CN110006871A - 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用 - Google Patents

一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110006871A
CN110006871A CN201910384185.3A CN201910384185A CN110006871A CN 110006871 A CN110006871 A CN 110006871A CN 201910384185 A CN201910384185 A CN 201910384185A CN 110006871 A CN110006871 A CN 110006871A
Authority
CN
China
Prior art keywords
histamine
fruit wine
content
dppi
lymphocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910384185.3A
Other languages
English (en)
Inventor
周晓鹰
魏涛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Changzhou University
Original Assignee
Changzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Changzhou University filed Critical Changzhou University
Publication of CN110006871A publication Critical patent/CN110006871A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/01—Arrangements or apparatus for facilitating the optical investigation
    • G01N2021/0106—General arrangement of respective parts
    • G01N2021/0112—Apparatus in one mechanical, optical or electronic block

Abstract

组胺是组氨酸在组氨酸脱羧酶的作用下脱羧基产生的炎性介质，它通过4种细胞膜上的受体发挥生物学作用，其中组胺4型受体在淋巴细胞上表达，在骨髓、脾、肺等与炎症相关部位高度表达。二肽肽酶I是一种溶酶体半胱氨酸蛋白酶，在淋巴细胞激活时释放。果酒类制造业中，组胺含量是一个重要的果酒质量标准，但由于发酵过程中不同程度的污染以及菌种本身的质量会导致果酒产品中组胺含量参次不齐，食用含有高组胺含量的果酒，容易引起机体一系列不良反应。本专利利用组胺可以与组胺4型受体结合而激活淋巴细胞并释放二肽肽酶I的特点，建立了一个快速测定外源性组胺的方法，可用于果酒等食品中组胺含量的质量控制，也可用作动植物组织中的组胺含量检测。

Description

一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用
技术领域
本发明涉及到一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用。
背景技术
组胺（histamine）是肥大细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞等免疫细胞在脱羧酶的作用下使组氨酸脱羧基产生的炎性介质。组胺对机体具有重要的影响，尤其在过敏性疾病机制中，这些免疫细胞被激活释放组胺，同时组胺又可以进一步激活其他免疫细胞。组胺可引起毛细血管扩张，使血管通透性增强，造成局部组织水肿；组胺会导致支气管平滑肌收缩、痉挛；并在细胞因子释放和粘附过程中发挥重要作用。
组胺是通过相应的4种细胞膜受体发挥生物学作用的。这4种受体在在表达、信号转导及其生理功能等方面均不同，其中组胺4型受体（H4R）是近年来新发现的受体，在淋巴细胞，中性粒细胞和树突状细胞上广泛表达，也在骨髓、外周血、脾、肺等与炎症相关部位高度表达。
研究发现，不仅是内源性组胺，来自食物或环境的外源性组胺也会诱发疾病，尤其是食物中的组胺会引起的机体快速反应，比如食物过敏，血管肿大等。各个国家都对食品（包括酒类、调味品、水产品、肉类等）中组胺含量制定了限量标准。组胺在微生物发酵或微生物腐败的过程中产生，比如，高含组氨酸的酒类和奶制品发酵、鱼虾等水产品腐烂过程中在酶及微生物的共同作用下产生大量组胺。
果酒类制造业中，组胺含量是一个重要的果酒质量标准，国际上已经对葡萄酒中的组胺制定了明确的限量标准，在瑞士规定含量不得高于10mg/L，而德国、比利时、法国限量标准更低，分别为2mg/L、5.6mg/L、8mg/L。但由于发酵过程中不同程度的污染以及菌种本身的质量会导致果酒产品中组胺含量参次不齐，甚至高组胺含量的劣质酒也有出现在市场和被消费。食用含有高组胺含量的果酒，容易引起组胺中毒，导致头晕、心跳加快、脉快、胸闷和呼吸促迫、血压下降、呕吐等症状。
二肽肽酶I（DPPI），是肽酶C1家族的溶酶体外半胱氨酸蛋白酶，高表达于各类免疫颗粒细胞（包括肥大细胞、中性粒细胞和细胞毒性淋巴细胞等）。DPPI是激活炎性细胞中的颗粒丝氨酸蛋白酶的激活酶，许多过敏性疾病和炎性疾病的发病都是和这些炎性蛋白酶活性增加有关。所以利用外源性组胺通过H4R激活淋巴细胞，进一步释放二肽肽酶I的细胞机制，我们建立了一个基于外源性组胺检测的细胞模型，并且应用于果酒等食品的质量控制，间接指示组胺含量。
本专利利用外源性组胺可以激活免疫淋巴细胞从而引起二肽肽酶I释放的特点，建立了一个可以快速测定食物中外源性组胺含量的方法。
发明内容
1.原代大鼠骨髓淋巴细胞的提取和细胞DPPI活性确认
取 Wistar 大鼠（6-8周），脱颈椎处死，剔除大腿上的肌肉组织，取出腿骨，用含4%青链霉素混合液的灭菌过的PBS冲出腿骨中的淋巴细胞，在200目细胞筛上过滤细胞悬液，并用红细胞裂解液去除红细胞，细胞悬液于37℃、5% CO2培养箱中过夜，去除贴壁细胞，获得较纯的骨髓淋巴细胞；检测淋巴细胞DPPI活性，以确认该收获的细胞可用。
2.基于外源性组胺检测的细胞模型的建立
利用本研究室设计和合成以苯丙氨酸-甘氨酸DPPI特异性底物GF-AFC以及建立的DPPI活性检测方法，建立基于外源性组胺检测的细胞模型。
白色荧光96孔板，每孔加入50μL新鲜的原代大鼠骨髓淋巴细胞（106个/mL），将外源性组胺（标准品）梯度稀释，浓度分别0.001、0.01、0.1、1、10mM。分别每孔加入10μL上述不同浓度的外源性组胺，置于37℃，干预30分钟后，再加入10μL含0.5mM GF-AFC的DPPI缓冲液（25mM柠檬酸，10mM NaCl），在激发波长400nm和发射波长492nm条件下检测荧光强度，并计算DPPI活性（Vmax）。
将无水乙醇（阴性对照）梯度稀释，浓度分别1.65、3.75、7.5、15、30%。白色荧光96孔板，每孔加入50μL新鲜的原代大鼠骨髓淋巴细胞（106个/mL），分别每孔加入10μL上述不同浓度的乙醇，37℃干预30分钟后，再加入10μL含0.5mM GF-AFC的DPPI缓冲液（25mM柠檬酸，10mM NaCl），在激发波长400nm和发射波长492nm条件下检测荧光强度，计算DPPI活性（Vmax）。我们的实验结果发现，在低浓度范围内酒精浓度对DPPI活性的检测结果没有影响。
3.标准曲线的建立
以上述外源性组胺的浓度为横轴、以DPPI活性为纵轴建立标准曲线。
4.利用细胞模型快速检测果酒中组胺含量是否超标
随机抽取果酒生产工厂中生产的同一批次、同一酒精度（平行条件）的果酒。
白色荧光96孔板，每孔加入50μL新鲜的原代大鼠骨髓淋巴细胞（106个/mL），分别每孔加入10μL随机抽取的果酒，37℃干预30分钟后，再加入10μL含0.5mM GF-AFC的DPPI缓冲液（25mM柠檬酸，10mM NaCl），在激发波长400nm和发射波长492nm条件下检测荧光强度，计算DPPI活性（Vmax1）；将国家限量标准的组胺加入同一浓度的酒精溶液中配制标准溶液，测其DPPI活性（Vmax0）。
4.1外源性组胺含量计算：通过组胺浓度-DPPI活性标准曲线计算待测果酒样品和标准溶液中外源性组胺含量，分别用C1和C0表示。
4.2 变异系数的确认CV (Coefficient of Variance)：以上检测均重复3-6次，CV% 小于10%为有效。CV（变异系数）的计算公式：CV% = SD/MN*100%（标准偏差SD、平均值MN）。
4.3 快速筛选出组胺含量超标的果酒：我们可以使用以下公式a= k×(C1/ C0)，k为校正系数，若a≤1则该果酒中组胺含量未超标；若a>1则该果酒中组胺含量超标。
附图说明
图1. 外源性组胺（标准品）增加骨髓淋巴细胞中DPPI活性表达，并呈浓度依赖
外源性组胺对骨髓淋巴细胞中DPPI活性有体外激活作用，并呈浓度依赖。组胺浓度分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10时，DPPI活性（Vmax）分别为1.61、1.78、2.09、2.37、2.17、2.35。（A）以外源性组胺的浓度为横轴、以DPPI活性为纵轴建立的线性标准曲线；（B）以lg(外源性组胺的浓度)为横轴、以DPPI活性为纵轴建立标准曲线（log-dose vs response）。可能是外源性组胺通过淋巴细胞上的组胺4型受体刺激淋巴细胞使其分泌DPPI，DPPI是激活炎性细胞使其炎性蛋白酶活性增加，引起细胞内的变化和细胞外基质中的酶链级反应，造成基质降解和组织重塑，导致组织损伤和慢性炎症。

Claims (6)

1.利用外源性组胺可以通过通过结合淋巴细胞表面组胺4型受体从而激活免疫淋巴细胞，并引起细胞释放二肽肽酶I的特点，建立一个可以快速测定食物和动植物组织中外源性组胺含量的方法。
2.细胞模型：提取大鼠原代淋巴细胞并确认细胞DPPI活性。
3.外源性组胺对淋巴细胞有体外激活作用，激活后的淋巴细胞释放DPPI，并呈组胺浓度依赖。组胺浓度分别为0、0.001、0.01、0.1、1、10时，DPPI活性（Vmax）分别为1.61、1.78、2.09、2.37、2.17、2.35。
4.乙醇对照组的设定：乙醇对淋巴细胞中DPPI活性有体外抑制作用，抑制率和高浓度（7-30%乙醇浓度）相关。而当乙醇浓度在低浓度范围内（0-3.75%），对DPPI活性（Vmax）无影响。
5.通过建立的细胞模型，测果酒样品中DPPI活性，根据外源性组胺浓度-DPPI活性标准曲线可计算出果酒样品中组胺的含量。
6. 使用公式快速筛选出组胺含量超标的果酒：a= k×(C1/ C0)，k为校正系数，若a≤1则该果酒中组胺含量未超标；若a>1则该果酒中组胺含量超标。
CN201910384185.3A 2019-02-20 2019-05-09 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用 Pending CN110006871A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2019101273884 2019-02-20
CN201910127388 2019-02-20

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110006871A true CN110006871A (zh) 2019-07-12

Family

ID=67176354

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910384185.3A Pending CN110006871A (zh) 2019-02-20 2019-05-09 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110006871A (zh)

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050014786A1 (en) * 2003-07-11 2005-01-20 Chongqing Sun Tetrahydroquinoline derivatives as cannabinoid receptor modulators
CN1706495A (zh) * 2005-05-31 2005-12-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种新的以异种免疫细胞为细胞载体的细胞疫苗及其制备方法
CN102171234A (zh) * 2008-08-05 2011-08-31 康奈尔大学 光交联核酸水凝胶
CN102413817A (zh) * 2009-04-27 2012-04-11 利发利希奥公司 治疗胰岛素抗性和糖尿病的组合物和方法
CN102617608A (zh) * 2012-03-09 2012-08-01 常州大学 一种抗组胺药氮异丙嗪的合成及分离方法
CN106399243A (zh) * 2016-09-30 2017-02-15 中山大学 一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂及方法
WO2018148585A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Genentech, Inc. Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof
CN108707140A (zh) * 2013-03-14 2018-10-26 勃林格殷格翰国际有限公司 蛋白酶c抑制剂
CN108883093A (zh) * 2016-02-08 2018-11-23 免疫制药有限公司 二盐酸组胺组合及其用途

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050014786A1 (en) * 2003-07-11 2005-01-20 Chongqing Sun Tetrahydroquinoline derivatives as cannabinoid receptor modulators
CN1706495A (zh) * 2005-05-31 2005-12-14 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种新的以异种免疫细胞为细胞载体的细胞疫苗及其制备方法
CN100354002C (zh) * 2005-05-31 2007-12-12 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种新的以异种免疫细胞为细胞载体的细胞疫苗及其制备方法
CN102171234A (zh) * 2008-08-05 2011-08-31 康奈尔大学 光交联核酸水凝胶
CN102413817A (zh) * 2009-04-27 2012-04-11 利发利希奥公司 治疗胰岛素抗性和糖尿病的组合物和方法
CN102617608A (zh) * 2012-03-09 2012-08-01 常州大学 一种抗组胺药氮异丙嗪的合成及分离方法
CN108707140A (zh) * 2013-03-14 2018-10-26 勃林格殷格翰国际有限公司 蛋白酶c抑制剂
CN108883093A (zh) * 2016-02-08 2018-11-23 免疫制药有限公司 二盐酸组胺组合及其用途
CN106399243A (zh) * 2016-09-30 2017-02-15 中山大学 一种干细胞样记忆性t细胞体外诱导剂及方法
WO2018148585A1 (en) * 2017-02-10 2018-08-16 Genentech, Inc. Anti-tryptase antibodies, compositions thereof, and uses thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALAN R. MCEUEN 等: ""The conversion of recombinant human mast cell prochymase to enzymatically active chymase by dipeptidyl peptidase I is inhibited by heparin and histamine"", 《EUR. J. BIOCHEM.》 *
吴晓苹 等: ""组氨酸及其衍生物在水介质中的电化学行为初探"", 《福州大学学报(自然科学版)》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Karamoko et al. The biochemical and microbiological quality of palm wine samples produced at different periods during tapping and changes which occured during their storage
CN100582226C (zh) 编码新蛋白水解酶的新基因
Karki et al. Selection and characterization of potential baker's yeast from indigenous resources of Nepal
RU2010109421A (ru) Ячмень с низким содержанием гордеинов
Heiss et al. Tissue-based analysis of a charred flat bread (galette) from a Roman cemetery at Saint-Memmie (Dép. Marne, Champagne-Ardenne, north-eastern France)
CN101906453B (zh) 一种制备乳酸链球菌素的发酵方法
Wang et al. Optimization of fermentation process for preparation of mulberry fruit wine by response surface methodology
WO2017093345A1 (fr) Procédé de culture d'algues rouges unicellulaires (aru) avec du perméat lacté
RU2528017C2 (ru) Способ получения ферментированного натурального продукта
CN110006871A (zh) 一个基于外源性组胺检测的细胞模型以及应用
Bak et al. Nutritional properties, microbial and sensory quality, and formation of biogenic amines in wild-grown mushrooms (Cantharellus cibarius & Boletus edulis) from Austrian local markets
Kraus et al. Effect of rehydration on dry wine yeast activity
Kumar et al. Fermentative production of vinegar from grapes and guava using adsorbed cells of Acetobacter aceti
JP2012057990A (ja) 新規な肉組織の鮮度判定方法
CN105154309B (zh) 一种低嘌呤、富含氨基酸和维生素d的食用菌醋制备方法
JP2007269681A (ja) 茸由来破骨細胞形成阻害剤
KR20140045790A (ko) 마-홍국을 이용한 막걸리 제조방법 및 그에 의한 마-홍국 막걸리
RU2384066C1 (ru) Способ приготовления хлебобулочного изделия
CN110089750A (zh) 一种八月瓜与宣木瓜复合酵素的制备工艺
JP2007153813A (ja) 健康機能性組成物及びその製造法
CN112111416B (zh) 一株用于果酒全过程绿色生产的东方伊萨酵母及其应用
JP2010252726A (ja) 柿の抗酸化活性機能増強法および健康食品素材
AU2016282708A1 (en) Process for saponin enhanced autoloysis of yeast
Vatti Optimisation of processing conditions and quality evaluation of honey mead
SU690072A1 (ru) Питательна среда дл выращивани инфузорий

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20190712