CN115427455A - 抗IL13Rα2抗体、其抗原结合片段和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够结合IL13Rα2的抗体及其抗原结合片段。所述抗体及其抗原结合片段特别可用于构建嵌合抗原受体(CAR)和基于CAR的免疫疗法以治疗表达IL13Rα2的癌症疾病。

Description

抗IL13Rα2抗体、其抗原结合片段和用途
技术领域
本实施方案总体上涉及抗IL13Rα2抗体及其抗原结合片段以及其用途，特别是在癌症治疗中的用途。
背景技术
免疫疗法彻底改变了癌症治疗。然而，胶质母细胞瘤(一种侵袭性脑癌形式)患者尚未从免疫疗法的突破中获益，并且所述疾病仍然是致命的。经离体工程改造以表达针对在癌细胞表面上表达的抗原的嵌合抗原受体(CAR)的患者源性T细胞的过继转移是目前正深入研究的免疫疗法形式。人工跨膜CAR分子由下列组成：细胞外抗原结合部分(通常是来自抗体的单链可变片段(scFv))、铰链区、跨膜结构域和来自T细胞受体复合物(CD3ζ)和来自一种或多种T细胞共刺激分子(例如CD28、4-1BB)的细胞外信号传导结构域。因此，CAR T细胞疗法组合了抗体的特异性和T淋巴细胞的杀伤力。靶向CD19的CAR T细胞在治疗难治性B细胞恶性肿瘤方面高度有效，并且在美国和欧洲被批准用于急性淋巴细胞白血病和非霍奇金氏淋巴瘤。靶向实体瘤的CAR T细胞产品尚未获得批准。类似地，使用CAR分子工程改造NK细胞和巨噬细胞(命名为CAR NK和CAR巨噬细胞)的概念也已被探索。
白介素13受体亚基α2(IL13Rα2)也称为分化簇213A2(CD213A2)，是一种结合白介素13(IL-13)的细胞膜蛋白。IL13Rα2与IL13Rα1(CD213A1)密切相关，IL13Rα1与白介素4受体α(IL4Rα)形成受体复合物，白介素4受体α是IL-13和IL-4受体共有的亚基。当IL-13与IL13Rα1/IL4Rα受体复合物结合时，导致JAK1、STAT3和STAT6的激活的信号传导过程被启动。与此形成鲜明对比的是，IL13Rα2作为单体以高亲和力结合IL-13，并且缺乏显著的细胞质结构域，并且因此似乎不充当信号转导子。IL13Rα2在健康的人细胞和组织中很少表达，在睾丸和垂体中的一些表达除外。然而，已经发现IL13Rα2在包括胶质母细胞瘤在内的多种癌症中选择性地过表达，这使IL13Rα2成为癌症疗法的靶点。
针对IL13Rα2的CAR T细胞已经在针对胶质母细胞瘤患者的小型临床试验中进行了评估(Clin Cancer Res 2015,21:4062-4072)。对于一名患者，治疗导致一段时间内的持续消退，直到IL13Rα2阴性肿瘤克隆重新长出(N Engl J Med 2016,375:2561-2569)。
美国专利第9,914,909号公开了表达CAR的T细胞，所述CAR包括细胞外结构域(包括结合IL13Rα2的IL-13及其变体)、跨膜区和细胞内信号传导结构域。据说CAR T细胞可用于治疗胶质母细胞瘤。
美国专利第9,868,788号公开了一种抗体，所述抗体特异性结合跨越人IL13Rα2的细胞外部分并且与犬IL13Rα2具有至少90％的序列同一性的线性表位。据说与化疗剂偶联的抗体可用于治疗胶质母细胞瘤。
美国专利第10,308,719号公开了与IL13Rα2结合的抗体及其片段和包含此类抗体片段的CAR构建体以及其在治疗胶质母细胞瘤中的用途。抗体抑制IL13和IL13Rα2之间的相互作用。IL13Rα2的N-连接糖基化促进抗体与IL13Rα2的相互作用。
Mol Cancer Ther 2008,7(6):1579-1587公开了从人scFv抗体噬菌体文库中获得的、针对IL-13Rα2的单链Fv(scFv)与假单胞菌属(Pseudomonas)外毒素(PE)获得抗IL-13Rα2(scFv)-PE38免疫毒素的融合。然而，与先前开发的呈IL-13和PE之间的融合形式(IL-13-PE38)的免疫毒素相比，所得的免疫毒素不介导更高的抗肿瘤活性。这是由于免疫毒素的scFv部分对靶抗原的低亲和力所致。
仍需要改进对胶质母细胞瘤和以IL13Rα2的过表达为特征的其他癌症的治疗。
发明内容
总体目标是提供抗IL13Rα2抗体及其抗原结合片段。
特定目标是提供可用于基于CAR的免疫疗法的此类抗IL13Rα2抗体及其抗原结合片段。
此目标和其他目标通过如本文所公开的实施方案来满足。
本发明在独立权利要求中限定。本发明的其他实施方案在从属权利要求中限定。
实施方案的一个方面涉及能够结合IL13Rα2的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对IL13Rα2的β折叠区域内的表位具有特异性，所述β折叠区域包含IL13Rα2中氨基酸编号68至75的第一β链、第一β链之后的环、IL13Rα2中氨基酸编号101至109的第二β链、第二β链之前的环、以及IL13Rα2中氨基酸编号124至128的第三β链。
在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)，其包含氨基酸序列GFTFX1X2X3X4，其中每个Xn(n＝1…4)独立地选自由G、A、S和Y组成的组。抗体或其抗原结合片段还包含VH结构域CDR2，其包含氨基酸序列IB1B2B3B4B5B6T，其中每个Bm(m＝1…6)独立地选自由G、S和Y组成的组。抗体或其抗原结合片段还包含VH结构域CDR3，其包含氨基酸序列AR-ZH-Z1DY，其中Z1选自由F、M、I和L组成的组，并且ZH表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：VVRSTYGY(SEQ ID NO:15)、YGHYAYGSY(SEQ ID NO:16)、YSSSGWYYGF(SEQ ID NO:17)、TPYSAY(SEQ ID NO:18)、RYRSHRPGLS(SEQ ID NO:19)、FHPRYGY(SEQ ID NO:20)、GSYSHYGAHY(SEQ ID NO:21)、YYHYDYGYYY(SEQ ID NO:22)、YSPFY(SEQ ID NO:3)、RNYWEHGGGS(SEQ ID NO:24)、HHYGYYPPGSVYY(SEQ ID NO:25)和VEYTYYGSEGSPV(SEQ ID NO:26)。抗体或其抗原结合片段另外包含可变轻(VL)结构域CDR1，其包含氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO:12)；和VL结构域CDR2，其包含氨基酸序列AAS。抗体或其抗原结合片段还包含VL结构域CDR3，其包含氨基酸序列QQ-ZL-T，其中ZL表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：TYYSPH(SEQ ID NO:28)、DYYLF(SEQ ID NO:29)、SYSTPY(SEQ IDNO:30)、FYSYPL(SEQ ID NO:31)、AFSPS(SEQ ID NO:32)、SYDTLL(SEQ ID NO:33)、ALSSLP(SEQ ID NO:34)、FSTRLS(SEQ ID NO:35)、GYSFPP(SEQ ID NO:4)、STYPF(SEQ ID NO:37)、YGSNPL(SEQ ID NO:38)和RYNGLF(SEQ ID NO:39)。
本发明还涉及CAR，其包含抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述抗原识别结构域包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段；包含抗原识别结构域的T细胞受体(TCR)复合物，所述抗原识别结构域包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段；以及缀合物，其包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段和效应分子。
本发明还涉及IL13Rα2的表位。表位在IL13Rα2的β折叠区域内，所述β折叠区域包含IL13Rα2中氨基酸编号68至75的第一β链、第一β链之后的环、IL13Rα2中氨基酸编号101至109的第二β链、第二β链之前的环、以及IL13Rα2中氨基酸编号124至128的第三β链。
其他方面还涉及编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段、CAR和/或TCR复合物的核酸分子；包含所述核酸分子的载体、包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段、CAR、TCR复合物、核酸和/或载体的细胞；以及包含根据本发明的抗体或其抗原结合片段、CAR、TCR复合物、缀合物、核酸分子、载体和/或细胞、以及药学上可接受的运载体的药物组合物。
本发明还涉及用作药物，特别是用于治疗或延缓表达IL13Rα2的癌症疾病的发作的药物的根据本发明的抗体或其抗原结合片段、CAR、TCR复合物、缀合物、核酸分子、载体、细胞和/或药物组合物。
本发明还涉及鉴定IL13Rα2阳性细胞的方法。方法包括使生物样品与根据本发明的抗体或其抗原结合片段接触并测量与生物样品的至少一种细胞结合的抗体或其抗原结合片段的量，从而将至少一种细胞鉴定为IL13Rα2阳性细胞。
实施方案的抗体及其抗原结合片段与IL13Rα2上的表位特异性结合，并且在转化为单链可变片段(scFv)形式时也保留与IL13Rα2的高度特异性和强结合。基于实施方案的抗体的抗原结合片段生成的CAR构建体在用于CAR T细胞免疫疗法时表现出高细胞毒性能力，并且从而可以用于治疗表达IL13Rα2的癌症。
附图说明
通过参考以下结合附图进行的描述可最好地理解所述实施方案以及其另外的目标和优点，在附图中：
图1示出了酶联免疫吸附测定(ELISA)结果。通过在三种不同浓度下(稀释2倍、20倍和200倍)进行ELISA来筛选1E10B9 scFv(B9scFv)和mAb47 scFv(47scFv)的细菌上清液与人IL13Rα2和非相关蛋白(链霉亲和素)的结合。评估两个集落(克隆_1和克隆_2)的两种scFv中的每一种。链霉亲和素特异性scFv G-strep-1被包括作为参考。通过HRP标记的抗FLAG抗体来检测结合，并在450nm(y轴)处测量吸光度值。报告的值是两个重复份的平均值。此外，已减去空白值(从仅添加培养基而不添加scFv获得的信号)。
图2示出了均相时间分辨荧光(HTRF)结果。通过HTRF筛选1E10B9scFv(X-ME107-B9)和mAb47 scFv(X-ME107-47)的细菌上清液与IL13Rα2的结合。非相关scFv被包括作为阴性对照，预期与非相关蛋白结合。测量结合信号(665nm)和背景/噪声信号(615nm)，并计算每个样品(y轴)的R值，即信号的比例。报告的值是两个重复份的平均值。此外，已减去空白值(从仅添加培养基而不添加scFv获得的信号)。
图3示出了44个纯化的W-ME107 scFv和参考克隆mAb47 scFv的凝胶电泳。
图4示出了ELISA结果。结合信号测量为针对人IL13Rα2-avi(空心条)、人IL13Rα2-Fc(黑条)、小鼠IL13Rα2-Fc(深灰条)、人IL13Rα1-Fc(向上斜条)、非相关蛋白(点填充条)和链霉亲和素(浅灰条)的44个W-ME107 scFv克隆、参考克隆mAb47 scFv和G-strep-1scFv的450nm处吸光度(y轴)。
图5示出了scFv与细胞系结合的结果。将所选择的scFv与人胶质母细胞瘤细胞系U-87MG(内源性地表达高水平的hIL13Rα2)或人非小细胞肺癌细胞A549(作为阴性对照)一起孵育。细胞进一步用抗FLAG-PE抗体染色并在流式细胞术中分析。scFv与细胞的结合显示为平均荧光强度(MFI，y轴)。
图6示出了十二个W-ME107 scFv克隆在存在或不存在IL13的情况下与IL13Rα2结合的表面等离子体共振(SPR)传感图。此外，包括抗链霉亲和素scFv G-strep-1(阴性对照，预期结合链霉亲和素)的传感图。未检测到纯化的克隆47scFv的活性。
图7示出了表位分箱实验的传感图。将10nM hIL13Rα2-avi注射到克隆mAb47mIgG1固定表面上，并且与十倍摩尔过量(100nM)的人IL13、W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-75或W-ME107-117一起预孵育。作为对照样品，还评估了与十倍摩尔过量的BI-8scFv(阴性对照)或克隆47mIgG1(阳性对照)一起预孵育的10nM hIL13Rα2-avi。
图8图解说明了W-ME107-117在IL13αR2上的HDX-MS作图的残差图，迹线描绘了不同的时间点，垂直线表示每个肽的差异总和。图表区域中两条垂直线之间的测量值没有统计学意义(单独的抗原或scFv存在下的抗原之间的差异不超过95％置信水平的重复方差)。
图9示出了ELISA结果。针对肽和hIL13Rα2抗原(x轴)来绘制结合信号、450nM处吸光度(y轴)。仅检测到W-ME107-117 scFv(黑条)和W-ME107-75(灰条)与hIL13Rα2的结合。
图10示出了IL13Rα2(浅灰色，残基31-328)在与IL-13(黑色)(PDB代码3LB6)的复合物中的结构，并突出显示了W-ME107-117的表位。HDX-MS定义的表位序列为深灰色，并且位于受体的结构域1上。左图示出了卡通表示的结构，其中β链表示为箭头，并且螺旋表示为螺旋形。表位序列存在于两个β折叠之一(链4、3、6、7)上，并包含链3、6、7中的残基，以及链3和4之间以及链5和6之间的环状区，两个环都面向结构域2。右图示出了表面表示的结构，其中IL-13已被去除，从而突出显示表位区域不与配体相互作用。IL-13结合位点呈现为黑色圆圈。
图11示出了慢病毒构建体的示意图。利用EF1α启动子来驱动含有所选择的scFv和细胞内T细胞激活结构域的嵌合抗原受体(CAR)的表达。使用T2A自切割肽来分离CAR构建体和用于检测的绿色荧光蛋白(GFP)。
图12示出了CAR T细胞杀伤结果。以0:1-25:1范围内的效应细胞/靶细胞比将表达荧光素酶的U-87MG细胞(表达IL13Rα2)或Mel526细胞(不表达IL13Rα2)与不同的CAR T细胞构建体共培养24小时。通过测量荧光素酶活性来评估靶细胞的活力。相对于未处理的对照(仅肿瘤细胞)来确定共培养物中靶细胞的相对活力(y轴)。以两个生物学和实验重复份执行测定。值显示为平均值±SEM。
图13示出了不同CAR T细胞构建体在靶标识别后的增殖。CAR T细胞用紫色染料染色并与U-87MG细胞共培养4天。与洛伐他汀(lovastatin)的共培养物用作非复制对照。CART细胞在靶标识别后复制，并根据细胞分裂次数(0次、1次、2次、3次和4次或更多次)进行分类。图示出了分裂中的CD3+GFP+细胞的百分比。通过确定每个分裂峰内的总CD3+GFP+群的百分比来评估百分比。示出了代表性数据。
图14A至14E突出显示了HDX-MS发现的W-ME107-10、W-ME107-27和W-ME107-75的表位序列。(A)与图10中的视图相比，IL13Rα2(浅灰色)在与IL-13(黑色)(PDB代码3LB6)的复合物中的结构旋转了180度。表位序列是深灰色的，具有编号的残基边界，并且都位于受体的结构域3上，从结构域2起始的一个序列除外。结构以卡通表示。(B-E)示出了表面表示的IL13Rα2，并突出显示了基于HDX-MS数据以及结合数据的W-ME107-10、W-ME107-27和W-ME107-75的预期表位的差异。表位区域为深灰色。为了清楚起见，IL-13(黑色)保持卡通表示。(B)和(C)分别图解说明了W-ME107-10和W-ME107-27的预测结合区域。在(D)中，W-ME107-75的结合区域以深灰色显示。W-ME107-75在许多实验中的表现得与W-ME107-10和W-ME107-27不同，并且因此预期具有不同的结合位点。表位包括受体的非常C末端部分，残基329-337。这些残基在已发表的结构中不可见，但在图中作为虚线包括在内。推测它们在W-ME107-75结合中很重要，因为它们在小鼠IL13Rα2中是非保守的。(E)此处蛋白质结构已经旋转了180度，并且肽228-245的开始(W-ME107-10和W-ME107-27的表位的一部分，但不是W-ME107-75的表位的一部分)被视为深灰色。
图15A至15D示出了工程改造CAR T细胞的谱分析和表征。(A)示出了IFN-γ分泌到未刺激的对照(模拟)CAR T细胞、W-ME107-10CAR T细胞、W-ME107-27 CAR T细胞、W-ME107-55 CAR T细胞、W-ME107-75 CAR T细胞和W-ME107-117 CAR T细胞的培养基中。(B)示出了IFN-γ分泌到与U87UU或U343MG肿瘤细胞共培养的对照(模拟)CAR T细胞、W-ME107-10 CART细胞、W-ME107-27 CAR T细胞、W-ME107-55 CAR T细胞、W-ME107-75 CAR T细胞和W-ME107-117 CAR T细胞的培养基中。(C)示出了对照(模拟)CAR T细胞、W-ME107-10 CAR T细胞、W-ME107-27 CAR T细胞、W-ME107-55 CAR T细胞、W-ME107-75CAR T细胞和W-ME107-117CAR T细胞中的CAR表达随时间的变化。(D)示出了存在或不存在肿瘤细胞刺激的情况下，对照(模拟)CAR T细胞、W-ME107-27 CAR T细胞和W-ME107-117 CAR T细胞上的表面激活标志物(PD-1、TIM-3、LAG-3、CD69和CD25)。
图16A至16C示出了工程改造CAR T细胞在体内控制胶质母细胞瘤肿瘤的生长。(A)实验程序的示意图。(B)示出了对照(模拟)CAR T细胞、W-ME107-10 CAR T细胞、W-ME107-75CAR T细胞和W-ME107-117CAR T细胞在肿瘤植入后不同天的肿瘤生长情况。(B)示出了对照(模拟)CAR T细胞、W-ME107-10 CAR T细胞、W-ME107-75 CAR T细胞和W-ME107-117 CAR T细胞在肿瘤植入后不同天的小鼠的存活百分比。
图17A至17B示出了scFv的重链和轻链的不同互补决定区(CDR)影响CAR-T细胞的CAR表达。(A)每种构建体的人Jurkat细胞上的CAR表达。(ns：无统计学意义；*：P<0.05；**：P<0.01)。(B)示出了GFP信号的代表性图，GFP信号作为每个构建体中的转导细胞和CAR表面染色信号的指示。
图18A至18C描述了当CAR细胞内信号传导结构域被去除时，工程改造CAR T细胞的基础水平激活减少。(A)用于表达CAR或诱饵CAR(没有称为dCAR的细胞内信号传导结构域的CAR分子)的慢病毒构建体的示意性图解说明。(B)示意图描绘了细胞膜上的CAR分子和诱饵CAR分子。(C)无刺激转导后第7天，不同CAR-T细胞构建体的IFN-γ分泌。
具体实施方式
本实施方案总体上涉及抗IL13Rα2抗体及其抗原结合片段以及其用途，特别是在癌症治疗中的用途。
本实施方案涉及对白介素13受体亚基α2(IL13Rα2)具有特异性的抗体及其抗原结合片段。实施方案的抗体和抗原结合片段特别适用于嵌合抗原受体(CAR)和基于CAR的各种疾病的免疫疗法，所述各种疾病包括以IL13Rα2的表达和呈递为特征的癌症疾病。
针对IL13Rα2的抗体和CAR构建体是本领域已知的，如背景技术部分中引用的文件中所举例说明。然而，现有技术的解决方案存在限制它们在癌症治疗中使用的各种缺点。例如，单克隆抗IL13Rα2抗体1E10B9(美国专利第9,868,788号；Debinski等人,New agentsfor targeting of IL-13RA2 expressed in primary human and canine brain tumors,PLoS One 2013,8(10):e77719))在从IgG抗体转化为单链可变片段(scFv)形式时失去了与人IL13Rα2特异性结合的能力，如实施例部分所示。在抗体形式交替变化时失去抗原结合并不少见，尤其是从IgG到scFv时。影响抗原结合位点结构的蛋白质折叠改变最有可能可以解释这一点。因此，现有技术的单克隆抗IL13Rα2抗体1E10B9可以以IgG形式使用但不适合转化为scFv形式，并且从而不适用于基于CAR的免疫疗法。
单克隆抗IL13Rα2抗体mAb47(美国专利第10,308,719号；Balyasnikova等人,Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibodytargeting interleukin(IL)-13receptorα2,J Biol Chem 2012,287(36):30215-30227；Kim等人,A novel single-chain antibody redirects adenovirus to IL13Rα2-expressing brain tumors,Sci Rep 2015,5:18133)在转化为scFv形式时表现出与人IL13Rα2的保留结合。然而，在基于CAR的免疫疗法中的本发明的scFv的比较实例中，基于mAb47 scFv生成的CAR T细胞仅表现出边缘靶细胞杀伤，而根据实施方案生成的CAR T细胞已经在低效应子与靶细胞比例下表现出显著的细胞毒性能力。因此，在用于基于CAR的免疫疗法中时，根据实施方案的抗体的抗原结合片段比抗体mAb47的抗原结合片段更优异。此外，当结合受体IL13Rα2时，抗体mAb47与配体白介素13(IL-13)竞争，而实施方案的若干种抗体及其抗原结合片段不与IL-13竞争结合IL13Rα2。
本文中，抗体或其抗原结合片段的可变区(包括本文所述的互补决定区(CDR))中的所有氨基酸因此根据国际免疫遗传学(IMGT)信息系统和命名法进行编号和定义(Lefranc等人,Dev Comp Immunol.(2003)1:55-77)。
人IL13Rα2蛋白序列中的氨基酸编号根据NCBI参考序列，登录号为NP_000631，并且版本为NP_000631.1，日期为2021年4月26日，并在下文进一步介绍(SEQ ID NO:107)。
Figure BDA0003897597900000101
可以基于亲和力和/或亲合力来确定抗体或其抗原结合片段的特异性。由抗原与抗体或其抗原结合片段的解离的平衡常数(KD)表示的亲和力是抗原决定簇(即，表位)与抗体或其抗原结合片段上的抗原结合位点之间的结合强度的量度。KD值越小，抗原决定簇与抗体或其抗原结合片段之间的结合强度越强。或者，亲和力也可以表示为亲和常数(KA)，其为1/KD。如技术人员将清楚的是，取决于特定的所关注抗原，可以以本身已知的方式确定亲和力。
亲合力是抗体或其抗原结合片段与相关抗原之间的结合强度的量度。亲合力与抗原决定簇和抗体或其抗原结合片段上的抗原结合位点之间的亲和力、以及存在于抗体或其抗原结合片段上的相关结合位点的数量相关。
通常，抗体或其抗原结合片段将以10-5至10-12摩尔/升(M)或更小，并且优选10-7至10-12M或更小并且更优选10-8至10-12M的平衡解离常数(KD)与其抗原结合，即以105至1012M-1或更大并且优选107至1012M-1或更大并且更优选108至1012M-1的亲和力常数(KA)与其抗原结合。
一般来讲，大于10-4M的任何KD值(或低于104M-1的任何KA值)都被认为指示非特异性结合。
优选地，实施方案的抗体或其抗原结合片段将以小于500nM、优选小于200nM、更优选小于10nM、诸如小于5nM的亲和力与IL13Rα2结合。
抗体或其抗原结合片段与抗原或抗原决定簇可以以本身已知的任何合适的方式确定，所述合适的方式包括例如斯卡查德分析(Scatchard analysis)和/或竞争性结合测定，诸如放射免疫测定(RIA)、酶免疫测定(EIA)和夹心竞争测定、
Figure BDA0003897597900000111
多重测定、以及其在本领域中本身已知的不同变型。
本发明人已经在IL13Rα2中发现了新的表位或抗原决定簇区域，其高度适合抗体及其抗原结合片段的靶向。具体地说，靶向此新表位的抗体及其抗原结合片段可用于基于CAR的免疫疗法。此表位对应于IL13Rα2的结构域1中的第二个也是最大的β折叠，如图10所示。这是受体的N末端部分，并且结构域1由一个β夹心折叠和两个彼此重叠的β折叠组成。此表位位于最大β折叠的4条链中的第3条中，并且位于远离IL-13与IL13Rα2的结合位点的区域，参见图10。
与此β折叠区域中的表位特异性结合的抗体及其抗原结合片段对IL13Rα2具有高特异性，未表现出与IL13Rα1结合。在基于CART细胞的免疫疗法中，抗原结合片段对表达IL13Rα2的癌细胞表现出优异的细胞毒性能力。
实施方案的一个方面因此涉及能够结合IL13Rα2的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段对IL13Rα2的β折叠区域或结构域内的表位具有特异性，所述β折叠区域包含IL13Rα2中氨基酸编号68至75的第一β链、第一β链之后的环、IL13Rα2中氨基酸编号101至109的第二β链、第二β链之前的环、以及IL13Rα2中氨基酸编号124至128的第三β链。
IL13Rα2的氨基酸序列呈现在SEQ ID NO:107中。氨基酸编号68至75对应于氨基酸序列EYELKYRN(SEQ ID NO:108)，氨基酸编号101至109对应于氨基酸序列IEAKIHTLL(SEQID NO:109)，并且氨基酸编号124至128对应于氨基酸序列AETTY(SEQ ID NO:110)。
图10图解说明了结构域1的最大β折叠，带有阴影线的椭圆围绕着编号为3、6和7的三条β链，形成一个表位。β链6和7与含有α螺旋和弯曲的环区域相互连接。β链3和6与包含两个转角和两条β链(编号4和5，其中β链4与链3、6、7一起属于最大的β折叠，而β链5属于结构域1的第一较小β折叠)的氨基酸序列相互连接。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对包含至少一种肽(也称为表位区)的表位具有特异性，所述至少一种肽选自由IL13Rα2中的氨基酸编号67至81、氨基酸编号96至106和氨基酸编号123至128组成的组。
在一个实施方案中，第一肽或表位区(VEYELKYRNIGSETW,SEQ ID NO:44)基本上对应于IL13Rα2中的β链3和β链3之后的转角。第二肽或表位区(DLNKGIEAKIH,SEQ ID NO:45)基本上对应于β链6和它之前的一小段环，而第三肽或表位区(WAETTY,SEQ ID NO:46)基本上对应于β链7。
抗体或其抗原结合片段对IL13Rα2的β折叠区域中的这三种肽或表位区中的至少一种具有特异性。因此，抗体或其抗原结合片段对第一肽或表位区(VEYELKYRNIGSETW,SEQID NO:44)具有特异性，抗体或其抗原结合片段对第二肽或表位区(DLNKGIEAKIH,SEQ IDNO:45)具有特异性，或者抗体或其抗原结合片段对第三肽或表位区(WAETTY,SEQ ID NO:46)具有特异性。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段对IL13Rα2的β折叠区域中的这三种肽或表位区中的至少两种具有特异性。因此，抗体或其抗原结合片段对第一肽或表位区(VEYELKYRNIGSETW,SEQ ID NO:44)和第二肽或表位区(DLNKGIEAKIH,SEQ ID NO:45)具有特异性，抗体或其抗原结合片段对第一肽或表位区(VEYELKYRNIGSETW,SEQ ID NO:44)和第三肽或表位区(WAETTY,SEQ ID NO:46)具有特异性，或者抗体或其抗原结合片段对第二肽或表位区(DLNKGIEAKIH,SEQ ID NO:45)和第三肽或表位区(WAETTY,SEQ ID NO:46)具有特异性。
在优选的实施方案中，抗体或其抗原结合片段对IL13Rα2的β折叠区域中的所有这三种肽或表位区具有特异性，即，对第一肽或表位区(VEYELKYRNIGSETW,SEQ ID NO:44)、第二肽或表位区(DLNKGIEAKIH,SEQ ID NO:45)和第三肽或表位区(WAETTY,SEQ ID NO:46)具有特异性。
本发明还涉及IL13Rα2的表位。表位在IL13Rα2的β折叠区域内，所述IL13Rα2包含IL13Rα2中氨基酸编号68至75的第一β链、第一β链之后的环、IL13Rα2中氨基酸编号101至109的第二β链、第二β链之前的环、以及IL13Rα2中氨基酸编号124至128的第三β链。
在一个实施方案中，表位包含选自由以下组成的组的至少一种肽，优选至少两种肽，和更优选所有三种肽：IL13Rα2中的氨基酸编号67至81，即VEYELKYRNIGSETW(SEQ IDNO:44)、氨基酸编号96至106，即DLNKGIEAKIH(SEQ ID NO:45)和氨基酸编号123至128，即WAETTY(SEQ ID NO:46)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)结构域互补决定区3(CDR3)，其包含氨基酸序列YSPFY(SEQ ID NO:3)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR3，其包含氨基酸序列YSPFYM(SEQ ID NO:9)。在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR3，其包含氨基酸序列ARYSPFYMDY(SEQ ID NO:10)、优选由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)结构域CDR3，其包含氨基酸序列GYSFPP(SEQ ID NO:4)。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL CDR3，其包含氨基酸序列QQGYSFPPT(SEQ ID NO:11)、优选由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR1，其包含氨基酸序列SGSY(SEQ ID NO:1)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR1，其包含氨基酸序列GFTFSGSY(SEQ ID NO:106)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含延伸的VH结构域CDR1，其包含氨基酸序列SGSYMS(SEQ ID NO:5)，优选包含氨基酸序列GFTFSGSYMS(SEQ ID NO:6)、优选由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR2，其包含氨基酸序列YGSGGY(SEQ ID NO:2)。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR2，其包含氨基酸序列IYGSGGYT(SEQ ID NO:7)、优选由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含延伸的VH结构域CDR2，其包含氨基酸序列SIYGSGGYTY(SEQ ID NO:8)、优选由所述氨基酸序列组成。
如本文所用的延伸的CDR涉及在根据IMGT命名法定义的CDR的氨基酸之外包含至少一种另外的氨基酸残基的氨基酸序列。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL结构域CDR1，其包含氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO:12)、优选由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL结构域CDR2，其包含氨基酸序列AAS、优选由所述氨基酸序列组成。
抗体或其抗原结合片段可以包含VH结构域和/或VL结构域CDR区的上述实施方案中的至少一种，优选CDR区中的至少两种，更优选CDR区中的至少三种，并且甚至更优选CDR区中的至少四种、至少五种或所有。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含上述VH结构域和/或VL结构域CDR区中的至少两种。此类实施方案包括：包含如上定义的VH结构域CDR1和VH结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1和VH结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1和VL结构域CDR1的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2和VH结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2和VL结构域CDR1的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR3和VL结构域CDR1的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR3和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR3和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；和包含如上定义的VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含上述VH结构域和/或VL结构域CDR区中的至少三种。此类实施方案包括：包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2和VH结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2和VL结构域CDR1的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2和VL结构域CDR2的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3和VL结构域CDR1的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3和VL结构域CDR2的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3和VL结构域CDR1的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3和VL结构域CDR2的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR3、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段；和包含如上定义的VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含上述VH结构域和/或VL结构域CDR区中的至少四种。此类实施方案包括：包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3和VL结构域CDR1的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR2、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；和包含如上定义的VH结构域CDR3、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含上述VH结构域和/或VL结构域CDR区中的至少五种。此类实施方案包括：包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR2的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段；和包含如上定义的VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗体或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含上述VH结构域和VL结构域CDR区中的全部六种。此类实施方案包括包含如上定义的VH结构域CDR1、VH结构域CDR2、VH结构域CDR3、VL结构域CDR1、VL结构域CDR2和VL结构域CDR3的抗原或其抗原结合片段。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSYMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSPFYMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)、优选由所述氨基酸序列组成。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VL结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSFPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)、优选由所述氨基酸序列组成。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含VH结构域，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；和VL结构域，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成。
本实施方案的特别优选的抗体在本文中表示为ME107-117或W-ME107-117，并且其对应的抗原结合片段表示为ME107-117 scFv或W-ME107-117 scFv。此抗体及其抗原结合片段特异性结合IL13Rα2的β折叠区域中的表位(图10)，并且包含上文呈现的VH和VL结构域CDR区。
实施方案的另一个方面涉及能够结合IL13Rα2的抗体或其抗原结合片段。抗体或其抗原结合片段包含VH结构域CDR1，其包含氨基酸序列GFTFX1X2X3X4、优选由所述氨基酸序列组成，其中每个Xn(n＝1…4)独立地选自由G、A、S和Y组成的组。抗体或其抗原结合片段还包含VH结构域CDR2，其包含氨基酸序列IB1B2B3B4B5B6T、优选由所述氨基酸序列组成，其中每个Bm(m＝1…6)独立地选自由G、S和Y组成的组。抗体或其抗原结合片段还包含VH结构域CDR3，其包含氨基酸序列AR-ZH-Z1DY、优选由所述氨基酸序列组成，其中Z1选自由F、M、I和L组成的组，并且ZH表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：VVRSTYGY(SEQ ID NO:15)、YGHYAYGSY(SEQ ID NO:16)、YSSSGWYYGF(SEQ ID NO:17)、TPYSAY(SEQ ID NO:18)、RYRSHRPGLS(SEQ ID NO:19)、FHPRYGY(SEQ ID NO:20)、GSYSHYGAHY(SEQ ID NO:21)、YYHYDYGYYY(SEQ ID NO:22)、YSPFY(SEQ ID NO:3)、RNYWEHGGGS(SEQ ID NO:24)、HHYGYYPPGSVYY(SEQ ID NO:25)和VEYTYYGSEGSPV(SEQ ID NO:26)。抗体或其抗原结合片段包含VL结构域CDR1，其包含氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO:12)、优选由所述氨基酸序列组成。抗体或其抗原结合片段还包含VL结构域CDR2，其包含氨基酸序列AAS、优选由所述氨基酸序列组成；和VL结构域CDR3，其包含氨基酸序列QQ-ZL-T、优选由所述氨基酸序列组成，其中ZL表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：TYYSPH(SEQ ID NO:28)、DYYLF(SEQ ID NO:29)、SYSTPY(SEQ ID NO:30)、FYSYPL(SEQ ID NO:31)、AFSPS(SEQ ID NO:32)、SYDTLL(SEQID NO:33)、ALSSLP(SEQ ID NO:34)、FSTRLS(SEQ ID NO:35)、GYSFPP(SEQ ID NO:4)、STYPF(SEQ ID NO:37)、YGSNPL(SEQ ID NO:38)和RYNGLF(SEQ ID NO:39)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含延伸的VH CDR1，其包含氨基酸序列GFTFX1X2X3X4MX5、优选由所述氨基酸序列组成。在此实施方案中，每个Xn(n＝1…5)独立地选自由G、A、S和Y组成的组。
在一个实施方案中，X5是S或G。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含延伸的VH CDR2，其包含氨基酸序列JIB1B2B3B4B5B6TY、优选由所述氨基酸序列组成。在此实施方案中，每个Bm(m＝1…6)独立地选自由G、S和Y组成的组，并且J选自由A、Y、G和S组成的组。
在一个实施方案中，J选自由A、Y和S组成的组。
在一个实施方案中，X1是S或Y；X2是S或G；X3是S或Y；并且X4是A、Y或G。
在一个实施方案中，B1是S或Y；B2是G；B3是S、G或Y；B4是G；B5是S或G；并且B6是S或Y。
在一个实施方案中，ZH-Z1表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：YGHYAYGSYF(SEQ ID NO:40)、TPYSAYI(SEQ ID NO:41)、GSYSHYGAHYL(SEQ ID NO:42)和YSPFYM(SEQ IDNO:9)。
在一个实施方案中，ZL表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：DYYLF(SEQ IDNO:29)、FYSYPL(SEQ ID NO:31)、ALSSLP(SEQ ID NO:34)和GYSFPP(SEQ ID NO:4)。
实施方案的当前优选的抗原结合片段在本文中表示为W-ME107-7、W-ME107-10、W-ME107-16、W-ME107-27、W-ME107-55、W-ME107-67、W-ME107-75、W-ME107-112、W-ME107-117、W-ME107-128、W-ME107-150和W-ME107-156。对应优选的抗体具有对应于这些抗原结合片段的CDR区和VH和VL结构域。表1示出了VH结构域CDR1，表2示出了VH结构域延伸的CDR1，表3示出了VH结构域CDR2，表4示出了VH结构域延伸的CDR2。表5示出了VH结构域CDR3，而表6示出了VL结构域CDR3。W-ME107-7、W-ME107-10、W-ME107-16、W-ME107-27、W-ME107-55、W-ME107-67、W-ME107-75、W-ME107-112、W-ME107-117、W-ME107-128、W-ME107-150和W-ME107-156中的全部具有QSISSY(SEQ ID NO:12)的共同VL结构域CDR1和AAS的共同VL结构域CDR2。
表1-VH结构域CDR1
克隆 VH结构域CDR1 SEQ ID NO:
W-ME107-7 GFTF GYYY 100
W-ME107-10 GFTF SSYA 101
W-ME107-16 GFTF SSYA 101
W-ME107-27 GFTF YGSY 102
W-ME107-55 GFTF SSYA 101
W-ME107-67 GFTF GSSY 103
W-ME107-75 GFTF YSYG 104
W-ME107-112 GFTF SSYA 101
W-ME107-117 GFTF SGSY 105
W-ME107-128 GFTF YSYG 104
W-ME107-150 GFTF SSYA 101
W-ME107-156 GFTF SSYG 106
表2-VH结构域延伸的CDR1
Figure BDA0003897597900000201
Figure BDA0003897597900000211
表3-VH结构域CDR2
克隆 VH结构域CDR2 SEQ ID NO:
W-ME107-7 I SGSGGS T 53
W-ME107-10 I SGSGGS T 53
W-ME107-16 I SGGGSY T 54
W-ME107-27 I SGYGGY T 55
W-ME107-55 I SGSGGS T 53
W-ME107-67 I SGSGSY T 56
W-ME107-75 I SGGGSY T 54
W-ME107-112 I SGSGGS T 53
W-ME107-117 I YGSGGY T 7
W-ME107-128 I SSGSSY T 57
W-ME107-150 I SGSGGS T 53
W-ME107-156 I SGGGSY T 54
表4-VH结构域延伸的CDR2
Figure BDA0003897597900000212
Figure BDA0003897597900000221
表5-VH结构域CDR3
克隆 VH结构域CDR3 SEQ ID NO:
W-ME107-7 AR VVRSTYGY F DY 64
W-ME107-10 AR YGHYAYGSY F DY 65
W-ME107-16 AR YSSSGWYYGF M DY 66
W-ME107-27 AR TPYSAY I DY 67
W-ME107-55 AR RYRSHRPGLS F DY 68
W-ME107-67 AR FHPRYGY F DY 69
W-ME107-75 AR GSYSHYGAHY L DY 70
W-ME107-112 AR YYHYDYGYYY F DY 71
W-ME107-117 AR YSPFY M DY 10
W-ME107-128 AR RNYWEHGGGS L DY 72
W-ME107-150 AR HHYGYYPPGSVYY F DY 73
W-ME107-156 AR VEYTYYGSEGSPV F DY 74
表6-VL结构域CDR3
克隆 VL结构域CDR3 SEQ ID NO:
W-ME107-7 QQ TYYSPH T 75
W-ME107-10 QQ DYYLF T 76
W-ME107-16 QQ SYSTPY T 77
W-ME107-27 QQ FYSYPL T 78
W-ME107-55 QQ AFSPS T 79
W-ME107-67 QQ SYDTLL T 80
W-ME107-75 QQ ALSSLP T 81
W-ME107-112 QQ FSTRLS T 82
W-ME107-117 QQ GYSFPP T 11
W-ME107-128 QQ STYPF T 83
W-ME107-150 QQ YGSNPL T 84
W-ME107-156 QQ RYNGLF T 85
实施方案的特别优选的抗原结合片段是W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-75和W-ME107-117，并且特别优选的抗体是具有W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-75和W-ME107-117的VH和VL CDR区的抗体。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-10的VH CDR区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表6中指定的克隆W-ME107-10的VL CDR3区以及共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-10的VH CDR区，以及如表6中指定的克隆W-ME107-10的VLCDR3区和共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-27的VH CDR区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表6中指定的克隆W-ME107-27的VL CDR3区以及共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-27的VH CDR区，以及如表6中指定的克隆W-ME107-27的VLCDR3区和共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-75的VH CDR区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表6中指定的克隆W-ME107-75的VL CDR3区以及共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-75的VH CDR区，以及如表6中指定的克隆W-ME107-75的VLCDR3区和共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-117的VH CDR区。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表6中指定的克隆W-ME107-117的VL CDR3区以及共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
在特定的实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含如表1、3和5中指定的、优选如表2、4和5中指定的克隆W-ME107-117的VH CDR区，以及如表6中指定的克隆W-ME107-117的VL CDR3区和共同的VL结构域CDR1和CDR2区。
W-ME107-10包含(SEQ ID NO:86)的VH结构域：EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGHYAYGSYFDYWGQGTLVTVSS
和(SEQ ID NO:87)的VL结构域：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYYLFTFGQGTKLEIK
W-ME107-27包含(SEQ ID NO:88)的VH结构域：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYGSYMGWVRQAPGKGLEWVSYISGYGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTPYSAYIDYWGQGTLVTVSS
和(SEQ ID NO:89)的VL结构域：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFYSYPLTFGQGTKLEIK
W-ME107-75包含(SEQ ID NO:90)的VH结构域：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYSYGMSWVRQAPGKGLEWVSYISGGGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYSHYGAHYLDYWGQGTLVTVSS
和(SEQ ID NO:91)的VL结构域：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALSSLPTFGQGTKLEIK
W-ME107-117包含(SEQ ID NO:13)的VH结构域：
EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSYMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSPFYMDYWGQGTLVTVSS
和(SEQ ID NO:14)的VL结构域：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSFPPTFGQGTKLEIK
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段的VH结构域通过接头与VL结构域融合。通常用于相互连接抗体及其抗原结合片段中的VH和VL结构域的各种此类接头可以根据实施方案使用。在特定的实施方案中，接头是肽接头。例如，肽接头可以包含氨基酸甘氨酸(G)和/或丝氨酸(S)，诸如由所述氨基酸组成。这种肽接头的例示性但非限制性实例包含GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成。
技术人员将理解，氨基酸序列中的一个、两个、三个、四个或甚至更多个氨基酸残基的微小变异(诸如取代，包括氨基酸的缺失或添加)可在不影响功能性质(诸如其结合抗体或其抗原结合片段的IL13Rα2的能力)的情况下发生。变异可在CDR的氨基酸序列中发生，在CDR区之外的氨基酸序列(即，框架区)中发生，或者在CDR的氨基酸序列中和重链和/或轻链可变区的CDR区之外的氨基酸序列中发生。因此，实施方案还涵盖与本文呈现的或序列表中的任何氨基酸序列具有至少75％、优选至少80％、诸如至少85％、以及更优选至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的抗体或其抗原结合片段。
如本文所用，序列同一性是指两个氨基酸序列(诸如肽或蛋白质序列)之间的序列相似度。通过序列比对来确定相似度以确定序列之间的结构和/或功能关系。氨基酸序列之间的序列同一性可以通过使用默认参数设置、使用可从国家生物技术信息中心(NCBI),Bethesda,Md.,USA获得的Needleman-Wunsch全局序列比对工具比较序列的比对来确定，例如经由http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi(对于蛋白质比对，间隙成本Existence:11Extension:1)进行。本说明书中提到的序列比较和百分比同一性已使用此软件确定。当将序列同一性水平与例如氨基酸序列进行比较时，这优选地应当相对于氨基酸序列的全长进行，即，使用全局比对方法以避免导致同一性的高重叠评估的高同一性重叠的短区域。例如，具有例如五个氨基酸的短多肽片段可能与整个氨基酸序列中的五个氨基酸区域具有100％相同的序列，但这不能提供100％的氨基酸同一性，除非所述片段形成在与所述氨基酸序列中的位置等价的其他位置也具有相同的氨基酸的较长序列的一部分。当所比较序列中的等价位置被相同的氨基酸占据时，那么分子在该位置处是相同的。将比对评分为同一性百分比是所比较序列的共同位置处的相同氨基酸数量的函数。当比较序列时，最佳比对可能需要在序列中的一个或多个中引入空位，以考虑序列中可能的插入和缺失。
在一个实施方案中，抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，抗体是多克隆抗体。
在一个实施方案中，抗体是经遗传改造的抗体，例如单链抗体、人源化抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、双特异性抗体或多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体是嵌合抗体。如本文所用的嵌合抗体是指包含来自一个物种的恒定结构域和来自第二物种的可变结构域的抗体。
在一个实施方案中，抗体是人源化抗体。如本文所用的人源化抗体是指具有至少一个来自非人来源的CDR区、经工程改造以具有比原始来源抗体更类似于真正的人抗体的结构和免疫功能的抗体。人源化抗体的实例是具有移植到人抗体中的来自非人抗体的CDR区的抗体。人源化可以另外地或另选地涉及选择的氨基酸取代以使非人氨基酸序列更像人序列。
制备抗体的合适方法是本领域已知的。例如，标准杂交瘤方法在Harlow和Lane(编辑),Antibodies:A Laboratory Manual,CSH Press(1988)和CA.Janeway等人(编辑),Immunobiology,5th Ed.,Garland Publishing,New York,N.Y.(2001))中有所描述。
可使用提供由培养中的连续细胞系产生的抗体分子的任何技术来制备单克隆抗体。这些技术包括但不限于最初在Nature 256:495-497,1975中描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(Immunol Today 4:72,1983；Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030,1983)和EBV-杂交瘤技术(Cole等人,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R LissInc,New York N.Y.,pp 77-96,(1985))。
多克隆抗体可以通过用包含IL13Rα2抗原的免疫原使动物免疫并从该免疫动物收集抗血清来制备。广泛的动物物种可以用于产生抗血清，包括但不限于兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊、绵羊、猪或马。
抗体及其抗原结合片段可另选地使用如本文所述的噬菌体展示选择来产生。
如本文所用的抗体的抗原结合片段可以选自由以下组成的组：单链抗体、Fv片段、scFv片段、Fab片段、F(ab')2片段、Fab'片段、Fd片段、单结构域抗体(sdAb)、scFv-Fc片段、di-scFv片段和CDR区。抗原结合片段的当前优选的实施方案是单链可变片段(scFv)。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段特异性结合IL13Rα2，优选人IL13Rα2。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段另外地或另选地特异性结合非人IL13Rα2。这种非人IL13Rα2的例示性但非限制性实例包括犬IL13Rα2、猫IL13Rα2、牛IL13Rα2、马IL13Rα2、绵羊IL13Rα2、大鼠IL13Rα2和/或小鼠IL13Rα2。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段不结合人IL13Rα1。
实施方案的一个方面涉及嵌合抗原受体(CAR)。CAR包含抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含根据实施方案的抗体或其抗原结合片段。CAR还包含跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
一般来讲，CAR包含胞外域、跨膜结构域和胞内域。CAR的胞外域包含抗原识别区，抗原识别区可以是scFv。胞外域还可包含引导CAR进入内质网的信号标签或肽。
跨膜结构域是CAR穿过细胞膜的部分。一般来讲，跨膜结构域可以来源于任何跨膜蛋白。在一个实施方案中，跨膜结构域包含疏水性α螺旋。可以包括在CAR中的跨膜结构域的例示性但非限制性实例包括分化簇28(CD28)的跨膜结构域的全部或部分、CD8α的跨膜结构域的全部或部分、CD27的跨膜结构域的全部或部分、CD137(4-1BB)的跨膜结构域的全部或部分、CD134(OX40)的跨膜结构域的全部或部分、CD3ε的跨膜结构域的全部或部分、CD3ζ的跨膜结构域的全部或部分、CD3γ的跨膜结构域的全部或部分、CD3δ的跨膜结构域的全部或部分、TCRα的跨膜结构域的全部或部分、和TCRβ的跨膜结构域的全部或部分，优选CD28的跨膜结构域的全部或部分或CD8α的跨膜结构域的全部或部分。
CAR的胞内域包含至少一个信号传导结构域。可以包括在CAR中的此类信号传导结构域的例示性但非限制性实例包括CD3的ζ链(CD3ζ)、CD28、CD137(4-1BB)、ICOS、CD27、CD40、OX40(CD134)或Myd88，优选CD3ζ和/或CD137。
在一个实施方案中，CAR包含相互连接抗原识别结构域和跨膜结构域的铰链结构域或间隔物。
实施方案的相关方面定义了包含抗原识别结构域的T细胞受体(TCR)复合物，所述抗原识别结构域包含根据实施方案的抗体或其抗原结合片段。
TCR是在T细胞表面发现的一种分子，其负责将抗原片段识别为与主要组织相容性复合物(MHC)分子结合的肽。当TCR与抗原肽和MHC结合时，T细胞通过信号转导，即由相关酶、共受体、特化的衔接头分子以及活化的或释放的转录因子介导的一系列生化事件而被激活。TCR复合物通常是与CD3γ链、CD3δ链和两条CD3ε链缔合的TCR分子。这些链与TCR和ζ链(Zeta链)缔合，以在T细胞中生成激活信号。TCR、ζ链和CD3分子共同构成TCR复合物。
可以使用的TCR的非限制性实例包括CMVpp65 TCR和TARP TCR。
实施方案的另一个方面涉及包含根据实施方案的抗体或其抗原结合片段和效应分子的缀合物。
实施方案的缀合物包含作为靶向结构域或分子的抗体或其抗原结合片段和效应结构域或分子。抗体或其抗原结合片段将缀合物靶向表达IL13Rα2的细胞，包括肿瘤细胞。
实施方案的抗体或其抗原结合片段可与各种所谓的效应结构域或分子结合使用。在一个实施方案中，效应分子选自由以下组成的组：可检测标记、细胞毒素、金属、另一种抗体或其抗原结合片段、核酸序列和脂质双层对接部分。
在一个实施方案中，效应结构域可用于检测和诊断目的。在这种情况下，效应结构域是可检测标记，诸如放射性标记、荧光标记、化学发光标记。然后缀合物可以用于IL13Rα2(诸如表达IL13Rα2的细胞)的诊断和成像，例如在受试者体内。然后可根据特定的可检测标记使用各种成像模式，例如X射线成像、磁共振成像(MRI)、正电子发射断层扫描(PET)或单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。
如果不使用可检测标记，实施方案的抗体或其抗原结合片段可以通过用抗体的至少一个氨基酸残基中的元素(诸如氢或碳)的同位素(诸如用氘代替氢并且用13C代替12C)取代所述元素来检测。
金属也可以用作用于成像目的的效应结构域，所述金属包括顺磁性金属和放射性同位素。
一旦缀合物已经使用抗体或其抗原结合片段靶向细胞，细胞毒素或细胞毒剂可以用作效应结构域以发挥细胞毒性并杀伤表达IL13Rα2的细胞。细胞毒素的典型实例是化疗剂。可以根据实施方案使用任何化疗剂，包括但不限于烷化剂、抗代谢药物、抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂和细胞毒性抗生素。
在另一个实施方案中，效应结构域是凋亡标签，其引起表达IL13Rα2并被缀合物靶向的细胞诱导的凋亡。这种细胞凋亡标签的实例是TRAIL蛋白。
在又另一个实施方案中，效应结构域是T细胞或B细胞表位、或编码所述T细胞或B细胞表位的核酸序列，其引起针对表位的T细胞或B细胞免疫的特异性诱导。
效应结构域可以是另一种抗体或其抗原结合片段。例如，效应结构域可以是IgG或其他免疫球蛋白的Fc结构域。Fc结构域然后可以用于经由蛋白A亲和柱实现纯化。另外或另选地，Fc结构域可改善缀合物的体内半衰期。此外，Fc区允许缀合物的二聚/多聚。
实施方案的另一个方面包括编码根据实施方案的抗体或其抗原结合片段、CAR和/或TCR复合物的核酸分子。如本文所用的核酸分子包括多核苷酸、寡核苷酸和核酸序列，并且通常意指DNA或RNA的聚合物，其可以是单链或双链的，其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸，并且其可以含有天然的、非天然的或改变的核苷酸间键联，诸如氨基磷酸酯键联或硫代磷酸酯键联，而不是在未修饰寡核苷酸的核苷酸之间发现的磷酸二酯。核酸分子还包括互补DNA(cDNA)和信使RNA(mRNA)。
核酸分子还可编码除根据实施方案的抗体或其抗原结合片段之外的其他分子。这种另一种分子的例示性实例是幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)中性粒细胞激活蛋白(NAP)，HP-NAP是在幽门螺杆菌细菌感染中充当毒力因子的十二聚体蛋白。它由12个单体亚基组成，并且每个亚基由四个α螺旋组成。HP-NAP的表面带高正电荷，并且具有激活人白血球(WBC)和与其相互作用的能力，白血球也称为白细胞。
实施方案的另一个方面涉及包含根据实施方案的核酸分子的载体。
载体优选为表达载体，即包含至少一种核酸分子的载体，所述核酸分子包含可以在包含所述表达载体的宿主细胞(诸如宿主T细胞)中表达(诸如转录和翻译)的编码序列。在一个实施方案中，表达载体选自DNA分子、RNA分子、质粒、游离质粒和病毒载体。
在一个实施方案中，载体是病毒载体。在特定的实施方案中，病毒载体选自由以下组成的组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、塞姆利基森林病毒病毒(Semliki Forest virus)、脊髓灰质炎病毒和杂合载体。
慢病毒是逆转录病毒的一个亚类。由于它们能够整合到非分裂细胞的基因组中，因此它们被改造为基因传递媒介物(载体)，这是慢病毒的独特特征，因为其他逆转录病毒只能感染分裂细胞。当病毒进入细胞(诸如T细胞)时，病毒基因组以RNA的形式被逆转录以产生DNA，然后通过病毒整合酶将DNA插入基因组的某个位置。载体(现在称为前病毒)保留在基因组中，并且如果它分裂，则传给细胞的后代。出于安全原因，慢病毒载体通常从不携带其复制所需的基因。为了产生慢病毒，将若干质粒转染到所谓的包装细胞系中，包装细胞系通常是HEK293。通常称为包装质粒的一种或多种质粒编码病毒体蛋白，诸如衣壳和逆转录酶。另一种质粒含有由载体传递的遗传物质。它被转录以产生单链RNA病毒基因组，并以ψ(psi)序列的存在为标志。此序列用于将基因组包装到病毒体中。
逆转录病毒是当前基因治疗方法的支柱之一。重组逆转录病毒，诸如莫洛尼鼠白血病病毒，具有以稳定的方式整合到宿主基因组中的能力。它们含有允许整合到宿主基因组中的逆转录酶。逆转录病毒载体可以是复制型的或复制缺陷型的。复制缺陷型载体是最常见的选择，因为病毒已将另外轮次的病毒体复制和包装所必需的基因的编码区替换为其他基因或缺失。这些病毒能够感染T细胞并传递其病毒有效载荷，但然后无法继续导致细胞裂解和死亡的典型裂解途径。如果载体是慢病毒或逆转录病毒载体，那么编码CAR和/或TCR复合物和HP-NAP和/或HP-NAP的免疫等价片段的核酸序列优选为RNA序列。
如本文所用的腺病毒载体包括腺病毒载体和腺病毒衍生的病毒载体。
腺病毒DNA不整合到基因组中，并且不在细胞分裂期间复制。腺衍生的病毒载体基于腺病毒，但其中已经进行了各种修饰，诸如与编码复制蛋白、调节蛋白、病毒表面蛋白等的核苷酸序列相关的修饰。
腺相关病毒(AAV)是一种感染人类和其他一些灵长类物种的小病毒。AAV可以感染分裂细胞和非分裂细胞，并且可将其基因组整合到宿主细胞的基因组中。此外，AAV大多保持游离型，表现出时间长且稳定的表达。AAV包装DNA的单链并且需要第二链合成的过程，而自互补腺相关病毒(scAAV)包装退火在一起以形成双链DNA的两条链。通过跳过第二链合成，scAAV允许在细胞中快速表达。如果载体是腺病毒载体，那么编码CAR和/或TCR复合物和HP-NAP和/或HP-NAP的免疫等价片段的核酸序列优选为DNA序列。
塞姆利基森林病毒是一种编码九种蛋白质的正链RNA病毒，基因组大约有13,000个碱基对。基因组的5'三分之二编码四种与RNA合成有关的非结构蛋白，而结构蛋白在3'三分之一中编码。在结构蛋白中，C蛋白构成二十面体衣壳，所述衣壳被来源于宿主细胞的脂质双层包膜。病毒的最外层表面几乎完全被糖蛋白E1和E2的异二聚体覆盖，排列成相互连接的三聚体，所述三聚体形成外壳。三聚体通过与核衣壳缔合的E2细胞质结构域锚定在膜中。由于其广泛的宿主范围和有效的复制，它也被开发为载体。
杂合载体是经遗传改造以具有多于一种载体的品质的载体病毒。例如，杂合载体可以是腺病毒和慢病毒的组合。
在一个实施方案中，编码抗体或其抗原结合片段、CAR和/或TCR复合物的核酸分子处于启动子的转录控制之下。在一个实施方案中，启动子选自由人EF1α启动子、CMV启动子和CAG启动子组成的组，优选EF1α启动子。
在一个实施方案中，载体包含在启动子(诸如EF1a启动子)的转录控制下编码CAR和/或TCR复合物的核酸分子。载体还包含在诱导型启动子(诸如诱导型NFAT-IL-2启动子)的转录控制下编码优选具有用于分泌的信号肽的HP-NAP的核酸分子。
实施方案的另一个方面涉及包含细胞，所述细胞包含根据实施方案的抗体或其抗原结合片段的细胞；CAR；TCR复合物；核酸分子和/或载体。
然后可以在细胞中转录核酸或载体以在细胞中产生抗体或其抗原结合片段、CAR和/或TCR复合物。
在一个实施方案中，细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞组成的组。在特定的实施方案中，细胞是T细胞。
实施方案还涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据实施方案的抗体或其抗原结合片段；CAR；TCR复合物；细胞；缀合物；核酸；和/或载体，以及药学上可接受的运载体。
药学上可接受的运载体可以是与药物组合物的其他成分相容的任何药学上可接受的运载体、载体和/或赋形剂，包括其组合。此类药学上可接受的运载体的非限制性实例包括注射溶液，诸如盐水或缓冲注射溶液。
实施方案还涉及根据本发明用作药物的抗体或其抗原结合片段；CAR；TCR复合物；缀合物，其中效应分子是细胞毒素；核酸分子；载体；细胞；和/或药物组合物。
在特定的实施方案中，根据实施方案抗体或其抗原结合片段；CAR；TCR复合物；缀合物，其中效应分子是细胞毒素；核酸分子；载体；细胞和/或药物组合物可以用于治疗以癌细胞上IL13Rα2表达为特征的癌症疾病(即，表达IL13Rα2的癌症疾病)或延缓其发作。
在一个实施方案中，表达IL13Rα2的癌症疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌、黑色素瘤和卡波西肉瘤(Kaposi's sarcoma)。
另一个实施方案涉及治疗、降低和/或预防患者的表达IL13Rα2的癌症的方法。方法包括向患者施用治疗有效量的根据本发明的抗体或其抗原结合片段；CAR；TCR复合物；缀合物，其中效应分子是细胞毒素；核酸分子；载体；细胞；和/或药物组合物。
如本文所用，有效量表示实现期望结果所必需的剂量下和时间段内有效的量。例如，在抑制肿瘤生长的背景中，有效量是例如与不施用细胞获得的反应相比，诱导、缓解、降低肿瘤负担和/或防止肿瘤扩散或生长的量。有效量可能根据诸如疾病状态、年龄、性别、患者体重的因素而变化。如本文所用并且如在本领域很好理解的“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指用于获得有益或期望结果(包括临床结果)的方法。有益或期望的临床结果可以包括例如一种或多种症状或病状的减轻或改善、疾病范围的缩小、稳定的疾病状态(即，防止恶化)、预防疾病传播、疾病进程的延缓或减慢、疾病状态的改善或缓和、疾病复发的减少以及缓解。“治疗”还可相比于不接受任何治疗时的预期生存，延长生存。
如本文所用并且如在本领域很好理解的预防(Preventing)或预防(prophylaxis)意指降低或预防发展疾病或病症的风险的方法，包括延长或延缓疾病发展。例如，容易发展疾病(诸如由于遗传(genetic)或遗传(hereditary)易感性)的患者可能受益于施用根据实施方案的抗体或其抗原结合片段、细胞、缀合物和/或药物组合物以预防、降低疾病风险，延缓和/或减慢疾病的发展。
患者优选是人类患者。然而，实施方案也可应用于兽医应用，即非人患者，诸如非人哺乳动物，包括例如灵长类动物、猴、猿、牛、绵羊、猪、山羊、马、猫、狗、小鼠、大鼠和豚鼠。根据实施方案的抗体或其抗原结合片段、细胞、缀合物和/或药物组合物可根据各种途径向患者施用，所述各种途径包括例如静脉内、皮下、腹膜内、肌内或瘤内施用。
本发明还涉及鉴定IL13Rα2阳性细胞的方法。方法包括使生物样品与根据实施方案的抗体或其抗原结合片段接触并测量与生物样品的至少一种细胞结合的抗体或其抗原结合片段的量，从而将至少一种细胞鉴定为IL13Rα2阳性细胞。
在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含同位素，或者与如本文先前描述的可检测标记融合或连接(诸如使用生物素-亲和素或生物素-链霉亲和素连接)。
或者，可以使用流式细胞术(FCM)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来检测IL13Rα2阳性细胞。
实施例
本文的实施例描述了靶向IL13Rα2、用于嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法以治疗癌症的人单链抗体可变片段(scFv)的发展。
实施例1–1E10B9和mAb47 IgG向scFv的转化以及通过ELISA和HTRF的结合表征
一项文献研究揭示了两种现有的单克隆抗IL13Rα2，即1E10B9(美国专利第9,868,788号；Debinski等人,New agents for targeting of IL-13RA2 expressed in primaryhuman and canine brain tumors,PLoS One 2013,8(10):e77719))和mAb克隆47(mAb47)(美国专利第10,308,719号；Balyasnikova等人,Characterization andimmunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin(IL)-13receptorα2,J Biol Chem 2012,287(36):30215-30227；Kim等人,A novelsingle-chain antibody redirects adenovirus to IL13Rα2-expressing braintumors,Sci Rep 2015,5:18133)。这些都是通过杂交瘤技术生成的小鼠抗体。在1E10B9的情况下，合成了编码IL13Rα2的细胞外结构域的一部分、在人和犬序列之间具有100％同源性的肽片段，并将其用作免疫原。因此，所得的抗体1E10B9结合受体的人和犬直系同源物。通过使用受体的完整细胞外区域作为免疫原(IL13Rα2-Fc)来获得mAb47。报告的对人IL13Rα2的亲和力为KD＝1.4nM，并且观察到与人IL13Rα1或小鼠IL13Rα2的结合(Balyasnikova等人,Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibodytargeting interleukin(IL)-13receptorα2,J Biol Chem 2012,287(36):30215-30227)。此外，这种抗体与IL-13竞争结合IL13Rα2。
合成了编码1E10B9和mAb47的scFv蛋白的基因，在细菌中表达蛋白质，并且通过ELISA和均相时间分辨荧光(HTRF)测试与人IL13Rα2的结合。这些测定的结果表明，只有mAb47 scFv保留了其全长亲本IgG对应物的结合能力。
材料和方法：
基因合成
1E10B9和mAb47的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的序列分别从美国专利第9,868,788号和第10,308,719号获得。1E10B9的VH的前七个氨基酸不包括在专利中。为了创建完整的VH基因，根据IMGT数据库(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi)中的搜索，包括了最同源的小鼠VH基因的前七个氨基酸。通过经由甘氨酸-丝氨酸接头((Gly4Ser)3)将VH与VL融合，形成了编码对应的scFv构建体1E10B9 scFv(也称为X-ME107-B9，(SEQ ID NO:92))和mAb47 scFv(也称为X-ME107-47，(SEQ ID NO:93))的基因。
1E10B9 scFv(VH+接头+VL+3×FLAG+His×6)(SEQ ID NO:92)
QIQLVQSGPELKKPGETVKIYCKASGYSFRDYSVHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYVDEFKGRFAFFLEASANTVYLQISNLKNEDTATYFCDYRFTYWGQGTLVTVSAGGGGSGGGGSGGGGSEIVMTQTPLILSVTIGQPASISCKSSQSVLYSNGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCVQGSHFPYTFGGGTKLEIKAAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAAHHHHHH
mAb47 scFv(VH+接头+VL+3×FLAG+His×6)(SEQ ID NO:93)
QVQLQQPGAELVRPGASVKLSCKASGYTFSNYLMNWVKQRPEQDLDWIGRIDPYDGDIDYNQNFKDKAILTVDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARGYGTAYGVDYWGQGTSVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASESVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASRQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPWTFGGGTKLEIKAAADYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKAAAHHHHHH
1E10B9 scFv和mAb47 scFv的合成和亚克隆由GenScript(Piscataway,NJ,USA)执行。这些的密码子优化基于大肠杆菌(Escherichia coli)表达执行。合成后，使用限制酶SfiI和NotI将scFv基因克隆到pHAT-6载体(SciLifeLab,Stockholm,Sweden)中。pHAT-6载体在C末端为分泌的scFv提供三重FLAG标签和六组氨酸(His×6)标签。
将载体转化成Top10大肠杆菌，并通过测序(GATC,Germany)确认预期序列。
蛋白质表达
1E10B9 scFv和mAb47 scFv(每种scFv两个菌落)的小规模表达在96深孔板中进行。孵育过夜之后，将细菌离心，并且上清液用于ELISA和HTRF两者中的功能评估。
ELISA
在4℃下，将人IL13Rα2-avi(参见实施例A1)和阴性对照蛋白链霉亲和素以PBS中1μg/ml包被到384孔ELISA板中过夜。
将板用MilliQ水洗涤两次并在封闭缓冲液中封闭2小时(磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)，补充有0.5％牛血清白蛋白(BSA)+0.05％TWEEN
Figure BDA0003897597900000361
)。将存在于细菌上清液中的带有三重FLAG标签的scFv 1E10B9和mAb47在封闭缓冲液中以1:2、1:20和1:200稀释，并且允许结合。还包括对链霉亲和素具有特异性的测定对照scFv(G-strep-1)。通过HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)来检测结合，之后与1-step Ultra TMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)一起孵育。通过添加1M硫酸来停止比色信号发展，并在450nm处对板进行读数。一式两份测定所有样品。
均相时间分辨荧光(HTRF)
将1E10B9、mAb47和阳性测定对照scFv在测定缓冲液(补充有0.1％ BSA的PBS)中以1:5稀释，并且允许与人IL13Rα2-avi和非相关蛋白结合，两者均在测定缓冲液中稀释至200nM。通过供体分子铽缀合的抗FLAG抗体(Cisbio#611FG2TL)和受体分子链霉亲和素缀合的XL665(Cisbio#610SAXL)来检测结合。将板在室温下避光孵育2小时，之后在Envision光谱仪(Perkin Elmer)上在615nm处(背景/噪声信号)和665nm处(结合信号)进行分析。一式两份测定所有样品。
结果
从GenScript获得4μg编码1E10B9 scFv和mAb47 scFv的载体。这些的DNA测序验证了正确的序列。执行小规模表达，并且使用ELISA和HTRF分析这些与一小组抗原的结合。
这些分析的结果显示，mAb47 scFv识别人IL13Rα2(图1和2)。在ELISA和HTRF中，1E10B9 scFv均未对任何所包括的抗原产生可检测信号。
结论
成功合成了编码IL13Rα2特异性小鼠IgG抗体1E10B9和mAb47的VH和VL的scFv基因，并且将其克隆到pHAT6中，并且表达蛋白质，并且通过ELISA和HTRF分析结合。
mAb47 scFv显示保留与人IL13Rα2的结合，并且未检测到与阴性对照蛋白的结合。
然而，1E10B9 scFv未显示与人IL13Rα2的结合。这与其全长IgG对应物的报道相反(Kim等人,A novel single-chain antibody redirects adenovirus to IL13Rα2-expressing brain tumors,Sci Rep 2015,5:18133)。在抗体形式交替变化时失去抗原结合并不少见，尤其是从IgG到scFv时。影响抗原结合位点结构的蛋白质折叠改变最有可能可以解释这一点。
实施例2-使用噬菌体文库对人和小鼠IL13Rα2进行噬菌体展示选择
执行噬菌体展示选择以分离对人和小鼠IL13Rα2具有特异性的scFv片段。scFv选自两个不同的人类噬菌体文库(SciLifeLib 1和2)。通过ELISA对总共920个克隆进行的初步筛选导致将673个阳性克隆送去测序。这些中的304个的结果是具有序列唯一性。
材料和方法：
抗原
用作噬菌体展示选择的抗原的IL13Rα2的人和小鼠版本在表7中列出。
表7-IL13Rα2试剂
Figure BDA0003897597900000381
噬菌体展示选择
采用两个人类合成scFv噬菌体文库SciLifeLib1和SciLifeLib2(SciLifeLab,Stockholm,Sweden)使用四轮选择富集来执行生物淘选。SciLifeLib 1和2是幼稚的人类合成scFv文库，其设计和构建与先前报道的相似(
Figure BDA0003897597900000382
等人,Protein Eng Des Sel(2016)29:427-437)。简而言之，人类种系基因IGHV3-23和IGKV1-39用作文库支架，并且使用Kunkel诱变将多样性引入六个互补决定区(CDR)中的四个；即CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3和CDR-L3。对于生物素化样品(hIL13Rα2-avi)，使用链霉亲和素包被的磁珠(Dynabeads M-280,ThermoFisher Scientific,#11206D)来执行选择。类似地，使用蛋白G偶联的磁珠(Dynabeads,ThermoFisher Scientific,#10004D)来捕获Fc融合的mIL13Rα2-Fc。在其中两个轨道中，为了优先选择跨物种反应性scFv，抗原在不同轮次中在人和小鼠IL13Rα2之间交替变化。此外，在另外两个轨道中，人IL-13(Prospec#cyt-446)被包括在选择缓冲液中。通过逐渐减少抗原量和增加不同轮次之间的洗涤次数和强度来增加选择压力。使用胰蛋白酶-抑肽酶方法对抗原结合的噬菌体进行洗脱。整个选择过程，除了噬菌体-靶蛋白孵育步骤外，都是自动化的，并且使用Kingfisher Flex机器人执行。不同参数的组合导致了覆盖总共六个不同选择轨道的方案。
scFv的重新克隆和表达
为了允许产生可溶性scFv，从每个选择轨道的第三轮和第四轮中分离出噬菌粒DNA。在池中，编码scFv片段的基因被限制性内切酶消化并亚克隆到筛选载体pHAT-6中，在C末端提供scFv的分泌信号以及三重FLAG标签和六组氨酸(His6)标签。随后将构建体转化至TOP10大肠杆菌中。挑选单菌落，培养并且IPTG诱导以在96孔格式中表达可溶性scFv。总共制备了存在于细菌上清液中的920个scFv克隆用于初步ELISA筛选。
ELISA筛选
在4℃下将小鼠IL13Rα2-Fc以PBS中1μg/ml直接包被到384孔ELISA板中过夜，而在4℃下将人IL13Rα2-avi也以PBS中1μg/ml通过链霉亲和素间接包被过夜。还包被了两种阴性对照蛋白链霉亲和素和BSA。
将存在于细菌上清液中的带有FLAG标签的W-ME107 scFv克隆在封闭缓冲液(补充有0.5％ BSA+0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000391
的PBS)中以1:3稀释，并且允许与包被的蛋白质结合。通过HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)来检测结合，之后与TMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)一起孵育。通过添加1M硫酸来停止比色信号发展，并在450nm处对板进行读数。一式两份测定所有样品。还包括两种参考scFv，mAb47 scFv和G-strep-1scFv。
DNA测序
将673个显示与人和/或小鼠IL13Rα2的结合的阳性scFv克隆送去GATC Biotech(Ebersberg,Germany)进行Sanger DNA测序。
结果
使用SciLifeLib 1和2在人和/或小鼠IL13Rα2中平行进行总共六个选择轨道。在重新克隆所选择的scFv克隆后，从第3轮和第4轮选择中挑选出92个克隆(菌落)，导致总共挑选出920个克隆。
ELISA筛选导致鉴定出具有不同结合特性的673个潜在命中。大多数命中仅显示与人IL13Rα2的结合，剩余的命中显示与人和小鼠IL13Rα2的结合。
673个命中的DNA测序导致鉴定出304个序列唯一的W-ME107克隆。
结论
通过噬菌体展示选择成功地分离了与人和/或小鼠IL13Rα2结合的scFv克隆。在对920个克隆进行初始ELISA筛选和对673个阳性命中进行DNA测序之后，鉴定出总共304个序列唯一的scFv克隆。大多数克隆仅与人IL13Rα2结合，但一组显示与人和小鼠IL13Rα2均结合。
实施例3-通过ELISA和HTRF对304个序列唯一的scFv克隆进行二次筛选
为了有助于对304个序列唯一的scFv克隆进行进一步排序，对所有序列唯一的克隆执行了二次ELISA筛选和均相时间分辨荧光(HTRF)筛选。
这些分析证实了初始ELISA筛选(实施例2)的结果，并且基于结合特异性鉴定了两个主要的克隆组。一组仅与人IL13Rα2结合，而另一组含有与人和小鼠IL13Rα2均结合的克隆。
使用生成的ELISA和HTRF数据进一步减少克隆数量，从而产生160个scFv的列表。这160个克隆是基于两个主要标准选择的；1)在小鼠和人IL13Rα2上均显示高信号(跨物种反应)或2)在人IL13Rα2上表现出高信号和对非相关目标的低背景信号。
材料和方法：
ELISA
将人IL13Rα2-avi通过链霉亲和素间接包被到384孔ELISA板中，而将小鼠IL13Rα2-Fc和阴性对照蛋白链霉亲和素和非相关蛋白直接包被到孔中。表7中给出了本实施例中使用的IL13Rα2蛋白质的详细信息。
在4℃下包被板过夜后，将板用MilliQ水洗涤两次，并且在封闭缓冲液(补充有0.5％ BSA+0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000411
的PBS)中封闭2小时。将存在于细菌上清液中的带有三重FLAG标签的W-ME107 scFv克隆在封闭缓冲液中以1:10稀释，并且允许结合。通过HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)来检测结合，之后与1-step Ultra TMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)一起孵育。通过添加1M硫酸来停止比色信号发展，并在450nm处对板进行分析。
一式两份测定所有样品。还包括两个阳性对照mAb47 scFv和G-strep-1。
HTRF
将W-ME107 scFv克隆以及参考mAb47 scFv和G-strep-1scFv在测定缓冲液(补充有0.1％ BSA的PBS)中以1:5稀释，并且允许与在测定缓冲液中稀释至200nM的hIL13Rα2-avi或非相关抗原结合。通过供体分子铽缀合的抗FLAG抗体(Cisbio#611FG2TL)和受体分子链霉亲和素缀合的XL665(Cisbio#610SAXL)来检测结合。将板在室温下避光孵育2小时，之后在Envision光谱仪(Perkin Elmer)上在615nm处(背景/噪声信号)和665nm处(结合信号)进行分析。将665nm值除以615nm值以获得每个样品的R值。
一式两份测定所有样品。
结果
ELISA
基于结合特异性，可以将scFv克隆分为两个主要组。含有大多数scFv的第一组仅与人IL13Rα2结合，而属于第二组的克隆与人和小鼠IL13Rα2均结合。参考克隆mAb47 scFv仅显示与人IL13Rα2的结合。
HTRF
在基于FRET的均质溶液测定中，还分析了304个scFv克隆与人IL13Rα2的结合。同样在该测定中，绝大多数克隆显示出与人IL13Rα2的明显结合，与包括在测定中的阴性对照蛋白无显著结合。出乎意料的是，mAb47 scFv表现出非常低的结合信号。
结论
通过噬菌体展示选择成功地对304个序列唯一的scFv克隆执行了ELISA和HTRF筛选。基于所述结果，以及实施例4中对相同样品执行的Luminex测定的结果，选择了160个克隆用于进一步的SPR筛选。这160个克隆可以根据它们的结合特性分为两个子集；i)仅与人IL13Rα2结合的克隆和ii)与人和小鼠IL13Rα2均结合的克隆。
实施例4-通过Luminex评价304个scFv克隆的结合特异性
在本实施例中，在基于Luminex的方法中进一步评价了所有304个唯一的scFv克隆以及参考克隆mAb47 scFv的特异性。
此分析显示，304个克隆中的8个对若干种非相关蛋白表现出非特异性结合。剩余的296个克隆以及参考克隆mAb47表现出与其预期抗原人IL13Rα2的特异性结合。
连同本实施例4中呈现的
Figure BDA0003897597900000421
数据，使用实施例3中对相同样品生成的ELISA和HTRF数据进一步减少克隆数量，从而产生160个scFv的列表。除了在
Figure BDA0003897597900000422
中的良好表现之外，这160个克隆是基于两个主要标准选择的；1)在小鼠和人IL13Rα2上均显示高信号(跨物种反应)或2)在人IL13Rα2上表现出高信号和对非相关目标的低背景信号。
材料和方法：
将生物素化人IL13Rα2-avi和31种生物素化非相关蛋白单独地与特异性中性抗生物素蛋白偶联的Luminex珠ID缀合。缀合后，将所有珠ID混合并且与存在于细菌上清液中的、在测定缓冲液(补充有3％BSA、0.05％TWEEN
Figure BDA0003897597900000423
和10μg/ml中性抗生物素蛋白的PBS)中以1:10稀释的scFv克隆一起孵育。对于31种非相关蛋白中的每一种，包括至少一种阳性对照scFv。通过R-PE缀合的抗FLAG M2(Prozyme#PJ315)抗体来实现克隆与特定蛋白质缀合的珠的结合，之后在FlexMAP 3D仪器上进行分析。
一式两份测定所有样品，并且针对每个珠ID计算每个克隆对应于中值荧光强度(MFI)的所获得的结合信号的平均值。
结果
304个scFv克隆筛选中的296个表现出与人IL13Rα2的特异性结合。然而，八个克隆除了与人IL13Rα2结合外，还显示与若干种非相关蛋白结合。
值得注意的是，对于31种非相关蛋白中的每一种，测定了至少一种阳性对照scFv。如预期的那样，所有这些都与它们的同源抗原特异性相互作用。这确保了所有抗原都在功能上与它们相应的珠偶联。
结论
通过噬菌体展示选择成功地对304个序列唯一的scFv克隆执行了基于32重
Figure BDA0003897597900000431
的测定。只有八个scFv显示与包括在测定中的非相关蛋白的非特异性结合。剩余的296个克隆和参考克隆mAb47表现出与人IL13Rα2的特异性结合，与31种非相关蛋白中的任一种均无显著结合。
实施例5-SPR对160个序列唯一scFv的动力学筛选
选择来自实施例4的160个W-ME107 scFv克隆以及参考克隆mAb47 scFv用于在基于动力学筛选的方法中通过表面等离子体共振(SPR)进一步表征，以实现不同克隆的有效排序。
材料和方法
动力学筛选在
Figure BDA0003897597900000432
T200仪器(GE Healthcare)上执行。根据制造商的建议，将充当捕获配体的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#F1804)固定在CM5-S胺传感器芯片的所有四个表面上。
将存在于细菌上清液中的160个带有FLAG标签的W-ME107克隆注射并捕获到芯片表面，之后以50nM注射hIL13Rα2-avi、hIL13Rα2-Fc或mIL13Rα2-Fc。表8中给出了本研究中使用的IL13Rα2蛋白的详细信息。用10mM甘氨酸-HCl pH 2.2重新生成表面。所有实验均在25℃下在电泳缓冲液(补充有0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000433
的HBS,pH 7.5)中执行。
通过减去作为抗FLAG M2抗体固定表面的参考表面的响应曲线，获得所有scFv克隆的响应曲线传感图。使用
Figure BDA0003897597900000441
T200Evaluation 3.1软件分析数据。
表8-IL13Rα2试剂
Figure BDA0003897597900000442
结果
将抗FLAG M2抗体固定在CM5 S芯片的所有四个表面上，并获得所捕获的scFv克隆的类似的RU水平。在以50nM注射IL13Rα2后，使用低pH酸溶液成功地重新生成每个表面。
通过视觉检查传感图(未示出)来执行数据分析。从传感图可以清楚地看出，克隆可以基于结合特性分为三组；(i)与人IL13Rα2-avi和人IL13Rα2-Fc两者以及小鼠IL13Rα2-Fc结合的scFv克隆；(ii)与两种人IL13Rα2变体均结合但不显示与小鼠IL13Rα2-Fc的可测量结合的scFv；(iii)仅与人IL13Rα2-avi结合但不与人IL13Rα2-Fc结合、其中的一些还表现出与小鼠IL13Rα2-Fc的结合的scFv。
表9列出了160个scFv中的44个的结合模式。基于与人受体的结合，这组被认为是最有前景的。更具体地说，考虑了高结合反应和有利的慢解离速率。另外，包括了显示跨物种反应性的克隆。
表9–44个scFv与三种不同IL13Rα2蛋白构建体的结合
Figure BDA0003897597900000443
Figure BDA0003897597900000451
Figure BDA0003897597900000461
报告为“-”的值表示无法检测到结合
报告为“+”的值表示相对较低的结合反应
报告为“++”的值表示相对较高的结合反应，但解离速率快
报告为“+++”的值表示良好的结合反应和有利的慢解离速率
结论
动力学筛选产生了显示不同结合特性的克隆；(i)与人IL13Rα2-avi和Fc融合的人IL13Rα2(IL13Rα2-Fc)两者以及小鼠IL13Rα2-Fc结合的克隆、(ii)与两种人IL13Rα2变体均结合但不显示与小鼠IL13Rα2-Fc的可测量结合的克隆、和(iii)仅与人IL13Rα2-avi结合但不显示与人IL13Rα2-Fc的可检测结合、其中的一些还表现出与小鼠IL13Rα2-Fc的结合的克隆。生成的数据允许对不同克隆进行有效排序，并且允许将克隆列表从160个进一步减少到44个。
实施例6-44个scFv克隆的小规模蛋白质纯化和ELISA分析
基于实施例3至5中呈现的结果，选择44个克隆和参考克隆mAb47 scFv用于小规模蛋白质生产和纯化。
使用蛋白A偶联的或镍偶联的磁珠在Kingfisher Flex仪器上以96孔形式进行蛋白质纯化。所有44个W-ME107 scFv克隆都可以以令人满意的纯度和足够的蛋白质浓度进行纯化。然而，参考克隆mAb47 scFv表达较差，并从而表现出低纯度和浓度。
当通过ELISA分析时，大多数纯化的克隆表现出与其预期的抗原人和/或小鼠IL13Rα2的结合。
材料和方法：
生产和纯化
44+1个scFv克隆中的每一个在15ml大肠杆菌培养物中产生。在30℃下产生蛋白质18小时后，用B-PER试剂(ThermoFisher Scientific#78248)使细胞裂解，并且将W-ME107scFv克隆和参考克隆mAb47 scFv的澄清细菌裂解物分别与蛋白A偶联的磁珠(ThermoFisher Scientific#88846)或MagneHis Ni颗粒磁珠(Promega#V8548)混合，以在Kingfisher Flex仪器上实现纯化。使用Zeba 96孔旋转脱盐板(ThermoFisherScientific#89807)将洗脱的scFv克隆的缓冲液更换成PBS。
在还原条件下通过凝胶电泳来分析纯化的scFv克隆以确定纯度和完整性，并且根据制造商的建议(ThermoFisher Scientific#23227)通过标准BCA(二辛可宁酸)测定来确定蛋白质浓度。
ELISA
在37℃下，将人IL13Rα2-avi、人IL13Rα2-Fc和小鼠IL13Rα2-Fc以PBS中1μg/ml包被到384孔ELISA板中，持续45分钟。表8中给出了本实施例中使用的IL13Rα2蛋白的详细信息。还包被了三种阴性对照蛋白(链霉亲和素、BSA和非相关蛋白)。将带有FLAG标签的scFv在封闭缓冲液(补充有0.5％ BSA+0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000471
的PBS)中稀释至1μg/ml，并且允许与包被的蛋白质结合。通过HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)来检测结合，之后与TMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)一起孵育。通过添加1M硫酸来停止比色信号发展，并在450nm处对板进行读数。
一式两份测定所有样品，包括参考克隆mAb47 scFv和阳性测定对照G-Strep-1scFv(对链霉亲和素具有特异性)。
结果
生产和纯化
对于44个W-ME107 scFv，SDS-PAGE显示出令人满意的样品纯度，即一条与预期的scFv分子量(大约30kDa)相关的主要条带，并且没有或仅有一些来源于大肠杆菌的弱蛋白条带(图3)。
然而，参考克隆mAb47表现出较低的样品纯度，具有多条来源于大肠杆菌的蛋白质条带。此外，与凝胶上的所有其他条带相比，对应于其预期分子量的蛋白质条带非常弱，这表明此克隆的样品浓度较低。
通过标准BCA测定来确定纯化的scFv样品的蛋白质浓度。在足够的蛋白质浓度(范围为0.1mg/ml-0.6mg/ml)下纯化所有44个W-ME107 scFv克隆。
ELISA
绝大多数纯化的W-ME107 scFv克隆表现出与其预期抗原人和/或小鼠IL13Rα2的结合，并且与包被的阴性对照蛋白不结合或结合非常差。然而，有一些克隆表现出低抗原结合或无抗原结合。
结论
在Kingfisher flex仪器上小规模纯化了44个W-ME107 scFv克隆和参考克隆mAb47。参考克隆mAb47除外，所有scFv克隆均显示出令人满意的样品纯度和足够的蛋白质浓度。
当在基于ELISA的方法中进行测定时，大多数克隆表现出与其预期抗原人和/或小鼠IL13Rα2的结合。然而，一些克隆没有如预期的那样表现，具有低抗原结合或无抗原结合。
实施例7-通过ELISA研究44个scFv克隆与人IL13Rα1的结合
使用基于ELISA的方法测试了在实施例6中被选择用于小规模蛋白质纯化的44个克隆和参考克隆mAb47 scFv与人IL13Rα1的结合。
结果显示，所有W-ME107 scFv克隆都表现出与其预期抗原人和/或小鼠IL13Rα2的结合，不与人IL13Rα1显著结合。对于参考克隆mAb47 scFv获得了相同的结果。
材料和方法：
将包被蛋白hIL13Rα2-avi(实施例A1)、hIL13Rα2-Fc(RnD Systems#7147-IR)、mIL13Rα2-Fc(RnD Systems#539-IR)和hIL13Rα1-Fc(RnD Systems#146-IR)在PBS中稀释至1μg/ml，并且直接包被到384孔ELISA板中。还包被了两种阴性对照蛋白链霉亲和素和非相关蛋白。在4℃下将板与包被蛋白一起孵育过夜后，将板用MilliQ水洗涤两次，并且在封闭缓冲液(补充有0.5％ BSA+0.05％TWEEN
Figure BDA0003897597900000491
的PBS)中封闭2小时。将存在于细菌上清液中的带有三重FLAG标签的W-ME107 scFv克隆在封闭缓冲液中以1:10稀释，并且允许结合。通过HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)来检测结合，之后与1-step UltraTMB ELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)一起孵育。通过添加1M硫酸来停止比色信号发展，并在450mm处对板进行分析。
一式两份测定所有样品，包括参考克隆mAb47 scFv和阳性ELISA对照G-Strep-1scFv(对链霉亲和素具有特异性)。
结果
所测定的所有W-ME107 scFv克隆都表现出与其预期抗原人和/或小鼠IL13Rα2的结合，如先前报告的那样(实施例3和实施例5)(图4)。对于任何克隆，未检测到与人IL13Rα1或与阴性对照蛋白的显著结合。
参考克隆mAb47 scFv仅表现出与人IL13Rα2的结合，并且不与IL13Rα2或人IL13Rα1结合，并且阳性测定对照G-strep-1 scFv与链霉亲和素包被的孔结合。
结论
当从细菌上清液中测定时，对于44个W-ME107 scFv克隆中的任一个或对于参考克隆mAb47 scFv，未检测到与人IL13Rα1的显著结合(图4)。
与动力学筛选结果(实施例5)相反，这里的所有克隆都显示与两种人IL13Rα2蛋白(带有avi标签的和Fc融合的)的结合。相反，在实施例5中，44个克隆中的12个未显示与Fc融合的变体可测量结合。这种差异很可能可以通过两种方法的灵敏度差异以及实验设置来解释。在本实施例中，受体附着在表面上，而在实施例5和9中，受体在溶液中。受体的标签或融合蛋白的差异可能对抗原的行为具有很大影响，并且不同的表位可能在两个实验设置中以不同的方式表现。
与小鼠IL13Rα2的结合与先前的SPR数据(实施例5)充分相关，即，在亲和筛选中未显示与靶标的可测量结合的scFv在此实验设置中也被认为是“非结合剂”。
一些scFv对所有分析的蛋白质都显示出低信号(例如W-ME107-97、W-ME107-101、W-ME107-129、W-ME107-130、W-ME107-137、W-ME107-141、W-ME107-151、W-ME107-157)(图4)。
实施例8–细胞结合
评估所选择的scFv与表达IL13Rα2的细胞的结合，以确认与还在靶细胞表面上的受体的结合。
材料和方法
通过在室温(RT)(约20-25℃)下将100ng纯化的scFv(实施例6)与人胶质母细胞瘤细胞系U-87MG(具有验证的IL13Rα2表达的原始Uppsala University克隆，PMID:27582061)或人非小细胞肺癌细胞(A549)的1×105个细胞一起孵育20分钟来评估scFv与表达IL13Rα2的细胞的结合。人胶质母细胞瘤细胞系U-87MG内源性地表达高水平的人IL13Rα2(hIL13Rα2)，而人非小细胞肺癌细胞不表达hIL13Rα2。
洗涤(1X PBS,0.1％ BSA,3mM EDTA)后，使用PE缀合的抗FLAG抗体在室温下将FLAG标签染色20分钟。使用CytoFLEX流式细胞仪(Beckman coulter,CA)进行读数。
结果
将所选择的scFv与表达IL13Rα2的靶细胞一起孵育，以确认与还在靶细胞表面上的受体的结合。所有scFv与内源性地表达高水平hIL13Rα2的人胶质母细胞瘤细胞系U-87MG特异性结合，但不与阴性对照人非小细胞肺癌细胞(A549)结合(图5)。
结论
流式细胞术成功地评估了所选择的W-ME107克隆的细胞结合能力，并且所选择的W-ME107克隆对靶细胞系显示出不同的结合亲合力。在此结合测定中未观察到脱靶，即与非胶质瘤细胞的结合。
实施例9-SPR对11个W-ME107 scFv克隆的单循环动力学
对基于实施例5、7和8的结果选择的11个最有前景的W-ME107克隆和参考克隆mAb47 scFv执行使用单循环动力学方法的表面等离子体共振(SPR)分析，以分别确定它们对人IL13Rα2-avi、人IL13Rα2-Fc和小鼠IL13Rα2-Fc的动力学参数。
对获得的数据进行的分析显示，亲合力最高的结合克隆对人和小鼠IL13Rα2显示出低纳摩尔范围内的KD值。
材料和方法：
根据制造商的建议，在
Figure BDA0003897597900000511
T200仪器(GE Healthcare)上，将充当捕获配体的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#F1804)固定在CM5-S胺传感器芯片的所有四个表面上。
将蛋白A纯化的带有FLAG标签的W-ME107克隆各自注射并捕获到芯片表面上，旨在实现克隆之间的相等反应单位(RU)。然而，从细菌上清液中捕获到未纯化的参考克隆mAb47，因为蛋白质纯化导致产率太低(实施例6)。
在电泳缓冲液(补充有0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000512
的HBS，pH 7.5)中制备分别由五种1.2nM-100nM范围内的浓度组成的人IL13Rα2-avi、人IL13Rα2-Fc和小鼠IL13Rα2-Fc的三倍稀释系列，并且依次注射到芯片表面上。解离阶段之后，芯片表面用10mM甘氨酸-HCl,pH2.1重新生成。
通过减去作为抗FLAG M2抗体固定表面的参考表面的响应曲线，获得所有scFv克隆的响应曲线传感图。使用软件BIAeval 3.1版(GE Healthcare)分析数据，并假设1:1Langmuir结合模型计算动力学参数。
结果
数据显示，所有W-ME107克隆对人hIL13Rα2-avi的亲和力在低纳摩尔至纳摩尔的范围内，亲和力最高的结合克隆W-ME107-27的KD值为3.1nM(表10)。
除了四个克隆(W-ME107-112、W-ME107-117、W-ME107-128和W-ME107-156)之外，所有克隆还与小鼠版本的受体结合。这与实施例5中呈现的数据充分相关。
出乎意料的是，虽然所有分析的克隆都清楚地显示与hIL13Rα2-avi的结合，但只有大约一半显示与Fc融合的人构建体(hIL13Rα2-Fc)的结合。这一点通过W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-55、W-ME107-112、W-ME107-143和W-ME107-150举例说明，它们针对hIL13Rα2-avi显示出高反应(>50RU)，但对Fc融合的人构建体几乎没有任何反应。在动力学筛选分析期间也注意到了这一点(实施例5)。
参考克隆mAb47 scFv(存在于细菌上清液中)与人IL13Rα2-avi的结合亲和力KD(M)确定为1.1nM。
表10–W-ME107克隆和参考克隆mAb47的动力学参数
Figure BDA0003897597900000521
Figure BDA0003897597900000531
存在于细菌上清液中的克隆mAb47 scFv除外，所有scFv样品均作为纯化样品存在。报告为“--”的值表示无法确定结合参数。报告为“**”的值表示由于低结合反应(RU)而导致的不确定数据。
结论
在
Figure BDA0003897597900000532
T200仪器上成功地对11个W-ME107scFv克隆和参考克隆mAb47进行了单循环动力学方法。人IL13Rα2-avi、人IL13Rα2-Fc和小鼠IL13Rα2-Fc的每个克隆的获得的动力学参数分别与动力学筛选分析期间获得的估计的亲和力充分相关(实施例5)。亲和力最高的结合克隆W-ME107-27具有3.1nM的KD值。W-ME107-27也是对小鼠IL13Rα2-Fc表现出最高亲和力的克隆(KD＝2.4nM)。
出乎意料的是，在本实施例中，一些克隆显示出与hL13Rα2-avi的良好结合，但不与hIL13R2α2-Fc结合(W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-55、W-ME107-112、W-ME107-143和W-ME107-150)。尽管事实上包括在这些蛋白质构建体中的氨基酸几乎相同(表8)。然而，不同的表位可能在两种构建体中以不同的方式表现。例如，由Fc融合引起的二聚可能会导致一些表位的空间位阻。
实施例10–通过nanoDSF确定11个W-ME107 scFv克隆的Tm
在Prometheus NT.48仪器上通过nanoDSF对11个纯化的W-ME107scFv克隆进行解链温度Tm(℃)测量，以便评价稳定性。
材料和方法：
nanoDSF技术测量蛋白质在经受热变性时的内在荧光，从而表征蛋白质在天然条件下的展开。
将蛋白A纯化的W-ME107 scFv克隆(实施例6)在PBS中稀释至0.1mg/ml并通过毛细管力装入“高灵敏度”毛细管(NanoTemper#PR-C006)中，随后将其安装到Prometheus NT.48仪器中。解链温度斜坡设置在20℃和95℃之间，加热1℃/分钟。
在330nm和350nm处测量色氨酸发射，并将计算的比例与温度作图以获得每个克隆的解链曲线，可以使用软件PR.ThermoControl(NanoTemper Inc)从其中推导出Tm值。
结果
通过nanoDSF确定解链温度。表11呈现了11个scFv克隆中的每一个的Tm值(拐点)。
表11–解链温度(Tm)值
Figure BDA0003897597900000541
结论
可以确定所有11个W-ME107 scFv克隆的解链温度Tm(℃)。对于W-ME107-27和W-ME107-143除外的所有克隆，Tm值在预期范围内，大约60℃<Tm<70℃，W-ME107-27和W-ME107-143分别表现出55℃和57℃的略低Tm值。
此外，所有克隆都仅表现一次解链事件，W-ME107-7除外，其表现两次解链事件。这可能是由于含有色氨酸的污染物或W-ME107-7的异质混合物(存在折叠和错误折叠的群体)。
确定的Tm值可用作蛋白质稳定性测量，并且获得的数据表明，与包括在此分析中的其他scFv克隆相比，克隆W-ME107-27和W-ME107-143的稳定性较低。
实施例11-SPR对W-ME107 scFv与IL13Rα2的结合的IL13抑制
使用基于SPR的方法分析了十二个W-ME107 scFv克隆和参考克隆mAb47 scFv与IL13竞争结合受体的能力。
将每个W-ME107克隆捕获到抗FLAG M2抗体固定的SPR芯片表面上，并允许与IL13α2受体本身以及与IL-13一起预孵育的IL13Rα2结合。
发现十二个克隆中的七个，W-ME107-7、W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-55、W-ME107-67、W-ME107-112、W-ME107-150，显示与IL-13竞争结合受体。在这里，一些克隆表现出与存在的IL-13的结合几乎完全丧失，而一些克隆仅表现出与受体的结合的部分丧失。克隆与和阴性对照蛋白一起预孵育的IL13Rα2的结合不可以阻断受体结合。这些发现表明，这七个克隆具有与受体上的IL-13的配体结合位点重叠或接近的结合表位。
不受IL-13存在影响的五个克隆，即W-ME107-16、W-ME107-75、W-ME107-117、W-ME107-128和W-ME107-156，结合与IL13Rα2的IL-13结合位点不同的表位。
参考克隆mAb 47scFv在此实验中未表现出结合活性，因此无法获得数据。然而，文献中已经报道，此抗体与IL-13竞争结合IL13Rα2(Balyasnikova等人,Characterizationand immunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin(IL)-13receptorα2,J Biol Chem 2012,287(36):30215-30227)。
材料和方法：
根据制造商的建议，在
Figure BDA0003897597900000551
T200仪器(GE Healthcare)上，通过ECD/NHS化学将充当捕获配体的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#F1804)固定在CM5-S胺传感器芯片的所有四个表面上。
将蛋白A纯化的、带有FLAG标记的十二个W-ME107克隆(实施例6)、阳性参考克隆mAb47和阴性对照G-strep-1scFv(对链霉亲和素具有特异性)注射并捕获到芯片表面上，之后注射100nM hIL13Rα2-avi(实施例A1)、100nM hIL13Rα2-avi+200nM IL13(Prospec#cyt-446)、100nM IL13Rα2-avi+200nM链霉亲和素(Sigma-Aldrich#SA4762)或200nM链霉亲和素。用10mM甘氨酸-HCl pH 2.1重新生成表面。所有实验均在25℃下在补充有0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000561
的HBS,pH 7.5中执行。
通过减去作为抗FLAG M2抗体固定表面的参考表面的响应曲线，获得所有scFv克隆的响应曲线传感图。
结果
成功地将抗FLAG M2抗体固定在CM5系列S芯片的所有四个表面上。在scFv克隆捕获和抗原注射后，通过低pH成功地重新生成芯片表面。
所有12个W-ME107 scFv克隆都表现出与hIL13Rα2以及与和阴性对照链霉亲和素一起预孵育的hIL13Rα2的结合。此外，没有克隆表现出与单独的链霉亲和素结合。
当测试克隆与和IL-13一起预孵育的hIL13Rα2的结合时，只有五个克隆(W-ME107-16、W-ME107-75、W-ME107-117、W-ME107-128和W-ME107-156)显示与受体-配体复合物的保留结合(图6)。对于剩余的七个克隆(W-ME107-7、W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-55、W-ME107-67、W-ME107-112和W-ME107-150)，结合可能被存在的IL-13或多或少地完全阻断，这表示为反应单位(RU)的减少(图6)。
无法观察到参考克隆mAb47 scFv的结合活性。如预期的那样，阴性对照G-strep-1scFv仅表现出与和链霉亲和素一起预孵育的hIL13Rα2以及单独的链霉亲和素的结合。
结论
结果显示，当IL-13存在时，12个W-ME107 scFv克隆中的7个无法与hIL13Rα2受体结合。这些结果表明，这些克隆具有与受体上的IL-13的配体结合位点重叠或接近的结合表位。当IL-13与受体结合时，剩余的五个克隆也能够与hIL13Rα2结合。
在先前执行的动力学测量中(实施例5和实施例9)，所有显示与IL-13结合竞争的克隆也没有或很少表现出与Fc融合的人IL13Rα2构建体(hIL13Rα2-Fc,RnD systems#7147-IR)的可检测结合。
实施例12-使用克隆mAb47 mIgG1的表位分箱实验
购买全长抗体克隆mAb47 mIgG1，并且在基于SPR的表位分箱方法中进行分析。此外，确定了其对人IL13Rα2的动力学常数。
克隆mAb47 mIgG1表现出对人IL13Rα2的亚纳摩尔范围内的、定义为平衡解离常数(KD(M))的亲和力，KD＝0.9nM。
此外，表位分箱数据显示，克隆mAb47 mIgG1与IL-13、W-ME107-10scFv和W-ME107-27 scFv竞争或干扰它们与人IL13Rα2的结合。这表明它们全部在受体上具有重叠的表位、或接近的表位。数据还显示，W-ME107-75 scFv和W-ME107-117 scFv不干扰克隆mAb47mIgG1与人IL13Rα2的结合，因此表明它们具有单独的非重叠表位。
材料和方法：
单循环动力学，SCK
将参考克隆mAb47 mIgG1(Creative Biolabs#NEUT-1190QC)在10nM NaAc pH 4.0中稀释至50μg/ml，并且根据制造商的建议通过NHS/EDC化学固定到CM5系列S芯片上。将由50nM至0.2nM范围内的5个浓度组成的人IL13Rα2-avi的4倍稀释系列依次注射到芯片表面上。
用空白参考表面传感图(未固定配体)减去结合传感图并安装到1:1Langmuir结合模型以获得动力学参数ka(M-1s-1)、kd(s-1)和KD(M)。
表位分箱
将10nM hIL13Rα2-avi注射到单独的或与十倍摩尔过量(100nM)的人IL13(Prospec#cyt-446)或W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-75、W-ME107-117 scFv克隆一起预孵育的固定克隆mAb47mIgG1表面上。作为对照样品，还评估了与10倍摩尔过量的BI-8scFv(阴性对照)或克隆mAb47 mIgG1(阳性对照)一起预孵育的10nM hIL13Rα2-avi。在缔合阶段和解离阶段之后，使用10nM甘氨酸HCl,pH 2.1重新生成芯片表面。用空白参考表面传感图(未固定抗体)减去结合传感图，并且可以获得每个样品的结合水平、反应单位(RU)。
结果
使用pH 2.1的10nM甘氨酸-HCl重新生成之后，使用具有保留活性的NHS/EDC化学将克隆mAb47 mIgG1成功固定到CM5系列S芯片上。
克隆mAb47 mIgG1对hIL13Rα2的亲和力被确定在亚纳摩尔范围内，KD值为0.9nM。观察到的缔合速率常数(ka)和解离速率常数(kd)分别确定为5.9×105M-1s-1和5.4×10-4s-1。
表位分箱显示，当hIL13Rα2分别与十倍摩尔过量的人IL-13、W-ME107-10 scFv、W-ME107-27 scFv或阳性对照克隆mAb47 mIgG1一起预孵育，之后注射到克隆mAb47 mIgG1固定表面上时，观察到的结合反应(RU，y轴)与单独注射hIL13Rα2相比降低(图7)。在W-ME107-75 scFv、W-ME107-117 scFv和阴性对照BI-8scFv中未观察到这一点，其中结合反应或多或少等于单独注射hIL13Rα2(图7)。
结论
参考克隆mAb47 mIgG1对人IL13Rα2的亲和力被确定在亚纳摩尔范围内(KD值为0.9nM)。
表位分箱结果显示，W-ME107-10和W-ME107-27以及人IL-13与参考克隆mAb47mIgG1竞争结合hIL13Rα2受体。
表位分箱分析的结果与先前对W-ME107 scFv克隆执行的SPR分析(实施例11)充分相关。本实施例显示，W-ME107-10 scFv和W-ME107-27 scFv与人IL-13竞争结合hIL13Rα2，而W-ME107-75和W-ME107-117没有。
总之，实施例11和12中的结果显示，W-ME107-10和W-ME107-27以及参考克隆mAb47与人IL13α2受体上的人IL-13结合位点结合或相邻，而W-ME107-75和W-ME107-117没有。Balyasnikova等人,Characterization and immunotherapeutic implications for anovel antibody targeting interleukin(IL)-13receptorα2,J Biol Chem2012,287(36):30215-30227也提出了IL-13和克隆mAb47的重叠表位，其中他们使用基于板的竞争测定显示了此抗体对人可溶性IL-13和hIL13Rα2之间的相互作用的显著抑制。
实施例13–HDX-MS的表位作图实验
当蛋白质溶解在含有重水(D2O)的缓冲液中时，它们与杂原子(例如，-OH、-NH、-SH)连接的氢被氘替换。在氢氘交换质谱(HDX-MS)中，氘并入的速度与肽骨架酰胺基团(-NHCO-)的分子内氢键合的程度相关。已经参与氢键合的骨架酰胺-NH氢，例如位于α-螺旋或β-折叠处的-NHCO-氢，比可用于与受体共享其氢的那些NH氢交换得更慢。因此，位于无序区域的骨架酰胺H将比参与β-折叠或α-螺旋的那些氢交换得更快。
现在，由于配体与蛋白质靶标的结合产生氢键合的局部变化(例如，结构稳定或不稳定)，因此这种技术可以用于鉴定蛋白质复合物的结合界面。对于大多数氢，H/D交换是短暂的，并且一旦多肽链与含水溶液接触，作为-OD、-SD并入的氘核就再次被氢替换。这种现象被称为“反向交换”，并且它对于与位于氨基酸残基侧链的杂原子结合的氘核非常快。幸运的是，在酸性条件下(pH-2.3)和在接近零℃的温度下，肽骨架酰胺基团(-NDCO-)处的反向交换减慢到与液相色谱法-质谱联用(LC-MS)的分析相容的时间窗。以这种方式，可以通过MS监测并入程度，因为每个D原子比H原子重一个质量单位。此外，当氘标记进一步与酶促蛋白水解组合时，可以监测蛋白质内不同区域的氘化谱。
材料和方法
通过将3μL的人IL13Rα2-avi(参见实施例A1)(1.6mg/mL)与24μL的氘化PBS混合来制备对照样品(单独的IL13Rα2)。抗原/scFv复合物如下制备：使用每个scFv 30kDa的平均分子量，将40μL的hIL13Rα2-avi(1.6mg/mL)与34.5μL的W-ME107-117 scFv(1.46mg/mL)、74μL的W-ME107-10 scFv(0.68mg/mL)、57.2μL W-ME107-27 scFv(0.88mg/mL)和122.8μL W-ME107-75 scFv(0.41mg/mL)混合，达到1:1的抗原/scFv摩尔比。使用10kDa蛋白质浓缩器Amicon Ultra 0.5mL将复合物浓缩至最初的40μL。通过将3μL的抗原/scFv复合物与24μL的氘化PBS混合4分钟、10分钟和60分钟来进行标记反应(一式三份进行，W-ME107-27和W-ME107-75的4分钟孵育除外，其以一式两份进行)。孵育后，通过将pH降低至约2.3并且将温度降低至约4℃、通过添加25μL含有6M尿素、100mM TCEP和0.5％ TFA的溶液来淬灭反应。
样品在自动化HDX-MS系统(CTC PAL/Biomotif HDX)中进行分析，样品在所述系统中在2℃下自动标记、淬灭、消化、清洗和分离。使用固定的胃蛋白酶柱(2.1×30mm)以60μL/分钟消化样品2分钟，之后使用0.1％甲酸、使用2mm I.D×10mm长的C-18前置柱(ACE HPLCColumns,Aberdeen,UK)以400μl/分钟进行在线脱盐步骤，持续1分钟。然后使用以60μL/分钟运行的2mm I.D×50mm长的HALO C18/1.8μm分析柱在0.1％甲酸中通过18分钟的ACN的8％-55％线性梯度来分离胃酶肽。使用以m/z 400、120,000分辨率运行的LTQ EliteOrbitrap质谱仪(Thermo Fisher Scientific)来执行所有实验。
所有HDX-MS数据均由HDExaminer 2.5.1.Mascot版本处理，其用于在专用数据库中进行肽鉴定，使用10ppm前体耐受性、0.05Da MS/MS质量误差。
结果
在本HDX-MS实验中，在两种不同的实验条件下使用氘化缓冲液用氘标记IL13Rα2。一组实验使用单独的IL13Rα2，而另一组实验中的IL13Rα2在等摩尔浓度的W-ME107-117scFv的存在下被标记。标记后停止反应，并且通过蛋白水解酶消化蛋白质。在随后的步骤中，通过液相色谱法-质谱联用(LC-MS)测量来源于IL13Rα2消化物的每种氘化肽的单独质量。在这些实验条件下，单独的IL13Rα2和存在W-ME107-117 scFv之间的氘并入的差异可完全归因于由W-ME107-117scFv的结合引起的氘并入的变化。现在，由于本领域中众所周知，抗体产生抗原/抗体界面(表位)处的氘并入的降低，因此确定这两个实验条件之间的氘并入的差异，并且作图成IL13Rα2与IL-13的3维(3D)结构(PDB 3LB6,Lupardus等人,Structure(2010)18:332-342)，以便确定表位的位置。如果在单独IL13Rα2和存在W-ME107-117 scFv之间具有统计学意义差异(t-学生测试，每个实验条件3个重复份，并且99％置信区间，p<0.01)的、来源于IL13Rα2的肽簇集成15至20埃格斯特朗的区域并且显示出足够的溶剂暴露以允许与scFv正确结合，则对它们进行鉴定并指定属于表位。
以下肽被鉴定为W-ME107-117 scFv的表位：对应于位置67-81的氨基酸序列VEYELKYRNIGSETW(SEQ ID NO:44)；对应于位置96-106的氨基酸序列DLNKGIEAKIH(SEQ IDNO:45)；和对应于位置123-128的氨基酸序列WAETTY(SEQ ID NO:46)(图8和表12和13)。这三个序列作图到IL13Rα2的结构域1，并且是这个β夹心结构域的第二个β折叠的一部分。表位区域更具体地由相邻的β链3、6和7、β链3之后的环、以及β链6之前的环组成(图10)。这两个环都指向受体的结构域2。表位区域形成连续的表面区域，所述表面区域与通常在抗原/抗体界面见到的那些匹配。从β折叠中突出的氨基酸主要是大氨基酸(Trp、Lys、His和Glu)，它们提供了若干带电基团以与抗体潜在的氢键合。这些残基在已发表的结构中具有限定的电子密度，并且见到彼此形成堆叠相互作用。表位区域位于结构域1的不与IL-13相互作用的一侧。
表12-在单独IL13Rα2和存在W-ME107-117之间存在统计学意义差异的区域的总结(p<0.001)
Figure BDA0003897597900000611
表13–图8中示出的肽的列表
肽编号 起始aa 终止aa 肽编号 起始aa 终止aa
1 29 37 38 174 183
2 29 38 39 185 204
3 29 39 40 187 199
4 30 37 41 187 202
5 30 39 42 187 204
6 38 46 43 187 206
7 38 48 44 188 206
8 39 48 45 200 206
9 39 49 46 203 210
10 40 49 47 204 210
11 50 64 48 205 210
12 52 62 49 205 211
13 63 68 50 207 211
14 63 69 51 228 232
15 67 80 52 228 233
16 69 80 53 228 243
17 70 80 54 228 245
18 71 80 55 229 243
19 74 80 56 230 243
20 81 95 57 232 245
21 81 96 58 232 246
22 81 102 59 234 243
23 90 95 60 235 243
24 96 102 61 235 245
25 96 109 62 235 246
26 103 109 63 246 253
27 123 128 64 253 269
28 146 154 65 270 275
29 163 171 66 274 283
30 165 171 67 274 285
31 165 172 68 276 283
32 172 179 69 284 292
33 172 183 70 323 333
34 173 181 71 323 337
35 173 183 72 338 352
36 173 184 73 339 352
37 173 186 74 341 352
作图到克隆W-ME107-10、W-ME107-27和W-ME107-75的肽以不同的组合重叠，并且都位于结构域3上，从结构域2起始的一种肽除外。肽在图14中突出显示，起始和终止氨基酸用数字标记(图14A)。W-ME107-10的HDX-MS给出下列两种肽：对应于氨基酸编号228-245的FTFQLQNIVKPLPPVYLT(SEQ ID NO:43)和对应于氨基酸编号253-271的EIKLKWSIPLGPIPARCFD(SEQ ID NO:36)。W-ME107-27的结果给出了相同的两种肽，其中添加了对应于氨基酸编号323-337的肽SEWSDKQCWGLNDIF(SEQ ID NO:23)，并且其中残基332-337来自重组蛋白的亲和标签。作图到W-ME107-75的表位由与上文提到的相同的氨基酸编号253-271和323-337的两种肽组成。
将这三种不同的肽作图到3维结构显示，它们全部簇集在IL13Rα2的C末端区域。克隆W-ME107-10和W-ME107-27都具有肽228-245。这种肽从结构域2起始并且持续到结构域3。接近肽Gln231、Gln233和Asn234的开头接近IL-13的结合位点(图14E)，即使没见到任何所述残基在结构中相互作用。对IL13Rα2结构的分析表明，scFv很难与这些残基相互作用并且同时与上文提到的其他肽相互作用。IL13Rα2的构象变化可解释HDX-MS结果中包括这些残基。
克隆W-ME107-75在其表位中缺少肽228-245，并且被发现不与IL-13结合竞争，而其他两个克隆则竞争。肽253-271与228-245相邻并且朝向IL-13结合位点，Arg268与配体形成键。所有三个克隆在表位作图中共享这种肽。然而，由于W-ME107-75的结合谱不同，这种scFv似乎将不太可能以与W-ME107-10和W-ME107-27相同的方式结合肽253-271，而是在肽253-271的开头结合更多(图14D)。
肽323-337是受体的非常C末端部分，并且位于228-245的对侧。蛋白质数据库(PDB)中公布的结构在残基329处终止，并且无法说明C末端部分在何处继续。这很可能是结构的柔性区域。查看来自实施例5和9的不同scFv如何结合小鼠IL13Rα2的数据，然后研究保守残基在结构中的位置，给出了更多关于为什么W-ME107-75与W-ME107-10和W-ME107-27不同的想法。在小鼠和人IL13Rα2中存在保守残基的条带，其沿着结构域3的顶部延伸并且由残基237-241、263-269和323-326组成。W-ME107-27被认为与W-ME107-10一样结合此区域，但缺乏与肽323-326的相互作用(图14B和14C)。另一方面，W-ME107-75与此保守区域的结合不多，而是与氨基酸残基253-266和非常C末端残基332-337结合。这意味着与W-ME107-10和W-ME107-27相比，在结构域3下方更远的区域。
此外，HDX-MS表位作图研究的结果与实施例12的数据充分相关，并且小鼠和人的序列比对分析与实施例5和9的与scFv的结合和非结合数据充分相关。克隆W-ME107-117作图到受体的一个远离IL-13结合位点的区域。克隆W-ME107-10、W-ME107-27和W-ME107-75全部作图到hIL13Rα2上的相似区域，但W-ME107-10和W-ME107-27具有一种共同的肽，W-ME107-75中缺乏所述肽。这种肽具有与IL-13配体的结合位点重叠的小区域。这三种scFv如何结合小鼠受体以及保守残基的位置的差异还可以帮助更多地查明不同的表位。
实施例14–使用肽阵列对scFv进行表位作图
W-ME107-10、W-ME107-27、W-ME107-75和W-ME107-117 scFv克隆在人IL13Rα2上的表位作图表明，受体的两个不同部分作为四个克隆的表位(实施例13)。W-ME107-10、W-ME107-27和W-ME117-75似乎与结构域3上的相似或重叠区域结合，而W-ME107-117与结构域1上的不同表位结合。克隆W-ME107-117的HDX-MS作图的初步结果导致若干种不同的肽分布在结构域1的两侧。为了缩小表位范围，合成了15个aa(氨基酸)长肽，其中1个氨基酸移位，覆盖IL13Rα2上的氨基酸39-102，并且在基于ELISA的方法中进行测定。
未检测到W-ME107-117 scFv与包括在阵列中的60种肽中的任一种的结合。只能检测到与覆盖整个细胞外结构域的蛋白质构建体的结合。这加强了实施例13中的发现，其中显示W-ME107-117 scFv在IL13Rα2受体中具有构象表位而不是线性肽表位。
材料和方法
由JPT Peptide Technologies(Germany)订购并合成六十种N末端生物素化肽，其表示IL13Rα2的一段74个氨基酸(氨基酸39-102)。到达后，将肽溶解在无菌DMSO(二甲基亚砜)中，最终浓度为0.5mg/ml。
在4℃下，用PBS中的1μg/ml链霉亲和素和1μg/ml hIL13Rα2-Fc包被384孔ELISA板过夜。洗涤和在封闭缓冲液(补充有0.5％BSA和0.05％ TWEEN
Figure BDA0003897597900000651
的PBS)中封闭板后，允许分别在封闭缓冲液中稀释至0.25μg/ml和1μg/ml的生物素化肽和生物素化形式的IL13Rα2ECD(hIL13Rα2-avi)结合30分钟。将纯化的W-ME107-117和W-ME107-75在封闭缓冲液中稀释至1μg/ml并且允许结合1小时。
通过HRP缀合的抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich#A8592)来检测结合。通过添加TMBELISA底物(ThermoFisher Scientific#34029)来开始结合信号发展，并通过添加1M硫酸来终止。在450nm处对板进行分析。
每个样品一式两份进行测定，在已经减去空白孔值后从所述样品中得到平均吸光度值。
结果
未检测到W-ME107-117 scFv与包括在阵列中的肽中的任一种的结合。仅检测到与hIL13Rα2-avi和hIL13Rα2-Fc的结合(图9)。如预期的那样，具有在肽阵列内不表示的表位的W-ME107-75 scFv仅表现出与IL13Rα2的ECD结构域的结合。使用10倍更高浓度的肽重复所述实验，结果相同。
结论
W-ME107-117 scFv的表位作图研究表明了位于IL13Rα2的对侧上的表位，从所述对侧处发现了W-ME107-10、W-ME107-27和W-ME107-75 scFv克隆的表位。图10中描绘的结构显示，W-ME107-117结合由三条β链(β链)组成的IL13Rα2的一部分，所述β链由折叠成单个β折叠(β折叠)结构域的环状区连接。包括在表位中的β折叠和两个环不在结合配体IL-13的IL13Rα2的一部分中。因此，W-ME107-117不干扰配体结合。与肽阵列的结合的不存在以及实施例12的结果加强了实施例13的结果，其中发现W-ME107-117具有构象表位。
实施例15–慢病毒构建和T细胞工程改造
本实施例基于所选择的scFv构建嵌合抗原受体(CAR)T细胞，并且在靶细胞杀伤测定中测试CAR T细胞。
材料和方法
用于T细胞转导的病毒载体构建
将所选择的scFv并入第二代CAR构建体中，所述构建体含有来自CD137(4-1BB)的共刺激结构域和来自CD3ζ的刺激结构域。在延伸因子1α(EF1α)启动子的控制下，将CAR盒克隆到第三代自灭活(SIN)慢病毒载体(SBI,System Biosciences,Mountain View,CA)中(图11)。绿色荧光蛋白(GFP)在CAR盒之后并入，并通过自切割T2A序列分离。所有重组序列均从Genscript(Piscataway,NJ)商购获得。使用构建的CAR慢病毒质粒和对应的辅助质粒通过瞬时转染293T细胞来执行病毒颗粒的生产。收获含有病毒颗粒的上清液，超速离心，然后用于实验。
T细胞工程改造
使用OKT-3(50ng/ml,BioLegend San Diego,CA)和IL-2(100IU/ml,Proleukin,Novartis,Basel,Switzerland)以2×106个细胞/毫升的浓度激活人外周血单核细胞(PBMC)3天。激活后，将T细胞(2×106个细胞)重悬在30μl浓缩慢病毒以及10mg/ml硫酸鱼精蛋白(Sigma-Aldrich,St Louis,Mo)和IL-2(100IU)中，并且在37℃下孵育4小时。在第二天以类似的方式转导T细胞，并重悬在最终浓度为100IU/ml IL-2的培养基(补充有10％ FBS、1％ PeSt、1％丙酮酸钠的RPMI1640)中。7天后，通过基于GFP表达(BD FACSAriaIII,BDBioscience,San Jose,CA)的分选来富集CAR T细胞。根据制造商的方案，使用immunocult试剂(STEMCELL Technologies,Vancouver,CA)扩增分选的细胞。
杀伤测定
天然表达hIL13Rα2的人胶质母细胞瘤细胞系U-87MG和不表达hIL13Rα2的黑色素瘤细胞系Mel526首先用慢病毒质粒进行修饰以表达萤火虫荧光素酶，以便使用荧光素酶信号作为细胞活力和对CAR T细胞的暴露的读出信号。这些靶细胞以0、0.2、1、5或25个效应细胞(CAR T细胞):1个靶细胞(肿瘤细胞)的CAR T细胞/靶细胞比与CAR工程改造的T细胞共培养24小时。本实施例中使用了CAR T细胞和阴性对照(靶向CD19的CAR T细胞)。萤火虫萤光素酶活性用作靶细胞活力的量度并使用ONE-Glo萤光素酶测定系统(Promega Biotech AB,Sweden)来测量。
结果
测试的所有CAR T细胞构建体特异性杀伤表达hIL13Rα2的胶质母细胞瘤细胞(U-87MG)，但不杀伤抗原阴性黑色素瘤细胞(Mel526)(图12)。如预期的那样，阴性对照(靶向CD19的CAR T细胞)不杀伤任何癌细胞系，因为癌细胞系均不表达CD19(图12)。
分别基于W-ME107-10 scFv、W-ME107-75 scFv和W-ME107-117scFv的W-ME107-10CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞已经在低效应细胞/靶细胞比下表现出显著的细胞毒性能力。另一方面，基于W-ME107-27 scFv和W-ME107-55 scFv的W-ME107-27CAR和W-ME107-55 CAR T细胞仅在较高的效应细胞/靶细胞比下表现出杀伤(图12)。基于已发表的mAb47 scFv(J Biol Chem 2012,287:30215–30227,Mol Ther 2016,24(2):354-363)产生的参考X-ME107-47(mAb47)CAR T细胞仅显示边缘靶细胞杀伤。
实施例16–增殖测定
本实施例研究了各种CAR T细胞在与靶细胞共培养时的增殖能力。
材料和方法
产生的CAR T细胞用CellTrace紫色标记(ThermoFisher)标记，以便在遇到抗原阳性靶细胞时跟踪细胞增殖。带有CellTrace紫色标记的T细胞要么未刺激，要么与靶U-87MG细胞共培养(1:1比例)。培养物要么未经处理，要么用10μM洛伐他汀(Sigma-Aldrich，作为对照防止T细胞增殖)处理4天，之后通过流式细胞术(BD FACSCantoII,BD Bioscience)进行分析。在直方图(峰模式)中见到的紫色染料的稀释被视为细胞增殖。
结果
大约一半的W-ME107-55 CAR和W-ME107-27 CAR T细胞在与肿瘤细胞共培养时分裂。引人注目的是，几乎所有的W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞在遇到靶细胞时分裂两次或更多次(图13)。参考mAb47(X-ME107-47)CAR T细胞在与靶肿瘤细胞共培养时也增殖，但考虑到只有一半的mAb47 CAR T细胞分裂两次或更多次，参考CAR T细胞的增殖小于W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞。如预期的那样，靶向CD19的CAR T细胞在和U-87MG细胞一起的培养中不增殖。W-ME107-10CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞全部在靶细胞识别后表现出高增殖能力。结果显示，W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞，但不是参考mAb47 CAR T细胞，能够与靶细胞有效相互作用并从而能够实现高增殖能力。
实施例17–CAR T细胞谱分析和表征
本实施例研究并表征了具有细胞因子释放谱、表面标志物表达和CAR表达状态的CAR T细胞。
材料和方法
使用如实施例15中所述的慢病毒构建体对人CAR T细胞进行工程改造。细胞要么在补充有IL-2(25IU/mL)的细胞培养基中培养直到分析，要么使用PBMC的3种供体作为刺激用快速扩增方案进行扩增，之后进行分析。
来自未刺激的CAR T细胞的IFN-γ分泌
使用慢病毒载体对模拟(作为对照)、W-ME107-55 CAR、W-ME107-27 CAR、W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117CAR T细胞进行工程改造，并且在标准T细胞培养基中培养(实施例15)。在慢病毒转导后的第7天，将CAR T细胞(200μL细胞培养基中2×105个细胞/孔)接种到96孔板中，并且在收获上清液之前另外培养1天。由CAR T细胞分泌到细胞培养上清液中的IFN-γ通过ELISA(Mabtech,Sweden)进行量化。
来自肿瘤刺激的CAR T细胞的IFN-γ分泌
使用慢病毒载体对模拟(作为对照)、W-ME107-55 CAR、W-ME107-27 CAR、W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117CAR T细胞进行工程改造(实施例15)，并且使用快速扩增方案进行扩增。扩增后，将CAR T细胞在补充有IL-2(25IU/mL)的细胞培养基中静置3天，并且将CAR T细胞和U87UU或U343MG肿瘤细胞以各种比例一起接种到96孔板中，并且在收集上清液之前另外培养2天。分泌到细胞培养上清液中的IFN-γ通过ELISA(Mabtech,Sweden)进行量化。
细胞表面上的CAR表达水平
使用慢病毒载体对模拟(作为对照)、W-ME107-55 CAR、W-ME107-27 CAR、W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117CAR T细胞进行工程改造，并且在标准T细胞培养基中培养(实施例15)。在慢病毒转导后第3、6和12天，对CAR T细胞进行CD3、CAR染色(使用抗人Ig(H+L)抗体)，并使用流式细胞仪进行分析。对于每种CAR T细胞，CAR表达水平随时间的变化呈现为直方图。
肿瘤刺激前后CAR T细胞表面激活标志物的表达
使用慢病毒载体对模拟(作为对照)、W-ME107-27 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞进行工程改造(实施例15)，并且使用快速扩增方案进行扩增。测定前，将工程改造CAR T细胞在补充有IL-2(25IU/mL)的细胞培养基中静置3天。将静置的CAR T细胞直接接种到96孔板中，单独培养并分析；或者与U87UU肿瘤细胞共培养1天。在流式细胞术中分析之前，对CART细胞进行PD-1、TIM-3、LAG-3、CD69、CD25和CD3染色。数据呈现为CAR T细胞中特异性标志物阳性细胞的百分比(门控为CD3阳性和GFP阳性细胞)。
结果
在用慢病毒载体进行T细胞转导后直接处于稳定状态，W-ME107-55 CAR和W-ME107-27 CAR T细胞分泌大量的IFN-γ，而W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T细胞与模拟CAR T细胞对照相比分泌相对少量的IFN-γ(图15A)。另一方面，当工程改造CAR T细胞与肿瘤细胞共培养时，W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117CAR T细胞以剂量依赖性方式表达更大量的IFN-gamma(IFN-γ)，而W-ME107-55 CAR和W-ME107-27 CAR T细胞几乎不响应任何肿瘤细胞刺激而分泌任何IFN-γ(图15B)。
在分析表面CAR表达水平随时间的变化时，观察到所有CAR T细胞在慢病毒转导后都具有在细胞表面上表达的CAR分子。然而，W-ME107-55 CAR和W-ME107-27 CAR的表达随时间下降，而W-ME107-10CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR在细胞表面上保持与开始时相似的水平(图15C)。
通过在存在和不存在肿瘤细胞刺激的情况下检查工程改造CAR T细胞上的表面激活标志物，注意到W-ME107-27 CAR T细胞已经在没有肿瘤细胞刺激的情况下表达了更高水平的这些激活标志物，并且另外的肿瘤刺激不影响标志物表达水平。另一方面，这些标志物在未刺激的W-ME107-117 CAR T细胞中保持在低水平，而在肿瘤细胞刺激时它们的表达急剧增加(图15D)。
总之，这些结果表明，W-ME107-55 CAR和W-ME107-27 CAR T细胞具有不依赖于靶标的基础水平激活，并且这种基础水平激活导致CAR T细胞对靶肿瘤细胞的反应性降低。
实施例18–CAR T细胞在体内控制胶质母细胞瘤肿瘤的生长
本实施例在动物模型中研究了各种CAR T细胞在控制胶质母细胞瘤肿瘤生长方面的功效。由于先前的数据表明W-ME107-55 CAR和W-ME107-27 CAR T细胞具有非特异性、不依赖靶点的基础水平激活，我们分析了W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117CAR T细胞的肿瘤生长抑制功效。
材料和方法
使用如实施例15中所述的慢病毒构建体对人CAR T细胞进行工程改造。由于先前的数据表明W-ME107-10 CAR、W-ME107-75 CAR和W-ME107-117 CAR T在增殖方面更好并且基础水平激活较低，我们在体内评价了这些CAR T细胞。对人胶质母细胞瘤细胞U343MG-Luc(5μL中1×105个细胞)进行工程改造以表达萤火虫荧光素酶，并植入到裸鼠的颅内。使用Hamilton注射器和立体定向注射框架在前囟前1mm和右1.5mm以及2.7mm深度处执行注射。在肿瘤植入后的第7天，小鼠在相同的位置处接受颅内施用的模拟T细胞(作为对照)或各种CAR T细胞(200万)治疗。随后使用IVIS系统(NightOWL)对小鼠进行荧光素酶信号成像，并严格按照当地批准的动物伦理许可在发展出严重症状时实施安乐死。示意性实验过程在图16A中示出。萤光素酶信号(平均值+SEM)呈现为肿瘤生长的指示，并且每个治疗组中小鼠的存活呈现为Kaplan-Meier曲线并使用Gehan-Breslow-Wilcoxon测试进行比较。
结果
测试的所有三种CAR T细胞(W-ME107-10 CAR T、W-ME107-75 CAR T和W-ME107-117 CAR T)都可以控制肿瘤生长，如与模拟T细胞治疗的小组相比，治疗组中的较低荧光素酶信号所示(图16B)。此外，W-ME107-75 CAR T细胞治疗和W-ME107-117 CAR T细胞治疗均显示在当前测定条件下显著改善小鼠的存活(图16C)。
实施例19CDR差异性地影响CAR表达和功能
本实施例通过用丙氨酸取代CDR区域中的氨基酸来研究不同构建体之间的CAR表达水平差异的机制。由于先前的数据表明W-ME107-27和W-ME107-117在CAR表面表达方面的差异最大，我们研究了这两个克隆并且取代了W-ME107-27中与W-ME107-117不同的氨基酸。
材料和方法：
病毒构建和T细胞工程改造
从Genscript订购具有氨基酸取代的DNA构建体(详见表14)并亚克隆到慢病毒载体中。慢病毒构建在实施例15中有所描述。使用慢病毒构建体对人Jurkat T细胞系进行工程改造。工程改造细胞在细胞培养基(补充有10％ FBS、1％ PeSt、1％丙酮酸钠的RPMI1640)中培养，直到病毒转导后4天通过流式细胞仪进行分析。
表14–构建体
Figure BDA0003897597900000711
Figure BDA0003897597900000721
CAR表达分析
对工程改造的细胞进行CAR染色(使用抗人Ig(H+L)抗体)，并使用流式细胞仪进行分析。对GFP阳性细胞中的CAR阳性细胞的百分比进行门控并呈现。
结果
W-ME107-27-Ala2、W-ME107-27-Ala4、W-ME107-27-Ala5在GFP阳性转导T细胞中显示出显著更高的CAR表达。W-ME107-27-Ala1、W-ME107-27-Ala3显示出与W-ME107-27相似水平的CAR表达(图17A、17B)。这些结果表明，重链中的CDR2和轻链中的CDR3对CAR表面表达的影响最大。
实施例20基础水平激活与细胞内信号传导结构域相关
本实施例通过去除CAR分子(诱饵CAR)的细胞内信号传导结构域，研究了工程改造的CAR T细胞的基础水平激活的机制。由于先前的数据表明W-ME107-27和W-ME107-117在CAR表面表达方面的差异最大，我们研究了这两个克隆。
材料和方法：
病毒构建和T细胞工程
从Genscript订购具有诱饵CAR的DNA构建体并亚克隆到慢病毒载体中(图18A)，慢病毒载体生成W-ME107-27dCAR和W-ME107-117dCAR。慢病毒构建在实施例15中有所描述。使用慢病毒构建体对人T细胞进行工程改造。
IFN-γ分泌
病毒转导后，将工程改造的细胞在供应有25IU IL-2/mL的细胞培养基(补充有10％ FBS、1％ PeSt、1％丙酮酸钠的RPMI1640)中培养7天。然后将工程改造的细胞(2×105个细胞/孔)铺板到200μL细胞培养基中的96孔板中，无需补充任何另外的细胞因子。24小时后收获细胞培养上清液，并且通过ELISA(Mabtech,Sweden)测量上清液中的IFN-γ。
结果
W-ME107-27和W-ME107-117 CAR T细胞均在稳定状态下分泌IFN-γ，而W-ME107-27 CAR T细胞分泌显著更大量的IFN-γ(图18C)。当细胞内信号传导结构域被去除时，与W-ME107-27dCAR和W-ME107-117dCAR的对应物相比，W-ME107-27dCAR和W-ME107-117dCAR都显示出显著降低的IFN-γ分泌(图18C)。模拟T细胞不分泌IFN-γ(图18C)。这些结果表明，工程改造CAR T细胞的基础水平激活与其细胞内信号传导结构域相关。
实施例A1-重组人IL13Rα2(hIL13Rα2-avi)的制备
克隆并分离生物素化hIL13Rα2。
材料和方法：
材料
MultiBac表达系统试剂盒,Geneva Biotech,NaN
SalI,G|TCGAC Thermo Fischer Scientific,FD0644
XhoI,C|TCGAG Thermo Fischer Scientific,FD0694
KpnI,GGTAC|C Thermo Fischer Scientific,FD0524
PstI,CTGCA|G Thermo Fischer Scientific,FD0615
快速DNA连接试剂盒,Thermo Fischer Scientific,K1422
Cre重组酶,NEB,M0298
GeneJET质粒小量提取试剂盒,Thermo Fischer Scientific,K0503
PureLink HiPure质粒DNA小提试剂盒,Thermo Fisher Scientific,K210002
LA,Sigma,L7025
LB Broth,Sigma,L03022
One Shot Mach1 T1噬菌体抗性化学感受态大肠杆菌,Thermo FischerScientific,C862003
One Shot PIR1化学感受态大肠杆菌,Thermo Fischer Scientific,C101010
壮观霉素(Spectamycin),Sigma,S4014
庆大霉素(Gentamycin),Sigma,G1397
IPTG,ThermoFisher,15529019
BluoGal,ThermoFisher,15519028
四环素(Tetracycline),Bioline,87030
DH10EmBacy感受态细胞(由multibac试剂盒制备)
Stellar感受态细胞,Clontech,636763.
17AEAMOP_ME107h_pMA-T,Gene Art
17AEAMPP_BirA_pMA-T,Gene Art
pFastBac正,GGA TTA TTC ATA CCG TCC CA
pACEBac1反(SV40 polyA),TGA AAT TTG TGA TGC TAT TGC
pIDS正,CGA TAC TAG TAT ACG GAC C
pIDS反,CCG TGC GTT TTA TTC TGT C
Hepes,VWR,441487M
甘油,VWR,444485B
TWEEN
Figure BDA0003897597900000741
(Surfact-Amps 80),Pierce,0028328
咪唑,Merck,1.04716.0250
NaCl,VWR,27800.360
HisTrap excel 1ml,GE Healthcare,17-3712-05
HiLoad Superdex 200 16/60,GE Healthcare,28-9893-35
Novex Sharp预染蛋白标准品,Invitrogen,LC5800
NuPAGE抗氧化剂,Invitrogen,NP0005
NuPAGE LDS样品缓冲液,Invitrogen,NP0007
NuPAGE MES SDS电泳缓冲液20X,Invitrogen,NP000202
NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris蛋白凝胶1.0mm 10孔,Invitrogen,NP0321BOX
NuPAGE Novex 4-12％ Bis-Tris蛋白凝胶1.0mm 15孔,Invitrogen,NP0323BOX
Pierce蛋白质浓缩器10K 5-20ml,Thermo Scientific,88527
抗6X His标签抗体,Abcam,ab18184
考马斯蛋白质测定试剂,Thermo Fisher Scientific,1856209
hIL13Rα2-avi的克隆
人IL13Rα2的ECD结构域(Uniprot Q14627氨基酸29-331)与BirA在杆状病毒/Sf9系统中共表达以产生生物素化受体。在基因构建体中，将天然信号肽(氨基酸1-28)交换为gp67杆状病毒信号肽，以将蛋白质分泌到培养基中。将Avi标签并入到受体的C末端以促进BirA的定向生物素化，之后是用于亲和纯化的His6标签。这给出了在Trp331之后添加的C末端氨基酸序列GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO:111)。构建体的两侧是克隆位点SalI和XhoI以及针对草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)优化的密码子。同样，大肠杆菌BirA连接酶基因的两侧是XhoI和KpnI以及优化的密码子。从GeneArt,Thermofisher订购基因(载体17AEAMOP_ME107h_pMA-T和载体17AEAMPP_BirA_pMA-T)。
根据制造商的方案来制备受体载体pACEBac1中的hIL13Rα2-avi和供体载体pIDS中的BirA的multibac构建体。通过在GATC处测序来验证载体序列。两种载体通过Cre-Lox重组而融合，形成hIL13Rα2-AVIhis/BirA构建体。将这种构建体转化到DH10EmbacY中以转座到杆粒中。通过这些细胞中的蓝/白筛选来进行阳性克隆的选择。最后，分离杆粒并通过PCR分析基因的并入。
hIL13Rα2-avi的表达和表征
将杆粒转染到Sf9细胞中以产生杆状病毒。人IL13Rα2在2.3L转染的Sf9培养物中表达48小时，并通过在HisTrap Excel柱上捕获而从培养基中收获。用缓冲液A(50mM HEPESpH 7.0、150mM NaCl、9mM咪唑、10％甘油和10μM TWEEN
Figure BDA0003897597900000751
)平衡柱。用缓冲液A洗涤柱后，用缓冲液B(50mM HEPES pH 7.0、150mM NaCl、9mM咪唑、10％甘油、10μM TWEEN
Figure BDA0003897597900000752
和300mM咪唑)洗脱蛋白质。
在汇集和浓缩含有蛋白质的级分后，使用50mM HEPES pH 7.0、150mM NaCl、10％甘油和10μM TWEEN
Figure BDA0003897597900000753
将样品在Superdex 200 16/60柱上抛光。选择、汇集并浓缩了根据SDS Page的最纯的蛋白质级分。将纯化的hIL13Rα2受体在SDS凝胶上电泳以确定纯度和尺寸。通过ELISA和蛋白质印迹法验证了与克隆mAb47单链对照的结合。还将受体送到Xiaofang Cao,Clinical Proteomics Mass Spectrometry,Science for LifeLaboratory以进行MS分析。样品电泳了三次，但只覆盖了部分序列。可以得出结论，蛋白质的ID是正确的。
上文描述的实施方案应被理解为是本发明的一些例示性实例。本领域的技术人员应当理解，在不脱离本发明的范围的情况下，可以对实施方案做出各种修改、组合和变化。具体地说，在技术上可行的情况下，不同实施方案中的不同的局部解决方案可组合在其他配置中。然而，本发明的范围由随附权利要求限定。
序列表
<110> 埃利塞拉疗法公司(ELICERA THERAPEUTICS AB)
<120> 抗IL13RA2抗体、其抗原结合片段和用途
<130> HSJ105439P.WOP
<150> SE 2050572-3
<151> 2020-05-15
<160> 119
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4
<212> PRT
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<211> 6
<212> PRT
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Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
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Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
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Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 16
Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 17
Tyr Ser Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Gly Phe
1 5 10
<210> 18
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 18
Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr
1 5
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 19
Arg Tyr Arg Ser His Arg Pro Gly Leu Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 20
Phe His Pro Arg Tyr Gly Tyr
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 21
Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 22
Tyr Tyr His Tyr Asp Tyr Gly Tyr Tyr Tyr
1 5 10
<210> 23
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 23
Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Gly Leu Asn Asp Ile Phe
1 5 10 15
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR部分
<400> 24
Arg Asn Tyr Trp Glu His Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 25
His His Tyr Gly Tyr Tyr Pro Pro Gly Ser Val Tyr Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 26
Val Glu Tyr Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Ser Pro Val
1 5 10
<210> 27
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> GS-接头
<400> 27
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 28
Thr Tyr Tyr Ser Pro His
1 5
<210> 29
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 29
Asp Tyr Tyr Leu Phe
1 5
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 30
Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr
1 5
<210> 31
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 31
Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu
1 5
<210> 32
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 32
Ala Phe Ser Pro Ser
1 5
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 33
Ser Tyr Asp Thr Leu Leu
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 34
Ala Leu Ser Ser Leu Pro
1 5
<210> 35
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 35
Phe Ser Thr Arg Leu Ser
1 5
<210> 36
<211> 19
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 36
Glu Ile Lys Leu Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg
1 5 10 15
Cys Phe Asp
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 37
Ser Thr Tyr Pro Phe
1 5
<210> 38
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 38
Tyr Gly Ser Asn Pro Leu
1 5
<210> 39
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3部分
<400> 39
Arg Tyr Asn Gly Leu Phe
1 5
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 40
Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Phe
1 5 10
<210> 41
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 41
Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile
1 5
<210> 42
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3部分
<400> 42
Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr Leu
1 5 10
<210> 43
<211> 18
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 43
Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Val Tyr
1 5 10 15
Leu Thr
<210> 44
<211> 15
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 44
Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr Trp
1 5 10 15
<210> 45
<211> 11
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 45
Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His
1 5 10
<210> 46
<211> 6
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 46
Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
1 5
<210> 47
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH延伸的CDR1
<400> 47
Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 48
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH延伸的CDR1
<400> 48
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser
1 5 10
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH延伸的CDR1
<400> 49
Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser Tyr Met Gly
1 5 10
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH延伸的CDR1
<400> 50
Gly Phe Thr Phe Gly Ser Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH延伸的CDR1
<400> 51
Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 52
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH延伸的CDR1
<400> 52
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser
1 5 10
<210> 53
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR2
<400> 53
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 54
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR2
<400> 54
Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 55
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR2
<400> 55
Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Tyr Thr
1 5
<210> 56
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR2
<400> 56
Ile Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr
1 5
<210> 57
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR2
<400> 57
Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH eCDR2
<400> 58
Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr
1 5 10
<210> 59
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH eCDR2
<400> 59
Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 60
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH eCDR2
<400> 60
Tyr Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH eCDR2
<400> 61
Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 62
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH eCDR2
<400> 62
Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH eCDR2
<400> 63
Ser Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 64
Ala Arg Val Val Arg Ser Thr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 65
Ala Arg Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 66
Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Gly Phe Met Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 67
Ala Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 68
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 68
Ala Arg Arg Tyr Arg Ser His Arg Pro Gly Leu Ser Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 69
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 69
Ala Arg Phe His Pro Arg Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 70
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 70
Ala Arg Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 71
Ala Arg Tyr Tyr His Tyr Asp Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 72
Ala Arg Arg Asn Tyr Trp Glu His Gly Gly Gly Ser Leu Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 73
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 73
Ala Arg His His Tyr Gly Tyr Tyr Pro Pro Gly Ser Val Tyr Tyr Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 74
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR3
<400> 74
Ala Arg Val Glu Tyr Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Ser Pro Val Phe
1 5 10 15
Asp Tyr
<210> 75
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 75
Gln Gln Thr Tyr Tyr Ser Pro His Thr
1 5
<210> 76
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 76
Gln Gln Asp Tyr Tyr Leu Phe Thr
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 77
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 78
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 78
Gln Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 79
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 79
Gln Gln Ala Phe Ser Pro Ser Thr
1 5
<210> 80
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 80
Gln Gln Ser Tyr Asp Thr Leu Leu Thr
1 5
<210> 81
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 81
Gln Gln Ala Leu Ser Ser Leu Pro Thr
1 5
<210> 82
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 82
Gln Gln Phe Ser Thr Arg Leu Ser Thr
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 83
Gln Gln Ser Thr Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 84
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 84
Gln Gln Tyr Gly Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL CDR3
<400> 85
Gln Gln Arg Tyr Asn Gly Leu Phe Thr
1 5
<210> 86
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH链
<400> 86
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 87
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL链
<400> 87
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Tyr Leu Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 88
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH链
<400> 88
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 89
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL链
<400> 89
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 90
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH链
<400> 90
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 91
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VL链
<400> 91
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Leu Ser Ser Leu Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 92
<211> 274
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 1E10B9 scFv
<400> 92
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Tyr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Arg Asp Tyr
20 25 30
Ser Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Phe Leu Glu Ala Ser Ala Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Asp Tyr Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ile Leu Ser Val Thr Ile Gly
130 135 140
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
145 150 155 160
Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro
180 185 190
Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
195 200 205
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly
210 215 220
Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240
Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp
245 250 255
Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His His His
260 265 270
His His
<210> 93
<211> 279
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> mAb47 scFv
<400> 93
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser
130 135 140
Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser
145 150 155 160
Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln
165 170 175
Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Gln
180 185 190
Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp
195 200 205
Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr
210 215 220
Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr
225 230 235 240
Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp
245 250 255
Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala
260 265 270
Ala His His His His His His
275
<210> 94
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 94
Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
1 5 10
<210> 95
<211> 12
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 95
Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
1 5 10
<210> 96
<211> 10
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 96
Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
1 5 10
<210> 97
<211> 14
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 97
Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu
1 5 10
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 98
Ala Lys Ile His Thr Leu Leu
1 5
<210> 99
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 99
Phe Thr Phe Gln Leu
1 5
<210> 100
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 100
Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr Tyr
1 5
<210> 101
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 101
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 102
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 102
Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser Tyr
1 5
<210> 103
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 103
Gly Phe Thr Phe Gly Ser Ser Tyr
1 5
<210> 104
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 104
Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr Gly
1 5
<210> 105
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 105
Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Tyr
1 5
<210> 106
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> VH CDR1
<400> 106
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly
1 5
<210> 107
<211> 380
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 107
Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile
1 5 10 15
Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val
20 25 30
Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr
35 40 45
Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu
50 55 60
Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr
65 70 75 80
Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp
85 90 95
Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln
100 105 110
Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr
115 120 125
Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp
130 135 140
Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly
145 150 155 160
Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu
165 170 175
Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly
180 185 190
Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys
195 200 205
Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg
210 215 220
Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro
225 230 235 240
Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu
245 250 255
Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr
260 265 270
Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val
275 280 285
Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu
290 295 300
Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly
305 310 315 320
Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu
325 330 335
Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu
340 345 350
Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr
355 360 365
Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr
370 375 380
<210> 108
<211> 8
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 108
Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn
1 5
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 109
Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu
1 5
<210> 110
<211> 5
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 110
Ala Glu Thr Thr Tyr
1 5
<210> 111
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 具有Avi标签和His6标签的C末端
<400> 111
Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His
1 5 10 15
His His His His His
20
<210> 112
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重CDR1区
<400> 112
Phe Tyr Gly Ser Tyr Met Gly Trp
1 5
<210> 113
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重CDR2区
<400> 113
Ser Tyr Ile Ser Gly Tyr Gly
1 5
<210> 114
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重CDR3区
<400> 114
Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp
1 5
<210> 115
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻CDR3区
<400> 115
Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 116
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重CDR1区
<400> 116
Phe Ala Gly Ser Tyr Met Ala Trp
1 5
<210> 117
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重CDR2区
<400> 117
Ser Ala Ile Ala Gly Ala Gly
1 5
<210> 118
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 重CDR3区
<400> 118
Arg Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Ala Asp
1 5
<210> 119
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 轻CDR3区
<400> 119
Gln Ala Tyr Ser Ala Pro Ala Thr
1 5

Claims (51)

1.一种能够结合白介素13受体亚基α2(IL13Rα2)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对IL13Rα2的β折叠区域内的表位具有特异性，所述β折叠区域包含IL13Rα2中氨基酸编号68至75的第一β链、所述第一β链之后的环、IL13Rα2中氨基酸编号101至109的第二β链、所述第二β链之前的环、以及IL13Rα2中氨基酸编号124至128的第三β链。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段对包含选自由以下组成的组的至少一种肽、优选至少两种肽、和更优选所有三种肽的表位具有特异性：IL13Rα2中的氨基酸编号67至81，即VEYELKYRNIGSETW(SEQ ID NO:44)、氨基酸编号96至106，即DLNKGIEAKIH(SEQ ID NO:45)和氨基酸编号123至128，即WAETTY(SEQ ID NO:46)。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)结构域互补决定区3(CDR3)，所述可变重结构域互补决定区3包含氨基酸序列YSPFY(SEQ ID NO:3)，优选包含氨基酸序列YSPFYM(SEQ ID NO:9)，并且更优选包含氨基酸序列ARYSPFYMDY(SEQ ID NO:10)、优选由所述氨基酸序列组成。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)结构域互补决定区3(CDR3)，所述可变轻结构域互补决定区3包含氨基酸序列GYSFPP(SEQ ID NO:4)，优选包含氨基酸序列QQGYSFPPT(SEQ ID NO:11)、优选由所述氨基酸序列组成。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)，所述可变重结构域互补决定区1包含氨基酸序列SGSY(SEQ ID NO:1)，优选包含氨基酸序列GFTFSGSY(SEQ ID NO:105)、优选由所述氨基酸序列组成。
6.根据权利要求5所述的抗体或其抗原结合片段，其中延伸的VH结构域CDR1包含氨基酸序列GFTFSGSYMS(SEQ ID NO:6)、优选由所述氨基酸序列组成。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变重(VH)结构域互补决定区2(CDR2)，所述可变重结构域互补决定区2包含氨基酸序列YGSGGY(SEQ ID NO:2)，优选包含氨基酸序列IYGSGGYT(SEQ ID NO:7)、优选由所述氨基酸序列组成。
8.根据权利要求7所述的抗体或其抗原结合片段，其中延伸的VH结构域CDR2包含氨基酸序列SIYGSGGYTY(SEQ ID NO:8)、优选由所述氨基酸序列组成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)结构域互补决定区1(CDR1)，所述可变轻结构域互补决定区1包含氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO:12)、优选由所述氨基酸序列组成。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含可变轻(VL)结构域互补决定区2(CDR2)，所述可变轻结构域互补决定区2包含氨基酸序列AAS、优选由所述氨基酸序列组成。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
可变重(VH)结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSYMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSPFYMDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:13)、优选由所述氨基酸序列组成；和
可变轻(VL)结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSFPPTFGQGTKLEIK(SEQ IDNO:14)、优选由所述氨基酸序列组成。
12.一种能够结合白介素13受体亚基α2(IL13Rα2)的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
可变重(VH)结构域互补决定区1(CDR1)，其包含氨基酸序列GFTFX1X2X3X4、优选由所述氨基酸序列组成，其中每个Xn、n＝1…4独立地选自由G、A、S和Y组成的组；
VH结构域CDR2，其包含氨基酸序列IB1B2B3B4B5B6T、优选由所述氨基酸序列组成，其中每个Bm、m＝1…6独立地选自由G、S和Y组成的组；
VH结构域CDR3，其包含氨基酸序列AR-ZH-Z1DY、优选由所述氨基酸序列组成，其中Z1选自由F、M、I和L组成的组，并且ZH表示选自由以下组成的组的氨基酸：VVRSTYGY(SEQ ID NO:15)、YGHYAYGSY(SEQ ID NO:16)、YSSSGWYYGF(SEQ ID NO:17)、TPYSAY(SEQ ID NO:18)、RYRSHRPGLS(SEQ ID NO:19)、FHPRYGY(SEQ ID NO:20)、GSYSHYGAHY(SEQ ID NO:21)、YYHYDYGYYY(SEQ ID NO:22)、YSPFY(SEQ ID NO:3)、RNYWEHGGGS(SEQ ID NO:24)、HHYGYYPPGSVYY(SEQ ID NO:25)和VEYTYYGSEGSPV(SEQ ID NO:26)；
可变轻(VL)结构域CDR1，其包含氨基酸序列QSISSY(SEQ ID NO:12)、优选由所述氨基酸序列组成；
VL结构域CDR2，其包含氨基酸序列AAS、优选由所述氨基酸序列组成；和
VL结构域CDR3，其包含氨基酸序列QQ-ZL-T、优选由所述氨基酸序列组成，其中ZL表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：TYYSPH(SEQ ID NO:28)、DYYLF(SEQ ID NO:29)、SYSTPY(SEQ ID NO:30)、FYSYPL(SEQ ID NO:31)、AFSPS(SEQ ID NO:32)、SYDTLL(SEQ ID NO:33)、ALSSLP(SEQ ID NO:34)、FSTRLS(SEQ ID NO:35)、GYSFPP(SEQ ID NO:4)、STYPF(SEQ IDNO:37)、YGSNPL(SEQ ID NO:38)和RYNGLF(SEQ ID NO:39)。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含延伸的VH CDR1，所述延伸的VH CDR1包含氨基酸序列GFTFX1X2X3X4MX5、优选由所述氨基酸序列组成，其中每个Xn、n＝1…5独立地选自由G、A、S和Y组成的组。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段，其中X5是S或G。
15.根据权利要求12至14中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含延伸的VH CDR2，所述VH CDR2包含氨基酸序列JIB1B2B3B4B5B6TY、优选由所述氨基酸序列组成，其中每个Bm、m＝1…6独立地选自由G、S和Y组成的组，并且J选自由A、Y、G和S组成的组。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中
X1是S或Y；
X2是S或G；
X3是S或Y；并且
X4是A、Y或G。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中
B1是S或Y；
B2是G；
B3是S、G或Y；
B4是G；
B5是S或G；并且
B6是S或Y。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中ZH-Z1表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：YGHYAYGSYF(SEQ ID NO:40)、TPYSAYI(SEQ ID NO:41)、GSYSHYGAHYL(SEQ ID NO:42)和YSPFYM(SEQ ID NO:9)。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中ZL表示选自由以下组成的组的氨基酸序列：DYYLF(SEQ ID NO:29)、FYSYPL(SEQ ID NO:31)、ALSSLP(SEQ IDNO:34)和GYSFPP(SEQ ID NO:4)。
20.根据权利要求12至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
VH结构域CDR1，其包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VHCDR2，其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VH CDR3，其包含SEQ ID NO:65的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR2，其包含AAS的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成，和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域CDR1，其包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VHCDR2，其包含SEQ ID NO:55的氨基酸序列；优选由所述氨基酸序列组成；VH CDR3，其包含SEQ ID NO:68的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR2，其包含AAS的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成，和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:78的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域CDR1，其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VHCDR2，其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VH CDR3，其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR2，其包含AAS的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成，和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域CDR1，其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VHCDR2，其包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VH CDR3，其包含SEQID NO:10的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR1，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成；VL CDR2，其包含AAS的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成，和VL CDR3，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列、优选由所述氨基酸序列组成。
21.根据权利要求12至20中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含：
VH结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSYMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSPFYMDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:13)、优选由所述氨基酸序列组成；和
VL结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSFPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYGHYAYGSYFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:86)、优选由所述氨基酸序列组成；和
VL结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQDYYLFTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:87)、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYGSYMGWVRQAPGKGLEWVSYISGYGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARTPYSAYIDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO:88)、优选由所述氨基酸序列组成；和
VL结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFYSYPLTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:89)、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFYSYGMSWVRQAPGKGLEWVSYISGGGSYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGSYSHYGAHYLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:90)、优选由所述氨基酸序列组成；和
VL结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQALSSLPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:91)、优选由所述氨基酸序列组成；或
VH结构域，其包含氨基酸序列EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSGSYMSWVRQAPGKGLEWVSSIYGSGGYTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARYSPFYMDYWGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:13)、优选由所述氨基酸序列组成；和
VL结构域，其包含氨基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGYSFPPTFGQGTKLEIK(SEQ ID NO:14)、优选由所述氨基酸序列组成。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是单链可变片段(scFv)。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用作药物。
24.根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
25.一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含：
抗原识别结构域，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；
跨膜结构域；和
细胞内信号传导结构域。
26.根据权利要求25所述的CAR，其中所述跨膜结构域选自由以下组成的组：分化簇28(CD28)的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD8α的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD27的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD137的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD134的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD3ε的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD3ζ的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD3γ的所述跨膜结构域的全部或一部分、CD3δ的所述跨膜结构域的全部或一部分、TCRα的所述跨膜结构域的全部或一部分和TCRβ的所述跨膜结构域的全部或一部分，所述跨膜结构域优选选自由以下组成的组：CD28的所述跨膜结构域的全部或一部分和CD8α的所述跨膜结构域的全部或一部分。
27.根据权利要求25或26所述的CAR，其中所述细胞内信号传导结构域选自由以下组成的组：分化簇3的ζ链(CD3ζ)、CD28、CD137、ICOS、CD27、CD40、CD134和/或Myd88，所述细胞内信号传导结构域优选选自由CD3ζ和/或CD137组成的组。
28.根据权利要求25至27中任一项所述的CAR，其用作药物。
29.根据权利要求25至27中任一项所述CAR，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
30.一种T细胞受体(TCR)复合物，其包含抗原识别结构域，所述抗原识别结构域包含根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
31.根据权利要求30所述的TCR复合物，其用作药物。
32.根据权利要求30所述的TCR复合物，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
33.一种缀合物，其包含：
根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段；和
效应分子，其中所述效应分子优选选自由以下组成的组：可检测标记、细胞毒素、金属、另一种抗体或其抗原结合片段、核酸序列和脂质双层对接部分。
34.根据权利要求33所述的缀合物，其用作药物，其中所述效应分子是细胞毒素。
35.根据权利要求33所述的缀合物，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤，其中所述效应分子是细胞毒素。
36.一种核酸分子，其编码根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求25至27中任一项所述的CAR和/或根据权利要求30所述的TCR复合物。
37.根据权利要求36所述的核酸分子，其用作药物。
38.根据权利要求36所述的核酸分子，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
39.一种载体，其包含根据权利要求36所述的核酸分子。
40.根据权利要求39所述的载体，其用作药物。
41.根据权利要求39所述的载体，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
42.一种细胞，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求25至27中任一项所述的CAR、根据权利要求30所述的TCR复合物、根据权利要求36所述的核酸和/或根据权利要求39所述的载体。
43.根据权利要求42所述的细胞，其中所述细胞选自由T细胞、自然杀伤(NK)细胞、B细胞、单核细胞和巨噬细胞组成的组，优选为T细胞。
44.根据权利要求42或43所述的细胞，其用作药物。
45.根据权利要求42或43所述的细胞，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
46.一种药物组合物，其包含根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段、根据权利要求25至27中任一项所述的CAR、根据权利要求30所述的TCR复合物、根据权利要求33所述的缀合物、根据权利要求36所述的核酸分子、根据权利要求39所述的载体和/或根据权利要求42或43所述的细胞、以及药学上可接受的运载体。
47.根据权利要求46所述的药物组合物，其用作药物。
48.根据权利要求46所述的药物组合物，其用于治疗疾病或延缓疾病的发作，所述疾病选自由以下组成的组：胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、乳腺癌、头颈癌、胰腺癌、肾癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、肺癌、尿路上皮癌和卡波西肉瘤。
49.一种鉴定白介素13受体亚基α2(IL13Rα2)阳性细胞的方法，其包括：
使生物样品与根据权利要求1至22中任一项所述的抗体或其抗原结合片段接触；和
测量与所述生物样品的至少一种细胞结合的所述抗体或其抗原结合片段的量，从而将所述至少一种细胞鉴定为IL13Rα2阳性细胞。
50.一种白介素13受体亚基α2(IL13Rα2)的表位，其中所述表位在IL13Rα2的β折叠区域内，所述β折叠区域包含IL13Rα2中氨基酸编号68至75的第一β链、所述第一β链之后的环、IL13Rα2中氨基酸编号101至109的第二β链、所述第二β链之前的环、以及IL13Rα2中氨基酸编号124至128的第三β链。
51.根据权利要求50所述的表位，其中所述表位包含选自由以下组成的组的至少一种肽、优选至少两种肽、和更优选所有三种肽：IL13Rα2中的氨基酸编号67至81，即VEYELKYRNIGSETW(SEQ ID NO:44)、氨基酸编号96至106，即DLNKGIEAKIH(SEQ ID NO:45)和氨基酸编号123至128，即WAETTY(SEQ ID NO:46)。
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