KR20230010188A - 항-IL13Rα2 항체, 이의 항원 결합 단편 및 용도 - Google Patents

항-IL13Rα2 항체, 이의 항원 결합 단편 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230010188A
KR20230010188A KR1020227035755A KR20227035755A KR20230010188A KR 20230010188 A KR20230010188 A KR 20230010188A KR 1020227035755 A KR1020227035755 A KR 1020227035755A KR 20227035755 A KR20227035755 A KR 20227035755A KR 20230010188 A KR20230010188 A KR 20230010188A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antigen
seq
antibody
amino acid
domain
Prior art date
Application number
KR1020227035755A
Other languages
English (en)
Inventor
디 위
티나 사렌
마그누스 에센드
로트숌 헬레나 페르손
카밀라 호프스트룀
야스민 안데르손
웰스 유안 아스토르가
아네트 루스
벤델라 패로우
Original Assignee
엘리세라 테라퓨틱스 에이비
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 엘리세라 테라퓨틱스 에이비 filed Critical 엘리세라 테라퓨틱스 에이비
Publication of KR20230010188A publication Critical patent/KR20230010188A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001116—Receptors for cytokines
    • A61K39/001119—Receptors for interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6849—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a receptor, a cell surface antigen or a cell surface determinant
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70521—CD28, CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 IL13Rα2에 결합할 수 있는 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 항체 및 이의 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)를 작제하는 데 그리고 IL13Rα2-발현 암 질환의 치료를 위한 CAR 기반 면역요법에서 특히 유용하다.

Description

항-IL13Rα2 항체, 이의 항원 결합 단편 및 용도
본 실시형태는 일반적으로 항-IL13Rα2 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 특히 암 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
면역요법은 암 치료의 혁신을 일으켰다. 그러나, 공격적 형태의 뇌암인 교모세포종을 갖는 환자는 면역요법의 획기적 발전을 아직 얻지 못하였고, 상기 질환은 치명적인 채로 남아있다. 암 세포 표면 상에서 발현된 항원으로 향하는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 발현시키도록 생체외에서 조작된 환자-유래 T 세포의 입양전이는 현재 집중적으로 연구되고 있는 면역요법 형태이다. 인공 막관통 CAR 분자는 세포외 항원-결합 모이어티, 전형적으로 항체로부터의 단일쇄 가변 단편(scFv), 힌지 영역, 막관통 도메인, 및 T 세포 수용체 복합체(CD3ζ)로부터의 그리고 하나 이상의 T 세포 공자극 분자, 예를 들어, CD28, 4-1BB로부터의 세포내 신호전달 도메인으로 이루어진다. 따라서, CAR T 세포 요법은 항체의 특이성을 T 림프구의 사멸 효능과 조합한다. CD19를 표적화하는 CAR T 세포는 난치성 B-세포 악성종양의 치료에 상당히 효과적이며, 미국과 유럽 모두에서 급성 림프모구 백혈병 및 비호지킨 림프종용으로 승인되었다. 고형 종양을 표적화하는 CAR T 세포 생성물은 아직 승인되지 않았다. 유사하게, CAR NK 및 CAR 대식세포로 표기되는 NK 세포 및 대식세포를 조작하기 위해 CAR 분자를 이용하는 개념이 마찬가지로 연구되었다.
분화 213A2의 클러스터(CD213A2)로도 알려진 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL13Rα2)는 인터류킨-13(IL-13)에 결합하는 세포막 단백질이다. IL13Rα2는 IL-13 및 IL-4 수용체에 의해 공유되는 서브유닛인 인터류킨-4 수용체 알파(IL4Rα)와 수용체 복합체를 형성하는 IL13Rα1(CD213A1)에 밀접하게 관련된다. IL-13이 IL13Rα1/IL4Rα 수용체 복합체에 결합할 때, JAK1, STAT3 및 STAT6의 활성화를 야기하는 신호전달 과정이 개시된다. 분명히 대조적으로, IL13Rα2는 단량체로서 높은 친화도로 IL-13에 결합하고, 중요한 세포질 도메인을 결여하며, 따라서, 신호 매개체로서 작용하는 것으로 나타나지 않는다. IL13Rα2는 정소 및 뇌하수체에서 일부 발현을 제외하고 건강한 인간 세포 및 조직에서 드문드문하게 발현된다. 그러나, IL13Rα2는 교모세포종을 포함하는 다양한 암에서 선택적으로 과발현되는 것이 발견되었고, 이를 암 요법에 대한 표적이 되게 하였다.
IL13Rα2로 향하는 CAR T 세포는 교모세포종을 갖는 환자에 대한 소규모 임상 시험에서 평가되었다(Clin Cancer Res 2015, 21: 4062-4072). 한 명의 환자에 대해, 상기 치료는 IL13Rα2-음성 종양 클론이 다시 자라날 때까지 일정 기간 동안 지속적인 퇴행을 야기하였다(N Engl J Med 2016, 375: 2561-2569).
미국 특허 제9,914,909호는 IL13Rα2에 결합하는 IL-13 또는 이의 변이체를 포함하는 세포외 도메인, 막관통 영역 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR을 발현시키는 T 세포를 개시한다. CAR T 세포는 교모세포종의 치료에서 유용한 것으로 언급된다.
미국 특허 제9,868,788호는 인간 IL13Rα2의 세포외 부분에 걸쳐있고 개 IL13Rα2와 적어도 90%의 서열 동일성을 갖는 선형 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체를 개시한다. 화학치료제에 결합된 항체는 교모세포종의 치료에서 유용한 것으로 언급된다.
미국 특허 제10,308,719호는 IL13Rα2에 결합하는 항체 및 이의 단편, 및 이러한 항체 단편을 포함하는 CAR 작제물 및 교모세포종 치료에서의 이들의 용도를 개시한다. 항체는 IL13과 IL13Rα2 사이의 상호작용을 저해한다. IL13Rα2의 N-연결 글리코실화는 IL13Rα2에 대한 항체의 상호작용에 기여하였다.
문헌[Mol Cancer Ther 2008, 7(6): 1579-1587]은 항-IL-13Rα2(scFv)-PE38 면역독소를 얻기 위해 인간 scFv 항체 파지 라이브러리 및 슈도모나스 외독소(Pseudomonas exotoxin: PE)로부터 얻은 바와 같은 IL-13Rα2에 대한 단일쇄 Fv(scFv)의 융합을 개시한다. 그렇지만, 얻어진 면역독소는 IL-13과 PE 사이의 융합체(IL-13-PE38)의 형성에서 이전에 발생된 면역독소에 비해 더 높은 항종양 활성을 매개하지 않았다. 이는 표적 항원에 대한 면역독소의 scFv 부분의 낮은 친화도로 인한 것이었다.
교모세포종 및 IL13Rα2의 과발현을 특징으로 하는 다른 암의 치료의 개선에 대한 요구가 여전히 존재한다.
일반적인 목적은 항-IL13Rα2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.
특정 목적은 CAR 기반 면역요법에서 유용한 이러한 항-IL13Rα2 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다.
이들 및 다른 목적은 본 명세서에 개시된 바와 같은 실시형태에 의해 충족된다.
본 발명은 독립항에 정의되어 있다. 본 발명의 추가 실시형태는 종속항에서 정의된다.
실시형태의 양상은 IL13Rα2에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2에서 아미노산 번호 68 내지 75의 제1 베타 가닥, 제1 베타 가닥에 후행하는 루프, IL13Rα2에서 아미노산 번호 101 내지 109의 제2 베타 가닥, 제2 베타 가닥에 선행하는 루프, 및 IL13Rα2에서 아미노산 번호 124 내지 128의 제3 베타 가닥을 포함하는 IL13Rα2의 베타 시트 영역 내의 에피토프에 대해 특이성을 갖는다.
다른 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFX1X2X3X4를 포함하는 가변 중쇄(VH) 도메인 상보성 결정 영역 1(CDR1)을 포함하되, 각각의 Xn(n=1...4)은 G, A, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 아미노산 서열 IB1B2B3B4B5B6T를 포함하는 VH 도메인 CDR2를 포함하되, 각각의 Bm(m=1...6)은 G, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 AR-ZH-Z1DY를 포함하는 VH 도메인 CDR3을 추가로 포함하되, Z1은 F, M, I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, ZH는 VVRSTYGY(서열번호 15), YGHYAYGSY(서열번호 16), YSSSGWYYGF(서열번호 17), TPYSAY(서열번호 18), RYRSHRPGLS(서열번호 19), FHPRYGY(서열번호 20), GSYSHYGAHY(서열번호 21), YYHYDYGYYY(서열번호 22), YSPFY(서열번호 3), RNYWEHGGGS(서열번호 24), HHYGYYPPGSVYY(서열번호 25) 및 VEYTYYGSEGSPV(서열번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 12)를 포함하는 가변 경쇄(VL) 도메인 CDR1 및 아미노산 서열 AAS를 포함하는 VL 도메인 CDR2를 추가로 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QQ-ZL-T를 포함하는 VL 도메인 CDR3을 추가로 포함하되, ZL은 TYYSPH(서열번호 28), DYYLF(서열번호 29), SYSTPY(서열번호 30), FYSYPL(서열번호 31), AFSPS(서열번호 32), SYDTLL(서열번호 33), ALSSLP(서열번호 34), FSTRLS(서열번호 35), GYSFPP(서열번호 4), STYPF(서열번호 37), YGSNPL(서열번호 38) 및 RYNGLF(서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항원 인식 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인; 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항원 인식 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR); 및 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 효과기 분자를 포함하는 접합체를 포함하는 CAR에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 IL13Rα2의 에피토프에 관한 것이다. 에피토프는 IL13Rα2에서 아미노산 번호 68 내지 75의 제1 베타 가닥, 제1 베타 가닥에 후행하는 루프, IL13Rα2에서 아미노산 번호 101 내지 109의 제2 베타 가닥, 제2 베타 가닥에 선행하는 루프, 및 IL13Rα2에서 아미노산 번호 124 내지 128의 제3 베타 가닥을 포함하는 IL13Rα2의 베타 시트 영역 내에 있다.
추가 양상은 또한 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, CAR 및/또는 TCR-복합체를 암호화하는 핵산 분자; 핵산 분자를 포함하는 벡터, 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, CAR, TCR-복합체, 핵산 및/또는 벡터를 포함하는 세포; 및 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, CAR, TCR-복합체, 접합체, 핵산 분자, 벡터 및/또는 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 의약으로서 사용하기 위한, 특히 IL13Rα2-발현 암 질환의 발병을 치료 또는 지연시키는 데 사용하기 위한 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, CAR, TCR-복합체, 접합체, 핵산 분자, 벡터, 세포 및/또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 IL13Rα2-양성 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 생물학적 샘플을 본 발명에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 생물학적 샘플의 적어도 하나의 세포에 결합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 측정하여, IL13Rα2-양성 세포로서 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
실시형태의 항체 및 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2 상의 에피토프에 특이적으로 결합하고, 또한 단일쇄 가변 단편(scFv) 형식으로 전환될 때 IL13Rα2에 대한 상당히 특이적이고 강한 결합을 보유한다. 실시형태 항체의 항원-결합 단편에 기반하여 생성된 CAR 작제물은 CAR T 세포 면역요법에서 사용될 때 높은 세포독성 능력을 나타냈고, 이에 의해, IL13Rα2-발현 암의 치료에서 사용될 수 있다.
실시형태는 추가 목적 및 이점과 함께, 수반하는 도면과 함께 취하는 다음의 설명을 참조로 하여 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1은 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA) 결과를 나타낸 도면. ELISA에 의해 3가지 상이한 농도(2, 20 및 200배 희석)에서 인간 IL13Rα2 및 관련없는 단백질(스트렙타비딘)에 결합에 대해 1E10B9 scFv(B9 scFv) 및 mAb47 scFv(47 scFv)의 박테리아 상청액을 선별하였다. 두 콜로니(클론_1 및 클론_2)를 2개의 scFv 각각에 대해 평가하였다. 스트렙타비딘 특이적 scFv G-strep-1을 참조로서 포함시켰다. 결합을 HRP-표지 항-FLAG 항체에 의해 검출하였고, 450㎚에서 흡광도 값을 측정하였다(y-축). 보고한 값은 2회 중복값의 평균이다. 또한, 블랭크 값(scFv 없이 단지 배지를 첨가한 것으로부터 얻은 신호)을 차감하였다.
도 2는 균질 시간 분해 형광법(HTRF) 결과를 나타낸 도면. IL13Rα2에 대한 결합에 대해 HTRF에 의해 1E10B9 scFv(X-ME107-B9) 및 mAb47 scFv(X-ME107-47)의 박테리아 상청액을 선별하였다. 관련없는 scFv를 관련없는 단백질에 결합할 것으로 예상되는 음성 대조군으로서 포함시켰다. 결합 신호(665㎚) 및 배경/노이즈 신호(615㎚)를 측정하였고, 신호의 비인 R-값을 각 샘플에 대해 계산하였다(y-축). 보고한 값은 2회 중복값의 평균이다. 또한, 블랭크 값(scFv 없이 단지 배지를 첨가한 것으로부터 얻은 신호)을 차감하였다.
도 3은 44개의 정제된 W-ME107 scFv 및 참조 클론 mAb47 scFv의 겔 전기영동을 도시한 도면.
도 4는 ELISA 결과를 나타낸다. 결합 신호를 인간 IL13Rα2-av(속이 빈 막대), 인간 IL13Rα2-Fc(검은색 막대), 마우스 IL13Rα2-Fc(진한 회색 막대), 인간 IL13Rα1-Fc(위쪽으로 향하는 대각선 줄무늬 막대), 관련없는 단백질(점무늬 막대) 및 스트렙타비딘(밝은 회색 막대)에 대한 44개의 W-ME107 scFv 클론, 참조 클론 mAb47 scFv 및 G-strep-1 scFv(y-축)의 450㎚에서의 흡광도(y-축)로서 측정하였다.
도 5는 세포주에 대한 scFv 결합의 결과를 나타낸다. 선택한 scFv를 인간 교모세포종 세포주 U-87MG(고수준의 hIL13Rα2를 내인성으로 발현시킴) 또는 (음성 대조군으로서의) 인간 비소세포 폐암 세포 A549와 함께 인큐베이션시켰다. 세포를 항-FLAG-PE 항체로 추가로 염색하였고, 유세포분석에서 분석했다. 세포에 대한 scFv의 결합을 평균 형광 강도(MFI, y-축)로서 나타낸다.
도 6은 IL13의 존재 유무와 상관없이, IL13Rα2에 대한 12개의 W-ME107 scFv 클론 결합의 표면 플라즈몬 공명(SPR) 센소그램(sensorgram)을 나타낸 도면. 또한, 항-스트렙타비딘 scFv G-strep-1(스트렙타비딘에 결합하는 것으로 예상되는 음성 대조군)의 센소그램을 포함시킨다. 정제된 클론 47개의 scFv의 활성은 검출되지 않았다.
도 7은 에피토프 비닝 실험의 센소그램을 나타낸다. 10nM의 hIL13Rα2-avi뿐만 아니라, 10배 몰 과량(100nM)의 인간 IL13, W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-75 또는 W-ME107-117과 함께 사전 인큐베이션시킨 것을 클론 mAb47 mIgG1 고정 표면 위에 주입하였다. 대조군 샘플로서, 10배 몰 과량의 BI-8 scFv(음성 대조군) 또는 클론47 mIgG1(양성 대조군)과 함께 사전 인큐베이션시킨 10nM hIL13Rα2-avi를 또한 평가하였다.
도 8은 IL13αR2에 대한 W-ME107-117의 HDX-MS 맵핑으로부터의 잔여 플롯을 도시하며, 흔적은 상이한 시점을 도시하고, 수직선은 펩타이드당 차이의 합계를 나타낸다. 플롯 면적에서 2개의 수직선 간의 측정은 통계학적으로 유의하지 않다(항원 단독 또는 scFv 존재 간의 차이는 95% 신뢰수준에서 복제 분산을 초과하지 않았다).
도 9는 ELISA 결과를 나타낸다. 결합 신호, 즉, 450nM에서의 흡광도(y-축)를 펩타이드 및 hIL13Rα2 항원(x-축)에 대해 플롯팅하였다. W-ME107-117 scFv(검은색 막대) 및 W-ME107-75(회색 막대)의 결합을 hIL13Rα2에 대해서만 검출하였다.
도 10은 IL-13(검은색)(PDB 암호 3LB6)와의 복합체로 IL13Rα2(밝은 회색, 잔기 31 내지 328)의 구조를 나타내며, W-ME107-117의 에피토프를 강조한다. HDX-MS에 의해 정의된 에피토프 서열을 진한 회색으로 색칠하고, 수용체의 도메인 1에 위치시킨다. 좌측 패널은 베타 가닥을 화살표 및 소용돌이로서 나선으로 나타낸 삽화 표현에 구조를 나타낸다. 에피토프 서열은 두 베타 시트(가닥 4, 3, 6, 7) 중 하나 상에서 발견되며, 가닥 3, 6, 7에서의 잔기와, 가닥 3과 4 사이 및 가닥 5와 6 사이의 루프 영역을 포함하고, 두 루프는 도메인 2를 향하고 있다. 우측 패널은 IL-13이 제거되고, 에피토프 영역이 리간드와 상호작용하지 않는다는 것을 강조하는 표면 표현의 구조를 나타낸다. IL-13 결합 부위를 검은색 원으로서 제시한다.
도 11은 렌티바이러스 작제물의 개략적 표현을 나타낸다. 선택된 scFv 및 세포내 T 세포 활성화 도메인을 함유하는 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 유도하기 위해 EF1α 프로모터를 이용하였다. T2A 자기-절단성 펩타이드를 사용하여 CAR 작제물 및 녹색 형광 단백질(GFP)을 분리시키고, 이를 검출을 위해 사용하였다.
도 12는 CAR T 세포 사멸 결과를 나타낸다. 루시퍼라제-발현 U-87MG 세포(IL13Rα2를 발현시킴) 또는 Mel526 세포(IL13Rα2를 발현시키지 않음)를 0:1 내지 25:1 범위의 효과기 대 표적 비로 24시간 동안 상이한 CAR T 세포와 함께 공동배양시켰다. 루시퍼라제 활성을 측정함으로써 표적 세포의 생존도를 평가하였다. 공동 배양물에서 표적 세포의 상대 생존도(y-축)를 비처리 대조군(종양 세포 단독)에 대해 결정하였다. 생물학적 및 실험적 중복물을 이용하여 분석을 수행하였다. 값을 평균±SEM으로서 나타낸다.
도 13은 표적 인식 시 상이한 CAR T 세포 작제물의 증식을 나타낸다. CAR T 세포를 바이올렛 염료로 염색하고, U-87MG 세포와 함께 4일 동안 공동배양시켰다. 로바스타틴과의 공동배양물은 비복제 대조군으로서 작용하였다. CAR T 세포를 표적 인식 시 복제하였고, 세포분열 수에 따라 범주화하였다(0, 1, 2, 3 및 4회 이상의 분열). 도면은 분열에서 CD3+GFP+ 세포의 백분율을 나타낸다. 각 분열 피크 내에서 총 CD3+GFP+ 집단의 %를 결정함으로써 백분율을 평가하였다. 대표적인 데이터를 나타낸다.
도 14A 내지 도 14E는 HDX-MS에 의해 발견된 W-ME107-10, W-ME107-27 및 W-ME107-75의 에피토프 서열을 강조한다. (A) IL-13(검은색)과의 복합체로 IL13Rα2(밝은 회색)의 구조(PDB 암호 3LB6)를 도 10의 도면에 비해서 180도 회전시킨다. 에피토프 서열을 진한 회색으로 칠하고 잔기 경계를 넘버링하고, 도메인 2에서 시작해서, 하나의 서열을 제외하고 수용체의 도메인 3 상에 모두 위치시킨다. 구조는 삽화 표현에 나타낸다. (B 내지 E)는 표면 표현에 IL13Rα2를 나타내고, 결합 데이터와 함께 HDX-MS 데이터에 기반하여 W-ME107-10, W-ME107-27 및 W-ME107-75에 대해 예상된 에피토프에서 차이를 강조한다. 에피토프 면적을 진한 회색으로 색칠한다. 분명함을 위해 삽화 표현에서 IL-13(검은색)을 유지한다. (B) 및 (C)는 각각 W-ME107-10 및 W-ME107-27의 예측된 결합 면적을 도시한다. (D)에서 W-ME107-75의 결합 면적을 진한 회색으로 나타낸다. W-ME107-75는 여러 실험에서 W-ME107-10 및 W-ME107-27과 다르게 거동하며, 따라서 상이한 결합 부위를 갖는 것으로 예상된다. 에피토프는 수용체의 가장 C-말단의 부분인 잔기 329 내지 337을 포함한다. 이들 잔기는 공개된 구조에서는 보이지 않지만, 도면에서 파선으로 포함시킨다. 마우스 IL13Rα2에서 비보존적이기 때문에 W-ME107-75 결합에 중요한 것으로 추정한다. (E) 본 명세서에서 단백질 구조를 180도 회전시키고, W-ME107-10 및 W-ME107-27에 대한 에피토프의 부분이지만 W-ME107-75에 대한 에피토프의 부분은 아닌 펩타이드 228 내지 245의 시작을 진한 회색으로 나타낸다.
도 15A 내지 도 15D는 조작된 CAR T 세포의 프로파일링 및 특성규명을 나타낸다. (A)는 비자극 대조군(모의(mock)) CAR T 세포, W-ME107-10 CART 세포, W-ME107-27 CART 세포, W-ME107-55 CART 세포, W-ME107-75 CAR T 세포 및 W-ME107-117 CAR T 세포의 배양물 배지 내로의 IFN-감마 분비를 나타낸다. (B)는 U87UU 또는 U343MG 종양 세포와 함께 공동배양시킨 대조군(모의) CART 세포, W-ME107-10 CART 세포, W-ME107-27 CART 세포, W-ME107-55 CART 세포, W-ME107-75 CAR T 세포 및 W-ME107-117 CAR T 세포의 배양물 배지 내로의 IFN-감마 분비를 나타낸다. (C)는 시간에 따른 대조군(모의) CART 세포, W-ME107-10 CART 세포, W-ME107-27 CART 세포, W-ME107-55 CART 세포, W-ME107-75 CAR T 세포 및 W-ME107-117 CAR T 세포에서의 CAR 발현을 나타낸다. (D)는 종양 세포 자극의 존재 또는 부재 하에 대조군(모의) CART 세포, W-ME107-27 CART 세포 및 W-ME107-117 CAR T 세포에 대한 표면 활성화 마커(PD-1, TIM-3, LAG-3, CD69 및 CD25)를 나타낸다.
도 16A 내지 도 16C는 조작된 CAR T 세포가 생체내 교모세포종 종양 성장을 제어한다는 것을 나타낸 도면. (A) 실험 절차의 개략도. (B)는 대조군(모의) CART 세포, W-ME107-10 CART 세포, W-ME107-75 CAR T 세포 및 W-ME107-117 CAR T 세포에 대한 종양 이식 후 다양한 일자에 종양 성장을 나타낸다. (C)는 대조군(모의) CART 세포, W-ME107-10 CART 세포, W-ME107-75 CAR T 세포 및 W-ME107-117 CAR T 세포에 대한 종양 이식 후 다양한 일자에 마우스의 생존 백분율을 나타낸다.
도 17A 내지 도 17B는 scFv의 중쇄 및 경쇄의 상이한 상보성 결정 영역(CDR)이 CAR-T 세포의 CAR 발현에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. (A) 각 작제물에 대해 인간 Jurkat 세포 상에서의 CAR 발현(ns: 통계학적 유의도 없음; *: P<0.05; **: P<0.01). (B) 각 작제물에서 형질도입된 세포 및 CAR 표면 염색 신호에 대한 표시로서, GFP 신호를 나타내는 대표적인 플롯.
도 18A 내지 도 18C는 CAR 세포내 신호전달 도메인이 제거되었을 때 조작된 CAR T 세포의 기저 수준 활성화가 감소되었다는 것을 설명하는 도면. (A) CAR 또는 유인(decoy) CAR을 발현시키기 위해 사용한 렌티바이러스 작제물의 개략적 도시(dCAR로 명명되는 세포내 신호전달 도메인이 없는 CAR 분자). (B) 개략적 도시는 세포막 상의 CAR 분자 및 유인 CAR 분자를 도시한다. (C) 자극이 없는 형질도입 후 제7일에 상이한 CAR-T 세포 작제물로부터의 IFN-γ 분비.
본 실시형태는 일반적으로 항-IL13Rα2 항체 및 이의 항원-결합 단편, 및 특히 암 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다.
본 실시형태는 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL13Rα2)에 대해 특이성을 갖는 항체 및 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 실시형태의 항체 및 항원-결합 단편은 키메라 항원 수용체(CAR)에서, 그리고 IL13Rα2의 발현 및 제시를 특징으로 하는 암 질환을 포함하는 다양한 질환의 CAR 기반 면역요법에서 사용하는 데 특히 적합하다.
IL13Rα2에 대한 항체 및 CAR 작제물은 배경 부문에 열거된 문헌에 예시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다. 그러나, 선행 기술의 해결책은 암 치료에서의 이들의 용도를 제한하는 다양한 단점에 시달린다. 예를 들어, 단클론성 항-IL13Rα2 항체 1E10B9(미국 특허 제9,868,788호; 문헌[Debinski, et al., New agents for targeting of IL-13RA2 expressed in primary human and canine brain tumors, PLoS One 2013, 8(10): e77719]))는, 실시예 부문에 나타낸 바와 같이 IgG 항체를 단일쇄 가변 단편(scFv) 형식으로 전환시켰을 때 인간 IL13Rα2에 특이적으로 결합하는 이의 능력을 상실한다. 항체 형식을 교대로 사용할 때 항원 결합의 손실은, 특히 IgG에서 scFv로 전환하는 경우에 드물지 않다. 항원-결합 부위의 구조에 영향을 미치는 변경된 단백질 폴딩은 이를 가장 잘 설명할 수 있다. 따라서, 선행 기술 단클론성 항-IL13Rα2 항체 1E10B9는 IgG 형식에서 사용될 수 있었지만, scFv 형식으로 전환하기에 적합하지 않으며, 이에 의해, CAR 기반 면역요법에서의 용법에 적합하지 않다.
단클론성 항-IL13Rα2 항체 mAb47(미국 특허 제10,308,719호; 문헌[Balyasnikova et al., Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin (IL)-13 receptor α2, J Biol Chem 2012, 287(36): 30215-30227; Kim et al., A novel single-chain antibody redirects adenovirus to IL13Rα2-expressing brain tumors, Sci Rep 2015, 5: 18133])은 scFv 형식으로 전환될 때 인간 IL13Rα2에 대해 보유된 결합을 나타냈다. 그러나, CAR 기반 면역요법에서 본 발명의 scFv와의 비교예에서, mAb47 scFv에 기반하여 생성된 CAR T 세포는 미미한 표적 세포 사멸만을 나타낸 반면, 실시형태에 따라 생성된 CAR T 세포는 낮은 효과기 대 표적 세포비로 실질적인 세포독성 능력을 이미 나타냈다. 따라서, 실시형태에 따른 항체의 항원-결합 단편은 CAR 기반 면역요법에서 사용될 때 항체 mAb47의 항원-결합 단편보다 우수하다. 더 나아가, 항체 mAb47은, 수용체 IL13Rα2에 결합할 때 리간드 인터류킨-13(IL-13)과 경쟁하는 반면, 실시형태의 몇몇 항체 및 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 IL-13과 경쟁하지 않는다.
본 명세서에서, 본 명세서에 기재된 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 가변 영역에서 모든 아미노산은 결과적으로 국제 면역유전학(International ImMunoGeneTics: IMGT) 정보 시스템 및 명명법에 따라 넘버링하고 정의한다(Lefranc et al., Dev Comp Immunol.　(2003) 1: 55-77).
인간 IL13Rα2 단백질 서열에서 아미노산 번호는 2021년 4월 26일자의 수탁번호 NP_000631 및 버전 NP_000631.1에 의한 NCBI 참조 서열에 따르며, 본 명세서에서 아래에 추가로 제시한다(서열번호 107).
Figure pct00001
항체 또는 이의 항원-결합 단편의 특이성은 친화도 및/또는 결합활성에 기반하여 결정될 수 있다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 항원의 해리를 위한 평형상수(K D)로 나타내는 친화도는 항원 결정기(antigenic determinant), 즉, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 상의 에피토프 및 항원-결합 부위 사이의 결합 강도에 대한 척도이다. K D 값이 작을수록 항원 결정기와 항체 또는 이의 항원-결합 단편 사이의 결합 강도는 더 강하다. 대안적으로, 친화도는 또한 1/K D인 친화도 상수(K A)로서 표현될 수 있다. 당업자에게 분명할 바와 같이, 친화도는 관심의 특정 항원에 따라서, 친화도는 그 자체가 알려진 방식으로 결정될 수 있다.
결합활성은 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 적절한 항원 사이의 결합 강도의 척도이다. 결합활성은, 항체 또는 이의 항원-결합 단편 상의 항원 결합 부위와 항원 결정기 사이의 친화도, 및 항체 또는 이의 항원-결합 단편 상에 존재하는 적절한 결합 부위의 수에 관한 것이다.
전형적으로, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 10-5 내지 10-12 몰/리터(M) 이하, 바람직하게는 10-7 내지 10-12M 이하, 더 바람직하게는 10-8 내지 10-12M의 평형 해리 상수(K D)로, 즉, 105 내지 1012M-1 이상, 바람직하게는 107 내지 1012M-1 이상, 더 바람직하게는 108 내지 1012M-1의 친화도 상수(K A)로 이들의 항원에 결합할 것이다.
일반적으로, 10-4M 초과의 임의의 K D 값(또는 104M-1 초과의 임의의 K A 값)은 비특이적 결합을 나타내는 것으로 간주된다.
바람직하게는, 실시형태의 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 500nM 미만, 바람직하게는 200nM 미만, 더 바람직하게는 10nM 미만, 예컨대, 5nM 미만의 친화도로 IL13Rα2에 결합할 것이다.
항원 또는 항원 결정기에 대한 항체, 또는 이의 항원-결합 단편의 특이적 결합은, 예를 들어, 스캐차드 분석(Scatchard analysis) 및/또는 경쟁 결합 분석, 예컨대, 방사면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소면역분석법(enzyme immunoassay: EIA) 및 샌드위치 경쟁 분석, LUMINEX® 다중복합 분석 및 당업계에 그 자체로 공지된 이들의 상이한 변이체를 포함하는, 그 자체로 공지된 임의의 적합한 방식으로 결정될 수 있다.
본 발명자들은 항체 및 이의 항원-결합 단편에 의해 표적화하는 데 상당히 적합한 IL13Rα2에서의 신규한 에피토프 또는 항원 결정기 영역을 발견하였다. 특히, 이런 신규한 에피토프를 표적화하는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 CAR 기반 면역요법에서 유용하다. 이 에피토프는 도 10에 나타낸 바와 같이 IL13Rα2의 도메인 1에서 제2 및 가장 큰 베타 시트에 대응한다. 이는 수용체의 N-말단 부분이며, 도메인 1은 서로의 위에 2개의 베타 시트가 있는 베타 샌드위치 폴딩으로 이루어진다. 에피토프는 가장 큰 베타 시트에서 4개의 가닥 중 3개에 위치되며, IL-13의 결합 부위로부터 IL13Rα2까지 떨어진 지점의 영역에 있다, 도 10 참조.
이 베타 시트 영역에서 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2에 대해 높은 특이성을 가졌고, IL13Rα1에 대해 결합을 나타내지 않았다. 항원-결합 단편은 CAR T 세포 기반 면역요법에서 IL13Rα2를 발현시키는 암 세포에 대해 우수한 세포독성 능력을 나타냈다.
따라서, 실시형태의 양상은 IL13Rα2에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2에서 아미노산 번호 68 내지 75의 제1 베타 가닥, 제1 베타 가닥에 후행하는 루프, IL13Rα2에서 아미노산 번호 101 내지 109의 제2 베타 가닥, 제2 베타 가닥에 선행하는 루프, 및 IL13Rα2에서 아미노산 번호 124 내지 128의 제3 베타 가닥을 포함하는 IL13Rα2의 베타 시트 영역 또는 도메인 내의 에피토프에 대해 특이성을 갖는다.
IL13Rα2의 아미노산 서열은 서열번호 107에 제시된다. 아미노산 번호 68 내지 75는 아미노산 서열 EYELKYRN(서열번호 108)에 대응하고, 아미노산 번호 101 내지 109는 아미노산 서열 IEAKIHTLL(서열번호 109)에 대응하며, 아미노산 번호 124 내지 128은 아미노산 서열 AETTY(서열번호 110)에 대응한다.
도 10은 에피토프를 형성하는 3, 6 및 7로 넘버링된 3개의 베타 가닥을 둘러싸는 빗금친 타원을 갖는 도메인 1의 가장 큰 베타 시트를 예시한다. 베타 가닥 6 및 7은 알파 나선과 굴곡을 포함하는 루프 영역과 상호 연결된다. 베타 가닥 3 및 6은 2개의 턴(turn) 및 2개의 베타 가닥(번호 4 및 5, 여기서 베타 가닥 4는 가닥 3, 6, 7과 함께 가장 큰 베타 시트에 속하고, 베타 가닥 5는 도메인 1의 처음의 더 작은 베타 시트에 속함)을 포함하는 아미노산 서열과 상호 연결된다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2에서 아미노산 번호 67 내지 81, 아미노산 번호 96 내지 106 및 아미노산 번호 123 내지 128로 이루어진 군으로부터 선택된, 에피토프 영역으로도 지칭되는, 적어도 하나의 펩타이드를 포함하는 에피토프에 대한 특이성을 갖는다.
실시형태에서, 제1 펩타이드 또는 에피토프 영역(VEYELKYRNIGSETW, 서열번호 44)은 실질적으로 IL13Rα2에서 베타 가닥 3, 및 베타 가닥 3에 후행하는 턴에 대응한다. 제2 펩타이드 또는 에피토프 영역(DLNKGIEAKIH, 서열번호 45)은 실질적으로 베타 가닥 6 및 이에 선행하는 루프의 짧은 신장부에 대응하는 반면, 제3 펩타이드 또는 에피토프 영역(WAETTY, 서열번호 46)은 실질적으로 베타 가닥 7에 대응한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2의 베타 시트에서 이들 3개의 펩타이드 또는 에피토프 영역 중 적어도 하나에 대해 특이성을 갖는다. 따라서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 펩타이드 또는 에피토프 영역(VEYELKYRNIGSETW, 서열번호 44)에 대해 특이성을 갖거나, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 펩타이드 또는 에피토프 영역(DLNKGIEAKIH, 서열번호 45)에 대해 특이성을 갖거나 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제3 펩타이드 또는 에피토프 영역(WAETTY, 서열번호 46)에 대해 특이성을 갖는다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2의 베타 시트에서 이들 3개의 펩타이드 또는 에피토프 영역 중 적어도 둘에 대해 특이성을 갖는다. 따라서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 펩타이드 또는 에피토프 영역(VEYELKYRNIGSETW, 서열번호 44) 및 제2 펩타이드 또는 에피토프 영역(DLNKGIEAKIH, 서열번호 45)에 대해 특이성을 갖거나, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제1 펩타이드 또는 에피토프 영역(VEYELKYRNIGSETW, 서열번호 44) 및 제3 펩타이드 또는 에피토프 영역(WAETTY, 서열번호 46)에 대해 특이성을 갖거나 또는 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 제2 펩타이드 또는 에피토프 영역(DLNKGIEAKIH, 서열번호 45) 및 제3 펩타이드 또는 에피토프 영역(WAETTY, 서열번호 46)에 대해 특이성을 갖는다.
바람직한 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2의 베타 시트에서 이들 3개의 펩타이드 또는 에피토프 영역 모두, 즉, 제1 펩타이드 또는 에피토프 영역(VEYELKYRNIGSETW, 서열번호 44), 제2 펩타이드 또는 에피토프 영역(DLNKGIEAKIH, 서열번호 45) 및 제3 펩타이드 또는 에피토프 영역(WAETTY, 서열번호 46)에 대해 특이성을 갖는다.
본 발명은 또한 IL13Rα2의 에피토프에 관한 것이다. 에피토프는 IL13Rα2에서 아미노산 번호 68 내지 75의 제1 베타 가닥, 제1 베타 가닥에 후행하는 루프, IL13Rα2에서 아미노산 번호 101 내지 109의 제2 베타 가닥, 제2 베타 가닥에 선행하는 루프, 및 IL13Rα2에서 아미노산 번호 124 내지 128의 제3 베타 가닥을 포함하는 IL13Rα2의 베타 시트 영역 내에 있다.
실시형태에서, 에피토프는 IL13Rα2에서 아미노산 번호 67 내지 81, 즉, VEYELKYRNIGSETW(서열번호 44), 아미노산 번호 96 내지 106, 즉, DLNKGIEAKIH(서열번호 45) 및 아미노산 번호 123 내지 128, 즉, WAETTY(서열번호 46)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드, 바람직하게는 적어도 2개의 펩타이드 및 더 바람직하게는 모두 3개의 펩타이드를 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 YSPFY(서열번호 3)를 포함하는 가변 중쇄(VH) 도메인 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 YSPFYM(서열번호 9)을 포함하는 VH 도메인 CDR3을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 ARYSPFYMDY(서열번호 10)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR3을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GYSFPP(서열번호 4)를 포함하는 가변 경쇄(VL) 도메인 CDR3을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QQGYSFPPT(서열번호 11)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR3을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SGSY(서열번호 1)를 포함하는 VH 도메인 CDR1을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFSGSY(서열번호 106)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR1을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SGSYMS(서열번호 5)를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 서열 GFTFSGSYMS(서열번호 6)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 연장된 VH 도메인 CDR1을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 YGSGGY(서열번호 2)를 포함하는 VH 도메인 CDR2를 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 IYGSGGYT(서열번호 7)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR2를 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SIYGSGGYTY(서열번호 8)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 연장된 VH 도메인 CDR2를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 연장된 CDR은 IMGT 명명법에 따라 정의된 바와 같은 CDR의 아미노산 외에 적어도 하나의 추가적인 아미노산 잔기를 포함하는 아미노산 서열에 관한 것이다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 12)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인 CDR1을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 AAS를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인 CDR2를 포함한다.
항체 또는 이의 항원-결합 단편은 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 CDR 영역의 상기 기재한 실시형태 중 적어도 하나, 바람직하게는 CDR 영역의 적어도 둘, 더 바람직하게는 적어도 셋 및 훨씬 더 바람직하게는 적어도 넷, 적어도 다섯 또는 모두를 포함할 수 있다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재한 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 CDR 영역 중 적어도 둘을 포함한다. 이러한 실시형태는 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1 및 VH 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1 및 VH 도메인 CDR3의 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2 및 VH 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 상기 정의한 바와 같은 VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재한 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 CDR 영역 중 적어도 셋을 포함한다. 이러한 실시형태는 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2 및 VH 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 상기 정의한 바와 같은 VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재한 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 CDR 영역 중 적어도 넷을 포함한다. 이러한 실시형태는 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR1을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR2을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재한 VH 도메인 및/또는 VL 도메인 CDR 영역 중 적어도 다섯을 포함한다. 이러한 실시형태는 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR2를 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR3 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 상기 기재한 VH 도메인 및 VL 도메인 CDR 영역의 모두 여섯을 포함한다. 이러한 실시형태는 상기 정의한 바와 같은 VH 도메인 CDR1, VH 도메인 CDR2, VH 도메인 CDR3, VL 도메인 CDR1, VL 도메인 CDR2 및 VL 도메인 CDR 3을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열
Figure pct00002
를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열
Figure pct00003
를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 및 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인을 포함한다.
실시형태의 특히 바람직한 항체는 본 명세서에서 ME107-117 또는 W-ME107-117로 정의되며, 이의 대응하는 항원-결합 단편은 ME107-117 scFv 또는 W-ME107-117 scFv로 정의된다. 이 항체 및 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2의 베타 시트에서 에피토프에 특이적으로 결합하고(도 10), 상기 제시한 바와 같은 VH 및 VL 도메인 CDR 영역을 포함한다.
실시형태의 다른 양상은 IL13Rα2에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFX1X2X3X4를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR1을 포함하되, 각각의 Xn(n=1...4)은 G, A, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 아미노산 서열 IB1B2B3B4B5B6T를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR2를 포함하되, 각각의 Bm(m=1...6)은 G, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 AR-ZH-Z1DY를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR3을 추가로 포함하되, Z1은 F, M, I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, ZH는 VVRSTYGY(서열번호 15), YGHYAYGSY(서열번호 16), YSSSGWYYGF(서열번호 17), TPYSAY(서열번호 18), RYRSHRPGLS(서열번호 19), FHPRYGY(서열번호 20), GSYSHYGAHY(서열번호 21), YYHYDYGYYY(서열번호 22), YSPFY(서열번호 3), RNYWEHGGGS(서열번호 24), HHYGYYPPGSVYY(서열번호 25) 및 VEYTYYGSEGSPV(서열번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 12)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인 CDR1을 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 또한 아미노산 서열 AAS를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인 CDR2 및 아미노산 서열 QQ-ZL-T를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인 CDR3을 포함하되, ZL은 TYYSPH(서열번호 28), DYYLF(서열번호 29), SYSTPY(서열번호 30), FYSYPL(서열번호 31), AFSPS(서열번호 32), SYDTLL(서열번호 33), ALSSLP(서열번호 34), FSTRLS(서열번호 35), GYSFPP(서열번호 4), STYPF(서열번호 37), YGSNPL(서열번호 38) 및 RYNGLF(서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFX1X2X3X4MX5를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 연장된 VH CDR1을 포함한다. 본 실시형태에서, 각각의 Xn(n=1...5)은 G, A, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
실시형태에서, X5는 S 또는 G이다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 JIB1B2B3B4B5B6TY를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 연장된 VH CDR2를 포함한다. 본 실시형태에서, 각각의 Bm(m=1...6)은 G, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, J는 A, Y, G 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, J는 A, Y 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, X1은 S 또는 Y이고; X2는 S 또는 G이며; X3은 S 또는 Y이고; X4는 A, Y 또는 G이다.
실시형태에서, B1은 S 또는 Y이고; B2는 G이며; B3은 S, G 또는 Y이고; B4는 G이며; B5는 S 또는 G이고; B6은 S 또는 Y이다.
실시형태에서, ZH-Z1은 YGHYAYGSYF(서열번호 40), TPYSAYI(서열번호 41), GSYSHYGAHYL(서열번호 42) 및 YSPFYM(서열번호 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시형태에서, ZL은 DYYLF(서열번호 29), FYSYPL(서열번호 31), ALSSLP(서열번호 34) 및 GYSFPP(서열번호 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타낸다.
실시형태의 현재 바람직한 항원-결합 단편은 본 명세서에서 W-ME107-7, W-ME107-10, W-ME107-16, W-ME107-27, W-ME107-55, W-ME107-67, W-ME107-75, W-ME107-112, W-ME107-117, W-ME107-128, W-ME107-150 및 W-ME107-156으로 정의된다. 대응적으로 바람직한 항체는 이들 항원-결합 단편에 대응하는 CDR 영역 및 VH 및 VL 도메인을 갖는다. 표 1은 VH 도메인 CDR1을 나타내고, 표 2는 VH 도메인 연장된 CDR1을 나타내며, 표 3은 VH 도메인 CDR2를 나타내고, 표 4는 VH 도메인 연장된 CDR2를 나타낸다. 표 5는 VH 도메인 CDR3을 나타내고, 표 6은 VL 도메인 CDR3을 나타낸다. W-ME107-7, W-ME107-10, W-ME107-16, W-ME107-27, W-ME107-55, W-ME107-67, W-ME107-75, W-ME107-112, W-ME107-117, W-ME107-128, W-ME107-150 및 W-ME107-156 모두는 QSISSY(서열번호 12)의 공통 VL 도메인 CDR1 및 AAS의 공통 VL 도메인 CDR2를 갖는다.
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
실시형태의 특히 바람직한 항원-결합 단편은 W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-75 및 W-ME107-117이고, 특히 바람직한 항체는 W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-75 및 W-ME107-117의 VH 및 VL CDR 영역을 갖는 항체이다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-10의 VH CDR 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-10의 VL CDR3 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-10의 VH CDR 영역, 및 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-10의 VL CDR3 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-27의 VH CDR 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-27의 VL CDR3 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-27의 VH CDR 영역, 및 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-27의 VL CDR3 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-75의 VH CDR 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-75의 VL CDR3 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-75의 VH CDR 영역, 및 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-75의 VL CDR3 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-117의 VH CDR 영역을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-117의 VL CDR3 영역을 포함한다.
특정 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 표 1, 표 3 및 표 5에 명시된 바와 같은, 바람직하게는 표 2, 표 4 및 표 5에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-117의 VH CDR 영역, 및 공통 VL 도메인 CDR1 및 CDR2 영역과 함께 표 6에 명시된 바와 같은 클론 W-ME107-117의 VL CDR3 영역을 포함한다.
W-ME107-10은 (서열번호 86):
Figure pct00010
의 VH 도메인
및 (서열번호 87):
Figure pct00011
의 VL 도메인을 포함한다.
W-ME107-27은 (서열번호 88):
Figure pct00012
의 VH 도메인
및 (서열번호 89):
Figure pct00013
의 VL 도메인을 포함한다.
W-ME107-75은 (서열번호 90):
Figure pct00014
의 VH 도메인
및 (서열번호 91):
Figure pct00015
의 VL 도메인을 포함한다.
W-ME107-117은 (서열번호 13):
Figure pct00016
의 VH 도메인
및 (서열번호 14):
Figure pct00017
의 VL 도메인을 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 VH 도메인은 링커를 통해 VL 도메인에 융합된다. 항체 및 이의 항원-결합 단편에서 VH 및 VL 도메인을 상호 연결하기 위해 통상적으로 사용되는 다양한 이러한 링커는 실시형태에 따라 사용될 수 있었다. 특정 실시형태에서, 링커는 펩타이드 링커이다. 예를 들어, 펩타이드 링커는 아미노산 글리신(G) 및/또는 세린(S)을 포함하거나, 예컨대, 이들로 이루어질 수 있었다. 이러한 펩타이드 링커의 예시적이지만, 비제한적인 예는 GGGGSGGGGSGGGGS(서열번호 27)의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진다.
당업자는 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 기능적 특성, 예컨대, 이것이 IL13Rα2에 결합하는 능력을 초래하는 일 없이 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4개 또는 심지어 더 많은 아미노산 잔기의 아미노산의 결실 또는 첨가를 비롯한, 치환과 같은 약간의 변형이 발생될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 변형은 CDR의 아미노산 서열에, CDR 영역, 즉, 프레임워크 영역 밖의 아미노산 서열에, 또는 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 CDR의 아미노산 서열과 CDR 영역 밖의 아미노산 서열 둘 다에 있을 수 있다. 따라서, 실시형태는 또한 본 명세서에 제시된 또는 서열목록의 임의의 아미노산 서열의 적어도 75%, 바람직하게는 적어도 80%, 예컨대, 적어도 85%, 더 바람직하게는 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 적어도 99%의 서열 동일성을 갖는 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 서열 동일성은 두 아미노산 서열, 예컨대, 펩타이드 또는 단백질 서열 사이의 서열 유사성을 지칭한다. 유사성은 서열 사이의 구조적 및/또는 기능적 관계를 결정하기 위해 서열 정렬에 의해 결정된다. 아미노산 서열 사이의 서열 동일성은, 예를 들어, 디폴트 파라미터 세팅(단백질 정렬을 위해, Gap costs Existence:11 Extension:1)을 이용하여 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi를 통해 미국 메릴랜드주 베세즈다 소재의 미국 국립생물정보센터(NCBI)로부터 입수 가능한 니들맨-분쉬 전역 서열 정렬 도구(Needleman-Wunsch Global Sequence Alignment Tool)를 이용하여 서열 정렬을 비교함으로써 결정될 수 있다. 이 소프트웨어를 이용하여 본 명세서에 언급된 서열 비교 및 백분율 동일성을 결정하였다. 서열 동일성 수준을, 예를 들어, 아미노산 서열과 비교할 때, 이는, 바람직하게는 아미노산 서열의 전체 길이에 대해 행해져야 하고, 즉, 전역 정렬 방법은 높은 동일성 중첩의 짧은 영역을 피하기 위해 사용되어 동일성의 높은 전반적 평가를 초래한다. 예를 들어, 5개의 아미노산을 갖는, 예를 들어, 짧은 폴리펩타이드 단편은 아미노산 서열의 전체 내에서 5개의 아미노산 영역에 대해 100% 동일한 서열을 가질 수 있지만, 단편이 아미노산 서열에서의 위치와 동등한 다른 위치에서 또한 동일한 아미노산을 갖는 더 긴 서열의 부분을 형성하지 않는 한, 100%의 아미노산 동일성을 제공하지 않는다. 비교되는 서열에서 동등한 위치가 동일한 아미노산에 의해 점유되는 경우, 해당 위치에서 분자는 동일하다. 정렬을 동일성 백분율로서 점수화하는 것은 비교되는 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일한 아미노산 수의 함수이다. 서열을 비교할 때, 서열에 가능한 삽입 및 결실을 고려하여, 서열 중 하나 이상에 갭이 도입되는 최적의 정렬이 필요할 수 있다.
실시형태에서, 항체는 단클론성 항체이다. 다른 실시형태에서, 항체는 다클론성 항체이다.
실시형태에서, 항체는 유전자 조작된 항체, 예를 들어, 단일쇄 항체, 인간화된 항체, 키메라 항체, CDR-접합 항체, 인간화된 항체, 이중특이성 항체 또는 다중 특이성 항체이다. 실시형태에서, 항체는 키메라 항체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 키메라 항체는 하나의 종으로부터의 불변 도메인 및 제2 종으로부터의 가변 도메인을 포함하는 항체를 지칭한다.
실시형태에서, 항체는 인간화된 항체이다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 인간화는 본래의 공급원 항체보다는 진정한 인간 항체와 더 유사한 구조 및 면역학적 기능을 갖도록 조작된 비-인간 공급원으로부터의 적어도 하나의 CDR 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 인간화된 항체의 예는 인간 항체에 접합된 비인간 항체로부터의 CDR 영역을 갖는 항체이다. 인간화는 추가적으로 또는 대안적으로, 비인간 아미노산 서열을 인간 서열과 더 유사하게 만들기 위해 선택된 아미노산 치환을 수반할 수 있다.
항체를 생성하는 적합한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 표준 하이브리도마 방법은 문헌[Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), 및 CA. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, N.Y. (2001))]에 기재되어 있다.
단클론성 항체는 배양물내 연속 세포주에 의한 항체 분자의 생성을 제공하는 임의의 기법을 이용하여 제조될 수 있다. 이들은 문헌[Nature 256: 495-497, 1975]에 처음 기재된 하이브리도마 기법, 인간 B-세포 하이브리도마 기법(Immunol Today 4:72, 1983; Proc Natl Acad Sci 80: 2026-2030, 1983) 및 EBV-하이브리도마 기법(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, New York N.Y., pp 77-96, (1985))을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
다클론성 항체는 IL13Rα2 항원을 포함하는 면역원으로 동물을 면역화시키고 면역화된 동물로부터 항혈청을 수집함으로써 제조될 수 있다. 토끼, 마우스, 래트, 햄스터, 염소, 양, 돼지 또는 말을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는, 항혈청 생산을 위해 다양한 동물 종이 사용될 수 있다.
항체 및 이의 항원-결합 단편은 대안적으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 파지 디스플레이 선택을 이용하여 생산될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같은 항체의 항원-결합 단편은 단일쇄 항체, Fv 단편, scFv 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fd 단편, 단일-도메인 항체(sdAb), scFv-Fc 단편, 다이-scFv 단편 및 CDR 영역으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 항원-결합 단편의 현재의 바람직한 실시형태는 단일쇄 가변 단편(scFv)이다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2, 바람직하게는 인간 IL13Rα2에 특이적으로 결합한다. 실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 추가적으로 또는 대안적으로 비-인간 IL13Rα2에 특이적으로 결합한다. 이러한 비-인간 IL13Rα2의 예시적이지만, 비제한적인 예는 개 IL13Rα2, 고양이 IL13Rα2, 소 IL13Rα2, 말 IL13Rα2, 양 IL13Rα2, 래트 IL13Rα2 및/또는 마우스 IL13Rα2를 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 인간 IL13Rα1에 결합하지 않는다.
실시형태의 양상은 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다. CAR은 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항원 인식 도메인을 포함한다. CAR은 또한 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함한다.
일반적으로, CAR은 엑토도메인, 막관통 도메인 및 엔도도메인을 포함한다. CAR의 엑토도메인은 scFv일 수 있는 항원 인식 영역을 포함한다. 엑토도메인은 또한 CAR을 소포체로 향하게 하는 신호 태그 또는 펩타이드를 포함할 수 있다.
막관통 도메인은 세포막을 가로지르는 CAR의 일부이다. 일반적으로, 막관통 도메인은 임의의 막관통 단백질로부터 유래될 수 있다. 실시형태에서, 막관통 도메인은 소수성 알파 나선을 포함한다. CAR에 포함될 수 있는 막관통 도메인의 예시적이지만, 비제한인 예는 분화 클러스터 28의 막관통 도메인(CD28)의 모두, 또는 일부, CD8α의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD27의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD137의 막관통 도메인(4-1BB)의 모두 또는 일부, CD134의 막관통 도메인(OX40)의 모두 또는 일부, CD3ε의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3ζ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3γ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3δ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, TCRα의 막관통 도메인의 모두 또는 일부 및 TCRβ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, 바람직하게는 CD28의 막관통 도메인의 모두 또는 일부 또는 CD8α의 막관통 도메인의 모두 또는 일부를 포함한다.
CAR의 엔도도메인은 적어도 하나의 신호전달 도메인을 포함한다. CAR에 포함될 수 있는 이러한 신호전달 도메인의 예시적이지만, 비제한적인 예는 CD3의 제타 쇄(CD3ζ), CD28, CD137(4-1BB), ICOS, CD27, CD40, OX40(CD134) 또는 Myd88, 바람직하게는 CD3ζ 및/또는 CD137을 포함한다.
실시형태에서, CAR은 항원 인식 도메인과 막관통 도메인을 상호 연결하는 힌지 도메인 또는 스페이서를 포함한다.
실시형태의 관련 양상은 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항원 인식 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 복합체를 정의한다.
TCR은 주조직적합 복합체(MHC) 분자에 결합된 펩타이드로서 항원의 단편을 인식하는 것을 담당하는 T 세포 표면 상에서 발견되는 분자이다. TCR이 항원성 펩타이드 및 MHC와 관여될 때, T 세포는 신호 형질도입, 즉, 연관된 효소, 공동-수용체, 전문화된 어댑터 분자, 및 활성화 또는 방출된 전사 인자에 의해 매개되는 일련의 생화학적 사건을 통해 활성화된다. TCR-복합체는 보통 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄 및 2개의 CD3ε 쇄와 연관된 TCR 분자이다. 이들 쇄는 T 세포에서 활성화 신호를 생성하기 위해 TCR 및 ζ-쇄(제타-쇄)와 회합된다. TCR, ζ-쇄 및 CD3 분자는 함께 TCR-복합체를 구성한다.
사용될 수 있는 TCR의 비제한적 예는 CMVpp65 TCR 및 TARP TCR을 포함한다.
실시형태의 다른 양상은 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 효과기 분자를 포함하는 접합체에 관한 것이다.
실시형태의 접합체는 표적화 도메인 또는 분자 및 효과기 도메인 또는 분자로서 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다. 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 종양 세포를 포함하는 IL13Rα2를 발현시키는 세포에 대한 접합체를 표적화한다.
실시형태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다양한 소위 효과기 도메인 또는 분자와 관련하여 사용될 수 있다. 실시형태에서, 효과기 분자는 검출 가능한 표지, 세포독소, 금속, 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 서열 및 지질 이중층 도킹 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 효과기 도메인은 검출 및 진단 목적을 위해 사용될 수 있다. 이러한 경우에, 효과기 도메인은 검출 가능한 표지, 예컨대, 방사성표지, 형광 표지, 화학발광 표지이다. 이어서, 접합체는, 예를 들어, 대상체 신체에서, IL13Rα2, 예컨대, IL13Rα2 발현 세포의 진단 및 영상화를 위해 사용될 수 있다. 이어서, 다양한 영상 기법은 특정 검출 가능한 표지, 예를 들어, X-선 영상화, 자기 공명 영상화(MRI), 양전자방출 단층촬영술(PET) 또는 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영술(SPECT)에 따라서 사용될 수 있다.
검출 가능한 표지를 이용하는 대신에, 실시형태의 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 수소 또는 탄소와 같은 원소를 동위원소로, 예컨대, 수소 대신에 중수소 및 12C 대신에 13C로 치환함으로써 검출될 수 있다.
금속은 또한 상자성 금속 및 방사성동위원소를 포함하는 영상화 목적을 위해 효과기 도메인으로서 사용될 수 있다.
세포독소, 또는 세포독성제는 세포독성을 발휘하기 위해 효과기 도메인으로서 사용될 수 있고, 일단 접합체가 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하여 세포를 표적화하였다면, IL13Rα2 발현 세포를 사멸시킬 수 있다. 세포독소의 전형적인 예는 화학치료제이다. 임의의 화학치료제는 알킬화제, 대사길항물질, 항미세관제, 토포아이소머라제 저해제 및 세포독성 항생제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 실시형태에 따라 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, 효과기 도메인은 세포 발현 IL13Rα2에 의한 세포자멸사의 유도를 야기하고 접합체에 의해 표적화된 세포자멸사 태그이다. 이러한 세포자멸사 태그의 예는 TRAIL 단백질이다.
또 다른 실시형태에서, 효과기 도메인은 T 세포 또는 B 세포 에피토프, 또는 에피토프에 대해 T- 또는 B-세포 면역의 특이적 유도를 야기하는 T 세포 또는 B 세포 에피토프에 대해 암호화하는 핵산 서열이다.
효과기 도메인은 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 예를 들어, 효과기 도메인은 IgG 또는 다른 면역글로불린의 Fc 도메인일 수 있다. 이어서, Fc 도메인은 단백질 A 친화도 칼럼을 통해 정제를 가능하게 하는 데 사용될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, Fc 도메인은 생체내 접합체의 반감기를 개선시킬 수 있다. 더 나아가, Fc 영역은 접합체의 이량체화/다량체화를 가능하게 한다.
실시형태의 추가 양상은 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, CAR 및/또는 TCR-복합체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같은 핵산 분자는 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 및 핵산 서열을 포함하고, 일반적으로 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있고, 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오타이드를 함유할 수 있으며, 비변형 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 사이에서 발견된 포스포다이에스터 대신에, 천연, 비천연 또는 변경된 뉴클레오타이드간 결합, 예컨대, 포스포로아미데이트 결합 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미한다. 핵산 분자는 또한 상보성 DNA(cDNA) 및 전령 RNA(mRNA)를 포함한다.
핵산 분자는 또한 실시형태에 따라 항체 또는 이의 항원-결합 단편보다는 다른 분자를 암호화할 수 있다. 이러한 다른 분자의 예시적 예는 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori: HP) 호중구 활성화 단백질(NAP)이고, HP-NAP는 헬리코박터 파일로리 박테리아 감염에서 발병인자로서 작용하는 12량체 단백질이다. 이는 12개의 단량체 서브유닛으로 이루어지고, 각 서브유닛은 4개의 알파-나선으로 이루어진다. HP-NAP의 표면은 상당히 양으로 하전되어 있고, 또한 백혈구를 의미하는 인간 백혈구 세포(WBS)와 상호작용하고 이를 활성화시키는 능력을 갖는다.
실시형태의 다른 양상은 실시형태에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
벡터는 바람직하게는 발현 벡터, 즉, 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 예컨대, 숙주 T 세포에서 발현될 수 있는, 예컨대, 전사 및 번역될 수 있는 암호화 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하는 벡터. 발현 벡터는 DNA 분자, RNA 분자, 플라스미드, 에피솜 플라스미드 및 바이러스 벡터 중에서 선택된 실시형태이다.
실시형태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 셈리키 삼림열 바이러스, 폴리오 바이러스 및 혼성 벡터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
렌티바이러스는 레트로바이러스의 하위부류이다. 이들은 다른 레트로바이러스가 분열 세포만을 감염시키기 때문에 렌티바이러스의 독특한 특징인 비분열 세포의 게놈으로 통합되는 이들의 능력 덕분에 유전자 전달 비히클(벡터)로서 적합화된다. RNA 형태에서 바이러스 게놈은 바이러스가 T 세포와 같은 세포에 유입될 때 역전사되어, DNA를 생성하고, 이어서, 바이러스 인테그라제 효소에 의해 위치에 있는 게놈에 삽입된다. 현재 프로바이러스로 불리는 벡터는 게놈에 남아있으며, 이것이 분열되는 세포의 자손에 대해 계대된다. 안전성의 이유로, 렌티바이러스 벡터는 전형적으로 이들의 복제에 필요한 유전자를 결코 운반하지 않는다. 렌티바이러스를 생성하기 위해, 몇몇 플라스미드는 소위 패키징 세포주, 통상적으로 HEK 293에 형질감염된다. 일반적으로 패키징 플라스미드로서 지칭되는 하나 이상의 플라스미드는 비리온 단백질, 예컨대, 캡시드 및 역전사효소를 암호화한다. 다른 플라스미드는 벡터에 의해 전달될 유전자 물질을 함유한다. 이는 단일-가닥 RNA 바이러스 게놈을 생성하도록 전사되고, ψ(프사이) 서열의 존재에 의해 표시된다. 이 서열은 비리온에 게놈의 패키징을 위해 사용된다.
레트로바이러스는 현재의 유전자 요법 접근의 중심 중 하나이다. 재조합 레트로바이러스, 예컨대, 몰로니(Moloney) 뮤린 백혈병 바이러스는 안정적인 방식으로 숙주 게놈에 통합되는 능력을 갖는다. 이들은 숙주 게놈에 통합을 가능하게 하는 역전사효소를 함유한다. 레트로바이러스 벡터는 복제-적격 또는 복제-결함 중 하나일 수 있다. 복제-결함 벡터는, 바이러스가 다른 유전자로 대체되거나 결실되는 비리온 복제 및 패키징의 추가 라운드에 필요한 유전자에 대한 암호화 영역을 갖기 때문에, 가장 통상적인 선택이다. 이들 바이러스는 T 세포를 감염시키고, 이들의 바이러스 페이로드(viral payload)를 전달하지만, 이어서, 세포 용해 및 사멸을 야기하는 전형적인 용해 경로를 계속하지 못한다. 벡터가 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터라면, CAR 및/또는 TCR-복합체 및 HP-NAP 및/또는 HP-NAP의 면역학적으로 동등한 단편을 암호화하는 핵산 서열은 바람직하게는 RNA 서열(들)이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같은 아데노바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터 및 아데노바이러스-유래 바이러스 벡터를 포함한다.
아데노바이러스 DNA는 게놈에 통합되지 않으며, 세포분열 동안 복제되지 않는다. 아데노-유래 바이러스 벡터는 아데노바이러스에 기반하지만, 이때, 예컨대 뉴클레오타이드 서열 암호화 복제 단백질, 조절 단백질, 바이러스 표면 단백질 등에 관해 다양한 변형이 행해졌다.
아데노-연관 바이러스(AAV)는 인간 및 일부 영장류 종을 감염시키는 소형 바이러스이다. AAV는 분열 세포와 비분열 세포를 둘 다 감염시킬 수 있고, 게놈을 숙주 세포에 혼입시킬 수 있다. 게다가, AAV는 대부분 길고 안정적인 발현을 수행하는 에피솜으로서 머무른다. AAV가 DNA의 단일 가닥을 패키징하고, 제2 가닥 합성 과정을 필요로 하지만, 자기-상보성 아데노-연관 바이러스(scAAV)는 함께 어닐링되는 가닥을 둘 다 패키징하여 이중 가닥 DNA를 형성한다. 제2 가닥 합성을 건너뜀으로써, scAAV는 세포에서의 신속한 발현을 가능하게 한다. 벡터가 아데노바이러스 벡터라면, CAR 및/또는 TCR-복합체 및 HP-NAP 및/또는 HP-NAP의 면역학적으로 동등한 단편을 암호화하는 핵산 서열은 바람직하게는 DNA 서열(들)이다.
셈리키 삼림열 바이러스는 9가지 단백질을 암호화하는 대략 13,000개의 염기쌍의 게놈이 있는 양성-가닥 RNA 바이러스이다. 게놈의 5'의 2/3는 RNA 합성에 관한 4가지 비구조적 단백질을 암호화하고, 구조적 단백질은 3'의 1/3에서 암호화된다. 구조적 단백질 중에서, C 단백질은 숙주 세포로부터 유래된 지질 이중층에 의해 뒤덮인 정이십면체 캡시드를 구성한다. 바이러스의 가장 바깥쪽 표면은 외부 껍질을 형성하는 상호 연결된 삼량체에 배열된 당단백질 E1과 E2의 이형이량체에 의해 거의 완전하게 뒤덮인다. 삼량체는 뉴클레오캡시드와 회합되는 E2 세포질 도메인에 의해 막에 고정된다. 이의 넓은 숙주 범위 및 효율적인 복제로 인해, 이는 또한 벡터로서 개발되었다.
혼성 벡터는 하나 초과의 벡터의 품질을 갖도록 유전자 조작된 벡터 바이러스이다. 예를 들어, 혼성 벡터는 아데노바이러스와 렌티바이러스의 조합일 수 있다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, CAR 및/또는 TCR-복합체를 암호화하는 핵산 분자(들)는 프로모터의 전사 제어 하에 있다. 실시형태에서, 프로모터는 인간 EF1α 프로모터, CMV 프로모터 및 CAG 프로모터, 바람직하게는 EF1α 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다.
실시형태에서, 벡터는 EF1a 프로모터와 같은 프로모터의 전사 제어 하에 CAR 및/또는 TCR-복합체를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 벡터는 또한 분비를 위해 바람직하게는 신호 펩타이드에 의해, 그리고 유도성 프로모터, 예컨대, 유도성 NFAT-IL-2 프로모터의 전사 제어 하에, HP-NAP를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
실시형태의 추가 양상은 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CAR; TCR-복합체; 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함하는 세포에 관한 것이다.
이어서, 핵산 또는 벡터는 세포에서 항체 또는 이의 항원-결합 단편, CAR 및/또는 TCR-복합체를 생성하기 위해 세포에서 전사될 수 있다.
실시형태에서, 세포는 T 세포, 자연살해(NK) 세포, B 세포, 단핵구 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 세포는 T 세포이다.
실시형태는 또한 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CAR; TCR-복합체; 세포; 접합체; 핵산; 및/또는 벡터 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 약제학적 조성물의 다른 구성성분(들)과 양립 가능한 임의의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 비히클 및/또는 부형제(이들의 조합물을 포함)일 수 있었다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 담체의 비제한적 예는 주사 용액, 예컨대, 식염수 또는 완충 주사 용액을 포함한다.
실시형태는 또한 의약으로서 사용하기 위한 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CAR; TCR-복합체; 효과기 분자가 세포독소인 접합체; 핵산 분자; 벡터; 세포 및/또는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CAR; TCR-복합체; 효과기 분자가 세포독소인 접합체; 핵산 분자; 벡터; 세포 및/또는 약제학적 조성물은 암 세포 상에서 IL13Rα2의 발현을 특징으로 하는 암 질환, 즉, IL13Rα2-발현 암 질환의 발병을 치료 또는 지연시키는 데 사용될 수 있다.
실시형태에서, IL13Rα2-발현 암 질환은 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암, 흑색종 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
추가 실시형태는 대상체에서 IL13Rα2-발현 암을 치료, 감소 및/또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 실시형태에 따른 유효량의 항체 또는 이의 항원-결합 단편; CAR; TCR-복합체; 효과기 분자가 세포독소인 접합체; 핵산 분자; 벡터; 세포 및/또는 약제학적 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 유효량은 목적하는 결과를 달성하는 데 필요한 투약량 및 일정 시간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 예를 들어, 종양 성장의 저해와 관련하여, 유효량은, 예를 들어, 세포의 투여 없이 얻은 반응에 비해서 관해를 유도하고/하거나, 종양 부담을 감소시키고/시키거나 종양 확산 또는 성장을 방지하는 양이다. 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별, 체중과 같은 인자에 따라 다를 수 있다. 본 명세서에 사용되고 당업계에서 잘 이해되는 바와 같은 치료하는 또는 치료는 임상 결과를 포함하는 유리한 또는 목적하는 결과를 얻기 위한 접근을 의미한다. 유리한 또는 목적하는 임상 결과는, 예를 들어, 하나 이상의 증상 또는 병태의 경감 또는 개선, 질환 정도의 감소, 질환의 안정화된 상태, 즉, 악화 방지, 질환 확산 방지, 질환 진행의 지연 또는 늦춤, 질환 상태의 개선 또는 완화, 질환 재발의 감소 및 관해를 포함할 수 있었다. 치료하는 또는 치료는 또한 임의의 치료를 받지 않은 경우 예상되는 생존에 비해서 생존을 연장시킬 수 있다.
본 명세서에 사용되고 당업계에서 잘 이해되는 바와 같은 예방하는 또는 예방은 질환 발생의 연장 또는 지연을 포함하여 질환 또는 병태가 발생할 위험이 감소되거나 방지되는 접근을 의미한다. 예를 들어, 유전자 또는 유전적 소인으로 인한 것과 같이 질환이 발생하는 성향이 있는 환자는 질환의 발생을 방지하고/하거나, 질환이 발생할 위험을 감소시키고/시키거나 질환의 발생을 지연시키고/시키거나 늦추는 데 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 세포, 접합체 및/또는 약제학적 조성물의 투여가 유리할 수 있었다.
환자는 바람직하게는 인간 환자이다. 그러나, 실시형태는 또한 수의과적 적용, 즉, 예를 들어, 영장류, 원숭이, 유인원, 소, 양, 돼지, 염소, 말, 고양이, 개, 마우스, 래트 및 기니피그를 포함하는 비인간 포유류와 같은 비인간 환자에 적용될 수 있다. 실시형태에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 세포, 접합체 및/또는 약제학적 조성물은, 예를 들어, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내 또는 종양내 투여를 포함하는 다양한 경로에 따라 환자에게 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 IL13Rα2-양성 세포를 확인하는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 생물학적 샘플을 실시형태에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계 및 생물학적 샘플의 적어도 하나의 세포에 결합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 측정하여, IL13Rα2-양성 세포로서 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계를 포함한다.
실시형태에서, 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 동위원소를 포함하거나, 예컨대, 본 명세서에서 앞서 기재된 바와 같이 바이오틴-아비딘 또는 바이오틴-스트렙타비딘 연결, 검출 가능한 표지를 이용하여 융합되거나 연결된다.
대안적으로, IL13Rα2-양성 세포는 유세포분석(FCM) 또는 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)을 이용하여 검출될 수 있었다.
실시예
본 명세서의 실시예는 암 치료를 위해 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포 요법에서 사용하기 위해 IL13Rα2를 표적화한 인간 단일쇄 항체 가변 단편(scFv)의 개발을 기재한다.
실시예 1 - 1E10B9 및 mAb47 IgG의 scFv로의 전환 및 ELISA 및 HTRF에 의한 결합 특성규명
문헌 연구는 2가지의 기존의 단클론성 항-IL13Rα2, 즉, 1E10B9 (미국 특허 제9,868,788호; 문헌[Debinski, et al., New agents for targeting of IL-13RA2 expressed in primary human and canine brain tumors, PLoS One 2013, 8(10): e77719])) 및 mAb 클론 47(mAb47)(미국 특허 제10,308,719호; 문헌[Balyasnikova et al., Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin (IL)-13 receptor α2, J Biol Chem 2012, 287(36): 30215-30227; Kim et al., A novel single-chain antibody redirects adenovirus to IL13Rα2-expressing brain tumors, Sci Rep 2015, 5: 18133])을 나타냈다. 이들은 모두 하이브리도마 기술에 의해 생성된 마우스 항체이다. 1E10B9의 경우에, 인간과 개 서열 간에 100% 상동성을 갖는 IL13Rα2의 세포외 도메인의 부분을 암호화하는 펩타이드 단편을 합성하고, 면역원으로서 사용하였다. 따라서 얻어진 항체 1E10B9는 수용체의 인간과 개 오솔로그 둘 다에 결합한다. mAb47은 면역원으로서 수용체의 전체 세포외 영역(IL13Rα2-Fc)을 이용함으로써 얻어졌다. 인간 IL13Rα2에 대해 보고된 친화도는 KD= 1.4nM이고, 인간 IL13Rα1 또는 마우스 IL13Rα2에 대해서는 결합이 보이지 않았다(Balyasnikova et al., Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin (IL)-13 receptor α2, J Biol Chem 2012, 287(36): 30215-30227). 또한, 이 항체는 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 IL-13과 경쟁한다.
1E10B9 및 mAb47의 scFv 단백질을 암호화하는 유전자를 합성시켰고, 단백질을 박테리아에서 발현시키고, ELISA 및 균질 시간 분해 형광법(HTRF)에 의해 인간 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 시험하였다. 이들 분자의 결과는 mAb47 scFv만이 이의 전장 모 IgG 상대의 결합 능력을 보유하였다는 것을 나타냈다.
물질 및 방법
유전자 합성
1E10B9 및 mAb47의 중쇄(VH) 및 경쇄(VL)의 가변 도메인 서열을 각각 미국 특허 제9,868,788호 및 제10,308,719호로부터 얻었다. 1E10B9의 VH의 처음 7개 아미노산을 특허에 포함시키지 않았다. 완전한 VH 유전자를 생성하기 위해, IMGT 데이터베이스에서의 검색에 기반하여 가장 상동성인 마우스 VH 유전자의 처음 7개 아미노산을 포함시켰다(http://www.imgt.org/3Dstructure-DB/cgi/DomainGapAlign.cgi). 글리신-세린 링커((Gly4Ser)3)를 통해 VL에 VH를 융합시킴으로써, X-ME107-B9(서열번호 92)로도 지칭되는 대응하는 scFv 작제물 1E10B9 scFv, 및 X-ME107-47(서열번호 93)로도 지칭되는 mAb47 scFv를 암호화하는 유전자를 형성하였다.
1E10B9 scFv(VH+링커+VL+3ХFLAG+His×6)(서열번호 92)
Figure pct00018
mAb47 scFv(VH+링커+VL+3ХFLAG+His×6)(서열번호 93)
Figure pct00019
GenScript(미국 뉴저지주 피스캐터웨이 소재)에 의해 1E10B9 scFv 및 mAb47 scFv의 합성 및 서브-클로닝을 수행하였다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 발현에 기반하여 이들의 코돈 최적화를 수행하였다. 합성 후에, 제한 효소 SfiI 및 NotI를 이용하여 scFv 유전자를 pHAT-6 벡터(SciLifeLab, 스웨덴 스톡홀름 소재)에 클로닝시켰다. pHAT-6 벡터는 C-말단에서 삼중-FLAG 태그 및 헥사히스티딘(His×6) 태그를 갖는 분비된 scFv를 제공한다.
벡터를 Top10 이콜라이(E. coli)에 형질전환시키고, 의도된 서열을 서열분석(GATC, 독일 소재)에 의해 확인하였다.
단백질 발현
scFv당 2개의 콜로니인 1E10B9 scFv 및 mAb47 scFv의 소규모 발현을 96-딥-웰 플레이트에서 수행하였다. 밤새 인큐베이션시킨 후에, 박테리아를 교반하고, ELISA와 HTRF 둘 다에서 기능성 평가를 위해 상청액을 사용하였다.
ELISA
인간 IL13Rα2-avi(실시예 A1 참조) 및 음성 대조군 단백질 스트렙타비딘을 4℃에서 밤새 PBS 중 1㎍/㎖에서 384-ELISA 웰 플레이트에 코팅하였다.
플레이트를 MilliQ 워터로 2회 세척하였고, 2시간 동안 차단 완충제(0.5% 소 혈청 알부민(BSA) + 0.05% TWEEN 20®로 보충한 인산염-완충 식염수(PBS))에서 차단시켰다. 박테리아 상청액에 존재하는 삼중-FLAG-태그된 scFv 1E10B9 및 mAb47을 차단 완충제에서 1:2, 1:20 및 1:200으로 희석시키고, 결합을 가능하게 하였다. 스트렙타비딘에 특이적인 분석 대조군 scFv(G-strep-1)를 또한 포함시켰다. 결합의 검출은 HRP-접합 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #A8592)를 통해 가능하게 된 후에, 1-단계 Ultra TMB ELISA 기질(ThermoFisher Scientific #34029)과 함께 인큐베이션이 이어졌다. 1M 황산을 첨가함으로써 비색 신호 발생을 중단시켰고, 450㎚에서 플레이트를 판독하였다. 모든 샘플을 2회 분석했다.
균질 시간 분해 형광법(HTRF)
1E10B9, mAb47 및 양성 분석 대조군 scFv를 분석 완충제(0.1% BSA로 보충한 PBS)에서 1:5로 희석시키고, 인간 IL13Rα2-avi 및 관련없는 단백질에 결합시키고, 둘 다 분석 완충제에서 200nM로 희석시켰다. 결합 검출은 공여자 분자 터븀-접합 항-FLAG 항체(Cisbio #611FG2TL) 및 수용자 분자 스트렙타비딘-접합 XL665(Cisbio #610SAXL)를 통해 가능하게 되었다. 615㎚(배경/노이즈 신호) 및 665㎚(결합 신호)에서 Envision 분광기(Perkin Elmer) 상에서 분석하기 전에 실온에서 2시간 동안 암실에서 플레이트를 인큐베이션시켰다. 모든 샘플을 2회 분석했다.
결과
1E10B9 scFv 및 mAb47 scFv를 암호화하는 4㎍의 벡터를 GenScript로부터 얻었다. 이들의 DNA 서열분석은 정확한 서열을 확인하였다. 소규모 발현을 수행하고, ELISA 및 HTRF를 이용하여 이들의 결합을 작은 세트의 항원에 대해 분석했다.
이들 분석의 결과는 mAb47 scFv가 인간 IL13Rα2를 인식하였다는 것을 나타냈다(도 1 및 도 2). 1E10B9 scFv는, ELISA에서도 HTRF에서도 포함 항원 중 어느 것에 대해 검출 가능한 신호를 일으키지 않았다.
결론
IL13Rα2 특이적 마우스 IgG 항체 1E10B9 및 mAb47의 VH 및 VL을 암호화하는 scFv 유전자를 성공적으로 합성하고, pHAT6에 클로닝하고, 단백질을 발현시키고, ELISA 및 HTRF에 의해 결합에 대해 분석했다.
mAb47 scFv는 인간 IL13Rα2에 대해 보유된 결합을 나타냈고, 음성 대조군 단백질에 대한 결합은 검출되지 않았다.
그러나, 1E10B9 scFv는 인간 IL13Rα2에 대한 결합을 나타내지 않았다. 이는 이의 전장 IgG 상대에 대해 보고된 것과 대조적이다(문헌[Kim et al., A novel single-chain antibody redirects adenovirus to IL13Rα2-expressing brain tumors, Sci Rep 2015, 5: 18133]). 항체 형식을 교대로 사용할 때 항원 결합의 손실은, 특히 IgG에서 scFv로 전환하는 경우에 드물지 않다. 항원-결합 부위의 구조에 영향을 미치는 변경된 단백질 폴딩은 이를 가장 잘 설명할 수 있다.
실시예 2 - 파지 라이브러리를 이용하는 인간 및 마우스 IL13Rα2에 대한 파지 디스플레이 선택
인간 및 마우스 IL13Rα2에 대해 특이성을 갖는 scFv 단편의 단리를 가능하게 하기 위해 파지 디스플레이 선택을 수행하였다. 두 상이한 인간 파지 라이브러리(SciLifeLib 1 및 2)로부터 scFv를 선택하였다. ELISA에 의한 총 920개의 클론의 1차 선별로 673개의 양성 클론을 초래하였고, 이를 서열분석을 위해 보냈다. 이 중 304개는 서열이 독특한 것으로 드러났다.
물질 및 방법
항원
파지 디스플레이 선택을 위한 항원으로서 사용한 IL13Rα2의 인간 및 마우스 버전을 표 7에 열거한다.
Figure pct00020
파지 디스플레이 선택
2가지의 인간 합성 scFv 파지 라이브러리, 즉, SciLifeLib1 및 SciLifeLib2 (SciLifeLab, 스웨덴 스톡홀름 소재)를 이용하여 4회의 풍부화(enrichment) 선택 라운드를 이용하여 바이오패닝(biopanning)을 수행하였다. SciLifeLib 1 및 2는 앞서 보고한 설계 및 작제에서와 유사한 천연 인간 합성 scFv 라이브러리이다(
Figure pct00021
et al., Protein Eng Des Sel (2016) 29: 427-437). 간략히 말해서, 인간 생식계열 유전자 IGHV3-23 및 IGKV1-39를 라이브러리 스캐폴드로서 사용하였고, 쿤켈(Kunkel) 돌연변이유발을 사용하여 6개의 상보성 결정 영역(CDR) 중 4개; 즉, CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 및 CDR-L3에 다양성을 도입하였다. 바이오틴일화된 샘플(hIL13Rα2-avi)에 대해, 스트렙타비딘-코팅 자기 비드(Dynabeads M-280, ThermoFisher Scientific, #11206D)를 이용하여 선택을 수행하였다. 유사하게, 단백질 G-결합 자기 비드(Dynabeads, ThermoFisher Scientific, #10004D)를 사용하여 Fc-융합 mIL13Rα2-Fc를 포획하였다. 2개의 트랙에서, 이종교배종 반응성 scFv에 대해 우선적으로 선택하기 위해, 항원은 상이한 라운드에서 인간과 마우스 IL13Rα2 간에 교대로 나타났다. 더 나아가, 다른 2개의 트랙에서, 인간 IL-13(Prospec #cyt-446)을 선택 완충제에 포함시켰다. 항원의 양을 감소시키고 상이한 라운드 사이의 세척 수 및 강도를 증가시킴으로써 선택 압력을 증가시켰다. 트립신-아프로토닌 접근을 이용하여 항원-결합 파지의 용리를 수행하였다. 파지-표적 단백질 인큐베이션 단계를 제외하고 전체 선택 공정을 자동화하였고, Kingfisher Flex 로봇으로 수행하였다. 상이한 파라미터의 조합은 총 6개의 상이한 선택 트랙을 아우르는 계획을 야기하였다.
scFv의 재클로닝 및 발현
가용성 scFv의 생산을 가능하게 하기 위해, 각 선택 트랙의 제3 및 제4 라운드로부터의 파지미드 DNA를 단리시켰다. 풀에서, scFv 단편을 암호화하는 유전자를 제한효소 분해시켰고, 선별 벡터 pHAT-6에 서브클로닝시켜, C-말단에서 삼중-FLAG 태그 및 헥사히스티딘(His6) 태그와 함께 scFv의 분비를 위한 신호를 제공하였다. 후속적으로 작제물을 TOP10 이콜라이에 형질전환시켰다. 단일 콜로니를 선별하고, 배양시키고, 96-웰 형식으로 가용성 scFv 발현을 위해 IPTG-유도하였다. 종합하면, 1차 ELISA 선별을 위해 박테리아 상청액에 존재하는 920개의 scFv 클론을 준비하였다.
ELISA 선별
마우스 IL13Rα2-Fc를 PBS 중 1㎍/㎖, 4℃에서 밤새 384-ELISA 웰 플레이트에 직접 코팅한 반면, 인간 IL13Rα2-avi를 또한 PBS 중 1㎍/㎖, 4℃에서 밤새 스트렙타비딘을 통해 간접적으로 코팅하였다. 두 음성 대조군 단백질, 즉, 스트렙타비딘 및 BSA를 또한 코팅하였다.
박테리아 상청액에 존재하는 FLAG-태그된 W-ME107 scFv 클론을 차단 완충제(0.5% BSA + 0.05% TWEEN 20®로 보충한 PBS)에서 1:3으로 희석시키고, 코팅 단백질에 결합시켰다. 결합의 검출은 HRP-접합 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #A8592)를 통해 가능하게 된 후에, Ultra TMB ELISA 기질(ThermoFisher Scientific #34029)과 함께 인큐베이션이 이어졌다. 1M 황산을 첨가함으로써 비색-신호 발생을 중단시켰고, 450㎚에서 플레이트를 판독하였다. 모든 샘플을 2회 분석했다. 또한 두 참조, 즉, scFv, mAb47 scFv 및 G-strep-1 scFv를 포함시켰다.
DNA 서열분석
인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대한 결합을 나타내는 673개의 양성 scFv 클론을 Sanger DNA 서열분석을 위해 GATC Biotech(독일 에버스베르크 소재)에 보냈다.
결과
SciLifeLib 1 및 2를 이용하여 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대해 총 6개의 트랙을 동시에 수행하였다. 선택된 scFv 클론의 재클로닝 후에, 선택 라운드 3 및 4로부터 92개의 클론(콜로니)을 선별하여 총 920개의 선별된 클론을 생성하였다.
ELISA 선별은 뚜렷한 결합 특징을 갖는 673개의 잠재적 히트의 식별을 초래하였다. 대다수의 히트는 인간 IL13Rα2에 대해서만 결합을 나타냈고, 남아있는 히트는 인간과 마우스 IL13Rα2 둘 다에 대해 결합을 나타낸다.
673개 히트의 DNA 서열분석은 304개의 서열이 독특한 W-ME107 클론의 식별을 초래하였다.
결론
파지 디스플레이 선택에 의해 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대한 scFv 클론을 성공적으로 단리시켰다. 920개 클론의 초기 ELISA 선별 및 673개의 양성 히트의 DNA 서열분석 후에, 총 304개의 서열이 독특한 scFv 클론을 확인하였다. 대다수의 클론은 인간 IL13Rα2에만 결합하였지만, 세트는 인간과 마우스 IL13Rα2 둘 다에 대해 결합을 나타냈다.
실시예 3 - ELISA 및 HTRF에 의한 304개의 서열이 독특한 scFv 클론의 2차 선별
304개의 서열이 독특한 scFv 클론의 추가적인 랭크를 용이하게 하기 위해, 모든 서열이 독특한 클론에 대해 2차 ELISA 선별 및 균질 시간 분해 형광(HTRF) 선별을 수행하였다.
이들 분석은 초기 ELISA 선별 결과를 확인하였고(실시예 2), 결합 특이성에 기반하여 클론의 2개 주요 그룹을 확인하였다. 하나의 그룹은 인간 IL13Rα2에 대해서만 결합된 반면, 다른 그룹은 인간과 마우스 IL13Rα2 둘 다에 결합된 클론을 포함하였다.
생성된 ELISA 및 HTRF 데이터를 사용하여 클론의 수를 감소시키고, 추가로 160개의 scFv의 목록을 생성하였다. 2가지 주요 기준에 기반하여 이들 160개의 클론을 선택하였다; 1) 마우스와 인간 IL13Rα2 둘 다에 대해 높은 신호를 나타냄(이종교배종 반응성) 또는 2) 인간 IL13Rα2에 대해 높은 신호 및 비관련 표적에 대해 낮은 배경 신호를 나타냄.
물질 및 방법
ELISA
인간 IL13Rα2-avi를 스트렙타비딘을 통해 384 ELISA 웰 플레이트에 간접적으로 코팅시킨 반면, 마우스 IL13Rα2-Fc 및 음성 대조군 단백질 스트렙타비딘 및 관련없는 단백질을 웰에 직접 코팅시켰다. 본 실시예에서 사용한 IL13Rα2 단백질에 대한 상세한 설명을 표 7에 제공한다.
밤새 4℃에서 플레이트를 코팅한 후에, 플레이트를 MilliQ 워터로 2회 세척하였고, 2시간 동안 차단 완충제(0.5% BSA + 0.05% TWEEN 20®로 보충한 PBS)에서 차단시켰다. 박테리아 상청액 중에 존재하는 삼중-FLAG-태그된 W-ME107 scFv 클론을 차단 완충제 중에서 1:10으로 희석시키고, 결합시켰다. 결합의 검출은 HRP-접합 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #A8592)를 통해 가능하게 된 후에, 1-단계 Ultra TMB ELISA 기질(ThermoFisher Scientific #34029)과 함께 인큐베이션이 이어졌다. 1M 황산을 첨가함으로써 비색 신호 발생을 중단시켰고, 450㎚에서 플레이트를 분석했다.
모든 샘플을 2회 분석했다. 또한 두 양성 대조군, 즉, mAb47 scFv 및 G-strep-1을 포함시켰다.
HTRF
W-ME107 scFv 클론뿐만 아니라 참조 mAb47 scFv 및 G-strep-1 scFv를 분석 완충제(0.1% BSA로 보충한 PBS) 중에 1:5로 희석시키고, 분석 완충제에서 200nM로 희석시킨 hIL13Rα2-avi 또는 관련없는 항원에 결합시켰다. 결합 검출은 공여자 분자 터븀-접합 항-FLAG 항체(Cisbio #611FG2TL) 및 수용자 분자 스트렙타비딘-접합 XL665(Cisbio #610SAXL)를 통해 가능하게 되었다. 615㎚(배경/노이즈 신호) 및 665㎚(결합 신호)에서 Envision 분광기(Perkin Elmer) 상에서 분석하기 전에 실온에서 2시간 동안 암실에서 플레이트를 인큐베이션시켰다. 665㎚ 값을 615㎚ 값으로 나누어서 각 샘플에 대한 R 값을 가져왔다.
모든 샘플을 2회 분석했다.
결과
ELISA
scFv 클론을 결합 특이성에 기반하여 2개의 주요 그룹으로 나눌 수 있었다. 대다수의 scFv를 포함하는 제1 그룹은 인간 IL13Rα2에만 결합하였지만, 제2 그룹에 속하는 클론은 인간과 마우스 IL13Rα2 둘 다에 결합하였다. 참조 클론 mAb47 scFv는 인간 IL13Rα2에 대해서만 결합을 나타냈다.
HTRF
FRET-기반 균질 용액 분석에서 인간 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 304개의 scFv 클론을 분석했다. 또한 이 분석에서, 훨씬 대다수의 클론이 인간 IL13Rα2에 대해 분명한 결합을 나타냈고, 본 분석에서 음성 대조군 단백질에 대해 유의미한 결합이 포함되지 않았다. 예상치 못하게, mAb47 scFv는 매우 낮은 결합 신호를 나타냈다.
결론
파지 디스플레이 선택에 의해 단리시킨 304개의 서열이 독특한 scFv 클론에 대해 ELISA 및 HTRF 선별을 성공적으로 수행하였다. 결과에 기반하여, 실시예 4에서 동일한 샘플에 대해 수행한 Luminex 분석으로부터의 결과와 함께, SPR에 의한 추가 선별을 위해 160개의 클론을 선택하였다. 이들 160개의 클론을 이들의 결합 특징에 기반하여 2개의 서브세트로 나눌 수 있었다; i) 인간 IL13Rα2만에 대한 클론 결합 및 ii) 인간과 마우스 IL13Rα2 둘 다에 대한 클론 결합.
실시예 4 - Luminex에 의한 304개 scFv 클론의 결합 특이성 평가
본 실시예에서, 모든 304개의 독특한 scFv 클론뿐만 아니라 참조 클론 mAb47 scFv를 Luminex-기반 접근에서 특이성에 대해 추가로 평가하였다.
이 분석은 304개의 클론 중 8개는 몇몇 관련없는 단백질에 대해 비특이적 결합을 나타냈다는 것을 보여주었다. 남아있는 296개의 클론뿐만 아니라 참조 클론 mAb47은 이들의 의도된 항원인 인간 IL13Rα2에 대해 특이적 결합을 나타냈다.
본 실시예 4에 제시된 LUMINEX® 데이터와 함께, 실시예 3의 동일한 샘플에 대해 생성된 ELISA 및 HTRF 데이터를 사용하여 클론 수를 감소시키고, 추가로 160개의 scFv 목록을 생성하였다. LUMINEX®에서 양호한 수행에 추가로, 2가지 주요 기준에 기반하여 이들 160개의 클론을 선택하였다; 1) 마우스와 인간 IL13Rα2 둘 다에 대해 높은 신호를 나타냄(이종교배종 반응성) 또는 2) 인간 IL13Rα2에 대해 높은 신호 및 비관련 표적에 대해 낮은 배경 신호를 나타냄.
물질 및 방법
바이오틴일화된 인간 IL13Rα2-avi 및 31가지의 바이오틴일화된 관련없는 단백질을 특이적 뉴트라비딘-결합 Luminex 비드 ID에 개개로 접합시켰다. 접합 후에, 모든 비드 ID를 혼합하고, 박테리아 상청액 중에 존재하는 scFv 클론와 함께 인큐베이션시키고, 분석 완충제(3% BSA, 0.05% TWEEN 20® 및 10㎍/㎖ 뉴트라비딘으로 보충한 PBS)에서 1:10으로 희석시켰다. 31가지의 관련없는 단백질 각각에 대해, 적어도 하나의 양성 대조군 scFv를 포함시켰다. 특정 단백질-접합 비드에 대한 클론의 결합은 R-PE-접합 항-FLAG M2(Prozyme #PJ315) 항체 다음에 FlexMAP 3D 기기 상에서의 분석을 통해 가능하게 되었다.
모든 샘플을 2회 분석하였고, 얻어진 결합 신호의 평균 값은 중앙값 강도 형광(MFI)에 대응하며, 각 비드 ID에 대해 각 클론에 대해 계산하였다.
결과
304개의 scFv 클론 선별 중 296개는 인간 IL13Rα2에 대해 특이적 결합을 나타냈다. 그러나, 인간 IL13Rα2에 대한 결합 이외에 8개의 클론은 몇몇 관련없는 단백질에 대해 결합을 나타냈다.
흥미롭게도, 31가지의 관련없는 단백질 각각에 대해, 적어도 하나의 양성 대조군 scFv를 분석했다. 이들 모두는 예상한 바와 같이 이들의 동족 항원과 특이적으로 상호작용하였다. 이는 모든 항원이 이들 각각의 비드에 기능적으로 결합되었다는 것을 보장한다.
결론
파지 디스플레이 선택에 의해 단리시킨 304개의 서열이 독특한 scFv 클론에 대해 32-plexed LUMINEX® 기반 분석을 성공적으로 수행하였다. scFv의 8개만이 분석에 포함시킨 관련없는 단백질에 대해 비특이적 결합을 나타냈다. 남아있는 296개의 클론 및 참조 클론 mAb47은 임의의 31개의 관련없는 단백질에 대해 유의미한 결합 없이 인간 IL13Rα2에 대해 특이적 결합을 나타냈다.
실시예 5 - SPR에 의한 160개의 서열이 독특한 scFv의 동력학 선별
상이한 클론의 효율적인 랭킹을 가능하게 하기 위해 동력학 선별-기반 접근에서 표면 플라즈몬 공명(SPR)에 의한 추가 특성규명을 위해 실시예 4로부터의 160개의 W-ME107 scFv 클론뿐만 아니라 참조 클론 mAb47 scFv를 선택하였다.
물질 및 방법
BIACORE® T200 기기(GE Healthcare)에 대해 동력학 선별을 수행하였다. 포획 리간드로서 작용하는 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #F1804)를 제조업자의 권장사항에 따라 CM5-S 아민 센서 칩의 모두 4개의 표면 상에 고정시켰다.
박테리아 상청액에 존재하는 160개의 FLAG-태그된 W-ME107 클론을 주입하고, 칩 표면 상에 포획한 후에, 50nM에서 hIL13Rα2-avi, hIL13Rα2-Fc 또는 mIL13Rα2-Fc 중 하나를 주입하였다. 본 연구에서 사용한 IL13Rα2 단백질에 대한 상세한 설명을 표 8에 제공한다. 표면을 10mM 글리신-HCl pH 2.2로 재생시켰다. 실행 완충제(0.05% TWEEN 20®로 보충한 HBS, pH 7.5) 중 25℃에서 모든 실험을 수행하였다.
항-FLAG M2 항체 고정 표면인 참조 표면의 반응 곡선을 차감함으로써, 모든 scFv 클론에 대한 반응 곡선 센소그램을 얻었다. BIACORE® T200 평가 3.1 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석했다.
Figure pct00022
결과
항-FLAG M2 항체를 CM5 S 칩의 모두 4개의 표면에 고정시키고, 포획된 scFv 클론의 유사한 RU-수준을 얻었다. 50nM에서 IL13Rα2 주입 후, 낮은 pH 산 용액을 이용하여 각 표면을 성공적으로 재생하였다.
센소그램의 육안 검사에 의해 데이터 분석을 수행하였다(데이터 미제시). 클론을 결합 특징에 기반하여 3개의 그룹으로 나눌 수 있다는 것이 센소그램으로부터 분명하였다; (i) 인간 IL13Rα2-avi와 인간 IL13Rα2-Fc뿐만 아니라 마우스 IL13Rα2-Fc에 대한 scFv 클론 결합; (ii) 인간 IL13Rα2 변이체 둘 다에 대해 scFv 결합이지만 마우스 IL13Rα2-Fc에 대해 측정 가능한 결합을 나타내지 않음; (iii) 인간 IL13Rα2-avi에 대해서만 scFv 결합이지만, 인간 IL13Rα2-Fc에 대해서는 결합하지 않고, 이 중 소수는 또한 마우스 IL13Rα2-Fc에 대해 결합을 나타냄.
160개의 scFv 중 44개에 대한 결합 패턴을 표 9에 열거한다. 인간 수용체에 대한 결합에 기반하여 이 세트가 가장 유망한 것으로 간주하였다. 더 구체적으로, 높은 결합 반응 및 바람직한 느린 오프-속도(off-rate)를 고려하였다. 또한, 이종교배종 반응성을 나타내는 클론을 포함시켰다.
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
결론
동력학 선별은 상이한 결합 특징을 나타내는 클론을 초래하였다; (i) 인간 IL13Rα2-avi와 Fc-융합된 인간 IL13Rα2(IL13Rα2-Fc) 둘 다뿐만 아니라 마우스 IL13Rα2-Fc에 대한 클론 결합, (ii) 인간 IL13Rα2 변이체 둘 다에 대해 클론 결합이지만, 마우스 IL13Rα2-Fc에 대해 측정 가능한 결합을 나타내지 않음 및 (iii) 인간 IL13Rα2-avi에 대해서만 클론 결합이지만 인간 IL13Rα2-Fc에 대해서는 측정 가능한 결합을 나타내지 않으며, 이 중 소수는 마우스 IL13Rα2-Fc에 대해 결합을 나타냄. 생성된 데이터는 상이한 클론의 효율적인 랭킹 및 160개에서 44개로의 클론 목록의 추가적인 감소를 가능하게 하였다.
실시예 6 - 44개의 scFv 클론의 소규모 단백질 정제 및 ELISA 분석
소규모 단백질 생산 및 정제에 대해 실시예 3 내지 5에 제시한 결과에 기반하여 44개의 클론 및 참조 클론 mAb47 scFv를 선택하였다.
단백질 A- 또는 니켈-결합 자기 비드를 이용하여 단백질 정제를 Kingfisher Flex 기기 상에서 96-웰 형식으로 수행하였다. 모든 44개의 W-ME107 scFv 클론을 만족스러운 손도 및 충분한 단백질 농도로 정제할 수 있었다. 그러나, 참조 클론 mAb47 scFv는 불량하게 발현되었고, 이에 의해 낮은 순도 및 농도를 나타냈다.
ELISA에 의해 분석할 때, 대부분의 정제된 클론은 이들의 예상된 항원, 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대해 결합을 나타냈다.
물질 및 방법
생성 및 정제
15㎖의 이콜라이 배양물에서 44+1개의 scFv 클론 각각을 생성하였다. 30℃에서 18시간 동안 단백질 생성 후에, 세포를 B-PER 시약(ThermoFisher Scientific #78248)에 의해 용해시키고, W-ME107 scFv 클론 및 참조 클론 mAb47 scFv의 정제된 박테리아 용해물을 단백질 A-결합 자기 비드(ThermoFisher Scientific #88846) 또는 MagneHis Ni-입자 자기 비드(Promega #V8548)와 각각 혼합하여, Kingfisher Flex 기기 상에서의 정제를 가능하게 하였다. Zeba 96-웰 스핀 탈염 플레이트(ThermoFisher Scientific #89807)를 이용하여 용리된 scFv 클론의 완충제를 PBS와 교환하였다.
순도 및 온전함을 결정하기 위해 환원 조건 하에 정제된 scFv 클론을 겔 전기영동에 의해 분석하고, 제조업자의 권장사항(ThermoFisher Scientific #23227)에 따라 표준 BCA(Bicinchoninic Acid) 분석에 의해 단백질 농도를 결정하였다.
ELISA
인간 IL13Rα2-avi, 인간 IL13Rα2-Fc 및 마우스 IL13Rα2-Fc를 37℃에서 45분 동안, PBS 중 1㎍/㎖로 384-ELISA 웰 플레이트에 코팅하였다. 본 실시예에서 사용한 IL13Rα2 단백질에 대한 상세한 설명을 표 8에 제공한다. 3종의 음성 대조군 단백질(스트렙타비딘, BSA 및 관련없는 단백질)을 또한 코팅하였다. FLAG-태그된 scFv를 차단 완충제(0.5% BSA + 0.05% TWEEN 20®로 보충한 PBS)에서 1㎍/㎖로 희석시키고, 코팅 단백질에 결합시켰다. 결합의 검출은 HRP-접합 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #A8592)을 통해 가능하게 된 후에, Ultra TMB ELISA 기질(ThermoFisher Scientific #34029)과 함께 인큐베이션이 이어졌다. 1M 황산을 첨가함으로써 비색-신호 발생을 중단시켰고, 450㎚에서 플레이트를 판독하였다.
참조 클론 mAb47 scFv 및 양성 분석 대조군 G-Strep-1 scFv(스트렙타비딘에 특이적)를 포함하는 모든 샘플을 2회 분석했다.
결과
생성 및 정제
44개의 W-ME107 scFv에 대해, SDS-PAGE는 만족스러운 샘플 순도를 나타냈고, 즉, 하나의 주요 밴드는 scFv의 예상 분자량(대략 30kDa)과 상관관계가 있고, 약한 이콜라이-유래 단백질 밴드는 없거나 단지 소수였다(도 3).
그러나 참조 클론 mAb47은 다중 이콜라이-유래 단백질 밴드에 의해 낮은 샘플 순도를 나타냈다. 또한, 예상 분자량에 대응하는 단백질 밴드는 겔 상의 모든 다른 밴드에 비해서 상당히 약했고, 이는 이런 클론의 낮은 샘플 농도를 나타낸다.
정제된 scFv 샘플의 단백질 농도를 표준 BCA 분석에 의해 결정하였다. 모두 44개의 W-ME107 scFv 클론을 0.1 내지 0.6㎎/㎖ 범위의 충분한 단백질 농도에서 정제하였다.
ELISA
훨씬 대다수의 정제된 W-ME107 scFv 클론은 이들의 의도된 항원인 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대해 결합을 나타냈고, 코팅된 음성 대조군 단백질에 대한 결합이 없거나 매우 낮았다. 그러나, 일부 클론은 낮은 항원 결합을 나타내거나 또는 항원 결합을 나타내지 않았다.
결론
44개의 W-ME107 scFv 클론 및 참조 클론 mAb47을 Kingfisher flex 기기 상에서 소규모로 정제하였다. 참조 클론 mAb47을 제외한 모든 scFv 클론은 만족스러운 샘플 순도 및 충분한 단백질 농도를 나타냈다.
ELISA-기반 접근에서 분석할 때, 대다수의 클론은 이들의 의도된 항원, 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대해 결합을 나타냈다. 그러나 소수의 클론은 항원 결합이 낮거나 항원 결합이 없는 것으로 예상한 바와 같이 수행하지 않았다.
실시예 7 - ELISA에 의한 44개의 scFv 클론의 인간 IL13Rα1에 대한 결합 연구
ELISA-기반 접근을 이용하여 인간 IL13Rα1에 대한 결합에 대해 실시예 6에서 소규모 단백질 정제에 대해 선택한 44개의 클론 및 참조 클론 mAb47 scFv를 시험하였다.
결과는 모든 W-ME107 scFv 클론이 이들의 의도된 항원인 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대해 결합을 나타내고, 인간 IL13Rα1에 대한 유의미한 결합이 없다는 것을 나타냈다. 참조 클론 mAb47 scFv에 대해 동일한 결과를 얻었다.
물질 및 방법
코팅 단백질 hIL13Rα2-avi(실시예 A1), hIL13Rα2-Fc(RnD Systems #7147-IR), mIL13Rα2-Fc(RnD Systems #539-IR) 및 hIL13Rα1-Fc(RnD Systems #146-IR)를 PBS 중 1㎍/㎖로 희석시키고, 384-웰 ELISA 플레이트에 직접 코팅하였다. 두 음성 대조군 단백질, 즉, 스트렙타비딘 및 관련없는 단백질을 또한 코팅하였다. 밤새 4℃에서 플레이트를 코팅 단백질과 함께 인큐베이션한 후에, 플레이트를 MilliQ 워터로 2회 세척하였고, 2시간 동안 차단 완충제(0.5% BSA + 0.05% TWEEN 20®로 보충한 PBS)에서 차단시켰다. 박테리아 상청액 중에 존재하는 삼중-FLAG-태그된 W-ME107 scFv 클론을 차단 완충제 중에서 1:10으로 희석시키고, 결합시켰다. 결합의 검출은 HRP-접합 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #A8592)를 통해 가능하게 된 후에, 1-단계 Ultra TMB ELISA 기질(ThermoFisher Scientific #34029)과 함께 인큐베이션이 이어졌다. 1M 황산을 첨가함으로써 비색 신호 발생을 중단시켰고, 450㎜에서 플레이트를 분석했다.
참조 클론 mAb47 scFv 및 양성 ELISA 대조군 G-Strep-1 scFv(스트렙타비딘에 특이적)를 포함하는 모든 샘플을 2회 분석했다.
결과
분석한 모든 W-ME107 scFv 클론은 앞서 보고한 바와 같이(실시예 3 및 실시예 5) 이들의 의도된 항원인 인간 및/또는 마우스 IL13Rα2에 대해 결합을 나타냈다(도 4). 임의의 클론에 대해서, 인간 IL13Rα1로 향하는 또는 음성 대조군 단백질에 대해 유의미한 결합을 검출할 수 없었다.
참조 클론 mAb47 scFv만이 인간 IL13Rα2로 향하는 결합을 나타냈고, 마우스 IL13Rα2 또는 인간 IL13Rα1 및 스트렙타비딘 코팅 웰에 결합된 양성 분석 대조군 G-strep-1 scFv에 대해서는 결합을 나타내지 않았다.
결론
박테리아 상청액으로부터 분석할 때 임의의 44개의 W-ME107 scFv 클론에 대해 또는 참조 클론 mAb47 scFv에 대해, 인간 IL13Rα1로 향하는 유의미한 결합을 검출할 수 없었다(도 4).
동력학 선별 결과와 대조적으로(실시예 5), 본 명세서의 모든 클론은 인간 IL13Rα2 단백질; avi-태그 및 Fc-융합 둘 다에 대해 결합을 나타냈다. 대조적으로, 실시예 5에서, 44개의 클론 중 12개는 Fc-융합 변이체에 대해 측정 가능한 결합을 나타내지 않았다. 이런 차이는 두 방법의 민감도 차이뿐만 아니라 실험 설정에 의해서도 설명될 수 있다. 본 실시예에서, 수용체를 표면에 부착하는 한편, 실시예 5 및 9에서, 수용체는 용액 중에 있다. 수용체의 태그 또는 융합 단백질 차이는 항원이 거동하는 방법에 큰 영향을 미칠 수 있었고, 두 실험 설정에서 상이한 에피토프는 상이하게 나타날 수 있다.
마우스 IL13Rα2에 대한 결합은 이전의 SPR 데이터와 상당히 상관관계가 있으며(실시예 5), 즉, 친화도 선별에서 표적에 대해 측정 가능한 결합을 나타내지 않는 scFv는 또한 본 실험 설정에서 "비결합제"로 간주하였다.
소수의 scFv는 모든 분석 단백질에 대해 낮은 신호를 나타냈다(W-ME107-97, W-ME107-101, W-ME107-129, W-ME107-130, W-ME107-137, W-ME107-141, W-ME107-151, W-ME107-157로 예시함)(도 4).
실시예 8 - 세포 결합
또한 표적 세포 표면 상에서 수용체에 대한 결합을 확인하기 위해 IL13Rα2를 발현시키는 세포에 대한 선택된 scFv의 결합을 평가하였다.
물질 및 방법
100ng 정제된 scFv(실시예 6)를 1×105개의 세포의 인간 교모세포종 세포주 U-87MG(확인된 IL13Rα2 발현을 갖는 본래의 Uppsala University 클론, PMID: 27582061) 또는 인간 비소세포 폐암 세포(A549)와 함께 20분 동안 실온(RT)(약 20 내지 25℃)에서 인큐베이션시킴으로써 IL13Rα2 발현 세포에 대한 scFv 결합을 평가하였다. 인간 교모세포종 세포주 U-87MG는 고수준의 인간 IL13Rα2(hIL13Rα2)를 내인성으로 발현시키는 반면, 인간 비소세포 폐암 세포는 hIL13Rα2를 발현시키지 않는다.
세척한 후에(1X PBS, 0.1% BSA, 3mM EDTA), 20분 동안 RT에서 PE 접합 항-FLAG 항체를 이용하여 FLAG-태그를 염색하였다. CytoFLEX 유세포분석기(Beckman coulter, 캘리포니아주 소재)를 이용하여 판독을 행하였다.
결과
선택된 scFv를 IL13Rα2를 발현시키는 표적 세포와 함께 인큐베이션시켜, 또한 표적 세포 표면 상에서 수용체에 대한 결합을 확인하였다. 모든 scFv는 고수준의 hIL13Rα2를 내인성으로 발현시키는 인간 교모세포종 세포주 U-87MG에 특이적으로 결합할 수 있었지만, 음성 대조군 인간 비소세포 폐암 세포(A549)에 결합하지 않았다(도 5).
결론
유세포분석은 선택된 W-ME107 클론의 세포 결합 능력을 성공적으로 평가했고, 선택된 W-ME107 클론은 표적 세포주에 대해 상이한 결합활성을 나타냈다. 본 결합 분석에서 비표적(off-target), 즉, 비-신경교종 세포에 대한 결합은 관찰되지 않았다.
실시예 9 - 11개의 W-ME107 scFv 클론에 대해 SPR에 의한 단일 주기 동력학
각각 인간 IL13Rα2-avi, 인간 IL13Rα2-Fc 및 마우스 IL13Rα2-Fc에 대한 이들의 동력학 파라미터를 결정하기 위해, 실시예 5, 7 및 8의 결과에 기반하여 선택한 11개의 가장 유망한 W-ME107 클론 및 참조 클론 mAb47 scFv에 대해, 단일 주기 동력학 접근을 이용하는 표면 플라즈몬 공명(SPR) 분석을 수행하였다.
얻어진 데이터의 분석은 인간 및 마우스 IL13Rα2 둘 다에 대해 낮은 나노몰 범위의 KD-값을 나타내는 가장 높은 친화도-결합 클론을 나타냈다.
물질 및 방법
포획 리간드로서 작용하는 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #F1804)를 제조업자의 권장사항에 따라 BIACORE® T200 기기(GE Healthcare) 상에서 CM5-S 아민 센서 칩의 모두 4개의 표면 상에 고정시켰다.
단백질 A 정제된 FLAG-태그된 W-ME107 클론을 각각 주입하고, 칩 표면 상에서 포획하고, 이는 클론 사이의 동일한 반응 단위(RU)를 목표로 한다. 그러나, 단백질 정제가 너무 낮은 수율을 초래하였기 때문에(실시예 6) 박테리아 상청액에서 정제되지 않은 참조 클론 mAb47을 포획하였다.
1.2 내지 100nM 범위의 5가지 농도로 이루어진 각각 인간 IL13Rα2-avi, 인간 IL13Rα2-Fc 및 마우스 IL13Rα2-Fc의 3배 연속 희석물을 실행 완충제(0.05% TWEEN 20®로 보충한 HBS, pH 7.5)에서 제조하고, 후속적으로 칩 표면 위로 주입하였다. 해리 상 후에, 10mM 글리신-HCl, pH 2.1을 이용하여 칩 표면을 재생하였다.
항-FLAG M2 항체 고정 표면인 참조 표면의 반응 곡선을 차감함으로써, 모든 scFv 클론에 대한 반응 곡선 센소그램을 얻었다. 소프트웨어 BIAeval 버전 3.1(GE Healthcare)을 이용해서 데이터를 분석하고, 동력학 파라미터를 계산하여 1:1 Langmuir 결합 모델을 추정하였다.
결과
데이터는 모든 W-ME107 클론이 인간 hIL13Rα2-avi에 대해 낮은 나노몰 내지 나노몰 범위에서 친화도를 나타내며, 가장 높은 친화도 결합 클론인 W-ME107-27이 3.1nM의 KD-값을 갖는다는 것을 나타냈다(표 10).
4개의 클론(W-ME107-112, W-ME107-117, W-ME107-128 및 W-ME107-156)을 제외한 모두는 또한 수용체의 마우스 형태에 결합되었다. 이는 실시예 5에 제시된 데이터와 상당히 상관관계가 있었다.
예상치 못하게, 분석한 클론은 모두 hIL13Rα2-avi에 대한 결합을 분명하게 나타냈지만, 약 절반만이 Fc-융합 인간 작제물(hIL13Rα2-Fc)에 대한 결합을 나타냈다. 이는 hIL13Rα2-avi(>50 RU)에 대해 높은 반응을 나타내지만 Fc-융합 인간 작제물에 대해 임의의 반응을 거의 나타내지 않는 W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-55, W-ME107-112, W-ME107-143 및 W-ME107-150으로 예시하였다. 이를 또한 동력학 선별 분석 동안에 주목하였다(실시예 5).
인간 IL13Rα2-avi에 대한 참조 클론 mAb47 scFv(박테리아 상청액에 존재)의 결합 친화도인 KD(M)은 1.1nM로 결정하였다.
Figure pct00026
Figure pct00027
결론
BIACORE® T200 기기 상에서 11 W-ME107 scFv 클론 및 참조 클론 mAb47에 대한 단일 주기 동력학 접근을 성공적으로 수행하였다. 인간 IL13Rα2-avi, 인간 IL13Rα2-Fc 및 마우스 IL13Rα2-Fc 각각에 대한 각 클론의 얻어진 동력학 파라미터는 동력학 선별 분석(실시예 5) 동안 얻은 친화도 추정치와 상당히 상관관계가 있었다. 가장 큰 친화도 결합 클론인 W-ME107-27은 3.1nM의 KD-값을 가졌다. W-ME107-27은 또한 마우스 IL13Rα2-Fc에 대해 가장 큰 친화도(KD = 2.4nM)를 나타내는 클론이었다.
예상치 못하게, 본 실시예에서, 일부 클론은 hL13Rα2-avi에 대해 양호한 결합을 나타냈지만 hIL13R2α2-Fc(W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-55, W-ME107-112, W-ME107-143 및 W-ME107-150)에 대해서는 그렇지 않았다. 이는 이들 단백질 작제물에 포함된 아미노산이 거의 동일하다는 사실에도 불구하고 그러하다(표 8). 그러나, 두 작제물에서 상이한 에피토프는 상이하게 나타날 수 있다. 예를 들어, Fc-융합에 의해 야기되는 이량체화는 일부 에피토프의 입체 장애를 야기할 수 있다.
실시예 10 - nanoDSF에 의한 11개의 W-ME107 scFv 클론의 Tm 결정
11개의 정제된 W-ME107 scFv 클론을 안정성을 평가하기 위해 Prometheus NT.48 기기 상의 nanoDSF에 의해 융점인 Tm(C)으로 측정하였다.
물질 및 방법
nanoDSF 기술은 열 변성 처리되는 동안에 단백질의 고유 형광을 측정하여, 천연 조건 하에서 단백질의 언폴딩을 특성규명한다.
단백질 A 정제된 W-ME107 scFv 클론(실시예 6)을 PBS 중 0.1㎎/㎖로 희석시키고, 모세관힘을 통해 "고 민감도" 모세관(NanoTemper #PR-C006)에 장입하고, 이를 후속적으로 Prometheus NT.48 기기 상에 장착하였다. 융점 기울기를 20C 내지 95C로 설정하고, 1C/분으로 가열하였다.
330㎚ 및 350㎚에서 트립토판 방출을 측정하고, 각 클론에 대한 용융 곡선을 얻기 위해 계산한 비를 온도에 대해 플롯팅하고, 소프트웨어 PR. ThermoControl(NanoTemper Inc)을 이용하여 이 Tm-값을 추론하였다.
결과
nanoDSF에 의해 융점을 결정하였다. 표 11은 11개 scFv 클론 각각에 대해 Tm-값(변곡점)을 제시한다.
Figure pct00028
결론
모두 11개의 W-ME107 scFv 클론에 대해 융점인 Tm(℃)을 결정할 수 있었다. 55℃ 및 57℃의 다소 더 낮은 Tm 값을 각각 나타낸 W-ME107-27 및 W-ME107-143을 제외한 모든 클론에 대해, Tm 값은 대략 60C < Tm < 70℃의 예상 범위에 있다.
또한, 모든 클론은 두 용융 사건을 나타낸 W-ME107-7을 제외하고 하나의 용융 사건만을 나타냈다. 이는 트립토판-함유 오염물질 또는 W-ME107-7의 이질적 혼합물(폴딩 및 미스폴딩된 집단이 존재)로 인할 가능성이 있을 수 있다.
결정된 Tm-값을 단백질 안정성 측정으로서 사용할 수 있고, 얻어진 데이터는 본 분석에 포함된 다른 scFv 클론에 비해서 클론 W-ME107-27 및 W-ME107-143에 대해 더 낮은 안정성을 나타낸다.
실시예 11 - SPR에 의한 IL13Rα2에 대한 W-ME107 scFv 결합의 IL13-저해
SPR-기반 접근을 이용하여 12개의 W-ME107 scFv 클론 및 참조 클론 mAb47 scFv가 수용체에 대한 결합에 대해 IL13과 결합하는 능력에 대해 분석했다.
각 W-ME107-클론을 항-FLAG M2 항체 고정 SPR 칩 표면 상에 포획하고, IL13α2 수용체 그 자체뿐만 아니라 IL-13와 함께 사전 인큐베이션시킨 IL13Rα2에 결합하는 것을 가능하게 하였다.
12개의 클론 중 7개, 즉, W-ME107-7, W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-55, W-ME107-67, W-ME107-112, W-ME107-150가 수용체에 대한 결합에 대해 IL-13 경쟁을 나타냈다는 것을 발견하였다. 본 명세서에서, 일부 클론은 존재하는 IL-13과의 거의 완전한 결합 상실을 나타낸 반면, 일부 클론은 수용체에 대한 부분적인 상실만을 나타냈다. 음성 대조군 단백질과 함께 사전 인큐베이션시킨 IL13Rα2에 대한 클론 결합은 수용체 결합을 차단할 수 없었다. 이들 결과는 이들 7가지 클론이 수용체 상의 IL-13의 리간드 결합 부위와 중복되거나, 근위에 있는 결합 에피토프를 갖는다는 것을 나타낸다.
IL-13의 존재에 의해 영향받지 않는 5가지 클론, 즉, W-ME107-16, W-ME107-75, W-ME107-117, W-ME107-128 및 W-ME107-156은 IL13Rα2의 IL-13 결합 부위와 별개인 에피토프에 결합하였다.
참조 클론 mAb 47 scFv는 본 실험에서 결합 활성을 나타내지 않았고, 따라서 데이터를 가져올 수 없었다. 그러나, 문헌에서 이 항체가 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 IL-13과 경쟁한다는 것이 보고되었다(Balyasnikova et al., Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin (IL)-13 receptor α2, J Biol Chem 2012, 287(36): 30215-30227).
물질 및 방법
포획 리간드로서 작용하는 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #F1804)를 제조업자의 권장사항에 따라 BIACORE® T200 기기(GE Healthcare) 상에서 ECD/NHS 화학을 통해 CM5-S 아민 센서 칩의 모두 4개의 표면 상에 고정시켰다.
12가지의 단백질 A 정제된 FLAG-태그된 W-ME107 클론(실시예 6), 양성 참조 클론 mAb47 및 음성 대조군 G-strep-1 scFv(스트렙타비딘에 특이적)를 주입하고, 칩 표면 상에서 포획한 후에, 100nM hIL13Rα2-avi(실시예 A1), 100nM hIL13Rα2-avi + 200nM IL13(Prospec #cyt-446), 100nM IL13Rα2-avi + 200nM 스트렙타비딘(Sigma-Aldrich #SA4762) 또는 200nM 스트렙타비딘 중 하나를 주입하였다. 표면을 10mM 글리신-HCl pH 2.1로 재생시켰다. 0.05% TWEEN 20®로 보충한 HBS, pH 7.5 중 25℃에서 모든 실험을 수행하였다.
항-FLAG M2 항체 고정 표면인 참조 표면의 반응 곡선을 차감함으로써, 모든 scFv 클론에 대한 반응 곡선 센소그램을 얻었다.
결과
항-FLAG M2 항체를 CM5 시리즈 S 칩의 모두 4개의 표면 상에 성공적으로 고정시켰다. scFv 클론 포획 및 항원 주입 후에, 칩 표면을 낮은 pH에 의해 성공적으로 재생시켰다.
모두 12개의 W-ME107 scFv 클론은 hIL13Rα2에 대해서 뿐만 아니라 음성 대조군 스트렙타비딘과 함께 사전 인큐베이션시킨 hIL13Rα2에 대해 결합을 나타냈다. 또한, 스트렙타비딘 단독에 대해 결합을 나타낸 클론은 없었다.
IL-13과 함께 사전 인큐베이션시킨 hIL13Rα2에 대한 결합에 대해 클론을 시험하였을 때, 5개의 클론(W-ME107-16, W-ME107-75, W-ME107-117, W-ME107-128 및 W-ME107-156)만이 수용체-리간드 복합체에 대한 결합이 남아있다는 것이 나타났다(도 6). 남아있는 7개의 클론(W-ME107-7, W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-55, W-ME107-67, W-ME107-112 및 W-ME107-150)에 대해, 결합은 IL-13의 존재에 의해 거의 완전하게 차단될 수 있었고, 이를 반응 단위(RU)의 감소에 의해 나타났다(도 6).
참조 클론 mAb47 scFv의 결합 활성은 볼 수 없었다. 예상한 바와 같이, 음성 대조군 G-strep-1 scFv만이 스트렙타비딘과 함께 사전 인큐베이션시킨 hIL13Rα2뿐만 아니라 스트렙타비딘 단독에 대해 결합을 나타냈다.
결론
결과는 IL-13이 존재할 때 12개의 W-ME107 scFv 클론 중 7개가 hIL13Rα2 수용체에 결합할 수 없었다는 것을 나타냈다. 이들 결과는 이들 클론이 수용체 상의 IL-13의 리간드 결합 부위와 중복되거나, 근위에 있는 결합 에피토프를 갖는다는 것을 나타낸다. 또한 IL-13이 수용체에 결합되었을 때, 남아있는 5개의 클론은 hIL13Rα2에 결합할 수 있었다.
IL-13과의 결합 경쟁을 나타내는 모든 클론은 또한 이전에 수행한 동력학 측정(실시예 5 및 실시예 9)에서 Fc-융합된 인간 IL13Rα2 작제물(hIL13Rα2-Fc, RnD systems #7147-IR)에 대해 검출 가능한 결합을 나타내지 않거나, 거의 나타내지 않았다.
실시예 12 - 클론 mAb47 mIgG1을 이용하는 에피토프 비닝 실험
전장 항체 클론 mAb47 mIgG1을 구입하였고, SPR 기반 에피토프 비닝 접근에서 분석했다. 또한, 인간 IL13Rα2에 대한 이의 동력학 상수를 결정하였다.
클론 mAb47 mIgG1은 서브 나노몰 범위인 KD = 0.9nM에서 인간 IL13Rα2에 대해 평형 해리 상수(KD(M))로서 정의되는 친화도를 나타냈다.
더 나아가, 에피토프 비닝 데이터는 클론 mAb47 mIgG1이 인간 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 IL-13, W-ME107-10 scFv 및 W-ME107-27 scFv와 경쟁하거나 방해하였다는 것을 나타냈다. 이는 이들이 모두 수용체 상에서 중복 에피토프 또는 근위의 에피토프를 갖는다는 것을 나타냈다. 데이터는 또한W-ME107-75 scFv 및 W-ME107-117 scFv가 인간 IL13Rα2에 대한 결합에 대해 클론 mAb47 mIgG1을 방해하지 않으며, 따라서, 이들이 별개의 비중복 에피토프를 갖는다는 것을 나타냈다.
물질 및 방법
단일 주기 동력학, SCK
참조 클론 mAb47 mIgG1(Creative Biolabs #NEUT-1190QC)을 10nM NaAc pH 4.0에서 50㎍/㎖로 희석시키고, 제조업자의 권장사항에 따라 NHS/EDC 화학을 이용하여 CM5 시리즈 S 칩 상에 고정하였다. 50nM에서 0.2nM까지의 범위의 5가지 농도로 이루어진 인간 IL13Rα2-avi의 4배 연속 희석물을 후속적으로 칩 표면 위에 주입하였다.
결합 센소그램을 블랭크 참조 표면 센소그램(고정된 리간드 없음)으로 차감하고, 1:1 Langmuir 결합 모델에 적합화시켜 동력학 파라미터인 ka(M-1 s-1), kd(s-1) 및 KD(M)를 가져왔다.
에피토프 비닝
10nM의 hIL13Rα2-avi를, 단독으로 또는 10배 몰 과량(100nM)의 인간 IL13(Prospec #cyt-446) 또는 W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-75, W-ME107-117 scFv 클론과 함께 사전 인큐베이션킨 고정된 클론 mAb47 mIgG1 표면 위에 주입하였다. 대조군 샘플로서, 10nM hIL13Rα2-avi를 10배 몰 과량의 BI-8 scFv(음성 대조군)와 함께 사전 인큐베이션시키거나 또는 클론 mAb47 mIgG1(양성 대조군)을 평가하였다. 회합 단계 및 해리 단계 후에, 10nM 글리신-HCl, pH 2.1을 이용하여 칩 표면을 생성하였다. 결합 센소그램을 블랭크 참조 표면 센소그램(고정된 항체 없음)으로 차감하고, 각 샘플의 반응 단위(RU)인 결합 수준을 가져올 수 있었다.
결과
NHS/EDC 화학을 이용하여 클론 mAb47 mIgG1을 CM5 시리즈 S 칩 상에 성공적으로 고정시켰고, pH 2.1에서 10nM 글리신-HCl에 의한 재생 후에 활성이 남아있었다.
hIL13Rα2에 대한 클론 mAb47 mIgG1의 친화도는 0.9nM의 KD-값으로 서브나노몰 범위가 되는 것으로 결정되었다. 관찰된 회합 속도 상수(ka) 및 해리 속도 상수(kd)는 각각 5.9×105M-1s-1 및 5.4×10-4s-1가 되는 것으로 결정되었다.
에피토프 비닝은, hIL13Rα2를 각각 10배 몰 과량의 인간 IL-13, W-ME107-10 scFv, W-ME107-27 scFv 또는 양성 대조군 클론 mAb47 mIgG1과 함께 사전 인큐베이션시킨 후 클론 mAb47 mIgG1 고정 표면 위로 주입했을 때, 관찰된 결합 반응(RU, y-축)이 hIL13Rα2 단독 주입에 비해서 감소되었다는 것을 나타냈다(도 7). 이는 결합 반응이 hIL13Rα2 단독 주입과 거의 동일한 경우에, W-ME107-75 scFv, W-ME107-117 scFv 및 음성 대조군 BI-8 scFv에 대해서는 관찰되지 않았다(도 7).
결론
인간 IL13Rα2로 향하는 참조 클론 mAb47 mIgG1의 친화도는 서브 나노몰 범위(0.9nM의 KD-값)인 것으로 결정되었다.
에피토프 비닝 결과는 W-ME107-10 및 W-ME107-27뿐만 아니라 인간 IL-13이 hIL13Rα2 수용체에 대한 결합에 대해 참조 클론 mAb47 mIgG1과 경쟁하였다는 것을 나타냈다.
에피토프 비닝 분석으로부터의 결과는 W-ME107 scFv 클론에 대해 이전에 수행한 SPR과 상당히 상관관계가 있었다(실시예 11). 본 실시예는 hIL13Rα2에 대한 결합에 대해 W-ME107-10 scFv 및 W-ME107-27 scFv가 인간 IL-13과 경쟁하는 반면, W-ME107-75 및 W-ME107-117은 그렇지 않았다는 것을 나타냈다.
종합하면, 실시예 11 및 12의 결과는 W-ME107-10 및 W-ME107-27뿐만 아니라 참조 클론 mAb47이 인간 IL13α2 수용체 상의 인간 IL-13 결합 부위에 결합되거나 근위에 있는 반면, W-ME107-75 및 W-ME107-117은 그렇지 않았다는 것을 나타냈다. IL-13 및 클론 mAb47의 중복 에피토프는 또한 문헌[Balyasnikova et al., Characterization and immunotherapeutic implications for a novel antibody targeting interleukin (IL)-13 receptor α2, J Biol Chem 2012, 287(36): 30215-30227]에 의해 시사되며, 여기서, 이들은 플레이트-기반 경쟁 분석을 이용하여 이 항체에 의해 인간 가용성 IL-13과 hIL13Rα2 사이의 상호작용의 유의미한 저해를 나타냈다.
실시예 13 - HDX-MS에 의한 에피토프 맵핑 실험
중수(D2O)를 함유하는 완충제에 단백질을 용해시킬 때, 헤테로원자에 부착된 이들의 수소(예를 들어, -OH, -NH, -SH)를 중수소로 대체한다. 수소 중수소 교환 질량 분석법(HDX-MS)에서, 중수소 혼입 속도는 펩타이드 골격 아마이드기(-NHCO-)의 분자내 수소 결합 정도와 상관관계가 있다. 수소 결합에 이미 관여하는 골격 아마이드-NH 수소, 예를 들어, α-나선 또는 β-시트에 위치된 -NHCO-수소는 이들의 수소를 수용자와 공유하는 데 이용할 수 있는 해당 NH 수소보다 더 느리게 교환한다. 따라서, 장애 영역에 위치된 골격 아마이드 H는 β-시트 또는 α-나선에 참여하는 해당 수소보다 더 빠르게 교환할 것이다.
이제, 단백질 표적에 대한 리간드의 결합이 수소 결합에서 국소 변화, 예를 들어, 구조 안정화 또는 탈안정화를 생성하기 때문에, 이 기법은 단백질 복합체의 결합 계면을 확인하는 데 사용할 수 있다. 대부분의 수소에 대해, H/D 교환은 오래가지 못하며, 폴리펩타이드 쇄가 물-함유 용액과 접촉되자마자, -OD, -SD로서 혼입되는 중수소는 수소로 다시 대체된다. 이런 현상은 "역교환(back exchange)"으로 불리며, 이는 아미노산 잔기의 측쇄에 위치된 헤테로원자에 결합된 중수소에 대해 매우 빠르다. 다행스럽게도, 산성 조건 하(pH 대략 2.3) 및 0℃ 온도 근처에서, 펩타이드 골격 아마이드 기(-NDCO-)에서의 역교환은 액체 크로마토그래피 및 질량분석법(LC-MS)에 의한 분석과 양립 가능한 시간 창까지 느려진다. 이 방식에서, 각각의 D 원자가 H 원자보다 더 무거운 하나의 질량 단위이기 때문에, 혼입 정도를 MS에 의해 모니터링할 수 있다. 추가적으로, 중수소 표지를 효소 단백질분해와 추가로 조합하고, 단백질 내의 상이한 영역의 프로파일을 모니터링할 수 있다.
물질 및 방법
3㎕의 인간 IL13Rα2-avi(실시예 A1 참조)(1.6㎎/㎖)를 24㎕의 중수소화된 PBS와 혼합함으로써 대조군 샘플(IL13Rα2 단독)을 제조하였다. 항원/scFv 복합체를 다음과 같이 제조하였다: 각각의 scFv에 대해 30 kDa 평균 분자량을 이용하여 1:1 항원/scFv 몰비를 위해 40㎕의 hIL13Rα2-avi(1.6㎎/㎖)를 34.5㎕의 W-ME107-117 scFv(1.46㎎/㎖), 74㎕의 W-ME107-10 scFv(0.68㎎/㎖), 57.2㎕ W-ME107-27 scFv(0.88㎎/㎖) 및 122.8㎕ W-ME107-75 scFv(0.41㎎/㎖)와 혼합하였다. 10 kDa 단백질 농축기 Amicon Ultra 0.5㎖를 이용하여 복합체를 초기 40㎕로 농축시켰다. 4분, 10분 및 60분 동안 3㎕의 항원/scFv 복합체를 24㎕의 중수소화된 PBS와 혼합함으로써(2회 행하는 W-ME107-27 및 W-ME107-75의 4분 인큐베이션을 제외하고 3회) 표지 반응을 생성하였다. 인큐베이션 후에, 6M 유레아, 100mM TCEP 및 0.5% TFA를 함유하는 25㎕의 용액을 첨가함으로써 pH를 대략 2.3으로 그리고 온도를 대략 4℃로 감소시킴으로써 반응을 퀀칭시켰다.
샘플을 자동으로 표지하고, 퀀칭시키고, 분해하고, 세정하고 2℃에서 분리시키는 자동화된 HDX-MS 시스템(CTC PAL/Biomotif HDX)에서 샘플을 분석했다. 60㎕/분에서 2분 동안 고정된 펩신 칼럼(2.1×30㎜)을 이용하여 분해한 후에 400㎕/분에서 1분 동안 0.1% 폼산을 이용하여 2㎜ I.D×10㎜ 길이 C-18 프레-칼럼(ACE HPLC Columns, 영국 애버딘 소재)을 이용해서 온라인 탈염 단계가 이어졌다. 이어서, 60㎕/분에서 작동하는 2㎜ I.D×50㎜ 길이 HALO C18/1.8㎛ 분석 칼럼을 이용하여 0.1% 폼산 중 ACN의 18분의 8 내지 55% 선형 구배에 의해 펩신 펩타이드를 분리시켰다. 모든 실험을 수행하기 위해 m/z 400에서 120,000 분해능으로 작동하는 LTQ Elite Orbitrap 질량분석기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하였다.
10ppm 전구체 공차, 0.05Da MS/MS 질량 오차를 이용하여 전용 데이터베이스에서 펩타이드 식별을 위해 사용한 HDExaminer 버전 2.5.1.Mascot에 의해 모든 HDX-MS 데이터를 처리하였다.
결과
본 HDX-MS 실험에서, 두 상이한 실험 조건 하에 변성 완충제를 이용하여 IL13Rα2를 중수소로 표지하였다. IL13Rα2 단독을 이용하는 실험, 및 등몰 농도의 W-ME107-117 scFv의 존재 하에 IL13Rα2를 표지한 다른 것을 이용하는 하나의 실험 세트. 표지 후에, 반응을 중단시키고, 단백질 분해 효소에 의해 단백질을 분해시켰다. 후속 단계에서, 액체 크로마토그래피 질량 분석법(LC-MS)에 의해 IL13Rα2 분해로부터 유래된 각각의 중수소화된 펩타이드의 개개 질량을 측정하였다. 이들 실험 조건 하에서, IL13Rα2 단독과 W-ME107-117 scFv 존재 하 간의 중수소 혼입의 차이는 W-ME107-117 scFv의 결합에 의해 야기된 중수소 혼입의 변화에 전적으로 기인할 수 있었다. 이제, 항체가 항원/항원 계면(에피토프)에서 중수소 혼입의 감소를 생성한다는 것이 당업계에 잘 알려져 있기 때문에, 이들 두 실험 조건 사이의 중수소 혼입의 차이를 결정하고, IL-13에 의한 IL13Rα2의 3차원(3D) 구조에 맵핑하여(PDB 3LB6, Lupardus, et al., Structure (2010) 18: 332-342) 에피토프 위치를 결정하였다. IL13Rα2 단독과 W-ME107-117 scFv 존재 하 사이에 통계적으로 유의미한 차이(t-스튜던트 검정, 실험 조건당 3개의 복제물, 및 99% 신뢰구간, p < 0.01)를 갖는 IL13Rα2로부터 유래된 펩타이드를 확인하고, 15 내지 20 옹스트롬의 영역에 클러스터링되고 scFv의 정확한 결합을 가능하게 하기 위한 충분한 용매 노출을 나타내는 경우 에피토프에 속하도록 배정하였다.
W-ME107-117 scFv에 대한 에피토프로서 다음의 펩타이드를 확인하였다: 67 내지 81번 위치에 대응하는 아미노산 서열 VEYELKYRNIGSETW(서열번호 44); 96 내지 106번 위치에 대응하는 아미노산 서열 DLNKGIEAKIH(서열번호 45); 및 123 내지 128번 위치에 대응하는 아미노산 서열 WAETTY(서열번호 46)(도 8 및 표 12 및 표 13). 이들 3개의 서열은 IL13Rα2의 도메인 1에 맵핑되고, 이런 베타 샌드위치 도메인의 제2 베타 시트의 부분이 된다. 에피토프 영역은 더 구체적으로 인접한 베타 가닥 3, 6 및 7, 베타 가닥 3에 후행하는 루프 및 베타 가닥 6에 선행하는 루프로 이루어졌다(도 10). 이들 루프 둘 다 수용체의 도메인 2를 가리킨다. 에피토프 영역은 전형적으로 항원/항체 계면에 보이는 것을 매칭한 연속적 표면 영역을 형성하였다. 베타 시트로부터 돌출된 아미노산은 주로 거대 아미노산(Trp, Lys, His 및 Glu)이며 항체에 대한 잠재적 수소 결합을 위해 몇몇 하전된 기를 제공한다. 이들 잔기는 공개된 구조에서 잘 정의된 전자 밀도를 갖고, 서로 적층 상호작용을 형성하는 것으로 보였다. 에피토프 영역은 IL-13과 상호작용하지 않는 도메인 1의 측면 상에 있었다.
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
클론 W-ME107-10, W-ME107-27 및 W-ME107-75에 대해 맵핑한 펩타이드는 상이한 조합으로 중복되었고, 도메인 2 상에서 시작하는 하나의 펩타이드를 제외하고 모두 도메인 3에 위치되었다. 펩타이드는 모두 도 14에서 강조하며, 개시 및 정지 아미노산은 숫자로 표시한다(도 14A). W-ME107-10의 HDX-MS는 다음의 두 펩타이드를 제공하였다: 아미노산 번호 228 내지 245에 대응하는 FTFQLQNIVKPLPPVYLT(서열번호 43) 및 아미노산 번호 253 내지 271에 대응하는 EIKLKWSIPLGPIPARCFD(서열번호 36). W-ME107-27에 대한 결과는 아미노산 번호 323 내지 337에 대응하는 펩타이드 SEWSDKQCWGLNDIF(서열번호 23)의 첨가가 있는 동일한 2개의 펩타이드를 제공하며, 여기서, 잔기 332 내지 337은 재조합 단백질의 친화도 태그로부터 유래된다. W-ME107-75에 대해 맵핑된 에피토프는 상기 언급한 것과 동일한 아미노산 번호 253 내지 271 및 323 내지 337을 갖는 두 펩타이드로 이루어졌다.
3차원 구조에 이들 3개의 상이한 펩타이드를 맵핑하는 것은 이들이 모두 IL13Rα2의 C-말단 영역을 향해 클러스터링된다는 것을 나타냈다. 클론 W-ME107-10과 W-ME107-27은 둘 다 펩타이드 228 내지 245를 가졌다. 펩타이드는 도메인 2에서 개시되고, 도메인 3을 통해 계속되었다. 펩타이드의 시작과 가깝게, Gln231, Gln233 및 Asn234는 IL-13의 결합 부위에 대해 근위에 있지만(도 14E), 잔기 중 어느 것도 구조에서 상호작용하는 것이 보이지 않았다. IL13Rα2의 구조 분석은 scFv가 이러한 잔기와 상호작용하는 것이 어렵고 동시에 상기 언급한 다른 펩타이드와 상호작용하는 것이 어렵다는 것을 나타냈다. IL13Rα2의 입체구조 변화는 HDX-MS 결과에서 이들 잔기의 포함을 설명할 수 있다.
클론 W-ME107-75는 이의 에피토프에서 펩타이드 228 내지 245가 결여되었고, IL-13 결합과 경쟁하지 않는 반면, 다른 두 클론은 경쟁하였다는 것을 발견하였다. 펩타이드 253 내지 271은 228 내지 245에 인접하며, Arg268가 있는 IL-13 결합 부위를 향해 놓여서 리간드에 대한 결합을 형성한다. 모두 3개의 클론은 에피토프 맵핑에서 이런 펩타이드를 공유하였다. 그러나, W-ME107-75의 상이한 결합 프로파일로 인해, 이런 scFv는 W-ME107-10 및 W-ME107-27와 동일한 방식으로 펩타이드 253 내지 271에 결합할 것 같지는 않으며, 오히려 펩타이드 253 내지 271의 시작에 더 많이 결합할 것이다(도 14D).
펩타이드 323 내지 337은 수용체의 가장 C-말단의 부분이며, 228 내지 245의 반대측에 놓인다. 단백질 데이터 뱅크(Protein Data Bank: PDB)에서 공개된 구조는 잔기 329에서 정지되고, C-말단의 부분이 어디까지 계속되는지는 말할 수 없다. 이는 구조의 가요성 영역일 가능성이 크다. 상이한 scFv가 마우스 IL13Rα2에 결합하는 방법의 실시예 5 및 9로부터의 데이터를 보고, 이어서, 보존된 잔기가 구조에 위치된 경우를 연구하는 것은 W-ME107-75가 W-ME107-10 및 W-ME107-27과 다른 이유에 대한 더 많은 아이디어를 제공하였다. 도메인 3의 상부를 따라서 신장하고 잔기 237 내지 241, 263 내지 269 및 323 내지 326으로 이루어진 마우스 및 인간 IL13Rα2에서 보존된 잔기의 밴드가 있다. W-ME107-27은 W-ME107-10과 같이 이 영역에 결합하지만 펩타이드 323 내지 326과의 상호작용은 결여하는 것으로 여겨진다(도 14B 및 도 14C). 다른 한편으로 W-ME107-75은 이런 보존된 영역에 많이 결합하지 않으며, 오히려, 아미노산 잔기 253 내지 266 및 가장 C-말단의 잔기 332 내지 337에 결합한다. 이는 W-ME107-10 및 W-ME107-27에 비해서 도메인 3 아래의 추가적인 영역을 의미한다.
더 나아가, HDX-MS 에피토프 맵핑 연구로부터의 결과는 실시예 12로부터의 데이터, 및 실시예 5 및 9에서 scFv에 대한 결합 및 비결합 데이터에 의한 마우스 및 인간의 서열 정렬의 분석과 상당히 상관관계가 있었다. 클론 W-ME107-117을 IL-13 결합 부위로부터 떨어진 수용체의 한 영역에 대해 맵핑한다. 클론 W-ME107-10, W-ME107-27 및 W-ME107-75를 모두 hIL13Rα2 상의 유사한 영역에 맵핑했지만, W-ME107-10 및 W-ME107-27은 W-ME107-75에 결여된 공통적인 하나의 펩타이드를 가졌다. 이런 펩타이드는 IL-13 리간드의 결합 부위와 중복되는 작은 영역을 가졌다. 이들 3개의 scFv가 마우스 수용체에 결합하는 방법 및 보존된 잔기가 위치된 곳의 차이는 다른 에피토프를 더 정확히 찾아내는 것에 도움을 줄 수 있다.
실시예 14 - 펩타이드 어레이를 이용하는 scFv의 에피토프 맵핑
인간 IL13Rα2에 대한 W-ME107-10, W-ME107-27, W-ME107-75 및 W-ME107-117 scFv 클론의 에피토프 맵핑은 4개 클론에 대한 에피토프로서 수용체의 2개의 별개의 부분을 나타냈다(실시예 13). W-ME107-10, W-ME107-27 및 W-ME117-75는 도메인 3 상의 유사 또는 중복되는 영역에 결합하는 것으로 보이는 반면, W-ME107-117은 도메인 1 상의 별개의 에피토프에 결합하였다. 클론 W-ME107-117의 HDX-MS 맵핑의 초기 결과는 도메인 1의 양측에 대해 여러 상이한 펩타이드 확산을 초래하였다. 에피토프를 좁히기 위한 시도에서, IL13Rα2 상의 aa(아미노산) 39 내지 102를 아우르는 이동에서 1 aa을 갖는 15 aa 길이의 펩타이드를 합성하고, ELISA-기반 접근에서 분석했다.
어레이에 포함된 임의의 60개의 펩타이드에 대한 W-ME107-117 scFv의 결합을 검출할 수 없었다. 전체 세포외 도메인을 뒤덮는 단백질 작제물을 향해서만 결합을 검출할 수 있었다. 이는 W-ME107-117 scFv가 IL13Rα2 수용체의 선형 펩타이드 에피토프보다는 입체구조 에피토프를 갖는다는 것이 나타난 실시예 13의 결과를 강화하였다.
물질 및 방법
IL13Rα2의 74 aa, aa 39 내지 102의 신장부를 나타내는 60개의 N-말단의 바이오틴일화된 펩타이드를 주문하고, JPT Peptide Technologies(독일 소재)에 의해 합성하였다. 도착 시, 펩타이드를 0.5㎎/㎖의 최종 농도로 멸균 DMSO(다이메틸 설폭사이드) 중에 용해시켰다.
384-ELISA 웰 플레이트를 4℃에서 밤새 PBS중 1㎍/㎖ 스트렙타비딘 및 1㎍/㎖ hIL13Rα2-Fc로 코팅하였다. 차단 완충제(0.5% BSA 및 0.05% TWEEN 20®으로 보충한 PBS) 중 플레이트의 세척 및 차단 후에, 차단 완충제 중 0.25㎍/㎖ 및 1㎍/㎖로 희석시킨 IL13Rα2 ECD, hIL13Rα2-avi의 바이오틴일화된 펩타이드 및 바이오틴일화된 형태를 각각 30분 동안 결합시켰다. 정제된 W-ME107-117 및 W-ME107-75를 차단 완충제 중 1㎍/㎖로 희석시켰고, 1시간 동안 결합시켰다.
결합의 검출은 HRP-접합 항-FLAG M2 항체(Sigma-Aldrich #A8592)를 통해 가능하였다. TMB ELISA 기질(ThermoFisher Scientific #34029)을 첨가함으로써 결합 신호 발생을 개시하고, 1M 황산을 첨가함으로써 종결시켰다. 플레이트를 450㎚에서 분석했다.
각 샘플을 2회 분석하였고, 블랭크 웰 값을 차감한 후에 이로부터의 평균 흡광도 값을 가져왔다.
결과
어레이에 포함된 임의의 펩타이드에 대한 W-ME107-117 scFv의 결합을 검출할 수 없었다. hIL13Rα2-avi 및 hIL13Rα2-Fc로 향하는 결합을 또한 검출하였다(도 9). 예상한 바와 같이, 펩타이드 어레이 내에 나타나지 않은 에피토프를 갖는 W-ME107-75 scFv는 IL13Rα2의 ECD 도메인으로 향하는 결합만을 나타냈다. 동일한 결과를 갖는 10배 더 높은 농도의 펩타이드를 이용하여 실험을 반복하였다.
결론
W-ME107-117 scFv의 에피토프 맵핑 연구는 W-ME107-10, W-ME107-27 및 W-ME107-75 scFv 클론의 에피토프를 발견한 곳으로부터 IL13Rα2의 반대편 상에 위치된 에피토프를 나타냈다. 도 10에 도시한 구조는 W-ME107-117이 단일 베타 시트(β-시트) 도메인으로 폴딩되는 루프 영역에 의해 연결되는 3개의 베타 가닥(β-시트)을 구성하는 IL13Rα2의 부분에 결합한다는 것을 나타낸다. 에피토프에 포함된 β-시트 및 2개의 루프는 리간드 IL-13에 결합하는 IL13Rα2의 부분에 있지 않다. 따라서, W-ME107-117은 리간드 결합을 방해하지 않는다. 실시예 12로부터의 결과와 함께 펩타이드 어레이에 대한 결합의 부재는 W-ME107-117이 입체구조 에피토프를 갖는다는 것을 발견한 실시예 13의 결과를 강화시킨다.
실시예 15 - 렌티바이러스 작제 및 T 세포 조작
본 실시예는 선택된 scFv에 기반하여 키메라 항원 수용체(CAR) T 세포를 작제하였고, 표적 세포 사멸 분석에서 CAR T 세포를 시험하였다.
물질 및 방법
T 세포의 형질도입을 위한 바이러스 벡터 작제
CD137(4-1BB)로부터의 공자극 도메인 및 CD3ζ로부터의 자극 도메인을 포함하는 2세대 CAR 작제물에 선택된 scFv를 혼입하였다. CAR 카세트를 연장인자-1 알파(EF1α) 프로모터의 제어 하에 3세대 자기-비활성화(SIN) 렌티바이러스 벡터(SBI, System Biosciences, 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재)에 클로닝하였다(도 11). CAR 카세트 후에 녹색 형광 단백질(GFP)을 혼입하고, 자기-절단성 T2A 서열에 의해 분리시켰다. 모든 재조합 서열을 Genscript(뉴저지주 피스카타웨이 소재)로부터 구입하였다. 작제된 CAR 렌티바이러스 플라스미드 및 대응하는 헬퍼 플라스미드를 이용하여 293T 세포의 일시적 형질감염에 대해 바이러스 입자의 생성을 수행하였다. 바이러스 입자-함유 상청액을 채취하고, 원심분리시키고, 이어서, 실험을 위해 사용하였다.
T 세포 조작
㎖당 2×106개의 세포의 농도로 3일 동안 OKT-3(50ng/㎖, BioLegend, 캘리포니아주 샌디에이고 소재) 및 IL-2(100 IU/㎖, 프로류킨, Novartis, 스위스 바젤 소재)를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 활성화시켰다. 활성화 후에, 10㎎/㎖ 프로타민 황산염(Sigma-Aldrich, 미주리주 세인트루이스 소재) 및 IL-2(100 IU)와 함께 30㎕의 농축시킨 렌티바이러스에서 T 세포(2×106개의 세포)를 재현탁시키고, 4시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 다음 날 유사한 방식으로 T 세포를 형질도입하고, 100IU/㎖ IL-2의 최종 농도로 배양 배지(10% FBS, 1% PeSt, 1% 피루브산나트륨으로 보충한 RPMI1640)에서 재현탁시켰다. 7일 후에, GFP 발현(BD FACSAriaIII, BD Bioscience, 캘리포니아주 산 호세 소재)에 기반하여 정렬함으로써 CAR T 세포를 풍부화시켰다. 제조업자의 프로토콜에 따른 이뮤노컬트(immunocult) 시약(STEMCELL Technologies, 캐나다 밴쿠버 소재)을 이용하여 정렬 세포를 확장시켰다.
사멸 분석
hIL13Rα2를 자연적으로 발현시키는 인간 교모세포종 세포주 U-87MG 및 hIL13Rα2를 발현시키지 않는 흑색종 세포주 Mel526은 CAR T 세포에 대한 세포 생존도 및 노출의 판독 신호로서 루시퍼라제 신호를 사용하기 위해 반딧불이-루시퍼라제를 발현시키는 렌티바이러스 플라스미드로 처음 변형시켰다. 이들 표적 세포를 24시간 동안 효과기(CAR T 세포) 대 표적(종양 세포) 세포비 0, 0.2, 1, 5 또는 25개의 CAR T 세포 대 1개의 표적 세포에서 CAR-조작된 T 세포와 함께 공동 배양시켰다. CAR T 세포 및 음성 대조군(CD19-표적화 CAR T 세포)을 본 실시예에서 사용하였다. 반딧불이 루시퍼라제 활성을 표적 세포 생존도의 측정으로서 사용하고, ONE-Glo 루시퍼라제 분석 시스템(Promega Biotech AB, 스웨덴 소재)을 이용하여 측정하였다.
결과
모든 시험한 CAR T 세포 작제물이 hIL13Rα2-발현 교모세포종 세포(U-87MG)를 특이적으로 사멸시켰지만, 항원-음성 흑색종 세포(Mel526)를 사멸시키지 않았다(도 12). 예상한 바와 같이 암 세포주는 CD19를 발현시키지 않기 때문에, 음성 대조군(CD19-표적화 CAR T 세포)은 임의의 암 세포주를 사멸시키지 않았다(도 12).
W-ME107-10 scFv, W-ME107-75 scFv 및 W-ME107-117 scFv에 기반한 W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CART 세포는 각각 이미 낮은 효과기 대 표적 세포비로 실질적인 세포독성 능력을 나타냈다. 반면에, W-ME107-27 scFv 및 W-ME107-55 scFv에 기반한 W-ME107-27 CAR 및 W-ME107-55 CAR T 세포는 보다 높은 효과기 대 표적 비에서만 사멸을 입증하였다(도 12). 이미 공개된 mAb47 scFv에 기반하여 생성된 참조 X-ME107-47(mAb47) CART 세포(J Biol Chem 2012, 287: 30215-30227, Mol Ther 2016, 24(2): 354-363)는 미미한 표적 세포 사멸만을 나타냈다.
실시예 16 - 증식 분석
본 실시예는 표적 세포와 함께 공동 배양할 때 다양한 CAR T 세포의 증식 능력을 연구하였다.
물질 및 방법
생성된 CAR T 세포는 항원-양성 표적 세포와 접했을 때 세포 증식을 추적하기 위하여 CellTrace Violet Label(ThermoFisher)로 표지하였다. CellTrace Violet-표지 T 세포는 비자극인 채로 남아있거나 또는 표적 U-87MG 세포(1:1 비)와 함께 공동배양하였다. 배양물을 처리하지 않고 두거나 또는 유세포분석(BD FACSCantoII, BD Bioscience)으로 분석하기 전에 4일 동안 10μM 로바스타틴(Sigma-Aldrich, 대조군으로서 T 세포 증식을 방지하기 위함)으로 처리하였다. 히스토그램에서 보이는 바이올렛-염료의 희석(피크 패턴)을 세포 증식으로서 간주하였다.
결과
W-ME107-55 CAR 및 W-ME107-27 CAR T 세포의 거의 절반이 종양 세포와의 공동배양 시 분할되었다. 현저하게, 거의 모든 W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포는 표적 세포와 접할 때 2회 이상 분할되었다(도 13). 참조 mAb47(X-ME107-47) CAR T 세포는 또한 표적 종양 세포와 공동 배양 시 증식되었지만, mAb47 CAR T 세포의 절반만이 2회 이상 분할되었다는 사실을 고려할 때, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CART 세포에 대해서보다 더 적었다. 예상한 바와 같이, CD19-표적화 CAR T 세포는 U-87MG 세포와의 배양에서 증식하지 않았다. 종합하면, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포는 표적 세포 인식 시 상당한 증식 능력을 입증하였다. 결과는 참조 mAb47 CART 세포를 제외하고 W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CART 세포가 표적 세포와 효율적으로 상호작용할 수 있고, 이에 의해 상당한 증식 능력을 달성할 수 있었다는 것을 나타낸다.
실시예 17 - CAR T 세포 프로파일링 및 특성규명
본 실시예는 사이토카인 방출 프로파일, 표면 마커 발현 및 CAR 발현 상태를 갖는 CAR T 세포를 연구하고 특성규명하였다.
물질 및 방법
실시예 15에 기재한 바와 같은 렌티바이러스 작제물을 이용하여 인간 CAR T 세포를 조작하였다. 세포를 분석까지 IL-2(25 IU/㎖)로 보충한 세포 배양 배지에서 배양시키거나, 분석 전에 자극으로서 PBMC의 3명의 공여자를 이용하여 빠른 확장 프로토콜로 확장시켰다.
비자극 CAR T 세포로부터의 IFN-감마 분비
렌티바이러스 벡터를 이용하여 모의(대조군으로서), W-ME107-55 CAR, W-ME107-27 CAR, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포를 조작하고, 표준 T 세포 배양 배지에서 배양시켰다(실시예 15). 렌티바이러스 형질도입 후 제7일에, CAR T 세포(200㎕ 배양 배지에서 웰당 2×105개의 세포)를 96-웰 플레이트에 파종하고, 추가 1일 동안 배양시킨 후에 상청액을 채취하였다. CAR T 세포에 의해 세포 배양물 상청액 내로 분비된 IFN-감마를 ELISA(Mabtech, 스웨덴 소재)에 의해 정량화하였다.
종양-자극된 CAR T 세포로부터의 IFN-감마 분비
렌티바이러스 벡터를 이용하여 모의(대조군으로서), W-ME107-55 CAR, W-ME107-27 CAR, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포를 조작하고(실시예 15), 빠른 확장 프로토콜을 이용하여 확장하였다. 확장 후에, 3일 동안 IL-2(25 IU/㎖)로 보충한 세포 배양 배지에서 CAR T 세포를 휴지시키고, CAR T 세포를 U87UU 또는 U343MG 종양 세포와 함께 다양한 비로 96-웰 플레이트에 파종하고, 추가 2일 동안 배양시킨 후에 상청액을 채취하였다. 세포 배양물 상청액 내로 분비된 IFN-감마를 ELISA(Mabtech, 스웨덴 소재)에 의해 정량화하였다.
세포 표면 상의 CAR 발현 수준
렌티바이러스 벡터를 이용하여 모의(대조군으로서), W-ME107-55 CAR, W-ME107-27 CAR, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포를 조작하고, 표준 T 세포 배양 배지에서 배양시켰다(실시예 15). 렌티바이러스 형질도입 후 3, 6 및 12일에, CAR T 세포를 CD3, CAR(항-인간 Ig(H+L) 항체를 이용)에 대해 염색하고, 유세포분석으로 분석했다. 시간에 따른 CAR 발현 수준을 각 CAR T 세포에 대해서와 같이 히스토그램으로서 제시하였다.
종양 자극 전 및 후의 CAR T 세포 표면 활성화 마커 발현
렌티바이러스 벡터를 이용하여 모의(대조군으로서), W-ME107-27 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포를 조작하고(실시예 15), 빠른 확장 프로토콜을 이용하여 확장시켰다. 분석 전 3일 동안 IL-2(25 IU/㎖)로 보충한 세포 배양 배지에서 조작된 CAR T 세포를 세포 배양 배지에서 휴지시켰다. 휴지된 CAR T 세포를 96-웰 플레이트에 직접 파종하고, 단독으로 배양시키고, 분석하거나; 또는 1일 동안 U87UU 종양 세포와 함께 공동배양시켰다. CAR T 세포를 PD-1, TIM-3, LAG-3, CD69, CD25 및 CD3에 대해 염색한 후에, 유세포분석에서 분석했다. 데이터를 (CD3-양성 및 GFP-양성 세포로서 게이팅된) CAR T 세포에서의 특이적-마커 양성 세포의 백분율로서 제시하였다.
결과
렌티바이러스 벡터로 T 세포 형질도입 직후에 정상 상태에서, W-ME107-55 CAR 및 W-ME107-27 CAR T 세포는 다량의 IFN-감마를 분비한 한편, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포는 모의 CAR T 세포 대조군에 비해서 상대적으로 소량의 IFN-감마를 분비한다(도 15A). 한편으로, 조작된 CAR T 세포를 종양 세포와 함께 공동배양시켰을 때, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포를 용량 의존적 방식으로 보다 다량의 IFN-감마(IFN-γ)를 발현시킨 반면, W-ME107-55 CAR 및 W-ME107-27 CAR T 세포는 종양 세포 자극에 반응하여 임의의 IFN-감마를 거의 분비하지 않았다(도 15B).
시간에 따라 표면 CAR 발현 수준을 분석할 때, 본 발명자들은 모든 CAR T 세포가 렌티바이러스 형질도입 후에 세포 표면 상에서 발현된 CAR 분자를 갖는다는 것을 관찰하였다. 그러나, W-ME107-55 CAR 및 W-ME107-27 CAR의 발현은 시간에 따라 감소되는 반면, W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR은 세포 표면 상에서 시작으로부터와 유사한 수준으로 남아있었다(도 15C).
종양 세포 자극의 존재 및 부재 하에 조작된 CAR T 세포 상에서 표면 활성화 마커를 시험함으로써, 본 발명자들은 W-ME107-27 CAR T 세포가 종양 세포 자극 없이 발현된 이들 활성화 마커의 이미 더 높은 수준을 가졌고, 추가적인 종양 자극은 마커 발현 수준에 영향을 미치지 않았다는 것을 주목하였다. 한편으로, 이들 마커는 비자극 W-ME107-117 CART 세포에서 낮은 수준으로 남아있었고, 종양 세포 자극 시 이들의 발현을 극적으로 증가시켰다(도 15D).
종합하면, 이들 결과는 W-ME107-55 CAR 및 W-ME107-27 CAR T 세포는 표적 의존적이지 않은 기저 수준 활성화를 가졌고, 이 기저 수준 활성화는 표적 종양 세포에 대해 CAR T 세포의 더 적은 반응성을 야기하였다는 것을 나타냈다.
실시예 18 - CAR T 세포는 생체내 교모세포종 종양 성장을 제어한다
본 실시예는 동물 모델에서 교모세포종 종양 성장을 제어함에 있어서 다양한 CAR T 세포의 효능을 연구하였다. 이전의 데이터는 W-ME107-55 CAR 및 W-ME107-27 CAR T 세포가 비특이적인, 표적-독립적 기저 수준 활성화를 갖는다는 것을 시사하기 때문에, 본 발명자들은 W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T 세포의 종양 성장 저해 효능을 분석했다.
물질 및 방법
실시예 15에 기재한 바와 같은 렌티바이러스 작제물을 이용하여 인간 CAR T 세포를 조작하였다. 이전의 데이터는 W-ME107-10 CAR, W-ME107-75 CAR 및 W-ME107-117 CAR T가 증식에서 더 양호하고 더 낮은 기저 수준 활성화를 가졌다는 것을 나타냈기 때문에, 본 발명자들은 생체내 이들 CAR T 세포를 평가하였다. 인간 교모세포종 세포 U343MG-Luc(5㎕ 중 1×105개의 세포)를 조작하여 반딧불이 루시퍼라제를 발현시키고, 누드 마우스에 두개내로 이식하였다. 주사기 및 정위주사 프레임을 이용하여 브레그마(bregma)로부터 1㎜ 전측 및 1.5㎜ 우측 및 2.7㎜ 깊이로 주사를 수행하였다. 종양 이식 후 제7일에, 마우스를 동일한 위치에 두개내로 투여한 (대조군으로서) 모의 T 세포 또는 다양한 CAR T 세포(2백만개)로 처리하였다. 마우스는 IVIS 시스템(NightOWL)을 이용하여 루시퍼라제 신호의 영상화로 추척하고, 현지 승인된 동물 윤리 허가를 엄격히 준수하여 중증 증상의 발생 시 안락사시켰다. 개략적 실험 절차를 도 16A에 나타낸다. 루시퍼라제 신호(평균+SEM)를 종양 성장의 지표로 제시하였고, 각 처리군에서 마우스의 생존을 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선으로서 제시하고, 게한-브레슬로-윌슨콕(Gehan-Breslow-Wilcoxon) 검정을 이용하여 비교하였다.
결과
모두 3개의 시험한 CAR T 세포(W-ME107-10 CAR T, W-ME107-75 CAR T 및 W-ME107-117 CAR T)는 모의 T 세포 처리군에 비해서 처리군에서 더 낮은 루시퍼라제 신호로 나타내는 바와 같이 종양 성장을 제어할 수 있었다(도 16B). 또한, W-ME107-75 CAR T 세포 처리와 W-ME107-117 CAR T 세포 처리가 둘 다 현재의 분석 조건에서 마우스 생존을 유의미하게 개선시킨다는 것을 나타냈다(도 16C).
실시예 19 CDR은 CAR 발현 및 기능성에 차별적으로 영향을 미친다
본 실시예는 CDR 영역의 아미노산을 알라닌으로 치환함으로써 상이한 작제물 사이의 CAR 발현 수준 차이의 메커니즘을 연구하였다. 이전의 데이터는 W-ME107-27 및 W-ME107-117이 CAR 표면 발현에서 가장 큰 차이를 갖는다는 것을 시사했기 때문에, 본 발명자들은 이들 두 클론 및 W-ME107-117과 상이한 W-ME107-27에서 치환된 아미노산을 연구하였다.
물질 및 방법
바이러스 작제 및 T 세포 조작
아미노산 치환을 갖는 DNA 작제물(표 14에서 상세히 설명함)을 Genscript에서 주문하고, 렌티바이러스 벡터에 서브클로닝하였다. 렌티바이러스 작제를 실시예 15에 기재하였다. 인간 Jurkat T 세포주를 렌티바이러스 작제물로 조작하였다. 바이러스 형질도입 후 제4일에 유세포분석에 의한 분석까지 조작된 세포를 세포 배양 배지(10% FBS, 1% PeSt, 1% 피루브산나트륨으로 보충한 RPMI1640)에서 배양시켰다.
Figure pct00032
CAR-발현 분석
조작된 세포를 CAR에 대해 염색하고(항-인간 Ig(H+L) 항체를 이용), 유세포분석으로 분석했다. GFP-양성 세포 중 CAR-양성 세포의 백분율을 게이팅하고 제시하였다.
결과
W-ME107-27-Ala2, W-ME107-27-Ala4, W-ME107-27-Ala5는 GFP 양성 형질도입된 T 세포 중 유의미하게 더 높은 CAR 발현을 나타냈다. W-ME107-27-Ala1, W-ME107-27-Ala3은 W-ME107-27과 유사한 수준의 CAR 발현을 나타냈다(도 17A, 도 17B). 이들 결과는 중쇄에서 CDR2 및 경쇄에서 CDR3이 CAR 표면 발현에 영향을 미치는 데 가장 잘 기여하였다는 것을 나타냈다.
실시예 20 기저 수준 활성화는 세포내 신호전달 도메인과 연관된다
본 실시예는 CAR 분자(유인 CAR)의 세포내 신호전달 도메인을 제거함으로써 조작된 CAR T 세포의 기저 수준 활성화 메커니즘을 연구하였다. 이전의 데이터는 W-ME107-27 및 W-ME107-117이 CAR 표면 발현에서 가장 큰 차이를 갖는다는 것을 시사했기 때문에, 본 발명자들은 이들 두 클론을 연구하였다.
물질 및 방법
바이러스 작제 및 T 세포 조작
유인 CAR이 있는 DNA 작제물은 Genscript 형태로 주문하였고, W-ME107-27dCAR 및 W-ME107-117dCAR을 생성한 렌티바이러스 벡터로 서브클로닝하였다(도 18A). 렌티바이러스 작제를 실시예 15에 기재하였다. 인간 T 세포를 렌티바이러스 작제물로 조작하였다.
IFN-γ 분비
조작된 세포를 바이러스 형질도입 후 7일 동안 25 IU IL-2/㎖로 공급한 세포 배양 배지(10% FBS, 1% PeSt, 1% 피루브산나트륨으로 보충한 RPMI1640)에서 배양시켰다. 이어서, 조작된 세포(2×105개의 세포/웰)를 임의의 추가 사이토카인 보충물 없이 200㎕ 세포 배양 배지 중 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24시간 후에 세포 배양물 상청액을 채취하고, 상청액 중 IFN-γ를 ELISA(Mabtech, 스웨덴 소재)에 의해 측정하였다.
결과
W-ME107-27과 W-ME107-117 CAR T 세포 둘 다 정상 상태에서 IFN-γ를 분비하는 반면, W-ME107-27 CAR T 세포는 유의미하게 더 많은 양의 IFN-γ를 분비하였다(도 18C). 세포내 신호전달 도메인을 제거했을 때, W-ME107-27dCAR과 W-ME107-117dCAR은 둘 다 이들의 상대에 비해서 유의미하게 더 낮은 IFN-γ 분비를 나타냈다(도 18C). 모의 T 세포는 IFN-γ를 분비하지 않는다(도 18C). 이들 결과는 조작된 CAR T 세포의 기저 수준 활성화가 이의 세포내 신호전달 도메인과 연관된다는 것을 나타냈다.
실시예 A1 - 재조합 인간 IL13Rα2(hIL13Rα2-avi)의 제조
바이오틴일화된 hIL13Rα2를 클로닝하고, 단리시켰다.
물질 및 방법
물질
MultiBac 발현 시스템 키트, Geneva Biotech, NaN
SalI,G|TCGAC Thermo Fischer Scientific, FD0644
XhoI, C|TCGAG Thermo Fischer Scientific, FD0694
KpnI, GGTAC|C Thermo Fischer Scientific, FD0524
PstI, CTGCA|G Thermo Fischer Scientific, FD0615
신속 DNA 결찰 키트, Thermo Fischer Scientific, K1422
Cre 재조합효소, NEB, M0298
GeneJET 플라스미드 Miniprep 키트, Thermo Fischer Scientific, K0503
PureLink HiPure 플라스미드 DNA 미니 키트, Thermo Fisher Scientific, K210002
LA, Sigma, L7025
LB 브로스, Sigma, L03022
One Shot Mach1 T1 파지-내성 화학적 적격 이콜라이, Thermo Fischer Scientific, C862003
One Shot PIR1 화학적 적격 이콜라이, Thermo Fischer Scientific, C101010
스펙타마이신(Spectamycin), Sigma, S4014
겐타마이신(Gentamycin), Sigma, G1397
IPTG, ThermoFisher, 15529019
BluoGal, ThermoFisher, 15519028
테트라사이클린, Bioline, 87030
DH10EmBacy 적격 세포(multibac 키트로부터 준비)
Stellar 적격 세포, Clontech, 636763.
17AEAMOP_ME107h_pMA-T, Gene Art
17AEAMPP_BirA_pMA-T, Gene Art
pFastBac 정방향, GGA TTA TTC ATA CCG TCC CA
pACEBac1 역방향(SV40 폴리A), TGA AAT TTG TGA TGC TAT TGC
pIDS 정방향, CGA TAC TAG TAT ACG GAC C
pIDS 역방향, CCG TGC GTT TTA TTC TGT C
Hepes, VWR, 441487M
글리세롤, VWR, 444485B
TWEEN 80®(Surfact-Amps 80), Pierce, 0028328
이미다졸, Merck, 1.04716.0250
NaCl, VWR, 27800.360
HisTrap 엑셀 1㎖, GE Healthcare, 17-3712-05
HiLoad Superdex 200 16/60, GE Healthcare, 28-9893-35
Novex Sharp 염색 전 단백질 표준, Invitrogen, LC5800
NuPAGE 항산화제, Invitrogen, NP0005
NuPAGE LDS 샘플 완충제, Invitrogen, NP0007
NuPAGE MES SDS 실행 완충제 20×, Invitrogen, NP000202
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 단백질 겔 1.0㎜ 10-웰, Invitrogen, NP0321BOX
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris 단백질 겔 1.0㎜ 15-웰, Invitrogen, NP0323BOX
Pierce 단백질 농축기 10K 5 내지 20㎖, Thermo Scientific, 88527
항-6X His 태그 항체, Abcam, ab18184
쿠마씨 단백질 분석 시약, Thermo Fisher Scientific, 1856209
hIL13Rα2-avi의 클로닝
인간 IL13Rα2의 ECD 도메인(Uniprot Q14627 aa 29 내지 331)을 바큘로바이러스/Sf9 시스템에서 BirA와 함께 공동발현시켜 바이오틴일화된 수용체를 생성하였다. 유전자 작제물에서, 배양 배지에 단백질의 분비를 위해 천연 신호 펩타이드(aa 1-28)를 gp67 바큘로바이러스 신호 펩타이드와 교환하였다. BirA에 의해 지시된 바이오틴일화를 용이하게 하기 위해 Avi-태그를 수용체에 대해 C-말단에 혼입한 후에, 친화도 정제를 위한 His6-태그를 혼입하였다. 이는 Trp331 후에 첨가한 C-말단의 아미노산 서열 GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(서열번호 111)를 제공하였다. 작제물은 클로닝 부위 SalI 및 XhoI에 측접하며, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)에 대해 코돈 최적화하였다. 마찬가지로, 이콜라이 BirA 리가제 유전자는 XhoI 및 KpnI에 측접하며, 코돈 최적화되었다. GeneArt, Thermofisher로부터 유전자를 주문했다(벡터 17AEAMOP_ME107h_pMA-T 및 벡터 17AEAMPP_BirA_pMA-T).
제조업자의 프로토콜에 따라 수용자 벡터 pACEBac1의 hIL13Rα2-avi 및 공여자 벡터 pIDS의 BirA의 multibac 작제물을 생성하였다. GATC에서 서열분석에 의해 벡터 서열을 확인하였다. 두 벡터를 Cre-Lox 재조합에 의해 융합시켜, hIL13Rα2-AVIhis/BirA 작제물을 형성한다. 바크미드(bacmid)에 전좌(transposition)를 위해 본 작제물을 DH10EmbacY에 형질전환하였다. 이들 세포에서 청/백 선별에 의해 양성 클론의 선택을 하였다. 최종적으로, 바크미드를 단리시키고, PCR에 의해 유전자의 혼입에 대해 분석했다.
hIL13Rα2-avi의 발현 및 특성규명
바크미드를 Sf9 세포에 형질감염시켜 바큘로바이러스를 생성하였다. 인간 IL13Rα2를 48시간 동안 2.3ℓ의 형질감염 Sf9 배양물에서 발현시켰고, HisTrap 엑셀 칼럼 상에 포획함으로써 배지로부터 채취하였다. 완충제 A(50mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 9mM 이미다졸, 10% 글리세롤 및 10μM TWEEN 80®)를 이용하여 칼럼을 평형상태로 만들었다. 칼럼을 완충제 A로 세척한 후에, 단백질을 완충제 B(50mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 9mM 이미다졸, 10% 글리세롤, 10μM TWEEN 80® 및 300mM 이미다졸)로 용리시켰다.
단백질 함유 분획을 풀링하고 농축시킨 후에, Superdex 200 16/60 칼럼 상에서 50mM HEPES pH 7.0, 150mM NaCl, 10% 글리세롤 및 10μM TWEEN 80®을 이용하여 샘플을 폴리싱하였다. SDS Page에 따라 가장 순수한 단백질 분획을 선택하고, 풀링하고, 농축시켰다. SDS 겔 상에서 정제된 hIL13Rα2 수용체를 실행하여 순도 및 크기를 결정하였다. ELISA 및 웨스턴 블롯에 의해 클론 mAb47 단일 쇄 대조군에 대한 결합을 확인하였다. MS 분석을 위해 수용체를 또한 Xiaofang Cao의 임상적 단백질체학 질량 분석법, 생명과학 실험실(Clinical Proteomics Mass Spectrometry, Science for Life Laboratory)에 보냈다. 샘플을 3회 실행했지만, 서열의 일부만을 포함시켰다. 본 발명자들은 단백질의 ID가 정확하다는 결론을 내릴 수 있었다.
상기 기재한 실시형태는 본 발명의 소수의 예시적인 예로서 이해하여야 한다. 당업자는 본 발명의 범주로부터 벗어나는 일 없이 실시형태에 대해 다양한 변형, 조합 및 변화가 만들어질 수 있다는 것을 이해할 것이다. 특히, 상이한 실시형태에서 상이한 부분의 해결책은 기술적으로 가능한 경우에 다른 구성으로 조합될 수 있다. 그러나, 본 발명의 범주는 첨부하는 청구범위에 의해 정해진다.
SEQUENCE LISTING <110> ELICERA THERAPEUTICS AB <120> ANTI-IL13RA2 ANTIBODIES, ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS AND USES THEREOF <130> WO/2021/230792 <140> PCT/SE2021/050419 <141> 2021-05-05 <150> SE 2050572-3 <151> 2020-05-15 <160> 119 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 1 Ser Gly Ser Tyr 1 <210> 2 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 2 Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 3 Tyr Ser Pro Phe Tyr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 4 Gly Tyr Ser Phe Pro 1 5 <210> 5 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 5 Ser Gly Ser Tyr Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 6 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Tyr Met Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 7 Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr 1 5 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 8 Ser Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 9 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 9 Tyr Ser Pro Phe Tyr Met 1 5 <210> 10 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 10 Ala Arg Tyr Ser Pro Phe Tyr Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 11 Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR1 <400> 12 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 13 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH chain <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser 20 25 30 Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Gly Ser Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Ser Pro Phe Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL chain <400> 14 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Ser Phe Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 15 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 15 Val Val Arg Ser Thr Tyr Gly Tyr 1 5 <210> 16 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 16 Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr 1 5 <210> 17 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 17 Tyr Ser Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Gly Phe 1 5 10 <210> 18 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 18 Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr 1 5 <210> 19 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 19 Arg Tyr Arg Ser His Arg Pro Gly Leu Ser 1 5 10 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 20 Phe His Pro Arg Tyr Gly Tyr 1 5 <210> 21 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 21 Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 22 Tyr Tyr His Tyr Asp Tyr Gly Tyr Tyr Tyr 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Gly Leu Asn Asp Ile Phe 1 5 10 15 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR part <400> 24 Arg Asn Tyr Trp Glu His Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 25 His His Tyr Gly Tyr Tyr Pro Pro Gly Ser Val Tyr Tyr 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 26 Val Glu Tyr Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Ser Pro Val 1 5 10 <210> 27 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GS-linker <400> 27 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 15 <210> 28 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 28 Thr Tyr Tyr Ser Pro His 1 5 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 29 Asp Tyr Tyr Leu Phe 1 5 <210> 30 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 30 Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr 1 5 <210> 31 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 31 Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu 1 5 <210> 32 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 32 Ala Phe Ser Pro Ser 1 5 <210> 33 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 33 Ser Tyr Asp Thr Leu Leu 1 5 <210> 34 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 34 Ala Leu Ser Ser Leu Pro 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 35 Phe Ser Thr Arg Leu Ser 1 5 <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Glu Ile Lys Leu Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg 1 5 10 15 Cys Phe Asp <210> 37 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 37 Ser Thr Tyr Pro Phe 1 5 <210> 38 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 38 Tyr Gly Ser Asn Pro Leu 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 part <400> 39 Arg Tyr Asn Gly Leu Phe 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 40 Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Phe 1 5 10 <210> 41 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 41 Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile 1 5 <210> 42 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 part <400> 42 Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr Leu 1 5 10 <210> 43 <211> 18 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro Pro Val Tyr 1 5 10 15 Leu Thr <210> 44 <211> 15 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr Trp 1 5 10 15 <210> 45 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His 1 5 10 <210> 46 <211> 6 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Trp Ala Glu Thr Thr Tyr 1 5 <210> 47 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 47 Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 48 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 48 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 49 Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser Tyr Met Gly 1 5 10 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 50 Gly Phe Thr Phe Gly Ser Ser Tyr Met Tyr 1 5 10 <210> 51 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 51 Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 52 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH extended CDR1 <400> 52 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met Ser 1 5 10 <210> 53 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 53 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 54 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 54 Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 55 Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Tyr Thr 1 5 <210> 56 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 56 Ile Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr 1 5 <210> 57 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR2 <400> 57 Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Thr 1 5 <210> 58 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 58 Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr 1 5 10 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 59 Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 60 Tyr Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 61 Gly Ile Ser Gly Ser Gly Ser Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 62 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 62 Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 63 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH eCDR2 <400> 63 Ser Ile Ser Ser Gly Ser Ser Tyr Thr Tyr 1 5 10 <210> 64 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 64 Ala Arg Val Val Arg Ser Thr Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 65 Ala Arg Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 66 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 66 Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Gly Trp Tyr Tyr Gly Phe Met Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 67 Ala Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp Tyr 1 5 10 <210> 68 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 68 Ala Arg Arg Tyr Arg Ser His Arg Pro Gly Leu Ser Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 69 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 69 Ala Arg Phe His Pro Arg Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 70 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 70 Ala Arg Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 71 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 71 Ala Arg Tyr Tyr His Tyr Asp Tyr Gly Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 72 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 72 Ala Arg Arg Asn Tyr Trp Glu His Gly Gly Gly Ser Leu Asp Tyr 1 5 10 15 <210> 73 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 73 Ala Arg His His Tyr Gly Tyr Tyr Pro Pro Gly Ser Val Tyr Tyr Phe 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 74 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR3 <400> 74 Ala Arg Val Glu Tyr Thr Tyr Tyr Gly Ser Glu Gly Ser Pro Val Phe 1 5 10 15 Asp Tyr <210> 75 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 75 Gln Gln Thr Tyr Tyr Ser Pro His Thr 1 5 <210> 76 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 76 Gln Gln Asp Tyr Tyr Leu Phe Thr 1 5 <210> 77 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 77 Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Tyr Thr 1 5 <210> 78 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 78 Gln Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 79 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 79 Gln Gln Ala Phe Ser Pro Ser Thr 1 5 <210> 80 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 80 Gln Gln Ser Tyr Asp Thr Leu Leu Thr 1 5 <210> 81 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 81 Gln Gln Ala Leu Ser Ser Leu Pro Thr 1 5 <210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 82 Gln Gln Phe Ser Thr Arg Leu Ser Thr 1 5 <210> 83 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 83 Gln Gln Ser Thr Tyr Pro Phe Thr 1 5 <210> 84 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 84 Gln Gln Tyr Gly Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL CDR3 <400> 85 Gln Gln Arg Tyr Asn Gly Leu Phe Thr 1 5 <210> 86 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH chain <400> 86 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Gly His Tyr Ala Tyr Gly Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL chain <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asp Tyr Tyr Leu Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 88 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH chain <400> 88 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser 20 25 30 Tyr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Tyr Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 89 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL chain <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 90 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH chain <400> 90 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Gly Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Ser His Tyr Gly Ala His Tyr Leu Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL chain <400> 91 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Leu Ser Ser Leu Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 92 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 1E10B9 scFv <400> 92 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Tyr Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Arg Asp Tyr 20 25 30 Ser Val His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Ala Phe Phe Leu Glu Ala Ser Ala Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Asp Tyr Arg Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 100 105 110 Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Glu Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ile Leu Ser Val Thr Ile Gly 130 135 140 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser 145 150 155 160 Asn Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser 165 170 175 Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser Gly Val Pro 180 185 190 Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 195 200 205 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Val Gln Gly 210 215 220 Ser His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 225 230 235 240 Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp His Asp 245 250 255 Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala Ala His His His His 260 265 270 His His <210> 93 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mAb47 scFv <400> 93 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Glu Gln Asp Leu Asp Trp Ile 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Gly Asp Ile Asp Tyr Asn Gln Asn Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Ile Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Tyr Gly Thr Ala Tyr Gly Val Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser 130 135 140 Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 145 150 155 160 Glu Ser Val Asp Asn Tyr Gly Ile Ser Phe Met Asn Trp Phe Gln Gln 165 170 175 Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Arg Gln 180 185 190 Gly Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Phe Ser Leu Asn Ile His Pro Met Glu Glu Asp Asp Thr Ala Met Tyr 210 215 220 Phe Cys Gln Gln Ser Lys Glu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr 225 230 235 240 Lys Leu Glu Ile Lys Ala Ala Ala Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp 245 250 255 Tyr Lys Asp His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Ala Ala 260 265 270 Ala His His His His His His 275 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 94 Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr 1 5 10 <210> 95 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr 1 5 10 <210> 96 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 96 Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr 1 5 10 <210> 97 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 97 Asp Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu 1 5 10 <210> 98 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 98 Ala Lys Ile His Thr Leu Leu 1 5 <210> 99 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 99 Phe Thr Phe Gln Leu 1 5 <210> 100 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 100 Gly Phe Thr Phe Gly Tyr Tyr Tyr 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 101 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 102 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 102 Gly Phe Thr Phe Tyr Gly Ser Tyr 1 5 <210> 103 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 103 Gly Phe Thr Phe Gly Ser Ser Tyr 1 5 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 104 Gly Phe Thr Phe Tyr Ser Tyr Gly 1 5 <210> 105 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 105 Gly Phe Thr Phe Ser Gly Ser Tyr 1 5 <210> 106 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH CDR1 <400> 106 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly 1 5 <210> 107 <211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Met Ala Phe Val Cys Leu Ala Ile Gly Cys Leu Tyr Thr Phe Leu Ile 1 5 10 15 Ser Thr Thr Phe Gly Cys Thr Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ile Lys Val 20 25 30 Asn Pro Pro Gln Asp Phe Glu Ile Val Asp Pro Gly Tyr Leu Gly Tyr 35 40 45 Leu Tyr Leu Gln Trp Gln Pro Pro Leu Ser Leu Asp His Phe Lys Glu 50 55 60 Cys Thr Val Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn Ile Gly Ser Glu Thr 65 70 75 80 Trp Lys Thr Ile Ile Thr Lys Asn Leu His Tyr Lys Asp Gly Phe Asp 85 90 95 Leu Asn Lys Gly Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu Pro Trp Gln 100 105 110 Cys Thr Asn Gly Ser Glu Val Gln Ser Ser Trp Ala Glu Thr Thr Tyr 115 120 125 Trp Ile Ser Pro Gln Gly Ile Pro Glu Thr Lys Val Gln Asp Met Asp 130 135 140 Cys Val Tyr Tyr Asn Trp Gln Tyr Leu Leu Cys Ser Trp Lys Pro Gly 145 150 155 160 Ile Gly Val Leu Leu Asp Thr Asn Tyr Asn Leu Phe Tyr Trp Tyr Glu 165 170 175 Gly Leu Asp His Ala Leu Gln Cys Val Asp Tyr Ile Lys Ala Asp Gly 180 185 190 Gln Asn Ile Gly Cys Arg Phe Pro Tyr Leu Glu Ala Ser Asp Tyr Lys 195 200 205 Asp Phe Tyr Ile Cys Val Asn Gly Ser Ser Glu Asn Lys Pro Ile Arg 210 215 220 Ser Ser Tyr Phe Thr Phe Gln Leu Gln Asn Ile Val Lys Pro Leu Pro 225 230 235 240 Pro Val Tyr Leu Thr Phe Thr Arg Glu Ser Ser Cys Glu Ile Lys Leu 245 250 255 Lys Trp Ser Ile Pro Leu Gly Pro Ile Pro Ala Arg Cys Phe Asp Tyr 260 265 270 Glu Ile Glu Ile Arg Glu Asp Asp Thr Thr Leu Val Thr Ala Thr Val 275 280 285 Glu Asn Glu Thr Tyr Thr Leu Lys Thr Thr Asn Glu Thr Arg Gln Leu 290 295 300 Cys Phe Val Val Arg Ser Lys Val Asn Ile Tyr Cys Ser Asp Asp Gly 305 310 315 320 Ile Trp Ser Glu Trp Ser Asp Lys Gln Cys Trp Glu Gly Glu Asp Leu 325 330 335 Ser Lys Lys Thr Leu Leu Arg Phe Trp Leu Pro Phe Gly Phe Ile Leu 340 345 350 Ile Leu Val Ile Phe Val Thr Gly Leu Leu Leu Arg Lys Pro Asn Thr 355 360 365 Tyr Pro Lys Met Ile Pro Glu Phe Phe Cys Asp Thr 370 375 380 <210> 108 <211> 8 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Glu Tyr Glu Leu Lys Tyr Arg Asn 1 5 <210> 109 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Ile Glu Ala Lys Ile His Thr Leu Leu 1 5 <210> 110 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 110 Ala Glu Thr Thr Tyr 1 5 <210> 111 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> C-terminal with Avi-tag and His6-tag <400> 111 Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu His 1 5 10 15 His His His His His 20 <210> 112 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy CDR1 region <400> 112 Phe Tyr Gly Ser Tyr Met Gly Trp 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy CDR2 region <400> 113 Ser Tyr Ile Ser Gly Tyr Gly 1 5 <210> 114 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy CDR3 region <400> 114 Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Tyr Ile Asp 1 5 <210> 115 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light CDR3 region <400> 115 Gln Phe Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 116 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy CDR1 region <400> 116 Phe Ala Gly Ser Tyr Met Ala Trp 1 5 <210> 117 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy CDR2 region <400> 117 Ser Ala Ile Ala Gly Ala Gly 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy CDR3 region <400> 118 Arg Ala Ala Ala Ala Ala Tyr Ala Asp 1 5 <210> 119 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light CDR3 region <400> 119 Gln Ala Tyr Ser Ala Pro Ala Thr 1 5

Claims (51)

  1. 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL13Rα2)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    IL13Rα2에서 아미노산 번호 68 내지 75의 제1 베타 가닥, 제1 베타 가닥에 후행하는 루프, IL13Rα2에서 아미노산 번호 101 내지 109의 제2 베타 가닥, 제2 베타 가닥에 선행하는 루프 및 IL13Rα2에서 아미노산 번호 124 내지 128의 제3 베타 가닥을 포함하는 IL13Rα2의 베타 시트 영역 내의 에피토프에 대해 특이성을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 IL13Rα2에서 아미노산 번호 67 내지 81, 즉, VEYELKYRNIGSETW(서열번호 44), 아미노산 번호 96 내지 106, 즉, DLNKGIEAKIH(서열번호 45) 및 아미노산 번호 123 내지 128, 즉, WAETTY(서열번호 46)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드, 바람직하게는 적어도 2개의 펩타이드, 및 더 바람직하게는 모두 3개의 펩타이드를 포함하는 에피토프에 대해 특이성을 갖는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 YSPFY(서열번호 3)를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 서열 YSPFYM(서열번호 9)을 포함하는, 더 바람직하게는 아미노산 서열 ARYSPFYMDY(서열번호 10)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 중쇄(VH) 도메인 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GYSFPP(서열번호 4)를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 서열 QQGYSFPPT(서열번호 11)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 경쇄(VL) 도메인 상보성 결정 영역 3(CDR3)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 SGSY(서열번호 1)를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 서열 GFTFSGSY(서열번호 105)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 중쇄(VH) 도메인 상보성 결정 영역 1 (CDR1)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제5항에 있어서, 연장된 VH 도메인 CDR1은 아미노산 서열 GFTFSGSYMS(서열번호 6)를 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 YGSGGY(서열번호 2)를 포함하는, 바람직하게는 아미노산 서열 IYGSGGYT(서열번호 7)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 중쇄(VH) 도메인 상보성 결정 영역 2(CDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 연장된 VH 도메인 CDR2는 아미노산 서열 SIYGSGGYTY(서열번호 8)를 포함하거나, 바람직하게는 이것으로 이루어진, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 QSISSY(서열번호 12)을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 경쇄(VL) 도메인 상보성 결정 영역 1(CDR1)을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 AAS를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 경쇄(VL) 도메인 상보성 결정 영역 2(CDR2)를 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    아미노산 서열
    Figure pct00033
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 중쇄(VH) 도메인; 및
    아미노산 서열
    Figure pct00034
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 경쇄(VL) 도메인
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL13Rα2)에 결합할 수 있는 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    아미노산 서열 GFTFX1X2X3X4를 포함하되, 바람직하게는 이것으로 이루어지되, 각각의 Xn(n=1...4)은 G, A, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, 가변 중쇄(VH) 도메인 상보성 결정 영역 1(CDR1);
    아미노산 서열 IB1B2B3B4B5B6T를 포함하되, 바람직하게는 이것으로 이루어지되, 각각의 Bm(m=1...6)은 G, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되는, VH 도메인 CDR2;
    아미노산 서열 AR-ZH-Z1DY를 포함하되, 바람직하게는 이것으로 이루어지되, Z1은 F, M, I 및 L로 이루어진 군으로부터 선택되고, ZH는 VVRSTYGY(서열번호 15), YGHYAYGSY(서열번호 16), YSSSGWYYGF(서열번호 17), TPYSAY(서열번호 18), RYRSHRPGLS(서열번호 19), FHPRYGY(서열번호 20), GSYSHYGAHY(서열번호 21), YYHYDYGYYY(서열번호 22), YSPFY(서열번호 3), RNYWEHGGGS(서열번호 24), HHYGYYPPGSVYY(서열번호 25) 및 VEYTYYGSEGSPV(서열번호 26)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내는, VH 도메인 CDR3;
    아미노산 서열 QSISSY(서열번호 12)를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 가변 경쇄(VL) 도메인 CDR1;
    아미노산 서열 AAS를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인 CDR2; 및
    아미노산 서열 QQ-ZL-T를 포함하되, 바람직하게는 이것으로 이루어지되, ZL은 TYYSPH(서열번호 28), DYYLF(서열번호 29), SYSTPY(서열번호 30), FYSYPL(서열번호 31), AFSPS(서열번호 32), SYDTLL(서열번호 33), ALSSLP(서열번호 34), FSTRLS(서열번호 35), GYSFPP(서열번호 4), STYPF(서열번호 37), YGSNPL(서열번호 38) 및 RYNGLF(서열번호 39)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내는, VL 도메인 CDR3
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  13. 제12항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 GFTFX1X2X3X4MX5를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 연장된 VH CDR1을 포함하되, 각각의 Xn(n=1...5)은 G, A, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  14. 제13항에 있어서, X5는 S 또는 G인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  15. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 아미노산 서열 JIB1B2B3B4B5B6TY를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 연장된 VH CDR2를 포함하되, 각각의 Bm(m=1...6)은 G, S 및 Y로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고, J는 A, Y, G 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  16. 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    X1은 S 또는 Y이고;
    X2는 S 또는 G이며;
    X3은 S 또는 Y이고; 그리고
    X4는 A, Y 또는 G인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    B1은 S 또는 Y이고;
    B2는 G이며;
    B3은 S, G 또는 Y이고;
    B4는 G이며;
    B5는 S 또는 G이고; 그리고
    B6은 S 또는 Y인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, ZH-Z1은 YGHYAYGSYF(서열번호 40), TPYSAYI(서열번호 41), GSYSHYGAHYL(서열번호 42) 및 YSPFYM(서열번호 9)으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  19. 제12항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ZL은 DYYLF(서열번호 29), FYSYPL(서열번호 31), ALSSLP(서열번호 34) 및 GYSFPP(서열번호 4)로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 나타내는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  20. 제12항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    서열번호 101의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR1, 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR2; 서열번호 65의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR1, AAS의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR2 및 서열번호 76의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR3; 또는
    서열번호 102의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR1, 서열번호 55의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR2; 서열번호 68의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR1, AAS의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR2 및 서열번호 78의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR3; 또는
    서열번호 104의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR1, 서열번호 54의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR2; 서열번호 70의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR1, AAS의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR2 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR3; 또는
    서열번호 105의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인 CDR1, 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR2; 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH CDR3, 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR1, AAS의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR2 및 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL CDR3
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원-결합 단편은,
    아미노산 서열
    Figure pct00035
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인; 및
    아미노산 서열
    Figure pct00036
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인; 또는
    아미노산 서열
    Figure pct00037
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인; 및
    아미노산 서열
    Figure pct00038
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인; 또는
    아미노산 서열
    Figure pct00039
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인; 및
    아미노산 서열
    Figure pct00040
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인; 또는
    아미노산 서열
    Figure pct00041
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인; 및
    아미노산 서열
    Figure pct00042
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인; 또는
    아미노산 서열
    Figure pct00043
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VH 도메인; 및
    아미노산 서열
    Figure pct00044
    를 포함하는, 바람직하게는 이것으로 이루어진 VL 도메인
    을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원-결합 단편은 단일쇄 가변 단편(scFv)인, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 의약으로서 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  25. 키메라 항원 수용체(CAR)로서,
    제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는, 항원 인식 도메인;
    막관통 도메인; 및
    세포내 신호전달 도메인
    을 포함하는, 키메라 항원 수용체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 막관통 도메인은 분화 클러스터 28의 막관통 도메인(CD28)의 모두, 또는 일부, CD8α의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD27의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD137의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD134의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3ε의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3ζ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3γ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, CD3δ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부, TCRα의 막관통 도메인의 모두 또는 일부 및 TCRβ의 막관통 도메인의 모두 또는 일부로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 막관통 도메인은 CD28의 막관통 도메인의 모두 또는 일부 및 CD8α의 막관통 도메인의 모두 또는 일부로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR.
  27. 제25항 또는 제26항에 있어서, 상기 세포내 신호전달 도메인은 분화 클러스터 3의 제타쇄(CD3ζ), CD28, CD137, ICOS, CD27, CD40, CD134 및/또는 Myd88로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 세포내 신호전달 도메인은 CD3ζ 및/또는 CD137로 이루어진 군으로부터 선택되는, CAR.
  28. 의약으로서 사용하기 위한, 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 CAR.
  29. 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, CAR.
  30. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 항원 인식 도메인을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 복합체.
  31. 의약으로서 사용하기 위한, 제30항에 따른 TCR-복합체.
  32. 제30항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, TCR-복합체.
  33. 접합체로서,
    제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편; 및
    효과기 분자로서, 바람직하게는 검출 가능한 표지, 세포독소, 금속, 다른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 핵산 서열 및 지질 이중층 도킹 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택된, 효과기 분자
    를 포함하는, 접합체.
  34. 제33항에 있어서, 상기 효과기 분자는 세포독소인, 의약으로서 사용하기 위한, 접합체.
  35. 제33항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한 것이되, 상기 효과기 분자는 세포독소인, 접합체.
  36. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 CAR 및/또는 제30항에 따른 TCR-복합체를 암호화하는, 핵산 분자.
  37. 의약으로서 사용하기 위한, 제36항에 따른 핵산 분자.
  38. 제36항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, 핵산 분자.
  39. 제36항에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  40. 의약으로서 사용하기 위한, 제39항에 따른 벡터.
  41. 제39항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, 벡터.
  42. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 CAR, 제30항에 따른 TCR-복합체, 제36항에 따른 핵산 및/또는 제39항에 따른 벡터를 포함하는, 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 세포는 T 세포, 자연살해(NK) 세포, B 세포, 단핵구 및 대식세포로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 T 세포인, 세포.
  44. 의약으로서 사용하기 위한, 제42항 또는 제43항에 따른 세포.
  45. 제42항 또는 제43항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, 세포.
  46. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 따른 CAR, 제30항에 따른 TCR-복합체, 제33항에 따른 접합체, 제36항에 따른 핵산 분자, 제39항에 따른 벡터 및/또는 제42항 또는 제43항에 따른 세포, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  47. 의약으로서 사용하기 위한, 제46항에 따른 약제학적 조성물.
  48. 제46항에 있어서, 교모세포종, 수모세포종, 유방암, 두경부암, 췌장암, 신장암, 난소암, 결장암, 간암, 폐암, 요로상피암 및 카포시 육종으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 치료에서 또는 질환의 발병을 지연시키는 데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  49. 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL13Rα2)-양성 세포를 확인하는 방법으로서,
    생물학적 샘플을 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 접촉시키는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플의 적어도 하나의 세포에 결합된 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 양을 측정하여, IL13Rα2-양성 세포로서 적어도 하나의 세포를 확인하는 단계
    를 포함하는, IL13Rα2-양성 세포를 확인하는 방법.
  50. 인터류킨-13 수용체 서브유닛 알파-2(IL13Rα2)의 에피토프로서,
    IL13Rα2에서 아미노산 번호 68 내지 75의 제1 베타 가닥, 상기 제1 베타 가닥에 후행하는 루프, IL13Rα2에서 아미노산 번호 101 내지 109의 제2 베타 가닥, 상기 제2 베타 가닥에 선행하는 루프 및 IL13Rα2에서 아미노산 번호 124 내지 128의 제3 베타 가닥을 포함하는 IL13Rα2의 베타 시트 영역 내에 있는, IL13Rα2의 에피토프.
  51. 제50항에 있어서, 상기 에피토프는 IL13Rα2에서 아미노산 번호 67 내지 81, 즉, VEYELKYRNIGSETW(서열번호 44), 아미노산 번호 96 내지 106, 즉, DLNKGIEAKIH(서열번호 45) 및 아미노산 번호 123 내지 128, 즉, WAETTY(서열번호 46)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 펩타이드, 바람직하게는 적어도 2개의 펩타이드 및 더 바람직하게는 모두 3개의 펩타이드를 포함하는, IL13Rα2의 에피토프.
KR1020227035755A 2020-05-15 2021-05-05 항-IL13Rα2 항체, 이의 항원 결합 단편 및 용도 KR20230010188A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE2050572 2020-05-15
SE2050572-3 2020-05-15
PCT/SE2021/050419 WO2021230792A1 (en) 2020-05-15 2021-05-05 ANTI-IL13Rα2 ANTIBODIES, ANTIGEN-BINDING FRAGMENTS AND USES THEREOF

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230010188A true KR20230010188A (ko) 2023-01-18

Family

ID=78524790

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227035755A KR20230010188A (ko) 2020-05-15 2021-05-05 항-IL13Rα2 항체, 이의 항원 결합 단편 및 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US20230183364A1 (ko)
EP (1) EP4149977A1 (ko)
JP (1) JP2023525226A (ko)
KR (1) KR20230010188A (ko)
CN (1) CN115427455A (ko)
AU (1) AU2021270220A1 (ko)
CA (1) CA3173893A1 (ko)
WO (1) WO2021230792A1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114672476A (zh) * 2022-01-14 2022-06-28 复旦大学附属中山医院 人pcsk9蛋白的优势构象表位及其应用
WO2023154829A2 (en) * 2022-02-09 2023-08-17 Absci Corporation Unlocking de novo antibody design with generative artificial intelligence

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2480008C (en) * 2002-03-22 2015-10-06 The Penn State Research Foundation Use of il-13 receptor subunit alpha 2 as an anti-cancer vaccine
US20180170992A1 (en) * 2015-01-26 2018-06-21 The University Of Chicago CAR T CELLS RECOGNIZING CANCER-SPECIFIC IL 13Ra2
WO2016123142A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 The University Of Chicago IL13RAα2 BINDING AGENTS AND USE THEREOF IN CANCER TREATMENT
WO2018156711A1 (en) * 2017-02-22 2018-08-30 H. Lee Moffitt Cancer Center And Research Institute, Inc. Il13ra2-binding chimeric antigen receptors

Also Published As

Publication number Publication date
US20230183364A1 (en) 2023-06-15
CN115427455A (zh) 2022-12-02
EP4149977A1 (en) 2023-03-22
CA3173893A1 (en) 2021-11-18
JP2023525226A (ja) 2023-06-15
AU2021270220A1 (en) 2022-11-10
WO2021230792A1 (en) 2021-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107636014B (zh) 抗癌融合多肽
KR102404077B1 (ko) Dll3 및 cd3에 결합하는 이중특이적인 항체 작제물
DK2982694T3 (en) Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3174903B1 (en) Bispecific single chain antibody construct with enhanced tissue distribution
CN107660213B (zh) 人源化抗MUCl＊抗体
KR20180030852A (ko) Flt3 및 cd3을 위한 항체 작제물
KR20180034430A (ko) Egfrviii 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체 작제물
KR20180037950A (ko) 메소텔린 및 cd3에 결합하는 이중특이적 항체 작제물
JP7482488B2 (ja) Ｃｄ１３７とｐｄ－ｌ１に特異的な新規融合タンパク質
KR20180002855A (ko) 항암 융합 폴리펩타이드
CN114230668A (zh) 抗cd3抗体、抗cd123抗体和与cd3和/或cd123特异性结合的双特异性抗体
KR20150134322A (ko) Ｃｄｈ19 및 ｃｄ3에 대한 항체 작제물
KR101504039B1 (ko) 인간 및 마우스 ｌ１ｃａｍ 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도
TW202311292A (zh) Ｃｄｈ３與ｃｄ３之雙特異性抗體構築體
KR20220050971A (ko) 신규 항-cd39 항체
CN111269315B (zh) 针对bcma的单克隆抗体
CN111171155B (zh) 抗cd3和cd123双特异性抗体及其用途
KR20230010188A (ko) 항-IL13Rα2 항체, 이의 항원 결합 단편 및 용도
JP2023540526A (ja) ネクチン－４抗体およびそれの使用
CN113754780A (zh) 靶向cldn18.2的嵌合抗原受体、其组合物及用途
KR102291725B1 (ko) 항-cntn4 항체 및 그의 용도
CN114341180A (zh) 抗pd-l1的人源化抗体
CN114144429A (zh) 针对pd-1和lag-3的双特异性抗体
KR20220157686A (ko) 항-bcam 항체 또는 그의 항원 결합 단편
CA3230246A1 (en) Bispecific antibody and use thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination