JP7266117B2 - クローディン１８．２を標的とする抗体又はキメラ抗原受容体 - Google Patents
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Description
本発明は、生物医学又はバイオ医薬品の技術分野に関し、具体的には、クローディン１８．２を標的とする抗体若しくはその抗原結合断片又はキメラ抗原受容体並びに医薬組成物を調製し、疾患を治療、予防、検出又は診断するためのその調製方法及び使用に関する。
クローディン１８．２は、胃上皮細胞にのみ一過性に発現し、他の正常組織にはめったに発現しない。しかしながら、多くの癌性組織でクローディン１８．２の発現が異常に上昇する（Ｎｉｉｍｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１：７３８０－９０，２００１）。クローディン１８．２は、胃癌、食道癌、膵癌、肺癌、卵巣癌及び他の腫瘍で発現する。クローディン１８．２を標的とする抗体は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、アポトーシスの誘導及び直接的な増殖阻害を通して腫瘍細胞の特異的溶解を媒介することができる。従って、クローディン１８．２は、胃癌、食道癌、膵癌、肺癌及び卵巣癌の治療において現在最も有望な標的である。
クローディン１８．１は、正常な肺及び胃の上皮細胞に選択的に発現する。２つの異なる変異体の存在がクローディン１８分子に更なる複雑性をもたらしている（Ｎｉｉｍｉ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１：７３８０－９０，２００１）。どのように有効性及び安全性を更に向上させるかが、この分野において考察されるべき問題である。
Ｇａｎｙｍｅｄにより開発されたＩＭＡＢ３６２（中国特許出願公開第２０１３８００２６８９８．３号明細書）は、臨床試験に入った最初のクローディン１８．２抗体の１つである。その胃癌に対する第ＩＩ相臨床試験では、化学療法との併用で使用されたこの抗体は、標準化学療法と比較して生存期間を有意に延長し（１３．２対８．４ヵ月）、クローディン１８．２が高発現である患者においてより高い有効性及びより長い生存期間中央値（１６．７ヵ月）を有した（ＮＣＴ０１６３００８３）。
本発明は、進行胃癌、膵癌などを有する患者に新たな希望をもたらす、クローディン１８．２陽性腫瘍に対して良好な有効性のある、クローディン１８．２を標的とする抗体若しくはその抗原結合断片又はキメラ抗原受容体Ｔ細胞を提供する。
本発明全体を通して、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）、ＬＣＤＲ（軽鎖相補性決定領域）、ＨＣＤＲ（重鎖相補性決定領域）、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３に関する実施形態の全ては、単独で又は任意の組み合わせで実施され得る。
一態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、
一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、以下の組み合わせのいずれか：
（１）配列番号５に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号６に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号７に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの軽鎖相補性決定領域及び／又は配列番号８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの重鎖相補性決定領域；
（２）配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの軽鎖相補性決定領域及び／又は配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの重鎖相補性決定領域
を含み；
一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、以下の組み合わせのいずれか：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域
を含む。
一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、以下の組み合わせのいずれか：
（１）配列番号５に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号６に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号７に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの軽鎖相補性決定領域及び／又は配列番号８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの重鎖相補性決定領域；
（２）配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの軽鎖相補性決定領域及び／又は配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む３つの重鎖相補性決定領域
を含み；
一部の実施形態において、抗体又はその抗原結合断片は、以下の組み合わせのいずれか：
（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域及び／又は配列番号２に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域；
（２）配列番号３に示されるアミノ酸配列の軽鎖可変領域及び／又は配列番号４に示されるアミノ酸配列の重鎖可変領域
を含む。
本発明の一態様において、抗体又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はｄｓＦｖ断片を含む。
本発明の一態様において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１７に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む。
本発明の一態様において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１８に示されるアミノ酸配列の重鎖定常領域を含む。
本発明の一態様において、抗体又はその抗原結合断片は、配列番号２８に示されるアミノ酸配列の軽鎖定常領域を含む。
本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、以下の利点：クローディン１８．２を発現する細胞に対するより高い親和性、ＡＤＣＣを媒介する亢進した能力及びより良好な腫瘍阻害効果の１つ以上を有する。
本発明の一態様において、上記の抗体又はその抗原結合断片は、いずれもクローディン１８．２に結合する。
本発明は、抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体、関連するＣＡＲ－Ｔ細胞並びにその調製方法及び使用にも関する。
具体的には、一態様において、本発明は、上記の抗体又はその抗原結合断片のいずれかを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗体又はその抗原結合断片の３つの軽鎖相補性決定領域は、配列番号５に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号６に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号７に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含み；及び抗体又はその抗原結合断片の３つの重鎖相補性決定領域は、配列番号８に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む、キメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、本発明は、抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、抗体又はその抗原結合断片の３つの軽鎖相補性決定領域は、配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含み；及び抗体又はその抗原結合断片の３つの重鎖相補性決定領域は、配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１アミノ酸配列と、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２アミノ酸配列と、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む、キメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体であって、抗体又はその抗原結合断片のＶＬの配列は、配列番号１であり、及びＶＨの配列は、配列番号２である、キメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体であって、抗体又はその抗原結合断片のＶＬの配列は、配列番号３であり、及びＶＨの配列は、配列番号４であるキメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、抗体又はその抗原結合断片のＶＨ及びＶＬは、リンカーにより；好ましくはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳリンカーにより；好ましくはＮ末端からＣ末端にＶＨ－ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ－ＶＬの順序で連結されている。
別の態様において、本発明は、前出の態様のいずれかに係る抗体又はその抗原結合断片、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域を順次含むキメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体であって、そのうちの抗体又はその抗原結合断片は、シグナルペプチドによって指図される、キメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体であって、シグナルペプチドは、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＶＨ３シグナルペプチド、ＩＬ２シグナルペプチドなどであり得、細胞外ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ２８ヒンジ領域などであり得、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域、ＣＤ２８膜貫通領域、４－１ＢＢ膜貫通領域などであり得、及び細胞内シグナル伝達領域は、ＣＤ２８シグナル伝達領域、４－１ＢＢシグナル伝達領域、ＯＸ４０シグナル伝達領域、ＣＤ３ζシグナル伝達領域などであり得る、キメラ抗原受容体に関する。
別の態様において、本発明は、キメラ抗原受容体であって、細胞外ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域であり、膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、細胞内シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζであり、及び抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ８αシグナルペプチドによって指図される、キメラ抗原受容体に関する。好ましくは、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号２１に示されるＣＤ８αシグナルペプチドであり、細胞外ヒンジ領域は、配列番号２２に示されるＣＤ８ヒンジ領域であり、膜貫通領域は、配列番号２３に示されるＣＤ８膜貫通領域であり、細胞内シグナル伝達領域は、配列番号２４に示される４－１ＢＢ及び配列番号２５に示されるＣＤ３ζである。
別の態様において、本発明は、前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片又はキメラ抗原受容体をコードする核酸に関する。
別の態様において、本発明は、前出の態様に係る核酸を含むベクター又は前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片又はキメラ抗原受容体を発現するベクターに関する。好ましくは、ベクターは、ウイルスベクターであり得；好ましくは、ウイルスベクターは、限定はされないが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを含み；好ましくは、ベクターは、非ウイルスベクターであり得；好ましくは、非ウイルスベクターは、トランスポゾンベクターであり得；好ましくは、トランスポゾンベクターは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙベクター、ＰｉｇｇｙＢａｃベクターなどであり得；好ましくは、ベクターは、哺乳類発現ベクターであり得；好ましくは、発現ベクターは、細菌発現ベクターであり得；好ましくは、発現ベクターは、真菌発現ベクターであり得る。
別の態様において、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
別の態様において、レンチウイルスベクターは、図１１に示されるプラスミドｐＲＲＬＳＩＮ－クローディン１８．２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔである。
別の態様において、ベクターは、ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンベクターである。
別の態様において、ＰＢトランスポゾンベクターは、図２４に示されるプラスミドＰＢ ＣＮ０２ ＣＡＲである。
別の態様において、本発明は、前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片又はキメラ抗原受容体を発現する細胞に関する。好ましくは、細胞は、細菌細胞であり；好ましくは、細菌細胞は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）細胞などであり；好ましくは、細胞は、真菌細胞であり；好ましくは、真菌細胞は、酵母細胞であり；好ましくは、酵母細胞は、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）細胞などであり；好ましくは、細胞は、哺乳類細胞であり；及び好ましくは、哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児腎細胞（２９３）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＤＣ細胞、ＮＫ細胞などである。
別の態様において、本発明は、前出の態様のいずれかに係るキメラ抗原受容体を含むＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。
別の態様において、本発明は、前出の態様に係るＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、前出の態様のいずれかに係るキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むベクターをＴ細胞にトランスフェクトすることを含む方法に関する。好ましい実施形態において、ベクターは、非ウイルスベクターである。好ましい実施形態において、ベクターは、ＰＢトランスポゾンベクターである。好ましい実施形態において、ＰＢトランスポゾンベクターは、図２４に示されるプラスミドＰＢ ＣＮ０２ ＣＡＲである。
別の態様において、本発明は、前出の態様に係るＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、トランスポザーゼをコードする核酸を含むベクターをＴ細胞にトランスフェクトすることを含む方法に関する。別の好ましい実施形態において、トランスポザーゼは、ＰＢトランスポザーゼである。
別の態様において、本発明は、前出の態様に係るＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、前出の態様のいずれかに係るキメラ抗原受容体をコードする核酸を含むトランスポゾンベクター及びトランスポザーゼをコードする核酸を含むトランスポザーゼベクターをＴ細胞にトランスフェクトすることを含む方法に関する。好ましい実施形態において、トランスポゾンベクターは、ＰＢトランスポゾンベクターである。好ましい実施形態において、ＰＢトランスポゾンベクターは、図２４に示されるプラスミドＰＢ ＣＮ０２ ＣＡＲである。好ましい実施形態において、トランスポザーゼは、ＰＢトランスポザーゼである。
別の態様において、本発明は、前出の態様に係るＣＡＲ－Ｔ細胞を調製する方法であって、前出の態様のいずれかに係るキメラ抗原受容体ベクターを含むレンチウイルスでＴ細胞を形質導入して、ＣＡＲ－Ｔ細胞を得ることを含む方法に関する。
別の態様において、本発明は、前出の態様のいずれかに係るＣＡＲ－Ｔ細胞を含む医薬組成物に関する。
別の態様において、本発明は、癌を治療する方法であって、必要としている対象に、前出の態様のいずれかに係るＣＡＲ－Ｔ細胞を投与することを含む方法に関する。
別の態様において、本発明は、癌の治療における、前出の態様のいずれかに係るＣＡＲ－Ｔ細胞の使用に関する。
別の態様において、本発明は、癌の治療用医薬組成物の調製における、前出の態様のいずれかに係るＣＡＲ－Ｔ細胞の使用に関する。
別の態様において、本発明は、以下の利点：クローディン１８．２を発現する細胞に対する良好な殺傷能力；及びクローディン１８．１を発現する細胞に対する低い殺傷能力の１つ以上を有するＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。
一態様において、本発明は、本明細書に開示される抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、それをコードする核酸又はそれを発現する細胞と；薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物を提供する。薬学的に許容可能な担体は、以下：薬学的に許容可能な媒体、分散剤、添加剤、可塑剤及び賦形剤の１つ以上を含む。
一態様において、本発明は、本明細書に開示される抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体又はそれをコードする核酸を含むキットを提供する。
一部の実施形態において、医薬組成物は、他の療法剤も含み得る。一部の実施形態において、他の療法剤としては、化学療法剤、免疫療法剤又はホルモン療法剤が挙げられる。抗体又は抗原結合断片を他の療法剤と併用して使用することにより、有効性を亢進させることができる。
一部の実施形態において、「有効性を亢進させること」とは、他の療法剤又は治療モダリティの有効性を亢進させることを指す。本明細書に開示される抗体又は抗原結合断片は、単独で又は他の療法剤若しくは治療モダリティと併用して投与することができる。一部の実施形態において、他の療法剤又はモダリティとしては、化学療法剤、免疫療法剤、ホルモン療法剤、放射線療法及び手術が挙げられる。
別の態様において、本発明は、疾患の治療又は予防用医薬組成物の調製における、前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター又は細胞の使用に関する。
別の態様において、本発明は、診断又は検出用キットの調製における、前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体又は核酸の使用に関する。
別の態様において、疾患の治療又は予防する方法であって、必要としている対象に、本明細書に開示される抗体若しくは抗原結合断片、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。
別の態様において、必要としている対象又は試料に、本明細書に開示される抗体若しくは抗原結合断片、キメラ抗原受容体、核酸又はキットを投与することを含む診断又は検出方法が提供される。
別の態様において、本発明は、疾患を治療又は予防するための、前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、核酸、ベクター、細胞又は医薬組成物の使用を提供する。
別の態様において、本発明は、検出又は診断のための、前出の態様のいずれかに係る抗体若しくはその抗原結合断片、キメラ抗原受容体、核酸又はキットの使用を提供する。
別の態様において、疾患は、癌である。
別の態様において、癌は、クローディン１８．２陽性癌である。
別の態様において、癌は、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、結腸癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫などを含む。
本発明は、以下の具体的な例と併せて更に説明されることになる。本明細書に説明される例は、本発明の一部の例に過ぎず、全ての例ではない。以下の例は、本方法及び本組成物をどのように利用するかについての完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、本発明の範囲を限定する意図はないことが理解されなければならない。本発明の例に基づき、当業者が創造的な作業なく達成する他のあらゆる例が本発明の保護範囲内に含まれるものとする。
実施例１．抗クローディン１８．２モノクローナル抗体の作製
１．１ 免疫化
Ｓｈａｎｄｏｎｇ ＢｏＡｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．からのＢｏＡｎ－ｈＭａｂトランスジェニックマウス（中国特許第１０３５７１８７２Ｂ号明細書に記載される方法に従い調製された）を、クローディン１８．２遺伝子を含むプラスミド（ＫＹｉｎｎｏ）及びクローディン１８．２タンパク質を安定に発現するＣＨＯ細胞（ＫＹｉｎｎｏ）で免疫した。プラスミドは、初回免疫に使用し、２～７回目の免疫は、プラスミドと細胞とを交互に使用した。合計１０匹のマウスを免疫した。血清濃度が高い５匹のマウスをブースター免疫化に選択し、４日後、それらのマウスを安楽死させた。脾臓を処理し、後の使用のために凍結した。
１．１ 免疫化
Ｓｈａｎｄｏｎｇ ＢｏＡｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．Ｌｔｄ．からのＢｏＡｎ－ｈＭａｂトランスジェニックマウス（中国特許第１０３５７１８７２Ｂ号明細書に記載される方法に従い調製された）を、クローディン１８．２遺伝子を含むプラスミド（ＫＹｉｎｎｏ）及びクローディン１８．２タンパク質を安定に発現するＣＨＯ細胞（ＫＹｉｎｎｏ）で免疫した。プラスミドは、初回免疫に使用し、２～７回目の免疫は、プラスミドと細胞とを交互に使用した。合計１０匹のマウスを免疫した。血清濃度が高い５匹のマウスをブースター免疫化に選択し、４日後、それらのマウスを安楽死させた。脾臓を処理し、後の使用のために凍結した。
１．２ ファージライブラリの構築
免疫化マウスの脾臓細胞をトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１５５９６－０２６）と加え合わせて完全に溶解させ、次に５分の１容量のクロロホルムと加え合わせ、十分に混合した。この混合物を室温で２０分間インキュベートし、１２０００ｒｐｍにおいて４℃で２０分間遠心した。上清を等容量のイソプロパノールと加え合わせた。得られた混合物を室温で２０分間インキュベートし、次に１２０００ｒｐｍにおいて４℃で２０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄し、次に１２０００ｒｐｍにおいて４℃で５分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿物を室温で乾燥させて、次にＤＥＰＣ水で再懸濁してＲＮＡを得て、次にこれを、Ｒｏｃｈｅ逆転写キットＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットを説明書のとおりに使用して（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：４８９７０３０００１）、ｃＤＮＡに逆転写した。
免疫化マウスの脾臓細胞をトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：１５５９６－０２６）と加え合わせて完全に溶解させ、次に５分の１容量のクロロホルムと加え合わせ、十分に混合した。この混合物を室温で２０分間インキュベートし、１２０００ｒｐｍにおいて４℃で２０分間遠心した。上清を等容量のイソプロパノールと加え合わせた。得られた混合物を室温で２０分間インキュベートし、次に１２０００ｒｐｍにおいて４℃で２０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿物を７５％エタノールで２回洗浄し、次に１２０００ｒｐｍにおいて４℃で５分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿物を室温で乾燥させて、次にＤＥＰＣ水で再懸濁してＲＮＡを得て、次にこれを、Ｒｏｃｈｅ逆転写キットＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ合成キットを説明書のとおりに使用して（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号：４８９７０３０００１）、ｃＤＮＡに逆転写した。
Ｃａｒｌｏｓ Ｆ．Ｂａｒｂａｓ ＩＩＩ，Ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載される方法により、ファージライブラリを構築した。重鎖及び軽鎖の可変領域の配列をＰＣＲによってｃＤＮＡから入手し、次にオーバーラップ伸長ＰＣＲに供してｓｃＦｖ配列を得た。次に、ｓｃＦｖをＳｆｉＩ酵素（ＮＥＢ、カタログ番号：Ｒ０１２３Ｌ）で５時間（５０℃）消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．）でプラスミドｐＣＯＭＢ３ｘ（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌａｂ，Ｉｎｃ．、ＢＩＯＶＥＣＴＯＲ５１０８３７）とライゲートした。ライゲーション産物をコンピテント大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＴＧ１細胞（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号：Ａ９６５９５－２）にエレクトロトランスフェクションし、次にそれを振盪機上で２２０ｒｐｍにおいて３７℃で培養し、ファージに感染させて、培養液の上清を回収し、濃縮し、精製して、ファージライブラリを得た。
１．３ スクリーニング
１．３．１ プレートスクリーニング：プレートをクローディン１８．２タンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって０．３μｇ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを２％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、ファージライブラリ（２×１０１２）を加えて２時間インキュベートした。４～１０回洗浄した後、クローディン１８．２に特異的に結合しているファージを溶出緩衝液（ｐＨ２．２）（４．２ｍＬの濃塩酸（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｋｅｍｉｏｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を５００ｍＬの超純水に加え、この混合物をグリシン粉末（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ、ＢＧ０６１７－５００）でｐＨ２．２に調整した）で溶出した。
１．３．１ プレートスクリーニング：プレートをクローディン１８．２タンパク質（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって０．３μｇ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを２％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、ファージライブラリ（２×１０１２）を加えて２時間インキュベートした。４～１０回洗浄した後、クローディン１８．２に特異的に結合しているファージを溶出緩衝液（ｐＨ２．２）（４．２ｍＬの濃塩酸（Ｔｉａｎｊｉｎ Ｋｅｍｉｏｕ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を５００ｍＬの超純水に加え、この混合物をグリシン粉末（Ｂｉｏｔｏｐｐｅｄ、ＢＧ０６１７－５００）でｐＨ２．２に調整した）で溶出した。
１．３．２ 細胞スクリーニング：ファージライブラリ（２×１０１２）を室温で２９３Ｔ－クローディン１８．１細胞（３×１０６細胞／バイアル）と回転混合し、１時間インキュベートした。得られた混合物を２％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次に室温で２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞（２×１０６細胞／バイアル）と回転混合し、２時間インキュベートした。４～１０回洗浄した後、クローディン１８．２に特異的に結合しているファージを溶出緩衝液（ｐＨ２．２）で溶出した。この細胞スクリーニングを通ったファージは、更にプレート上でのスクリーニングを受けることができた。
実施例２．完全抗体の構築及び作製
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により、クローンＣＬＤ３８７－Ｃ１１５、ＣＬＤ３８９－Ｃ２７９＼ＣＡ８０２＼ＣＡ８５２、ＣＬＤＱＭｉｘ－ＣＡ８０８．１＼ＣＡ８１１＼ＣＡ８１８、ＣＬＤＱ１－ＣＡ８４１＼ＣＡ８４３、ＣＬＤ３９３－Ｃ１００２＼Ｃ１０２４がシーケンシングされた。これらのクローンの可変領域のアミノ酸配列を表１に示す。
Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．により、クローンＣＬＤ３８７－Ｃ１１５、ＣＬＤ３８９－Ｃ２７９＼ＣＡ８０２＼ＣＡ８５２、ＣＬＤＱＭｉｘ－ＣＡ８０８．１＼ＣＡ８１１＼ＣＡ８１８、ＣＬＤＱ１－ＣＡ８４１＼ＣＡ８４３、ＣＬＤ３９３－Ｃ１００２＼Ｃ１０２４がシーケンシングされた。これらのクローンの可変領域のアミノ酸配列を表１に示す。
可変領域遺伝子増幅（２＊Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、製造者：Ｖａｚｙｍｅ、カタログ番号：Ｐ５１５－ＡＡ、バッチ番号：７Ｅ２１１ＧＢ）、シグナルペプチド及び可変領域オーバーラップ伸長及び相同組換え（ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ、製造者：Ｖａｚｙｍｅ、カタログ番号：Ｃ１１２－０１、バッチ番号：７Ｅ２１１Ｌ８）などの方法により、ＶＨ又はＶＬをコードするヌクレオチド配列断片を、それぞれ重鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号１７）を含むベクターｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び軽鎖定常領域をコードするヌクレオチド配列（配列番号２８）を含むｐＣＤＮＡ３．４（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に挿入した。次に、これらのベクターをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、振盪機上で３７℃／８％ＣＯ２／１２５ｒｐｍにおいてインキュベートした。６～７日間一過性に発現させた後、上清をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより精製してクローディン１８．２抗体を得て、ＵＶ２８０での吸光係数によって抗体濃度を決定した。
抗体ＩＭＡＢ３６２を参照抗体として選択した。胃癌に対する第ＩＩ相臨床試験では、化学療法と併用したこの抗体により、標準化学療法と比較して生存期間が有意に延長した（１３．２対８．４ヵ月）。ＩＭＡＢ３６２では、クローディン１８．２が高発現である患者において、より高い有効性及びより長い生存期間中央値（１６．７ヵ月）が認められた。ＩＭＡＢ３６２は、臨床試験に入った最初のクローディン１８．２抗体の１つでもある。
参照抗体の作製：Ｇａｎｙｍｅｄのクローディン１８．２抗体ＩＭＡＢ３６２のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴデータベース及び中国特許出願公開第２０１３８００２６８９８号明細書において利用可能であり、重鎖及び軽鎖配列がそれぞれ配列番号１９及び２０に示される。全遺伝子配列を合成し、ベクターｐＣＤＮＡ３．４に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞で発現させて、ＩＭＡＢ３６２と名付けられた抗体を作製した。
実施例３．抗クローディン１８．２抗体の特徴付け
３．１ Ｅｌｉｓａによるクローディン１８．２タンパク質に対する抗体の結合
プレートを種々の濃度（０．２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ）のクローディン１８．２抗原（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、３％脱脂粉乳によって３７℃で１時間ブロッキングした。１００μＬの候補抗体を各ウェルに１μｇ／ｍＬで加え、３７℃で１時間インキュベートし、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰを加えて３７℃で１時間インキュベートした。１０分間発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定した。結果を図１、図２、表２及び表３に示す。
３．１ Ｅｌｉｓａによるクローディン１８．２タンパク質に対する抗体の結合
プレートを種々の濃度（０．２μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、０．０１２５μｇ／ｍＬ）のクローディン１８．２抗原（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって１００μＬ／ウェルでコーティングし、４℃で一晩インキュベートし、３％脱脂粉乳によって３７℃で１時間ブロッキングした。１００μＬの候補抗体を各ウェルに１μｇ／ｍＬで加え、３７℃で１時間インキュベートし、続いてヤギ抗ヒトＩｇＧ／ＨＲＰを加えて３７℃で１時間インキュベートした。１０分間発色させた後、マイクロプレートリーダーでＯＤ４５０を測定した。結果を図１、図２、表２及び表３に示す。
３．２ フローサイトメトリーによって測定した２９３Ｔ－クローディン１８．１／１８．２細胞及びＮＵＧＣ４細胞に対する抗体の結合
９６ウェル丸底プレートに５０μＬの２９３Ｔ－クローディン１８．１若しくは１８．２細胞（ＫＹｉｎｎｏ）又はＮＵＧＣ４細胞を１×１０５細胞／ウェルで加えた。各候補抗体をＦＡＣＳ緩衝液（滅菌ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ）で段階希釈し、９６ウェル丸底プレートに５０μＬ／ウェルで加えた後、４℃で１時間インキュベートした。２０００ｒｐｍで３分間遠心した後、上清を廃棄した。次に、得られた細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０９）と１μｇ／ｍＬの最終濃度で加え合わせ、４℃で１時間インキュベートした後、２０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を廃棄し、得られた細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｐｈａｒｍａ、ＮｏｖｏＣｙｔｅ ２０６０）によって分析した。結果を図３Ａ～図５Ｂ及び表４～表９に示す。
９６ウェル丸底プレートに５０μＬの２９３Ｔ－クローディン１８．１若しくは１８．２細胞（ＫＹｉｎｎｏ）又はＮＵＧＣ４細胞を１×１０５細胞／ウェルで加えた。各候補抗体をＦＡＣＳ緩衝液（滅菌ＰＢＳ、０．２％ＢＳＡ）で段階希釈し、９６ウェル丸底プレートに５０μＬ／ウェルで加えた後、４℃で１時間インキュベートした。２０００ｒｐｍで３分間遠心した後、上清を廃棄した。次に、得られた細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルの蛍光二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０４０－０９）と１μｇ／ｍＬの最終濃度で加え合わせ、４℃で１時間インキュベートした後、２０００ｒｐｍで３分間遠心した。上清を廃棄し、得られた細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、フローサイトメーター（ＡＣＥＡ Ｐｈａｒｍａ、ＮｏｖｏＣｙｔｅ ２０６０）によって分析した。結果を図３Ａ～図５Ｂ及び表４～表９に示す。
図３Ａに示されるとおり、２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を標的として、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１の平均蛍光強度は、３μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ及び０．３７５μｇ／ｍＬの濃度でＩＭＡＢ３６２よりも高かった。これは、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１が、３μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ、０．７５μｇ／ｍＬ及び０．３７５μｇ／ｍＬの濃度において、２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞に対してより高い親和性を有することを示している。
図５Ｂに示されるとおり、ＮＵＧＣ４細胞を標的として、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１の平均蛍光強度は、３μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ及び０．７５μｇ／ｍＬの濃度でＩＭＡＢ３６２よりも高かった。これは、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１が、３μｇ／ｍＬ、１．５μｇ／ｍＬ及び０．７５μｇ／ｍＬの濃度において、クローディン１８．２を発現するＮＵＧＣ４細胞に対してより高い親和性を有することを示している。
図３Ａに示されるとおり、２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞を標的として、候補抗体ＣＬＤＱ１－ＣＡ８４１－ＩｇＧ１の平均蛍光強度は、３μｇ／ｍＬ及び１．５μｇ／ｍＬの濃度でＩＭＡＢ３６２よりも高かった。これは、候補抗体ＣＬＤＱ１－ＣＡ８４１－ＩｇＧ１が、３μｇ／ｍＬ及び１．５μｇ／ｍＬの濃度において、２９３Ｔ－クローディン１８．２細胞に対してより高い親和性を有することを示している。
図４Ａに示されるとおり、２９３Ｔ－クローディン１８．１細胞を標的として、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１及びＣＬＤＱ１－ＣＡ８４１－ＩｇＧ１の平均蛍光強度は、ＩＭＡＢ３６２と同程度であり、これらは、全て様々な濃度でより低いレベルであった。
上記の結果は、ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１及びＣＬＤＱ１－ＣＡ８４１－ＩｇＧ１が、クローディン１８．２を発現する細胞のより良好な結合能力を有し、クローディン１８．１の結合能力が弱いことを示している。これは、クローディン１８．２細胞が一層結合し易く、臨床適用でクローディン１８．２以外の標的への特異的結合が起こる可能性が低いため、より良好な薬学的効果が実現することを示している。
３．３ 抗体のＡＤＣＣ
滅菌ウシ胎仔血清を解凍し、ＲＰＭＩ１６４０培地に１：９９の比で加えてＡＤＣＣ緩衝液を得た。ＰＢＭＣ細胞を解凍し、インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。標的細胞（２９３Ｔ－クローディン１８．１又は１８．２）の密度をＡＤＣＣ緩衝液で２×１０５細胞／ｍＬに調整し、９６ウェル丸底プレートの各ウェルに５０μＬの標的細胞を加えた。試験しようとする抗体を１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬからＡＤＣＣ緩衝液で１０倍希釈し、次に標的細胞をコーティングした９６ウェル丸底プレートの各ウェルに５０μＬの希釈した抗体を加え、インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で３０～６０分間インキュベートした。ＰＢＭＣ細胞を回収し、ＡＤＣＣ緩衝液で２×１０６細胞／ｍＬ～５×１０６細胞／ｍＬの密度に希釈し、次に試験しようとする標的細胞及び試料でコーティングした９６ウェル丸底プレートの各ウェルに１００μＬの希釈した細胞を加え、インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で４～６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を３００ｇで２～５分間遠心し、次に５０μＬの上清を新しい９６ウェル平底プレートに慎重にピペッティングし、５０μＬのＬＤＨ試液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を加えた。次に、細胞をインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に停止緩衝液を加えた。４９０ｎｍでのＯＤ値をマイクロプレートリーダーによって測定し、ここで、バックグラウンド波長は、６５０ｎｍであった。結果を図６Ａ～図６Ｂ及び表１０～表１１に示す。
滅菌ウシ胎仔血清を解凍し、ＲＰＭＩ１６４０培地に１：９９の比で加えてＡＤＣＣ緩衝液を得た。ＰＢＭＣ細胞を解凍し、インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。標的細胞（２９３Ｔ－クローディン１８．１又は１８．２）の密度をＡＤＣＣ緩衝液で２×１０５細胞／ｍＬに調整し、９６ウェル丸底プレートの各ウェルに５０μＬの標的細胞を加えた。試験しようとする抗体を１０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬからＡＤＣＣ緩衝液で１０倍希釈し、次に標的細胞をコーティングした９６ウェル丸底プレートの各ウェルに５０μＬの希釈した抗体を加え、インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で３０～６０分間インキュベートした。ＰＢＭＣ細胞を回収し、ＡＤＣＣ緩衝液で２×１０６細胞／ｍＬ～５×１０６細胞／ｍＬの密度に希釈し、次に試験しようとする標的細胞及び試料でコーティングした９６ウェル丸底プレートの各ウェルに１００μＬの希釈した細胞を加え、インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で４～６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を３００ｇで２～５分間遠心し、次に５０μＬの上清を新しい９６ウェル平底プレートに慎重にピペッティングし、５０μＬのＬＤＨ試液（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ１７８０）を加えた。次に、細胞をインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした。インキュベーション後に停止緩衝液を加えた。４９０ｎｍでのＯＤ値をマイクロプレートリーダーによって測定し、ここで、バックグラウンド波長は、６５０ｎｍであった。結果を図６Ａ～図６Ｂ及び表１０～表１１に示す。
図６Ａに示されるとおり、２９３Ｔ－クローディン１８．２を標的とし、且つＰＢＭＣをエフェクター細胞として、１μｇ／ｍＬ及び０．１μｇ／ｍＬの濃度で標的細胞に対する候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１の阻害率は、対応する濃度の参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも高かったことから、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１は１μｇ／ｍＬ及び０．１μｇ／ｍＬの濃度で参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも良好なＡＤＣＣ媒介能力を有することが示唆される。これは、ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１が、クローディン１８．２を発現する標的細胞をより良好に殺傷することができ、より良好な薬学的効果を有することを示している。
細胞をカウントし、ＡＤＣＣ緩衝液で４×１０５細胞／ｍＬに希釈した。適切な量の試料を取って段階希釈した。エフェクター細胞ジャーカット（Ｇ７０１１、Ｐｒｏｍｅｇａ）を１５００ｒｐｍで遠心し、上清を廃棄し、１％ＦＢＳ ＲＰＭＩ－１６４０培地で再懸濁した。細胞をカウントし、ＡＤＣＣ緩衝液で８×１０５細胞／ｍＬに希釈した。次に、白色９６ウェルプレート（３９１７、Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに２５μＬの標的細胞を加え、標的細胞をコーティングした各ウェルに２５μＬの段階希釈した抗体を加えた。各ウェルに２５μＬのエフェクター細胞（ジャーカット）を２００００：１００００のエフェクター細胞対標的細胞比で加えた。次に、９６ウェルプレートを細胞インキュベーターにおいて５時間インキュベートし、室温で平衡化させた。次に、各ウェルに７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ発色緩衝液（Ｇ７９４０、Ｐｒｏｍｅｇａ）を加えて１５分間反応させて、プレートをＴｅｃａｎマイクロプレートリーダー（化学発光）で検出した。結果を図７Ａ～図８及び表１２～表１３に示す。
図７Ａに示されるとおり、ＮＵＧＣ４を標的として、ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１のＥＣ５０値は、１．２６４μｇ／ｍＬであり、これは、２．１５４μｇ／ｍＬの参照抗体ＩＭＡＢ３６２のＥＣ５０値よりも低かったことから、候補抗体ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１が参照抗体ＩＭＡＢ３６２よりも良好なＡＤＣＣ媒介能力を有することが示される。これは、ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１が、クローディン１８．２を発現する標的細胞をより良好に殺傷することができ、より良好な薬学的効果を有することを示している。
実施例４．抗クローディン１８．２抗体のＦｃ末端の修飾
４．１ 抗体のＦｃ末端の修飾
抗体のＡＤＣＣを亢進させ、且つ抗体とＦｃ受容体との間の親和性を変えるため、抗体のＦｃ末端を突然変異させた。重鎖定常領域の突然変異型アミノ酸配列は、配列番号１８に示される。得られた抗体は、ＣＬＤＱＭｉｘ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬと名付けた。
４．１ 抗体のＦｃ末端の修飾
抗体のＡＤＣＣを亢進させ、且つ抗体とＦｃ受容体との間の親和性を変えるため、抗体のＦｃ末端を突然変異させた。重鎖定常領域の突然変異型アミノ酸配列は、配列番号１８に示される。得られた抗体は、ＣＬＤＱＭｉｘ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬと名付けた。
４．２ Ｆｃ受容体に対する修飾抗体の親和性
４．２．１ ヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＦｃＲｎ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＣＭ－Ｈ８２Ｗ４、１μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．２ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を３３．３ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、１５０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、定常状態解析を用いて平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
４．２．１ ヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＦｃＲｎ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＦＣＭ－Ｈ８２Ｗ４、１μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．２ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を３３．３ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、１５０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、定常状態解析を用いて平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
４．２．２ ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ）に対する抗体の親和性
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、１μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．２ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を１０００ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、１５０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、定常状態解析を用いて平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、１μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．２ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を１０００ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、１５０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、定常状態解析を用いて平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
４．２．３ ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ）に対する抗体の親和性
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３８９－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、０．５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．５ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を１６６．７ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、３０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、１：１モデルを用いた曲線の当てはめによって会合定数（ｋｏｎ）、解離定数（ｋｄｉｓ）を計算し、ｋｄ／ｋａの比で平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ１６ａ（Ｖ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３８９－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、０．５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．５ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を１６６．７ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、３０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、１：１モデルを用いた曲線の当てはめによって会合定数（ｋｏｎ）、解離定数（ｋｄｉｓ）を計算し、ｋｄ／ｋａの比で平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
４．２．４ ヒトＣＤ１６ａ（Ｆ）に対する抗体の親和性
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ１６ａ（Ｆ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３８９－Ｈ２７Ｈ－Ｂ、０．５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．５ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を３３３．３ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、３０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、１：１モデルを用いた曲線の当てはめによって会合定数（ｋｏｎ）、解離定数（ｋｄｉｓ）を計算し、ｋｄ／ｋａの比で平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ１６ａ（Ｆ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３８９－Ｈ２７Ｈ－Ｂ、０．５μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．５ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を３３３．３ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、３０秒に設定し、解離時間は、１００秒に設定した。アッセイ後、１：１モデルを用いた曲線の当てはめによって会合定数（ｋｏｎ）、解離定数（ｋｄｉｓ）を計算し、ｋｄ／ｋａの比で平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
４．２．５ ヒトＣＤ３２ｂに対する抗体の親和性
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、１μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．２ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を２０００ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、４０秒に設定し、解離時間は、５０秒に設定した。アッセイ後、定常状態解析を用いて平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）に基づくＯｃｔｅｔＲＥＤ９６システムにより、抗体結合反応速度を決定した。ヒトＣＤ３２ａ（Ｈ）（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０３７４－Ｈ２７Ｈ１－Ｂ、１μｇ／ｍＬ）をストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ ａｎｄ Ｒｅａｄ（商標）バイオセンサーに０．２ｎｍのローディング高さでロードした。抗体を２０００ｍＭからＰＢＳＴで２倍段階希釈し、且つブランク対照をセットした。会合時間は、４０秒に設定し、解離時間は、５０秒に設定した。アッセイ後、定常状態解析を用いて平衡解離定数（ｋＤ）を計算した。
表１４に示されるとおり、作動性受容体、特にヒトＣＤ１６ａ（Ｆ）に対するＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬの親和性は、大幅に向上しており、従って対象におけるＡＤＣＣがより良好に促進される。
実施例５．抗クローディン１８．２抗体の薬力学
１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地でヒト胃癌ＮＵＧＣ４細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、カタログ番号：ＪＣＲＢ０８３４）をインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で単層培養によってインビトロ培養した。従来の実施技法に従い、週２回、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで消化して継代した。８０％～９０％の細胞飽和度及び所要の数に達したとき、細胞を回収し、カウントし、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌、６～８週齢、１８～２２ｇ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に移植した。０．２ｍＬ（１×１０６細胞）のＮＵＧＣ４細胞を（１：１の容積比でマトリゲルと共に）各マウスの右背部に皮下移植し、平均腫瘍容積が約６０～７０ｍｍ３になったところでマウスを無作為化した。動物を投与前に秤量し、腫瘍容積を測定した。マウスは、腫瘍容積別に無作為化し（乱塊法計画）、各群８匹とした。体重を週２回測定し、腫瘍直径をノギスで週２回測定した。腫瘍容積は、以下の式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の長径及び短径を表す）を用いて計算した。結果を図９及び表１５に示す。
１０％ウシ胎仔血清、１００Ｕ／ｍＬペニシリン及び１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地でヒト胃癌ＮＵＧＣ４細胞（ＪＣＲＢ細胞バンク、カタログ番号：ＪＣＲＢ０８３４）をインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で単層培養によってインビトロ培養した。従来の実施技法に従い、週２回、細胞をトリプシン－ＥＤＴＡで消化して継代した。８０％～９０％の細胞飽和度及び所要の数に達したとき、細胞を回収し、カウントし、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌、６～８週齢、１８～２２ｇ）（Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｌｉｎｇｃｈａｎｇ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）に移植した。０．２ｍＬ（１×１０６細胞）のＮＵＧＣ４細胞を（１：１の容積比でマトリゲルと共に）各マウスの右背部に皮下移植し、平均腫瘍容積が約６０～７０ｍｍ３になったところでマウスを無作為化した。動物を投与前に秤量し、腫瘍容積を測定した。マウスは、腫瘍容積別に無作為化し（乱塊法計画）、各群８匹とした。体重を週２回測定し、腫瘍直径をノギスで週２回測定した。腫瘍容積は、以下の式：Ｖ＝０．５ａ×ｂ２（式中、ａ及びｂは、それぞれ腫瘍の長径及び短径を表す）を用いて計算した。結果を図９及び表１５に示す。
図９に示されるとおり、５ｍｇ／ｋｇ ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬの腫瘍阻害効果は、１０ｍｇ／ｋｇ ＩＭＡＢ３６２と同等であった。１０ｍｇ／ｋｇ ＩＭＡＢ３６２と比較すると、１０ｍｇ／ｋｇ ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬは、より良好な腫瘍阻害効果を実証した。このことから、ＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬ抗体がＩＭＡＢ３６２よりも良好な腫瘍阻害活性を有し、及びＣＬＤＱＭＩＸ－ＣＡ８０８．１－ＩｇＧ１－ＶＬＰＬＬが腫瘍に及ぼす阻害効果が用量依存的であることが示された。腫瘍阻害効果は、用量と共に増加する。
実施例６．クローディン１８．２特異的キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞の調製
６．１ キメラ抗原受容体の遺伝子断片の調製
本発明では、融合遺伝子断片を以下の順序のコード遺伝子：ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＡ８４１ ｓｃＦｖ ＶＨ－リンカー－ＣＡ８４１ ｓｃＦｖ ＶＬ、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域並びに４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域で設計し、この融合遺伝子を遺伝子合成技法によって直接合成することにより、発現したキメラ抗原受容体がｓｃＦｖ ＶＨ－リンカー－ｓｃＦｖ ＶＬ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζのアミノ酸配列を有することを可能にした。リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列を有し、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号２１の配列を有し、ＣＤ８ヒンジ領域（ＣＤ８ヒンジ）は、配列番号２２の配列を有し、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ ＴＭ）は、配列番号２３の配列を有し、４－１ＢＢは、配列番号２４の配列を有し、及びＣＤ３ζは、配列番号２５の配列を有した。
６．１ キメラ抗原受容体の遺伝子断片の調製
本発明では、融合遺伝子断片を以下の順序のコード遺伝子：ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＡ８４１ ｓｃＦｖ ＶＨ－リンカー－ＣＡ８４１ ｓｃＦｖ ＶＬ、ＣＤ８ヒンジ領域、ＣＤ８膜貫通領域並びに４－１ＢＢ及びＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達領域で設計し、この融合遺伝子を遺伝子合成技法によって直接合成することにより、発現したキメラ抗原受容体がｓｃＦｖ ＶＨ－リンカー－ｓｃＦｖ ＶＬ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζのアミノ酸配列を有することを可能にした。リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳの配列を有し、ＣＤ８αシグナルペプチドは、配列番号２１の配列を有し、ＣＤ８ヒンジ領域（ＣＤ８ヒンジ）は、配列番号２２の配列を有し、ＣＤ８膜貫通領域（ＣＤ８ ＴＭ）は、配列番号２３の配列を有し、４－１ＢＢは、配列番号２４の配列を有し、及びＣＤ３ζは、配列番号２５の配列を有した。
ヒトＥＦ１ａプロモーターを含むｐＲＲＬＳＩＮレンチウイルスベクターの全遺伝子を合成し、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）配列をＥＧＦＲｔマーカータンパク質配列に置き換えて、ｐＲＲＬＳＩＮ－ＥＧＦＲｔベクターを得た（図１０を参照されたい）。
６．２ キメラ抗原受容体のレンチウイルス発現ベクターの構築
本例において、本発明のレンチウイルスプラスミドベクターの構築に使用したベクターシステムは、第３世代自己不活性化レンチウイルスベクターシステムであった。このシステムは、３つのプラスミド、タンパク質Ｇａｇ／ＰｏｌをコードするｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥパッケージングプラスミド（Ｕｎｉｂｉｏ、ＶＴ１４４９）と、Ｒｅｖタンパク質をコードするｐＲＳＶ－ｒｅｖパッケージングプラスミド（Ｕｎｉｂｉｏ、ＶＴ１４４５）と、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇ（Ｕｎｉｂｉｏ、ＶＴ１４４３）とを有する。
本例において、本発明のレンチウイルスプラスミドベクターの構築に使用したベクターシステムは、第３世代自己不活性化レンチウイルスベクターシステムであった。このシステムは、３つのプラスミド、タンパク質Ｇａｇ／ＰｏｌをコードするｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥパッケージングプラスミド（Ｕｎｉｂｉｏ、ＶＴ１４４９）と、Ｒｅｖタンパク質をコードするｐＲＳＶ－ｒｅｖパッケージングプラスミド（Ｕｎｉｂｉｏ、ＶＴ１４４５）と、ＶＳＶ－Ｇタンパク質をコードするエンベローププラスミドＰＭＤ２．Ｇ（Ｕｎｉｂｉｏ、ＶＴ１４４３）とを有する。
本例では、Ｐ２Ａ（配列番号２６）によって連結された特異的ＣＡＲ及びＥＧＦＲｔ（配列番号２７）を発現するレンチウイルス発現ベクターを構築し、第６．１節で得られた標的遺伝子をｐＲＲＬＳＩＮ－ＥＧＦＲｔベクターに連結して、ｐＲＲＬＳＩＮ－クローディン１８．２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔという名称の組換えプラスミドを形成した（図１１を参照されたい）。具体的な配列は、ｐＲＲＬＳＩＮ－ＣＤ８α－ｓｃＦｖ ＶＨ－リンカー－ｓｃＦｖ ＶＬ－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔであった。酵素消化及びシーケンシングによる確認後、構築に成功したベクターは、パッケージングの準備が整っていた。ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔは、単一のｍＲＮＡに転写されたが、最終的にＥＧＦＲｔ及び抗クローディン１８．２キメラ抗原受容体の２つのペプチド鎖に翻訳された。抗クローディン１８．２ ＣＡＲは、細胞膜上に位置し、ＣＤ８αシグナルペプチドの指図下にあった。
本例で得られた標的ＣＡＲを含む４つの配列は、以下のとおりである。
ｓｃＦｖ ＣＡ８０８．１－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０１と称する）
ｓｃＦｖ ＣＡ８４１－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０２と称する）
ｓｃＦｖ Ｃ２７９－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０３と称する）
ｓｃＦｖ Ｃ１１５－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０４と称する）
ｓｃＦｖ ＣＡ８０８．１－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０１と称する）
ｓｃＦｖ ＣＡ８４１－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０２と称する）
ｓｃＦｖ Ｃ２７９－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０３と称する）
ｓｃＦｖ Ｃ１１５－ＣＤ８ヒンジ－ＣＤ８ＴＭ－４－１ＢＢ－ＣＤ３ζ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ（以下、ＣＮ０４と称する）
６．３ キメラ抗原受容体レンチウイルスの調製
ｐＲＲＬＳＩＮ－クローディン１８．２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ発現プラスミド並びにｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドを抽出し、トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と特定の比で混合して、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。主な手順は、以下のとおりである。
ｐＲＲＬＳＩＮ－クローディン１８．２ＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ発現プラスミド並びにｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドを抽出し、トランスフェクション試薬ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と特定の比で混合して、２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトした。主な手順は、以下のとおりである。
（１）５～８代まで継代した２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ－３２１６）を７５ｃｍ３細胞培養フラスコ内の１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯから購入）含有ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯから購入）に７×１０６の細胞密度で播種した。混合後、細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２でトランスフェクト前の２４時間培養した。翌日、約７０～８０％の細胞凝集が認められ、細胞をトランスフェクトした。
（２）２４時間後、標的発現プラスミド並びにｐＭＤＬｇ－ｐＲＲＥ、ｐＲＳＶ－ｒｅｖ及びｐＭＤ２．Ｇヘルパープラスミドを４：３：２：２の重量比で混合し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯから購入）で希釈して溶液Ａを得た。ＰＥＩ希釈剤を全プラスミド：ＰＥＩ＝３：１の比で調製し、Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ培地で希釈して溶液Ｂを入手した。溶液Ａ及びＢを十分に混合し、室温で１５分間インキュベートした。
（３）２９３Ｔ細胞をプレートに固定化し、プラスミド－ＰＥＩ混合物とゆっくり加え合わせた。得られた混合物を穏やかに振盪し、ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で４～６時間培養した。インキュベーション後、１０％ＦＢＳを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地に培地を交換した。
（４）４８時間及び９６時間のトランスフェクション後、ウイルスを含有する培養上清を回収し、３０００ｒｐｍにおいて４℃で５分間遠心した。０．４５μｍフィルタで上清をろ過し、ＰＥＧ８０００／ＮａＣｌと４：１の容積比で混合し、４℃で２～３時間インキュベートし、高速で３０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿物を予め冷却しておいたＴ細胞培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、０４－４１８Ｑ）又はＰＢＳで再懸濁してウイルス濃縮物を得て、これを後の使用のために－８０℃で保存した。
６．４ レンチウイルス力価アッセイ
本例では、細胞を感染させることにより、レンチウイルスの生物学的活性力価を決定した。レンチウイルス活性アッセイには、２９３Ｔ細胞を使用し、２４ウェル培養プレートの各ウェルに１×１０５細胞を接種した。各ウェルに、１０％ＦＢＳを含有する１ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ培地を加えた。この混合物をトランスフェクション添加剤ポリブレンで６μｇ／ｍＬの最終濃度となるように希釈した。レンチウイルス濃縮物を５番目の濃度まで３倍段階希釈し、１μＬ／ウェルにおいてデュプリケートで加え、十分に混合した。細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を消化し、ＣＡＲ又はＥＧＦＲｔのタンパク質発現の陽性率を抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０６５－００６）又は抗ヒトＥＧＦＲｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５２９０４）フロー色素を使用してフローサイトメーターによって検出した。力価は、以下の式：レンチウイルス活性力価（ＴＵ／ｍＬ）＝陽性率×希釈係数×１００×１０５によって計算した。ＰＥＩトランスフェクションによってパッケージングした上記ＣＡＲ（ＣＮ０１、ＣＮ０２、ＣＮ０３及びＣＮ０４）のレンチウイルス濃縮物の活性力価は、１×１０８ＴＵ／ｍＬよりも高かった（図１２）。
本例では、細胞を感染させることにより、レンチウイルスの生物学的活性力価を決定した。レンチウイルス活性アッセイには、２９３Ｔ細胞を使用し、２４ウェル培養プレートの各ウェルに１×１０５細胞を接種した。各ウェルに、１０％ＦＢＳを含有する１ｍＬの新鮮なＤＭＥＭ培地を加えた。この混合物をトランスフェクション添加剤ポリブレンで６μｇ／ｍＬの最終濃度となるように希釈した。レンチウイルス濃縮物を５番目の濃度まで３倍段階希釈し、１μＬ／ウェルにおいてデュプリケートで加え、十分に混合した。細胞をＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。２４時間後、細胞を消化し、ＣＡＲ又はＥＧＦＲｔのタンパク質発現の陽性率を抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１０９－０６５－００６）又は抗ヒトＥＧＦＲｔ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３５２９０４）フロー色素を使用してフローサイトメーターによって検出した。力価は、以下の式：レンチウイルス活性力価（ＴＵ／ｍＬ）＝陽性率×希釈係数×１００×１０５によって計算した。ＰＥＩトランスフェクションによってパッケージングした上記ＣＡＲ（ＣＮ０１、ＣＮ０２、ＣＮ０３及びＣＮ０４）のレンチウイルス濃縮物の活性力価は、１×１０８ＴＵ／ｍＬよりも高かった（図１２）。
６．５ Ｔリンパ球の調製
ＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＣＤ３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓヒト凍結乾燥キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した）によってマイクロビーズで標識した。高純度のＣＤ３＋ Ｔリンパ球を選択し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の比率は、９５％を超えていた。精製したＴ細胞を、ヒトＣＤ３ＣＤ２８ Ｔ細胞アクチベーター（ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１１３２Ｄ）を使用して活性化し、増殖させた。
ＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＣＤ３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓヒト凍結乾燥キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した）によってマイクロビーズで標識した。高純度のＣＤ３＋ Ｔリンパ球を選択し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の比率は、９５％を超えていた。精製したＴ細胞を、ヒトＣＤ３ＣＤ２８ Ｔ細胞アクチベーター（ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１１３２Ｄ）を使用して活性化し、増殖させた。
６．６ レンチウイルス形質導入Ｔリンパ球
第６．３節で調製したレンチウイルスによってＴ細胞を形質導入することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞を入手した。２４～４８時間刺激して活性化させた後、顕微鏡法を用いて第６．５節からのＴリンパ球をその活性化に関して観察した。活性化したＴリンパ球は、容積が増し、細長い形状又は不規則な形状をしている。活性化Ｔリンパ球を回収し、遠心し、Ｔ細胞培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、０４－４１８Ｑ）に１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の最終濃度並びに１ｍＬの最終容積で再懸濁し、１２ウェル培養プレートに加えた。レンチウイルスを同じ培地でＭＯＩ＝３～５に希釈し、感染のために１×１０６個の活性化Ｔリンパ球と混合した。この混合物を２４ウェルプレート上でインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を再び遠心し、培地を新しくした。その後、２日毎に細胞密度を測定し、細胞密度をＮＭＴ ２×１０６細胞／ｍＬに制御しながら細胞を更に拡大させた。Ｔ細胞をレンチウイルスと４８～７２時間コインキュベートした後、種々のキメラ抗原受容体の発現をフローサイトメトリーにより決定した。非形質導入Ｔリンパ球を陰性対照として、種々のキメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球の陽性率を表１６に示す（図１３）。
第６．３節で調製したレンチウイルスによってＴ細胞を形質導入することにより、ＣＡＲ－Ｔ細胞を入手した。２４～４８時間刺激して活性化させた後、顕微鏡法を用いて第６．５節からのＴリンパ球をその活性化に関して観察した。活性化したＴリンパ球は、容積が増し、細長い形状又は不規則な形状をしている。活性化Ｔリンパ球を回収し、遠心し、Ｔ細胞培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、０４－４１８Ｑ）に１０ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－７及び５ｎｇ／ｍＬ ＩＬ－１５の最終濃度並びに１ｍＬの最終容積で再懸濁し、１２ウェル培養プレートに加えた。レンチウイルスを同じ培地でＭＯＩ＝３～５に希釈し、感染のために１×１０６個の活性化Ｔリンパ球と混合した。この混合物を２４ウェルプレート上でインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。翌日、細胞を再び遠心し、培地を新しくした。その後、２日毎に細胞密度を測定し、細胞密度をＮＭＴ ２×１０６細胞／ｍＬに制御しながら細胞を更に拡大させた。Ｔ細胞をレンチウイルスと４８～７２時間コインキュベートした後、種々のキメラ抗原受容体の発現をフローサイトメトリーにより決定した。非形質導入Ｔリンパ球を陰性対照として、種々のキメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球の陽性率を表１６に示す（図１３）。
種々のキメラ抗原受容体をパッケージングするレンチウイルスに感染させた後、Ｔリンパ球を約９日間培養すると、約３００倍の拡大に達し、これは、種々のキメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球をある程度までインビトロで拡大できたことを示しており、続くインビトロ機能研究及び動物における薬力学研究への保証が得られた。
６．７ インビトロ毒性アッセイ
６．７．１ 標的特異性アッセイ
クローディン１８には、配列上、８つのアミノ酸のみが変化している２つのスプライシング変異体、即ちクローディン１８．１及びクローディン１８．２がある。クローディン１８．１は、正常肺細胞に選択的に発現する一方、クローディン１８．２は、正常細胞で極めて限局的であり、しかし、複数の腫瘍（例えば、胃癌、肺癌、膵癌）において高頻度に異所的に活性化し、過剰発現する。本例では、クローディン１８．１タンパク質及びクローディン１８．２タンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞（ＫＹｉｎｎｏから購入した、ＫＣ－０９９０／ＫＣ－０９８６）を標的細胞とし、且つ種々のｓｃＦｖの調製したクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔをエフェクター細胞として、２９３Ｔ細胞、クローディン１８．２タンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞及びクローディン１８．１タンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞を種々のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比で使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞とのコインキュベーション系を構築した。腫瘍細胞の溶解率を測定することにより、これらの２つのタンパク質に対するＣＡＲ－Ｔの特異的応答を評価した。インビトロアッセイの結果から（図１４）、種々のｓｃＦｖの調製したクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０１、ＣＮ０２、ＣＮ０３、ＣＮ０４）を２９３Ｔ－ｈクローディン１８．２細胞と１：１及び３：１のＥ：Ｔ比でインキュベートしたとき、一定の腫瘍細胞数で、腫瘍細胞の殺傷効率は、２４時間の時点で２０％～５０％の範囲であった（表１７）ことが実証された。２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞と１：１及び３：１のＥ：Ｔ比でコインキュベートしたとき、種々のｓｃＦｖの調製したクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞に対して特異的溶解能力の点で有意に異なり、とりわけ、ＣＮ０２ ＣＡＲ－Ｔは、２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞に対して有意な特異的溶解能力を有しなかった一方、ＣＮ０１、ＣＮ０３及びＣＮ０４ ＣＡＲ－Ｔは、２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞に対して種々の程度の特異的溶解能力を有した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的応答は、培養上清中に分泌されたサイトカイン（ＩＮＦ－γ）の含有量を測定することによっても評価した。種々のｓｃＦｖのクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０１、ＣＮ０２、ＣＮ０３、ＣＮ０４）と２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞との上清中におけるＩＦＮ－γサイトカイン放出の差は、殺傷アッセイの結果と一致した（図１５及び表１８）。ＣＮ０２群における２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞コインキュベーション上清中のＩＦＮ－γサイトカインは、ＣＮ０１、ＣＮ０３及びＣＮ０４群と比べて有意に少なかった。
６．７．１ 標的特異性アッセイ
クローディン１８には、配列上、８つのアミノ酸のみが変化している２つのスプライシング変異体、即ちクローディン１８．１及びクローディン１８．２がある。クローディン１８．１は、正常肺細胞に選択的に発現する一方、クローディン１８．２は、正常細胞で極めて限局的であり、しかし、複数の腫瘍（例えば、胃癌、肺癌、膵癌）において高頻度に異所的に活性化し、過剰発現する。本例では、クローディン１８．１タンパク質及びクローディン１８．２タンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞（ＫＹｉｎｎｏから購入した、ＫＣ－０９９０／ＫＣ－０９８６）を標的細胞とし、且つ種々のｓｃＦｖの調製したクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔをエフェクター細胞として、２９３Ｔ細胞、クローディン１８．２タンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞及びクローディン１８．１タンパク質を過剰発現する２９３Ｔ細胞を種々のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比で使用して、ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的細胞とのコインキュベーション系を構築した。腫瘍細胞の溶解率を測定することにより、これらの２つのタンパク質に対するＣＡＲ－Ｔの特異的応答を評価した。インビトロアッセイの結果から（図１４）、種々のｓｃＦｖの調製したクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０１、ＣＮ０２、ＣＮ０３、ＣＮ０４）を２９３Ｔ－ｈクローディン１８．２細胞と１：１及び３：１のＥ：Ｔ比でインキュベートしたとき、一定の腫瘍細胞数で、腫瘍細胞の殺傷効率は、２４時間の時点で２０％～５０％の範囲であった（表１７）ことが実証された。２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞と１：１及び３：１のＥ：Ｔ比でコインキュベートしたとき、種々のｓｃＦｖの調製したクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞は、２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞に対して特異的溶解能力の点で有意に異なり、とりわけ、ＣＮ０２ ＣＡＲ－Ｔは、２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞に対して有意な特異的溶解能力を有しなかった一方、ＣＮ０１、ＣＮ０３及びＣＮ０４ ＣＡＲ－Ｔは、２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞に対して種々の程度の特異的溶解能力を有した。ＣＡＲ－Ｔ細胞の特異的応答は、培養上清中に分泌されたサイトカイン（ＩＮＦ－γ）の含有量を測定することによっても評価した。種々のｓｃＦｖのクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０１、ＣＮ０２、ＣＮ０３、ＣＮ０４）と２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞との上清中におけるＩＦＮ－γサイトカイン放出の差は、殺傷アッセイの結果と一致した（図１５及び表１８）。ＣＮ０２群における２９３Ｔ－ｈクローディン１８．１細胞コインキュベーション上清中のＩＦＮ－γサイトカインは、ＣＮ０１、ＣＮ０３及びＣＮ０４群と比べて有意に少なかった。
特異的溶解アッセイ：アッセイには、ＬＤＨ放出アッセイキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ、ＣＫ１２）を使用した。これは、ジアホラーゼによって触媒されるＩＮＴ発色反応であり、細胞傷害時に放出されるＬＤＨの活性を比色定量法によって測定するものである。細胞アポトーシス又は壊死によって引き起こされる細胞膜構造の損傷は、酵素活性が比較的安定している乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）を含め、細胞質中の酵素が培養液中に放出されることにつながり得る。細胞傷害性は、溶解細胞から培養液中に放出されるＬＤＨの活性アッセイにより定量的に分析することができる。ＬＤＨ放出は、細胞膜完全性の重要な指標であると考えられ、細胞傷害性アッセイに広く用いられている。
サイトカインアッセイ：サイトカインの測定には、ヒトＩＦＮ－γ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＳＩＦ５０）を使用した。これは、抗原又は抗体の固定化及び抗原又は抗体の酵素標識化に基づくものである。固体担体の表面に結合する抗原又は抗体は、免疫学的活性を保持している一方、酵素標識された抗原又は抗体は、免疫学的活性及び酵素活性の両方を保持している。アッセイでは、固定化された抗体又は抗原に試料中の試験物質（抗原又は抗体）を結合させる。洗浄することによって未結合物質を除去し、酵素標識された抗原又は抗体を加える。この場合、固定化された酵素の量が試料中の試験物質の量に関連する。酵素と反応する基質を加えて発色させた後、定性的又は定量的分析のための色により、試料中の試験物質の含有量を判定することができる。
６．７．２ 標的毒性アッセイ
本例では、生成物の作用機序（ＭＯＡ）を模擬することにより、インビトロ薬力学試験を構築した。本発明者は、ｐｌｖｘベクターでクローディン１８．２タンパク質を過剰発現するプラスミドを構築し、レンチウイルスを調製した。胃癌細胞ＮＵＧＣ４及びＡＧＳをレンチウイルスに感染させて、続くＣＡＲ－Ｔ細胞の機能検証のための標的細胞としての陽性細胞のスクリーニングを通して、クローディン１８．２タンパク質が高発現であるＮＵＧＣ４細胞及びＡＧＳ細胞を入手した。上記で調製した種々のｓｃＦｖのクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的腫瘍細胞とのコインキュベーション系を種々のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比で構築した。非形質導入Ｔ細胞と腫瘍細胞とのコインキュベーション系を対照として、腫瘍細胞の溶解率を測定することによりＣＡＲ－Ｔ細胞の生物学的有効性を評価した。
本例では、生成物の作用機序（ＭＯＡ）を模擬することにより、インビトロ薬力学試験を構築した。本発明者は、ｐｌｖｘベクターでクローディン１８．２タンパク質を過剰発現するプラスミドを構築し、レンチウイルスを調製した。胃癌細胞ＮＵＧＣ４及びＡＧＳをレンチウイルスに感染させて、続くＣＡＲ－Ｔ細胞の機能検証のための標的細胞としての陽性細胞のスクリーニングを通して、クローディン１８．２タンパク質が高発現であるＮＵＧＣ４細胞及びＡＧＳ細胞を入手した。上記で調製した種々のｓｃＦｖのクローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞をエフェクター細胞として使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的腫瘍細胞とのコインキュベーション系を種々のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比で構築した。非形質導入Ｔ細胞と腫瘍細胞とのコインキュベーション系を対照として、腫瘍細胞の溶解率を測定することによりＣＡＲ－Ｔ細胞の生物学的有効性を評価した。
インビトロアッセイの結果から（図１６及び表１９）、ＣＡＲ－Ｔ細胞をクローディン１８．２陽性腫瘍細胞（ＡＧＳ－クローディン１８．２及びＮＵＧＣ－４）とコインキュベートしたとき、２４時間の時点で腫瘍細胞の殺傷効率が優れており、Ｔ細胞と比べて有意に高かった一方、クローディン１８．２陰性細胞株ＡＧＳに対する殺傷効果は、弱かったことが実証された。また、ＣＡＲ－Ｔ細胞の生物学的有効性は、培養上清中に分泌されたサイトカイン（ＩＮＦ－γ）の含有量を測定することによっても評価した。クローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ細胞をクローディン１８．２陽性腫瘍細胞（ＡＧＳ－クローディン１８．２及びＮＵＧＣ－４）とコインキュベートした後、ＩＦＮ－γサイトカインの発現は、Ｔ細胞群と比べて有意に高かった（図１７、表２０）。
このインビトロ細胞傷害性アッセイから、種々のキメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球は、全てクローディン１８．２陽性腫瘍細胞に良好な殺傷能力を及ぼすことが明らかになり、これは、動物における薬力学的研究の基礎をもたらすものである。
６．８ 動物における研究
本例では、胃癌腫瘍を担持する免疫不全マウスの薬力学的モデルを構築した。インビトロ研究に基づき、雌ＮＯＧマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した）の各々の背部に１×１０７個のＮＵＧＣ４－クローディン１８．２細胞を移植した。移植後１１日目（腫瘍容積は約８０～１００ｍｍ３であった）、マウスに投与した。媒体対照群に０．９％標準生理食塩水を投与し、モック－Ｔ（プラスミドをトランスフェクトしていないＴ細胞）群に１×１０７細胞を投与し、ＣＮ０２低用量群及び高用量群（陽性細胞）にそれぞれ５．００×１０６及び１．００×１０７細胞を投与した。用量容積は、１００μＬであった。各群に６匹の動物を割り付けた。投与後、腫瘍を週２回測定した。腫瘍成長曲線をプロットし、ＴＧＩ及びＴ／Ｃを計算し、研究終了時に全ての腫瘍を撮影した。ＣＡＲ－Ｔ投与前（－２日目）、投与後２、９及び２８日目に血液を採取し、マウスの末梢血中のＣＡＲのベクターコピー数（ＶＣＮ）をｑＰＣＲによって測定することにより、ＣＡＲＴ細胞の拡大を確認した。結果から、ＣＡＲ－Ｔ投与後３６日以内に両方の治療群の有効性が有意になったことが明らかになった。クローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０２）低用量群の６匹のマウスで腫瘍が完全に退縮し（６／６匹）、高用量群の５匹のマウスで腫瘍が完全に退縮した（５／６匹）（図１８）。
本例では、胃癌腫瘍を担持する免疫不全マウスの薬力学的モデルを構築した。インビトロ研究に基づき、雌ＮＯＧマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから購入した）の各々の背部に１×１０７個のＮＵＧＣ４－クローディン１８．２細胞を移植した。移植後１１日目（腫瘍容積は約８０～１００ｍｍ３であった）、マウスに投与した。媒体対照群に０．９％標準生理食塩水を投与し、モック－Ｔ（プラスミドをトランスフェクトしていないＴ細胞）群に１×１０７細胞を投与し、ＣＮ０２低用量群及び高用量群（陽性細胞）にそれぞれ５．００×１０６及び１．００×１０７細胞を投与した。用量容積は、１００μＬであった。各群に６匹の動物を割り付けた。投与後、腫瘍を週２回測定した。腫瘍成長曲線をプロットし、ＴＧＩ及びＴ／Ｃを計算し、研究終了時に全ての腫瘍を撮影した。ＣＡＲ－Ｔ投与前（－２日目）、投与後２、９及び２８日目に血液を採取し、マウスの末梢血中のＣＡＲのベクターコピー数（ＶＣＮ）をｑＰＣＲによって測定することにより、ＣＡＲＴ細胞の拡大を確認した。結果から、ＣＡＲ－Ｔ投与後３６日以内に両方の治療群の有効性が有意になったことが明らかになった。クローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０２）低用量群の６匹のマウスで腫瘍が完全に退縮し（６／６匹）、高用量群の５匹のマウスで腫瘍が完全に退縮した（５／６匹）（図１８）。
（１）体重：媒体対照群及びモック群と比較して、クローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０２）低用量群及び高用量群の体重に有意な差はなかった（図１９）。
（２）腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ）：投与１４日後、クローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０２）低用量群及び高用量群のＴＧＩは、それぞれ１００％及び８８．３３％であった（図２０）。
（３）死亡率：投与後３１日までに媒体対照群で１匹の動物の死亡が認められ、クローディン１８．２ ＣＡＲ－Ｔ（ＣＮ０２）低用量群及び高用量群では死亡は観察されなかった（図２１）。
実施例７．非ウイルス法によるＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
７．１ 非ウイルスＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンベクターの構築
本例では、ｐＢｌｕｅｓｃｉｒｐｔベクター（Ｇｅｎｅｒａｌ ＢＩＯＬによって合成された）を骨格として、遺伝子インスレーター配列ｃＨＳ４を見つけ出してポリクローナル部位の両端に置き、ＰＢトランスポゾンの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列を見つけ出してベクターのｃＨＳ４配列の内側に構築し、ＩＴＲ内側の５’末端にＥＦ１ａプロモーターを挿入し、３’末端にポリＡシグナルを挿入した。ポリクローナル配列が中央に保持され、その中にＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ配列を挿入して、図２４に示されるとおりのＰＢ ＣＮ０２ ＣＡＲプラスミド構造を形成した。
７．１ 非ウイルスＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）トランスポゾンベクターの構築
本例では、ｐＢｌｕｅｓｃｉｒｐｔベクター（Ｇｅｎｅｒａｌ ＢＩＯＬによって合成された）を骨格として、遺伝子インスレーター配列ｃＨＳ４を見つけ出してポリクローナル部位の両端に置き、ＰＢトランスポゾンの５’ＩＴＲ及び３’ＩＴＲ配列を見つけ出してベクターのｃＨＳ４配列の内側に構築し、ＩＴＲ内側の５’末端にＥＦ１ａプロモーターを挿入し、３’末端にポリＡシグナルを挿入した。ポリクローナル配列が中央に保持され、その中にＣＡＲ－Ｐ２Ａ－ＥＧＦＲｔ配列を挿入して、図２４に示されるとおりのＰＢ ＣＮ０２ ＣＡＲプラスミド構造を形成した。
７．２ 非ウイルスＰＢトランスポゾンベクターによるＣＡＲ－Ｔ細胞の調製
７．２．１ ＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＣＤ３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓヒト凍結乾燥キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した）によってマイクロビーズで標識した。高純度のＣＤ３＋ Ｔリンパ球を選択し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の比率は９５％を超えていた。精製したＴ細胞を、ヒトＣＤ３ＣＤ２８ Ｔ細胞アクチベーター（ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１１３２Ｄ）を使用して活性化し、増殖させた。
７．２．１ ＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した末梢血単核球（ＰＢＭＣ）をＣＤ３ ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓヒト凍結乾燥キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した）によってマイクロビーズで標識した。高純度のＣＤ３＋ Ｔリンパ球を選択し、ＣＤ３陽性Ｔ細胞の比率は９５％を超えていた。精製したＴ細胞を、ヒトＣＤ３ＣＤ２８ Ｔ細胞アクチベーター（ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、１１１３２Ｄ）を使用して活性化し、増殖させた。
７．２．２ 刺激後３日目に電気穿孔を実施した。電気穿孔のための細胞を、ピペットを使用して再懸濁し、カウントした。各電気穿孔に５×１０６細胞を使用した。５×１０６細胞をＤＰＢＳ（ＧＩＢＣＯ、１４１９０－１４４）で４ｍＬに希釈し、３００ｇにおいて室温で１０分間遠心した。上清を廃棄し、細胞を５ｍＬのＤＰＢＳで再懸濁して洗浄し、３００ｇにおいて室温で１０分間遠心し、次に上清を廃棄した。次に、細胞を１００μＬの電気穿孔緩衝液Ｅｎｔｒａｎｓｔｅｒ－Ｅ（Ｅｎｇｒｅｅｎ、９８６６８－２０）に再懸濁し、この細胞懸濁液を１．５ｍＬ遠心管に移した。
遠心管に表２１の成分を加え、十分に混合した。
Ｌｏｎｚａ製の電気穿孔機器を使用して電気穿孔を実施した。細胞／プラスミド懸濁液をキュベットに速やかに移し、そのキュベットを軽く叩くことにより、キュベット内で細胞懸濁液の液面の平衡を完全に成り立たせた。電気穿孔には、プログラムＥＯ１１５を使用した。電気穿孔後、キュベットを慎重に取り出した。次に、５００μＬの予熱したＴ細胞培地Ｘ－ＶＩＶＯ １５（Ｌｏｎｚａ、０４－４１８Ｑ）を加え、インキュベーターにおいて３７℃で５分間平衡化させて、微孔性ローディングチップを使用して２～３回ブローすることにより細胞を再懸濁した。２ｍＬの予熱した培地が入った１２ウェルプレートに細胞を移し、３７℃でインキュベートした。生存率の向上のため、電気穿孔の４～６時間後に培地を新しくした。上清を廃棄し、予熱した新鮮培地を加えた。細胞をインキュベーターにおいて３７℃／５％ＣＯ２で試験前の４８時間インキュベートした。
一方で、レンチウイルスを使用したＣＡＲ－Ｔ対照群をセットした。調製方法は、第６．６節を参照することができる。
電気穿孔の４８～７２時間後、非形質導入Ｔリンパ球を陰性対照として、フローサイトメトリーにより抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）２抗体を使用してキメラ抗原受容体の発現を決定した。種々のキメラ抗原受容体を発現するＴリンパ球の陽性率を表２２に示す（図２２）。
７．３ 標的毒性アッセイ
本例では、生成物の作用機序（ＭＯＡ）を模擬することにより、インビトロ薬力学試験を行った。クローディン１８．２が高発現である樹立胃癌細胞ＮＵＧＣ４及びＡＧＳを標的細胞として使用し、上記の非ウイルスを使用して調製したＣＮ０２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰＢ）及びレンチウイルスを使用して調製したＣＮ０２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｌｅｎｔｉ）をエフェクター細胞として使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的腫瘍細胞とのコインキュベーション系を種々のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比で構築した。非形質導入Ｔ細胞と腫瘍細胞とのコインキュベーション系を対照として、腫瘍細胞の溶解率を測定することによりＣＡＲ－Ｔ細胞の生物学的有効性を評価した。
本例では、生成物の作用機序（ＭＯＡ）を模擬することにより、インビトロ薬力学試験を行った。クローディン１８．２が高発現である樹立胃癌細胞ＮＵＧＣ４及びＡＧＳを標的細胞として使用し、上記の非ウイルスを使用して調製したＣＮ０２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ＰＢ）及びレンチウイルスを使用して調製したＣＮ０２ ＣＡＲ－Ｔ細胞（ｌｅｎｔｉ）をエフェクター細胞として使用した。ＣＡＲ－Ｔ細胞と標的腫瘍細胞とのコインキュベーション系を種々のＥ：Ｔ（エフェクター細胞：標的細胞）比で構築した。非形質導入Ｔ細胞と腫瘍細胞とのコインキュベーション系を対照として、腫瘍細胞の溶解率を測定することによりＣＡＲ－Ｔ細胞の生物学的有効性を評価した。
インビトロアッセイの結果から（図２３及び表２３）、一定の腫瘍細胞数について、腫瘍細胞の溶解率がエフェクター細胞数と線形的に相関すること；及びＣＡＲ－Ｔ細胞をクローディン１８．２陽性腫瘍細胞（ＡＧＳ－クローディン１８．２及びＮＵＧＣ－４）とコインキュベートしたとき、２４時間の時点で腫瘍細胞の殺傷効率が優れており、Ｔ細胞と比べて有意に高かった一方、クローディン１８．２陰性細胞株ＡＧＳに対する殺傷効果は、弱かったことが実証された。
Claims (16)
- ３つの軽鎖相補性決定領域及び３つの重鎖相補性決定領域を含む、クローディン１８．２に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
前記抗体若しくは前記その抗原結合断片の前記３つの軽鎖相補性決定領域は、配列番号５に示されるＬＣＤＲ１と、配列番号６に示されるＬＣＤＲ２と、配列番号７に示されるＬＣＤＲ３とを含み、及び前記抗体若しくは前記その抗原結合断片の前記３つの重鎖相補性決定領域は、配列番号８に示されるＨＣＤＲ１と、配列番号９に示されるＨＣＤＲ２と、配列番号１０に示されるＨＣＤＲ３とを含むか、又は
前記抗体若しくは前記その抗原結合断片の前記３つの軽鎖相補性決定領域は、配列番号１１に示されるＬＣＤＲ１と、配列番号１２に示されるＬＣＤＲ２と、配列番号１３に示されるＬＣＤＲ３とを含み、及び前記抗体若しくは前記その抗原結合断片の前記３つの重鎖相補性決定領域は、配列番号１４に示されるＨＣＤＲ１と、配列番号１５に示されるＨＣＤＲ２と、配列番号１６に示されるＨＣＤＲ３とを含む、抗体又はその抗原結合断片。 - クローディン１８．２に結合する抗体又はその抗原結合断片であって、
配列番号１に示される軽鎖可変領域及び配列番号２に示される重鎖可変領域を含むか、又は
配列番号３に示される軽鎖可変領域及び配列番号４に示される重鎖可変領域を含む、抗体又はその抗原結合断片。 - 配列番号１７に示される重鎖定常領域又は配列番号１８に示される重鎖定常領域を含む、請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片。
- 請求項１又は２に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
- 前記抗体又は前記その抗原結合断片、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域及び細胞内シグナル伝達領域を順次含む、請求項４に記載のキメラ抗原受容体。
- 前記細胞外ヒンジ領域は、ＣＤ８ヒンジ領域であり、前記膜貫通領域は、ＣＤ８膜貫通領域であり、及び前記細胞内シグナル伝達領域は、４－１ＢＢ及びＣＤ３ζである、請求項５に記載のキメラ抗原受容体。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項４～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片又は請求項４～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現する、細胞。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項７に記載の核酸又は請求項８に記載の細胞を含む医薬組成物。
- 請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項７に記載の核酸又は請求項８に記載の細胞を含むキット。
- 癌を治療、予防、検出又は診断するための薬剤であって、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項７に記載の核酸、又は請求項８に記載の細胞を含む、薬剤。
- 前記癌は、クローディン１８．２陽性癌である、請求項１１に記載の薬剤。
- 前記癌は、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、結腸癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病及びリンパ腫のうちの一又は複数を含む、請求項１２に記載の薬剤。
- 癌を治療、予防、検出又は診断するための薬剤の製造における、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体若しくはその抗原結合断片、又は請求項４～６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、又は請求項７に記載の核酸、又は請求項８に記載の細胞の使用。
- 前記癌は、クローディン１８．２陽性癌である、請求項１４に記載の使用。
- 前記癌は、胃癌、膵癌、食道癌、肺癌、卵巣癌、頭頸部癌、膀胱癌、子宮頸癌、肉腫、細胞腫、結腸癌、腎癌、結腸直腸癌、肝癌、黒色腫、乳癌、骨髄腫、神経膠腫、白血病及びリンパ腫のうちの一又は複数を含む、請求項１５に記載の使用。
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