JP2018518459A - 分泌性tnt car細胞免疫療法 - Google Patents

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Abstract

腫瘍壊死療法関連抗原を標的化するCAR細胞が、がん処置の新たな方法として記載される。TNT CAR細胞は、患者において、安全かつ有効であり、ヒト腫瘍およびがんを処置するのに使用しうることが提起されている。一局面では、(a)TNT抗体の抗原結合性ドメイン;(b)ヒンジドメイン;(c)膜貫通ドメイン;および(d)細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)が提供される。別の局面では、上記キメラ抗原受容体は、(a)TNT抗体の抗原結合性ドメイン;(b)CD8αヒンジドメイン;(c)CD8α膜貫通ドメイン;(d)CD28共刺激性シグナル伝達領域および/または4−1BB共刺激性シグナル伝達領域;ならびに(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。

Description

本願は、2015年4月30日に出願された米国仮出願第62/155,296号の米国特許法第119条(e)のもとの優先権を主張し、その内容は、全体において参照によって本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる配列表を含有する。2016年4月29日に作成された前記ASCIIコピーは、064189−7181_SL.txtと名付けられ、42,860バイトのサイズである。
技術分野
本開示は一般に、ヒト免疫学の分野、具体的には、がんの免疫療法に関する。
本発明の背景についての以下の考察は、本発明へと向けて技術を補助するためだけに提供される。
壊死性細胞を、モノクローナル抗体(MAb)の選択的結合のための標的として活用する、がんのイメージングおよび治療のためのユニークな手法が、本出願人らの研究グループにより開発されている(Epstein, A.L.ら(1988年)、Cancer Res.、48巻:5842〜5848頁;Chen, F.M.ら(1991年)、J Natl Cancer Inst.、83巻:200〜204頁;Epstein, A.L.ら(1991年)、Antibody, Immunoconj & Radiopharm.、4巻:151〜161頁;Miller, G.K.ら(1993年)、Hybridoma、12巻:689〜698頁;Hornick, J.L.ら(1998年)、Cancer Biother & Radiopharm、13巻:255〜268頁)。腫瘍壊死療法(TNT)は、腫瘍関連細胞表面抗原に結合するMAbを利用する他の方法とは根本的に異なっている。対照的なことに、TNT MAbは、正常または腫瘍細胞が、死滅するか、または損なわれる(例えば、低酸素症、壊死、アポトーシス、または細胞傷害性試薬および/もしくは過程により)場合に、細胞ゴーストにより顕示または保持される細胞内抗原を認識するのである。したがって、TNT MAbは、正常組織内に見出されない、透過性、変性細胞の存在のために、悪性腫瘍内に局在化する。
Epstein,A.L.ら、Cancer Res.(1988年)48巻:5842〜5848頁 Chen,F.M.ら、J Natl Cancer Inst.(1991年)83巻:200〜204頁 Epstein,A.L.ら、Antibody,Immunoconj&Radiopharm.(1991年)4巻:151〜161頁
本開示の態様は、(a)TNT抗体の抗原結合性ドメイン;(b)ヒンジドメイン;(c)膜貫通ドメイン;および(d)細胞内ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるキメラ抗原受容体(CAR)に関する。本開示のさらなる態様は、(a)TNT抗体の抗原結合性ドメイン;(b)CD8αヒンジドメイン;(c)CD8α膜貫通ドメイン;(d)CD28共刺激性シグナル伝達領域および/または4−1BB共刺激性シグナル伝達領域;ならびに(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるキメラ抗原受容体(CAR)に関する。
ある特定の実施形態では、TNT抗体の抗原結合性ドメインは、TNT重鎖可変領域と、TNT軽鎖可変領域とを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、TNT重鎖可変領域は、配列番号1〜3、9〜11、17〜19、25〜27、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つを含むCDR領域を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにこれからなる。一部の実施形態では、TNT重鎖可変領域は、配列番号7、15、23、31、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つによりコードされるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにこれからなる。
一部の実施形態では、TNT軽鎖可変領域は、配列番号4〜6、12〜14、28〜30、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDR領域を含む。一部の実施形態では、TNT軽鎖可変領域は、配列番号8、16、24、32、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つによりコードされるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにこれからなる。
ある特定の実施形態では、CARは、TNT重鎖可変領域と、TNT軽鎖可変領域との間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含むか、または代替的にさらにこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。ある特定の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。さらなる実施形態では、リンカーポリペプチドは、配列(グリシン−セリン)n[配列中、nは、1〜6の整数である](配列番号66)を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにこれからなる。
ある特定の実施形態では、CARは、CARへと接合させた検出可能なマーカーおよび/または精製マーカーをさらに含むか、または代替的にさらにこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
本開示のさらなる態様は、上記で記載したCARをコードする単離核酸配列またはその相補体またはそれらの各々の同等物に関する。
ある特定の実施形態では、単離核酸配列は、TNT抗体の抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドの上流に配置されたKozakコンセンサス配列をさらに含むか、またはさらにこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
ある特定の態様では、単離核酸は、単離核酸へと作動的にカップリングさせた、抗生物質耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにこれからなる。
本開示の態様は、上記で記載した単離核酸のうちの1または複数を含むベクターに関する。ある特定の実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターの群より選択されるプラスミドまたはウイルスベクターである。単離核酸およびそれらを含有するベクターは、本明細書で記載されるCARを調製するのに有用である。
本開示のさらなる態様は、上記で記載した組成:TNT CAR、CARをコードする単離核酸もしくはその相補体、または単離核酸を含有するベクターのうちの1または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにこれらからなる単離細胞に関する。ある特定の実施形態では、単離細胞は、細菌細胞、例えば、E.coliなどの原核細胞の場合もあり、真核細胞の場合もある。一部の実施形態では、単離真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ科動物細胞、イヌ科動物細胞、マウス細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される。さらなる実施形態では、単離細胞は、本明細書で開示される種のうちのいずれかに由来する、T細胞、B細胞、またはNK細胞である。
ある特定の実施形態では、単離細胞は、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結された、NFAT調節性ポリヌクレオチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離核酸をさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。単離細胞の非限定的な例は、細菌細胞、例えば、E.coliなどの原核細胞、または真核細胞である。一部の実施形態では、単離真核細胞は、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ科動物細胞、イヌ科動物細胞、マウス細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される。さらなる実施形態では、単離細胞は、本明細書で開示される種のうちのいずれかに由来する、T細胞、B細胞、またはNK細胞である。
ある特定の実施形態では、単離核酸は、抗生物質耐性遺伝子をコードするポリヌクレオチドをさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される、1または複数の分子である。
本開示の態様は、上記で記載した組成、例えば、CAR、単離核酸、細胞、またはベクター、および担体のうちの1または複数を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにこれらからなる組成物に関する。
ある特定の実施形態では、組成物は、免疫調節性分子および/または免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結されたNFAT調節性ポリヌクレオチドを含む単離核酸をさらに含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される、1または複数の分子である。
本開示の態様は、TNT関連抗原もしくはその断片、および/またはTNT関連抗原を発現させる細胞に結合したCARまたはCARを含む細胞を含む単離複合体に関する。一態様では、抗原結合性ドメインを、細胞の表面上で発現させる。別の態様では、TNT関連抗原を、腫瘍内、例えば、腫瘍の壊死性組織内で発現させる。腫瘍の非限定的な例は、充実性腫瘍である。充実性腫瘍の非限定的な例は、結腸がん細胞を含む腫瘍である。本明細書では、他の充実性腫瘍を開示する。一態様では、TNT CARを含有するかまたは発現させる細胞は、NK細胞、B細胞、またはT細胞である。腫瘍または細胞は、任意の動物細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞に由来しうる。
本開示の一部の態様は、TNT CAR発現細胞を作製する方法であって、単離細胞に、本明細書で記載されるCARをコードする核酸配列を形質導入するステップを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる方法に関する。
さらなる態様では、方法は、CARを発現させる細胞を選択および単離するステップをさらに含む。さらなる態様では、細胞は、哺乳動物細胞、例えば、NK細胞、B細胞、またはT細胞などのヒト細胞などの真核細胞である。細胞には、本明細書で記載されるウイルスベクターを使用して形質導入することもでき、代替的に、「Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy」と題する、Rietら(2013年)、Meth. Mol. Biol.、969巻:187〜201頁において記載されている技術を使用して形質導入することもできる。
ある特定の実施形態では、方法は、細胞に、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結された、NFAT調節性ポリヌクレオチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離核酸を形質導入するステップをさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。細胞には、本明細書で記載されるウイルスベクターを使用して形質導入することもでき、代替的に、「Nonviral RNA transfection to transiently modify T cell with chimeric antigen receptors for adoptive therapy」と題する、Rietら(2013年)、Meth. Mol. Biol.、969巻:187〜201頁において記載されている技術を使用して形質導入することもできる。
ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される1または複数である。
ある特定の実施形態では、TNT CAR発現細胞を作製する方法は、TNT CAR発現細胞の集団を活性化および拡大するステップをさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。本開示のある特定の態様は、TNT CARを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離活性化細胞集団に関する。ある特定の実施形態では、細胞は、NK細胞、B細胞、またはT細胞のうちの1または複数である。
本開示の態様は、腫瘍を、有効量の、上記で開示した単離細胞または組成物と接触させることにより、TNT関連抗原を発現させる腫瘍の増殖を阻害する方法に関する。接触させるステップは、in vitroにおけるステップの場合もあり、in vivoにおけるステップの場合もある。接触させるステップが、in vitroにおけるステップである場合、方法を使用して、患者の腫瘍に対する個別化療法について調べることもでき、組合せ療法についてアッセイすることもできる。接触させるステップが、in vivoにおけるステップである場合、方法は、がんを患うヒト患者など、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害するのに有用であり、患者は、有効量の細胞を施される。ある特定の実施形態では、腫瘍は、充実性腫瘍である。ある特定の実施形態では、標的化されるがん/腫瘍は、充実性腫瘍、または血液および/もしくは骨髄に影響を及ぼすがんである。ある特定の実施形態では、単離細胞は、処置される対象に対して自家である。別の態様では、方法は、対象へと、有効量の細胞減少療法を投与するステップをさらに含むか、またはこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。さらなる態様では、方法は、対象へと投与される細胞を単離するステップと、細胞に、本明細書で記載されるCARをコードする、有効量の単離核酸を形質導入するステップと、CARをコードする細胞の集団を得るように、細胞を培養し、これを、任意選択で、拡大し、活性化させるステップと、次いで、細胞を、患者へと投与するステップとをさらに含む。
本明細書ではまた、上記で言及した組成物のうちの1または複数と、本明細書で開示される方法における、それらの使用のための指示とを含むキットも開示される。
図1は、HLA依存的なT細胞の活性化をバイパスするように、T細胞シナプスを、単鎖抗体構築物で置きかえるCAR T細胞形成法を示す概略図である。リンカー配列を、配列番号67として開示する。
図2A〜2Dは、腫瘍の壊死性領域に結合するTNT抗体の特徴を示す。図2Aは、全ての腫瘍に典型的な、生存索状物(viable cord)、新たな壊死性領域、および旧来の壊死を伴う、H&E染色されたヒト腫瘍を示す。TNTが、マウスおよびヒトの両方の腫瘍に結合する能力を、図2B〜2Dに示す。図2Bは、BALB/cマウスにおける、皮下Colon 26腫瘍内の、放射性標識されたTNT抗体の取込みを示す。図2Cは、右肺野および左肺野の両方における、小型の腫瘍小節からなる、気管支肺胞癌を伴う患者の肺内の、放射性標識されたchTNT−3についてのイムノシンチグラフィー画像を示す。図2Dは、I−131で放射性標識されたchTNT−3を注射された患者であって、肺尖後枝癌腫塊(apical posterior lung carcinoma mass)を伴う患者についてのイムノシンチグラフィー画像を示す。経時的に撮影された画像は、血液プールについての初期イメージングの強度が、経時的に低下することを示す一方で、腫瘍についての画像は、10日間にわたり維持されていることから、腫瘍に対する特異性が裏付けられる。加えて、この患者は、左下腹部領域内の化膿性炎症性病変を有したが、PMNは、高度な異質染色質の核を有し、これが、TNT抗原を遮蔽することから、TNT抗体の結合が妨げられるという所見のために、イメージングされなかった。膀胱は、代謝されたI−131放射性標識の蓄積を示すが、これは、排泄の際に消失する。 図2A〜2Dは、腫瘍の壊死性領域に結合するTNT抗体の特徴を示す。図2Aは、全ての腫瘍に典型的な、生存索状物、新たな壊死性領域、および旧来の壊死を伴う、H&E染色されたヒト腫瘍を示す。TNTが、マウスおよびヒトの両方の腫瘍に結合する能力を、図2B〜2Dに示す。図2Bは、BALB/cマウスにおける、皮下Colon 26腫瘍内の、放射性標識されたTNT抗体の取込みを示す。図2Cは、右肺野および左肺野の両方における、小型の腫瘍小節からなる、気管支肺胞癌を伴う患者の肺内の、放射性標識されたchTNT−3についてのイムノシンチグラフィー画像を示す。図2Dは、I−131で放射性標識されたchTNT−3を注射された患者であって、肺尖後枝癌腫塊を伴う患者についてのイムノシンチグラフィー画像を示す。経時的に撮影された画像は、血液プールについての初期イメージングの強度が、経時的に低下することを示す一方で、腫瘍についての画像は、10日間にわたり維持されていることから、腫瘍に対する特異性が裏付けられる。加えて、この患者は、左下腹部領域内の化膿性炎症性病変を有したが、PMNは、高度な異質染色質の核を有し、これが、TNT抗原を遮蔽することから、TNT抗体の結合が妨げられるという所見のために、イメージングされなかった。膀胱は、代謝されたI−131放射性標識の蓄積を示すが、これは、排泄の際に消失する。
図3A〜3Bは、放射性標識されたTNT抗体の、腫瘍の壊死性領域への結合を裏付ける、オートラジオグラフィー研究を示す。図3Aは、ヌードマウスに異種移植されたヒトME−180子宮頸部腫瘍についてのH&E染色切片を示す。明るく染色された領域は、壊死性であり、より暗く染色された領域は、生存腫瘍である。図3Bは、肉眼オートラジオグラフィーにより染色された連続切片を示す。暗く染色された領域は、48時間前に投与された、放射性標識された抗体の沈着を示す。この研究では、抗体は、壊死性領域だけを染色することが見られる。壊死性領域に結合する抗体の例を、赤色矢印で示す一方、黄色矢印は、抗体により標識されない生存帯域をマークする。
図4は、Colon 26マウス腫瘍モデルにおける、LECに誘導される免疫細胞浸潤を示す。これらの研究では、腫瘍を有するマウスを、腫瘍植込みの7〜11日目に、chTNT−3単独(対照)またはLEC/chTNT−3で処置し、3日後に屠殺した。上の3つのパネルは、対照処置マウスから採取し、下の3つのパネルは、LEC/chTNT−3処置マウスから得た。対照と比較して、標的化されたLECは、PMNおよび樹状細胞の両方への大規模な浸潤をもたらし、右下パネルに示される、有効な免疫応答を発生させ、この場合、新たに発生した壊死性領域、ならびに併発する腫瘍血管線維症および凝血の周囲には、リンパ浸潤物が見られる。
図5は、LEC/chTNT−3の走化活性を示す。THP−1ヒト単球性白血病細胞を、走化性チャンバー(chemotaxis chamber)において使用して、LEC/chTNT−3、遊離LEC、およびchTNT−3(陰性対照)の生物活性を決定した。
図6A〜6Bは、誘導性L−12およびLEC遺伝子についての概略図を示す。
図7は、バイシストロニックの誘導性IL−12およびLEC遺伝子についての概略図を示す。
図8A〜8Bは、(図8A)NFATタンパク質結合性モチーフおよび誘導性NFAT遺伝子(配列番号57)の転写開始部位であるTSS、ならびに(図8B)バイシストロニックの誘導性IL−12およびLEC遺伝子についての概略図を示す。
図9は、誘導性NFAT−ZsGreen1遺伝子を含有するレンチウイルスを用いて形質導入されたNK−92MI細胞を示す。ZsGreen1とは、Clontech Laboratories(Mountain View、CA)により開発された修飾GFPである。形質導入された細胞を、50fmolのrmIL−12で刺激する前に、完全RPMI中で、2週間にわたり培養した。16時間にわたる刺激の後、細胞を、ZsGreen1の発現について評価した。
図10は、誘導性NFAT−ZsGreen1遺伝子を単独で含有するレンチウイルス、またはCD19 CARに加えてこれを含有するレンチウイルスを用いて形質導入されたJurkat細胞についてのフローサイトメトリー結果を示す。CAR−NFAT細胞を、標的のCD19+ Raji細胞と共に、1:1のCAR対標的細胞比で、一晩にわたりインキュベートした。16時間にわたるインキュベーションの後、細胞を、フローサイトメトリーを介して、ZsGreen1の発現の誘導について評価した。
図11は、TNT−CARを単独で含有するレンチウイルス、または誘導性NFAT−LECもしくはNFAT−IL12遺伝子を含有するレンチウイルスに加えてこれを含有するレンチウイルスを用いて形質導入されたJurkat細胞について、IL−12分泌の誘導を示す。24ウェルプレート上で、形質導入された細胞を、一本鎖ウシ胸腺DNA(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)またはPMA(10ng/mL)およびイオノマイシン(500ng/mL)でコーティングしたウェル内の、完全RPMI 500μL中の細胞2×10個でインキュベートした。16時間にわたる刺激の後、細胞上清を採取し、ELISAを介して、scmIL−12についてアッセイした。scmIL−12:マウス一本鎖IL−12である。
本開示は、当然ながら変動しうるので、記載される特定の態様に限定されないことを理解されたい。また、本開示の範囲は、付属の特許請求の範囲だけによって限定されるので、本明細書で使用される用語法は、特定の態様について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではないことも理解されたい。
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。本技術の実施または試行では、本明細書で記載される方法および材料と類似または同等の、任意の方法および材料を使用しうるが、ここでは、好ましい方法、デバイス、および材料について記載する。本明細書で引用される全ての技術的刊行物および特許公開は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本技術が、先行発明により、このような開示に先行する権利がないことの容認とはみなされないものとする。
本技術の実施では、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技量の範囲内にある、組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組換えDNAについての従来の技法を利用する。例えば、SambrookおよびRussell編(2001年)、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3版;Ausubelら編(2007年)、Current Protocols in Molecular Biologyシリーズ;Methods in Enzymologyシリーズ(Academic Press, Inc.、N.Y.);MacPhersonら(1991年)、PCR 1: A Practical Approach(Oxford University Press内、IRL Press);MacPhersonら(1995年)、PCR 2: A Practical Approach;HarlowおよびLane編(1999年)、Antibodies, A Laboratory Manual;Freshney(2005年)、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique、5版;Gait編(1984年)、Oligonucleotide Synthesis;米国特許第4,683,195号;HamesおよびHiggins編(1984年)、Nucleic Acid Hybridization;Anderson(1999年)、Nucleic Acid Hybridization;HamesおよびHiggins編(1984年)、Transcription and Translation;Immobilized Cells and Enzymes(IRL Press(1986年));Perbal(1984年)、A Practical Guide to Molecular Cloning;MillerおよびCalos編(1987年)、Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(Cold Spring Harbor Laboratory);Makrides編(2003年)、Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells;MayerおよびWalker編(1987年)、Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology(Academic Press、London);ならびにHerzenbergら編(1996年)、Weir’s Handbook of Experimental Immunologyを参照されたい。
範囲を含む、全ての数値表示、例えば、pH、温度、時間、濃度、および分子量は、必要に応じて、(+)もしくは(−)1.0もしくは0.1の増分、または代替的に±15%、または代替的に10%、または代替的に5%、または代替的に2%の変動で変わる概数である。常に明示的に言明されているわけではないが、全ての数値表示には、「約」という用語を前置することを理解されたい。また、常に明示的に言明されているわけではないが、本明細書で記載される試薬は、単に例示的なものであり、当技術分野では、このような試薬の同等物が公知であることも理解されたい。
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本技術が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、このようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体の、同等物または生物学的同等物が、本技術の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。
定義
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ある(a)」、「ある(an)」、および「その」は、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、複数の指示対象を含む。例えば、「細胞」という用語は、それらの混合物を含む、複数の細胞を含む。
本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、例えば、哺乳動物および鳥類を含む類別である、生きている多細胞性の脊椎動物を指す。「哺乳動物」という用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。
本明細書では、「対象」、「宿主」、「個体」、および「患者」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象、例えば、ヒト、動物、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、ヒツジ、マウス、ウマ、およびウシを指すように、互換的に使用される。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、例を目的として、限定せずに述べると、IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM、これらの組合せと、任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギ、およびマウスなどの哺乳動物のほか、サメ免疫グロブリンなど、非哺乳動物種における免疫応答中に産生される同様の分子とを含む、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子をまとめて指す。そうでないことが具体的に言及されない限り、「抗体」という用語は、他の分子への結合を実質的に除外して、目的の分子(または目的の分子と酷似する分子の群)に特異的に結合する、無傷の免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合性断片」(例えば、目的の分子に対する結合定数が、生物学的試料中の他の分子に対する結合定数を、少なくとも10−1超えるか、少なくとも10−1超えるか、または少なくとも10−1超える抗体および抗体断片)を含む。「抗体」という用語はまた、キメラ抗体(例えば、ヒト化マウス抗体)、ヘテロコンジュゲート抗体(二特異性抗体など)などの遺伝子操作形態も含む。また、Pierce Catalog and Handbook、1994〜1995年(Pierce Chemical Co.、Rockford、Ill.);Kuby, J.、Immunology、3版、W.H. Freeman & Co.、New York、1997年も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、Bリンパ球の単一のクローン、または単一の抗体の軽鎖遺伝子および重鎖遺伝子をトランスフェクトした細胞により産生される抗体を指す。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法、例えば、ハイブリッドの抗体形成細胞を、骨髄腫細胞の、脾臓免疫細胞との融合体から作ることにより作製する。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
抗体構造との関連で、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により相互接続された、重(H)鎖と軽(L)鎖とを有する。ラムダ(λ)およびカッパ(κ)という、2つの種類の軽鎖が存在する。抗体分子の機能的活性を決定する、5つの主要な重鎖クラス(またはアイソタイプ):IgM、IgD、IgG、IgA、およびIgEが存在する。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域(領域は「ドメイン」としてもまた公知)を含有する。組み合わせて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「CDR」ともまた呼ばれる、3つの超可変領域により中断される、「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびCDRの広がりについては、規定されている(参照により本明細書に組み込まれる、Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、U. S. Department of Health and Human Services、1991年を参照されたい)。今日では、Kabatによるデータベースは、オンラインで維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。構成要素である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組合せである、抗体のフレームワーク領域は、大部分、β−シートコンフォメーションを採用し、CDRは、ループを形成し、これは、β−シート構造を接続し、場合によって、その一部を形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間の非共有結合的相互作用により、CDRを、適正な配向性で位置決めする足場を形成するように作用する。
CDRは主に、抗原のエピトープへの結合を担う。各鎖のCDRは、N末端から始めて、順に番号付けされる、CDR1、CDR2、およびCDR3と称することが典型的であり、また、特定のCDRが配置される鎖により同定される(重鎖領域を、CDHRと表示し、軽鎖領域を、CDLRと表示する)ことも典型的である。したがって、CDHR3が、それが見出される抗体の重鎖の可変ドメインに由来するCDR3であるのに対し、CDLR1は、それが見出される抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するCDR1である。TNT抗体は、TNT関連抗原に固有な、特異的V領域およびV領域配列を有し、したがって、特異的CDR配列を有する。異なる特異性(すなわち、異なる抗原に対する、異なる結合性部位)を伴う抗体は、異なるCDRを有する。抗体によって変動するのはCDRであるが、CDR内の限定された数のアミノ酸位置だけが抗原への結合に直接関与する。CDR内のこれらの位置を、特異性決定残基(SDR)と呼ぶ。
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、抗体分子またはT細胞受容体など、特異的な体液性または細胞性免疫の産物が特異的に結合しうる、化合物、組成物、または物質を指す。抗原は、例えば、ハプテン、単純な中間代謝物、糖(例えば、オリゴ糖)、脂質、およびホルモンのほか、複合炭水化物(例えば、多糖)、リン脂質、およびタンパク質などの高分子を含む、任意の種類の分子でありうる。抗原の一般的な類別は、ウイルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、原虫および他の寄生生物抗原、腫瘍抗原、自己免疫疾患、アレルギー、および移植片拒絶に関与する抗原、毒素、ならびにその他の抗原を含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「抗原結合性ドメイン」という用語は、抗原標的に特異的に結合しうる、任意のタンパク質またはポリペプチドドメインを指す。
本明細書で使用される「TNT」という用語は、抗体について記載する場合、腫瘍壊死療法(TNT)関連抗原またはその機能的な同等物を認識する抗体を指す。「腫瘍壊死療法(TNT)関連抗原」とは、死につつある細胞では、全抗原、エピトープ、またはそれらの断片が保持されるが、正常では、細胞死の場合を除き、全抗原、エピトープ、または断片が露出されない抗原である。このようなTNT関連抗原の非限定的な例は、通例、細胞死の後に限り接近可能となるDNAまたはDNA/ヒストン標的であり、例えば、TNT−1は、ヒストンH1の部分に結合する。他のヒストン標的は、H2A、H2B、H3、H4、H5、および/または他のヒトもしくは動物ヒストンを含むがこれらに限定されない。他のTNT関連抗原は、一本鎖DNAおよび異質染色質のDNAを含むがこれらに限定されない。TNT抗体は、TNT−1、TNT−2、TNT−3、およびNHS76を含むがこれらに限定されず、これらのCDRは、下記で列挙されるか、または、米国特許第8,795,672号;米国特許第8,545,838号において記載されている通り、当技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、TNT−1という用語は、CDRのうちのいずれか1つ、好ましくはCDR3領域のうちの少なくとも1つ、最も好ましくは下記で開示されるCDR3領域の両方と、少なくとも70%、または代替的に少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有するCDRを伴うアミノ酸配列を含む抗体を指す。
TNT−1 CDHR1, 配列番号1:
GFSLTDYG
TNT−1 CDHR2, 配列番号2:
IWGGGST
TNT−1 CDHR3, 配列番号3:
AKEKRRGYYYAMDY
TNT−1 CDLR1, 配列番号4:
SSVSSSY
TNT−1 CDLR2, 配列番号5:
STS
TNT−1 CDLR3, 配列番号6:
QQYSGYPLT
TNT−1の重鎖可変領域配列、配列番号7:
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGACTATGGTGTAAGGTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGGTGGAAGCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAAAGAGAAACGGAGGGGGTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
TNT−1の軽鎖可変領域配列、配列番号8:
GGAGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCACTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
本明細書で使用される場合、TNT−2という用語は、CDRのうちのいずれか1つ、好ましくはCDR3領域のうちの少なくとも1つ、最も好ましくは下記で開示されるCDR3領域の両方と、少なくとも70%、または代替的に少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有するCDRを伴うアミノ酸配列を含む抗体を指す。
TNT−2 CDHR1, 配列番号9:
GYSFTGYY
TNT−2 CDHR2, 配列番号10:
INPYNGAT
TNT−2 CDHR3, 配列番号11:
ARLDRGDY
TNT−2 CDLR1, 配列番号12:
ENVVTY
TNT−2 CDLR2, 配列番号13:
GAS
TNT−2 CDLR3, 配列番号14:
GQGYSYPYT
TNT−2の重鎖可変領域配列、配列番号15:
GAGGTACAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACTAGACCGGGGGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
TNT−2の軽鎖可変領域配列、配列番号16:
AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGTACG
本明細書で使用される場合、TNT−3という用語は、CDRのうちのいずれか1つ、好ましくはCDR3領域のうちの少なくとも1つ、最も好ましくは下記で開示されるCDR3領域の両方と、少なくとも70%、または代替的に少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有するCDRを伴うアミノ酸配列を含む抗体を指す。
TNT−3 CDHR1, 配列番号17:
GYTFTRYW
TNT−3 CDHR2, 配列番号18:
IYPGNSDT
TNT−3 CDHR3, 配列番号19:
ARGEEIGVRRWFAY
TNT−3 CDLR1, 配列番号20:
QSISNY
TNT−3 CDLR2, 配列番号21:
YAS
TNT−3 CDLR3, 配列番号22:
QQSNSWPLT
TNT−3の重鎖可変領域配列、配列番号23:
CAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGACTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGATACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGCTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAATAGTGATACTAGCTACTACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCTGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGAGGAAATAGGGGTACGACGCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
TNT−3の軽鎖可変領域配列、配列番号24:
GATATTGTGC TAACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTGTGA CTCCAGGAGA TAGAGTCAGT CTTTCCTGCA GGGCCAGGCA AAGTATTAGC AACTACCTAC ACTGGTATCA ACAAAAATCA CATGAGTCTC CAAGGCTTCT CATCAAGTAT GCTTCCCAGT CCATCTCTGG CATCCCCTCC AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACTCTCA GTATCAACAG TGTGGAGACT GAAGATTTTG GAATGTATTT CTGTCAACAG AGTAACAGCT GGCCGCTCAC GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAAATAAA A
本明細書で使用される場合、NHS76という用語は、CDRのうちのいずれか1つ、好ましくはCDR3領域のうちの少なくとも1つ、最も好ましくは下記および米国特許第6,827,925号で開示されるCDR3領域の両方と、少なくとも70%、または代替的に少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有するCDRを伴うアミノ酸配列を含む抗体を指す。
NHS76 CDHR1, 配列番号25:
SGYYWG
NHS76 CDHR2, 配列番号26:
SIYHSGSTYYNPSLKS
NHS76 CDHR3, 配列番号27:
GKWSKFDY
NHS76 CDLR1, 配列番号28:
QGDSLRSYYAS
NHS76 CDLR2, 配列番号29:
GKNNRPS
NHS76 CDLR3, 配列番号30:
NSRDSSGNHVV
NHS76の重鎖可変領域配列、配列番号31:
CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC CGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CCTGTCCCTC ACCTGCGCTG TCTCTGGTTA CTCCATCAGC AGTGGTTACT ACTGGGGCTG GATTCGGCAG CCCCCAGGGA AGGGGCTGGA GTGGATTGGG AGTATCTATC ATAGTGGGAG CACCTACTAC AACCCGTCCC TCAAGAGTCG AGTCACCATA TCAGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC CTGAAGCTGA GCTCTGTGAC CGCCGCAGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGGGAAG TGGTCGAAGT TTGACTATTG GGGCCAAGGC ACCCTGGTCA CCGTCTCTTC A
NHS76の軽鎖可変領域配列、配列番号32:
TCCTCTGAGC TGACTCAGGA CCCTGCTGTG TCTGTGGCCT TGGGACAGAC AGTCAGGATC ACATGCCAAG GAGACAGCCT CAGAAGCTAT TATGCAAGCT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA CAGGCCCCTG TACTTGTCAT CTATGGTAAA AACAACCGGC CCTCAGGGAT TCCAGACCGA TTCTCTGGCT CCAGCTCAGG AAACACAGCT TCCTTGACCA TCACTGGGGC TCAGGCGGAA GATGAGGCTG ACTATTACTG TAACTCCCGG GACAGCAGTG GTAACCATGT GGTATTCGGC GGAGGGACCA AGCTGACCGT CCTA
本明細書で使用される場合、細胞に言及して「自家」という用語は、同じ対象(レシピエントまたは宿主)から単離され、注入し戻される細胞を指す。「同種」とは、非自家細胞を指す。
本明細書で使用される場合、「B細胞」という用語は、獲得性免疫系の体液性免疫におけるリンパ球の種類を指す。B細胞は主に、抗体を作り、抗原提示細胞として働き、サイトカインを放出し、抗原との相互作用による活性化の後で、メモリーB細胞を発生させるように機能する。B細胞は、T細胞など、他のリンパ球から、細胞表面上のB細胞受容体の存在により識別される。B細胞は、単離することもでき、商業的に利用可能な供給源から得ることもできる。市販のB細胞株の非限定的な例は、細胞株である、AHH−1(ATCC(登録商標)CRL−8146(商標))、BC−1(ATCC(登録商標)CRL−2230(商標))、BC−2(ATCC(登録商標)CRL−2231(商標))、BC−3(ATCC(登録商標)CRL−2277(商標))、CA46(ATCC(登録商標)CRL−1648(商標))、DG−75[D.G.−75](ATCC(登録商標)CRL−2625(商標))、DS−1(ATCC(登録商標)CRL−11102(商標))、EB−3[EB3](ATCC(登録商標)CCL−85(商標))、Z−138(ATCC:#CRL−3001)、DB(ATCC CRL−2289)、Toledo(ATCC CRL−2631)、Pfiffer(ATCC CRL−2632)、SR(ATCC CRL−2262)、JM−1(ATCC CRL−10421)、NFS−5 C−1(ATCC CRL−1693);NFS−70 C10(ATCC CRL−1694)、NFS−25 C−3(ATCC CRL−1695)、およびSUP−B15(ATCC CRL−1929)を含む。さらなる例は、未分化大細胞リンパ腫に由来する細胞株、例えば、DEL、DL−40、FE−PD、JB6、Karpas 299、Ki−JK、Mac−2A Ply1、SR−786、SU−DHL−1、SU−DHL−2、SU−DHL−4、SU−DHL−5、SU−DHL−6、SU−DHL−7、SU−DHL−8、SU−DHL−9、SU−DHL−10、およびSU−DHL−16、DOHH−2、NU−DHL−1、U−937、Granda 519、USC−DHL−1、RL;ホジキンリンパ腫に由来する細胞株、例えば、DEV、HD−70、HDLM−2、HD−MyZ、HKB−1、KM−H2、L 428、L 540、L1236、SBH−1、SUP−HD1、SU/RH−HD−1を含むがこれらに限定されない。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、American Type Culture CollectionすなわちATCC(http://www.atcc.org/)およびGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures(https://www.dsmz.de/)を含む。
「キメラ抗原受容体」(CAR)という用語は、本明細書で使用される場合、抗原に結合することが可能な細胞外ドメインと、細胞外ドメインが由来するポリペプチドとは異なるポリペプチドに由来する膜貫通ドメインと、少なくとも1つの細胞内ドメインとを含む融合タンパク質を指す。「キメラ抗原受容体(CAR)」とは、場合によって、「キメラ受容体」、「Tボディー(T−body)」、または「キメラ免疫受容体(CIR)」と呼ばれる。「抗原に結合することが可能な細胞外ドメイン」とは、ある特定の抗原に結合しうる、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。「細胞内ドメイン」または「細胞内シグナル伝達ドメイン」とは、細胞内の生物学的過程の活性化または阻害を引き起こすシグナルを伝達するドメインとして機能することが公知である、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、細胞内ドメインは、一次シグナル伝達ドメインに加えて、1または複数の共刺激性シグナル伝達ドメインを含みうるか、代替的にこれらから本質的になりうるか、またはなおさらにこれらを含みうる。「膜貫通ドメイン」とは、細胞膜にわたり、細胞外ドメインと、シグナル伝達ドメインとを連結するように機能しうることが公知である、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを意味する。キメラ抗原受容体は、任意選択で、細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとの間のリンカーとして働く「ヒンジドメイン」を含みうる。本明細書では、このようなドメインの非限定的な例、例えば、
ヒンジドメイン:IgG1重鎖ヒンジ配列、配列番号59:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
膜貫通ドメイン:CD28膜貫通領域 配列番号60:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
細胞内ドメイン:4−1BB共刺激性シグナル伝達領域、配列番号61:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
細胞内ドメイン:CD28共刺激性シグナル伝達領域、配列番号62:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
細胞内ドメイン:CD3ゼータシグナル伝達領域、配列番号63:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
を提示する。
本明細書で使用される場合、「CD8αヒンジドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるCD8αヒンジドメインの配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ヒト、マウス、および他の種のCD8αヒンジドメインの配列例は、Pinto, R. D.ら(2006年)、Vet. Immunol. Immunopathol.、110巻:169〜177頁において提示されている。CD8αヒンジドメインと関連する配列は、Pinto, R. D.ら(2006年)、Vet. Immunol. Immunopathol.、110巻:169〜177頁において提示されている。このような配列の非限定的な例は、
ヒトCD8アルファヒンジドメイン、配列番号33:
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
マウスCD8アルファヒンジドメイン、配列番号34:
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
ネコCD8アルファヒンジドメイン、配列番号35:
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY
を含む。
本明細書で使用される場合、「CD8α膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるCD8α膜貫通ドメインの配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ヒトT細胞表面糖タンパク質CD8アルファ鎖(GenBank受託番号:NP_001759.3)のアミノ酸位置183〜203、またはマウスT細胞表面糖タンパク質CD8アルファ鎖(GenBank受託番号:NP_001074579.1)のアミノ酸位置197〜217、およびラットT細胞表面糖タンパク質CD8アルファ鎖(GenBank受託番号:NP_113726.1)のアミノ酸位置190〜210と関連する断片配列は、CD8α膜貫通ドメインについてのさらなる配列例を提示する。列挙した受託番号の各々と関連する配列を、以下の通りに提示する:
ヒトCD8アルファ膜貫通ドメイン、配列番号36:
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
マウスCD8アルファ膜貫通ドメイン、配列番号37:IWAPLAGICVALLLSLIITLI
ラットCD8アルファ膜貫通ドメイン、配列番号38:IWAPLAGICAVLLLSLVITLI
本明細書で使用される場合、「CD28膜貫通ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるCD28膜貫通ドメインの配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、少なくとも90%の配列同一性、または代替的に、少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。GenBank受託番号:XM_006712862.2およびXM_009444056.1と関連する断片配列は、CD28膜貫通ドメインについてのさらなる非限定的配列例を提示する。列挙した受託番号の各々と関連する配列を、配列番号60によりコードされる配列として提示する。
本明細書で使用される場合、「4−1BB共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示される4−1BB共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。4−1BB共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、下記で提示される例示的な配列:
4−1BB共刺激性シグナル伝達領域、配列番号39:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
など、米国公開第20130266551A1号(米国出願第13/826,258号として出願された)において提示されている。
本明細書で使用される場合、「CD28共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるCD28共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。CD28共刺激性シグナル伝達ドメインの配列例は、米国特許第5,686,281号;Geiger, T. L.ら、Blood、98巻:2364〜2371頁(2001年);Hombach, A.ら、J Immunol、167巻:6123〜6131頁(2001年);Maher, J.ら、Nat Biotechnol、20巻:70〜75頁(2002年);Haynes, N. M.ら、J Immunol、169巻:5780〜5786頁(2002年);Haynes, N. M.ら、Blood、100巻:3155〜3163頁(2002年)において提示されている。非限定的な例は、下記のCD28配列:
MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS (配列番号40)
の残基114〜220、およびそれらの同等物を含む。
本明細書で使用される場合、「ICOS共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるICOS共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。ICOS共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国公開第2015/0017141A1号に提示されており、下記に提示される、例示的なポリヌクレオチド配列を含む。
ICOS共刺激性シグナル伝達領域、配列番号64:
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA
本明細書で使用される場合、「OX40共刺激性シグナル伝達領域」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるOX40共刺激性シグナル伝達領域の配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、または代替的に、90%の配列同一性、または代替的に、少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。OX40共刺激性シグナル伝達領域の非限定的な配列例は、米国公開第2012/20148552A1号に開示されており、下記に提示される、例示的な配列を含む。
OX40共刺激性シグナル伝達領域、配列番号65:
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC
本明細書で使用される場合、「CD3ゼータシグナル伝達ドメイン」という用語は、この名称と関連する特異的タンパク質断片と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、本明細書で示されるCD3ゼータシグナル伝達ドメインの配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。CD3ゼータシグナル伝達ドメインの非限定的な配列例は、米国出願第13/826,258号、例えば、
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR (配列番号41)
において提示されている。
「組成物」は典型的に、活性薬剤、例えば、化合物または組成物と、希釈剤、結合剤、安定化剤、緩衝剤、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなど、不活性(例えば、検出可能な薬剤または標識)または活性な、天然に存在するまたは天然に存在しない担体との組合せを意図し、薬学的に許容される担体を含む。担体はまた、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、および炭水化物(例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、およびオリゴ糖を含む糖;アルジトール、アルドン酸、エステル化糖などの誘導体化糖;ならびに多糖または糖ポリマー)などの医薬賦形剤および添加剤も含み、これらは単独または組合せで存在することが可能であり、単独または組合せにより、重量または容量で、1〜99.99%を構成する。例示的なタンパク質賦形剤は、ヒト血清アルブミン(HSA)などの血清アルブミン、組換えヒトアルブミン(rHA)、ゼラチン、カゼインなどを含む。緩衝能においてもまた機能しうる、代表的なアミノ酸/抗体構成要素は、アラニン、アルギニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタームなどを含む。炭水化物賦形剤もまた、本技術の範囲内において意図されており、その例は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、D−マンノース、ソルボースなどの単糖;ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなどの二糖;ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなどの多糖;ならびにマンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール ソルビトール(グルシトール)、およびミオイノシトールなどのアルジトールを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「〜を含むこと」という用語は、組成物および方法が、列挙される要素を含むが、他の要素を除外しないことを意味するように意図される。組成物および方法を規定するのに使用される場合の「〜から本質的になること」とは、意図される使用のための組合せにとって本質的に重要な他の要素を除外することを意味するものとする。例えば、本明細書で規定される通り、要素から本質的になる組成物は、単離および精製法、ならびにリン酸緩衝食塩水、保存剤など、薬学的に許容される担体から、微量の夾雑物を除外しないであろう。「〜からなること」とは、本明細書で開示される組成物を投与するための、微量を超える他の成分の要素、および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行句の各々により規定される態様は、本開示の範囲内にある。
本明細書で使用される「コンセンサス配列」という用語は、複数の配列のシリーズをアラインメントすることにより決定されるアミノ酸または核酸配列であり、複数の配列の各対応する位置における、アミノ酸または塩基の主要な選択肢を表す、理想的な配列を規定する、アミノ酸または核酸配列を指す。複数の配列シリーズの配列に基づき、シリーズのコンセンサス配列は、配列の各々と、ゼロ、1つ、少数、またはこれを超える置換により異なりうる。複数の配列シリーズの配列に応じてまた、シリーズの、1つを超えるコンセンサス配列を決定することができる。コンセンサス配列の生成は、精緻な数学的解析下に置かれている。多様なソフトウェアプログラムを使用して、コンセンサス配列を決定することができる。
「細胞減少療法」とは、本明細書で使用される場合、化学療法、寒冷療法、および放射線療法を含むがこれらに限定されない。当技術分野では、細胞の増殖を低減するように作用する薬剤が公知であり、広く使用されている。がん細胞を、それらが分裂している場合に限り死滅させる化学療法薬を、細胞周期特異的と称する。これらの薬物は、トポイソメラーゼ阻害剤および代謝拮抗物質を含む、S期において作用する薬剤を含む。
トポイソメラーゼ阻害剤とは、トポイソメラーゼ酵素(トポイソメラーゼIおよびII)の作用に干渉する薬物である。化学療法の過程において、トポイソメラーゼ酵素は、複製に必要なDNAの構造の操作を制御し、したがって、細胞周期特異的である。トポイソメラーゼI阻害剤の例は、上記で列挙したカンプトテシン(camptothecan)類似体である、イリノテカンおよびトポテカンを含む。トポイソメラーゼII阻害剤の例は、アムサクリン、エトポシド、エトポシドリン酸塩、およびテニポシドを含む。
代謝拮抗物質とは通例、染色体の複製に関与する過程に干渉することが多い正常代謝基質の類似体である。代謝拮抗物質は、周期内の極めて特異的な期にある細胞を攻撃する。代謝拮抗物質は、葉酸アンタゴニスト、例えば、メトトレキサート;ピリミジンアンタゴニスト、例えば、5−フルオロウラシル、フロクスウリジン(foxuridine)、シタラビン、カペシタビン、およびゲムシタビン;プリンアンタゴニスト、例えば、6−メルカプトプリンおよび6−チオグアニン;アデノシンデアミナーゼ阻害剤、例えば、クラドリビン、フルダラビン、ネララビン、およびペントスタチンなどを含む。
植物アルカロイドは、ある特定の種類の植物に由来する。ビンカアルカロイドは、ツルニチニチソウ(Catharanthus rosea)の植物体から作られる。タキサンは、太平洋イチイ(Pacific Yew tree)(Taxus)の樹皮から作られる。ビンカアルカロイドおよびタキサンはまた、抗微小管剤としても公知である。ポドフィロトキシンは、ポドフィルムの植物体に由来する。カンプトテシン類似体は、アジア原産の「カンレンボク(Happy Tree)」(Camptotheca acuminata)に由来する。ポドフィロトキシンおよびカンプトテシン類似体はまた、トポイソメラーゼ阻害剤としても分類される。植物アルカロイドは一般に、細胞周期特異的である。
これらの薬剤の例は、ビンカアルカロイド、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびビノレルビン;タキサン、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル;ポドフィロトキシン、例えば、エトポシドおよびテニポシド(tenisopide);ならびにカンプトテシン類似体、例えば、イリノテカンおよびトポテカンを含む。
寒冷療法は、温度の低下、例えば、低温治療(hypothermic therapy)を伴う療法を含むがこれらに限定されない。
放射線療法は、当技術分野で公知の通り、放射線、例えば、電離放射線、UV放射線への曝露を含むがこれに限定されない。例示的な投与量は、少なくとも約2Gy〜約10Gy以下の範囲の電離放射線の線量および/または少なくとも約5J/m〜約50J/m以下の範囲の紫外放射線の線量、通例約10J/mを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「検出可能なマーカー」という用語は、直接的にまたは間接的に、検出可能なシグナルを発生させることが可能な、少なくとも1つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース−6−リン酸デヒドロゲナーゼなどの、例えば比色定量、蛍光、発光による検出可能なシグナルを発生させる酵素、蛍光、発光色素などの発色団、電子顕微鏡法、または伝導性、電流滴定、ボルタンメトリー、インピーダンスなど、それらの電気的特性により検出される電子密度を伴う群、例えば、それらの分子が、それらの物理的および/または化学的特性の、検出可能な修飾を誘導するのに十分なサイズである、検出可能な群を含み、このような検出は、回折、表面プラズモン共鳴、表面の変動、接触角の変化などの光学法、または原子間力分光法、トンネル効果などの物理学的方法、または32P、35S、もしくは125Iなどの放射性分子により達成することができる。
「有効(effective)量」または「有効(efficacious)量」とは、薬剤の量、または2つもしくはこれを超える薬剤の組合せ量であって、哺乳動物または他の対象を処置するために投与されると、疾患のためのこのような処置を施すのに十分である、量または組合せ量を指す。「有効(effective)量」とは、薬剤、疾患およびその重症度、ならびに処置される対象の年齢、体重などに応じて変動するであろう。
核酸配列へと適用される「〜をコードする」という用語は、その天然状態にあるか、または当業者に周知の方法により操作されるときに、ポリペプチドおよび/またはその断片のmRNAを産生するように転写および/または翻訳されうる場合、ポリペプチド「をコードする」と言われるポリヌクレオチドを指す。アンチセンス鎖とは、このような核酸の相補体であり、ここから、コード配列を推定することができる。
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、発現させる核酸配列との関連における、その場所および配向性に関わらず、核酸配列の転写を増進、改良、または改善する配列エレメントを表す。エンハンサーは、単一のプロモーターからの転写を増強する場合もあり、1つを超えるプロモーターからの転写を同時に増強する場合もある。転写を改良するこの機能性が、保持されるか、または実質的に保持される(例えば、野生型活性、すなわち全長配列の活性の、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%)限りにおいて、野生型エンハンサー配列の、任意の切断された、変異された、またはこれら以外の修飾された改変体もまた、上記の規定の範囲内にある。
一態様では、抗体の「同等物」または「生物学的同等物」という用語は、抗体が、そのエピトープタンパク質またはその断片に選択的に結合する能力であって、ELISAまたは他の適切な方法により測定される能力を意味する。生物学的に同等な抗体は、基準抗体と同じエピトープに結合する、抗体、ペプチド、抗体断片、抗体の改変体、抗体の誘導体、および抗体の模倣体(mimetic)を含むがこれらに限定されない。
明示的な列挙を伴わないが、そうでないことが意図されない限りにおいて、本開示が、ポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体に関する場合、このようなポリペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、または抗体の同等物または生物学的同等物は、本開示の範囲内にあることが意図されることを推察されたい。本明細書で使用される場合、「その生物学的同等物」という用語は、基準タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸に言及する場合、「その同等物」と同義であることを意図し、所望の構造または機能性をなおも維持しながら、最小限の相同性を有する、タンパク質、抗体、ポリペプチド、または核酸を意図する。本明細書で具体的に列挙されない限りにおいて、本明細書で言及される、任意のポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質はまた、その同等物も含むことが想定される。例えば、同等物は、少なくとも約70%の相同性もしくは同一性、または少なくとも80%の相同性もしくは同一性、または代替的に少なくとも約85%、または代替的に少なくとも約90%、または代替的に少なくとも約95%、または代替的に98%の相同性パーセントもしくは同一性パーセントを意図し、基準タンパク質、ポリペプチド、または核酸と実質的に同等な生体活性を呈する。代替的に、ポリヌクレオチドに言及する場合、その同等物は、ストリンジェントな条件下で、基準ポリヌクレオチドまたはその相補体にハイブリダイズするポリヌクレオチドである。
別の配列と、ある特定の百分率(例えば、80%、85%、90%、または95%)の「配列同一性」を有するポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチド領域(またはポリペプチドもしくはポリペプチド領域)とは、アラインメントし、2つの配列を比較するときに、その百分率の塩基(またはアミノ酸)が同じであることを意味する。アラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1987年)、補遺30巻、7.7.18節、表7.7.1において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するBLASTである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ:遺伝子コード=標準;フィルター=なし;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=10;行列=BLOSUM62;記載=50の配列;ソート=高スコア;データベース=非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIRを使用する、BLASTNおよびBLASTPである。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレス:ncbi.nlm.nih.gov/cgi−bin/BLASTにおいて見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドが、mRNAへと転写される過程および/または転写されたmRNAが、その後、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へと翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドが、ゲノムDNAに由来する場合、発現は、真核細胞内のmRNAのスプライシングを含みうる。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のmRNAまたはタンパク質の量を測定することにより決定することができる。一態様では、1つの試料に由来する遺伝子の発現レベルを、対照または基準試料に由来する、この遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。別の態様では、1つの試料に由来する遺伝子の発現レベルを、化合物の投与後に、同じ試料に由来する、この遺伝子の発現レベルと直接比較することができる。
「第1選択」または「第2選択」または「第3選択」という語句は、患者により受容される処置の順序を指す。第1選択治療レジメンは、最初に施される処置であるのに対し、第2または第3選択治療は、それぞれ、第1選択治療の後、または第2選択治療の後で施される。National Cancer Instituteは、第1選択治療を、「疾患または状態のための最初の処置」として規定している。がんを伴う患者では、一次処置は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの治療の組合せでありうる。当業者はまた、第1選択治療を、「一次治療および一次処置」とも称する。2008年5月1日が最後の閲覧日である、www.cancer.govにおけるNational Cancer Instituteのウェブサイトを参照されたい。患者が、第1選択治療に対して、ポジティブな臨床応答を示さなかったか、または不顕性の応答を示したか、または第1選択治療を停止しているために、患者には、その後の化学療法レジメンを施すのが典型的である。
本明細書で使用される場合、「相同性」または「同一な」、「同一性」パーセントまたは「類似性」パーセントとは、2つまたはこれを超える核酸またはポリペプチド配列の文脈で使用される場合、2つまたはこれを超える配列または部分配列であって、同じであるか、または指定された百分率の、同じヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する配列または部分配列、例えば、指定された領域(例えば、本明細書で記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書で記載される抗体のアミノ酸配列)にわたり、少なくとも60%の同一性、好ましくは少なくとも65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、またはこれを超える同一性を有する配列または部分配列を指す。相同性は、比較を目的としてアラインメントされうる、各配列内の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列内の位置が、同じ塩基またはアミノ酸により占有される場合、分子は、この位置において相同である。配列間の相同性の程度は、配列により共有される、マッチする位置または相同な位置の数の関数である。アラインメントおよび相同性パーセントまたは配列同一性パーセントは、当技術分野で公知のソフトウェアプログラム、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1987年)、補遺30巻、7.7.18節、表7.7.1において記載されているソフトウェアプログラムを使用して決定することができる。アラインメントのためには、デフォルトのパラメータを使用することが好ましい。好ましいアラインメントプログラムは、デフォルトのパラメータを使用するBLASTである。特に、好ましいプログラムは、以下のデフォルトのパラメータ:遺伝子コード=標準;フィルター=なし;鎖=両方;カットオフ=60;期待値=10;行列=BLOSUM62;記載=50の配列;ソート=高スコア;データベース=非冗長、GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS translations+SwissProtein+SPupdate+PIRを使用する、BLASTNおよびBLASTPである。これらのプログラムの詳細については、以下のインターネットアドレス:ncbi.nlm.nih.gov/cgi−bin/BLASTにおいて見出すことができる。「相同性」または「同一な」、「同一性」パーセントまたは「類似性」パーセントという用語はまた、被験配列の相補体も指すか、またはこれに適用することもできる。用語はまた、欠失および/または付加を有する配列のほか、置換を有する配列も含む。本明細書で記載される通り、好ましいアルゴリズムは、ギャップなどに対処しうる。好ましくは、同一性は、少なくとも約25アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたり存在するか、またはより好ましくは少なくとも50〜100アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さである領域にわたり存在する。「非類縁の」または「非相同な」配列は、本明細書で開示される配列のうちの1つと、40%未満の同一性、または代替的に25%未満の同一性を共有する。
「ハイブリダイゼーション」とは、1または複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化する複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソンクリック塩基対合により生じる場合もあり、フーグスティーン結合により生じる場合もあり、他の任意の配列特異的な形で生じる場合もある。複合体は、二重鎖構造を形成する2つの鎖、多重鎖複合体を形成する3つもしくはこれを超える鎖、自己ハイブリダイズする一本鎖、またはこれらの任意の組合せを含みうる。ハイブリダイゼーション反応は、PCR反応の開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断など、より広範な工程内のステップを構成しうる。
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、約25℃〜約37℃のインキュベーション温度;約6倍濃度のSSC〜約10倍濃度のSSCのハイブリダイゼーション緩衝液濃度;約0%〜約25%のホルムアミド濃度;および約4倍濃度のSSC〜約8倍濃度のSSCの洗浄溶液を含む。中程度のハイブリダイゼーション条件の例は、約40℃〜約50℃のインキュベーション温度;約9倍濃度のSSC〜約2倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約30%〜約50%のホルムアミド濃度;および約5倍濃度のSSC〜約2倍濃度のSSCの洗浄溶液を含む。高ストリンジェンシー条件の例は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。一般に、ハイブリダイゼーションインキュベーション時間は、5分間〜24時間であり、1つ、2つ、またはこれを超える洗浄ステップを伴い、洗浄インキュベーション時間は、約1、2、または15分間である。SSCとは、0.15MのNaClおよび15mMのクエン酸緩衝液である。他の緩衝液系を使用する、SSCの同等物を利用しうることが理解される。
本明細書で使用される場合、「免疫調節性分子」という用語は、免疫応答を調節しうるか、またはこれに直接に影響を及ぼしうる任意の分子であって、CCL2、CCL5、CCL14、CCL19、CCL20、CXCL8、CXCL13、およびLECなどのケモカイン;インターロイキン(例えば、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−18、IL−21など)、インターフェロンα、β、およびγなどのリンホカインおよびサイトカイン;細胞増殖を刺激する因子(例えば、GM−CSF)、および他の因子(例えば、腫瘍壊死因子、DC−SIGN、MlP1α、MlP1β、TGF−β、またはTNF);B7分子およびCD40などのT細胞活性化のための共刺激性シグナルをもたらす因子;CD83などのアクセサリー分子;TAP1/TAP2トランスポータータンパク質などの抗原のプロセシングおよび提示に関与するタンパク質;LMP2およびLMP7などのプロテオソーム分子;gp96、HSP70、およびHSP90などの熱ショックタンパク質;ならびにMHCまたはHLA分子;ならびにそれらの生物学的同等物を含むがこれらに限定されない任意の分子を指す場合がある。本明細書では、免疫調節性分子の非限定的な例が開示される。
本明細書で使用される場合、「B7.1」(B7;BB1;B7−1;CD80;LAB7;CD28LG;CD28LG1としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、B7.1と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、B7.1配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NM_005191.3およびNP_005182.1と関連する配列が、例示的である。
非限定的な例は、NP_005182.1、配列番号42:
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPR CRERRRNERL RRESVRPV
を含む。
B7.1を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、B7.1を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(http://www.linscottsdirectory.com/)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「CCL19」(ELC;CKb11;MIP3B;MIP−3b;SCYA19としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、CCL19と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、CCL19配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000009.11、NC_018920.2、NT_008413.19、NP_006265.1と関連する配列が、例示的である。
非限定的な例は、NP_006265.1、配列番号43:
MALLLALSLL VLWTSPAPTL SGTNDAEDCC LSVTQKPIPG YIVRNFHYLL IKDGCRVPAV VFTTLRGRQL CAPPDQPWVE RIIQRLQRTS AKMKRRSS
を含む。
CCL19を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、CCL19を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(http://www.linscottsdirectory.com/)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「CCL20」(CKb4;LARC;ST38;MIP3A;Exodus;MIP−3a;SCYA20;MIP−3−アルファとしてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、CCL20と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、CCL20配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000002.11、NC_018913.2、NT_005403.18、NP_001123518.1、およびNP_004582.1と関連する配列が、例示的である。
例は、NP_004582.1、配列番号44:
MCCTKSLLLA ALMSVLLLHL CGESEAASNF DCCLGYTDRI LHPKFIVGFT RQLANEGCDI NAIIFHTKKK LSVCANPKQT WVKYIVRLLS KKVKNM
およびNP_001123518.1、配列番号45:
MCCTKSLLLA ALMSVLLLHL CGESEASNFD CCLGYTDRIL HPKFIVGFTR QLANEGCDIN AIIFHTKKKL SVCANPKQTW VKYIVRLLSK KVKNM
を含む。
CCL20を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、CCL20を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(2015年4月9日に最後にアクセスした、ウェブアドレス:linscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「CD40L」(IGM;IMD3;TRAP;gp39;CD154;CD40LG;HIGM1;T−BAM;TNFSF5;hCD40Lとしてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、CD40Lと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、CD40L配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000023.10、NC_018934.2、NT_011786.17、NP_000065.1と関連する配列が、例示的である。
非限定的な例は、NP_000065.1、配列番号46:
MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL DKIEDERNLH EDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDIML NKEETKKENS FEMQKGDQNP QIAAHVISEA SSKTTSVLQW AEKGYYTMSN NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY IYAQVTFCSN REASSQAPFI ASLCLKSPGR FERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE LQPGASVFVN VTDPSQVSHG TGFTSFGLLK L
を含む。
CD40Lを組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、CD40Lを、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(2015年4月9日に最後にアクセスした、linscottsdirectory.comのウェブアドレスを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「CD137L」(TNFSF9;4−1BB−Lとしてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、CD137Lと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、CD137L配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000019.9、NT_011295.12、NC_018930.2、およびNP_003802.1と関連するタンパク質が、例示的である。
非限定的な例は、NP_003802.1、配列番号47:
MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL LAAACAVFLA CPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE
を含む。
CD137Lを組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、CD137Lを、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(2015年4月9日に最後にアクセスした、ウェブアドレス:linscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「GITRL」(TNFSF18;TL6;AITRL;hGITRLとしてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、GITRLと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、GITRL配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000001.10、NC_018912.2、NT_004487.20、およびNP_005083.2と関連するタンパク質が、例示的である。
非限定的な例は、NP_005083.2、配列番号48:
MTLHPSPITC EFLFSTALIS PKMCLSHLEN MPLSHSRTQG AQRSSWKLWL FCSIVMLLFL CSFSWLIFIF LQLETAKEPC MAKFGPLPSK WQMASSEPPC VNKVSDWKLE ILQNGLYLIY GQVAPNANYN DVAPFEVRLY KNKDMIQTLT NKSKIQNVGG TYELHVGDTI DLIFNSEHQV LKNNTYWGII LLANPQFIS
を含む。
GITRLを組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、GITRLを、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(2015年4月9日に最後にアクセスした、linscottsdirectory.comのウェブアドレスを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「GM−CSF」(顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子;CSF2としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、GM−CSFと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、GM−CSF配列の例が提示される。加えて、UniProt参照番号:P04141−CSF2_HUMAN:
MWLQSLLLLG TVACSISAPA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH
YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE (配列番号49)
と関連するタンパク質配列が、例示的である。
GM−CSFを組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、GM−CSFを、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(http://www.linscottsdirectory.com)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「IL−12」(「インターロイキン12」としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、IL−12と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、IL−12配列の例を提示するが、これは、単鎖IL−12、IL−12A(GenBank受託番号:NC_000003.11、NT_005612.17、NC_018914.2)、およびIL−12B(GenBank受託番号:NC_000005.9、NC_018916.2、NT_023133.14)など、成熟形態のIL−12ならびにその改変体および断片を含むがこれらに限定されない。米国特許第8,556,882号において開示されている配列と関連するタンパク質配列、例えば、配列番号50の配列によりコードされる単鎖IL−12は、例示的である。IL−12を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、IL−12を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(http://www.linscottsdirectory.com)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「IL−2」(「インターロイキン2」としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、IL−2と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。非限定的な例は、天然ヒトIL−2の全長配列を提示する配列番号51:
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
である。
「低毒性IL−2」という用語は、類似の生物学的機能を呈するが、対象へと投与された場合に毒性がより低い、IL−2の修飾バージョンを指す。一部の実施形態では、低毒性IL−2は、野生型IL−2と比較して、血管透過性が低減される変異を含む。米国特許第7,371,371号は、ヒトIL−2のアミノ酸位置22〜58の間の、野生型IL−2の透過性増強領域内の、例示的な変異について開示している。非限定的な例は、ヒト配列内の38位における、RからWへの変異を含む。米国特許第7,371,371号は、IL−2の透過性増強領域の外側の、1または複数の位置において変異を含む低毒性IL−2についてもさらに開示している。
本明細書で使用される場合、「IL−15」(「インターロイキン15」としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、IL−15と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、IL−15配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000004.11、NC_018915.2、NT_016354.20、NP_000576.1、NP_751915.1と関連するタンパク質配列が、例示的である。非限定的な例は、配列番号52によりコードされる成熟タンパク質を含む。Il−15を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、Il−15を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(上記で言及したlinscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「IL−18」(「インターロイキン18」、IGIF、「インターロイキン1ガンマ」、IL1F4、IFNガンマ誘導性因子、IL−1gとしてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、IL−18と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、IL−18配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000011.9、NC_018922.2、NT_033899.9、NP_001230140.1、NP_001553.1と関連するタンパク質配列が、例示的である。非限定的な例は、配列番号53によりコードされる成熟タンパク質を含む。IL−18を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、IL−18を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(上記で言及したlinscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「IL−21」(「インターロイキン21」;Za11;CVID11としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、IL−21と、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、IL−21配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000004.11、NC_018915.2、NT_016354.20と関連するタンパク質配列が、例示的である。非限定的な例は、配列番号54によりコードされる成熟タンパク質を含む。Il−21を組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、Il−21を、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(上記で言及したlinscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「LEC」(CCL16;LMC;NCC4;CKb12;HCC−4;LCC−1;Mtn−1;NCC−4;SCYL4;ILINCK;SCYA16としてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、LECと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、LEC配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000017.10、NT_010783.16、NT_187614.1、NC_018928.2、NP_004581.1と関連するタンパク質配列が、例示的である。
非限定的な例は、NP_004581.1、配列番号55:
MKVSEAALSL LVLILIITSA SRSQPKVPEW VNTPSTCCLK YYEKVLPRRL VVGYRKALNC HLPAIIFVTK RNREVCTNPN DDWVQEYIKD PNLPLLPTRN LSTVKIITAK NGQPQLLNSQ
を含む。
LECを組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、LECを、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(上記で言及したlinscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される場合、「OX40L」(TNFSF4;GP34;CD252;TXGP1;CD134L;OX−40Lとしてもまた公知である)という用語は、この名称と関連する特異的分子と、類似の生物学的機能を有する他の任意の分子であって、OX40Lと、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。本明細書では、OX40L配列の例が提示される。加えて、GenBank受託番号:NC_000001.10、NT_004487.20、NC_018912.2、NP_003317.1と関連するタンパク質配列が、例示的である。
非限定的な例は、NP_003317.1、配列番号56:
MERVQPLEEN VGNAARPRFE RNKLLLVASV IQGLGLLLCF TYICLHFSAL QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEF CVL
を含む。
OX40Lを組成物の一部として投与する、一部の実施形態では、OX40Lを、合成することもでき、任意の利用可能な商業的供給源から購入することもできる。このような供給源は、Santa Cruz Biosciences、Origene、ならびに精製タンパク質およびそれらの修飾バージョンの他の販売元を含む。商業的供給源のリストは、Linscott’s Directory of Immunological & Biological Reagents(上記で言及したlinscottsdirectory.comを参照されたい)において見出すことができる。
本明細書で使用される「単離された」という用語は、他の材料を実質的に含まない、分子または生物学的薬剤または細胞材料を指す。一態様では、「単離された」という用語は、天然の供給源中に存在する、他のDNAもしくはRNA、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官のそれぞれから分離された、DNAもしくはRNAなどの核酸、またはタンパク質もしくはポリペプチド(例えば、抗体またはその誘導体)、または細胞もしくは細胞小器官、または組織もしくは器官を指す。「単離された」という用語はまた、組換えDNA法により作製される場合、細胞材料、ウイルス材料、もしくは培養培地を実質的に含まない核酸もしくはペプチド、または化学合成される場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない核酸もしくはペプチドも指す。さらに、「単離核酸」とは、断片としては天然に存在しておらず、天然の状態では見出されない核酸断片を含むことを意図する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、他の細胞性タンパク質から単離されたポリペプチドを指すようにも使用され、精製ポリペプチドおよび組換えポリペプチドの両方を包含することを意図する。本明細書では、「単離された」という用語はまた、他の細胞または組織から単離された細胞または組織を指すようにも使用され、培養細胞または培養組織および操作細胞または操作組織の両方を包含することを意図する。
本明細書で使用される場合、「単離細胞」という用語は一般に、組織の他の細胞から実質的に分離された細胞を指す。
「免疫細胞」とは、例えば、骨髄中で産生される造血幹細胞(HSC)、リンパ球(T細胞、B細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞)、および骨髄由来細胞(好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞)に由来する白血球(white blood cell(leukocyte))を含む。
本明細書で使用される場合、「リンカー配列」という用語は、1〜10回、または代替的に、1〜約8回、または代替的に、1〜約6回、または代替的に、約5もしくは4回、または代替的に、3回、または代替的に、2回反復されうる、1〜10、または代替的に、8アミノ酸、または代替的に、6アミノ酸、または代替的に、5アミノ酸を含む、任意のアミノ酸配列に関する。例えば、リンカーは、3回反復されるペンタペプチドからなる、最大で15アミノ酸残基を含みうる。一態様では、リンカー配列は、gly−gly−gly−gly−ser(配列番号68)の3つのコピーを含む、(グリシン4セリン)3の可撓性ポリペプチドリンカー(配列番号67)である。
「腫瘍組織型に対応する正常細胞」とは、腫瘍組織と同じ組織型に由来する正常細胞を指す。非限定的な例は、肺腫瘍を有する患者に由来する正常肺細胞、または結腸腫瘍を有する患者に由来する正常結腸細胞である。
本明細書で使用される場合、「NFAT調節性ポリヌクレオチド」という用語は、転写因子の活性化T細胞核因子(「NFAT」)ファミリーと相互作用するポリヌクレオチドを指す。NFATは、大半の免疫細胞内で発現するカルシニューリン依存性転写因子のコレクションを指し、T細胞内の遺伝子転写の活性化において、重要な役割を果たす(Fric, J.ら(2012年)、Blood、120巻(7号):1380〜1389頁)。特に、NFATは、免疫応答中に、多数の遺伝子(最も注目すべきものとしてIL−2、IL−4、TNF−α、およびIFN−γ)の転写を制御する(Fric, J.ら(2012年)、Blood、120巻(7号):1380〜1389頁;Rao, A.ら(1997年)、Annu Rev Immunol.、15巻:707〜747頁;Hogan, P.G.ら(2003年)、Genes Dev.、17巻(18号):2205〜2232頁)。NFATと相互作用するポリヌクレオチドの例は、
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCG (配列番号57)およびその同等物である。
本明細書で使用される場合、「T細胞」という用語は、胸腺内で成熟するリンパ球の種類を指す。T細胞は、細胞媒介性免疫において重要な役割を果たし、B細胞など、他のリンパ球から、細胞表面上のT細胞受容体の存在により識別される。T細胞は、単離することもでき、商業的に利用可能な供給源から得ることもできる。「T細胞」は、CD3を発現させる、全ての種類の免疫細胞であって、ヘルパーT細胞(CD4+細胞)、細胞傷害性T細胞(CD8+細胞)、ナチュラルキラーT細胞、調節性T細胞(Treg)、およびガンマ−デルタT細胞を含む免疫細胞を含む。「細胞傷害性細胞」は、細胞傷害応答を媒介することが可能な細胞である、CD8+ T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、および好中球を含む。市販のT細胞株の非限定的な例は、細胞株である、BCL2(AAA)Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2902(商標))、BCL2(S70A)Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2900(商標))、BCL2(S87A)Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2901(商標))、BCL2 Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2899(商標))、Neo Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2898(商標))、TALL−104ヒト細胞傷害性T細胞株(ATCC #CRL−11386)を含む。さらなる例は、例えば、Deglis、EBT−8、HPB−MLp−W、HUT 78、HUT 102、Karpas 384、Ki 225、My−La、Se−Ax、SKW−3、SMZ−1、およびT34などの成熟T細胞株;ならびに未成熟T細胞株、例えば、ALL−SIL、Be13、CCRF−CEM、CML−T1、DND−41、DU.528、EU−9、HD−Mar、HPB−ALL、H−SB2、HT−1、JK−T1、Jurkat、Karpas 45、KE−37、KOPT−K1、K−T1、L−KAW、Loucy、MAT、MOLT−1、MOLT 3、MOLT−4、MOLT 13、MOLT−16、MT−1、MT−ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER−255、PF−382、PFI−285、RPMI−8402、ST−4、SUP−T1〜SUP−T14、TALL−1、TALL−101、TALL−103/2、TALL−104、TALL−105、TALL−106、TALL−107、TALL−197、TK−6、TLBR−1、TLBR−2、TLBR−3、およびTLBR−4、CCRF−HSB−2(CCL−120.1)、J.RT3−T3.5(ATCC TIB−153)、J45.01(ATCC CRL−1990)、J.CaM1.6(ATCC CRL−2063)、RS4;11(ATCC CRL−1873)、CCRF−CEM(ATCC CRM−CCL−119);ならびに皮膚T細胞リンパ腫細胞株、例えば、HuT78(ATCC CRM−TIB−161)、MJ[G11](ATCC CRL−8294)、HuT102(ATCC TIB−162)を含むがこれらに限定されない。REH、NALL−1、KM−3、L92−221を含むがこれらに限定されないヌル白血病細胞株は、K562赤白血病、THP−1単球性白血病、U937リンパ腫、HEL赤白血病、HL60白血病、HMC−1白血病、KG−1白血病、U266骨髄腫などの他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株と同様、免疫細胞の、別の商業的に利用可能な供給源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、American Type Culture CollectionすなわちATCC(http://www.atcc.org/)およびGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures(https://www.dsmz.de/)を含む。
本明細書で使用される場合、ナチュラルキラー細胞としてもまた公知の「NK細胞」という用語は、骨髄に由来し、生得性免疫系において極めて重要な役割を果たすリンパ球の種類を指す。NK細胞は、抗体および細胞表面上の主要組織適合性複合体の非存在下であってもなお、ウイルス感染細胞、腫瘍細胞、またはストレスを受けた他の細胞に対して、迅速な免疫応答をもたらす。NK細胞は、単離することもでき、商業的に利用可能な供給源から得ることもできる。市販のNK細胞株の非限定的な例は、細胞株である、NK−92(ATCC(登録商標)CRL−2407(商標))、NK−92MI(ATCC(登録商標)CRL−2408(商標))を含む。さらなる例は、NK細胞株である、HANK1、KHYG−1、NKL、NK−YS、NOI−90、およびYTを含むがこれらに限定されない。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、American Type Culture CollectionすなわちATCC(http://www.atcc.org/)およびGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures(https://www.dsmz.de/)を含む。
調節性ポリヌクレオチドに言及して本明細書で使用される場合、「作動的に連結された」という用語は、調節性ポリヌクレオチドと、それが連結されるポリヌクレオチド配列との会合であって、特異的なタンパク質が、調節性ポリヌクレオチドに結合すると、連結されたポリヌクレオチドが転写されるような会合を指す。
本明細書で使用される場合、細胞、組織、または器官に関して、「〜を過剰発現させる」という用語は、タンパク質を、対照細胞、対照組織、または器官内で産生される量を超える量まで発現させることを意味する。過剰発現するタンパク質は、宿主細胞に対して内因性の場合もあり、宿主細胞に対して外因性の場合もある。
「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはそれらの類似体である、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有することが可能であり、公知または未知の任意の機能を果たしうる。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子または遺伝子断片(例えば、プローブ、プライマー、ESTまたはSAGEタグ)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、転移RNA、リボソームRNA、RNAi、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含みうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリヌクレオチドのアセンブリーの前に付与することもでき、その後に付与することもできる。ヌクレオチドの配列は、ヌクレオチド以外の構成要素で中断させることができる。ポリヌクレオチドは、標識化構成要素とのコンジュゲーションを介するなど、重合化の後でさらに修飾することができる。用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。そうでないことが指定または要求されない限りにおいて、ポリヌクレオチドである本技術の任意の態様は、二本鎖形態と、二本鎖形態を構成することが公知であるかまたは予測される、2つの相補的な一本鎖形態の各々との両方を包含する。
本明細書で使用される場合、「核酸配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチドであれ、デオキシリボヌクレオチドであれ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指すように互換的に使用される。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、または多重鎖の、DNAまたはRNA、ゲノムDNA、cDNA、DNA−RNAハイブリッド体、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然のヌクレオチド塩基、化学的もしくは生化学的に修飾されたヌクレオチド塩基、非天然のヌクレオチド塩基、または誘導体化ヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、遺伝子など、コード配列の発現を調節する、任意の配列を指す。プロモーターは、例えば、構成的、誘導的、抑制的、または組織特異的でありうる。「プロモーター」とは、転写の開始および速度を制御するポリヌクレオチド配列の領域である、制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合しうる遺伝子エレメントを含有しうる。
「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は、2つまたはこれを超えるサブユニットのアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を指すように、互換的に、かつ、それらの最も広い意味で使用する。サブユニットは、ペプチド結合で連結することができる。別の実施形態では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどで連結することができる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含有しなければならないが、アミノ酸の最大数には、限定がなされず、タンパク質の配列を含む場合もあり、ペプチドの配列を含む場合もある。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシン、ならびにD光学異性体およびL光学異性体の両方、アミノ酸類似体およびペプチド模倣体を含む、天然および/または非天然もしくは合成のアミノ酸を指す。
本明細書で使用される場合、「精製された」という用語は、絶対的な純度を要求するのではなく、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物とは、全部または一部において、タンパク質または他の夾雑物から単離された、核酸、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物である。一般に、本開示の範囲内の使用のための、実質的に精製されたペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物の、治療的投与のための完全医薬製剤中の、医薬担体、賦形剤、緩衝液、吸収増強剤、安定化剤、保存剤、アジュバントまたは他の共成分(co−ingredient)との混合または製剤化の前に、調製物中に存在する、全ての高分子種のうちの80%超を構成する。より典型的には、ペプチド、タンパク質、生物学的複合体、または他の活性化合物は、他の製剤成分との混合の前に、精製調製物中に存在する、全ての高分子種のうちの90%超、しばしば95%超を表すように精製する。他の場合、精製調製物は、本質的に均質であることが可能であり、この場合、従来の技法では、他の高分子種は、検出可能でない。
本明細書で使用される場合、「精製マーカー」という用語は、精製または同定に有用な、少なくとも1つのマーカーを指す。このマーカーの非網羅的なリストは、His、lacZ、GST、マルトース結合性タンパク質、NusA、BCCP、c−myc、CaM、FLAG、GFP、YFP、cherry、チオレドキシン、poly(NANP)、V5、Snap、HA、キチン結合性タンパク質、Softag 1、Softag 3、Strep、またはSタンパク質を含む。適切な直接的または間接的蛍光マーカーは、FLAG、GFP、YFP、RFP、dTomato、cherry、Cy3、Cy5、Cy5.5、Cy7、DNP、AMCA、ビオチン、ジゴキシゲニン、Tamra、Texas Red、ローダミン、Alexa fluor、FITC、TRITC、または他の任意の蛍光色素もしくはハプテンを含む。
本明細書で使用される場合、「組換えタンパク質」という用語は、組換えDNA法により作製されるポリペプチドを指し、この場合、一般に、ポリペプチドをコードするDNAを、適切な発現ベクターへと挿入し、次にこれを使用して、異種タンパク質を作製するように、宿主細胞を形質転換する。
本明細書で使用される場合、「特異的結合」という用語は、抗体と抗原との、少なくとも10−6Mの結合アフィニティーによる接触を意味する。ある特定の態様では、抗体は、少なくとも約10−7M、好ましくは、10−8M、10−9M、10−10M、10−11M、または10−12Mのアフィニティーで結合する。
「充実性腫瘍」とは、通例、嚢胞も液体領域も含有しない、組織の異常な塊である。充実性腫瘍は、良性の場合もあり、悪性の場合もあり、転移性の場合もあり、非転移性の場合もある。異なる種類の充実性腫瘍は、それらを形成する細胞型にちなんで名付けられている。充実性腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫を含む。
キメラ抗原受容体細胞の作製に適用される場合の、「形質導入する」または「形質導入」という用語は、外来のヌクレオチド配列を、細胞へと導入する工程を指す。一部の実施形態では、この形質導入は、ベクターを介して行う。
本明細書で使用される場合、対象における疾患「を処置すること」またはその「処置」とは、(1)疾患の素因があるか、もしくはその症状をいまだ提示していない対象において、症状もしくは疾患が生じることを防止すること;(2)疾患を阻害するか、もしくはその発症を停止させること;または(3)疾患もしくは疾患の症状を改善するか、もしくは退縮を引き起こすことを指す。当技術分野で理解される通り、「処置」とは、臨床結果を含む、有益なまたは所望の結果を得るための手法である。本技術の目的では、有益なまたは所望の結果は、検出可能であれ、検出不能であれ、1または複数の症状の緩和または改善、状態(疾患を含む)の広がりの減殺、状態(疾患を含む)の安定した(すなわち、増悪させない)状況、状態(疾患を含む)の進行の遅延または緩徐化、状態(疾患を含む)の改善または軽減、および寛解(部分的であれ、完全であれ)のうちの1または複数を含みうるがこれらに限定されない。開示される組成物および方法を含有する処置は、第1選択、第2選択、第3選択、第4選択、第5選択治療であることが可能であり、単独の治療として、または他の適切な療法と組み合わせて使用することを意図する。
本明細書で使用される場合、「ベクター」という用語は、異なる宿主間の移入のためにデザインされた核酸構築物であって、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、BAC、YACなどを含むがこれらに限定されない核酸構築物を指す。一部の実施形態では、プラスミドベクターは、市販のベクターから調製することができる。他の実施形態では、ウイルスベクターは、当技術分野で公知の技法に従い、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、AAVなどから作製することができる。一実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
本明細書で使用される場合、「WPRE」または「ウッドチャック肝炎ウイルス(WHP)転写後調節エレメント」という用語は、この名称と関連する特異的ヌクレオチド断片と、類似の生物学的機能を有し、本明細書で示されるWPRE配列と、少なくとも70%、または代替的に、少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、好ましくは90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも95%の配列同一性を共有する他の任意の分子とを指す。例えば、WPREとは、ウッドチャック肝炎ウイルスゲノム配列(GenBank受託番号:J04514)内に存在する、ヒトB型肝炎ウイルス転写後調節エレメント(HBVPRE)と同様の領域を指し、このゲノムの配列のうちの、1093〜1684位の592ヌクレオチドが、転写後調節領域に対応することを指す(Journal of Virology、72巻、5085〜5092頁、1998年)。レトロウイルスベクターを使用する解析は、目的の遺伝子の3’末端非翻訳領域へと挿入されたWPREが、産生されるタンパク質の量を、5〜8倍増大させることを明らかにした。また、WPREの導入が、mRNAの分解を抑制することも報告されている(Journal of Virology、73巻、2886〜2892頁、1999年)。広い意味では、mRNAを安定化させることにより、アミノ酸への翻訳の効率を増大させる、WPREなどのエレメントもまた、エンハンサーであると考えられる。
上記で列挙したGenBank受託番号および参考文献の各々と関連する配列は、参照により本明細書に組み込まれる。
略語一覧
CAR:キメラ抗原受容体
HLA:組織適合性リンパ球抗原
IL:インターロイキン
Ip:腹膜内
IRES:内部リボソーム侵入部位
LEC:肝臓発現ケモカイン(liver−expressed chemokine)
MFI:平均蛍光強度
MOI:感染多重度
PBMC:末梢血単核細胞
PBS:リン酸緩衝食塩水
scFv:単鎖可変断片
TNT:腫瘍壊死療法
WPRE:ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント
本開示を実行するための様態
がん治療剤としての、免疫調節性分子の投与が追求されている。しかし、全身投与に随伴する重度の副作用(Giovarelli, M.ら(2000年)、J Immunol.、164巻:3200〜3206頁;Lasek, W.ら(2014年)、Cancer Immunol Immunother.、63巻:419〜435頁)のために、有効な免疫応答を達成するために、対象となる腫瘍内で、高濃度のこれらの免疫調節性分子を得ることは困難であった。
遺伝子操作されたキメラ抗原受容体(CAR)T細胞による自家処置を使用して、B細胞性リンパ腫および白血病において最近得られつつある、いまだかつてない結果(Maude, S. L.ら(2014年)、New Engl. J. Med.、371巻:1507〜1517頁;Porter, D. L.ら(2011年)、New Engl. J. Med.、365巻:725〜733頁)のために、いくつかの研究室が、この手法を、卵巣がん、前立腺がん、および膵臓腫瘍を含む充実性腫瘍に適用し始めている。CAR改変T細胞は、モノクローナル抗体の、HLAに依存しない標的化特異性を、活性化T細胞の、細胞溶解活性、増殖、およびホーミング特性と組み合わせるが、チェックポイント抑制に応答しない。抗原を発現させる標的を直接死滅させるそれらの能力のために、CAR T細胞は、任意の抗原陽性細胞または組織に対して高度に毒性であることから、高度に腫瘍特異的な抗体を伴うCARを構築することが要件となっている。現況では、ヒト充実性腫瘍に対するCAR改変T細胞は、α−葉酸受容体、メソテリン、およびMUC−CD、PSMA、ならびに他の標的に対して構築されているが、大半は、正常組織内で、ある程度の抗原オフターゲット発現を示す。これらの構築物は、患者において、同じ例外的な結果を示していないことから、充実性腫瘍に対して使用しうる、新規の標的およびCAR T細胞の構築法を同定するためのさらなる研究に対する必要が強調される。
したがって、本開示は、一部の態様では、TNT抗体の抗原結合性ドメインである、TNT関連抗原に特異的な結合性ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)、ならびにその使用および作製と関連する、方法および組成物を提示する。
キメラ抗原受容体およびそれらの使用
I.構成要素
本開示は、TNT関連抗原に結合するキメラ抗原受容体(CAR)であって、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む細胞活性化部分を含むか、またはこれから本質的になるか、またはこれからなるCARを提示する。細胞外ドメインは、他に抗原結合性ドメインと称する、標的特異的な結合性エレメントを含む。細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、共刺激性シグナル伝達領域およびゼータ鎖部分を含む。CARは、任意選択で、最大で300アミノ酸、好ましくは10〜100アミノ酸、より好ましくは25〜50アミノ酸のスペーサードメインをさらに含みうる。
抗原結合性ドメイン。ある特定の態様では、本開示は、TNT関連抗原に特異的な抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCARを提示する。TNTとは、腫瘍壊死療法の頭字語である。「腫瘍壊死療法(TNT)関連抗原」とは、死につつある細胞では、全抗原、エピトープ、またはそれらの断片が保持されるが、正常では、細胞死の場合を除き、全抗原、エピトープ、またはそれらの断片が露出されない抗原である。このようなTNT関連抗原の非限定的な例は、通例、細胞死の後に限り接近可能となるDNAまたはDNA/ヒストン標的であり、例えば、TNT−1は、ヒストンH1の部分に結合する。また、ヒストン標的でもある、他のTNT関連抗原は、H2A、H2B、H3、H4、H5、および/または他のヒトもしくは動物ヒストンを含むがこれらに限定されない。他のTNT関連抗原は、一本鎖DNAおよび異質染色質のDNAを含むがこれらに限定されない。抗原結合性ドメインは、抗体である、TNT−1、TNT−2、TNT−3、またはNHS76の抗原結合性ドメインを含みうるか、これらから本質的になりうるか、またはなおさらにこれらからなりうる。
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、TNT抗体またはTNT関連抗原に結合する抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなる。これらの抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体は市販されており、例えば、2015年4月10日に最後にアクセスしたウェブアドレス:biocompare.com/pfu/110447/soids/123510/Antibodies/TNTを参照されたい。一態様では、抗原結合性ドメインは、TNT抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。非限定的な実施形態では、TNT抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、TNT抗体の抗原結合性ドメインを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおこれからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列:(i) GFSLTDYG (配列番号1), (ii) GYSFTGYY (配列番号9), (iii) GYTFTRYW (配列番号17), (iv) SGYYWG (配列番号25)、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる50アミノ酸、または代替的に約40アミノ酸、または代替的に約30アミノ酸、または代替的に約20アミノ酸、または代替的に約10アミノ酸、または代替的に約5アミノ酸、または代替的に約4、もしくは3、もしくは2、もしくは1アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDRH1配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列:(i) IWGGGST (配列番号2), (ii) INPYNGAT (配列番号10), (iii) IYPGNSDT (配列番号18), (iv) SIYHSGSTYYNPSLKS (配列番号26)、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる50アミノ酸、または代替的に約40アミノ酸、または代替的に約30アミノ酸、または代替的に約20アミノ酸、または代替的に約10アミノ酸、または代替的に約5アミノ酸、または代替的に約4、もしくは3、もしくは2、もしくは1アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDRH2配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、以下の配列:(i) AKEKRRGYYYAMDY (配列番号3), (ii) ARLDRGDY (配列番号11), (iii) ARGEEIGVRRWFAY (配列番号19), (iv) GKWSKFDY (配列番号27)、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる50アミノ酸、または代替的に約40アミノ酸、または代替的に約30アミノ酸、または代替的に約20アミノ酸、または代替的に約10アミノ酸、または代替的に約5アミノ酸、または代替的に約4、もしくは3、もしくは2、もしくは1アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDRH3配列を含む。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列:
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGACTATGGTGTAAGGTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGGTGGAAGCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAAAGAGAAACGGAGGGGGTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (配列番号7)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列:
GAGGTACAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACTAGACCGGGGGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (配列番号15)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列:
CAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGACTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGATACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGCTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAATAGTGATACTAGCTACTACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCTGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGAGGAAATAGGGGTACGACGCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA (配列番号23)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、重鎖可変領域は、下記で言及されるポリヌクレオチド配列:
CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC CGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CCTGTCCCTC ACCTGCGCTG TCTCTGGTTA CTCCATCAGC AGTGGTTACT ACTGGGGCTG GATTCGGCAG CCCCCAGGGA AGGGGCTGGA GTGGATTGGG AGTATCTATC ATAGTGGGAG CACCTACTAC AACCCGTCCC TCAAGAGTCG AGTCACCATA TCAGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC CTGAAGCTGA GCTCTGTGAC CGCCGCAGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGGGAAG TGGTCGAAGT TTGACTATTG GGGCCAAGGC ACCCTGGTCA CCGTCTCTTC A
(配列番号31)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の配列:(i) SSVSSSY (配列番号4), (ii) ENVVTY (配列番号12), (iii) QSISNY (配列番号20), (iv) QGDSLRSYYAS (配列番号28)、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる50アミノ酸、または代替的に約40アミノ酸、または代替的に約30アミノ酸、または代替的に約20アミノ酸、または代替的に約10アミノ酸、または代替的に約5アミノ酸、または代替的に約4、もしくは3、もしくは2、もしくは1アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDRL1配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の配列:(i) STS (配列番号5), (ii) GAS (配列番号13), (iii) YAS (配列番号21), (iv) GKNNRPS (配列番号29)、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる50アミノ酸、または代替的に約40アミノ酸、または代替的に約30アミノ酸、または代替的に約20アミノ酸、または代替的に約10アミノ酸、または代替的に約5アミノ酸、または代替的に約4、もしくは3、もしくは2、もしくは1アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDRL2配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、以下の配列:(i) QQYSGYPLT (配列番号6), (ii) GQGYSYPYT (配列番号14), (iii) QQSNSWPLT (配列番号22), (iv) NSRDSSGNHVV (配列番号30)、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つで始まり、カルボキシ末端における、さらなる50アミノ酸、または代替的に約40アミノ酸、または代替的に約30アミノ酸、または代替的に約20アミノ酸、または代替的に約10アミノ酸、または代替的に約5アミノ酸、または代替的に約4、もしくは3、もしくは2、もしくは1アミノ酸を後続させるアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなるCDRL3配列を含む。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列:
GGAGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCACTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (配列番号8)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列:
AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGTACG (配列番号16)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列:
GATATTGTGCTAACTCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGACTCCAGGAGATAGAGTCAGTCTTTCCTGCAGGGCCAGGCAAAGTATTAGCAACTACCTACACTGGTATCAACAAAAATCACATGAGTCTCCAAGGCTTCTCATCAAGTATGCTTCCCAGTCCATCTCTGGCATCCCCTCCAGGTTCAGTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACTCTCAGTATCAACAGTGTGGAGACTGAAGATTTTGGAATGTATTTCTGTCAACAGAGTAACAGCTGGCCGCTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAAATAAAA (配列番号24)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、軽鎖可変領域は、ポリヌクレオチド配列:
TCCTCTGAGC TGACTCAGGA CCCTGCTGTG TCTGTGGCCT TGGGACAGAC AGTCAGGATC ACATGCCAAG GAGACAGCCT CAGAAGCTAT TATGCAAGCT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA CAGGCCCCTG TACTTGTCAT CTATGGTAAA AACAACCGGC CCTCAGGGAT TCCAGACCGA TTCTCTGGCT CCAGCTCAGG AAACACAGCT TCCTTGACCA TCACTGGGGC TCAGGCGGAA GATGAGGCTG ACTATTACTG TAACTCCCGG GACAGCAGTG GTAACCATGT GGTATTCGGC GGAGGGACCA AGCTGACCGT CCTA (配列番号32)によりコードされるポリペプチドもしくはその抗原結合性断片、またはそれらの各々の同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
本開示の別の態様では、TNT抗体の抗原結合性ドメインは、以下の特徴:
(a)軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインのCDRと少なくとも80%同一である、1または複数のCDRを含むこと;
(b)重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインのCDRと少なくとも80%同一である、1または複数のCDRを含むこと;
(c)軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される軽鎖配列のうちのいずれかの軽鎖可変ドメインと少なくとも80%同一であること;
(d)HC免疫グロブリン可変ドメイン配列が、開示される重鎖配列のうちのいずれかの重鎖可変ドメインと少なくとも80%同一であること;および
(e)抗体が、開示される配列のうちのいずれかが結合するエピトープと重なり合うエピトープに結合すること
のうちの1または複数を含む。
同等物のさらなる例は、ペプチドに対して少なくとも85%、もしくは代替的に少なくとも90%、もしくは代替的に少なくとも95%、もしくは代替的に少なくとも97%のアミノ酸同一性を有するペプチド、または抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含み、この場合、高ストリンジェンシーの条件は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
例示的な抗原結合性ドメインは、下記で言及されるペプチドのうちの1または複数を含むことが可能であり、一態様では、特定の抗原について言及されるHCおよびLCの3つのCDRの全てであって、表1および表2のそれぞれにおいて開示されるCDRの全てを含みうる。
一態様では、本開示は、TNT−1、TNT−2、TNT−3、およびNHS76からなる群より選択される抗体と少なくとも80%、または代替的に85%、または代替的に90%、または代替的に95%、または代替的に少なくとも97%同一である抗体の抗原結合性ドメインを提示する。同等物のさらなる例は、抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含み、この場合、高ストリンジェンシーの条件は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、HC可変ドメイン配列は、TNT−1の可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、TNT−1の可変ドメイン配列を含む。
一態様では、本開示は、TNT−1のCDRを含む抗体の抗原結合性ドメインを提示する。一態様では、本開示は、TNT−1のCDRと少なくとも85%、もしくは代替的に80%、もしくは代替的に85%、もしくは代替的に90%、もしくは代替的に95%、もしくは代替的に少なくとも97%同一である抗体の抗原結合性ドメイン、またはTNTのCDRをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提示し、この場合、高ストリンジェンシーの条件は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、HC可変ドメイン配列は、TNT−2の可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、TNT−2の可変ドメイン配列を含む。
一態様では、本開示は、TNT−2のCDRを含む抗体の抗原結合性ドメインを提示する。一態様では、本開示は、TNT−2のCDRと少なくとも85%、もしくは代替的に80%、もしくは代替的に85%、もしくは代替的に90%、もしくは代替的に95%、もしくは代替的に少なくとも97%同一である抗体の抗原結合性ドメイン、またはTNT−2のCDRをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提示し、この場合、高ストリンジェンシーの条件は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、HC可変ドメイン配列は、TNT−3の可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、TNT−3の可変ドメイン配列を含む。
一態様では、本開示は、TNT−3のCDRを含む抗体の抗原結合性ドメインを提示する。一態様では、本開示は、TNT−3のCDRと少なくとも85%もしくは代替的に85%、もしくは代替的に90%、もしくは代替的に95%、もしくは代替的に少なくとも97%同一である抗体の抗原結合性ドメイン、またはTNT−3のCDRをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提示し、この場合、高ストリンジェンシーの条件は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
本明細書で提示される抗体についての一部の態様では、HC可変ドメイン配列は、NHS76の可変ドメイン配列を含み、LC可変ドメイン配列は、NHS76の可変ドメイン配列またはそれらの各々の同等物を含む。
一態様では、本開示は、NHS76のCDRを含む抗体の抗原結合性ドメインを提示する。一態様では、本開示は、NHS76と少なくとも80%同一、もしくはNHS76のCDRと少なくとも85%、もしくは代替的に85%、もしくは代替的に90%、もしくは代替的に95%、もしくは代替的に少なくとも97%同一である抗体の抗原結合性ドメイン、またはNHS76のCDRをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを提示し、この場合、高ストリンジェンシーの条件は、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む。
膜貫通ドメイン。膜貫通ドメインは、天然の供給源から導出することもでき、合成の供給源から導出することもできる。供給源が、天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。本開示で特に使用される膜貫通領域は、CD8、CD28、CD3、CD45、CD4、CD5、CDS、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRに由来しうる。代替的に、膜貫通ドメインは、合成であることが可能であり、この場合、膜貫通ドメインは主に、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含むであろう。フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三残基の組(triplet)が、合成の膜貫通ドメインの各末端において見出されることが好ましい。任意選択で、好ましくは、2〜10アミノ酸の間の長さの、短鎖オリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、CARの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの連結を形成しうる。グリシン−セリンの二残基の組(doublet)は、特に適切なリンカーをもたらす。
細胞質ドメイン。CARの細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインは、CARが配置された免疫細胞の、従来のエフェクター機能のうちの少なくとも1つの活性化を担う。細胞内シグナル伝達ドメインとは、エフェクター機能シグナルを伝達し、免疫細胞を、その特異的機能を果たすように導く、タンパク質の部分を指す。シグナル伝達ドメインの全体を使用することもでき、切断部分が、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分である限りにおいて、その切断部分を使用することもできる。TCRおよび共受容体のほか、それらの誘導体または改変体の細胞質配列は、CARにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインとして機能しうる。本開示で特に使用される細胞内シグナル伝達ドメインは、FcR、TCR、CD3、CDS、CD22、CD79a、CD79b、CD66dに由来しうる。TCRを介して発生するシグナルは、単独では、T細胞の完全な活性化には不十分であるので、二次シグナルまたは共刺激性シグナルもまた、要求されうる。したがって、CD27、CD28、4−1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD−1、ICOS、リンパ球機能関連抗原1(LFA−1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7−H3、またはCD83に特異的に結合するリガンドを含むがこれらに限定されない共刺激性シグナル伝達分子の細胞内領域もまた、CARの細胞質ドメインに組み入れることができる。
一部の実施形態では、キメラ抗原受容体の細胞活性化部分は、CD8タンパク質、CD28タンパク質、4−1BBタンパク質、およびCD3−ゼータタンパク質からなる群より選択される、1もしくは複数のタンパク質またはそれらの断片を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる、T細胞シグナル伝達ドメインである。
具体的な実施形態では、CARは、TNT抗体の抗原結合性ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、共刺激性シグナル伝達領域、およびCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおこれらからなる。さらなる実施形態では、共刺激性シグナル伝達領域は、CD28共刺激性シグナル伝達領域および4−1BB共刺激性シグナル伝達領域の一方または両方を含む。
一部の実施形態では、CARは、検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含みうる。別の態様では、本明細書で記載されるCARは、組成物中、例えば、診断または治療のための、薬学的に許容される担体中に含有される。
II.TNT抗体を調製するための工程
本開示における使用のための抗体は、購入することもでき、当技術分野で公知であり、本明細書で簡略に記載される方法を使用して調製することもできる。それらの製造および使用については周知であり、例えば、Harlow, E.およびLane, D.、Antibodies: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1999年において開示されている。抗体は、当技術分野で公知の標準的な方法を使用して作出することができる。抗体の例は、モノクローナル抗体、単鎖抗体、および抗体の機能的断片を含む(がこれらに限定されない)。
抗体は、一連の宿主、例えば、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、ヒト、および他の宿主において産生させることができる。宿主は、標的抗原またはTNT関連抗原のC末端断片もしくは単離ポリペプチドなど、免疫原特性を有するその断片もしくはオリゴペプチドを注射することにより免疫化することができる。宿主種に応じて、多様なアジュバントを添加および使用して、免疫学的応答を増大させることができる。このようなアジュバントは、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、ならびにリソレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、スカシガイヘモシアニン、およびジニトロフェノールなどの界面活性物質を含むがこれらに限定されない。ヒトにおいて使用されるアジュバントでは、BCG(カルメット−ゲラン桿菌)およびCorynebacterium parvumが特に有用である。本開示はまた、単離ポリペプチドおよびアジュバントも提示する。
ある特定の態様では、本開示の抗体は、ポリクローナル抗体、すなわち、異なるアミノ酸配列を有する、複数種類のTNT抗体の混合物である。一態様では、ポリクローナル抗体は、異なるCDRを有する、複数種類のTNT抗体の混合物を含む。したがって、異なる抗体を産生する細胞の混合物を培養し、結果として得られる培養物から精製された抗体を使用することができる(WO2004/061104を参照されたい)。
モノクローナル抗体の作製:TNT関連抗原に対するモノクローナル抗体は、培養物中の連続的な細胞株による抗体分子の産生をもたらす任意の技法を使用して調製することができる。このような技法は、ハイブリドーマ法(例えば、KohlerおよびMilstein、Nature、256巻:495〜497頁(1975年)を参照されたい);トリオーマ法;ヒトB細胞ハイブリドーマ法(例えば、Kozborら、Immunol. Today、4巻:72頁(1983年)を参照されたい)およびヒトモノクローナル抗体を作製するEBVハイブリドーマ法(例えば、Coleら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁(1985年)を参照されたい)を含むがこれらに限定されない。ヒトモノクローナル抗体は、本技術の実施において活用することができ、ヒトハイブリドーマを使用すること(例えば、Coteら、Proc. Natl. Acad. Sci.、80巻:2026〜2030頁(1983年)を参照されたい)により作製することもでき、in vitroにおいて、ヒトB細胞を、エプスタインバーウイルスで形質転換すること(例えば、Coleら、MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY、Alan R. Liss, Inc.、77〜96頁(1985年)を参照されたい)により作製することもできる。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団を単離することができる。抗体の保存的領域をコードする配列に由来するプライマーを活用するPCRを使用して、抗体の部分をコードする配列を、集団から増幅し、次いで、抗体または可変ドメインなど、それらの断片をコードするDNAを、増幅された配列から再構築する。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌上に、融合ポリペプチドを発現させ、提示するための他のタンパク質(例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質)をコードするDNAへと融合させることもできる。次いで、増幅された配列を発現させ、例えば、発現させた抗体またはその断片の、TNT関連抗原ポリペプチド上に存在する抗原またはエピトープに対するアフィニティーに基づき、さらに選択または単離することができる。代替的に、TNT関連抗原のモノクローナル抗体を発現させるハイブリドーマは、対象を、例えば、TNT関連抗原またはその断片のアミノ酸配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる単離ポリペプチドで免疫化し、次いで、慣例的な方法を使用して、ハイブリドーマを、対象の脾臓から単離することにより調製することができる。例えば、Milsteinら(GalfreおよびMilstein、Methods Enzymol、73巻:3〜46頁(1981年))を参照されたい。標準的な方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることにより、特異性(すなわち、異なるエピトープに対する)およびアフィニティーを変化させたモノクローナル抗体を作製する。所望の特性、例えば、TNT関連抗原への結合を伴う選択されたモノクローナル抗体は、(i)ハイブリドーマにより発現された形で使用することもでき、(ii)ポリエチレングリコール(PEG)などの分子に結合させて、その特性を変更することもでき、(iii)モノクローナル抗体をコードするcDNAを、単離し、配列決定し、多様な形で操作することができる。一態様では、抗TNTモノクローナル抗体は、ヒト重鎖導入遺伝子と、軽鎖導入遺伝子とを含むゲノムを有するトランスジェニックの非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたB細胞であって、不死化細胞へと融合させたB細胞を含むハイブリドーマにより作製する。ハイブリドーマ法は、当技術分野で公知であり、Harlowら、Antibodies:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor、N.Y.、349頁(1988年);Hammerlingら、Monoclonal Antibodies And T−Cell Hybridomas、563〜681頁(1981年)において教示されているハイブリドーマ法を含む。
ファージディスプレイ法:上記で言及した通り、本開示の抗体は、組換えDNAおよびファージディスプレイ技術の適用を介して作製することができる。例えば、TNT抗体は、当技術分野で公知の、多様なファージディスプレイ法を使用して調製することができる。ファージディスプレイ法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面に提示する。所望の結合特性を伴うファージは、抗原、典型的には、固体表面またはビーズに結合させるかまたは捕捉した抗原により、直接選択することにより、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(例えば、ヒトまたはマウス)から選択する。これらの方法において使用されるファージは典型的に、fdおよびM13を含む糸状ファージであって、Fab、F、またはジスルフィド安定化F抗体ドメインを、組換えにより、ファージ遺伝子IIIまたはVIIIタンパク質へと融合させた、糸状ファージである。加えて、方法を、Fab発現ライブラリーの構築(例えば、Huseら、Science、246巻:1275〜1281頁、1989年を参照されたい)に適応させて、TNT関連抗原ポリペプチド、例えば、ポリペプチド、またはその誘導体、断片、類似体、もしくは相同体に所望の特異性を伴うモノクローナルFab断片の迅速かつ有効な同定を可能とすることができる。本開示の単離抗体を作製するのに使用しうるファージディスプレイ法の他の例は、Hustonら、Proc. Natl. Acad. Sci.、U.S.A.、85巻:5879〜5883頁(1988年);Chaudharyら、Proc. Natl. Acad. Sci.、U.S.A.、87巻:1066〜1070頁(1990年);Brinkmanら、J. Immunol. Methods、182巻:41〜50頁(1995年);Amesら、J. Immunol. Methods、184巻:177〜186頁(1995年);Kettleboroughら、Eur. J. Immunol.、24巻:952〜958頁(1994年);Persicら、Gene、187巻:9〜18頁(1997年);Burtonら、Advances in Immunology、57巻:191〜280頁(1994年);PCT/GB91/01134;WO90/02809;WO91/10737;WO92/01047;WO92/18619;WO93/11236;WO95/15982;WO95/20401;WO96/06213;WO92/01047(Medical Research Councilら);WO97/08320(Morphosys);WO92/01047(CAT/MRC);WO91/17271(Affymax);ならびに米国特許第5,698,426号、同第5,223,409号、同第5,403,484号、同第5,580,717号、同第5,427,908号、同第5,750,753号、同第5,821,047号、同第5,571,698号、同第5,427,908号、同第5,516,637号、同第5,780,225号、同第5,658,727号、および同第5,733,743号において開示されているファージディスプレイ法を含む。
ジスルフィド結合を介してポリペプチドを接合させることにより、バクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドを提示するために有用な方法については、Lohning、米国特許第6,753,136号により記載されている。上記の参考文献に記載されている通り、ファージを選択した後で、ファージに由来する抗体をコードする領域を単離し、ヒト抗体を含む全抗体、または他の任意の所望の抗原結合性断片を作出し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含む、任意の所望の宿主内で発現させるのに使用することができる。例えば、WO92/22324;Mullinaxら、BioTechniques、12巻:864〜869頁(1992年);Sawaiら、AJRI、34巻:26〜34頁(1995年);およびBetterら、Science、240巻:1041〜1043頁(1988年)において開示されている方法など、当技術分野で公知の方法を使用して、組換えにより、Fab、Fab’、およびF(ab’)断片を作製する技法もまた、利用することができる。
一般に、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面上に存在するため、良好な結合活性を維持する改変体を同定するために、ディスプレイベクターへとクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片を、適切な抗原に対して選択することができる。例えば、Barbas IIIら、Phage Display, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2001年)を参照されたい。しかし、選択および/またはスクリーニングのために、抗体断片ライブラリーを、溶解性のファージベクター(改変T7またはラムダZap系)へとクローニングすることなど、他のベクターフォーマットをこの工程のために使用しうるであろう。
抗体作製のための代替法:抗体はまた、リンパ球集団内で、in vivoにおける産生を誘導することにより作製することもでき、組換え免疫グロブリンライブラリーまたは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることにより作製することもできる(Orlandiら、PNAS、86巻:3833〜3837頁(1989年);Winter, G.ら、Nature、349巻:293〜299頁(1991年))。
代替的に、単鎖抗体を作製するための技法を使用することができる。単鎖抗体(scF)は、リンカーペプチド(典型的には、ほぼ5〜25アミノ酸の長さ)により接続された、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。scFにおける重鎖および軽鎖の可変領域は、同じ抗体から導出することもでき、異なる抗体から導出することもできる。scFは、組換え法を使用して、例えば、scFをコードするベクターの、E.coliなどの宿主生物内の発現により合成することができる。scFをコードするDNAは、上述の抗体の重鎖または重鎖の可変領域をコードするDNAと、その軽鎖または軽鎖の可変領域をコードするDNAとから選択されるDNAの、全アミノ酸配列または所望のアミノ酸配列をコードする部分的DNAを鋳型として使用し、その両端を規定するプライマー対を使用するPCRにより増幅を実施し、リンカーの両端を、重鎖および軽鎖のそれぞれへとライゲーションするように、ポリペプチドリンカー部分をコードするDNAと、その両端を規定するプライマー対とを組み合わせる増幅をさらに実施することにより得ることができる。scFをコードするDNAを含有する発現ベクターと、発現ベクターにより形質転換された宿主とは、当技術分野で公知の、従来の方法に従い得ることができる。
また、抗原結合性断片、例えば、抗体分子のペプシン消化により作製しうるF(ab’)断片、およびF(ab’)断片のジスルフィド架橋を還元することにより作出しうるFab断片も、作出することができる。代替的に、Fab発現ライブラリーを構築して、所望の特異性を伴うモノクローナルFab断片の、迅速かつ簡易な同定を可能とすることができる(Huseら、Science、256巻:1275〜1281頁(1989年))。
抗体の修飾。本開示の抗体は、抗原に対するアフィニティーを増大させるように、多量体化することができる。多量体化される抗体は、1種類の抗体の場合もあり、同じ抗原の複数のエピトープを認識する、複数の抗体の場合もある。抗体の多量体化の方法としては、IgG CH3ドメインの、2つのscF分子への結合、ストレプトアビジンへの結合、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフの導入などを例示することができる。
本明細書で開示される抗体組成物は、これらの抗体のうちのいずれかと、別の薬剤との間で形成される、コンジュゲートの形態(免疫コンジュゲート)でありうる。一態様では、本明細書で開示される抗体を、放射性物質へとコンジュゲートさせる。別の態様では、本明細書で開示される抗体を、ポリエチレングリコール(PEG)など、多様な種類の分子に結合させることができる。
抗体のスクリーニング。所望の特異性を有する抗体を同定するスクリーニングのために、多様なイムノアッセイを使用することができる。当技術分野では、特異性が確立された、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体を使用する、競合的結合またはイムノラジオメトリックアッセイのための多数のプロトコールが周知である。このようなイムノアッセイは、TNT関連抗原またはその任意の断片もしくはオリゴペプチドと、その特異的抗体との間の複合体の形成についての測定を伴うことが典型的である。2つの非干渉的TNT関連抗原エピトープに特異的なモノクローナル抗体を活用する、2部位型の、モノクローナルベースのイムノアッセイを使用しうるが、競合的結合アッセイもまた、利用することができる(Maddoxら、J. Exp. Med.、158巻:1211〜1216頁(1983年))。
抗体の精製。本明細書で開示される抗体は、均質性まで精製することができる。抗体の分離および精製は、従来のタンパク質分離および精製法を利用することにより実施することができる。
例だけを目的として述べると、抗体は、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などの使用を適切に選択し、組み合わせることにより、分離および精製することができる。Strategies for Protein Purification and Characterization:A Laboratory Course Manual、Daniel R. Marshakら編、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996年);Antibodies: A Laboratory Manual、HarlowおよびDavid Lane編、Cold Spring Harbor Laboratory(1988年)。
クロマトグラフィーの例は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーを含む。一態様では、クロマトグラフィーは、HPLCまたはFPLCなどの液体クロマトグラフィーを利用することにより実施することができる。
一態様では、アフィニティークロマトグラフィーにおいて、プロテインAカラムまたはプロテインGカラムを使用することができる。他の例示的なカラムは、プロテインAカラムである、HyperD、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)などを含む。
III.CARを調製するための単離核酸および工程
本開示の態様は、TNT CARを含む単離細胞と、このような細胞を作製する方法とに関する。細胞は、原核細胞または真核細胞である。一態様では、細胞は、T細胞、B細胞またはNK細胞である。真核細胞は、任意の好ましい種に由来することが可能であり、例えば、動物細胞、ヒト、ネコ科動物、またはイヌ科動物細胞などの哺乳動物細胞でありうる。
具体的な実施形態では、単離細胞は、TNT抗体の抗原結合性ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD28共刺激性シグナル伝達領域および/または4−1BB共刺激性シグナル伝達領域、ならびにCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる外因性CARを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。ある特定の実施形態では、単離細胞は、T細胞、例えば、動物T細胞、哺乳動物T細胞、ネコ科動物T細胞、イヌ科動物T細胞、またはヒトT細胞である。ある特定の実施形態では、単離細胞は、NK細胞、例えば、動物NK細胞、哺乳動物NK細胞、ネコ科動物NK細胞、イヌ科動物NK細胞、またはヒトNK細胞である。
ある特定の実施形態では、TNT CAR発現細胞を作製する方法であって、単離細胞の集団に、TNT CARをコードする核酸配列を形質導入するステップを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる方法が開示される。さらなる態様では、前記核酸配列の形質導入に成功した細胞の部分集団を選択する。一部の実施形態では、単離細胞は、T細胞、動物T細胞、哺乳動物T細胞、ネコ科動物T細胞、イヌ科動物T細胞、またはヒトT細胞であり、これにより、TNT CAR T細胞を作製する。ある特定の実施形態では、単離細胞は、NK細胞、例えば、動物NK細胞、哺乳動物NK細胞、ネコ科動物NK細胞、イヌ科動物NK細胞、またはヒトNK細胞であり、これにより、TNT CAR NK細胞を作製する。一部の実施形態では、単離細胞は、B細胞、動物B細胞、哺乳動物B細胞、ネコ科動物B細胞、イヌ科動物B細胞またはヒトB細胞であり、これにより、TNT CAR B細胞を作製する。
単離細胞の供給源。本明細書で開示される細胞の拡大および遺伝子改変の前に、細胞を、対象(例えば、自家療法を伴う実施形態における)から得ることもでき、市販の培養物から得ることもできる。
T細胞またはNK細胞は、対象におけるいくつかの供給源であって、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位に由来する組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む供給源から得ることができる。
当技術分野では、対象となる細胞を単離する方法が周知であり、本出願にたやすく適応させることができ;例示的な方法については、下記の実施例で記載する。本開示と関連する使用のための単離法は、Life Technologies Dynabeads(登録商標)システム;STEMcell Technologies EasySep(商標)、RoboSep(商標)、RosetteSep(商標)、SepMate(商標);Miltenyi Biotec MACS(商標)細胞分離キット、ならびに他の市販の細胞分離および単離キットを含むがこれらに限定されない。免疫細胞の特定の亜集団は、ビーズまたはこのようなキットで利用可能な他の結合剤であって、固有の細胞表面マーカーに特異的なビーズまたは結合剤を使用することにより単離することができる。例えば、MACS(商標)CD4+およびCD8+ MicroBeadsを使用して、CD4+およびCD8+T細胞を単離することができる。
代替的に、細胞は、T細胞については、細胞株である、BCL2(AAA)Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2902(商標))、BCL2(S70A)Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2900(商標))、BCL2(S87A)Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2901(商標))、BCL2 Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2899(商標))、Neo Jurkat(ATCC(登録商標)CRL−2898(商標))を含むがこれらに限定されず;B細胞については、細胞株である、AHH−1(ATCC(登録商標)CRL−8146(商標))、BC−1(ATCC(登録商標)CRL−2230(商標))、BC−2(ATCC(登録商標)CRL−2231(商標))、BC−3(ATCC(登録商標)CRL−2277(商標))、CA46(ATCC(登録商標)CRL−1648(商標))、DG−75[D.G.−75](ATCC(登録商標)CRL−2625(商標))、DS−1(ATCC(登録商標)CRL−11102(商標))、EB−3[EB3](ATCC(登録商標)CCL−85(商標))、Z−138(ATCC #CRL−3001)、DB(ATCC CRL−2289)、Toledo(ATCC CRL−2631)、Pfiffer(ATCC CRL−2632)、SR(ATCC CRL−2262)、JM−1(ATCC CRL−10421)、NFS−5 C−1(ATCC CRL−1693);NFS−70 C10(ATCC CRL−1694)、NFS−25 C−3(ATCC CRL−1695)、およびSUP−B15(ATCC CRL−1929)を含むがこれらに限定されず;NK細胞については、細胞株である、NK−92(ATCC(登録商標)CRL−2407(商標))、NK−92MI(ATCC(登録商標)CRL−2408(商標))を含むがこれらに限定されない、市販の細胞培養物を介して得ることができる。さらなる例は、例えば、Deglis、EBT−8、HPB−MLp−W、HUT 78、HUT 102、Karpas 384、Ki 225、My−La、Se−Ax、SKW−3、SMZ−1、およびT34などの成熟T細胞株;未成熟T細胞株、例えば、ALL−SIL、Be13、CCRF−CEM、CML−T1、DND−41、DU.528、EU−9、HD−Mar、HPB−ALL、H−SB2、HT−1、JK−T1、Jurkat、Karpas 45、KE−37、KOPT−K1、K−T1、L−KAW、Loucy、MAT、MOLT−1、MOLT 3、MOLT−4、MOLT 13、MOLT−16、MT−1、MT−ALL、P12/Ichikawa、Peer、PER0117、PER−255、PF−382、PFI−285、RPMI−8402、ST−4、SUP−T1〜SUP−T14、TALL−1、TALL−101、TALL−103/2、TALL−104、TALL−105、TALL−106、TALL−107、TALL−197、TK−6、TLBR−1、TLBR−2、TLBR−3、およびTLBR−4、CCRF−HSB−2(CCL−120.1)、J.RT3−T3.5(ATCC TIB−153)、J45.01(ATCC CRL−1990)、J.CaM1.6(ATCC CRL−2063)、RS4;11(ATCC CRL−1873)、CCRF−CEM(ATCC CRM−CCL−119);皮膚T細胞リンパ腫細胞株、例えば、HuT78(ATCC CRM−TIB−161)、MJ[G11](ATCC CRL−8294)、HuT102(ATCC TIB−162);未分化大細胞リンパ腫に由来するB細胞株、例えば、DEL、DL−40、FE−PD、JB6、Karpas 299、Ki−JK、Mac−2A Ply1、SR−786、SU−DHL−1、SU−DHL−2、SU−DHL−4、SU−DHL−5、SU−DHL−6、SU−DHL−7、SU−DHL−8、SU−DHL−9、SU−DHL−10、およびSU−DHL−16、DOHH−2、NU−DHL−1、U−937、Granda 519、USC−DHL−1、RL;ホジキンリンパ腫に由来するB細胞株、例えば、DEV、HD−70、HDLM−2、HD−MyZ、HKB−1、KM−H2、L 428、L 540、L1236、SBH−1、SUP−HD1、およびSU/RH−HD−1;ならびにHANK1、KHYG−1、NKL、NK−YS、NOI−90、およびYTなどのNK細胞株を含むがこれらに限定されない。REH、NALL−1、KM−3、L92−221を含むがこれらに限定されないヌル白血病細胞株は、K562赤白血病、THP−1単球性白血病、U937リンパ腫、HEL赤白血病、HL60白血病、HMC−1白血病、KG−1白血病、U266骨髄腫などの、他の白血病およびリンパ腫に由来する細胞株と同様、免疫細胞の、別の商業的に利用可能な供給源である。このような市販の細胞株の非限定的な例示的供給源は、American Type Culture CollectionすなわちATCC(http://www.atcc.org/)およびGerman Collection of Microorganisms and Cell Cultures(https://www.dsmz.de/)を含む。
NFAT連結ポリヌクレオチドの構築。本開示の一部の態様は、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結されたNFAT調節性ポリヌクレオチドを含む単離核酸に関する。このような連結ポリヌクレオチドを調製するための技法は、米国特許第8,556,882号において記載されている。
一部の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、NFAT応答性エレメントを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。NFAT応答性エレメントの例は、NFAT1、NFAT2、NFAT3、NFAT4、および/もしくはそれらの相補体、または任意の同等物を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、NFATが結合しうる、1または複数の結合性モチーフを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。一部の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、同じ結合性モチーフおよび/またはNFAT応答性エレメントの、1回または複数回の反復を含み;一部の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、1または複数の、異なるNFAT結合性モチーフおよび/またはNFAT応答性エレメントを含む。ある特定の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、1〜15の間、好ましくは2〜10の間、なおより好ましくは3〜9の間、なおより好ましくは6つのNFAT結合性モチーフおよび/またはNFAT応答性エレメントを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。具体的な実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、同じNFAT結合性モチーフまたはNFAT応答性エレメントの6回リピートを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、配列:AGGAAAAAC(配列番号58)またはその同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、配列:GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCG(配列番号57)またはその同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
ある特定の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドは、6回反復された配列番号57、配列番号58、またはそれらの同等物を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドは、免疫調節性分子、その機能的な部分または改変体のヌクレオチド配列をコードする配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
一部の実施形態では、単離ヌクレオチドは、プロモーター配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはさらにこれからなる。ある特定の実施形態では、プロモーター配列は、免疫調節性分子のためのプロモーター配列である。さらなる実施形態では、プロモーター配列は、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドによりコードされる免疫調節性分子と同じ免疫調節性分子のプロモーター配列でありうる。代替的な実施形態では、プロモーター配列は、異なる免疫調節性分子のプロモーター配列である。
ある特定の実施形態では、NFAT調節性ポリヌクレオチドを、3’端において、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結する。ある特定の実施形態では、プロモーター配列を、2つのポリヌクレオチドの間に配置する。なおさらなる態様では、単離核酸は、形質導入された細胞の選択を支援する、検出可能な標識または遺伝子(例えば、抗生物質耐性遺伝子)をさらに含む。
ベクター。CAR細胞は、ベクターを使用して調製することができる。本開示の態様は、(i)TNT CARをコードする単離核酸配列、または(ii)免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドと、これらの核酸および/もしくは相補体、ならびに/またはそれらの各々の同等物の一方または両方を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるベクターとに関する。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、TNT抗体の抗原結合性ドメイン、CD8αヒンジドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD28共刺激性シグナル伝達領域および/または4−1BB共刺激性シグナル伝達領域、ならびにCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなるCARをコードする。具体的な実施形態では、単離核酸配列は、(a)TNT抗体の抗原結合性ドメインに続き、(b)CD8αヒンジドメイン、(c)CD8α膜貫通ドメインに続き、(d)CD28共刺激性シグナル伝達領域および/または4−1BB共刺激性シグナル伝達領域に続き、(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインをコードする配列を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、CARをコードし、TNT抗体の抗原結合性ドメインをコードする配列の上流におけるKozakコンセンサス配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
一部の実施形態では、単離核酸は、免疫調節性分子を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。さらなる実施形態では、免疫調節性分子は、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される、1または複数の分子である。
一部の実施形態では、単離核酸は、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなり、上記で開示した方法に従い作出されうる、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結されたNFTA調節性ポリヌクレオチドを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。
一部の実施形態では、単離核酸は、検出可能な標識および/または抗生物質耐性を付与するポリヌクレオチドを含む。一態様では、標識またはポリヌクレオチドは、単離核酸の形質導入に成功した細胞を選択するのに有用である。
一部の実施形態では、単離核酸配列は、ベクター内に含まれる。ある特定の実施形態では、ベクターは、プラスミドである。他の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターである。このようなベクターの非限定的な例は、限定せずに述べると、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを含む。具体的な実施形態では、ベクターは、レンチウイルスベクターである。
例示的なベクターの調製および前記ベクターを使用するCAR発現細胞の作出については、下記の実施例で詳細に論じる。まとめると、天然または合成の、CARまたは免疫調節性分子をコードする核酸の発現は、CARポリペプチドまたはその部分をコードする核酸を、プロモーターへと作動可能に連結し、構築物を、発現ベクターへと組み込むことにより達成することが典型的である。同様の方法を使用して、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドを含む単離核酸配列を構築することができる。ベクターは、真核細胞における複製および組込みに適しうる。当技術分野では、ベクターおよび/または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrookら(2001年、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory、New York)を参照されたい。
一態様では、「ベクター」という用語は、非分裂細胞および/または緩徐に分裂する細胞に、感染および形質導入し、標的細胞のゲノムへと組み込む能力を保持する組換えベクターを意図する。いくつかの態様では、ベクターは、野生型ウイルスに由来するか、またはこれに基づく。さらなる態様では、ベクターは、野生型レンチウイルスに由来するか、またはこれに基づく。このようなベクターの例は、限定せずに述べると、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、サル免疫不全症ウイルス(SIV)、およびネコ免疫不全症ウイルス(FIV)を含む。代替的に、マウス白血病ウイルス(MLV)など、他のレトロウイルスを、ベクター骨格のためのベースとして使用しうることも想定される。本開示に従うウイルスベクターが、特定のウイルスの構成要素に必ずしも制約されないことは明らかであろう。ウイルスベクターは、2つまたはこれを超える、異なるウイルスに由来する構成要素を含むことが可能であり、また、合成の構成要素も含みうる。ベクターの構成要素を操作して、標的細胞への特異性など、所望の特徴を得ることができる。
本開示の組換えベクターは、霊長動物および非霊長動物に由来する。霊長動物レンチウイルスの例は、ヒト後天性免疫不全症候群(AIDS)の原因作用物質である、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、およびサル免疫不全症ウイルス(SIV)を含む。非霊長動物のレンチウイルス群は、原型的な「遅発性ウイルス」である、ビスナ/マエディウイルス(VMV)のほか、類縁の、ヤギ関節炎脳炎ウイルス(CAEV)、ウマ伝染性貧血ウイルス(EIAV)、ならびに、より近年になって記載された、ネコ免疫不全症ウイルス(FIV)およびウシ免疫不全症ウイルス(BIV)を含む。当技術分野では、先行技術による組換えレンチウイルスベクターが公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第6,924,123号;同第7,056,699号;同第7,419,829号;および同第7,442,551号を参照されたい。
米国特許第6,924,123号は、ある特定のレトロウイルス配列が、標的細胞ゲノムへの組込みを容易とすることについて開示する。この特許は、各レトロウイルスゲノムがgag、pol、およびenvと呼ばれる遺伝子であって、ビリオンタンパク質および酵素をコードする遺伝子を含むことについて教示する。これらの遺伝子は、両方の末端において、末端反復(LTR)と呼ばれる領域で挟まれている。LTRは、プロウイルスの組込みおよび転写を担う。LTRはまた、エンハンサー−プロモーター配列としても用いられる。言い換えると、LTRは、ウイルス遺伝子の発現を制御しうる。レトロウイルスRNAによるカプシド形成は、ウイルスゲノムの5’末端に配置されたプサイ配列により生じる。LTR自体は、U3、R、およびU5と呼ばれる3つのエレメントに分けうる、同一な配列である。U3は、RNAの3’末端に固有の配列に由来する。Rは、RNAの両方の末端において反復される配列に由来し、U5は、RNAの5’末端に固有の配列に由来する。3つのエレメントのサイズは、異なるレトロウイルスの間で大幅に変動しうる。ウイルスゲノムでは、ポリ(A)付加部位(終結)は、右側のLTR内のRとU5との間の境界にある。U3は、細胞性タンパク質と、場合によって、ウイルス転写活性化タンパク質とに応答性の、プロモーター配列および複数のエンハンサー配列を含む、プロウイルスの転写制御エレメントの大半を含有する。
構造遺伝子である、gag、pol、およびenv自体に関しては、gagは、ウイルスの内部構造タンパク質をコードする。gagタンパク質は、タンパク質分解により、成熟タンパク質MA(マトリックス)、CA(カプシド)、およびNC(ヌクレオカプシド)へとプロセシングされる。pol遺伝子は、ゲノムの複製を媒介するDNAポリメラーゼ、関連するRNase Hおよびインテグラーゼ(IN)を含有する逆転写酵素(RT)をコードする。
ウイルスベクター粒子を作製するためには、ベクターのRNAゲノムを、宿主細胞内で、それをコードするDNA構築物から発現させる。ベクターゲノムによりコードされない粒子の構成要素は、宿主細胞内で発現する、さらなる核酸配列(通例、gag/pol遺伝子およびenv遺伝子の一方または両方を含む「パッケージング系」)により、トランスでもたらされる。ウイルスベクター粒子の作製のために要求される配列のセットは、一過性トランスフェクションにより宿主細胞へと導入することもでき、宿主細胞ゲノムへと組み込むこともでき、諸方法を組み合わせた形でもたらすこともできる。当業者には、関与する技法が公知である。
本開示における使用のためのレトロウイルスベクターは、Lentigen Corp.製の、InvitrogenのpLentiシリーズ、version 4、6、および6.2の「ViraPower」系;City of Hope Research Instituteの研究室で作出され、使用されているpHIV−7−GFP;Clontech製の「Lenti−X」レンチウイルスベクターである、pLVX;Sigma−Aldrich製のpLKO.1−puro;Open Biosystems製のpLemiR;およびCharite Medical School、Institute of Virology(CBF)、Berlin、Germanyの研究室で作出され、使用されているpLVを含むがこれらに限定されない。
外因性核酸を、宿主細胞へと導入するか、または、そうではなく、細胞を、本開示の阻害剤へと曝露するのに使用される方法に関わらず、宿主細胞内の組換えDNA配列の存在を確認するために、様々なアッセイを実施することができる。このようなアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロット法、RT−PCRならびにPCRなど、当業者に周知の「分子生物学」アッセイ;例えば、免疫学的手段(ELlSAおよびウェスタンブロット)または本明細書で記載されるアッセイにより、特定のペプチドの存在または非存在を検出して、本開示の範囲内に収まる薬剤を同定するアッセイなどの「生化学」アッセイを含む。
パッケージングベクターおよび細胞株。単離核酸は、パッケージングベクターおよび細胞株を使用することにより、レトロウイルスパッケージング系へとパッケージングすることができる。パッケージングベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターを含むがこれらに限定されない。パッケージングベクターは、遺伝子物質の、細胞への送達を容易とするエレメントおよび配列を含有する。例えば、レトロウイルス構築物は、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングするのに要求される全てのビリオンタンパク質をトランスでコードする、複製能力のないレトロウイルスゲノムに由来する、少なくとも1つのレトロウイルスヘルパーDNA配列を含む、パッケージングベクターであり、複製能力のあるヘルパーウイルスの産生を伴わずに、高力価で、複製能力のないレトロウイルスベクターをパッケージングすることが可能なビリオンタンパク質を作製するためのレトロウイルス構築物である。レトロウイルスDNA配列は、ウイルス5’LTRの、天然のエンハンサーおよび/またはプロモーターをコードする領域を欠き、ヘルパーゲノムをパッケージングする一因となるプサイ機能配列、および3’LTRの両方を欠くが、外来のポリアデニル化部位、例えば、SV40ポリアデニル化部位と、ウイルスの産生が所望される細胞型内の効率的な転写を導く外来のエンハンサーおよび/またはプロモーターとをコードする。レトロウイルスは、モロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)、またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)などの白血病ウイルスである。外来のエンハンサーおよびプロモーターは、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)最初期(IE)エンハンサーおよびプロモーター、モロニーマウス肉腫ウイルス(MMSV)のエンハンサーおよびプロモーター(U3領域)、ラウス肉腫ウイルス(RSV)のU3領域、脾臓病巣形成ウイルス(Spleen Focus Forming Virus)(SFFV)のU3領域、または天然のモロニーマウス白血病ウイルス(MMLV)プロモーターへと接続されたHCMV IEエンハンサーでありうる。レトロウイルスパッケージングベクターは、プラスミドベースの発現ベクターによりコードされる、2つのレトロウイルスヘルパーDNA配列からなることが可能であり、この場合、例えば、第1のヘルパー配列は、同種指向性(ecotropic)であるMMLVまたはGALVのgagおよびpolタンパク質をコードするcDNAを含有し、第2のヘルパー配列は、envタンパク質をコードするcDNAを含有する。宿主範囲を決定するenv遺伝子は、異種指向性(xenotropic)、両種指向性(amphotropic)、同種指向性、多種指向性(polytropic)(ミンク病巣形成)、もしくは10A1マウス白血病ウイルスenvタンパク質、またはテナガザル白血病ウイルス(GALV)envタンパク質、ヒト免疫不全症ウイルスenv(gp160)タンパク質、水疱性口内炎ウイルス(VSV)Gタンパク質、ヒトI型およびII型T細胞白血病(HTLV)env遺伝子産物をコードする遺伝子、前述のenv遺伝子のうちの1もしくは複数の組合せに由来するキメラエンベロープ遺伝子、または前述のenv遺伝子生成物の細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインをコードするキメラエンベロープ遺伝子、および所望の標的細胞上の特異的表面分子を指向するモノクローナル抗体に由来しうる。
パッケージング工程では、パッケージングベクターと、レトロウイルスベクターとを、ヒト胎児性腎細胞、例えば、293細胞(ATCC番号:CRL1573、ATCC、Rockville、Md.)など、ウイルスを産生することが可能な、哺乳動物細胞の第1の集団へと一過性に共トランスフェクトして、高力価の組換えレトロウイルス含有上清を作製する。本開示の別の方法では、次いで、この、一過性にトランスフェクトされた細胞の第1の集団を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球と共培養して、標的細胞に、外来遺伝子を、高効率で形質導入する。本発明のさらに別の方法では、上記で記載した、一過性にトランスフェクトされた細胞の第1の集団に由来する上清を、哺乳動物の標的細胞、例えば、ヒトリンパ球または造血幹細胞とインキュベートして、標的細胞に、外来遺伝子を、高効率で形質導入する。
別の態様では、パッケージングベクターを、ヒト胎児性腎細胞、例えば、293細胞など、ウイルスを産生することが可能な、哺乳動物細胞の第1の集団内で安定的に発現させる。レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターは、選択可能なマーカーによる共トランスフェクションまたは偽型ウイルスの感染により、細胞へと導入する。いずれの場合にも、ベクターは、組み込まれる。代替的に、ベクターは、エピソームで維持されたプラスミドに導入することができる。高力価の組換えレトロウイルス含有上清が作製される。
CAR細胞の活性化および拡大。所望のCARを発現させる細胞の遺伝子改変の前であれ、後であれ、細胞は、米国特許第6,352,694号;同第6,534,055号;同第6,905,680号;同第6,692,964号;同第5,858,358号;同第6,887,466号;同第6,905,681号;同第7,144,575号;同第7,067,318号;同第7,172,869号;同第7,232,566号;同第7,175,843号;同第5,883,223号;同第6,905,874号;同第6,797,514号;同第6,867,041号;およびLapatevaら(2014年)、Crit Rev Oncog、19巻(1〜2号):121〜32頁;Tamら(2003年)、Cytotherapy、5巻(3号):259〜72頁;Garcia−Marquezら(2014年)、Cytotherapy、16巻(11号):1537〜44頁などの参考文献において記載されている方法など、一般に公知の方法を使用して、活性化させ、拡大することができる。ex vivoにおけるTNT関連抗原による刺激は、選択されたCARを発現させる細胞亜集団を活性化させ、拡大することができる。代替的に、細胞は、TNT関連抗原との相互作用により、in vivoにおいて活性化させることができる。
ある特定の免疫細胞の場合、さらなる細胞集団、可溶性リガンドおよび/もしくはサイトカイン、または刺激剤が、細胞を活性化させ、拡大するのに要求されうる。関連する試薬は当技術分野で周知であり、公知の免疫学的原理に従い選択される。例えば、可溶性CD−40リガンドは、ある特定のB細胞集団を活性化させ、拡大するときに一助となる場合があり、同様に、照射フィーダー細胞も、NK細胞の活性化および拡大のための手順において使用することができる。
当技術分野では、対象となる細胞を活性化させる方法が周知であり、本出願にたやすく適応させることができ;例示的な方法については、下記の実施例で記載する。本開示と関連する使用のための単離法は、Life Technologies Dynabeads(登録商標)システム活性化および拡大キット;BD Biosciences Phosflow(商標)活性化キット、Miltenyi Biotec MACS(商標)活性化/拡大キット、および対象となる細胞の活性化部分に特異的な、他の市販の細胞キットを含むがこれらに限定されない。免疫細胞の特定の亜集団は、ビーズまたはこのようなキットにおいて利用可能な他の薬剤を使用することにより活性化させるかまたは拡大することができる。例えば、α−CD3/α−CD28 Dynabeads(登録商標)を使用して、単離T細胞の集団を活性化させ、拡大することができる。
IV.使用法
治療的適用。本開示の方法態様は、それを必要とする対象における腫瘍の増殖を阻害し、かつ/またはそれを必要とするがん患者を処置するための方法に関する。一部の実施形態では、腫瘍は、充実性腫瘍である。一部の実施形態では、がんは、血液および/または骨髄に影響を及ぼすがんである。一部の実施形態では、腫瘍またはがん細胞は、TNT関連抗原を発現または過剰発現させる。ある特定の実施形態では、これらの方法は、対象または患者へと、有効量の単離細胞を投与するステップを含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。さらなる実施形態では、この単離細胞は、TNT CARを含む。なおさらなる実施形態では、単離細胞は、T細胞またはNK細胞である。一部の実施形態では、単離細胞は、処置される対象または患者に対して自家である。さらなる態様では、腫瘍は、TNT関連抗原を発現させ、対象は、本明細書で記載される診断法などの診断法により、治療のために選択されている。対象は、動物、哺乳動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ウシ、ウマ、マウス、またはヒト患者である。
本明細書で開示されるTNT CAR細胞は、単独で投与することもでき、希釈剤、公知の抗がん治療剤、および/またはサイトカインもしくは免疫調節性である他の細胞集団など、他の構成要素と組み合わせて投与することもできる。本明細書で開示されるTNT CAR細胞は、第1選択治療、第2選択治療、第3選択治療、またはさらなる治療として投与することができる。さらなる治療の非限定的な例は、放射線療法、寒冷療法、もしくは化学療法などの細胞減少療法、または生物学的薬剤を含む。さらなる非限定的な例は、非改変免疫細胞、1もしくは複数の免疫調節性分子を発現させるベクターを含む改変免疫細胞、または本明細書で開示される抗原とは異なる抗原に対して特異的なCAR細胞など、他の関連する細胞型を含む。本開示のCAR細胞についてと同様、一部の実施形態では、これらの細胞は、自家の場合もあり、同種の場合もある。適切な処置レジメンは、主治医または主治獣医が決定する。
本開示の医薬組成物は、処置または防止される疾患に適切な形で投与することができる。投与の数量および頻度は、患者の状態、ならびに患者の疾患の種類および重症度などの因子により決定されるが、適切な投与量は、臨床試験により決定することができる。一態様では、本開示の医薬組成物を、直接的な注射により、直接投与するか、または静脈内注射など、全身投与する。
本開示の態様は、患者が、TNT CAR療法に応答する可能性が高いのか、これに応答する可能性が高くないのかを決定するための例示的な方法を提示する。方法は、患者から単離された腫瘍試料中の壊死の存在または非存在を決定するステップと、所与の腫瘍試料中に存在する壊死の量を定量化するステップとを含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはさらにこれらからなり、壊死の存在は、患者が、TNT CAR療法に応答する可能性が高いことを指し示し、壊死の非存在は、患者が、TNT療法に応答する可能性が高くないことを指し示す。ある特定の実施形態では、方法は、有効量のTNT CAR療法を、TNT CAR療法に応答する可能性が高いと決定された患者へと投与するステップをさらに含むか、または代替的にこれから本質的になるか、またはなおさらにこれからなる。TNT CAR療法は、患者に対して、自家の場合もあり、同種の場合もあり、患者は、充実性腫瘍を患う対象、動物またはヒトでありうる。
当技術分野では、壊死についての組織学的染色の技法が周知である。例えば、「H&E染色」ともまた称するヘマトキシリンおよびエオシン染色は、とりわけ、腫瘍形成性またはがん性の増殖において、組織中の壊死の存在を同定するための一般的な技法である。細胞質におけるH&E染色は、部分的には、細胞質におけるRNAの喪失に帰せられ、部分的には、細胞質におけるタンパク質の変性に帰せられる、好酸球増加症の増大を裏付ける。壊死性組織の染色では、細胞質は、細胞質小器官の酵素消化のために、「虫食い状態」に見えることが多い。ミエリン形態、石灰化、および他の細胞への食作用の証拠もまた、組織学的染色により検出されうる、壊死性組織の特徴である。壊死性組織はまた、細胞死の結果としての核溶解、核濃縮、および核崩壊を裏付けることが多い、核染色における特定の特徴も有する。顕微鏡法と、このような壊死性特徴についての、手動式または自動式の定量化とを使用して、TNT CAR療法の妥当性を決定することができる。腫瘍形成性もしくはがん性増殖または壊死性組織を検出する代替的な手段であって、バイオマーカーベースまたはイメージングベースの診断法を一般に含むがこれらに限定されない手段もまた、患者が、TNT CAR療法に応答するのかどうか、したがって、使用しうるのかどうかの決定に同等に妥当である。
V.担体
本開示のさらなる態様は、担体と、本明細書で開示される実施形態において記載される生成物(例えば、TNT CAR、TNT CARを含む単離細胞、単離核酸、ベクター、TNT CARおよび免疫調節性分子を含有する単離細胞ならびに/またはそのようなものをコードする核酸)のうちの1または複数とを含む、または代替的にこれらから本質的になる、またはなおさらにこれらからなる組成物に関する。さらなる態様では、組成物は加えて、免疫調節性分子、および/またはNFAT調節性ポリヌクレオチドと免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドとを含む単離核酸を含みうる。
ある特定の実施形態では、免疫調節性分子は、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される1または複数である。
略述すると、1または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせた、特許請求される組成物のうちのいずれか1つを含むがこれに限定されない本開示の医薬組成物。このような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液;グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物;タンパク質;ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸;抗酸化剤;EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤;アジュバント(例えば、水酸化アルミニウム);および保存剤を含みうる。本開示の組成物は、経口、静脈内、局所、腸内、および/または非経口投与のために製剤化することができる。ある特定の実施形態では、本開示の組成物を、静脈内投与のために製剤化する。
細胞または組成物の投与は、単回用量で行うこともでき、処置の過程を通して、持続的に行うこともでき、間欠的に行うこともできる。最も有効な投与手段および投与量を決定する方法は、当業者に公知であり、治療のために使用される組成物、治療目的、および処置される対象と共に変動するであろう。主治医が選択する用量レベルおよびパターンにより、単回投与を実行することもでき、複数回投与を実行することもできる。当技術分野では、適切な投与製剤および薬剤を投与する方法が公知である。さらなる態様では、本開示の細胞および組成物を、他の処置と組み合わせて投与することができる。
当技術分野で公知であり、例えば、PCT/US2011/064191において記載されている方法を使用して、細胞および細胞集団を、宿主へと投与する。本開示の細胞または組成物のこの投与は、実験的アッセイおよびスクリーニングアッセイのための、所望の疾患、障害、または状態についての動物モデルを作出するために行うことができる。
IV.キット
本明細書で明示される通り、本開示は、TNT CAR細胞を作製し、投与するための方法を提示する。特定の一態様では、本開示は、これらの方法を実施するためのキットのほか、細胞および/もしくは組織を回収し、かつ/またはスクリーン/形質導入/その他を実施し、かつ/または結果を解析することなど、本開示の方法を実行するための指示も提示する。
一態様では、キットは、本明細書で開示される単離核酸のうちのいずれか1つおよび/または前記核酸を含むベクターおよび/または単離された同種細胞、好ましくは、T細胞もしくはNK細胞、および/または患者からの自家細胞の調達についての指示を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。このようなキットはまた、本明細書で開示される培地および他の試薬など、TNT CAR発現細胞の形質導入および/もしくは選択ならびに/または活性化および/もしくは拡大に適切な培地および他の試薬も含みうるか、または代替的にこれらから本質的になりうるか、またはなおさらにこれらを含みうる。
一態様では、キットは、単離されたCAR発現細胞またはその集団を含むか、または代替的にこれらから本質的になるか、またはなおさらにこれらからなる。一部の実施形態では、このキットの細胞は、それを必要とする対象への投与の前における活性化および/または拡大を要求しうる。さらなる実施形態では、キットは、単離されたCAR発現細胞を活性化させ、かつ/または拡大するように、本開示の上記で網羅される培地および試薬などの培地および試薬をさらに含みうるか、またはこれらから本質的になりうる。一部の実施形態では、細胞は、TNT CAR療法のために使用するものとする。さらなる実施形態では、キットは、単離細胞の、TNT CAR療法を必要とする患者への投与についての指示を含む。
本開示のキットはまた、例えば、緩衝剤、保存剤、またはタンパク質安定化剤も含みうる。キットは、検出可能な標識を検出するために必要な構成要素、例えば、酵素または基質をさらに含みうる。キットはまた、アッセイし、被験試料と比較しうる、1つの対照試料または対照試料のシリーズも含有しうる。キットの各構成要素は、個別の容器内に封入することができ、多様な容器の全ては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための指示と共に、単一のパッケージ内にあってもよい。本開示のキットは、キットの容器上または容器内に書面を含有しうる。書面は、キット内に含有される試薬を、どのようにして使用するのかについて記載する。
適宜、これらの示唆されるキットの構成要素は、当業者による使用に好都合なように、パッケージングすることができる。例えば、これらの示唆されるキットの構成要素は、溶液中でまたは分散液などとして提供することができる。
以下の例は、本開示を実行に移す、多様な場合に使用しうる手順を例示する。
(実施例1 LECの生物活性)
LEC融合タンパク質の生物活性は、製造元のプロトコール(Li, J.ら(2003年)、J Immunother.、26巻:320〜331頁;Li, J.ら(2003年)、Cancer Res.、63巻:8384〜8392頁)において記載されている通り、96−Well Microchemotaxis Chamber(Neuroprobe、Gaithersburg、MD)内の標的細胞の遊走を測定することにより、in vitroにおいて裏付けた。略述すると、LEC/chTNT−3、組換えヒトLEC、または親chTNT−3を、結合培地(1%のBSAおよび25mmol/LのHEPESを伴うRPMI 1640)中で0.39nM〜50nMに系列希釈し、Microchemotaxis装置の下部チャンバーに入れた。次いで、10個のヒトTHP−1単球性細胞を含有する100μLの結合培地を、上部チャンバーへと添加し、37℃、5%COの加湿されたインキュベーター内で1.5時間にわたるインキュベーションの後、遊走細胞の百分率を計算して、遊走指数(ケモカインおよび融合タンパク質へと曝露された細胞の平均数を、結合培地へと曝露された細胞の平均数で除した数)を決定した。全てのアッセイは、三連で実施した。図5に示される通り、遊離ヒト組換えLECおよび融合タンパク質は、THP−1細胞の遊走を誘導した。融合タンパク質へと曝露されたTHP−1細胞の遊走は、用量依存的であり、1.6nMという低濃度で始めて、12.5nMの濃度でピークに達した。このアッセイでは、遊離ヒト組換えLECは、約25nMのより高い濃度でピークに達した。親抗体(chTNT−3)へと曝露されたTHP−1細胞は、融合タンパク質のLEC部分の生物活性を検証する遊走を何ら示さなかった。
(実施例2 分泌性TNT CAR T細胞の作出)
NFATエンハンサー連結型IL−12およびLEC遺伝子の構築
ヒトIL−2遺伝子の転写活性化部位の上流におけるヌクレオチド−286〜−258において見出されるNFATモチーフを、誘導性構築物のために活用する((NFAT)と表記される)。下線を付した配列は、NFAT結合性部位を指し示し、斜字体の配列は、AP−1結合性部位(Fiering, S.ら(1990年)、Genes Dev.、4巻(10号):1823〜1834頁)を指し示す(配列番号57):
これらのNFATモチーフリピートには、ヌクレオチド−70〜+47のIL−2遺伝子プロモーターであって、そのTATAボックス部位および転写開始部位を保持するIL−2遺伝子プロモーターが後続する。この最小限のIL−2プロモーター配列は、IL−12またはLECをコードするDNA配列に直接続くように読み取られる(図6Aおよび6B)。したがって、IL−12またはLECは、適正なT細胞の活性化、およびNFATの、最小限のIL−2プロモーターへの結合の後に限り発現し、転写開始を可能とする。
誘導性IL−12遺伝子は、Genewiz Gene Synthesisのサービスにより合成する。制限酵素部位を、+47において付加して、LECのサブクローニングを可能とするか、または遺伝子をこの誘導性構築物へと置換する。代替的に、二重誘導性IL−12−LEC遺伝子を構築するために、IL−12およびLEC遺伝子を、最小限のIL−2プロモーター配列の下流にサブクローニングし、下記の図7に示される内部リボソーム侵入部位で隔てる。
TNT−CARおよび誘導性遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
別に、NovaBlue Singles(商標)化学的コンピテントE.coli細胞を、TNT−CARおよび誘導性プラスミドcDNAで、形質転換する。形質転換されたE.coli細胞の増殖後、TNT−CARおよび誘導性プラスミドを精製し、一晩にわたるT DNAリガーゼ反応(New England Biosciences;Ipswich、MA)を介して、HIV−1 5’および3’末端反復(LTR)、パッケージングシグナル(Ψ)、EF1αプロモーター、内部リボソーム侵入部位(IRES)、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)、ならびにサルウイルス40起点(SV40)を含有するHIV−1ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、NovaBlue Singles(商標)化学的コンピテントE.coli細胞を、結果として得られる、TNT−CARおよび誘導性遺伝子を含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、HEK293T細胞を、10mLのcomplete−Tet−DMEM中に、100mmの組織培養処理プレート1枚当たりの細胞4.0×10個で播種し、加湿された5%COインキュベーター内、37℃で、一晩にわたりインキュベートする。80〜90%コンフルエントに達したら、HEK293T細胞に、TNT−CARまたは誘導性遺伝子のレンチウイルスベクターと、レンチウイルスのエンベロープ構成要素およびカプシド構成要素を形成するのに必要な遺伝子を含有する、レンチウイルスパッケージングベクターとを共トランスフェクトする。HEK293T細胞に結合するベクター含有ナノ粒子の形成を容易とするように、特許権のある反応緩衝液およびポリマーもまた添加する。トランスフェクトされたHEK293T細胞培養物を、37℃で、4時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、新鮮なcomplete Tet DMEM 10mLで置きかえる。次いで、HEK293T細胞を、さらなる48時間にわたりインキュベートし、その後、細胞上清を採取し、主要なレンチウイルスカプシドタンパク質である、p24に対するサンドイッチELISAを介して、レンチウイルス粒子について調べる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的であるCD4およびCD8T細胞に形質導入するために使用するまで、−80℃で保管する。
ヒトCD4およびCD8末梢血T細胞の精製、活性化、および濃縮
Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare;Little Chalfont、Buckinghamshire、UK)を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞(PBMC)を、0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)および2mMのEDTAを含有するPBSを伴う遠心分離により回収および洗浄する。CD4およびCD8T細胞についてポジティブ選択するように、磁気的に活性化させたLSカラムを使用して、これらのヒトT細胞サブセットを単離するのに、MACS CD4およびCD8 MicroBeads(Miltenyi Biotec;San Diego、CA)キットを使用する。次いで、磁気的に結合したT細胞を、磁気MACS分離器から取り出し、LSカラムからフラッシュ洗浄し、新鮮な完全培地中で洗浄する。CD4およびCD8T細胞集団の純度は、Life Technologies Acoustic Attune(登録商標)Cytometerを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、USCのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮する。1:1に混合されたCD4およびCD8T細胞を、適切な細胞培養容器内で、100IU/mLのIL−2を補充された完全培地中、1mL当たりの細胞1.0×10個の密度で維持し、これに、α−CD3/α−CD28 Human T−cell Dynabeads(Life Technologies;Carlsbad、CA)を添加して、培養T細胞を活性化させる。次いで、T細胞に、TNT−CARレンチウイルス粒子を用いて形質導入する前に、5%COインキュベーター内、37℃で、2日間にわたりインキュベートする。
CD4CD8T細胞のレンチウイルス形質導入
活性化T細胞を回収し、死細胞を、Ficoll−Hypaque密度勾配遠心分離、またはMACS Dead Cell Removal Kit(Miltenyi Biotec;San Diego、CA)の使用により除去する。6ウェルプレートに、活性化T細胞を、完全培地1mL中の細胞1.0×10個の濃度で播種する。逐次的なTNT−CAR.IL−12−LEC細胞の作製のために、生細胞の最大の形質導入効率をもたらす形質導入手順を選択するように、細胞に、下記の多様な方法により形質導入する。
スピンフェクションを介するレンチウイルス形質導入
TNT−CARまたは誘導性遺伝子のレンチウイルス粒子を、レンチウイルス粒子と標的細胞表面との相互作用を容易とすることにより、形質導入の一助となるカチオン性ポリマーである、4μg/mLのポリブレンと共に、細胞懸濁物へと添加する。細胞を、32℃、800×gで、1時間にわたり遠心分離し、その後、一晩にわたりインキュベートする。遠心分離に続き、レンチウイルス含有培地を吸引し、細胞ペレットを、100IU/mLのIL−2を伴う、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。細胞を、5%COの加湿されたインキュベーター内、37℃で一晩にわたり静置する。翌日、枯渇培地を吸引し、レンチウイルス上清を、細胞へと再度添加する。形質導入の3日後、細胞をペレット化させ、IL−2および400μg/mLのジェネティシン(G418スルフェート)(Life Technologies;Carlsbad、CA)を伴う、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。
RetroNectinを介するレンチウイルス形質導入
PBS中で一晩にわたるインキュベーションを介して、RetroNectinを、組織培養処理されていないプレートに播種する。その後、TNT−CARまたは誘導性遺伝子のレンチウイルス粒子を、RetroNectinでコーティングしたプレートへと添加する。半日間にわたるインキュベーション後、レンチウイルス上清を吸引し、1:1に混合されたCD4CD8T細胞を、RetroNectin−レンチウイルスでコーティングしたプレートの、100IU/mLのIL−2を伴う、新鮮な完全培地中に添加し、5%COの加湿されたインキュベーター内、37℃で、3日間にわたり静置する。その後、細胞をペレット化させ、IL−2および400μg/mLのジェネティシンを伴う、新鮮な完全培地中に再懸濁させる。
抗生物質選択を介する、TNT−CAR.IL−12−LEC細胞の選択
抗生物質を使用して、TNT−CAR.IL−12−LEC細胞について選択するため、2つの抗生物質耐性遺伝子を、TNT−CARレンチウイルスベクターおよび誘導性IL−12−LECレンチウイルスベクターへと個別に導入する。2ステップの形質導入手順において、CD4CD8T細胞に、上記で記載したスピンフェクションまたはRectroNectinを介して、TNT−CARレンチウイルスを用いて形質導入する。第1の抗生物質を伴う1週間の培養後、生細胞を精製し、スピンフェクションまたはRectroNectinを介して、誘導性IL−12−LECレンチウイルスを用いた、第2の形質導入を施す。形質導入後、細胞を、両方の抗生物質を含有する培養培地中でインキュベートして、TNT−CAR.IL−12−LEC含有細胞について選択する。
FACSを介する、TNT−CAR.IL−12−LEC細胞の選択
略述すると、形質導入後のT細胞培養物を、ビオチンコンジュゲートα−イディオタイプTNT抗体で標識して、TNT−CARのscFv領域を同定する。続いて、イソチオシアン酸フルオレセインコンジュゲートストレプトアビジンを使用して、α−TNTを結合させる。細胞を、氷上に保ち、蛍光活性化細胞分取(FACS)を介して、TNT−CAR細胞を濃縮するために、USCのフローサイトメトリーコア施設へと移送する。細胞分取は、BD FACSAria(商標)II(BD Biosciences;Franklin Lakes、NJ)を使用して、コア施設の職員が実施する。誘導性IL−12−LEC含有細胞を濃縮するために、GFPレポーター遺伝子を、形質導入細胞のポジティブ選択のために使用する。
(実施例3 NFATエンハンサー連結型IL−12およびLEC遺伝子の構築)
ヒトIL−2遺伝子の転写活性化部位の上流におけるヌクレオチド−286〜−258において見出されるNFATモチーフの8回リピートを、誘導性構築物のために活用する((NFAT)と表記される)。下線を付した配列は、NFAT結合性部位を指し示し、斜字体の配列は、AP−1結合性部位を指し示す(配列番号57):
これらのNFATモチーフリピートには、ヌクレオチド−70〜+47のIL−2遺伝子プロモーターであって、そのTATAボックス部位および転写開始部位を保持するIL−2遺伝子プロモーターが後続する。この最小限のIL−2プロモーター配列は、IL−12またはLECをコードするDNA配列に直接続くように読み取られことになる(図8A)。したがって、IL−12またはLECは、適正なT細胞の活性化、およびNFATの、最小限のIL−2プロモーターへの結合の後に限り発現し、転写開始を可能とするであろう。
誘導性IL−12遺伝子は、Genewiz Gene Synthesisのサービスにより合成する。制限酵素部位を、+47において付加して、LECのサブクローニングを可能とするか、または遺伝子をこの誘導性構築物へと置換する。代替的に、二重誘導性IL−12−LEC遺伝子を構築するために、IL−12およびLEC遺伝子を、最小限のIL−2プロモーター配列の下流にサブクローニングし、図8Bに示される内部リボソーム侵入部位で隔てる。
TNT−CARおよび誘導性遺伝子の、レンチウイルスプラスミドへのサブクローニング
別に、NEB(登録商標)5−アルファ化学的コンピテントE.coli細胞を、TNT−CARおよび誘導性プラスミドcDNAで、形質転換する(New England Biosciences;Ipswich、MA)。形質転換されたE.coli細胞の増殖後、TNT−CARおよび誘導性プラスミドを精製し、一晩にわたるT DNAリガーゼ反応(New England Biosciences;Ipswich、MA)を介して、HIV−1 5’および3’末端反復(LTR)、パッケージングシグナル(Ψ)、EF1αプロモーター、内部リボソーム侵入部位(IRES)、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)、ならびにサルウイルス40起点(SV40)を含有するHIV−1ベースのレンチウイルスベクターへと挿入されるように、適切な制限酵素で消化する。次いで、NEB(登録商標)5−アルファ化学的コンピテントE.coli細胞を、結果として得られる、TNT−CARおよび誘導性遺伝子を含有するレンチウイルスプラスミドで形質転換する。
レンチウイルス粒子の作製
トランスフェクションの前に、293 LTV細胞(優れたレンチウイルス産生性のために選択された、HEK 293 T細胞のサブクローン)を、10%の透析FCSに、ペニシリン/ストレプトマイシンを加えて補充した、10mLの完全DMEM中に150cmの組織培養処理プレート1つ当たりの細胞4.0×10個で播種し、加湿された5%COインキュベーター内、37℃で、一晩にわたりインキュベートする。80〜90%コンフルエンシーに達したら、トランスフェクションの2時間前に、培地を、ペニシリン/ストレプトマイシンを伴わない、10%の透析FCSを補充した、10mlのDMEMと交換する。2時間後、細胞に、TNT−CARおよび/または誘導性遺伝子のレンチウイルスプラスミドに加えて、レンチウイルスのカプシド構成要素およびエンベロープ構成要素を形成するのに必要なレンチウイルス遺伝子を含有する、パッケージングおよびエンベローププラスミドを共トランスフェクトする。293 LTV細胞に結合するプラスミド含有ナノ粒子の形成を容易とするように、タカラバイオ株式会社/Clontech(Mountain View、CA)により開発された、特許権のある反応緩衝液およびポリマー溶液を添加する。トランスフェクトされた293 LTV細胞培養物を、37℃で、24時間にわたりインキュベートした後で、トランスフェクション培地を、10%の透析FCSに、ペニシリン/ストレプトマイシンを加えて補充した、新鮮な完全DMEM 10mLで置きかえる。その後、レンチウイルス含有上清を、24時間ごとに、3日間にわたり回収する。最終的な回収の後、上清を、4℃、350×gで遠心分離し、残存する細胞および破砕物を濾過により除く。次いで、レンチウイルス含有上清を、4℃、20,000×gで、2時間にわたり超遠心分離し、7%のトレハロースおよび1%BSAを含有するPBS中に再懸濁させる。レンチウイルス含有上清をアリコートに分け、標的エフェクター細胞に形質導入するために使用するまで、−80℃で保管する。
ヒトCD4およびCD8末梢血T細胞の精製、活性化、および濃縮
Ficoll−Paque Plus(GE Healthcare;Little Chalfont、Buckinghamshire、UK)を伴う密度勾配遠心分離により濃縮された末梢血単核細胞(PBMC)を、0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)および2mMのEDTAを含有するPBSを伴う遠心分離により回収および洗浄する。CD4およびCD8T細胞について、PBMCを磁気的に単離するのに、T細胞濃縮キット(Stem Cell Technologies)を使用する。CD4およびCD8T細胞集団の純度は、Life Technologies Acoustic Attune(登録商標)Cytometerを使用するフローサイトメトリーにより評価し、必要な場合、USCのフローサイトメトリーコア施設で実施される蛍光活性化細胞分取により濃縮する。1:1に混合されたCD4およびCD8T細胞を、適切な細胞培養容器内で、100IU/mLのIL−2を補充された完全な50%のクリック培地/50%のRPMI−1640中、1mL当たりの細胞1.0×10個の密度で維持し、これに、α−CD3/α−CD28 Human T−cell activatorビーズ(Stem Cell Technologies)を添加して、培養T細胞を活性化させる。次いで、T細胞を、TNT−CARレンチウイルス粒子を用いて形質導入する前に、5%COインキュベーター内、37℃で、2日間にわたりインキュベートする。
CD4CD8T細胞のレンチウイルス形質導入
活性化T細胞を回収し、死細胞を、Ficoll−Hypaque密度勾配遠心分離、またはMACS Dead Cell Removal Kit(Miltenyi Biotec;San Diego、CA)の使用により除去する。6ウェルプレートに、活性化T細胞を、完全培地中、1mL当たりの細胞1.0×10個の濃度で播種する。細胞に、Lentiblastトランスフェクション補助剤(Oz Biosciences、San Diego、CA)を使用して、レンチウイルス粒子を用いて形質導入する。形質導入するのが難しい細胞、すなわち、NK−92MIの形質導入効率を増大させるために、細胞を、RetroNectinでコーティングしたプレート(タカラバイオ株式会社/Clontech;Mountain View、CA)内で、32℃、800×gで、1時間にわたり遠心分離してから、一晩にわたるインキュベーションを施すことができる。形質導入の翌朝、レンチウイルス含有枯渇培地を、新鮮な完全RPMIと交換する。形質導入された細胞を、さらなる下流のアッセイおよび解析まで培養する。
抗生物質選択を介する、TNT−CAR.IL−12−LEC細胞の選択
抗生物質を使用して、TNT−CAR.IL−12−LEC細胞について選択するため、2つの抗生物質耐性遺伝子を、TNT−CARおよび誘導性IL−12−LECレンチウイルスプラスミドへと個別に導入する。2ステップの形質導入手順において、CD4CD8T細胞に、上記で記載したスピンフェクションまたはRectroNectinを介して、TNT−CARレンチウイルスを用いて形質導入する。第1の抗生物質を伴う1週間の培養後、生細胞を精製し、スピンフェクションまたはRectroNectinを介して、誘導性IL−12−LECレンチウイルスを用いた、第2の形質導入を施す。形質導入後、細胞を、両方の抗生物質を含有する培養培地中でインキュベートして、TNT−CAR.IL−12−LEC含有細胞について選択する。
FACSを介する、TNT−CAR.IL−12−LEC細胞の選択
略述すると、形質導入後のT細胞培養物を、ビオチンコンジュゲートα−イディオタイプTNT抗体で標識して、TNT−CARのscFv領域を同定する。続いて、イソチオシアン酸フルオレセインコンジュゲートストレプトアビジンを使用して、α−TNTを結合させる。細胞を、氷上に保ち、蛍光活性化細胞分取(FACS)を介して、TNT−CAR細胞を濃縮するために、USCのフローサイトメトリーコア施設へと移送する。細胞分取は、BD FACSAria(商標)II(BD Biosciences;Franklin Lakes、NJ)を使用して、コア施設の職員が実施する。誘導性IL−12−LEC含有細胞を濃縮するために、緑色蛍光タンパク質(GFP)レポーター遺伝子を、形質導入細胞のポジティブ選択のために使用する。
誘導性遺伝子の誘導についてのアッセイ
CAR NFAT細胞の刺激
CAR NFAT細胞を、完全培地中、1mL当たりの細胞0.5〜5.0×10個の範囲の密度で播種する。NFAT遺伝子を誘導するため、以下の条件のうちの1つを実施する:標的細胞または標的抗原を、1:1のCAR−NFAT対標的細胞比で添加するか;細胞は、イオノマイシン(500ng/mL)を加えた、1〜2%のPHAもしくはPMA(最終濃度:10ng/mL)で刺激するか;または細胞に、所与の希釈剤対照を施す。一晩にわたるインキュベーション後、CAR−NFAT細胞または上清を、下流の解析のために採取する。
フローサイトメトリー
採取された細胞を、遠心分離により、PBS中で、2回洗浄する。その後、細胞を、PBS 2% FCS中に再懸濁させ、CAR細胞(すなわち、抗scFv、抗CD3)および標的細胞抗原(例えば、抗CD19)に対する蛍光抗体によるその後の染色のために、FcRブロッキングを施す。4℃で1時間にわたるインキュベーションの後、細胞を、PBS 2% FCS中で洗浄し、Life Technologies Attune(登録商標)Acoustic Focusing Cytometerを使用して、誘導された遺伝子発現について解析する。
LECおよびIL−12についてのELISA
刺激された細胞を遠心分離し、上清を、適正な捕捉抗体(下記の表を参照されたい)でコーティングされた96ウェルプレートへと移す。4℃で一晩にわたるインキュベーションの後、ELISAプレートを、PBS/0.05% Tween−20中で洗浄し、次いで、コンジュゲートさせた、適切なビオチン化検出抗体でプローブする。その後、プレートを、ストレプトアビジン−HRPと共にインキュベートし、TMB基質(Biolegend;San Diego、CA)を使用して発色させる。発色性のTMB反応は、1MのHSOにより停止させる。450nmにおける吸光度を、BioTek製のSynergy HTマイクロプレートリーダー(BioTek;Winooski、VT)上で測定する。
均等物
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本技術が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
本明細書で例示的に記載される本技術は、本明細書では具体的に開示されない、任意の1または複数の要素、1または複数の限定の非存在下で、適切に実施することができる。したがって、例えば、「〜を含むこと(comprising)」、「〜を含むこと(including)」、「〜を含有すること」などの用語は、広く、限定を伴わずに読み取られるべきものである。加えて、本明細書で利用される用語および表現は、限定的な用語ではなく、記載的な用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴の、任意の均等物またはそれらの部分を除外する意図は存在しないが、特許請求される本技術の範囲内では、多様な改変が可能であることが認識されている。
したがって、本明細書で提示される材料、方法、および例は、好ましい態様を表すものであり、例示的なものであり、本技術の範囲に対する限定として意図されるものではないことを理解すべきである。
本明細書では、本技術について、広く、かつ、一般的に記載してきた。一般的開示の中に収まるより狭い種および亜属的群分けの各々もまた、本技術の一部を形成する。これは、本技術についての一般的記載であって、排除される材料が、本明細書で具体的に列挙されるのかどうかに関わらず、任意の対象物を属から除外する条件または否定的限定を伴う記載を含む。
加えて、マーカッシュ群との関係で、本技術の特徴または態様について記載する場合、当業者は、本技術が、これにより、マーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーの亜群との関係でもまた記載されることを認識するであろう。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、各々が参照により個別に組み込まれた場合と同じ程度に、参照によりそれらの全体において明示的に組み込まれる。矛盾する場合は、定義を含む本明細書が支配する。
他の態様は、以下の特許請求の範囲において明示される。
配列表
TNT−1 CDHR1、配列番号1:
GFSLTDYG
TNT−1 CDHR2、配列番号2:
IWGGGST
TNT−1 CDHR3、配列番号3:
AKEKRRGYYYAMDY
TNT−1 CDLR1、配列番号4:
SSVSSSY
TNT−1 CDLR2、配列番号5:
STS
TNT−1 CDLR3、配列番号6:
QQYSGYPLT
TNT−1の重鎖可変領域配列、配列番号7:
CAGGTGCAGCTGAAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCATCACATGCACTGTCTCAGGGTTCTCATTAACCGACTATGGTGTAAGGTGGATTCGCCAGCCTCCAGGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTGGTGGAAGCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGAGCATCAGCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATGTACTACTGTGCCAAAGAGAAACGGAGGGGGTATTACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
TNT−1の軽鎖可変領域配列、配列番号8:
GGAGAAAATGTGCTCACCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAAAAGGTCACCATGACCTGCAGGGCCAGCTCAAGTGTAAGTTCCAGTTACTTGCACTGGTACCAGCAGAAGTCAGGTGCCTCCCCCAAACTCTGGATTTATAGCACATCCAACTTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGTGTGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTACAGTGGTTACCCACTCACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
TNT−2 CDHR1、配列番号9:
GYSFTGYY
TNT−2 CDHR2、配列番号10:
INPYNGAT
TNT−2 CDHR3、配列番号11:
ARLDRGDY
TNT−2 CDLR1、配列番号12:
ENVVTY
TNT−2 CDLR2、配列番号13:
GAS
TNT−2 CDLR3、配列番号14:
GQGYSYPYT
TNT−2の重鎖可変領域配列、配列番号15:
GAGGTACAGCTGCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACTACATGCACTGGGTGAAGCAAAGCCATGTAAAGAGCCTTGAGTGGATTGGACGTATTAATCCTTACAATGGTGCTACTAGCTACAACCAGAATTTCAAGGACAAGGCCAGCTTGACTGTAGATAAGTCCTCCAGCACAGCCTACATGGAGCTCCACAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGACTAGACCGGGGGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA
TNT−2の軽鎖可変領域配列、配列番号16:
AACATTGTAATGACCCAATCTCCCAAATCCATGTCCATGTCAGTAGGAGAGAGGGTCACCTTGACCTGCAAGGCCAGTGAGAATGTGGTTACTTATGTTTCCTGGTATCAACAGAAACCAGAGCAGTCTCCTAAACTGCTGATATACGGGGCATCCAACCGGTACACTGGGGTCCCCGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGCAACAGATTTCACTCTGACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTTGCAGATTATCACTGTGGACAGGGTTACAGCTATCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACAAAGTTGGAAATAAAACGTACG
TNT−3 CDHR1、配列番号17:
GYTFTRYW
TNT−3 CDHR2、配列番号18:
IYPGNSDT
TNT−3 CDHR3、配列番号19:
ARGEEIGVRRWFAY
TNT−3 CDLR1、配列番号20:
QSISNY
TNT−3 CDLR2、配列番号21:
YAS
TNT−3 CDLR3、配列番号22:
QQSNSWPLT
TNT−3の重鎖可変領域配列、配列番号23:
CAGGTCCAACTGCAGCAGTCAGGAGCTGAACTGGTCAAGACTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACACCTTTACCAGATACTGGATGCACTGGGTAAAACAGAGGCCTGGACAGGCTCTGGAATGGATTGGCGCTATTTATCCTGGAAATAGTGATACTAGCTACTACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCAAACTGACTGCAGTCACATCTGCCAGCACTGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACTCTGCCGTCTATTACTGTGCAAGAGGGGAGGAAATAGGGGTACGACGCTGGTTTGCTTACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTGCA
TNT−3の軽鎖可変領域配列、配列番号24:
GATATTGTGC TAACTCAGTC TCCAGCCACC CTGTCTGTGA CTCCAGGAGA TAGAGTCAGT CTTTCCTGCA GGGCCAGGCA AAGTATTAGC AACTACCTAC ACTGGTATCA ACAAAAATCA CATGAGTCTC CAAGGCTTCT CATCAAGTAT GCTTCCCAGT CCATCTCTGG CATCCCCTCC AGGTTCAGTG GCAGTGGATC AGGGACAGAT TTCACTCTCA GTATCAACAG TGTGGAGACT GAAGATTTTG GAATGTATTT CTGTCAACAG AGTAACAGCT GGCCGCTCAC GTTCGGTGCT GGGACCAAGC TGGAAATAAA A
NHS76 CDHR1、配列番号25:
SGYYWG
NHS76 CDHR2、配列番号26:
SIYHSGSTYYNPSLKS
NHS76 CDHR3、配列番号27:
GKWSKFDY
NHS76 CDLR1、配列番号28:
QGDSLRSYYAS
NHS76 CDLR2、配列番号29:
GKNNRPS
NHS76 CDLR3、配列番号30:
NSRDSSGNHVV
NHS76の重鎖可変領域配列、配列番号31:
CAGGTGCAGC TGCAGGAGTC CGGCCCAGGA CTGGTGAAGC CTTCGGAGAC CCTGTCCCTC ACCTGCGCTG TCTCTGGTTA CTCCATCAGC AGTGGTTACT ACTGGGGCTG GATTCGGCAG CCCCCAGGGA AGGGGCTGGA GTGGATTGGG AGTATCTATC ATAGTGGGAG CACCTACTAC AACCCGTCCC TCAAGAGTCG AGTCACCATA TCAGTAGACA CGTCCAAGAA CCAGTTCTCC CTGAAGCTGA GCTCTGTGAC CGCCGCAGAC ACGGCCGTGT ATTACTGTGC AAGAGGGAAG TGGTCGAAGT TTGACTATTG GGGCCAAGGC ACCCTGGTCA CCGTCTCTTC A
NHS76の軽鎖可変領域配列、配列番号32:
TCCTCTGAGC TGACTCAGGA CCCTGCTGTG TCTGTGGCCT TGGGACAGAC AGTCAGGATC ACATGCCAAG GAGACAGCCT CAGAAGCTAT TATGCAAGCT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA CAGGCCCCTG TACTTGTCAT CTATGGTAAA AACAACCGGC CCTCAGGGAT TCCAGACCGA TTCTCTGGCT CCAGCTCAGG AAACACAGCT TCCTTGACCA TCACTGGGGC TCAGGCGGAA GATGAGGCTG ACTATTACTG TAACTCCCGG GACAGCAGTG GTAACCATGT GGTATTCGGC GGAGGGACCA AGCTGACCGT CCTA
ヒトCD8アルファヒンジドメイン、配列番号33:
PAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
マウスCD8アルファヒンジドメイン、配列番号34:
KVNSTTTKPVLRTPSPVHPTGTSQPQRPEDCRPRGSVKGTGLDFACDIY
ネコCD8アルファヒンジドメイン、配列番号35:
PVKPTTTPAPRPPTQAPITTSQRVSLRPGTCQPSAGSTVEASGLDLSCDIY
ヒトCD8アルファ膜貫通ドメイン、配列番号36:
IYIWAPLAGTCGVLLLSLVIT
マウスCD8アルファ膜貫通ドメイン、配列番号37:IWAPLAGICVALLLSLIITLI
ラットCD8アルファ膜貫通ドメイン、配列番号38:IWAPLAGICAVLLLSLVITLI
4−1BB共刺激性シグナル伝達領域、配列番号39:
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
CD28配列(配列番号40):
MLRLLLALNL FPSIQVTGNK ILVKQSPMLV AYDNAVNLSC KYSYNLFSRE FRASLHKGLDSAVEVCVVYG NYSQQLQVYS KTGFNCDGKL GNESVTFYLQ NLYVNQTDIY FCKIEVMYPPPYLDNEKSNG TIIHVKGKHL CPSPLFPGPS KPFWVLVVVG GVLACYSLLVTVAFIIFWVR SKRSRLLHSD YMNMTPRRPG PTRKHYQPYA PPRDFAAYRS
CD3ゼータシグナル伝達ドメイン(配列番号41):
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
“B7.1” NP_005182.1、配列番号42:
MGHTRRQGTS PSKCPYLNFF QLLVLAGLSH FCSGVIHVTK EVKEVATLSC GHNVSVEELA QTRIYWQKEK KMVLTMMSGD MNIWPEYKNR TIFDITNNLS IVILALRPSD EGTYECVVLK YEKDAFKREH LAEVTLSVKA DFPTPSISDF EIPTSNIRRI ICSTSGGFPE PHLSWLENGE ELNAINTTVS QDPETELYAV SSKLDFNMTT NHSFMCLIKY GHLRVNQTFN WNTTKQEHFP DNLLPSWAIT LISVNGIFVI CCLTYCFAPR CRERRRNERL RRESVRPV
“CCL19” NP_006265.1、配列番号43:
MALLLALSLL VLWTSPAPTL SGTNDAEDCC LSVTQKPIPG YIVRNFHYLL IKDGCRVPAV VFTTLRGRQL CAPPDQPWVE RIIQRLQRTS AKMKRRSS
“CCL20”
例は、NP_004582.1、配列番号44:
MCCTKSLLLA ALMSVLLLHL CGESEAASNF DCCLGYTDRI LHPKFIVGFT RQLANEGCDI NAIIFHTKKK LSVCANPKQT WVKYIVRLLS KKVKNM
およびNP_001123518.1、配列番号45:
MCCTKSLLLA ALMSVLLLHL CGESEASNFD CCLGYTDRIL HPKFIVGFTR QLANEGCDIN AIIFHTKKKL SVCANPKQTW VKYIVRLLSK KVKNM
を含む。
“CD40L” NP_000065.1 、配列番号46:
MIETYNQTSP RSAATGLPIS MKIFMYLLTV FLITQMIGSA LFAVYLHRRL DKIEDERNLH EDFVFMKTIQ RCNTGERSLS LLNCEEIKSQ FEGFVKDIML NKEETKKENS FEMQKGDQNP QIAAHVISEA SSKTTSVLQW AEKGYYTMSN NLVTLENGKQ LTVKRQGLYY IYAQVTFCSN REASSQAPFI ASLCLKSPGR FERILLRAAN THSSAKPCGQ QSIHLGGVFE LQPGASVFVN VTDPSQVSHG TGFTSFGLLK L
“CD137L” NP_003802.1、配列番号47:
MEYASDASLD PEAPWPPAPR ARACRVLPWA LVAGLLLLLL LAAACAVFLA CPWAVSGARA SPGSAASPRL REGPELSPDD PAGLLDLRQG MFAQLVAQNV LLIDGPLSWY SDPGLAGVSL TGGLSYKEDT KELVVAKAGV YYVFFQLELR RVVAGEGSGS VSLALHLQPL RSAAGAAALA LTVDLPPASS EARNSAFGFQ GRLLHLSAGQ RLGVHLHTEA RARHAWQLTQ GATVLGLFRV TPEIPAGLPS PRSE
“GITRL” NP_005083.2、配列番号48:
MTLHPSPITC EFLFSTALIS PKMCLSHLEN MPLSHSRTQG AQRSSWKLWL FCSIVMLLFL CSFSWLIFIF LQLETAKEPC MAKFGPLPSK WQMASSEPPC VNKVSDWKLE ILQNGLYLIY GQVAPNANYN DVAPFEVRLY KNKDMIQTLT NKSKIQNVGG TYELHVGDTI DLIFNSEHQV LKNNTYWGII LLANPQFIS
「GM−CSF」である、UniProt参照番号:P04141−CSF2_HUMAN(配列番号49):
MWLQSLLLLG TVACSISAPA RSPSPSTQPW EHVNAIQEAR RLLNLSRDTA AEMNETVEVI SEMFDLQEPT CLQTRLELYK QGLRGSLTKL KGPLTMMASH
YKQHCPPTPE TSCATQIITF ESFKENLKDF LLVIPFDCWE PVQE
“IL−12” 配列番号50:
CATGGCCATG TGTCATCAGC AGCTGGTCAT CAGCTGGTTC AGCCTGGTGT TCCTGGCCAG CCCCCTGGTG GCCATCTGGG AGCTGAAGAA AGACGTGTAC GTGGTGGAGC TGGACTGGTA TCCCGACGCC CCTGGCGAGA TGGTGGTGCT GACCTGCGAC ACCCCCGAAG AGGACGGCAT CACCTGGACC CTGGACCAGA GCAGCGAGGT GCTGGGCAGC GGCAAGACCC TGACCATCCA GGTCAAAGAG TTCGGCGACG CCGGCCAGTA CACCTGCCAC AAGGGCGGCG AAGTGCTGTC CCACAGCCTG CTGCTGCTGC ACAAGAAAGA GGATGGCATC TGGTCCACCG ACATCCTGAA GGACCAGAAA GAGCCCAAGA ACAAGACCTT CCTGCGGTGC GAGGCCAAGA ACTACAGCGG CCGGTTCACC TGTTGGTGGC TGACCACCAT CAGCACCGAC CTGACCTTCA GCGTGAAGAG CAGCCGGGGC AGCAGCGACC CTCAGGGCGT GACCTGCGGA GCCGCCACCC TGAGCGCCGA GAGAGTGCGG GGCGACAACA AAGAGTACGA GTACAGCGTC GAGTGCCAGG AAGATAGCGC CTGCCCTGCC GCCGAGGAAA GCCTGCCCAT CGAGGTGATG GTGGACGCCG TGCACAAGCT GAAGTACGAG AACTACACCT CCAGCTTTTT CATCCGGGAC ATCATCAAGC CCGACCCCCC CAAGAACCTG CAGCTGAAGC CCCTGAAGAA CAGCCGGCAG GTGGAGGTGT CCTGGGAGTA CCCTGACACC TGGTCCACCC CCCACAGCTA CTTCAGCCTG ACCTTCTGTG TGCAGGTGCA GGGCAAGAGC AAGCGGGAGA AGAAAGACCG GGTGTTCACC GACAAGACCA GCGCCACCGT GATCTGCCGG AAGAACGCCA GCATCAGCGT GCGGGCCCAG GACCGGTACT ACAGCAGCTC CTGGTCCGAG TGGGCCAGCG TGCCCTGCAG CGGCGGAGGG GGCGGAGGAA GCCGGAACCT GCCCGTGGCT ACCCCCGACC CCGGCATGTT CCCCTGCCTG CACCACAGCC AGAACCTGCT GCGGGCCGTG AGCAACATGC TGCAGAAGGC CCGGCAGACC CTGGAATTCT ACCCCTGCAC CAGCGAGGAA ATCGACCACG AGGACATCAC CAAGGATAAG ACCAGCACCG TGGAGGCCTG CCTGCCCCTG GAACTGACCA AGAACGAGAG CTGTCTGAAC TCTCGGGAGA CAAGCTTCAT CACCAACGGC TCTTGCCTGG CCAGCAGAAA GACCAGCTTC ATGATGGCCC TGTGCCTGAG CAGCATCTAC GAGGACCTGA AGATGTACCA GGTGGAGTTC AAGACCATGA ACGCCAAGCT GCTGATGGAC CCCAAGCGGC AGATCTTCCT GGATCAGAAC ATGCTGGCCG TGATCGACGA GCTGATGCAG GCCCTGAACT TCAACAGCGA GACAGTGCCC CAGAAGTCCA GCCTGGAAGA GCCCGACTTC TACAAGACCA AGATCAAGCT GTGCATCCTC CTGCATGCCT TCCGGATCCG GGCCGTGACC ATCGACCGGG TGATGAGCTA CCTGAACGCC AGCTGATGAG C
“IL−2” 配列番号51:
APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT
“IL−15” 配列番号52 .
WVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEKKNIKEFLQSFVHIVQMFINTS
“IL−18” 配列番号53 .
MAAEPVEDNCINFVAMKFIDNTLYFIAEDDENLESDYFGKLESKLSVIRNLNDQVLFIDQGNRPLFEDMTDSDCRDNAPRTIFIISMYKDSQPRGMAVTISVKCEKISTLSCENKIISFK EMNPPDNIKDTKSDIIFFQRSVPGHDNKMQFESSSYEGYFLACEKERDLFKLILKKEDEL GDRSIMFTVQNED
“IL−21” 配列番号54 . QGQDRHMIRMRQLIDIVDQLKNYVNDLVPEFLPAPEDVETNCEWSAFSCFQKAQLKSANTGNNERIINVSIKKLKRKPPSTNAGRRQKHRLTCPSCDSYEKKPPKEFLERFKSLLQKMIHQHLSSRTHGSEDS
“LEC” NP_004581.1、配列番号55:
MKVSEAALSL LVLILIITSA SRSQPKVPEW VNTPSTCCLK YYEKVLPRRL VVGYRKALNC HLPAIIFVTK RNREVCTNPN DDWVQEYIKD PNLPLLPTRN LSTVKIITAK NGQPQLLNSQ
“OX40L” NP_003317.1、配列番号56:
MERVQPLEEN VGNAARPRFE RNKLLLVASV IQGLGLLLCF TYICLHFSAL QVSHRYPRIQ SIKVQFTEYK KEKGFILTSQ KEDEIMKVQN NSVIINCDGF YLISLKGYFS QEVNISLHYQ KDEEPLFQLK KVRSVNSLMV ASLTYKDKVY LNVTTDNTSL DDFHVNGGEL ILIHQNPGEF CVL
NFATと相互作用するポリヌクレオチドの例(配列番号57):
GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCG
NFATと相互作用するポリヌクレオチドの例(配列番号58):
AGGAAAAAC
ヒンジドメイン:IgG1重鎖ヒンジ配列、配列番号59:
CTCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCG
膜貫通ドメイン:CD28膜貫通領域、配列番号60:
TTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTG
細胞内ドメイン:4−1BB共刺激性シグナル伝達領域、配列番号61:
AAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTG
細胞内ドメイン:CD28共刺激性シグナル伝達領域、配列番号62:
AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC
細胞内ドメイン:CD3ゼータシグナル伝達領域、配列番号63:
AGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA
ICOS共刺激性シグナル伝達領域、配列番号64:
ACAAAAAAGA AGTATTCATC CAGTGTGCAC GACCCTAACG GTGAATACAT GTTCATGAGA GCAGTGAACA CAGCCAAAAA ATCCAGACTC ACAGATGTGA CCCTA
OX40共刺激性シグナル伝達領域、配列番号65:
AGGGACCAG AGGCTGCCCC CCGATGCCCA CAAGCCCCCT GGGGGAGGCA GTTTCCGGAC CCCCATCCAA GAGGAGCAGG CCGACGCCCA CTCCACCCTG GCCAAGATC

Claims (102)

  1. (a)TNT抗体の抗原結合性ドメイン;(b)ヒンジドメイン;(c)膜貫通ドメイン;および(d)細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体(CAR)。
  2. (a)TNT抗体の抗原結合性ドメイン;(b)CD8αヒンジドメイン;(c)CD8α膜貫通ドメイン;(d)CD28共刺激性シグナル伝達領域および/または4−1BB共刺激性シグナル伝達領域;ならびに(e)CD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む、請求項1に記載のキメラ抗原受容体(CAR)。
  3. 前記TNT抗体の前記抗原結合性ドメインが、TNT重鎖可変領域と、TNT軽鎖可変領域とを含む、請求項1または2に記載のCAR。
  4. 前記TNT重鎖可変領域と、前記TNT軽鎖可変領域との間に配置されたリンカーポリペプチドをさらに含む、請求項3に記載のCAR。
  5. 前記TNT重鎖可変領域が、配列番号1〜3、9〜11、17〜19、25〜27、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つを含むCDR領域を含む、請求項3または4に記載のCAR。
  6. 前記TNT重鎖可変領域が、配列番号7、15、23、31、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つによりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項3または4に記載のCAR。
  7. 前記TNT軽鎖可変領域が、配列番号4〜6、12〜14、28〜30、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つを含むCDR領域を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載のCAR。
  8. 前記TNT軽鎖可変領域が、配列番号8、16、24、32、またはそれらの各々の同等物のうちのいずれか1つによりコードされるアミノ酸配列を含むCDR領域を含む、請求項3から6のいずれか一項に記載のCAR。
  9. 前記リンカーポリペプチドが、配列(グリシン−セリン)n[配列中、nは、1〜6の整数である](配列番号66)を含むポリペプチドを含む、請求項4から8のいずれか一項に記載のCAR。
  10. 前記CARへと接合させた検出可能なマーカーまたは精製マーカーをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載のCAR。
  11. 同等物が、前記CARに対して少なくとも80%のアミノ酸同一性を有するポリペプチド、または前記CARをコードするポリヌクレオチドの相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを含み、高ストリンジェンシーの条件が、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む、請求項5から10のいずれか一項に記載のCAR。
  12. 請求項1から10のいずれか一項に記載のCARをコードする単離核酸配列またはその相補体またはそれらの各々の同等物であって、同等物が、ポリヌクレオチドもしくはその相補体、または前記ポリヌクレオチドもしくは前記CARをコードする前記単離核酸の相補体と、高ストリンジェンシーの条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドに対して、少なくとも80%の配列同一性を有し、高ストリンジェンシーの条件が、約55℃〜約68℃のインキュベーション温度;約1倍濃度のSSC〜約0.1倍濃度のSSCの緩衝液濃度;約55%〜約75%のホルムアミド濃度;および約1倍濃度のSSC、0.1倍濃度のSSC、または脱イオン水の洗浄溶液を含む、単離核酸配列またはその相補体またはそれらの各々の同等物。
  13. TNT抗体の抗原結合性ドメインをコードするポリヌクレオチドの上流に配置されたKozakコンセンサス配列をさらに含む、請求項12に記載の単離核酸。
  14. 前記単離核酸が、抗生物質耐性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項12または13に記載の単離核酸配列。
  15. 請求項12から14のいずれか一項に記載の単離核酸配列を含むベクター。
  16. 前記ベクターが、プラスミドである、請求項15に記載のベクター。
  17. レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターからなる群より選択されるウイルスベクターである、請求項15に記載のベクター。
  18. 請求項1から11のいずれか一項に記載のCAR;および/または請求項12から14のいずれか一項に記載の単離核酸;および/または請求項15から17のいずれか一項に記載のベクターを含む単離細胞。
  19. 免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結されたNFAT調節性ポリヌクレオチドを含む単離核酸をさらに含む、請求項18に記載の単離細胞。
  20. 前記単離核酸へとカップリングさせた、抗生物質耐性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項19に記載の単離細胞。
  21. 免疫調節性分子が、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される1または複数である、請求項19または20に記載の単離細胞。
  22. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはGM−CSFを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  23. 前記免疫調節性分子が、IL−12、ならびに/またはIL−2および低毒性IL−2のうちの1もしくは複数を含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  24. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−15を含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  25. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−21を含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  26. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはB7.1を含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  27. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはOX40Lを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  28. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはCD40Lを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  29. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはGITRLを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  30. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−18を含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  31. 前記免疫調節性分子が、IL−2および低毒性IL−2のうちの1または複数と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  32. 前記免疫調節性分子が、IL−15と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  33. 前記免疫調節性分子が、IL−21と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  34. 前記免疫調節性分子が、GM−CSFと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  35. 前記免疫調節性分子が、OX40Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  36. 前記免疫調節性分子が、CD137Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  37. 前記免疫調節性分子が、B7.1と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  38. 前記免疫調節性分子が、CD40Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  39. 前記免疫調節性分子が、GITRLと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項19または20に記載の単離細胞。
  40. 前記細胞が、原核細胞または真核細胞である、請求項18から39のいずれか一項に記載の単離細胞。
  41. 前記細胞が、真核細胞である、請求項18から40のいずれか一項に記載の単離細胞。
  42. 前記真核細胞が、動物細胞、哺乳動物細胞、ウシ細胞、ネコ科動物細胞、イヌ科動物細胞、マウス細胞、ウマ細胞、またはヒト細胞から選択される、請求項41に記載の単離細胞。
  43. 前記真核細胞が、T細胞、B細胞、またはNK細胞である、請求項42に記載の単離細胞。
  44. 請求項1から11のいずれか一項に記載のCAR;および/または請求項12から14のいずれか一項に記載の単離核酸;および/または請求項15から17のいずれか一項に記載のベクター;および/または請求項18から43のいずれか一項に記載の単離細胞を含む組成物。
  45. 免疫調節性分子をさらに含む、請求項44に記載の組成物。
  46. 免疫調節性分子が、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される1または複数である、請求項45に記載の組成物。
  47. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはGM−CSFを含む、請求項45に記載の組成物。
  48. 前記免疫調節性分子が、IL−12、ならびに/またはIL−2および低毒性IL−2のうちの1もしくは複数を含む、請求項45に記載の組成物。
  49. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−15を含む、請求項45に記載の組成物。
  50. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−21を含む、請求項45に記載の組成物。
  51. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはB7.1を含む、請求項45に記載の組成物。
  52. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはOX40Lを含む、請求項45に記載の組成物。
  53. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはCD40Lを含む、請求項45に記載の組成物。
  54. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはGITRLを含む、請求項45に記載の組成物。
  55. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−18を含む、請求項45に記載の組成物。
  56. 前記免疫調節性分子が、IL−2および低毒性IL−2のうちの1または複数と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  57. 前記免疫調節性分子が、IL−15と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  58. 前記免疫調節性分子が、IL−21と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  59. 前記免疫調節性分子が、GM−CSFと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  60. 前記免疫調節性分子が、OX40Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  61. 前記免疫調節性分子が、CD137Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  62. 前記免疫調節性分子が、B7.1と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  63. 前記免疫調節性分子が、CD40Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  64. 前記免疫調節性分子が、GITRLと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項45に記載の組成物。
  65. TNT抗原を発現させる細胞に結合した、請求項1から10のいずれか一項に記載のCARを含む単離細胞を含む単離複合体。
  66. TNT関連抗原またはその断片に結合した、請求項1から11のいずれか一項に記載のCARを含む前記単離細胞を含む単離複合体。
  67. TNT CAR発現細胞を作製する方法であって、単離細胞に、請求項12から14のいずれか一項に記載の単離核酸配列を形質導入するステップを含む、方法。
  68. 前記細胞に、免疫調節性分子をコードするポリヌクレオチドへと作動的に連結されたNFAT調節性ポリヌクレオチドを含む単離核酸を形質導入するステップ
    をさらに含む、請求項67に記載の方法。
  69. TNT抗体のTNT抗原結合性ドメインの発現について選択することにより、前記単離核酸を形質導入された前記細胞を選択するステップをさらに含む、請求項67または68に記載の方法。
  70. 免疫調節性分子が、B7.1、CCL19、CCL21、CD40L、CD137L、GITRL、GM−CSF、IL−12、IL−2、低毒性IL−2、IL−15、IL−18、IL−21、LEC、およびOX40Lからなる群より選択される1または複数である、請求項68に記載の方法。
  71. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはGM−CSFを含む、請求項68に記載の方法。
  72. 前記免疫調節性分子が、IL−12、ならびに/またはIL−2および低毒性IL−2のうちの1もしくは複数を含む、請求項68に記載の方法。
  73. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−15を含む、請求項68に記載の方法。
  74. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−21を含む、請求項68に記載の方法。
  75. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはB7.1を含む、請求項68に記載の方法。
  76. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはOX40Lを含む、請求項68に記載の方法。
  77. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはCD40Lを含む、請求項68に記載の方法。
  78. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはGITRLを含む、請求項68に記載の方法。
  79. 前記免疫調節性分子が、IL−12および/またはIL−18を含む、請求項68に記載の方法。
  80. 前記免疫調節性分子が、IL−2および低毒性IL−2のうちの1または複数と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  81. 前記免疫調節性分子が、IL−15と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  82. 前記免疫調節性分子が、IL−21と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  83. 前記免疫調節性分子が、GM−CSFと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  84. 前記免疫調節性分子が、OX40Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  85. 前記免疫調節性分子が、CD137Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  86. 前記免疫調節性分子が、B7.1と、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  87. 前記免疫調節性分子が、CD40Lと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  88. 前記免疫調節性分子が、GITRLと、CCL19、CCL21、およびLECのうちの1または複数とを含む、請求項68に記載の方法。
  89. 前記単離細胞が、T細胞、B細胞、およびNK細胞からなる群より選択される、請求項67から88のいずれか一項に記載の方法。
  90. TNT関連抗原を発現させる腫瘍の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍を、請求項41に記載の単離細胞と接触させるステップを含む、方法。
  91. 前記接触させるステップが、in vitroまたはin vivoにおけるステップである、請求項90に記載の方法。
  92. 前記接触させるステップが、in vivoにおけるステップであり、前記単離細胞が、処置される対象に対して自家である、請求項91に記載の方法。
  93. 前記対象へと、有効量の細胞減少療法を投与するステップをさらに含む、請求項92に記載の方法。
  94. 前記細胞減少療法が、化学療法、寒冷療法、および/または放射線療法を含む、請求項93に記載の方法。
  95. TNT関連抗原を発現させるがんの処置を必要とする対象における、TNT関連抗原を発現させるがんを処置する方法であって、前記対象へと、有効量の、請求項41に記載の単離細胞を投与するステップを含む、方法。
  96. 前記単離細胞が、処置される前記対象に対して自家である、請求項95に記載の方法。
  97. 前記対象へと、有効量の細胞減少療法を投与するステップをさらに含む、請求項95または96に記載の方法。
  98. 前記細胞減少療法が、化学療法、寒冷療法、および/または放射線療法を含む、請求項97に記載の方法。
  99. 前記がんが、血液および/または骨髄に影響を及ぼすがんである、請求項95から98のいずれか一項に記載の方法。
  100. 前記対象が、ヒト患者である、請求項95から99のいずれか一項に記載の方法。
  101. 本明細書に開示される組成物と、任意選択で、使用のための指示とを含むキット。
  102. TNT結合性ドメインと、任意選択で、使用のための指示とを含む、請求項100または101に記載のキット。
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