は、ＦＡＣＳ予備スクリーニングと同じであった。

試験結果：
治療に使用される抗体は、標的特異性が非常に優れると要求されている。これらのモノクローン抗体の特異性をさらに分析するために、実施例３にて得られた複数のクローンを、より多い細胞株でフローサイトメーターにて同定した。結果を表５および図６に示した。コントロール１は、ＦＭＣ－６３（ヒト化マウス抗ヒトＣＤ１９ファージ抗体クローン）であり、コントロール２は、陰性対照ファージ抗体クローンであった。＃６２および＃７８のクローンは、３種類のＣＤ１９陽性細胞のいずれにも結合でき、中位蛍光強度（ＭＦＩ）が高く、ＣＤ１９陰性細胞株のいずれにも結合せず、ＭＦＩが低く、特異性が良好であった。一方、＃５０および＃５２のクローンは、ＣＤ１９陽性細胞株Ｒａｊｉに結合でき、かつ、ＣＤ１９ノックアウトＲａｊｉ細胞（Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ）、ＣＤ１９陰性細胞株ＪｕｒｋａｔおよびＣＤ１９陰性細胞株Ｋ５６２に結合しないが、ＣＤ１９陽性細胞株ＪＶＭ－２およびＣＤ１９陽性細胞株Ｋ５６２－ＣＤ１９にも結合しないため、それらの結合は、非特異的結合である可能性があり、試験のニーズを満たしていない。

実施例５．フロー競合法による特異的クローンの結合エピトープの判定
試験目的および原理：
ＦＭＣ６３は最も広く使用されている抗ＣＤ１９マウスクローンである。当該クローンを使用したＣＡＲ－Ｔ療法は、印象的な臨床結果が得られた。その原因として、このクローンとＣＤ１９抗原との結合エピトープの特性に関連しているかもしれない。本願発明に得られた特異的クローンがＦＭＣ６３認識とオーバーラップするＣＤ１９エピトープを標的とするか否かを確認するために、フロー競合試験を実施した。本試験において、試験されるクローンのファージを異なる濃度勾配のＦＭＣ６３抗体とプレミックスしてから、陽性標的細胞ＮＡＬＭ６に結合し、一次抗体であるマウス抗Ｍ１３抗体および二次抗体であるＦＩＴＣ馬抗マウス－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体をインキュベートしてＦＩＴＣの蛍光強度を測定することにより、ＦＭＣ６３抗体が＃６２ファージおよび＃７８ファージの陽性標的細胞ＮＡＬＭ６への結合に影響を及ぼしたかどうかを判断した上、これら２つのクローンがマウスＦＭＣ６３に由来したｓｃＦｖと類似の結合特性を持っているかどうかを判断した。

フロー競合試験の基本的な手順：
（１）抗体勾配希釈：ＦＭＣ６３ ＡｂおよびＣＤ２２（クローン：Ｍ９７１）を抗体原濃度に基づき４００μｇ／ｍＬに希釈し、そしてそれぞれ４０μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．０４μｇ／ｍＬ、０．００４μｇ／ｍＬに希釈し、各ウェルに５０μＬずつの抗体を加えた。
（２）ファージパッケージングおよび希釈：前述したように＃６２ファージ、＃７８ファージおよびＦＭＣ６３ファージに対してＫＯ７感染を行い、パッケージングし、初期力価に基づき４×１０^１０ｐｆｕ／ｍＬ、２×１０^１０ｐｆｕ／ｍＬという２つの濃度に希釈し、ファージ５０μＬずつを各ウェルに加え、抗体と均一にプレミックスした。
（３）ＮＡＬＭ６細胞をＰＢＳで１回洗浄してから、ＰＢＳで６ｘ１０^６／ｍＬに再懸濁し、細胞５０μＬ、プレミックスした抗体ファージ混合液１００μＬずつを各ウェルに加え、よく混合し、４℃で１時間インキュベートした。
（４）プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで１０００倍に希釈されたマウス抗Ｍ１３抗体を１００μＬ／ウェル加え、４℃で０．５時間インキュベートした。
（５）プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳで１００倍に希釈されたＦＩＴＣ 馬抗マウス－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を１００μＬ／ウェル加え、４℃で０．５時間インキュベートした。
（６）プレートをＰＢＳで２回洗浄し、マシン上でフローした。
（７）ＦＬＯＷＪＯソフトウェアで分析し、ＭＦＩを計算し、ｇｒａｐｈｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアで曲線を描いた。

主なサンプルと試薬：
標的細胞ＮＡＬＭ６
ＦＭＣ６３ ＡｂおよびＣＤ２２（クローン：Ｍ９７１）抗体、ＩＡＳＯ ＢＩＯ自己発現
ヘルパーファージ ＫＯ７，Ｔｈｅｒｍｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１８３１１０１９
抗Ｍ１３バクテリオファージコートタンパク質ｇ８ｐ抗体，ａｂｃａｍ，ａｂ９２２５
ＦＩＴＣ馬抗マウス－ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ），Ｖｅｃｔｏｒ，ＦＩ２０００

試験結果：
結果を図７に示した。ＭＦＩで描いた曲線によると、ＦＭＣ６３抗体の濃度が高くなると、＃６２、＃７８、ＦＭＣ６３ファージは、いずれもＭＦＩが減少し、競合阻害が起こり、かつ用量依存的であるが、ＣＤ２２（クローン：Ｍ９７１）抗体は、ＦＭＣ６３ファージＭＦＩに対して明らかな影響を与えず、ＣＤ１９抗原と作用するときに＃６２、＃７８、およびＦＭＣ６３抗体は、結合エピトープがクロスオーバーしており、＃６２、＃７８およびＦＭＣ６３はＣＤ１９抗原と類似の結合特性を持っている可能性があると示された。

実施例６．レポーター遺伝子法によるＣＡＲ分子のスクリーニング
試験目的および原理：
実施例４で得られたこれらの特異的クローンをＣＡＲ－Ｔに構築した後、標的細胞を特異的に認識し、ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化できるかどうかを確認するために、効率的なＣＡＲ－Ｔスクリーニング法、すなわちレポーター遺伝子法を開発した。その原理を図８に示した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化は、ＣＡＲ分子の細胞内ドメインにあるＣＤ３ζと共刺激因子によって達成される。そのうち、ＣＤ３ζは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の活性化に必要である細胞内のＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化できる。したがって、ＮＦＡＴレポーター遺伝子法を使用して、ＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化する機能を有するＣＡＲ分子をスクリーニングすることができる。本試験では、ＮＦＡＴ－ｆｆＬｕｃ（ｆｆＬｕｃ、ホタルルシフェラーゼ）レポーター遺伝子と統合されたＪｕｒｋａｔ細胞をレポーター細胞として使用した。ＣＡＲをコードする核酸分子を、プラスミドエレクトロポレーションによってレポーター細胞表面に一時的に発現した。ＣＡＲ分子を発現したレポーター細胞と標的細胞をコンインキュベートした後、標的細胞の表面抗原は、ＣＡＲ分子を特異的に活性化でき、さらにレポーター遺伝子の発現を活性化することができる。次に、ルシフェラーゼの活性を検出することにより、ＣＡＲ分子のＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を評価することができる。このプラスミドには、トランケートされたＥＧＦＲ（ｔＥＧＦＲ）をコードする配列も含まれ、細胞表面にｔＥＧＦＲが発現されている場合、ＣＡＲを成功に発現した細胞をマークすることができる。さらに、異なるＣＡＲ分子はエレクトロポレーション中の異なる効率を持っているため、ＣＡＲをコードする核酸分子とブレンドされた内部参照プラスミド（ＣＭＶ－ｈＲＬｕｃ、レニラルシフェラーゼをコードするもの）を使用してエレクトロポレーション効率を較正した。レンチウイルスをパッケージ化し、Ｔ細胞を再感染させてＣＡＲ－Ｔを調製して機能を検出する従来の方法と比較して、本願発明におけるレポーター遺伝子法は簡単な手順で、候補ＣＡＲ分子の腫瘍細胞を認識する能力と特異性を迅速かつ効率的に初期評価できる。

レポーター遺伝子法の概要的な試験ステップ：
（１）試験されるＣＡＲ分子をコードするプラスミドと内部参照プラスミドを一定の比率で混合した後、レポーター細胞をエレクトロポレーション法でトランスフェクトした。
（２）トランスフェクトした後４８時間、トランスフェクトされたレポーター細胞の一部を採取し、ＰＥ－抗ヒトＥＧＦＲ抗体で染色し、フローサイトメトリーでＣＡＲ分子の発現状況を検出した。
（３）トランスフェクトした後７２時間、レポーター細胞と標的細胞を１：１の比率で混合した後、それらをそれぞれＵ底９６ウェルプレートに広げ、２４時間インキュベートした。各ウェルに３ｘ１０^４レポーター細胞を加え、各標的細胞に３つの複数のウェルを設定した。
（４）インキュベーションが完了したら、１０００ｇで５ｍｉｎ、４°Ｃで遠心分離し、培養上清を除去し、ウェルあたりライセート１００μＬで細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性検出のためにそこから細胞ライセート２０μＬを取り出した。

主なサンプルと試薬：
標的細胞Ｒａｊｉ、ＪＶＭ２、ＲＥＨ、Ｋ５６２、Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ；

エレクトロポレーションキット，Ｃｅｌｅｔｒｉｘ、Ｃａｔ．Ｎｏ．１２０７；
ＰＥ－抗ヒトＥＧＦＲ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２９０４；
デュアルルシフェラーゼ検出キット、翊聖、１１４０２ＥＳ６０；
コーニング９６ウェルクリア丸底ＴＣ処理されたマイクロプレート，Ｃｏｓｔａｒ，＃３７９９。

試験結果：
レポーター遺伝子法により、図８に示す結果を得た。そのうち、Ｒａｊｉ、ＪＶＭ２およびＲＥＨは、ＣＤ１９抗原を発現する陽性標的細胞であり、それらは異なるＣＤ１９抗原発現密度を有する（図９に示す）。Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏおよびＫ５６２は、陰性標的細胞として、表面にＣＤ１９抗原を発現しない。ＰＸＬ０９２は、ＦＭＣ６３－ｂｂｚをコードする陽性参照ＣＡＲ分子である。５７－１、６２－１、６９－１、７０－１は、試験されるＣＡＲ分子であり、そのうち、６２－１は、上記のＮｏ．６２ファージクローンを使用して構築された。表面にＣＡＲ分子を発現しているレポーター細胞を単独でインキュベートする（バッファグループ）と、弱いバックグラウンドシグナルを生成する。バックグラウンドシグナルは、レポーター遺伝子の上流プロモーターの効果に由来することもあるし、ＣＡＲ分子の自発的活性化によって生成されることもある。したがって、バックグラウンドシグナルが高いほど、ＣＡＲ分子が自発的に活性化する可能性が高くなる。レポーター細胞と陰性標的細胞をコンインキュベートした場合、ＣＡＲ分子が非特異的に結合しない場合、得られるシグナルはＢｕｆｆｅグループと同じはずである。レポーター細胞と陽性標的細胞をコンインキュベートした場合、ＣＡＲ分子は、陽性標的細胞の表面抗原によって特異的に活性化されてシグナルを生成し、シグナル強度が抗原密度に関連している。図から示されたように、ＣＡＲ分子Ｎｏ．６２－１は、対照ＰＸＬ０９２と近いＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を持っており、明らかな非特異的活性化の問題がない。ＣＡＲ分子Ｎｏ．５７－１およびＮｏ．６９－１もＮＦＡＴシグナル伝達経路を活性化できるが、ＰＸＬ０９２より劣っている。ＣＡＲ分子Ｎｏ．７０－１は比較的に強いバックグラウンド活性化シグナルを持っており、陽性標的細胞の特異性による能力が弱い。

実施例７．ＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ機能検証
試験目的と原理：
上記のレポーター遺伝子法によって予備スクリーニングして得られた活性化機能を有するＣＡＲ分子に対して、ＣＡＲ－Ｔ細胞における機能をさらに確認する必要がある。このために、これらのクローン化されたレンチウイルスベクターを調製し、Ｔ細胞に形質導入してＣＡＲ－Ｔ細胞を調製した。そして、ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ（ＣＤ１０７ａ ｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）およびインビトロ細胞殺傷アッセイ（ｉｎｖｉｔｒｏ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ａｓｓａｙ）によってＣＡＲ－Ｔ細胞のインビトロ生物学的有効性評価を行った。これらのＣＡＲ－Ｔレベルの機能検証を通じて、最終的に、下流のＣＡＲ－Ｔ製品開発に理想的な有効性と安全性を備えた候補一本鎖抗体クローンを選択した。

ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ
ＣＤ１０７ａは細胞内微小胞のマーカーであり、グランザイムがロードされた微小胞が細胞膜と融合すると、細胞膜上のＣＤ１０７ａが増加し、モネンシン（ｍｏｎｅｓｉｎ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入）を使用してその回収をブロックすると、微小胞放出の強度を定量的に反映できる。ＣＡＲ－Ｔが標的細胞上の標的抗原によって刺激されると、グランザイムの放出を引き起こし、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａの増加を検出することによりＴ細胞の活性化状況を判断することができる。

ＣＤ１０７ａ脱顆粒の概要的な試験手順：
（１）試験されるＣＡＲ－Ｔ細胞および標的細胞を３００ｇで、室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、Ｔ細胞培地に１×１０^６細胞／ｍＬに再懸濁した。
（２）２４ウェルプレートに試験されるＣＡＲ－Ｔ細胞５００μＬと標的細胞５００μＬを加え、均一に混合した。
（３）各ウェルの細胞にＰＥ／Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ１０７ａ抗体５μＬおよびｍｏｎｅｎｓｉｎ １μＬを加え、細胞インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）に入れ、３時間インキュベートした。
（４）インキュベーションが完了したら、２４ウェルプレートから細胞懸濁液５００μＬを取り出し、３００ｇで、４℃で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１ｍＬのＰＢＳ＋１％ＨＳＡで細胞を２回洗浄した。
（５）細胞を１００μＬのＰＢＳ＋１％ＨＳＡで再懸濁し、ＡＰＣ マウス抗ヒトＣＤ８ ５μＬおよびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＥＧＦＲ抗体５μＬ（またはＦＩＴＣ－ＣＤ１９タンパク質）をそれぞれ添加し、均一に混合して、氷上で、２０ｍｉｎ暗所でインキュベートした。
（６）インキュベーションが完了した後、細胞を１ｍＬのＰＢＳ＋１％ＨＳＡで３回洗浄し、４００μＬのＰＢＳ＋１％ＨＳＡで再懸濁し、フローサイトメトリーで検出した。

主なサンプルと試薬：
標的細胞Ｒａｊｉ，ＲＥＨ，ＮＡＬＭ６，Ｋ５６２－ＣＤ１９，Ｋ５６２，Ｒａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ，；
Ｍｏｎｅｎｓｉｎ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．４２０７０１；
ＰＥ／Ｃｙ７マウス抗ヒトＣＤ１０７ａ，ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５６１３４８；
ＡＰＣマウス抗ヒトＣＤ８，ＢＤ，Ｃａｔ．Ｎｏ．５５５３６９；
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗ヒトＥＧＦＲ，ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５２９０８；
ＦＩＴＣ－ＣＤ１９タンパク質，Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＤ９－ＨＦ２５１。

試験結果：
レンチウイルス形質導入によってＣＡＲ－Ｔ細胞を得、当該ＣＡＲ－Ｔ細胞をインビトロで９～１２日間培養してＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイを行った。試験されるＣＡＲ－Ｔ細胞、標的細胞、モネンシンおよびＣＤ１０７ａ抗体を３時間コンインキュベートし、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞は、細胞密度がいずれも５×１０^５細胞／ｍＬであった。次に、サンプルをＣＤ８抗体、ＥＧＦＲ抗体（またはＣＤ１９－ＦＩＴＣタンパク質）で標識した後、フローサイトメトリーを行った。ＦＳＣ：ＳＳＣ散布図で生細胞ゲート（Ｐ１）を選択して細胞破片を除去した。Ｐ１ゲート中の細胞をＦＳＣ－Ｈ：ＳＳＣ－Ａ分析した後、単分散細胞ゲート（Ｐ２）を選択し、次に、Ｐ２ゲートからさらにＣＤ８陽性細胞（Ｐ３）を選択し、最後にＰ３ゲートにおいて、ＥＧＦＲ抗体またはＣＤ１９－ＦＩＴＣ染色陽性細胞（すなわち、ＣＡＲ陽性細胞）におけるＣＤ１０７ａ陽性の割合を分析した。分析結果は、図１１（３回の独立した試験の結果）に示され、＃６２および＃７８クローンのＣＡＲ－Ｔ細胞は、対照ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＦＭＣ６３）と近いＣＤ１０７ａ脱顆粒機能を持っていることが示唆されている。

インビトロ細胞殺傷試験
試験の目的と原理：インビトロ細胞殺傷試験では、ＣＤ１９陽性標的細胞としてＮａｌｍ－６、Ｒｅｈ、Ｊｖｍ－２、Ｊｅｋｏ－１、Ｂｖ１７３およびＫ５６２－ＣＤ１９を用い、ＣＤ１９陰性標的細胞としてＫ５６２、Ｔｈｐ－１およびＳｋｍ－１細胞を用いて、ＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞の抗原特異的殺傷能力を評価した。そのうち、上記の細胞に対して、それぞれレンチウイルス形質導入によって、ホタルルシフェラーゼを安定して発現する標的細胞を得るため、サンプルのルシフェラーゼ活性は標的細胞の数を反映することができる。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞をコンインキュベートし、培養した。標的細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞によって殺傷されると、ルシフェラーゼが放出され、すぐに不活化された（ホタルルシフェラーゼの半減期は約０．５時間である）。一方、標的細胞がＣＡＲ－Ｔ細胞によって殺傷されたり阻害されたりしない場合、標的細胞が増殖し、ルシフェラーゼが発現し続けるにつれて、より多くのルシフェラーゼが産生される。したがって、ルシフェラーゼの活性に基づいてＣＡＲ－Ｔによる標的細胞の殺傷状況を検出できる。

インビトロ細胞殺傷の概要的な試験手順：
（１）上記の細胞を３００ｇで、室温で５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、Ｔ細胞培地に２ｘ１０^５細胞／ｍＬまで再懸濁した。９６ウェルプレートの各ウェルに標的細胞１００μＬずつを加えた。
（２）試験されるＣＡＲ－ＴサンプルのＣＡＲ陽性率およびエフェクター細胞と標的細胞の比率に応じて、ＣＡＲ－Ｔ細胞１００μＬずつを９６ウェルプレートの各ウェルに添加し、標的細胞と均一に混合した後、それを二酸化炭素インキュベーターに入れ、２４時間インキュベートした。
（３）ルシフェラーゼ検出キットを使用して、各ウェルサンプルのルシフェラーゼ活性をそれぞれ検出した。

主なサンプルと試薬：
標的細胞Ｎａｌｍ－６、Ｒｅｈ、Ｊｖｍ－２、Ｊｅｋｏ－１、Ｂｖ１７３、Ｋ５６２－ＣＤ１９、Ｋ５６２、Ｔｈｐ－１およびＳｋｍ－１；
Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｅ２５２０。

試験結果：
ＣＡＲ－Ｔ細胞サンプルと一定数の標的細胞（１ｘ１０^４個）をエフェクター細胞と標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ）４：１で混合し、２４時間コンインキュベートした後、サンプルのルシフェラーゼ活性（ＲＬＵ）を検出した。そのうち、コントロールは、標的細胞のみを含む対照サンプルであった。ルシフェラーゼ活性はサンプル中の標的細胞の数を反映できるため、サンプル中のルシフェラーゼ活性の変化に基づいて、標的細胞に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷／阻害能力を得ることができる。ルシフェラーゼ活性の読み取り値（ＲＬＵ）が低いほど、より多くの標的細胞が殺傷されたことが示される。

図１２に示すように、３グループのＣＡＲ－Ｔ細胞サンプル（＃６２、＃７８クローン、および対照ＦＭＣ６３から調製されたＣＡＲ－Ｔ細胞）は、エフェクター細胞と標的細胞の比率４：１の場合、いずれも、陽性標的細胞を効果的に殺傷ことができる。Ｔ細胞と陽性標的細胞をコンインキュベートした場合、明らかな殺傷はなかった。すべてのＣＡＲ－ＴおよびＴ細胞サンプルは、陰性標的細胞とコンインキュベートされた場合は、明らかな殺傷はなかった。したがって、３グループのＣＡＲ－Ｔサンプルは、いずれもＣＤ１９陽性標的細胞を特異的に殺傷することができ、かつＣＤ１９陰性標的細胞を非特異的に殺傷しなかった。

繰り返し刺激後の殺傷試験
試験目的と原理：
マイトマイシン（Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）で処理した標的細胞（Ｒａｊｉ）を異なるグループのＣＤ１９ ＣＡＲ－Ｔ細胞と混合して３回刺激した後、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞をコンインキュベートし、培養して、標的細胞によって繰り返し刺激された後の異なるｓｃＦｖ ＣＡＲ－Ｔの殺傷能力が変化するかどうかを確定した。

繰り返し刺激した後の殺傷試験の概要的な試験手順：
（１）Ｒａｊｉ細胞を４ｘ１０^６取り出し、３００ｇ、室温で５分間遠心分離した。
（２）完全培地を密度０．２ｘ１０^６細胞／ｍＬに調整し、Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ母液（５μｇ／μＬ）４μＬを加えてよく混合し、２４時間インキュベートして置いた。
（３）２４時間処理したＲａｊｉ－Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ細胞を３００ｇで遠心分離して培地を交換し、ＰＢＳで６回洗浄し、Ｒａｊｉ－Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ細胞をＣＴＳ培地に再懸濁し、カウントし、密度２ｘ１０^６細胞／ｍＬに調整して置いた。
（４）ＣＡＲ－Ｔ ＣＡＲの陽性率に従って、１ｘ１０^５ＣＡＲ＋細胞を取り、２４ウェルプレートに移した。Ｒａｊｉ－Ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ細胞５０μＬをＣＡＲ－Ｔの各ウェルに加え、エフェクター細胞と標的細胞の比率Ｅ：Ｔ＝１：１になるように調整した（エフェクター細胞はＣＡＲ＋として計算された）。ＣＴＳ完全培地を最終培養液体積５００μＬまで補充し、よく混合し、３７℃、５％ＣＯ_２で７２時間培養し、カウントして、標的細胞（Ｒａｊｉ）を再びＭｉｔｏｍｙｃｉｎで処理し、ＣＡＲ－Ｔ ＣＡＲ陽性率を検出し、前述したステップを３回繰り返した後、ＣＡＲ－Ｔ ＣＡＲの陽性率を検出し、陽性標的細胞Ｎａｌｍ－６、Ｒｅｈおよび陰性標的細胞Ｔｈｐ－１、Ｓｋｍ－１をコンインキュベートして殺傷活性を検出し、そのプロセスはインビトロ細胞殺傷試験と同じであった。

試験結果：
図１３に示したように、３つのグループのＣＡＲ－Ｔ細胞サンプル（＃６２、＃７８クローンおよび対照ＦＭＣ６３）は、いずれも、陽性標的細胞を効果的に殺傷でき、かつ用量依存的であり、繰り返し刺激後の殺傷強度が＃７８クローン＞対照ＦＭＣ６３＞＃６２クローンであった。Ｔ細胞と陽性標的細胞をコンインキュベートした場合、明らかな殺傷はなかった。すべてのＣＡＲ－ＴおよびＴ細胞サンプルは、陰性標的細胞とコンインキュベートした場合に明らかな殺傷がなかった。したがって、３つのグループのＣＡＲ－Ｔサンプルは、陽性標的細胞で繰り返し刺激された後、いずれも、ＣＤ１９陽性標的細胞を特異的に殺傷することができ、かつＣＤ１９陰性標的細胞を非特異的に殺傷しなかった。

実施例８．抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖｓ親和力測定
試験目的と原理：
ＣＤ１９ｓｃＦｖｓと抗原との間の親和力は、患者体内のＣＡＲ－Ｔの殺傷効果と生存時間に重要な影響を与える可能性があり、この重要な特性を確定するために、ＦｏｒｔｅＢｉｏ社のＯｃｔｅｔ分子相互作用技術を使用して測定した。Ｏｃｔｅｔシステムで使用される生体膜干渉技術は、リアルタイムでハイスループット生体分子相互作用情報を提供するラベルフリー技術である。当該機器はセンサーの表面に白色光を放射し、かつ反射光を収集する。バイオセンサーの光学フィルムの厚さは、異なる周波数の反射スペクトルに影響を与え、一部の周波数の反射光は建設的な干渉（青）を形成し、他の周波数の反射光は相殺的な干渉（赤）を形成する。これらの干渉を、分光計によって検出し、干渉スペクトルを形成し、かつ干渉スペクトルの位相シフト強度（ｎｍ）によって表示される。したがって、センサー表面に結合する分子の数が増減すると、分光計で干渉スペクトルの位相シフトは、リアルタイムで検出され、この位相シフトはセンサー表面の生体膜の厚さを直接反映するため、生体分子の相互作用に関する高品質のデータを得ることができ、生体分子間の相互作用の動力学的パラメーターを測定でき（Ｋｏｎ、Ｋｄｉｓ、ＫＤ）、開発プロセスに重要な情報を提供する。

概要的な試験手順を図１４に示した。
（１）ローディングバッファー（１×ＰＢＳ，ｐＨ７．４，０．０１％ ＢＳＡおよび０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ｒＦｃｓを２０μｇ／ｍＬに希釈し、サンプルをバイオセンサーに約０．８ｎＭロードした。
（２）６０ｓの平衡段階の後、複数の抗原濃度（４００～１２．５ｎＭ）でのＣＤ１９抗原の結合動力学をモニターした。各濃度で１６０秒間結合および３００秒間解離まで行った。
（３）１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５で３回洗浄して、チップを再生した。
（４）１：１結合部位モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｘ－１００評価ソフトウェア）を使用して結合定数を分析した。

試験結果：
親和力とは、単一分子のリガンドへの結合の強さを指す。通常、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定および報告される。平衡解離定数は、２つの分子間の相互作用の強さを評価およびランキングするために使用される。抗体のその抗原への結合は可逆プロセスであり、結合反応の速度が反応物の濃度に比例する。ＫＤ値が小さいほど、抗体の標的に対する親和力が高くなる。図１５に示すように、ＦＭＣ６３、＃６２、および＃７８はすべてＣＤ１９抗原に結合でき、親和力の順番がＦＭＣ６３＞＃７８＞＃６２であった。

実施例９．メンブレンプロテオームアレイ（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ａｒｒａｙ）
試験目的と原理：
メンブレンプロテオームアレイ（ＭＰＡ）は、細胞に基づくハイスループットプラットフォームであり、膜タンパク質に結合する単離抗体やその他のリガンドの標的の同定に用いられる。膜タンパク質は、ヒトゲノムによってコードされるすべてのタンパク質の約４分の１を占め、通常、細胞外に保持することが困難な複雑なコンフォメーション構造に折りたたまれている。ＭＰＡの重要な特徴として、膜タンパク質を細胞内で自然な状態で直接発現およびテストできるため、その構造的完全性と自然な翻訳後修飾は維持される。ＭＰＡは、これまでに組み立てられた最大の膜タンパク質ライブラリーを利用しており、５，０００種類を超えるユニークな膜タンパク質を表している。ＭＰＡプラットフォームを通じて、＃７８の特異的テストを行って、ＣＤ１９以外の抗原に非特異的に結合するかどうかを検証し、かつオフターゲット効果のリスクを評価した。

概要的な試験手順は次のとおりであった。
（１）ＭＰＡには約５０００種類の異なる膜タンパク質クローンが含まれており、ヒト膜プロテオームの９０％以上を占めている。各クローンは、ｃＤＮＡプラスミドを含むＨＥＫ－２９３Ｔ細胞で過剰発現され、当該プラスミドは、３８４ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに独立にトランスフェクトされ、膜タンパク質の発現を保証するために３６時間インキュベーションした。
（２）ＭＰＡの特異性を測定する前に、陽性（タンパク質Ａ）、陰性（ブランクベクタートランスフェクション）対照を発現するＨＥＫ－２９３Ｔ、ＱＴ６細胞上でスクリーニングするための＃７８抗体のテスト濃度を決定し、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ ６４７標識二次抗体を使用し、フローサイトメトリーで検出した。
（３）クローン７８抗体を２０μｇ／ｍＬに希釈し、上記の二次抗体を使用してＩｎｔｅｌｌｉｃｙｔｉＱｕｅでタンパク質ライブラリー全体の結合活性を測定した。プレート間の適合性と再現性を確保するために、各アレイプレートにはいずれも陽性および陰性対照が含まれている。
（４）＃７８抗体を段階希釈した後、２回目のフローサイトメトリー試験により、ＭＰＡスクリーニングによって決定された各標的が再現性よく結合できるかどうか、および用量依存性であるかどうかを確認し、シークエンシングによって標的の同一性を再確認した。

主なサンプルと試薬：
細胞株：ＨＥＫ－２９３Ｔ，Ｑ６Ｔ
Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ標的同一性ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｆ（ａｂ’）_２断片ヤギ抗ウサギＩｇＧ，Ｆｃ断片特異的，Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，１１１－６０６－０４６
ヤギ血清，Ｓｉｇｍａ，Ｇ６７６７

試験結果：
図１６に示したように、試験の予備スクリーニング段階では、＃７８抗体は５０００種類を超える膜タンパク質のほとんどに非特異的に結合しなかったが、ＳＤＣ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ４、およびＨＴＲ５Ａを高く発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞への結合が観察された。この結合は再現性があるかどうかを確認するために、＃７８抗体の濃度勾配希釈を実行し、試験を繰り返した。試験結果は、＃７８抗体がＣＤ１９と陽性対照（タンパク質Ａ）を高く発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に結合でき、かつ結合の平均蛍光強度が用量依存的であることを示した。検証試験において、＃７８抗体は、どの濃度でもＳＤＣ１、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ ４およびＴＲ５Ａを高く発現するＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に結合しなかった。これは、＃７８抗体が優れた特異性を持ち、患者体内のオフターゲットのリスクが少なく、安全性が良いであることを証明した。

本発明は、抗体スクリーニングに完全ヒトファージを使用し、完全ヒトモノクローン抗体を直接得た。従来のハイブリドーマ技術と比較して、マウス抗体のヒト化という難しいステップが省略され、完全ヒト抗体は、ヒト化マウス抗体に比べて免疫原性が低くなり、抗体薬やＣＡＲ－Ｔアプリケーションでより良い展望がある。

抗体スクリーニングの過程で、組換え発現されたＣＤ１９タンパク質を直接使用してスクリーニングされた抗体クローンは、いずれも、ＣＤ１９を高度に発現する細胞株Ｒａｊｉに結合できないことを発見した。これは、組換え発現されたＣＤ１９タンパク質抗原と細胞膜表面上の天然状態のＣＤ１９との間のコンフォメーションおよびアクセス可能なエピトープの大きな違いによって引き起こされる可能性がある。この問題を克服するために、ＣＲＩＳＰ技術を使用してＣＤ１９遺伝子ノックアウトされたＲａｊｉ－ＣＤ１９ｋｏ細胞株を調製した。タンパク質／細胞株交互パニング法を用いて、組換え発現されたＣＤ１９タンパク質とＲａｊｉ細胞に同時に結合できるファージ抗体を濃縮し、細胞膜表面のＣＤ１９抗原に特異的に結合できるモノクローン抗体をスクリーニングした。

開発プロセスでは、ファージレベルの抗体スクリーニング／特異性同定を通じて、特異的抗体クローンを迅速かつ効率的にスクリーニングし、ＣＡＲ－Ｔ機能テストに直接接続して最適な候補抗体を選択できた。このプロセスは、時間のかかる面倒な抗体タンパク質の発現と機能の同定試験をスキップし、ＣＡＲ－Ｔ開発のための抗体スクリーニングプロセスを最適化した。これにより、研究の質を確保しながら研究開発の効率が向上した。

参考文献：-
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5. Ｊｉａｓｈｅｎｇ Ｗａｎｇ， Ｙｏｎｇｘｉａｎ Ｈｕ， ａｎｄ Ｈｅ Ｈｕａｎｇ， Ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｒｅｌａｐｓｅ ａｆｔｅｒ ＣＤ１９－ｔａｒｇｅｔｅｄ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １０２， ＰＰ１－１０， Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２０１７ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ
6. ＪｉｅＸｕａ， Ｓａｉ－Ｊｕａｎ Ｃｈｅｎ ｅｔ．ａｌ， Ｅｘｐｌｏｒａｔｏｒｙ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａ ｂｉｅｐｉｔｏｐｉｃ ＣＡＲ Ｔ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｎｔｉｇｅｎ ｉｎ ｒｅｌａｐｓｅｄ／ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｍｙｅｌｏｍａ， Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ． ２０１９ Ａｐｒ １５． ｐｉｉ： ２０１８１９７４５． ｄｏｉ： １０．１０７３／ｐｎａｓ．１８１９７４５１１６
7. Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ－ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ＩＳＳＮ １０６４－３７４５ ＩＳＳＮ １９４０－６０２９ （ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ＩＳＢＮ ９７８－１－４９３９－７４４６－７ ＩＳＢＮ ９７８－１－４９３９－７４４７－４ （ｅＢｏｏｋ）， ＤＯＩ １０．１００７／９７８－１－４９３９－７４４７－４
8. Ｌａｍｅｒｓ ＣＨ， Ｇｒａｔａｍａ ＪＷ． ｅｔ． ａｌ， Ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ａｎｄ ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｅｘ ｖｉｖｏ－ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｂｌｏｏｄ． ２０１１ Ｊａｎ ６；１１７（１）：７２－８２． ｄｏｉ： １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１０－０７－２９４５２０．
9. Ｍａｒｃｅｌａ Ｖ． Ｍａｕｓ１ ａｎｄ Ｃａｒｌ Ｈ． Ｊｕｎｅ， Ｍａｋｉｎｇ Ｂｅｔｔｅｒ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２０１６ Ａｐｒｉｌ １５； ２２（８）： １８７５-１８８４． ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８－０４３２．ＣＣＲ－１５－１４３３．
10. Ｓａｕｎａ ＺＥ， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ＡＳ ｅｔ．ａｌ， Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｍｉｔｉｇａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ タンパク質ｓ． Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１８ Ｏｃｔ；３６（１０）：１０６８－１０８４
11. Ｒｙｄｚｅｋ Ｊ， Ｈｕｄｅｃｅｋ Ｍ ｅｔ．ａｌ， ｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｏｖｅｌ ＮＦ－κＢ／ＮＦＡＴ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２０１９ Ｆｅｂ ６；２７（２）：２８７－２９．

Claims (13)

1. ＣＤ１９を標的とする完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片であって、前記完全ヒト抗体の軽鎖可変領域がＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、
   （１）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＡＧＹＤであり、
   ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＥＮＴであり、
   ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＲＶであり、
   ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＮＳＷであり、
   ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＤＤＳＤＴであり、
   ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＱＳＴＹＩＹＧＧＹＹＤＴである組合せ、および、
   （２） ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＮＮＡであり、
   ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＹＤＤであり、
   ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶであり、
   ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＳＹＷであり、
   ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＧＤＳＤＴであり、
   ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＬＳＹＳＷＳＳＷＹＷＤＦである組合せからなる群から選ばれる１つである、完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片。
2. 前記軽鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すアミノ酸配列を含み、
   あるいは、
   前記軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片。
3. 前記一本鎖抗体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７または１０に示すアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載の完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片。
4. ＣＤ１９を標的とする一本鎖抗体を含むＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体であって、前記一本鎖抗体は、軽鎖可変領域がＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含み、重鎖可変領域がＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を含み、前記ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３が、
   （１）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＡＧＹＤであり、
   ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＥＮＴであり、
   ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＱＳＹＤＳＳＬＳＧＷＲＶであり、
   ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＮＳＷであり、
   ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＤＤＳＤＴであり、
   ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＱＳＴＹＩＹＧＧＹＹＤＴである組合せ、および、
   （２）ＬＣＤＲ１のアミノ酸配列がＳＳＮＩＧＮＮＡであり、
   ＬＣＤＲ２のアミノ酸配列がＹＤＤであり、
   ＬＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＡＷＤＤＳＬＮＧＷＶであり、
   ＨＣＤＲ１のアミノ酸配列がＧＹＳＦＴＳＹＷであり、
   ＨＣＤＲ２のアミノ酸配列がＩＹＰＧＤＳＤＴであり、
   ＨＣＤＲ３のアミノ酸配列がＡＲＬＳＹＳＷＳＳＷＹＷＤＦである組合せからなる群から選ばれる１つである、ＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体。
5. 前記軽鎖可変領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９に示すアミノ酸配列を含み、
   あるいは、
   前記軽鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１に示すアミノ酸配列を含み、前記重鎖可変領域がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に示すアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
6. 前記一本鎖抗体がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７または１０に示すアミノ酸配列を含む、請求項４または請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
7. 請求項４～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する改変Ｔ細胞。
8. 請求項７に記載のＴ細胞を含む、ＣＤ１９を細胞表面に発現する腫瘍を治療する薬物。
9. 請求項１～３のいずれか一項に記載の完全ヒト抗体またはその一本鎖抗体もしくは断片をコードする、単離核酸分子。
10. 前記完全ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すヌクレオチド配列を含み、かつ、重鎖可変領域をコードする配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すヌクレオチド配列を含み、
    あるいは、
    前記完全ヒト抗体の軽鎖可変領域をコードする配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すヌクレオチド配列を含み、かつ、重鎖可変領域をコードする配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すヌクレオチド配列を含む、
    請求項９に記載の核酸分子。
11. 前記一本鎖抗体をコードする配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１または４に示すヌクレオチド配列を含む、請求項９または１０に記載の核酸分子。
12. 請求項１０～１１のいずれの核酸分子を含む発現ベクター。
13. ＥＧＦＲまたはトランケートされたＥＧＦＲのコード配列をさらに含む、請求項１２に記載の発現ベクター。

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