CN116640216A - 抗cd19抗体的抗体、抗cd22抗体的抗体及其应用 - Google Patents
抗cd19抗体的抗体、抗cd22抗体的抗体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了抗CD19抗体的抗体、抗CD22抗体的抗体及其应用，并将两种抗体应用于CD19单靶点CAR‑T细胞CAR阳性表达率的检测、CD22单靶点CAR‑T细胞CAR阳性表达率的检测和CD19‑CD22双靶点CAR‑T细胞CAR阳性表达率的检测中。
Description
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体涉及抗CD19抗体的抗体、抗CD22抗体的抗体及其应用。
背景技术
嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor，CAR）是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。
目前已上市的CAR-T产品中包含多款靶向CD19的产品，虽然靶向CD19的CAR-T细胞在治疗B细胞恶性肿瘤方面已取得良好的疗效，但是仍有患者在接受CAR-T细胞治疗后，产生CD19阴性的肿瘤复发。这种进行CAR-T治疗前的肿瘤细胞表面表达CD19抗原，但复发的肿瘤细胞表面不再表达CD19抗原的现象被认为是在CAR-T细胞治疗后产生的抗原逃逸（antigen-loss or escape）现象。因此为了克服肿瘤抗原逃逸现象，研发了同时靶向CD19和CD22的CAR-T细胞，CD22也是治疗B淋巴细胞来源血液系统肿瘤的主要靶点之一。使用这种双靶点CAR-T产品，只要有一个肿瘤抗原靶点被识别，CAR-T细胞就可被活化。从CAR-T产品治疗疾病的原理即可看出，CAR-T产品中CAR阳性表达率的检测非常重要。
在对单靶点CAR-T产品进行CAR阳性表达率检测时，通用型的方法可以使用抗F(ab')2 抗体，商业渠道获得的抗F(ab')2 抗体可与其同种属来源的、含有Fab段可变区的scFv结合而达到检测CAR表达的目的，其可检测不同靶点的CAR，例如荧光标记的抗鼠F(ab')2 抗体与鼠源scFv结合以达到检测CAR阳性率的目的，来自Jackson ImmunoRearchLaboratories的多克隆山羊抗小鼠F(ab')2抗体是目前使用较多的抗体。但针对双靶点CAR-T产品，F(ab')2 抗体无法专属地区分针对不同靶点的胞外抗原识别结构域，因此为了更全面、充分的了解双靶点产品、考察双靶点产品的CAR阳性率，需要开发能够专属区分双靶点产品中针对不同靶点胞外抗原识别结构域的检测方法。同时，所开发的针对双靶点胞外抗原识别结构域的检测方法同样适用于相应单靶点。
发明内容
本申请分别提供了抗CD19抗体的抗体、抗CD22抗体的抗体，并将两种抗体应用于CD19单靶点CAR-T细胞CAR阳性表达率的检测和CD19-CD22双靶点CAR-T细胞CAR阳性表达率的检测中。
一种抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:28所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:28所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:29所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:29所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:30所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:30所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:31所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:31所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:32所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:32所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:33所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:33所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
一种抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述CD19抗体为CD19 scFv，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，可选的，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位被荧光素标记。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，被荧光素标记的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述被荧光素标记的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的氨基酸序列轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
和/或，所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素或Alexa Fluor® 405荧光素；可选地，所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素。
本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在某些实施方式中，编码上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：编码如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:38所示；和编码如SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:39所示；
或，编码如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:40所示；和编码如SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:41所示；
或，编码如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:42所示；和编码如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:43所示。
本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
本申请还提供了一种细胞，其包含上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体中的任一种。
本申请还提供了一种上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种在制备检测试剂中的应用。
本申请还提供了一种检测试剂，其包含上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，检测试剂用于检测以下样品的一种或多种：
包含如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19VL氨基酸序列的样品。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品选自以下样品：细胞样品、血液样品。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述检测试剂用于以下用途中的一种或多种：
a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR阳性表达率；
b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；
c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品；
所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19 VL氨基酸序列。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于非实体瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于白血病患者；可选地，所述样品来自于淋巴细胞白血病患者；进一步可选地，所述样品来自于急性淋巴细胞白血病患者；更进一步可选地，所述样品来自于成人急性淋巴细胞白血病患者或儿童急性淋巴细胞白血病患者。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于淋巴瘤患者；可选地，所述样品来自于B细胞淋巴瘤患者；进一步可选地，所述样品来自于非霍奇金淋巴瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于自身免疫性疾病患者；可选地，所述自身免疫性疾病患者为系统性红斑狼疮患者。
一种CD19单靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位对CD19单靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD19 CAR+ T细胞比例。
上述检测方法在某些实施方式中，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位被Alexa Fluor 647荧光标记；
和/或，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位抗CD19抗体的抗体中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
一种抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:34所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:34所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:35所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:35所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:36所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:36所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:37所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:37所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
一种抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述CD22抗体为CD22 scFv，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，可选的，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施方式中，所述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被荧光素标记；可选地，所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素或Alexa Fluor® 405荧光素。
本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在某些实施方式中，编码上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：编码如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:44所示；和编码如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:45所示；
或，编码如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:46所示；和编码如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示。
本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
本申请还提供了一种细胞，其包含上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体中的任一种。
本申请还提供了一种上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种在制备检测试剂中的应用。
本申请还提供了一种检测试剂，其包含上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，检测试剂用于检测以下样品的一种或多种：
包含如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22VL氨基酸序列的样品。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品选自以下样品：细胞样品、血液样品。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述检测试剂用于以下用途中的一种或多种：
a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR阳性表达率；
b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；
c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品；
所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22 VL氨基酸序列。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于非实体瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于白血病患者；可选地，所述样品来自于淋巴细胞白血病患者；进一步可选地，所述样品来自于急性淋巴细胞白血病患者；更进一步可选地，所述样品来自于成人急性淋巴细胞白血病患者、儿童急性淋巴细胞白血病患者。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于淋巴瘤患者；可选地，所述样品来自于B细胞淋巴瘤患者；进一步可选地，所述样品来自于非霍奇金淋巴瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施方式中，所述样品来自于自身免疫性疾病患者；可选地，所述自身免疫性疾病患者为系统性红斑狼疮患者。
一种CD22单靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位对CD22单靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD22 CAR+T细胞比例。
上述检测方法在某些实施方式中，所述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被Alexa Fluor 647荧光标记。
上述检测方法在某些实施方式中，所述抗CD22抗体的抗体中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
一种CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，和/或，使用上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，对CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD19 CAR+T细胞和/或CD22 CAR+T细胞比例。
上述检测方法在某些实施方式中，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位和/或抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被Alexa Fluor 647荧光标记；
上述检测方法在某些实施方式中，
所述抗CD19抗体的抗体中，
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
和/或，所述抗CD22抗体的抗体中，
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
附图说明
图1中简要展示了本申请中抗CD19抗体的抗体、抗CD22抗体的抗体的筛选流程。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
以下对本申请做进一步描述：在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的蛋白质和核酸化学、分子生物学、细胞和组织培养、微生物学、免疫学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体”（Chimeric Antigen Receptor，CAR）是CAR细胞治疗药物的核心部件，其可包括胞外抗原识别结构域、铰链区、跨膜区和细胞内结构域。CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T）细胞免疫疗法，被认为是最有希望攻克肿瘤的手段之一。CAR-T细胞就是利用基因改造的方法使T细胞表达CAR蛋白，这种CAR蛋白有能力在不依赖于抗原提呈的情况下识别膜表面的完整蛋白，进而引起T细胞的活化和功能效应。
在本申请中，术语“胞外抗原识别结构域”是指抗原识别结构域（AntigenRecognition Domain，ARD）。CAR细胞治疗产品（如CAR-T细胞）之所以能特异性识别和/或结合到肿瘤细胞表达的靶抗原，依赖于胞外抗原识别结构域，到目前为止，抗原识别结构域从抗体的单链可变区（Single Chain Variable Fragment，缩写为scFv）、或者从受体配体相互作用、TCR模拟物、可变的淋巴细胞受体（Variable Lymphocyte Receptors，VLR）衍生而来。到目前为止，最为常见的来源就是scFv抗体。针对二个或大于二个靶点的scFv抗体中包括针对不同靶点的VH区和VL区，不同区域之间通过连接序列直接连接或间接连接，其排列方式可以通过以下形式的任意一种：靶点1 VL-靶点1 VH-靶点2 VL-靶点2 VH，靶点2 VL-靶点2 VH-靶点1 VL-靶点1 VH，靶点1 VL-靶点2 VL-靶点2 VH-靶点1 VH，靶点2 VL-靶点1VL-靶点1 VH-靶点2 VH，上述“-”代表通过连接序列连接。
本申请中，术语“特异性识别和/或结合”是指CAR胞外抗原识别结构域和特异性靶标之间的识别和/或结合，或者CAR胞外抗原识别结构域和特异性检测抗体之间的识别和/或结合是以比CAR结合其它靶标或检测抗体更大的亲和性、亲合力、更容易、和/或以更大的持续时间结合。
在本申请中，术语“抗体”具有本领域常规的含义，在本申请中以最广泛的含义使用，在生物科学领域，通过分析不同抗体重链和轻链的氨基酸序列发现，重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定。因此，将抗体轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)，重链和轻链的V区分别简称为VH和VL，重链和轻链的C区分别简称为CH和CL。在抗体可变区内有一小部分氨基酸残基变化特别强烈，这些氨基酸的残基组成和排列顺序更易发生变异区域称高变区(hypervariableregions，HVR)；在L链、H链的V区中各有三个高变区，该部位因在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，故高变区又称互补性决定区(complementarity determining region，CDR)。抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。抗体的6个CDR区共同决定了抗体对相应抗原的识别能力和特异性。本领域技术人员应当理解，当本申请限定了6个CDR区的氨基酸序列时，抗体对相应抗原的识别能力和特异性是可预期的。
在本申请中，术语“抗原结合部位”具有本领域常规的含义，是指抗体上可特异性识别并结合抗原的关键部位，包括VH和/或VL区。
在本申请中，术语“连接序列”通常是指长度为约1至100个氨基酸的寡肽或多肽区，其将本发明的抗体、嵌合抗原受体的任何结构/区域连接在一起。连接序列可由不同的氨基酸残基(如甘氨酸和丝氨酸)组成，以便相邻的蛋白质结构域相对于彼此自由移动。当期望确保两个相邻结构域在空间上不相互干扰时，可使用较长的连接序列。
在本申请中，术语“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除从天然状态下经人工手段获得后，经过人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
在本申请中，术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，其可以是从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体（YAC）、细菌人工染色体（BAC）或P1来源的人工染色体（PAC）；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录酶病毒（包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒（如单纯疱疹病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒（如SV40）。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。术语“转座子”是指不连续的DNA片段，具有在染色体位点之间迁移和携带基因信息的能力，如：睡美人SB系统和来源于鳞翅目昆虫的PB系统。在一些实施例中，还可以使用电转的方法将mRNA转导进T细胞。
在本申请中，术语“包含”、“包括”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下本领域技术人员可接受的波动范围，如：在±0.5%-10%的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、5.5%、6%、6.5%、7%、7.5%、8%、8.5%、9%、9.5%或10%的范围内变动。
在本申请中，CD19 CAR-T细胞、CD19-CD22 CAR-T细胞、EGFR CAR-T细胞等CAR-T细胞采用现有制备方法制备。我们采用二代CAR结构，CD8α引导链为信号肽，以相应scFv为胞外肿瘤抗原识别区域，铰链区和跨膜区采用CD8α的结构，以4-1BB为胞内共刺激信号，CD3ζ为T细胞激活信号。具体制备步骤如下：
1、1、慢病毒载体的构建：分别人工合成包含本申请中相应scFv的CAR结构片段（CAR结构依次包括：如SEQ ID NO:55所示CD8α引导链、相应scFv序列、如SEQ ID NO:56所示的CD8α铰链区、如SEQ ID NO:57所示的CD8α跨膜区、如SEQ ID NO:58所示的4-1BB胞内共刺激信号，如SEQ ID NO:59所示的CD3ζ T细胞激活信号，其中：CD19 scFv的氨基酸序列如SEQID NO:48所示，CD19-CD22 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:50所示，EGFR scFv的氨基酸序列如WO2022068870A1中SEQ ID NO:9所示），并分别构建到经过抗性改造的空慢病毒载体（厂家：SBI公司，货号：CD500-CD800，如WO2021/121227实施例1中记载的经过抗性改造）中获得CAR表达载体，随后将CAR表达载体和三种包装质粒一起转染293T细胞，经过收集纯化之后得到有功能性的慢病毒载体。三种包装质粒分别是PMD2.0G（购自Biovector公司，产品号Biovector012259），pMDLg-pRRE（购自Biovector公司，产品号Biovector012251），pRSV-Rev（购自Biovector公司，产品号Biovector012253）。
2、通过慢病毒转导的方式制备相应CAR-T细胞
转导实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行，简述转导步骤如下：
1）分选T细胞：从人单采血细胞中分离获得外周血单个核细胞（PBMC），然后从PBMC细胞中分选获得T细胞；
2）对T细胞进行激活处理：将分离的T细胞用完全淋巴细胞培养液（X-VIVO15培养基 + 5% FBS + 300IU/ml IL-2或X-VIVO15培养基 + 5% FBS + 5ng/ml IL-15 + 10ng/mlIL-7）进行重悬，使终浓度为（1~2）×106个细胞/ml，并加入5~10µl的CD3/CD28磁珠刺激，混匀后置于培养箱培养，培养条件为37℃ + 5% CO2，培养时间至少24小时；
3）慢病毒转导T细胞：取出激活培养的T细胞，加入终浓度为8µg/ml的聚凝胺（polybrene），混匀，并按MOI=2缓慢加入慢病毒载体，混匀后将其置于离心机中，1500rpm，离心1.5小时。然后将其置于培养箱培养，培养条件为37℃ + 5% CO2，培养时间至少24小时；
4）转导后T细胞的扩增培养：取出转导后的细胞，监测细胞密度，使细胞维持在（0.5~1）×106个细胞/ml，以备后续实施例使用。
抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位
一种抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:28所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:28所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:29所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:29所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:30所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:30所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:31所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:31所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:32所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:32所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:33所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:33所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
在抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。
本申请还提供了一种抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
在本申请中，采用了IMGT规则进行CDR的划分。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，所述CD19抗体为CD19scFv，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列，可选的，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位被荧光素标记。
上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，被荧光素标记的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
和/或，所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素或Alexa Fluor® 405荧光素；可选地，所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素。
分离的核酸分子、载体、细胞
本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在某些实施例中，编码上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：编码如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:38所示；和编码如SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:39所示；
或，编码如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:40所示；和编码如SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:41所示；
或，编码如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:42所示；和编码如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:43所示。
本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
本申请还提供了一种细胞，其包含上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体中的任一种。
抗CD19 抗体的抗体或其抗原结合部位的应用
本申请还提供了一种上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种在制备检测试剂中的应用。
本申请还提供了一种检测试剂，其包含上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，检测试剂用于检测以下样品的一种或多种：
包含如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19VL氨基酸序列的样品。
在本申请中，通过实验证明了：以CD19 scFv作为靶抗原所产生的抗体#113、#114、#115可以特异性的用于检测含有CD19 scFv氨基酸序列的样品。同时还通过实验证明了：以CD19 scFv作为靶抗原所产生的抗体#113可以特异性的用于检测含有CD19-CD22双靶点scFv氨基酸序列的样品。进一步地，由于被检测细胞表面CAR阳性率的CD19-CD22双靶点CAR-T细胞中，CD19-CD22双靶点scFv采用CD22 VL-CD19 VL-CD19 VH-CD22 VH的形式，其中：CD19 VL和CD19 VH之间的连接序列也与用于产生抗体的靶抗原CD19 scFv中的连接序列不同，因此以CD19 scFv作为靶抗原所产生的抗体，要确认其用于检测时不受连接序列变化的影响。以CD19 scFv作为靶抗原获得的抗体#113，针对本申请按CD22 VL-CD19 VL-CD19VH-CD22 VH顺序排列CD19-CD22双靶点结构进行CAR表达率检测，能准确有效的检出，说明以CD19 scFv为靶抗原获得的相应抗体与靶抗原的结合位点与靶抗原上的连接序列处无关，而是与CD19 VH或CD19 VL结合。因此，本申请以CD19 scFv作为靶抗原获得的抗体对于采用CD22 VL-CD22 VH-CD19 VL-CD19 VH、CD19 VL-CD19 VH-CD22 VL-CD22 VH、CD19 VL-CD22 VL-CD22 VH-CD19 VH的双靶点结构同样适用。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品选自以下样品：细胞样品、血液样品。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述检测试剂用于以下用途中的一种或多种：
a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR阳性表达率；
b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；
c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品；
所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列。
或，如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19 VL氨基酸序列。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于非实体瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于白血病患者；可选地，所述样品来自于淋巴细胞白血病患者；进一步可选地，所述样品来自于急性淋巴细胞白血病患者；更进一步可选地，所述样品来自于成人急性淋巴细胞白血病患者、儿童急性淋巴细胞白血病患者。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于淋巴瘤患者；可选地，所述样品来自于B细胞淋巴瘤患者；进一步可选地，所述样品来自于非霍奇金淋巴瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于自身免疫性疾病患者；可选地，所述自身免疫性疾病患者为系统性红斑狼疮患者。
CD19单靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法
一种CD19单靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位对CD19单靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD19 CAR+ T细胞比例。
上述检测方法在某些实施例中，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位被Alexa Fluor 647荧光标记；
和/或，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位抗CD19抗体的抗体中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
抗CD22 抗体的抗体或其抗原结合部位
一种抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:34所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:34所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:35所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:35所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:36所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:36所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:37所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别为SEQ ID NO:37所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
在抗体中，常见的划分CDR规则有Kabat、AbM、Chothia、Contact、IMGT，这些规则为本领域技术人员熟知的，当应用执行这些规则的网站时，只要将VH和VL序列输入并选择相应规则，即可得到依据不同规则的CDR序列。本领域技术人员应当理解，本申请的保护范围涵盖了通过采用不同规则分析获得的CDR序列的组合。
一种抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的氨基酸序列为如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
在本申请中，采用了KABAT规则进行CDR的划分。
上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，所述CD22抗体为CD22scFv，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列，可选的，其氨基酸序列为如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位在某些实施例中，所述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被荧光素标记；可选地，所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素或Alexa Fluor® 405荧光素。
分离的核酸分子、载体、细胞
本申请还提供了一种分离的核酸分子，其包含编码上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
上述分离的核酸分子在某些实施例中，编码上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：编码如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:44所示；和编码如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:45所示；
或，编码如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:46所示；和编码如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的核苷酸序列，可选地，其如SEQ ID NO:47所示。
本申请还提供了一种载体，其包含上述分离的核酸分子。
本申请还提供了一种细胞，其包含上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体中的任一种。
抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的应用
本申请还提供了一种上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种在制备检测试剂中的应用。
本申请还提供了一种检测试剂，其包含上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、分离的核酸分子、载体、细胞中的任一种。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，检测试剂用于检测以下样品的一种或多种：
包含如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22VL氨基酸序列的样品。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品选自以下样品：细胞样品、血液样品。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述检测试剂用于以下用途中的一种或多种：
a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR阳性表达率；
b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；
c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品；
所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22 VL氨基酸序列。
在本申请中，通过实验证明了：以CD22 scFv作为靶抗原所产生的抗体可以特异性的用于检测含有CD19-CD22双靶点scFv氨基酸序列的样品，这样的抗体当然可以特异性的用于检测含有CD22 scFv氨基酸序列的样品。进一步地，由于被检测细胞表面CAR阳性率的CD19-CD22双靶点CAR-T细胞中，CD19-CD22双靶点scFv采用CD22 VL-CD19 VL-CD19 VH-CD22 VH的形式，其中：CD22 VL和CD22 VH位于CD19VL和CD19VH的两侧，因此以CD22 scFv作为靶抗原所产生的抗体，要确认其与靶抗原的结合不受连接序列的影响。以CD22 scFv作为靶抗原获得的抗体23E3、24H10，针对本申请按CD22 VL-CD19 VL-CD19 VH-CD22 VH顺序排列CD19-CD22双靶点结构进行CAR表达率检测，能准确有效的检出，说明以CD22 scFv为靶抗原获得的相应抗体与靶抗原的结合位点与靶抗原上的连接序列处无关，而是与CD22 VH或CD22 VL结合。因此，本申请以CD22 scFv作为靶抗原获得的抗体对于采用CD22 VL-CD22VH-CD19 VL-CD19 VH、CD19 VL-CD19 VH-CD22 VL-CD22 VH、CD19 VL-CD22 VL-CD22 VH-CD19 VH的双靶点结构同样适用。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于非实体瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于白血病患者；可选地，所述样品来自于淋巴细胞白血病患者；进一步可选地，所述样品来自于急性淋巴细胞白血病患者；更进一步可选地，所述样品来自于成人急性淋巴细胞白血病患者、儿童急性淋巴细胞白血病患者；
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于淋巴瘤患者；可选地，所述样品来自于B细胞淋巴瘤患者；进一步可选地，所述样品来自于非霍奇金淋巴瘤患者。
上述应用或检测试剂在某些实施例中，所述样品来自于自身免疫性疾病患者；可选地，所述自身免疫性疾病患者为系统性红斑狼疮患者。
CD22单靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法
一种CD22单靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位对CD22单靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD22 CAR+T细胞比例。
上述检测方法在某些实施例中，所述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被Alexa Fluor 647荧光标记。
上述检测方法在某些实施例中，所述抗CD22抗体的抗体中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法
一种CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用上述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，和/或，使用上述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，对CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD19 CAR+T细胞和/或CD22 CAR+T细胞比例。
上述检测方法在某些实施例中，所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位和/或抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被Alexa Fluor 647荧光标记；
上述检测方法在某些实施例中，
所述抗CD19抗体的抗体中，
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
和/或，所述抗CD22抗体的抗体中，
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，可选的，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列，可选的，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别为如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、免疫效应细胞、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniais, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ndedition, Cold Spring Harbor Laboratory Press。
实施例1、作为靶抗原的CD19 scFv和CD22 scFv的分别制备及动物免疫的进行
图1中简要展示了本申请中抗CD19抗体的抗体、抗CD22抗体的抗体的筛选流程。
将编码CD19 scFv氨基酸序列的DNA序列构建入带有His标签的重组表达载体，其中CD19 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:48所示，并使用哺乳动物细胞HEK293进行表达后纯化获得靶抗原CD19 scFv；类似地，使用相同的表达载体和表达系统制备针对另一靶点CD33的scFv作为阴性对照抗原，该阴性对照抗原CD33 scFv的氨基酸序列分子量大小与前述CD19 scFv的氨基酸序列分子量大小接近，且靶抗原CD19 scFv和阴性对照抗原CD33 scFv中使用了相同的连接序列用于连接VL和VH。将上述所得靶抗原CD19 scFv和阴性对照抗原CD33 scFv分别用于1只免疫新西兰兔，每只兔子共进行三次免疫。
将编码CD22 scFv氨基酸序列的DNA序列构建入带有His标签的重组表达载体，其中CD22 scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:49所示，并使用哺乳动物细胞HD CHO-S进行表达后纯化获得靶抗原CD22 scFv；由于在本申请CD19-CD22双靶点CAR-T细胞中，选择将CD22 VL和VH分别设计于CD19 scFv的N端和C端，以CD22 scFv为靶抗原时不希望所获得的抗体是特异性结合于CD22 scFv的连接序列，所以选择的阴性对照抗原有所不同：将编码CD22 scFv氨基酸序列中连接序列的DNA序列构建入相同的表达载体和表达系统，进行表达后纯化获得阴性对照抗原，将上述所得靶抗原CD22 scFv和阴性对照抗原scFv分别用于免疫4只新西兰兔，共进行三次免疫。
实施例2、兔免疫血清的ELISA检测和FACS检测
三次免疫后，采集兔免疫血清进行酶联免疫吸附检测（即ELISA检测）及流式细胞荧光分选检测（即FACS检测），其中：ELISA检测用于在蛋白水平检测待测样品与靶抗原的特异性结合及效价；FACS检测通过测定待测样品与靶抗原CAR-T阳性细胞的结合情况以及待测样品与未转染T细胞（即UTD细胞，作为阴性对照）的结合情况，来判断待测样品是否与细胞表面表达的天然构象的靶抗原有效结合。
一、针对使用以CD19 scFv为靶抗原的情况
1、ELISA检测
试验步骤如下：第三次免疫新西兰兔之后7天，耳缘静脉取兔免疫血清并进行不同比例的稀释后作为待测样品；使用浓度为0.5mg/mL的靶抗原CD19 scFv和浓度为0.5mg/mL的阴性对照抗原分别包被不同的96孔板，封闭过夜；将待测样品加入包被好的96孔板中，将96孔板在37℃恒温箱孵育1小时；用洗涤液洗涤96孔板4次以将未结合的待测样品洗去；加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（购自 Jackson ImmunoResearch Laboratories，货号#111-035-045），37℃恒温箱孵育1小时；用洗涤液洗涤96孔板4次后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色后在370nm下测定吸光度读数并进行数据处理。
试验结果表示，兔免疫血清能够很好地识别靶抗原，且随稀释梯度上升与靶抗原呈特异性结合，效价128000:1。
2、FACS检测
试验步骤：针对CD19 CAR-T细胞悬液和UTD细胞悬液，分别设置检测管、阴性对照管（细胞对照管、二抗对照管）、阳性对照管。具体如下：收集CD19 CAR-T细胞及UTD，分别重悬至细胞密度为1×107个/mL以获得细胞悬液；检测管中将1:400稀释的兔免疫血清分别与CD19 CAR-T细胞或UTD于4℃孵育1h，各管离心后收集细胞沉淀，加入二抗Alexa Fluor®647荧光标记的抗兔F(ab')2抗体（购自Cell Signaling Technology，货号#4414）用于检测兔免疫血清中的兔源抗体，室温避光孵育15分钟；各管离心后收集细胞沉淀，洗涤细胞沉淀、重悬后进行流式检测。另设细胞对照管（仅加入CD19 CAR-T细胞悬液，不加入兔免疫血清或二抗，操作步骤与检测管相同）及二抗对照管（CD19 CAR-T细胞悬液中仅加入二抗，不加入兔免疫血清，操作步骤与检测管相同）作为阴性对照。设置阳性对照管（CD19 CAR-T细胞悬液中加入Alexa Fluor®647荧光标记的抗鼠F(ab')2抗体，用于直接检测CD19 CAR-T细胞表面表达的鼠源CD19 scFv，抗鼠F(ab')2抗体购自Jackson ImmunoResearchLaboratories，货号#115-605-072）。通过验证检测管与阳性对照管所测CAR阳性率的差异以判断待测样品是否适合进行下一步验证，相差≤5％以内则用于进行下一步验证。
试验结果如表1所示，兔免疫血清与CD19 CAR-T细胞表达的天然构象的CD19 scFv分子结合良好，并且不与UTD结合；2个阴性对照管中均无结合检出；检测管与阳性对照管所测的CAR阳性率相差≤5％。以上结果表明该兔免疫血清与靶抗原的结合性良好，可用于进一步开发抗CD19 scFv的单克隆抗体。
表1、兔免疫血清与CAR-T阳性细胞/UTD细胞结合的流式检测结果(CAR阳性百分率)
二、针对使用以CD22 scFv为靶抗原的情况
1、ELISA检测
试验步骤如下：第三次免疫新西兰兔之后7天，耳缘静脉取兔免疫血清并进行不同比例的稀释后作为待测样品；使用浓度为1μg/mL的靶抗原CD22 scFv和浓度为1μg/mL的阴性对照抗原分别包被不同的96孔板，封闭过夜；将待测样品加入包被好的96孔板中，将96孔板在37℃恒温箱孵育1小时；用洗涤液洗涤96孔板4次以将未结合的待测样品洗去；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗（Anti-Rabbit IgG FC Monoclonal Secondary Antibody,GenScript, #A01856），37℃恒温箱孵育1小时；用洗涤液洗涤96孔板4次后加入3,3',5,5'-四甲基联苯胺（TMB）显色后于450nm下测定吸光度读数并进行数据处理。
试验结果所示，在4株兔免疫血清中，2株兔血清（R09403#、R09404#）能够更好地识别靶抗原，且随稀释梯度上升与靶抗原呈特异性结合，效价分别为32000:1和64000:1。
2、FACS检测
试验步骤如下：收集CD19-CD22 CAR-T细胞重悬至细胞密度为1×107个/mL以获得细胞悬液；检测管中将不同稀释度1:200、1:400、1:800和1:1600的2株兔免疫血清R09403#、R09404#分别与CD19-CD22 CAR-T细胞于4℃孵育1h，各管离心后收集细胞沉淀，加入二抗Alexa Fluor®647荧光标记的抗兔F(ab')2抗体（购自Cell Signaling Technology，货号#4414）用于检测兔免疫血清中的兔源抗体，室温避光孵育15分钟；各管离心后收集细胞沉淀，洗涤细胞沉淀、重悬后进行流式检测。另设置阳性对照管（细胞悬液中加入Alexa Fluor®647荧光标记的抗鼠F(ab')2抗体，用于直接检测鼠源CD22 VL或VH，抗鼠F(ab')2抗体购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，货号#115-605-072）。通过验证检测管与阳性对照管所测CAR阳性率的差异以判断待测样品是否适合进行下一步验证，相差≤5%以内则用于进行下一步验证。
试验结果如表2所示，兔免疫血清与CD19-CD22 CAR-T细胞表达的CD22 VL或VH结合良好。通过FACS检测得到：编号R09403#的兔血清在稀释度1:200时，检测所得CAR阳性百分率与阳性对照Anti-mouse F(ab')2-AF647抗体检测的CAR实际阳性率相差≤5%，随着稀释倍数增大，在流式检测过程中逐渐表现出检测结果偏低的情况，表示抗体使用量不足；编号R09404#的兔血清在稀释度1:200、1:400、1:800时，检测所得CAR阳性百分率与阳性对照Anti-mouse F(ab')2-AF647抗体检测的CAR实际阳性率相差≤5%，随着稀释倍数增大到1：1600，在流式检测过程中表现出抗体量不足，检测结果偏低的情况。以上结果表明该兔免疫血清可用于进一步开发抗CD22 scFv的单克隆抗体。
表2、兔免疫血清与CAR-T细胞结合的流式检测结果(CAR阳性百分率)
实施例3、单克隆细胞培养上清液的ELISA检测和FACS检测
一、针对使用CD19 scFv为靶抗原的情况
确定兔免疫血清与CD19 CAR-T细胞有结合后，将对应动物安乐死留取全血细胞，按照常规方法分离PBMC并分选单个B细胞，再按照常规方法进行单克隆细胞培养扩增。采集单克隆细胞培养上清液进行ELISA检测及FACS检测，这些检测的作用与实施例2中相应实验的作用相同。
1、ELISA检测
试验步骤如下：收集单克隆细胞培养上清液替代兔免疫血清，其他步骤与实施例2第一部分中针对使用CD19 scFv为靶抗原中对应的ELISA检测的步骤相同。
试验结果如表3所示，单克隆细胞培养所得15株上清液均能较好识别靶抗原CD19scFv，且与阴性对照抗原CD33 scFv的结合很低，均为阳性克隆。
表3、各单克隆细胞培养上清液的ELISA检测结果
2、FACS筛选
试验步骤如下：收集阳性克隆上清液替代兔免疫血清，其他步骤与实施例2第一部分中针对使用CD19 scFv为靶抗原部分中对应的FACS检测的步骤相同，且采用相同的方法设置阳性对照管。
试验结果如表4所示，大部分阳性克隆上清液与CD19 CAR-T细胞表达的天然构象的CD19 scFv分子结合良好，并且不与UTD结合。剔除流式检测中整体结合较差的3E10、4F6克隆，从其余3个克隆1C11、2F2、4E11中选取亲和性最好的亚克隆1C11-25A4、2F2-25B8及4E11-25C9，进行下一步筛选。
表4、各阳性克隆上清液与CAR-T/UTD细胞结合的流式检测结果(CAR阳性百分率)
二、针对使用CD22 scFv为靶抗原的情况
确定编号R09403#、R09404#的2株兔免疫血清与CD19-CD22 CAR-T细胞中抗CD22VL或VH结合良好后，将对应动物安乐死留取全血细胞，按照常规方法分离PBMC后将从2株兔免疫血清中获得的PBMC混合并分选单个B细胞，再按照常规方法进行克隆培养扩增。采集单克隆细胞培养上清液进行ELISA检测及FACS检测，这些检测的作用与实施例2中相应实验的作用相同。
1、ELISA检测
试验步骤如下：收集单克隆细胞培养上清液替代兔免疫血清，使用浓度分别为0.5μg/mL的CD22 scFv靶抗原、0.5μg/mL阴性对照抗原分别包被96孔板，其余步骤与实施例2第二部分中针对使用CD22 scFv为靶抗原中对应的ELISA检测的步骤相同。
试验结果如表5所示，单克隆细胞培养所得45株上清液均能较好识别靶抗原，且与对照抗原的结合很低，均为阳性克隆。
表5、各单克隆细胞培养上清液的ELISA检测结果
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2、FACS检测
试验步骤如下：收集CD19-CD22 CAR-T细胞和CD19 CAR-T细胞，其中以CD19 CAR-T细胞为阴性对照细胞，收集单克隆细胞培养上清液替代兔免疫血清，其他步骤与实施例2第二部分针对使用CD22 scFv为靶抗原部分中对应的FACS检测的步骤相同，且采用相同的方法设置阳性对照管。
阳性单克隆细胞培养上清液与CD19-CD22 CAR-T细胞、与CD19 CAR-T细胞的结合情况均如表6所示，45株阳性单克隆细胞培养上清液中的2株（23E3、24H10）与CD19-CD22CAR-T阳性细胞上的抗CD22 VL或VH结合良好并与CD19 CAR-T阳性细胞上的CD19 scFv分子不结合，且所测得的CAR阳性百分率与Alexa Fluor®647荧光标记的抗鼠F(ab')2抗体检测的CAR阳性百分率（31.6%）相差≤5％。
表6、各克隆培养上清液与CD22-CD19 CAR-T/ CD19 CAR-T细胞结合的流式检测结果(阳性百分率)
进一步地，还针对挑选出来的2株单克隆细胞培养上清液（23E3、24H10）进行了特异性检测，具体步骤如下：收集EGFR CAR-T阳性细胞和UTD细胞，并收集筛选得到的2株单克隆细胞培养上清液分别与EGFR CAR-T阳性细胞、UTD细胞于4℃孵育1h，其他步骤与实施例2第二部分针对使用CD22 scFv为靶抗原部分中对应的FACS检测的步骤相同。
单克隆细胞培养上清液与EGFR CAR-T阳性细胞、UTD细胞的结合情况如表7所示，2株单克隆上清与EGFR CAR-T阳性细胞、未转染的T细胞均不结合，表明筛选出的2株克隆上清的特异性良好，可用于进一步开发。
表7、2株单克隆细胞培养上清液与EGFR CAR-T/ UTD细胞结合的流式检测结果(CAR阳性百分率)
实施例4、兔单克隆抗体的FACS验证
一、针对使用CD19 scFv为靶抗原的情况
收集实施例3中筛选到的阳性克隆细胞（1C11-25A4、2F2-25B8、4E11-25C9）提取总RNA，RT-PCR扩增重链、轻链可变区核苷酸序列并进行测序获得重链、轻链可变区的氨基酸序列，再将获得的重链、轻链可变区核苷酸序列和兔IgG 重链、轻链恒定区核苷酸序列（兔IgG 重链恒定区核苷酸序列来源于ncbi GenBank ACCESSION: L29172.1，具体如SEQ IDNO:61所示，其氨基酸序列来源于ncbi PROTEIN_ID: AAB59265.1，具体如SEQ ID NO:60所示；兔IgG轻链恒定区核苷酸序列来源于ncbi GenBank ACCESSION: K01358.1，具体如SEQID NO:63所示，其氨基酸序列来源于PROTEIN_ID: AAB59259.1，具体如SEQ ID NO:62所示）重组到表达载体上，再使用哺乳动物细胞表达重组兔单克隆全抗，所得重组兔单克隆全抗命名为#113、#114、#115，#113、#114、#115分别与1C11-25A4、2F2-25B8、4E11-25C9相对应，经过前述测序1C11-25A4和#113单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:28所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示）、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:29所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQID NO:5所示），2F2-25B8和#114单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:30所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8所示）、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:31所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:65、SEQID NO:10所示），4E11-25C9和#115单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:32所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13所示）、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:33所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:15所示）。检测所得3株纯化兔单克隆抗体与CD19 CAR-T阳性细胞表面表达的CD19 scFv分子的结合能力，以支持其应用于含有CD19 CAR的阳性细胞率的流式检测。
试验步骤：仅用纯化兔单抗替代兔免疫血清，其余步骤与实施例2第一部分中针对使用CD19 scFv为靶抗原部分中对应的FACS检测的步骤相同。且采用相同的方法设置阴性对照管（细胞对照管、二抗对照管）和阳性对照管。
试验结果如表8所示，3株兔单克隆抗体均与CD19 CAR-T细胞表达的天然构象的CD19 scFv分子结合良好，而与UTD细胞不结合；同时各阴性对照管中也均无结合检出；各检测管与阳性对照管所测的CAR阳性率相差≤5%。表明各株单克隆抗体与靶抗原的结合良好，可满足非临床及临床检测的需要。
表8、兔单克隆抗体与CAR-T阳性细胞/UTD细胞结合的流式检测结果(CAR阳性百分率)
本发明筛选出的单克隆抗体为特异识别如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv的抗体，可特异性结合含有该CD19 scFv胞外抗原识别结构域的CAR-T细胞，不与其它不相干抗体以及膜蛋白有非特异结合（排除了与实施例2所用对照抗原的交叉结合）。本发明所获得的特异性抗体的具体应用可以包括但不限于以下3个方面：a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞表达率；b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体(Anti-drug antibody，ADA)时，作为标准参比品；在上述应用中，所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19 VL氨基酸序列。
二、针对使用CD22 scFv为靶抗原的情况
收集实施例3中筛选到的阳性克隆（23E3、24H10）提取总RNA，RT-PCR扩增重链、轻链可变区核苷酸序列并进行测序获得重链、轻链可变区的氨基酸序列，再将获得的重链、轻链可变区核苷酸序列和兔IgG 重链、轻链恒定区核苷酸序列（兔IgG 重链恒定区核苷酸序列来源于ncbi ACCESSION: L29172.1，具体如SEQ ID NO:61所示，其氨基酸来源于PROTEIN_ID: AAB59265.1，具体如SEQ ID N:60所示；兔IgG轻链恒定区核苷酸序列来源于ncbi ACCESSION: K01358.1，具体如SEQ ID NO:63所示，其核苷酸来源于PROTEIN_ID:AAB59259.1，具体如SEQ ID NO:62所示）重组到表达载体上，再使用哺乳动物细胞表达重组兔单克隆全抗，经过前述测序23E3-1单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:34所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示）、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21所示），24H10-1单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:36所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24所示）、轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示（其CDR1、CDR2、CDR3分别如SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27所示）。检测所得2株纯化兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T阳性细胞表面表达的抗CD22 VL或VH的结合能力，以支持其应用于含有CD22 CAR的阳性细胞率的流式检测。
试验步骤：仅用纯化兔单抗替代兔免疫血清，检测管中兔单克隆抗体与CD19-CD22CAR-T阳性细胞的比例如表9所示，其余步骤与实施例2第二部分中针对使用CD22 scFv为靶抗原部分中对应的FACS检测的步骤相同。在表9的检测中，每次测试中添加1×106细胞。
试验结果如表9所示，2株兔单克隆抗体均与CD19-CD22 CAR-T细胞表达的天然构象的抗CD22 VL和/或VH结合良好。
表9、兔单克隆抗体与CD22-CD19 CAR-T阳性细胞结合的流式检测结果(阳性百分率)
本发明筛选出的单克隆抗体为特异识别如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv、或如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv、或同时含有如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH和如SEQID NO:52所示的CD22 VL的氨基酸序列的特异性抗体，其不与其它抗体以及膜蛋白有非特异结合。本发明所获得的特异性抗体的具体应用可以包括但不限于以下3个方面：a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞表达率；b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品；在上述应用中，所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22 VL氨基酸序列。
实施例5、荧光素标记兔单克隆抗体的FACS检测
一、针对使用CD19 scFv为靶抗原的情况
将兔单克隆抗体1C11-25A4（#113单抗）采用现有方法进行荧光素标记，检测所得经过荧光素标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T阳性细胞表面的CD19 scFv分子的结合能力，以确认经过荧光素标记的兔单克隆抗体是否可以不影响其在针对CD19 CAR阳性率检测方面的应用。
试验步骤：收集CD19-CD22 CAR-T细胞，重悬至细胞密度为1×107个/mL；实验分为2组，1组为使用Alexa Fluor®647荧光标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T细胞于4℃孵育1h（将该组简称为荧光素-单抗组），另1组为使用未经过荧光素标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T细胞于4℃孵育1h（将该组简称为无荧光素-单抗组）。各组完成孵育后离心收集细胞沉淀，洗涤重悬后进行流式检测。将荧光素-单抗组与无荧光素-单抗组的FACS检测结果进行对比，如果两组之间差异≤5%，认为荧光素标记不影响兔单克隆抗体发挥作用，即经过荧光素标记的兔单克隆抗体可用于针对CD19 CAR的阳性率检测。
试验结果如表10所示，使用Alexa Fluor® 647荧光素标记的1C11-25A4兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T细胞表面的CD19 scFv分子结合良好，荧光素-单抗组与无荧光素-单抗组的FACS检测所得CAR阳性率相差≤5％，表明该荧光素标记的兔单克隆抗体均可用于针对CD19 CAR的阳性率检测。表10中，“——”表示未做检测。
表10、荧光素标记兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T结合的流式检测结果
二、针对使用CD22 scFv为靶抗原的情况
将实施例4中确认的2株兔单克隆抗体24H10-1、23E3-1采用现有方法进行荧光素标记，检测所得经过荧光素标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T阳性细胞表面的抗CD22部分的结合能力，以确认经过荧光素标记的兔单克隆抗体是否可以不影响其在针对CD22 CAR阳性率检测方面的应用。
试验步骤：收集CD19-CD22 CAR-T细胞，重悬至细胞密度为1×107个/mL；实验分为3组，1组为使用Alexa Fluor® 405作为荧光素标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T阳性细胞于4℃孵育1h（将该组称为Alexa Fluor 405-单抗组）、第2组为使用Alexa Fluor®647作为荧光素标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T阳性细胞于4℃孵育1h（将该组称为Alexa Fluor 647-单抗组）、第3组为使用未经过荧光素标记的兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T阳性细胞于4℃孵育1h（将该组简称为无荧光素-单抗组），每组中又分为不同投料比和使用不同株单克隆抗体的亚组，各组完成孵育后离心收集细胞沉淀，洗涤重悬后流式上机检测。将使用了荧光素标记兔单克隆抗体的组与使用了未经荧光素标记兔单克隆抗体的组进行对比，如果两者之间FACS检测的CAR阳性率相差≤5％，认为荧光素标记不影响兔单克隆抗体发挥作用，即经过荧光素标记的兔单克隆抗体可用于针对CD22 CAR的阳性率检测。
试验结果如表11所示，在使用克隆号为24H10-1作为抗体的各个亚组中，使用Alexa Fluor 647荧光素标记、按照投料比（投料比指裸抗与荧光素的投料比）1:0.4生产的兔单克隆抗体所测结果与使用未经荧光素标记的24H10-1的检测结果具有最好的一致性；在使用克隆号为23E3-1作为抗体的各个亚组中，使用Alexa Fluor 647荧光素标记、按照投料比1:0.4生产的兔单克隆抗体所测结果与使用未经荧光素标记的23E3-1的检测结果具有最好的一致性；以上结果表明Alexa Fluor 647荧光素标记、按照投料比1:0.4生产的2株兔单克隆抗体（24H10-1和23E3-1）均可用于针对CD22 CAR的阳性率检测。
表11、荧光素标记兔单克隆抗体与CD19-CD22 CAR-T结合的流式检测结果
实施例6、抗CD19 scFv抗体、抗CD22 scFv抗体用于检测CD19-CD22双靶点CAR-T阳性率
使用实施例5中制备的经过荧光素标记的抗CD19 scFv抗体和抗CD22 scFv抗体，针对CD19 CAR阳性率和针对CD22 CAR阳性率进行CD19-CD22双靶点CAR-T细胞和UTD细胞的CAR表达阳性率检测，以确认这两株经过荧光素标记的抗体是否可专属的评价CD 19 CAR阳性率和CD22 CAR阳性率。
试验步骤：收集CD19-CD22 CAR-T阳性细胞和UTD细胞，分别重悬至细胞密度为1×107个/mL；设置检测管和阴性对照管，其中：检测管1使用Alexa Fluor ®647-抗CD19 scFv抗体（1C11-25A4，即#113）和FITC-CD3抗体对细胞进行标记，检测管2使用Alexa Fluor®647-抗CD22 scFv抗体（23E3-1）和FITC-CD3抗体对细胞进行标记，阴性对照管中加入细胞和FITC荧光标记的IgG1作为阴性对照；各管在2~8℃避光孵育60分钟，然后经PBS洗涤、重悬后再分别加入7-AAD（用于区分死细胞和活细胞的染料），避光孵育10分钟后立即通过流式细胞仪检测CD3+CAR+（抗CD19）T细胞和CD3+CAR+（抗CD22）T细胞比例，CD3是区分是否为T细胞的标志物。
试验结果如表12所示，抗CD19 scFv抗体、抗CD22 scFv抗体均与CD22-CD19 CAR-T细胞上的CD19 scFv分子、CD22 scFv VL/VH分子结合良好，通过检测CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面的CD19 scFv和CD19 scFv VL/VH获得的CAR表达阳性率结果相差≤5％，且抗CD19 scFv抗体和抗CD22 scFv抗体均不与未经转染的T细胞相结合，表明该检测方法可用于专属的进行CAR（抗CD19）和/或CAR（抗CD22）阳性率检测。
表12 抗CD19 scFv抗体、抗CD22 scFv抗体与CD22-CD19 CAR-T结合的流式检测结果
序列描述
SEQ ID NO:1，#113抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR1氨基酸序列；
GFSLSNYA
SEQ ID NO:2，#113抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR2氨基酸序列；
ISNSGSA
SEQ ID NO:3，#113抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR3氨基酸序列；
ARPRSYGDDS DVYSYYGMDL
SEQ ID NO:4，#113抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列；
QSISSY
SEQ ID NO:5，#113抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列；
QCTRGSSSSS TYGNA
SEQ ID NO:6，#114抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR1氨基酸序列；
GFSLNTYT
SEQ ID NO:7，#114抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR2氨基酸序列；
ITSSGGT
SEQ ID NO:8，#114抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR3氨基酸序列；
ARGGYVIYGY DMTRLDL
SEQ ID NO:9，#114抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列；
EDIGTN
SEQ ID NO:10，#114抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列；
QQGYSCIDVD NV
SEQ ID NO:11，#115抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR1氨基酸序列；
GFSLSSYT
SEQ ID NO:12，#115抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR2氨基酸序列；
ISYDGNT
SEQ ID NO:13，#115抗CD19 scFv的抗体重链可变区CDR3氨基酸序列；
ARLWAYDDGS SYGVNL
SEQ ID NO:14，#115抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列；
QSTGSY
SEQ ID NO:15，#115抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列；
QCTYDSSSSD FA
SEQ ID NO:16，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区CDR1氨基酸序列；
NYPMI
SEQ ID NO:17，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区CDR2氨基酸序列；
YISSSGNTWY ATWAKG
SEQ ID NO:18，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区CDR3氨基酸序列；
GGASNL
SEQ ID NO:19，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列；
QASQSIGSSL A
SEQ ID NO:20，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列；
FTSTLES
SEQ ID NO:21，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列；
QTYYGIASGS FLYG
SEQ ID NO:22，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区CDR1氨基酸序列；
SNAMI
SEQ ID NO:23，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区CDR2氨基酸序列；
YISANGNPFY PNWAKG
SEQ ID NO:24，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区CDR3氨基酸序列；
GGASNL
SEQ ID NO:25，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区CDR1氨基酸序列；
QASQSIGSSL A
SEQ ID NO:26，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列；
YASTLAS
SEQ ID NO:27，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区CDR3氨基酸序列；
QTYYGISGSS FLYG
SEQ ID NO:28，#113抗CD19 scFv的抗体重链可变区氨基酸序列；
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYAMSWVRQAPGKGLEYIGIISNSGSAYYASWAKGRFTISKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARPRSYGDDSDVYSYYGMDLWGPGTLVTVSS
SEQ ID NO:29，#113抗CD19 scFv的抗体轻链可变区氨基酸序列；
DVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSISSYLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLESGV PSRFKGSGAGTEYTLTISDLECADAATYYCQCTRGSSSSSTYGNAFGGGTEVVVK
SEQ ID NO:30，#114抗CD19 scFv的抗体重链可变区氨基酸序列；
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLNTYTMTWVRQAPGKGLEWIGIITSSGGTYYATWAKGRFTISKSSSTTVDLKMTRLTTEDTATYFCARGGYVIYGYDMTRLDLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:31，#114抗CD19 scFv的抗体轻链可变区氨基酸序列；
AYDMTQTPASVEVVVGGTVTIKCQASEDIGTNLAWYQQKPGQPPKLLIYAAARLASGVSSRFKGSRSETEFTLAISGVQCDDAATYYCQQGYSCIDVDN VFGGGTEVVVK
SEQ ID NO:32，#115抗CD19 scFv的抗体重链可变区氨基酸序列；
QSVEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSSYTMSWVRQAPGKGLEYIGIISYDGNTYYASWAKGRFTVSKTSTTVDLKITSPTTEDTATYFCARLWAYDDGSSYGVNLWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO:33，#115抗CD19 scFv的抗体轻链可变区氨基酸序列；
DVVMTQTPASVEAAVGGTVTIKCQASQSTGSYLAWYQQKPGQPPKLLIYRASTLESGVPSRFKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQCTYDSSSSDFAFGGGT
SEQ ID NO:34，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区氨基酸序列；
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGFSLSNYPMIWVRQAPGEGLEWIGYISSSGNTWYATWAKGRFTISKSSTTVDLKMTSLTSEDTATYFCARGGASNLWGPGTLVTVSS
SEQ ID NO:35，#23E3-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区氨基酸序列；
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADVVMTQTPSSVSAAVGGTVTIQCQASQSIGSSLAWYQQKPGQRPKLLVYFTSTLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQTYYGIASGSFLYGFGGGTEVVVK
SEQ ID NO:36，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区氨基酸序列；
METGLRWLLLVAVLKGVQCQSLEESGGRLVTPGTPLTLTCTVSGIDLSSNAMIWVRQAPGEGLQWIGYISANGNPFYPNWAKGRFTISKTSTTVDLKMTSLTASDTAIYFCARGGASNLWGPGTLVTVSS
SEQ ID NO:37，#24H10-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区氨基酸序列；
MDTRAPTQLLGLLLLWLPGARCADIVMTQTPSSVEAAVGGTVTIKCQASQSIGSSLAWYQQKPGQRPKLLIYYASTLASGVPSRLKGSGSGTEFTLTISDLECADAATYYCQTYYGISGSSFLYGFGGGTEVVVE
SEQ ID NO:38，编码#113抗CD19 scFv的抗体重链可变区的核苷酸序列；
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATGCAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTAGTAATAGTGGTAGTGCATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGGTTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGACCACGGTCATATGGTGATGATAGTGATGTTTATTCATACTACGGCATGGACCTCTGGGGCCCAGGGACCCTCGTCACCGTCTCTTCA
SEQ ID NO:39，编码#113抗CD19 scFv的抗体轻链可变区的核苷酸序列；
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTAGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGAGCTGGGACAGAGTACACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTCGTGGTAGTAGTAGTAGTAGTACTTATGGAAATGCTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA
SEQ ID NO:40，编码#114抗CD19 scFv的抗体重链可变区的核苷酸序列；
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAATACCTATACAATGACCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATGGATCGGAATCATTACTAGTAGTGGTGGCACATACTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAATCCTCGTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGGCTGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGTGGTTATGTTATTTATGGTTATGATATGACTCGGTTGGATCTCTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:41，编码#114抗CD19 scFv的抗体轻链可变区的核苷酸序列；
GCCTATGATATGACCCAGACTCCAGCCTCTGTGGAGGTAGTTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTGAGGACATTGGCACGAATTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGCTGCAGCCAGACTGGCATCTGGGGTCTCATCGCGGTTCAAAGGCAGTAGATCTGAGACAGAGTTCACTCTCGCCATCAGCGGCGTGCAGTGTGACGATGCTGCCACTTACTACTGTCAACAGGGTTATAGTTGTATTGATGTTGATAATGTTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA
SEQ ID NO:42，编码#115抗CD19 scFv的抗体重链可变区的核苷酸序列；
CAGTCGGTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAGCTATACAATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAATACATCGGAATCATTAGTTATGATGGTAACACATACTACGCGAGCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCGTCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAGATCACCAGTCCGACAACCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGACTTTGGGCATATGATGATGGTAGTAGTTATGGCGTTAATTTGTGGGGCCAAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:43，编码#115抗CD19 scFv的抗体轻链可变区的核苷酸序列；
GATGTTGTGATGACCCAGACTCCAGCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCACTGGTAGCTACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTACAGGGCATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAATGCACTTATGATAGTAGTAGTAGTGATTTTGCTTTCGGCGGAGGGACC
SEQ ID NO:44，编码#23E3-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区的核苷酸序列；
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCGCTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGATTCTCCCTCAGTAACTATCCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGGAATGGATCGGATATATTAGTAGCAGTGGTAACACATGGTACGCGACCTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAGTCCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAAGCGAGGACACGGCCACCTATTTCTGTGCCAGAGGGGGAGCTAG TAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:45，编码#23E3-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区的核苷酸序列；
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTTCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCCGACGTCGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCCAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCCCAAGCTCCTAGTCTACTTTACATCCACTCTGGAATCTGGGGTCCCATCGCGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAACCTATTATGGTATTGCTAGTGGTAGTTTCCTTTATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCAAA
SEQ ID NO:46，编码#24H10-1抗CD22 scFv的抗体重链可变区的核苷酸序列；
ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTCAGTCACTGGAGGAGTCCGGGGGTCGCCTGGTCACGCCTGGGACACCCCTGACACTCACCTGCACAGTCTCTGGAATCGACCTCAGTAGCAATGCAATGATCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGGAGGGGCTGCAATGGATCGGATATATTAGTGCTAATGGTAATCCATTCTATCCGAACTGGGCGAAAGGCCGATTCACCATCTCCAAAACCTCGACCACGGTGGATCTGAAAATGACCAGTCTGACAGCTTCAGACACGGCCATTTATTTCTGTGCCAGAGGGGGAGCTAG TAACTTGTGGGGCCCAGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
SEQ ID NO:47，编码#24H10-1抗CD22 scFv的抗体轻链可变区的核苷酸序列；
ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTACTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCAGATGTGCTGACATTGTGATGACCCAGACTCCATCCTCCGTGGAGGCAGCTGTGGGAGGCACAGTCACCATCAAGTGCCAGGCCAGTCAGAGCATTGGTAGTAGCTTGGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGGGCAGCGTCC CAAGCTCCTGATCTATTATGCGTCCACTCTGGCATCTGGGGTCCCATCGCGGTTGAAAGGCAGTGGATCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCGACCTGGAGTGTGCCGATGCTGCCACTTACTACTGTCAAACCTATTATGGTATTAGTGGTAGTAGTTTCCTTTATGGTTTCGGCGGAGGGACCGAGGTGGTGGTCGAA
SEQ ID NO:48，靶抗原CD19 scFv氨基酸序列；
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRGGGGSGGGGSGGGGSQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:49，靶抗原CD22 scFv氨基酸序列；
DIELTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSSVKAEDLAVYYCQQSYSYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSGGGGSQVKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYDFSISWMNWVRQRPGQGLEWIGRIYPGDGDSNYNGKFEGKATLTADKSSSTAYMQLSGLTSVDSAVYFCARTTTMIALYAMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:50，CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
DIELTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSSVKAEDLAVYYCQQSYSYPFTFGSGTKLEIKRGGGGSDIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKRGSTSGSGKPGSGEGSTKGQVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTLTVSSGGGGSQVKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYDFSISWMNWVRQRPGQGLEWIGRIYPGDGDSNYNGKFEGKATLTADKSSSTAYMQLSGLTSVDSAVYFCARTTTMIALYAMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:51，CD22 VH氨基酸序列；
QVKLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYDFSISWMNWVRQRPGQGLEWIGRIYPGDGDSNYNGKFEGKATLTADKSSSTAYMQLSGLTSVDSAVYFCARTTTMIALYAMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO:52，CD22 VL氨基酸序列；
DIELTQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLIYWASTRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTVSSVKAEDLAVYYCQQSYSYPFTFGSGTKLEIKR
SEQ ID NO:53，CD19 VH 氨基酸序列；
QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADKSSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:54, CD19 VL氨基酸序列；
DIVLTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR
SEQ ID NO:55：引导肽（即信号肽）的氨基酸序列；
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO:56：铰链区的氨基酸序列；
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD
SEQ ID NO:57：跨膜区的氨基酸序列；
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO:58：共刺激信号传导区的氨基酸序列；
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO:59：胞内信号传导区的氨基酸序列；
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO:60：CH区氨基酸序列；
GQPKAPSVFPLAPCCGDTPSSTVTLGCLVKGYLPEPVTVTWNSGTLTNGVRTFPSVRQSSGLYSLSSVVSVTSSSQPVTCNVAHPATNTKVDKTVAPSTCSKPTCPPPELLGGPSVFIFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSEDDPEVQFTWYINNEQVRTARPPLREQQFNSTIRVVSTLPIAHEDWLRGKEFKCKVHNKALPAPIEKTISKARGQPLEPKVYTMGPPREELSSRSVSLTCMINGFYPSDISVEWEKNGKAEDNYKTTPAVLDSDGSYFLYSKLSVPTSEWQRGDVFTCSVMHEALHNHYTQKSISRSPGK
SEQ ID NO:61：编码CH区氨基酸序列的核苷酸序列；
GGGCAACCTAAGGCTCCGTCAGTCTTCCCACTGGCCCCCTGCTGCGGGGACACACCCAGCTCCACGGTGACCTTGGGCTGCTTGGTCAAAGGCTACCTCCCCGAGCCAGTGACCGTGACTTGGAACTCGGGCACCCTCACCAATGGGGTACGCACCTTCCCGTCCGTCCGGCAGTCCTCAGGCCTCTACTCGCTGAGCAGCGTGGTGAGCGTGACCTCAAGCAGCCAGCCCGTCACCTGCAACGTGGCCCACCCAGCCACCAACACCAAAGTGGACAAGACCGTTGCGCCCTCGACATGCAGCAAGCCCACGTGCCCACCCCCTGAACTCTTGGGGGGACCGTCTGTTTTCATCTTTCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCACGCACCCCCGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCGAGGATGACCCCGAGGTGCAGTTCACATGGTACATAAACAACGAGCAGGTGCGCACCGCCCGGCCGCCGCTACGGGAGCAGCAGTTCAACAGCACGATCCGTGTGGTCAGCACCCTCCCCATCGCGCACGAGGACTGGCTGAGGGGCAAGGAGTTCAAGTGCAAAGTCCACAACAAGGCACTCCCGGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAGAGGGCAGCCCCTGGAGCCGAAGGTCTACACCATGGGCCCTCCCCGGGAGGAGCTGAGCAGCAGGTCGGTCAGCCTGACCTGCATGATCAACGGCTTCTACCCTTCCGACATCTCGGTGGAGTGGGAGAAGAACGGGAAGGCAGAGGACAACTACAAGACCACGCCGGCCGTGCTGGACAGCGACGGCTCCTACTTCCTCTACAGCAAGCTCTCAGTGCCCACGAGTGAATGGCAACGGGGCGACGTCTTCACCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCTTGCACAACCACTACACGCAGAAGTCCATCTCCCGCTCTCCGGGTAAA
SEQ ID NO:62：CL区氨基酸序列；
GDPVAPTVLIFPPAADQVATGTVTIVCVANKYFPDVTVTWEVDGTTQTTGIENSKTPQNSADCTYNLSSTLTLTSTQYNSHKEYTCKVTQGTTSVVQSFNRGDC
SEQ ID NO:63：编码CL区氨基酸序列的核苷酸序列；
GGTGATCCAGTTGCACCTACTGTCCTCATCTTCCCACCAGCTGCTGATCAGGTGGCAACTGGAACAGTCACCATCGTGTGTGTGGCGAATAAATACTTTCCCGATGTCACCGTCACCTGGGAGGTGGATGGCACCACCCAAACAACTGGCATCGAGAACAGTAAAACACCGCAGAATTCTGCAGATTGTACCTACAACCTCAGCAGCACTCTGACACTGACCAGCACACAGTACAACAGCCACAAAGAGTACACCTGCAAGGTGACCCAGGGCACGACCTCAGTCGTCCAGAGCTTCAATAGGGGTGACTG
SEQ ID NO:64，#113抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列；
RAS
SEQ ID NO:65，#114抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列；
AAR
SEQ ID NO:66，#115抗CD19 scFv的抗体轻链可变区CDR2氨基酸序列；
RAS。
Claims (46)
1.一种抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:28所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:29所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:30所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:31所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:32所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:33所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
2.一种抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:9、SEQID NO:65、SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:30所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:32所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求3所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述CD19抗体为CD19 scFv，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO:48所示的氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位被荧光素标记。
6. 根据权利要求5所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素或Alexa Fluor® 405荧光素。
7.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求1-6中任一项所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
8.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其中编码根据权利要求1-6中任一项所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：
编码如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码如SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的核苷酸序列；
或，编码如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码如SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的核苷酸序列；
或，编码如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的分离的核酸分子，其中：
编码如SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:38所示，编码如SEQID NO:29所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:39所示；
或，编码如SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:40所示，编码如SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:41所示；
或，编码如SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:42所示，编码如SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:43所示。
10.一种载体，其包含根据权利要求7-9中任一项所述的分离的核酸分子。
11.一种细胞，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、权利要求7-9中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求10所述的载体中的任一种。
12.一种根据权利要求1-6中任一项所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、权利要求7-9中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的细胞中的任一种在制备检测试剂中的应用。
13.一种检测试剂，其包含根据权利要求1-6中任一项所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位、权利要求7-9中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求10所述的载体、权利要求11所述的细胞中的任一种。
14.根据权利要求12所述的应用或权利要求13所述的检测试剂，其用于检测以下样品的一种或多种：
包含如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19 VL氨基酸序列的样品。
15.根据权利要求14所述的应用或检测试剂，其中所述样品选自以下样品：细胞样品、血液样品。
16.根据权利要求12所述的应用或权利要求13所述的检测试剂，其中所述检测试剂用于以下用途中的一种或多种：
a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR阳性表达率；
b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；
c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品。
17.根据权利要求16所述的应用或检测试剂，其中所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:48所示的CD19 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:53所示的CD19 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:54所示的CD19 VL氨基酸序列。
18.一种抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:34所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:35所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:36所示抗体重链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:37所示抗体轻链可变区中的CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列。
19.一种抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其氨基酸序列包括重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。
20. 根据权利要求18或19所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:34所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:35所示的氨基酸序列；
或，所述重链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:36所示的氨基酸序列，所述轻链可变区的氨基酸序列包含如SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。
21. 根据权利要求20所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述CD22抗体为CD22 scFv，其氨基酸序列包含如SEQ ID NO:49所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求21所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位被荧光素标记。
23. 根据权利要求22所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，其中所述荧光素为Alexa Fluor® 647荧光素或Alexa Fluor® 405荧光素。
24.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求18-23中任一项所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列。
25.根据权利要求7所述的分离的核酸分子，其中编码根据权利要求18-23中任一项所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位的核苷酸序列包含：
编码如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码如SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的核苷酸序列；
或，编码如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的核苷酸序列和编码如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的核苷酸序列。
26.根据权利要求25所述的分离的核酸分子，其中：
编码如SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:44所示，编码如SEQID NO:35所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:45所示；
或，编码如SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:46所示，编码如SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:47所示。
27.一种载体，其包含根据权利要求24-26中任一项所述的分离的核酸分子。
28.一种细胞，其包含根据权利要求18-23中任一项所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、权利要求24-26中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求27所述的载体中的任一种。
29.一种根据权利要求18-23中任一项所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、权利要求24-26中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求27所述的载体、权利要求28所述的细胞中的任一种在制备检测试剂中的应用。
30.一种检测试剂，其包含根据权利要求18-23中任一项所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位、权利要求24-26中任一项所述的分离的核酸分子、权利要求27所述的载体、权利要求28所述的细胞中的任一种。
31.根据权利要求29所述的应用或权利要求30所述的检测试剂，其中所述检测试剂用于检测以下样品的一种或多种：
包含如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列的样品；
包含如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22 VL氨基酸序列的样品。
32.根据权利要求31所述的应用检测试剂，其中所述样品选自以下样品：细胞样品、血液样品。
33.根据权利要求29所述的应用或权利要求30所述的检测试剂，其中所述检测试剂用于以下用途中的一种或多种：
a、用于检测CAR-T细胞中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR阳性表达率；
b、用于检测患者回输CAR-T细胞后，患者血液中表达目标胞外抗原识别结构域的CAR-T阳性细胞浓度；
c、患者回输CAR-T细胞后，在检测患者血液中产生的针对目标胞外抗原识别结构域的抗药抗体时，作为标准参比品。
34.根据权利要求33所述的应用或检测试剂，其中所述目标胞外抗原识别结构域包含：
如SEQ ID NO:49所示的CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:50所示的CD19-CD22 scFv氨基酸序列；
或，如SEQ ID NO:51所示的CD22 VH氨基酸序列和如SEQ ID NO:52所示的CD22 VL氨基酸序列。
35.根据权利要求15或32所述的应用或检测试剂，其中所述样品来自于非实体瘤患者。
36.根据权利要求35所述的应用或检测试剂，其中所述非实体瘤患者包括白血病患者。
37.根据权利要求36所述的应用或检测试剂，其中所述白血病患者包括淋巴细胞白血病患者。
38.根据权利要求37所述的应用或检测试剂，其中所述淋巴细胞白血病患者包括急性淋巴细胞白血病患者。
39.根据权利要求38所述的应用或检测试剂，其中所述急性淋巴细胞白血病患者包括成人急性淋巴细胞白血病患者、儿童急性淋巴细胞白血病患者。
40.根据权利要求35所述的应用或检测试剂，其中所述非实体瘤患者包括淋巴瘤患者。
41.根据权利要求40所述的应用或检测试剂，其中所述淋巴瘤患者包括B细胞淋巴瘤患者。
42.根据权利要求41所述的应用或检测试剂，其中所述B细胞淋巴瘤患者包括非霍奇金淋巴瘤患者。
43.根据权利要求15或32所述的应用或检测试剂，其中所述样品来自于自身免疫性疾病患者。
44.根据权利要求43所述的应用或检测试剂，其中所述自身免疫性疾病患者为系统性红斑狼疮患者。
45.一种CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面CAR阳性率的检测方法，包括以下步骤：
使用Alexa Fluor 647荧光标记的根据权利要求1-6中任一项所述的抗CD19抗体的抗体或其抗原结合部位，和/或，使用Alexa Fluor 647荧光标记的根据权利要求18-23中任一项所述的抗CD22抗体的抗体或其抗原结合部位，对CD19-CD22双靶点CAR-T细胞表面的CAR分子进行标记，通过流式细胞仪检测CD19 CAR+ T细胞和/或CD22 CAR+ T细胞比例。
46. 根据权利要求45所述的检测方法，其中所述抗CD19抗体的抗体中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；
其中所述抗CD22抗体的抗体中，重链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18所示的氨基酸序列，轻链可变区的CDR1、CDR2、CDR3分别包含如SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21所示的氨基酸序列。
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