KR20240049794A - Cxcr5, pd-1, 및 icos 발현 종양 반응성 cd4 t 세포 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다. 본 방법은 대상체에게 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 투여하는 단계를 포함한다. 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 코딩하는 핵산을 단리하는 방법 또한 개시한다. 본 방법은 종양 세포 항원을 발현하는 종양을 앓는 대상체로부터의 샘플로부터 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 단리하는 단계, 및 TCR을 코딩하는 핵산 분자를 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포로부터 클로닝하는 단계를 포함한다. 추가로, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 방법을 개시한다. 추가 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체가 체크포인트 억제제에 대해 반응하는지 여부를 결정하는 방법을 개시한다. 본 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 본 방법에서 사용되는 조성물 또한 개시한다.

Description

CXCR5, PD-1, 및 ICOS 발현 종양 반응성 CD4 T 세포 및 그의 용도

관련 출원에 대한 상호 참조

이는 2021년 6월 7일에 출원된 미국 가출원 제63/197,780호의 이익을 주장하며, 이는 본원에서 참조로 포함된다.

기술분야

이는 암 분야, 구체적으로, 종양 치료를 위한 세포, 예컨대, 분화 클러스터 4 양성(CD4⁺: cluster of differentiation 4-positive), 유도성 T 세포 공동자극인자 양성(ICOS⁺: inducible T-cell costimulator-positive), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 양성(PD-1⁺: programmed cell death protein 1-positive), C-X-C 모티프 케모카인 수용체 5 양성(CXCR5⁺: C-X-C motif chemokine receptor 5-positive)(CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺) T 세포의 입양 전달의 용도, 및 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포로부터의 T 세포 수용체(TCR: T cell receptor)의 용도, 및 예컨대, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 측정함으로써 치료를 평가하는 방법에 관한 것이다.

배경

입양 T 세포 전달(ACT: Adoptive T-cell transfer)은 임상적으로 암 환자에게 효과적인 치료를 제공하는 것으로 나타났다. 그러나, 상이한 ACT 시험에서 다양한 반응률과 장기 암 관해가 관찰되었다. T 세포 유형 및 다른 면역 표적 요법의 공동 투여는 ACT의 효능에 영향을 미칠 수 있다. CD4 및 CD8 종양 침윤 림프구(TIL: tumor infiltrating lymphocyte)가 이러한 ACT 시험에 사용되었으며, 상기 둘 모두 암 환자에서 치료 반응을 보였지만, 지금까지 대부분의 긍정적인 임상 데이터는 흑색종 특정 시험과 연관되어 있었다. 최근에는 종양 반응성 TIL이 면역 매개 종양 파괴의 원인이라는 것이 인식되었다. 그러나, ACT를 위한 TIL 생성물은 종양 반응성 T 세포의 빈도가 낮을 수 있다. 입양 전달의 효능을 증가시키는 암 치료를 위한 추가적인 면역치료 방법에 대해서는 여전히 요구되고 있다.

요약

체크포인트 억제제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 면역치료 항체 및/또는 체크포인트 억제제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, PD-1 항체와 함께 사용될 수 있는 종양 반응성 CD4 T 세포를 농축시키는 방법을 개시한다.

일부 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다. 본 방법은 대상체에게 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 투여하여 종양을 치료하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양, 예컨대, 두부경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 흑색종, 난소암, 폐암, 유방암, 또는 전립선암이다. 일부 예에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 대상체에 있어 자가 유래인 것이다. 추가 실시양태에서, 본 방법은 대상체에게 치료 유효량의 인터류킨(IL)-2, IL-15, IL-21, 프로그래밍된 사멸(PD: Programmed Death)-1 길항제, 프로그래밍된 사멸 리간드(PD-L1: Programmed Death Ligand) 길항제, 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4: cytotoxic T-lymphocyte-Associated Protein 4) 길항제, B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA: B- and T-lymphocyte Attenuator) 길항제, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3: T-cell Immunoglobulin and Mucin-domain containing-3) 길항제, 림프구 활성화 유전자 3(LAG3: Lymphocyte-Activation Gene 3) 길항제, 4-1BB 효능제, 또는 OX-40 효능제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 방법을 개시한다. 본 방법은 글루타민, 혈청 및 항생제를 포함하는 조직 배양 배지 중에서 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 배양하여 1차 배양물을 형성하는 단계; 1차 배양물을 유효량의 동종이계의 조사된 배양 보조 세포 및 인터류킨(IL)-2로 자극하여 자극된 T 세포를 형성하는 단계; 및 자극된 T 세포를 조직 배양 배지 및 유효량의 IL-2에서 배양하는 단계를 포함한다.

추가의 다른 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체가 암 치료제에 대해 반응할지 여부를 결정하는 방법을 개시한다. 본 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 존재한다면, 이는 치료제, 예컨대, 체크포인트 억제제 또는 방사선이 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적일 것임을 시사하는 것이다. 종양을 앓는 대상체에게 제1 용량의 암 치료제를 투여하는 단계, 및 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수를 측정하는 단계를 포함하는, 종양을 앓는 대상체가 암 치료제에 대해 반응할지 여부를 결정하는 방법 또한 개시한다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수가 증가하였다면, 이는 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적이라는 것을 시사하는 것이다.

추가 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다. 본 방법은 종양을 앓는 대상체에게 제1 용량의 암 치료제를 투여하는 단계, 및 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양이 증가하였다면, 이는 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적이라는 것을 시사하는 것이다. 본 방법은 또한 제2 용량의 암 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 용량은 제2 용량과 동일하거나, 또는 제2 용량은 제1 용량보다 낮다.

다른 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법은 종양을 앓는 대상체애개 제1 용량의 암 치료제를 투여하는 단계, 및 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수를 측정하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양이 감소하였거나, 또는 변함이 없다면, 이는 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과가 없다는 것을 시사하는 것이다. 본 방법은 또한 제2 용량의 암 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 용량은 제1 용량보다 높거나, 또는 제2 용량은 제1 용량과 동일하다.

추가 실시양태에서, 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 코딩하는 핵산을 단리하는 방법을 개시한다. 본 방법은 종양 세포 항원을 발현하는 종양을 앓는 대상체로부터의 샘플로부터 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 단리하는 단계, 및 TCR을 코딩하는 핵산 분자를 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포로부터 클로닝하는 단계를 포함한다. 본 핵산 분자에 의해 코딩된 TCR 또한 개시한다.

본 개시내용의 상기 및 다른 특징은 첨부 도면을 참조하여 진행되는 하기의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다

도면의 간단한 설명
도 1a-1b. CD4 TIL ICOS /PD-1 서브세트에서의 HPV -반응성. HPV-두부경부(H&N) 환자로부터의 CD4 TIL에서의 HPV E6 펩티드 반응성. (a) HPV+ 두부경부(H&N) 암 환자로부터 종양 샘플을 수득하였다. 종양을 분해시키고, 다양한 항체(Ab) 마커로 염색하였다. 유세포 분석 도트 플롯은 Treg가 게이팅 아웃된 상태에서(CD25^hi 및 CD127^lo) CD4에 대해 게이팅된 세포에 대한 ICOS 및 PD-1 염색을 보여준다. 3개 사분면에 있는 수치는 해당 사분면 내에 포함된 세포의 비율(%)을 나타낸다. (b) a의 종양으로부터의 CD4 T 세포가 PD-1/ICOS 발현에 기초하여 유세포 분석법에 의해 분류되었다: 1) ICOS^-/PD-1^- 2) ICOS^-/PD-1⁺, 및 3) ICOS^+/PD-1⁺. CD4 T 세포의 상기 상이한 서브세트를 IL-2에서 2주 동안 확장시킨 후, 자가 환자 말초 혈액으로부터 단리된 단핵구와 함께 24시간(hr) 동안 인큐베이션시키고, HPV-16 E6 단백질에 대한 중첩 펩티드(전체 단백질 서열 커버)로 펄싱하였다. b의 플로우 플롯은 분류된 세 CD4 TIL 집단에 대한 활성화 마커 CD25 및 OX40의 발현을 보여준다.
도 2a-2c. 항PD -1 반응자 샘플 대 비반응자 샘플에서의 CD4 TIL에 대한 단일 세포 RNA 분석. (a) 항PD-1 요법으로 처리된 흑색종 환자로부터의 관심 종양 침윤 CD4 T 세포 집단에 대한 대표적인 게이팅 전략법. 선택된 유전자의 정규화된 전사체 값은 중간 두 플롯의 X축과 Y축을 따라 표시되며, 유전자는 표지되어 있다. 드로잉된 게이트에는 % 멤버십이 포함되어 있다. 두 축 어디든 그를 따라 있는 세포는 두 중간 플롯에서 상응하는 유전자의 전사체 수준이 기능적으로 0인 것으로 해석될 수 있다. X축을 따라 있고, Y축에 인접한 세포는 두 외부 플롯에서 상응하는 유전자의 전사체 수준이 기능적으로 0인 것으로 해석될 수 있다. 이러한 경우, 관심 세포는 FoxP3 전사체를 발현하지 않는 CD3, CD4 T 세포였다. (b) 항PD-1 요법에 대한 반응 환자 및 비반응 환자("모든 샘플")에서 비FoxP3 발현 CD3+ CD4+ T 세포 내의 ICOS 및 PDCD1 전사체, 둘 모두를 함유하는 세포의 비율(%)을 비교하는 등고선 플롯 뿐만 아니라, 항PD-1 요법에 대한 비반응 환자 및 반응 환자에서의 세포에 대한 별도의 플롯. (c) 반응자 대 비반응자에서 ICOS⁺PDCD1⁺ 비Treg CD3⁺ CD4⁺ T 세포 집단을 비교 수행하는 차등 발현 분석 결과로부터 작성된 유전자 목록. FC는 변화 배수(fold change)이고, 여기서 값이 1 미만인 것은 반응자에서의 발현 수준이 더 높은 유전자에 상응하고, 값이 1 초과인 것은 비반응자에서의 발현 수준이 더 높은 유전자에 상응한다. Q 값은 FDR 보정된 p 값이고, 통계적 유의도의 척도로서 사용된다.
도 3. CD4 TIL에서의 반응자 대 비반응자 CXCR5 발현. ICOS⁺PDCD1⁺ CD4/FoxP3^neg T 세포(상단 플롯) 및 모든 비ICOS⁺PDCD1⁺ CD4/FoxP3^neg T 세포(하단 플롯) 내에서 CXCR5 RNA를 발현하는 세포의 비율(%)의 사이드 바이 사이드 비교. %CXCR5⁺ 발현에 대한 값은 처리 전 샘플 및 처리 후 샘플로 분리되어 있다(X축). CXCR5 전사체를 발현하는 세포의 비율(%)은 Y축에 도시되어 있고, 제시된 바와 같이 반응자와 비반응자 간의 비교를 수행하였다.
도 4a-4b. 다중 종양 유형으로부터의 CD4 TIL 상의 CXCR5 발현.
종양을 수술 샘플로부터 수득하고, 효소적으로 분해하였다. 이어서, 종양 샘플을 유세포 분석법에 의해 CD4 서브세트 내 CXCR5 발현의 존재에 대해 분석하였다. 샘플은 CD4 T 세포에 대해 게이팅되었고, Treg는 FoxP3 및 CD25 항체를 사용하여 분석에서 게이팅 아웃되었다. CD4 T 세포 집단을 ICOS 및 PD-1 발현에 대해 평가하였고, ICOS⁺/PD-1⁺ 이중 양성(DP: double positive) 뿐만 아니라, ICOS^-/PD-1^- 이중 음성(DN: double negative) 집단은 게이팅되었고, CXCR5 양성 세포의 비율(%)은 하단의 두 패널에 제시되어 있다. 평가된 종양 유형은 HPV 양성 및 음성 두부경부(H&N) 암, 결장직장암 (CRC), 및 흑색종이다.
도 5a-5c. T 세포 활성화 검정법에서 CD4 TIL에 의한 종양 항원 인식. 종양을 HPV+ H&N 암 환자로부터 수득하였다. CD4 TIL 서브세트의 E6 및 E7 반응성을 측정하였다. CD4 TIL을 PD-1, ICOS 및 CXCR5에 대해 염색하고, 분류하고, 2주 동안 시험관내에서 확장시켰다. 서브세트 CD4 TIL 서브세트는 이중 음성 "DN"(PD-1^-ICOS^- 발현), CXCR5^-(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5^- 발현), 및 CXCR5⁺(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5⁺ 발현)에 기초하여 분류되었고, Treg는 CD25 및 CD127 염색을 이용하여 분류에서 배제시켰다. HPV E6 또는 E7 종양원성 단백질의 전체 서열을 커버하는 중첩 펩티드로 펄싱된 자가 말초 혈액 단핵구와 함께 CD4 TIL의 서브세트를 인큐베이션시켰다. CD4 TIL을 펩티드로 펄싱된 단핵구와 함께 밤새도록 인큐베이션시킨 후, 활성화 단백질 CD25 및 OX40의 상향조절에 대해 평가하였다. CD25 및 OX40의 배경/기준선 수준을 평가하기 위해, CD4 TIL 서브세트를 E6 또는 E7 펩티드로 펄싱되지 않은 단핵구와 함께 인큐베이션시켰다("T 세포/펩티드 부재"). 기준선 대비 CD25 및 OX40 수준 증가는 E6 또는 E7 단백질에 반응하는 CD4 TIL의 비율(%)을 나타낸다. 도 5a 및 5b는 상기 검정법에 대한 원시 흐름 데이터를 보여주는 것이다. 도 5c는 3개의 상이한 CD4 TIL 집단에서 E6 및 E7 펩티드를 사용하여 수행된 동일한 검정법으로부터의 감산이 되는 펩티드 부재하의 단핵구와 인큐베이션된 T 세포인 배경/기준선과 함께 E6- 및 E7-반응성 T 세포의 비율(%)을 나타낸 막대 그래프를 보여주는 것이다.
도 6a-6c. 공동 배양 검정법에서 CD4 TIL에 의한 종양 직접 인식. a) 전이성 림프절을 흑색종 환자로부터 외과적으로 절제하고, 효소적으로 분해하고, CD4⁺ 비드 농축 키트를 사용하여 세포 분류하기 위해 제조하였다. CD4 TIL을 시험관내에서 분류 및 확장시켰고, 각 서브세트는 이중 음성 "DN"(PD-1^-ICOS^-), CXCR5^-(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5^-), 및 CXCR5⁺(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5⁺)에 기초하여 분류되었고, Treg는 CD25 및 CD127 염색을 이용하여 분류에서 배제시켰다. 1x10⁵개를 자가 종양 세포의 수를 증가시키면서 함께 공동 배양시켰을 때(7.5x10⁴), OX40 및 CD25의 상향조절에 의한 종양 인식에 대하여 확장된 CD4 TIL 서브세트를 평가하였다. CD4 TIL을 첨가하기 전 24시간 동안 MHC 클래스 II를 상향조절하기 위해 자가 종양 세포를 INF-γ(20 ng/mL)와 함께, 또는 그의 부재하에서 인큐베이션시켰다. b) OX40 및 CD25 공동 발현으로 평가된 바와 같은, 도 6a의 실험으로부터의 종양 반응성 T 세포의 비율(%)을 나타내는 막대 그래프. 3개의 상이한 CD4 TIL 집단에 대해 T 세포를 자가 종양 세포와 함께 공동으로 인큐베이션시킨 경우 수행된 동일한 검정법으로부터의 감산이 되는 종양 부재하에서 인큐베이션된 T 세포에서의 OX40/CD25 발현인 배경/기준선. c) 제2 검정법에서, 도 6a와 동일한 환자 샘플로부터의 CD4 TIL 간의 비교를 수행하였다. 본 검정법에서는 1x10⁵개의 DN(PD-1^-ICOS^-) CD4의 공동 배양물을 1x10⁵개의 자가 종양과 함께 인큐베이션된 CXCR5⁺(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5⁺)와 비교하고, 48 hr 후 OX40 및 CD25 발현에 대해 평가하였다.
도 7a-7d. 자가 종양과 함께 인큐베이션되었을 때의 CD4 TIL 서브세트에 의한 사이토카인 생산. 전이성 림프절을 흑색종 환자(도 6a-6c와 동일한 환자 샘플)로부터 외과적으로 절제하고, 효소적으로 분해하고, CD4⁺ 비드 농축 키트를 사용하여 세포 분류하기 위해 제조하였다. CD4 TIL을 시험관내에서 분류 및 확장시켰고, 각 서브세트는 이중 음성 "DN"(PD-1^-ICOS^-), CXCR5^-(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5^-), 및 CXCR5⁺(PD-1⁺ICOS⁺CXCR5⁺)에 기초하여 분류되었고, Treg는 CD25 및 CD127 염색을 이용하여 분류에서 배제시켰다. CD4 TIL 서브세트로부터의 상청액을 자가 종양 세포의 수를 증가시키면서(2.5x10⁴, 6.5x10⁴, 7.5x10⁴) 48 hr 동안 공동 배양하였을 때의 사이토카인 생산에 의한 종양 인식에 대해 평가하고, 종양 부재하에서 48 hr 동안 배양된 동일한 CD4 TIL 서브세트와 비교하였다. CD4 TIL 서브세트의 공동 배양 전 24시간 동안 MHC 클래스 II를 상향조절하기 위해 자가 종양 세포를 INF-γ(20 ng/mL)와 함께 인큐베이션시켰다. 상청액을 하기 사이토카인: a) IL-5, b) TNF-a, c) IL-10, 및 d) IL-13에 대해 평가하였다.

상세한 설명

진단 방법을 위해 특정 서브집단을 사용하기 위해서는 암 환자에 대한 면역요법 및 입양 T 세포 전달의 효능을 개선시킬 필요가 있고, 항종양 반응에 관여하는 CD4 T 세포를 특징화할 필요가 있다. PD-1+ICOS+ CD4⁺ 종양 침윤 림프구(TIL)는 CXCR5⁺ 및 CXCR5^- 세포를 포함한다. 종양 반응성 CD4 T 세포의 표현형 및 기능이 결정되었다는 것이 본원에 개시되어 있으며, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ 세포는 종양 미세환경에서 특이적으로 유도된 종양 침윤 CD4 T 세포의 독특한 집단이라는 것이 문서로 기록되었다. 이들 세포는 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5^- 세포와 비교하여 IL-5 및 TNF-α 발현에 대해 농축되어 있으며, 감소된 IL-10 생산을 보인다. 생물학적 샘플 중 상기 세포를 평가함으로써 치료 효능을 결정하고, 종양을 앓는 대상체가 치료에 반응하는지 여부를 평가하는 방법을 제공한다. CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 입양 전달이 대상체에서 종양을 치료하는 데 사용될 수 있다.

용어

달리 명시되지 않는 한, 기술적 용어는 통상적인 사용법에 따라 사용된다. 분자 생물학에서 일반적인 용어의 정의는 문헌 [Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishers, 2009]; 및 [Meyers et al. (eds.), The Encyclopedia of Cell Biology and Molecular Medicine, published by Wiley-VCH in 16 volumes, 2008]; 및 다른 유사한 참고문헌에서 살펴볼 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "하나"("a," "an") 및 "그"라는 단수 용어는 문맥상 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 단수의 지시어 뿐만 아니라, 복수의 지시어, 둘 모두를 지칭한다. 예를 들어, "항원"이라는 용어는 단일 또는 복수 항원을 포함하고, "적어도 하나의 항원"이라는 어구와 동등한 것으로 간주될 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "포함하다(comprises)"라는 용어는 "포함하다(includes)"라는 것을 의미한다. 추가로, 핵산 또는 폴리펩티드에 대해 제공된 임의의 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자 질량 값은 달리 명시되지 않는 한, 근사치이며, 설명 목적으로 제공된다는 것이 이해되어야 한다. 본원에 기술된 것과 유사하거나, 또는 등가인 많은 방법 및 물질이 사용될 수 있지만, 특히 적합한 방법 및 물질이 본원에 기술되어 있다. 상충되는 경우, 용어 설명을 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것은 아니다. 다양한 실시양태의 리뷰를 용이하게 하기 위해, 용어에 대한 하기 설명이 제공된다:

4- 1BB: 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리(TNFRS: Tumor necrosis factor receptor superfamily)의 단백질이며, CD137 및 TNFRSF9로도 지칭되는 막횡단 단백질. 4-1BB의 발현은 일반적으로 활성화 의존적이고, 활성화된 NK 및 NKT 세포, 조절 T 세포, 활성화된 CD4 및 CD8 T 세포, 수지상 세포(DC: dendritic cell), 자극된 비만 세포, 분화성 골수 세포, 단핵구, 호중구 및 호산구를 포함하는 광범위한 면역 세포 서브세트에 존재한다(문헌 [Wang, 2009, Immunological Reviews 229: 192-215]). 4-1BB 발현은 또한 종양 맥관 구조(문헌 [Broll, 2001, Amer. J. Clin. Pathol. 115(4):543-549]; [Seaman, 2007, Cancer Cell 11: 539-554]) 상에서와 염증 부위 또는 죽상 경화성 내피(문헌 [Drenkard, 2007 FASEB J. 21: 456-463]; [Olofsson, 2008, Circulation 117: 1292-1301]) 상에서 입증되었다. 4-1BB를 자극하는 리간드, 즉, 4-1BB 리간드(4-1BBL: 4-1BB Ligand)는 활성화된 항원 제시 세포(APC: antigen-presenting cell), 골수 전구 세포, 및 조혈 줄기 세포 상에서 발현된다. 인간 4-1BB는 255개의 아미노산 단백질이다(2017년 6월 1일자로 이용가능한 GENBANK 수탁 번호 NM_―001561 및 NP_―001552(이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 4-1BB의 효능제 항체는 예를 들어, 미국 특허 제8,337,850호(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

수준을 변경: 대조군 수준과 비교하여 특정 세포 유형의 세포수, 또는 핵산 서열 또는 아미노산 서열(예를 들어, 폴리펩티드, siRNA, miRNA, mRNA, 유전자)의 생산 또는 발현의 수준을 증가 또는 감소시킴으로써 변화시킴.

안티센스 , 센스 및 안티진 ( antigene ): DNA에는 2개의 역 평행 가닥, (+) 가닥으로 지칭되는 5' → 3' 가닥과 (-) 가닥으로 지칭되는 3' → 5' 가닥이 있다. RNA 폴리머라제는 5'→ 3' 방향으로 핵산을 부가하기 때문에, DNA의 (-)는 전사 중에 RNA의 주형으로 작용한다. 따라서, RNA 전사체는 (-) 가닥에 상보적이고, (+) 가닥과 동일한 서열을 가질 것이다(U가 T로 치환된 것을 제외).

안티센스 분자는 RNA 또는 DNA의 (+) 가닥에 특이적으로 하이브리드화 가능하거나, 또는 특이적으로 상보적인 분자이다. 센스 분자는 DNA의 (-) 가닥에 특이적으로 하이브리드화 가능하거나, 또는 특이적으로 상보적인 분자이다. 안티진은 DNA 표적에 대한 안티센스 또는 센스 분자이다. 안티센스 RNA(asRNA: antisense RNA)는 센스(코딩) 핵산 분자에 상보적인 RNA 분자이다.

항체: 항원, 예컨대, PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, 4-1BB 또는 OX-40 폴리펩티드, 또는 그의 단편의 에피토프를 인식하고, 그에 결합하는(예컨대, 특이적으로 인식하고, 특이적으로 결합하는) 적어도 경쇄 또는 중쇄 면역글로불린 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드 리간드. 면역글로불린 분자는 중쇄 및 경쇄로 구성되며, 이들 각각은 중쇄 가변(V_H) 영역 및 경쇄 가변(V_L) 영역으로 명명되는 가변 영역을 갖는다. 종합하면, V_H 영역 및 V_L 영역은 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 역할을 한다.

항체는 무손상 면역글로불린 및 당업계에 널리 공지된 항체의 변이체 및 일부, 예컨대, 단일 도메인 항체(예컨대, VH 도메인 항체), Fab 단편, Fab' 단편, F(ab)'₂ 단편, 단일 쇄 Fv 단백질("scFv": single chain Fv), 및 이황화 안정화된 Fv 단백질("dsFv": disulfide stabilized Fv)을 포함한다. scFv 단백질은 면역글로불린의 경쇄 가변 영역 및 면역글로불린의 중쇄 가변 영역이 링커에 의해 결합된 융합 단백질인 한편, dsFv에서, 쇄는 쇄의 회합을 안정화시키기 위해 이황화 결합을 도입하도록 돌연변이화되었다. 상기 용어는 또한 예컨대, 키메라 항체(예를 들어, 인간화 뮤린 항체), 이종접합체 항체(예컨대, 이중특이적 항체)와 같은 유전자 조작된 형태를 포함한다. 또한, 문헌 [Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL)]; [Kuby, J., Immunology, 3^rd Ed., W. H. Freeman & Co., New York, 1997]을 참조한다.

전형적으로, 자연적으로 발생된 면역글로불린은 이황화 결합에 의해 상호연결된 중쇄(H) 및 경쇄(L)를 갖는다. 경쇄에는 람다(λ)와 카파(k)의 두 가지 유형이 있다. 항체 분자의 기능적 활성을 결정하는 5가지 주요 중쇄 부류(또는 이소타입): IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE가 있다.

각각의 중쇄 및 경쇄는 불변 영역 및 가변 영역을 포함한다(영역은 "도메인"으로도 공지). 조합하여, 중쇄 및 경쇄 가변 영역은 항원에 특이적으로 결합한다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR(complementarity-determining region)"로도 불리는 3개의 초가변 영역에 의해 중단된 "프레임워크" 영역을 함유한다. 프레임워크 영역 및 CDR의 범위는 (Kabat et al.)(문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991] 참조) 및 ImMunoGeneTics 데이터베이스(IMGT)(문헌 [Lefranc, Nucleic Acids Res 29:207-9, 2001]; 및 imgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?_ livret=0&Option=humanIg 참조)에 따라 정의되었다. 카바트(Kabat) 데이터베이스는 온라인에서 유지되고 있다(ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). 상이한 경쇄 또는 중쇄의 프레임워크 영역의 서열은 인간과 같은 종 내에서 비교적 보존되어 있다. 항체의 프레임워크 영역, 즉, 구성 경쇄 및 중쇄의 조합된 프레임워크 영역은 3차원 공간에서 CDR을 위치시키고, 정렬시키는 역할을 한다.

CDR은 주로 항원의 에피토프에 결합하는 역할을 한다. 각 쇄의 CDR은 전형적으로 N-말단으로부터 시작하여 순차적으로 넘버링되는 CDR1, CDR2 및 CDR3으로 지칭되며, 또한 전형적으로 특정 CDR이 위치하는 쇄에 의해 식별된다. 따라서,V_H CDR3(또는 H-CDR3)은 그것이 발견되는 항체의 중쇄의 가변 도메인에 위치하는 한편, V_L CDR1(또는 L-CDR1)은 그것이 발견되는 항체의 경쇄의 가변 도메인의 CDR1이다. PD-1, PD-L1 또는 PD-L2에 결합하는 항체는 예를 들어, 특정 V_H 영역 및 V_L 영역 서열, 따라서, 특정 CDR 서열을 가질 것이다. 상이한 특이성(즉, 상이한 항원에 대한 상이한 조합 부위)을 갖는 항체는 상이한 CDR을 갖는다. 항체마다 항체가 상이한 CDR이지만, CDR 내의 제한된 수의 아미노산 위치만이 항원 결합에 직접 관여한다. CDR 내의 이러한 위치를 특이성 결정 잔기(SDR: specificity determining residue)라고 한다.

"V_H" 또는 "VH"에 관한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 것을 포함하여 면역글로불린 중쇄의 가변 영역을 지칭한다. "V_L" 또는 "VL"에 관한 언급은 Fv, scFv, dsFv 또는 Fab의 것을 포함하여 면역글로불린 경쇄의 가변 영역을 지칭한다.

"단일클론 항체"는 B 림프구의 단일 클론에 의해 또는 단일 항체의 경쇄 및/또는 중쇄 유전자가 형질감염된 세포에 의해 생성된 항체이다. 단일클론 항체는 당업자에게 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 면역 비장 세포와 골수종 세포의 융합으로부터 하이브리드 항체 형성 세포를 제조함으로써 생성된다. 단일클론 항체는 인간화 단일클론 항체를 포함한다.

"키메라 항체"는 예컨대, 인간과 같은 하나의 종으로부터의 프레임워크 잔기, 및 PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3 또는 4-1BB 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 예컨대, 뮤린 항체와 같은 또 다른 종으로부터의 CDR(일반적으로 항원 결합을 부여)을 갖는다.

"인간" 항체(또한 "완전 인간" 항체라고도 함)는 인간 프레임워크 영역 및 인간 면역글로불린으로부터의 모든 CDR을 포함하는 항체이다. 한 예에서, 프레임워크 및 CDR은 동일한 기원의 인간 중쇄 및/또는 경쇄 아미노산 서열로부터 유래한다. 그러나, 하나의 인간 항체로부터의 프레임워크는 상이한 인간 항체로부터의 CDR을 포함하도록 조작될 수 있다. "인간화" 면역글로불린은 인간 프레임워크 영역 및 비인간(예를 들어, 마우스, 래트, 또는 합성) 면역글로불린으로부터의 하나 이상의 CDR을 포함하는 면역글로불린이다. CDR을 제공하는 비인간 면역글로불린은 "공여자"로 명명되고, 프레임워크를 제공하는 인간 면역글로불린은 "수용자"로 명명된다. 한 실시양태에서, 모든 CDR은 인간화 면역글로불린에서 공여자 면역글로불린으로부터 유래한다. 불변 영역은 존재할 필요는 없지만, 존재하는 경우, 인간 면역글로불린 불변 영역과 실질적으로 동일하여야 하고, 즉, 적어도 약 85-90%, 예컨대, 약 95% 또는 그 초과로 동일하여야 한다. 따라서, 가능하게는 CDR을 제외한 인간화 면역글로불린의 모든 부분은 천연 인간 면역글로불린 서열의 상응하는 부분과 실질적으로 동일하다. "인간화 항체"는 인간화 경쇄 및 인간화 중쇄 면역글로불린을 포함하는 항체이다. 인간화 항체는 CDR을 제공하는 공여자 항체와 동일한 항원에 결합한다. 인간화 면역글로불린 또는 항체의 수용자 프레임워크는 공여자 프레임워크에서 취한 아미노산에 의한 제한된 수의 치환을 가질 수 있다. 인간화 또는 다른 단일클론 항체는 추가의 보존적 아미노산 치환을 가질 수 있으며, 이는 항원 결합 또는 다른 면역글로불린 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 인간화 면역글로불린은 유전 공학에 의해 구성될 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호 참조).

항원: 동물에 주사 또는 흡수되는 조성물을 포함하여, 동물에서 항체 또는 T 세포 반응의 생성을 자극할 수 있는 화합물, 조성물, 또는 물질. 항원은 이종 면역원에 의해 유도된 것을 포함하여 특정 체액성 또는 세포성 면역의 생성물과 반응한다. 용어 "항원"은 관련된 모든 항원성 에피토프를 포함한다. "에피토프" 또는 "항원성 결정기"는 B 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 상의 부위를 지칭한다. 한 실시양태에서, 에피토프가 MHC 분자와 함께 제시될 때 T 세포는 에피토프에 반응한다. 에피토프는 인접 아미노산 또는 단백질의 3차 폴딩에 의해 병치되는 비인접 아미노산, 둘 모두에 의해 형성될 수 있다. 인접 아미노산으로 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매에 노출될 때 유지되는 반면, 3차 폴딩에 의해 형성된 에피토프는 전형적으로 변성 용매로 처리시 손실된다. 에피토프는 전형적으로 고유한 공간적 입체형태로 적어도 3개, 및 더욱 일반적으로, 적어도 5, 약 9, 또는 약 8-10개의 아미노산을 포함한다. 에피토프의 공간적 입체형태를 결정하는 방법은 예를 들어, x선 결정법 및 2차원 핵자기 공명을 포함한다.

항원 제시 세포(APC): MHC 클래스 I 또는 클래스 II 분자에 결합된 항원을 T 세포에 제시할 수 있는 세포. APC는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, B 세포, T 세포 및 랑게르한스 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 T 세포(CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포 포함)에 항원을 제시할 수 있는 T 세포는 항원 제시 T 세포(T-APC: antigen presenting T cell)이다.

B- 및 T- 림프구 감쇠인자 ( BTLA ): CD272로도 공지된 단백질. BTLA 발현은 T 세포의 활성화 중에 유도되고, BTLA는 Th1 세포 상에 발현된 상태로 유지된다. BTLA는 B7 상동체인 B7H4와 상호작용하고, 종양 괴사 패밀리 수용체와의 상호작용을 통해 T 세포 억제에서 역할을 한다. BTLA는 헤르페스 바이러스 진입 매개 인자(HVEM: herpes virus entry mediator)로도 공지된 종양 괴사 인자(수용체) 슈퍼 패밀리 구성원 14(TNFRSF14)에 대한 리간드이다. BTLA-HVEM 복합체는 T 세포 면역 반응을 음성적으로 조절한다. 특정의 비제한적인 BTLA 아미노산 서열, 및 BTLA를 코딩하는 mRNA 서열은 2016년 9월 1일자로 GENBANK® 수탁 번호 NM_001085357(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 제공된다. BTLA 길항제는 예를 들어, BTLA에 특이적으로 결합하고, 종양 괴사 인자 수용체에 대한 BTLA의 결합을 억제함으로써, BTLA의 발현 또는 활성을 감소시키거나, BTLA의 T 세포 억제 기능을 억제하는 작용제를 포함한다. 예시적인 화합물은 항체(예를 들어, 항BTLA 항체), RNAi 분자, 안티센스 분자, 및 우성 음성 단백질을 포함한다.

결합 또는 안정한 결합(올리고뉴클레오티드): 충분한 양의 올리고뉴클레오티드가 염기쌍을 형성하거나, 또는 그의 표적 핵산에 하이브리드화되어 그 결합의 검출을 허용한다면, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산에 결합, 또는 안정적으로 결합하는 것이다. 결합은 표적:올리고뉴클레오티드 복합체의 물리적 또는 기능적 특성에 의해 검출될 수 있다. 표적과 올리고뉴클레오티드 사이의 결합은 기능적 및 물리적 결합 검정법, 둘 모두를 포함하여, 당업자에게 공지된 임의의 절차에 의해 검출될 수 있다. 예를 들어, 결합이 유전자의 발현, DNA 복제, 전사, 번역 등과 같은 생합성 프로세스에 대해 관찰가능한 효과를 갖는지 여부를 결정함으로써 결합을 기능적으로 검출할 수 있다.

DNA 또는 RNA의 상보적 가닥의 결합을 검출하는 물리적 방법은 당업계에 널리 공지되어 있으며, DNase I 또는 화학적 풋프린팅, 겔 이동 및 친화도 절단 검정법, 노던 블롯팅, 도트 블롯팅 및 광 흡수 검출 절차와 같은 방법을 포함한다. 예를 들어, 간단하고 신뢰할 수 있기 때문에 널리 사용되는 한 가지 방법은 온도가 서서히 증가하면서 220 내지 300 nm에서 올리고뉴클레오티드(또는 유사체) 및 표적 핵산을 함유하는 용액의 광 흡수 변화를 관찰하는 것을 포함한다. 올리고뉴클레오티드 또는 유사체가 그의 표적에 결합한 경우, 올리고뉴클레오티드(또는 유사체)와 표적이 서로 해리되거나 용융되면서 특징적인 온도에서 흡수가 갑자기 증가한다.

올리고머와 그의 표적 핵산 사이의 결합은 빈번하게 올리고머의 50%가 그의 표적으로부터 용융되는 온도(Tm)에 의해 특징화된다. (T_m)이 더 높다는 것은 (T_m)이 더 낮은 복합체에 비해 더 강하거나, 더욱 안정적인 복합체라는 것을 의미한다.

결합 친화도: 항원에 대한 항체의 친화도. 한 실시양태에서, 친화도는 문헌 [Frankel et al., Mol . Immunol ., 16:101-106, 1979]에 기술된 스캐차드(Scatchard) 방법의 변형에 의해 계산된다. 다른 실시양태에서, 결합 친화도는 항원/항체 해리 속도에 의해 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 높은 결합 친화도는 경쟁 방사성면역검정법에 의해 측정된다. 또 다른 실시양태에서, 결합 친화도는 ELISA에 의해 측정된다. 항원(예컨대, PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, 4-1BB 또는 OX-40 폴리펩티드)과 "특이적으로 결합하는" 항체는 항원에 높은 친화도로 결합하고, 다른 비관련 항원에 유의적으로 결합하지 않는 항체이다.

암 치료제: 대상체에서 암을 치료하는 데 사용되는 임의의 작용제. 암 치료제는 체크포인트 억제제, 생물학적 반응 개질제(예를 들어, 사이토카인 및 케모카인), 암 백신, 화학요법 및/또는 방사선을 포함한다.

CD4: MHC 클래스 II 분자와의 상호작용을 매개하는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원인 T 세포 표면 단백질. 그의 표면에 CD4 분자(CD8이 아님)를 제시하는 T 세포는 MHC 클래스 I이 아닌 MHC II에 의해 제시되는 항원에 특이적이다(MHC 클래스 II 제한). MHC 클래스 I는 β-2 마이크로글로불린을 포함한다. CD4의 짧은 세포질/세포내 테일(C)은 티로신 키나제 Lck를 동원하고, 상호작용할 수 있도록 허용하는 아미노산 서열을 포함한다. CD4는 T 세포 수용체(TCR)의 공동 수용체이며, TCR이 항원 제시 세포와 소통하는 것을 돕다. 예시적인 CD4 서열은 2021년 4월 18일자로 GNABANK 수탁 번호 NM_000616.5 및 NM_001195014.3(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.

CD8: T 세포 수용체(TCR)에 대한 공동 수용체 역할을 하는 막횡단 당단백질. CD8 공동 수용체는 T 세포 신호전달에 역할을 하고, 세포독성 T 세포 항원 상호작용을 지원한다. CD8은 주요 조직적합성 복합체(MHC: major histocompatibility complex) 분자에 결합하지만, MHC 클래스 I 단백질에 특이적이다. 단백질에는 알파와 베타라는 2가지 이소폼이 있으며, 각각 다른 유전자에 의해 코딩된다. 인간의 경우, 두 유전자는 모두 염색체 2번의 2p12 위치에 있다.

CD39( ENTPD1 ): 2개의 막횡단 도메인과 큰 세포외 영역을 가진 내재성 막 단백질(문헌 [Maliszewski et al, 1994]). 이는 인간 림프구 상의 활성화 마커 및 혈관 엑토-ADPase로 처음 확인되었다(문헌 [Kaczmarek E et al. (1996) Biol Chem]). 용어 "CD39"는 또한 엑토뉴클레오시드 트리포스페이트 디포스포하이드롤라제-1(ENTPD1: ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolase-1)로 명명된 CD39 단백질을 나타낸다. 생체내 CD39는 조절 T 세포(Treg 세포), B 세포 및 여러 선천성 면역 세포에서 발현된다. 이는 아데노신 트리포스페이트(ATP: adenosine triphosphate)와 아데노신 디포스페이트(ADP: adenosine diphosphate)의 아데노신 모노포스페이트(AMP: adenosine monophosphate)(이는 이어서 엑토-5'-뉴클레오티다제인 CD73에 의해 아데노신으로 프로세싱)로의 가수분해를 통하여 면역 억제에 중요한 역할을 한다. 아데노신은 T 세포 상의 A2A 수용체에 결합을 통해 세포 내 cAMP의 축적을 증진시켜 T 세포 활성화를 방지하는 강력한 면역조절제이다(문헌 [Deaglio S et al., JEM, 2007]). CD39 및 CD73, 둘 모두의 발현은 여러 인간 고형 악성 종양에서 증가한다(문헌 [Antonioli Luca et al., Trends Mol Med, 2013]). 저산소 환경에서 두 효소 모두의 상향조절이 선호되며, 이들의 순차적인 협동 작용은 종양 면역회피에 역할을 할 수 있다(문헌 [Eltzschig HK et al., Blood 2009]; [Ghiringhelli F et al., J Biomed Biotech, 2012]). 특정의 비제한적 CD39 아미노산 서열, 및 CD39를 코딩하는 mRNA 서열은 2017년 5월 1일자로 GENBANK® 수탁 번호 NM_001776(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.

CD103: 인테그린 알파 E(ITGAE: integrin alpha E)로 공지된 CD103은 인테그린 베타 7(β7-ITGB7)에 결합하여 이종이량체 인테그린 분자 αEβ7을 형성한다. αEβ7의 주요 리간드는 상피 세포에서 발견되는 부착 분자인 E-카드헤린이다. 이는 장 부위로의 T 세포 귀소 및 조직 상주 기억(T_RM: tissue-resident memory) 세포의 보유에 중요하다. 생체내에서, CD103은 장내 수지상 세포의 서브세트, 및 조직 상주 기억 세포(T_RM)로서 특징화된 말초 조직 상에 존재하는 T 세포 집단 상에서 발현된다(문헌 [Schenkel JM et al., Immunity, 2014]; [Mueller SN et al., Nat Rev Immunol, 2015]). CD103은 또한 고등급 장액성 난소암, 폐암, 방광의 요로 세포 암종 및 자궁내막 암종에서 CD8 T 세포의 서브세트 상에서 발현된다(문헌 [Webb JR et al., Clin Cancer Res, 2014]; [Webb JR et al., Cancer Immunol Res, 2015]; [Komdeur FL et al., Oncotarget, 2016]; [Djenidi F et al., J Immunol, 2015]; [Wang B et al., J Urol, 2015]; [Workel HH et al, EJC, 2015]). 상기 악성 종양에서, CD103+ CD8 T 세포는 종양 내에 우선적으로 위치하므로, 종양 세포와의 직접적인 상호작용을 선호한다. CD103+ CD8 T 세포는 그의 리간드 PD-L1과의 상호작용 시 T 세포 증식, 생존 및 이펙터 기능의 억제를 초래하는 활성화/고갈 표면 분자인 PD-1을 높은 수준으로 발현한다(문헌 [Webb JR et al., Cancer Immunol Res, 2015]). 특정의 비제한적 CD103 아미노산 서열, 및 CD103을 코딩하는 mRNA 서열은 2017년 5월 20일자로 GENBANK® 수탁 번호 NM_002208(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.

체크포인트 억제제: 면역 반응을 약화시키는 면역계 조절자를 표적화하는 암 면역요법. 체크포인트 억제제는 림프구 활성화 유전자 3(LAG3), T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3), CTLA4(이필리무맙, YERVOY®), PD-1, 및 PD-L1과 같은 분자를 표적화하는 분자를 포함한다. 펨브로리주맙(KEYTRUDA®) 및 니볼루맙(OPDIVO®)은 FDA 승인 체크포인트 억제제이다.

화학요법제: 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질환의 치료에서 치료 유용성을 갖는 임의의 화학 작용제. 상기 질환으로는 종양, 신생물, 및 암 뿐만 아니라, 예컨대, 건선과 같은 과형성 성장을 특징으로 하는 질환을 포함한다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 방사성 화합물이다. 당업자는 유용한 화학요법제를 쉽게 확인할 수 있다(예를 들어, 문헌 [Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition]; [Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2^nd ed., ⓒ 2000 Churchill Livingstone, Inc]; [Baltzer, L., Berkery, R. (eds.): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995]; [Fischer, D.S., Knobf, M.F., Durivage, H.J. (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993] 참조). 조합 화학요법은 암을 치료하기 위해 1 초과의 작용제의 투여이다. 한 예는 세포, 방사성 화합물, 또는 화학 화합물과 조합하여 사용되는 PD-1, PD-L1, 또는 CTLA-4 폴리펩티드에 결합하는 항체의 투여이다.

보존적 변이체: "보존적" 아미노산 치환은 항체와 같은 단백질의 친화도에 실질적으로 영향을 미치거나 감소시키지 않는 치환이다. 예를 들어, PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3 CTLA-4, 4-1BB, 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 인간 항체는 최대 약 1, 최대 약 2, 최대 약 5, 및 최대 약 10, 또는 최대 약 15개의 보존적 치환을 포함하고, PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4, 4-1BB 또는 OX40 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있다. 용어 보존적 변이는 또한 항체가 PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4, 4-1BB 또는 OX40 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다면, 비치환된 모체 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용을 포함한다. 비보존적 치환은 PD-1, PD-L1, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4, 4-1BB, 또는 OX40 폴리펩티드에 대한 활성 또는 결합을 감소시키는 것들이다.

기능적으로 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 아미노산 치환 표는 당업자에게 널리 공지되어 있다. 하기 6개 그룹은 서로 보존적 치환으로 간주되는 아미노산의 예이다:

1) 알라닌(A), 세린(S), 트레오닌(T);

2) 아스파르트산(D), 글루탐산(E);

3) 아스파라긴(N), 글루타민(Q);

4) 아르기닌(R), 리신(K);

5) 이소류신(I), 류신(L), 메티오닌(M), 발린(V); 및

6) 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 트립토판(W).

접촉: 직접적인 물리적 결합의 배치; 고체 및 액체 형태, 그 둘 모두를 포함한다.

대조군 수준(면역 파라미터): 예컨대, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포와 같은 면역 파라미터의 기준선 수준. 일부 실시양태에서, 대조군 수준은 치료제의 부재하에서 특정 유형의 세포와 같은 면역계의 성분의 수준이다. 대조군 수준은 관심 작용제로 처리되지 않은 대상체로부터의 샘플, 또는 대조군 작용제로 처리된 대상체로부터의 샘플에서 측정될 수 있다. 대조군 수준은 또한 시간에 따른 다수의 샘플의 평균으로부터 결정된 값과 같은 표준 값일 수 있다. 대조군 수준은 또한 특정 용량의 치료제로 처리된 대상체로부터의 샘플에서 측정될 수 있으며, 여기서 상기 용량은 대상체가 현재 평가 중인 시점에 대상체에게 투여되지 않는다. 대조군은 평가 중인 대상체에서 또는 상이한 대상체로부터의 것일 수 있다.

사이토카인: 용어 "사이토카인"은 나노몰 내지 피코몰 농도에서 체액성 조절제 역할을 하고, 정상 상태 또는 병리학적 상태에서 개별 세포 및 조직의 기능적 활성을 조정하는 다양한 그룹의 가용성 단백질 및 펩티드에 대한 일반 명칭으로 사용된다. 이 단백질은 또한 세포 사이의 상호작용을 직접적으로 매개하고, 세포외 환경에서 일어나는 프로세스를 조절한다. 사이토카인의 예로는 종양 괴사 인자 α(TNFα), 인터루킨(IL)-5, IL-10 및 IL-13을 포함하나, 이에 제한되지 않다.

C-X-C- 케모카인 수용체 5( CXCR5 ): 버킷 림프종 수용체(BLR1: Burkitt lymphoma receptor), CD185, MDR15 및 MGC117347로도 공지된 CXC 케모카인 수용체 패밀리의 구성원인 G 단백질 커플링된 수용체. 프로세싱되지 않은 CXCR5 전구체는 길이가 372개 아미노산이고, 분자량이 42kDa이다. 리간드는 B 세포 화학유인물질인 CXCL13으로도 공지된 BLC이다. 자연에서 CXCR5는 B 세포, 특히 천연 B 세포에서 발견된다. CXCR5의 세포외(EC) 도메인은 CXCL13 결합과 같은 특징과 특성을 유지한다. 가용성 CXCR5 분자는 본질적으로 CXCR5의 EC 도메인으로 구성될 수 있으며, 이는 일반적으로 분자의 처음 약 60개 아미노산을 포함하고, 즉, CXCR5의 아미노 말단부이다.

CXCR5는 비난잡한 수용체이다. CXCL13은 CXCR5의 리간드이며, 예컨대, 여포 수지상 세포와 같은 간질 세포 및 림프 조직에서 구성적으로 발현된다. 생체내에서 CXCL13은 B 세포 및 B 헬퍼 여포성 T 세포(TFH)라고 불리는 T 세포의 작은 서브세트를 특이적으로 유인한다.

2021년 5월 1일자로, CXCR5를 코딩하는 핵산 분자는 GENBANK® 수탁 번호 NM_001716으로서, 및 인간 CXCR5 단백질 서열은 GENBANK® 수탁 번호 NP_116743으로서 이용가능하다(상기 둘 모두 참조로 포함된다).

세포독성 T 림프구 연관 단백질 4( CTLA -4): CD152로도 공지된 단백질. CTLA-4는 면역글로불린 슈퍼패밀리의 구성원이다. CTLA-4는 면역 체크포인트 역할을 하여, 면역 반응을 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA-4는 조절 T 세포(Treg)에서 구성적으로 발현되며, 활성화 후 통상적인 T 세포에서 상향조절된다. CLTA4는 항원 제시 세포 표면의 CD80 또는 CD86과 결합하며, T 세포의 억제제이다. CTLA-4 단백질 및 CTLA-4를 코딩하는 mRNA의 구체적인 비제한적 예는 예를 들어, 2016년 10월 7일자로 GENBANK® 수탁 번호 NM_001037631(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. CTLA-4 길항제는 예를 들어, CTLA-4에 특이적으로 결합하고, 항원 제시 세포의 표면의 CD80 또는 CD86에 대한 CTLA-4의 결합을 억제함으로써 CTLA-4의 발현 또는 활성을 감소시키거나, CTLA-4의 T 세포 억제 기능을 억제하는 작용제를 포함한다. 예시적인 화합물은 항체(예컨대, 항CTLA-4 항체), RNAi 분자, 안티센스 분자, 및 우성 음성 단백질을 포함한다.

감소 또는 억제: 수, 양, 크기 또는 강도가 줄어들거나, 작아지게 하는 것. 한 예에서, 질환(예컨대, 종양 형성)의 위험을 감소 또는 억제시키는 것은 종양이 발생할 가능성을 적어도 약 20%만큼, 예를 들어, 적어도 약 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%만큼 감소시키는 것을 포함한다. 또 다른 예에서, 질환 위험을 감소 또는 억제시키는 것은 질환 발생을 지연시키는 것, 예를 들어, 적어도 약 6개월, 예컨대, 약 1년, 예컨대, 약 2년, 약 5년, 또는 약 10년 지연시키는 것을 포함한다.

한 예에서, 종양의 징후 및 증상을 감소 또는 억제시키는 것은 종양 또는 전이의 크기, 부피, 또는 수를 원하는 양만큼, 예를 들어, 치료 조성물 부재하에서의 반응과 비교하여 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 50%, 적어도 75%, 또는 심지어 적어도 90%만큼 감소시키는 것을 포함한다.

(세포 또는 생체 분자를) 검출하는 또는 검출: 연구 중인 생체분자 또는 특정 세포 유형, 예컨대, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재를 정량적으로 또는 정성적으로 결정하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 대상체로부터의 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재를 정량적으로 또는 정성적으로 결정하는 것. 일반적으로, 단백질, 핵산과 같은 생물학적 분자의 검출, 또는 특정 세포 유형 또는 세포 증식을 검출하기 위해서는 간단한 관찰이 아닌 생물학적 검정법을 수행하여야 한다. 예를 들어, 항체 또는 핵산 프로브(둘 모두 표지될 수 있음)를 사용하는 검정법은 각각 단백질 또는 세포를 검출하는 데 사용될 수 있다. 검출 검정법은 면역조직화학법 및 유세포 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

진단: 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 종양과 같은, 병리학적 상태의 존재 또는 성질을 확인하는 것. 진단 방법은 민감도와 특이성이 다르다. 진단 검정법의 "민감도"는 양성 반응을 보이는, 이환된 개체의 비율(%)(참 양성의 비율(%))이다. 진단 검정법의 "특이성"은 1에서 위 양성 비율을 뺀 값이며, 위 양성 비율은 양성 반응을 보이지만, 질환을 앓지 않는 개체의 비율로 정의된다. 특정 진단 방법이 병태의 결정적인 진단을 제공하지는 않을 수 있지만, 방법이 진단에 도움이 되는 양성 징후를 제공한다면 충분하다. "예후"는 병리학적 상태, 예컨대, 종양 또는 전이의 발생(예컨대, 중증도)의 확률이다. 진단 검정법은 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 검출하는 것을 포함할 수 있다.

DNA( 데옥시리보핵산 ): DNA는 대부분의 살아있는 유기체의 유전 물질을 구성하는 장쇄 중합체이다(일부 바이러스에는 리보핵산(RNA)을 포함하는 유전자를 갖는다). DNA 중합체에서 반복 단위는 4개의 상이한 뉴클레오티드이며, 이들 각각은 포스페이트 기가 부착된 데옥시리보스 당에 결합된 4가지 염기, 아데닌, 구아닌, 시토신 및 티민 중 하나를 포함한다. 삼중 뉴클레오티드(코돈으로 지칭)은 폴리펩티드의 각 아미노산 또는 정지 신호를 코딩한다. 코돈이라는 용어는 또한 DNA 서열이 전사되는 mRNA에서 3개의 뉴클레오티드의 상응하는(및 상보적인) 서열에 사용된다.

달리 명시되지 않는 한, DNA 분자에 대한 임의의 언급은 상기 DNA 분자의 역상보체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 단일 가닥이 요구되는 경우를 제외하고, DNA 분자는 단일 가닥만을 나타내도록 작성되더라도, 이중 가닥 DNA 분자의 두 가닥 모두를 포함한다.

코딩한다: 폴리뉴클레오티드는 그의 천연 상태에서 또는 당업자에게 널리 공지된 방법으로 조작되었을 때, 폴리펩티드 또는 그의 단편 및/또는 그들에 대한 mRNA을 생산하도록 번역 및/또는 전사될 수 있다면, 폴리펩티드를 코딩한다고 지칭된다. 안티센스 가닥은 상기 핵산의 상보체이며, 이로부터 코딩 서열이 추론될 수 있다.

배양 보조 세포(feeder cell): 세포층, 예컨대, 배양 디쉬의 바닥 위 세포층. 배양 보조 세포는 영양소, 성장 인자 및/또는 사이토카인을 배양 배지 내로 방출하고, 다른 세포, 예컨대, T 세포가 상호작용할 수 있는 기질을 제공할 수 있다. 세포는 조사될 수 있다. 한 실시양태에서, 배양 보조 세포는 조사된 동종이계의 말초 혈액 단핵 세포이다.

유도성 T 세포 공동자극인자 ( ICOS ): CD278로도도 공지된 단백질은 외래 항원에 대한 모든 기본 T 세포 반응, 즉, 증식, 림포카인 분비, 세포-세포 상호작용을 매개하는 분자의 상향조절을 증진시ㅣ고, B 세포에 의한 항체 분비에 효과적인 도움을 주는 단백질. 상기 인자는 또한 T 세포와 B 세포 사이의 효율적인 상호작용 및 T 세포 의존성 항원에 대한 정상적인 항체 반응을 촉진시킨다. ICOS에 대한 예시적인 아미노산 서열은 1999년 11월 1일자로 이용가능한 FASTA 수탁 번호 Q9Y6W8-1로 제공되며, 아미노산 및 핵산 서열은 2008년 10월 7일자로 이용가능한 GENBANK® 수탁 번호 AJ277832로 제공되며, 이들은 모두 본원에서 참조로 포함된다. ICOS는 활성화된 T 세포에서 발현된다.

면역 체크포인트 억제제: 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, T 세포 및 일부 암 세포와 같은 특정 유형의 면역계 세포에서 생물학적 경로를 차단하는 작용제의 한 유형. 이들 억제제는 T 세포가 암 세포를 사멸시키는 것을 억제한다. 체크포인트 억제제가 차단되면, 면역계에 대한 "억제"는 감소되고, T 세포는 그의 활성화 프로파일을 증가시켜 암 세포에 대한 T 세포 반응을 증가시킬 수 있다. T 세포 또는 암 세포 상에서 발견되는 체크포인트 단백질의 예로는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, 및 TIM-33을 포함한다.

면역 반응: 예컨대, B 세포, T 세포, 또는 단핵구와 같은 면역계의 세포의 자극에 대한 반응. 한 실시양태에서, 반응은 특정 항원에 특이적이다("항원 특이적 반응"). 한 실시양태에서, 면역 반응은 T 세포 반응, 예컨대, CD4+ 반응 또는 CD8+ 반응이다. 또 다른 실시양태에서, 반응은 B 세포 반응이며, 그 결과로 특정 항체가 생산된다.

질환을 억제 또는 치료: 예컨대, 종양 성장과 같은 질환을 억제시키는 것은 질환의 완전한 발생을 억제시키거나, 또는 질환 과정의 생리학적 효과를 감소시키는 것을 지칭한다. 몇몇 예에서, 질환을 억제 또는 치료하는 것은 종양의 증상을 감소시키는 것을 지칭한다. 예를 들어, 암 치료는 암을 앓는 것으로 알려진 사람에서 부신생물 증후군의 발병을 예방하거나, 종양의 징후 또는 증상을 감소시킬 수 있다. "치료"는 질환 또는 질환과 관련된 병리학적 상태의 징후 또는 증상을 호전시키는 치료적 중재를 지칭한다. 대상체는 무증상일 수 있는 바, 이에 치료는 증상의 발병을 예방한다. "호전시킨다"는 것"은 예컨대, 종양과 같은 질환의 징후 또는 증상의 수 또는 중증도를 감소시키는 것을 지칭한다.

인터류킨 (IL): 처음에 백혈구(white blood cell)(백혈구(leukocyte))에 의해 발현되는 것으로 관찰된 사이토카인 그룹(분비된 단백질 및 신호 분자)이다. IL-10은 활성화된 대식세포 및 헬퍼 T 세포에 의해 생산되는 IFN-감마, IL-2, IL-3, TNF 및 GM-CSF를 비롯한 다수의 사이토카인의 합성을 억제시키는 단백질이다. 구조적으로 IL-10은 이황화 결합에 관여하는 4개의 보존된 시스테인을 포함하는 약 160개의 아미노산으로 구성된 단백질이다. 인간 IL-10에 대한 예시적인 단백질 서열은 2021년 5월 1일자로 이용가능한 GENBANK 수탁 번호 NP_000563(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. IL-2는 면역을 담당하는 백혈구(백혈구, 종종 림프구)의 활성을 조절하는 15.5-16 kDa 단백질이다. 생체내에서, IL-2의 주요 공급원은 활성화된 CD4+ T 세포 및 활성화된 CD8+ T 세포이다. IL-2는 알파(CD25), 베타(CD122) 및 감마(CD132)라고 불리는 3개의 쇄로 구성된 복합체인 IL-2 수용체를 통해 신호를 전달한다. 감마 쇄는 모든 패밀리 구성원이 공유한다. 인간 IL-2에 대한 예시적인 단백질 서열은 2021년 5월 1일자로 이용가능한 GENBANK 수탁 번호 NP_000577(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 동종이량체인 IL-5는 호산구 분화 인자(EDF: eosinophil differentiation factor)로도 공지되어 있다. 이 사이토카인은 2형 T 헬퍼 세포 및 비만 세포에 의해 생산되고, 림프구 활성화의 매개인자이다. 또한 B 세포 성장을 자극하고, 면역글로불린 분비를 증가시킨다. 인간 IL-5에 대한 예시적인 단백질 서열은 2021년 5월 1일자로 이용가능한 GENBANK 수탁 번호 NP_000870(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. IL-13은 염증 및 면역 반응의 조절에서 역할을 하는 다면발현성 사이토카인이다. IL-13의 신호전달은 IL-4와 공유된 다중 서브유닛 수용체를 통해 시작된다. 이 수용체는 알파 IL-4 수용체(IL-4Rα)와 알파 인터루킨-13 수용체(IL-13R1)로 구성된 이종이량체 수용체 복합체이다. IL-13의 생물학적 효과의 대부분은 전사 신호 전달 인자 및 활성 인자6(STAT6: signal transducer and activator of transcription 6)과 연결되어 있다. 인간 IL-13에 대한 예시적인 단백질 서열은 2021년 5월 1일자로 이용가능한 GENBANK 수탁 번호 NP_002179(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. IL-15는 IL-2/IL-15 수용체 베타 쇄(CD122) 및 공통 감마 쇄(감마-C, CD132)로 구성된 복합체에 결합하고, 이를 통해 신호를 전달한다. IL-15는 바이러스(들) 감염 후 단핵 식세포(및 일부 다른 세포)에 의해 분비된다. IL-15는 인간 염색체 4q31의 34 kb 영역에 의해 코딩되는 14-15 kDa 당단백질이다. 인간 IL-15 유전자는 9개의 엑손(1-8 및 4A) 및 8개의 인트론으로 구성되며, 그 중 4개(엑손 5 내지 8)는 성숙한 단백질을 코딩한다. IL-15에 대한 예시적인 아미노산 서열은 2021년 5월 3일자 GENBANK 수탁 번호 NP_000576.1(이는 본원에서 참조로 포함된다)에서 살펴볼 수 있다.

단리된: 예컨대, 핵산, 단백질(항체 포함) 또는 세포와 같은 "단리된" 생물학적 성분은 성분이 자연적으로 발생하는 환경의 다른 생물학적 성분(예컨대, 다른 세포), 즉, 다른 염색체 및 염색체외 DNA 및 RNA, 단백질 및 세포소기관과 실질적으로 분리되거나, 또는 정제되어 있다. "단리된" 핵산, 단백질 및 세포는 표준 정제 방법에 의해 정제된 핵산, 단백질 및 세포를 포함한다. 상기 용어는 또한 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질 뿐만 아니라, 화학적으로 합성된 핵산을 포함한다. 세포와 관련하여, 단리된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ 세포는 시험관내 배양물에서 증식될 수 있다.

림프구: 신체의 면역 방어에 관여하는 일종의 백혈구 유형. 림프구에는 두 가지 주요 유형: B 세포 및 T 세포가 존재한다.

림프구 활성화 유전자 3( LAG3 ): 인간에서 CD223으로도 불리는 LAG3 유전자에 의해 코딩되는 단백질. LAG-3은 T 세포 기능에 대한 다양한 생물학적 효과를 갖는 세포 표면 분자이며, 면역 체크포인트 수용체이다. LAG3은 T 세포의 세포 증식, 활성화, 및 항상성을 음성으로 조절하고, Treg 억제 기능에서 역할을 하는 것으로 보고되었다. 인간 LAG3을 코딩하는 예시적인 아미노산 및 mRNA는 2017년 4월 9일자로 GENBANK® 수탁 번호 NM_002286.5(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.

포유동물: 본 용어는 인간 및 비인간 포유동물, 둘 모두를 포함한다. 유사하게, 용어 "대상체"는 인간 및 수의학적 대상체, 둘 모두를 포함한다.

평균 형광 강도( 유세포 분석법): 유세포 분석법은 산란된 레이저 광 또는 형광색소에 의해 방출되는 형광에 관계 없이 세포 또는 입자의 광 강도 측정에 관한 것이다. 광은 광전 증폭관(PMT: photomultiplier tube)에 의해 감지되어, 증폭기를 통해 원래의 형광 강도에 비례하는 전압과 PMT의 전압으로 변환된다. 연속 분포인 상기 전압은 아날로그 디지털 변환기(ADC: Analog to Digital Converter)에 의해 이산형 분포로 변환되어 형광 수준에 따라 각 신호를 특정 채널에 배치한다. 이는 ADC의 분해능이 클수록 이를 반영하는 연속 분포에 더 가깝다.

유세포 분석 데이터는 선형 또는 로그 스케일을 사용하여 표시할 수 있다. 로그 스케일의 사용은 분포가 오른쪽으로 치우친 대부분의 생물학적 상황에서 나타난다. 이 경우 분포를 정규화하는 효과가 있으며 - 이는 로그 정규라고 하며, 데이터가 로그 변환된다. 선형 신호는 선형 증폭기를 통과하지만, 로그 변환은 로그 증폭기 또는 참조표(LUT: Look Up Table)를 사용하여 수행할 수 있다. 분석 세포계측기의 대부분의 ADC는 10비트이고, 즉, 이들은 데이터를 2e10 또는 1024 채널로 나누지만, 12비트 또는 14비트 ADC를 사용하여 데이터의 분해능을 높이는 추세가 증가하고 있다.

단일 데이터 채널(산란 또는 형광)의 데이터는 x 축이 1024 채널(10비트 ADC의 경우)로 나누어진 히스토그램으로 표시된다. 데이터가 선형 스케일이면 채널 번호와 해당 채널의 선형 값을 쉽게 얻을 것이다. 로그 스케일에서, x 축은 여전히 1024개의 채널로 나누어지지만, 5-log 10 스케일로 표시된다(일반적으로 5-log 10 사용).

유세포 분석 데이터를 정량화하기 위해, 모집단 분포의 척도가 사용된다. 일반적으로, 중심 경향의 척도는 평균과 중앙값이다. 평균(mean)은 '평균(average)'이며, 산술 또는 기하 평균일 수 있다. 산술 평균은 Σ (x)/n으로, 기하 평균은 (a1 x a2 x a3....an)의 n 제곱근으로 계산된다. 일반적으로 로그 증폭 데이터의 경우, 데이터 분포의 가중치를 고려할 때, 기하 평균이 사용되며, 산술 평균은 선형 데이터 또는 선형 스케일로 표시되는 데이터에 사용된다. 중앙값은 중심 값, 즉, 50번째 백분위 수이며, 여기서 값의 절반은 높고 절반은 낮다. "높은" 발현 및 "낮은" 발현을 갖는 세포는 전체 집단의 형광에 따라 상대적으로 결정될 수 있으며; 이들 파라미터는 유세포 분석 데이터의 플롯에 쉽게 시각화된다.

배지(조직 배양 또는 세포 배양): 특정 세포 집단의 성장(세포 증식/확장)을 지원하는데 필요한 영양소를 갖는 합성 배양 조건 세트. 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함한다. 한 실시양태에서, 성장 배지는 세포 성장을 증진시키기 위해 다양한 영양소가 보충된 최소 필수 배지, 예컨대, RPMI를 함유한다. 추가로, 최소 필수 배지는 예컨대, 인간, 송아지 또는 우태아 혈청과 같은 첨가제로 보충될 수 있다.

OX40: OX40 수용체("OX40")(문헌 [Paterson et al. (1987) Mol . Immunol . 24:1281-1290]; [Calderhead et al. (1993) J. Immunol . 151:5261-5271])는 (활성화 여부와 상관 없이) T 세포의 많은 서브클래스 표면에 존재하는 CD28 수용체와는 달리, 생체내에서 항원 활성화 CD4⁺ T 세포에만 존재하는 것으로 나타났다(문헌 [Weinberg et al. (1994) J. Immunol . 152:4712-4721]; [Weinberg et al. (1996) Nature Medicine 2:183-189]). 예를 들어, OX40은 자가면역 질환의 염증 부위에서 자가항원을 인식하지만, 말초에서는 인식하지 못하는 활성화된 CD4⁺ T 세포에 존재한다. OX40은 또한 두부경부 편평 세포 종양 및 흑색종 환자로부터 제거된 종양 침윤 림프구 및 배수 림프절 세포로부터 단리된 일정 비율의 CD4⁺ T 세포의 표면에 존재하는 것으로 나타났다(문헌 [Vetto et al. (1997) Am. J. Surg . 174:258-265]). 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리의 구성원인 OX40 리간드는 항CD3 항체로 활성화된 T 세포를 공동 자극하는 것으로 (즉, 비항원 특이적 방식으로) 나타났다(문헌 [Godfrey et al. (1994) J. Exp . Med . 180:757-762]).

비경구: 예컨대, 소화관을 통하지 않고 장 밖에 투여. 일반적으로, 비경구용 제제는 섭취를 제외한 임의의 가능한 방식을 통해 투여되는 제제이다. 이 용어는 특히 정맥내, 척수내, 근육내, 복강내, 관절내, 또는 피하로 투여되는 주사, 및 예를 들어, 비내, 피내 및 국소 적용을 포함하는 다양한 표면 적용을 지칭한다.

약제: 대상체 또는 세포에 적절하게 투여될 때 원하는 치료 또는 예방 효과를 유도할 수 있는 화학 화합물 또는 조성물.

약학적으로 허용되는 담체: 유용한 약학적으로 허용되는 담체는 통상적이다. 문헌 [Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 22 ^nd ed., London, UK: Pharmaceutical Press (2013)]에는 본원에 개시된 항체의 약학적 전달에 적합한 조성물 및 제제가 기술되어 있다.

일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 모드에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, 비경구용 제제는 일반적으로 비히클로서 물, 생리 염수, 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약학적 및 생리학적으로 허용되는 유체를 포함하는 주사용 유체를 포함한다. 고체 조성물(예컨대, 산제, 환제, 정제, 또는 캡슐 형태)의 경우, 통상적인 비독성 고체 담체는 예를 들어, 약학 등급의 만닛톨, 락토스, 전분, 또는 스테아르산 마그네슘을 포함할 수 있다. 생물학적 중성 담체 이외에, 투여되는 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예컨대, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충화제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 함유할 수 있다.

폴리뉴클레오티드: 용어 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 서열은 적어도 10개의 염기 길이의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 지칭한다. 재조합 폴리뉴클레오티드는 그의 유래 기점이 되는 유기체의 자연 발생 게놈에서 바로 인접한 코딩 서열, 둘 모두(5' 단부에 하나 및 3' 단부에 하나)에 바로 인접하지 않는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 그러므로, 상기 용어는 예를 들어, 벡터에; 자율 복제 플라스미드 또는 바이러스에; 또는 원핵생물 또는 진핵생물의 게놈 DNA에 도입되거나, 다른 서열과 독립적인 별도의 분자(예컨대, cDNA)로서 존재하는 재조합 DNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 또는 어느 한 뉴클레오티드의 변형된 형태일 수 있다. 이 용어는 단일 가닥 및 이중 가닥 형태의 DNA를 포함한다.

폴리펩티드: 길이 또는 번역 후 변형(예컨대, 글리코실화 또는 인산화)에 관계 없이, 임의의 아미노산 쇄. 폴리펩티드는 3 내지 30개 아미노산 길이일 수 있다. 한 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 7 내지 약 25개의 아미노산 길이이다. 또 추가의 또 다른 실시양태에서, 폴리펩티드는 약 8 내지 약 10개의 아미노산 길이이다. 추가의 또 다른 실시양태에서, 펩티드는 약 9개의 아미노산 길이이다. 폴리펩티드와 관련하여, "포함하다"는 추가의 아미노산 서열 또는 다른 분자가 분자에 포함될 수 있음을 나타내고, "~로 본질적으로 이루어진다"는 추가의 아미노산 서열이 분자에 포함되지 않지만, 다른 작용제(예를 들어, 표지 또는 화합물)는 포함될 수 있다는 것을 나타내고, "~로 이루어진다"는 추가 아미노산 서열 및 추가 작용제가 분자에 포함되지 않음을 나타낸다.

프로그래밍된 세포 사멸 단백질(PD)-1: PD-1 분자는 면역글로불린 유전자 슈퍼 패밀리의 구성원이다. 인간 PD-1은 면역글로불린 슈퍼패밀리 도메인을 함유하는 세포외 영역, 막횡단 도메인, 및 면역수용체 티로신 기반 억제 모티프(ITIM; immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif)를 포함하는 세포내 영역을 갖는다(문헌 [Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992]; [Shinohara et al., Genomics 23:704, 1994]; 미국 특허 제5,698,520호(본원에서 참조로 포함된다)). 이러한 특징은 또한 gp49B, PIR-B, 및 살해 억제 수용체(KIR: killer inhibitory receptor)도 포함하는 면역억제 수용체라 불리는 더 큰 분자 패밀리를 정의한다(문헌 [Vivier and Daeron (1997) Immunol. Today 18:286]). 이론에 제한되지 않으면서, 이들 수용체의 티로실 인산화된 ITIM 모티프는 S112 함유 포스파타제와 상호작용하고, 이는 억제성 신호로 이어지는 것으로 간주된다. 이들 면역억제성 수용체의 서브세트는 KIR과 같은 주요 조직 적합성 복합체(MHC) 분자에 결합하고, 세포독성 T 림프구 관련 단백질 4(CTLA-4)는 B7-1 및 B7-2에 결합한다. 인간에서, PD-1은 본래는 활성화 유도된 아폽토시스가 이루어진 T 세포주에서 확인된 50-55 kDa 타입 I 막횡단 수용체이다. PD-1은 T 세포, B 세포, 및 대식세포 상에서 발현된다. PD-1에 대한 리간드는 B7 패밀리 구성원 PD-리간드 1(PD-L1, B7-H1로도 공지) 및 PD-L2(B7-DC로도 공지)이다.

생체내에서, PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 단핵구 상에서 발현된다. 실험 데이터는 중추 및 말초 면역 반응의 하향조절에서 PD-1과 그의 리간드의 상호 작용을 보여준다. 특히, PD-L1의 존재하에서 야생형 T 세포에서의 증식은 억제되지만, PD-1 결핍 T 세포에서는 증식이 억제되지 않는다. 추가로, PD-1 결핍 마우스는 자가면역 표현형을 나타낸다. 인간 PD-1의 예시적인 아미노산 서열은 문헌 [Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992; 문헌 [Shinohara et al. Genomics 23:704,1994]; 미국 특허 제5,698,520호에 기재되어 있다.

(예를 들어, 가교 또는 응집에 의한) PD-1의 결합은 면역 세포에서 억제성 신호의 전달로 이어져, 면역 세포 아네르기의 증가와 동시에 면역 반응의 감소를 초래한다. PD-1은 두 리간드, PD-L1 및 PD-L2에 결합하며, 이들 둘 모두는 B7 패밀리의 폴리펩티드의 구성원인 인간 PD-1 리간드 폴리펩티드이다.

PD-1 길항제는 PD 리간드 1(PD-L1) 또는 PD 리간드 2(PD-L2)의 발현 또는 활성을 감소시키거나, 또는 PD-1과 PD-L1, 또는 PD-L2 사이의 상호작용을 감소시키는 작용제를 포함한다. 예시적인 화합물은 항체(예컨대, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 및 항PD-L2 항체), RNAi 분자(예컨대, 항PD-1 RNAi 분자, 항PD-L1 RNAi, 및 항PD-L2 RNAi), 안티센스 분자(예컨대, 항PD-1 안티센스 RNA, 항PD-L1 안티센스 RNA, 및 항PD-L2 안티센스 RNA), 우성 음성 단백질(예컨대, 우성 음성 PD-1 단백질, 우성 음성 PD-L1 단백질, 및 우성 음성 PD-L2 단백질)을 포함하고, 예를 들어, PCT 공개 번호 2008/083174(이는 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다.

증식: 자손을 생산하기 위한 세포의 분열, 이는 당업계에 공지된 많은 방식으로 측정될 수 있다. 이는 총 세포 수를 계수하는 검정법, 특정 세포 유형의 세포 수를 계수하는 검정법, Ki-67 검정법, 티미딘 도입, 및 브로모데옥시우리 딘 검정법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 종양 세포의 증식은 정성적으로 및 정량적으로 평가될 수 있다.

정제된: 정제된이라는 용어는 절대 순도를 요구하지 않소; 오히려 상대적인 용어로 의도된다. 따라서, 예를 들어, 정제된 펩티드 제제는 펩티드 또는 단백질이 세포내 자연환경에 있는 것보다 더 농축된 것이다. 한 실시양태에서, 단백질 또는 펩티드가 제제의 총 펩티드 또는 단백질 함량의 적어도 50%를 나타내도록 제제가 정제된다. 실질적인 정제는 다른 단백질 또는 세포 성분으로부터의 정제를 의미한다. 실질적으로 정제된 단백질은 적어도 60%, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 순수하다. 따라서, 한 특정의 비제한적인 예에서, 실질적으로 정제된 단백질에는 다른 단백질 또는 세포 성분이 90% 없다.

샘플(생물학적 샘플): 체액, 조직, 세포, 및 그의 서브성분, 예컨대, DNA, RNA, 및 단백질을 포함하는 생물학적 샘플을 포함한다. 예를 들어, 일반적인 샘플은 종양 생검, 골수, 비장, 림프절, 혈액, 예컨대, 말초 혈액을 포함한다(그러나, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 단리될 수 있는 임의의 다른 공급원도 포함할 수 있으며, 조직 생검, 수술 표본, 미세 바늘 흡인물, 부검 물질 등을 포함).

특이적 결합제: 정의된 표적에만 실질적으로 결합하는 작용제. 한 실시양태에서, 특이적 결합제는 PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, 4-1BB 또는 OX-40 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 또는 다중클론 항체이다.

용어 "특이적으로 결합한다"는 예컨대, PD-1, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, 4-1BB 또는 OX-40 폴리펩티드와 같은 항원과 관련하여, 항체 또는 다른 리간드가 항원을 보유하는 세포 또는 조직과 전체적으로 또는 부분적으로 우선적인 결합을 하고, 항원이 결여된 세포 또는 조직과는 그러지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 분자와 비표적 세포 또는 조직 사이에서 어느 정도의 비특이적 상호 작용이 발생할 수 있다는 것도 인지된다. 그럼에도, 특이적 결합은 항원의 특이적 인식을 통해 매개되는 것으로 구별될 수 있다. 선택적으로 반응성인 항체는 항원에 결합하지만, 낮은 친화도로 그렇게 할 수 있다. 특이적 결합은 항체(또는 다른 리간드)와 항원이 결여된 세포 사이보다 항체(또는 다른 리간드)와 항원을 보유하는 세포 사이에 훨씬 더 강한 결합을 초래한다. 특이적 결합은 전형적으로 폴리펩티드가 결여된 세포 또는 조직과 비교하여 폴리펩티드를 보유하는 세포 또는 조직과 결합된 항체 또는 다른 리간드의 양(단위 시간당)을 2배 초과, 예를 들어, 5배 초과, 10배 초과, 또는 100배 초과 증가시킨다. 상기 조건하에서 단백질에 대한 특이적 결합은 특정 단백질에 대한 그의 특이성에 대해 선택된 항체를 필요로 한다. 다양한 면역검정 포맷은 특정 단백질과 특이적으로 면역반응성인 항체 또는 다른 리간드를 선택하는 데 적합하다. 예를 들어, 고상 ELISA 면역검정법은 단백질과 특이적으로 면역반응성인 단일클론 항체를 선택하기 위해 통상적으로 사용된다. 특이적 면역반응성을 결정하는 데 사용될 수 있는 면역검정 포맷 및 조건에 관한 설명은 문헌 [Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York (1988)]을 참조한다.

대상체: 인간 및 비인간 포유동물을 포함하여 인간 및 수의학적 대상체, 둘 모두를 포함하는 범주인 살아있는 다세포 척추동물 유기체.

T 세포: 면역 반응에 중요한 백혈구. T 세포는 CD4⁺ T 세포 및 CD8⁺ T 세포를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. CD4⁺ T 림프구는 그의 표면에 "분화 클러스터 4"(CD4)로 알려진 마커를 보유하는 면역 세포이다. 헬퍼 T 세포로도 알려진 이들 세포는 항체 반응 및 살해 T 세포 반응을 포함하여 면역 반응을 조정하는 데 도움을 준다. CD8⁺ T 세포는 "분화 클러스터 8"(CD8) 마커를 보유한다. 한 실시양태에서, CD8+ T 세포는 세포독성 T 림프구이다. 또 다른 실시양태에서, CD8+ 세포는 억제 T 세포이다. T 세포는 항원 제시 세포 상에 제시된 특정 관심 항원에 반응할 수 있을 때 "활성화"된다.

T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3): 인간에서 HAVCR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질. TIM3은 마우스에서 대식세포 활성화를 조절하고, 실험적 자가면역 뇌척수염의 중증도를 증진시키는 Th1 특이적 세포 표면 단백질인 면역 체크포인트이다. Tim-3 경로는 암에서 고갈된 CD8+ T 세포에서 PD-1 경로와 상호작용할 수 있다. 인간 TIM-3에 대한 예시적인 mRNA 및 단백질 서열은 2017년 4월 30일자 GENBANK® 수탁 번호 NM_032782.4(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.

치료 유효량: 치료되는 대상체에서 원하는 효과를 달성하기에 충분한 특정 물질, 예컨대, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 정량. 예를 들어, 이는 종양의 성장을 저해 또는 억제하는 데 필요한 양일 수 있다. 한 실시양태에서, 치료 유효량은 종양의 제거, 크기 감소, 또는 전이를 예방하는 데 필요한 양이다. 대상체에게 투여될 때, 원하는 시험관내 효과를 달성하는 것으로 나타난 표적 조직 농도(예를 들어, 종양에서)를 달성할 투여량이 일반적으로 사용될 것이다.

종양: 양성 또는 악성일 수 있는 세포의 비정상적인 성장. 암은 비정상적이거나 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 악성 종양이다. 종종 악성 종양과 연관된 다른 특징으로는 전이, 이웃 세포의 정상적인 기능 간섭, 비정상적인 수준의 사이토카인 또는 다른 분비 생성물의 방출, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화, 예컨대, 림프와 같은 주변 또는 원위 조직 또는 기관의 침범 등을 포함한다. "전이성 질환"은 원래의 종양 부위를 떠나 예를 들어, 혈류나 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 이동하는 암 세포를 지칭한다. 따라서, 전이성 암은 전이성 암이 유래된 원래(원발) 암의 기원 부위가 아닌 신체의 하나 이상의 부위에 발생한 암이다. 개체의 종양 양은 종양의 수, 부피 또는 중량으로 측정될 수 있는 "종양 부담"이다. 전이되지 않는 종양은 "양성"으로 지칭된다.

개체의 종양 양은 종양의 수, 부피 또는 중량으로 측정될 수 있는 "종양 부담"이다. 전이되지 않는 종양은 "양성"으로 지칭된다. 주변 조직을 침범하고/거나, 전이할 수 있는 종양은 "악성"으로 지칭된다. 혈액학적 종양의 예로는 급성 백혈병(예컨대, 11q23 양성 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수아세포성, 전골수구성, 골수단구성, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예컨대, 만성 골수구성(과립구성) 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 및 만성 림프구성 백혈병)를 포함한 백혈병, 진성 적혈구증가증, 림프종, 호지킨병, 비호지킨 림프종(지연형 및 고등급형), 다발성 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 병, 골수이형성 증후군, 털세포 백혈병 및 골수 이형성증을 포함한다.

예컨대, 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예로는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 활액종, 중피종, 유잉 종양, 평활근 육종, 횡문근 육종, 결장 암종, 림프계 악성 종양, 췌장암, 유방암(기저 유방 암종, 유관암종, 소엽 유방 암종 포함), 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 한선 암종, 갑상선 수질 암종, 유두 갑상선 암종, 크롬 친화성 세포종, 피지선 암종, 유두 암종, 유두 선암종, 수질 암종, 기관지 유래 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담관암종, 융모막 암종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 및 CNS 종양(예컨대, 신경교종, 성상세포종, 수아세포종, 두개인두종, 뇌실막세포종, 송과체종, 혈관아세포종, 청신경종, 핍지교종, 수막종, 흑색종, 신경아세포종 및 망막아세포종)을 포함한다.

"확립된" 또는 "기존" 종양은 진단 검사로 식별할 수 있는 기존 종양이다. 일부 실시양태에서, 확립된 종양은 촉진될 수 있다. 일부 실시양태에서, "확립된 종양"은 크기가 적어도 500 ㎣, 예컨대, 적어도 600 ㎣, 적어도 700 ㎣, 또는 적어도 800 ㎣이다. 다른 실시양태에서, 종양의 길이는 적어도 1 cm이다. 고형 종양과 관련하여 확립된 종양은 일반적으로 혈액 공급이 왕성하며, Treg 및 골수 유래 억제 세포(MDSC: myeloid derived suppressor cell)를 유도한다.

여러 예에서, 종양은 두부경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 또는 흑색종이다.

종양 괴사 인자( TNF )-α: 뚜렷한 막 TNF-α 수용체를 통해 효과를 발휘하는 사이토카인. 야생형 TNF는 주로 안정한 동종삼량체로 배열된 212개 아미노산으로 구성된 타입 II 막횡단 단백질로 생산된다. 수용성 동종삼량체 사이토카인(sTNF)은 메탈로프로테아제 TNF 알파 전환 효소(TACE: TNF alpha converting enzyme, ADAM17로도 불림)에 의해 막횡단 형태로부터 단백질분해 절단을 통해 방출된다. 분비된 형태와 막 결합 형태, 둘 모두 생물학적 활성을 갖고 있지만, 다른 활성을 갖고 있는 것으로 간주된다. TNF와 구조적으로 관련된 사이토카인인 림프톡신(LT)의 결정학적 연구에 따르면 두 사이토카인 모두 동종삼량체로 존재하며, 서브유닛은 에지 대 에지가 3중 대칭으로 패킹되어 있다.

TNF는 종양 괴사 인자 수용체 타입 1(TNFR1, CD120a 및 p55/60으로도 불림)과 종양 괴사 인자 수용체 타입 2(TNFR2, CD120b; p75/80으로도 불림)라는 두 가지 수용체에 결합할 수 있다. TNFR1은 55 kDa 단백질이고, TNFR2는 75 kDa 단백질이다. TNFR1은 대부분의 조직에서 발현되며, TNF의 막 결합 형태 및 가용성 삼량체 형태, 둘 모두에 의해 완전히 활성화될 수 있는 반면, TNFR2는 대부분 면역계의 세포에서 발견되며, TNF 동종삼량체의 막 결합 형태에 반응한다. TNF는 주로 활성화된 대식세포에 의해 생산된다. TNF-α와 그의 수용체의 결합은 2차 림프 기관의 구조적 및 기능적 조직화, 아폽토시스 및 항종양 활성, 바이러스 복제 억제, 면역조절 및 염증을 비롯한 다수의 필수 기능을 매개한다. TNF는 또한 자가면역 질환, 급성기 반응, 패혈성 쇼크, 발열 및 악액질의 발병에서 중요한 역할을 한다. 이러한 다양한 기능은 두 TNF 형태와 두 막횡단 수용체 사이의 동족 상호작용을 통해 유도된다.

본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허 및 다른 참고문헌은 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다. 모든 GENBANK® 수탁 번호는 2021년 5월 1일자로 데이터베이스에 제시된 바와 같이 본원에서 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 용어 설명을 포함한 본 명세서가 우선할 것이다. 추가로, 물질, 방법 및 예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것은 아니다.

치료 방법: 입양 면역요법

본원에서 관심 대상체, 예컨대, 종양을 앓는 대상체의 치료 방법을 개시한다. 본 방법은 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 투여를 포함한다. 본원에서 대상체에서 면역 반응을 증가시키는 방법, 예컨대, 면역계를 증진시키는 방법을 개시한다. 본원에 개시된 바와 같이 정제된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 투여는 면역 반응, 예를 들어, 종양에 대한 면역 반응을 유발하는 대상체의 능력을 증가시킬 것이다. 따라서, 생체외에서 대상체로부터 선택된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 정제된 집단을 정제 및 생성하고, 치료량의 상기 세포를 도입함으로써, 수용자 대상체의 면역 반응을 증진시킨다. 하기에 논의되는 바와 같이, 추가의 작용제를 대상체에게 투여할 수도 있다. 대상체는 인간 또는 수의학적 대상체일 수 있다.

한 예에서, 본 방법은 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포(예를 들어, 종양 생검으로부터의 T 세포)를 포함하는 공여자 세포 집단을 공여자로부터 단리하는 단계, 및 임의적으로, 세포를 확장시키는 단계를 포함한다. 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 수용자에게 투여함으로써, 수용자에서 종양에 대한 면역반응을 일으킨다. 일부 실시양태에서, 추가의 암 치료제, 예컨대, 화학요법제를 투여할 수 있다. 치료제는 제한하는 것은 아니지만, 체크포인트 억제제일 수 있다.

몇몇 실시양태에서, 본 방법은 또한 대상체에게 치료 유효량의 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, 4-1BB 효능제, 또는 OX40 효능제를 투여하는 단계를 포함한다. PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제의 투여는 하기에 상세히 기술된다. 추가 실시양태에서, 본 방법은 치료 유효량의 IL-2, IL-15, 및/또는 IL-21을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 치료량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및 치료 유효량의 PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, 4-1BB 효능제 및/또는 OX40 효능제의 투여는 예방적으로 수용자에서 종양의 재발을 예방하거나, 종양의 재발을 치료하기 위해, 또는 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 치료량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및 치료 유효량의 IL-2, IL-15, 및/또는 IL-21의 투여 또한 예방적으로 수용자에서 종양의 재발을 예방하거나, 종양의 재발을 치료하기 위해, 또는 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 자가 유래의 것이다. 그러나, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 또한 MHC가 매칭되는 동종이계의 공여자로부터 단리될 수 있다. 일반적으로, T 세포는 CD4, CXCR5, ICOS, 및 PD-1의 발현에 대해 양성이다. 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS: fluorescence activated cell sorting)를 사용하여 다르게 착색된 항CD4, 항CXCR5, 항ICOS 및 항PD-1 항체를 사용함으로써 CD4, CXCR5, ICOS, 및 PD-1에 대해 양성인 세포 집단을 확인(및 원하는 경우 분류)할 수 있다. 간략하게, 종양 생검으로부터의 말초 혈액 단핵 세포 또는 T 세포와 같은 세포 집단을 항CD4, 항CXCR5, 항ICOS 및 항PD-1 항체(각각 다른 형광단이 부착)의 존재하에서 항체가 세포에 결합하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킨다. 비결합 항체를 제거한 후, 통상적인 방법을 사용하여 FACS로 세포를 분석한다. 특정 예에서, 생성된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 집단은 전체 CD4+ 양성 세포 집단 대비 적어도 30% 순수하거나, 예컨대, 전체 CD4 양성 세포 집단 대비 적어도 약 50% 순수하거나, 적어도 약 60% 순수하거나, 적어도 약 70% 순수하거나, 적어도 약 80% 순수하거나, 적어도 약 90% 순수하거나, 적어도 약 95% 순수하거나, 또는 적어도 약 96%, 약 97%, 약 98% 또는 약 99% 순수하다. 따라서, 제한된 수의 이종 세포만이 투여된다. 1 초과의 라운드의 세포 분류를 위해 세포를 프로세싱할 수 있다. T 세포 집단을 동결보존 전 또는 수용자 내로의 주입 전에 미코플라스마, 멸균성, 내독소, 및 기능 및 순도에 대해 관리된 품질에 대해 세포를 시험할 수 있다.

한 실시양태에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적으로 지시된 표지된 항체를 사용하여 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포, 및 추가 마커를 발현하는 이들 세포 집단을 확인, 정량화, 및/또는 단리한다. 항체는 효소, 자성 비드, 콜로이드성 자성 비드, 합텐, 형광색소, 금속 화합물, 방사성 화합물 또는 약물을 포함하나, 이에 제한되지 않는 다른 화합물에 접합될 수 있다. 항체에 접합될 수 있는 효소는 알칼리성 포스파타아제, 페록시다제, 우레아제 및 β-갈락토시다아제를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체에 접합될 수 있는 형광색소는 플루오레세인 이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트, 피코에리트린, 알로피코시아닌 및 텍사스 레드(Texas Red)를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체에 접합될 수 있는 추가의 형광색소에 대해서는 문헌 [Haugland, R. P., Handbook of Fluorescent Probes and Research Products, published by Molecular Probes, 9^th Edition (2002)]를 참조한다. 항체에 접합될 수 있는 금속 화합물은 페리틴, 콜로이드성 금, 및 특히, 콜로이드성 초상자성 비드를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체에 접합될 수 있는 합텐은 비오틴, 디곡시제닌, 옥사졸론 및 니트로페놀을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체에 접합 또는 도입될 수 있는 방사성 화합물은 당업계에 공지되어 있으며, 테크네튬 99(⁹⁹Tc), ¹²⁵I, 제한하는 것은 아니지만, ¹⁴C, ³H 및 ³⁵S를 포함하는 임의의 방사성 핵종을 포함하는 아미노산을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

일부 예에서, 생물학적 샘플, 예컨대, 말초 혈액 샘플 또는 종양 샘플로부터 세포를 적절히 표지된 항체와 접촉시킴으로써 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 단리한다. 그러나, 원하는 세포 집단을 정제하고, 단리하기 위해 상이한 효능의 다른 기술을 사용할 수 있다. 사용된 분리 기술은 수집하고자 하는 세포 분획의 생존도 유지를 최대화시켜야 한다. 물론, 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 방법의 세포 독성, 분리의 용이성 및 속도, 및 필요한 장비 및/또는 기술에 의존할 것이다.

유세포 분석기에 의해 생성된 데이터는 히스토그램을 생성하기 위해 단일 차원으로, 또는 2차원 도트 플롯으로 또는 심지어 3차원으로 플롯팅될 수 있다. 이들 플롯 상의 영역은 "게이트"라 불리는 일련의 서브세트 추출을 생성함으로써 형광 강도를 기준으로 순차적으로 분리될 수 있다. 특정 게이팅 프로토콜은 당업계에 공지되어 있다. 플롯은 일반적으로 로그 스케일로 작성된다. 상이한 형광 염료의 방출 스펙트럼이 중첩되기 때문에, 검출기에서의 신호는 전자적 및 계산적으로 보정된다. 유세포 분석기를 사용하여 축적된 데이터는 소프트웨어, 예컨대, FLOWJO® 또는 BD FACSDIVA®를 사용하여 분석될 수 있다. 분석은 대부분 별도의 컴퓨터에서 수행된다. 관심 단백질을 고수준 또는 저수준으로 발현하는 세포의 확인을 허용하는 게이팅의 원리는 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 게이트 확립을 학습하기 위한 사용 지침 프로그램은 예를 들어, FLOWJO® 웹 사이트에 제공되어 있다. 일반적으로, 당업자는 데이터 분석을 위한 임의의 FACS 기계 및 컴퓨터 프로그램을 용이하게 사용하여 특정 마커를 발현하는 세포를 분리하기 위한 게이트를 확립할 수 있다. 예로서, 당업자는 CD4의 발현이 없는 세포(CD4^-) 또는 CD4의 발현이 존재하는 세포(CD4⁺)를 쉽게 확인할 수 있다.

추가의 분리 절차는 항체 코팅된 자성 비드를 이용한 자기 분리, 친화성 크로마토그래피, 단일클론 항체에 결합되거나, 또는 보체와 함께 사용되는 세포독성제, 및 고체 매트릭스에 부착된 단일클론 항체를 이용하는 "패닝," 또는 또 다른 편리한 기술을 포함할 수 있다. 자성 비드 및 다른 고체 매트릭스, 예컨대, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공사막 및 플라스틱 페트리 디쉬에 부착된 항체는 직접 분리를 허용한다. 항체에 의해 결합된 세포는 세포 현탁액으로부터 고체 지지체를 물리적으로 간단히 분리함으로써 세포 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 고상에 연결된 항체와 세포의 정확한 인큐베이션 조건 및 기간은 시스템에 특이적인 몇 가지 요인에 따라 결정될 것이다. 그러나, 적절한 조건의 선택은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이어서, 관심 마커(예컨대, 제한하는 것은 아니지만, CD4, CXCR5, ICOS, 및 PD-1)를 발현하는 세포가 고상에 결합된 항체에 결합하도록 충분한 시간을 허용한 후에 비결합 세포는 생리 완충제로 용출 또는 세척될 수 있다. 이어서, 결합된 세포는 주로 고상의 성질 및 사용된 항체에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 고상으로부터 분리되고, 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여 정량화된다. 특정의 한 비제한적인 예에서, 고상으로부터 분리된, 결합된 세포는 FACS에 의해 정량화된다(상기 참조).

항체는 당업계에 공지된 바와 같이, 세포 분리 및 정량화를 가능하게 하기 위해, 이후에 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 제거될 수 있는 비오틴, 또는 FACS와 함께 사용될 수 있는 형광색소에 접합될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 자동화된 성분 채집 기기(예컨대, CS-3000 혈액 세포 분리기(Baxter Health Care, 미국 일리노이주 디어필드 소재), 또는 등가 기기)를 사용하는 성분 채집 절차를 사용하여 대상체로부터 세포를 수집할 수 있다. 특정의 비제한적인 예에서, 하나 이상의 세포 표면 마커에 특이적으로 지시된 표지된 항체를 사용하여 본원에 개시된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확인하고 정량화한다.

일부 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 대상체에 투여 전에 시험관내에서 확장된다. 확장 방법은 하기 개시된다.

본 개시내용은 또한 농축된 (예컨대, 정제된) CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및 임의적으로, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, 4-1BB 효능제 및/또는 OX40 효능제를 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 본 개시내용은 또한 농축된 (예컨대, 정제된) CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 T 세포 및 임의적으로, IL-2, IL-15, 및/또는 IL-21을 포함하는 치료 조성물을 제공한다. 조성물은 본원에 개시된 방법, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 종양을 앓는 대상체의 치료에 유용하다. 특정 예에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 집단은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 치료 투여 형태로 배치된다. PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3, 4-1BB 효능제, OX40 효능제, IL-2, IL15 및/또는 IL21은 또한 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한 치료 투여 형태로 존재한다.

치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 대상체에게 투여된다. 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 특정의 비제한적인 예는 대상체의 킬로그램당 약 1 X 10⁵개의 세포 내지 대상체의 kg당 약 1 X 10⁹개의 세포, 예컨대, 약 1 X 10⁶개의 세포/kg 내지 약 1 X 10⁸개의 세포/kg, 예컨대, 약 5 X 10⁶개의 세포/kg 내지 약 75 X 10⁶개의 세포/kg, 예컨대, 약 25 X 10⁶개의 세포/kg, 또는 약 50 X 10⁶개의 세포/kg인 용량으로 투여되는 정제된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 포함한다.

정제된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 임상의에 의해 결정되는 바와 같이 단일 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포는 원하는 반응 및 수득된 반응에 따라 대략 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주 또는 매달 간격으로 투여될 수 있다. 일부 예에서, 일단 원하는 반응을 수득하고 나면, 추가의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여되지 않는다. 그러나, 수용자가 종양과 연관된 하나 이상의 증상을 보이는 경우, 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 그 시점에 투여될 수 있다.

투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체가 화학요법으로 치료받은 후 정맥내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 또한 투여된 세포의 증식을 지지하기 위해 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-15, 및/또는 IL-21을 투여받는다.

본원에 개시된 정제된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 약학적으로 허용되는 담체, 예컨대, 염수와 함께 투여될 수 있다. PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, 4-1BB 효능제, 및/또는 OX40 효능제, 및 임의적으로 사이토카인 예컨대, IL-2, IL-15 및/또는 IL-21 또한 하기 기술되는 바와 같이 약학적으로 허용되는 담체에 제제화될 수 있다. 이들은 단일 조성물 또는 2개의 개별 조성물로 제제화될 수 있다. 일부 예에서, 다른 치료제가 T 세포와 함께 투여된다. 다른 치료제는 원하는 효과에 따라 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 투여 전, 그 동안, 또는 그 이후에 투여될 수 있다. 예시적인 치료제는 시험관내에서 T 세포를 자극하는 데 사용되는 항미생물제, 인터페론-알파와 같은 면역 자극제, 또는 화학요법제 또는 펩티드 백신을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 예에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 함유하는 조성물은 또한 하나 이상의 치료제를 포함한다. 임의적으로 하나 이상의 추가의 작용제와 함께 조합된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 사용은 종양 부피, 종양 전이, 및/또는 종양 재발을 감소시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 다른 세포, 예컨대, CD8⁺ T 세포와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 상기 CD8+ T 세포는 확장된 종양 침윤 림프구일 수 있다. 추가 실시양태에서, 치료 유효량의 CD8⁺ T 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포 또한 대상체에게 투여된다. CD8+ T 세포, 예컨대, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포의 단리 및 사용 방법은 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 2018/226336(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 치료 유효량의 CD8+ T 세포, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포의 특정의 비제한적인 예는 약 1 X 10⁵ 개의 세포/kg(대상체) 내지 약 1 X 10⁹개의 세포/kg(대상체), 예컨대, 약 1 X 10⁶개의 세포/kg 내지 약 1 X 10⁸개의 세포/kg, 예컨대, 약 5 X 10⁶ 개의 세포/kg 내지 약 75 X 10⁶개의 세포/kg, 예컨대, 약 25 X 10⁶ 개의 세포/kg, 또는 약 50 X 10⁶개의 세포/kg인 용량으로 투여되는 정제된 T 세포를 포함한다. 상기 CD8⁺ 세포는 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포와 동일한 조성물에 포함될 수 있거나, 또는 별개로 투여될 수 있다.

정제된 CD8+ T 세포, 예컨대, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포는 임상의에 의해 결정되는 바와 같이 단일 또는 다회 용량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 세포는 원하는 반응 및 수득된 반응에 따라 대략 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 1주, 2주 또는 매달 간격으로 투여될 수 있다. 일부 예에서, 일단 원하는 반응을 수득하고 나면, 추가의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및/또는 CD8⁺ T 세포, 예컨대, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포는 투여되지 않는다. 그러나, 수용자가 종양과 연관된 하나 이상의 증상을 보이는 경우, 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및/또는 CD8⁺ T 세포, 예컨대, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포가 그 시점에 투여될 수 있다.

CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및/또는 CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포 투여는 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 대상체가 화학요법으로 치료받은 후 정맥내로 투여된다. 다른 실시양태에서, 대상체는 또한 투여된 세포의 증식을 지지하기 위해 사이토카인, 예컨대, IL-2 및/또는 IL-15를 투여받는다. 임의적으로, 체크포인트 억제제가 대상체에게 투여된다.

일반적으로, 상기 방법은 예컨대, 양성 또는 악성 종양과 같은 종양을 앓는 대상체를 선별하는 단계, 및 대상체에게 치료 유효량의 (1) CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및 (2) 임의적으로 체크포인트 억제제 길항제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, 또는 CTLA-4 길항제, 또는 4-1BB 효능제, 또는 OX-40 효능제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 비제한적인 예에서, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제, CTLA-4 길항제, 4-1BB 효능제, 또는 OX40 효능제는 각각 PD-1, PD-L1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG3, BTLA, CTLA-4, 4-1BB, 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체(또는 그의 항원 결합 단편)일 수 있다. CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 종양 부피의 감소, 전이 감소 또는 예방, 양성 종양의 악성 종양으로의 전환 예방 및/또는 종양 재발 예방 또는 억제와 같이 종양 치료에 유용하다. 투여는 국소적이거나 전신적일 수 있다. 적합한 투여 방법은 임상의에게 알려져 있다.

일부 실시양태에서, 본원에 제공된 방법의 이점은 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포와 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제 및/또는 CTLA-4 길항제, 및/또는 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제의 조합이 암 요법을 위한 활성제의 투여량을 감소시키면서, 요법의 상응하는 임의의 바람직하지 않은 부작용(예컨대, 세포독성)을 감소시킨다는 것이다. 추가 실시양태에서, 본원에 제공된 방법의 또 다른 이점은 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포와 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제 및/또는 CTLA-4 길항제와의, 또는 4-1BB 효능제 및 또는 OX40 효능제와의 조합이 예컨대, 종양 부피 감소, 전이 감소 또는 예방, 양성 종양의 악성 종양으로의 전환 예방 및/또는 종양 재발 예방 또는 억제와 같은 종양 치료에 효과적이라는 점이다. 추가 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포와 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, LAG3 길항제 및/또는 CTLA-4 길항제, 또는 4-1BB 효능제 및/또는 OX40 효능제의 조합은 대상체의 생존을 증가시킨다.

예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 암 치료제와 같은 추가의 작용제 또한 관심 대상체에 투여될 수 있다. 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 종양의 외과적 절제와 같은 추가의 치료 또한 대상체에게 수행될 수 있다. 종양에 적합한 표준 화학치료 요법이 대상체에게 투여될 수도 있다.

치료를 위해 대상체를 선별할 수 있다. 예를 들어, 개시된 치료 방법에 반응할 가능성이 있는 대상체를 확인하기 위해 진단 검정법(예컨대, 면역조직화학(IHC) 검정법)이 종양(또는 종양의 샘플)에 대해 수행될 수 있다. 선별 방법은 하기에 개시되어 있다.

추가 실시양태에서, 대상체는 치료를 위해 종양이 PD-L1 또는 PD-L2 발현에 대하여 양성 반응을 보이는지 여부에 대해 IHC 검정법에 의해 선별된다. PD-L1 발현에 대하여 양성 반응을 보이는 종양을 검출하기 위한 예시적인 검정법은 문헌 [Topalian et al. 2012. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N. Engl. J. Med. 366:2443-2454]; [Wolchok et al. 2013. Nivolumab plus ipilimumab in advanced melanoma. N. Engl. J. Med. 369:122-133]; [Herbst et al. 2014. Predictive correlates of response to the anti-PD-L1 antibody MPDL3280A in cancer patients. Nature. 515:563-567]; [Garon et al. 2015. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 372:2018-2028]; 및 [Reck et al. Pembrolizumab versus chemotherapy for PD-L1-positive non-small-cell lung cancer. N. Engl. J. Med. 375:1823-1833](상기 문헌은 각각 본원에서 참조로 포함된다)에 제공되어 있다.

종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 종양은 임의의 관심 종양일 수 있다. 종양은 두부경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 또는 흑색종일 수 있다. 종양은 폐암, 난소암 신장 세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 전립선암, 유방암, 교아세포종 또는 직장암일 수 있다. 폐암은 소세포 폐 암종 또는 비소세포 폐 암종일 수 있다. 간암은 간 암종일 수 있다. 유방암은 삼중 음성 유방암일 수 있다. 종양은 고형 종양일 수 있다.

일부 실시양태에서, 종양은 두부경부 종양, 예컨대, 비강, 부비동, 비인두, 구강, 인두, 후두, 하인두, 타액선 및 부신결종증의 종양이다. 종양은 흑색종, 예컨대, 전이성 흑색종일 수 있다. 종양은 결장직장암일 수 있다.

추가의 예는 피부 종양, 뇌 종양, 자궁경부 암종, 고환 암종, 위장관 종양, 비뇨생식계 종양, 부인과계 종양, 내분비계 종양, 연조직 및 뼈의 육종, 중피종, 흑색종, 중추 신경계의 신생물, 또는 백혈병이다. 다른 실시양태에서, 종양은 폐 종양, 예컨대, 비소세포 폐암 또는 소세포 폐암이다. 추가의 실시양태에서, 종양은 예컨대, 식도, 위, 췌장, 간, 담도, 소장, 결장, 직장 및 항문 부위의 암과 같은 위장관의 종양일 수 있다. 추가의 다른 실시양태에서, 종양은 비뇨생식계의 종양, 예컨대, 신장, 요도, 방광, 전립선, 요도, 음경 및 고환의 암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 부인과 종양, 예컨대, 자궁경부, 질, 외음부, 자궁, 임신성 영양막 질환, 난소, 난관, 복막 또는 유방의 암이다. 다른 실시양태에서, 종양은 내분비계 종양, 예컨대, 갑상선 종양, 부갑상선 종양, 부신 피질 종양, 췌장 내분비 종양, 카르시노이드 종양 및 카르시노이드 증후군이다. 종양은 연조직 및 뼈의 육종, 중피종, 피부암, 피부 흑색종 및 안내 흑색종을 포함하는 흑색종, 중추 신경계의 신생물, 망막아세포종을 포함하는 소아기 암, 윌름스 종양, 신경 섬유 종증, 신경아세포종, 유잉 육종 계열 종양, 횡문근 육종일 수 있다. 종양은 비호지킨 림프종, 피부 T 세포 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종 및 호지킨병을 포함하는 림프종일 수 있다. 종양은 예컨대, 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 림프구 백혈병과 같은 백혈병일 수 있다. 종양은 형질 세포 신생물, 원발 부위 불명 암, 복막 암종증, 카포시 육종, AIDS 연관 림프종, AIDS 연관 원발성 중추 신경계 림프종, AIDS 연관 호지킨병 및 AIDS 연관 항문 생식 암, 간 전이성 암, 뼈 전이성 암, 악성 흉막 및 심낭 삼출액 및 악성 복수일 수 있다.

일부 실시양태에서, 종양의 치료는 종양의 진단 후, 또는 전조 상태의 개시(예컨대, 이형성증 또는 양성 종양의 발생) 후에 개시된다. 치료는 암의 초기 단계에서 개시될 수 있으며, 예를 들어, I기 진단 과정에서 또는 이형성증이 진단되거나, 동소 증식 병태가 진단되는 시기와 같이 대상체가 병태의 증상을 나타내기 전에 개시될 수 있다. 그러나, 치료는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, I기, II기, III기 및 IV기 암과 같은, 질환의 임의의 단계 중에 개시될 수 있다. 일부 예에서, 치료는 악성 또는 심지어 전이성 종양으로 전환될 수 있는 양성 종양을 앓는 대상체에게 수행된다.

이형성증 또는 조기(양성) 전조 상태를 검출할 때의 치료와 같은 병태의 발생 전의 치료는 본원에서 병태 발병의 "위험이 있는" 대상체의 치료로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 조성물의 투여는 본원에 기술된 병태의 발생 중에 또는 그 후에 수행될 수 있다. 조성물은 종양이 발생할 위험이 있는 대상체에게 투여될 수 있다.

종양의 존재는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있으며, 전형적으로 세포학적 및 형태학적 평가를 포함한다. 종양은 확립된 종양일 수 있다. 세포는 생검으로부터 얻은 세포를 포함하여 생체내 또는 생체외에 있을 수 있다.

예컨대, 악성 암과 같은 병태의 발생 후 개시된 치료는 병태 중 하나의 증상의 중증도를 감소시키거나, 증상을 완전히 제거하거나, 전이, 종양 부피 또는 종양 수를 감소시킬 수 있다. 일부 예에서, 종양은 치료 후 검출할 수 없게 된다.

본 개시내용의 한 측면에서, 예컨대, 전이와 같은 종양의 형성은 지연, 예방 또는 감소된다. 또 다른 측면에서, 원발성 종양의 크기가 감소된다. 추가 측면에서, 종양의 증상이 감소된다. 추가의 또 다른 측면에서, 종양 부피가 감소된다. 추가의 또 다른 측면에서, 종양의 재발은 예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24개월, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년 동안 지연되거나, 예방된다.

일부 실시양태에서, 면역 반응이 측정될 수 있고/거나, 종양 부피가 측정될 수 있고/거나, 전이성 병변의 개수가 측정될 수 있고/거나, 종양의 증상이 측정될 수 있다. 치료 유효 용량은 면역 반응을 증가시키고/거나, 종양 부피를 감소시키고/거나, 전이 개수 및/또는 크기를 감소시키고/거나, 종양의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다.

개시된 방법 및 조성물은 전형적으로 인간 대상체를 치료하는 데 사용되지만, 다른 척추동물, 예컨대, 다른 영장류, 개, 고양이, 말, 및 소에서 유사하거나 동일한 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 적합한 투여 포맷은 의사에 의해 각 대상체에 대해 개별적으로 가장 잘 결정될 수 있다. 다양한 약학적으로 허용되는 담체 및 그의 제제화는 표준 제제화 논문, 예컨대, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기술되어 있다. 문헌 [Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42: 2S, 1988] 또한 참조한다. 약학 조성물의 투여 형태는 선택된 투여 모드에 의해 결정될 것이다.

CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 임의의 경로에 의해 국소적으로 또는 전신으로 투여될 수 있다. 예를 들어, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 종양내, 복강내, 정맥내로 투여될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 정맥내 투여될 수 있다. PD-1, PD-L1, PD-L2, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4 길항제, 4-1BB 효능제, 또는 OX40 효능제는 또한 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 복강내, 흉골내, 또는 관절내 주사 또는 주입을 포함하는 임의의 경로, 또는 설하, 경구, 국소, 비강내, 또는 경점막 투여, 또는 폐 흡입에 의해 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및/또는 PD-1, PD-L1, PD-L2, BTLA, TIM-3, LAG3, CTLA-4 길항제, 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제는 종양이 위치하는 조직에, 또는 종양에 직접(종양내) 투여된다. 비경구용 조성물이 제공되는 경우, 예컨대, 주사 또는 주입용인 경우, 활성제는 일반적으로 수성 담체, 예를 들어, pH 약 3.0 내지 약 8.0, 바람직하게, pH 약 3.5 내지 약 7.4, 3.5 to 6.0, 또는 3.5 내지 약 5.0의 등장성 완충체 용액 중에 현탁된다. 유용한 완충제는 시트르산 나트륨-시트르산 및 인산나트륨-인산, 및 아세트산나트륨-아세트산 완충제를 포함한다. 치료 유효량의 제제가 경피 주사 또는 전달 후 수 시간 또는 수일에 걸쳐 혈류로 전달되도록 저장소 또는 "데포" 서방형 제제 형태가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8⁺CD39⁺CD103⁺ T 세포 또한 대상체에게 투여된다.

특정 실시양태에서, PD-1, PD-L1, PD-L2, BTLA, TIM-3, LAG3, 또는 CTLA-4 길항제(예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 항체 또는 항원 결합 단편), 또는 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제(예컨대, 효능제 항체)는 약 0.01-10 mg/kg, 0.01-5 mg/kg, 0.01-1 mg/kg, 0.01-0.1 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-3 mg/kg, 0.5-1.0 mg/kg, 0.05-0.5 mg/kg 범위의 용량으로 제한 없이, 매일, 주 2 또는 3회, 매주, 매 2주, 매 3주, 매달 등을 포함하는 투여의 투약 스케줄에 따라, 또는 치료 의사에 의해 적절하다고 간주되는 다른 용량 및 투약 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 조합 요법의 일부로서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여 스케줄이 치료상 이점을 제공하기에 충분한 생리학적 농도의 작용제를 제공하는 한, 추가 작용제 전, 그 후, 또는 그와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.

일부 실시양태에서, PD-1 또는 PD-L1 길항제(예컨대, PD-1 또는 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편)는 약 0.01-10 mg/kg, 0.01-5 mg/kg, 0.01-1 mg/kg, 0.01-0.1 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-3 mg/kg, 0.5-1.0 mg/kg, 0.05-0.5 mg/kg 범위의 용량으로 제한 없이, 매일, 주 2 또는 3회, 매주, 매 2주, 매 3주, 매달 등을 포함하는 투여의 투약 스케줄에 따라, 또는 치료 의사에 의해 적절하다고 간주되는 다른 용량 및 투약 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 조합 요법의 일부로서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여 스케줄이 치료상 이점을 제공하기에 충분한 생리학적 농도의 작용제를 제공하는 한, PD-1 또는 PD-L1 길항제 전, 그 후, 또는 그와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, CTLA-4 길항제(예컨대, CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편)는 약 0.01-10 mg/kg, 0.01-5 mg/kg, 0.01-1 mg/kg, 0.01-0.1 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-3 mg/kg, 0.5-1.0 mg/kg, 0.05-0.5 mg/kg 범위의 용량으로 제한 없이, 매일, 주 2 또는 3회, 매주, 매 2주, 매 3주, 매달 등을 포함하는 투여의 투약 스케줄에 따라, 또는 치료 의사에 의해 적절하다고 간주되는 다른 용량 및 투약 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 조합 요법의 일부로서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여 스케줄이 치료상 이점을 제공하기에 충분한 생리학적 농도의 작용제를 제공하는 한, CTLA-4 길항제 전, 그 후, 또는 그와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 추가 실시양태에서, BTLA 길항제(예컨대, BTLA에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편)는 약 0.01-10 mg/kg, 0.01-5 mg/kg, 0.01-1 mg/kg, 0.01-0.1 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-3 mg/kg, 0.5-1.0 mg/kg, 0.05-0.5 mg/kg 범위의 용량으로 제한 없이, 매일, 주 2 또는 3회, 매주, 매 2주, 매 3주, 매달 등을 포함하는 투여의 투약 스케줄에 따라, 또는 치료 의사에 의해 적절하다고 간주되는 다른 용량 및 투약 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 조합 요법의 일부로서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여 스케줄이 치료상 이점을 제공하기에 충분한 생리학적 농도의 작용제를 제공하는 한, BTLA 길항제 전, 그 후, 또는 그와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 추가 실시양태에서, LAG3 또는 TIM-3 길항제(예컨대, LAG3 또는 TIM-3에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편)는 약 0.01-10 mg/kg, 0.01-5 mg/kg, 0.01-1 mg/kg, 0.01-0.1 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-3 mg/kg, 0.5-1.0 mg/kg, 0.05-0.5 mg/kg 범위의 용량으로 제한 없이, 매일, 주 2 또는 3회, 매주, 매 2주, 매 3주, 매달 등을 포함하는 투여의 투약 스케줄에 따라, 또는 치료 의사에 의해 적절하다고 간주되는 다른 용량 및 투약 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 조합 요법의 일부로서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여 스케줄이 치료상 이점을 제공하기에 충분한 생리학적 농도의 작용제를 제공하는 한, LAG3 또는 TIM-3 길항제 전, 그 후, 또는 그와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.

추가의 다른 실시양태에서, 4-1BB 효능제(예컨대, 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편) 또는 OX40 효능제(예컨대, OX40에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편)는 약 0.01-10 mg/kg, 0.01-5 mg/kg, 0.01-1 mg/kg, 0.01-0.1 mg/kg, 1-10 mg/kg, 1-5 mg/kg, 1-3 mg/kg, 0.5-1.0 mg/kg, 0.05-0.5 mg/kg 범위의 용량으로 제한 없이, 매일, 주 2 또는 3회, 매주, 매 2주, 매 3주, 매달 등을 포함하는 투여의 투약 스케줄에 따라, 또는 치료 의사에 의해 적절하다고 간주되는 다른 용량 및 투약 스케쥴에 따라 투여될 수 있다. 조합 요법의 일부로서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 투여 스케줄이 치료상 이점을 제공하기에 충분한 생리학적 농도의 작용제를 제공하는 한, 4-1BB 또는 OX40 효능제 전, 그 후, 또는 그와 동시에 대상체에게 투여될 수 있다.

지속 방출 조성물이 이용될 수 있다. 지속 방출 조성물의 적합한 예는 적합한 중합체 물질(예컨대, 예를 들어, 성형품, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐 형태의 반투과성 중합체 매트릭스), 적합한 소수성 물질(예컨대, 예를 들어, 허용되는 오일 중 에멀젼) 또는 이온 교환 수지, 및 난용성 유도체(예컨대, 예를 들어, 난용성 염)를 포함한다. 지속 방출 제제는 종양의 위치에 따라 경구, 직장, 비경구, 수조내, 질내, 복강내, 국소(분말, 연고, 젤, 점적 또는 경피 패치에 의해), 협측, 또는 경구 또는 비강 스프레이로 투여될 수 있다.

개시된 방법에 유용한 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제는 통상적이다. 예를 들어, 비경구 제제는 일반적으로 물, 생리 식염수, 다른 평형 염 용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약학적 및 생리학적으로 허용되는 유체 비히클인 주사용 유체를 포함한다. 포함될 수 있는 부형제는 예를 들어, 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 또는 혈장 제제이다. 원하는 경우, 투여되는 약학 조성물은 소량의 비독성 보조 물질, 예를 들어, 습윤화제 또는 유화제, 보존제, 및 pH 완충화제 등, 예를 들어, 아세트산나트륨 또는 소르비탄 모노라우레이트를 또한 함유할 수 있다. 이러한 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나, 또는 명백할 것이다.

키트도 제공한다. CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 및/또는 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM-3, BTLA, 또는 CTLA-4 길항제, 또는 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제는 정확한 투여량의 개별 투여에 적합한 단위 투여 형태로 제제화될 수 있다. 키트는 예컨대, 벡터 중에 PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM-3, BTLA, 또는 CTLA-4 길항제, 또는 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제를 코딩하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 투여되는 활성 화합물(들)의 양은 치료되는 대상체, 병의 중증도, 및 투여 방식에 따라 달라질 것이며, 처방 임상의의 판단에 가장 좌우된다. 이들 범위 내에서, 투여되는 제제는 치료될 대상체에서 원하는 효과를 달성하기에 효과적인 양의 활성 성분(들)을 함유할 것이다. 예컨대, 만성 투여가 달성되도록 매일, 격주, 매주, 격월 또는 매달과 같이 정해진 시간 간격에 걸쳐, 다회 치료가 구상된다.

추가의 작용제는 예컨대, 사이토카인, 케모카인, 또는 화학요법제가 투여될 수 있다. 이는 개시된 약학 조성물에 포함될 수 있다. 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-15 및/또는 IL-21이 투여될 수 있다. 한 예에서, 암의 예방 및 치료를 위해, 외과적 치료가 대상체에게 수행될 수 있다. 한 예에서, 상기 투여는 순차적이다. 다른 예에서, 상기 투여는 동시 투여이다.

개시된 방법에서 유용한 화학요법제의 예는 알킬화제, 대사길항제, 천연 생성물, 또는 호르몬 및 그의 길항제를 포함한다. 알킬화제의 예로는 질소 머스타드(예컨대, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 멜팔란, 우라실 머스타드 또는 클로람부실), 알킬 술포네이트(예컨대, 부술판), 니트로소우레아(카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 또는 다카르바진)를 포함한다. 대사길항제의 예에는 엽산 유사체(예컨대, 메토트렉세이트), 피리미딘 유사체(예컨대, 5-FU 또는 시타라빈), 및 퓨린 유사체, 예컨대, 메르캅토퓨린 또는 티오구아닌을 포함한다. 천연 생성물의 예는 빈카 알칼로이드(예컨대, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 또는 빈데신), 에피포도필로톡신(예컨대, 에토포시드 또는 테니포시드), 항생제(예컨대, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신, 또는 미토마이신 C), 및 효소(예컨대, L-아스파라기나제)를 포함한다. 다른 작용제의 예로는 백금 배위 착체(예컨대, 시스플라틴으로도 알려진 시스-디아민-디클로로 플래티늄 II), 치환된 우레아(예컨대, 하이드록시우레아), 메틸 히드라진 유도체(예컨대, 프로카르바진), 및 부신피질 억제제(예컨대, 미토테인 및 아미노글루테티미드)를 포함한다. 호르몬 및 길항제의 예에는 아드레노코르티코스테로이드(예컨대, 프레드니손), 프로게스틴(예컨대, 하이드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 및 메게스트롤 아세테이트), 에스트로겐(예컨대, 디에틸 스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올), 항에스트로겐(예컨대, 타목시펜), 및 안드로겐(예컨대, 테스테론 프로프리오네이트 및 플루옥시메스테론)을 포함한다. 가장 일반적으로 사용되는 화학요법 약물의 예로는 아드리아마이신, 알케란, Ara-C, BiCNU, 부술판, CCNU, 카보플래튬, 시스플래튬, 시톡산, 다우노루비신, DTIC, 5-FU, 플루다라빈, 히드레아, 이다루비신, 이포스파미드, 메토트렉세이트, 미트라마이신, 미토마이신, 미톡산트론, 질소 머스타드, 탁솔(또는 도세탁셀과 같은 다른 탁산), 벨반, 빈크리스틴, VP-16을 포함하는 한편, 일부 더욱 새로운 약물로는 젬시타빈(Gemzar), 허셉틴, 이리노테칸(캄토사르, CPT-11), 류스타틴, 나벨빈, 리툭산 STI-571, 탁소텔, 토포테칸(히캄틴), 젤로다(카페시타빈), 제벨린 및 칼시트리올을 포함한다. 사용될 수 있는 면역조정제의 비제한적인 예로는 AS-101(Wyeth-Ayerst Labs), 브로피리민(Upjohn), 감마 인터페론(Genentech), GM-CSF(과립구 대식세포 콜로니 자극 인자; Genetics Institute), IL-2(Cetus 또는 Hoffman-LaRoche), 인간 면역글로불린(Cutter Biological), IMREG(Imreg of New Orleans, La), SK&F 106528, 및 TNF(종양 괴사 인자(tumor necrosis factor); Genentech)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 소라페닙을 투여받는다.

추가의 화학요법제는 항체일 수 있다. 항체는 공지된 농도의 멸균 용액으로 제공되지만, 동결 건조된 형태로 제공되고, 투여 전에 멸균수로 재수화될 수 있다. 이어서, 항체 용액은 0.9% 염화나트륨, USP를 함유하는 주입 백에 첨가되고, 전형적으로 kg 체중당 0.5 내지 15 mg의 투여량으로 투여된다. 1997년에 리툭산(RITUXAN)®의 승인 이후 미국에서 시판된 항체 약물의 투여에 있어 당업계에서 상당한 경험이 통용된다. 항체는 프로그래밍된 사멸(PD)-1 또는 프로그래밍된 사멸 리간드(PD-L1)에 특이적으로 결합할 수 있다(아래 참조). 항체는 정맥내 푸시 또는 볼루스보다는 느린 주입으로 투여될 수 있다. 한 예에서, 더 높은 로딩 용량이 투여되고, 후속적인 유지 용량은 더 낮은 수준으로 투여된다. 예를 들어, 4 mg/kg의 초기 로딩 용량을 약 90분 동안 주입한 후, 이전 용량이 내약성이 우수하다면, 2 mg/kg의 주당 유지 용량을 4 내지 8주 동안 30분 동안 주입할 수 있다.

치료 요법은 또한 수술, 화학 요법, 방사선, 또는 다른 면역제거제, 예컨대, CAMPATH, 항CD3 항체 또는 다른 항체 요법, 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 미코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토카인, 및 방사선을 포함한다. 예컨대, 문헌 [Izumoto et al. 2008 J Neurosurg 108:963-971]에 기술된 바와 같은 펩티드 백신. 예시적인 화학요법제는 안트라사이클린(예컨대, 독소루비신(예컨대, 리포솜 독소루비신), 빈카 알칼로이드(예컨대, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈), 알킬화제(예컨대, 사이클로포스파미드, 데카르바진, 멜팔란, 이포스파미드, 테모졸로미드), 면역 세포 항체(예컨대, 알렘투주맙, 젬투주맙, 리툭시맙, 토시투모맙), 대사길항제(예컨대, 엽산 길항제, 피리미딘 유사체, 퓨린 유사체 및 아데노신 데아미나아제 억제제(예컨대, 플루다라빈) 포함), mTOR 억제제, TNFR 글루코코르티코이드 유도된 TNFR 관련 단백질(GITR) 효능제, 프로테아좀 억제제(예컨대, 아클라시노마이신 A, 글리오톡신 또는 보르테조밉), 면역조정제, 예컨대, 탈리도미드 또는 탈리도미드 유도체(예컨대, 레날리도미드)를 포함한다.

조합 요법에 사용하기 위해 고려되는 일반 화학요법제는 아나스트로졸(아리미덱스®), 비칼루타미드(CASODEX®), 블레오마이신 술페이트(BLENOXANE®), 부술판(MYLERAN®), 부술판 주사(BUSULFEX®), 카페시타빈(XELODA®), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-플루오로시티딘, 카르보플라틴(PARAPLATIN®), 카르무스틴(BICNU®), 클로람부실(LEUKERAN®), 시스플라틴(PLATINOL®), 클라드리빈(LEUSTATIN®), 사이클로포스파미드(CYTOXAN® 또는 NEOSAR®), 시타라빈, 사이토신 아라비노시드(CYTOSAR-U®), 시타라빈 리포솜 주사(DEPOCYT®), 다카르바진(DTIC-DOME®), 닥티노마이신(악티노마이신 D, 코스메간), 다우노루비신 하이드로클로라이드(CERUBIDINE®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DAUNOXOME®), 덱사메타손, 도세탁셀(TAXOTERE®), 독소루비신 하이드로클로라이드(ADRIAMYCIN®, RUBEX®), 에토포시드(VEPESID®), 플루다라빈 포스페이트(FLUDARA®), 5-플루오로우라실(ADRUCIL®, EFUDEX®), 플루타미드(EULEXIN®), 테자시티빈, 젬시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(HYDREA®), 이다루비신(IDAMYCIN®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(CAMPTOSAR®), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(ALKERAN®), 6-메르캅토 퓨린(PURINETHOL®), 메토트렉세이트(FOLEX®), 미톡크산트론(NOVANTRONE®), 마일로타그, 파클리탁셀(TAXOL®), 피닉스(이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴이 포함된 폴리페프로산 20 임플란트(GLIADEL®), 타목시펜 시트레이트(NOLVADEX®), 테니포시드(VUMON®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(TIRAZONE®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(HYCAMPTIN®), 빈블라스틴(VELBAN®), 빈크리스틴(ONCOVIN®), 및 비노렐빈(NAVELBINE®)을 포함한다. 예시적인 알킬화제는 제한 없이, 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 술포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠; 우라실 머스타드(AMINOURACIL MUSTARD®, CHLORETHAMINACIL®, DEMETHYLDOPAN®, DESMETHYLDOPAN®, HAEMANTHAMINE®, NORDOPAN®, URACIL NITROGEN MUSTARD®, URACILLOST®, URACILMOSTAZA®, URAMUSTIN®, URAMUSTINE®), 클로메틴(MUSTARGEN®), 사이클로포스파미드(CYTOXAN®, NEOSAR®, CLAFEN®, ENDOXAN®, PROCYTOX®, REVIMMUNE™), 이포스파미드(MITOXANA®), 멜팔란(ALKERAN®), 클로람부실(LEUKERAN®), 피포브로만(AMEDEL®, VERCYTE®), 트리에틸렌멜라민(HEMEL®, HEXYLEN®, HEXASTAT®), 트리에틸렌티오포스포라민, 테모졸로미드(TEMODAR®), 티오테파(THIOPLEX®), 부술판(BUSILVEX®, MYLERAN®), 카르무스틴(BICNU®), 로무스틴(CEENU®), 스트렙토조신(ZANOSAR®), 및 다카르바진(DTIC-DOME®)을 포함한다. 추가의 예시적인 알킬화제는 제한 없이, 옥살리플라틴(ELOXATIN®); 테모졸로 미드(TEMODAR® 및 TEMODAL®); 닥티노마이신(악티노마이신-D로도 공지, COSMEGEN®); 멜팔란(또한 L-PAM, L-사르코리신 및 페닐알라닌 머스타드로도 공지, ALKERAN®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 공지, HEXYLEN®); 카르무스틴(BICNU®); 벤다무스틴(TREANDA®); 부술판(BUSULFEX® 및 MYLERAN®); 카르보플라틴(PARAPLATIN®); 로무스틴(CCNU로도 공지, CEENU®); 시스플라틴 (CDDP로도 공지, PLATINOL® 및 PLATINOL®-AQ); 클로람부실(LEUKERAN®); 사이클로포스파미드(CYTOXAN® 및 NEOSAR®); 다카르바진(DTIC, DIC 및 이미다졸카르복사미드로도 공지, DTIC-DOME®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 공지, HEXYLEN®); 이포스파미드(IFEX®); 프레드누무스틴; 프로카르바진(MATULANE®); 메클로레타민(질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 하이드로클로라이드로도 공지, MUSTARGEN®); 스트렙토조신(ZANOSAR®); 티오테파(티오포름아미드, TESPA 및 TSPA로도 공지, THIOPLEX®); 사이클로포스파미드(ENDOXAN®, CYTOXAN®, NEOSAR®, PROCYTOX®, REVIMMUNE®); 및 벤다무스틴 HCl(TREANDA®)을 포함한다. 예시적인 mTOR 억제제는 예컨대, 템시롤리무스; 리다포롤리무스(공식적으로 데페롤리무스, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R, 23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하이드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23, 29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.0^4,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트로 공지, AP23573 및 MK8669로도 공지, 및 PCT 공개 번호 WO 03/064383에 기술); 에베롤리무스(AFINITOR® 또는 RAD001); 라파마이신(AY22989, SIROLIMUS®); 시마피모드(CAS164301-51-3); 엠시롤리무스, (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올(AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N²-[1,4-디옥소-4-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸-세린-, 내부 염(SF1126, CAS 936487-67-1), 및 XL765를 포함한다. 예시적인 면역조정제는 제한 없이, 예컨대, 아푸투주맙(ROCHE®로부터 이용가능); 페그필그라스팀(NEULASTA®); 레날리도미드(CC-5013, REVLIMID®); 탈리도미드(THALOMID®), 액티미드(CC4047); 및 IRX-2(인터루킨 1, 인터루킨 2, 및 인터페론 γ를 포함하는 인간 사이토카인의 혼합물, CAS 951209-71-5, IRX Therapeutics로부터 이용가능)를 포함한다. 예시적인 안트라사이클린은 예컨대, 독소루비신(아드리아마이신® 및 RUBEX®); 블레오마이신(LENOXANE®); 다우노루비신(다우노루비신 하이드로클로라이드, 다우노마이신, 및 루비도마이신 하이드로클로라이드, CERUBIDINE®); 다우노루비신 리포솜(다우노루비신 시트레이트 리포솜, DAUNOXOME®); 미토크산트론(DHAD, 노반트론®); 에피루비신(ELLENCE™); 이다루비신(IDAMYCIN®, IDAMYCIN PFS®); 미토마이신 C(MUTAMYCIN®); 젤다나마이신; 헤르비마이신; 라비도마이신; 및 데스아세틸라비도마이신을 포함한다. 빈카 알칼로이드의 예는 예컨대, 비노렐빈 타르트레이트(NAVELBINE®), 빈크리스틴(ONCOVIN®), 및 빈데신(ELDISINE®); 빈블라스틴(빈블라스틴 술페이트, 빈카류 코블라스틴 및 VLB로도 공지, ALKABAN-AQ® 및 VELBAN®); 및 비노렐빈(NAVELBINE®)을 포함한다. 예시적인 프로테오좀 억제제는 보르테조밉(VELCADE®); 카르필조밉(PX-171-007, (S)-4-메틸-N-((S)-1-(((S)-4-메틸-1-((R)-2-메틸옥시란-2-일)-1-옥소펜탄-2-일)아미노)-1-옥소-3-페닐프로판-2-일)-2-((S)-2-(2-모르폴리노아세트아미도)-4-페닐부탄아미도)-펜탄아미드); 마리조밉(NPI-0052); 익사조밉 시트레이트(MLN-9708); 델란조밉(CEP-18770); 및 O-메틸-N-[(2-메틸-5-티아졸릴)카르보닐]-L-세릴-O-메틸-N-[(1S)-2-(2R)-2-메틸-2-옥시라닐]-2-옥소-1-(페닐메틸)에틸]-L-세린아미드(ONX-0912)를 포함한다. 예시적인 GITR 효능제는 예컨대, GITR 융합 단백질 및 항GITR 항체(예컨대, 2가 항GITR 항체), 예컨대, 예컨대, GITR 융합 단백질(미국 특허 제6,111,090호, 유럽 특허 제090505B1호, 미국 특허 제8,586,023호, PCT 공개 번호 WO 2010/003118 및 2011/090754에 기술), 또는 항GITR 항체(예컨대, 미국 특허 제7,025,962호, 유럽 특허 제1947183B1호호, 미국 특허 제7,812,135호, 미국 특허 제8,388,967호, 미국 특허 제8,591,886호, 유럽 특허 제EP 1866339호, PCT 공개 번호 WO 2011/028683, PCT 공개 번호 WO 2013/039954, PCT 공개 번호 WO2005/007190, PCT 공개 번호 WO 2007/133822, PCT 공개 번호 WO2005/055808, PCT 공개 번호 WO 1999/40196, PCT 공개 번호 WO 2001/03720, PCT 공개 번호 WO 1999/20758, PCT 공개 번호 WO2006/083289, PCT 공개 번호 WO 2005/115451, 미국 특허 제7,618,632호, 및 PCT 공개 번호 WO 2011/051726에 기술)를 포함한다.

T 세포 확장 방법

CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 시험관내에서 확장시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체로부터 단리된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 글루타민, 혈청, 및 항생제를 포함하는 조직 배양 배지에서 배양하여 1차 배양물을 형성할 수 있다. 세포는 일반적으로 적절한 배양 베쓸에 시딩된다. 세포(들)를 배양하는 데 사용되는 배양 베쓸은 그 안에서 T 세포를 배양할 수 있는 한, 플라스크, 조직 배양 플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로 웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티 웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, 셀스택(CELLSTACK)® 챔버, 배양 백, 및 롤러 병을 포함할 수 있지만, 이에 특별히 제한되지 않는다. 세포는 배양물의 필요에 따라 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50 ml, 100 ml, 150 ml, 200 ml, 250 ml, 300 ml, 350 ml, 400 ml, 450 ml, 500 ml, 550 ml, 600 ml, 800 ml, 1000 ml, 1500 ml, 또는 그 안에서 도출가능한 임의 범위의 부피로 배양될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양 베쓸은 조직 배양 플레이트, 예를 들어, 6 웰, 24 웰, 또는 96 웰 플레이트일 수 있다. 다른 실시양태에서, 배양 베쓸은 생물반응기일 수 있으며, 이는 세포가 증식될 수 있도록 생물학적 활성 환경을 지원하는 생체외 임의의 장치 또는 시스템을 지칭할 수 있다. 생물반응기는 적어도 또는 약 2, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500 ℓ, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 15 ㎥ 또는 그 안에서 도출가능한 임의 범위의 부피를 가질 수 있으며, 세포 집단의 성장을 지원하는 데 필요한 영양소와 함께 배양될 수 있다.

일반적으로, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 탄소원, 질소원 및 pH를 유지하기 위한 완충제를 포함하는 성장 배지 중에서 배양된다. 배지는 또한 지방산 또는 지질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민(들), 성장 인자, 사이토카인, 항산화 물질, 피루브산, 완충화제, 및 무기 염을 함유할 수 있다. 예시적인 성장 배지는 T 세포 성장을 증진시키기 위해 비필수 아미노산 및 비타민과 같은 다양한 영양소가 보충된 최소 필수 배지, 예컨대, 둘베코스 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's Modified Eagle's medium) 또는 ESSENTIAL 8™(E8™) 배지를 함유한다. 최소 필수 배지의 예로는 최소 필수 배지 이글(MEM) 알파 배지, 둘베코 변형 이글 배지(DMEM: Dulbecco's modified Eagle medium), 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(RPMI: Roswell Park Memorial Institute)-1640 배지, 199 배지, 및 F12 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 임의적으로, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 페니실린, 스트렙토마이신, 또는 테트라사이클린과 같은 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 글루타민 또한 조직 배양 배지에 첨가될 수 있다. 예컨대, 항생제 및 아미노산과 같은 첨가제가 당업계에 공지되어 있다.

추가로, 최소 필수 배지는 추가 첨가제, 예컨대, 인간, 태아 송아지 또는 소 혈청으로 보충될 수 있다. 혈청은 2.5% (부피/부피) 내지 약 15% (부피/부피), 예컨대, 약 10-15% (부피/부피), 예컨대, 2.5% (부피/부피), 약 5% (부피/부피), 약 6% (부피/부피), 약 7% (부피/부피), 약 8% (부피/부피), 약 9% (부피/부피), 약 10% (부피/부피), 약 11% (부피/부피), 약 12% (부피/부피), 약 13% (부피/부피), 약 14% (부피/부피), 또는 약 15% (부피/부피) 혈청의 농도로 포함될 수 있다. 혈청은 태아 송아지 혈청일 수 있다. 다른 실시양태에서, 혈청은 인간 혈청, 예컨대, 인간 AB 혈청이다.

대안적으로, 배지는 무혈청일 수 있다. 다른 경우에, 성장 배지는 혈청 대체물을 함유할 수 있다. 예시적인 혈청 대체물은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, KNOCKOUT™ 혈청 대체물은 예를 들어, 미국 특허 출원 제2002/0076747호(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 혈청에 대한 대안은 알부민(예컨대, 지질이 풍부한 알부민, 예컨대, 재조합 알부민과 같은 알부민 대체물, 식물 전분, 덱스트란 및 단백질 가수분해물), 트랜스페린(또는 다른 철 수송체), 지방산, 인슐린, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2-메르캅토에탄올, 3'-티올글리세롤, 또는 그와의 등가물을 적절하게 함유하는 물질을 포함할 수 있다. 혈청에 대한 대안은 예를 들어, 국제 공개 번호 WO 98/30679에 개시된 방법에 의해 제조될 수 있다.

배양물은 본질적으로 이종 동물 유래 성분이 없는 배지 또는 배양 조건을 지칭하는 "무-이종(XF: xeno-Free)"일 수 있다. 인간 세포를 배양하기 위해, 마우스와 같은 비인간 동물의 임의의 단백질은 이종 성분일 것이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 개시된 조건은 무-이종이다. 따라서, 인간 세포를 배양하기 위해, 인간 AB 혈청을 포함하는 배양물은 "무-이종"일 수 있다.

다른 배양 조건을 적절하게 정의할 수 있다. 예를 들어, 배양 온도는 약 30 내지 40℃, 예를 들어, 적어도 또는 약 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39℃일 수 있지만, 이에 특별히 제한되지는 않는다. 한 실시양태에서, 세포는 37℃에서 배양된다. CO₂ 농도는 약 1 내지 10%, 예를 들어, 약 2% 내지 5%, 또는 그 안에서 도출가능한 임의의 범위일 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 약 5% CO₂ 농도가 사용된다

1차 배양물을 유효량의 동종이계의 조사된 배양 보조 세포 및 사이토카인, 예컨대, IL-21, IL-15, IL-12, 종양 성장 인자(TGF: 종양 growth factor)-β 또는 IL-2로 자극하여 자극된 T 세포를 형성한다. 배양 보조 세포는 예를 들어, 동종이계의 조사된 말초 혈액 단핵 세포일 수 있다. 인간 배양 보조 세포를 포함하는 배양 보조 세포는 예컨대, 4000 rad의 감마 방사선으로 조사될 수 있다.

일부 실시양태에서, 일부 실시양태에서, 세포는 또한 다중클론 T 세포 자극제, 예를 들어, 피토헤마글루티닌으로 자극된다. T 세포는 예컨대, 비드 상에서 항CD3 및 항CD28로 자극될 수 있다. T 세포는 항CD3/항CD28 접합된 비드, 예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28과 함께 인큐베이션함으로써 활성화될 수 있고, 예를 들어, 예를 들어 미국 공개 출원 제US20140271635 A1호를 참조한다. 추가 실시양태에서, 예컨대, 비드 상에서의 항CD3/항CD28 자극은 사이토카인, 예컨대, IL-2와 함께 조합된다. 사이토카인은 또한 IL-21, IL-15, IL-12, 또는 TGF-β일 수 있다.

일부 실시양태에서, 약 1,000 내지 약 2,000개의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 약 100,000 내지 약 300,000개의 동종이계의 배양 보조 세포, 예컨대, 조사된 동종이계의 PBMC로 자극되도록 하는 비로 사용된다. 다른 실시양태에서, 약 1,000 내지 약 2,000개의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 약 200,000개의 동종이계의 배양 보조 세포로 자극되도록 하는 비로 사용된다.

사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-15 또는 IL-21이 배양물에 포함될 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-12 및/또는 TGF-β가 배양물에 포함된다.

일부 실시양태에서, IL-2는 약 0.3 내지 약 30,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 30,000 ng/ml, 약 30 내지 약 30,000 ng/ml, 약 300 내지 약 30,000 ng/ml 또는 약 3,000 내지 약 30,000 ng/ml의 농도로 배양물에 포함된다. IL-2는 약 3 내지 약 3,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 300 ng/ml, 또는 약 3 내지 약 30 ng/ml의 농도로 배양물에 포함될 수 있다. IL-2의 농도는 예를 들어, 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1 ng/ml일 수 있다. IL-2의 농도는 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 ng/ml일 수 있다. IL-2의 농도는 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 ng/ml일 수 있다. IL-2의 농도는 예를 들어, 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 또는 30,000 ng/ml일 수 있다. IL-2의 농도는 예를 들어, 약 15 내지 약 20 ng/ml, 예컨대, 18 ng/ml일 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-2는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml의 IL-2인 농도로 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, IL-2는 약 10 ng/ml의 농도로 포함된다. 또 다른 비제한적인 예에서, IL-2는 약 10 ng/ml 내지 약 170 ng/ml의 농도로 포함된다.

다른 실시양태에서, IL-15는 약 0.3 내지 약 30,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 30,000 ng/ml, 약 30 내지 약 30,000 ng/ml, 약 300 내지 약 30,000 ng/ml 또는 약 3,000 내지 약 30,000 ng/ml의 농도로 배양물에 포함된다. IL-15는 약 3 내지 약 3,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 300 ng/ml, 또는 약 3 내지 약 30 ng/ml의 농도로 배양물에 포함될 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 또는 30,000 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 15 내지 약 20 ng/ml, 예컨대, 18 ng/ml일 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-15는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml의 IL-15인 농도로 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, IL-15는 약 10 ng/ml의 농도로 포함된다. 또 다른 비제한적인 예에서, IL-15는 약 10 ng/ml 내지 약 170 ng/ml의 농도로 포함된다.

추가 실시양태에서, IL-12는 약 0.3 내지 약 30,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 30,000 ng/ml, 약 30 내지 약 30,000 ng/ml, 약 300 내지 약 30,000 ng/ml 또는 약 3,000 내지 약 30,000 ng/ml의 농도로 배양물에 포함된다. IL-12는 약 3 내지 약 3,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 300 ng/ml, 또는 약 3 내지 약 30 ng/ml의 농도로 배양물에 포함될 수 있다. IL-12의 농도는 예를 들어, 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1 ng/ml일 수 있다. IL-12의 농도는 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 ng/ml일 수 있다. IL-12의 농도는 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 ng/ml일 수 있다. IL-12의 농도는 예를 들어, 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 또는 30,000 ng/ml일 수 있다. IL-12의 농도는 예를 들어, 약 15 내지 약 20 ng/ml, 예컨대, 18 ng/ml일 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-12는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml의 IL-12인 농도로 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, IL-12는 약 10 ng/ml의 농도로 포함된다. 또 다른 비제한적인 예에서, IL-12는 약 10 ng/ml 내지 약 170 ng/ml의 농도로 포함된다.

추가 실시양태에서, IL-21은 약 0.3 내지 약 30,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 30,000 ng/ml, 약 30 내지 약 30,000 ng/ml, 약 300 내지 약 30,000 ng/ml 또는 약 3,000 내지 약 30,000 ng/ml의 농도로 배양물에 포함된다. IL-21은 약 3 내지 약 3,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 300 ng/ml, 또는 약 3 내지 약 30 ng/ml의 농도로 배양물에 포함될 수 있다. IL-21의 농도는 예를 들어, 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 또는 30,000 ng/ml일 수 있다. IL-15의 농도는 예를 들어, 약 15 내지 약 20 ng/ml, 예컨대, 18 ng/ml일 수 있다. 일부 실시양태에서, IL-21은 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml의 IL-21인 농도로 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, IL-21은 약 10 ng/ml의 농도로 포함된다. 또 다른 비제한적인 예에서, IL-21은 약 10 ng/ml 내지 약 170 ng/ml의 농도로 포함된다.

일부 실시양태에서, TGF-β는 약 0.3 내지 약 30,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 30,000 ng/ml, 약 30 내지 약 30,000 ng/ml, 약 300 내지 약 30,000 ng/ml 또는 약 3,000 내지 약 30,000 ng/ml의 농도로 배양물에 포함된다. TGF-β는 약 3 내지 약 3,000 ng/ml, 예컨대, 약 3 내지 약 300 ng/ml, 또는 약 3 내지 약 30 ng/ml의 농도로 배양물에 포함될 수 있다. TGF-β의 농도는 예를 들어, 약 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 또는 1 ng/ml일 수 있다. TGF-β의 농도는 예를 들어, 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30 ng/ml일 수 있다. TGF-β의 농도는 예를 들어, 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 또는 1,000 ng/ml일 수 있다. TGF-β의 농도는 예를 들어, 약 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 15,000, 20,000, 25,000 또는 30,000 ng/ml일 수 있다. TGF-β의 농도는 예를 들어, 약 15 내지 약 20 ng/ml, 예컨대, 18 ng/ml일 수 있다. 일부 실시양태에서, TGF-β는 약 5 ng/ml 내지 약 15 ng/ml의 TGF-β의 농도로 사용될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, TGF-는 약 10 ng/ml의 농도로 포함된다. 또 다른 비제한적인 예에서, TGF-β는 약 10 ng/ml 내지 약 170 ng/ml의 농도로 포함된다.

이어서, 자극된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 배양물을 시험관내 확장을 통해 신선한 조직 배양 배지 및 사이토카인, 예컨대, IL-2, IL-21, 및/또는 IL-15로 보충한다. 일부 실시양태에서, IL-2는 배양물에 포함된다. 다른 실시양태에서, IL-12는 배양물에 포함된다. 추가 실시양태에서, IL-15는 배양물에 포함된다. 상기 사이토카인의 조합 또한 유용하다.

배양은 임의의 기간 동안 유지될 수 있다. 일부 실시양태에서, 배양물에서 10 내지 30일 후에, 확장된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 사용을 위해 수확된다. 세포는 예를 들어, 배양물 중에서 약 15 내지 30일, 약 10 내지 12일, 또는 약 12 내지 30일 후에 수확될 수 있다. 세포는 배양물 중에서 after 약 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 후에 수확될 수 있다.

T 세포 수용체를 코딩하는 핵산의 단리 및 사용 방법

종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 T 세포 수용체(TCR)를 코딩하는 핵산을 단리하는 방법을 제공한다. 이들 방법은 종양 세포 항원을 발현하는 종양을 앓는 대상체로부터의 샘플로부터 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 단리하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양은 고형 종양, 예컨대, 두부경부 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 결장직장암이다. 종양은 난소암, 신장 세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 전립선암, 유방암, 교아세포종 또는 직장암일 수 있다. 대상체는 인간 대상체 또는 수의학적 대상체일 수 있다. 샘플은 말초 혈액 샘플 또는 종양 절제 샘플을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 대상체로부터의 임의의 샘플일 수 있다. CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 단리하는 방법을 본원에서 개시한다.

일부 실시양태에서, 본 방법은 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 것을 포함한다. 시험관내에서 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 방법 또한 개시한다. 다른 실시양태에서, 1차 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 이용되고, 여기서 세포는 시험관내에서 확장되지 않는다.

본 방법은 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포로부터의 TCR을 코딩하는 핵산 분자를 클로닝하는 단계를 추가로 포함한다. TCR 클로닝 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제8,697,854호(이는 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다. TCR은 면역글로불린 슈퍼 패밀리의 구성원이며, 일반적으로 α- 및 β-서브 유닛으로 이루어진다. 이들은 하나의 N-말단 면역글로불린(Ig) 가변(V) 도메인, 하나의 Ig 불변(C) 도메인, 막횡단/세포막 스패닝 영역, 및 C-말단 단부에 짧은 세포질 테일을 보유한다. TCR α 쇄 및 β 쇄, 둘 모두의 가변 도메인은 3개의 초가변 또는 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)을 갖는 반면, β 쇄의 가변 영역은 일반적으로 항원과 접촉하지 않는 추가의 초가변 영역(HV4)을 가지며, 따라서 CDR로 간주되지 않는다.

CDR3은 프로세싱된 항원을 인식하는 주요 CDR이지만, 알파 쇄의 CDR1은 또한 항원성 펩티드의 N-말단부와 상호작용하는 것으로 나타났다. β 쇄의 CDR1은 또한 펩티드의 C-말단부와 상호작용한다. CDR2는 MHC를 인식하는 것으로 간주된다. β 쇄의 CDR4는 항원 인식에 참여하지 않는 것으로 간주되지만, 초항원과 상호작용하는 것으로 나타났다. TCR 도메인의 불변 도메인은 시스테인 잔기가 이황화 결합을 형성하는 짧은 연결 서열로 이루어지며, 이는 두 쇄 사이에 연결을 형성한다. 특정 항원에 대한 TCR의 친화도에 기인하여 이는 치료상 유용하다. 예를 들어, 특정 TCR을 발현하는 T 세포에 의한 입양 면역요법을 사용함으로써 종양을 효과적으로 치료할 수 있다. TCR을 클로닝하는 방법, 및 TCR로 형질감염된 세포를 이용하여 입양 면역요법을 이용하는 방법은 PCT 공개 번호 WO 2006/031221, 미국 특허 제5,906,936호; PCT 공개 번호 WO97/32603; PCT 공개 번호 WO2007/065957, 및 PCT 공개 번호 WO2008/039818에 개시되어 있다. TCR을 코딩하는 핵산 분자 및 상기 수용체를 포함하는 T 세포(또는 NK 세포)를 생성하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668]; [Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, published online February 23, 2010, pages 1-9]; [Till et al., 2008, Blood, 1 12:2261 -2271]; [Park et al., Trends Biotechnol., 29:550-557, 2011]; [Grupp et al., N Engl J Med., 368:1509-1518, 2013]; [Han et al., J. Hematol Oncol., 6:47, 2013]; PCT 공개 WO2012/079000, WO2013/126726; 및 미국 공개 2012/0213783(이들은 각각 그 전문이 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

일부 실시양태에서, 단일 세포 RNA 서열은 T 세포 수용체 또는 pair-seq(Adaptive)에 사용된다. 한 비제한적인 예에서, 정제된 T 세포는 플루다임(fluidigm) 또는 10x 게노믹스(Genomics) 기기를 사용하여 단일 세포로 단리된다. 이어서, T 세포 DNA를 증폭시키고, 시퀀싱한다. T 세포는 상기 프로세스를 위해 프라이밍되거나, 또는 항원 제시될 필요는 없다.

적절한 클로닝 및 시퀀싱 기술의 추가 예 및 많은 클로닝 실시를 통해 당업자에게 지시하기에 충분한 지침은 공지되어 있다(예컨대, 문헌 [Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4^th ed, Cold Spring Harbor, New York, 2012)] 및 [Ausubel et al. (In Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, through supplement 104, 2013)] 참조). 생물학적 시약 및 실험 장비의 제조사로부터의 제품 정보도 유용한 정보를 제공한다. 상기 제조사로는 SIGMA 케미칼 컴퍼니(SIGMA Chemical Company: 미국 미주리주 세인트루이스 소재), R&D 시스템즈(R&D Systems: 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재), 파마시아 애머샴(Pharmacia Amersham: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), CLONTECH 라보라토리즈 인크.(CLONTECH Laboratories, Inc.: 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 켐 진즈 코포레이션(Chem Genes Corp), 알드리치 케미칼 컴퍼니(Aldrich Chemical Company: 미국 위스콘신주 밀워키 소재), 글렌 리서치 인크(Glen Research, Inc), GIBCO BRL 라이프 테크놀로지즈 인크.(GIBCO BRL Life Technologies, Inc: 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재), 플루카 케미카-바이오케미카 아날리티카(Fluka Chemica-Biochemika Analytika)(Fluka Chemie AG: 스위스 부흐 소재), 인비트로젠(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재)뿐만 아니라, 당업자에게 공지된 다른 많은 상업적 공급원을 포함한다.

TCR을 코딩하는 핵산 서열은 임의의 적합한 방법에 의해 제조될 수 있다. 일단 전체 서열이 클로닝되고, 공지되며, 예컨대, 문헌 [Narang et al., Meth . Enzymol. 68:90-99, 1979]의 포스포트리에스테르 방법; 문헌 [Brown et al., Meth . Enzymol . 68:109-151, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett . 22:1859-1862, 1981]의 디에틸포스포라미다이트 방법; 예를 들어, 문헌 [Needham-VanDevanter et al., Nucl . Acids Res. 12:6159-6168, 1984]에 기술된 바와 같이 자동화된 합성기를 이용하여 문헌 [Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts . 22(20):1859-1862, 1981]에 의해 기술된 고상; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고상 방법과 같은 방법에 의해 직접 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 이는 상보적 서열과의 하이브리드화 또는 단일 가닥을 주형으로 사용하여 DNA 폴리머라제를 이용한 중합에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다.

핵산은 또한 증폭 방법에 의해 제조될 수 있다. 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR: polymerase chain reaction), 리가제 연쇄 반응(LCR: ligase chain reaction), 전사 기반 증폭 시스템(TAS: transcription-based amplification system), 자기 부양 서열 복제 시스템(3SR: self-sustained sequence replication system)을 포함한다. 다양한 클로닝 방법, 숙주 세포, 및 시험관 내 증폭 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다. 생물학적 활성을 감소시키지 않으면서, 본원에 기술된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 변형시킬 수 있다. 표적화 분자의 융합 단백질로의 클로닝, 발현 또는 도입을 용이하게 하기 위해 일부 변형이 이루어질 수 있다. 이러한 변형은 당업자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, 종결 코돈, 아미노 말단에 부가되어 개시 부위를 제공하는 메티오닌, 편리하게 위치된 제한 부위를 생성하기 위해 양쪽 말단에 배치된 추가 아미노산, 또는 정제 단계를 돕기 위한 추가 아미노산(예컨대, 폴리 His)를 포함한다.

TCR을 코딩하는 핵산 분자는 이종 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. TCR을 코딩하는 핵산 분자는 숙주 세포에서의 발현을 위한 벡터(예를 들어, 렌티바이러스 벡터 또는 감마 레트로바이러스 벡터)에 포함될 수 있다. 예시적인 세포는 포유동물 세포이며, T 세포, 예컨대, 세포독성 T 림프구(CTL) 및 NK 세포를 포함한다. 특정의 비제한적인 예에서, 세포는 T 세포, 예를 들어, CD3⁺ T 세포이다. CD3⁺ T 세포는 CD4⁺ T 세포일 수 있다.

핵산 분자는 또한 예컨대, 박테리아, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 재조합으로 조작된 세포에서 발현될 수 있다. TCR은 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 항체 및 항원 결합 단편을 발현 및 정제하는 방법은 공지되어 있고, 본원에 추가로 기술되어 있다(예컨대, 문헌 [Al-Rubeai (ed), Antibody Expression and Production, Springer Press, 2011] 참조). 당업자는 E. 콜라이(E. coli), 다른 박테리아 숙주, 효모, 및 다양한 고등 진핵 세포, 예컨대, COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주를 비롯한, 단백질의 발현에 이용가능한 수많은 발현 시스템에 대해 잘 알고 있다. 용어 "숙주 세포"는 또한 대상체 숙주 세포의 임의의 자손도 포함한다. 복제 중에 발생하는 돌연변이가 있을 수 있기 때문에 모든 자손이 모체 세포와 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 외래 DNA가 숙주에서 지속적으로 유지됨을 의미하는 안정한 전달 방법이 당업계에 공지되어 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 본 개시내용의 구체적인 실시양태는 TCR을 발현하는 T 세포, 예컨대, 인간 T 세포 및 인간 NK 세포를 포함한다. 상기 T 세포는 CD3⁺ T 세포, 예컨대, CD4⁺ 또는 CD8⁺ T 세포일 수 있다.

TCR을 코딩하는 핵산의 발현, 프로모터(구성적 또는 유도성), 이어서 발현 카세트 내로의 도입. 프로모터는 거대세포바이러스 프로모터 및 인간 T 세포 림프친화 바이러스 프로모터(HTLV: human T cell lymphotrophic virus promoter)-1을 비롯한, 임의의 관심 프로모터일 수 있다. 임의적으로, 예컨대, 거대세포바이러스 인핸서와 같은 인핸서가 구조물에 포함된다. 카세트는 원핵생물 또는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 발현 카세트는 단백질을 코딩하는 DNA의 발현을 조절하는 데 유용한 특정 서열을 함유한다. 예를 들어, 발현 카세트는 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 종결 인자, 개시 서열, 단백질-코딩 유전자 앞의 개시 코돈(즉, ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하는 유전자의 정확한 판독 프레임을 유지하기 위한 서열, 및 정지 코돈을 포함할 수 있다. 벡터는 약물 내성(예를 들어, 암피실린 또는 테트라사이클린 내성)을 코딩하는 마커와 같은 선별가능한 마커를 코딩할 수 있다.

클로닝된 유전자의 고수준 발현을 얻기 위해서는, 최소한, 전사를 지시하는 강력한 프로모터, 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위(내부 리보솜 결합 서열), 및 전사/번역 종결인자를 포함하는 발현 카세트를 구성하는 것이 바람직하다. 진핵 세포의 경우, 제어 서열은 예를 들어, 면역글로불린 유전자, HTLV, SV40 또는 거대세포바이러스로부터 유래한 프로모터 및/또는 인핸서, 및 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있으며, 스플라이스 공여자 및/또는 수용자 서열(예를 들어, CMV 및/또는 HTLV 스플라이스 수용자 및 공여자 서열)을 추가로 포함할 수 있다.

숙주가 진핵생물일 경우, 인산칼슘 공침전과 같은 DNA의 형질 감염 방법, 통상적인 기계적 절차, 예컨대, 미세주입, 전기천공, 리포솜에 둘러싸인 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 카세트에 의해 형질전환된 세포는 카세트에 함유된 유전자, 예컨대, amp, gpt, neo 및 hyg 유전자에 의해 부여된 항생제에 대한 내성에 의해 선별될 수 있다.

진핵 세포는 또한 TCR을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 예컨대, 단순 포진 티미딘 키나제 유전자와 같은 선별가능한 표현형을 코딩하는 제2 외래 DNA 분자와 함께 동시에 형질전환될 수 있다. 또 다른 방법은 진핵 세포를 일시적으로 감염 또는 형질전환시키고, 단백질을 발현시키기 위해 시미안 바이러스 40(SV40), 렌티 바이러스 또는 소 유두종 바이러스와 같은 진핵 바이러스 벡터를 사용하는 것이다(예를 들어, 문헌 [Viral 발현 Vectors, Springer press, Muzyczka ed., 2011] 참조). 당업자는 예컨대, COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주와 같은 고등 진핵 세포를 포함하는 세포에서 단백질을 생산하는 데 사용되는 플라스미드 및 벡터와 같은 발현 시스템을 쉽게 사용할 수 있다.

일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 TCR의 발현에 이용된다. 바이러스 벡터는 시미안 바이러스 40, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스(AAV: adeno-associated virus), 렌티바이러스 벡터, 및 레트로바이러스, 예컨대, 감마 레트로바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 레트로바이러스 벡터는 진핵 세포 내로의 유전자 전달을 위한 매우 효율적인 방법을 제공한다. 추가로, 레트로바이러스 통합은 제어된 방식으로 발생하며, 세포당 새로운 유전자 정보의 하나 또는 몇몇 카피의 안정적인 통합을 초래한다. 이론에 제한되지 않으면서, 렌티바이러스 벡터는 예컨대, 간세포와 같은 비증식 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 예컨대, 뮤린 백혈병 바이러스와 같은 온코-레트로바이러스로부터 유래된 벡터보다 유리하다. 또한, 면역원성이 낮다는 추가의 이점이 있다. TCR을 발현하기 위한 렌티바이러스 벡터의 사용은 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어, 미국 출원 제2014/0050708호에 개시되어 있다(이는 본원에서 참조로 포함된다). 트랜스포손이 사용될 수 있다.

일부 실시양태에서, 관심 대상체로의 도입을 위해 숙주 세포가 생산된다. 숙주 세포는 말초 혈액 림프구(PBL: peripheral blood lymphocyte) 또는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell), 정제된 T 세포, 또는 정제된 NK 세포일 수 있다. T 세포는 임의의 T 세포, 예컨대, 배양된 T 세포, 예컨대, 1차 T 세포, 또는 배양된 T 세포주, 예컨대, Jurkat, SupT1 등으로부터의 T 세포, 또는 포유동물(예컨대, TCR-T 세포가 추후에 투여될 인간 환자)로부터 얻은 T 세포일 수 있다. 인간 대상체와 같은 포유동물 대상체로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선, 또는 다른 조직 또는 체액을 포함하나, 이에 제한되지 않는 수많은 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. T 세포는 임의의 유형의 T 세포일 수 있으며, CD3⁺ 세포, CD4⁺/CD8⁺ 이중 양성 T 세포, CD4⁺ 헬퍼 T 세포, 예컨대, Th₁ 및 Th₂ 세포, CD8⁺ T 세포(예컨대, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 세포, 기억 T 세포, 천연 T 세포 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 발생 단계의 것일 수 있다. T 세포는 CD3⁺ T 세포, 예컨대, CD8⁺ T 세포 또는 CD4⁺ T 세포일 수 있다. 대안적 실시양태에서, 세포는 NK 세포, 예컨대, TCRNK 세포가 나중에 투여될 동일한 대상체로부터 수득된 NK 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 수의학적 대상체로부터의 것이다.

본원에 기술된 적어도 하나의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단 또한 제공된다. 세포 집단은 TCR을 코딩하는 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포, 게다가 재조합 발현 벡터를 전혀 포함하지 않는 적어도 하나의 다른 세포, 예컨대, 숙주 세포(예컨대, T 세포), 또는 T 세포 이외의 세포, 예컨대, B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구 등을 포함하는 이종 집단일 수 있다. 대안적으로, 세포 집단은 실질적으로 동종 집단일 수 있으며, 여기서 집단은 TCR을 코딩하는 재조합 발현 벡터를 포함하는(예컨대, 이들로 본질적으로 이루어진) 숙주 세포를 주로 포함한다. 집단은 또한 세포의 클론 집단일 수 있으며, 여기서 집단의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론이므로, 집단의 모든 세포는 재조합 발현 벡터를 포함한다. 본 발명의 한 실시양태에서, 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론 집단이다. T 세포는 CD3+ T 세포, 예컨대, CD8⁺ T 세포 또는 CD4⁺ T 세포일 수 있다. 세포는 NK 세포일 수 있다.

세포는 수용자에게 자가 유래의 것일 수 있다. 수용자는 종양을 앓거나, 또는 종양을 앓을 위험이 있을 수 있다. 수용자는 종양에 대한 사전 치료를 받았을 수 있다. 종양은 고형 종양일 수 있고, 예컨대, 고형 종양은 두부경부 편평 세포 암종, 흑색종, 또는 결장직장암이다. 종양은 폐암, 난소암, 신장 세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 전립선암, 유방암, 교아세포종 또는 직장암일 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가 T 세포 또는 NK 세포는 대상체, 예컨대, 인간 대상체로부터 단리된 것이고, 단리된 TCR은 이들 세포 내로 도입된다. 이어서, 이들 형질전환된 세포는 대상체에게 재도입된다. 이 시나리오에서 공여자와 수용자는 동일한 대상체이다. 대상체는 인간일 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체에게는 치료 유효량의 TCR을 발현하는 T 세포 및/또는 클로닝된 NK 세포가 투여된다. 특정 실시양태에서(미국 공개 출원 제US20140271635 A1(이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조), 확장 및 유전자 변형 전에, T 세포의 공급원이 대상체로부터 수득된다.

일부 실시양태에서, T 및/또는 NK 세포는 자가 유래의 것이다. 다른 실시양태에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 동종이계의의 것이다. 이어서, T 세포 및/또는 NK 세포는 이후 상기 개시된 바와 같이 대상체에 도입된다. 한 실시양태에서, 세포는 형질도입 후 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 또는 30일 동안, 예컨대, 약 4 내지 30일, 예컨대, 약 10 내지 15일, 또는 약 10 내지 30일 동안 벡터를 일시적으로 발현한다. 한 비제한적인 예에서, 벡터는 전기 천공에 의해 T 세포내로 형질 도입된다.

용어 "대상체"는 면역 반응이 유도될 수 있는 살아있는 유기체(예컨대, 포유동물)를 포함하는 것으로 의도된다. 대상체의 예로는 인간, 개, 고양이, 마우스, 래트, 돼지(및 다른 수의학적 대상체) 및 비인간 영장류를 포함한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위의 조직, 복수, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 다른 실시양태에서, 당업계에서 이용가능한 임의의 많은 T 세포주가 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 백혈구 성분 채집술을 거칠 수 있으며, 여기서 백혈구를 생체외에서 수집, 농축 또는 고갈시켜 관심 세포, 예컨대, T 세포 및/또는 NK 세포를 선별 및/또는 단리한다. 이들 세포 단리물을 당업계에 공지된 방법에 의해 확장시키고, TCR 구성물이 도입되도록 처리하여 클로닝된 TCR을 발현하는 자가 세포를 생성할 수 있다. 한 측면에서, TCR 발현 세포는 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 렌티바이러스 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 사용하여 생성된다. 일부 비제한적인 예에서, T 세포 및/또는 NK 세포는 예컨대, 피콜™ 분리와 같은 당업자에게 공지된 임의의 많을 기술을 사용하여 대상체로부터 수집된 혈액 단위로부터 수득될 수 있거나, 세포는 성분 채집에 의해 수득될 수 있다. 성분 채집 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, NK 세포, 다른 유핵 백혈구, 적혈구 및 혈소판을 포함한 림프구를 함유한다.

성분 채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고, 세포를 후속 프로세싱 단계에 적합한 완충제 또는 배지에 넣을 수 있다. 일부 비제한적인 예에서, 세포는 포스페이트 완충처리된 염수(PBS: phosphate buffered saline)로 세척된다. 대안적인 예에서, 세척 용액에는 칼슘이 결여되어 있고, 마그네슘이 없을 수 있거나, 또는 모두 2가 양이온이 아니더라도 다수가 결여되어 있을 수 있다. 칼슘 부재하에서의 초기 활성화 단계는 확대 활성화로 이어질 수 있다. 세척 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해, 예컨대, 반자동 "관류형" 원심 분리(예를 들어, 코베(Cobe) 2991 세포 프로세서, 백스터 CYTOMATE(Baxter CYTOMATE)® 또는 HAEMONETICS CELL SAVER 5®)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 달성될 수 있다. 세척 후, 세포는 완충제를 포함 또는 미포함 생리 염수 용액과 같은 다양한 생체 적합성 완충제 중에 재현탁될 수 있다. 대안적으로, 성분 채집 샘플의 바람직하지 않은 성분을 제거하고, 세포를 배양 배지에 바로 재현탁시킬 수 있다.

일부 실시양태에서, T 세포는 음성 선별에 의해 말초 혈액 림프구로부터 단리된다. 예컨대, CD3+, CD4+, CD28+ CD45RA+, 및 CD45RO+ T 세포, 나이브 및/또는 기억 T 세포와 같은 T 세포의 특정 서브집단은 양성 또는 음성 선별 기술에 의해 추가로 단리될 수 있다. 예를 들어, T 세포는 원하는 T 세포를 자극하는 데 충분한 시간 동안 항CD3/항CD28 접합된 비드, 예컨대, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T, 또는 CD3/IL-2와 함께 인큐베이션시킴으로써 T 세포를 활성화시킬 수 있었고, 예를 들어, 미국 공개 출원 제US20140271635 A1호를 참조한다. 비드는 밀테니이(Miltenyi) 비드일 수 있다. 비제한적인 예에서, 기간은 약 24 내지 약 72시간이고, 그 사이의 모든 정수 값이다. 추가의 비제한적인 예에서, 기간은 적어도 24시간, 36, 48시간 이상이다. 면역손상된 개체로부터 단리하는 경우와 같이, 다른 세포 유형에 비해 T 세포가 거의 없는 어떤 상황에서는 더 긴 배양 시간을 사용하여 T 세포를 단리시킬 수 있다. 다회 라운드의 선별을 사용할 수도 있다.

음성 선별에 의한 T 세포 집단의 농축은 음성 선별된 세포에 고유한 표면 마커에 대한 항체의 조합으로 달성될 수 있다. 한 방법은 음성으로 선별된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대한 단일클론 항체의 칵테일을 사용하는 음성 자기 면역 부착 또는 유세포 분석법을 통한 세포 분류 및/또는 선별이다. 예를 들어, 음성 선별에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 전형적으로 CD8a, CD14, CD15, CD16, CD19, CD36, CD56, CD132, TCR γ/σ, 및 CD235a(글리코포린 A(Glycophorin A))에 대한 항체를 포함한다. 음성 선별에 의해 CD8+ 세포를 농축하기 위해, 단일클론 항체 칵테일은 CD4, CD15, CD16, CD19, CD34, CD36, CD56, CD123, TCR γ/δ 및 CD235a에 대한 항체를 함유한다. 하나 이상의 사이토카인을 발현하는 T 세포 집단이 선별될 수 있다. 세포 발현에 대한 스크리닝 방법은 PCT 공개 번호 WO 2013/126712에 개시되어 있다.

양성 또는 음성 선별에 의해 원하는 세포 집단을 단리하기 위해, 세포 및 표면(예컨대, 비드와 같은 입자)의 농도를 변화시켜 세포와 비드가 최대로 접촉할 수 있도록 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 100만 개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가 실시양태에서, 1억 개 초과의 세포/ml가 사용된다. 다른 실시양태에서, 1,000만, 1,500만, 2,000만, 2,500만, 3,000만, 3,500만, 4,000만, 4,500만, 5,000만, 5,500만, 6,000만, 6,500만, 7,000만, 7,500만, 8,000만, 8,500만, 9,000만, 9,500만, 또는 1억 개의 세포/ml의 세포 농도가 사용된다. 이론에 제한되지 않으면서, 고농도를 사용하면 세포 수율 증가, 세포 활성화, 및 세포 확장이 이루어질 수 있다. 더 낮은 농도의 세포 또한 사용될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, T 세포와 표면 (예컨대, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의적으로 희석시키면, 입자와 세포 사이의 상호작용이 최소화된다. 이는 입자에 결합될 다량의 원하는 항원을 발현하는 세포를 선별한다. 일부 실시양태에서, 사용되는 세포의 농도는 5Х10⁶/ml이다. 다른 실시양태에서, 사용되는 농도는 약 1Х10⁵/ml 내지 1Х10⁶/ml, 및 그 사이의 임의의 정수 값일 수 있다.

세포는 2-10℃, 또는 실온에서 다양한 속도로 다양한 기간 동안 회전장치에서 인큐베이션될 수 있다. 자극을 위한 T 세포는 또한 세척 단계 후에 동결될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, 동결 및 후속 해동 단계는 세포 집단에서 과립구 및 어느 정도의 단핵구를 제거함으로써 더 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후, 세포를 동결 용액에 현탁시킬 수 있다. 다수의 동결 용액 및 파라미터가 당업계에 공지되어 있고, 이와 관련하여 유용하겠지만, 한 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민 및 75% DMSO, 또는 31.25% 플라즈마라이트-A(PlasmaLyte-A), 31.25% 덱스트로스 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로스, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지, 또는 예를 들어, 헤스판(Hespan) 및 플라스마라이트 A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 배지의 사용을 포함하고, 이어서, 세포는 분당 1°의 속도로 -80℃에서 동결되고, 액체 질소 저장 탱크의 기상에 보관된다. -20℃에서 또는 액체 질소에서 즉시 제어되지 않는 동결 뿐만 아니라, 제어된 동결의 다른 방법이 사용될 수 있다(미국 공개 제US-2014-0271635 A1호 참조).

혈액 샘플 또는 성분 채집 생성물은 본원에 기술된 바와 같이 확장된 세포가 필요할 수 있을 때 이전에 대상체로부터 수집될 수 있다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 어느 시점에든 수집될 수 있고, T 세포와 같이 원하는 세포는 본원에 기술된 것들과 같이 T 세포 요법이 유익할 다수의 질병 또는 병태를 위한 T 세포 요법에서 나중에 사용하기 위해 단리되고, 동결될 수 있다. 한 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분 채집은 일반적으로 건강한 대상체로부터 취해진다. 특정 측면에서, 혈액 샘플 또는 성분 채집은 종양과 같은 질환이 발병할 위험이 있지만, 아직 질환이 발병하지 않은 건강한 대상체로부터 채취되고, 나중에 사용하기 위해 관심 세포가 단리되고, 동결된다. 특정 측면에서, T 세포는 확장, 동결 및 추후에 사용될 수 있다. 특정 측면에서, 본원에 기술된 바와 같이, 샘플은 종양과 같은 특정 질환의 진단 직후, 단, 임의의 치료 전에 환자로부터 수집된다. 추가의 측면에서, 세포는 다수의 관련 치료 양식에 앞서 대상체로부터 혈액 샘플 또는 성분 채집으로부터 단리된다. 특정 측면에서, 동결보존된 세포는 본원에 기술된 바와 같이 해동되고, 세척되며, 사용 전에 실온에서 1시간 동안 휴지되다. 혈액 샘플 또는 성분 채집 생성물은 필요할 때 대상체로부터 수집될 수 있으며, 동결되지 않는다. 일부 실시양태에서, 자가 종양 보유 T 세포는 후속 형질 감염 및 주입을 위해 개체로부터 단리된다.

T 세포는 일반적으로 예를 들어, 미국 특허 번호 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 활성화 및 확장될 수 있다. T 세포는 CD3/TCR 복합체 연관 신호를 자극하는 작용제 및 T 세포의 표면상의 공동 자극 분자를 자극하는 리간드에 부착된 표면과의 접촉에 의해 확장될 수 있다. T 세포는 또한 PHA를 사용하여 확장될 수 있거나, 벌크 PBMC를 CD3/28 또는 CD3/IL2로 자극할 수 있다. 일부 비제한적인 예에서, T 세포 집단은 본원에 기술된 바와 같이, 예컨대, 항CD3 항체, 또는 그의 항원 결합 단편, 또는 표면에 고정된 항CD2 항체와의 접촉에 의해, 또는 칼슘 이온 운반체와 함께 단백질 키나제 C 활성인자(예컨대, 브리오스타틴)와의 접촉에 의해 자극될 수 있다. T 세포의 표면에서 보조 분자의 공동 자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드가 사용된다. 예를 들어, T 세포 집단은 T 세포의 증식을 자극하기에 적합한 조건하에서 항CD3 항체 및 항CD28 항체와 접촉될 수 있다. CD4+ T 세포의 증식을 자극하기 위해, 항CD3 항체 및 항CD28 항체가 사용될 수 있다. 항CD28 항체의 예는 93, B-T3, XR-CD28(Diaclone: 프랑스 브장송 소재)을 포함한다. 당업계에 통상적으로 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다(문헌 [Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998]; [Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999]; [Garland et al., J. Immunol. Meth. 227(1-2):53-63, 1999]). 다른 방법은 T 세포 증식을 자극하기 위해 피토헤마글루티닌과 함께 동종이계의 조사된 PBMC의 사용을 포함한다.

일단 TCR이 단리되면, 다양한 검정법을 이용하여 분자의 활성, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 항원 자극 후 T 세포를 확장시키는 능력, 재자극 없이 T 세포 확장을 유지하는 능력, 및 적절한 시험관내 및 동물 모델에서의 항암 활성을 평가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 4-1BB와 같은, 활성화 마커의 상향조절은 예컨대, 유세포 분석법에 의해 평가된다.

본 방법은 클로닝된 TCR을 발현하는 치료 유효량의 약학 조성물 세포, 예컨대, T 세포 및/또는 NK 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이를 필요로 하는 대상체, 예컨대, 종양을 앓는 대상체는 이어서, 화학요법 또는 수술(암의 경우) 또는 항바이러스제(HIV 감염의 경우)로 표준 치료를 받을 수 있다. 이종성 TCR을 발현하는 숙주 세포의 투여는 예컨대, 종양 부피 감소, 전이 감소, 또는 종양의 징후 또는 증상의 감소와 같이 종양을 치료할 수 있다.

약학 조성물은 하나 이상의 약학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 조합하여 TCR 발현 숙주 세포, 예컨대, 본원에 기술된 바와 같은 다수의 TCR 발현 숙주 세포를 포함할 수 있다. TCR 발현 숙주 세포는 T 세포, 예컨대, CD3⁺ T 세포, 예컨대, CD4⁺ 및/또는 CD8⁺ T 세포, 및/또는 NK 세포일 수 있다. 상기 조성물은 완충제, 예컨대, 중성 완충처리된 염수, 포스페이트 완충처리된 염수 등; 탄수화물, 예컨대, 글루코스, 만노스, 수크로스 또는 덱스트란, 만닛톨; 단백질; 폴리펩티드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; 킬레이트제, 예컨대, EDTA 또는 글루타티온; 애주번트(예컨대, 수산화알루미늄); 보존제를 포함할 수 있다.

세포와 관련하여, 세포를 도입하기 위해 다양한 수성 담체, 예를 들어, 완충 염수 등이 사용될 수 있다. 이들 용액은 멸균되고, 일반적으로 바람직하지 않은 물질이 없다. 이들 조성물은 통상적인, 널리 공지된 멸균화 기술에 의해 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 예컨대, pH 조정제 및 완충화제, 독성 조정제 등과 같은 생리학적 조건에 근접하도록 하는 데 필요한 약학적으로 허용되는 보조 물질, 예를 들어, 아세트산나트륨, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 락트산 나트륨 등을 함유할 수 있다. 이들 제제의 농도는 광범위하게 변할 수 있으며, 선택된 특정 투여 모드 및 대상체의 필요에 따라 주로 유체 부피, 점도, 체중 등에 기초하여 선택될 것이다.

한 실시양태에서, 약학 조성물은 예컨대, 내독소, 미코플라스마, 복제 가능 렌티바이러스(RCL: replication competent lentivirus), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항CD8/항CD39/항CD103 코팅된 비드, 마우스 항체, 풀링된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 박테리아 및 진균과 같은 오염 물질을 실질적으로 함유하지 않고, 예컨대, 상기 오염 물질이 검출가능한 수준으로 존재하지 않는다.

투여되는 조성물의 정확한 양은 환자(대상체)의 연령, 체중, 종양 크기, 전이 정도, 및 상태의 개인차를 고려하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 본원에 기술된 T 세포(및/또는 NK 세포)를 포함하는 약학 조성물은 10⁴ 내지 10⁹개의 세포/kg(체중), 예컨대, 10⁵ 내지 10⁶개의 세포/kg(체중)(상기 범위 내의 모든 정수 값 포함)의 투여량으로 투여될 수 있다고 언급될 수 있다. 예시적인 용량은 10⁶개의 세포/kg 내지 약 1 X 10⁸개의 세포/kg, 예컨대, 약 5 X 10⁶개의 세포/kg 내지 약 7.5 X 10⁷개의 세포/kg, 예컨대, 약 2.5 X 10⁷개의 세포/kg, 또는 약 5.0 X 10⁷ 개의 세포/kg이다.

조성물은 상기 투여량으로 1회 또는 다회, 예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10회 투여될 수 있다. 조성물은 면역 요법에 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(예컨대, 문헌 [Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988] 참조). 조성물은 매일, 매주, 격월 또는 매월 투여될 수 있다. 일부 비제한적인 예에서, 조성물은 정맥내 투여용으로 제제화되고, 다회 투여된다. 투여량 및 투여 빈도는 대상체의 상태, 및 대상체 질환의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정되지만, 적절한 투여량은 임상 시험에 의해 결정될 수 있다.

한 실시양태에서, TCR은 T 세포 또는 NK 세포와 같은 세포로 도입되고, 대상체는 세포의 초기 투여 및 세포의 1회 이상의 후속 투여를 받고, 여기서 1회 이상의 후속 투여는 이전 투여 후 15일, 예컨대, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 또는 2일 미만 내에 투여된다. 한 실시양태에서, 주당 1회 초과의 세포 투여가 대상체(예컨대, 인간)에게 제공되고, 예컨대, TCR 발현 세포의 주당 2, 3, 또는 4회 투여가 제공된다. 한 실시양태에서, 대상체는 주당 1회 초과의 T 세포 투여(예컨대, 주당 2, 3, 또는 4회 투여)(사이클로도 지칭됨)를 투여한 후, 1주일 동안 투여를 받지 않은 후, TCR 발현 세포의 1회 이상의 추가 투여(예컨대, 주당 1회 초과의 세포 투여)가 대상체에게 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 대상체(예컨대, 인간 대상체)는 1회 초과의 사이클의 TCR 발현 세포를 받고, 각 사이클 사이의 시간은 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3일 미만이다. 한 실시양태에서, TCR 발현 세포는 주당 3회 투여를 위해 격일로 투여된다. 또 다른 실시양태에서, TCR 발현 세포는 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8주 이상 동안 투여된다. 환자에게 투여되는 상기 치료법의 투여량은 치료되는 병태 및 치료 수용자의 정확한 특성에 따라 달라질 것이다. 인간 투여를 위한 투여량의 스케일링은 당업계에 수용된 관행에 따라 수행될 수 있다.

일부 실시양태에서, TCR 변형된 T 세포는 생체내에서 복제하여 지속되는 종양 제어를 유발할 수 있는 장기 지속성을 초래할 수 있다. 다양한 측면에서, 대상체에게 투여된 T 세포, 또는 이들 세포의 자손은 대상체에게 T 세포 투여 후 대상체에서 적어도 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 13개월, 14개월, 15개월, 16개월, 17개월, 18개월, 19개월, 20개월, 21개월, 22개월, 23개월 동안, 또는 수년 동안 지속된다. 다른 실시양태에서, 세포 및 이들의 자손은 대상체에게 T 세포의 투여 후 6개월, 5개월, 4개월, 3개월, 2개월 또는 1개월 미만, 예컨대, 3주, 2주, 1주 동안 존재한다.

본 조성물의 투여는 주사, 수혈, 또는 이식(implantation/transplantation) 을 포함한 임의의 편리한 방식으로 수행될 수 있다. 개시된 조성물은 경동맥(trans arterial), 피하, 피내, 종양내, 절내, 골수내, 근육내, 정맥내(i.v.) 주사 또는 복강내로 환자에게 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 피내 또는 피하 주사에 의해 환자에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 i.v. 주사에 의해 투여된다. 조성물은 또한 종양 또는 림프절로 직접 주사될 수 있다.

한 실시양태에서, 단리된 세포 집단을 함유하는 조성물은 또한 하나 이상의 추가의 약제, 예컨대, 하나 이상의 항미생물제(예를 들어, 항생제, 항바이러스제 및 항진균제), 항종양제(예를 들어, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 고갈제(예를 들어, 플루다라빈, 에토포시드, 독소루비신, 또는 빈크리스틴), 또는 비스테로이드성 항염증제(예컨대, 아세틸살리실산, 이부프로펜, 또는 나프록센 나트륨), 사이토카인(예를 들어, 인터루킨-2) 또는 백신을 함유할 수 있다. 다수의 화학요법제가 현재 당업계에 공지되어 있다. 한 실시양태에서, 화학요법제는 유사 분열 억제제, 알킬화제, 대사길항제, 인터킬레이팅 항생제, 성장 인자 억제제, 세포주기 억제제, 효소, 토포이소머라제 억제제, 항생존제, 생체 반응 조절제, 항호르몬, 예컨대, 항안드로겐제, 및 항혈관형성제로 구성된 군으로부터 선택된다.

악성 종양의 치료를 위해, 상기 방법은 또한 치료 유효량의 추가 암 치료제(화학요법제 및 방사선 포함) 또는 수술을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.

TCR을 발현하는 세포는 수술, 방사선, 화학요법 또는 면역요법과 함께 투여될 수 있다. 적합한 화학요법제가 상기에 개시되어 있다. TCR을 발현하는 세포는 또한 하기에 상세히 개시된 바와 같이 PD-1, CTLA-4, TIM-3, LAG3, BTLA 길항제 및/또는 4-1BB 또는 OX40 효능제와 함께 투여될 수 있다.

검출 및 치료 방법

CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 투여가 진단 및 치료에 유용하다는 것이 본원에서 개시된다. 이들 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포는 대상체로부터의 생물학적 샘플에서 측정된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 말초 혈액 샘플 또는 종양 생검이다. 대상체는 임의의 대상체, 예컨대, 인간 또는 수의학적 대상체일 수 있다. 추가 실시양태에서, 대상체는 종양을 앓거나, 종양을 앓는 것으로 의심되거나, 종양을 앓을 위험이 있다. 종양은 고형 종양일 수 있다. 일부 비제한적 예에서, 고형 종양은 두부경부 편평 세포 암종, 폐암, 흑색종, 난소암 신장 세포 암종, 방광암, 자궁경부암, 간암, 전립선암, 유방암, 교아세포종 또는 직장암이다.

일부 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체가 생체 반응 조절제(예컨대, 사이토카인 및 케모카인), 암 백신, 화학요법제, 면역 치료제, 및 방사선을 포함하나, 이에 제한되지 않는 암 치료제에 반응할지 여부를 결정하는 방법을 개시한다. 일부 실시양태에서, 암 치료제는 체크포인트 억제제, 4-1BB 효능제, 및 OX40 효능제, 사이토카인, 및/또는 방사선일 수 있다. 암 치료제는 화학물질일 수 있다. 상기 방법은 또한 대상체가 수술에 반응하는지 여부를 검출하는 데 사용될 수 있다.

상기 방법은 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재를 검출하는 단계를 포함하고, 여기서 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재는 암 치료제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 체크포인트 억제제, 4-1BB 효능제, OX40 효능제, 사이토카인 및/또는 방사선이 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적일 것이다. 상기 방법은 또한 대상체가 절제와 같은 수술 절차에 반응할 것임을 나타낼 수 있다. 상기 방법은 또한 암 치료제를 대상체에게 투여하는 단계, 또는 수술 절차를 수행하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 비제한적 예에서, 암 치료제는 체크포인트 억제제이며, 이는 제한 없이, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제 또는 LAG3 길항제일 수 있다. 적합한 길항제는 하기에 상세하게 개시되어 있다. 적합한 4-1BB 효능제 및 OX40 효능제 또한 하기 개시되어 있다.

다른 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체가 예컨대, 암 치료제를 비롯한 치료 요법에 반응할지 여부를 결정하는 방법을 개시한다. 암 치료제는 화학요법제 또는 방사선일 수 있다. 암 치료제는 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제 또는 LAG3 길항제일 수 있거나, 4-1BB 또는 OX40 효능제일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 제1 용량의 암 치료제를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 수를 측정하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양의 증가하였다면, 이는 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적이라는 것을 시사하는 것이다.

추가 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체가 암 치료제에 반응할지 여부를 결정하는 방법을 개시한다. 암 치료제는 화학요법제 또는 방사선일 수 있다. 암 치료제는 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제 또는 LAG3 길항제일 수 있거나, 4-1BB 또는 OX40 효능제일 수 있다. 본 방법은 제1 용량의 암 치료제를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 수를 측정하는 단계를 포함하고, 여기서 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양의 증가하였다면, 이는 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적이라는 것을 시사하는 것이다. 추가 실시양태에서, 본 방법은 제2 용량의 암 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제1 용량은 제2 용량과 동일하거나, 여기서 제2 용량은 제1 용량보다 낮다.

추가의 다른 실시양태에서, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법을 개시한다. 본 방법은 제1 용량의 암 치료제를 대상체에게 투여하는 단계, 및 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 수를 측정하는 단계를 포함한다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양의 감소되었거나, 또는 변함이 없다면, 이는 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양 치료에 효과적이지 않다는 것을 시사하는 것이다. 제2 용량의 암 치료제를 대상체에게 투여하며, 여기서 제2 용량은 제1 용량보다 높거나, 또는 여기서 제2 용량은 제1 용량과 동일하다.

일부 실시양태에서, 대상체는 상기 논의된 바와 같이, 종양을 앓거나, 종양이 발생할 위험이 있는 것이다. 이들 대상체는 예컨대, 의사와 같은 당업자에게 적합한 표준 방법에 의해 확인될 수 있다. 개시된 방법은 관심 대상체를 선별하는 단계, 및 체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제 또는 LAG3 길항제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 관심의 암 치료제를 투여하는 단계를 포함한다. 대상체는 또한 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제를 투여받을 수 있다. 상기 방법은 수술 절차에 반응할 대상체를 검출할 수 있다.

추가 실시양태에서, 대상체는 치료 유효량의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포, 및 치료 유효량의 암 치료제, 예컨대, 제한하는 것은 아니지만, 체크포인트 억제제, 예를 들어, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제 또는 LAG3 길항제를 투여받는다. 암 치료제은 또한 4-1BB 효능제 또는 OX40 효능제, 또는 사이토카인일 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 정제된 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포, 및 체크포인트 억제제, 4-1BB 효능제, OX40 효능제, 또는 사이토카인의 투여는 예컨대, 종양과 같은 병리학적 상태를 극복하는 대상체의 능력을 증가시킬 것이다. 세포 및 체크포인트 억제제는 단일 약학 조성물 또는 별도의 약학 조성물에 포함될 수 있다. 따라서, 생체외에서 대상체로부터 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 정제된 집단을 정제하고 생성하고, 이들 세포의 치료량을 도입함으로써, 수용자 대상체의 면역 반응이 증진된다. 치료 유효량의 체크포인트 억제제, 4-1BB 효능제, OX40 효능제 또는 사이토카인의 투여는 또한 수용자의 면역 반응을 증진시킨다. 따라서, 화학요법제 또는 방사선이 효과적인지 여부를 결정하기 위한 본원에 개시된 방법은 상기 기술된 임의의 치료 방법과 조합하여 (및 임의의 대상체에서) 사용될 수 있다.

본 방법은 또한 대상체에게 치료상 효과적인 암 치료제의 용량을 평가하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 방법은 관심 대상체에게 투여되는 용량이 감소될 수 있고, 여전히 효과적인지를 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다. 본원에 개시된 방법은 또한 대상체에게 투여되는 용량이 너무 낮아서, 치료에 효과적이도록 하기 위해서는 증량되어야 하는지 여부를 결정하는 데 사용될 수 있다.

개시된 임의의 방법은 예컨대, B 및/또는 T 세포와 같은 다른 세포 유형을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 개시된 방법은 또한 마커, 예컨대, PD-L1, CTLA-4, BTLA, TIM-3 또는 LAG3의 발현을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. CD4, CXCR5, ICOS 및 PD-1의 발현이 평가된다.

일부 실시양태에서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 측정된다. 대조군과 비교하여 생물학적 샘플로부터의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수가 증가되었다면, 이는 암 치료제의 용량이 대상체를 치료하는 데 유용하다는 것을 시사하는 것이며, 여기서 대조군과 비교하여 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수가 유의적 변경되지 않았다면, 이는 암 치료제의 용량이 대상체를 치료하는 데 유용하지 않다는 것을 시사하는 것이다. 대조군은 암 치료제의 투여 전 대상체로부터의 샘플 중 이전에 결정된 표준 값, 또는 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양, 또는 대상체가 대조군 물질을 투여받았을 때, 대상체로부터의 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양일 수 있다.

일반적으로, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포 수를 측정하는 단계는 대상체로부터 T 세포를 포함하는 샘플을 수득하는 것, 및 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재 또는 개수를 측정하는 것을 포함한다. 일부 예에서, 샘플은 생검 샘플, 혈액 샘플, 또는 말초 혈액 단핵 세포 샘플이다. 본 방법은 면역조직화학법 및/또는 유세포 분석법을 포함한다.

본 방법은 예컨대, 대상체로부터의 생물학적 샘플에 대한 면역조직화학 방법을 포함할 수 있다. 샘플은 종양 샘플일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD4, ICOS, CXCR5, 또는 PD-1에 결합하는 항체와 같은 항체(또는 항원 결합 단편)는 검출가능한 표지로 직접 표지된다. 또 다른 실시양태에서, CD4, ICOS, PD-1 또는 CXCR5에 결합하는 항체(또는 항원 결합 단편)(제1 항체)는 표지되지 않으며, 제1 항체에 결합하는 항체에 결합할 수 있는 제2 항체 또는 다른 분자가 이용된다. 당업자에게 널리 공지된 바와 같이, 제1 항체의 특정 종 및 부류에 특이적으로 결합할 수 있는 제2 항체가 선택된다. 예를 들어, 제1 항체가 인간 IgG일 경우, 이때 2차 항체는 항인간-IgG일 수 있다. 항체에 결합할 수 있는 다른 분자는 제한 없이, 단백질 A 및 단백질 G를 포함하며, 둘 모두 상업적으로 이용가능하다.

항체 또는 2차 항체에 적합한 표지는 상기 기술되어 있으며, 다양한 효소, 보결 분자단, 형광 물질, 발광 물질, 자성 물질 및 방사성 물질을 포함한다. 적합한 효소의 비제한적 예로는 호스래디쉬 페록시다제, 알칼리 포스파타제, 베타-갈락토시다제 또는 아세틸콜린 에스테라제를 포함한다. 적합한 보결 분자단 복합체의 비제한적인 예는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴을 포함한다. 적합한 형광 물질의 비제한적인 예로는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린을 포함한다. 비제한적인 예시적인 발광 물질은 루미놀이고; 비제한적인 예시적인 자성제는 가돌리늄이고, 비제한적인 예시적인 방사성 표지는 ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S 또는 ³H를 포함한다.

세포는 유세포 분석법을 사용하여 정량화할 수도 있다. 추가 실시양태에서, 샘플은 예를 들어, T 세포, 예컨대, CD8 T 세포 또는CD4+CXCR5+ T 세포, 예컨대, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 분리하기 위해 정제될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 방법은 CD4+ T 세포, 예컨대, CXCR5⁺ T 세포의 양을 측정하는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양은 대조군과 비교된다. 적합한 대조군은 상기에 언급되어 있다.

일부 예에서, 세포 현탁액은 종양 샘플로부터 생성된다. 하나의 비제한적인 예에서, 멸균 조건하에서, 종양은 작은 조각으로 절단되고, 인간 혈청 알부민 뿐만 아니라, 히알루로니다제, 콜라게나제, DNase를 포함한 RPMI-1640에서 분해된다. 세포는 예를 들어, 자석 교반 막대로 교반하면서 실온에서 1시간 동안 분해될 수 있다. 세포 현탁액은 세포 필터를 통해 여과된다. 종양 침윤 림프구는 밀도 구배 용액으로 원심분리함으로써 농축될 수 있다.

T 세포를 단리, 검출 및/또는 정량화하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예시적인 프로토콜이 본원에 제공된다. T 세포의 증식을 측정하는 방법도 당업계에 공지되어 있다. 이들 방법은 일반적으로 단순한 육안 관찰이 아닌 분자 및/또는 생화학적 기술의 사용을 포함한다. 일부 예에서, 세포 형광 활성화 세포 분석(FACS: fluorescence activated cell analyse)이 이용된다. FACS는 적절하게 표지된 항체로 세포를 염색함으로써 T 세포와 같은 세포를 분류(단리)하는 데 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 몇몇 항체(예컨대, CD4, CXCR5, ICOS 및 PD-1에 결합하는 항체) 및 FACS 분류는 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 실질적으로 정제된 집단을 생성하는 데 사용될 수 있다. 임의의 FACS 기술이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,061,620호에 개시된 FACS의 방법을 참조한다.

그러나, 원하는 세포 집단을 정제하고, 단리하기 위해 상이한 효능의 다른 기술이 사용될 수 있다. 사용되는 분리 기술은 수집될 세포 분획의 생존도의 유지를 최대화해야 한다. 사용되는 특정 기술은 물론 분리 효율, 방법의 세포 독성, 분리의 용이성 및 속도, 및 필요한 장비 및/또는 전문적 기술에 의존할 것이다.

분리 절차는 항체 코팅된 자성 비드를 이용한 자기 분리, 단일클론 항체에 결합되거나, 보체와 함께 사용되는 세포독성제, 및 고체 매트릭스에 부착된 단일클론 항체를 이용하는 "패닝," 또는 또 다른 편리한 기술을 포함한다. 자성 비드 및 다른 고체 매트릭스, 예컨대, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공사막 및 플라스틱 페트리 디쉬에 부착된 항체는 직접 분리를 허용한다. 항체에 의해 결합된 세포는 세포 현탁액으로부터 고체 지지체를 물리적으로 간단히 분리함으로써 세포 현탁액으로부터 제거될 수 있다. 고상에 연결된 항체와 세포의 정확한 인큐베이션 조건 및 기간은 이용되는 시스템에 특이적인 수개의 인자에 따라 결정될 것이다. 그러나, 적절한 조건의 선택은 당업계에 널리 공지되어 있다.

이어서, 관심 마커(예컨대, CD4, CXCR5, ICOS 및/또는 PD-1)를 발현하는 세포가 고상에 결합된 항체에 결합하도록 충분한 시간을 허용한 후에 비결합 세포는 생리 완충제로 용리 또는 세척될 수 있다. 이어서, 결합된 세포는 주로 고상의 성질 및 사용된 항체에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 고상으로부터 분리된다.

항체는 세포 분리를 가능하게 하기 위해, 이후에 지지체에 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘으로 제거될 수 있는 비오틴, 또는 FACS와 함께 사용될 수 있는 형광색소에 접합될 수 있다.

예를 들어, CD4 또는 CD3을 발현하는 세포는 처음에 CD4 또는 CD3의 세포 표면 발현에 의해 다른 세포로부터 분리된다. 이어서, 단리된 CD4⁺ 세포 또는 CD3⁺ 세포의 순도는 원하는 경우, 예컨대,BD LSRFORTESSA® 유세포 분석기(Becton Dickinson: 미국 캘리포니아주 산 호세 소재)를 사용하여 체크된다. 한 실시양태에서, 세포 집단을 분류하는 FACS와 같은 추가 정제 단계가 수행된다. 한 예에서, 이 분류는 CXCR5, ICOS 및 PD-1의 발현을 검출하기 위해 수행될 수 있다.

본 방법은 또한 세포 증식을 측정하는 단계를 포함할 수 있다. 증식의 평가와 같은 세포 증식을 분석하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 형광 염료로 관심 세포의 생체외 화학적 표지를 포함하는 막 염료 희석 접근법이 이용될 수 있다. 삼중수소화된 뉴클레오시드 유사체(일반적으로 ³H-티미딘 데옥시리보뉴클레오시드, ³H-TdR) 또는 브로모데옥시우리딘(BrdU)의 표지가 이용될 수 있다. BrdU 도입을 측정하기 위해 FACS 분석이 이용가능하다. 예컨대, DNA 함량 및 세포주기 연관 단백질과 같은 증식의 대용 마커도 사용될 수 있다.

한 예에서, Ki67 또는 PCNA의 측정이 이용될 수 있다. Ki67 항원은 활성 세포주기의 모든 단계(G1, S, G2 및 M 단계)에서 세포를 증식시킴으로써 발현되는 프로토타입 세포주기 관련 핵 단백질이다. 휴지(G0) 세포에는 존재하지 않는다. Ki67 항체는 증식을 확립하는 데 유용하다. Ki67 항체를 사용하여 휴지 세포 중 증식 세포를 정량화할 수 있다(Ki67 지수). Ki67은 통상적으로 세포주기 및 증식의 마커로서 사용되며; Ki67에 대한 항체는 예컨대, ABCAM®으로부터 상업적으로 이용가능하고, 면역조직화학 및 FACS 분석에서 이들 항체를 사용하는 방법이 이용가능하다.

샘플링시 활성 세포주기에 있는 세포를 검출하기 위해 다른 방법을 사용할 수 있다. 림프구, 예컨대, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 증식은 또한 세포를 포함하는 생물학적 샘플에서 DNA를 표지하기 위해 안정한 동위원소를 이용하는 방법을 사용하여 측정될 수 있다. DNA는 데 노보 합성 경로를 통해 균일하고, 고도로 표지된다. 사용되는 안정적인 동위원소 표지, 예컨대, ²H--글루코스 또는 중수(²H₂O 또는 H₂ ¹⁸O)는 동물과 인간에게 무독성이며, 일반적으로 미국 식품의약국(FDA: Food and Drug Administration)에 의해 안전한 것으로 간주된다(미국 특허 출원 공개 제2009/0155179호 참조). 림프구 DNA 내로의 안정한 동위원소 표지 도입의 측정은 하기 단계를 포함한다: (i) 추가 단리 없이 염색질로부터 DNA의 추출 또는 그의 방출, DNA의 데옥시리보뉴클레오티드로의 가수 분해, (ii) 퓨린 데옥시리보뉴클레오티드로부터 데옥시리보스의 선택적 방출, (iii) 가스 크로마토그래피/질량 분석법(GC/MS)에 의한 분석에 적합한 휘발성 유도체(예컨대, 펜탄 테트라아세테이트, 펜타플루오로벤질 테트라아세틸 유도체, 또는 또 다른 적합한 유도체)로의 퓨린 데옥시리보스의 유도체화, (iv) 상기 유도체의 GC/MS 분석, (v) 상기 유도체의 질량 동위원소 이성질체 존재비의 패턴 분석, 및 (vi) 상기 패턴으로부터 안정적인 동위원소 도입의 척도인 과잉 농축 값 계산. 이들 각각의 방법의 구체적인 실시양태가 교시되어 있다(미국 특허 제5,910,40호 참조).

PD-1, CTLA -4, TIM-3, LAG3 , BTLA 길항제

및 4- 1BB 및 OX40 효능제

체크포인트 억제제, 예컨대, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG3 길항제, TIM-3 길항제 및/또는 BTLA 길항제는 예를 들어, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포와 병용하여 본원에 개시된 방법에 사용된다. 4-1BB 효능제는 또한 본원에 개시된 방법에서 사용된다. PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, LAG3 길항제, TIM-3 길항제, BTLA 길항제, 및/또는 4-1BB 및 OX40 효능제는 화학 또는 생물학적 화합물일 수 있다. 작용제는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 항체일 수 있다. 적합한 길항제 및 효능제는 또한 이들 항체의 항원 결합 단편을 포함한다(항원 결합 단편에 대한 설명은 상기 참조). 길항제는 예를 들어, 억제제 핵산 분자 또는 소분자, 예컨대, 900 달톤 미만 또는 800 달톤 미만의 분자일 수 있다.

PD-1 길항제는 세포 상에서 발현된 PD-L1 또는 PD-L2가 면역 세포(T 세포, B 세포 또는 NKT 세포) 상에서 발현된 인간 PD-1에 결합하는 것을 차단하는 임의의 화학 화합물 또는 생물학적 분자일 수 있다. PD-1 및 그의 리간드에 대한 대안적 명칭 또는 동의어는 PD-1의 경우, PDCD1, PD1, CD279 및 SLEB2; PD-L1의 경우, PDCD1L1, PD-L1, B7H1, B7-4, CD274 및 B7-H; 및 PD-L2의 경우, PDCD1L2, PDL2, B7-DC, Btdc 및 CD273을 포함한다. 예시적인 인간 PD-1 아미노산 서열은 NCBI 수탁 번호 NP_005009에서 살펴볼 수 있다. 예시적인 인간 PD-L1 및 PD-L2 아미노산 서열은 각각 2017년 4월 28일자 NCBI 수탁 번호 NP_054862 및 NP__079515(참조로 포함)에서 살펴볼 수 있다. 생체내에서, PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포 및 단핵구 상에서 발현된다. 인간에서, PD-1은 원래는 활성화 유도된 아폽토시스가 이루어진 T 세포주에서 확인된 50-55 kDa의 타입 I 막횡단 수용체이다. PD-1은 T 세포, B 세포 및 대식 세포 상에서 발현된다. PD-1에 대한 리간드는 B7 패밀리 구성원 PD-리간드 1(PD-L1, B7-H1로도 공지) 및 PD-L2(B7-DC로도 공지)이다. PD-L1 또는 PD-L2 억제제는 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다.

실험 데이터는 중추 및 말초 면역 반응의 하향 조절에서 PD-1과 그의 리간드의 상호작용을 시사한다. 특히, PD-L1의 존재하에 야생형 T 세포에서 증식이 억제되지만, PD-1 결핍 T 세포에서는 증식이 억제되지 않는다(예컨대, 문헌 [Ishida et al., EMBO J. 11:3887, 1992]; [Shinohara et al. Genomics 23:704,1994]; 미국 특허 제5,698,520호(이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조).

추가의 PD-1 아미노산 서열은 미국 특허 제6,808,710호 및 미국 특허 출원 공개 제2004/0137577호, 제2003/0232323호, 제2003/0166531호, 제2003/0064380호, 제2003/0044768호, 제2003/0039653호, 제2002/0164600호, 제2002/0160000호, 제2002/0110836호, 제2002/0107363호, 및 제2002/0106730호(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

PD-1은 PD-L1에 결합하는 그의 능력에 기초한 CD28/CTLA-4 패밀리 분자의 구성원이다. 생체내에서, CTLA-4와 같이, PD-1은 항CD3에 반응하여 T 세포의 표면에서 빠르게 유도된다(문헌 [Agata et al. Int. Immunol. 8:765, 1996]). T 세포 고갈은 PD-1 발현의 유도와 동반된다(PCT 공개 번호 2008/083174(이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조). PD-1의 발현 또는 활성을 감소시키는 작용제와 T 세포를 접촉시킴으로써 T 세포 세포독성을 증가시킬 수 있다. PD-1의 발현 또는 활성을 감소시키는 작용제는 예컨대, 종양에 대해, 면역 반응을 증가시키는 데 사용될 수 있다. 이론에 제한되지 않으면서, PD-1 발현 또는 활성의 감소는 세포독성 T 세포 활성의 증가를 초래하여 특이적 면역 반응을 증가시킨다.

PD-1 패밀리 구성원은 항원 제시 세포 상의 하나 이상의 수용체, 예컨대, PD-L1 및 PD-L2에 결합한다. PD-L1에 대한 예시적인 아미노산 서열은 2000년 10월 4일자로 이용가능한 GENBANK® 수탁 번호 AAG18508(본원에 참조로 포함된다)로서 제공된다. 예시적인 PD-L2 전구체 아미노산 서열은 2002년 4월 8일자로 이용가능한 GENBANK® 수탁 번호 AAK15370(본원에 참조로 포함된다)으로서 제공된다. 예시적인 변이체 PD-L2 전구체 아미노산 서열은 2006년 12월 12일자로 이용가능한 GENBANK® 수탁 번호 Q9BQ51(본원에 참조로 포함된다)로서 제공된다.

본원에 개시된 방법에서 사용되는 길항제는 PD 리간드 1(PD-L1) 또는 PD 리간드 2(PD-L2)의 발현 또는 활성을 감소시키거나, PD-1과 PD-L1 사이의 상호작용 또는 PD-1과 PD-L2 사이의 상호작용을 감소시키는 작용제를 포함하며; 이들은 PD 길항제이다. 예시적인 화합물은 항체(예컨대, 항PD-1 항체, 항PD-L1 항체, 및 항PD-L2 항체), RNAi 분자(예컨대, 항PD-1 RNAi 분자, 항PD-L1 RNAi, 및 항PD-L2 RNAi), 안티센스 분자(예컨대, 항PD-1 안티센스 RNA, 항PD-L1 안티센스 RNA, 및 항PD-L2 안티센스 RNA), 우성 음성 단백질 (예컨대, 우성 음성 PD-1 단백질, 우성 음성 PD-L1 단백질, 및 우성 음성 PD-L2 단백질), 및 소분자 억제제를 포함한다. 이들 PD-1 길항제 중 임의의 것은 본원에 개시된 방법에 유용하다.

다른 항체(예컨대, 항CTLA-4 항체, 및 항LAG3 항체, 항TIM-3 항체 또는 항BTLA 항체), RNAi 분자(예컨대, 항CTLA-4 RNAi 분자, 항LAG3 RNAi, 항TIM-3 RNAi 및 항BTLA RNAi), 안티센스 분자(예컨대, 항CTLA-4 안티센스 RNA, 항LAG3 안티센스 RNA, 항TIM-3 안티센스 RNA 및 항BTLA 안티센스 RNA)가 본원에 개시된 방법에 유용하다. 우성 음성 단백질, 우성 음성 CTLA-4 단백질, 우성 음성 LAG3 단백질, 우성 음성 LAG-3 단백질 및 우성 음성 BTLA 단백질) 또한 유용하다. 이들 길항제 중 임의의 것은 본원에 개시된 방법에 유용하다. 추가로, 4-1BB 및 OX40 효능제, 예컨대, 4-1BB 또는 OX40에 결합하는 항체 및 RNA 압타머가 본원에 개시된 방법에 유용하다. TGF-β 수용체 억제성 또는 우성 음성 단백질도 유용하다.

길항제는 세포에서 표적의 발현 또는 활성을 감소시키는 능력을 갖는 작용제이다. 일부 실시양태에서, PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG3, TIM-3, CTLA-4 또는 BTLA은 대조군에서의 상기 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 감소된다. 활성의 예시적인 감소는 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 검출가능한 활성의 완전한 부재이다. 한 예에서, 대조군은 PD-1 길항제로 처리되지 않은 세포이다. 또 다른 예에서, 대조군은 표준 값, 또는 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 담체와 같은 작용제와 접촉된 세포이다. 발현 또는 활성은 당업계의 임의의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, PD-1 길항제는 PD-1의 PD-L1, PD-L2, 또는 그 둘 모두에의 결합을 억제 또는 감소시킨다. 한 비제한적인 예에서, PD-L1 길항제는 PD-L1 또는 PD-1의 결합을 감소시킨다.

효능제는 세포에서 표적의 발현 또는 활성을 증가시키는 능력을 갖는 작용제이다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 또는 OX40 발현 또는 활성은 대조군에서의 상기 발현 또는 활성과 비교하여 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 100%만큼 증가된다. 활성의 예시적인 증가는 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 검출가능한 활성의 완전한 부재이다. 한 예에서, 대조군은4-1BB 또는 OX40 효능제로 처리되지 않은 세포이다. 또 다른 예에서, 대조군은 표준 값, 또는 활성에 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 담체와 같은 작용제와 접촉된 세포이다. 발현 또는 활성은 당업계의 임의의 표준 방법에 의해 결정될 수 있다. 한 비제한적인 예에서, 4-1BB 또는 OX40 효능제는 결합을 자극하거나 증가시킨다.

A. 항체

일부 실시양태에서, 길항제는 항체이다. PD-1에 결합하는 항체의 예시적인 아미노산 서열은 예를 들어, 미국 특허 공개 제2006/0210567호(이는 본원에서 참조로 포함된다) 개시되어 있다. PD-1에 결합하는 항체는 또한 미국 특허 공개 제2006/0034826호(이는 또한 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. PD-1에 결합하는 항체는 또한 미국 특허 제7,488,802호, 미국 특허 제7,521,051호, 미국 특허 제8,008,449호, 미국 특허 제8,354,509호, 미국 특허 제8,168,757호, 및 U.S. PCT 공개 번호 WO2004/004771, PCT 공개 번호 WO2004/072286, PCT 공개 번호 WO2004/056875, 및 미국 공개된 특허 출원 제2011/0271358호에 개시되어 있다. 항체는 KEYTRUDA®(펨브롤리주맙)일 수 있다. 항체는 오노 파마슈티칼즈(Ono Pharmaceuticals)의 니볼루맙(Nivolumab)(ONO-4538/BMS-936558) 또는 OPDIVO®와 같은 항PD-1 항체일 수 있다. PD-L1 결합 길항제는 YW243.55.S70, MPDL3280A, MDX-1105 및 MEDI 4736을 포함한다(미국 공개 특허 출원 제2017/0044256호 참조). 인간 PD-L1에 특이적으로 결합하고, 개시된 방법 및 조성물에 유용한 단일클론 항체의 예는 PCT 공개 번호 WO2013/019906, PCT 공개 번호 WO2010/077634 A1 및 미국 특허 제8,383,796호에 개시되어 있다. PD-1에 대한 체크포인트 억제제 항체(예컨대, 니볼루맙, 피딜리주맙, 및 펨브롤리주맙) 또는 PD-L1에 대한 체크포인트 억제제 항체(예컨대, 더발루맙, 아테졸리주맙 및 아벨루맙)는 본원에 개시된 임의의 방법에 유용하다. PD-1, PD-L2 및 PD-1에 결합하는 항체는 또한 특허 제8,552,154호에 개시되어 있다. 몇몇 예에서, 항체는 적어도 10⁷ M^-1, 예컨대, 적어도 10⁸ M^-1, 적어도 5 X 10⁸ M^-1 또는 적어도 10⁹ M^-1의 친화도 상수로 CTLA-4, BTLA, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2에 특이적으로 결합한다. 임의의 이들 항체, 및 항원 결합 단편은 본원에 개시된 방법에서 유용하다.

CTLA-4에 특이적으로 결합하는 예시적인 항체는 PCT 공개 번호 WO 2001/014424, PCT 공개 번호 WO 2004/035607, 미국 공개 제2005/0201994호, 유럽 특허 제EP1141028호, 및 유럽 특허 제EP 1212422 B1호에 개시되어 있다. 추가의 CTLA-4 항체는 미국 특허 제5,811,097호, 미국 특허 제5,855,887호, 미국 특허 제6,051,227호, 미국 특허 제6,984,720호, 미국 특허 제6,682,736호, 미국 특허 제6,207,156호, 미국 특허 제5,977,318호, 미국 특허 제6,682,736호, 미국 특허 제7,109,003호, 미국 특허 제7,132,281호, 미국 특허 제7,452,535호, 및 미국 특허 제7,605,238호; PCT 공개 번호 WO 01/14424, PCT 공개 번호 WO 00/37504, PCT 공개 번호 WO 98/42752, 미국 공개 특허 출원 제2000/037504호, 미국 공개 출원 제2002/0039581호, 및 미국 공개 출원 제2002/086014호에 개시되어 있다. CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 문헌 [Hurwitz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95(17):10067-10071 (1998)]; [Camacho et al., J. Clin. Oncol., 22(145): Abstract No. 2505 (2004)(antibody CP-675206)]; [Mokyr et al., Cancer Res., 58:5301-5304 (1998)]에 개시되어 있다. 일부 실시양태에서, CTLA-4 길항제는 이필리무맙 (MDX-010 및 MDX-101 및 YERVOY®로도 공지)이다(PCT 공개 번호 WO 2001/014424(이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조). 상기 항체 및 항원 결합 단편은 본원에 개시된 방법에 유용하다.

추가 실시양태에서, BTLA 길항제는 본원에 개시된 방법에 이용된다. BTLA에 특이적으로 결합하는 항체는 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2016/0222114호, 미국 공개 특허 출원 제2015/0147344호, 및 미국 공개 특허 출원 제2012/0288500호(이들은 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 구체적으로 헤르페스 바이러스 진입 매개체(HVEM: Herpesvirus entry mediator) 시스 복합체를 사용하여 BTLA 활성을 조정하는 생물학적 작용제는 미국 공개 특허 출원 제2014/0220051호 및 미국 공개 특허 출원 제2010/0104559호(이 둘 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 추가의 다른 실시양태에서, TSR-022과 같은 항체는 TIM-3에 특이적으로 결합한다. 추가 실시양태에서, 예컨대, BMS-986016, GSK2831781, 또는 PCT 공개 번호 WO2015042246 A1(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시된 항체와 같은 항체는 LAG3에 특이적으로 결합한다. 또한, clinicaltrials.gov에 인터넷상에서 입수할 수 있으며, 본원에 참조로 포함된 임상 시험 번호 NCT01968109("Safety Study of Anti-LAG-3 With and Without Anti-PD-1 in the Treatment of Solid Tumors")를 참조한다. 이들 항체 및 항원 결합 단편은 본원에 개시된 방법에서 유용하다.

4-1BB 효능제 항체 또한 유용하다. 적합한 항체는 예를 들어, 미국 특허 제8,337,850 및 PCT 공개 번호 WO 2015179236 A1(이 둘 모두 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 개시된 임의의 방법에 사용되는 항체는 우렐루맙(BMS-663513) 및 PF-05082566(Pfizer)를 포함한다.

OX40 효능제 항체 또한 유용하다. 적합한 효능제로는 MEDI6469를 포함한다(문헌 [Duhen et al., Nature Communications 12: 1047, 2021] 및 [Curti et al., Cancer Research 72(24): 1-10, 2013] 참조). 추가의 OX40 효능제는 예를 들어, PCT 공개 번호 2006/121810(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. OX40 효능제는 OX40 리간드-Ig 융합 단백질, 및 상기 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 포함한다(문헌 [Oberst et al., Molecular Therapy of Cancer 17(5):1024, 2018] 및 [Morris et al., Molecular Immunology 44(12):3112, 2007] 참조).

개시된 방법에 유용한 항체는 단일클론 항체, 인간화 항체, 탈면역화 항체(예컨대, 인간-항마우스 반응을 감소시키기 위해), 키메라 항체, 및 면역글로불린 (Ig) 융합 단백질을 포함한다. 이들 항체의 항원 결합 단편 또한 본원에 개시된 방법에 유용하다. 다중클론 항체는 예컨대, 적합한 대상체(예컨대, 수의학적 대상체)를 면역원으로 면역화시킴으로써 당업자에 의해 제조될 수 있다. 면역화된 대상체의 항체 역가는 고정화된 항원을 사용하는 효소 결합 면역 흡착 검정법(ELISA: enzyme linked immunosorbent assay)과 같은 표준 기술에 의해 시간 경과에 따라 모니터링될 수 있다. 한 예에서, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2(또는 그의 조합)에 특이적으로 결합하는 항체는 포유동물로부터(예컨대, 혈청으로부터) 단리될 수 있으며, 당업자에게 공지된 기술에 의해 추가로 정제될 수 있다. 예를 들어, 항체는 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 정제되어 IgG 항체를 단리시킬 수 있다.

항체 생산 세포는 대상체로부터 수득될 수 있고, 표준 기술에 의해 단일클론 항체를 제조하는 데 사용될 수 있다(문헌 [Kohler and Milstein Nature 256:495 49, 1995]; [Brown et al., J. Immunol. 127:539 46, 1981]; [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77 96, 1985]; [Gefter, M. L. et al. (1977) Somatic Cell Genet. 3:231 36]; [Kenneth, R. H. in Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses. Plenum Publishing Corp., New York, N.Y. (1980)]; [Kozbor et al. Immunol. Today 4:72, 1983]; [Lerner, E. A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387 402]; [Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 76:2927 31, 1976] 참조). 한 예에서, 불멸 세포주(일반적으로 골수종)는 PD-1, PD-L1, PD-L2, TIM-3, LAG3, BTLA, CTLA-4, 4-1BB 또는 OX40으로 면역화된 포유동물의 림프구(일반적으로 비장 세포)에 융합되고, 생성된 하이브리도마 세포의 배양 상청액을 스크리닝하여 관심 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 확인한다.

한 실시양태에서, 하이브리도마를 생산하기 위해, 불멸 세포주(예컨대, 골수종 세포주)가 림프구와 동일한 포유동물 종으로부터 유래된다. 예를 들어, 뮤린 하이브리도마는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB 또는 OX40 펩티드로 면역화된 마우스로부터의 림프구를 불멸화 마우스 세포주와 융합시켜 제조될 수 있다. 한 예에서, 히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유하는 배양 배지("HAT 배지")에 민감한 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC: American Type Culture Collection: 미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 이용가능한 P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 또는 Sp2/O-Ag14 골수종 세포주를 비롯한 다수의 골수종 세포주 중 임의의 것은 표준 기술에 따라 융합 파트너로서 사용될 수 있다. HAT 민감성 마우스 골수종 세포는 폴리에틸렌 글리콜("PEG")을 사용하여 마우스 비장 세포에 융합될 수 있다. 이어서, 융합으로부터 생성된 하이브리도마 세포는 융합되지 않은 (및 비생산적으로 융합된) 골수종 세포를 사멸시키는 HAT 배지를 사용하여 선별된다. 관심 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포는, 예컨대, 면역학적 검정법(예컨대, 효소 결합 면역흡착 검정법(ELISA) 또는 방사성면역검정법(RIA))을 사용하여, 예를 들어, PD-1, PD-L1, TIM-3, LAG3, BTLA, CTLA-4, PD-L2, 4-1BB 또는 OX40 분자에 결합하는 생산 항체에 대한 하이브리도마 배양 상청액을 스크리닝함으로써 검출될 수 있다.

단일클론 항체 분비 하이브리도마를 제조하는 것에 대한 대안으로서, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB 또는 OX40으로 재조합의 조합 면역글로불린 라이브러리(예컨대, 항체 파지 디스플레이 라이브러리)를 스크리닝하여 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 라이브러리 구성원을 단리시킴으로써 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 4-1BB 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 단일클론 항체를 확인하고, 단리시킬 수 있다. 파지 디스플레이 라이브러리를 생성 및 스크리닝하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다(예컨대, 제한하는 것은 아니지만, Pharmacia 및 Stratagene). 항체 디스플레이 라이브러리의 생성 및 스크리닝에 사용하기에 특히 적합한 방법 및 시약의 예는 예를 들어, 미국 특허 제5,223,409; PCT 공개 번호 WO 90/02809; PCT 공개 번호 WO 91/17271; PCT 공개 번호 WO 92/18619; PCT 공개 WO 92/20791; PCT 공개 번호 WO 92/15679; PCT 공개 번호 WO 92/01047; PCT 공개 WO 93/01288; PCT 공개 번호 WO 92/09690; Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:7978 7982, 1991; [Hoogenboom et al., Nucleic Acids Res. 19:4133 4137, 1991]에서 살펴볼 수 있다.

한 예에서, 각각의 CDR의 특이성 결정 영역의 서열이 결정된다. SDR 외부에 있는 잔기(비리간드 접촉 부위)가 치환된다. 예를 들어, 상기 표에서와 같은 임의의 CDR 서열에서, 최대 1, 2 또는 3개의 아미노산이 치환될 수 있다. 하나의 항체로부터의 프레임워크 영역 및 다른 항체로부터의 CDR을 포함하는 키메라 항체의 생산은 당업계에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 인간화 항체가 통상적으로 생산될 수 있다. 항체 또는 항체 단편은 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB 또는 OX40에 결합하는 공여자 단일클론 항체로부터 상보성 결정 영역 (CDR) 및 인간 수용체 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 프레임워크로부터의 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 가변 영역 프레임워크를 갖는 인간화 면역글로불린일 수 있다. 인간화 단일클론 항체는 공여자 마우스 면역글로불린(예컨대, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 4-1BB 또는 OX40 특이적 항체)의 중쇄 및 경쇄 가변 쇄로부터의 공여자 상보성 결정 영역(CDR)을 인간 가변 도메인으로 전달한 후, 친화도를 유지하도록 요구되는 경우 프레임 워크 영역에서 인간 잔기를 치환함으로써 생산될 수 있다. 인간화 단일클론 항체로부터 유래된 항체 성분의 사용은 공여자 항체의 불변 영역의 면역원성과 연관된 잠재적인 문제를 없앤다. 인간화 단일클론 항체를 생산하는 기술은 예를 들어, 문헌 [Jones et al., Nature 321:522, 1986]; [Riechmann et al., Nature 332:323, 1988]; [Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988]; [Carter et al., Proc . Natl . Acad . Sci . U.S.A . 89:4285, 1992]; [Sandhu, Crit . Rev. Biotech.12:437, 1992]; 및 [Singer et al., J. Immunol.150:2844, 1993]에 기술되어 있다. 항체는 임의의 이소타입일 수 있지만, 일부 실시양태에서, 항체는 IgG₁, IgG₂, IgG₃ 및 IgG₄를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 IgG이다. 일부 실시양태에서, 인간화 면역글로불린은 적어도 10⁷ M^-1, 예컨대, 적어도 10⁸ M^-1 적어도 5 X 10⁸ M^-1 또는 적어도 10⁹ M^-1의 친화도 상수로 관심 항원(예컨대, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 또는 OX40)에 특이적으로 결합한다.

한 실시양태에서, 인간화 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 서열은 공여자 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 서열과 적어도 약 65% 동일할 수 있다. 따라서, 인간화 면역글로불린 중쇄 가변 영역 프레임워크의 서열은 공여자 면역글로불린 중쇄 가변 프레임워크의 서열과 적어도 약 75%, 적어도 약 85%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 95% 동일할 수 있다. 인간 프레임워크 영역, 및 인간화 항체 프레임워크 영역에서 이루어질 수 있는 돌연변이는 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호(이는 본원에서 참조로 포함된다) 참조).

항체, 예컨대, 뮤린 단일클론 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체와 같은 항체는 전장 분자 뿐만 아니라, 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 특정 에피토프 결정기와 결합할 수 있는 그의 단편, 예를 들어,예컨대, Fab, F(ab')₂, 및 Fv를 포함한다. 이들 항체 단편은 그들의 항원 또는 수용체와 선택적으로 결합하는 일부 능력을 보유한다. 이들 단편은 하기를 포함한다:

(1) 항체 분자의 1가 항원 결합 단편을 함유하는 단편인 Fab는 전체 항체를 효소 파파인으로 분해하여 무손상 경쇄 및 하나의 중쇄의 일부를 생성함으로써 제조될 수 있고;

(2) 항체 분자의 단편인 Fab'는 전체 항체를 펩신으로 처리한 후 환원시켜 무손상 경쇄 및 중쇄의 일부를 생성함으로써 수득될 수 있고; 항체 분자당 2개의 Fab' 단편이 수득되고;

(3) 후속 환원 없이 전체 항체를 효소 펩신으로 처리함으로써 수득될 수 있는 항체의 단편 (Fab')₂; F(ab')₂는 2개의 이황화 결합에 의해 함께 유지된 2개의 Fab'단편의 이량체이고;

(4) 2개의 쇄로 발현되는, 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작된 단편인 Fv; 및

(5) 유전자 융합된 단일 쇄 분자로서 적합한 폴리펩티드 링커에 의해 연결된, 경쇄의 가변 영역, 중쇄의 가변 영역을 함유하는 유전자 조작된 분자로서 정의된 단쇄 항체(예컨대, scFv).

이들 항원 결합 단편을 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988] 참조). 몇몇 예에서, 가변 영역은 개별 폴리펩티드로 발현된 경쇄의 가변 영역 및 중쇄의 가변 영역을 포함한다. Fv 항체는 전형적으로 약 25 kDa이고, 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄 당 3개의 CDR을 갖는 완전한 항원 결합 부위를 함유한다. 이들 항체를 생산하기 위해, V_H 및 V_L은 숙주 세포에서 2개의 개별 핵산 구성물로부터 발현될 수 있다. V_H 및 V_L이 비인접하게 발현되는 경우, Fv 항체의 쇄는 전형적으로 비공유 상호작용에 의해 함께 유지된다. 그러나, 이들 쇄는 희석시 해리되는 경향이 있으므로, 글루타르알데히드, 분자간 이황화물 또는 펩티드 링커를 통해 쇄를 가교시키는 방법이 개발되었다. 따라서, 한 예에서, Fv는 이황화 안정화 Fv(dsFv: disulfide stabilized Fv)일 수 있으며, 여기서 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 이황화 결합에 의해 화학적으로 연결된다.

추가 예에서, Fv 단편은 펩티드 링커에 의해 연결된 V_H 및 V_L 쇄를 포함한다. 이들 단일 쇄 항원 결합 단백질(scFv)은 올리고뉴클레오티드에 의해 연결된 V_H 및 V_L 도메인을 코딩하는 DNA 서열을 포함하는 구조 유전자를 구성함으로써 제조된다. 구조 유전자는 발현 벡터에 삽입되고, 이어서 E. 콜라이와 같은 숙주 세포에 도입된다. 재조합 숙주 세포는 2개의 V 도메인을 연결하는 링커 펩티드를 갖는 단일 폴리펩티드 쇄를 합성한다. scFv를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(문헌 [ Whitlow et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 97, 1991]; [Bird et al., Science 242:423, 1988]; 미국 특허 제4,946,778호; [Pack et al., Bio/Technology 11:1271, 1993]; 및 [Sandhu, 상기 문헌 동일] 참조).

항체 단편은 항체의 단백질 가수분해에 의해 또는 단편을 코딩하는 DNA의 E. 콜라이에서의 발현에 의해 제조될 수 있다. 항체 단편은 통상적인 방법에 의해 전체 항체의 펩신 또는 파파인 분해에 의해 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 펩신으로 항체의 효소적 절단에 의해 생성되어 F(ab')₂로 나타내는 5S 단편을 제공할 수 있다. 이 단편은 티올 환원제, 및 임의적으로, 이황화 결합의 절단으로부터 생성된 술프하이드릴 기에 대한 차단기를 사용하여 추가로 절단되어 3.5S Fab' 1가 단편을 생성할 수 있다. 대안적으로, 펩신을 사용한 효소적 절단은 2개의 1가 Fab' 단편 및 Fc 단편을 직접 생성한다(미국 특허 제4,036,945호 및 미국 특허 제4,331,647호, 및 여기 포함된 참고문헌; 문헌 [Nisonhoff et al., Arch. Biochem . Biophys. 89:230, 1960]; [Porter, Biochem . J. 73:119, 1959]; [Edelman et al., Methods in Enzymology, Vol. 1, page 422, Academic Press, 1967]; 및 [Coligan et al. at sections 2.8.1-2.8.10 and 2.10.1-2.10.4] 참조).

단편이 무손상 항체에 의해 인식되는 항원에 결합하는 한, 항체를 절단하는 다른 방법, 예컨대, 1가 경쇄 단편을 형성하기 위한 중쇄 분리, 단편의 추가 절단, 또는 다른 효소, 화학 또는 유전 기술이 사용될 수 있다.

당업자는 항체의 보존적 변이체가 생성될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 항체 단편, 예컨대, dsFv 단편 또는 scFv 단편에 사용된 이러한 보존적 변이체는 V_H 및 V_L 영역 사이의 정확한 폴딩 및 안정화에 필요한 아미노산 잔기를 보유할 것이며, 분자의 낮은 pI 및 낮은 독성을 보존하기 위해 잔기의 전하 특징을 유지할 것이다. 수율을 증가시키기 위해 V_H 및 V_L 영역에서 아미노산 치환(예컨대, 최대 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개 또는 최대 5개의 아미노산 치환)이 이루어질 수 있다. 따라서, 당업자는 용이하게 관심 항체의 아미노산 서열을 리뷰하고, 상기 간단한 표에서 하나 이상의 아미노산을 위치시키고, 보존적 치환을 확인하고, 널리 공지된 분자 기법을 사용하여 보존적 변이체를 생성할 수 있다.

이펙터 분자, 예컨대, 치료, 진단, 또는 검출 모이어티는 당업자에게 공지된 다수의 임의의 수단을 이용하여 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체에 연결될 수 있다. 공유 및 비공유 부착 수단이 모두 사용될 수 있다. 이펙터 분자를 항체에 부착시키는 절차는 이펙터의 화학 구조에 따라 달라진다. 폴리펩티드는 전형적으로 다양한 작용기; 예컨대, 카복실산(COOH), 유리 아민(-NH₂) 또는 술프하이드릴(-SH) 기를 함유하며, 이는 이펙터 분자의 결합을 초래하기 위해 항체 상의 적합한 작용기와의 반응에 이용가능하다. 대안적으로, 항체는 추가의 반응성 작용기를 노출하거나, 또는 부착시키도록 유도체화된다. 유도체화는 피어스 케미칼 컴퍼니(Pierce Chemical Company: 미국 일리노이주 록포드 소재)로부터 이용가능한 것과 같은 다수의 링커 분자의 부착을 포함할 수 있다. 링커는 항체를 이펙터 분자에 결합시키는 데 사용되는 임의의 분자일 수 있다. 링커는 항체 및 이펙터 분자, 그 둘 모두에 공유 결합을 형성할 수 있다. 적합한 링커는 당업자에게 당업자에게 널리 공지되어 있고, 직쇄 또는 분지쇄 탄소 링커, 헤테로사이클릭 탄소 링커 또는 펩티드 링커를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 항체 및 이펙터 분자가 폴리펩티드일 경우, 링커는 그의 측기를 통해(예컨대, 시스테인에 대한 이황화 결합을 통해) 또는 말단 아미노산의 알파 탄소 아미노기 및 카복실기에 구성 아미노산에 결합될 수 있다.

항체를 코딩하는 핵산 서열은 예를 들어, 적절한 서열의 클로닝을 포함하는 임의의 적합한 방법에 의해 또는 문헌 [Narang et al., Meth . Enzymol . 68:90-99, 1979]의 포스포트리에스테르 방법, 문헌 [Brown et al., Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979]의 포스포디에스테르 방법; 문헌 [Beaucage et al., Tetra. Lett . 22:1859-1862, 1981]의 디에틸포스포라미다이트 방법; 예를 들어, 문헌 [Needham-VanDevanter et al., Nucl . Acids Res. 12:6159-6168, 1984]에 기술된 바와 같은 자동화 합성기를 사용하는 문헌 [Beaucage & Caruthers, Tetra. Letts . 22(20):1859-1862, 1981]에 기재된 고상 포스포라미다이트 트리에스테르 방법; 및 미국 특허 제4,458,066호의 고상 지지체 방법과 같은 방법에 의한 직접적인 화학적 합성을 사용하여 제조될 수 있다. 화학 합성은 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 생성한다. 이는 상보성 서열과의 하이브리드화에 의해 또는 단일 가닥을 주형으로 사용하여 DNA 폴리머라제를 이용한 중합화에 의해 이중 가닥 DNA로 전환될 수 있다. 당업자는 DNA의 화학적 합성이 일반적으로 약 100개 염기의 서열로 제한되지만, 더 짧은 서열의 라이게이션에 의해 더 긴 서열이 수득될 수 있음을 인식할 것이다.

CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체를 코딩하는 서열을 코딩하는 예시적인 핵산은 클로닝 기술에 의해 제조될 수 있다. 적절한 클로닝 및 시퀀싱 기술의 예, 및 다수의 클로닝 실시를 통해 당업자에게 지시하기에 충분한 지침은 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌 동일], [Berger and Kimmel (eds.), 상기 문헌 동일], 및 [Ausubel, 상기 문헌 동일]에서 살펴볼 수 있다. 생물학적 시약 및 실험 장비 제조사의 제품 정보도 유용한 정보를 제공한다. 상기 제조사에는 SIGMA 케미칼 컴퍼니(SIGMA Chemical Company: 미국 미주리주 세인트루이스 소재), R&D 시스템즈(R&D Systems: 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재), 파마시아 애머샴(Pharmacia Amersham: 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재), CLONTECH 라보라토리즈 인크.(CLONTECH Laboratories, Inc.: 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재), 켐 진 코포레이션(Chem Genes Corp.), 알드리치 케미칼 컴퍼니(Aldrich Chemical Company: 미국 위스콘신주 밀워키 소재), 글렌 리서치 인크.(Glen Research, Inc.), GIBCO BRL 라이프 테크놀로지즈 인크.(GIBCO BRL Life Technologies, Inc.: 미국 메릴랜드주 게이더스버그 소재), 플루카케미카-바이오케미카 아날리티카(Fluka Chemica-Biochemika Analytika)(Fluka Chemie AG, 스위스 부흐 소재), 인비트로젠(Invitrogen: 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재), 및 어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems: 미국 캘리포니아주 포스터 시티 소재) 뿐만 아니라, 당업자에게 공지된 다른 다수의 상용 공급원을 포함한다.

핵산은 또한 증폭 방법에 의해 제조될 수 있다. 증폭 방법은 중합효소 연쇄 반응(PCR), 리가제 연쇄 반응(LCR), 전사 기반 증폭 시스템(TAS), 자기 부양 서열 복제 시스템(3SR)을 포함한다. 다양한 클로닝 방법, 숙주 세포, 및 시험관 내 증폭 방법이 당업자에게 널리 공지되어 있다.

한 예에서, 유용한 항체는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체로부터의 가변 영역을 코딩하는 cDNA를 이펙터 분자(EM: effector molecule)를 코딩하는 cDNA를 포함하는 벡터로 삽입하여 제조된다. 가변 영역 및 EM이 하나의 연속 폴리펩티드가 생성되도록 프레임 내에서 판독되도록 삽입이 이루어진다. 따라서, 코딩된 폴리펩티드는 기능적 Fv 영역 및 기능적 EM 영역을 함유한다. 한 실시양태에서, 마커가 scFv의 카복실 말단에 위치하도록, 검출가능한 마커(예컨대, 효소)를 코딩하는 cDNA는 scFv에 라이게이션된다. 또 다른 예에서, 검출가능한 마커는 scFv의 아미노 말단에 위치한다. 추가의 예에서, 마커가 중쇄 가변 영역의 카복실 말단에 위치하도록, 검출가능한 마커를 코딩하는 cDNA는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역에 라이게이션된다. 중쇄 가변 영역은 이어서 이황화 결합을 사용하여 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역에 라이게이션될 수 있다. 추가의 또 다른 예에서, 마커가 경쇄 가변 영역의 카복실 말단에 위치하도록, 마커를 코딩하는 cDNA는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 또는 OX40에 결합하는 항체의 경쇄 가변 영역에 라이게이션된다. 경쇄 가변 영역은 이어서 이황화 결합을 사용하여 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 4-1BB, 또는 OX40에 특이적으로 결합하는 항체의 중쇄 가변 영역에 라이게이션될 수 있다.

일단 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 핵산이 단리되고, 클로닝되고 나면, 단백질은 예컨대, 박테리아, 식물, 효모, 곤충 및 포유동물 세포와 같은 재조합으로 조작된 세포에서 발현될 수 있다. 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 하나 이상의 DNA 서열은 적합한 숙주 세포 내로의 DNA 전달에 의해 시험관내에서 발현될 수 있다. 세포는 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다. 상기 용어는 또한 대상체 숙주 세포의 자손을 포함한다. 복제 중에 돌연변이가 발생할 수 있기 때문에 모든 자손이 부모 세포와 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 외래 DNA가 숙주에서 지속적으로 유지되는 것을 의미하는 안정한 전달 방법은 당업계에 공지되어 있다.

항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 제어 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 코딩 서열에 작동적으로 연결된 발현 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 발현 제어 서열과 적합한 조건하에서 달성되도록 라이게이션된다. 발현 제어 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 종결인자, 단백질 코딩 유전자 앞의 개시 코돈(즉, ATG), 인트론을 위한 스플라이싱 신호, mRNA의 적절한 번역을 허용하는 유전자의 정확한 판독 프레임을 유지하기 위한 것, 및 정지 코돈을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 서열의 삽입 또는 도입을 허용하기 위해 조작될 수 있고, 원핵생물 또는 진핵생물에서 발현될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클을 포함하나, 이에 제한되지 않는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 숙주는 미생물, 효모, 곤충 및 포유동물 유기체를 포함할 수 있다. 원핵생물에서 진핵생물 또는 바이러스 서열을 갖는 DNA 서열을 발현하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 숙주에서 발현 및 복제가가능한 생물학적 기능성 바이러스 및 플라스미드 DNA 벡터는 당업계에 공지되어 있다.

재조합 DNA에 의한 숙주 세포의 형질전환은 당업자에게 널리 공지된 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 숙주가 E. 콜라이와 같은 원핵생물일 경우, DNA를 흡수할 수 있는 적격 세포는 지수 성장 단계 후에 수거된 후, 당업계에 널리 공지된 절차를 사용하여 CaCl₂ 방법에 의해 처리된 세포로부터 제조될 수 있다. 대안적으로, MgCl₂ 또는 RbCl이 사용될 수 있다. 원한다면 숙주 세포의 원형질체를 형성한 후 또는 전기 천공법에 의해 형질전환이 수행될 수도 있다.

숙주가 진핵생물일 경우, 인산칼슘 공침전과 같은 DNA의 형질 감염 방법, 통상적인 기계적 절차, 예컨대, 미세주입, 전기 천공, 리포솜에 둘러싸인 플라스미드의 삽입, 또는 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 진핵 세포는 또한 항체 또는 그의 기능적 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 및 단순 포진 티미딘 키나제 유전자와 같은 선별가능한 표현형을 코딩하는 제2 외래 DNA 분자와 함께 동시에 형질전환될 수 있다. 또 다른 방법은 진핵세포를 일시적으로 감염시키거나 형질전환시키고, 단백질을 발현시키기 위해 진핵생물 바이러스 벡터, 예컨대, 시미안 바이러스 40(SV40: simian virus 40) 또는 소 유두종 바이러스를 사용하는 것이다(예를 들어, 문헌 [Eukaryotic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Gluzman ed., 1982] 참조). 당업자는 예컨대, the COS, CHO, HeLa 및 골수종 세포주와 같은 고등 진핵 세포를 포함하는 세포에서 단백질을 생산하는 데 사용되는 플라스미드 및 벡터와 같은 발현 시스템을 쉽게 사용할 수 있다.

재조합으로 발현된 폴리펩티드의 단리 및 정제는 분취용 크로마토그래피 및 면역학적 분리를 비롯한 통상적인 수단에 의해 수행될 수 있다. 일단 발현되고 나면, 재조합 항체는 황산 암모늄 침전, 친화성 칼럼, 칼럼 크로마토그래피 등을 비롯한 당업계의 표준 절차에 따라 정제될 수 있다(일반적으로, 문헌 [R. Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, N.Y., 1982] 참조). 적어도 약 90 내지 95%의 동종성의 실질적으로 순수한 조성물이 본원에 개시되어 있고, 98 내지 99% 또는 그 초과의 동종성이 약학적 목적으로 사용될 수 있다. 치료적으로 사용되어야 할 경우, 원하는 대로 부분적으로 또는 동종으로 정제되고 나면, 폴리펩티드에는 실질적으로 내독소가 없어야 한다.

E. 콜라이와 같은 박테리아로부터 단일 쇄 항체의 발현 및/또는 단일 쇄 항체를 포함하는 적절한 활성 형태로의 리폴딩 방법이 기술되었으며, 널리 공지되어 있고, 본원에 개시된 항체에 적용가능하다. 문헌 [Buchner et al., Anal. Biochem . 205:263-270, 1992]; [Pluckthun, Biotechnology 9:545, 1991]; [Huse et al., Science 246:1275, 1989] 및 [Ward et al., Nature 341:544, 1989](이들은 모두 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다.

종종, E. 콜라이 또는 다른 박테리아로부터의 기능성 이종 단백질은 봉입체로부터 단리되고, 강한 변성제를 사용한 가용화 및 후속 리폴딩을 필요로 한다. 당업계에 널리 공지된 바와 같이, 가용화 단계 중에, 이황화 결합을 분리시키기 위해 환원제가 존재해야 한다. 환원제를 포함한 예시적인 완충제는 0.1 M 트리스 pH 8, 6 M 구아니딘, 2 mM EDTA, 0.3 M DTE(디티오에리트리톨)이다. 이황화 결합의 재산화는 문헌 [Saxena et al., Biochemistry 9: 5015-5021, 1970](본원에서 참조로 포함된다))에 기술되어 있는 바와 같이, 및 특히, 문헌 [Buchner et al., 상기 문헌 동일]에 기술된 바와 같이, 환원 및 산화된 형태의 저분자량 티올 시약의 존재하에 일어날 수 있다.

전형적으로 변성 및 환원된 단백질을 리폴딩 완충제로 희석(예를 들어, 100배)함으로써 복원이 달성된다. 예시적인 완충제는 0.1 M 트리스, pH 8.0, 0.5 M l-아르기닌, 8 mM 산화된 글루타티온(GSSG), 및 2 mM EDTA이다.

2개의 쇄 항체 정제 프로토콜에 대한 변형으로서, 중쇄 및 경쇄 영역은 개별적으로 가용화되고 환원된 후 리폴딩 용액에서 조합된다. 한 단백질이 다른 단백질에 비해 5배의 몰 과량을 초과하지 않도록 하는 몰비로 두 단백질이 혼합될 때 예시적인 수율이 얻어진다. 산화 환원-셔플링이 완료된 후, 과량의 산화된 글루타티온 또는 다른 산화 저분자량 화합물을 리폴딩 용액에 첨가하는 것이 바람직하다.

재조합 방법 이외에, 본원에 개시된 항체 및 그의 기능적 단편 또한 표준 펩티드 합성을 사용하여 전체적으로 또는 부분적으로 구성될 수 있다. 약 50개 미만의 아미노산 길이의 폴리펩티드의 고상 합성은 서열의 C-말단 아미노산을 불용성 지지체에 부착한 후, 서열의 나머지 아미노산을 순차적으로 첨가함으로써 달성될 수 있다. 고상 합성 기술은 문헌 [Barany & Merrifield, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol. 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Part A. pp. 3-284]; [Merrifield et al., J. Am. Chem . Soc . 85:2149-2156, 1963], 및 [Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chem. Co., Rockford, Ill., 1984]]에 기술되어 있다. 더 긴 길이의 단백질은 더 짧은 단편의 아미노 및 카복실 말단의 축합에 의해 합성될 수 있다. 카복실 말단 단부의 활성화(예컨대, 커플링 시약 N, N'-디실릴헥실카르보디미드의 사용)에 의해 펩티드 결합을 형성하는 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다.

B. 억제성 핵산

CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2의 발현 및/또는 활성을 감소시키는 억제성 핵산이 또한 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 한 실시양태는 표적 유전자의 발현의 간섭 또는 억제를 위한 소형 억제성 RNA(siRNA: small inhibitory RNA)이다. PD-1, PD-L1 및 PD-L2를 코딩하는 핵산 서열은 모두 2017년 4월 28일자로 GENBANK® 수탁 번호 NM_005018, AF344424, NP_079515 및 NP_054862(이들은 모두 참조로 포함된다).

일반적으로, siRNA는 다이서(Dicer) 또는 DCL 효소에 의한 비교적 긴 이중 가닥 RNA 분자의 절단에 의해 생성된다(문헌 [Zamore, Science, 296:1265-1269, 2002]; [Bernstein et al., Nature, 409:363-366, 2001]). 동물 및 식물에서, siRNA는 RISC로 어셈블리되고, RISC의 서열 특이적 리보핵 분해 활성을 가이드하여 세포질에서 mRNA 또는 다른 RNA 표적 분자의 절단을 초래한다. 핵에서, siRNA는 또한 이질염색질 연관 히스톤 및 DNA 메틸화를 가이드하여 개별 유전자 또는 큰 크로마틴 도메인의 전사 침묵을 초래한다. PD-1 siRNA는 예컨대, 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인크.(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)로부터, 상업적으로 이용가능하다.

본 개시내용은 표적 유전자의 발현의 간섭 또는 억제에 적합한 RNA로서, RNA는 각각의 가닥 상에 0 내지 5개의 뉴클레오티드의 3' 및/또는 5' 오버행을 함유하는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오티드의 이중 가닥 RNA를 포함하는 RNA를 제공한다. RNA의 서열은 발현의 간섭 또는 억제가 바람직한 표적 유전자, 예컨대, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2의 mRNA 또는 전사체의 일부와 실질적으로 동일하다. 본 개시내용의 목적상, 발현의 간섭 또는 억제가 요구되는 표적 유전자의 mRNA 또는 전사체의 특정 부분과 "실질적으로 동일한" RNA의 서열은 표적 유전자의 mRNA의 특정 부분 또는 전사체와 약 30% 이하, 및 일부 실시양태에서, 약 10% 이하로 상이하다. 특정 실시양태에서, RNA의 서열은 표적 유전자의 mRNA의 특정 부분 또는 전사체와 정확히 동일하다.

따라서, 본원에 개시된 siRNA는 약 15 내지 약 40개의 뉴클레오티드 길이의 이중 가닥 RNA 및 각각의 가닥 상에 0 내지 5개의 뉴클레오티드 길이를 갖는 3' 또는 5' 오버행을 포함하며, 여기서 이중 가닥 RNA의 서열은 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2를 코딩하는 핵산의 mRNA 또는 전사체의 일부와 실질적으로 동일하다(상기 참조). 특정 예에서, 이중 가닥 RNA는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2를 코딩하는 핵산과 실질적으로 동일한 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 20, 21, 또는 22개의 뉴클레오티드를 함유한다. 추가의 예에서, 이중 가닥 RNA는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2를 코딩하는 핵산과 100% 동일한 약 19 내지 약 25개의 뉴클레오티드를 함유한다. 본 맥락에서 "약"은 정수량만을 지칭하는 것은 아니어야 한다. 한 예에서, "약" 20개의 뉴클레오티드는 길이가 19 내지 21개의 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드를 지칭한다.

이중 가닥 RNA의 오버행과 관련하여, 오버행의 길이는 한 오버행의 길이가 다른 가닥의 오버행 길이에 의존하지 않는다는 점에서 두 가닥 사이에서 독립적이다. 특정 예에서, 3' 또는 5' 오버행의 길이는 적어도 하나의 가닥에서 0개 뉴클레오티드이고, 일부 경우에서, 양쪽 가닥에서 0개 뉴클레오티드이다(따라서, 평활 말단 dsRNA). 다른 예에서, 3' 또는 5' 오버행의 길이는 적어도 하나의 가닥 상에 1개 뉴클레오티드 내지 5개 뉴클레오티드이다. 더욱 구체적으로, 일부 예에서, 3 '또는 5' 오버행의 길이는 적어도 하나의 가닥 상에 2개 뉴클레오티드, 또는 양쪽 가닥 상에 2개 뉴클레오티드이다. 특정 예에서, dsRNA 분자는 두 가닥 모두에서 2개 뉴클레오티드의 3' 오버행을 갖는다.

따라서, 제공된 하나의 특정 RNA 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 20, 21, 또는 22개의 뉴클레오티드를 함유하고, 3' 오버행의 길이는 두 가닥 모두에서 2개의 뉴클레오티드이다. 본원에 제공된 RNA의 실시양태에서, 이중 가닥 RNA는 약 40-60% 아데닌 + 우라실(AU) 및 약 60-40% 구아닌 + 사이토신(GC)을 함유한다. 더욱 특히, 특정 예에서, 이중 가닥 RNA는 약 50% AU 및 약 50% GC를 함유한다.

본원에서는 또한 예를 들어, 이중 가닥 RNA의 센스 가닥에서 적어도 하나의 변형된 리보뉴클레오티드를 추가로 포함하는 RNA도 기술한다. 특정 예에서, 변형된 리보뉴클레오티드는 적어도 하나의 가닥의 3 '오버행에 있거나, 더욱 특히, 센스 가닥의 3' 오버행에 있다. 변형된 리보뉴클레오티드의 예는 검출가능한 표지(예컨대, 로다민 또는 FITC와 같은 형광단), 티오포스페이트 뉴클레오티드 유사체, 데옥시뉴클레오티드(염기 분자가 리보핵산이기 때문에 변형된 것으로 간주), 2'-플루오로우라실, 2'-아미노우라실, 2'-아미노시티딘, 4-티오우라실, 5-브로모우라실, 5-아이오도우라실, 5-(3-아미노알릴)-우라실, 이노신, 또는 2'O-Me-뉴클레오티드 유사체를 포함하는 리보뉴클레오티드를 포함하는 것으로 특히 고려된다.

CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2에 대한 안티센스 및 리보자임 분자 또한 본원에 개시된 방법에서 유용하다. 안티센스 핵산은 특정 mRNA 분자의 적어도 일부에 상보적인 DNA 또는 RNA 분자이다(문헌 [Weintraub, Scientific American 262:40, 1990]). 세포에서, 안티센스 핵산은 상응하는 mRNA에 하이브리드화하여 이중 가닥 분자를 형성한다. 세포가 이중 가닥인 mRNA를 번역하지 않기 때문에, 안티센스 핵산은 mRNA의 번역을 간섭한다. CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2를 생성하는 표적 세포에 도입될 때 쉽게 합성되고, 더 큰 분자보다 문제를 유발할 가능성이 낮기 때문에, 약 15개의 뉴클레오티드의 안티센스 올리고머가 바람직하다. 유전자의 시험관 내 번역을 억제하기 위한 안티센스 방법의 사용은 당업계에 널리 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Marcus-Sakura, Anal. Biochem. 172:289, 1988] 참조).

안티센스 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 또는 50개의 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 안티센스 핵산은 당업계에 공지된 절차를 사용하여 화학적 합성 및 효소 라이게이션 반응을 사용하여 구성될 수 있다. 예를 들어, 안티센스 핵산 분자는 자연적으로 발생된 뉴클레오티드 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나, 또는 안티센스와 센스 핵산 사이에 형성된 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 디자인된 다양하게 변형된 뉴클레오티드를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있으며, 예컨대, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드가 사용될 수 있다. 안티센스 핵산을 생성하는 데 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예는 다른 것들 중에서 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-아이오도우라실, 히포크산틴, 크산틴, 4-아세틸사이토신, 5-(카복시히드록실메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 디하이드로우라실, 베타-D-갈락토실퀴오신, 이노신을 포함한다.

블루머가 이중 나선 DNA 주위를 감아 3 가닥 나선을 형성하기 때문에 전사를 정지시키기 위해 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것은 삼중체 전략법으로 알려져 있다. 따라서, 이들 삼중체 화합물은 선택된 유전자상의 고유한 부위를 인식하도록 디자인될 수 있다(문헌 [Maher, et al., Antisense Res. and Dev . 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design 6(6):569), 1991]). 이러한 유형의 억제성 올리고뉴클레오티드 또한 본원에 개시된 방법에서 유용하다.

DNA 제한 엔도뉴클레제와 유사한 방식으로 다른 단일 가닥 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 갖는 RNA 분자인 리보자임도 유용하다. 이들 RNA를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 변형을 통해, RNA 분자에서 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하고 이를 절단하는 분자를 조작하는 것이 가능하다(문헌 [Cech, J. Amer . Med . Assn . 260:3030, 1988]). 이 접근법의 주요 장점은 이들이 서열 특이적이므로 특정 서열을 갖는 mRNA만이 불활성화된다는 것이다.

리보자임의 두 가지 기본 유형, 즉, 테트라히메나(tetrahymena)형(문헌 [Hasselhoff, Nature 334:585, 1988])과 "해머헤드(hammerhead)"형이 있다. 테트라 히메나형 리보자임은 길이가 4개의 염기인 서열을 인식하는 반면, "해머헤드"형 리보자임은 길이가 11-18의 염기인 서열을 인식한다. 인식 서열이 길수록, 서열이 표적 mRNA 종에서 독점적으로 발생할 가능성이 더 크다. 결과적으로, 해머헤드형 리보자임은 특정 mRNA 종을 불활성화시키는 데 테트라히메나형 리보자임보다 바람직하고, 인식 서열이 짧은 것보다 18개 염기 인식 서열이 바람직하다.

다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, siRNA 및 다른 억제성 핵산 분자를 치료제로서 투여하는 데 사용될 수 있다. 이러한 시스템은 예를 들어, 리포솜 내 캡슐화, 마이크로입자, 마이크로캡슐, 나노입자, 치료 분자(들)를 발현할 수 있는 재조합 세포(예컨대, 문헌 [Wu et al., J. Biol . Chem . 262, 4429, 1987] 참조), 레트로 바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서 치료 핵산의 구성 등을 포함한다.

C. 소분자

CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 길항제, 및 4-1BB 또는 OX40 효능제는 천연 생성물 또는 합성(또는 반합성) 추출물, 둘 모두의 큰 라이브러리 또는 당업계에 공지된 방법에 따른 화학 라이브러리로부터 확인된 분자를 포함한다. CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 활성 감소를 검출하는 스크리닝 방법(예를 들어, PD-1, PD-L1 및 PD-L2의 세포 사멸 검출)은 활성에 대해 공급원으로부터 화합물을 확인하는 데 유용하다. 4-1BB 또는 OX40 활성 증가를 검출하는 스크리닝 방법도 상기 공급원으로부터 화합물을 확인하는 데 유용하다. 초기 스크리닝은 다양한 화합물 라이브러리, 다양한 다른 화합물 및 화합물 라이브러리를 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2의 발현을 억제하는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 분자에 결합하는 분자, 및 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2의 활성을 억제하는 분자가 확인될 수 있다. 4-1BB 또는 OX40의 발현 및/또는 활성을 증가시키는 분자 또한 확인될 수 있다. 이들 소분자는 조합 라이브러리, 천연 생성물 라이브러리, 또는 다른 소분자 라이브러리로부터 확인될 수 있다. 추가로, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 길항제, 및 4-1BB 또는 OX40 효능제는 상용 공급원으로부터의 화합물 및 확인된 억제제의 상업적으로 이용가능한 유사체로서 확인될 수 있다. 일부 실시양태에서, 소분자는 900 달톤 미만, 또는 800 달톤 미만이다.

시험 추출물 또는 화합물의 정확한 공급원은 길항제의 확인에 중요하지 않다. 따라서, 길항제는 사실상 다수의 화학 추출물 또는 화합물로부터 확인될 수 있다. 길항제일 수 있는 상기 추출물 또는 화합물의 예는 식물, 진균, 원핵생물 또는 동물 기반 추출물, 발효 브로쓰 및 합성 화합물 뿐만 아니라, 기존 화합물의 변형을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 당류, 지질, 펩티드 및 핵산 기반 화합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 무작위 또는 지시된 합성(예컨대, 반합성 또는 전체 합성)의 임의의 다수의 화학 화합물을 생성하기 위해 다수의 방법이 또한 이용가능하다. 합성 화합물 라이브러리는 브랜든 어소시에이트(Brandon Associates: 미국 뉴햄프셔주 메리맥 소재) 및 알드리치 케미칼(Aldrich Chemical: 미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 상업적으로 이용가능하다. 효능제 및 길항제는 메이브릿지 케미칼 컴퍼니(Maybridge Chemical Co: 영국 콘월주 트레빌렛 소재), 콤제넥스(Comgenex: 미국 뉴저지주 프린스톤 소재), 브랜든 어소시에이트(미국 뉴햄프셔 메리맥 소재), 및 마이크로소스(Microsource: 미국 코네티컷주 뉴 밀포드 소재)를 비롯한 다수의 회사로부터 상업적으로 이용가능한 합성 화합물 라이브러리로부터 확인될 수 있다. CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 길항제, 또는 4-1BB 또는 OX40 효능제는 알드리치(미국 위스콘신주 밀워키 소재)로부터 이용가능한 라이브러리와 같은 희귀 화학 라이브러리로부터 확인할 수 있다. CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2 길항제, 또는 4-1BB 또는 OX40 효능제는 바이오틱스(Biotics: 영국 서식스주 소재), 제노바(Xenova: 영국 슬라우 소재), 하버 브랜치 오션그래픽스 인스티튜트(Harbor Branch Oceangraphics Institute: 미국 플로리다주 포르 피어스 소재), 및 파르마마르, U.S.A.(PharmaMar, U.S.A.: 미국 매사추세츠주 캠브리지 소재)를 비롯한 다수의 공급원으로부터 상업적으로 이용가능한 박테리아, 진균, 식물, 동물 추출물의 형태의 천연 화합물 라이브러리에서 확인할 수 있다. 천연 및 합성적으로 생성된 라이브러리 및 화합물은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형된다.

유용한 화합물은 다수의 화학 부류 내에서 발견될 수 있지만, 전형적으로 소형 유기 화합물을 포함하는 유기 화합물이다. 분자량이 50 초과하지만, 약 2,500 달톤 미만, 예를 들어, 약 750 달톤 미만 또는 약 350 달톤 미만인 소형 유기 화합물이 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 부류는 헤테로사이클, 펩티드, 당류, 스테로이드 등을 포함한다. 화합물은 효능, 안정성, 약학적 적합성 등을 증진시키기 위해 변형될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 유용한 화합물은 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2에 대한 Kd가 1 nM 미만, 10 nm 미만, 1 μM 미만, 10 μM 미만, 또는 1 mM 미만이다.

D. 펩티드 변이체

인간 CTLA-4, 인간 BTLA, 인간 TIM-3, 인간 LAG3, 인간 PD-1, 인간 PD-L1, 또는 인간 PD-L2에 특이적으로 결합하는 면역어드헤신 또한 사용될 수 있다. 면역어드헤신은 면역글로불린 분자의 Fc 영역과 같은 불변 영역에 융합된 단백질의 세포외 또는 결합부를 함유하는 융합 단백질이다. PD-1에 특이적으로 결합하는 면역어드헤신 분자의 예는 PCT 공개 번호 WO2010/027827 및 WO2011/066342(이 둘 모두 참조로 포함된다)에 개시되어 있다. 상기 면역어드헤신 분자는 PD-L2-FC 융합 단백질인 AMP-224(B7-DCIg로도 공지)를 포함한다. 융합 단백질인 추가의 PD-1 길항제는 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2014/0227262호(이는 본원에서 참조로 포함된다)에 개시되어 있다.

한 실시양태에서, 개시된 방법에서 유용한 LAG3 길항제는 수지상 세포를 활성화시키는 데 사용된 가용성 LAG3인 IMP321이다. 또 다른 실시양태에서, 개시된 방법에 사용되는 경우 TIM-3 길항제는 CA-327(Curis)이다.

CTLA-4 길항제는 우성 음성 단백질 또는 면역어드헤신일 수 있으며, 예를 들어, 미국 공개 특허 출원 제2016/0264643호(이는 본원에서 참조로 포함된다)를 참조한다. 추가의 항CTLA-4 길항제는 CTLA-4가 그의 동족 리간드에 결합하는 능력을 억제하고, B7의 CTLA-4에 대한 능력을 파괴하고, CTLA-4에 결합하는 CD80의 능력을 파괴하고, CTLA-4에 결합하는 CD86의 능력을 파괴할 수 있는 소분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 억제제를 포함한다.

한 실시양태에서, 길항제로서 작용하는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 단백질의 변이체는 길항제 활성을 갖는 단백질을 확인하기 위한 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 단백질의 점 돌연변이체 또는 말단절단 돌연변이체와 같은 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 한 예에서, 길항제는 가용성 단백질이다.

추가 실시양태에서, 효능제로서 작용하는 4-1BB의 변이체는 효능제 활성을 갖는 단백질을 확인하기 위한 점 돌연변이 또는 말단절단 돌연변이체와 같은 4-1BB 돌연변이체의 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인할 수 있다. 효능제는 가용성 단백질일 수 있다.

따라서, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 또는 4-1BB 변이체의 라이브러리는 핵산 수준에서 조합 돌연변이유발법에 의해 생성될 수 있고, 다양한 종류로 이루어진 유전자 라이브러리에 의해 코딩된다. CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 4-1BB 변이체의 라이브러리는 잠재적인 서열의 축퇴 세트가 개별 폴리펩티드로서, 또는 대안적으로, 관심 서열의 세트를 함유하는 더 큰 융합 단백질의 세트(예컨대,파지 디스플레이를 위한)로서 발현될 수 있도록, 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물을 유전자 서열로 효소적으로 라이게이션시킴으로써 생성될 수 있다.

축퇴 올리고뉴클레오티드 서열로부터 잠재적인 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 4-1BB 변이체의 라이브러리를 생성하는 데 사용될 수 있는 다양한 방법이 있다. 축퇴 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에서 수행될 수 있으며, 이어서, 합성 유전자는 적절한 발현 벡터로 라이게이션된다. 축퇴 유전자 세트를 사용하면 원하는 잠재적인 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 4-1BB 서열 세트를 코딩하는 모든 서열을 하나의 혼합물로 제공할 수 있다. 축퇴 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌 [Narang, et al., Tetrahedron 39:3, 1983]; [Itakura et al. Annu. Rev. Biochem. 53:323, 1984]; [Itakura et al. Science 198:1056, 1984] 참조).

추가로, CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2 또는 4-1BB 단백질 코딩 서열의 단편 라이브러리를 사용하여 특정 길항제(또는 4-1BB의 경우 효능제)의 스크리닝 및 변이체의 후속적인 선택을 위한 단편 집단을 생성할 수 있다. 한 실시양태에서, 코딩 서열 단편의 라이브러리는 닉킹이 분자당 대략 한 번만 발생하는 조건하에서 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 또는 4-1BB의 이중 가닥 PCR 단편을 뉴클레제로 처리하는 단계, 이중 가닥 DNA를 변성시키는 단계, 상이하게 닉킹된 생성물로부터의 센스/안티센스 쌍을 포함할 수 있는 이중 가닥 DNA를 형성하도록 DNA를 복원시키는 단계, S1 뉴클레제를 처리하여 재형성된 이중체로부터 단일 가닥 부분을 제거하는 단계, 생성된 단편 라이브러리를 발현 벡터에 라이게이션시키는 단계에 의해 생성될 수 있다. 이 방법에 의해, 다양한 크기의 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, PD-L2, 또는 4-1BB의 N-말단, C-말단 및 내부 단편을 코딩하는 발현 라이브러리가 유도될 수 있다.

점 돌연변이 또는 말단절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물을 스크리닝하고, 선택된 특성을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리를 스크리닝하기 위한 몇몇 기술이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 기술은 단백질의 조합 돌연변이유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 적합하다. 큰 유전자 라이브러리를 스크리닝하기 위해 고처리량 분석이 가능한 가장 널리 사용되는 기술은 일반적으로 유전자 라이브러리를 복제가능한 발현 벡터로 클로닝하는 단계, 생성된 벡터 라이브러리로 적절한 세포를 형질전환시키는 단계, 및 원하는 활성의 검출이 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 분리를 용이하게 하는 조건하에서 조합 유전자를 발현시키는 단계를 포함한다. 반복 앙상블 돌연변이유발(REM: Recursive ensemble mutagenesis)을 스크리닝 분석과 함께 사용하여 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 길항제, 또는 4-1BB 및 OX40 효능제를 확인할 수 있다(문헌 [Arkin and Youvan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7811 7815, 1992]; [Delagrave et al., Protein Eng. 6(3):327 331, 1993]).

한 실시양태에서, 세포 기반 분석은 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 변이체의 라이브러리를 분석하기 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터의 라이브러리는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2를 일반적으로 합성하고 분비하는 세포주로 형질감염될 수 있다. 이어서, 형질감염된 세포는 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 및 특정 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 (각각) 변이체가 분비되도록 배양된다. 세포 또는 상청액에서의 활성에 대한 돌연변이체의 발현 효과는 예컨대, 임의의 기능 검정법에 의해 검출될 수 있다. 이어서, 내인성 활성이 억제된 세포로부터 플라스미드 DNA를 회수할 수 있고, 개별 클론을 추가로 특징화할 수 있다.

펩티드모방체는 또한 CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2 길항제로서 사용될 수 있다. 펩티드 유사체는 약학 산업에서 주형 펩티드의 특성과 유사한 특성을 갖는 비펩티드성 약물로서 일반적으로 사용된다. 이러한 유형의 비펩티드성 화합물은 일반적으로 전산화 분자 모델링의 도움으로 개발된다. 치료적으로 유용한 펩티드와 구조적으로 유사한 펩티드모방체를 사용하여 동등한 치료 또는 예방 효과를 생성할 수 있다. 일반적으로, 펩티드모방체는 패러다임 폴리펩티드(예를 들어, PD-1 생물학적 활성을 갖는 폴리펩티드)와 구조적으로 유사하지만, 임의적으로 --CH₂NH--, --CH₂S--, --CH₂--CH₂--, --CH.=.CH--(시스 및 트랜스), --COCH₂--, --CH(OH)CH₂--, 및 --CH₂SO― 결합에 의해 대체된 하나 이상의 펩티드 결합을 갖는다. 이러한 펩티드 결합은 당업계에 공지된 방법에 의해 대체될 수 있다(예컨대, 문헌 [Morley, Trends Pharm. Sci. pp. 463 468, 1980]; [Hudson et al. Int. J. Pept. Prot. Res. 14:177 185, 1979]; [Spatola, Life Sci. 38:1243 1249, 1986]; [Holladay, et al. Tetrahedron Lett. 24:4401 4404, 1983] 참조). 펩티드모방체는 경제적으로 얻을 수 있고, 안정적일 수 있고, 증가된 수명 또는 흡수를 가질 수 있다. 펩티드모방체의 표지는 일반적으로 정량적 구조-활성 데이터 및/또는 분자 모델링에 의해 예측되는 펩티드모방체의 비간섭 위치(들)에 직접 또는 스페이서를 통해 (예컨대, 아미드 기에 의해) 하나 이상의 표지의 공유 부착을 포함한다. 이러한 비간섭 위치는 일반적으로 펩티드모방체가 결합하여 치료 효과를 생성하는 거대분자(들)와 직접 접촉을 형성하지 않는 위치이다. 펩티드모방체의 유도체화는 펩티드모방체의 원하는 생물학적 또는 약리학적 활성을 실질적으로 방해하지 않아야 한다.

CTLA-4, BTLA, TIM-3, LAG3, PD-1, PD-L1, 또는 PD-L2의 생물학적 활성을 간섭하는 우성 음성 단백질 또는 우성 음성 단백질을 코딩하는 핵산은 또한 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. 우성 음성 단백질은 우성 음성 단백질이 상응하는 야생형 단백질의 적어도 10, 20, 35, 50, 100개, 또는 150개 초과의 아미노산과 적어도 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 심지어 99%의 서열 동일성을 갖는 서열을 갖는 임의의 아미노산 분자이다. 예를 들어, 우성 음성 PD-L1은 돌연변이를 가지는 데, 이는 천연(야생형) PD-1보다 PD-1에 더 밀접하게 결합하지만, PD-1을 통한 어떤 세포 신호 전달도 활성화시키지 않는다.

우성 음성 단백질은 발현 벡터로서 투여될 수 있다. 발현 벡터는 비바이러스 벡터 또는 바이러스 벡터(예컨대, 레트로바이러스, 재조합 아데노 연관 바이러스 또는 재조합 아데노바이러스 벡터)일 수 있다. 대안적으로, 우성 음성 단백질은 예를 들어, 미세 주입 기술을 사용하여 전신 또는 감염된 부위에 재조합 단백질로서 직접 투여될 수 있다.

폴리펩티드 길항제는 빈번하게 더 큰 폴리펩티드(예컨대, ras 또는 효소와의 융합 단백질)의 일부로서, 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 생성될 수 있다. 대안적으로, 상기 펩티드는 화학적 방법에 의해 합성될 수 있다. 재조합 숙주에서 이종 단백질의 발현 방법, 폴리펩티드의 화학적 합성, 및 시험관내 번역은 당업계에 널리 공지되어 있다(문헌 [Maniatis el al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), 2nd Ed., Cold Spring Harbor, N.Y.]; [Berger and Kimmel, Methods in Enzymology, Volume 152, Guide to Molecular Cloning Techniques (1987), Academic Press, Inc., San Diego, Calif.]; [Kaiser et al., Science 243:187, 1989]; [Merrifield, Science 232:342, 1986; Kent, Annu. Rev. Biochem. 57:957, 1988] 참조).

펩티드는 예컨대, 직접 화학 합성에 의해 생성되고, 길항제로서 사용될 수 있다. 펩티드는 N-말단 및/또는 C-말단에 공유 결합에 의해 부착된 비펩티드 모이어티를 갖는 변형된 펩티드로서 생성될 수 있다. 특정 바람직한 실시양태에서, 카복시 말단 또는 아미노 말단 또는 둘 모두는 화학적으로 변형된다. 말단 아미노 및 카복실 기의 가장 일반적인 변형은 각각 아세틸화 및 아미드화이다. 아실화(예컨대, 아세틸화) 또는 알킬화(예컨대, 메틸화)와 같은 아미노-말단 변형 및 아미드화와 같은 카복시-말단 변형, 및 고리화를 포함하는 다른 말단 변형은 다양한 실시양태에 포함될 수 있다. 코어 서열에 대한 특정 아미노-말단 및/또는 카복시-말단 변형 및/또는 펩티드 연장은 유리한 물리적, 화학적, 생화학적 및 약리학적 특성, 예컨대, 안정성 증진, 효력 및/또는 효능 증가, 혈청 프로테제에 대한 내성, 바람직한 약동학적 특성 등 제공할 수 있다,

본 개시내용은 하기 비제한적 실시예에 의해 예시된다.

실시예

실시예 1

물질 및 방법

건강한 공여자 혈액 샘플, 환자 혈액 및 조직 샘플: 말초 혈액, 비침범 림프절, 전이성 림프절 및 종양 샘플을 두경부 편평 세포 암종(HNSCC: head and neck squamous cell carcinoma), 흑색종 및 결장암을 앓고 있는 개체로부터 수득하였다. 모든 대상체는 서면 동의서에 서명하였고, 연구는 헬싱키 선언(Declaration of Helsinki)에 의해 확립된 윤리적 표준에 따라 수행하였다. 샘플 수집시에는 환자들은 요법을 받고 있는 중이 아니었다. 이전에 이들은 화학요법, 방사선요법, 수술, 면역요법을 비롯한 매우 다양한 요법을 받았거나, 또는 치료를 받은 적이 없는 상태였다.

말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 FICOLL-PAQUE® PLUS(GE Healthcare) 구배를 통해 전혈로부터 정제하고, 분석 전에 동결보존하였다.

종양 표본을 하기와 같이 제조하였다: 멸균 조건하에서 표본을 기계적 해리에 의해 단일 세포 현탁액으로 프로세싱하고, 히알루로니다제 0.5 mg/ml, 콜라게나제 1 mg/ml(둘 모두 Sigma-Aldrich), DNase 30 U/ml(Roche) 및 인간 혈청 알부민(MP Biomedicals)로 보충된 1.5% 최종 농도의 RPMI-1640에서 분해시켰다. 세포를 자석 교반 막대로 교반하면서 실온에서 1시간(hr) 동안 분해시켰다. 세포 현탁액을 70 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 일부 경우에서, FICOLL-PAQUE® PLUS 밀도 원심분리에 의해 상기 기술된 바와 같이 종양 침윤 림프구를 농축시켰다. 종양 단일 세포 현탁액을 추가 분석까지 LN₂에서 동결보존하였다.

항체 및 유세포 분석법: 형광 표지된 항체를 하기 제조사로부터 구입하였다:

바이오레전드(Biolegend): CD3(UCHT1), CD4(OKT-4 또는 RPA-T4), CD8(RPA-T8), CD25(BC96), CD45(2D1), CD45RA(HI100), CD69(FN50), CD127(A019D5), HLA-DR(L243), CTLA-4(BNI3), 4-1BB(4B4-1), CCR7(G043H7);

BD 바이오사이언스(BD Bioscience): CD27(M-T271), Ki-67(B56), OX40(L106), PD-1(EH12);

써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific): CD39(eBioA1), CD103(Ber-ACT8 및 B-Ly7), CD154(24-31), CXCR5(MU5UBEE), FOXP3(PCH101), ICOS(ISA-3).

생존가능한 세포를 구별하기 위해 고정가능한 생/사 염료를 사용하였다(Biolegend). FACS 완충제(PBS, 1% FBS 및 0.01% NaN3으로 보충)에서 세포 표면 염색을 수행하였다. 제조사의 지침에 따라 e바이오사이언스(eBioscience)의 Fix/Perm 키트를 사용하여 세포내 염색을 수행하였다. 세포 분류를 위해 ATTUNE® 유세포 분석기(ThermoFisher Scientific) 또는 FORTESSA™ 유세포 분석기 및 FACSARIA™ II(둘 모두 BD)에서 염색된 세포를 획득하였다. 데이터는 FLOWJO® 소프트웨어 10.7.1(Treestar)을 사용하여 분석하였다.

세포 분류 및 T 세포 확장: 동결보존된 PBMC 및 종양 침윤 림프구(TIL)를 해동시키고, 일부 경우에서, 생체외 염색 및 확장을 위해 스템셀(Stemcell)로부터의 T 세포 농축 키트 또는 MILTENYI®을 사용하여 T 림프구에 대해 농축시켰다. TIL 농축을 위해 EpCAM 비드(StemCell)를 칵테일에 첨가하였다. 이어서, 농축된 T 세포 분획을 항체(Ab)로 표지하고, 관심 집단을 세포 분류 후, FACSARIA™ II(BD)에서 >95% 순도로 정제하였다. 기억 CD4+ Tconv 세포는 CD4+CD8-CD45RA-CCR7+/-CD127+CD25-(전체 기억)로 분류되었다. TIL로부터의 CD4+ 서브세트는 CD3+CD4+CD8-CD45RA-CCR7+/-CD127+ CD25-ICOS-PD-1-(DN CD4), CD3+CD4+CD8-CD45RA-CCR7+/-CD127+CD25-ICOS-PD-1+(SP CD4), 및 CD3+CD4+CD8-CD45RA-CCR7+/-CD127+CD25-ICOS+PD-1+(DP CD4)로 분류되었다. 일부 실험에서 ICOS/PD-1 DP CD4+ 세포는 CXCR5 발현을 기반으로 CXCR5+ 및 CXCR5-DP 서브세트로 추가로 분류되었다.

DN, SP, DP, 및 DP/CXCR5+/- CD4+ TIL의 확장을 위해, 세포를 분류하고, 2 mmol/L L-글루타민(Gibco), 1% (vol/vol) 비필수 아미노산(Gibco), 1% (vol/vol) 피루브산나트륨(Gibco), 페니실린(50 U/ml) + 스트렙토마이신(50 ㎍/ml)(Gibco), 및 10% 우태아 혈청(Hyclone) 또는 5% 인간 혈청으로 보충된 완전 RPMI-1640에서 배양하였다. 기능적 검정 및 확장을 위해, 세포 분류에 CD3 항체를 사용하지 않았다. 분류된 CD4+ T 세포(1000 - 2500개의 세포/웰)를 다중클론으로 96 웰 둥근 바닥 플레이트(Corning/Costar)에서 1 ㎍/ml 피토헤마글루티닌(PHA)(Sigma)으로 자극하거나, 또는 5,000-25,000개의 CD4 TIL을 글렉스(Grex) 6 웰 플레이트에서 조사된(5000 rad) 동종이계의 배양 보조 세포(100:1 - 조사된 PBMC:CD4 TIL) 존재하에 항CD3/28 비드로 자극하고, 50-500 IU/ml의 IL-2(Proleukin)와 함께 인큐베이션시켰다. 웰이 전면생장에 도달하였을 때, T 세포를 분할하고, 세포주를 분석시까지 완전 배지 IL-2에서 유지시키거나, 또는 LN₂에서 동결보존하였다.

인간 유두종바이러스 ( HPV ) 중첩 펩티드 합성:

HPV 항원의 CD4 T 세포 인식을 스크리닝하기 위해, HPV(타입 16 및 18) E6 및 E7 종양단백질(길이 각각 159, 99, 159 및 106 aa)의 전장 아미노산 서열을 코딩하는 4개의 중첩 펩티드 라이브러리를 사용하였다. 각 풀의 펩티드는 11개의 아미노산이 중첩된다. HPV16 E6은 37개의 펩티드를 함유하고, HPV16 E7은 22개의 펩티드를 함유하고, HPV18 E6은 37개의 펩티드를 함유하고, HPV18 E7은 각 풀에 24개의 펩티드를 함유한다. 펩티드는 GENSCRIPT® USA, 인크.(ENSCRIPT® USA, Inc.)에 의해 합성하였다.

T 세포 반응성 검정법( HPV 펩티드): OX40 및 CD25의 상향조절을 사용하여 확장된 CD4+ TIL 서브세트에 의한 종양단백질 E6 및 E7의 인식을 평가하였다. 검정을 위해, 확장된 CD4+ T 세포 서브세트를 해동시키고, 항원 제시 세포(APC)로서 자가 단핵구와 함께 공동 배양하기 2일 전에 500 IU/ml IL-2가 보충된, 5% 풀 인간 혈청을 포함하는 완전 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 각 공동 배양 전에 T 세포를 세척하고, 배지를 사이토카인 무함유 배지로 교체하였다. CD14+ 단핵구를 동결보존된 자가 PBMC로부터 단리하고, CD14 비드(Miltenyi® Biotec)를 사용하여 농축시키고, 2-4 hr 동안 HPV 펩티드 풀로 펄싱하였다. 모든 검정을 위해, 항CD3 Ab(OKT3)를 양성 대조군으로 사용하고, DMSO를 비히클 대조군으로 사용하였다. 동일한 부피(100 ㎕)의 T 세포와 단핵구를 함께 혼합하였다. 1x10⁵개의 CD4+ T 세포를 단독으로, 펩티드 펄스된 단핵구 또는 펩티드로 펄싱되지 않은 단핵구(T 세포: 단핵구 비 = 10:1 - 5:1)와 함께 16 - 19 hr 동안 (밤새도록) 배양하였다. 공동 배양 후, 세포를 수확하고, 펠릿화하고, 활성화 마커의 상향조절을 위해 유세포 분석법을 통해 평가하였다. 세포를 생존성 염료로 표지한 후, 이어서, CD4, OX40, CD25, CD40L 및 PD-1 세포 표면 염색을 수행하였다. 세포를 세척하고, 염색 완충제 중에 재현탁시킨 후, ATTUNE® 유세포 분석기(ThermoFisher Scientific)에서 획득하였다. FLOWJO® 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.

CD4 T 세포 - 종양 세포 반응성 검정법: OX40 및 CD25의 상향조절을 사용하여 자가 CD4+ TIL 서브세트에 의한 종양 세포의 인식을 평가하였다. 확장된 CD4+ T 세포 서브세트를 해동시키고, 검정 전 1 내지 2일 동안 500 IU/ml IL-2로 보충된 5% 풀링된 인간 혈청을 포함하는 완전 RPMI-1640 배지 중에서 배양하였다. T 세포:종양 세포 공동 배양 전에, 확장된 CD4+ 세포 서브세트를 세척하고, 배지를 IL-2 무함유 배지로 교체하여 OX40 및 CD25의 발현을 감소시켰다. 이어서, 확장된 CD4+ T 세포(1x10⁵)를 단독으로, 또는 자가 종양 세포와 함께 (T 세포:표적 세포 비 = 2:1) 배양하였다. 공동 배양 48 hr 후, T 세포를 생존성 염료로 표지한 후, 이어서, 세포 표면 염색을 위해 CD4, CD25 및 OX40에 대한 항체로 표지하였다. 세포를 유세포 분석법으로 분석하였다. 일부 조건에서, 종양 세포를 T 세포를 첨가하기 전에 24 hr 동안 20 ng/ml의 재조합 인간 IFN-γ(BIOLEGEND®)와 함께 미리 인큐베이션시켰다. 48 hr 공동 배양 실험으로부터 상청액을 수집하고, 사이토카인 비드 어레이(CBA: cytokine bead array)에 의해 사이토카인에 대해 분석하였다. CBA의 경우, 제조사의 프로토콜(INVITROGEN®, Platinum ProcartaPlex Human Panel 2, 13-plex)을 따라 수행하였다. IL-5, IL-10, IL-13 및 TNF-α에 대해 얻은 데이터는 루미넥스 200(Luminex 200) 기기에서 분석하였다.

단일 세포 RNAseq 데이터 분석: 데이터는 진 익스프레션 옴니버스(Gene Expression Omnibus) 수탁 번호 GSE120575에서 다운로드받았다. 다운로드 전, 데이터를 프로세싱하고, 리드 100만 개당 전사체(TPM: transcripts per million read)로 발현 수준을 정규화하였다. 추가 분석을 위해 데이터를 SEQGEQ™(FLOWJO® LLC)로 임포트하였다. 적어도 1000개의 유전자에 대해 0이 아닌 값을 나타내지 않는 세포는 하우스키핑 유전자 목록의 낮은 평균 값(log₂(TPM+1) < 2.5)을 제시하였다면, 또는 PTPRC(CD45) 및 CD3E/CD3D/CD3G 발현이 0인 경우, 필터링하였다. 이어서, 세포를 CD3E/CD3D/CD3G의 합산 값 > 1로 게이팅하여 T 세포를 정의하였다. 관심 집단을 확인하기 위해, T 세포 내에서 FoxP3-CD4⁺CD8^- 세포를 게이팅하고, CD4 세포 내에서 PDCD1 및 ICOS 이중 양성 세포에 대해 추가로 게이팅하였다. 이어서, 샘플을 항PD-1 처리 전 또는 처리 후 단리 여부에 기초하여, 및 항PD-1 처리에 대한 공급원 환자의 반응에 의해 샘플을 계층화하였다. 3가지 조건에서 반응자와 비반응자를 비교하여 차등 발현 RNA 분석을 수행하였고: 처리 전 또는 처리 후, 처리 전, 처리 후 사이에 차이가 없고, 유의적으로 발현되는 것으로 밝혀진 유전자 목록(FDR 보정 p 값 < .05)을 추가 분석을 위해 내보냈다.

실시예 2

CXCR5 , PD-1, 및 ICOS에 대한 항체( Ab )는 인간 종양 반응성 CD4 T 세포에 대해 농축시킨다.

인간 종양에서 PD-1 및 ICOS를 공동 발현하는 CD4 TIL을 확인하였고, 이들 세포를 종양 반응성에 대해 농축시킨다(도 1). 종양(두부경부암 환자)로부터 단리된 인간 CD4 T 세포를 PD-1 및 ICOS 이중 양성 세포로 분류하고, PD-1 양성 및 ICOS 음성 및 PD-1/ICOS 이중 음성 세포와 비교하였다. 활성화 마커 OX40 및 CD25의 상향조절로 제시되는 바와 같이 종양 반응성(이 경우, HPV E6 특이적 T 세포)은 PD-1/ICOS 이중 양성 집단 내에서 고도로 농축되었고, 여기서 CD4 TIL의 다른 서브집단에서는 반응성이 거의 또는 전혀 발견되지 않았다(도 1). PD-1 및 ICOS는 마우스의 종양에서 종양 반응성 CD4 T 세포를 확인하는 데 사용될 수 있다는 점에 주목한다(문헌 [A1 spach et al., Nature, 2019. 574 (7760:696)]).

CD4 T 세포의 PD-1/ICOS 이중 양성 서브집단이 종양 반응성에 대해 농축되었다. 따라서, 면역요법 치료, 항PD-1 차단에 반응하는 환자에서 이들 세포가 더 높은 비율로 발견되는지 여부를 조사하였다. RNAseq 단일 세포 데이터 세트(문헌 [Sade-Feldman et al., Cell, 2018. 175:998])를 이용하였고, 여기서 RNA는 흑색종 환자로부터 단리된 종양 침윤 백혈구로부터 단리시켰다. 상기 환자 집단 내에서 일부 환자는 항PD-1 요법에는 반응하였지만, 다른 환자는 반응하지 않았다. PD-1/ICOS 이중 양성 CD4는 종양 반응성에 대해 고도로 농축되는 바, 반응 환자에서 상기 CD4 TIL의 비율이 증가했는지 여부를 결정하였다. 놀랍게도, 반응자 대 비반응 환자에서 PD-1/ICOS 이중 양성 CD4 TIL의 비율에서는 차이가 없는 것으로 나타났다(도 2b). PD-1/ICOS 이중 양성 CD4 TIL 집단의 비율에서 정량적 차이는 나타나지 않았지만; PD-1+/ICOS+ CD4 TIL 내에서 반응자 대 비반응자 샘플 사이에 정성적 차이가 있는지 여부를 조사하였다(RNA 분석). 흥미롭게도, 두 mRNA는 비반응자 샘플 대비 반응자 샘플에서의 이중 양성 CD4 TIL 집단 내에서 고도로 유의적인 증가를 보였다(CXCR5(q 값 = 1.41 x 10^-7) 및 TCF7(q 값 = 6.33 x 10^-6))(도 2c). 도 3은 다른 CD4 TIL 서브집단(좌측 패널, 비ICOS/PD-1 DP TIL)은 PD-1 처리 전 및 처리 후, 이 둘 모두 반응자 대 비반응자에서 어떤 증가도 보이지 않았는 바, CXCR5 RNA를 발현한 세포 비율의 증가는 ICOS+/PD-1+ TIL 집단(우측 패널)에 특이적이었다는 것을 보여주는 것이다. CXCR5는 세포 표면 단백질이기 때문에, CXCR5 단백질이 실제로 상이한 종양 유형으로부터 단리된 세포 중 PD-1+/ICOS+ CD4 TIL 표면에서 발현되었는지 여부를 시험할 수 있었다. 도 4a-4b에 제시된 바와 같이. PD-1+/ICOS+/CXCR5+ CD4 TIL은 흑색종, 결장암, HPV 양성 및 음성 두부경부암 표본에서 발견되었다.

종양 반응성 CD4 T 세포는 인간 종양의 면역 매개 파괴에서 중요한 역할을 할 수 있다(문헌 [Tran, E et al., Science, 2014. 344(6148):641]). CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL이 종양 반응성에 대해 농축되었는지 여부를 확인하기 위해, 이를 분류하고, ICOS^-/PD-1^- CD4 TIL(DN) 및 및 CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL과 비교하였다. 그 결과, HPV E6 및 E7 단백질에 대한 반응(T 세포 활성화 단백질 CD25 및 OX40의 상향조절)으로 측정된 바, CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL은 ICOS^-/PD-1^- CD4 TIL보다 종양 반응성 세포의 빈도가 더 높았고, CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL과 비교하였을 때에는 종양 반응성의 빈도가 유사한 것으로 나타났다(도 5a-5c). 흑색종 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 또 다른 실험을 수행하였다. 도 5a-5c에 제시된 동일한 T 세포 집단을 단리하고, 분류하고, 자가 종양 세포와 함께 인큐베이션시킨 후, 이어서, CD25 및 OX40의 상향조절에 대해 평가하였다. 두부경부암 환자 샘플과 유사하게, CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL은 ICOS^-/PD-1^- CD4 TIL에 비해 종양 반응성이 증가하였고, CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL에서도 유사한 양의 종양 반응성이 발견되었다(도 6a-6c). 사이토카인 생산은 T 세포에 의한 Ag 특이적 인식의 또 다른 특징이다. 따라서, 종양과 함께 인큐베이션된 CD4 TIL의 상청액을 사이토카인의 존재에 대해 시험하였다(도 7a-7d). CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL은 IL-5, IL-10, TNFα 및 IL-13에 대하여 나타난 바와 같이, ICOS^-/PD-1^- CD4 TIL과 비교하였을 때, 세포당 더 많은 종양 특이적 사이토카인을 생성하였다. CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL은 CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL과 비교하여 더 많은 IL-5 및 TNFα를 생성하였다. 그에 반해, CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL은 CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL과 비교하였을 때, IL-10은 더 높은 수준으로, 및 IL-13은 유사한 수준으로 생성하였다.

결론적으로, PD-1/ICOS 이중 양성 CD4 TIL 내의 CXCR5⁺ 서브세트는 종양 면역요법(예컨대, TIL 요법 및/또는 TCR 기반 요법)에 사용될 수 있는 치료 특성을 가지고 있다. 이는 항PD-1 요법에 대한 반응자가 PD-1/ICOS 이중 양성 집단 내에서 CXCR5를 발현하는 세포의 비율이 증가했음을 보여주는 단일 세포 RNA 데이터 세트에서 명백하였다(도 3).

CXCR5는 또한 다른 CD4 TIL 서브세트(비ICOS/PD-1 DP TIL)에서도 발현되었지만, 다른 CD4 TIL 서브세트에서의 그의 발현과 항PD-1 요법에 대한 반응과는 상관관계가 없었다. 흥미롭게도, CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ 및 CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ 둘 모두 종양 반응성에 대해 농축되었고, 유사한 비율의 종양 반응성 T 세포를 가졌다(도 5 & 6). CXCR5⁺ 및 CXCR5^- 서브세트는 유사한/높은 수준의 PD-1을 발현하지만, CXCR5⁺ 서브세트만이 항PD-1 치료 활성과 상관관계가 있었다.

따라서, CXCR5⁺ 서브세트 내에서 면역 매개 종양 파괴를 증진시키는 데 도움이 되는 상기 두 세포 유형 사이에는 (종양 Ag 인식 이외의 다른) 정성적 차이가 존재한다. 이를 위해, CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL과 CXCR5^-/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL 간의 종양 유발 사이토카인 생산을 비교하였다. CXCR5+ 서브세트에서 IL-5/TNF-α 생산 증가 및 IL-10 생산 감소가 검출되었다. IL-5 및 TNF-α는 종양내 염증을 증가시키는 이펙터 사이토카인인 반면, IL-10은 면역 억제 특성을 갖는 사이토카인이다(sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0008874914002020 참조). 따라서, CXCR5⁺/ICOS⁺/PD-1⁺ CD4 TIL의 사이토카인 프로파일, 종양 반응성에 대한 농축 및/또는 다른 품질을 통해 항PD-1 요법에 대한 임상 반응과 그의 연관성이 설명이 된다. 이러한 흥미로운 특성에 기인하여 상기 세포 집단이 입양 세포 치료 환경에서 치료제로 사용될 수 있다는 것을 신뢰할 수 있다.

본 개시내용의 원리가 적용될 수 있는 가능한 많은 실시양태를 고려하여, 예시된 실시양태는 단지 한 예일 뿐이며, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 간주되지 않아야 함을 인식하여야 한다. 오히려, 본 발명의 범주는 하기 청구범위에 의해 정의된다. 따라서, 본 발명자들은 이러한 청구범위의 범주 및 정신에 포함되는 모든 것을 본 발명인 것으로 주장한다.

Claims (42)

1. 종양을 앓는 대상체에게 치료 유효량의 CD4 양성(CD4⁺), 유도성 T 세포 공동자극인자 양성(ICOS⁺), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 양성(PD-1⁺), C-X-C 모티프 케모카인 수용체 5 양성(CXCR5⁺) T 세포를 투여하여 종양을 치료하는 단계를 포함하는, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 종양이 고형 종양인 방법.
3. 제2항에 있어서, 고형 종양이 두부경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 흑색종, 난소암, 폐암, 유방암, 또는 전립선암인 방법.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 대상체에 있어 자가 유래인 방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 치료 유효량의 인터류킨(IL)-2, IL-15, IL-21, 프로그래밍된 사멸(PD)-1 길항제, 프로그래밍된 사멸 리간드(PD-L1) 길항제, 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4) 길항제, B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 길항제, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3) 길항제, 림프구 활성화 유전자 3(LAG3) 길항제, 4-1BB 효능제, 또는 OX40 효능제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
7. 제6항에 있어서,
   a) PD-1 길항제가 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   b) PD-L1 길항제가 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   c) CTLA-4 길항제가 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   d) BTLA 길항제가 BTLA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   e) TIM-3 길항제가 TIM-3에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   f) LAG3 길항제가 LAG3에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   g) 4-1BB 효능제가 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
   h) OX40 효능제가 OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
8. 제7항에 있어서, a)-h) 중 어느 하나가 인간 단일클론 항체, 인간화 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합 단편인 방법.
9. 제6항에 있어서, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, 또는 LAG3 길항제가 소형 억제성 RNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 소분자 또는 우성 음성 단백질인 방법.
10. 글루타민, 혈청, 및 항생제를 포함하는 조직 배양 배지 중에서 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 배양하여 1차 배양물을 형성하는 단계;
    1차 배양물을 유효량의 동종이계의 조사된(irradiated) 배양 보조 세포 및 인터류킨(IL)-2로 자극하여 자극된 T 세포를 형성하는 단계; 및
    자극된 T 세포를 조직 배양 배지 및 유효량의 IL-2에서 배양하여;
    CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 단계
    를 포함하는, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 방법.
11. 제10항에 있어서, 1차 배양물을 약 5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 IL-2에서 자극하는 단계, 및/또는 자극된 T 세포를 약 5 ng/ml 내지 약 50 ng/ml의 IL-2에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 1차 배양물을 약 10 ng/ml의 IL-2에서 자극하는 단계, 및/또는 자극된 T 세포를 약 10 ng/ml의 IL-2에서 배양하는 단계를 포함하는 방법.
13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 1차 배양물을 유효량의 동종이계의 조사된 배양 보조 세포로 자극하는 단계가 약 1,000 내지 약 2,000개의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 약 100,000 내지 약 300,000개의 동종이계의 배양 보조 세포로 자극하는 것을 포함하는 것인 방법.
14. 종양을 앓는 대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재를 검출하는 단계를 포함하고,
    여기서 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 존재는, 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적일 것임을 시사하는 것인, 종양을 앓는 대상체가 암 치료제에 대해 반응할지 여부를 결정하는 방법.
15. 종양을 앓는 대상체에게 제1 용량의 암 치료제를 투여하는 단계, 및
    대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수를 결정하는 단계
    를 포함하고, 여기서 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수의 증가는, 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적이라는 것을 시사하는 것인, 종양을 앓는 대상체가 암 치료제에 대해 반응할지 여부를 결정하는 방법.
16. 제14항 또는 제15항에 있어서, 암 치료제를 대상체에게 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
17. 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료제가 체크포인트 억제제, 화학요법제, 방사선, 또는 그의 조합인 방법.
18. 종양을 앓는 대상체에게 제1 용량의 암 치료제를 투여하는 단계, 및
    대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수를 결정하는 단계로서,
    여기서 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양의 증가는, 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과적이라는 것을 시사하는 것인 단계, 및
    제2 용량의 암 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제1 용량은 제2 용량과 동일하거나, 또는 제2 용량은 제1 용량보다 낮은 것인, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법.
19. 종양을 앓는 대상체에게 제1 용량의 암 치료제를 투여하는 단계, 및
    대상체로부터의 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수를 결정하는 단계로서,
    여기서 대조군과 비교하여 생물학적 샘플 중 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 양의 감소 또는 변함 없음은, 제1 용량의 암 치료제가 대상체에서 종양을 치료하는 데 효과가 없다는 것을 시사하는 것인 단계, 및
    제2 용량의 암 치료제를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 제2 용량은 제1 용량보다 높거나, 또는 제2 용량은 제1 용량과 동일한 것인, 종양을 앓는 대상체를 치료하는 방법.
20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 대조군이 암 치료제로 처리하기 전의 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플 중의 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포의 수이거나, 또는 대조군이 표준 값인 방법.
21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 암 치료제가 체크포인트 억제제 또는 화학요법제인 방법.
22. 제21항에 있어서, 체크포인트 억제제가 대상체에 대한 프로그래밍된 사멸(PD)-1 길항제, 프로그래밍된 사멸 리간드(PD-L)1 길항제, 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4) 길항제, B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 길항제, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3) 길항제, 림프구 활성화 유전자 3(LAG3) 길항제, 또는 4-1BB 효능제인 방법.
23. 제14항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 말초 혈액 샘플 또는 종양 생검인 방법.
24. 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
25. 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 종양이 고형 종양인 방법.
26. 제25항에 있어서, 고형 종양이 두부경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 또는 흑색종인 방법.
27. 종양 세포 항원을 발현하는 종양을 앓는 대상체로부터의 샘플로부터 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 단리하는 단계, 및
    T 세포 수용체(TCR)를 코딩하는 핵산 분자를 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포로부터 클로닝하여,
    TCR을 코딩하는 핵산 분자를 단리하는 단계
    를 포함하는, 종양 세포 항원에 특이적으로 결합하는 TCR을 코딩하는 핵산을 단리하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 샘플이 말초 혈액 또는 종양 생검인 방법.
29. 제27항 또는 제28항에 있어서, T 세포 수용체를 클로닝하기 전 시험관내에서 CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포를 확장시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 TCR을 코딩하는 핵산 분자.
31. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 TCR을 코딩하는 핵산 분자에 의해 코딩된 TCR.
32. 제30항의 핵산 분자로 형질감염된 단리된 숙주 T 세포.
33. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에게 유효량의 CD8⁺ T 세포를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
34. 대상체에서 종양을 치료하는 데 사용하기 위한, 치료 유효량의 CD4 양성(CD4⁺), 유도성 T 세포 공동자극인자 양성(ICOS⁺), 프로그래밍된 세포 사멸 단백질 1 양성(PD-1⁺), C-X-C 모티프 케모카인 수용체 5 양성(CXCR5⁺) T 세포를 포함하는 조성물.
35. 제34항에 있어서, 종양이 고형 종양인 조성물.
36. 제35항에 있어서, 고형 종양이 두부경부 편평 세포 암종, 결장직장암, 흑색종, 난소암, 폐암, 유방암, 또는 전립선암인 조성물.
37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, CD4⁺ICOS⁺PD-1⁺CXCR5⁺ T 세포가 대상체에 있어 자가 유래인 조성물.
38. 제34항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 조성물.
39. 제34항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에 대한 치료 유효량의 인터류킨(IL)-2, IL-15, IL-21, 프로그래밍된 사멸(PD)-1 길항제, 프로그래밍된 사멸 리간드(PD-L1) 길항제, 세포독성 T 림프구 연관 단백질 4(CTLA-4) 길항제, B- 및 T-림프구 감쇠인자(BTLA) 길항제, T 세포 면역글로불린 및 뮤신 도메인 함유-3(TIM-3) 길항제, 림프구 활성화 유전자 3(LAG3) 길항제, 4-1BB 효능제, 또는 OX40 효능제를 추가로 포함하는 조성물.
40. 제39항에 있어서,
    a) PD-1 길항제가 PD-1에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    b) PD-L1 길항제가 PD-L1에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    c) CTLA-4 길항제가 CTLA-4에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    d) BTLA 길항제가 BTLA에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    e) TIM-3 길항제가 TIM-3에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    f) LAG3 길항제가 LAG3에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    g) 4-1BB 효능제가 4-1BB에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편이고;
    h) OX40 효능제가 OX40에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 단편인 조성물.
41. 제40항에 있어서, a)-h) 중 어느 하나가 인간 단일클론 항체, 인간화 단일클론 항체, 또는 그의 항원 결합 단편인 조성물.
42. 제39항에 있어서, PD-1 길항제, PD-L1 길항제, CTLA-4 길항제, BTLA 길항제, TIM-3 길항제, 또는 LAG3 길항제가 소형 억제성 RNA, 안티센스 RNA, 리보자임, 소분자 또는 우성 음성 단백질인 조성물.