CN108883093A - 二盐酸组胺组合及其用途 - Google Patents

二盐酸组胺组合及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN108883093A
CN108883093A CN201780017047.0A CN201780017047A CN108883093A CN 108883093 A CN108883093 A CN 108883093A CN 201780017047 A CN201780017047 A CN 201780017047A CN 108883093 A CN108883093 A CN 108883093A
Authority
CN
China
Prior art keywords
subject
cell
cancer
treatment
blood sample
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780017047.0A
Other languages
English (en)
Inventor
A·马特纳
F·埃瓦德赛德
F·伯格索伦
K·海兰斯特
H·维克托林格劳尔斯
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Immune Pharmaceuticals Ltd
Original Assignee
Immune Pharmaceuticals Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=59563785&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN108883093(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Immune Pharmaceuticals Ltd filed Critical Immune Pharmaceuticals Ltd
Publication of CN108883093A publication Critical patent/CN108883093A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/417—Imidazole-alkylamines, e.g. histamine, phentolamine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A61K31/341—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide not condensed with another ring, e.g. ranitidine, furosemide, bufetolol, muscarine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K33/00—Medicinal preparations containing inorganic active ingredients
    • A61K33/18—Iodine; Compounds thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39541—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against normal tissues, cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2827—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against B7 molecules, e.g. CD80, CD86
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A61K2039/507—Comprising a combination of two or more separate antibodies

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供了治疗受试者中的癌症、预防或延迟缓解期的受试者中的癌症复发、延长癌症缓解、增加存活和减少或减轻癌症症状的方法，其包括a)施用二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD‑1)/程序性死亡配体1(PD‑L1)的抑制剂，或b)任选地连同组胺受体激动剂一起施用降低活性氧物种(ROS)的试剂。本发明还提供了基于细胞毒性T细胞的重新分布、NK细胞的频率或其它生物化学变化来预测癌症治疗功效的方法，以及预防癌症复发和延长癌症缓解的相关方法。本发明还提供了相关的试剂盒和组合物。

Description

二盐酸组胺组合及其用途
技术领域
本发明提供了治疗受试者中的癌症、预防或延迟缓解期的受试者中的癌症复发、延长癌症缓解、增加存活和减少或减轻癌症症状的方法，其包括a)施用二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)/程序性死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，或b)任选地连同组胺受体激动剂一起施用降低活性氧物种(ROS)的试剂。本发明还提供了基于细胞毒性T细胞的重新分布、NK细胞的频率或其它生物化学变化来预测癌症治疗功效的方法，以及预防癌症复发和延长癌症缓解的相关方法。本发明还提供了相关的试剂盒和组合物。
背景技术
二盐酸组胺源自生物胺组胺。它抑制活性氧物种的产生，其抑制T细胞和天然杀伤(NK)细胞的功能，包括它们对免疫活化细胞因子的反应性。细胞因子白细胞介素(IL)-2和二盐酸组胺的共施用帮助通过IL-2的T细胞和NK细胞活化，导致癌细胞包括急性髓样白血病(AML)的癌细胞的破坏。
诊断患有急性髓样白血病(AML)的患者接受诱导化学疗法，旨在获得白血病细胞的微观消失和正常造血的再现(完全缓解，CR)。缓解后阶段包括巩固化学疗法，目的是根除不可检测的白血病细胞。然而，CR复发是常见的，特别是在老年患者(>60岁)中，并且显著地解释了为何仅少数成年AML患者实现长期无白血病存活(LFS)。AML复发后的长期存活的前景很差。因此，迫切需要预防处于CR的AML和其它癌症中的复发的方法。
另外，研究人员意识到癌症治疗经常不是最佳有效的，因为尽管免疫系统可识别肿瘤细胞，但由于限制或关闭抗肿瘤应答的抑制机制，它仍可保持静止。例如，发现负调节性T细胞表面分子，其在活化的T细胞中上调以抑制其活性，导致较不有效的肿瘤细胞杀死。这些抑制性分子由于其与T细胞共刺激分子CD28的同源性而被称为负共刺激分子。这些蛋白质，也称为免疫检查点蛋白质，在多重途径中起作用，所述途径包括早期活化信号的减弱、对正共刺激的竞争和抗原呈递细胞的直接抑制。
一种免疫检查点蛋白质PD-1(程序性细胞死亡蛋白1)也称为CD279(分化簇279)，在活化的T细胞和B细胞以及涉及调节免疫活化和耐受之间平衡的单核细胞上表达。PD-1的主要作用推测为在对感染的炎症应答期间限制外周中的T细胞活性且限制自身免疫。PD-1配体B7-H1/PD-L1和B7-DC/PD-L2响应各种促炎细胞因子而上调，并且可与发炎组织中的活化T细胞上的PD-1结合，从而限制免疫应答。
PD-1配体在许多人肿瘤上以高于正常水平表达，所述人肿瘤例如肺癌、卵巢癌和结肠癌以及黑素瘤，在其中它们通过结合肿瘤浸润性淋巴细胞上的PD-1来抑制局部抗肿瘤T细胞应答。抑制PD-1和PD-L1之间的相互作用可增强体外T细胞应答并且介导临床前抗肿瘤活性。
免疫检查点抑制剂(ICI)例如PD-1的使用看起来代表用于改善癌症免疫疗法的有希望的方法。然而，PD-1/PD-L1抑制剂与免疫活化的其它手段(包括疫苗)的组合经常不导致免疫疗法的希望改善。
因此，需要用于基于用ICI的治疗，特别是基于PD-1途径抑制剂的疗法，特别是用于肿瘤、癌症和/或传染病的疗法的安全有效手段。
发明内容
在一个实施例中，本发明提供了降低患有原发性或转移性癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的肿瘤负荷。
在另一个实施例中，本发明提供了降低患有活动性癌症的受试者中的转移性肿瘤扩散的风险的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的转移性肿瘤扩散的风险。
在另一个实施例中，本发明提供了预防或延迟受试者中的癌症再现、重现或转移性扩散的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而预防或延迟所述受试者中的所述癌症再现、重现或转移性扩散。
在另一个实施例中，本发明提供了预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而预防所述癌症缓解期的所述受试者中的所述癌症复发。
在另一个实施例中，本发明提供了延迟癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而延迟所述癌症缓解期的所述受试者中的所述癌症复发。
在另一个实施例中，本发明提供了延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
在另一个实施例中，本发明提供了增加癌症缓解期的受试者中的存活的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而增加所述受试者的存活。
在另一个实施例中，本发明提供了延长癌症缓解期的受试者的存活时间的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延长所述受试者的存活时间。
在另一个实施例中，本发明提供了降低受试者中的恶性肿瘤生长的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而降低所述受试者中的恶性肿瘤生长。
在另一个实施例中，本发明提供了减少或减轻癌症缓解期的受试者中的癌症症状的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而减少或减轻所述受试者中的所述癌症症状。
在另一个实施例中，本发明提供了用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含a)治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，以及所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且d)测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，其中如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在细胞毒性T细胞的重新分布，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，并且e)如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，从而预防所述受试者中的所述癌症复发。
在另一个实施例中，本发明提供了延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，并且e)如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
在另一个实施例中，本发明提供了预防在化学疗法后处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)的第一周期；c)在所述第一治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)测量所述血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的分布；并且e)如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用二盐酸组胺和IL-2的另外周期，从而预防所述受试者中的AML复发。
在另一个实施例中，本发明提供了用于预测受试者中的癌症治疗功效的试剂盒，其包含治疗量的组胺受体激动剂、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：(a)从所述受试者获得第一血样；(b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；(c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且(d)测量所述第一血样和所述第二血样中的NK细胞频率，其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：(a)从所述受试者获得第一血样；(b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；(c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且(d)测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：(a)从所述受试者获得第一血样；(b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；(c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且(d)测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗受试者的癌症的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的减少活性氧物种(ROS)的试剂。
附图说明
视为本发明的主题在说明书的结论部分中特别指出并清楚地请求保护。然而，当与附图一起阅读时，通过参考下述详细描述，可最好地理解本发明的组构和操作方法以及其目的、特征和优点，在所述附图中：
图1.四个治疗组中的每个受试者的个别肿瘤大小。显示了在肿瘤进展期间的第8、11和13天时，对照(n＝29)、组胺(n＝29)、α-PD1/PDL1(n＝8)和组胺+α-PD1/PDL1(n＝8)治疗组中的每个受试者的肿瘤大小。肿瘤大小指示为对照的％，其中100％是在肿瘤接种后2周时的对照肿瘤的平均大小。
图2.四个治疗组中的平均肿瘤大小。显示了在肿瘤进展期间的第8、11和13天时，对照(n＝29)、组胺(n＝29)、α-PD1/PDL1(n＝8)和组胺+α-PD1/PDL1(n＝8)治疗组中的平均(s.e.m.)肿瘤大小的平均值±标准误。使用双因素ANOVA对组进行统计学比较。*p<0.05，***p<0.001。所有指示的p值都是双侧的。肿瘤大小指示为对照的％，其中100％是在肿瘤接种后2周时的对照肿瘤的平均大小。
图3.四个治疗组中的肿瘤大小。四个治疗组中的肿瘤大小显示为在肿瘤测量的分别时间点的箱形图。方框显示了肿瘤大小的第一四分位数和第三四分位数，其中中值肿瘤大小由水平线指示。胡须指示肿瘤大小的最高值和较低值。使用斯氏t检验计算P值。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。所有指示的p值都是双侧的。肿瘤大小指示为对照的％，其中100％是在肿瘤接种后2周时的对照肿瘤的平均大小。
图4.复发:缓解期IV试验的概述。首次完全缓解(CR)期间的合格AML患者经过18个月接受HDC/IL-2的十个3周周期。从周期1和3之前以及之后收集的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。患者在完成最后一个治疗周期后随访6个月。
图5.分析的患者。流程图显示研究中包括的患者数目和成功分析的样品数目。
图6.在使用HDC/IL-2的免疫治疗期间的非复发和复发AML患者中的CD8+亚群分布。(A)在HDC/IL-2治疗(C1D1n＝62；C1D21n＝54；C3D1n＝52；C3D21n＝51)的第一周期和第三周期之前(周期1，第1天，C1D1)以及之后(C1D21)的CD8+T细胞的血细胞计数。(B)用于确定CD8+T细胞区室内的幼稚(TN；CD45RA+CCR7+)、中枢记忆(TCM；CD45RO+CCR7+)、效应记忆(TEM；CD45RO+CCR7-)和效应(Teff；CD45RA+CCR7-)细胞的门控策略。(C-F)在免疫疗法的第一周期开始(C1D1)或结束(C1D21)时，在非复发(n＝18)和复发(n＝26)患者中的CD8+亚群TN(C)、TCM(D)、TEM(E)和Teff(F)细胞频率。通过斯氏配对t检验执行统计分析。
图7.在免疫疗法开始时的CD8+亚群对LFS的影响。基于在HDC/IL-2的第一治疗周期之前收集的血样中的TN(A)TCM(B)、TEM(C)和Teff(D)CD8+T细胞的中值百分比，将患者进行二分。通过时序检验分析LFS。
图8.CD8+亚群的改变分布对接受HDC/IL-2的患者的临床结果的影响。基于在第一治疗周期期间的CD8+T细胞亚群频率的诱导或降低，随后为通过时序检验的LFS和OS分析，将(A-D)中的所有患者和(F-I)中>60岁的患者进行二分。基于从TEM到Teff细胞的转换(反式)或无转换，将(E)中的所有患者和(J)中>60岁的患者进行二分，并且通过时序检验分析LFS和OS。通过在第一治疗周期期间发生的TEM细胞(％)降低和Teff细胞(％)的同时诱导，患者视为转换阳性的。
图9.在免疫治疗期间的TEM和Teff细胞分布中的变化之间的负相关。在用HDC/IL-2的第一治疗周期期间，CD8+TEM(y轴)和Teff(x轴)频率中的变化是相关的。非复发患者以红点标记，而复发患者以黑点标记。
图10.接受HDC/IL-2的年轻和老年患者中的CD8+T细胞群体的分布。(A-D)在HDC/IL-2免疫疗法的周期1之前(周期1，第1天；C1D1)或之后(C1D21)，在<60岁的患者(n＝17)和>60岁的患者(n＝27)中的CD8+亚群TN、TCM、TEM和Teff细胞频率。通过斯氏配对t检验执行统计分析。在(E-L)中，基于在第一治疗周期期间的不同CD8+亚群频率的诱导或降低，随后为通过时序检验的LFS和OS分析，将<60岁的患者进行二分。在(M-N)中，基于从TEM到Teff细胞的转换或无转换，将<60岁的患者进行二分，并且通过时序检验分析LFS和OS。
图11.在使用HDC/IL-2的免疫治疗期间，在CD8+T细胞上的活化标记物的表达。在CD3+CD8+群体中的(A)CD25+和(B)CD69+细胞频率(周期1，第1天；C1D1n＝62；C1D21n＝63)。(C)CD3+CD8+T细胞上的HLA-DR的中值荧光强度(MFI)(n＝44)。(D)用PMA/离子霉素刺激在免疫疗法的第一周期开始(C1D1)或结束(C1D21)时收集的血样，随后为IFN-γ的细胞内染色。箱形图显示了在第一治疗周期之前和之后的产生IFN-γ的CD8+T细胞的频率(C1D1n＝58；C1D21n＝63)。通过斯氏配对t检验执行统计分析。在周期1期间HLA-DR强度的降低(在小图C中显示)在非参数分析中保持统计上显著的(威尔科克森符号秩检验，P＝0.0003)。
图12.接受HDC/IL-2的患者中的HLA-DR表达和白血病特异性CD8+T细胞对LFS的影响。(A)在治疗开始时(C1D1；n＝44)或在第一治疗周期之后(C1D21；n＝47)，通过CD3+CD8+T细胞上的中值HLA-DR表达，将患者进行二分。通过时序检验分析LFS和OS。(B-C)用来自白血病相关抗原(AML-肽)的肽库、或来自CMV、EBV和流感病毒的肽库(CEF-肽)、或不用肽(阴性对照)刺激来自经历HDC/IL-2治疗的患者的血样。通过流式细胞术测定产生IFN-γ的CD8+T细胞的百分比。在(B)中，代表性的点图显示了没有刺激的样品以及用AML-肽或CEF-肽刺激的样品中的IFN-γ产生。在(C)中，基于AML特异性或CEF特异性CD8+T细胞的存在或不存在，随后为通过时序检验的LFS分析，将患者进行二分。在后面的分析中仅考虑在抗原特异性T细胞分析的最后时间点(C3D21；105天)之前没有事件发生的患者。
图13.TEM至Teff细胞转换和NK细胞NKp46表达对临床结果的影响。(A-B)当在第一治疗周期期间显示TEM细胞(％)的降低和Teff细胞(％)的同时诱导时，患者视为转换阳性的，并且当在免疫治疗的第一周期之后(C1D21)，他们的CD16+NK细胞表达高于NKp46的中值水平时，视为NKp46高。数据显示具有转换TEM-Teff和NKp46高(两者)、仅转换、仅NKp46高、无转换TEM-Teff和低NKp46表达(两者均无)的患者的LFS和OS(通过时序检验分析趋势)。
图14.小于和大于60岁的患者中的NK细胞的诱导和活化。小图A-F中的箱形图显示了在<60岁(年轻，白色；NK细胞计数，n＝17，NCR表达，n＝21)和>60年(老年，灰色；NK细胞计数，n＝30，NCR表达，n＝35)的患者中，在用HDC/IL-2的第一个21天治疗周期之前(C1D1)和之后(C1D21)，血液中的CD16+或CD56亮NK细胞数目(A和D)、以及CD16+或CD56亮NK细胞上的NKp30(B和E)和NKp46(C和F)的中值荧光强度(MFI)。使用斯氏配对t检验分析NK细胞计数和NCR表达的诱导。
图15：NK细胞NCR表达对老年AML患者的无白血病存活(LFS)和总体存活(OS)的影响。在小图A-D中，显示了老年患者(>60)的LFS和OS，基于在第一个HDC/IL-2治疗周期之前(A和B)或之后(C和D)，高于(红色)或低于(黑色)在CD16+NK细胞上的NKp30(A和C)或NKp46(B和D)表达的中值，将所述老年患者进行二分。
图16.使用HDC/IL-2的免疫治疗增加白血细胞计数，并且减少血液单核细胞水平。小图AD显示了在使用HDC/IL-2的免疫治疗的周期1(C1)和3(C3)之前(第1天；D1)和之后(第21天；D21)的(A)白血细胞、(B)嗜酸性粒细胞、(C)嗜中性粒细胞和(D)单核细胞的外周血细胞计数。斯氏配对t检验用于分析时间点之间的差异。在小图E-F中，基于在周期1期间的中值单核细胞降低，随后为通过时序检验的LFS和OS分析，将患者进行二分。
图17.组胺H2R表达对LFS和OS的影响。小图A-B显示了如通过斯氏配对t检验分析的，在HDC/IL-2的周期期间，(A)CD14++和(B)CD16+单核细胞的H2R表达。在小图C-F中，基于在免疫治疗的1第21天(C1D21)时的(C和E)CD14++或(D和F)CD16+单核细胞的中值H2R表达(MFI)，随后为通过时序检验的LFS和OS分析，将患者进行二分。
图18.在HDC/IL-2的免疫治疗期间髓样表面标记物的重新分布。小图A显示了在第1天和第21天时，在周期1和3中的CD14+单核细胞上HLA-DR、CD40和CD86(MFI)表达。小图B-D显示了(B)CD16+单核细胞、(C)CD1c+DC和(D)CD141+DC的相应表达数据。斯氏配对t检验用于分析时间点之间的差异。
图19.髓样细胞上的HLA-ABC表达预测在用HDC/IL-2的治疗期间的LFS。小图A-D显示了在下述髓样细胞亚群的指定时间点的HLA-ABC表达：(A)CD14+单核细胞、(B)CD16+单核细胞、(C)CD1c+DC和(D)CD141+DC。斯氏配对t检验用于分析时间点之间的差异。在小图E(LFS)和F(OS)中，基于周期1第1天(C1D1)时的CD14+单核细胞的中值HLA-ABC表达，随后为通过时序检验的LFS和OS分析，将患者进行二分。
图20.连同或不连同在免疫疗法开始时的高CD8+TEM计数或在免疫治疗期间的TEM至TEff转换，单核细胞HLA-ABC表达对患者结果的影响。在小图A-C中，基于C1D1时的CD14+单核细胞上的中值HLA-ABC表达，随后为通过时序检验的LFS或OS分析，将在周期1第1天(C1D1)时具有血液CD8+TEM细胞的高或低计数的患者进行二分。小图D-F显示了在免疫疗法的周期1期间实现或未实现CD8+TEM至TEff细胞转换的患者的相应结果。
图21.CMML患者携带具有免疫抑制性质的白血病细胞。小图A显示了外周血中的CMML单核细胞的代表性门控策略。绿色群体包含成熟的白血病CD14+细胞，而未成熟的CD34+胚细胞用蓝色描绘。(B)来自CMML患者(n＝11)和健康对照(n＝10)的外周血中的CD14+和CD34+细胞上的gp91phox和H2R的流式细胞术分析。小图C显示了来自FACS分选的CD14+CMML细胞的代表性ROS测量，连同或不连同用HDC(50μM)、雷尼替丁(10μM)和AH202399AA(10μM)的抑制，而小图D显示了使用NOX-2抑制剂HDC(100μM，p<0.001)的11个组合实验。使用威尔科克森匹配对符号秩检验分析小图D。
图22.产生ROS的CMML细胞损害NK细胞功能。小图A显示了共焦显微照片，其描绘了NK细胞(左)和CD14+CMML细胞(右)之间的相互作用。蓝色染色代表核的DAPI染色，并且绿色染料与膜结合的gp91phox结合。(B)在抗CD33抗体林妥珠单抗(1μg/ml)和HDC(100μM)的存在或不存在下，通过IL-2刺激的NK细胞(n＝9)针对CD14+CMML细胞的脱颗粒。使用斯氏配对t检验和邦弗朗尼校正来分析数据。小图C显示了在以范围为16:1至1:1的比率与CMML细胞过夜温育后的NK细胞死亡(n＝6)。对于每个供体，图中显示了具有至少50％的凋亡NK细胞来自第一NK:CMML比率的凋亡NK细胞的程度。当指示时，在过夜温育期间存在NOX2-抑制剂HDC(100μM)、PARP-1抑制剂PJ34(0.5μM)、NOX2抑制剂DPI(3μM)或过氧化氢酶(200U/ml)。通过单因素ANOVA随后为邦弗朗尼多重比较检验，分析抑制剂对CMML诱导的NK细胞凋亡的作用。
图23.CD8+T细胞对CMML细胞诱导的ROS介导的细胞死亡敏感。小图A显示了在抑制剂HDC(100μM)、PARP-1抑制剂PJ34(0.5μM)、NOX2抑制剂DPI(3μM)或过氧化氢酶(200U/ml)的存在或不存在下，在以比率1:1与CMML细胞温育过夜后的CD8+T细胞凋亡(n＝4)。通过单因素ANOVA随后为邦弗朗尼多重比较检验进行分析。在小图B中，将指示的CD8+T细胞亚群分选，并且连同或不连同NOX2抑制剂DPI(3μM，n＝3)，以比率1:1与CMML细胞温育过夜。TN细胞定义为CD45RA+CCR7+，TCM定义为CD45RO+CCR7+，TEM定义为CD45RO+CCR7-，并且TEff定义为CD45RA+CCR7-。通过单因素ANOVA随后为邦弗朗尼多重比较检验进行分析。
图24.CMML患者中的活化NK细胞受体的表达。小图A显示了受体NKp30、NKp46、NKp80、NKG2D、DNAM-1和2B4的中值荧光强度(MFI)，而小图B显示了关于相应受体阳性的NK细胞百分比。在小图A和B中，CMML患者(n＝10)在PBMC中分成高于(n＝5)或低于(n＝5)2％CD34+胚细胞，并且与年龄匹配的对照(H.D；n＝10)进行比较。通过斯氏t检验分析数据。
图25.ROS介导的活化受体的下调。(A)在PARP-1抑制剂PJ34(0.5μM)的存在或不存在下，将来自健康供体的NK细胞和单核细胞共温育过夜。展示了受体NKp46、NKp80、DNAM-1和CD16的中值荧光强度(MFI)。通过斯氏t检验分析数据。
应了解，为了说明的简单和清楚，附图中所示的元件不一定按比例绘制。例如，为了清楚起见，一些元件的尺寸可相对于其它元件放大。此外，在认为适当的情况下，参考数字可在附图中重复，以指示相应或类似的元件。
具体实施方式
在下述详细描述中，阐述了许多具体细节，以便提供本发明的透彻理解。然而，本领域技术人员将理解，本发明可无需这些具体细节而实践。在其它情况下，没有详细描述众所周知的方法、程序和组分，以免模糊本发明。
在另一个实施例中，本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂与另一种治疗剂，从而治疗所述受试者中的所述癌症。在一个实施例中，治疗剂是程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)抑制剂。在另一个实施例中，治疗剂是程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂。
在一个实施例中，本发明提供了降低患有原发性或转移性癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的肿瘤负荷。
在另一个实施例中，本发明提供了降低患有活动性癌症的受试者中的转移性肿瘤扩散的风险的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的转移性肿瘤扩散的风险。
在另一个实施例中，本发明提供了预防或延迟受试者中的癌症再现、重现或转移性扩散的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而预防或延迟所述受试者中的所述癌症再现、重现或转移性扩散。
在另一个实施例中，本发明提供了预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而预防所述癌症缓解期的所述受试者中的所述癌症复发。
在另一个实施例中，本发明提供了延迟癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而延迟所述癌症缓解期的所述受试者中的所述癌症复发。
在另一个实施例中，本发明提供了延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
在另一个实施例中，本发明提供了增加癌症缓解期的受试者中的存活的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而增加所述受试者的存活。
在另一个实施例中，本发明提供了延长癌症缓解期的受试者的存活时间的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延长所述受试者的存活时间。
在另一个实施例中，本发明提供了降低受试者中的恶性肿瘤生长的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而降低所述受试者中的恶性肿瘤生长。
在另一个实施例中，本发明提供了减少或减轻癌症缓解期的受试者中的癌症症状的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而减少或减轻所述受试者中的所述癌症症状。
在另一个实施例中，本发明提供了用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含a)治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，以及所述试剂盒的使用说明书。
PD-1抑制剂
在一个实施例中，本发明的癌症治疗包括施用与如本文所述的一种或多种治疗剂组合的PD-1的抑制剂。在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗体。在一个实施例中，抗体是拮抗性抗体或核酸编码的抗体(胞内抗体)。在另一个实施例中，PD-1抑制剂是siRNA、反义RNA、包含能够结合PD-1但阻止PD-1信号传导的氨基酸序列的蛋白质(或编码核酸)(例如PD-L1或PD-L2的片段和免疫球蛋白的Fc部分的融合蛋白)、与膜结合的PD-1竞争结合其配体PD-L1和PD-L2的可溶性蛋白质(或编码可溶性蛋白质的核酸)；或能够抑制PD-1途径信号传导的小分子抑制剂。
在一个实施例中，PD-1抑制剂是抗PD1抗体纳武单抗(MDX-1 106/BMS-936558/ONO-4538)，(Brahmer等人，2010.J Clin Oncol.28(19):3167-75；PMID:2051 6446)；或Pidilizumab(CT-01 1)，(Berger等人，2008.Clin Cancer Res.14(10):3044-51；PMID:18483370)；和MK-3475(SCH 900475)。在另一个实施例中，抗PD1抗体是派姆单抗。
在另一个实施例中，PD-1途径抑制剂是针对PD-1配体的抗体(或编码抗体的核酸)，在一个实施例中，是特异性结合PD-1或PD-2配体的细胞外结构域的抗体。在一个实施例中，抗体结合配体上的PD-1或PD-2结合位点的近端且破坏其。
PD-L1抑制剂
在一个实施例中，抗PD-L1抗体是MDX-1 105/BMS-936559(Brahmer等人2012.NEngl J Med.366(26):2455-65；PMID:22658128)；MPDL3280A/RG7446或MEDI4736。在另一个实施例中，PD-1途径抑制剂是包含能够结合PD-1但阻止PD-1途径信号传导的氨基酸序列的蛋白质(或编码核酸)。在一个实施例中，PD-1途径抑制剂是PD-L1或PD-L2配体的片段的融合蛋白。在一个实施例中，PD-1途径抑制剂是融合蛋白，其包含PD-L1或PD-L2的细胞外结构域或者其能够结合PD-1的片段和免疫球蛋白的Fc部分。此类融合蛋白的例子由AMP-224(与鼠lgG2a蛋白的未修饰Fc部分融合的鼠IgG-L2/B7-DC的细胞外结构域；Mkrtichyan等人，2012.J Immunol.189(5):2338-47；PMID:22837483)表示。
组胺
在一个实施例中，组胺用于本发明的方法和组合物中。在另一个实施例中，组胺受体激动剂用于本发明的方法和组合物中。在一个实施例中，本发明的组胺是二盐酸组胺。在另一个实施例中，本发明的组胺是N-甲基-组胺。在另一个实施例中，本发明的组胺是4-甲基-组胺。在另一个实施例中，本发明的组胺包含其它组胺H2受体激动剂。
二盐酸组胺是商购可得的，并且制备二盐酸组胺以及其它形式的组胺的方法是本领域已知的(例如美国专利6,528,654，其以引用的方式并入本文)。
施用模式
在一个实施例中，PD-1或PD-L1抑制剂和组胺的施用可在相同的施用部位或在不同的施用部位同时或时间上交错发生。
在另一个实施例中，本文所述的任何治疗性或预防性药物或化合物可同时施用。在另一个实施例中，它们可在彼此不同的时间施用。在一个实施例中，它们可在彼此的几分钟内施用。在另一个实施例中，它们可在彼此的几小时内施用。在另一个实施例中，它们可在彼此的1小时内施用。在另一个实施例中，它们可在彼此的2小时内施用。在另一个实施例中，它们可在彼此的5小时内施用。在另一个实施例中，它们可在彼此的12小时内施用。在另一个实施例中，它们可在彼此的24小时内施用。
在一个实施例中，本文所述的任何治疗性或预防性药物或化合物可在相同的施用部位施用。在另一个实施例中，它们可在不同的施用部位施用。
免疫刺激剂
在另一个实施例中，其中施用PD-1或PD-L1抑制剂和组胺的本发明的方法还包括施用另外的免疫刺激剂的步骤。在一个实施例中，另外的免疫刺激剂是白细胞介素-2(IL-2)。IL-2的施用可在与PD-1或PD-L1抑制剂和组胺相同的施用部位或不同的施用部位同时或时间上交错发生。
在另一个实施例中，PD-1或PD-L1抑制剂和组胺作为与LAG-3的抑制剂、吲哚胺2,3-双加氧酶1(IDO1)的抑制剂、sipuleucel-T、或其它疫苗接种或其组合的组合治疗施用。在另一个实施例中，PD-1或PD-L1抑制剂和组胺作为与抗CD40、抗CD27、抗4-1BB或其组合的组合治疗施用。在另一个实施例中，PD-1或PD-L1抑制剂和组胺作为与其它免疫刺激剂的组合治疗施用。在一个实施例中，免疫刺激剂是IFN、IL-21、抗杀死免疫球蛋白样受体[KIR]或其组合。
在另一个实施例中，除施用PD-1或PD-L1抑制剂和组胺之外，还在本发明的方法中施用癌症疫苗。在一个实施例中，疫苗是在另一个实施例中，疫苗是在另一个实施例中，疫苗是sipuleucel-T。
在另一个实施例中，本发明提供了用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含a)治疗量的二盐酸组胺和PD-1或PD-L1抑制剂、以及所述试剂盒的使用说明书。
在一个实施例中，组胺是免疫刺激剂。在一个实施例中，除二盐酸组胺之外，该试剂盒还包含另外的免疫刺激剂。在一个实施例中，另外的免疫刺激剂是IL-2。在另一个实施例中，除二盐酸组胺和PD-1或PD-L1抑制剂之外，该试剂盒还包含另外的治疗，包括上文所述的治疗。
预测癌症治疗的功效
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法。
在一个实施例中，生物标记物用于预测受试者中的癌症治疗功效。在一个实施例中，生物标记物是H2R。在另一个实施例中，生物标记物是NKp30。在另一个实施例中，生物标记物是NKp46。
在另一个实施例中，生物标记物是人白细胞抗原-抗原D相关(HLA-DR)、CD86、CD40或其组合。在另一个实施例中，生物标记物是HLA-ABC的低表达。在另一个实施例中，血单核细胞计数的降低预示无白血病存活。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：(a)从所述受试者获得第一血样；(b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；(c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且(d)测量所述第一血样和所述第二血样中的NK细胞频率，其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：(a)从所述受试者获得第一血样；(b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；(c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且(d)测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：(a)从所述受试者获得第一血样；(b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；(c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且(d)测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在一个实施例中，预测如本文所述的癌症治疗功效的方法可与以下结合使用：预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法、延长受试者中的癌症缓解的方法、预防在化学疗法后处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的方法或其组合，其中所述方法包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)在所述第一血样和所述第二血样中测量预测受试者中的癌症治疗功效的方法中使用的生物标记物，并且e)如果所述生物标记物已从所述第一血样到所述第二血样改变，其方式预测如本文所述的癌症治疗的功效，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期。
细胞毒性T细胞的重新分布
在一个实施例中，本发明提供了预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；并且d)测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，其中如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，并且其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在细胞毒性T细胞的重新分布，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
在另一个实施例中，本发明提供了预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，并且e)如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，从而预防所述受试者中的所述癌症复发。
在另一个实施例中，本发明提供了延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；c)在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，并且e)如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
在另一个实施例中，本发明提供了预防处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的方法，其包括以下步骤：a)从所述受试者获得第一血样；b)向所述受试者施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)的第一周期；c)在所述第一治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；d)测量所述血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率；并且e)如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用二盐酸组胺和IL-2的另外周期，从而预防所述受试者中的AML复发。
活性氧物种(ROS)
在另一个实施例中，本发明提供了治疗受试者中的癌症的方法，其包括以下步骤：施用治疗量的降低活性氧物种(ROS)的试剂。在一个实施例中，该方法包括施用治疗量的降低细胞外ROS的试剂的步骤。
在一个实施例中，该试剂是ROS形成的抑制剂。在另一个实施例中，该试剂是细胞外ROS的清除剂。
在一个实施例中，该方法还包括施用组胺受体激动剂的步骤。在一个实施例中，癌症是白血病。在一个实施例中，白血病是慢性髓单核细胞性白血病(CMML)。
癌症
在一个实施例中，如本文所述的治疗癌症的方法包括预防或延迟缓解期的受试者中的癌症复发、延长癌症缓解、增加存活、减少或减轻癌症症状的方法或其组合。在另一个实施例中，如本文所述的治疗癌症的方法包括降低患有原发性或转移性癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，降低患有活动性癌症的受试者中的转移性肿瘤扩散的风险，预防或延迟受试者中的癌症再现、重现或转移性扩散，预防受试者中的癌症复发，延迟癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发，延长受试者中的癌症缓解，增加癌症缓解期的受试者中的存活，延长癌症缓解期的受试者的存活时间，降低受试者中的恶性肿瘤生长，减少或减轻癌症缓解期的受试者中的癌症症状，或其组合。
在一个实施例中，通过本发明的方法治疗的受试者已患有或正患有癌症或肿瘤。在另一个实施例中，通过本发明的方法治疗的受试者处于癌症或肿瘤的缓解期。在另一个实施例中，受试者处于完全缓解(CR)中。在一个实施例中，CR来自白血病。评估完全缓解的方法是本领域众所周知的。
在另一个实施例中，通过本发明的方法治疗的受试者具有实体瘤或淋巴瘤，并且显示对早期癌症治疗的“应答”。在另一个实施例中，通过本发明的方法治疗的受试者具有实体瘤或淋巴瘤，并且显示对早期癌症治疗的“完全应答”。
在一个实施例中，患有癌症或肿瘤的受试者已用手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法包括预期增强针对癌症的免疫系统应答的疗法或其组合进行治疗。在另一个实施例中，用组胺和PD-1或PD-L1抑制剂治疗患有癌症或肿瘤的受试者。
在一个实施例中，本发明的方法中的受试者患有或已患有癌症。在另一个实施例中，受试者患有或已患有肿瘤。在另一个实施例中，受试者患有肿瘤疾病。在另一个实施例中，受试者患有恶性肿瘤。在另一个实施例中，受试者患有或已患有癌前状况或恶变前状况。
在一个实施例中，癌症是白血病。在一个实施例中，白血病是急性髓样白血病(AML)。在另一个实施例中，白血病是慢性髓样白血病(CML)。在另一个实施例中，白血病是慢性髓单核细胞性白血病(CMML)。在另一个实施例中，白血病是急性淋巴细胞性白血病(ALL)。在另一个实施例中，白血病是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在另一个实施例中，白血病是毛细胞白血病。
在一个实施例中，肿瘤是实体瘤。在一个实施例中，实体瘤是结肠癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌、肝癌、骨癌、卵巢癌、胰腺癌、脑癌、头颈癌或其它实体瘤。
在一个实施例中，癌症或肿瘤在乳腺、前列腺、肺、结肠、胃、胰腺、卵巢或脑中。在另一个实施例中，癌症是造血系统癌症、神经母细胞瘤或恶性神经胶质瘤。
在另一个实施例中，癌症选自下述中的一种或多种：肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、卡波西肉瘤、AIDS相关淋巴瘤、原发性CNS淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统、基底细胞癌-参见皮肤癌(非黑色素瘤)、胆管癌、膀胱癌、骨癌、尤文肉瘤肿瘤家族、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤、脑干胶质瘤、脑瘤、星形细胞瘤、脑和脊髓肿瘤治疗概述、脑干胶质瘤、中枢神经系统非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、中枢神经系统胚胎肿瘤、中枢神经系统生殖细胞肿瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤-参见非霍奇金淋巴瘤、类癌瘤、胃肠道、原发灶不明的癌症、心(心脏)肿瘤、中枢神经系统、非典型畸胎样瘤/横纹肌样瘤、胚胎瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤、原发性、宫颈癌、胆管癌、脊索瘤、慢性骨髓增生性肿瘤、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤-参见蕈样肉芽肿和塞扎里综合征、原位导管癌(DCIS)、胚胎瘤、中枢神经系统、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、嗅神经母细胞瘤、尤文肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、眼癌、眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、恶性骨纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、胆囊癌、胃部(胃)癌、胃肠道类癌瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、中枢神经系统、颅外、性腺外、卵巢、睾丸、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤-参见脑肿瘤脑干、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增生症、朗格汉斯细胞、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾、肾细胞、肾母细胞瘤和其它儿童肾肿瘤、朗格汉斯细胞组织细胞增生症、喉癌、急性淋巴细胞性(ALL)、急性髓性(AML)、慢性淋巴细胞性(CLL)、慢性粒细胞性(CML)、毛细胞、唇和口腔癌、肝癌(原发性)、肺癌、非小细胞、小细胞、淋巴瘤、艾滋病相关、伯基特-参见非霍奇金淋巴瘤、皮肤T细胞-参见蕈样肉芽肿和塞扎里综合征、霍奇金、非霍奇金、原发性中枢神经系统(CNS)、巨球蛋白血症、瓦尔登斯特伦病-参见非霍奇金淋巴瘤、男性乳腺癌、骨恶性纤维组织细胞瘤和骨肉瘤、黑色素瘤、眼内(眼)、默克细胞癌、间皮瘤、恶性、隐匿性原发灶的转移性鳞状颈癌、涉及NUT基因的中线束癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常综合征、骨髓增生异常/骨髓增生性肿瘤、骨髓瘤、多发性、骨髓增生性肿瘤、慢性、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口癌、口腔癌、唇和口咽癌、骨肉瘤和骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、上皮细胞、生殖细胞肿瘤、低恶性潜在肿瘤、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞瘤)、乳头状瘤病、副神经节瘤、鼻旁窦和鼻腔癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体瘤、浆细胞肿瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺母细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、原发性腹膜癌、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管、移行细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、尤因、卡波西、骨肉瘤(骨癌)、横纹肌肉瘤、软组织、子宫、血管肿瘤、塞扎里综合症、皮肤癌、黑色素瘤、默克细胞癌、非黑色素瘤、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌-参见皮肤癌(非黑色素瘤)、隐匿性原发灶的鳞状颈癌、转移性、胃(胃部)癌、T-皮肤淋巴瘤、皮肤-参见蕈样肉芽肿和塞扎里综合征、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、原发癌、输尿管和肾盂、移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜、子宫肉瘤、阴道癌、血管肿瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症-参见非霍奇金淋巴瘤、以及肾母细胞瘤。
在一个实施例中，癌前状况是光化性角化病、巴瑞特氏食管、萎缩性胃炎、原位导管癌、先天性角化不良、缺铁性咽下困难、扁平苔癣、口腔粘膜下纤维化、日光性弹力组织变性、宫颈发育不良、粘膜白斑病、粘膜红斑病或其组合。在一个实施例中，癌前状况是发育不良或良性瘤形成。在一个实施例中，癌前状况是前列腺上皮内瘤(PIN)、增生性炎性萎缩(PIA)、非典型小腺泡增生(ASAP)、鳞状上皮内病变(SIL)、非典型子宫内膜增生、卵巢上皮发育不良、乳腺钙化、MGUS(意义未明的单克隆丙种球蛋白病)、外阴上皮内瘤变(VIN)、原位小叶癌(LCIS)阴道上皮内瘤变、或VAIN外阴硬化性苔藓和扁平苔藓、宫颈上皮内瘤变(CIN)、巴瑞特氏食道或其组合。
在一个实施例中，将本发明的方法中描述的癌症治疗给予缓解期的受试者。在一个实施例中，受试者处于来自造血系统癌症的缓解期。在一个实施例中，将其给予已经历诱导治疗的受试者。在一个实施例中，诱导化学疗法包括阿糖胞苷和柔红霉素的组合。在一个实施例中，将其给予已完成巩固治疗的受试者。在一个实施例中，巩固化学疗法包括阿糖胞苷和柔红霉素的组合。在另一个实施例中，巩固阶段包括2-4个疗程的高剂量阿糖胞苷，有时添加蒽环类(在一个实施例中，柔红霉素，或在另一个实施例中，伊达比星)。在另一个实施例中，巩固阶段包括高剂量阿糖胞苷而不添加蒽环类。在另一个实施例中，巩固阶段包括同种异体或自体移植。在另一个实施例中，受试者在巩固阶段结束后接受同种异体或自体移植。
在一个实施例中，癌症治疗是免疫学治疗或免疫疗法。在一个实施例中，该治疗增强了受试者中针对癌症的免疫应答。在另一个实施例中，该治疗在受试者中诱导针对癌症的免疫应答。在一个实施例中，该治疗包括向受试者施用细胞因子。在一个实施例中，细胞因子是免疫刺激剂。
细胞因子
在一个实施例中，细胞因子是白细胞介素。在一个实施例中，白细胞介素是IL-2。在另一个实施例中，白细胞介素是IL-12。在另一个实施例中，白细胞介素是IL-15。在一个实施例中，白细胞介素以低剂量施用。
在一个实施例中，IL-2以16,400U/kg的剂量每天施用两次。
在另一个实施例中，细胞因子是干扰素。在一个实施例中，干扰素是干扰素-α。在一个实施例中，干扰素是干扰素-β。在一个实施例中，干扰素是干扰素-γ。
在另一个实施例中，细胞因子是造血生长因子。在一个实施例中，造血生长因子选自：促红细胞生成素、IL-11、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其组合。
在一个实施例中，本发明的方法包括施用抗CTLA-4，并且本发明的组合物包含抗CTLA-4。在一个实施例中，CTLA4或CTLA-4(细胞毒性T-淋巴细胞相关蛋白4)，也称为CD152(分化簇152)，是一种蛋白质受体，其充当免疫检查点，下调免疫系统。在一个实施例中，向受试者施用抗CTLA-4以改善癌症治疗的功效。
在一个实施例中，给予缓解期的受试者或患有癌症的受试者的巩固疗法包括向受试者施用组胺受体激动剂。在一个实施例中，组胺是免疫刺激剂。在一个实施例中，组胺是二盐酸组胺。
在一个实施例中，施用0.5mg二盐酸组胺。
在一个实施例中，如本文所述的治疗剂，包括IL-2、组胺和PD-1或PD-L1抑制剂每天施用一次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每天施用两次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每天施用三次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每天施用四次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每周施用一次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每周施用两次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每周施用三次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每周施用四次。在另一个实施例中，治疗剂对受试者每两周施用一次。
在一个实施例中，癌症治疗包括施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)。在一个实施例中，如下文实例4中所述，当用IL-2和组胺的第一轮或第三轮治疗诱导细胞毒性T细胞的重新分布，其中存在T效应记忆细胞的频率降低并且T效应细胞的伴随增加时，如下文实例3中所述，每天两次以0.5mg施用的二盐酸组胺和每天两次以16,400U施用的IL-2，在预防AML缓解期的患者的复发方面高度有效。
在一个实施例中，本文方法中描述的癌症治疗是如图4中所述的巩固后治疗或维持治疗。
在一个实施例中，本发明的一些方法对在一轮巩固后治疗之前和之后从受试者中抽取的第一样品和第二样品进行实践。在一个实施例中，在巩固后治疗完成之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第一轮巩固后治疗之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第三轮巩固后治疗之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第一轮和第三轮巩固后治疗之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第一轮直到第四轮巩固后治疗之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第二轮巩固后治疗之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第四轮巩固后治疗之前和之后获取样品。在另一个实施例中，在第一轮巩固后治疗之前和第三轮巩固后治疗之后获取样品。在另一个实施例中，在第一轮巩固后治疗之前和第二轮巩固后治疗之后获取样品。在另一个实施例中，在第一轮巩固后治疗之前和第四轮巩固后治疗之后获取样品。
在一个实施例中，如实例3中所述，每个治疗周期持续3周。在另一个实施例中，每个治疗周期持续1-5周。在另一个实施例中，每个治疗周期持续1周。在另一个实施例中，每个治疗周期持续2周。在另一个实施例中，每个治疗周期持续4周。
在一个实施例中，如下文实例3中所述，巩固后治疗包括10个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括1-5个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括5-10个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括10-15个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括5个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括15个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括7个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括12个周期。在另一个实施例中，巩固治疗包括3个周期。
在一个实施例中，来自受试者的样品是组织样品。在另一个实施例中，来自受试者的样品是血样。在一个实施例中，血样是外周血样品。在另一个实施例中，来自受试者的样品是脑脊髓液(CSF)样品。在另一个实施例中，来自受试者的样品是尿样品。在另一个实施例中，来自受试者的样品是粪便样品。
试剂盒
在另一个实施例中，本发明提供了用于预测受试者中的癌症治疗功效的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了用于预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了预防在化学疗法后处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了用于预测受试者中的癌症治疗功效的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、如本文所述的用于测量生物标记物的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了用于预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、如本文所述的用于测量生物标记物的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、如本文所述的用于测量生物标记物的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在另一个实施例中，本发明提供了用于预防在化学疗法后处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的试剂盒，其包含治疗量的二盐酸组胺、免疫刺激剂、如本文所述的用于测量生物标记物的手段和所述试剂盒的使用说明书。
在一个实施例中，本发明的癌症治疗预防癌症复发。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗预防癌症的重现。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗延迟癌症的复发。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗延迟癌症的重现。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗延长癌症的缓解。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗增加患有癌症的受试者的存活。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗延长患有癌症的受试者的存活时间。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗治疗受试者中的癌症。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗减少受试者中的癌症症状。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗减轻受试者中的癌症症状。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗延长无癌症缓解。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗降低受试者中的恶性肿瘤大小。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗降低患有原发性或转移性癌症的患者中的肿瘤负荷。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗降低患有活动性癌症的患者中的转移性肿瘤扩散的风险。在另一个实施例中，本发明的癌症治疗预防或延迟患者中的癌症再现、重现或转移性扩散，所述患者已经历手术、化学疗法或降低癌症负担的任何其它治疗。
在一个实施例中，缓解包括来自造血系统癌症的缓解。在一个实施例中，来自造血系统癌症的缓解是在一个实施例中，在诱导化学疗法后，受试者在显微镜下不含癌细胞(在骨髓、血液或其它器官中)连同正常造血的再现。
在一个实施例中，癌症缓解是癌症体征和症状的减少或消失。在一个实施例中，缓解是部分缓解，在一个实施例中，所述部分缓解是癌症的一些但并非全部体征和症状已消失时。在另一个实施例中，缓解是完全缓解，在一个实施例中，所述完全缓解是癌症的所有体征和症状已消失时，尽管癌症仍可能在体内。
在一个实施例中，受试者在诱导治疗后进入缓解期，在一个实施例中，所述诱导治疗包括手术、化学疗法或降低肿瘤负荷的其它手段。
在一个实施例中，“治疗”指治疗性处理和预防性或预防措施，其中目的是预防或减轻如上所述的靶向病理状况或病症。因此，在一个实施例中，本发明的方法包括在受试者处于化学疗法或手术或其它治疗后的癌症缓解期时施用于受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用于已复发为癌症的受试者。在另一个实施例中，本发明的方法包括施用于患有活动性癌症的受试者。
因此，在一个实施例中，治疗可包括直接影响或治愈，压制，抑制，预防，降低发生率，降低严重性，延迟发作，降低与疾病、病症或状况相关的症状，或其组合。因此，在一个实施例中，“治疗”尤其指延迟进展、加速缓解、诱导缓解、增加缓解、加速恢复、增加替代治疗的功效或减少对替代治疗的抗性或其组合。在另一个实施例中，治疗指降低受试者中的癌症的发病机制、改善受试者中的癌症症状、改善受试者中的癌症的继发症状或延长受试者中的癌症复发的潜伏期。在一个实施例中，“预防”尤其指延迟症状的发作、预防疾病复发、减少复发事件的次数或频率、增加症状发作之间的潜伏期或其组合。在一个实施例中，“压制”或“抑制”尤其指降低症状的严重性、降低急性发作的严重性、降低症状的次数、降低疾病相关症状的发生率、降低症状的潜伏期、改善症状、降低继发症状、降低继发感染、延长患者存活或其组合。
在一个实施例中，本发明的方法减轻受试者中的症状。在一个实施例中，症状是原发性的，而在另一个实施例中，症状是继发性的。在一个实施例中，“原发性”指其为癌症的直接结果的症状，而在一个实施例中，“继发性”指源自原发性原因或随之而来的症状。在一个实施例中，本发明的方法治疗与癌症相关的原发性或继发性症状或继发性并发症。
在另一个实施例中，“症状”可为癌症的任何表现，包括颤搐、抽筋、肌肉僵硬；影响手臂或腿部的肌无力；含糊不清或鼻言；咀嚼或吞咽困难；全身无力、萎缩或其组合。
根据本发明的任何方法且在一个实施例中，受试者是人。在另一个实施例中，受试者是非人灵长类动物。在另一个实施例中，受试者是鼠，其在一个实施例中是小鼠，并且在另一个实施例中是大鼠。在另一个实施例中，受试者是犬科动物、猫科动物、牛科动物、马科动物、laprine或猪科动物。在另一个实施例中，受试者是哺乳动物。在另一个实施例中，受试者是对癌症或肿瘤易感的任何生物。
治疗组合物和施用方法
在一个实施例中，本发明的方法包括施用药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的治疗剂，包括PD-1或PD-L1的抑制剂、二盐酸组胺和IL-2，以及药学可接受的载体。
在一个实施例中，“药物组合物”指治疗有效量的活性成分，即PD-1或PD-L1的抑制剂、二盐酸组胺或IL-2，连同药学可接受的载体或稀释剂。在一个实施例中，“治疗有效量”指对于给定状况和施用方案提供疗效的量。
在一个实施例中，含有治疗剂的药物组合物可通过本领域技术人员已知的任何方法施用于受试者，例如肠胃外、透粘膜、透皮、肌内、静脉内、皮内、腹膜内、心室内、颅内、阴道内或肿瘤内。在一个实施例中，皮下施用治疗剂。
在如本发明方法和组合物中所述的另一个实施例中，药物组合物经口施用，并且因此以适合于经口施用的形式配制，即作为固体或液体制剂。合适的固体经口制剂包括片剂、胶囊、丸剂、颗粒剂、丹剂等等。合适的液体经口制剂包括溶液、悬浮液、分散体、乳液、油等等。在本发明的另一个实施例中，将活性成分配制在胶囊中。根据该实施例，除活性化合物和惰性载体或稀释剂之外，本发明的组合物还包含硬凝胶胶囊。
在另一个实施例中，药物组合物通过液体制剂的静脉内、动脉内或肌内注射进行施用。合适的液体制剂包括溶液、悬浮液、分散体、乳液、油等等。在另一个实施例中，药物组合物静脉内施用，并且因此以适合于静脉内施用的形式配制。在另一个实施例中，药物组合物动脉内施用，并且因此以适合于动脉内施用的形式配制。在另一个实施例中，药物组合物肌内施用，并且因此以适合于肌内施用的形式配制。
在另一个实施例中，药物组合物局部施用于体表，并且因此以适合于局部施用的形式配制。合适的局部制剂包括凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等等。对于局部施用，制备治疗剂并且作为生理学可接受的稀释剂中的溶液、悬浮液或乳液，连同或不连同药物载体施加。
在另一个实施例中，本文提供的药物组合物是控释组合物，即其中治疗剂经过施用后的一段时间释放的组合物。控释或持续释放组合物包括在亲脂性贮库(例如脂肪酸、蜡、油)中的制剂。在另一个实施例中，该组合物是立即释放组合物，即其中所有治疗剂在施用后立即释放的组合物。
上述添加剂、赋形剂、制剂和施用方法中的每一种代表本发明的分开实施例。
本文引用的所有专利、专利申请和科学出版物都在此以引用的方式整体并入。
呈现以下实例以便更全面地说明本发明的优选实施例。然而，它们决不应被解释为限制本发明的广泛范围。
实例
实例1
抗PD-1/抗PDL1和组胺的组合-方法
将EL-4胸腺瘤细胞系(由Dr.Ingo Schmitz,Otto-von-Guericke-University,Magdeburg，德国提供)在DMEM培养基(Sigma，Stockholm，瑞士)中培养，所述DMEM培养基补充有10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺，如Martner,A.等人The Journal of Immunology，第194卷，第10期，第5014-5021页中所述。C57BL/6J小鼠(6-8周龄，购自Charles River Laboratories，Sulzfeld，德国)用1.75-2x105EL-4肿瘤细胞进行皮下接种，并且在细胞接种前一天开始通过每周三次的腹膜内注射，用盐水(对照)或在盐水中稀释的1.5mg二盐酸组胺(购自Sigma-Aldrich，Stockholm，德国)进行处理。在肿瘤接种后三、六和十天通过腹膜内注射施用两百四十μg针对程序性细胞死亡-1受体的抗体(抗小鼠PD1，克隆RMP1-14，称为α-PD1)和240μg针对程序性死亡配体1的抗体(抗小鼠PD-L1，克隆10F.9G2，称为α-PDL1)(两者均购自BioXcell,West Lebanon,NH,USA，分别为目录号BE0146和BE0101)。每2-3天手动测量肿瘤。肿瘤大小计算为长度×宽度。在肿瘤接种后两周处死小鼠，此时对照肿瘤达到大约1.5cm2的大小。
实例2
抗PD-1/抗PDL1和组胺的组合-结果
与先前研究(Martner,A.等人The Journal of Immunology，第194卷，第10期，第5014-5021页)一致，用组胺处理携带EL-4的小鼠显著降低肿瘤生长率(图1-3)。α-PD1-+α-PDL1抑制性抗体的施用导致肿瘤生长的可比较降低。组胺和抗PD1/抗PDL1的组合增加EL-4肿瘤生长的降低超过单独的每次治疗(组胺或α-PD1/α-PDL1)。在图1-3中，肿瘤大小指示为对照的％，其中100％是在实验结束时(即肿瘤接种后2周)对照肿瘤的平均大小。
实例3
在免疫治疗期间细胞毒性T细胞亚群的动态预测急性髓样白血病中的结果
材料与方法
患者、研究设计和目标
该单臂多中心IV期研究(复发:缓解，NCT01347996，在www.clinicaltrials.gov登记)招募了处于第一次CR中的患有AML的84个患者(18-79岁)。如图4中示意性所示，在18个月期间或者直至复发或死亡时，患者接受与低剂量IL-2组合的二盐酸组胺(HDC；Ceplene)的十个连续21天周期。
治疗持续总共18个月或直至患者复发，死亡，因不良事件而中断治疗，撤回同意书或变得失访。周期1至3包括3周的治疗和3周的停止治疗，并且在周期4至10中，停止治疗期延长至6周。在每个周期中，治疗臂中的患者每天两次皮下接受以0.5mg的HDC(MaximPharmaceuticals，San Diego，CA)和人重组IL-2(阿地白细胞介素；16 400U/kg每天两次皮下；Chiron Corporation，Emeryville，CA)。治疗18个月后(HDC/IL-2臂)，所有患者都在免疫疗法结束后追踪至少六个月。
剂量、施用途径、排除标准等与对于先前III期试验[Blood.2006；108(1):88-96，以引用的方式并入本文]所述的那些相同。复发:缓解研究中的主要终点包括通过监测在治疗周期之前和治疗周期之后的T细胞和NK细胞表型，来评价HDC/IL-2的定量和定性药效学效应。该方案陈述为支持这些目标而收集的所有数据将根据入选时的患者年龄(<60和>60岁)对于整个群体和亚组进行分析。本文报道的T细胞生物学相对于临床结果(LFS和OS)的方面是事后执行的。患者特征呈现于表1中。
表1.患者特征
缩写：LFS，无白血病存活，ND，未完成
关于先前诱导和巩固治疗的更详细说明可在其它地方找到。
外周血的采样和流式细胞术
在第一治疗周期和第三治疗周期之前和之后，即周期1，第1天(C1D1)和周期1，第21天(C1D21)，周期3，第1天(C3D1)和周期3，第21天(C3D21)，收集外周血。分离PBMC并且在当地场所冷冻保存，并且在干冰上运送至中心实验室(在Sahlgrenska Cancer Center,University of Gothenburg，瑞典)，用于通过使用流式细胞术的分析。对于这些分析，将冷冻的PBMC样品在补充有10％FCS的Iscoves培养基中快速解冻。随后，将细胞在Iscoves培养基中洗涤，其后在PBS中洗涤。首先通过在4℃下在PBS中温育30分钟，用LIVE/DEAD可固定黄色染剂(Life technologies,Grand Island,NY,USA)染色细胞，随后为在含有0.5％BSA和0.1％EDTA的PBS中、或在光亮染色缓冲液(BD Biosciences，Stockholm，瑞典)中，在4℃下染色表面标记物30分钟。下述抗人单克隆抗体用于表型分型：CD3-FITC(HIT3a)、CD4-APC-H7(RPA-T4)、CD4-Horizon V450(RPA-T4)、CD8-APC(RPA-T8)、CD8-PerCP-Cy5.5(RPA-T8/SK1)、CD8-Qdot705(3B5)、CD16-Horizon V450(3G8)、CD25-亮紫421(M-A251)、CD45RA-APC(HI100)、CD45RO-PE(UCHL1)、CD56-PerCP-eFluor710(CMSSB)、CD56-PE-Cy7(NCAM16.2)、CD69-PE-Cy7(FN50)、HLA-DR-FITC(L243)(全部来自BD Biosciences)、来自Biolegend,SanDiego,CA,USA的CCR7-PE-Cy7(G043H7)、CD3-太平洋蓝(S4.1)、CD14-Qdot655(TüK4)和链霉抗生物素蛋白-Qdot605(全部来自Life technologies)。根据制造商的说明书，在使用FoxP3固定/透化试剂盒(eBioscience,San Diego,CA,USA)的表面染色以及固定和透化后，执行IFN-γ-PE-Cy7(B27；BD Biosciences)的细胞内染色。
在4激光BD LSRFortessa SORP流式细胞仪(405、488、532和640nm；BDBiosciences)上分析染色样品。使用FlowJo软件7.6.5或更高版本(TreeStar,Ashland,OR,USA)或FACSDiva软件6或更高版本(BD Biosciences)分析数据。排除了活力低于25％的样品。
可从84个患者中的81个获得血样。全血的差异计数在当地场所执行，并且用于计算血液CD8+T细胞的绝对计数。分析所有可用样品的T细胞含量和表达活化标记物(包括响应PMA的CD25和CD69和IFN-γ产生)。如果分析根据预定标准(实验失败、细胞很少、细胞活力差)失败，则将第二样品解冻用于重新分析。如果第二次尝试也未能生成数据，则将这些样品从分析中排除。在第二组实验中，分析可用样品的T细胞亚群分布和HLA-DR表达。根据上述预定标准，所有成功分析的样品都包括在本报告中。图5显示了在分析中包括或从分析中排除的患者的流程图。
PMA/离子霉素或肽刺激后的IFN-γ生产
在HDC/IL-2免疫疗法的第一治疗周期和第三治疗周期之前和之后收集的解冻样品种植在96孔板中补充有10％FCS的Iscoves培养基中，每孔1x106个细胞。细胞在37℃下静置过夜。第二天，在由以下组成的刺激之前用温热的培养基洗涤细胞：与0.2μg/ml PMA(Sigma-Aldrich Munich，德国)连同2μg/ml离子霉素(Sigma-Aldrich)一起温育5小时，或者与AML-肽库(覆盖白血病相关蛋白WT1、PRAME、存活素和hTERT的重叠肽；MiltenyiBiotec)或作为对照的CEF-肽(对于MHC I类特异性的32种肽与源自人巨细胞病毒(HCMV)、EB病毒(EBV)和流感病毒的序列；Miltenyi Biotec)一起温育6小时。
每种肽的最终浓度为0.6nmol。将各2μg/ml的共刺激分子抗CD28(CD28.2；BDBiosciences)和抗CD49d(9F10；BD Biosciences)加入具有肽刺激的孔以及阴性对照样品中，所述阴性对照样品作用于确定背景信号。对于所有刺激，根据制造商的方案，在刺激的最后4小时期间添加Golgiplug(BD Biosciences)。如上所述，在固定、透化和用IFN-γ细胞内染色之前，样品用LIVE/DEAD可固定黄色染剂和表面标记物进行染色。如果产生IFN-γ的CD8+T细胞的频率在任何时间点(C1D1、C1D21、C3D1、C3D21)都超过0.05％(在扣除如由阴性对照样品确定的背景后)，则患者视为具有AML或CEF特异性CD8+T细胞。为了避免选择偏倚，在这些分析中仅考虑在最后一个时间点(C3D21；105天)之前没有发生事件(复发)的患者。
统计学
根据统计分析计划，配对t检验用于CD8+T细胞表型的单一比较。为了确定CD8+子集或标记物的动态对结果的影响，如果没有另外说明，则通过单个时间点的中值或通过在第一治疗周期期间的诱导/降低，将样品进行二分。T细胞功能相对于结果的分析基于在试验截止日期(2014年10月13日)时，即所有患者已跟踪至少24个月(18个月的治疗和6个月的另外随访)时可用的LFS和OS数据，所述LFS定义为从使用HDC/IL-2的免疫治疗开始到复发或由于任何原因的死亡的天数，所述OS定义为相应的死亡时间。复发定义为骨髓中的至少5％胚细胞或髓外白血病的存在。使用时序检验分析T细胞表型对LFS和OS的影响。
使用Cox单变量回归模型评价年龄、根据由European LeukemiaNet[Blood.2010；115(3):453-474]建议的风险组分类、实现CR所需的诱导过程数目(1或>1)、以及巩固过程数目(0-2或>2)对LFS和OS的影响。p值低于0.1(年龄和诱导周期数目)的预后因素被包括作为Cox多变量回归分析中的潜在混杂因素(表2)。
表2.CD8+T细胞表型对LFS和OS的影响方面的单变量和多变量Cox回归分析。
缩写：LFS，无白血病存活，OS，总体存活
*关于年龄和诱导周期数目进行调整
**转换：TEM的降低伴随TEFF的同时诱导。
***用于Cox回归分析的少数事件
所有指示的P值都是2侧的。该研究根据赫尔辛基宣言原则进行。该试验由每个参与机构的伦理委员会批准，并且所有患者在入选前都给出了书面知情同意书。
实例4
在免疫治疗期间细胞毒性T细胞亚群的动态预测急性髓样白血病中的后果-结果
如图4所示，处于第一次CR中的AML患者在巩固后阶段接受HDC/IL-2的10个连续3周周期。在第一免疫治疗周期和第三免疫治疗周期之前和之后收集的外周血就CD8+T细胞含量和表型进行分析。在治疗周期期间，HDC/IL-2不改变血液中CD8+T细胞的绝对计数(图6A)。另外，在治疗前或治疗后的CD8+T细胞计数(高于或低于中值)不影响复发风险(数据未显示)。
当比较第一治疗周期之前和之后的CD8+TN、TCM、TEM和Teff分布时，非复发患者显示TEM细胞级分的明显降低连同Teff细胞的诱导(图6)。在治疗开始时，具有高百分比(高于中值)的TEM细胞的患者显示LFS的可能性略高，而对于具有高或低百分比(按中值)的TN、TCM或Teff细胞的患者，未发现复发风险的显著差异(图7)。在周期1期间经历TEM细胞的频率降低或Teff细胞诱导的患者显示显著改善的LFS和/或OS(图8C-D，其中多变量分析的结果显示于表2中)。另外，在第一治疗周期期间幼稚T细胞的频率诱导显著预测了LFS和OS(图8A，表2)。在免疫治疗期间，TCM细胞的分布似乎未改变(图8D)，并且不影响复发风险(图8B)。T细胞亚群的分布在治疗周期3期间没有显著改变(数据未显示)。
已提出用抗原刺激CD8+T细胞，以驱动从TN→TCM→TEM→Teff细胞的分化[Currentopinion in immunology.2013；25(5):556-563；Vaccine.2015；33(7):914-923]。我们因此推测在HDC/IL-2的第一治疗周期期间，从TEM细胞诱导Teff细胞。实际上，在周期1期间观察到Teff的诱导和TEM的降低之间的关联性(图9)。44个可分析患者中的十八个(41％)显示对效应T细胞转换的记忆，定义为CD8+TEM细胞的降低，伴随CD8+Teff细胞中的同时增加。这些患者显示改善的LFS(HR 0.19，P<0.001)和OS(HR 0.13，P＝0.002；图8E，表2)。
老年患者中的T细胞表型
试验方案规定了根据入选时的患者年龄(<60和>60岁)通过亚组的结果分析。在免疫治疗开始时的CD8+T细胞计数或CD8+TN/TCM/TEM/Teff细胞的分布在年龄组之间并无显著不同(图10A-D)。在第一周期期间，用HDC/IL-2处理仅在老年患者中诱导Teff细胞频率的显著增加(图10D)。TN和Teff细胞的分布改变、TEM细胞的频率降低以及TEM细胞明显转换为Teff细胞对结果的影响在老年患者中是显著的。免疫疗法诱导的CD8+T细胞分化的所有这些方面因此预示该年龄组中的LFS和/或OS(图8F-J)，并且在就预后因子校正后保持显著预测性(表2)。在周期1期间CD8+T细胞亚群的动态不能显著预测年轻患者中的LFS或OS(图10E-N)。
T细胞活化的另外标记物
除T细胞表型的分布之外，我们还分析了免疫疗法对细胞毒性T细胞活化标记物的影响。频繁采用的活化T细胞标记物CD69和CD25的表达水平不受HDC/IL-2处理的影响(图11A-B)，并且这些标记物的表达水平不影响临床结果(数据未显示)。相比之下，HLA-DR的表达在第一治疗周期期间降低(图11C)。HLA-DR主要由记忆群体表达，并且降低对于TCM和TEM细胞是显著的，但TN或Teff细胞则不是(数据未显示)。在第一HDC/IL-2治疗周期结束时，CD8+T细胞上HLA-DR的低表达弱预测有利的临床结果(OS的单变量Cox回归分析为P＝0.04，而OS的多变量Cox回归分析为P＝0.12；图12A)。
白血病特异性T细胞的存在预示着维持的CR
我们接下来确定了CD8+T细胞在免疫疗法之前和免疫疗法之后离体产生IFN-γ的能力。在第一治疗周期之前和第一治疗周期之后，患者的CD8+T细胞在用PMA/离子霉素刺激后产生IFN-γ的能力是相似的(图11D)，并且不影响临床结果(未显示)。为了确定患者是否携带与白血病抗原特异性反应的CD8+T细胞，通过代表已知的白血病相关抗原(WT1、存活素、PRAME和hTERT)的肽库刺激PBMC，随后定量产生IFN-γ的CD8+T细胞。来自PBMC的健康供体CD8+T细胞不响应白血病来源的肽而产生高于背景水平的IFN-γ(数据未显示)。20个分析的患者中的三个在免疫治疗开始时(C1D1)展示针对任何这些抗原的抗原特异性CD8+T细胞。这些患者中的两个经历了晚期复发(在>600天时)。七个患者在免疫治疗期间(在C1D21时，n＝2，在C3D1时，n＝4或在C3D21时，n＝1)获得白血病反应性T细胞，所有患者都保持处于不间断的CR中。通过Kaplan-Meier分析，白血病特异性CD8+T细胞的存在预测了LFS(P＝0.01)，而响应病毒对照肽(CMV、EBV和流感；CEF)的抗原特异性CD8+T细胞的存在则不是(P＝0.5；图12B-C)。
该研究的结果首次指示，在免疫治疗期间血液中的细胞毒性T细胞表型的分布改变与处于CR中的未移植的AML患者的预后相关。重大发现是T细胞免疫的这些方面决定了老年患者的复发风险和存活，所述老年患者处于复发和死亡的高风险中。评估对效应T细胞转换的记忆可广泛用于基于T细胞的癌症免疫疗法中。CD8+T细胞亚群的动态与年轻患者中的结果之间缺乏显著关联性的原因尚不清楚，但可能与该年龄组中的较低复发率连同可用于分析的较少样品有关。
解释在HDC/IL-2免疫疗法的第一周期期间AML患者的血液中从TEM细胞到Teff细胞的转变的发现的精确机制仍有待确定。然而，IL-2已报道促进CD8+T细胞发育成记忆和效应细胞群体，并且因此可想象HDC/IL-2方案的IL-2组分对于观察到的记忆至效应T细胞转换是关键的。另外，记忆至效应T细胞转换与TEM细胞在抗原暴露后分化成Teff细胞的观点一致。虽然替代解释是可能的，包括在免疫治疗期间T细胞亚群的外渗，但我们假设使用HDC/IL-2的免疫治疗促进效应T细胞的发育，这可解释在经历TEM至Teff转换的患者中的临床结果的强烈预测。值得注意的是，其他人已显示AML特异性T细胞携带Teff细胞表型。为进一步支持在免疫治疗期间的功能性T细胞免疫的发展，在治疗过程期间在7/20个患者中注意到与白血病肽反应的可检测水平的CD8+T细胞。白血病特异性CD8+T细胞而不是与常见病毒抗原反应的CD8+T细胞的存在显著预测LFS。这些结果与关于AML中的免疫反应性白血病相关抗原的作用的先前观察一致，并且支持细胞毒性T细胞用于监视白血病克隆的作用。
HLA-DR视为T细胞活化标记物，但CD8+T细胞上的HLA-DR表达增加也已与癌症、慢性病毒感染和衰老中的T细胞压制和耗尽联系。在免疫治疗期间TCM和TEM细胞中的HLA-DR表达降低、以及具有表达降低的患者中朝向有利临床结果的趋势，提示CD8+T细胞的记忆群体可在免疫治疗期间转向改善的效应功能。
HDC/IL-2已开发用于AML免疫疗法，以扩增且活化T细胞和天然杀伤(NK)细胞(IL-2组分)群体，并且同时保护这些抗白血病效应细胞免于通过髓样细胞来源的活性氧物种的失活(HDC组分)。来自复发:缓解试验的早期结果显示，用HDC/IL-2处理触发了天然细胞毒性受体(NCR)的表达，连同血液中的NK细胞计数增加，所述NCR是对于异常细胞的NK细胞识别重要的活化受体。复发:缓解试验结果提示，NCR表达和NK细胞计数的周期内增量仅微弱地预测LFS和OS，而本文提供的结果暗示在第一治疗周期期间CD8+T细胞亚群的分布改变对于预后是关键的。我们观察到，在第一治疗周期期间具有TEM至Teff细胞转换，连同在免疫治疗后在细胞毒性CD16+NK细胞上的高NKp46表达的患者被显著保护免于复发，而具有单独的TEM至Teff细胞转换或高NKp46表达的患者仅部分受保护(图13)。这些数据支持T和NK细胞效应子功能在免疫治疗期间同时进化的假设，并且两个细胞亚群均可促成复发保护。
实例5
天然细胞毒性受体的NK细胞表达可确定经历用于缓解维持的免疫疗法的老年AML 患者中的复发风险
在诊断时，患有急性髓样白血病(AML)的大约70％的患者>60岁。虽然高比例的老年患者在化学疗法后达到完全缓解(CR)，但白血病复发在化学疗法后阶段是常见的，并且明显解释了为何老年患者的5年存活率在10-15％的范围内。用二盐酸组胺和低剂量白细胞介素-2(HDC/IL-2)的免疫治疗旨在增强天然杀伤(NK)细胞的抗白血病功能，以减少或根除残留的白血病。在III期试验中，用HDC/IL-2治疗显示预防处于CR中的AML患者的复发。
NK细胞功能的几个方面据报道与AML预后相关，但尚未进行老年患者中的NK细胞生物学方面的系统分析。人NK细胞包含两个主要表型：细胞毒性CD16+/56+NK细胞(本文称为CD16+NK细胞)构成健康受试者中90-95％的血液NK细胞，而弱细胞毒性CD16-/56亮细胞(CD56亮NK细胞)被视为CD16+NK细胞的前体。NK细胞的细胞毒性通过活化和抑制性NK细胞受体及其在恶性靶细胞上的同源配体来调节。主要的活化受体包括天然细胞毒性受体(NCR；NKp46、NKp30和NKp44)和NKG2D。我们先前已公开了AML患者中的NK细胞生物学方面的中期报告，所述AML患者参与使用HDC/IL-2用于缓解维持的IV期试验。此处，我们报告了来自该试验的最终结果，其中重点在于老年AML患者(>60岁)的亚组。
如其它地方所述，处于第一次CR中的AML患者接受了经过18个月的HDC/IL-2的十个三周周期。在第一周期之前和第一周期之后抽取血样，用于分析NCR的绝对NK细胞计数和NK细胞表达。先前的中期报告显示，在治疗周期期间，用HDC/IL-2治疗增加了血液中的NK细胞计数，连同NKp30和NKp46的NK细胞表达增加。我们首先分别比较了年轻(<60岁)和年老(>60岁)患者中的NK细胞和NCR诱导程度。在治疗开始时的NK细胞计数和NCR表达在这些年龄组之间没有差异，除了CD56亮与CD16+细胞的比率在老年患者中较低(P＝0.045，曼-怀二氏检验)之外，这与健康受试者中的先前发现一致。关于在治疗周期期间在血液中的CD16+和CD56亮NK细胞累积(图14A、14D)、或NKp30和NKp46受体的NK细胞表达诱导(图14B-14C、14E-14F)，年轻和老年患者并无不同。
我们的目的是通过高或低(按中值)NK细胞计数或NK细胞NCR表达强度，随后为无白血病存活(LFS)和总体存活(OS)的分析，将年轻和老年患者进行二分，来确定NK细胞相关标记物对结果的影响。NK细胞计数并未显著预测年轻或老年患者中的结果，并且NK细胞NCR表达不能预测年轻患者中的结果(LFS的P>0.5，未显示)。在治疗开始时(周期1天1；C1D1)，在CD16+NK细胞上具有高于中值的NKp30表达的老年患者显示改善的LFS和OS，具有与NKp46相似的趋势(图15A和15C)。在第一治疗周期(周期1第21天；C1D21)之后，CD16+NK细胞上NKp46的高表达与LFS和OS呈正相关，具有与NKp30相似的趋势(图15B和15D)。在第一治疗周期期间，在结果与NK细胞计数的诱导水平或NCR的诱导之间没有观察到显著相关(即，C1D21减去C1D1水平，未显示)。在对于年龄、风险组分类、实现CR所需的诱导过程数目和巩固过程数目校正的多变量分析中，C1D1时的NKp30表达和C1D21时的NKp46表达独立地预测了老年患者中的LFS和/或OS(表3)。处于CR中的一个患者死于脓毒症，而所有其它死亡之前都是复发，这同样说明了老年AML患者组中复发对于巩固后阶段的存活的影响。
NCR表达与年轻患者中的结果之间缺乏相关性的原因尚不清楚，但可能与研究中年轻患者的数目较少，连同该年龄组中的复发和死亡发生率较低(数据未显示)有关。NK细胞功能依赖NCR与靶细胞上的其配体之间的相互作用，其中跟着发生NK细胞的细胞毒性的活化。虽然NCR配体经常由恶性AML细胞表达，但新近诊断的AML患者的NK细胞可表达较低的NCR密度，这影响NK细胞的抗白血病效率以及存活和在化学疗法后达到CR的可能性。我们的结果通过指出NCR在预防AML的化学疗法后阶段中的复发中的作用扩展了这些先前发现。需要进一步的研究来证实这些结果，并且确定NK细胞NCR表达是否同样预示着未治疗的患者或经历其它免疫疗法的患者中的复发。
表3：NKp30或NKp46表达对LFS和OS的影响的单变量和多变量分析。
单变量和多变量Cox回归分析用于确定高于或低于NKp30周期1第1天(C1D1)或NKp46周期1第21天(C1D21)的中值表达水平对>60岁的患者中的LFS和OS的影响。在多变量分析中，危害比对于年龄、风险组分类、实现CR所需的诱导过程数目以及巩固过程数目进行校正。
材料与方法
患者
该单臂多中心IV期研究(复发:缓解，NCT01347996，在www clinicaltrials.gov登记)招募了处于第一次CR中的患有AML的84个患者(18-79岁)，所述患者接受HDC/IL-2的十个21天周期共18个月或者直至复发或死亡时。主要终点包括通过监测在第一治疗周期之前和第一治疗周期之后的NK细胞表型及其功能性，来评价HDC/IL-2的定量和定性药效学效应。该方案陈述为支持这些目标而收集的数据将根据入选时的患者年龄(<60和>60岁)对于整个限定群体和亚组进行分析。NK细胞计数和NCR表达相对于结果的分析是事后执行的。表4说明了在老年患者(>60岁，中值67.2，范围60-79)入选时的特征。患者特征、诱导和巩固治疗、排除标准、治疗和给药的细节在先前的中期报告(实例4)中找到。
外周血的采样和流式细胞术
在治疗周期1之前和之后，即在周期1的第1天和第21天(C1D1和C1D21)时，收集外周血，并且分离PBMC并且在当地场所冷冻保存，并且在干冰上运送至中心实验室(在Sahlgrenska Cancer Center,University of Gothenburg，瑞典)，用于流式细胞术分析。PBMC样品用荧光染料缀合的抗体和活力标记物进行染色，并且使用4激光BD LSRFortessaSORP(BD Biosciences,San Diego,CA)进行分析，如在其他地方(实例4)详细说明的。
样品可从37个年轻患者中的32个和47个老年患者中的45个获得。分析了所有可用的样品。如果分析根据预定标准(实验失败、细胞很少、细胞活力差)失败，则将第二样品解冻用于重新分析。在对于C1D1样品的18例和对于C1D21样品的12例中，第二次尝试也未能生成数据，并且将这些样品从分析中排除。全血的差异计数在当地场所执行，并且用于计算血液NK细胞的绝对计数。四个年轻患者和五个老年患者缺乏差异计数。
表4：患者特征(年龄>60)
统计学
根据统计计划，配对/检验用于NK细胞表型的单一比较。NK细胞标记物相对于结果的分析基于在试验截止日期(2014年10月13日)时，即所有患者已跟踪至少24个月(18个月的治疗和6个月的另外随访)时可用的LFS(定义为从使用HDC/IL-2的免疫治疗开始到复发或由于任何原因的死亡的天数)和OS数据。复发定义为骨髓中至少5％的胚细胞或髓外白血病的出现。LFS定义为从用HDC/IL-2治疗的第一天到复发或由于任何原因的死亡的时间。OS定义为相应的死亡时间，不管原因如何。使用时序检验分析LFS和OS。通过单变量和多变量Cox回归分析进一步分析显著预测LFS和/或OS的参数。在多变量分析中，危害比对于年龄、风险组分类、实现CR所需的诱导过程数目(1或>1)、以及巩固过程数目(0-2或>2；表1)进行校正。所有指示的P值都是2侧的。患者根据通过European LeukemiaNet的建议重新分类。该试验由每个参与机构的伦理委员会批准，并且所有患者在入选前都给出了书面知情同意书。
实例6
在急性髓样白血病的复发预防性免疫治疗期间髓性细胞群体的动态
在患有急性髓样白血病(AML)的患者中，未成熟的髓样细胞在血液和骨髓中快速积累。尽管大多数AML患者在化学疗法后实现了白血病细胞的消失(完全缓解，CR)，但大多数成年患者经历了长期存活前景不佳的白血病复发。使用与T细胞和NK细胞活化细胞因子IL-2结合的二盐酸组胺(HDC)的免疫疗法(HDC/IL-2)目前在欧盟和以色列内用于在巩固后阶段的复发预防。该方案的批准基于III期试验结果，显示接受HDC/IL-2的患者中的复发风险显著降低，并且元分析比较通过单独的IL-2或HDC/IL-2实现的复发预防支持HDC组分的临床有效性。
NOX2是髓样细胞的活性氧物种(ROS)生成NADPH氧化酶。HDC靶向成熟髓样细胞上的组胺H2受体(H2R)，以压制NOX2依赖性ROS形成。NOX2来源的ROS的抑制已发现保护邻近的抗白血病效应细胞免受ROS诱导的失活，其已提出作为与AML中HDC的复发预防性质相关的机制。另外，先前的研究指示HDC作为髓性细胞的促分化剂。Yang等人因此报道，由于组胺形成酶的遗传破坏具有组胺缺乏的小鼠显示受损的髓样细胞分化连同对化学诱导的癌症的易感性增加。HDC还显示增强单核细胞来源的树突细胞(DC)上的CD86和HLA-DR表达，并且以NOX2依赖性方式增强髓样细胞上的CD11b表达。
这些先前发现促使我们评价87在使用HDC/IL-2的免疫治疗期间的血液中的髓样细胞群体的动态。我们报道髓样细胞亚群及其成熟标记物的表达在基于HDC的免疫治疗期间得到调节，并且血液中的髓样细胞的动态可能与AML的临床结果相关。
患者、材料与方法
患者、研究设计和目标。处于第一次CR中的八十四个成年AML患者(年龄18-79)入选了复发:缓解试验(NCT01347996，在www.clinicaltrials.gov登记)。在先前的出版物中说明了详细的患者特征。复发:缓解试验是单臂多中心IV期研究，其中所有患者都接受HDC和低剂量IL-2的十个连续21天周期，共18个月或者直至复发或死亡时。该方案与先前的III期试验中采用的方案相同。患者在巩固完成后46天的中值时入选，并且在免疫治疗开始后随访至少24个月。三个患者撤回同意书，并且未包括在任何分析中。另外十四个患者过早地中断研究，并且在最后一个捕获的随访日期时进行审查。复发定义为骨髓中至少5％的胚细胞或髓外白血病的存在。主要试验终点包括HDC/IL-2对在治疗周期期间的外周血中的T细胞和NK细胞群体的定量和定性作用。对髓样群体及其对临床结果(无白血病存活，LFS和总体存活，OS)的影响的作用目前分析是事后执行的。该研究根据赫尔辛基宣言中概述的原则进行，并且由每个参与机构的伦理委员会批准。所有患者在入选前都给出了书面知情同意书。
PBMC的分离、染色和流式细胞术。在第一和第三HDC/IL-2治疗周期之前和之后，收集外周血。分离PBMC并且在当地场所冷冻保存，并且在干冰上运送至TIMM Laboratory,University of Gothenburg，用于通过两个髓样实验对象组的分析，一个用于确定通过118个髓样细胞的活化标记物表达，并且另一个用于确定单核细胞上的H2R表达水平。在解冻后，将针对活化实验对象组的冷冻保存样品在人FC块(BD Biosciences，Stockholm，瑞典)中预温育。针对H2R实验对象组的样品用LIVE/DEAD可固定黄色染剂(Life Technologies,Grand Island,NY,USA)染色。其后，将样品在4℃下与Brilliant染色缓冲液(BDBiosciences)中的表面标记物抗体的混合物(活化实验对象组)、或含有0.5％BSA和0.1％EDTA的PBS(H2R实验对象组)中温育30分钟。利用下述抗人单克隆抗体：CD3-PerCPCy5.5(HIT3A)、CD19-PerCPCy5.5(SJ25C1)、CD16-亮紫605(3G8)、HLA-DR-APCH7(G46-6)、CD14-PECy7CD141-APC(1A4)、HLA-ABC-FITC(G46-2,6)、CD40-PE(5C3)、CD86-亮紫711(FUN1)、CD11b-太平洋蓝(ICRF44)、CD33-PECy7(P67.6)(全部来自BD Biosciences)、CD56-PerCP eflour 710(CMSSB)(eBioscience,San Diego,CA,USA)、CD1c-亮紫421(L161)(Biolegend,San Diego,CA,USA)、抗组胺H2受体(多克隆兔IgG)(MBL International,Woburn,MA,USA)、山羊抗兔-APC和CD14-Qdot655或CD14-太平洋蓝(两者克隆TüK4)(LifeTechnologies)。
在4激光BD LSRFortessa SORP流式细胞仪(405、488、532和640nm；BDBiosciences)上分析样品。通过使用FlowJo软件7.6.5或更高版本(TreeStar,Ashland,OR)执行数据分析。可从84个患者中的81个获得血样。使用上述髓样实验对象组对PBMC执行髓样细胞的表型分析。使用H2R实验对象组分析了四十九个患者，并且使用活化标记物实验对象组分析了59个样品。基于冷冻PBMC活力的可用性来选择这些患者。差异计数通过参与中心对全血执行，并且可用于同意书继续研究的81个患者。差异计数使用143天来确定血液中的髓样群体(嗜酸性粒细胞、嗜中性粒细胞和单核细胞)的绝对计数。
统计分析。如统计研究计划中指出的，使用Prism 6通过斯氏配对t检验执行在免疫治疗之前和免疫治疗之后，血细胞计数和髓样细胞上的成熟标记物表达的比较。使用斯氏配对t检验的所有报道的显著性通过威尔科克森匹配对检验也保持显著。使用时序检验确定这些免疫参数对试验截止日期(2014年10月13日)时的LFS和OS的影响。使用SPSSstatistics 24软件，通过Cox单变量和多变量回归分析进一步分析使用时序检验显著预测LFS或OS的参数。在多变量分析中，基于高于或低于中值表达，将连续参数例如荧光强度转换为额定值。单变量Cox分析用于确定年龄、风险组(根据由European LeukemiaNet(14)的建议分类)、实现CR所需的诱导过程数目(1或>1)、以及巩固过程数目(0-2或>2)对LFS和OS的影响。LFS的P值低于0.1的预后因素(年龄和诱导周期数目)被包括作为多变量Cox分析中的潜在混杂因素。
结果
使用HDC/IL-2的免疫疗法增加血液中的嗜酸性粒细胞计数处于第一次CR中的患有AML的八十四个成年患者参与复发:缓解试验。在巩固后阶段，患者接受了用HDC/IL-2的免疫疗法的10个连续3周周期。在治疗周期1和3之前和之后收集外周血，并且通过差异计数分析白细胞群体的含量。另外，通过流式细胞术分析从血液中分离的PBMC的单核细胞和DC群体的含量及其活化标记物的表达。
在治疗周期期间，存在周期间标准化的总白血细胞数目显著增加(图16A)。白血细胞的诱导主要由嗜酸性粒细胞促成，所述嗜酸性粒细胞的数目通常在治疗周期期间增加十倍(图16B)。尽管嗜酸性粒细胞计数在治疗周期之间收缩，但在周期3开始时的嗜酸性粒细胞计数几乎保持高达周期1开始之前的两倍(图16B)。在治疗周期之前、在治疗周期之后的嗜酸性粒细胞计数，以及在治疗周期期间的嗜酸性粒细胞诱导对根据LFS或OS的临床结果都没有显著影响(数据未显示)。
用HDC/IL-2的治疗降低血液中的单核细胞计数。与HDC/IL-2治疗期间的嗜酸性粒细胞计数的增量相反，单核细胞和嗜中性粒细胞的数目在第一治疗周期期间降低(图16C-D)。在周期3期间不存在单核细胞或嗜中性粒细胞计数的进一步降低。与免疫疗法开始时的水平相比，单核细胞计数在周期3中保持降低(图16D)。
在免疫疗法193之前或之后血液中的嗜中性粒细胞计数不影响临床结果(数据未显示)。然而，当在第一治疗周期期间通过单核细胞计数的高或低/无降低的中值，将患者进行二分时，强单核细胞降低显著预测LFS(图16E)，对于OS具有相似的趋势(图16F)。单核细胞降低对LFS的影响在单变量而不是多变量回归分析中保持显著(表5)。
表5.单核细胞计数的降低、H2R的单核细胞表达和HLA-ABC的单核细胞表达对LFS 和OS的影响的单变量和多变量Cox回归分析。
1多变量分析对于年龄和诱导周期数进行校正。
2分析中包括低于CD8+TEM C1D1的中值频率的患者。
3在分析中包括在周期1期间未展示CD8+TEM至Teff细胞转换的患者
H2R的单核细胞表达预测经历基于HDC的免疫疗法的患者中的复发风险和存活。在用HDC/IL-2的治疗期间，血液中的两个主要单核细胞群体，CD14++CD16-(CD14++)和CD14+CD16+(CD16+)细胞减少至相似程度(数据未显示)。较早的研究显示HDC连接组胺2型受体(H2R)，以在体外抑制NOX2来源的ROS形成，加上促进髓样细胞的分化。在免疫治疗期间评价CD14++和CD16+单核细胞上的H2R表达，并且与临床结果相关联。如图17A-B所示，H2R的表达在治疗周期期间和治疗周期之间的CD16+单核细胞上、以及在第一HDC/IL-2治疗周期期间的CD14++单核细胞上显著增强。在第一治疗周期后，在CD14++或CD16+单核细胞上的高H2R表达强烈预测LFS和OS(图17C-F)。在免疫疗法开始时观察到朝向高单核细胞H2R表达的有益影响的相似趋势(数据未显示)。在多变量分析中，单核细胞H2R表达对LFS和OS的影响保持显著(表5)。
用HDC/IL-2的治疗增加了单核细胞和DC上的活化标记物表达。为了进一步阐明HDC/IL-2治疗对髓样起源细胞的作用，在治疗周期1和3之前和之后测定活化标记物HLA-DR、CD40和CD86的表达。结果显示在治疗周期期间在CD14++和CD16+单核细胞两者上的这些活化标记物的表达增加(图18A-B)。对于CD14++单核细胞，在周期3期间和在两个治疗周期期间的CD40表达中观察到HLA-DR表达的显著增加(图18A)。对于CD16+单核细胞，所有分析的活化标记物在至少一个HDC/IL-2治疗周期期间显著增加(图18B)。
血液中的两个主要DC群体分别携带CD1c+和CD141+DC表型。与单核细胞类似，DC的数目在HDC/IL-2免疫治疗期间降低(数据未显示)。关于DC相关活化标记物的表达，在CD1c+和CD141+DC群体之间存在差异。CD40的表达仅用HDC/IL-2治疗期间在CD1c+DC上增加，而HLA-DR和CD86的表达仅在CD141+DC上诱导(图18C-D)。相比之下，HLA-DR和CD86的表达在HDC/IL-2治疗期间在CD1c+DC上略微减少(图18C)。在临床结果与单核细胞或DC上的HLA-DR、CD40或CD86表达之间未观察到显著关联性(数据未显示)。
髓样细胞上的低HLA-ABC表达预示着具有血液中的细胞毒性T细胞分布改变的患者的有利临床结果。用HDC/IL-2的治疗一致地允许在治疗周期期间分析的所有单核细胞和DC群体上的HLA-ABC表达增强(图19A-D)。在免疫治疗开始时CD14++单核细胞上的HLA-ABC高表达预示着预后不良(图19E-F)，其在多变量分析中保持显著(表1)。在第一HDC/IL-2治疗周期后，观察到在CD14++单核细胞上具有高HLA-ABC表达的患者朝向短LFS的类似趋势(P＝0.15，n＝62，时序检验)。CD16+单核细胞、CD1c+DC和CD141+DC上的HLA-ABC表达与CD14++单核细胞的HLA-ABC表达高度相关联(数据未显示)。在这些髓样群体上的HLA-ABC高治疗前表达也预示了不良的临床结果(数据未显示)。
我们推测残留的骨髓恶性细胞上的HLA-ABC表达可能与单核细胞和DC上的HLA-ABC表达相似。恶性细胞上的高HLA-ABC表达因此促进与细胞毒性T细胞的相互作用，以识别且破坏恶性细胞，但也通过与杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)的相互作用阻碍NK细胞的细胞毒性的活化。在来自复发:缓解试验的先前报告中，我们观察到在免疫治疗开始时具有血液中的CD8+效应记忆细胞(TEM；CD45RO+CCR7-)的高频率的患者、或者在第一HDC/IL-2治疗周期期间经历CD8+TEM细胞值CD8+T效应细胞(TEff；CD45RA+CCR7-)转换的患者，显示改善的LFS和OS。这些因素可指示与复发风险降低相关的功能性T细胞免疫。在治疗开始时具有高于CD8+TEM细胞的中值频率的患者中，CD14++单核细胞C1D1上的HLA-ABC表达不影响复发风险(图20A)。相比之下，低单核细胞HLA-ABC表达的有利影响在开始免疫治疗时携带少量CD8+TEM细胞的患者中是明显的(图20B-C，表1)。类似地，在其中观察到TEM至TEff转换的患者未显示在单核细胞上的低HLA-ABC表达的明显益处(图20D)，而转换阴性患者显著受益于在C1D21上具有低单核细胞HLA-ABC表达(图20E-F，表5)。
讨论
假定AML的化学疗法后阶段的白血病复发来源于残留的恶性细胞的扩增，并且巩固后免疫疗法的目标是根除这些剩余的细胞。尽管细胞毒性T细胞和NK细胞视为用于监视白血病细胞的主要效应群体，但髓样免疫细胞的正常功能对于这些淋巴细胞的活性是关键的。在HDC/IL-2组合免疫疗法中，所提出的IL-2组分的功能是活化细胞毒性淋巴细胞，而HDC组分通过抑制免疫抑制性ROS的产生和促进髓样细胞的成熟来靶向髓样诱导的免疫抑制。
在用HDC/IL-2的治疗周期期间观察到的显著嗜酸性粒细胞增多与先前的AML试验一致，其中用IL-2的单一疗法显示为触发嗜酸性粒细胞增多，可能是由于IL-2诱导的IL-5和GM-CSF产生。因此，在用HDC/IL-2的治疗期间观察到的嗜酸性粒细胞的诱导可能归因于IL-2组分。值得注意的是，我们研究中使用的IL-2剂量低于大多数的先前研究，并且不能正式排除通过HDC组分对嗜酸性粒细胞增多水平的贡献。我们观察到嗜酸性粒细胞计数与复发风险或存活方面的临床结果之间无关联性。
除嗜酸性粒细胞增多之外，IL-2的施用已报道在AML患者中引起嗜中性粒细胞减少症。在我们的研究中，使用与HDC组合的低剂量的IL-2，在第一治疗周期中观察到血液嗜中性粒细胞的轻度和瞬时降低。在HDC/IL-2的第一周期期间观察到类似且更明显的单核细胞计数降低。单核细胞计数，而不是嗜中性粒细胞计数，在治疗周期3开始时保持在较低水平下。表型分析揭示在HDC/IL-2治疗期间，CD14++和CD16+单核细胞两者的血细胞计数均降低。虽然来自先前AML试验的关于HDC或IL-2对单核细胞计数的作用的信息很少，但来自患有转移性肾细胞癌(RCC)患者中的临床试验结果指示IL-2增加而不是降低血液中的单核细胞计数。有利的是，在通过Donskov等人的RCC试验中，在IL-2方案中加入HDC预防单核细胞增多。在进一步支持HDC作为未成熟髓样细胞的抑制剂中，小鼠中的组胺合成的遗传缺陷与未成熟髓样细胞的显著累积有关。我们因此假设HDC组分促成我们的HDC/IL-2AML试验中观察到的单核细胞计数降低。有趣的是，类似于嗜中性粒细胞和单核细胞，CD1c+和CD141+DC的数目在我们试验中的免疫治疗期间也得到降低。这是出乎意料的，因为HDC的施用先前显示为增强荷瘤小鼠中的DC数目。然而，在上述RCC试验之一中，发现IL-2治疗降低血液DC计数。因此，我们推测，与单核细胞的降低相反，DC数目的降低可归因于IL-2。然而，应当注意CR中的AML患者最近已经历强化学疗法，并且观察到的白细胞计数中的波动可至少部分反映在骨髓功能的恢复期间发生的事件。
在几种形式的癌症中，不适当活化的单核细胞和嗜中性粒细胞与免疫抑制联系，并且它们在血液和其它组织中的存在经常预示着对于存活的不良预后。在RCC中，在IL-2治疗之前和之后的低单核细胞和/或嗜中性粒细胞计数或在IL-2治疗期间单核细胞计数的降低已显示为预测有利的临床结果。在本研究中，在第一HDC/IL-2治疗周期期间单核细胞计数的强降低与LFS相关，因此支持血液中单核细胞的存在可阻碍免疫疗法的有效性的观点。
所提出的HDC对髓样细胞的作用包括抑制NOX2依赖性ROS形成和促进髓样细胞成熟。这些作用经由髓样细胞上表达的H2R的连接来严格介导。在复发:缓解试验中，观察到在HDC/IL-2治疗期间，特别是在第一治疗周期期间，H2R的表达在CD14++以及CD16+单核细胞上强烈增强。在C1D21时的高单核细胞H2R表达预示着改善的LFS和OS，这在考虑潜在混杂因素的多变量分析中保持显著。我们还观察到在免疫疗法开始时具有高密度H2R的患者朝向有利存活的趋势。H2R的高表达密度可能增强髓样细胞对HDC治疗的响应性，并且可视为用HDC/IL-2免疫治疗的效率的生物标记物。需要进一步研究以确定髓样细胞H2R表达对于AML临床过程的重要性，包括未接受免疫疗法的患者中H2R表达的潜在影响。
除H2R之外，在治疗周期期间，单核细胞和DC群体上几种其它成熟标记物的表达显著增加，指示免疫疗法不仅在体外而且在体内触发人细胞的髓样成熟。然而，出乎意料的是，HLA-DR、CD40或CD86的高髓样细胞表达对LFS没有影响，而HLA-ABC的高表达与复发风险增强相关。在第一免疫治疗周期之前和之后，HLA-DR、CD86和CD40的单核细胞表达与单核细胞HLA-ABC表达强相关(数据未显示)。在用HDC/IL-2治疗之前和之后，对于HLA-DR和HLA-ABC的DC表达发现类似的关联性(数据未显示)。我们因此推测HLA-DR、CD40或CD86表达的正面影响缺乏可能与这些成熟标记物与负面预后标记物HLA-ABC的关联性有关。
几个证据暗示NK细胞和T细胞功能对于AML的有利临床结果是重要的。在HDC/IL-2免疫治疗期间，先前报道了NK细胞相关参数，包括NK细胞计数和天然细胞毒性受体(NCR)的NK细胞表达，显著预测了巩固后阶段的复发和死亡。另外，与功能性细胞毒性(CD8+)T细胞相关的参数，包括在治疗开始时的大量CD8+TEM细胞、从TEM到Teff细胞的CD8+T细胞转换、以及与AML来源的抗原反应的CD8+T细胞的存在，预测有利的临床结果。我们的先前结果还提示NK细胞和CD8+T细胞可构成AML的复发预防中的独立效应臂。
在本研究中，髓样细胞上的HLA-ABC高表达与不良预后相关，并且因此可为可想到的生物标记物。单核细胞上的HLA-ABC表达与所有其它分析的髓样细胞群体之间的强关联性提示，单核细胞HLA-ABC表达也可反映残留的白血病胚细胞上的HLA表达。在白血病胚细胞上表达的HLA-ABC可经由通过NK细胞表达的KIR连接来抑制NK细胞的细胞毒性。有利的是，低HLA-ABC表达对LFS的有利影响看起来局限于展示CD8+T细胞的不利分布的患者，即低频率的CD8+TEM细胞和TEM至TEff转换的缺乏。具有不利T细胞分布的患者可依赖NK细胞介导的白血病细胞监测，其因此提供了对该患者组中的低HLA-ABC表达的有利临床影响的可能解释。必须强调这些结论的初步性质，并且需要关于髓样细胞HLA-ABC表达与AML中NK细胞和T细胞的抗白血病功能之间的可能相互作用的进一步研究。
我们得出结论，髓样细胞群体的表型和动态可与AML中的复发风险相关，并且靶向髓样细胞功能方面的策略可改善旨在预防复发的免疫疗法的效率。
实例7
在慢性髓单核细胞性白血病中的NOX2依赖性免疫抑制
慢性髓单核细胞性白血病(CMML)是骨髓增生性和骨髓发育不良性肿瘤，具有很少的治疗选项和不良预后。天然杀伤(NK)细胞和其它抗白血病淋巴细胞在CMML中的作用在很大程度上是未知的。我们旨在深入了解CMML中的免疫逃逸机制，其中重点在于通过髓样细胞NADPH氧化酶(NOX2)形成的免疫抑制活性氧物种(ROS)。发现原代人CMML细胞的显性群体表达膜结合的NOX2并且释放ROS，其依次又在共培养的NK细胞、CD8+T效应记忆和CD8+T效应细胞中触发广泛的PARP1依赖性细胞死亡。ROS形成的抑制剂和细胞外ROS的清除剂阻止CMML细胞诱导的淋巴细胞死亡，并且促进朝向抗体包被的原代CMML细胞的NK细胞脱颗粒。在CMML患者中，血液中的未成熟细胞计数(CD34)升高与几种NK细胞活化受体的表达降低相关。我们提议CMML细胞可利用细胞外ROS作为免疫逃逸的靶向机制。
患有CMML的患者呈现血液中的单核细胞计数升高(>1x109/L)，连同血液和骨髓中的胚细胞存在。CMML通常缓慢进展，伴有骨髓增生和骨髓发育不良的体征。诊断后的中值存活<2年，具有少数长期存活者，这通过转换成急性髓样白血病(AML)的高风险而部分得到解释。绝大多数CMML患者年龄>60岁且不适合于同种异体骨髓移植，这仍然是唯一潜在治愈的治疗。
活性氧物种(ROS)由几种类型的髓样细胞产生，作为针对微生物的防御策略。然而，由单核细胞和粒细胞的NADPH氧化酶/NOX2(NOX2)形成的ROS也已归因于免疫调节中的作用。因此，髓样细胞经由NOX2产生ROS的完整能力据报道对于阻碍自身反应性T细胞的活性是重要的。在癌症中，NOX2来源的ROS的细胞外释放与抗肿瘤淋巴细胞的显著功能障碍相关，所述抗肿瘤淋巴细胞特别是天然杀伤(NK)细胞和T细胞亚群。NOX2介导的ROS形成的抑制剂，二盐酸组胺(HDC)与NK细胞和T细胞活化细胞因子白细胞介素-2(IL-2)组合用于AML的化学疗法后阶段的复发预防。III期试验结果的事后分析暗示HDC/IL-2的临床疗效在患有单核细胞分化的AML的患者中是显著的，其中患者携带共表达功能性NOX2和组胺2型受体(H2R)的白血病细胞。
对于该研究，我们(1)确定了原代人CMML细胞上的NOX2和H2R表达，(2)评价了CMML细胞的潜在免疫抑制性质，并且(3)确定了来自CMML患者的循环NK细胞和CD8+T细胞亚群的表型。我们的结果提示，NOX2来源的ROS可构成CMM中的白血病相关免疫抑制的可靶向机制。
患者和健康献血者。在获得书面知情同意书后，获得了在瑞典的Region VastraGotaland和Region Skane医院可见的患有CMML的患者的血样。根据2008年WHO分类，患者符合CMML的标准。在十二个患者中，10个(83％)患有CMML-1(定义为血管中的<5％胚细胞，包括前单核细胞，或骨髓中的<10％)，而2个(17％)患有CMML-2。十个患者为男性，并且2个为女性(年龄52-88岁，中值为70)。CMML患者中的循环单核细胞的绝对计数可从9个患者获得，并且范围为4.5x109/L至29.6x109/L，而中值为10.0x109/L。来自健康献血者的Leukopacks(血沉棕黄层)得自在瑞典的Sahlgrenska University Hospital和Kungalv Hospital的血液中心。对于患者NK细胞的免疫表型分型，使用来自年龄匹配个体(年龄50-82岁，中值为65.5)的对照样品。
细胞的分离。如所述的分离来自患者和健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。简言之，在葡聚糖沉降后，血样或血沉棕黄层白细胞经受密度梯度离心。使用MACS NK细胞分离试剂盒、CD8+分离试剂盒和MACS单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec，Stockholm，瑞典)，通过免疫磁性分离分别获得来自健康供体的NK细胞、CD8+细胞和单核细胞。通过FACS从患者PBMC中分离原代白血病胚细胞和单核细胞。胚细胞定义为CD14-CD34+，并且单核细胞定义为CD14+CD33+。
ROS产生。如所述的，通过异鲁米诺增强的化学发光测量原代CMML细胞的细胞外ROS产生。简言之，在异鲁米诺(10μg/ml)和辣根过氧化物酶(HRP；4U/ml)存在下，将2x105个细胞加入96孔板中，并且通过NOX2诱导剂N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(fMLF；0,1μM)进行刺激。使用FLUOstar Omega平板阅读器(BMG Labtech)记录光发射。
淋巴细胞死亡。将分离的淋巴细胞亚群与来自CMML患者的原代白血病单核细胞一起，连同或不连同NOX2抑制剂或其它抗氧化化合物，在37℃下在5％CO2中共培养过夜。在用LIVE/可固定死细胞染剂(Life Technologies)染色后，通过流式细胞术评价淋巴细胞死亡。在受体表达测定中，在PARP-1抑制剂PJ34(0.5μM)的存在或不存在下，纯化的NK细胞与单核细胞一起共培养过夜。下述抗体用于受体表达评价：来自Miltenyi Biotec的NKp46-PE(克隆：9E2)和DNAM-1-PE-Cy7(克隆：DX11)，来自BD Pharmingen的NKp80-APC(克隆：4A4.D10)和CD16-BV605(克隆：3G8)。
将CD8+T细胞亚群染色，并且在3激光FACSARIA II流式细胞仪(BDBiosciences)上分选。下述抗体用于区分T细胞群体：来自Life technologies的CD3-太平洋蓝(克隆：S4.1)、CD8-APC-H7(克隆：SK1)、CD45RA-APC(克隆：HI100)、CD45RO-PE(克隆：UCHL1)和CCR7-PE-Cy7(克隆：G043H7)，全部来自BD Pharmingen。CD8+T细胞亚群进一步如下定义：幼稚T细胞(TN)为CD45RA CCR7+，T中枢记忆细胞(TCM)为CD45ROCCR7+，T效应记忆细胞(TEM)为CD45ROCCR7-，并且T效应细胞(TEff)为CD45RACCR7-。
NK细胞脱颗粒和ADCC的测定。NK细胞脱颗粒和针对患者来源的恶性单核细胞的细胞毒性在使用人源化抗CD33抗体的林妥珠单抗(Abbvie，Stockholm，瑞典)的实验中进行评价。在抗CD107a-PE-Cy7抗体(BDPharmingen)和抗氧化化合物的存在下，来自健康供体的NK细胞与用CellTrace甲紫染剂(Life Technologies)标记的单核细胞一起在37℃和5％CO2下共培养四小时。其后，用LIVE/可固定死细胞染剂(Life Technologies)染色细胞，并且通过流式细胞术评价单核细胞的裂解和NK细胞脱颗粒。对于培养实验、细胞毒性测定和共焦显微镜，使用补充有10％人AB+血清的Iscoves改良达尔贝科最低必需培养基(IDMEM)。
共焦显微镜检查。来自CMML患者的原代白血病单核细胞用来自NovusBiologicals的抗黄素细胞色素b558(gp91phox)(克隆7D5，FITC)进行染色，并且随后在林妥珠单抗(1μg/ml)的存在下，在共焦载玻片上以1：2的比率与健康NK细胞一起温育45分钟。然后将细胞在PBS中充分洗涤，并且用ProLong Gold抗褪色试剂与DAPI(Invitrogen)固定。使用Zeiss LSM700共焦显微镜获得显微照片，并且使用来自Zeiss的ZEN Blue软件进行分析。
化合物。使用下述化合物：二盐酸组胺(HDC；100μM；Sigma-Aldrich)、H2R受体拮抗剂雷尼替丁(Glaxo，Molndal，瑞典)、AH202399AA(雷尼替丁的化学对照，Glaxo)、过氧化氢酶(200U/ml；Sigma-Aldrich)、白细胞介素-2(IL-2；500U/ml；Chiron)、NOX2抑制剂二亚苯基氯化碘盐(DPI；3μM；Sigma-Aldrich)和PARP-1抑制剂PJ34(0.5μM；Sigma-Aldrich)。
通过流式细胞术的免疫表型分型。在10个CMML患者和10个健康的年龄匹配的对照中，通过流式细胞术测量在细胞培养之前和细胞培养之后的活化受体的NK细胞表达。在这些实验中，将细胞以200μl中的1x106个细胞/孔的浓度与存在的IL-2(500u/ml)一起在96孔板中培养3天。细胞然后在第1天和第3天时进行染色，并且使用4激光BD LSRFortessa SORP流式细胞仪进行分析。NK细胞定义为CD3-/CD56+细胞。该分析包括与NK细胞活化或成熟相关的下述受体：NKp30-PE(克隆：AF29-4D12)、NKp80-APC(克隆：4A4.D10)和DNAM-1-PE-Cy7(克隆：DX11)，全部来自Miltenyi Biotec。NKp46-PE(克隆：9E2)、NKG2D-PE-Cy7(克隆：1D11)、LFA-1b-APC(克隆：6.7)、CD57-FITC(克隆：HNK-1)来自BD Pharmingen。2B4-FITC来自R&D systems，并且NKG2C-太平洋蓝(克隆：MM0488-9R17)来自Novus Biologicals。
使用由抗CD33(克隆P67.6，PE-Cy7)、抗CD34(克隆8G12，PE)、抗CD56(克隆NCAM16，PE-Cy7，APC)、抗CD14(克隆MφP9，APC-Cy7)、抗CD15(克隆HI98，APC)(全部来自BDPharmingen)组成的实验对象组，分析来自CMML患者的单核细胞和胚细胞。抗黄素细胞色素b558(gp91phox)(克隆7D5，FITC)。抗组胺H2受体(多克隆兔IgG)来自MBL International(Woburn,MA)，并且山羊抗兔二抗(PE-Cy5.5)来自Invitrogen。
统计分析和伦理考虑。单因素ANOVA随后为邦弗朗尼事后检验用于多重比较，并且配对t检验用于单一比较。P值<0.05视为显著的。在附图中，星号如下使用：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。所有指示的P值都是双侧的。该研究由Gothenburg的伦理审查委员会批准，并且所有实验都按照赫尔辛基宣言执行。
结果
单核细胞性CMML细胞表达功能性NOX2和组胺H2受体。免疫抑制性ROS由慢性髓样白血病中的恶性粒细胞和AML中的恶性单核细胞产生，但原代CMML细胞的潜在ROS形成能力仍是未知的。在最初的实验中，我们分析了来自人CMML细胞的ROS产生连同其NOX2表达，如通过细胞膜结合的NOX2特异性亚基gp91phox的中值荧光强度(MFI)所反映的。来自CMML患者的外周血中的单核细胞CD14+群体表达与来自健康供体的CD14+单核细胞相似水平的gp91phox(图21A和B)。对于所有CMML患者，对于gp91phox阳性的CD14+单核细胞的部分超过99％(数据未显示)。
经由H2受体(H2R)的信号传导已显示转导组胺诱导的ROS形成抑制。原代单核细胞CMML细胞始终表达高水平的H2R，提示NOX2活性可由HDC靶向(图21A和B)。虽然大多数CMML细胞是CD33CD14+，但在大多数患者的血液中检测到较小的CD34+细胞群体。与更成熟的单核细胞CMML细胞相反，CD34胚细胞表达低水平的gp91phox和中等水平的H2R(图21A和B)。为了确定gp91phox的表达是否反映功能性NOX2，通过FACS分选患者CD14+细胞，随后分析用fMLF刺激后的ROS产生，所述fMLF是细菌来源的甲酰化三肽，其触发人髓样细胞中的ROS形成。发现分选的单核细胞CMML细胞产生高水平的ROS，并且HDC的添加显著压制ROS产生(图21C和D)。HDC的ROS抑制作用依次又被雷尼替丁(特异性H2R拮抗剂)拮抗，但不被雷尼替丁的化学对照AH202399AA(其中硫醚基团已替换为醚)拮抗，从而将其在H2R处的亲和力降低>50倍(图21C)。这些结果暗示HDC通过靶向H2R压制CMML细胞中NOX2介导的ROS产生。
NOX2的抑制促进朝向抗体包被的原代CMML细胞的NK细胞脱颗粒和ADCC。健康和恶性髓样细胞先前显示为通过产生ROS来损害NK细胞的抗肿瘤功能[16]。我们在共培养实验中获得了相互作用的原代CD14+CMML细胞和NK细胞的共焦显微照片。当分析CD14+CMML细胞和NK细胞之间的相互作用时，我们观察到细胞之间的明显突触和膜结合的NOX2朝向NK细胞的极化(图22A)。单核细胞CMML细胞在免疫突触附近表达NOX2连同其产生高水平ROS的能力的发现，促使我们研究ROS产生是否可构成CMML细胞通过其逃避免疫介导的杀死的机制。为此，我们测试了在作为连接抗体的林妥昔单抗(抗CD33)的存在或不存在下，IL-2刺激的NK细胞响应原代CD14+CMML细胞脱颗粒的能力，以增强NK细胞和CMML细胞之间的相互作用。单独的NK细胞展示针对原代CMML细胞的很少脱颗粒。林妥昔单抗的添加显著增加NK细胞应答(p<0.01，n＝9)，并且NOX2抑制剂HDC的添加进一步增强了针对原代白血病细胞的脱颗粒应答(p<0.01，n＝9；图22B)。
CD14+CMML细胞在淋巴细胞中诱导PARP 1依赖性细胞死亡。在过夜共培养实验中，原代CD14+CMML细胞在健康NK细胞(p<0.001，n＝6，图22C)和CD8+T细胞(p<0.001，n＝4，图23A)中触发显著的细胞死亡。CMML诱导的淋巴细胞凋亡通过NOX2抑制剂HDC和DPI以及过氧化氢酶得到阻止，所述过氧化氢酶通过降解H2O2清除细胞外ROS。淋巴细胞也通过PJ34(PARP-1的抑制剂)从CMML细胞诱导的细胞死亡中得到援救，因此提示由CMML细胞形成的ROS在NK细胞和CD8+T细胞中诱导PARP 1依赖性细胞死亡(也称为依赖性细胞死亡(parthanatos))(图22C和23A)。
CMML细胞优先压制成熟T细胞亚群。我们先前已显示CD8+T效应记忆细胞(TEM)的存在与接受用HDC/IL-2的免疫疗法用于巩固后阶段的复发预防的AML患者的有利预后相关。为了确定CMML细胞是否特异性抑制某些T细胞亚群，我们FACS分选CD8+T细胞亚群(TN、TCM、TEM和Teff)，并且将这些亚群与原代单核细胞CMML细胞一起培养过夜。血液中的CD8+T细胞亚群分布在CMML患者和年龄匹配的健康对照受试者中是相似的(数据未显示)。观察到CMML细胞占优势地在更成熟的CD8+T细胞亚群(即TEM和Teff细胞)中诱导细胞死亡，而TN细胞对CMML细胞诱导的细胞凋亡在很大程度上是抗性的(图23B)。T细胞亚群细胞凋亡中的差异占优势地通过ROS敏感性中的差异加以解释，因为NOX2抑制剂DPI从CMML细胞诱导的细胞凋亡中有效援救所有T细胞亚群。
来自CMML患者的NK细胞中受体表达的缺乏。NK细胞的功能通过NK细胞表面上表达的活化和抑制受体进行调节。较早的研究显示，髓样恶性肿瘤(包括AML和MDS)中的活化NK细胞受体的表达降低预示着对于存活的不利预后。此外，MDS的进展先前已与活化NK细胞受体的下调有关。
当关于外周CD14-CD34+胚细胞的百分比分析患者时，我们发现与年龄匹配的健康对照相比，具有较高比例的循环CD34+胚细胞(>2％的PBMC)的患者组显示活化NK细胞受体NKp30、NKp80和2B4的强度显著更低(图24A)。另外，血液中表达NKp30、NKp46、NKp80、DNAM1和2B4的循环NK细胞频率在CMML患者中低于健康对照中(图24B)。我们还在IL-2的存在或不存在下培养来自患者或健康供体的PBMC共72小时，并且测定NK细胞受体的表达。观察到IL-2刺激显著增强了患者来源的NK细胞中的NKp30、NKp46和DNAM1表达(数据未显示)。
较早的研究显示产生ROS的单核细胞在体外下调活化NK细胞受体的表达。然而，观察到的活化受体下调是反映与NK细胞凋亡的起始相关的次级事件还是通过NK细胞的受体表达的直接ROS诱导降低仍是未知的。我们因此在PARP-1抑制剂PJ34的存在下，使NK细胞暴露于来自健康供体的产生ROS的单核细胞，尽管暴露于ROS，所述单核细胞仍维持NK细胞的活力。如图25A所示，在PJ34的存在下暴露于单核细胞来源的ROS的NK细胞显著下调NKp46和CD16，具有与NKp80和DNAM-1相似的趋势。当NK细胞在不存在产生ROS的细胞的情况下暴露于PJ34时，未观察到NK细胞受体表达的下调(数据未显示)。
讨论
NK细胞和髓样细胞参与双向串扰以起始免疫应答，并且已提出NK细胞通过杀死髓样细胞亚群来成形、调节且终止免疫应答。NK细胞还针对几种恶性髓样细胞发挥细胞毒性。已提出NK细胞功能的缺乏影响髓样白血病中的疾病过程。例如，血液中的低NK细胞计数与患有慢性髓样白血病的患者中的酪氨酸激酶抑制剂中断后的白血病复发相关，并且弱NK细胞功能和活化NCR的表达缺乏预示着患有AML的患者中的预后不良。
虽然关于髓样恶性肿瘤中的NK细胞缺乏的潜在机制的细节仍有待确定，但已提出来自髓样细胞的NOX2依赖性细胞外ROS形成作为免疫抑制的促成途径。本研究中的主要发现是CMML患者携带表达功能性NOX2的单核细胞性白血病细胞，并且从白血病细胞释放的NOX2来源的ROS触发具有据称的抗白血病功能的淋巴细胞中的功能障碍和细胞死亡，所述淋巴细胞包括NK细胞和CD8+T细胞。我们还显示靶向由CMML细胞产生的NOX2来源的ROS的策略维持了NK细胞和CD8+淋巴细胞亚群的活力，并且维持了NK细胞的抗白血病功能。这些策略包括细胞外ROS的降解(过氧化氢酶)和NOX2的特异性抑制(DPI)，连同连接H2R以抑制NOX2功能的HDC。
相对较少的研究已解决了CMML的免疫生物学或抗白血病淋巴细胞对于疾病过程的作用。在41个MDS患者(6个患有CMML)的群组中，Carlsten及同事观察到与年龄匹配的健康对照相比，源自骨髓样品的NK细胞展示降低的细胞毒性。这些作者还证实患者来源的NK细胞中的活化受体(DNAM-1和NKG2D)的表面表达减少，这与骨髓胚细胞计数升高相关联。虽然这些先前研究不允许CMML中的NK细胞区室的分开分析，但结果与通过来自CMML患者的NK细胞的几种活化受体表达降低的发现一致，特别是在具有血液中较高计数的CD14-CD34+胚细胞的患者中。根据先前研究，我们观察到由单核细胞产生的ROS诱导活化NK细胞受体的下调。使用PARP-1抑制剂PJ34的实验暗示ROS在不存在细胞死亡的情况下也触发NK细胞受体的下调，因此支持ROS而不是与早期凋亡相关的细胞事件，降低活化NK细胞受体表达的表达。我们的结果还暗示NK细胞受体缺乏至少部分地可被细胞因子活化逆转(数据未显示)，在来自CMML患者的NK细胞上的NKp46、NKp30和DNAM-1表达通过IL-2恢复到与健康的年龄匹配的供体可比较的MFI水平。
细胞毒性T细胞在CMML中的作用尚未得到详细表征。同种异体干细胞移植(allo-SCT)是CMML中唯一潜在治愈的治疗，暗示T细胞免疫可能在消除恶性细胞中起作用。在allo-SCT后复发的CMML患者中，通过使用CD3+T细胞的供体淋巴细胞输注(DLI)的临床功效进一步支持了这一观点。在本研究中，我们观察到原代CMML细胞在CD8+T细胞区室中触发显著的ROS依赖性细胞凋亡，特别是在假定介导白血病细胞清除的非幼稚细胞中。这些发现与较早的报告一致，所述报告显示CD8+TEM对通过低水平的外源ROS诱导的细胞死亡高度敏感。应该进一步限定解释T细胞亚群对CMML细胞来源的ROS的差异敏感性的机制。此外，还需要进一步的研究来阐明CMML细胞诱导的针对T细胞的免疫抑制是否影响疾病的进程，并且通过白血病细胞的ROS形成是否可促成allo-SCT据报道在CMML中的有限益处。
NOX2抑制剂HDC已显示在化学疗法完成后，与低剂量IL-2组合使用时可预防AML的复发。III期试验结果的事后分析提示根据法国-美国-英国(FAB)分类，HDC/IL-2的临床功效在AML 4级和5级患者中是显著的。这些AML亚型含有具有单核细胞分化的白血病群体，其携带功能性NOX2，具有产生且释放ROS连同H2R的能力。这些发现已形成了通过单核细胞AML细胞的ROS产生可作为白血病诱导的免疫逃逸机制的假设的背景。本研究的结果暗示类似的免疫抑制机制可能在CMML中唾手可得。
总之，我们的结果提示原代人CMML细胞产生免疫抑制性ROS，其可影响NK细胞和T细胞依赖性白血病细胞清除。我们提出靶向细胞外ROS的策略可能在改善CMML中的抗白血病细胞免疫中具有价值。
虽然本文已说明且描述了本发明的某些特征，但本领域普通技术人员现在将想到许多修改、取代、改变和等价物。因此，应理解所附权利要求预期覆盖如落入本发明的真正精神内的所有这些修改和变化。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种降低患有原发性或转移性癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的肿瘤负荷。
2.一种降低患有活动性癌症的受试者中的转移性肿瘤扩散的风险的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的转移性肿瘤扩散的风险。
3.一种预防或延迟受试者中的癌症再现、重现或转移性扩散的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而预防或延迟所述受试者中的所述癌症再现、重现或转移性扩散。
4.一种预防受试者中的癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而预防所述受试者中的所述癌症复发。
5.一种延迟癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延迟所述癌症缓解期的所述受试者中的所述癌症复发。
6.一种延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
7.一种增加癌症缓解期的受试者中的存活的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而增加所述受试者的存活。
8.一种延长癌症缓解期的受试者的存活时间的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延长所述受试者的存活时间。
9.一种降低受试者中的恶性肿瘤生长的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而降低所述受试者中的恶性肿瘤生长。
10.一种减少或减轻癌症缓解期的受试者中的癌症症状的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而减少或减轻所述受试者中的所述癌症症状。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、Pidilizumab、BMS 936559和MPDL328OA。
13.根据权利要求5-12中任一项所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
14.根据权利要求5-12中任一项所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其还包括施用治疗量的另外免疫刺激剂的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述另外的免疫刺激剂是白细胞介素-2(IL-2)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括施用癌症疫苗的步骤。
18.一种用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含a)治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，以及所述试剂盒的使用说明书。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、Pidilizumab、BMS 936559和MPDL328OA。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的试剂盒，其还包含免疫刺激剂。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述免疫刺激剂是白细胞介素-2(IL-2)。
25.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，
其中如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在细胞毒性T细胞的重新分布，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
26.一种预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，和
e.如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，
从而预防所述受试者中的所述癌症复发。
27.一种延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，和
e.如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，
从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
28.根据权利要求1-8、10-17和25-27中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述白血病是急性髓样白血病(AML)。
30.根据权利要求1-8、10-17和25-27中任一项所述的方法，其中所述癌症是胸腺瘤。
31.根据权利要求5-8、10-17和25-30中任一项所述的方法，其中所述受试者处于所述癌症的完全缓解(CR)中。
32.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括向所述受试者施用细胞因子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述白细胞介素包含IL-2。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述白细胞介素包含IL-12或IL-15。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述白细胞介素以低剂量施用。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述IL-2以16,400U/kg的剂量每天施用两次。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子包含干扰素。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述干扰素包含干扰素-α。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述干扰素包含干扰素-β。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述干扰素包含干扰素-γ。
42.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子包含造血生长因子。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述造血生长因子选自：促红细胞生成素、IL-11、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其组合。
44.根据权利要求25-43中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括向所述受试者施用组胺受体激动剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述二盐酸组胺以0.5mg每天施用两次。
48.根据权利要求25-47中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)。
49.根据权利要求25-48中任一项所述的方法，其中所述缓解期的受试者正在经历用于复发预防的免疫疗法。
50.根据权利要求25-49中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括施用程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
51.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述治疗周期是所述治疗的第一周期。
52.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述治疗周期是所述治疗的第三周期。
53.根据权利要求25-52中任一项所述的方法，其中所述周期是3周的治疗周期。
54.根据权利要求25-53中任一项所述的方法，其中所述血样是外周血样品。
55.根据权利要求26-54中任一项所述的方法，其中所述治疗或提议的治疗是皮下施用的。
56.一种防止处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)的第一周期；
c.在所述第一治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；
d.测量所述血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率；和
e.如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用二盐酸组胺和IL-2的另外周期，
从而预防所述受试者中的AML复发。
57.一种用于预测受试者中的癌症治疗功效的试剂盒，其包含治疗量的组胺受体激动剂、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
59.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的试剂盒，其中所述免疫刺激剂是细胞因子。
61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述细胞因子是白细胞介素。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述白细胞介素包含IL-2。
63.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述白细胞介素包含IL-12或IL-15。
64.根据权利要求57-63中任一项所述的试剂盒，其中所述用于测量CD8+细胞毒性表型的手段包括针对CD25、CD69和IFN-γ的抗体。
65.根据权利要求57-63中任一项所述的试剂盒，其中所述用于测量CD8+细胞毒性表型的手段包含CD3-FITC(HIT3a)、CD4-APC-H7(RPA-T4)、CD4-Horizon V450(RPA-T4)、CD8-APC(RPA-T8)、CD8-PerCP-Cy5.5(RPA-T8/SK1)、CD8-Qdot705(3B5)、CD16-Horizon V450(3G8)、CD25-亮紫421(M-A251)、CD45RA-APC(HI100)、CD45RO-PE(UCHL1)、CD56-PerCP-eFluor710(CMSSB)、CD56-PE-Cy7(NCAM16.2)、CD69-PE-Cy7(FN50)、HLA-DR-FITC(L243)、CCR7-PE-Cy7(G043H7)、CD3-太平洋蓝(S4.1)、CD14-Qdot655(TüK4)和链霉抗生物素蛋白-Qdot605、IFN-γ-PE-Cy7或其组合。
66.根据权利要求57-65中任一项所述的试剂盒，其还包括用于收集血样的一个或多个容器。
67.根据权利要求57-66中任一项所述的试剂盒，其还包含治疗量的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、Pidilizumab、BMS 936559和MPDL328OA。
70.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的NK细胞频率，
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述癌症是急性髓样白血病。
72.根据权利要求70或71中任一项所述的方法，其中所述NK细胞是CD56亮NL细胞、CD16+NK细胞或两者。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中通过检测NK细胞相关生物标记物来测量所述NK细胞水平。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述NK细胞相关生物标记物是NKp30。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述NK细胞相关生物标记物是NKp46。
76.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述生物标记物是白细胞表面受体。
78.根据权利要求76-77中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是单核细胞表面受体。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是组胺2型受体(H2R)。
80.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
81.根据权利要求80所述的方法，所述生物标记物是白细胞表面受体。
82.根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是人白细胞抗原(HLA)A。
83.根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是人白细胞抗原(HLA)B。
84.根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是人白细胞抗原(HLA)C。
85.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的减少活性氧物种(ROS)的试剂。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述试剂减少细胞外ROS。
87.根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述试剂是ROS形成的抑制剂。
88.根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述试剂是细胞外ROS的清除剂。
89.根据权利要求85-88中任一项所述的方法，其还包括施用组胺受体激动剂的步骤。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
92.根据权利要求70-91中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)。
93.根据权利要求70-92中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述白血病是慢性髓单核细胞性白血病(CMML)。

Claims (94)

1.一种降低患有原发性或转移性癌症的受试者中的肿瘤负荷的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的肿瘤负荷。
2.一种降低患有活动性癌症的受试者中的转移性肿瘤扩散的风险的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而降低所述受试者中的转移性肿瘤扩散的风险。
3.一种预防或延迟受试者中的癌症再现、重现或转移性扩散的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而预防或延迟所述受试者中的所述癌症再现、重现或转移性扩散。
4.一种预防受试者中的癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的二盐酸组胺和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而预防所述受试者中的所述癌症复发。
5.一种延迟癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延迟所述癌症缓解期的所述受试者中的所述癌症复发。
6.一种延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
7.一种增加癌症缓解期的受试者中的存活的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而增加所述受试者的存活。
8.一种延长癌症缓解期的受试者的存活时间的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而延长所述受试者的存活时间。
9.一种降低受试者中的恶性肿瘤生长的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)抑制剂，从而降低所述受试者中的恶性肿瘤生长。
10.一种减少或减轻癌症缓解期的受试者中的癌症症状的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，从而减少或减轻所述受试者中的所述癌症症状。
11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、Pidilizumab、BMS 936559和MPDL328OA。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
14.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其还包括施用治疗量的另外免疫刺激剂的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述另外的免疫刺激剂是白细胞介素-2(IL-2)。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其还包括施用癌症疫苗的步骤。
18.一种用于延长受试者中的癌症缓解的试剂盒，其包含a)治疗量的组胺受体激动剂和程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂，以及所述试剂盒的使用说明书。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、Pidilizumab、BMS 936559和MPDL328OA。
21.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
22.根据权利要求18-20中任一项所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的试剂盒，其还包含免疫刺激剂。
24.根据权利要求23所述的试剂盒，其中所述免疫刺激剂是白细胞介素-2(IL-2)。
25.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，
其中如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在细胞毒性T细胞的重新分布，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
26.一种预防癌症缓解期的受试者中的所述癌症复发的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，和
e.如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，
从而预防所述受试者中的所述癌症复发。
27.一种延长受试者中的癌症缓解的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率，和
e.如果存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得与所述第一血样相比，所述第二血样中存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用所述治疗的另外周期，
从而延长所述受试者中的所述癌症缓解。
28.根据权利要求1-8、10-17和25-27中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述白血病是急性髓样白血病(AML)。
30.根据权利要求1-8、10-17和25-27中任一项所述的方法，其中所述癌症是胸腺瘤。
31.根据权利要求5-8、10-17和25-30中任一项所述的方法，其中所述受试者处于所述癌症的完全缓解(CR)中。
32.根据权利要求25-31中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括向所述受试者施用细胞因子。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子是白细胞介素。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述白细胞介素包含IL-2。
35.根据权利要求33所述的方法，其中所述白细胞介素包含IL-12或IL-15。
36.根据权利要求33-35中任一项所述的方法，其中所述白细胞介素以低剂量施用。
37.根据权利要求34所述的方法，其中所述IL-2以16,400U/kg的剂量每天施用两次。
38.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子包含干扰素。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述干扰素包含干扰素-α。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述干扰素包含干扰素-β。
41.根据权利要求38所述的方法，其中所述干扰素包含干扰素-γ。
42.根据权利要求32所述的方法，其中所述细胞因子包含造血生长因子。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述造血生长因子选自：促红细胞生成素、IL-11、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或其组合。
44.根据权利要求25-43中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括向所述受试者施用组胺受体激动剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
46.根据权利要求44所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述二盐酸组胺以0.5mg每天施用两次。
48.根据权利要求25-47中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)。
49.根据权利要求25-48中任一项所述的方法，其中所述缓解期的受试者正在经历用于复发预防的免疫疗法。
50.根据权利要求25-49中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括施用程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
51.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述治疗周期是所述治疗的第一周期。
52.根据权利要求25-50中任一项所述的方法，其中所述治疗周期是所述治疗的第三周期。
53.根据权利要求25-52中任一项所述的方法，其中所述周期是3周的治疗周期。
54.根据权利要求25-53中任一项所述的方法，其中所述血样是外周血样品。
55.根据权利要求26-54中任一项所述的方法，其中所述治疗或提议的治疗是皮下施用的。
56.一种防止处于完全缓解(CR)的患有AML的受试者中的急性髓样白血病(AML)复发的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)的第一周期；
c.在所述第一治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；
d.测量所述血样中的CD8+细胞毒性T细胞表型的频率；和
e.如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在细胞毒性T细胞的重新分布，使得存在T效应记忆细胞(TEM)的频率降低和T效应细胞(Teff)的频率增加，则向所述受试者施用二盐酸组胺和IL-2的另外周期，
从而预防所述受试者中的AML复发。
57.一种用于预测受试者中的癌症治疗功效的试剂盒，其包含治疗量的组胺受体激动剂、免疫刺激剂、用于测量CD8+细胞毒性表型的手段和所述试剂盒的使用说明书。
58.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
59.根据权利要求57所述的试剂盒，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
60.根据权利要求57-59中任一项所述的试剂盒，其中所述免疫刺激剂是细胞因子。
61.根据权利要求60所述的试剂盒，其中所述细胞因子是白细胞介素。
62.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述白细胞介素包含IL-2。
63.根据权利要求61所述的试剂盒，其中所述白细胞介素包含IL-12或IL-15。
64.根据权利要求57-63中任一项所述的试剂盒，其中所述用于测量CD8+细胞毒性表型的手段包括针对CD25、CD69和IFN-γ的抗体。
65.根据权利要求57-63中任一项所述的试剂盒，其中所述用于测量CD8+细胞毒性表型的手段包含CD3-FITC(HIT3a)、CD4-APC-H7(RPA-T4)、CD4-Horizon V450(RPA-T4)、CD8-APC(RPA-T8)、CD8-PerCP-Cy5.5(RPA-T8/SK1)、CD8-Qdot705(3B5)、CD16-Horizon V450(3G8)、CD25-亮紫421(M-A251)、CD45RA-APC(HI100)、CD45RO-PE(UCHL1)、CD56-PerCP-eFluor710(CMSSB)、CD56-PE-Cy7(NCAM16.2)、CD69-PE-Cy7(FN50)、HLA-DR-FITC(L243)、CCR7-PE-Cy7(G043H7)、CD3-太平洋蓝(S4.1)、CD14-Qdot655(TüK4)和链霉抗生物素蛋白-Qdot605、IFN-γ-PE-Cy7或其组合。
66.根据权利要求57-65中任一项所述的试剂盒，其还包括用于收集血样的一个或多个容器。
67.根据权利要求57-66中任一项所述的试剂盒，其还包含治疗量的程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或程序性细胞死亡配体1(PD-L1)的抑制剂。
68.根据权利要求67所述的试剂盒，其中所述PD-1或PD-L1抑制剂是抗体。
69.根据权利要求68所述的试剂盒，其中所述抗体选自：纳武单抗、派姆单抗、Pidilizumab、BMS 936559和MPDL328OA。
70.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的NK细胞频率，
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在NK细胞频率的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
71.根据权利要求70所述的方法，其中所述癌症是急性髓样白血病。
72.根据权利要求70或71中任一项所述的方法，其中所述NK细胞是CD56亮NL细胞、CD16+NK细胞或两者。
73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中通过检测NK细胞相关生物标记物来测量所述NK细胞水平。
74.根据权利要求73所述的方法，其中所述NK细胞相关生物标记物是NKp30。
75.根据权利要求73所述的方法，其中所述NK细胞相关生物标记物是NKp46。
76.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的增加，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
77.根据权利要求76所述的方法，其中所述生物标记物是白细胞表面受体。
78.根据权利要求76-77中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是单核细胞表面受体。
79.根据权利要求76-78中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是组胺2型受体(H2R)。
80.一种预测受试者中的癌症治疗功效的方法，其包括以下步骤：
a.从所述受试者获得第一血样；
b.向所述受试者施用用于所述癌症的治疗周期或提议的治疗；
c.在所述治疗周期完成后，从所述受试者获得第二血样；和
d.测量所述第一血样和所述第二血样中的生物标记物表达的水平，
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是有效的，和
其中如果与所述第一血样相比，所述第二血样中不存在生物标记物表达水平的减少，则所述癌症治疗预测为在所述受试者中是无效的，
从而预测所述癌症治疗在所述受试者中的功效。
81.根据权利要求80所述的方法，所述生物标记物是白细胞表面受体。
82.根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是人白细胞抗原(HLA)A。
83.根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是人白细胞抗原(HLA)B。
84.根据权利要求80-81中任一项所述的方法，其中所述生物标记物是人白细胞抗原(HLA)C。
85.一种治疗受试者的癌症的方法，其包括以下步骤：向所述受试者施用治疗量的减少活性氧物种(ROS)的试剂。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述试剂减少细胞外ROS。
87.根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述试剂是ROS形成的抑制剂。
88.根据权利要求85-86中任一项所述的方法，其中所述试剂是细胞外ROS的清除剂。
89.根据权利要求85-88中任一项所述的方法，其还包括施用组胺受体激动剂的步骤。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是二盐酸组胺。
91.根据权利要求89所述的方法，其中所述组胺受体激动剂是N-甲基-组胺或4-甲基-组胺。
92.根据权利要求70-91中任一项所述的方法，其中所述癌症治疗包括施用二盐酸组胺和白细胞介素-2(IL-2)。
93.根据权利要求70-92中任一项所述的方法，其中所述癌症是白血病。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述白血病是慢性髓单核细胞性白血病(CMML)。
CN201780017047.0A 2016-02-08 2017-02-08 二盐酸组胺组合及其用途 Pending CN108883093A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662292397P 2016-02-08 2016-02-08
US62/292,397 2016-02-08
PCT/IL2017/050160 WO2017137989A1 (en) 2016-02-08 2017-02-08 Histamine dihydrochloride combinations and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN108883093A true CN108883093A (zh) 2018-11-23

Family

ID=59563785

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780017047.0A Pending CN108883093A (zh) 2016-02-08 2017-02-08 二盐酸组胺组合及其用途

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20210292417A1 (zh)
EP (1) EP3413890A1 (zh)
JP (1) JP2019506454A (zh)
CN (1) CN108883093A (zh)
AU (1) AU2017216927A1 (zh)
BR (1) BR112018016142A2 (zh)
CA (1) CA3013881A1 (zh)
CL (1) CL2018002136A1 (zh)
CO (1) CO2018009398A2 (zh)
IL (1) IL261009A (zh)
MX (1) MX2018009621A (zh)
WO (1) WO2017137989A1 (zh)
ZA (1) ZA201805328B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110006871A (zh) * 2019-02-20 2019-07-12 常州大学 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020526576A (ja) * 2017-06-29 2020-08-31 イミューン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 急性骨髄性白血病の再発を遅延及び予防する方法
KR20220011562A (ko) * 2018-04-25 2022-01-28 안나 마트너 급성 골수성 백혈병에서의 재발 위험 감소 및 생존 연장을 위한 방법 및 조성물
WO2020033331A1 (en) * 2018-08-06 2020-02-13 Martner Anna Method and compositions for treating colon cancer and breast cancer

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6498181B1 (en) * 1999-01-06 2002-12-24 Maxim Pharmaceuticals Synergistic tumorcidal response induced by histamine

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110006871A (zh) * 2019-02-20 2019-07-12 常州大学 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用

Also Published As

Publication number Publication date
AU2017216927A1 (en) 2018-08-30
ZA201805328B (en) 2019-04-24
CL2018002136A1 (es) 2018-12-07
CO2018009398A2 (es) 2018-10-10
IL261009A (en) 2018-10-31
EP3413890A1 (en) 2018-12-19
JP2019506454A (ja) 2019-03-07
MX2018009621A (es) 2019-03-28
WO2017137989A1 (en) 2017-08-17
BR112018016142A2 (pt) 2019-10-08
CA3013881A1 (en) 2017-08-17
WO2017137989A4 (en) 2017-10-05
US20210292417A1 (en) 2021-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7034125B2 (ja) Ｃａｒの抗腫瘍活性のための毒性管理
US20200239845A1 (en) Expanded nk cells
Laurent et al. The engagement of CTLA-4 on primary melanoma cell lines induces antibody-dependent cellular cytotoxicity and TNF-α production
US11207393B2 (en) Regulatory T cell PD-1 modulation for regulating T cell effector immune responses
JP5936818B2 (ja) 細胞傷害活性抗ｌａｇ−３モノクローナル抗体および臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防における該抗体の使用方法
CN110381963A (zh) 涉及色氨酸代谢途径调节剂的免疫治疗方法和组合物
JP2020517302A (ja) Ｃｄ１９に対するヒト化抗原結合ドメイン及び使用方法
CN102770455A (zh) 用于体内扩增调节性t细胞的方法
US7488474B2 (en) Method for detecting regulatory T cells using expression of folate receptor 4 as indicator, method for treating diseases using the detection method, pharmaceutical composition for immunostimulation, and method for treating diseases using the composition
CN108883093A (zh) 二盐酸组胺组合及其用途
CN109154027A (zh) 用于监测和治疗癌症的方法
Oshimi et al. Perforin gene expression in granular lymphocyte proliferative disorders
JP2020523018A (ja) がんの処置のための腫瘍反応性ヒトｔ細胞の同定のためのｃｄ３９およびｃｄ１０３の使用
EP1749538A1 (en) Methods of inducing differentiation of regulatory t-cells and proliferating the same with gpi anchor protein agonist and medicinal composition therefor
KR102423631B1 (ko) 케모카인 억제제, 콜로니 자극 인자 억제제 및 면역항암제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 병용 요법
Wang et al. TIGIT immune checkpoint blockade enhances immunity of human peripheral blood NK cells against castration-resistant prostate cancer
Vasilevsky et al. OX40 engagement stabilizes Mxd4 and Mnt protein levels in antigen‐stimulated T cells leading to an increase in cell survival
US20060228351A1 (en) Method of inducing differentiation and proliferating regulatory t cell by anti-cd52 antibody and medicinal composition therefor
Chen et al. The possible regulatory effect of the PD-1/PD-L1 signaling pathway on Tregs in ovarian cancer.
KR20240049794A (ko) Cxcr5, pd-1, 및 icos 발현 종양 반응성 cd4 t 세포 및 그의 용도
Tin et al. Double-negative T cells utilize a TNFα-JAK1-ICAM-1 cytotoxic axis against acute myeloid leukemia
Duan et al. RIG-I is an intracellular checkpoint that limits CD8+ T-cell antitumor immunity
EP3750988A1 (en) Improved alpha beta t processed cell production method
JP2022513082A (ja) 免疫応答を調節するためのＩＲＥ１α－ＸＢＰ１シグナル伝達経路バイオマーカーの使用
Aziz et al. Study of immunomics and immune regulation in ovarian cancer

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20181123