CN103304669A

CN103304669A - 人源化肿瘤免疫细胞因子tntil2及其制备方法和用途

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Publication number: CN103304669A
Application number: CN2012100652557A
Authority: CN
Inventors: 史训龙; 鞠佃文; 周佩; 冯美卿; 叶丽; 朱海燕; 李继扬; 黄海
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-03-12
Filing date: 2012-03-12
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明属于新型药物制备技术领域，涉及人源化免疫细胞因子，具体涉及人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2及其制备方法和用途。本发明利用人源化重组抗体技术制备人源化的抗肿瘤细胞核单抗，将人源化单抗与IL-2融合表达后，制成TNTIL2融合蛋白；其中的IL-2可特异性地到达肿瘤部位，逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，激活机体局部和全身的抗肿瘤免疫。制得的TNTIL2可作为对多种实体瘤有治疗效果的抗肿瘤候选药物。该具有免疫调节作用的活性多肽免疫细胞因子，可用于肿瘤的单独或者辅助治疗。

Description

人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于新型药物制备技术领域，涉及人源化免疫细胞因子，具体涉及人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2及其制备方法和用途。

背景技术

目前，临床治疗肿瘤的方法主要有外科手术、放射治疗和化学治疗三种方案。所述的传统治疗方案尚存在如下缺陷：缺乏治疗的特异性，无法杀伤残存的肿瘤细胞以及不能控制肿瘤的转移和复发，甚至放、化疗可导致巨大的毒副反应，最终患者常常死于肿瘤的转移、复发或放化疗导致的感染等不良反应。因此新的治疗肿瘤的手段特别是免疫治疗的发展越来越受到有关研究人员的重视。

研究显示，肿瘤局部免疫细胞耐受、细胞因子缺乏等多种因素造成肿瘤局部处于深度的免疫抑制状态，免疫效应细胞在数量和质量上都不足以激发起有效的抗肿瘤免疫应答，这是肿瘤能逃避机体免疫系统攻击的原因，也是抗肿瘤生物治疗诞生的理论基础，逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，提高局部活化的免疫效应细胞的数量，激发强烈的抗肿瘤免疫反应，成为肿瘤免疫(生物)治疗的一个主要目的，其中细胞因子治疗是肿瘤生物治疗最成功也是最重要的方向之一。

白介素-2(IL-2)是目前用于肿瘤免疫治疗的最成功的细胞因子之一。其治疗原理主要在于其在机体免疫调节中的关键作用，研究显示，IL-2能促进T细胞生长，增殖并诱导产生LAK细胞和TIL细胞，激活NL细胞，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)等，其通过诱导和激活抗体免疫活性细胞(NK、TIL、LAK、CTL)达到杀伤癌细胞的效果，有研究表明IL-2用于肾细胞癌、黑素瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、结肠直肠癌有较明显疗效，对肝癌、卵巢癌、头颈部鳞癌、膀胱癌、肺癌等有不同程度的疗效及控制癌性腹水的疗效。但研究还表明，肿瘤局部处于深度的免疫抑制状态，IL-2的作用机理决定了需要有足量的IL-2浓度才可产生足够的免疫激活效应。临床研究实践显示，传统静脉滴注等给药方式通常需要高剂量的IL-2才能在体内分布形成肿瘤局部IL-2高浓度，但是高剂量的IL-2则会带来严重的全身副反应，如“系统性毛细血管渗漏综合症”，原因是IL-2改变了毛细血管通透性，该些安全问题使IL-2的临床应用受到了极大的限制。

美国临床肿瘤学会(ASCO)公布的报告显示，在癌症研究方面取得主要的癌症研究进展中，单抗药物治疗或者单抗联合化疗药物治疗在癌症治疗中占的比重越来越大，这显示了单抗介导的肿瘤靶向治疗，越来越被肿瘤学术界和广大患者所认同。如从早期的抗叶酸受体抗体到现在的scFv抗体片断与IL-2融合表达等等，目前尚没有免疫细胞因子(单抗-细胞因子融合蛋白)类药物的上市，但是已经有该类产品进入临床或临床前研究。这表明免疫细胞因子治疗设想是极具有现实意义的。

目前处于临床或临床前研究阶段的单抗-细胞因子融合蛋白如下表所示：

据文献公开，目前抗肿瘤单抗药物所用的多数肿瘤抗原是细胞膜抗原，尚存在肿瘤类型分布较少，针对肿瘤细胞膜抗原的单抗的作用不持久，易被机体的单核巨噬细胞系统清除等问题。研究发现肿瘤细胞与正常细胞之间存在明显的差异，恶性肿瘤具有明显的坏死区(通常占整个肿瘤的1/3-2/3)，同时变性或坏死的细胞膜渗透性增加，因此细胞内的DNA、组蛋白等结构成分才可以与靶向分子有接触的机会，这在事实上形成了肿瘤特异选择性。同时，鉴于实体瘤分化与结构特征上的共性，针对这些靶位的抗体能在肿瘤组织中滞留更长的时间，在理论上可用于任一种或多种肿瘤，这是有关针对膜表面分子的抗体所无法比拟的。如2007年已获得SFDA批准上市销售生物制品I类新药“碘[131I]肿瘤细胞核人鼠嵌合单克隆抗体(¹³¹I-chTNT)”，是第一个以肿瘤细胞核单抗TNT作为靶向治疗的产品，充分显示肿瘤坏死治疗的抗体的发展已经到了应用阶段。

发明内容

本发明的目的是提供新的抗肿瘤生物药，具体涉及一种具有肿瘤靶向的特异性和肿瘤组织分布的广泛性的抗肿瘤生物药。尤其涉及一种人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2及其制备方法和用途。

本发明所述的人源化肿瘤免疫细胞因子以序列4的白介素-2(IL-2)作为组成之一，选择更新、更安全的人源化肿瘤细胞核TNT抗体chTNT，只保留鼠源3％成分，与IL-2由短肽链(序列3)交联融合而成，使IL-2具有靶向肿瘤局部免疫激活作用，该人源化肿瘤免疫细胞因子具有肿瘤治疗的广谱性。

本发明中，依据免疫细胞因子(immunocytokine)的治疗构想，将单抗片段与细胞因子融合，利用单抗与肿瘤抗原特异性结合的原理，将细胞因子靶向到肿瘤组织，使之达到减毒增效的作用。

具体的，本发明利用人源化重组抗体技术制备人源化的抗肿瘤细胞核单抗，将人源化单抗与IL-2融合表达后，制成TNTIL2融合蛋白；其中的IL-2可特异性地到达肿瘤部位，逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，激活机体局部和全身的抗肿瘤免疫。制得的TNTIL2可作为对多种实体瘤有治疗效果的抗肿瘤候选药物。该具有免疫调节作用的活性多肽免疫细胞因子，可用于肿瘤的单独或者辅助治疗。

更具体的，本发明通过下述方法制备人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2，其包括步骤：

1)用Raji Burkitt’s淋巴瘤细胞系生产杂交瘤的免疫原，对该细胞进行细胞核提取；

2)用获得的细胞核提取物免疫Balb/c小鼠，制备脾脏单细胞混悬液，与8-azaguanine-resistant鼠骨髓瘤NS-1混合构建融合细胞；

3)将混合的细胞放在含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的RPMI-1640培养基的组织细胞板培养，挑选出阳性鼠源性TNT单克隆抗体(简称：muTNT-MAb)融合细胞分泌株，液氮存储；

4)用PCR和RT-PCR扩增技术获得抗体VH和VL基因cDNA片段，然后将VH和VL克隆入携带人IgG1和人λ链恒定区片段人的真核表达载体，融合构成TNTIL2基因的人源化抗体部分，构建重组抗体重链和轻链真核表达载体，共转化小鼠骨髓瘤细胞NS0ELISA法筛选得chTNT高表达细胞株；

5)将人IL2基因融合于抗体重链真核表达载体中TNT重链基因的C末端，构成融合蛋白的重链-IL2的融合基因序列，同轻链真核表达载体共转化NS0细胞，筛选得TNT-IL2高表达细胞株；

6)采用谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)基因表达系统，大量表达TNT-IL2，所用真核表达载体为pEE12。

本发明所述的免疫细胞因子制备方法可用目前已知的方法，如细菌表达，酵母表达，哺乳动物细胞表达，噬菌体展示等，但是不限定于上述列举的4种方法。

本发明的免疫细胞因子TNTIL2进行了急性毒性实验，结果表明其无异常毒性反应发生；经动物治疗实验，结果显示，所述人源化免疫细胞因子TNTIL2可呈剂量依赖性地抑制小鼠黑色素瘤B16F10的生长，且延长半衰期，明显减少用药频度(3天1次)；所述源化免疫细胞因子TNTIL2可呈剂量依赖性地抑制小鼠Lewis肺癌的生长，且延长半衰期，明显减少用药频度(3天1次)，免疫组化的结果证实TNTIL2具有对肿瘤组织局部免疫增强的靶向作用。

本发明的免疫细胞因子TNTIL2可进一步制成药物制剂，本发明的一个实施例中采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒制备粉针剂。

本发明的人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2可实现IL-2的肿瘤特异性治疗，既达到IL-2治疗的肿瘤特异性，提高IL-2的抗肿瘤效果，又使IL-2的副反应只局限在肿瘤组织，提高化疗药物的摄取。所适用的肿瘤类型为肺癌，黑色素瘤等，但是不限定于列举的肿瘤类型。

本发明的人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2可用于肿瘤的单独或者辅助其他抗肿瘤方法治疗，如放疗，化疗，手术等。

本发明的人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2具有如下优点：

1)人源化抗肿瘤细胞核单抗免疫原性降低，不引起人体HAMA、HACA等免疫应答，

鼠源性抗体作为外源性大分子蛋白质，在反复使用时，常会诱导人抗抗体(HAMA)的产生。为了降低抗体的免疫原性并改善其功能，人们利用基因工程技术的原理，根据不同的需要制备了各种特异性的基因工程抗体，基因工程抗体经改造后可以具有更佳的生物学活性，免疫原性大大降低。

本发明的TNTIL2融合蛋白，利用人源化重组抗体技术制备人源化的抗肿瘤细胞核单抗，由于抗体97％为人来源序列，进入人体不会引起HAMA反应、HACA反应等免疫应答，病人可以安全重复注射而无不良反应。

2)抗肿瘤细胞核单抗是一种通用型抗体靶向技术，可用于多种恶性实体瘤治疗，

由于实体肿瘤发生发展到一定阶段都会发生明显的组织坏死，坏死比例可达到30％-50％，抗肿瘤细胞核单抗是将肿瘤坏死组织的细胞核作为抗原的靶向治疗技术，是一种通用型抗体靶向技术，具有广谱的抗肿瘤作用。不仅可以和多种肿瘤组织结合，而且肿瘤特异性高，正常组织细胞膜完整，没有坏死的细胞组织，因此不会和该单抗结合，TNTIL2可作为对多种实体瘤都有治疗效果的抗肿瘤候选药物。

3)TNTIL2将单抗的特异性和IL-2的免疫激活作用结合起来，逆转肿瘤局部免疫抑制状态，激活抗肿瘤免疫功能，

IL-2可以特异性激活T细胞、NK细胞等，具有明显治疗肿瘤的作用，但缺乏肿瘤特异性，半衰期短，全身应用不良反应严重。将人源化单抗与IL-2融合表达后，IL-2可以特异性地到达肿瘤部位，逆转肿瘤局部的免疫抑制状态，激活机体局部和全身的抗肿瘤免疫。

4)TNTIL2可明显地延长IL-2的半衰期，减少给药次数，

抗体IgG在体内具有较长的半衰期，IgG的Fc段和细胞因子融合可作为一种常用的延长细胞因子半衰期的方法，将人源化单抗与IL-2融合，可明显延长IL-2的半衰期，使每日注射改为每周或者更长时间注射一次，方便病人给药，减少病人的痛苦和经济负担。

(5)TNTIL2可将IL-2的副作用转变为治疗作用，增加肿瘤细胞通透性，与其他化疗药物合用产生协同作用，

IL-2最大的不良反应时全身给药后导致的毛细血管渗漏综合症，可以导致病人低血压、休克等。单抗IL-2融合蛋白使IL-2的不良反应减少且局限在肿瘤内及肿瘤周围，从而使肿瘤部位的毛细血管通透性大大增加，如联合化疗，可使肿瘤摄取化疗药物的数量增加4-5倍，从而减少化疗药物用量，减少不良反应，增强化疗药物对肿瘤细胞的杀伤作用。

附图说明

图1是抗IL2抗体对普通型IL2治疗组的免疫组化染色，其中显示了IL2在肿瘤组织和肿瘤坏死区域呈弱阳性表达。

图2是抗IL2抗体对TNTIL2 1.0mg/kg治疗组的免疫组化染色，其中显示了IL2在肿瘤组织和肿瘤坏死区域呈强阳性表达。

具体实施方式

实施例1 制备人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2

利用Raji Burkitt’s淋巴瘤细胞系(用来生产杂交瘤的免疫原)，对该细胞进行细胞核提取。对8周大的Balb/c小鼠用细胞核提取物进行免疫。在最后一次免疫的4天后，处死小鼠，并在无菌条件下取出脾脏。脾脏被处理成单细胞混悬液，并和8-azaguanine-resistant鼠骨髓瘤NS-1在40％聚乙二醇1540中混合构建融合细胞。然后将混合的细胞被放在含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的RPMI-1640培养基的96孔组织细胞板上进行培养。挑选出对固定Raji淋巴瘤细胞的核免疫荧光反应呈阳性的鼠源性TNT单克隆抗体(简称：muTNT-MAb)融合细胞分泌株，存储在液氮中。

用PCR和RT-PCR扩增技术获得抗体VH和VL基因cDNA片段，然后将VH和VL克隆入已携带人IgG1和人λ链恒定区片段人的真核表达载体，从而将rhTNT的轻链和重链可变区基因序列与人γ1和λ链恒定区基因序列融合构成TNTIL2基因中的人源化抗体部分，构建重组抗体重链和轻链真核表达载体，通过电穿孔法共转化小鼠骨髓瘤细胞NS0，用ELISA法筛选得到chTNT高表达细胞株。

利用基因工程方法将人IL2基因融合于抗体重链真核表达载体中TNT重链基因的C末端，构成融合蛋白的重链-IL2的融合基因序列。同轻链真核表达载体共转化NS0细胞，并筛选得到TNT-IL2高表达细胞株。

TNT-IL2的大量表达采用谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase，GS)基因表达系统，所用真核表达载体为pEE12。

本发明所涉及的基因序列如表1所示，

表1

实施例2 人源化免疫细胞因子TNTIL2的制备和质量标准

制备过程为：NS0摇瓶细胞培养，生物反应器细胞培养，收集细胞上清，纯化前上清预处理，Protein A亲和纯化，SP-Sepharose阳离子交换纯化，Q-Sepharose阴离子交换纯化，除菌过滤，20℃保存。

参考品的检定，

按照有关原液生产检定工艺规程，进行原液鉴定。主要检定结果如表2所示。

表2 TNT-IL2原液鉴定测定项目结果

检定项目	结果
		鉴别试验	合格
蛋白含量	1.30mg/ml
		重链分子量(含IL2)	61KD
轻链分子量	27KD
		IL2比活性	2.48×10⁶IU/mg
SDS-PAGE纯度	100％
		HPLC纯度	97.37％
肽图分析	批与批间一致
		等电点	6.8
免疫活性	合格
		残留外源性DNA	合格
细菌内毒素含量	合格

实施例3 制备含免疫细胞因子TNTIL2的粉针剂

采用常规的冷冻干燥法，以水作为溶媒，包括步骤：取融合蛋白TNTIL2，加入赋形剂，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，灌装，半轧塞，冷冻干燥，压塞轧盖即可。所用的赋形剂选自甘露醇、水解明胶、葡萄糖、乳糖、右旋糖苷等中的一种或几种。每瓶含融合蛋白TNTIL2 10～100mg，-20℃保存待用。

或采用喷雾干燥法制备粉针剂，以水作为溶媒，包括步骤：取融合蛋白TNTIL2，加或不加赋形剂(赋形剂同上)，加水溶解，加入活性炭，过滤除菌，喷雾干燥，无菌分装，压塞轧盖即可。每瓶含融合蛋白TNTIL2 10～100mg，-20℃保存待用。

制备的粉针剂使用前加入适量注射用水或者生理盐水充分溶解后，采用氯胺T法进行标记，标记后的样品经进一步纯化后，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装入管制玻璃瓶内，丁基橡胶药用瓶塞和铝盖密封包装。外包装包括屏蔽铅罐、发泡塑料防震衬里和外包装铁桶或专用塑料桶，-80℃保存待用。

制备水针剂中，以注射用水、生理盐水等作为溶媒配制，也可加适量辅料，辅料选自乙醇、丙二醇、甘油、聚乙二醇、苯甲酸苄酯、二甲基乙酰胺或人血白蛋白中的一种或几种。每支含融合蛋白TNTIL2 5～100mg，-20℃保存待用。

使用前，取出水针剂室温充分溶解约1小时，然后采用氯胺T法进行标记，进一步纯化后，用0.22μm微孔滤膜过滤，分装入管制玻璃瓶内，丁基橡胶药用瓶塞和铝盖密封包装，-80℃保存待用。

实施例4 急性毒性实验

1)药物：融合蛋白TNTIL2注射液，放射性浓度2mCi/ml，放化纯＞95％，免疫活性＞50％，无菌，热原检查合格。使用时用4％人血白蛋白生理盐水溶液稀释到需要的浓度。

2)动物：昆明种小鼠，随机分4组，5只/组，共20只，雌雄各半。

3)方法：小鼠尾静脉分别注入三种剂量，即0.25mCi融合蛋白chTNTIL2/0.25mgchTNT-MAb/只，0.5mCi融合蛋白TNTIL2/0.5mg chTNT-MAb/只，1mCi融合蛋白TNTIL2/1mg chTNT-MAb/只，观察48小时。

4)结果显示：融合蛋白TNTIL2用药量单位重量为人用剂量的20倍，TNTIL2用药量单位重量为人用剂量的200倍时，观察48小时，无一小鼠死亡，表明该药无异常毒性反应发生。

实施例5 免疫细胞因子TNTIL2对于黑色素瘤的治疗实验

一、实验动物：240只雌性实验鼠C57BL/6(复旦大学动物学部)，体重：18～22g，

二、实验方法

(一)荷瘤小鼠动物模型制作：

细胞悬液使用前1000g离心3分钟，用生理盐水洗涤一次，所得细胞悬液备用。用20号穿刺针把细胞悬液移植至C57BL/6小鼠。

C57BL/6小鼠右后腿外侧按每只2×10⁵/0.1ml接种处于对数生长期的B16F10黑色素瘤细胞。

三、受试药物

1.人源化免疫细胞因子TNTIL2，纯度：＞95％，

规格：1mg/支，IL2生物活性＞10⁶IU/支，

免疫活性符合要求，无菌、无热源检查均合格。保存在4±2℃的冰箱中，

2.注射用环磷酰胺

3.注射用重组人白介素2(普通型IL2，辽宁卫星生物制品研究所)，

规格：50万IU/支

四、给药途径：为尾静脉注射，给药体积为0.1ml。

五、实验分组和治疗

荷瘤后24小时将小鼠随机分为6组，每组10只，分别注射生理盐水、注射用环磷酰胺100mg/kg、普通型IL2 100万IU/kg或TNTIL2 0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg。环磷酰胺为单次冲击量治疗，普通型IL2每天一次，连续15天，TNTIL2治疗每3天一次，共给药6次。尾静脉注射同等体积的生理盐水的小鼠为空白对照组。

六、疗效评价：试验前测定小鼠体重，荷瘤后20天处死小鼠，测体重及其瘤重。

七、统计分析：试验进行两次，实验结果分别表示。体重及瘤重用每组平均值±标准差表示，统计学检验用t检验。

实验结果如表3所示：所述的人源化免疫细胞因子TNTIL2可呈剂量依赖性地抑制小鼠黑色素瘤B16F10的生长。所制得的TNTIL2，延长了半衰期，明显减少了用药频度(3天1次)与普通型IL2(每天1次)同剂量比较体内抑瘤作用相当，无显著差别。

表3

其中，***与生理盐水对照组比较P＜0.01，###与环磷酰胺组比较P＜0.01，+与普通型IL2组比较P＞0.05，n＝10

实施例6 人源化免疫细胞因子TNTIL2对Lewis肺癌的治疗实验

二、实验方法

(一)荷瘤小鼠动物模型制作：

细胞悬液使用前1000g离心3分钟，用生理盐水洗涤一次，所得细胞悬液备用。用20号穿刺针将细胞悬液移植至C57BL/6小鼠。

C57BL/6小鼠右后腿外侧按每只5×10⁴/0.1ml接种处于对数生长期的Lewis肺癌3LL细胞。

三、受试药物

1.人源化免疫细胞因子TNTIL2，纯度：＞95％，

规格：1mg/支，IL2生物活性＞10⁶IU/支，

2.注射用环磷酰胺

3.注射用重组人白介素2(普通型IL2，辽宁卫星生物制品研究所)，规格：50万IU/支

四、给药途径为尾静脉注射，给药体积为0.1ml。

五、实验分组和治疗

六、疗效评价：试验前测定小鼠体重，荷瘤后20天处死小鼠，测体重及其瘤重。Lewis肺癌动物模型试验中的生理盐水对照组、普通型IL2治疗组、TNTIL2 0.25mg/kg治疗组和TNTIL2 1.0mg/kg治疗组，随机选取2只处死小鼠肿瘤组织制备病理切片，行常规HE染色和免疫组化染色。

实验结果(如表4，图1，图2所示)表明：所述的人源化免疫细胞因子TNTIL2可呈剂量依赖性地抑制小鼠Lewis肺癌的生长。TNTIL2延长了半衰期，明显减少了用药频度(3天1次)与普通型IL2(每天1次)同剂量比较体内抑瘤作用相当，无显著差别；免疫组化的结果证实肿瘤组织内有中等程度以上的TNTIL2浸润，显示了肿瘤组织的局部免疫增强的靶向作用。

表4

其中，***与生理盐水对照组比较P＜0.01，###与环磷酰胺组比较P＜0.01，++与普通型IL2组比较P＜0.05，n＝10

实施例7 人源化免疫细胞因子TNTIL2的药代动力学研究

2)动物：猕猴，SD大鼠，雌雄各半。

3)方法：静脉分别注射碘125(¹²⁵I)同位素标记的融合蛋白TNTIL2。通过同位素标记示踪法，对该药在动物体内的动态变化规律进行系统研究，阐明该药吸收、分布、代谢和排泄的过程与特点，提供药代动力学参数，为进行药理、毒理研究和临床合理用药提供依据。

4)结果：本品经静脉注射后，在血液内以三室模型分布和清除，猕猴血浆中原形药T_1/2α平均为1.87～3.33h，T_1/2β平均为9.82～17.38h，T_1/2γ平均为7.84～68.38h。大鼠血浆中原形药分布相半衰期T_1/2α平均为1.77～3.03h，清除相半衰期T_1/2β平均为24.58～28.88h，第三相半衰期T_1/2γ平均为82.07～114.19h。动物实验的高、中、低剂量之间也没有显著差异(P＞0.05)，AUC与给药剂量呈线形关系。给药后的短时间内，药物在猕猴和大鼠体内积聚的主要脏器均为肝，以后在脾内积聚较多，在脏器中滞留的主要是原形药，药物不能透过大鼠和猕猴的血脑屏障。药物在动物体内主要通过尿液排出，从粪便中排出很少；而排出物中以代谢物为主，未测得有原形药存在。

Claims

1.人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2，其特征在于，由人源化单抗与白介素-2由序列3的短肽链交联融合制成TNTIL2融合蛋白；

所述的人源化单抗是人源化肿瘤细胞核TNT抗体，具有轻链序列和重链序列；

所述的白介素-2的结构如序列4所示。

2.制备权利要求1的人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2的方法，其特征在于，其包括步骤：

3)将混合的细胞置含有次黄嘌呤、氨喋呤和胸苷的RPMI-1640培养基的组织细胞板培养，挑选阳性鼠源性TNT单克隆抗体融合细胞分泌株，液氮存储；

4)用PCR和RT-PCR扩增获得抗体VH和VL基因cDNA片段，然后将VH和VL克隆入携带人IgG1和人λ链恒定区片段人的真核表达载体，融合构成TNTIL2基因的人源化抗体部分，构建重组抗体重链和轻链真核表达载体，共转化小鼠骨髓瘤细胞NS0，ELISA法筛选得chTNT高表达细胞株；

6)采用谷氨酰胺合成酶基因表达系统，大量表达TNT-IL2。

3.按权利要求2所述的方法，其中步骤6)采用的真核表达载体为pEE12。

4.权利要求1的人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2在制备抗肿瘤免疫调节制剂中的用途。

5.权利要求1的人源化肿瘤免疫细胞因子TNTIL2在制备抗肿瘤免疫靶向调节制剂中的用途。

6.根据权利要求4或5的用途，其特征在于，所述的免疫调节制剂或免疫靶向调节制剂用于肿瘤的单独或者辅助其他抗肿瘤方法治疗，如放疗，化疗或手术方法治疗。

7.根据权利要求4或5的用途，其特征在于，所述的肿瘤类型为肺癌或黑色素瘤或其他实体瘤。