CN110770582A - 确定免疫调节药物用于人的毒性的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了用于确定免疫调节药物的施用是否可能在人体内引发严重的细胞因子释放综合征的人源化小鼠模型和方法。还提供了用于确定候选药物或药物组合在人体中的免疫毒性的人源化小鼠模型和方法。

Description

确定免疫调节药物用于人的毒性的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年4月17日提交的美国临时申请号62/486,441和2017年6月19日提交的美国临时申请号62/521,617的优先权的权益，其两者的全部内容在此全文引入。
技术领域
本发明总体上涉及一种确定免疫调节药物是否在施用该免疫调节药物的人中引发细胞因子释放综合征反应的方法。本发明还提供了一种具有用于药物候选物的药物安全性评估的预测价值的体内小鼠方法。
背景技术
单克隆抗体(mAb)已治疗性地用于癌症和自身免疫性疾病的治疗中。这些治疗性mAb中的许多靶向于免疫细胞(尤其是T细胞和B细胞)表面上的蛋白质。但是，mAb在输注时可具有可能致命的多种不良反应，如细胞因子释放综合征(CRS)或全身性炎症反应综合征(SIRS)。当大量淋巴细胞(B细胞、T细胞和/或自然杀伤(NK)细胞)和/或骨髓细胞(巨噬细胞、树突细胞和单核细胞)被所施用的单克隆抗体激活并释放炎性细胞因子时，在临床上表现出CRS。症状发作的时间和CRS的严重程度取决于mAb的类型和免疫细胞激活的程度。
在药物的临床试验之前，通常有两种现有的毒性测试方法，即在动物模型中的体内测试和体外全血或外周血单核细胞(PBMC)分析。不幸的是，这两种方法不能正确地预测或确定毒性，特别是人类中的免疫毒性。体外测试不能模拟人类患者身体；对潜在药物毒性的全身性反应无法在体内以外的任何模型中建模。啮齿动物和非人类灵长类动物模型中的基因组响应可能无法模拟人类反应。就毒性而言，在临床前测试与临床试验之间存在巨大的空白。
已经尝试了将人类干细胞移植到非人类哺乳动物中进行测试的方法。但是，这样的方法在从患者获得非胚胎干细胞(例如，从患者获得骨髓)方面存在重大问题，并且还具有它们花费太多时间等待干细胞生长和分化成各种细胞的缺点。因此，这样的方法是侵入性的(如果可能的话)、麻烦的和不实用的。
由现在已不存在的TeGenero AG,Wurzburg开发的TGN1412是IgG4亚类的人源化单克隆抗体(mAb)，其对于由人T细胞表达的共刺激分子CD28是特异性的。它被称为“CD28超级激动剂”(CD28SA)。因为与经典的CD28-特异性mAb不同，它可以激活T-淋巴细胞而没有T细胞抗原受体(TCR)的同时结合(engagement)(Hunig,2007,Adv Immunol 95:111-148)。
在2006年3月13日由Northwick Park Hospital,London的独立Parexel临床试验单位进行的首次人体试验中，向健康人类志愿者静脉内应用100μg/kg体重的TGN1412导致威胁生命的细胞因子释放综合征，其仅在将志愿者转移到医院的重症监护室后才得到控制(Suntharalingam等，2006，Engl J Med 355：1018-1028)。因此，抗CD28免疫调节药物TGN1412在I期试验中由于在试验受试者中发生细胞因子风暴(其严重威胁涉及的六名健康志愿者的生命，所有六名志愿者均遭受多器官功能衰竭)而严重失败。
然而，该研究中的临床前工作并未在使用大鼠CD28特异性超激动剂的类似大鼠模型中以及在接受比人类志愿者高最多50倍剂量的TGN1412本身的食蟹猴(猕猴(Macacafascicularis))中显示出这种“细胞因子风暴”的证据(Duff,2006,Expert ScientificGroup on Phase One Clinical Trials Final Report.Norwich,UK:StationaryOffice)。此外，将TGN1412添加到人PBMC的培养物中不会导致细胞因子释放。英国NationalInstitute for Biological Standards and Control(NIBSC)代表政府的一期临床试验专家科学小组重复了所有关键的猴子和PBMC培养实验，并确认TGN1412在这些系统中的无害表现(Duff,2006)。因此，这些大鼠、食蟹猴和培养的人PBMC分析不足以警示人类志愿者经历的细胞因子风暴。注射CD28SA后，啮齿动物和食蟹猴未释放毒性的全身细胞因子可能是由于完整免疫系统对这类药物的反应性的种间差异所致，并且提出了针对这类差异的具体建议(Gogishvili等，2009，PLoS ONE 4(2):e4643.https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004643；Nguyen等,2006,Proc Natl Acad Sci U S A.103:7765-7770；Schraven和Kalinke,2008,Immunity 28:591-595)。
一个人有大约1x1012个T淋巴细胞，并且在任何给定时刻，这些细胞中不到百分之一在血液中循环。目前尚不清楚培养的PBMC对TGN1412的反应失败是由于这些细胞与驻留在淋巴组织中的那些细胞(其在志愿者中明显具有细胞因子释放的反应)相比的功能缺陷，还是由于淋巴器官(而不是血液)中存在的细胞类型对TGN1412介导的T淋巴细胞激活的需要。
已知的人PBMC培养物对可溶性TGN1412的没有细胞因子释放的反应表明该系统不能以身体内完整人类免疫系统一样的方式对所有淋巴细胞激活剂产生反应。纠正此缺陷可能不仅允许详细分析人CD28超级激动剂(SA)(例如TGN1412)的作用，而且还可以揭示临床前开发过程中其他看似无害的药物的反应性。
因此，持续需要一种新的体内人源化动物模型，该模型可有效用于免疫调节药物的毒性测试以及在患者治疗和临床试验之前确定在个体中的毒性如细胞因子释放综合征。
发明内容
根据非限制性示例实施方案，本发明提供确定在施用免疫调节药物后免疫调节药物是否可能在人体内引发严重的细胞因子释放综合征的方法。根据示例实施方案，本方法包括：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述小鼠；
(c)在移植PBMC后5-7天向所述小鼠施用免疫调节药物；
(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，
其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和
(e)确定所述免疫调节药物可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征，
其中所述小鼠中严重细胞因子释放综合征的存在指示所述免疫调节药物的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征。
根据另一示例实施方案，提供了确定在施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合后所述免疫调节药物的组合是否可能在人体内引发严重的细胞因子释放综合征的方法。所述方法包括：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述小鼠；
(c)在移植PBMC后5-7天向所述小鼠施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物；
(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，
其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和
(e)确定所述免疫调节药物的组合可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征，
其中所述小鼠中严重细胞因子释放综合征的存在指示所述免疫调节药物的组合的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征。
根据其它示例实施方案，本发明提供确定在施用免疫调节药物后在人体内不引发细胞因子释放综合征的免疫调节药物的安全剂量的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
(a)提供具有第一剂量的免疫调节药物，所述免疫调节药物的第一剂量确定为在其施用后在第一人源化的辐照免疫缺陷小鼠中引发轻度或严重的细胞因子释放综合征；
(b)提供第二免疫缺陷小鼠，所述第二小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(c)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述第二小鼠；
(d)在移植PBMC后5-7天向所述第二小鼠施用免疫调节药物，所述免疫调节药物以低于所述第一剂量的第二剂量施用；
(e)测定所述第二小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度；和
(f)确定所述免疫调节药物用于施用于所述人的安全剂量，所述安全剂量是在向所述第二小鼠施用所述免疫调节药物后产生IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度的剂量，
其中所述第二小鼠中IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度指示所述安全剂量的所述免疫调节药物的施用在所述人中可能不引发细胞因子释放综合征。
根据其它示例实施方案，本发明提供确定药物候选物用于人的免疫毒性的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)移植4.5-5.5x107的人PBMC到所述小鼠；
(b)在移植后4-7天向所述小鼠施用药物候选物；
(c)测定所述小鼠的血液中的细胞因子浓度，其中所述细胞因子是选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF的至少一种细胞因子；和
(d)确定所述药物候选物的免疫毒性，
其中所述小鼠中选自以下的至少一种细胞因子的血液浓度指示人体中所述药物候选物的免疫毒性：
IFN-γ≥300pg/ml，
IL-2≥15pg/ml，
IL-4≥10pg/ml，
IL-6≥10pg/ml，
IL-10≥25pg/ml，和
TNF≥5pg/ml。
在另一实施方案中，提供了确定免疫调节药物施用于人在所述人中诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法。所述方法包括：
(a)提供在移植来自人的1.5-3.0x107个分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用免疫调节药物的人源化辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和
(b)在体外检测小鼠的血液样品中存在的包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示所述免疫调节药物施用于所述人可能诱导严重的细胞因子释放综合征。
在另一实施方案中，提供了确定第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合施用于人在所述人中诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法。所述方法包括：
(a)提供在移植来自人的1.5-3.0x107个分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合的人源化辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和
(b)在体外检测小鼠的血液样品中存在的IFN-γ和/或IL-10的浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合施用于所述人可能诱导严重的细胞因子释放综合征。
在另一实施方案中，提供了确定药物候选物在人体中的免疫毒性的方法。所述方法包括：
(a)提供在移植4.5-5.5x107个分离的人外周血单核细胞(PBMC)后4-7天施用药物候选物的人源化的辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和
(b)在体外检测小鼠血液样品中存在的至少一种人细胞因子的浓度以确定药物候选物的人免疫毒性，其中至少一种人细胞因子选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF，且其中当在小鼠血液样品中检测到低的人细胞因子浓度时，药物候选物具有低的人免疫毒性。
附图说明
本文参考以下附图描述了非限制性示例实施方案：
图1A描绘了在移植人外周血单核细胞(hPBMC)2x107 hPBMC/小鼠后的NSG和NSG-CSF-1小鼠的体重测量。每组有10只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图1B描绘了2x107 hPBMC/小鼠移植后的NSG小鼠体重测量。每条线代表一只小鼠。
图2A描绘了移植来自供体331的2x107 hPBMC/小鼠后第5天，NSG、NSG-IL-6和NSG-CSF-1小鼠的人PBMC重建。每组5只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图2B描绘了NSG小鼠中移植来自四个不同供体362、213、309和364的2x107 hPBMC/小鼠后第5天或第10天的不同细胞群体。每组每个时间点2-5只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图2C描绘了NSG小鼠中在移植来自供体358的3x107 hPBMC/小鼠后第5天或第10天的不同细胞群体。每组每个时间点4只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图3A描绘了以5x107 hPBMC/小鼠移植供体4692的5只NSG小鼠的体重测量。数据是平均值±SEM。
图3B描绘了以5x107 hPBMC/小鼠移植供体362的5只NSG小鼠的体重测量。数据是平均值±SEM。
图3C描绘了以2x107 hPBMC/小鼠移植供体309的5只NSG小鼠的体重测量。数据是平均值±SEM。
图3D描绘了以3x107 hPBMC/小鼠移植供体358的4只NSG小鼠的体重测量。数据是平均值±SEM。
图4A描绘了第5天(2x107 hPBMC/小鼠移植)人源化小鼠中10个供体的PBMC重建之间的比较。通过流式细胞术测试人源化NSG小鼠的所指示免疫细胞亚群的重建。显示了人CD45+细胞占总细胞的百分比，以及CD3、CD19、CD14和CD56占CD45+细胞的百分比(在CD45+细胞上门控)。(供体A4692、A4625和A4668仅显示CD45、CD3、CD19和CD14，但未显示CD56)。
图4B描绘了移植前去识别的患者供体的信息(供体A4625和A4668除外)。
图5A-5F描绘了将mAb注射到10个不同供体的hPBMC(2x107 PBMC/小鼠)人源化的NSG小鼠中后细胞因子的诱导。小鼠i.v.注射0.5mg/kg OKT3或1mg/kg抗CD28(ANC28.1/5D10 mAb)，或者PBS(对照)。小鼠在2和6小时采血，并通过BD CBA Th1/Th2 II试剂盒测量循环细胞因子浓度。细胞因子浓度显示在图5A-5F中。每组的小鼠数目为2-5，且数据表示为平均值±SEM。
图5A描绘了mAb激发之后的诱导后的IFN-γ水平：严重/高反应：≥1,800pg/ml；中等/轻度反应：300pg/ml≤IFN-γ<1,800pg/ml；和低/无反应：<300pg/ml。
图5B描绘了IL-10水平：严重/高反应：≥120pg/ml；中等/轻度反应：25pg/ml≤IL-10<120pg/ml；和低/无反应：<25pg/ml。
图5C描绘了在mAb激发之后的细胞因子诱导后人源化小鼠的IL-6水平。
图5D描绘了在mAb激发之后的细胞因子诱导后人源化小鼠的IL-2水平。
图5E描绘了在mAb激发之后的细胞因子诱导后人源化小鼠的IL-4水平。
图5F描述了mAb激发之后的细胞因子诱导后人源化小鼠的TNF水平。
图6描绘了接受OKT3或抗CD28 mAb施用的10个供体之间的不同反应。在抗CD28mAb施用后，供体A4692、A4668和362具有严重/高IFN-γ和IL-10水平的反应；供体A4625、266、345、309和213具有中等/轻度IFN-γ和IL-10水平的反应；及供体364和353具有低/无IFN-γ和IL-10水平的反应。
图7描绘了10个供体的hPMBC移植的人源化NSG小鼠，随后注射对照PBS、OKT3或抗CD28 mAb的直肠温度的变化。每组的小鼠数目为2-5，且数据表示为平均值±SEM。
图8描绘了注射免疫调节药物后10个供体的人源化小鼠的临床评分。在PBS、OKT3或抗CD28 mAb注射后2和6小时，按照以下标准评估每只小鼠的临床评分：评分：0＝正常活动；1＝正常活动、竖毛、脚尖步态；2＝弯腰，活动减少但仍活动；3＝运动不足，但在出现提示时活动；4＝濒死(对触摸无反应)。每组的小鼠数目为2-5，且数据表示为平均值±SEM。
图9A-9F描绘了在2x107 PBMC/小鼠或5x107 PBMC/小鼠的供体213人源化的小鼠中细胞因子反应的比较。
图9A描绘了在5x107 PBMC/小鼠而非2x107 PBMC/小鼠中升高到1800pg/ml以上的IFN-γ水平。
图9B描绘了在5x107 PBMC/小鼠而非2x107 PBMC/小鼠中升高到120pg/ml以上的IL-10水平。
图9C描绘了2x107 PBMC/小鼠和5x107 PBMC/小鼠的IL-6水平。
图9D描绘了2x107 PBMC/小鼠和5x107 PBMC/小鼠的IL-2水平。
图9E描绘了2x107 PBMC/小鼠和5x107 PBMC/小鼠的IL-4水平。
图9F描绘了2x107 PBMC/小鼠和5x107 PBMC/小鼠的TNF水平。
图10A-10F描绘了在不同的人PBMC浓度(来自供体309的2x107、3x107和4x107/小鼠)人源化的NSG小鼠中注射抗体后的细胞因子诱导。小鼠静脉内注射0.5mg/kg OKT3、1mg/kg抗CD28、10mg/kg(派姆单抗)或作为对照的PBS。小鼠在2和6小时采血，并通过BD CBA Th1/Th2 II试剂盒测量循环细胞因子浓度。每组的小鼠数目为3-5，且数据表示为平均值±SEM。
图10A描绘了2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠和4x107 PBMC/小鼠的INFγ水平。
图10B描绘了2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠和4x107 PBMC/小鼠的IL-10水平。
图10C描绘了2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠和4x107 PBMC/小鼠的IL-6水平。
图10D描绘了2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠和4x107 PBMC/小鼠的IL-2水平。
图10E描绘了2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠和4x107 PBMC/小鼠的IL-4水平。
图10F描绘了2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠和4x107 PBMC/小鼠的TNF水平。
图11A-11D描绘了在供体309PBMC人源化的小鼠中响应于OKT3、抗CD28和(派姆单抗)的体温和临床评分变化。
图11A描绘了第5天的供体309小鼠细胞群体。5只NSG小鼠移植2x107 hPBMC/小鼠；5只NSG小鼠移植3x107 hPBMC/小鼠，和5只NSG小鼠移植4x107 hPBMC/小鼠。所有小鼠在100cGy X射线辐照后4小时移植。小鼠在第5天采血用于通过流式细胞术进行CD45、CD3、CD19、CD14和CD56细胞群体测试。
图11B描绘了人源化小鼠在药物注射后2和6小时的临床评分：对照PBS、0.5mg/kgOKT3、1mg/kg抗CD28或10mg/kg
Figure BDA0002304375810000103
(派姆单抗)。用以下标准评估临床评分：评分：0＝正常活动；1＝正常活动、竖毛、脚尖步态；2＝弯腰，活动减少但仍然活动；3＝运动不足，但在出现提示时活动；4＝垂死的。每组5只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图11C显示了使用供体309的2x107 hPMBC/小鼠测量的直肠温度。小鼠注射对照PBS、0.5mg/kg OKT3、1mg/kg抗CD28或10mg/kg
Figure BDA0002304375810000111
(派姆单抗)。在药物注射后2小时和6小时测量直肠温度。3-5只小鼠/组，且数据表示为平均值±SEM。
图11D显示了使用供体309的3x107 hPMBC/小鼠测量的直肠温度。小鼠注射对照PBS、0.5mg/kg OKT3、1mg/kg抗CD28或10mg/kg(派姆单抗)。在药物注射后2小时和6小时测量直肠温度。3-5只小鼠/组，且数据表示为平均值±SEM。
图11E显示了使用供体309的4x107 hPMBC/小鼠测量的直肠温度。小鼠注射对照PBS、0.5mg/kg OKT3、1mg/kg抗CD28或10mg/kg
Figure BDA0002304375810000113
(派姆单抗)。在药物注射后2和6小时测量直肠温度。3-5只小鼠/组，且数据表示为平均值±SEM。
图12A-12F描绘了
Figure BDA0002304375810000114
(派姆单抗)在用不同剂量的
Figure BDA0002304375810000115
诱导不同的细胞因子水平中的剂量效应。在
Figure BDA0002304375810000116
给药前六天，NSG小鼠移植供体358的3x107 hPBMC/小鼠。在给药当天，小鼠静脉内注射PBS，0.5mg/kg OKT3，2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg
Figure BDA0002304375810000117
小鼠在2和6小时采血，并通过BD CBA Th1/Th2 II试剂盒测量循环细胞因子浓度。每组5只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图12A描绘了3x107 PBMC/小鼠的INFγ水平。
图12B描绘了3x107 PBMC/小鼠的IL-10水平。
图12C描绘了3x107 PBMC/小鼠的IL-6水平。
图12D描绘了3x107 PBMC/小鼠的IL-2水平。
图12E描绘了3x107 PBMC/小鼠的IL-4水平。
图12F描绘了3x107 PBMC/小鼠的TNF水平。
图13A-13C描绘了在供体358PBMC人源化的小鼠中响应于
Figure BDA0002304375810000118
(派姆单抗)的体温和临床评分变化。
图13A描绘了第5天的供体358小鼠细胞群体。在100cGy X-射线辐照后4小时，四(4)只NSG小鼠移植3x107个hPBMC。第5天，小鼠采血用于通过流式细胞术进行CD45、CD3、CD19、CD14和CD56细胞群体测试。
图13B描绘了药物注射后的人源化小鼠临床评分。在PBS，0.5mg/kg OKT3，2.5mg/kg、5mg/kg和10kg/mg
Figure BDA0002304375810000121
(派姆单抗)2和6小时后，按照以下标准评估临床评分：评分：0＝正常活动；1＝正常活动、竖毛、脚尖步态；2＝弯腰，活动减少但仍然活动；3＝运动不足，但在出现提示时活动；4＝垂死的。每组5只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图13C描述了在不同时间人源化小鼠中测量的直肠温度。小鼠注射对照PBS，0.5mg/kg OKT3，2.5mg/kg、5mg/kg和10mg/kg
Figure BDA0002304375810000122
(派姆单抗)，并在药物注射后2和6小时测量直肠温度。每组5只小鼠，且数据表示为平均值±SEM。
图14A-B描绘了药物暴露后细胞因子释放的体外和体内测量的不同结果。
图14A提供了比较对于IFN-γ(图面a和b)或IL-10(图面c和d)对4个不同的PBMC供体通过体外(图面a和c)或体内(图面b和d)实验获得的响应于抗CD28处理的细胞因子释放水平的直方图。数据表示为平均值±SEM。
图14B提供了比较对于针对IL6(图面e和f)或IL4(图面g和h)的4个不同PBMC供体通过体外(图面e和g)或体内(图面f和h)实验获得的响应于抗CD28处理的细胞因子释放水平的直方图。数据表示为平均值±SEM。
图15提供了针对a)IFN-γ；b)IL-10；c)IL-6和d)IL-4的PBMC供体213的通过体外或体内实验获得的响应于抗CD28处理的细胞因子释放水平的直方图。数据表示为平均值±SEM。每个图中的虚线是抗CD28实验的对照水平。
图16提供了针对a)IFN-γ；b)IL-6；c)IL-4；d)IL-10；e)IL-2；和f)TNF对于PBMC供体213或供体364响应于
Figure BDA0002304375810000123
(派姆单抗)、
Figure BDA0002304375810000124
(来那度胺)或两种药物的治疗的细胞因子释放水平的直方图。PBS处理为对照。数据表示为平均值±SEM。
图17提供了针对a)IFN-γ；b)IL-10；c)IL-6；d)IL-2；e)IL-4；和f)TNF对于PBMC供体213或供体364响应于
Figure BDA0002304375810000131
(派姆单抗)、ATG或两种药物的处理的细胞因子释放水平的直方图。PBS处理为对照。数据表示为平均值±SEM。
图18提供了针对a)IFN-γ；b)IL-6；c)IL-4；d)IL-2；e)IL-4；和f)TNF对于PBMC供体213或供体364响应于抗CD-28、ATG或两种药物的处理的细胞因子释放水平的直方图。PBS处理为对照。数据表示为平均值±SEM。
图19示出了在移植人PBMC之前在有或没有辐照的情况下人源化小鼠全血中第5天和第10天的细胞群体；小鼠用来自六个不同供体之一的PBMC人源化：362、345和2785(上图)及213、364和3251(下图)。
图20显示了对于用来自六个不同供体(362、345和2785(图面a)及213、364和3251(图面b))之一的PBMC人源化的小鼠在辐照后(IR)和无辐照情况下(非-IR)随PBMC移植后天数变化的体重损失。
图21显示了在移植PBMC后第10天没有任何药物治疗的情况下PBMC人源化小鼠中的细胞因子水平。
图22A-22B显示了用供体362或213的PBMC人源化的辐照或未辐照的小鼠在药物处理后释放的细胞因子水平的图。药物(OKT3、KEYTRUDA或ATG)或阴性对照(PBS)于PBMC移植后第6天施用。
图22A提供了IFN-γ(图面a)、IL-10(图面b)和IL-6(图面c)的水平的图。
图22B提供了IL-2(图面d)、IL-4(图面e)和TNF(图面f)的水平的图。
具体实施方式
定义：
在描述示例性实施方案时，为了清楚起见采用特定术语。然而，实施方案并不旨在限于该特定术语。除非另有说明，否则技术术语根据常规用法使用。
如本文中所使用的，“一”或“一个”可以表示一个或多个。如本文所使用的，“另一”可以表示至少第二或更多的。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语包括复数并且复数术语包括单数。
术语“NSG”是指NOD scidγ的免疫缺陷小鼠模型(即，NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ小鼠；Jackson Laboratory货号：005557)。该小鼠在NOD/ShiLtJ遗传背景上携带两个突变；严重联合免疫缺陷(scid)和白介素2(IL2)受体共同γ链的完全无效等位基因(IL2rgnull)。这些小鼠极度免疫缺陷的。
术语“NSG-CSF-1”是指其基因组包含人CSF-1(巨噬细胞集落刺激因子-1)基因的NSG小鼠模型，且转基因NSG-CSF-1小鼠表达人CSF-1细胞因子(Jackson Laboratory货号：028654)。
术语“NSG-IL-6”是指其基因组包含人白介素-6(IL-6)基因并表达人IL-6细胞因子的NSG小鼠模型(Jackson Laboratory货号：028655)。
术语“CD”是指分化簇。
术语“CD3”是指分化簇3，并表示作为成熟T淋巴细胞上T细胞受体(TCR)复合物的部分的抗原。
术语“CD4”是指分化簇4，并且该抗原是在免疫细胞如T辅助细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞表面上发现的糖蛋白。
术语“CD8”是指分化簇8，且是一种主要在细胞毒性T细胞的表面上表达，但也可以在自然杀伤细胞、皮质胸腺细胞和树突细胞上发现的共受体。
术语“CD14”是指分化簇14，并且是主要由巨噬细胞和树突细胞表达的抗原。
术语“CD19”是指分化簇19，并且该抗原存在于B细胞上。
术语“CD28”是指分化簇28，且是提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号的在T细胞上表达的蛋白质之一。除T细胞受体(TCR)外，通过CD28的T细胞刺激可为产生各种白介素(例如，IL-6)提供有效的信号。
术语“CD45细胞”是指分化簇45，且该抗原存在于人淋巴细胞、单核细胞和其他骨髓细胞上。
术语“CD56”是指分化簇56，且是在自然杀伤细胞(NK细胞)表面上表达的亲同性结合糖蛋白。
术语“外周血单核细胞(PBMC)”是指具有圆形细胞核的外周血细胞。这些单核血细胞在组织和血液之间再循环，且是免疫系统中抵抗感染和适应于入侵者的关键组分。单核细胞(mononuclear cell)有两种主要类型，淋巴细胞和单核细胞(monocyte)。PBMC的淋巴细胞群体通常由T细胞、B细胞和NK细胞组成。可以通过本领域众所周知的方法(例如，Ficoll梯度)从全血样品分离PBMC。
术语“细胞因子”是指在细胞信号传导中重要的一类小蛋白质(～5-20kDa)的成员。细胞因子包括趋化因子、干扰素、白介素、淋巴因子和肿瘤坏死因子。细胞因子的实例包括IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNFα。细胞因子由广泛的细胞产生，包括免疫细胞如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞；给定的细胞因子可由一种以上类型的细胞产生。它们的释放对其周围细胞的行为有影响。已经确定细胞因子作为免疫调节剂参与自分泌信号传导、旁分泌信号传导和内分泌信号传导。
术语“细胞因子释放综合征”(“CRS”)在本文中与“全身性炎症反应综合征”(“SIRS”)、“细胞因子级联”、“高细胞因子血症”和“细胞因子风暴”可互换使用。“细胞因子风暴”(在本领域中也被称为“高细胞因子血症”)定义了患者中的全身性炎症反应，其特征特别在于低血压、发热和/或寒颤，并有可能导致死亡。据推测细胞因子风暴由细胞因子和免疫细胞之间不受控的正反馈回路引起，从而导致各种细胞因子的大大升高的水平。尽管这些术语可能在一定程度上有所不同，但是它们都是由于施用某些抗体于受试者而导致受试者的不可接受的高细胞因子释放的结果。受试者通过释放不可接受的高水平细胞因子对治疗作出反应。本文中提及这些术语之一旨在涵盖所有这些术语。
术语“细胞因子释放综合征(CRS)的分级”是基于Daniel W.Lee等“CurrentConcepts in the Diagnosis and Management of cytokine release syndrome”,Blood.2014Jul 10；124(2):188-195的定义：1级：症状不危及生命，且仅需对症治疗(例如，发烧、恶心、疲劳、头痛、肌痛、不适)；2级：症状需要中度干预且对其有反应，需氧量<40％，或对液体或低剂量的一种血管加压药有反应的低血压，或2级器官毒性；3级：症状需要积极干预并对其有反应，需氧量≥40％，或需要高剂量或多种血管加压药的低血压，或3级器官毒性或4级转氨酶升高(transaminitis)；4级：威及生命的症状，需要呼吸机支持，或4级器官毒性(排除转氨酶升高)；5级：死亡。为本申请的目的，严重CRS是指4-5级，而轻度CRS涵盖1-3级。
本发明人已经确定，在人源化小鼠模型中响应于施用的药物或药物候选物释放的某些细胞因子的浓度可用于预测在人类中响应于施用的药物或药物候选物预期的细胞因子释放综合征的相对严重程度。对于移植来自人的1.5-3.0x 107个PBMC的免疫缺陷小鼠，本发明人确定某些细胞因子的小鼠血药浓度的阈值以确定在小鼠中通过移植后5-7天施用于小鼠的药物诱导的细胞因子释放的严重程度。下表总结了这些阈值。
表1.确定通过施用于移植1.5-3.0x 107个hPBMC的免疫缺陷小鼠的药物诱导的细胞因子释放的严重程度的阈值
Figure BDA0002304375810000161
Figure BDA0002304375810000171
表1的小鼠细胞因子阈值浓度值结合可得的文献报告从实验数据确定，且其变异性为±10％。
严重/高反应的小鼠细胞因子阈值浓度值对应于4-5的人类CRS等级；中等/轻度反应的小鼠细胞因子阈值浓度值对应于1-3的人类CRS等级；且中等/轻度反应的小鼠细胞因子阈值浓度值对应于<1的人类CRS等级。
在所公开的小鼠中具有1.5-3.0x 107 PBMC移植的方法中，发明人已经确定，当在小鼠中观察到严重/高反应时，例如当IFN-γ≥1800pg/ml或IL-10≥120pg/ml时，则很可能在施用药物或药物候选物后，人可能具有严重的细胞因子释放综合征。类似地，在所公开的小鼠中具有1.5-3.0x 107 PBMC移植的方法中，发明人确定，当在小鼠中观察到低/无反应时，例如当IFN-γ<300pg/ml或IL-10<25pg/ml时，则很可能在施用药物或药物候选物后，人可能不具有严重的细胞因子释放综合症，而是可能至多具有低水平的细胞因子释放。在移植1.5-3.0x 107 PBMC的小鼠中这些阈值之间IFN-γ或IL-10的浓度被指定为中等/轻度反应，表明人在施用药物或药物候选物后可能发生中等/轻度细胞因子释放综合征。小鼠中诱导的IL-6、IL-4、IL-2或TNFα的阈值可以类似地用于评估对药物或药物候选物的细胞因子反应的严重程度。小鼠中诱导的IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-4、IL-2和TNFα的阈值可单独地或以任何组合使用以评估在人体中对药物或药物候选物的细胞因子反应的严重程度。
术语“供体”、“个体”、“人类”、“受试者”和“患者”(以及这些术语的单数形式)在本文中一定程度上可以互换使用。在本发明人进行的测试中，使用“供体”PBMC。在本方法中，使用来自正在考虑可能对其施用免疫调节药物的特定人、个体、受试者或患者(而不是“供体”)的PBMC。本文中这些术语之一的使用旨在涵盖这些术语中的每一个。在本方法中，个体、受试者和患者是人。然而，可以预期，该方法可以应用于其他哺乳动物，可能对该方法进行一些修改，这可以由本领域技术人员使用本文所述的方法和技术确定。
术语“免疫调节药物”是指可以激活或抑制免疫系统的任何治疗剂(例如，mAb)，例如通过激活或抑制淋巴细胞功能，例如T细胞功能，如T细胞抑制或激活。免疫调节药物或药剂，或者免疫调节剂，或免疫治疗药物可包括例如白介素、细胞因子、趋化因子、免疫调节酰亚胺药物或可用于免疫疗法的其他药剂。作为非限制性实例，癌症免疫疗法试图刺激免疫系统以破坏肿瘤。因此，免疫调节药物或药剂可用于尝试治疗患者的癌症，但是免疫调节药物的用途不限于癌症的治疗。免疫疗法可以单独使用，或与其他治疗方法结合使用。免疫调节药物的一个示例实施方案是免疫刺激药物，如抗体，优选单克隆抗体(mAb)。例如，单克隆抗体可以是人CD28特异性超激动性单克隆抗体。
免疫调节药物的实例包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺及其衍生物或类似物、来那度胺
Figure BDA0002304375810000181
泊马度胺
Figure BDA0002304375810000182
和阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；IMLYGICTM(talimogene laherparepvec)，一种遗传修饰的溶瘤病毒疗法；达雷木单抗一种抗CD38抗体；阿达木单抗
Figure BDA0002304375810000184
EMPLICITITM(艾洛珠单抗)、epacadostat，一种吲哚胺2,3-二加氧酶(IDO1)的口服羟基脒抑制剂、卡妥索单抗
Figure BDA0002304375810000185
替伊莫单抗
Figure BDA0002304375810000186
托西莫单抗-I131
Figure BDA0002304375810000187
本妥昔单抗
Figure BDA0002304375810000188
betuximab
Figure BDA0002304375810000189
利妥昔单抗(
Figure BDA00023043758100001810
或
Figure BDA00023043758100001811
)、阿仑单抗贝伐单抗
Figure BDA00023043758100001813
帕妥珠单抗
Figure BDA00023043758100001814
曲妥珠单抗trastuzumab emtansinen(KADCYLATM)、狄诺塞麦(或
Figure BDA00023043758100001817
)、伊匹单抗
Figure BDA00023043758100001818
奥法木单抗
Figure BDA00023043758100001819
和帕尼单抗
Figure BDA00023043758100001820
检查点抑制剂是阻断由一些类型的免疫系统细胞(如T细胞)和一些癌细胞产生的某些蛋白质的药物。这些蛋白质帮助保持免疫反应受到控制，并可以防止T细胞杀死癌细胞。当这些蛋白质被检查点抑制剂阻断时，免疫系统上的“刹车”被释放。虽然这种免疫“刹车”的释放可以使T细胞能够更好地杀死癌细胞，但也可能导致作为不良反应的CRS。
一类示例的免疫调节药物是检查点抑制剂，其通常是单克隆抗体，如FDA批准的抗癌药物伊匹单抗
Figure BDA0002304375810000191
派姆单抗
Figure BDA0002304375810000192
和纳武单抗
Figure BDA0002304375810000193
免疫系统的一个重要方面是它能够区分身体内的正常细胞和视为“外来”的那些细胞。这使免疫系统攻击外来细胞而单单放过正常细胞。为此，它利用了“检查点”，某些免疫细胞上需要被激活(或灭活)以启动免疫反应的分子。FDA批准的示例性检查点抑制剂包括CTLA-4抑制剂伊匹单抗
Figure BDA0002304375810000194
PD-1抑制剂派姆单抗
Figure BDA0002304375810000195
和纳武单抗
Figure BDA0002304375810000196
以及PD-L1抑制剂阿特珠单抗
Figure BDA0002304375810000197
阿维单抗
Figure BDA0002304375810000198
和度伐单抗
Figure BDA0002304375810000199
术语“T细胞激活”优选地指明T细胞激活的机制，其在不同类型的T细胞之间可能略有变化。但是，CD4+ T细胞中的“双信号模型”适用于大多数的T细胞类型。更详细地，CD4+T细胞的激活通常分别通过T细胞表面的T细胞受体和CD28两者被主要组织相容性编码的抗原呈递分子啮合及与抗原呈递细胞(APC)表面上其结合的抗原肽和B7家族成员的结合而发生。两种细胞-细胞接触通常都是产生有效免疫反应所需要的。例如，在不存在CD28共刺激的情况下，单独的T细胞受体信号传导可能导致T细胞无能。CD28和T细胞受体两者下游的其他信号传导途径涉及技术人员已知的许多其他蛋白质。T细胞的激活可以通过细胞因子释放和/或细胞增殖，特别是T细胞的增殖来确定，如下文所述。
采用如Jamie L Brady等“Preclinical Screening for Acute Toxicity ofTherapeutic Monoclonal Antibodies in a hu-SCID Model”,Clinical&TranslationalImmunology(2014)3,e29；doi:10.1038/cti.2014.28；2014年12月19日在线发布所定义的术语“临床评分”：0＝正常活动；1＝正常活动，竖毛，脚尖步态；2＝弯腰，活动减少，但仍然活动；3＝运动不足，但在出现提示时可活动；4＝垂死(对触摸无反应)。
术语“剂”或“剂量”是指患者一次服用的药物量。
用于人的免疫调节药物的“安全剂量”在本文中是指在将免疫调节药物施用于移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)的辐照的免疫缺陷小鼠后，在小鼠中产生对应于低/无反应的细胞因子血液浓度(例如，IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml)的剂量，如通过本文公开的方法所确定的。免疫学安全剂量可以对应或不对应于具有治疗功效的剂量。
“功效”是指施用于患者的药物或活性剂在患者中产生治疗效果的能力。
“治疗有效量”或“有效量”是实现药理作用的药物制剂的量。术语“治疗有效量”包括例如预防有效量。药物的“有效量”是实现期望的药理作用或治疗性改善而没有不适当的不良副作用所需的量。药物的有效量由本领域技术人员根据具体患者和疾病来选择。应当理解，由于药物的代谢，受试者的年龄、体重、一般状况，所治疗的病症，治疗的病症的严重程度以及处方医师的判断的差异，“有效量”或“治疗有效量”可以因受试者而异。
本文的术语“免疫毒性”是指药物或药物候选物产生不利的免疫刺激，例如细胞因子释放综合征的倾向性。
术语“药物候选物”是指任何潜在的药物或组合物，包括一种或多种活性剂如抗体、小分子和/或通过药物发现筛选确定为潜在地具有缓解、治疗和/或治愈疾病、病态、损伤、病痛或病症的治疗效果的其他化合物。
一个方面，本发明人发明了一种用于筛选和确定个体中的药物免疫毒性，特别是细胞因子释放综合征(CRS)人源化小鼠模型，其用于药物的临床前测试、临床试验和/或个体的单个治疗。本发明可用于确定个体对免疫调节药物的反应性和确定向个体施用免疫调节药物的安全剂量。
另一方面，本发明的人源化小鼠方法也可用于药物候选物的药物安全性评价。特别地，所公开的方法提供了药物候选物在人体中的免疫毒性的改进的临床前动物测试。
本文公开的用于确定药物免疫毒性的方法的优点在于能够检测对给定的免疫调节药物或免疫调节药物的组合的反应中的个体差异，与诸如体外PBMC细胞培养方法的现有技术方法相比在反应预测中具有更高的准确性，仅需从个体抽取适量(100毫升或更少)的血液进行测试，可商业获得合适的免疫缺陷小鼠以及不到两周的周转时间。
关于药物候选物的临床前免疫毒性测试，该方法具有上述所有优点，并且进一步提供一种用于评估药物候选物在施用后诱导的免疫刺激水平的灵敏方法，从而通过允许早期消除诱导不可接受的高水平的免疫刺激(例如，人体内通过施用此类药物候选物诱导的细胞因子释放)的药物候选物而节省药物研发的时间和成本。
有利地，如本文中进一步讨论的，本发明人发现该测定系统可预测体内反应，并且是研究和药物安全性评估的有力工具。在人类志愿受试者上进行的新药物候选者的当前临床测试常常导致药物失败。失败的原因是主要由于现有的体内动物模型的不足导致在临床前研究中并未暴露出毒性。对于可以准确地预测潜在药物候选物的不良反应的体内动物模型存在着长期未得到满足的需求。本发明的人源化小鼠模型可用作高准确度的药物筛选平台以从大量临床上相关的药物候选物中鉴定引起细胞因子释放的潜在药物候选物。因此，本方法代表了用于药物免疫毒性测试的可靠的预测分析方法，从而在临床前和临床测试之间提供了必要的联系。将本测定方法整合到药物开发项目中应加快用于治疗性药物开发的药物批准过程，例如在FDA。
一方面，本发明涉及确定免疫调节药物是否引起人的免疫毒性的方法。换句话说，本方法可以用作针对待接受免疫调节药物的个体患者的对于患者接受这种免疫调节药物是否安全的筛选分析。该方法可以包括：从人类受试者收获外周血单核细胞(PBMC)；将免疫调节药物(例如，mAb)施用于已被辐照并移植来自该个体收获PBMC的非人类免疫缺陷哺乳动物(例如，人源化的免疫缺陷小鼠)；和检测释放的一种或多种细胞因子(以IFN-γ和/或IL-10为例)；且因此确定免疫调节药物是否引起免疫毒性，其中如果免疫调节药物在非人类哺乳动物中引发严重的细胞因子风暴，那么该免疫调节药物在该个体中引起免疫毒性。
对于可用于医师在施用免疫调节药物之前确定人类受试者中的潜在CRS的可靠的体内小鼠方法存在着长期未满足的需要。理想地，该方法应准确地确定接受免疫调节药物的哪些人类受试者会遭受严重的CRS不良事件。如2006年3月报道的(如上所述)，在Northwick Park Hospital涉及mAb TGN1412的人体试验期间，该试验中有6名志愿者因不良事件而住院。尽管该试验的临床前工作在大鼠模型或食蟹猴(猕猴)中或在体内人PBMC细胞培养试验中均未显示CRS的迹象，但许多患者发生血管性水肿、皮肤和粘膜肿胀，继而出现多器官功能障碍。然而，本发明人发现，某些患者可能对给定的免疫调节药物有或没有严重的CRS不良事件，并且他们已经发明了一种用于预先确定特定患者在施用特定药物时是否可能发生CRS的方法。
细胞因子释放综合征伴随T细胞和自然杀伤(NK)细胞以及其他免疫细胞群体(例如，巨噬细胞等)的激活而发生。通过添加免疫调节剂，T细胞和自然杀伤细胞的激活可以导致高水平细胞因子的释放及下游损伤，且可能导致死亡。尽管由于TGN1412临床试验，对T细胞激活的作用已受到很多关注，但NK细胞激活也被证明是响应于免疫调节剂的细胞因子释放综合征的来源，例如CAMPATH 1-H(抗CD52抗体)的治疗已证明涉及NK细胞，在体内具有高水平的TNF、IFN-γ和IL-6释放(Wing MG等(1995)Ther.Immunol.2:183-190)，并且由IL-2和IL12的组合的治疗产生的毒性被证明是自然杀伤细胞而非B或T细胞激活的结果(CarsonW.E.,(1999)J Immunol 162；4943-4951)。对于不同的免疫调节剂和各种不同免疫细胞群体的激活，细胞因子释放综合征可以表现出高水平的细胞因子释放，其可以随各种激活的免疫细胞群体而变化。
本发明人认识到，在这种复杂的生物系统中，许多变量必须在小鼠模型可以提供药物诱导CRS的准确预测之前仔细地选择和优化。不幸的是，目前，在本领域中几乎没有关于应该选择哪些变量或应该如何优化它们的指导。考虑到该系统的高度错综复杂的特性，需要这些变量之间的微妙平衡以使小鼠模型提供有用和准确的药物诱导CRS的预测。
本发明人发现，人细胞数量(即，施用于小鼠的PBMC的数量)和小鼠中存在的人细胞类型的分布(随移植后时间变化)是系统中的关键变量。据发现，当将人PBMC注射到小鼠中时，仅人T细胞可以扩增；其他人细胞类型(例如，NK细胞和B细胞)开始灭绝。进一步发现，当人T细胞计数在小鼠中变得过高时，它们引起GVHD，其表现为体重减轻、弯腰姿势、掉毛、活动能力降低、呼吸急促和最终死亡。当小鼠表现出严重的GVHD时，严重损害测试结果的准确性。
不受理论的束缚，出乎意料地发现，PBMC中的成体人T细胞将小鼠识别为外来物并开始攻击小鼠，从而导致小鼠的健康问题和可能导致死亡(伴随着细胞因子的释放)。发生这种情况时，小鼠开始发生明显的体重减轻，并表现出病态症状，这使得小鼠模型不能准确地确定CRS。
不受理论的束缚，据信过多PBMC的移植增加了小鼠中的细胞因子释放谱，使得该方法提供不准确的预测(即，易于提供假阳性)。观察到，当移植的PBMC数量超过5x107个PBMC/小鼠时，一些小鼠发生显著的体重减轻，可能是由于移植后非常快速的GVHD(移植物抗宿主病)。当小鼠具有GVHD时，在这些小鼠中由免疫调节药物诱导的细胞因子释放反应不能准确地确定人类受试者对免疫调节药物的反应。或者，当移植的PBMC的数量低于某个阈值(例如，＜1×107/小鼠)时，该方法也不能以最佳灵敏度确定人类受试者对免疫调节药物的反应，并且将提供假阴性。此外，我们在移植前用X射线照射小鼠以破坏小鼠免疫系统，从而最小化排斥反应并最大化注射的人PBMC的存活。
因此，本发明人已经确定，移植的PBMC的数量和在免疫调节药物施用之前的PBMC移植时间对于通过平衡小鼠中人免疫细胞的足够群体的存在和分布来防止小鼠中GVHD的发作而获得该分析的最佳准确性至关重要。
PBMC人源化小鼠模型(与早先的BLT(骨髓/肝/胸腺)或干细胞人源化小鼠模型不同)在本领域中被认为是仅T细胞模型，因为当将人PBMC注射到小鼠体内时，只有T细胞群体可以扩增，而其他人细胞类型随着时间死亡。在本领域中，PBMC人源化小鼠通常在PBMC移植的10天后使用，其中PBMC移植数量通常为每小鼠1百万至1千万个细胞，从而研究需要等待T细胞群体扩增到足以进行实验的大数量。通常，小鼠细胞群体中存在的10％人CD45或人CD3T细胞被用作最少人细胞数量的标准。然而，本发明人已经确定，为了使PBMC人源化小鼠模型提供最佳的药物毒性测试，在小鼠中不仅需要T细胞，而且还需要其他细胞类型，尤其是NK细胞和单核细胞。
因此，在本文的某些实施方案中，本发明满足了长期未满足的需求，并且涉及确定免疫调节药物是否在个体(如人类)中引发细胞因子风暴反应(即，严重的细胞因子释放综合征)的体内方法，其包括以下步骤：(a)从被考虑接受免疫调节药物的个人收获或分离PBMC；(b)将1.5x107-3.0x107个收获/分离的PBMC移植到已接受辐照(例如，以功能上抑制小鼠免疫细胞攻击移植的PBMC)的免疫缺陷小鼠(NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1)中；(c)在移植后第5-7天，优选第6天，对移植的免疫缺陷小鼠施用免疫调节药物；(d)检测施用后释放的一种或多种细胞因子的存在；和(e)与对照药剂(例如，对照mAb)相比，评估对免疫调节药物的细胞因子反应以通过测定小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度来确定小鼠中细胞因子释放是否为指示严重细胞因子释放综合征的水平。
在一个实施方案中，本方法包括将从人分离的1.5x107-3.0x107个PBMC移植到辐照的免疫缺陷小鼠(例如，NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1)中；在移植后5-7天，优选6天，对移植的免疫缺陷小鼠施用免疫调节药物；检测施用后释放的一种或多种细胞因子的量；和确定免疫调节药物可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合症，其中在所述小鼠中严重的细胞因子释放综合症的存在指示所述免疫调节药物的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合症。本方法可以进一步包括提供辐照的免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGyX-射线辐照，或从人分离PBMC，或将药物施用后释放的细胞因子量与施用阴性对照药剂后释放的量进行比较。合适的阴性对照药剂的实例包括缓冲液或同种型对照mAb。检测的细胞因子可以是IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-2、IL-4、TNF或前述的组合，优选地细胞因子是IFN-γ或IL-10。如与未患严重CRS的其他患者相比的，本测定法使医师能够区分(或鉴定)哪些人类患者可能患有严重的CRS。
根据优选的示例实施方案，在移植前，用75-125cGy X-射线或100cGy X-射线辐照免疫缺陷小鼠。根据另外的示例实施方案，辐照发生在移植前至少四个小时。
本发明人已经确定，PBMC可以从个体(假定接受免疫调节药物)收获，并且可以用于在免疫缺陷小鼠(例如，NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1)中移植以获得人源化小鼠而使用本文公开的测定法测试由一种或多种药物诱导的免疫毒性(即，细胞因子释放)。有利地，本发明人惊奇地发现，该测定系统可预测将接受免疫调节药物施用的人类患者的体内反应。
存在可以在本发明的方法中使用的多种人细胞因子。已知许多炎性细胞因子在细胞因子释放综合征期间释放，包括IFN-γ、IL-1β、TNF、IL-2、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12。在确定细胞因子释放综合征时，据信一些细胞因子比其他细胞因子明显更重要。在本发明中，包括IFN-γ和/或IL-10作为确定CRS反应的预测细胞因子可能是特别合适的(Teachey DT等Cancer Discov.2016 Jun；6(6):664-79.doi:10.1158/2159-8290.CD-16-0040.Epub2016 Apr 13)。
本发明人发现人源化小鼠血液中的IFN-γ和/或IL-10可用于可靠地预测受试者中可预期的CRS的严重程度。与免疫调节药物诱导后的其他细胞因子水平相比及与人类相比，PBMC人源化小鼠中的IFN-γ水平和IL-10水平较高。预期可以使用其他抗体来帮助确定潜在反应的严重性。
本发明人发现，在免疫调节药物如抗CD28(ANC28.1/5D10)施用于小鼠后6小时，人源化小鼠血液中的IFN-γ水平处于或高于1800pg/ml和/或IL-10水平处于或高于120pg/ml的供体很可能产生严重的CRS(例如4-5级)(如果该药物施用于该人类受试者)。人源化小鼠血液中IFN-γ水平在300pg/ml至1,800pg/ml之间和/或IL-10水平在25pg/ml至120pg/ml之间的供体在接受免疫调节药物后很可能发生轻度CRS(发生1-3级CRS)(而不是严重CRS)。人源化小鼠血液中IFN-γ水平低于300pg/ml和/或IL-10水平低于25pg/ml的供体在接受免疫调节药物后很可能不发生CRS(Teachey DT等2016；Weiβmuller等.,PloS One DOI:10.1371/journal.pone.0149093 March 2016)。
在某些实施方案中，本发明涉及使用来自供体/受试者的1500万至3000万个收获/分离的人PBMC/小鼠，并将该PBMC移植到免疫缺陷小鼠中以获得人源化免疫缺陷小鼠，如下所述。在某些优选的实施方案中，使用1500万至2500万个收获/分离的人PBMC/小鼠。在某些优选的实施方案中，使用2000万收获/分离的人PMBC/小鼠。移植后5-7天，对小鼠施用免疫调节药物，并测量小鼠中的人细胞因子浓度以确定IFN-γ和IL-10的细胞因子释放是否为“严重或高反应”、“中度或低反应”或“无反应”的细胞因子释放，作为特定供体/受试者在免疫调节药物施用后是否出现细胞因子释放综合征(CRS)的预测因素或确定因素。“严重/高反应”测定为在向人源化小鼠施用免疫调节药物后6小时等于或高于1,800pg/ml的IFN-γ水平及等于或高于120pg/ml的IL-10水平。测量IFN-γ和IL-10，因为它们被确定为最能预测是否发生细胞因子释放综合征或细胞因子风暴。本发明人证明，使用本发明的体内分析系统，移植到免疫缺陷小鼠中的不同人供体PBMC对CRS诱导剂的反应不同。
在本方法中，如果受试者在人源化小鼠模型方法中是“低/无反应者”，则他/她在免疫调节药物施用时不太可能引发细胞因子反应，在这种情况下对个体施用免疫调节药物是安全的。因此，如果个体使用本方法确定为“低/无反应者”，则由于可能具有极其不利的细胞因子风暴效应而在以前无法用于治疗的免疫调节药物实际上可以用于该特定个体。如果使用个体的PBMC的人源化小鼠通过本方法确定该个体对免疫调节药物具有严重/高的IFN-γ和IL-10反应，则该个体很可能引发细胞因子风暴反应，且因而对个体施用免疫调节药物是不安全的。
在本方法中，使用免疫缺陷的小鼠(也称为免疫缺陷小鼠)。NSG小鼠是免疫缺陷的近交实验室小鼠品系。NSG小鼠缺乏成熟T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞或其组合。NSG小鼠还存在多种细胞因子信号传导途径的缺陷，并且在先天免疫方面有许多缺陷。NSG小鼠中的复合免疫缺陷允许移植广泛的原代人细胞以获得人源化小鼠，并使得能够对人类生物学和疾病的许多领域进行复杂建模。本发明人发现NSG小鼠具有与NSG-CSF-1小鼠和NSG-IL-6小鼠相似的反应。如本文所用，术语“人源化小鼠”、“人源化的免疫缺陷的小鼠”、“人源化免疫缺陷小鼠”及其复数形式可互换使用。因此，应将这些术语之一的使用解释为涵盖其所有。
在某些实施方案中，非人类哺乳动物是缺乏免疫系统的遗传修饰小鼠(即，人源化免疫缺陷小鼠)。免疫缺陷小鼠的实例包括但不限于NSG(即，NOD scidγ(NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ)小鼠)、NSG-CSF-1、NSG-IL-6等。本发明旨在涵盖免疫缺陷小鼠的其他具体实例。免疫缺陷小鼠优选缺乏其自身的T细胞、B细胞、NK细胞或其组合。结果，免疫缺陷小鼠预期允许移植人外周血单核细胞(PBMC)而没有即时移植物抗宿主排斥反应。
尽管先前的体内测定法可用于证明药物诱导的细胞因子信号，但本发明人假设，由于先前的测定法未能考虑在测试动物中供体细胞数量及其动态免疫学变化(例如，足够的循环CD3细胞和NK细胞，以及GVHD的存在)的关键性，现有技术的测定法容易产生假阳性和假阴性反应。前者可能是由于供体细胞(即，CD3细胞和NK细胞)过多，从而使该测定法过于灵敏-且无法产生细胞因子释放的准确预测。后者可能是由于供体细胞(即，CD3细胞和NK细胞)太少，从而也使测定法太不灵敏-无法产生细胞因子释放的准确预测。使事情复杂化的是，过高的CD3细胞可导致移植物抗宿主防御机制在测试动物中运行，从而使小鼠模型不适合筛选细胞因子释放。
本发明解决了提供一种准确确定人类受试者中的严重CRS的体内筛选测定法的长期未满足的需求。这可以通过调节移植的PBMC的量和PBMC移植后施用药物的时机间来实现。
如本领域技术人员可理解的，有许多合适的方式来收获和分离PBMC。也存在许多合适的方式将PBMC引入免疫缺陷小鼠中，包括，作为非限制性实例，静脉内和心内方式。
本发明人已经确定，PBMC可以从单个人(假定接受免疫调节药物)收获，且然后可以用于移植到免疫缺陷小鼠(例如NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1)中以使用本文公开的测定法测试毒性(即细胞因子释放)。有利地，本发明人发现该测定系统可预测将接受免疫调节药物施用的提供PBMC的人类患者的体内反应。
在不依赖于理论的情况下，据信太多的PBMC可能增强细胞因子释放谱的敏感性，从而使其过度扩展而提供不准确的预测(即，提供许多假阳性)。观察到，当PBMC的数量超过5x107个PBMC/小鼠时，一些小鼠发生明显的体重减轻，可能是由于GVHD(移植物抗宿主病)。当发生这种情况时，这些小鼠中由免疫调节药物诱导的细胞因子释放反应不能准确地确定人类受试者中的CRS。可选地，当施用的PBMC数量低于某个阈值(例如，＜1x107/小鼠)时，该方法也不能以最佳灵敏度确定CRS(即，提供许多假阴性)。
在本方法的示例实施方式中，在将分离的PBMC移植到免疫缺陷小鼠之前至少四小时，小鼠用100cGy X-射线(或75cGy-125cGy X-射线)辐照。辐照可以在从人收获和分离PBMC的步骤之后、之前或与其同时发生。据信通过使用辐射，T细胞在NSG小鼠中更快地扩增。不受理论的束缚，据信辐照增强了人类细胞的移植。尽管尚不清楚确切的机制，辐照可导致骨髓抑制(myeloablation)，其破坏小鼠免疫细胞并增加人PBMC生存因子和加速人T细胞扩增。辐照还诱导外周血、脾脏和骨髓中小鼠免疫细胞的细胞死亡(凋亡)，从而允许增加的人免疫细胞到达骨髓。没有辐照的情况下，将需要更长的时间来获得足够的人免疫细胞以进行本发明的方法。但是，随着时间，人PBMC丧失一些细胞类型，例如NK细胞和单核细胞，因为这些细胞类型无法在小鼠中生长，且它们只存活数天并消亡。通常，NK和骨髓细胞的更新比CD3 T细胞更快，但是小鼠中NK细胞和骨髓细胞的短存活期是由于缺乏刺激它们存活的因子(如IL15)。无论有无辐照，由于NK细胞(和骨髓细胞)的短存活期，NK细胞应在PBMC移植后第10天失去。只有T细胞可以在NSG小鼠中扩增。该测定法需要尽可能多的人免疫细胞类型来测试毒性。因此，具有最佳移植人免疫细胞群体且在严重GVHD发作之前的时间段，例如具有1.5x107至3.0x107 PBMC移植的本方法的第5-7天，对于实现最佳灵敏度而同时最小化假阴性是至关重要的。
在某些示例实施方案中，本发明涉及将特定范围的人PMBC(1.5-3.0x107/小鼠)移植到免疫缺陷小鼠中。在某些优选的实施方案中，移植的人PBMC的数量是2×107/小鼠。
本发明人还发现，当将特定个体的PBMC移植到辐照的免疫抑制小鼠中，和然后在这种移植后的关键时间段内(例如5-7天后)(优选6天后)将免疫调节药物施用于小鼠时，则可以使用IFN-γ和/或IL-10测量细胞因子反应以确定该特定的人是否是“严重”或“高反应者”，这意味着受试者很可能引发重大细胞因子释放反应如细胞因子释放综合症，其可能对人是致命的，且因此不应施用该免疫调节药物。
某些T细胞激活剂，特别是针对T细胞抗原受体(TCR)的单克隆抗体(mAb)如ORTHOCLONE
Figure BDA0002304375810000301
(“OKT3”)，一种鼠单克隆抗体(其临床上用于免疫抑制的第一种mAb)，可诱导促炎性细胞因子的全身释放(Abramowicz D.等Transplantation,1989Apr；47(4):606-8)。其中最危险的是TNF、干扰素-γ(IFN-γ)和IL-2。在接受mAb治疗的患者中，通过大剂量皮质类固醇治疗来控制这种细胞因子释放综合征或“细胞因子风暴”是常规实现的。ORTHOCLONE是莫罗单抗-CD3的商标名，它是一种静脉给予以逆转移植器官(包括心脏、肾脏和肝脏)的急性排斥反应的免疫抑制药物。OKT3通过阻断在急性移植物排斥中起主要作用的T细胞的功能发挥作用。OKT3与T细胞的细胞膜中称为CD3的分子发生反应并阻断其功能。OKT3与T淋巴细胞的结合导致其早期活化，导致细胞因子释放，继而阻断T细胞功能。它是作为CRS的强诱导剂的免疫抑制药物。抗CD28抗体ANC28.1/5D10是较弱的CRS诱导剂。其他抗体和免疫调节剂可用于本方法中，包括正在开发的药物候选物。
免疫调节药物的实例包括但不限于抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20mAb、抗CD52 mAb；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺及其衍生物或类似物，如来那度胺
Figure BDA0002304375810000303
泊马度胺
Figure BDA0002304375810000304
和阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；IMLYGICTM(talimogenelaherparepvec)；阿达木单抗
Figure BDA0002304375810000311
卡妥索单抗
Figure BDA0002304375810000312
替伊莫单抗托西莫单抗-I131
Figure BDA0002304375810000314
本妥昔单抗
Figure BDA0002304375810000315
betuximab
Figure BDA0002304375810000316
利妥昔单抗(
Figure BDA0002304375810000317
或
Figure BDA0002304375810000318
)、阿仑单抗(
Figure BDA0002304375810000319
或
Figure BDA00023043758100003110
)、贝伐单抗帕妥珠单抗
Figure BDA00023043758100003112
曲妥珠单抗
Figure BDA00023043758100003113
trastuzumab emtansinen(KADCYLATM)、狄诺塞麦(
Figure BDA00023043758100003114
或
Figure BDA00023043758100003115
)、奥法木单抗
Figure BDA00023043758100003116
帕尼单抗
Figure BDA00023043758100003117
派姆单抗
Figure BDA00023043758100003118
纳武单抗
Figure BDA00023043758100003119
伊匹单抗
Figure BDA00023043758100003120
阿特珠单抗
Figure BDA00023043758100003121
阿维单抗
Figure BDA00023043758100003122
度伐单抗
Figure BDA00023043758100003123
达雷木单抗色瑞替尼
Figure BDA00023043758100003125
和抗胸腺细胞球蛋白(
Figure BDA00023043758100003126
(兔)或
Figure BDA00023043758100003127
(马))。
因此，在某些示例实施方式中，免疫调节药物是治疗性抗体。该抗体可以是单克隆的或多克隆的。单克隆抗体(mAb)可包括但不限于TGN1412(抗CD28 mAb)(TAB08)、OKT3(抗CD3 mAb)、
Figure BDA00023043758100003128
(利妥昔单抗)(抗CD20 mAb)、(阿仑单抗，也作为销售)(抗CDS2 mAb)、
Figure BDA00023043758100003131
(派姆单抗)、
Figure BDA00023043758100003132
(纳武单抗)、
Figure BDA00023043758100003133
(伊匹单抗)、
Figure BDA00023043758100003134
(色瑞替尼)、
Figure BDA00023043758100003135
(阿特珠单抗)、(阿维单抗)、
Figure BDA00023043758100003137
(度伐单抗)等。在其他实施方案中，免疫调节药物可以是小分子药物，如
Figure BDA00023043758100003138
(来那度胺)；多克隆抗体，如抗胸腺细胞球蛋白；或生物药物，如蛋白质，例如干扰素。
如本领域技术人员理解的，可以使用多种施用途径将免疫调节药物施用于非人类免疫缺陷哺乳动物。示例性的施用途径包括但不限于静脉内、股骨内，心室内、心内、腹膜内施用途径等。优选的施用途径是静脉内输注。
不依赖于特定理论，据信在用人PBMC移植小鼠后第5-7天存在于人源化免疫缺陷小鼠中的主要细胞可测试施用免疫调节药物时的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴毒性。该测试取决于包括注射后PBMC细胞数量和人PBMC的比率的因素。据信，所施用的细胞的细胞类型和细胞数量(量)之间的平衡对于确定细胞因子释放综合征是重要的。例如，如图2B中所示，NK细胞(CD56)是存在的CD45细胞的约20-30％，并在移植后第10天降低至1-5％。因此，到第10天，该PBMC人源化小鼠中的主要细胞类型是T细胞，且该PBMC人源化小鼠不具有许多其他人细胞类型且不是毒性测试的良好模型。
本发明的非限制性示例实施方案包括确定在向人类个体施用免疫调节药物时，免疫调节药物是否可能在该个体中引发细胞因子释放综合征(CRS)、SIRS或细胞因子风暴(CRS的严重情况)的方法。根据示例实施方案，该方法包括以下步骤：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)将从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)移植到所述小鼠中；
(c)在移植后5-7天向所述小鼠施用免疫调节药物；
(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和
(e)确定所述免疫调节药物可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征，
其中在所述小鼠中严重细胞因子释放综合症的存在指示所述免疫调节药物的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合症。
在另一个非限制性的示例实施方案中，本发明包括确定在对人类个体施用免疫调节药物时，免疫调节药物是否可能在该个体中引发细胞因子释放综合征(CRS)、SIRS或细胞因子风暴(CRS的严重情况)的方法。根据示例实施方案，该方法包括以下步骤：
(a)从人分离外周血单核细胞(PBMC)；
(b)将2x107的所述分离的PBMC移植到辐照的免疫缺陷小鼠中；
(c)在移植后5-7天向所述小鼠施用免疫调节药物；
(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，
其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征，和
其中在所述小鼠中严重细胞因子释放综合症的存在指示所述免疫调节药物的施用可能在所述的人中引发严重的细胞因子释放综合症。
根据示例实施例，该方法可以进一步包括
(e)确定该人是否适合用免疫调节药物进行治疗，
其中在小鼠中引发的严重细胞因子释放综合症指示该人不适合用该免疫调节药物治疗。
如果在小鼠模型中响应于免疫调节药物的细胞因子IFN-γ和IL-10的浓度测量为“严重/高”，则该免疫调节药物可能引发严重的细胞因子释放综合征或细胞因子风暴，且该人不适合治疗。如果认为某个人不适合使用该特定免疫调节药物的治疗，可以尝试另一种抗体或化学疗法或其他药物来治疗该个体/患者。
如果IFN-γ和IL-10两者的浓度显示“低/无反应”或“低反应”，则该人类个体适合用该免疫调节药物进行治疗。“无反应”相对于“低反应”下限的确定可能难以辨别，并且可能取决于分析的灵敏度，但是可能没有必要在反应谱的这一端设置明确界线，因为“无反应”和“低反应”两者都表示该人适合于治疗。
如本文所述，人源化移植的小鼠注射不同的免疫调节药物，如各种治疗性抗体，包括例如抗CD28 mAb、OKT3(抗CD3 mAb)，并观察抗体在人源化小鼠中的作用。相对于某些个体/样品，抗CD28和OKT3处理的小鼠均显示出主要炎性细胞因子的显著增加。对非人源化小鼠的施用不诱导细胞因子反应。这些发现表明，移植PBMC的人源化小鼠可以确定某些药物对特定受试者/个体的免疫毒性。
本方法包括对已经移植人PBMC的非人类哺乳动物施用免疫调节药物，并确定该免疫调节药物是否在非人类哺乳动物中引起毒性，其中如果该药剂在非人类哺乳动物中引起毒性，则认为该药剂在人类中引起免疫毒性。
免疫毒性是指药剂对个体的免疫系统功能性的不良的/不希望的影响。参见，例如，Weir,A,Journal of Immunotoxicology,5:3-10(2008)；Gribble,E J.等,ExpertOpinion Drug Metab Toxicol,3(2)(2007)。
在一些情况下，免疫毒性可在人体内产生细胞因子风暴。细胞因子风暴、细胞因子释放综合征或输注反应通常是在首次暴露于药剂(例如治疗性mAb)时观察到的不良事件。其特征在于几种炎性细胞因子的全身性释放。症状从轻到重，包括疲劳、头痛、荨麻疹、瘙痒、支气管痉挛、呼吸困难、舌头或喉咙肿胀的感觉、鼻炎、恶心、呕吐、潮红、发烧、发冷、低血压、心动过速和乏力。参见，例如，Wing,M.等Journal of Immunotoxicology,5:11-15(2008)和Wang,H.等,American Journal of Emergency Medicine,26:711-715(2008)。
因此，在再另一方面，本发明涉及确定(一种或多种)药剂的施用是否在需要的个体(例如人)中引起细胞因子释放综合征的方法。该方法包括在一定天数后向移植一定数量的PBMC的非人类哺乳动物施用该药剂，并测定非人类免疫缺陷哺乳动物中由该药剂诱导的一种或多种人细胞因子的水平；和确定该药剂是否在非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，其中如果该药剂在非人类哺乳动物中引起细胞因子释放综合征，则该药剂在人类中引起细胞因子释放综合征。
本发明人发现，在PBMC移植到NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1小鼠中后测试免疫调节药物的天数是关键的，只要天数产生合适的细胞组成。天数可以根据最初将多少PBMC移植到小鼠中而有所不同。也就是说，如果移植了更多的PBMC(在当前范围内)，则测试免疫调节药物前的天数与移植更少的PBMC(在当前范围内)相比可能会稍短(也在当前范围内)。据信，由于成体人T细胞对小鼠的免疫细胞同种异体识别导致移植的PBMC开始杀死小鼠细胞，小鼠经历移植物抗宿主病(GVHD)。发生这种情况时，小鼠开始发生明显的体重减轻，并表现出严重的病态症状，这使小鼠模型无法准确确定CRS。在某些实施方案中，本发明提出在PBMC移植后4-7天或5-7天施用免疫调节药物。在某些优选的实施方案中，本发明提出在PBMC移植后6天施用免疫调节药物。
本发明人比较了随每只小鼠中注射的细胞数量(每小鼠2000万个细胞vs.每小鼠5000万个细胞)变化的IFN-γ和IL-10的反应水平(参见图9A-9B)。注射到小鼠中的PBMC数量是决定性因素。当注射大量的PBMC(例如每小鼠5000万个PBMC)时，小鼠显示出高的细胞因子释放，IFN-γ和IL-10均分别增加≥1,800pg/ml和≥120pg/ml。但是该供体(213)(用于图9中的)在之前每小鼠注射2000万PBMC时具有低的细胞因子释放。该数据表明，每小鼠2000万个PBMC(或每小鼠1500-3000万个PBMC的范围)在用于患者筛选的优选范围内。根据本发明，用于检测个体响应于免疫治疗药物的细胞因子风暴中的PBMC范围为1500万至3000万PBMC。优选地，PBMC范围在2000万到2500万PBMC之间。更优选地，浓度是每小鼠2000万个PBMC。
本发明提供了用于确定免疫调节药物在人类患者中引起不良的细胞因子释放综合征(CRS)的潜能的改进的体内方法。
有利地，如本文进一步讨论的，本发明人还发现该测定系统对于体内反应是确定性的，并且代表了研究和药物安全性评估的有力工具。当前在人类志愿受试者上对新药物候选物的临床测试常常导致药物失败。失败的原因是主要由于现有体内动物模型的不足导致毒性在临床前研究未暴露。对于可以准确地预测潜在药物候选物的不良反应的体内动物模型存在着长期未得到满足的需求。筛选用于开发成治疗药物候选者的药物候选物必须通过体外和体内临床前测试。
本领域技术人员也将理解，存在多种将PBMC引入非人类哺乳动物中的方法。这类方法的非限制性实例可以包括静脉内、股骨内、心室内、心内施用途径。优选地，PBMC通过静脉内引入。
本发明人发现PBMC移植时间是关键的。特别地，观察到可以在小鼠移植受试者的PBMC后的特定时间范围内施用免疫调节药物。
在移植后第3天，细胞数量不足。本发明人发现，在第5天，存在足够的人类细胞类型，并且这些人类细胞的数量对于测试是最佳的(人CD45％＞10％)。但是在第10天，许多细胞类型的细胞数量(总活细胞的百分比)减少。例如，NK细胞从第5天的20-30％减少到第10天的1-5％(图2B和2C)。因此，本方法包括在移植后第4至7天或第5至7天或第6天对人源化小鼠施用药物。
据信，需要许多淋巴、骨髓和可能其他人免疫细胞类型参与免疫毒性反应，并且这包括起重要作用的T细胞和NK细胞。在目前的PBMC人源化小鼠模型中，发明人发现在早期时间点小鼠中存在不同的人细胞类型。在移植的第5天，人T细胞和NK细胞是那些小鼠中的主要细胞群体(图2和图4A)。
还据信，为了最佳的毒性测试，需要在小鼠中达到临界的人细胞水平。当人PBMC注射到小鼠中时，只有人T细胞可以扩增；其他细胞类型将随时间开始消亡。在随时间的细胞数量(即，施用于小鼠的PBMC数量)和细胞类型变化之间需要复杂的平衡。
此外，本发明人发现，实验需要在小鼠发生移植物抗宿主病GVHD之前进行，该疾病表现为体重减轻。如下面进一步讨论的，在8天后，发明人观察到移植PBMC的许多人源化小鼠的显著体重减轻，这表明严重的移植物抗宿主病GVHD。一般认为，在小鼠中人T细胞无法永远生长；当T细胞数量很高时，它们会攻击小鼠(伴随细胞因子释放)，并引起GVHD。如果小鼠患有GVHD，由于在人T细胞攻击小鼠细胞时释放细胞因子，这将影响测试结果的准确性(Ju XP等Transplantation.1997；63(9):1307-1313)。小鼠最终因GVHD而死亡。
GVHD的实例的数据在图3A-3D中描绘。在图3A和3B中，早在5×107 PBMC移植后的第6天，移植来自供体4629和362的PMBC到小鼠中引起显著的体重减轻。图3C显示对于供体309，接受2×107 PMBC的小鼠在第8天后开始体重减轻，而图3D显示了接受来自供体358的3×107 PMBC的小鼠在第7天后开始体重减轻。
此外，具有GVHD的这些小鼠在8天后患病，且因此不再适合该研究。本发明人不仅观察到体重减轻，它们还表现出弯腰的姿势、掉毛、活动减少和呼吸急促。体重减轻20％后，必须处死小鼠。
因此，为了确保小鼠不患有GVHD或其他疾病，关键的是在移植PBMC后的8天之前施用免疫调节药物。此外，药物可能不能过早施用，因为在早至(例如)第3天时可能没有足够的细胞。需要有足够的循环池以使测试准确。
因此，考虑到以上因素，在某些实施方案中，在小鼠移植PBMC后5-7天将免疫调节药物施用于小鼠。在一些优选的实施方案中，免疫调节药物在移植PBMC后6天施用于小鼠。在这段时间内，小鼠应保持在适宜的条件下，包括满足本领域技术人员已知的哺乳动物的基本需求(例如食物、水、光照)。
在下面阐述的实施例中，发明人对于10个供体的实验选择第6天。测量一种或多种促炎性细胞因子(人或小鼠)表达增加的方法也是本领域技术人员已知的。促炎性人细胞因子包括IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、IL-4、γ-干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子α(TNF-α或“TNF”)、IL-10或其组合。可以使用流式细胞术如本文所述的确定促炎性细胞因子的表达增加。
另一方面，公开了一种确定在施用免疫调节药物的组合后，该免疫调节药物组合是否可能在人体中引发严重的细胞因子释放综合征(CRS)的方法。在一个实施方案中，组合包括第一免疫调节药物和第二免疫调节药物。在另一个实施方案中，该方法包括提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；然后将从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)移植到免疫缺陷小鼠以产生人源化小鼠；在移植PBMC后5-7天向人源化小鼠施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物；测定人源化小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和确定免疫调节药物的组合可能在该人中引发严重的细胞因子释放综合征，其中在小鼠中严重的细胞因子释放综合征的存在指示免疫调节药物组合的施用可能在该人中引发严重的细胞因子释放综合征。
每只小鼠移植的PBMC数量可以是2x107 PBMC。免疫缺陷小鼠可以是NSG小鼠、NSG-IL-6小鼠或NSG-CSF-1小鼠，优选为NSG小鼠。免疫缺陷小鼠可以在移植之前用100cGy X-射线进行辐照。可以在移植后6天进行药物的施用。多种细胞因子可以进一步包括IL-2、IL-4、IL-6或TNF。可以测定IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-2、IL-4和TNF中每一种的细胞因子浓度。在施用所述免疫调节药物组合后2至6小时，优选6小时测定多种细胞因子的血液浓度。
在多种免疫调节药物的一种示例性组合中，免疫调节药物可独立地选自抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52 mAb；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺及其衍生物或类似物，如来那度胺
Figure BDA0002304375810000381
泊马度胺
Figure BDA0002304375810000382
和阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；IMLYGICTM(talimogene laherparepvec)；阿达木单抗
Figure BDA0002304375810000383
卡妥索单抗替伊莫单抗
Figure BDA0002304375810000385
托西莫单抗-I131
Figure BDA0002304375810000386
本妥昔单抗betuximab
Figure BDA0002304375810000388
利妥昔单抗(
Figure BDA0002304375810000389
或
Figure BDA00023043758100003810
)、阿仑单抗(
Figure BDA00023043758100003811
Figure BDA00023043758100003812
或
Figure BDA00023043758100003813
)、贝伐单抗
Figure BDA00023043758100003814
帕妥珠单抗曲妥珠单抗
Figure BDA00023043758100003816
trastuzumab emtansinen(KADCYLATM)、狄诺塞麦(
Figure BDA00023043758100003817
或)、奥法木单抗
Figure BDA0002304375810000391
帕尼单抗
Figure BDA0002304375810000392
派姆单抗
Figure BDA0002304375810000393
纳武单抗
Figure BDA0002304375810000394
伊匹单抗
Figure BDA0002304375810000395
阿特珠单抗
Figure BDA0002304375810000396
阿维单抗
Figure BDA0002304375810000397
和度伐单抗
Figure BDA0002304375810000398
达雷木单抗
Figure BDA0002304375810000399
色瑞替尼
Figure BDA00023043758100003910
和抗胸腺细胞球蛋白(
Figure BDA00023043758100003911
(兔)或
Figure BDA00023043758100003912
(马))。
在另一个示例性组合中，第一免疫调节药物和第二免疫调节药物独立地选自抗CD28 mAb、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52mAb、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；talimogene laherparepvec；阿达木单抗、卡妥索单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗-I131、本妥昔单抗、betuximab、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、trastuzumab emtansinen、狄诺塞麦、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、达雷木单抗、色瑞替尼、艾洛珠单抗和抗胸腺细胞球蛋白。抗CD52 mAb可以是阿仑单抗，抗C20 mAb可以是利妥昔单抗，抗CD3 mAb可以是OKT3，和抗CD28 mAb可以是TGN1412。
在一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是派姆单抗或纳武单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、epacadostat、talimogene laherparepvec、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、色瑞替尼、达雷木单抗、艾洛珠单抗或度伐单抗。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是派姆单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是派姆单抗，和第二免疫调节药物是泊马度胺。
在一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是纳武单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是纳武单抗，和第二免疫调节药物是泊马度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是纳武单抗，和第二免疫调节药物是艾洛珠单抗。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是纳武单抗，和第二免疫调节药物是达雷木单抗。在一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是纳武单抗，和第二免疫调节药物是伊匹单抗。
在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是伊匹单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或度伐单抗。
在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是阿特珠单抗、阿维单抗或度伐单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、派姆单抗、伊匹单抗、利妥昔单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或阿仑单抗。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是度伐单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是度伐单抗，和第二免疫调节药物是利妥昔单抗。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是度伐单抗，和第二免疫调节药物是泊马度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是度伐单抗，和第二免疫调节药物是达雷木单抗。在又一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是度伐单抗，和第二免疫调节药物是依鲁替尼。
在一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是艾洛珠单抗，和第二免疫调节药物是泊马度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是阿特珠单抗，和第二免疫调节药物是泊马度胺。在另一个优选的实施方案中，第一免疫调节药物是阿特珠单抗，和第二免疫调节药物是来那度胺。
另一方面，本发明提供了确定在施用免疫调节药物后在人体内不引发细胞因子释放综合征的免疫调节药物的安全剂量的方法。本方法可以包括提供具有第一剂量的免疫调节药物，所述免疫调节药物的第一剂量确定为在其施用后在第一辐照的人源化免疫缺陷小鼠中引发轻度或严重细胞因子释放综合征；提供第二免疫缺陷小鼠，所述第二小鼠用75-125cGy X-射线辐照；将从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)移植到所述第二小鼠中；在移植PBMC后5-7天向所述第二小鼠施用免疫调节药物，所述免疫调节药物以低于所述第一剂量的第二剂量施用；确定所述第二小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度；和确定所述免疫调节药物用于施用于所述人的安全剂量，所述安全剂量是在施用所述免疫调节剂于所述第二小鼠后产生IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度的剂量，其中所述第二小鼠中IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度指示所述安全剂量的所述免疫调节药物的施用可能不会在所述人中引发细胞因子释放综合征。
在另一个实施方案中，本方法提供了对于怀疑在人体内引发轻度或严重细胞因子释放综合征的免疫调节药物的安全剂量的优化。本方法包括：提供免疫缺陷的小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；移植从人分离的1.5-3.0x107外周血单核细胞(PBMC)；在移植PBMC后5-7天，向所述小鼠施用免疫调节药物，所述免疫调节药物施用的剂量低于怀疑引发轻度或严重细胞因子释放的剂量；测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度；和确定用于在所述人中施用的所述免疫调节药物的安全剂量，所述安全剂量是在施用所述免疫调节药物于所述小鼠后产生IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度的剂量，其中所述小鼠中IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度指示，所述安全剂量的所述免疫调节药物的施用在所述人可能不引发细胞因子释放综合征。
每只小鼠移植的PBMC数量可以是2x107 PBMC。示例性免疫缺陷小鼠包括NSG小鼠、NSG-IL-6小鼠、NSG-CSF-1小鼠等。优选地，免疫缺陷小鼠是NSG小鼠。在优选的实施方案中，免疫缺陷小鼠在移植前用100cGy X-射线进行辐照。可以在移植后6天进行药物的施用。多种细胞因子可以进一步包括IL-2、IL-4、IL-6或TNF。多种细胞因子的血液浓度可以在施用免疫调节药物后2至6小时，优选在施用免疫调节药物后6小时测定。免疫调节药物可以是本文公开的任何药物。例如，免疫调节药物可以是抗-CD28 mAb、抗-CD3mAb、抗-CD20 mAb、抗-CD52 mAb、派姆单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、epacadostat、talimogene laherparepvec、纳武单抗、来那度胺、色瑞替尼或抗胸腺细胞球蛋白。
另一方面，本发明提供了确定向人施用免疫调节药物在人体内诱导细胞因子释放综合征的可能性的体外方法，该方法包括：提供在移植来自人的1.5-3.0x 107个分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用免疫调节药物的人源化、辐照的免疫缺陷小鼠的血液样品；和体外检测小鼠血液样品中存在的包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，其中小鼠血液样品中IFN-γ≥1,800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示向该人施用免疫调节药物可能诱导严重的细胞因子释放综合征。
另一方面，本发明提供一种确定向人施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合在人体内诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法。本方法可以包括提供来自在移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合的人源化、辐照的免疫缺陷小鼠的血液样品；和体外检测小鼠血液样品中存在的包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示向该人施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合可能诱导严重的细胞因子释放综合征。
根据进一步的方面，本发明提供了一种人源化小鼠模型作为准确地从大量临床相关的药物候选物中鉴定以进行临床评估的药物筛选平台。本测定法消除了在人体中引发细胞因子释放的潜在药物候选物，且因此代表了用于药物免疫毒性测试的强大预测工具。
本测定法代表针对可能对人体免疫系统产生不利影响的药物候选物的药物测试分析。本测定法还可提供针对药物候选物或药物候选物组合的药物测试。该模型提供了临床前测试与临床测试之间的必要联系。将本测定法整合到药物开发计划中应当加快用于治疗药物开发的FDA批准过程。这些方法中的药物候选物或药物候选物组合不限于就本文其他实施方案提及的免疫调节药物，而是可以包括在治疗、减轻和/或治愈疾病、病态、病痛、损伤或其他病症方面可能具有治疗作用的任何药物候选物。
因此，另一方面，本发明涉及确定药物候选物在人体中是否引起免疫毒性的方法。该方法包括向已经移植人外周血单核细胞(hPBMC)的非人类免疫缺陷哺乳动物(例如NSG、NSG-CSF-1或NSG-IL-6小鼠)施用药物，并通过确定该药物是否在非人类哺乳动物中引起免疫毒性而确定药物是否在人体内引起免疫毒性。
因此，本发明提供了确定药物候选物用于人的免疫毒性的体内方法，其包括以下步骤：(a)提供免疫缺陷的小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；(b)将4.5-5.5x107-5.5x107个人PBMC，优选5.0x107个人PBMC移植到小鼠(例如NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1)中；(c)在移植后4-7天向小鼠施用药物候选物；(d)测定所述小鼠血液中的细胞因子浓度，其中所述细胞因子是选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF的至少一种细胞因子；和(e)确定所述药物候选物的免疫毒性，其中所述小鼠中选自IFN-γ≥300pg/ml，IL-2≥15pg/ml，IL-4≥10pg/ml，IL-6≥10pg/ml，IL-10≥25pg/ml或TNF≥5pg/ml的至少一种细胞因子的血液浓度指示所述药物候选物在人体中的免疫毒性。免疫缺陷小鼠可以是NSG小鼠、NSG-IL-6小鼠或NSG-CSF-1小鼠，优选为NSG小鼠。在优选的实施方案中，免疫缺陷小鼠用100cGy X-射线辐照。细胞因子释放可以在药物候选物施用后2至6小时，优选药物候选物施用后6小时在小鼠血液中测定。
在一个实施方案中，确定药物候选物的人免疫毒性的方法包括将4.5×107-5.5×107的人PBMC移植到辐照的免疫缺陷小鼠；在移植后4-7天，优选移植后5-7天，更优选6天向所述小鼠施用药物候选物；测定所述小鼠血液中的细胞因子释放，其中所述细胞因子是选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF的至少一种细胞因子；和当在小鼠血液中检测到低的细胞因子释放时，确定该药物候选物具有低的人类免疫毒性。在一个实施方案中，确定药物候选物的人免疫毒性的方法包括提供来自在移植4.5-5.5x 107个分离的人外周血单核细胞(PBMC)后4-7天，优选移植后5-7天，更优选6天施用药物候选物的人源化、辐照的免疫缺陷小鼠的血液样品；和体外检测小鼠血液样品中存在的至少一种人细胞因子的浓度以确定药物候选物的人免疫毒性，其中所述至少一种人细胞因子选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNFα，且其中当在小鼠血液样本中检测到低的人细胞因子浓度时，药物候选物的人免疫毒性低。免疫缺陷小鼠可以是NSG小鼠、NSG-IL-6小鼠或NSG-CSF-1小鼠，优选地所述免疫缺陷小鼠是NSG小鼠。免疫缺陷小鼠可以用75-125cGy X-射线辐照，优选免疫缺陷小鼠用100cGy X-射线辐照。可以在药物候选物施用后2至6小时，优选在药物候选物施用后6小时，测定小鼠血液中的细胞因子释放。小鼠血液中的低细胞因子释放可包括IFN-γ<300pg/ml，IL-10<25pg/ml，IL-2<15pg/ml，IL-4<10pg/ml，IL-6<10pg/ml或TNF<5pg/ml。小鼠血液中的低细胞因子释放可包括不超过通过施用阴性对照诱导的细胞因子量的细胞因子量。
本发明进一步提供了用于鉴定药物候选物和/或药物组合是否具有适合于FDA批准的安全性特征的步骤，其中低的细胞因子释放指示适合于FDA批准的安全性特征。根据非限制性的示例实施方案，将4.5x107至5.5x107的人PBMC移植到辐照的免疫缺陷小鼠中。根据其他非限制性的示例实施方案，将5.0x107个人PBMC移植到辐照的免疫缺陷小鼠中。确定安全性特征的方法中移植的PBMC可以来自单一个体或一群人。根据优选的实施方案，在将PBMC移植到免疫缺陷小鼠中之前至少四小时，用75cGy-125cGy X-射线照射免疫缺陷小鼠。根据其他优选的实施方案，在将PBMC移植到免疫缺陷小鼠中之前至少四小时用1100cGy X-射线照射免疫缺陷小鼠。例如，对药物的反应可以与对照药剂相比来评估。本测定使得能够确定药物候选物通过药物安全性评估。
根据其他示例实施方案，本发明提供了移植人外周血单核细胞的人源化、辐照的免疫缺陷小鼠，所述人源化、辐照的免疫缺陷小鼠是NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠。优选地，小鼠被移植1.5-3.0×107个PBMC。NSG小鼠可以进一步包含人巨噬细胞集落刺激因子-1基因(NSG-CSF-1)或人白介素-6基因(NSG-IL-6)。更优选地，小鼠用2x107PBMC移植。根据其他示例的优选实施方案，小鼠移植4.5-5.5×107个PBMC。
根据其他示例性实施方案，本发明提供了移植了人外周血单核细胞的人源化免疫缺陷小鼠，所述人源化免疫缺陷小鼠是具有人巨噬细胞集落刺激的因子-1基因的NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG)小鼠(NSG-CSG-1)。优选地，小鼠移植1.5-3.0×107个PBMC。更优选地，小鼠移植2x107个PBMC。根据其他示例优选实施方案，小鼠移植4.5-5.5×107个PBMC。
参照以下详细描述结合附图，本发明示例实施方案的其他方面、优点和/或其他特征将变得显而易见。对于本领域技术人员清楚的是，本文提供的所描述实施方案仅是示例性和说明性的，而不是限制性的。可以设想其修改的许多实施方案都落入本公开及其等同物的范围内。
提供以下实施例以进一步说明本方法的各种非限制性实施方案和技术，包括在开发本方法时进行的实验。然而，应当理解，这些实施例仅是示例性的，并不限制权利要求的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的是，许多变化和修改旨在被包含在本发明的精神和范围内。
实施例
实施例1.人源化小鼠中人PBMC的移植
在本研究中，使用了两个人源化免疫缺陷小鼠品系：6周龄雌性(i)NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,JAX货号005557)小鼠和(ii)NSG-CSF-1小鼠(JacksonLaboratory货号:028654)。在人PBMC移植前至少4小时，小鼠用100cGy X-射线照射。将来自相同供体的纯化/分离的人PBMC(Astarte Biologics或Allcells)以1-5x107个细胞/小鼠静脉内(iv)注射到NSG或NSG-CSF-1小鼠中。hPBMC注射后，每天观察小鼠的体重、皮毛的整体外观和活动性。
图1A显示了以2x107个hPBMC/小鼠的hPBMC移植后，十只NSG或NSG-CSF-1小鼠的每日体重变化，表示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。图1B描绘了hPBMC移植(2x107hPBMC/小鼠)后5只个体NSG小鼠的体重测量。每条线代表一只小鼠。观察到，大多数小鼠第8天开始表现出明显的体重减轻。此外，除了在移植后的体重减轻之外，小鼠开始显示出移植物抗宿主病(GVHD)，如下文进一步讨论的。
实施例2.移植后不同时间点的人移植细胞类型和细胞数量的动力学
在该实验中，在三个不同品系的小鼠的hPBMCs移植后研究了来自不同人供体的移植的人单核细胞的细胞类型和细胞数量。在移植后第5天和/或第10天对小鼠采血，并通过流式细胞术分析人细胞(类型和百分比)。具体而言，小鼠PBMC(与hPBMC混合)用人抗体染色：抗CD45、抗CD3、抗CD14、抗CD19和抗CD56。
NSG、NSG-IL-6(Jackson Laboratory货号028655)和NSG-CSF-1小鼠用于测试人细胞重建(即，人细胞在移植后的不同时间点显示出不同的总活细胞百分比)。图2A显示NSG、NSG-IL-6和NSG-CSF-1小鼠的重建在移植来自供体331的hPBMC后第5天表现出相当的人细胞。结果表明这三个小鼠品系之间没有显著差异。在移植的第5天，所有三个小鼠品系都具有约20％的人CD45细胞重建。在人CD45细胞中，大多数是CD3 T细胞和NK细胞(图2A)。
在另一项研究中，不同的细胞群体在来自不同供体(图2B，2x107 PBMC/小鼠)或供体358(图2C，3x107 PBMC/小鼠)的hPBMC移植到NSG中之后的两个不同时间点检查。在这些实验中，每个时间点每组使用2-5只小鼠，且数据以平均值±SEM表示。如图2B和2C中所示，在第5天存在约10％至15％的人CD45+，和在第10天存在35％至50％的CD45+。这些数据表明，移植的人CD45+细胞在人源化小鼠中随着时间增加。有趣的是观察到，在第5天，人源化小鼠中CD45+细胞的群体中存在20-30％的CD56(NK)细胞。但是，在第10天，CD56(NK)细胞显著下降至1-5％。这些数据表明，CD45百分比的增加与特定单核细胞类型(例如，CD56 NK细胞)的消失相关。总之，在hPMBC移植后，人源化免疫缺陷小鼠中移植的单核细胞的细胞类型和细胞数量存在动态变化。T细胞和NK细胞在第5天是主要的细胞类型，但在第10天，仅T细胞类型为主要细胞类型，NK细胞随时间消亡。为了使本发明的方法起作用，必须保持平衡以使得并非所有的NK细胞在药物测试时(例如在第10天)消亡。
hPBMC人源化小鼠模型被认为是T细胞模型，因为人T细胞是随着人细胞重建后的时间的主要细胞群体。该实施例的结果证实了这一点。图2B和2C表明，在从移植后第5天的10％至15％增加至第10天的35％至50％的人CD45细胞中，CD3 T细胞的百分比从第5天的65％至80％增加到第10天的90％至95％。
存在着许多参与免疫毒性反应的细胞类型。T细胞、NK细胞和单核细胞都起着非常重要的作用。在hPBMC人源化小鼠模型中，发现在移植后的早期时间点小鼠中仍存在不同的人细胞类型。在移植后的第5天，人T细胞和NK细胞在hPBMC人源化小鼠的细胞群体中是主要的，图2B和2C。该发现为发明人提供了在hPBMC人源化小鼠中研究免疫毒性反应的机会。选择移植后的早期时间点，例如第6天，来进行免疫毒性和CRS的测试。
小鼠在第0天辐照，并在同一天移植hPBMC。由于受到辐照，小鼠的体重从第1天至第3天下降。第4天后，小鼠开始增加体重。显然，如图1A所示，与NSG-CSF-1相比，NSG小鼠具有更大的体重。NSG小鼠也看起来更健康和更活跃。因此，NSG小鼠用于以后的测试。
实施例3.移植时间的关键性
在本研究中，在hPBMC移植后检查一些人源化小鼠中体重减轻的基础。在多个小鼠中观察到明显的体重减轻，表明这些小鼠中的移植物抗宿主病(GVHD)。GVHD实例的数据在图3A、3B、3C和3D中示出。
图3A和3B分别描绘了对于供体4692和供体362在NSG小鼠中移植5x107个PBMC/小鼠后随时间变化的5只人源化NSG小鼠的体重测量。移植来自任一供体的PBMC后的第7天之后，这一移植细胞水平导致显著的体重减轻(～10％)。约20％的体重减轻代表小鼠中的严重GVHD状态，并需要处死小鼠。
图3C描绘了随供体309移植(2×107个PBMC/小鼠)后的时间变化的5只人源化NSG小鼠的体重测量。PBMC移植后的第8天之后观察到明显的体重减轻(～10％)。
图3D显示了随供体358移植(3x107 PBMC/小鼠)后的时间变化的4只人源化NSG小鼠的体重测量。移植后第9天，接受来自供体358的PMBC的小鼠开始显著的体重减轻(～10％)。
据信GVHD造成观察到的体重减轻。随着小鼠中移植的人T细胞开始生长，它们攻击小鼠细胞。如以上实施例2所述，CD45细胞的百分比随移植后时间增加，并且当T细胞数量高时，具有GVHD的小鼠在8天后患病而不再适合该研究。
GVHD小鼠不仅表现出体重减轻，而且还表现出弯腰姿势、掉毛、活动能力降低和呼吸急促的迹象。20％的体重减轻后，必须处死小鼠并终止实验。移植8天后GVHD的频繁出现揭示了施用用于毒性测试的免疫调节药物之前人PBMC移植时机的关键性的另一个方面。
移植后不能过早(例如第2-3天)施用免疫调节药物，因为在小鼠中可能没有足够的循环细胞数量和类型以产生可靠和可再现的结果。
但是，如果小鼠患有GVHD，它将影响测试结果。因此，在随后的实验中，选择细胞移植后第6天来测试药物施用对更多供体的作用。
不同的细胞因子可能在药物施用后的不同时间点释放。最早释放的细胞因子应该是TNF，它总是在药物施用后1小时前或1小时时达到峰值。此外，如果没有器官衰竭，大多数细胞因子在24小时后恢复至正常水平。因此，选择药物施用后2小时和6小时作为对小鼠采血并测试血清的细胞因子浓度的时间。
实施例4.在移植的第5天人T-细胞和NK细胞是hPBMC人源化NSG小鼠中的主要细胞群体
在本研究中，在人源化小鼠中检查了十(10)个供体的单核细胞重建并进行比较。每只小鼠移植来自供体的2x107个hPBMC。十个供体中的七个的去识别患者信息在图4B中列出。
通过流式细胞术测试每个供体的五只人源化NSG小鼠的所指免疫细胞亚群的重建。在注射hPBMC的NSG小鼠中，在重建的第5天，通过流式细胞术分析全血。测量人CD45、CD3、CD19、CD14和CD56。图4A中对于10个供体显示了作为总细胞的百分比的人CD45+细胞，以及作为CD45+细胞百分比的CD3、CD19、CD14和CD56(在CD45+细胞上门控)。供体A4692、A4625和A4668仅显示CD45、CD3、CD19和CD14。人源化小鼠在外周血中显示平均10-25％的人CD45+细胞(图4A)。在人CD45细胞中，存在30-80％的T细胞和10-40％的CD56(NK)细胞，不同供体之间显示出差异。
在随后的实验中，选择移植后5-7天范围内的一天作为向小鼠施用免疫调节药物以进行毒性测试的最佳时间。
实施例5.人源化小鼠中通过免疫调节药物诱导的细胞因子释放
为建立用于临床前测试和临床实验的用于筛选和测定药物免疫毒性(细胞因子释放综合征(CRS))的人源化小鼠模型，所有患者需要阳性对照。ORTHOCLONE OKT3，也称为莫罗单抗-CD3，是用作免疫抑制药物以免疫抑制移植受体的鼠单克隆抗体(mAb)(抗CD3mAb)。OKT3结合CD3受体，其可以激活T细胞以释放细胞因子，从而导致细胞因子释放综合征(CRS)。OKT3对于所有患者用作阳性对照。为了测试该方法的特异性和灵敏度，需要选择目标药物，其几乎没有方法来测试其免疫毒性。选择抗CD28 mAb作为目标药物用于评估本方法的特异性和灵敏度。
九(10)个不同供体的PBMC用于产生用于这些实验的人源化NSG小鼠。在hPBMC移植(2x107 PBMC/小鼠)的第6天，小鼠通过静脉内注射抗体OKT3(抗CD3 mAb；BioLegend，目录号317302)或ANC28.1/5D10(也称为“ANC28”、“抗CD28 mAb”或“抗CD28”；Ancell,目录号177-824)诱导人细胞因子释放。PBS缓冲液用作阴性对照。在2和6小时对小鼠采血，收集血清并使用BD细胞计数珠阵列(CBA)人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD，目录号551809)分析细胞因子浓度(参见图5A-5F)。
图5A-5F描绘了对于九(9)个不同供体在注射抗体OKT3(抗CD3 mAb)和ANC28(抗CD28)到人源化小鼠组中后2和6小时测量的不同细胞因子(即，分别IFN-γ、IL-6、IL-2、IL-10、IL-4和TNF)的浓度的多个图。小鼠i.v.注射0.5mg/kg OKT3或1mg/kg抗CD28和5ml/kgPBS(阴性对照)。在2和6小时对小鼠采血，并通过BD CBA Th1/Th2 II试剂盒测量循环细胞因子浓度。每组的小鼠数目为2-5，且数据表示为平均值±SEM。
实施例6.药物施用后增加的循环细胞因子浓度
为了确定是否诱导细胞因子风暴，在抗体注射之后的2和6小时后，在小鼠血清中测定细胞因子(人IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF)(参见图5A-5F)。在注射OKT3时人IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-2、IL-4和TNF的显著诱导在所有10个供体中2和6小时都发现。
但是对于施用抗CD28 mAb的小鼠，仅一些供体诱导细胞因子的显著释放。并非所有供体在抗CD28注射时具有细胞因子释放反应。
如图5A所示，在抗CD28注射后6小时，10个供体显示出关于IFN-γ细胞因子的不同释放谱：
严重/高反应：供体A4692、A4668和362(IFN-γ≥1800pg/ml)，
中等/轻度反应：供体A4625、366、345、309和213(IFN-γ≥300pg/ml至<1800pg/ml)，和
低/无反应：供体364和353(IFN-γ<300pg/ml)。
图5B显示了在已移植2x107(PBMC/小鼠)的NSG小鼠中2或6小时观察到的抗CD28mAb IL-10细胞因子反应。一条线描绘在120pg/ml的IL-10水平处，这是严重/高反应与低反应之间的截止值，使得更容易确定反应是否为严重/高反应。6小时的反应如下：
严重/高反应：供体A4692、A4668和362(IL-10≥120pg/ml)，
中等/轻度反应：供体A4625、366、345、213和309(IL-10≥25pg/ml至<120pg/ml)，和
低/无反应：供体364和353(<25pg/ml)。
我们观察到IFN-γ水平≥1800pg/ml(通过OKT3或抗CD28 mAb)的供体也表现出IL-10水平的提高(即，≥120pg/ml)。当IFN-γ和IL-10的水平分别增加到高于≥1,800pg/ml和≥120pg/ml时，如果注射药物，供体很可能发生CRS。
图5C-5F描述了在2或6小时分别IL-6、IL-2、IL-4和TNF的细胞因子释放。
图5C显示在已移植2x107(PBMC/小鼠)的NSG小鼠中2或6小时观察到的抗CD28 mAbIL-6细胞因子反应。6小时的反应如下：
严重/高反应：供体A4692、A4668和362(IL-6≥25pg/ml)，
中等/轻度反应：供体A4625、366、345、213和309(IL-6≥10pg/ml至<25pg/ml)，和
低/无反应：供体364和353(IL-6<10pg/ml)。
图5D显示了在已移植2x107(PBMC/小鼠)的NSG小鼠中2或6小时观察到的抗CD28mAb IL-2细胞因子反应。6小时的反应如下：
严重/高反应：供体A4692、A4668和362(IL-2≥80pg/ml)，中等/轻度反应：供体A4625、366、345、213和309(15pg/ml≤IL-2<80pg/ml)，和
低/无供体364和353(IL-2<15pg/ml)。
图5E显示了在已移植2x107(PBMC/小鼠)的NSG小鼠中2或6小时观察到的抗CD28mAb IL-4细胞因子反应。6小时的反应如下：
严重/高反应：供体A4692、A4668和362(IL-4≥25pg/ml)，中等/轻度反应：供体A4625、366、345、213和309(10pg/ml≤IL-4<25pg/ml)，和
低/无反应：供体364和353(IL-4<10pg/ml)。
图5F显示在已移植2x107(PBMC/小鼠)的NSG小鼠中2或6小时观察到的抗CD28 mAbTNF细胞因子反应。6小时的反应如下：
严重/高反应：供体A4692、A4668和362(TNF≥20pg/ml)，中等/轻度反应：供体A4625、366、345、213和309(5pg/ml≤TNF<20pg/ml)，和
低/无反应：供体364和353(TNF<5pg/ml)。
图6总结了在施用OKT3或抗CD28后在其诱导IFN-γ和IL-10的能力方面10个供体的反应。请注意，在抗CD28 mAb施用后，供体A4692、A4668和362为严重/高反应者；供体A4625、366、345、309和213是中等/轻度反应者；且供体364和353是低/无反应者。这些数据清楚地表明，具有PBMC移植的NSG/NSG-CSF-1/NSG-IL-6小鼠模型可用于区分在对人施用免疫调节药物后是否可能引发严重的细胞因子释放综合征反应(或是其预测子)。
如图5A-F和图6所示，OKT3注射后所有十个供体/患者PBMC移植的小鼠均显示出实质的细胞因子释放。但是对于施用抗CD28mAb，仅一部分供体PBMC移植的小鼠显示出那些细胞因子的显著诱导。并非每个供体响应于抗CD28注射而具有高水平的细胞因子释放。这些结果类似于人类中的变异。对于CRS强诱导剂(如OKT3)，每个供体都有反应，但对于弱诱导剂(如抗CD28)，没有其他方法可以检测到供体之间存在巨大差异，如该方法中观察到的。IFN-γ反应可以用作一个例子：三个供者/患者PBMC移植的小鼠对抗CD28显示出高反应，五个供体/患者PBMC移植的小鼠显示出对抗CD28的中等反应，两个供体/患者PBMC移植的小鼠显示出对抗CD28的低/无反应。当存在细胞因子释放时，小鼠还显示出体温下降和临床评分提高。本方法可用于检测新药物免疫毒性，也可用于针对个体患者筛选药物毒性。
实施例7.免疫调节药物处理后NSG小鼠的体温变化
在治疗之前以及再次紧接在各采血时间点之前测量实施例5和6的小鼠的直肠温度。温度数据在图7中示出。人源化NSG小鼠在药物处理后在一些动物中显示出体温略有下降。注意到，在具有高IFN-γ释放的小鼠中，体温更经常下降(图7)。对于OKT3和抗CD28组中的小鼠，在6小时时间点体温从37-38℃降至36℃以下。图7显示了药物注射后的低温诱导。在注射对照PBS、OKT3和抗CD28的10个供体的hPMBC人源化小鼠中测量直肠温度。每组的小鼠数目为2-5，且数据表示为平均值±SEM。
实施例8.药物注射后小鼠的临床评分的评价
小鼠的临床评分如下通过进行评分的标记和分级来监测：评分：0＝正常活动；1＝正常活动，竖毛，脚尖步态；2＝弯腰，活动减少，但仍然活动；3＝运动不足，但在出现提示时活动；4＝垂死(死亡点)。处死临床评分为4的小鼠。每组的小鼠数目为2-5，且数据表示为平均值±SEM。
在OKT3或抗CD28 mAb治疗组中，大多数具有细胞因子释放的小鼠在6小时时间点评分为1。没有或具有低细胞因子释放的小鼠没有临床评分。药物注射后小鼠的临床评分在图8中示出。大多数小鼠的临床评分为1。
实施例9.PBMC的移植(5x107/小鼠)提供用于药物候选物毒性筛选的人源化小鼠模型
我们已经开发了一种人源化小鼠模型，其可用于毒性测试以筛选发现中的潜在药物。在药物候选物开发的早期阶段，需要筛选潜在的药物候选物是否可能具有毒性活性。在该小鼠模型中，有目的地增强了细胞因子反应的敏感性以便筛选与潜在药物候选物相关的任何毒性(例如，细胞因子释放综合征)。
为此，大量的PBMC(即5x107/小鼠)移植到人源化NSG小鼠中。在第6天，小鼠接受药物并测定细胞因子释放谱。此时，如在使用2×107 PBMC/小鼠的上述实验中一样评估IFN-γ和II-10水平。
图9A和9B描绘了对于药物注射后的IFN-γ或IL-10水平比较2x107和5x107 PBMC/小鼠的供体213。观察到，使用相同量的单克隆抗体(即，OKT3 mAb＝0.5mg/kg和抗CD28 mAb＝1mg/kg)在第6天OKT3和抗CD28 mAb施用后，IFN-γ和IL-10水平随着更高的PBMC移植增加。据信5x107 PMBC/小鼠的这种增强的细胞因子释放适用于临床前药物开发中的筛选测定。图9C-9F描绘了供体213中2x107 PBMC/小鼠和5x107 PBMC/小鼠的细胞因子反应(分别IL-6、IL-2、IL-4和TNF)的比较。这些数据表明，对于药物毒性筛选，大量的PBMC提供了可靠且灵敏的测试方法。
实施例10.不同PBMC移植浓度的细胞因子释放的比较
在本实验中，我们使用移植三种PBMC浓度之一的人源化小鼠比较细胞因子释放以确定细胞浓度的影响。特别地，我们比较了在移植2x107 PBMC/小鼠、3x107 PBMC/小鼠或4x107 PBMC/小鼠的人源化NSG小鼠中用免疫治疗药物(例如，mAb OKK3、抗CD28或
Figure BDA0002304375810000541
(派姆单抗))治疗后这些小鼠产生的细胞因子水平。
在移植后第6天，小鼠接受免疫治疗药物(mAb)，并且在这三组小鼠中确定细胞因子释放谱。在2和6小时对小鼠采血，并通过BDCBA Th1/Th2 II试剂盒测量循环细胞因子浓度。图10A-F描绘了在移植2x107、3x107或4x107 PBMC/小鼠的供体309人源化NSG小鼠中，在药物注射后的细胞因子水平。图10A描绘了每组小鼠的INFγ水平。图10B描绘了每组小鼠的IL-10水平。图10C描绘了每组小鼠的IL-6水平。图10D描绘了每组小鼠的IL-2水平。图10E描绘了每组小鼠的IL-4水平。图10F描绘了每组小鼠的TNF水平。
我们观察到，在这些实验条件下，在较低移植水平(2x107或3x107PBMC/小鼠)的两个小鼠组中使用相同量的mAb(即，OKT3 mAb＝0.5mg/kg，抗CD28 mAb＝1mg/kg和
Figure BDA0002304375810000551
＝10mg/kg)在第6天施用OKT3和抗CD28 mAb和
Figure BDA0002304375810000552
(派姆单抗)后，细胞因子水平显示出相似的增加。但是，以4x107 PBMC/小鼠进行移植时，在这些实验条件下，发现对每种药物注射的细胞因子反应过高而不能以最佳灵敏度区分个体反应。相反，在这些条件下，每只小鼠2x107和3x107细胞的PBMC移植提供了用于筛选在人类个体中响应于药物的细胞因子风暴发生的灵敏测试。
实施例11.不同浓度PBMC移植的体温和临床评分
在本研究中，我们在移植不同PBMC浓度的人源化小鼠中测量了不同的细胞类型、体温和临床评分。本研究中使用的PBMC从供体309获得。图11A描绘了PBMC移植后第5天的细胞群体。尽管CD45群体中不同细胞类型的百分比相似，但总人CD45+细胞百分比随小鼠中PBMC移植水平的增加而提高。图11B描绘了施用OKT3mAb(0.5mg/kg)、抗CD28(1mg/kg)和(派姆单抗；10mg/kg)后人源化小鼠中的临床评分。图11C、11D和11E描绘了小鼠的体温变化。如图11C和11D中所示，与2x107 PBMC/小鼠组相比，3x107 PBMC/小鼠组存在轻微的体温下降。
实施例12.细胞因子水平随增加的药物剂量而提高
药物耐受性通常因人而异。人源化免疫缺陷小鼠模型可用于测试患者个体中细胞因子释放的药物浓度相关性。
在本研究中，发明人检查了不同浓度的
Figure BDA0002304375810000561
(派姆单抗)以确定在人源化小鼠中是否存在CRS的剂量依赖性。在人PBMC移植前至少4小时，用100cGy X-射线辐照6周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,JAX货号005557)小鼠。这些实验中的PBMC来自供体358。纯化/分离的人PBMC以3x107细胞/小鼠静脉内注射到小鼠中。PBMC移植六天后，小鼠iv注射PBS(阴性对照)，0.5mg/kg OKT3(阳性对照)，2.5mg/kg、5mg/kg或10mg/kg
Figure BDA0002304375810000562
每组有5只小鼠。这些
Figure BDA0002304375810000563
剂量处于对于
Figure BDA0002304375810000564
的U.S.处方信息中讨论的临床试验中所研究的剂量范围内。很少有
Figure BDA0002304375810000565
施用后的严重细胞因子释放综合征的不良反应报告的明确记载。在2和6小时对小鼠采血，并使用BD CBA Th1/Th2 II试剂盒测量循环细胞因子浓度。如图12A-F所示，对于IFN-γ、IL-10、IL-6、IL-2、IL-4和TNF中的每一种，注射阳性对照OKT3后测得的水平非常高。如图12A-F中所示，细胞因子水平随着
Figure BDA0002304375810000566
剂量的增加而提高。在2.5mg/kg的
Figure BDA0002304375810000567
下，细胞因子水平与阴性对照组(即PBS对照组)相似，并且几乎没有细胞因子释放。相反，细胞因子水平随着
Figure BDA0002304375810000568
剂量的增加而提高，当使用10mg/kg
Figure BDA0002304375810000569
时具有高细胞因子反应。
如在12A至12F中可以看到的，给药后6小时的细胞因子水平显示对
Figure BDA00023043758100005610
(派姆单抗)量的剂量依赖性反应，其随剂量增加而提高。在2.5mg/kg的
Figure BDA00023043758100005611
浓度下，每种细胞因子的水平在PBS对照组所测量水平的误差范围内，表明几乎没有细胞因子释放。在10mg/kg下，每种细胞因子的水平处于预测CRS的中等范围内。因此，对于供体358，施用2.5mg/kg
Figure BDA00023043758100005613
比施用10mg/kg
Figure BDA00023043758100005614
(派姆单抗)具有更低的产生CRS的风险。
细胞因子释放的剂量依赖性表明，就避免免疫毒性而言，体内人源化小鼠模型可用于筛选用于个体患者的最佳药物浓度。然后可以将这些信息与关于有效治疗患者的疾病的剂量范围的其他知识结合使用以确定有效但安全的药物剂量。
实施例13.对于不同剂量的
Figure BDA0002304375810000571
(派姆单抗)的体温和临床评分
在本研究中，发明人测量了实施例12所描述的人源化小鼠中的各种细胞类型、体温和临床评分。图13A描绘了细胞移植后第5天的细胞群体。发明人观察到，T细胞和NK细胞代表这些小鼠中的主要细胞类型。图13B描绘了在以不同
Figure BDA0002304375810000572
剂量施用免疫治疗药物(
Figure BDA0002304375810000573
(派姆单抗))后的临床评分。在以5mg/kg和10mg/kg
Figure BDA0002304375810000574
给药时，给药后6小时的临床评分与阳性对照(OKT施用)相同。图13C描绘了不同剂量的
Figure BDA0002304375810000575
的小鼠体温变化。
实施例14.体内人源化小鼠模型与体外分析的比较
体外全血或PBMC测定目前是药物筛选中用于测试细胞因子释放的主要测定法。在该实施例中，对于相同的PBMC供体，通过两种方法(体外PBMC测定法和体内人源化小鼠方法)测定响应于药物治疗的细胞因子释放。
体内方法
第0天：在人PBMC移植前至少4小时，用100cGy X-射线对6周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,JAX货号005557)小鼠进行照射。纯化/分离的人PBMC以3×107细胞/小鼠静脉内注射给小鼠。PBMC来自供体213、309、345或366。第5天，对小鼠采血以进行人细胞移植测试。第6天，对小鼠施用药物；使用BD CBA Th1/Th2 II试剂盒在施用药物后6小时测定小鼠血清中的细胞因子水平。在这些实验中，每组使用5只小鼠。
体外方法
第-1天：用药物涂覆平板：在PBS中稀释药物(例如，抗体)；使平板在柜中保持开放。
第0天：处理来自每个供体的PBMC。PBMC来自供体213、309、345或366。在补充RPMI中解冻PBMC并洗涤一次。计数细胞并以1x106细胞/ml重悬在补充RPMI中。用200μl PBS洗涤涂覆的孔两次，然后用200μL补充RPMI洗涤一次。在每个孔中接种100μl细胞(每个孔总共1x105个细胞)。
第2天：从每个孔收获上清液，并使用BD CBA Th1/Th2 II试剂盒测量细胞因子水平。
结果
对于来自四个不同供体的PBMC的抗CD28抗体(Ancell，目录号177-824)处理，比较了用于确定药物处理后细胞因子释放水平的两种方法。对于体外测定，抗CD28在96孔板中以10μg/孔用药。对于体内方法，抗CD28以1mg/kg用药。收集体外PBMC培养孔的上清液和来自小鼠的血清，并测量细胞因子水平。在体内测定或体外测定中，分别将抗体OKT3(用于体内测定的0.5mg/kg或用于体外测定的1mg/ml)用作阳性对照，而PBS或同种型抗体用作阴性对照。测定的细胞因子水平在图14A(IFN-γ和IL-10)和14B(IL-6和IL-4)中显示为平均值±平均值的标准误差(SEM)。图14A和14B显示，对于四个PBMC供体的每一个，对于任何给定的细胞因子，通过两种测定法测定不同的水平。
图15重新绘制了图14A和图14B的供体213的细胞因子水平数据以使得更容易比较在两种测试中测定的细胞因子水平的差异。对于四种细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-6和IL-4中的每一种，体外测试显示，在抗CD-28给药后供体213细胞中产生相对少的细胞因子释放。在体外测定中，在抗CD28给药后测量的细胞因子水平与用抗CD28的对照同种型抗体(“媒介2”)给药后测定的那些细胞因子水平很少差异，而在对照OKT3抗体给药后的细胞因子水平远高于OKT3的对照同种型抗体(“媒介1”)给药后测定的水平。相反，通过体内测试方法，对于四种细胞因子IFN-γ、IL-10、IL-6和IL-4中的每一种，在抗CD-28或OKT3C给药后供体213细胞中产生的细胞因子水平远高于阴性对照中测得的水平。
这些结果表明，对于某些人，体外测试可能不会显示他们在给药免疫活性药物后发生细胞因子风暴反应，然而体内测试表明，这些个体可能在给药免疫活性药物后发生细胞因子风暴反应。体内人源化小鼠方法比体外测定更灵敏，并且可以预测体外测试可能遗漏的人体中细胞因子风暴的可能性。
实施例15.药物组合处理后的细胞因子释放
PBMC人源化小鼠模型可以有效地测试单一药物是否可能在个体中诱导细胞因子风暴。但是，对于药物筛选和临床治疗，有时必须使用药物组合。该实施例表明，PBMC人源化小鼠模型可用于测试药物组合的细胞因子释放。用该模型获得的结果显示是供体特异性的。
在移植人PBMC之前至少4小时，用100cGy X-射线对6周龄的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,JAX货号005557)小鼠进行照射。将来自相应供体的分离的人PBMC以3×107细胞/小鼠静脉内注射于小鼠。PBMC来自供体213或供体364。在PBMC移植后第6天，我们向小鼠施用药物的组合，并使用BD CBA Th1/Th2 II试剂盒在施用药物后6小时测定小鼠血清中的细胞因子水平。每个实验组使用五只小鼠。
测试的药物组合为：
Figure BDA0002304375810000591
(派姆单抗)和
Figure BDA0002304375810000592
(来那度胺)；
Figure BDA0002304375810000593
和抗胸腺细胞球蛋白(ATG)((兔))；以及抗CD28和ATG。
派姆单抗
Figure BDA0002304375810000595
是用于癌症免疫治疗的人源化抗体。来那度胺
Figure BDA0002304375810000596
是沙利度胺的衍生物，它是用于癌症治疗的口服免疫调节小分子药物。抗胸腺细胞球蛋白(ATG)，商品名为(兔)，是一种用于降低接受移植如肾脏移植的患者的身体自然免疫的免疫抑制剂。
在
Figure BDA0002304375810000601
(派姆单抗)和
Figure BDA0002304375810000602
(来那度胺)实验中，人源化NSG小鼠静脉内(iv)注射5mg/kg
Figure BDA0002304375810000603
经口施用100mg/kg来那度胺，或接受两种药物。iv 5ml/kg PBS处理用作对照。
在
Figure BDA0002304375810000604
(派姆单抗)和ATG实验中，人源化NSG小鼠静脉内注射5mg/kg
Figure BDA0002304375810000605
1mg/kg ATG，或接受两种药物。iv 5ml/kg PBS处理用作对照。
在抗CD28和ATG实验中，人源化NSG小鼠静脉内注射1mg/kg抗CD28，1mg/kg ATG，或接受两种药物。iv 5ml/kg PBS处理用作阴性对照。
在
Figure BDA0002304375810000606
(派姆单抗)和
Figure BDA0002304375810000607
(来那度胺)实验中测定的细胞因子水平对于两个供体显示在图16中。测定水平的细胞因子为IFN-γ(图面a)、IL-10(图面b)、IL-6(图面c)、IL-2(图面d)、IL-4(图面e)和TNF(图面f)。
基于来自评估(派姆单抗)与地塞米松和免疫调节剂
Figure BDA0002304375810000609
(来那度胺)组合用于治疗多发性骨髓瘤的两项中止的临床试验的数据，FDA在2017年发布了一项声明，
Figure BDA00023043758100006010
和来那度胺组合的治疗导致严重毒性和死亡的风险增加。
如图16所示，当
Figure BDA00023043758100006011
(派姆单抗)和
Figure BDA00023043758100006012
(来那度胺)组合使用时，IFN-γ、IL-6、IL-2和TNF各自对于供体213而非供体364显示出相对于单独使用每种药物处理所产生的水平显著提高的细胞因子释放。
抗胸腺细胞球蛋白(ATG)用于预防和治疗器官移植中的急性排斥反应和再生障碍性贫血的治疗。先前已证明ATG刺激临床毒性。图17显示了用单独
Figure BDA00023043758100006013
(派姆单抗)、单独ATG和
Figure BDA00023043758100006014
与ATG的组合治疗后的细胞因子结果。对于供体213而非供体364，用
Figure BDA00023043758100006015
和ATG组合治疗后的IFN-γ、IL-6、IL-10和TNF的水平高于单独使用任一药物治疗后的水平。
图18显示了用单独抗CD28、单独ATG和抗CD28与ATG的组合治疗后的细胞因子结果。对于供体213，与单独使用任一药物治疗后相比，用药物组合治疗后IIFN-γ、IL-6、IL-2和TNF的水平更高，但对于供体364，与单独使用任一药物治疗后相比，仅IL-2和TNF在药物组合的治疗后升高。
这些结果表明体内人源化小鼠模型可以预测单一药物以及药物组合的高细胞因子释放的可能性。另外，不同的PBMC供体对组合疗法显示出不同的细胞因子释放反应。
本研究证明，在体内方法中使用患者自己的PBMC在临床给药之前筛选是否特定药物组合对患者可能诱导严重的细胞因子释放的优势。类似地，本方法可用于筛选与药物组合施用相关的可能的药物相关毒性。
实施例16.辐照的人源化小鼠中的人免疫细胞群体和细胞类型分布
在该实施例中，我们评估了辐照的人源化小鼠中的人免疫细胞群体和细胞类型分布。证明了人PBMC移植到免疫缺陷小鼠中之前的X射线辐照及移植后时间对小鼠中人细胞群体的影响。
六周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,JAX货号005557)小鼠用于移植人PBMC。对于经历辐照处理的小鼠，小鼠在移植人PBMC之前至少4小时用100cGy X-射线辐照。来自供体的纯化/分离的人PBMC以2×107个细胞/小鼠静脉内注射到小鼠。PBMC来自六个不同供体之一：362、345、2785、213、364或3251。小鼠在移植后第5天和第10天采血，并通过流式细胞术分析小鼠血液中的人细胞以确定存在的人细胞类型和每种类型的百分比。具体地，与人PBMC混合的小鼠PBMC用人抗体进行染色：抗CD45、抗CD3、抗CD14、抗CD19和抗CD56 mAb。结果显示在图19中，其说明在第5天和第10天时接受和不接受辐照的小鼠之间人细胞群体是不同的。
如图19所示，在第5天，辐照小鼠中的总人类白细胞群体(CD45+)为约8-15％，而在非辐照小鼠中仅为1-3％，关于总群体具有供体间的变异。图19进一步显示，在第5天，辐照或非辐照的小鼠在总人细胞(CD45+)群体中白细胞类型的分布几乎相同，每一个中的主要细胞类型为CD3+细胞(T细胞)和CD56+(NK细胞)，而具有低百分比的CD19+细胞(B细胞)和CD14+细胞(单核细胞)。
图19显示，在第10天，辐照小鼠中总人细胞(CD45+)群体生长到活细胞的约30-85％，但非辐照小鼠中仅活细胞的8-17％，具有单个供体之间的差异。
图19进一步显示，在第10天，对于辐照或非辐照的小鼠，总人细胞(CD45+)群体中白细胞类型的分布也相似。在辐照或非辐照小鼠中，主要细胞类型是CD3+细胞(T细胞)，其在小鼠中生长并扩增其群体。在辐照或非辐照小鼠中仅存在很小或可忽略百分比的存活CD56+(NK细胞)、CD19+细胞(B细胞)和CD14+细胞(单核细胞)，即这些细胞在小鼠中并不生长和扩增其群体。
因为辐照小鼠中在第5天或第10天存在的人细胞的绝对数量比非辐照小鼠中同一天存在的人细胞的绝对数量高约3至15倍，因此辐照小鼠表现出存在的每种人白细胞类型的更高数量。重要的是，在第5天，辐照小鼠在人CD45+细胞群体中具有更高的存活CD56+(NK细胞)、CD19+细胞(B细胞)和CD14+细胞(单核细胞)的绝对数量，从而提供了提高细胞因子释放综合征的测试灵敏度和准确性的人免疫系统的优良建模。
实施例17.辐照和非辐照人源化小鼠中作为GVHD指标的体重减轻
在本研究中，我们使用体重减轻作为人源化小鼠中GVHD的指标。每天对用来自六个不同人类供体(362、345、2785、213、364或3251)中每一个的2000万PBMC移植的人源化小鼠进行体重测量。根据实施例16中的程序，在移植供体PBMC之前，小鼠进行辐照或不辐照。对于每个供体的辐照组和非辐照组的体重测量显示于
图20，图面a(供体362、345和2785)、图面b(供体213、364和3251)中。图20显示，对于所有供体，辐照小鼠的体重减轻比非辐照小鼠更早发生，证明辐照的人源化小鼠比非辐照的人源化小鼠更快发生GVHD。对于所有六个人类供体，第8天后辐照的人源化小鼠的体重减轻是显著的(至少约10％)，表明第8天后的显著GVHD。即使在PBMC移植后12-14天，非辐照小鼠未显示显著的体重减轻，表明慢得多的重度GVHD的发作。
实施例18.在人源化小鼠中GVHD单独引起细胞因子释放(在不存在药物处理的情况下)
本实施例证明，经历重度GVHD的小鼠由于GVHD而分泌人细胞因子。辐照的人源化小鼠比非辐照的人源化小鼠更快发生GVHD。
图21显示了在没有任何药物治疗的情况下，PBMC移植后第10天人源化小鼠中存在的人细胞因子水平。显示了六个供体(362、345、2785、213、364和3251)的人源化小鼠的IFN-γ(图面a)、IL-10(图面b)和IL-6(图面c)的细胞因子测量(PBMC移植前有或没有辐照)。对于每个供体，在移植后第10天，三种细胞因子中每一种在辐照小鼠血液中的存在高于非辐照小鼠。在第10天，基于实施例17中公开的体重测量，由于存在GVHD相关的人白细胞的人细胞因子分泌，辐照小鼠比非辐照小鼠具有更严重的GVHD。
实施例19.辐照和非辐照的人源化小鼠中的细胞因子释放
该实施例评估了小鼠的X射线辐照(在PBMC移植前)对药物诱导的人细胞因子释放的影响。
小鼠移植来自供体362(高反应者)或供体21(中等反应者)的2000万个PBMC。在移植供体hPBMC之前小鼠进行辐照或不辐照。移植后六天，小鼠用免疫调节药物处理(iv注射0.5mg/kg OKT3、10mg/kg KEYTRUDA，1mg/kg ATG或5ml/kg PBS(阴性对照))。测定在药物处理六小时后获得的小鼠血液中的细胞因子水平。图22A-22B中显示了比较辐照的和非辐照的人源化小鼠中药物诱导的细胞因子水平的结果。图22A示出了IFN-γ(图面a)、IL-10(图面b)和IL-6(图面c)的数据，而图22B显示了IL-2(图面d)、IL-4(图面e)和TNF(图面f)的数据。图22A-22B显示，对于每种细胞因子，在任一供体中，给定药物处理后非辐照小鼠中的细胞因子水平与在相同药物处理后辐照小鼠中测定的细胞因子水平相比始终较低。
如实施例16中所公开的，辐照小鼠中产生的更高细胞因子水平可能是由于这些小鼠中存在的更高的人免疫细胞(T细胞和NK细胞)数量。因此，辐照的人源化小鼠模型提供了对于检测响应于给定药物的免疫刺激中的个体差异的更高灵敏度。
材料和方法
1.PBMC人源化小鼠重建
六周龄雌性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ(NSG,JAX货号005557)小鼠及其衍生物，NSG-CSF-1、NSG-IL-6小鼠在人PBMC移植前至少4小时用100cGy X-射线照射。纯化的人PBMC商购得到(Astarte Biologics或Allcells technologies)。解冻后，PBMC用PBS洗涤两次，然后静脉内(i.v.)注射于NSG小鼠，1000-5000万细胞/小鼠。hPBMC注射后，每天观察小鼠的总体皮毛外观和活动性。在hPBMC移植后的另一天，对小鼠采血以通过流式细胞术测试人细胞百分比。小鼠PBMC用人抗CD45、抗CD3、抗CD14、抗CD19、抗CD56染色。
2.人源化小鼠中细胞因子释放的诱导和测量
在hPBMC移植的第6天，小鼠通过静脉内注射抗体OKT3(抗CD3 mAb)和ANC28(抗CD28 mAb)、
Figure BDA0002304375810000641
(派姆单抗)(抗PD-1)、ATG、
Figure BDA0002304375810000642
(来那度胺)和作为基线对照的PBS缓冲液诱导人细胞因子释放。小鼠在2和/或6小时采血，收集血清并使用BD细胞计数珠阵列(CBA)人Th1/Th2细胞因子试剂盒II(BD目录号551809)分析细胞因子浓度。本测定法对各种细胞因子的检测限如下：IFN-γ,7pg/ml；IL-2，2.6pg/ml；IL-4，2.6pg/ml；IL-6，3.0pg/ml；IL-10，2.8pg/ml；和TNF，2.8pg/ml。
3.体温的测量
在治疗之前和再次紧接在每个时间点放血之前测量小鼠的直肠温度。通过插入直肠热电偶探头并等待直到获得稳定的读数来测量温度。
4.临床评分的评估
如Brady等,Clinical&Translational Immunology,2014的参考文献中所述，发明人如下进行评分的标记和评分：评分：0＝正常活动；1＝正常活动，竖毛，脚尖步态；2＝弯腰，活动减少，但仍活动；3＝运动不足，但在出现提示时可活动；4＝濒死(死亡点)。对临床评分为4的小鼠处死。
5.统计学分析
使用GraphPad Prism 5.0分析结果。
本公开进一步包括以下方面。
方面1.一种确定在施用免疫调节药物后所述免疫调节药物是否可能在人体内引发严重的细胞因子释放综合征的方法，所述方法包括：(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；(b)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述小鼠；(c)在移植所述PBMC后5-7天向所述小鼠施用免疫调节药物；(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和(e)确定所述免疫调节药物可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征，其中所述小鼠中严重细胞因子释放综合征的存在指示所述免疫调节药物的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征。
方面2.一种确定对人施用免疫调节药物在人体内诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法，该方法包括：(a)提供在移植来自人的1.5-3.0x107分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用免疫调节药物的人源化的、辐照的免疫缺陷小鼠的血液样品；和(b)体外检测小鼠血液样品中存在的包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，其中小鼠血液样品中IFN-γ≥1800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示对该人施用免疫调节药物可能诱导严重细胞因子释放综合征。
方面3.一种确定在施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合后，所述免疫调节药物的组合是否可能在人体中引发严重细胞因子释放综合征的方法，所述方法包括：(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线照射；(b)移植从人分离的1.5-3.0×107个外周血单核细胞(PBMC)到所述小鼠；(c)移植PBMC后5-7天向所述小鼠施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物；(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和(e)确定所述免疫调节药物组合可能在所述人中引发严重细胞因子释放综合征，其中所述小鼠中严重细胞因子释放综合征的存在指示所述免疫调节药物组合的施用在所述人中可能引发严重细胞因子释放综合征。
方面4.一种确定对人施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合在所述人中诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法，该方法包括：(a)提供来自在移植来自人的1.5-3.0x107个分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合的人源化的辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和(b)体外检测小鼠血液样品中包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，其中IFN-γ≥1800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示对该人施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合可能诱导严重细胞因子释放综合征。
方面5.一种确定在施用免疫调节药物后在人中不引发细胞因子释放综合征的免疫调节药物的安全剂量的方法，所述方法包括：(a)提供具有第一剂量的免疫调节药物，免疫调节药物的所述第一剂量确定为在其施用后在第一人源化的辐照免疫缺陷小鼠中引发轻度或严重细胞因子释放综合征；(b)提供第二免疫缺陷小鼠，所述第二小鼠用75-125cGyX-射线照射；(c)将从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)移植到所述第二小鼠；(d)在移植PBMC后5-7天向所述第二小鼠施用免疫调节药物，所述免疫调节药物以低于所述第一剂量的第二剂量施用；(e)测定所述第二小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度；和(f)确定所述免疫调节药物用于在所述人中施用的安全剂量，所述安全剂量是在向所述第二小鼠施用免疫调节药物后产生IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度的剂量，其中所述第二小鼠中IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度指示所述安全剂量的所述免疫调节药物的施用在所述人中可能不引发细胞因子释放综合征。
方面6.一种确定用于人的药物候选物的免疫毒性的方法，所述方法包括：(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；(b)将4.5-5.5×107的人PBMC移植到所述小鼠；(c)在移植后4-7天向所述小鼠施用药物候选物；(d)确定所述小鼠血液中的细胞因子浓度，其中所述细胞因子是选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF的至少一种细胞因子；和(e)确定所述药物候选物的免疫毒性，其中所述小鼠中选自以下的至少一种细胞因子的血液浓度指示所述药物候选物在人体中的免疫毒性：IFN-γ≥300pg/ml，IL-2≥15pg/ml，IL-4≥10pg/ml，IL-6≥10pg/ml，IL-10≥25pg/ml或TNF≥5pg/ml。
方面7.一种确定药物候选物在人体内的免疫毒性的方法，该方法包括：(a)提供来自在移植4.5-5.5x107个分离的人外周血单核细胞(PBMC)后4-7天施用药物候选物的人源化、辐照的免疫缺陷小鼠的血液样品；和(b)在体外检测小鼠血液样品中至少一种人细胞因子的浓度以确定药物候选物的人免疫毒性，其中所述至少一种人细胞因子选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF，且其中当在小鼠血液样品中检测到低的人细胞因子浓度时，所述药物候选物具有低人免疫毒性。
方面8.方面1-7中任一项的方法，其中所述小鼠是NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1小鼠。
方面9.方面1至8中任一项的方法，其中所述小鼠是NSG小鼠。
方面10.方面1至9中任一项所述的方法，其中所述小鼠用100cGy X-射线辐照。
方面11.方面1-5和8-10中任一项的方法，其中所述移植步骤用2×107个PBMC进行。
方面12.方面1-11中任一项的方法，其中所述施用步骤在移植后6天进行。
方面13.方面1-12中任一项的方法，其中所述多种细胞因子进一步包括IL-2、IL-4、IL-6和TNF。
方面14.方面1-13中任一项的方法，其中在施用所述免疫调节药物或所述免疫调节药物组合后2-6小时测定多种细胞因子的血液浓度。
方面15.方面1-14中任一项的方法，其中在施用所述免疫调节药物或所述免疫调节药物组合后6小时测定多种细胞因子的血液浓度。
方面16.方面1-15中任一项的方法，其中所述免疫调节药物选自抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52mAb；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；talimogene laherparepvec；阿达木单抗、卡妥索单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗-I131、本妥昔单抗、betuximab、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、trastuzumab emtansinen、狄诺塞麦、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、达雷木单抗、色瑞替尼、艾洛珠单抗和抗胸腺细胞球蛋白。
方面17.方面16的方法，其中所述抗CD28 mAb是TGN1412。
方面18.方面16的方法，其中所述抗CD3 mAb是OKT3。
方面19.方面16的方法，其中所述抗C20 mAb是利妥昔单抗。
方面20.方面16的方法，其中所述抗CD52 mAb是阿仑单抗。
方面21.方面3至4和5-15中任一项的方法，其中所述第一免疫调节药物和所述第二免疫调节药物独立地选自抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52mAb；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺、来那度胺、泊马度胺)、阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；talimogene laherparepvec；阿达木单抗、卡妥索单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗-I131、本妥昔单抗、betuximab、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、trastuzumab emtansinen、狄诺塞麦、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、达雷木单抗、色瑞替尼、艾洛珠单抗和抗胸腺细胞球蛋白。
方面22.方面3至4、5-15和21中任一项的方法，其中所述第一免疫调节药物是派姆单抗或纳武单抗；和所述第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、epacadostat、talimogene laherparepvec、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或度伐单抗。
方面22.方面3至4、5-15和21中任一项的方法，其中所述第一免疫调节药物是伊匹单抗，和所述第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或度伐单抗。
方面23.方面3至4、5-15和21中任一项的方法，其中所述第一免疫调节药物是阿妥珠单抗、阿维单抗或度伐单抗，和所述第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺，派姆单抗、依匹单抗、利妥昔单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或阿仑单抗。
方面24.方面3至4、5-15和21中任一项的方法，其中所述抗CD52 mAb是阿仑单抗，所述抗C20 mAb是利妥昔单抗，所述抗CD3mAb是OKT3，或所述抗CD28 mAb是TGN1412。
方面25.方面6或7的方法，其中所述移植步骤(b)用5x107个PBMC进行。
在本说明书中提及的任何出版物或参考文献指示本发明所属领域的技术人员的水平。本文中的所有专利、出版物和/或参考文献通过引用并入，其程度就好像每个单独的出版物被具体地和单独地指示通过引用整体并入一样。
尽管本文描述了关于使用人源化的免疫抑制小鼠来确定免疫调节药物是否可以施用于人而不在人体中引起不可接受的高细胞因子反应的示例实施方式，但是应当理解，本发明的方法可以用于各种哺乳动物和/或药物，和/或可用于处理人类以外的哺乳动物。因此，本发明不限于这些实施例。鉴于本文提供的教导，本领域普通技术人员将认识到本发明可以使用的其他应用。因此，本领域普通技术人员能够在其他应用中使用本发明的方法。因此，这些替代用途旨在成为本发明的部分。
在前述说明书中，本发明参照本发明的具体实施方式进行描述。然而，将显而易见的是，在不脱离本发明的更广泛精神和范围的情况下，可以对其进行各种修改和改变。因此，意图是这样的改变和修改落入由所附权利要求书限定的本发明的范围内。因此，说明书和附图应被认为是说明性而非限制性的。

Claims (53)

1.一种确定在施用免疫调节药物后所述免疫调节药物是否可能在人体内引发严重的细胞因子释放综合征的方法，所述方法包括：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述小鼠；
(c)在移植所述PBMC后5-7天向所述小鼠施用免疫调节药物；
(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，
其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和
(e)确定所述免疫调节药物可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征，
其中所述小鼠中严重细胞因子释放综合征的存在指示所述免疫调节药物的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述小鼠是NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1小鼠。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述小鼠是NSG小鼠。
4.如权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中所述小鼠用100cGy X-射线辐照。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述移植步骤(b)用2x107个PBMC进行。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述施用步骤(c)在移植后6天进行。
7.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)中的所述多种细胞因子进一步包括IL-2、IL-4、IL-6和TNF。
8.如权利要求1所述的方法，其中所述多种细胞因子的血液浓度在所述免疫调节药物施用后2-6小时测定。
9.如权利要求1所述的方法，其中所述多种细胞因子的血液浓度在所述免疫调节药物施用后6小时测定。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述免疫调节药物选自抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52 mAb；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；talimogene laherparepvec；阿达木单抗、卡妥索单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗-I131、本妥昔单抗、betuximab、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、trastuzumab emtansinen、狄诺塞麦、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、达雷木单抗、色瑞替尼、艾洛珠单抗和抗胸腺细胞球蛋白。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述抗CD28 mAb是TGN1412。
12.如权利要求10所述的方法，其中所述抗CD3 mAb是OKT3。
13.如权利要求10所述的方法，其中所述抗C20 mAb是利妥昔单抗。
14.如权利要求10所述的方法，其中所述抗CD52 mAb是阿仑单抗。
15.一种确定在施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合后所述免疫调节药物的组合是否可能在人体内引发严重的细胞因子释放综合征的方法，所述方法包括：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述小鼠；
(c)在移植所述PBMC后5-7天向所述小鼠施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物；
(d)测定所述小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度，
其中IFN-γ≥1,800pg/ml和IL-10≥120pg/ml的血液浓度指示所述小鼠中的严重细胞因子释放综合征；和
(e)确定所述免疫调节药物的组合可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征，
其中所述小鼠中严重细胞因子释放综合征的存在指示所述免疫调节药物的组合的施用可能在所述人中引发严重的细胞因子释放综合征。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述小鼠是NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1小鼠。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述小鼠是NSG小鼠。
18.如权利要求15所述的方法，其中在步骤(a)中所述小鼠用100cGy X-射线辐照。
19.如权利要求15所述的方法，其中所述移植步骤(b)用2x107个PBMC进行。
20.如权利要求15所述的方法，其中所述施用步骤(c)在移植后6天进行。
21.如权利要求15所述的方法，其中步骤(d)中的所述多种细胞因子进一步包括IL-2、IL-4、IL-6和TNF。
22.如权利要求15所述的方法，其中所述多种细胞因子的血液浓度在所述免疫调节药物的组合施用后2-6小时测定。
23.如权利要求15所述的方法，其中所述多种细胞因子的血液浓度在所述免疫调节药物的组合施用后6小时测定。
24.如权利要求15所述的方法，其中所述第一免疫调节药物和所述第二免疫调节药物独立地选自抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52 mAb、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素、咪喹莫特、沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿普司特、硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌、talimogenelaherparepvec、阿达木单抗、卡妥索单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗-I131、本妥昔单抗、betuximab、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、trastuzumabemtansinen、狄诺塞麦、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、达雷木单抗、色瑞替尼、艾洛珠单抗和抗胸腺细胞球蛋白。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一免疫调节药物是派姆单抗或纳武单抗；和所述第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、epacadostat、talimogene laherparepvec、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或度伐单抗。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述第一免疫调节药物是伊匹单抗，和所述第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、派姆单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、利妥昔单抗、阿仑单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或度伐单抗。
27.如权利要求24所述的方法，其中所述第一免疫调节药物是阿特珠单抗、阿维单抗或度伐单抗，和所述第二免疫调节药物是来那度胺、泊马度胺、派姆单抗、伊匹单抗、利妥昔单抗、色瑞替尼、达雷木单抗或阿仑单抗。
28.如权利要求24所述的方法，其中所述抗CD52 mAb是阿仑单抗，所述抗C20 mAb是利妥昔单抗，所述抗CD3 mAb是OKT3，或所述抗CD28 mAb是TGN1412。
29.一种确定在施用免疫调节药物后在人体内不引发细胞因子释放综合征的所述免疫调节药物的安全剂量的方法，所述方法包括：
(a)提供具有第一剂量的免疫调节药物，所述免疫调节药物的第一剂量确定为在其施用后在第一人源化的辐照免疫缺陷小鼠中引发轻度或严重的细胞因子释放综合征；
(b)提供第二免疫缺陷小鼠，所述第二小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(c)移植从人分离的1.5-3.0x107个外周血单核细胞(PBMC)到所述第二小鼠；
(d)在移植所述PBMC后5-7天向所述第二小鼠施用免疫调节药物，所述免疫调节药物以低于所述第一剂量的第二剂量施用；
(e)测定所述第二小鼠中包括IFN-γ和IL-10的多种细胞因子的血液浓度；和
(f)确定所述免疫调节药物用于施用于所述人的安全剂量，所述安全剂量是在向所述第二小鼠施用所述免疫调节药物后产生IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度的剂量，
其中所述第二小鼠中IFN-γ<300pg/ml和IL-10<25pg/ml的血液浓度指示所述安全剂量的所述免疫调节药物的施用在所述人中可能不引发细胞因子释放综合征。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述第二小鼠是NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1小鼠。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述第二小鼠是NSG小鼠。
32.如权利要求29所述的方法，其中步骤(b)中的所述第二小鼠用100cGy X-射线辐照。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述移植步骤(c)用2x107个PBMC进行。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述施用步骤(d)在移植后6天进行。
35.如权利要求29所述的方法，其中步骤(d)中的所述多种细胞因子进一步包括IL-2、IL-4、IL-6和TNF。
36.如权利要求29所述的方法，其中所述多种细胞因子的血液浓度在所述免疫调节药物施用后2-6小时测定。
37.如权利要求29所述的方法，其中所述多种细胞因子的血液浓度在所述免疫调节药物施用后6小时测定。
38.如权利要求29所述的方法，其中所述免疫调节药物选自抗CD28单克隆抗体(mAb)、抗CD3 mAb、抗CD20 mAb、抗CD52 mAb；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；干扰素；咪喹莫特；沙利度胺、来那度胺、泊马度胺、阿普司特；硫唑嘌呤、克拉屈滨、环磷酰胺、静脉注射免疫球蛋白、甲氨蝶呤、米托蒽醌；talimogene laherparepvec；阿达木单抗、卡妥索单抗、替伊莫单抗、托西莫单抗-I131、本妥昔单抗、betuximab、利妥昔单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、帕妥珠单抗、曲妥珠单抗、trastuzumab emtansinen、狄诺塞麦、奥法木单抗、帕尼单抗、派姆单抗、纳武单抗、伊匹单抗、阿特珠单抗、阿维单抗、度伐单抗、达雷木单抗、色瑞替尼、艾洛珠单抗和抗胸腺细胞球蛋白。
39.如权利要求38所述的方法，其中所述抗CD28 mAb是TGN1412。
40.如权利要求38所述的方法，其中所述抗CD3 mAb是OKT3。
41.如权利要求38所述的方法，其中所述抗C20 mAb是利妥昔单抗。
42.如权利要求38所述的方法，其中所述抗CD52 mAb是阿仑单抗。
43.一种确定药物候选物用于人的免疫毒性的方法，所述方法包括：
(a)提供免疫缺陷小鼠，所述小鼠用75-125cGy X-射线辐照；
(b)移植4.5-5.5x107个人PBMC到所述小鼠；
(c)在移植后4-7天向所述小鼠施用药物候选物；
(d)测定所述小鼠的血液中的细胞因子浓度，其中所述细胞因子是选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF的至少一种细胞因子；和
(e)确定所述药物候选物的免疫毒性，
其中所述小鼠中选自以下的至少一种细胞因子的血液浓度指示人体中所述药物候选物的免疫毒性：
IFN-γ≥300pg/ml，
IL-2≥15pg/ml，
IL-4≥10pg/ml，
IL-6≥10pg/ml，
IL-10≥25pg/ml，和
TNF≥5pg/ml。
44.如权利要求42所述的方法，其中所述小鼠是NSG、NSG-IL-6或NSG-CSF-1小鼠。
45.如权利要求42所述的方法，其中所述小鼠是NSG小鼠。
46.如权利要求42所述的方法，其中在步骤(a)中所述小鼠用100cGy X-射线辐照。
47.如权利要求42所述的方法，其中所述移植步骤(b)用5x107个PBMC进行。
48.如权利要求42所述的方法，其中所述施用步骤(c)在移植后6天进行。
49.如权利要求42所述的方法，其中细胞因子的血液浓度在所述药物候选物施用后2-6小时测定。
50.如权利要求42所述的方法，其中细胞因子的血液浓度在所述药物候选物施用后6小时测定。
51.一种确定免疫调节药物施用于人在所述人中诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法，所述方法包括：
(a)提供在移植来自人的1.5-3.0x107个分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用免疫调节药物的人源化辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和
(b)在体外检测所述小鼠的血液样品中存在的包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，
其中所述小鼠血液样品中IFN-γ≥1,800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示所述免疫调节药物施用于所述人可能诱导严重的细胞因子释放综合征。
52.一种确定第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合施用于人在所述人中诱导严重细胞因子释放综合征的可能性的方法，所述方法包括：
(a)提供在移植来自人的1.5-3.0x107个分离的外周血单核细胞(PBMC)后5-7天施用第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合的人源化辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和
(b)在体外检测所述小鼠的血液样品中存在的包括IFN-γ和/或IL-10的多种细胞因子的浓度，其中IFN-γ≥1,800pg/ml或IL-10≥120pg/ml的浓度指示所述第一免疫调节药物和第二免疫调节药物的组合施用于所述人可能诱导严重的细胞因子释放综合征。
53.一种确定药物候选物在人体中的免疫毒性的方法，所述方法包括：
(a)提供来自在移植4.5-5.5x107个分离的人外周血单核细胞(PBMC)后4-7天施用药物候选物的人源化辐照免疫缺陷小鼠的血液样品；和
(b)在体外检测所述小鼠血液样品中存在的至少一种人细胞因子的浓度以确定所述药物候选物的人免疫毒性，其中所述至少一种人细胞因子选自IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和TNF，且其中当在所述小鼠血液样品中检测到低的人细胞因子浓度时，所述药物候选物具有低的人免疫毒性。
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11959925B2 (en) 2017-04-17 2024-04-16 The Jackson Laboratory Method of determining toxicity of an immunomodulatory drug for use in humans
WO2020041174A1 (en) * 2018-08-20 2020-02-27 The Jackson Laboratory Method of determining toxicity of an immunomodulatory drug
WO2023075539A1 (ko) * 2021-10-29 2023-05-04 서울대학교 산학협력단 면역억제물질 예측용 유전자 집단의 선별방법 및 이를 이용한 면역억제능 평가방법

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105158B1 (en) * 1992-11-16 2006-09-12 The Corporation Of Mercer University Methods of administering microencapsulated materials for immune modulated diseases
CN103304669A (zh) * 2012-03-12 2013-09-18 复旦大学 人源化肿瘤免疫细胞因子tntil2及其制备方法和用途
CN104160272A (zh) * 2011-12-06 2014-11-19 麻省理工学院 利用人源化的小鼠来确定毒性
CN105452861A (zh) * 2013-03-22 2016-03-30 皇家创新有限公司 评估细胞因子风暴反应的体外方法

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110082091A1 (en) 2009-09-28 2011-04-07 Theramab Gmbh Method for Preclinical Testing of Immunomodulatory Drugs
EP3056082B1 (en) 2009-10-06 2018-09-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified mice and engraftment
EP2422618A1 (en) 2010-08-27 2012-02-29 Technologie Integrale Ltd. Animal model for the evaluation of the efficacy of an HIV vaccine
ES2948210T3 (es) 2011-02-15 2023-09-06 Regeneron Pharma Ratones humanizados con M-CSF y uso de los mismos
TWI810145B (zh) 2015-06-23 2023-08-01 杰克森實驗室 具有病患衍生之異種移植物之非ｈｌａ配對的人源化ｎｓｇ小鼠模式
CN108780084B (zh) 2015-09-03 2022-07-22 诺华股份有限公司 预测细胞因子释放综合征的生物标志物
US11959925B2 (en) 2017-04-17 2024-04-16 The Jackson Laboratory Method of determining toxicity of an immunomodulatory drug for use in humans
CN110055223A (zh) 2018-01-19 2019-07-26 北京百奥赛图基因生物技术有限公司 一种B2m基因改造的免疫缺陷动物的制备方法及其应用
AU2021347320A1 (en) 2020-09-24 2023-05-11 The Jackson Laboratory Humanized mouse models for assessing immune cell therapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7105158B1 (en) * 1992-11-16 2006-09-12 The Corporation Of Mercer University Methods of administering microencapsulated materials for immune modulated diseases
CN104160272A (zh) * 2011-12-06 2014-11-19 麻省理工学院 利用人源化的小鼠来确定毒性
CN103304669A (zh) * 2012-03-12 2013-09-18 复旦大学 人源化肿瘤免疫细胞因子tntil2及其制备方法和用途
CN105452861A (zh) * 2013-03-22 2016-03-30 皇家创新有限公司 评估细胞因子风暴反应的体外方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
S.L.MALCOLM 等: "A humanised mouse model of cytokine release: Comparison of CD3-specific antibody fragments", 《JOURNAL OF IMMUNOLOGICAL METHODS》 *
SABRINA WEISSMÜLLER 等: "TGN1412 Induces Lymphopenia and Human Cytokine Release in a Humanized Mouse Model", 《PONE》 *

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