JP2007269681A

JP2007269681A - 茸由来破骨細胞形成阻害剤

Info

Publication number: JP2007269681A
Application number: JP2006096644A
Authority: JP
Inventors: Hirokazu Kawagishi; 洋和河岸; Etsuko Harada; 栄津子原田; Koji Yamaguchi; 宏二山口; Kazuyoshi Yazawa; 一良矢澤
Original assignee: IWADE KINGAKU KENKYUSHO KK; Shizuoka University NUC; Iwade Research Institute of Mycology Co Ltd
Current assignee: IWADE KINGAKU KENKYUSHO KK; Shizuoka University NUC; Iwade Research Institute of Mycology Co Ltd
Priority date: 2006-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2026-03-31
Also published as: JP4912720B2

Abstract

【課題】南米チリやアルゼンチンに自生し、特有の芳香を有し、局地的に賞味されているアンニンコウが、抗破骨細胞形成効果を有する食材としての茸であることを立証する。
【解決手段】学名グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 及び／又はグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) の子実体の水抽出物を有効成分として含有する破骨細胞形成阻害剤、或いは学名グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 及び／又はグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) の菌糸体の水抽出物を有効成分として含有する破骨細胞形成阻害剤である。
【選択図】なし

Description

本発明は、南米のチリやアルゼンチンに自生し、特有の芳香を有し、局地的に賞味されているアンニンコウ（杏仁こう）が破骨細胞の形成を阻害する効果があることを見出し、その子実体又は菌糸体を原料として、水抽出物を得て骨粗しょう症、慢性関節リウマチ、歯周病等、代謝性骨疾患に有効な破骨細胞形成阻害剤を提供するものである。

本発明のアンニンコウは学名グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 或いはグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) と称し、南米チリのパタゴニア地方とかアルゼンチンに自生する強い芳香を有する食用茸であり、日本では未だ知られていなかった。本出願人は現地におもむいてグリフォラ・ガルガルやグリフォラ・ソルドゥレンタの各種の株を採取し、種菌として１０数種類を保有している。本発明においては、これらグリフォラ・ガルガルやグリフォラ・ソルドゥレンタに属する茸をアンニンコウと称する。
グリフォラ属の茸としては、学名グリフォラ・フロンドーサ（Grifola frondosa）、日本名、舞茸が代表的である。舞茸は人工栽培に成功し、広葉樹のおが屑に栄養材を配合した培地を、ポリプロピレン製の袋に入れて人工栽培され、年間を通じて日本各地で容易に購買できる状態にある。しかしながら、舞茸には破骨細胞形成阻害効果がない。

骨は硬組織であり研究材料として扱いにくかったため、その代謝の解明が遅れていた。近時、骨を構成する骨芽細胞、骨細胞、破骨細胞の単離方法が確率し、その代謝が究明されつつある。骨は化学的には、約８０％のリン酸カルシウムなどの無機質と約２０％のコラーゲン等の有機質からなる。骨芽細胞は骨組織の内部表面に存在し盛んにコラーゲン等の骨基質蛋白質を分泌している。この基質蛋白質にリン酸カルシウム、ヒドロキシアパタイトの結晶が沈着し硬い骨組織ができあがる。

このような活性の高い骨芽細胞に対し、骨組織の表面には扁平で不活発な骨芽細胞がある。この細胞は基質合成能は乏しいが、骨基質中に埋もれている骨細胞と突起を介して連絡しており、何らかのシグナル伝達を行っている可能性がある。骨細胞は多くの細長い細胞突起を伸ばし、その細胞突起は骨中の骨細胞同士、及び他の細胞とギャップ結合を介して接触し、高度に発達した細胞間ネットワークを形成している。このネットワークによって、骨の細胞は相互に制御し、骨代謝を営んでいると考えられる。また、生理的なカルシウムの恒常性は破骨細胞による骨溶解が重要な役割を果たしていると思われる。

破骨細胞は２から数１０の核を有する直径２０〜１００μｍの多核の巨細胞で、骨を溶解する細胞である。組織的には酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ陽性多核細胞である。
破骨細胞は造血幹細胞から発生する。発生した前駆破骨細胞は、破骨細胞へと分化し、最終的に幾つかの破骨細胞が融合し、多核の成熟破骨細胞が形成される。
破骨細胞が骨基質を溶解し（骨吸収）、一方、骨芽細胞が骨基質を合成することによって、骨の形成や成長、代謝が円滑に行われ、骨の強度を維持していると考えられる。

本発明は、アンニンコウの子実体や菌糸体中の水溶性成分により、破骨細胞の形成を阻害するものである。更に本発明者らは、日本で未だ知られていないアンニンコウの人工栽培法に成功したものである。
破骨細胞形成阻害剤としては、特許文献１及び特許文献２がある。特許文献１は硫酸化グリコサミノグリカン又はその塩を有効成分として含有する破骨細胞形成抑制剤であり、特許文献２はインターロイキン１８又はその機能性誘導体を含んでなる破骨細胞形成抑制剤である。本発明は、特定の茸類に破骨細胞形成阻害作用を見出して完成したものである。
特開２００４−２１０７１５号公報特開平１０−２３６９７４号公報

一般に、アンニンコウは強い芳香がある。しかも菌糸体培養の際には特に大量の芳香成分を放出する。芳香成分としてはベンズアルデヒド及びシンナムアルデヒドを特定した。菌糸体の培養は容易に行えるが、子実体を発生させることは困難であった。同様の操作を行っても、子実体が発生する場合としない場合があり、その発生量もまちまちであった。又、原基を形成しても、その発育に長時間を要したり、収量が低かったり、子実体が小さかったりして人工的に栽培することは困難であった。
子実体を大量に栽培する方法を完成した結果、実験関係者及びその家族のアンニンコウの摂取量が増大した。その結果、関係者間にアンニンコウは代謝性骨疾患を緩解するとの認識が生じた。そのため、この事実を少なくとも細胞単位で確認する必要が生じた。

本発明は上記課題を解決することを目的とし、その構成は、学名グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 及び／又はグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) の子実体の水抽出物を有効成分として含有する破骨細胞形成阻害剤、或いは学名グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 及び／又はグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) の菌糸体の水抽出物を有効成分として含有する破骨細胞形成阻害剤である。

本発明者らはアンニンコウの子実体の人工栽培に成功し、得られた子実体の一部を研究関係者に配付した。その結果、骨粗しょう症の痛みが緩解したとの複数の情報を得た。これらの情報を確認するため、子実体の各種抽出液に関し、細胞レベルで破骨細胞の形成阻害効果を確認したものである。その結果、水抽出液、酢酸エチル抽出液が顕著に有効であった。同時に、毒性試験も行いアンニンコウの水抽出液、酢酸エチル抽出液は細胞毒性がないことを確認した。

本発明により、アンニンコウを美味な茸として単に食するのみで骨粗しょう症を始め、骨代謝の異常に起因する疾患を予防、緩解、治癒させることが可能である。更に、アンニンコウから有効成分を抽出し、いわゆる健康食品として提供することにより、より多くの有効成分を摂取することが可能になる。更に、容易に栽培できる菌糸体にも、子実体に及ばずながら、同様の効果があることを確認した。

本発明に係るアンニンコウは、南米のチリやアルゼンチンを現実に訪れ、南極ブナ等の林に入りアンニンコウを探索することによって採取することができる。採取したアンニンコウから胞子或いは菌糸体を分離して、本発明の栽培方法によってアンニンコウを人工的に栽培することができる。或いは、本出願人が販売する栽培アンニンコウの子実体を購入して胞子又は菌糸体を得ることもできる。
アンニンコウの子実体は、形状は舞茸と近似しているが、やや小ぶりで、葉幅が広く、色も淡く、黄土色ないし淡褐色の舞茸であり、芳香を有し、味にも優れる。

アンニンコウを栽培するにあたっては、培地は舞茸の栽培に通常使用される培地でもよく、南米に生育する南極ブナ（ノトファグス）のおが屑を併用した培地も好ましい。例えば、培地基材として南極ブナ及び他の広葉樹のおが屑を用い、栄養材として米ぬか、フスマ、ビール粕等を、培地基材／栄養材＝４／１〜１１／１、好ましくは５／１〜９／１（容量比）の割合で混合し、含水率を６０〜７０％に調整して培地とする。使用に際しては、これら培地を培養ビンや培養袋に入れて、高圧下で滅菌し、冷却後に使用する。

第１工程においては、種菌の接種及び培養は通常の舞茸と同様であってもよいが、温度１８〜３０℃、好ましくは１８〜２５℃、相対湿度５０〜８０％、好ましくは６０〜７０％の実質的に暗黒の条件が望ましい。第１工程において、菌糸が培地全体に蔓延し、ベンズアルデヒドを主成分とする強い芳香が培養室全体に広がる。この強烈な芳香がアンニンコウに特徴的である。このときの培地表面の菌糸体のベンズアルデヒドの含有量は数１００〜７００μｇ／ｇ、多くは、２００〜５００μｇ／ｇである。

第２工程は充分に蔓延した菌糸体に刺激を与える工程である。刺激は光照射、低温又は光照射と低温刺激の両者を使用する。光刺激は、照度１００〜３０００Ｌx 程度である。低温刺激も使用でき、第１工程の温度より７〜１７℃、好ましくは１０〜１５℃低下させる。
刺激を与える時期は極めて重要であり、遅すぎても、早すぎても、安定した原基を確実に形成させることはできない。前述の通り、菌糸培養中にベンズアルデヒドを主成分とする強い芳香を放散するが、この芳香が急に激減する時がある。この時の培地表面の菌糸体のベンズアルデヒド含有量は１００μｇ／ｇ以下、例えば３０〜８０μｇ／ｇである。この時期を逃さずに刺激を与える。

第２工程で形成した原基を成長させる第３工程は通常の舞茸とほぼ同様であり、相対湿度９０〜１００％で培養する。原基は培養を続けると、表面が白色から灰色を経て黒色へと変化していく。原基の表面が黒色化した後、培養ビンの蓋を外したり、培養袋を開封する等の方法で培地の空気の循環を促し、培地中の二酸化炭素の濃度を下げることにより培養を促進することができる。
本発明の方法によれば、種菌の接種から８０〜１２０日程度で、培地１ｋｇからアンニンコウの子実体８０〜１２０ｇを安定して収穫することができる。

第３工程において、子実体が充分に発育する寸前に第４工程を行うこともできる。すなわち、子実体が８０〜９５％生育した状態で、炭酸ガス濃度及び湿度を上昇させて２０〜６０時間培養を継続することにより、強度の芳香を有するアンニンコウを得ることができる。炭酸ガス濃度及び湿度を上昇させるには、培養棚の周囲を透明な板で囲ったり、培養基を個別に囲ったり、袋を被せたりすることにより達成される。
第４工程を経て得られた栽培アンニンコウは強い芳香を有し、芳香の主成分はベンズアルデヒドである。
本発明の方法で栽培されたアンニンコウは、淡色の舞茸様外観とベンズアルデヒドを主成分とする強い芳香で判別できる。

菌糸体の培養は、担子菌の培養に通常用いられる固体培養法及び液体培養法のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、シュークロース、マルトース、澱粉等、資化し得る炭素源であれば利用できる。窒素源としては、硫安、硝安、硝酸ソーダ、尿素等の他、天然の複合栄養源として、じゃが芋エキス、人参エキス、麦芽エキス、玉葱エキス、コーンスティーブリカー、酵母エキス、ペプトン等を使用できる。ｐＨはやや酸性、好ましくは４ないし５である。培養温度は１５ないし２７℃、好ましくは１９〜２５℃である。
培養は通常好気的条件下がよく、例えば、振とう培養法或いは通気撹拌培養法が用いられる。

破骨細胞形成阻害効果の程度、及び細胞毒性の程度は、下記の方法で試験することができる。
アンニンコウの子実体、その破砕物及び／又は乾燥物を水、温水或いは熱水により抽出し、又は煮沸抽出して一定濃度の抽出物をサンプル液とする。或いは菌糸体の培養物を遠心分離する。得られた遠心分離物をそのまま、或いは乾燥後、水、温水或いは熱水により抽出し、又は煮沸抽出して一定濃度の抽出物をサンプル液とする。

一定量のサンプル液と、骨芽細胞様株化細胞であるＵＡＭＳ−３２細胞と、マウス骨髄細胞を、１０^-8Ｍの活性型ビタミンＤ₃と１０^-6ＭのプロスタグランジンＥ₂を含む培養液で５〜６日間培養することで破骨細胞が形成される。２〜３日に一度培地交換を行う。破骨細胞形成確認後、破骨細胞をＴＲＡＰ染色して顕微鏡下に計測することにより、サンプル液の破骨細胞形成阻害効果を測定することができる。同時にＭＴＴ活性も測定し、サンプルの細胞毒性の程度を測定することができる。

サンプル液を加えることなく上記の実験を行うことによりコントロール値が得られ、このコントロール値との比較により破骨細胞形成阻害効果及び細胞毒性を客観的に計測することができる。
実験の結果、アンニンコウの子実体には顕著な破骨細胞形成阻害効果が確認され、細胞毒性は全くなかった。アンニンコウの菌糸体に関しても、子実体には及ばずながら破骨細胞形成阻害効果を確認した。

破骨細胞形成阻害試験
マウス由来の骨髄細胞と骨芽細胞様間質細胞の共存培養法を用いた。破骨細胞形成阻害活性は破骨細胞（多核、ＴＲＡＰ陽性) の形成した数をカウントして評価した。
マウス（♀、５〜７週齢）の脛骨、大腿骨から採取した骨髄細胞１．３×１０⁸と、頭蓋骨から採取し培養した骨芽細胞様間質細胞１．０×１０⁶を培養液７．２ｍｌに懸濁した。培養液は１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍｕｍＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍＡｌｐｈａＭｅｄｉｕｍ）であった。これを４８穴プレートに１５０μｌ／ウェルになるように分注した。

サンプルは本発明者らの人工栽培法で得られたアンニンコウの子実体をクロロホルム、酢酸エチル、精製水を用いて室温でそれぞれ抽出して得た。サンプルは１００ｍｇ／ｍｌとなるようにメタノールに溶解し、更に培養液で希釈しそれぞれの溶媒の希釈系列を作成した。但し、水抽出サンプルはメタノールに溶解しなかったため蒸留水に溶解した。各濃度のサンプル溶液５０μｌを、２０ｎｇ／μｌの１α，２５ジヒドロキシビタミンＤ₃〔以下、１，２５（ＯＨ）₂ＶＤ₃とする〕５０μｌと共に培養液に添加し全量を２５０μｌ／ウェルとした。炭酸ガスインキュベータを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％で培養した。

培養開始３日目にサンプルを追加するため、各ウェルの上澄液１００μｌを除去し、初日の添加濃度の２倍のサンプル溶液と１，２５（ＯＨ）₂ＶＤ₃（４０ｎｇ／ｍｌ）の各５０μｌを、各ウェルに添加し再び同一条件で培養した。１週間程度培養した後、培養液を除去し、ＰＢＳで洗浄後、１０％ホルマリン含有ＰＢＳ溶液を０．５ｍｌ／ウェル加えて１０分間固定した。細胞はウェル底に固着した。次にエタノールを０．５ｍｌ／ウェル添加し、１分間再固定した。その後、乾燥させ、ＴＲＡＰ反応に供し、破骨細胞を染色した。

ＴＲＡＰとは破骨細胞のマーカーである酒石酸抵抗性フォスファターゼの略称であり、ＴＲＡＰ反応液はナフトールＡＳ−ＭＸフォスフェートを１５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアルデヒドに溶解し、１５ｍｌのバッファー（５０ｍＭの酒石酸ナトリウムを含む０．１ｍ酒石酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ＝５．０）にｆａｓｔｒｅｄｖｉｏｌｅｔ１ｂｓａｌｔを９ｍｇ添加した溶液と混合して調製した。
ＴＲＡＰ反応により染色された、核を２個以上有する破骨細胞を顕微鏡下に計測し、１ウェル当たりの破骨細胞数を計測し、コントロールは被検物質の代わりに同量の１０％牛胎児血清含有α−ＭＥＭ培地を添加したものである。コントロールを１００として溶媒と濃度に関連して、相対的破骨細胞数を図１に示した。

細胞毒性試験
共存培養後、培養液を除去せず、１ｍｇ／ｍｌのＭＴＴ試薬を１２５ｍｌ／ウェル添加した。次いで、炭酸ガスインキュベーターを用いて３７℃、炭酸ガス濃度５．０％の条件で２時間培養した。培養終了後、培養液を除去し、ジメチルサルフォキサイドを１００μｌ／ウェル加えて波長λ＝５７０ｎｍの吸光度を測定して図１に併記した。この場合もサンプル液を添加せずに培養したコントロールを１００として各実験結果の相対的破骨細胞数を示した。
ＭＴＴ試薬は、３−（４，５−ジメチル−２−チアゾリィ）−２，５−ジフェニル−２Ｈ−タータゾリウムブロマイドを１ｍｇ／ｍｌになるように水に溶解して調製した。

図１から明らかなように、酢酸エチル抽出部と水抽出部共に、１２．５、２５、５０μｇ／ｍｌ濃度で有意の破骨細胞形成阻害効果が見られ、細胞毒性はコントロールよりも少なかった。したがって、アンニンコウは骨粗しょう症を始め、骨代謝異常性疾患に有効であることが実証された。

溶媒による抽出物を共存させることによる効果を示すグラフであり、コントロールを１００とする相対的破骨細胞形成数と細胞毒性を示した。

Claims

グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 及び／又はグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) の子実体の水抽出物を有効成分として含有する破骨細胞形成阻害剤。
グリフォラ・ガルガル（Grifola gargal) 及び／又はグリフォラ・ソルドゥレンタ（Grifola sordulenta) の菌糸体の水抽出物を有効成分として含有する破骨細胞形成阻害剤。