CN102413817A - 治疗胰岛素抗性和糖尿病的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供电动改变的流体(富含气体的电动流体)，其包括一定量的电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述量足以对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一者提供调节，以及提供用于治疗糖尿病和与糖尿病相关的病症或疾患(例如胰岛素抵抗)或其症状的治疗组合物和方法。提供了任选与其它治疗剂组合的电动改变的离子含水流体。特定方面提供了通过调节细胞膜、膜电位、膜蛋白(如膜受体，包括但不限于G蛋白偶联受体(GPCR))和细胞间连接(例如紧密连接、间隙连接、粘着带和桥粒)中的至少一者来调控或调节与所述炎性反应相关的细胞内信号转导。其它实施方案包括电动改变的流体(例如，电动改变的富含气体的流体和溶液)和治疗组合物的特定施用途径或制剂。

Description

治疗胰岛素抗性和糖尿病的组合物和方法
发明领域
本文所公开的某些实施方案涉及通过施用包含如本文所公开的至少一种电动改变的流体的治疗组合物来治疗受试者的胰岛素抗性和/或糖尿病性病症或疾患或其至少一种症状。本文所公开的特定实施方案涉及通过调节细胞膜、膜电位、膜蛋白(如膜受体，包括但不限于G-蛋白偶联受体)和细胞间连接(例如紧密连接、间隙连接、粘着带和桥粒(desmasome))中的至少一种来调控或调节细胞内信号转导。某些方面涉及电动改变的流体(富含气体的电动流体)，其包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，其量足以对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一者提供调节。
相关专利申请的交叉引用
本申请要求2009年4月27日提交的序列号为61/173,134的美国临时专利申请的优先权的权益。
发明背景
糖尿病是一种严重的终身代谢病，其定义是存在长期的高血糖水平(高血糖症)。此疾病通常导致失明、心血管疾病、中风、肾衰竭、截肢和神经损伤。糖尿病若不受控制就可能使妊娠恶化，患有糖尿病的妇女所生育的婴儿中有出生缺陷的较常见。在美国，糖尿病是公认的死亡和残疾的主要原因之一。糖尿病可导致严重和过早的并发症，例如糖尿病性视网膜病变。
最近的科学发现已表明，慢性炎症与胰岛素抗性和/或糖尿病之间存在联系。炎症是对创伤或微生物(如细菌或病毒)感染的免疫反应和/或血管反应，并且可以是急性或慢性的和/或局部或全身性的。炎性反应通常破坏、稀释或限制损伤剂和受试者中的受损组织。炎症(特别是急性形式的炎症)的特征在于疼痛、发热、发红、肿胀和可能的机能缺失的典型体征。在组织学水平上，炎症涉及复杂的系列事件，包括小动脉、毛细血管和小静脉扩张，以及通透性及血流增加、流体(包括血浆蛋白)渗出和白细胞迁入炎症区，特别是具有局部反应的区域。
糖尿病的治疗剂治疗包括广泛系列的药品。然而，当今大部分可用的治疗具有相当大的副作用，如腹痛、腹泻、恶心、排气、胃气胀、食欲不振、体重增加、低血糖和体液潴留。因此有必要找到更好的糖尿病治疗剂和治疗方法。由于炎症与胰岛素抗性和糖尿病之间存在联系，因此协同使用抗炎药物和糖尿病药物的联合疗法可能会使治疗效果上佳。
发明概述
本发明的特定方面提供治疗糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的电动改变的含水流体，所述电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地成形，其量足以治疗糖尿病或糖尿病相关的病症或疾患或至少其一种症状。在某些实施方案中，电荷稳定的含氧纳米结构是流体中主要的电荷稳定的含气体的纳米结构物质。在特定方面，流体中作为电荷稳定的含氧纳米结构存在的溶解氧分子的百分比选自大于以下的百分比：0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。在某些实施方案中，总的溶解氧基本上存在于电荷稳定的含氧纳米结构中。在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于选自以下尺寸的平均直径：90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm；以及小于5nm。在优选方面，离子水溶液包括盐水溶液。在某些实施方案中，流体是超氧合的。在特定实施方案中，流体包括溶剂化电子的形式。
在特定方面，电动改变的含水流体的改变包括使流体暴露于流体动力诱导的局部化电动效应。在特定实施方案中，暴露于局部化电动效应包括暴露于电压脉冲和电流脉冲中的至少一种。在某些方面，使流体暴露于流体动力诱导的局部化电动效应包括使流体暴露于用以产生流体的装置的诱导电动效应的结构特征。
在某些实施方案中，糖尿病相关病症或疾患包括选自以下中的至少一种：糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病或IDDM(1型)、非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM(2型)、胰岛素抗性；和糖尿病性视网膜病。在优选的方面，糖尿病相关病症或疾患包括糖尿病和胰岛素抗性中的至少一种。优选地，糖尿病相关病症或疾患包括胰岛素抗性。在某些方面，糖尿病相关病症或疾患的至少一种症状与至少一种选自以下的病症相关：慢性炎症、急性炎症、胰岛素抗性。
在某些方面，电动改变的含水流体调节一氧化氮的局部或细胞水平。
在特定实施方案中，电动改变的含水流体促进至少一种选自以下的细胞因子在施用部位的局部减少：IL-1β、IL-8、TNF-α和TNF-β。
在某些方面，所述方法还包括通过同时或辅助地用另外的抗炎剂治疗受试者来协同或非协同地抑制或减轻炎症。优选地，所述其它抗炎剂包括类固醇或糖皮质激素类固醇。在特定实施方案中，糖皮质激素类固醇包括布地奈德(Budesonide)或其活性衍生物。
在某些实施方案中，所述方法还包括联合疗法，其中对患者施用至少一种附加治疗剂。在特定方面，至少一种附加治疗剂选自：双胍类，包括二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍；胰岛素；α-葡糖苷酶抑制剂；双胍类；DPP-4抑制剂；氯茴苯酸类；磺脲类；噻唑烷二酮类；α-葡糖苷酶抑制剂，包括阿卡波糖和米格列醇；DPP-4抑制剂，包括维格列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀和阿格列汀；磺脲类，包括乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、甲磺吖庚脲、格列甲嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列吡脲和格列美脲；氯茴苯酸类，包括那格列奈、米格列奈和瑞格列奈；噻唑烷二酮类，包括曲格列酮、吡格列酮和罗西格列酮；MMP抑制剂，包括MMP-9和MMP-2的抑制剂；短效β2-激动剂、长效β2-激动剂；抗胆碱能类；皮质类固醇类、全身性皮质类固醇类；肥大细胞稳定剂；白三烯调节剂；甲基黄嘌呤；β2-激动剂；沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇；吡布特罗、阿福特罗、福莫特罗、沙美特罗；抗胆碱能类，包括异丙托铵和噻托溴铵；皮质类固醇类，包括倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、莫米松、去炎松、甲基强的松龙、泼尼松龙、强的松；白三烯调+节剂，包括孟鲁司特、扎鲁司特和弃白通；肥大细胞稳定剂，包括色甘酸和萘多罗米；甲基黄嘌呤类，包括茶碱；组合药物，包括异丙托铵和沙丁胺醇、氟替卡松和沙美特罗、布地奈德和福莫特罗；抗组胺剂，包括羟嗪、苯海拉明、氯雷他定、西替立嗪和氢化可的松；免疫系统调节药物，包括他克莫司和吡美莫司；环孢霉素；硫唑嘌呤；麦考酚酸酯；及其组合。
在某些方面，至少一种附加治疗剂为TSLP和/或TSLPR拮抗剂。优选地，TSLP和/或TSLPR拮抗剂选自对TSLP和TSLP受体特异性的中和抗体、可溶性TSLP受体分子和TSLP受体融合蛋白，包括TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或编码一个以上受体链的组分的多肽。在某些方面，治疗包括改变细胞膜结构或功能中的至少一者，包括改变膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性中的至少一者。在特定实施方案中，膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整联蛋白。在某些方面，跨膜受体包括G-蛋白偶联受体(GPCR)。在特定方面，G-蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白质α亚单位相互作用。优选地，G蛋白质α亚单位包括选自以下的至少一种：Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。优选地，至少一种G蛋白质α亚单位为Gαq。
在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构在离子含水流体中稳定地成形，其量足以在所述流体接触活细胞时对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一者提供调节。在某些方面，调节细胞膜电导率包括调节全细胞电导。在特定方面，调节全细胞电导包括调节全细胞电导的至少一种电压依赖性贡献。特定方面包括调节钙依赖性细胞通信途径或系统(例如，调节磷脂酶C活性；调节腺苷酸环化酶(AC)活性)。特定方面包括调节与至少一种选自以下的病症或症状相关的细胞内信号转导：慢性炎症、急性炎症和胰岛素抗性。
所述方法的特定方面包括施用至细胞网或细胞层，并且还包括调节其中的细胞间连接(例如，选自紧密连接、间隙连接、粘着带和桥粒中的至少一种)。在某些方面，细胞网或层包括选自以下的至少一种：CNS血管中的内皮细胞、内皮星形胶质细胞紧密连接、血-脑脊髓液紧密连接或屏障、肺上皮细胞型连接、支气管上皮细胞型连接和肠上皮细胞型连接。
在所述方法的特定实施方案中，电动改变的含水流体是氧合的，并且其中在大气压下流体中氧的存在量为至少8ppm、至少15ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。在某些方面，电动改变的含水流体包括溶剂化电子形式和电动改性或带电氧物质中的至少一种。在某些方面，溶剂化电子或电动改性或带电氧物质的存在量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。在所述方法的特定实施方案中，电动改变的氧合含水流体包含至少部分地由分子氧稳定的溶剂化电子。
某些方面包括改变细胞膜结构或功能的能力，所述改变能够足以对细胞内信号转导提供调节，所述调节在封闭的气密容器中持续至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少12个月或更长的时间。
在所述方法的特定实施方案中，氧在电动改变的流体的电荷稳定的含氧纳米结构中的存在量在大气压下为至少8ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
另外的方面提供配制适用于治疗糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂的方法，包括：获得适用于治疗受试者的糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂；以及将治疗剂与一定量的电动改变的含水流体相组合，所述电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地成形，其量足以治疗炎症或其至少一种症状，其中能够配制适用于治疗糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂。在特定实施方案中，电荷稳定的含氧纳米结构在离子含水流体中稳定地成形，其量足以在所述流体接触活细胞时对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一者提供调节。
又一方面提供药物组合物，包含：适用于治疗受试者的糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂；一定量的电动改变的含水流体，所述电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地成形，其量足以治疗炎症或其至少一种症状。特定方面提供通过权利要求48的方法制备的药物组合物。某些方面包括通过局部、吸入、鼻内和静脉内途径中的至少一种进行施用。
在特定方面，膜相关蛋白包括CCR3。在某些方面，治疗包括调节NF-κB表达和/或活性。
附图简述
图1为现有技术混合装置的部分截面、部分框图。
图2为混合装置的示例性实施方案的框图。
图3为将第一物质递送到图2的混合装置的示例性系统的图解。
图4为图2的混合装置的顶部的不完全的部分截面视图。
图5为图2的混合装置的第一侧面部分的不完全的截面视图。
图6为图2的混合装置的第二侧面部分的不完全的截面视图。
图7为位于图5的第一侧面部分与图6的第二侧面部分之间的图2的混合装置的侧面部分的不完全的截面视图。
图8为图2的混合装置的转子和定子的透视图。
图9为图2的混合装置的第一室内部的透视图。
图10为包括泵410的替代实施方案的图2的混合装置的第一室内部的不完全的截面视图。
图11为图2的混合装置的第二室内部的透视图。
图12为混合装置的替代实施方案的侧面部分的不完全的截面视图。
图13为供混合装置的替代实施方案使用的壳体的中心部分的替代实施方案的透视图。
图14为供混合装置的替代实施方案使用的轴承壳的替代实施方案的不完全的截面视图。
图15为通过垂直于转轴的平面截取的图2的混合装置的混合室的截面视图，其描绘了当转子的通孔接近(但不对齐)定子的孔隙时由空泡引起的转动流类型。
图16为通过垂直于转轴的平面截取的图2的混合装置的混合室的截面视图，其描绘了当转子的通孔对齐定子的孔隙时由空泡引起的转动流类型。
图17为通过垂直于转轴的平面截取的图2的混合装置的混合室的截面视图，其描绘了当之前对齐定子的孔隙的转子的通孔不再与其对齐时由空泡引起的转动流类型。
图18为转子的替代实施方案的侧视图。
图19为通过垂直于转子的转轴的平面截取的放大的不完全的截面视图，其描绘了在转子中形成的通孔和在定子中形成的通孔的交替构型。
图20为通过穿过转子的转轴并沿其延伸的平面截取的放大的不完全的截面视图，其描绘了在转子中形成的通孔和在定子中形成的通孔的构型。
图21为通过穿过转子的转轴并沿其延伸的平面截取的放大的不完全的截面视图，其描绘了在转子中形成的通孔和在定子中形成的通孔的交替偏移构型。
图22为可用于构造转子的通孔和/或定子的孔隙的形状的图解。
图23为可用于构造转子的通孔和/或定子的孔隙的形状的图解。
图24为可用于构造转子的通孔和/或定子的孔隙的形状的图解。
图25为可用于构造转子的通孔和/或定子的孔隙的形状的图解。
图26为在表面附近形成的双电层(″EDL″)的图解。
图27为混合室内部的模型的透视图。
图28为图27的模型的截面视图。
图29为实验装置的图解。
图30示出用图2的混合装置中的氧处理并储存于各在65华氏度封盖的500ml薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中的水中的溶解氧水平。
图31示出用图2的混合装置中的氧处理并储存于均在39华氏度冷冻的500ml薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中的水中的溶解氧水平。
图32示出用图2的混合装置中的氧处理的500ml饮料流体的溶解氧保留。
图33示出用图2的混合装置中的氧处理的500ml布劳恩(Braun)平衡盐溶液的溶解氧保留。
图34示出另外的实验，其中使用图2的混合装置，通过用图2的混合装置中的氮处理水来从水中喷氧。
图35示出在标准的温度和压力下通过图2的混合装置从水中喷氧。
图36为示例性纳米笼(nanocage)的图解。
图37A和37B示出富氧流体的瑞利散射效应；
图38示出在富含气体的流体和去离子对照流体存在下的促有丝分裂测定的细胞因子分布；以及
图39示出在各种溶解氧饱和比下的假单胞菌属(Pseudomonas)细菌的生长速率的差异。
图40A和40B示出使用富氧细胞培养基和非富含气体的培养基的伤口体外愈合。
图41A至41F示出真皮和表皮体内伤口愈合的组织学切片。
图42示出Hale染色在受处理的和对照的愈合伤口中的表达，用于检测酸性粘多糖，如透明质酸。
图43示出用于检测血管生成的冯维勒布兰德氏因子(vonWillebrand’s Factor)染色在受处理的和对照的愈合伤口中的表达。
图44示出Luna染色的检测，用于检测受处理的和对照的愈合伤口中的弹性蛋白。
图45示出受处理的和对照的愈合伤口中每个视野的肥大细胞数目。
图46示出在使用本发明的富含气体的培养基和对照培养基的角膜成纤维细胞测定中在分开的时间点上的死细胞百分比。
图47示出本发明的富含气体的流体在聚合物袋中的储存期限。
图48示出在加压罐氧合流体(1)、本发明的富含气体的流体(2)或对照去离子流体(3)的存在下使脾细胞与MOG接触的结果。
图49-58示出细胞因子的全血样本评价结果。
图59-68示出支气管肺泡灌洗液(BAL)样本评价的相应细胞因子结果。
图69-75示出将缓激肽B2膜受体固定到氨丙基硅烷(APS)生物传感器上的研究。图69中指定了样本板设置，并根据如图71中所指定的样本设置评定缓激肽对固定化受体的结合。缓激肽结合的结果示于图72。根据图73中所指定的设置对缓激肽对受体的结合进行进一步的滴定。如图74所示，缓激肽对B2受体的结合是浓度依赖性的，并且与平常的盐水相比，本发明公开的专利性富含气体的盐水流体中的结合亲和力增大。缓激肽对B2受体结合的稳定化示于图75。
图76-83显示本文所公开的特定实施方案影响调节性T细胞的能力的数据。该研究涉及照射抗原呈递细胞并引入抗原和T细胞。
图84显示本发明的电动产生的流体减少了鲑降钙素和动物模型的血清吸收。结果与紧密连接的增强一致。
图85-89显示在用于产生图84的数据的动物模型的肺组织中的紧密连接相关蛋白的表达水平。
图90-94显示由暴露于RDC1676-01(通过具有另外添加氧的本专利装置处理的无菌盐水；本发明的富含气体的电动产生的流体(Rev))的人包皮角质形成细胞获得的数据，其显示出NOS1和NOS3以及Nostrin、NOS3的上调。
图95和96显示支持发生在混合装置中的局部化电动效应(电压/电流)的数据，所述混合装置包括绝缘转子和定子结构以允许在电动流体产生的过程中检测电压/电流效应。
图97A-C显示为进一步表征本发明的电动产生的流体的基本性质而进行的核磁共振(NMR)研究的结果。电动产生的流体增加了报告海藻糖溶质的13C-NMR线宽。
图98和99显示为进一步表征本发明的电动产生的流体的基本性质而进行的伏安研究(即方波伏安法(图98)和溶出极谱法(图99))的结果。在-0.14V、-0.47V、-1.02V和-1.36V观察到电动产生的流体所独特的方波伏安法的峰差异(相对于对照)。对于电动产生的Revera和Solas流体，在-0.9伏可见显著的极谱峰，并且非电动产生的空白和盐水对照流体的波谱在-0.19伏和-0.3伏显示出特征峰，所述特征峰在电动产生的流体的波谱中是不存在的。
图100-106显示评定电动产生的流体的测试对上皮细胞膜极性和离子通道活性的影响的膜片钳技术的结果。结果表明本发明的电动产生的流体影响全细胞电导的电压依赖性贡献。
图107A-D和108A-D显示的数据表明，当在雄性豚鼠中单独施用或作为硫酸沙丁胺醇的稀释剂施用本发明的电动产生的流体(例如RDC1676-00、RDC1676-01、RDC1676-02和RDC1676-03)时，其具有防止乙酰甲胆碱诱导的支气管收缩的保护作用。
图109-114显示为评定本发明的电动产生的流体在棕色挪威大鼠(Brown Norway rat)卵白蛋白敏化模型中的气道抗炎特性而进行的布地奈德实验的结果。本发明的电动产生的流体减少了嗜酸性粒细胞计数，显示出在减少嗜酸性粒细胞计数方面与布地奈德的协同效应强，Penh值降低，潮气量增加，嗜酸细胞活化趋化因子的血液水平降低，在作为用本发明的电动产生的流体(例如Rev 60)单独或与布地奈德组合处理结果的刺激后6小时的两种主要关键抗炎细胞因子IL10和干扰素γ的血液水平显著提高，并且Rantes的全身水平降低。数据显示布地奈德750μg/kg与本发明的电动产生的流体(例如Rev 60)有相当的协同效应。
图115显示本发明的电动产生的流体(例如Revera 60和Solas)将DEP诱导的TSLP受体在支气管上皮细胞(BEC)中的表达分别减少了大约90％和50％，而生理盐水(NS)只有边际效应。
图116显示本发明的电动产生的流体(例如Revera 60和Solas)将支气管上皮细胞中的DEP诱导的细胞表面结合的MMP9水平分别抑制了大约80％和70％，而生理盐水(NS)只有边际效应。
图117A-C显示系列膜片钳实验的结果，该实验在两个时间点(15分钟(左图)和2小时(右图))和不同的电压方案下评定电动产生的流体(例如RNS-60和Solas)对上皮细胞膜极性和离子通道活性的影响。
图118A-C针对涉及图117A-C的实验显示在三种电压方案(A，从0mV阶跃；B，从-60mV阶跃；C，从-120mV阶跃)和两个时间点(15分钟(空心圆)和2小时(实心圆))下由RNS-60电流数据减去Solas电流数据所得到的图。
图119A-D显示系列膜片钳实验的结果，该实验利用不同的外部盐溶液和在不同的电压方案(图A和C显示从0mV的阶跃；图B和D显示从-120mV的阶跃)下评定电动产生的流体(例如Solas(图A和B)和RNS-60(图C和D))对上皮细胞膜极性和离子通道活性的影响。
图120A-D针对涉及图119A-D的实验显示对于Solas(图A和B)和RNS-60(图C和D)来说，在两种电压方案(图A和C，从0mV阶跃；图B和D，从-120mV阶跃))下由20mM CaCl2(菱形)和40mMCaCl2(方块)电流数据减去CsCl电流数据(示于图119中)所得到的图。
图121A显示对RNS60-1(rns60-1 1um 3D.jpg)的1mm2AFMAFM扫描。小峰(″l″)表示～20nm宽且～1.5nm高或更小的疏水性纳米气泡。
图121B显示对PNS60-1(pp60-11um 3d.jpg)的1mm2扫描。此扫描显示峰(″2″)(疏水性纳米气泡)，其基本上大于(～60nm宽和～5nm高)RNS60-1可见的峰。
图122A-B显示荧光激活细胞分选(FACS)分析的结果，其中使用生理盐水或RNS-60来比较白细胞上的细胞表面受体CD193(CCR3)的表达水平。X轴表示样本荧光的对数，Y轴表示样本中发生荧光的事件。
图123A-C显示荧光激活细胞分选(FACS)分析的结果，其中使用生理盐水或RNS-60来比较白细胞上的细胞表面受体CD154(CD40L)(图A)、CD11B(图B)和CD3(图C)的表达水平。X轴表示样本荧光的对数，Y轴表示样本中发生荧光的事件。
图124A-C显示检验RNS60对MBP引发的T细胞中的NFκB激活的影响的两组凝胶迁移实验(图A和B)和荧光素酶活性(报告基因)测定(图C)的结果。
发明详述
本文所公开的某些实施方案涉及通过对受试者施用包含富含气体的流体的治疗组合物来提供治疗胰岛素抗性和/或糖尿病性病症或疾患或其至少一种症状的组合物和方法。在某些特定实施方案中，富含气体的流体包括富氧的水。
糖尿病性疾患或病症
本文的某些实施方案涉及通过预防或缓解胰岛素抗性和/或糖尿病相关病症或疾病的至少一种症状来治疗受试者的治疗组合物和治疗方法。
本文进一步的实施方案涉及预防或缓解与胰岛素抗性和/或糖尿病相关病症有关的并发症的治疗组合物和治疗方法，包括缓解例如糖尿病性视网膜病的症状。
电动产生的流体：
如本文所用，″电动产生的流体″是指出于本文工作实施例的目的，通过本文详细描述的示例性混合装置(还参见US200802190088和WO2008/052143，两者以引用的方式全文并入本文)而产生的申请人发明的电动产生的流体。如本文公开和呈现的数据所示，电动流体表示相对于现有技术的非电动流体(包括相对于现有技术的氧合非电动流体，例如压力罐氧合流体等)为新颖的且本质上不同的流体。如在本文各方面中所公开的那样，电动产生的流体具有独特且新颖的物理和生物特性，包括但不限于以下：
在特定方面，电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地形成，其量足以在所述流体接触活细胞时对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种提供调节。
在特定方面，电动产生的流体是指在流体动力诱导的局部(例如相对于总的流体体积而言是非均匀的)电动效应(例如电压/电流脉冲)(如本文所述的装置结构局部效应)存在下产生的流体。在特定方面，所述流体动力诱导的局部化电动效应与本文中公开并讨论的表面相关双层和/或流动电流效应相结合。
在特定方面，所施用的本发明的电动改变的流体包含电荷稳定的含氧纳米结构，其量足以对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种提供调节。在某些实施方案中，电动改变的流体为超氧合的(例如RNS-20、RNS-40和RNS-60，在标准盐水中分别包含20ppm、40ppm和60ppm的溶解氧)。在特定的实施方案中，电动改变的流体为非超氧合的(例如RNS-10或Solas，其含有10ppm(例如在标准盐水中大约环境水平的溶解氧)。在某些方面，本发明的电动改变的流体的盐度、无菌度、pH等在流体的电动产生时建立，并通过适当的途径来施用无菌流体。或者，在施用流体之前适当地调节流体的盐度、无菌度、pH等中的至少一种(例如使用无菌盐水或适当的稀释剂)以使之与施用途径生理相容。优选地，用于对盐度、无菌度、pH等中的至少一种进行调节的稀释剂和/或盐水溶液和/或缓冲组合物也为电动流体，或以其它方式相容。
在特定方面，本发明的电动改变的流体包括盐水(例如一种或多种溶解盐；例如基于碱金属的盐(Li+、Na+、K+、Rb+、Cs+等)、基于碱土金属的盐(例如Mg++、Ca++)等，或基于过渡金属的阳离子(例如Cr、Fe、Co、Ni、Cu、Zn等)，在每种情况下均连同任意合适的阴离子组分，包括但不限于F-、Cl-、Br-、I-、PO4-、SO4-和基于氮的阴离子。特定方面包括基于混合盐的电动流体(例如Na+、K+、Ca++、Mg++、过渡金属离子等)，其具有多种组合及浓度，且任选具有抗衡离子的混合物。在特定方面，本发明的电动改变的流体包括标准盐水(例如大约0.9％的NaCl或约0.15M NaCl)。在特定方面，本发明的电动改变的流体包括盐水，该盐水的浓度为至少0.0002M、至少0.0003M、至少0.001M、至少0.005M、至少0.01M、至少0.015M、至少0.1M、至少0.15M或至少0.2M。在特定方面，本发明的电动改变的流体的电导率为至少10μS/cm、至少40μS/cm、至少80μS/cm、至少100μS/cm、至少150μS/cm、至少200μS/cm、至少300μS/cm或至少500μS/cm、至少1mS/cm、至少5mS/cm、10mS/cm、至少40mS/cm、至少80mS/cm、至少100mS/cm、至少150mS/cm、至少200mS/cm、至少300mS/cm或至少500mS/cm。在特定方面，任何盐均可用于制备本发明的电动改变的流体，条件是这些盐能够形成本文所公开的生物活性的盐稳定的纳米结构(例如盐稳定的含氧纳米结构)。
根据特定方面，包含电荷稳定的含气体的纳米结构的本发明的流体组合物的生物效应可以通过改变流体的离子组分和/或通过改变流体的气体组分予以调节(例如提高、降低、调整等)。
根据特定方面，包含电荷稳定的含气体的纳米结构的本发明的流体组合物的生物效应可以通过改变流体的气体组分来调节(例如提高、降低、调整等)。在优选的方面，将氧用于制备本发明的电动流体。在另外的方面，将氧与至少一种选自氮、氧、氩、二氧化碳、氖、氦、氪、氢和氙的其它气体混合。如上所述，离子也可以有所不同，包括连同改变气体的成分。
考虑到本文所公开的教导和测定系统(例如基于细胞的细胞因子测定、膜片钳测定等)，本领域的技术人员可容易地选择适当的盐及其浓度以实现本文所公开的生物活性。
表1：示例性阳离子和阴离子。
常见阳离子：
Figure BDA0000102298890000171
Figure BDA0000102298890000181
常见阴离子：
简单离子：
Figure BDA0000102298890000182
含氧阴离子：
Figure BDA0000102298890000183
Figure BDA0000102298890000191
有机酸的阴离子：
乙酸根离子        CH3COO-甲酸根离子        HCOO-
其它：
Figure BDA0000102298890000192
Figure BDA0000102298890000201
表2.示例性阳离子和阴离子。
单原子阳离子
  式   电荷   名称
  H+   1+   氢离子
  Li+   1+   锂离子
  Na+   1+   钠离子
  K+   1+   钾离子
  Cs+   1+   铯离子
  Ag+   1+   银离子
  Mg2+   2+   镁离子
  Ca2+   2+   钙离子
  Sr2+   2+   锶离子
  Ba2+   2+   钡离子
  Zn2+   2+   锌离子
  Cd2+   2+   镉离子
  Al3+   3+   铝离子
5多原子阳离子
  式   电荷   名称
  NH4+   1+   铵离子
  H3O+   1+   水合氢离子
多价阳离子
  式   电荷  名称
  Cr2+   2  铬(II)离子或二价铬离子
  Cr3+   3  铬(III)离子或三价铬离子
  Mn2+   2  锰(II)离子或二价锰离子
  Mn4+   4  锰(IV)离子
  Fe2+   2  铁(II)离子或二价铁离子
  Fe3+   3  铁(III)离子或三价铁离子
  Co2+   2  钴(II)离子或二价钴离子
  Co3+   3  钴(III)离子或三价钴离子
  Ni2+   2  镍(II)离子或二价镍离子
  Ni3+   3  镍(III)离子或三价镍离子
  Cu+   1  铜(I)离子或一价铜离子
  Cu2+   2  铜(II)离子或二价铜离子
  Sn2+   2  锡(II)离子或二价锡离子
  Sn4+   4  锡(IV)离子或四价锡离子
  Pb2+   2  铅(II)离子或二价铅离子
  Pb4+   4  铅(IV)离子或四价铅离子
单原子阴离子
  式   电荷   名称
  H-   1-   负氢离子
  F-   1-   氟离子
  Cl-   1-   氯离子
  Br-   1-   溴离子
  I-   1-   碘离子
  O2-   2-   氧离子
  S2-   2-   硫离子
  N3-   3-   氮离子
多原子阴离子
  式   电荷   名称
  OH-   1-   氢氧根离子
  CN-   1-   氰离子
  SCN-   1-   硫氰酸根离子
  C2H3O2-   1-   乙酸根离子
  ClO-   1-   次氯酸根离子
  ClO2-   1-   亚氯酸根离子
  ClO3-   1-   氯酸根离子
  ClO4-   1-   高氯酸根离子
  NO2-   1-   亚硝酸根离子
  NO3-   1-   硝酸根离子
  MnO42-   2-   高锰酸根离子
  CO32-   2-   碳酸根离子
  C2O42-   2-   草酸根离子
  CrO42-   2-   铬酸根离子
  Cr2O72-   2-   重铬酸根离子
  SO32-   2-   亚硫酸根离子
  SO42-   2-   硫酸根离子
  PO33-   3-   亚磷酸根离子
  PO43-   3-   磷酸根离子
本发明提出用于治疗糖尿病或糖尿病相关疾患的新型富含气体的流体，包括但不限于富含气体的离子水溶液、盐水溶液(例如标准盐水溶液和本文所讨论以及本领域公认的其它盐水溶液，包括任何生理相容的盐水溶液)、细胞培养基(例如基本培养基及其它培养基)。如果培养基仅含有生长所必需的营养物质，则将其称为″基本″培养基。对于原核宿主细胞，基本培养基通常包括碳源、氮源、磷源、镁源以及痕量的铁和钙(Gunsalus和Stanter，The Bacteria，第1卷第1章，Acad.Press Inc.，N.Y.(1960))。大多数基本培养基使用葡萄糖为碳源，氨为氮源，正磷酸盐(例如PO4)为磷源。可根据具体生长的原核或真核生物体来改变或补充培养基组分，以促使最佳生长而不抑制靶蛋白的生产(Thompson等，Biotech.and Bioeng.27：818-824(1985))。
在特定方面，电动改变的含水流体适于调节其中溶解的报告溶质(例如海藻糖)的13C-NMR线宽。NMR线宽效应是测量例如本文特定工作实施例中所述的测试流体中的溶质″翻滚″的间接方法。
在特定方面，电动改变的含水流体的特征为以下中的至少一种：-0.14V、-0.47V、-1.02V和-1.36V中任何一个独特的方波伏安峰差；-0.9伏下的极谱峰；以及在-0.19伏和-0.3伏下不存在极谱峰，这些是本文中特定工作实施例所公开的电动产生的流体所独有的。
在特定方面，电动改变的含水流体适于改变细胞膜电导率(例如全细胞电导的电压依赖性贡献作为在本文中公开的膜片钳研究中的量度)。
在特定方面，电动改变的含水流体是氧合的，其中在大气压下流体中氧的存在量为至少15ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm的溶解氧。在特定方面，电动改变的含水流体在大气压下具有小于15ppm、小于10ppm的溶解氧水平，或者具有大致为环境氧的水平。
在特定方面，电动改变的含水流体是氧合的，其中流体中氧的存在量介于大约8ppm和大约15ppm之间，这种情况有时在本文中称作″Solas″。
在特定方面，电动改变的含水流体包括溶剂化电子(例如通过分子氧稳定的)和电动改性和/或带电的氧物质中的至少一种，且其中在某些实施方案中，溶剂化电子和/或电动改性或带电的氧物质的存在量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。
在特定方面，电动改变的含水流体适于充分改变细胞膜的结构或功能(例如改变膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性)，以提供对细胞内信号转导的调节，其中在特定方面，膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体(例如G-蛋白偶联受体(GPCR)、TSLP受体、β2肾上腺素能受体、缓激肽受体等)、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整联蛋白。在某些方面，受影响的G-蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白质α亚单位(例如Gαs、Gαi、Gαq和Gα12)相互作用。
在特定方面，电动改变的含水流体适于调节细胞内信号转导，包括对钙依赖性细胞通信途径或系统的调节(例如磷脂酶C活性的调节或腺苷酸环化酶(AC)活性的调节)。
在特定方面，电动改变的含水流体的特征为在本文工作实施例和别处中描述的各种生物活性(例如调控细胞因子、受体、酶及其它蛋白质以及细胞内信号转导途径)。
在特定方面，电动改变的含水流体表现出与二甲双胍的协同作用和/或添加活性。
在特定方面，电动改变的含水流体减少DEP诱导的TSLP受体在支气管上皮细胞(BEC)中的表达，如本文中的工作实施例所示。
在特定方面，电动改变的含水流体抑制支气管上皮细胞(BEC)中的DEP诱导的细胞表面结合的MMP9的水平，如本文中的工作实施例中所示。
在特定方面，电动改变的含水流体的生物效应被白喉毒素抑制，表明β阻断、GPCR阻断和Ca通道阻断影响电动改变的含水流体的活性(例如影响调节性T细胞功能)，如本文中的工作实施例中所示。
在特定方面，电动改变的含水流体的物理和生物效应(例如将细胞膜的结构或功能改变到足以对细胞内信号转导提供调节的能力)在封闭的容器(例如封闭的气密容器)中持续至少两个月、至少三个月、至少四个月、至少五个月、至少六个月或更长的时间。
因此，进一步的方面提供所述电动产生的溶液和制备电动改变的氧合含水流体或溶液的方法，所述方法包括：在相对运动的两个间隔表面之间提供流体物质流并限定其间的混合体积，其中流动的流体物质在混合体积内和穿过混合体积的单程停留时间大于0.06秒或大于0.1秒；以及在适于将至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm的氧溶解在物质中并电动改变流体或溶液的条件下将氧(O2)引入到混合体积内流动的流体物质当中。在某些方面，用不到100毫秒、不到200毫秒、不到300毫秒或不到400毫秒将氧注入到所述物质当中。在特定实施方案中，表面积与体积之比为至少12、至少20、至少30、至少40或至少50。
更进一步的方面提供制备电动改变的氧合含水流体或溶液的方法，包括：在其间限定混合体积的两个间隔表面之间提供流体物质流；和在适于用不到100毫秒、不到200毫秒、不到300毫秒或不到400毫秒将至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm的氧注入到物质当中的条件下将氧引入到混合体积内的流动物质当中。在某些方面，混合体积内流动物质的停留时间大于0.06秒或大于0.1秒。在特定实施方案中，表面积与体积之比为至少12、至少20、至少30、至少40或至少50。
另外的实施方案提供制备电动改变的氧合含水流体或溶液的方法，包括使用混合装置通过混合第一物质与第二物质来产生输出混合物，所述装置包括：第一室，其配置成接收来自第一物质源的第一物质；定子；具有转轴的转子，所述转子设置在定子内并且配置成绕其中的转轴转动，转子和定子中的至少之一具有多个通孔；限定在转子与定子之间的混合室，所述混合室与第一室流体连通并且配置成接收来自第一室的第一物质，并且经由在转子和定子之一中所形成的多个通孔对混合室提供第二物质；第二室，其与混合室流体连通，并且配置成接收来自混合室的输出物；和安装在第一室内的第一内部泵，所述第一内部泵配置成将第一物质从第一室泵送到混合室当中。在某些方面，第一内部泵配置成在第一物质进入混合室之前向第一物质当中赋予圆周速度。
进一步的实施方案提供制备电动改变的氧合含水流体或溶液的方法，包括使用混合装置通过混合第一物质与第二物质来产生输出混合物，所述装置包括：定子；具有转轴的转子，所述转子被设置在定子内并且配置成绕其中的转轴转动；限定在转子与定子之间的混合室，所述混合室具有敞开的第一端和敞开的第二端，第一物质通过敞开的第一端进入混合室，输出物通过敞开的第二端离开混合室，第二物质通过转子和定子中的至少之一进入混合室；第一室，其与混合室的敞开的第一端的至少大部分连通；和第二室，其与混合室的敞开的第二端连通。
另外的方面提供了根据任何上述方法制备的电动改变的氧合含水流体或溶液。
糖尿病和胰岛素抗性
糖尿病是一种严重的终身代谢病，其定义为存在长期的高血糖水平(高血糖症)。这种高血糖症状态是肽类激素胰岛素活性的相对或绝对缺乏的结果。胰岛素由胰腺的β细胞产生和分泌。胰岛素促进葡萄糖的利用、蛋白质合成以及碳水化合物能量作为糖原的形成和储存。葡萄糖作为糖原储存在体内，这是一种聚合的葡萄糖形式，其可转回葡萄糖以满足代谢要求。在正常条件下，经葡萄糖刺激后以基础速率和提高的速率分泌胰岛素，均通过将葡萄糖转化成糖原以维持代谢体内平衡。
术语糖尿病涵盖若干种不同的高血糖症状态。这些状态包括1型(胰岛素依赖型糖尿病或IDDM)和2型(非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM)糖尿病。1型糖尿病与胰岛素水平的不足、减少或没有相关，这不足以将血糖水平维持在生理范围内。
2型糖尿病是越来越普遍的老化疾病。其最初特征是对胰岛素或胰岛素抗性的敏感性降低，并且循环胰岛素浓度补偿性地上升，其中后者是维持正常血糖水平所需的。胰腺β细胞分泌的增加导致胰岛素水平增高，并且所导致的高胰岛素血症与糖尿病的心血管并发症相关。随着胰岛素抗性的恶化，对胰腺β细胞的需求不断增加，直到胰腺不能再提供足够的胰岛素水平，导致血液中的葡萄糖水平升高。最终发生明显的高血糖症和高脂血症，导致与糖尿病相关的破坏性长期并发症，包括心血管疾病、肾衰竭和失明。
由II型糖尿病导致的心血管循环受损所引起的一种具体的并发症为糖尿病性视网膜病，其中眼睛(更具体地为视网膜)由于心血管功能减弱而受到损伤。在视网膜中，循环缺乏所致的损伤最初表现为使动脉弱化，这导致动脉的渗漏。这种渗漏导致小点状出血和肿胀。随着疾病的发展，循环问题致使部分视网膜缺血或缺氧，导致在循环系统试图在视网膜内维持适当氧水平时形成新的脆性血管。这一过程称为新血管形成，其导致血液频繁渗入视网膜中，因为新血管比较脆弱且易于出血。在糖尿病晚期，异常的血管生长持续进行并发展出疤痕组织。脆弱血管和疤痕组织的后果可能是非常严重的，常常会导致视网膜脱离、青光眼和失明。
引起2型糖尿病的确切机制尚不明确，但其导致葡萄糖向骨骼肌当中的运输受损，并且除了导致胰岛素反应不足外，肝葡萄糖的产生也增加。饮食调控通常是无效的，因此多数患者最终需要药物干预来努力防止和/或延缓疾病并发症的进展。许多患者可用很多现有的口服抗糖尿病药物中的一种或多种进行治疗，包括胰岛素、α-葡糖苷酶抑制剂、双胍、DPP-4抑制剂、氯茴苯酸、磺脲和噻唑烷二酮。
α-葡糖苷酶抑制剂(包括阿卡波糖和米格列醇)是竞争性地抑制某些消化碳水化合物的酶(具体地为小肠中的α-葡糖苷酶)的糖类，其中膜结合的α-葡糖苷酶将低聚糖、三糖和二糖水解成葡萄糖及其它单糖。
双胍(如二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍)通过抑制肝脏糖异生和通过增加已存在于血流中的葡萄糖的吸收来降低血清葡萄糖的水平。据信DPP-4抑制剂(包括维格列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀和阿格列汀)可提高肠促胰岛素水平(GLP-1和GIP)。肠促胰岛素抑制胰高血糖素的释放，这可限制葡萄糖水平、增加胰岛素分泌并减少胃排空。
磺脲(包括乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、甲磺吖庚脲、格列甲嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列吡脲和格列美脲)结合至胰腺β细胞的细胞膜上的ATP依赖性K+(KATP)通道，从而增加胰岛素(原)的分泌。还据信磺脲类：1)使β细胞对葡萄糖敏感；2)限制肝脏中的葡萄糖产生；3)减少脂解(分解和释放由脂肪组织产生的脂肪酸)；和4)降低肝脏对胰岛素的清除率。
氯茴苯酸(包括那格列奈、米格列奈和瑞格列奈)与磺脲类的作用机制类似。氯茴苯酸结合至胰腺β细胞的细胞膜上的ATP依赖性K+(KATP)通道，这又可增加胰岛素(原)的分泌。
噻唑烷二酮(包括曲格列酮、吡格列酮和罗西格列酮)结合至过氧化物酶体增殖物激活受体((细胞核内的一组受体分子)。这些受体的正常配体为游离脂肪酸(FFA)和类二十烷酸。当被激活时，受体迁移至DNA，从而激活若干特定基因的转录。这些不同基因的激活导致：1)降低胰岛素抗性；2)减弱脂肪细胞分化；3)抑制VEGF诱导的血管生成；4)降低瘦素(leptin)水平(导致食欲增强)；5)降低某些白介素(例如IL-6)水平；和6)提高脂联素水平。
最近的科学发现已表明慢性炎症与作为糖尿病前兆的胰岛素抗性之间有关联。Solinas等，Cell Metabolism 6，386-397(2007)(据此全文以引用的方式并入)；Duncan等，Diabetes 52，1799-1805(2003)(据此全文以引用的方式并入)；Kathryn E.Wellen和
Figure BDA0000102298890000291
S.Hotamisligil，J.Clin.Invest.115，1111-1119(2005)(据此全文以引用的方式并入)。更具体地讲，炎症通过促进胰岛素受体底物-1(IRS-1)的丝氨酸磷酸化来诱导胰岛素抗性，其损害胰岛素信号传导。个体细胞通过损害胰岛素信号传导变得对血清胰岛素更具抗性，并且代替葡萄糖(由糖原)释放到血流当中的信号。这表明对炎症的药物靶向尤其可降低胰岛素抗性，从而预防糖尿病。此外，采用双重方法，将抗炎疗法与糖尿病的药物治疗相结合可导致加强胰岛素抗性和糖尿病症状的缓解。
炎症
炎症的发生可作为受试者对外来物质(特别是微生物源的外来物质)入侵的防御反应。另外，机械创伤、毒素和瘤形成可诱导炎性反应。白细胞的积聚和随后的激活是大部分形式的炎症发病机制中的主要事件。炎症缺陷可危及宿主，使其容易使感染或伤口恶化。过度的炎症(如长期的炎性反应)可导致炎性疾病，包括但不限于胰岛素抗性、糖尿病、动脉硬化、白内障、慢性皮肤病、再灌注损伤和癌症；导致感染后综合症，如传染性脑膜炎、风湿热；以及导致风湿性疾病，如全身性红斑狼疮和类风湿性关节炎。这些疾病每年影响着世界范围内的数百万人，并导致死亡率和发病率的增加。这些不同疾病过程中的炎性反应的共性使其调控成为预防或治疗人类疾病的主要因素。
促炎性细胞因子的过量产生牵涉到许多炎性疾病和自身免疫疾病的发病机制。TNFα的分泌是引发炎性级联反应的主要事件(Brennan F.M.等，Lancet，1989，2：244-7；Haworth C等，Eur.J.Immunol.1991，21：2575-2579)，并直接促进这些疾病(特别是胰岛素抗性和糖尿病)的引发和维持。其它细胞因子也发挥作用，包括白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12、一氧化氮(NO)、IFN-γ、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-10。这些细胞因子的某些(例如IL-8)可增强或加重炎性反应，而其它的(例如IL-10)可减弱或缓解炎性反应。
免疫系统的细胞(特别是巨噬细胞)响应激活刺激而分泌出许多这样的细胞因子。细胞因子的靶细胞可定域在任何身体腔室中，并且可通过长距离机制作用或可作用于邻近的细胞。因此，细胞因子可以局部或全身的方式调控炎症。
胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)。胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)为引发树突细胞介导的Th2型炎性反应的IL-7样细胞因子，并且被视为过敏性炎症的主开关。TSLP为B细胞和T细胞两者发育和成熟所不可缺少的生长因子。具体而言，鼠TSLP支持B淋巴细胞增殖，并且是B细胞增殖所需的。鼠TSLP在控制T细胞受体-γ(TCR.γ.)基因座的重排中起关键作用，并且对胸腺细胞和成熟T细胞具有显著的刺激作用。参见例如Friend等，Exp.Hematol.，22：321-328，1994；Ray等，Eur.J.Immunol.，26：10-16，1996；Candeias等，ImmunologyLetters，57：9-14，1997。
TSLP具有类似于IL-7的细胞因子活性。例如，TSLP可在刺激B细胞增殖反应中代替IL-7(Friend等，如上文)。尽管TSLP和IL-7介导对靶细胞类似的作用，但它们似乎具有不同的信号传导途径，并且其生物反应可能会不同。例如，尽管TSLP调节STAT5的活性，但其不能激活任何Janus族酪氨酸激酶成员(Levin等，J.Immunol.，162：677-683，1999)。
TSLP对树突细胞和TNF产生的影响。在2001年失隆了人TSLP和人TSLP受体之后，人们发现人TSLP可有效激活不成熟的CD11c+髓样树突细胞(mDC)(参见例如Reche等，J.Immunol.，167：336-343，2001；和Soumelis等，Nat.Immunol.，3：673-680，2002)。Th2细胞在免疫学教科书和文献中一般被定义为产生IL-4、IL-5、IL-13和IL-10的CD4+T细胞，Th1细胞(如CD4+T细胞)产生IFN-γ，并且有时产生TNF。当TSLP-DC用于体外刺激原初同种异基因CD4+T细胞时，诱导了独特类型的Th2细胞，其产生传统的Th2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13以及大量的TNF，但很少或没有IL-10或干扰素-γ(Reche等，如上文)(还参见，例如Soumelis等，Nat.Immunol.，3：673-680，2002)。TNF通常不被视为Th2细胞因子。然而，TNF在哮喘性气道中是突出的，并且与TNF分泌增加相关的基因型与哮喘危险的增大相关。参见Shah等，Clin.Exp.Allergy.，25：1038-1044，1995；以及Moffatt，M.F.和Cookson，W.O.，Hum.Mol.Genet.，6：551-554，1997。
TSLP诱导人mDC以在mRNA水平和蛋白水平上表达TNF超家族蛋白OX40L(Ito等，J.Exp.Med.，202：1213-1223)。由TSLP-DC表达OX40L对于炎性Th2细胞的细化是重要的。因此，TSLP激活的DC通过上调OX40L而不诱导Th1-极化细胞因子产生而造成容许Th2的微环境。同上。
TSLP表达、过敏原特异性反应和哮喘。早期研究显示人原发性皮肤角质形成细胞、支气管上皮细胞、平滑肌细胞和肺成纤维细胞高度表达TSLP mRNA(Soumelis等，Nat.Immunol.，3：673-680，2002)。由于TSLP主要在表皮顶层的角质形成细胞中表达，这表明TSLP产生是完全分化的角质形成细胞的特征。在具有特应性皮炎的患者中的TSLP表达与朗氏细胞迁移和原位激活有关，这表明TSLP可直接促进这些细胞的激活，这些激活的细胞随后可迁移到引流淋巴结并引发过敏原特异性反应。同上。在更近期的研究中，通过原位杂交显示TSLP表达在哮喘气道中增加，并且其与Th2吸引性趋化因子表达和疾病严重程度两者都相关，这提供了TSLP与哮喘之间的联系(Ying等，J.Immunol.，174：8183-8190，2005)。
TSLP受体(TSLPR)和过敏性反应、哮喘。TSLP受体(TSLPR)是大约50kDa的蛋白质，且与共同γ链具有显著的相似性。TSLPR为新的1型细胞因子受体，其与IL-7Rα(CD127)结合构成受体复合物，例如Pandey等，Nat.Immunol.，1：59-64，2000中所述。TSLPR在其羧基端附近具有可与磷酸化STAT5缔合并且在与TSLP接合时介导多种生物学功能的酪氨酸残基(Isaksen等，J.Immunol.，168：3288-3294，2002)。
人TSLPR由单核细胞和CD11c+树突细胞表达，并且TSLP结合诱导TH2细胞吸引性趋化因子CCL17和CCL22的表达。此外，如上所述，TSLPR诱导的树突细胞的激活间接导致了TH2细胞因子IL-4、IL-5和IL-13的分泌增加，这可能是调控CD4+T细胞体内平衡所需的。在小鼠中，TSLPR的缺乏对淋巴细胞数目没有影响。然而，与仅缺乏共同γ链的小鼠相比，TSLPR和共同γ链的缺乏导致较少的淋巴细胞。参见Reche等，J.Immunol.，167：336-343，2001；和Soumelis等，Nat.Immunol.，3：673-680，2002。
研究己发现，TSLP和TSLPR在小鼠的过敏性疾病的引发中起关键作用。在一项研究中，实验结果表明被改造为在皮肤中过表达TSLP的小鼠患上了特应性皮炎，其特征为含炎性浸润的湿疹性皮肤损伤、循环Th2细胞的大幅度增加以及血清IgE升高(Yoo等，J.Exp.Med.，202：541-549，2005)。研究表明在小鼠中TSLP可直接激活DC。在由Li等进行的另一项研究中，研究小组证实在皮肤中过表达TSLP的转基因小鼠患上了特应性皮炎，这强化了TSLP与特应性皮炎发病之间的联系。
另一组研究表明TSLP是小鼠体内引发过敏性气道炎症所需的。在一项研究中，Zhou等表明TSLP转基因的血餐特异性(lunch specific)表达诱导过敏性气道炎症(哮喘)，其特征为白细胞(包括Th2细胞)的大量浸润、杯状细胞增生和上皮下纤维化以及血清IgE水平增加(Zhou等，Nat.Immunol.，6：1047-1053，2005)。然而，相反的是，缺乏TSLPR的小鼠没有能响应吸入的抗原而发生哮喘(Zhou等(上文)；和Al-Shami等，J.Exp.Med.，202：829-839，2005)。因此，这些研究共同表明TSLP是在小鼠中引发过敏性气道炎症所需的。
此外，在Yong-Jun等进行的研究中证实，上皮细胞源性TSLP在人体内引发DC介导的炎性Th2反应，这表明TSLP代表了在上皮细胞-DC界面处的过敏性炎症的主开关(Yong-Jun等，J.Exp.Med.，203：269-273，2006)。
在近期的研究中显示出通过抑制TSLPR的DC功能调节降低了小鼠中的严重程度(Liyun Shi等，Clin.Immunol.，129：202-210，2008)。另一组研究表明，TSLPR不仅在DC中表达，还在巨噬细胞、肥大细胞和CD4+T细胞上表达(Rochman等，J.Immunol.，178：6720-6724，2007；以及Omori M.和Ziegler S.，J.Immunol.，178：1396-1404，2007)。为了排除TSLPR中和对过敏性炎症中的CD4+T细胞或其它效应细胞的直接影响，Liyun Shi等进行了其中在将负载OVA的DC过继转移至未试验过的小鼠的气道之前用抗TSLPR体外处理的实验。此前已发现OVA-DC引发强的嗜酸性气道炎症并伴有Th2细胞因子(如IL-4和IL-5)的大量产生(Sung等，J.Immunol.，166：1261-1271；和Lambrecht等，J.Clin.Invest.，106：551-559，2000)。然而，用抗TSLPR预处理OVA-DC导致嗜酸性粒细胞和淋巴细胞浸润以及IL-4和IL-5水平的显著降低，这进一步说明TSLPR在DC引发的过敏性疾病中所起的作用。这一结果也支持阻断DC上的TSLPR将有助于控制气道炎症(Liyun Shi等，如上文)。
已经有越来越多的实验牵涉TSLP/TSLPR在各种生理过程和病理过程中的作用。TSLP的生理作用包括调节免疫系统，特别是刺激B细胞和T细胞增殖、发育和成熟。TSLP在过敏性哮喘的病理学中起关键作用，并且局部抗体介导的TSLP受体阻断起到缓解过敏性疾病的作用。因此据信TSLP与TSLP受体之间的相互作用在如下的许多生理疾病过程中是重要的：过敏性炎症、特应性皮炎或特应性湿疹患者的皮肤损害、胰岛素抗性或糖尿病以及哮喘。
炎症相关的病症或疾病
本文的某些实施方案涉及通过预防或缓解与某些病症或疾病相关的至少一种炎症症状来治疗受试者的治疗组合物和方法。例如，本文公开的治疗组合物和/或方法可适用于治疗或预防胰岛素抗性和糖尿病。
治疗方法
术语″治疗″是指并包括逆转、缓解、抑制疾病、疾患或病症或其一种或多种症状的进展或预防疾病、疾患或病症或其一种或多种症状；并且″治疗″和″治疗上″是指本文中所定义的治疗行为。
″治疗有效量″是在实施本文所提供的本发明过程中所使用的任何化合物的任何量，该量足以逆转、缓解、抑制疾病、疾患或病症或其一种或多种症状的进展或预防疾病、疾患或病症或其一种或多种症状。
本文的某些实施方案涉及治疗糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗组合物和方法。例如，本文所公开的治疗组合物和/或方法可适用于治疗或预防选自以下的一种或多种病症或疾病：糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病或IDDM(1型)、非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM(2型)、胰岛素抗性以及糖尿病性视网膜病。
已经用类固醇、甲氨蝶呤、免疫抑制药物(包括环磷酰胺、环孢霉素、硫唑嘌呤和来氟米特)、非类固醇类抗炎剂(如阿斯匹林、对乙酰氨基酚)和COX-2抑制剂、金剂和抗疟疾治疗剂来治疗与炎症有关的许多病症或疾病。这些药物具有多种缺点和不良反应，包括注射部位反应、皮疹、上呼吸道感染、自身免疫性疾病和对感染的敏感性增强。此外，许多抗炎药品需要静脉内(IV)施用或皮下(SC)施用，而不是采取更方便和适用的口服或局部皮肤途径。因此，仍然需要开发用于与炎症相关的病症和疾病的新药和治疗方法。
联合疗法
其它方面提供了本文公开的发明方法，其还包括联合疗法，其中将至少一种附加治疗剂施用于患者。在某些方面，所述至少一种附加治疗剂选自胰岛素、α-葡糖苷酶抑制剂、双胍类、DPP-4抑制剂、氯茴苯酸类、磺脲类和噻唑烷二酮类。
在特定实施方案中，至少一种附加治疗剂选自：由阿卡波糖和米格列醇组成的α-葡糖苷酶抑制剂；由二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍组成的双胍类；由维格列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀和阿格列汀组成的DPP-4抑制剂；由乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、甲磺吖庚脲、格列甲嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列吡脲和格列美脲组成的磺脲类；由那格列奈、米格列奈和瑞格列奈组成的氯茴苯酸类；由曲格列酮、吡格列酮和罗西格列酮组成的噻唑烷二酮类；及其组合。
另外的方面提供了本文公开的发明方法，其还包括与TSLP和/或TSLPR拮抗剂(例如对TSLP和TSLP受体特异性的中和抗体，可溶性TSLP受体分子，和TSLP受体融合蛋白，如TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或编码一个以上受体链的组分从而模拟生理受体异源二聚体或更高阶低聚物的多肽。如果受体包括一个以上多肽链，则可以利用单链融合)的联合疗法。
用于炎症和/或糖尿病的治疗剂治疗包括静脉内、皮下、局部或口服施用广泛系列的药物，这取决于所要达到的结果。然而，现在大部分可用的抗炎治疗剂具有相当大的缺点，包括注射部位的重度反应、对感染的敏感性增加、皮疹或其它副作用。因此，需要有更好的抗炎治疗剂及治疗方法。
电动产生的富含气体的流体和溶液的抗炎活性：
根据本发明的某些方面，本文所公开的富含气体的流体和/或溶液具有抗炎特性和效果，并且可用作治疗患有与炎症相关疾病或疾患的受试者的抗炎剂。图38显示来自健康血液供体的经刺激的淋巴细胞的细胞因子分布实验结果。从图38中可以看出，本发明的富氧流体(水)影响特定细胞因子(特别是IL-6、IL-8和IL-1β)的下调。
促炎性细胞因子的增产牵涉许多炎性疾病和自身免疫疾病的发病机制。TNFα的分泌是引发炎性级联反应的主要事件(Brennan F.M.等，Lancet，1989，2：244-7；Haworth C等，Eur.J.Immunol.1991，21：2575-2579)，并且直接促进炎性疾病和自身免疫疾病的引发和维持。其它促炎性细胞因子也有作用，包括白介素1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、IL-12、一氧化氮、IFN-γ和GM-CSF，而抗炎细胞因子(如IL-10)可减少疾病发生。免疫系统的细胞(特别是巨噬细胞)响应激活刺激而分泌许多这样的细胞因子。
炎性过程涉及到多种细胞类型。单核细胞、巨噬细胞及其它免疫细胞过量产生TNFα是多种疾病的发病机制中的关键因素。巨噬细胞和T细胞在免疫反应的引发和维持中尤其发挥重要的作用。一旦被病理或免疫原性刺激激活，巨噬细胞便通过释放大量细胞因子来反应，这些细胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12、一氧化氮(NO)、IL-6、GM-CSF、G-CSF、M-CSF等。T细胞释放IL-2、IL-4、INF-γ及其它炎性细胞因子。这些细胞因子激活其它免疫细胞，并且一些也可以作为独立的细胞毒性剂起作用。巨噬细胞和T细胞源性炎症介质的过量释放特别可导致正常细胞及周围组织的损伤。
促炎性细胞因子牵涉到促进包括糖尿病在内的许多疾病和疾病症状。平滑肌细胞的NO的诱导在败血性休克期间介导降低的平均动脉压和全身血管阻力，这表明了NO的根本性作用。因此，靶向对IL-8、IL-1β和NO的下调效果的疗法可有益于治疗炎性疾病或疾患，包括治疗败血症、败血性休克内毒素性休克和糖尿病。
TNFα的过度产生促进许多自身免疫疾病(如糖尿病和类风湿性关节炎)的临床特征。IL-1β和TNFα水平增加也促成全身性红斑狼疮(SLE)。狼疮患者内的血清C反应性蛋白、IL-1β和TNFα水平高于对照组，表明炎性反应的增加在该疾病中起作用(Liou L.B.Clin.Exp.Rheumatol.2001，19：515-523)。对患有一种形式的SLE，即神经精神性红斑狼疮(NPLE)的患者的研究表明，表达TNFα的mRNA的周围血液单核细胞的数目以及NO代谢物的脑脊髓液水平与NPLE疾病的严重程度相关(Svenungsson E.等，Ann.Rheum.Dis.2001，60：372-9)。
IL-1和TNFα在动物模型中的多种急性以及慢性反应中起重要作用。另外，IL-11、IFNα和IFNβ也可上调炎性反应。相反，若干细胞因子可能参与下调炎性反应(即IL-4、IL-10、IL-13等)。如实施例1中所示，与在具有T3抗原的对照培养基中的细胞相比，与具有T3抗原的本发明的富含气体的流体接触的细胞显示出IFN-γ水平的增加，而具有T3抗原的本发明的富含气体的培养基中的IL-8比具有T3抗原的对照培养基中的低。另外，在具有PHA的本发明的富含气体的培养基中的IL-6、IL-8和TNF-α水平比在具有PHA的对照培养基中的低，而当与在具有PHA的对照培养基中相比时，具有PHA的本发明的富含气体的流体中的IL-1β水平低。在单独的本发明的富含气体的培养基中，IFN-γ水平比在对照培养基中的高。这些结果与抗炎微环境一致。
NO被认为是炎性反应的介质和调节剂。它对病原体具有细胞毒素特性，但是也可对受试者自身的组织具有有害作用(Korhonen等，Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(4)：471-9，2005)。NO与可溶性鸟苷酸环化酶反应形成环磷酸鸟苷(cGMP)，其介导许多NO的影响。NO也可以与分子氧和超氧化物阴离子相互作用以产生可调节各种细胞功能的活性氧物质。NO的这些间接作用对炎症具有显著的作用，其中由诱导性NO合酶(iNOS)大量地产生NO，由激活的炎性细胞合成活性氧物质。事实上，肥胖症中NO的过度产生促进对肌细胞胰岛素作用和β细胞功能的损害，这可导致胰岛素抗性和糖尿病。NO可以由角质形成细胞、成纤维细胞、内皮细胞和可能的其它细胞产生。NO的一些血管作用包括血管舒张、抑制血小板对血管内皮的粘附、抑制白细胞对血管内皮的粘附以及清除超氧化物(Shah等，Env.Health Persp.v.106(5)：1139-1143)。
此外，已证实NO合成的抑制可延缓伤口缩合、改变胶原组织并改变新生表皮(neoepidermis)厚度(Amadeu和Costa，J.Cutan.Pathol.33：465-473，2006)。伤口中的肥大细胞迁移和血管生成也受NO抑制的影响(出处同上)。不受任何具体机制理论的约束，在某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可调节局部的和/或细胞的NO产生或降解，这与本文所公开的实施例部分所示的伤口愈合效果谱一致。由于调控途径可变，在某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可增加NO的产生和/或延迟NO的降解，而在其它某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可减少NO的产生和/或加速NO的降解。
具体地讲，用富氧盐水溶液处理的伤口在第4天至第11天和在第3天与第11天之间显示出伤口愈合的增强，用富氧盐水溶液处理的伤口中新表皮迁移速度为用生理盐水溶液处理的伤口的表皮迁移速度的2至4倍，如本文实施例8所示。研究还显示在第15天与第22天之间，用富氧盐水溶液处理的伤口以更快的速率分化，如通过较早地形成较多成熟的表皮层所证明。在所有阶段，在用富氧盐水溶液处理的伤口内没有出现与正常愈合相关的表皮中所出现的增厚。
因此，按照此伤口愈合效果谱，但不期望受任何具体理论的约束，据信富氧盐水溶液可调节伤口内NO的局部水平和/或细胞水平。NO在伤口愈合中调节生长因子、胶原沉积、炎症、肥大细胞迁移、表皮增厚和新血管形成。此外，一氧化氮由受氧调节的可诱导酶产生。
在肥大细胞迁移的情况下，富氧溶液的早期迁移和晚期迁移也出现差异。这与本领域中关于NO合成抑制所知的情况一致(Amadeu和Costa，J.Cutan Pathol 33：465-473，2006)。
现在参考图41A至41F，各图示比较存在或不存在富氧盐水溶液的猪表皮组织的伤口愈合结果。可以看出，在第1、4和16天后出现对照伤口的愈合及使用富氧盐水溶液的伤口的愈合。
图41A示出对照伤口在第1天的伤口愈合。可以看出，伤口显示出表皮/真皮增厚和轮廓消失。图41B示出用富氧盐水溶液处理的伤口在第1天的伤口愈合。伤口显示出正常的表皮/真皮厚度，正常的轮廓显示在新伤口上是典型的。
现在参考图41C和41D，示出对照伤口在第4天的伤口愈合和用富氧盐水溶液处理的伤口在第4天的伤口愈合。对于图41C中所示的对照伤口，伤口显示出600微米的表皮突出物。在图41D中用富氧盐水溶液处理的伤口中，示出有1200微米的表皮突出物。因此，在实验的前4天，用富氧盐水溶液处理的伤口中产生的表皮突出物显示的表皮生长速率为未用富氧盐水溶液处理的伤口的两倍。
现参考图41E，示出第16天的对照伤口。与图41F中所示的用富氧盐水溶液处理的伤口所示出的相比，对照伤口显示出分化较少的表皮，其中表皮/真皮轮廓消失较。图41F显示出伤口中更加分化的表皮和更正常的表皮/真皮轮廓显示。
在炎性过程的前两个阶段，异物或者被破坏(例如，如果异物为生物体)，或者异物周围的组织被松散(例如，如果异物为刺)。在愈合阶段，炎症开始消退，单个血管和血管形态再次趋于正常，并且开始伤口的修复。修复过程的三个主要事件为：(1)通过成纤维细胞的增殖形成新结缔组织；(2)上皮再生；和(3)长出新的毛细血管。
甚至在炎症消退之前，成纤维细胞就开始从周围的正常组织向损伤区里移动，在所述正常组织中，它们通常以休眠状态存在。它们通过沿纤维蛋白链的变形运动迁移，并将自身分布在整个愈合区。一旦在损伤组织当中固定到位，成纤维细胞便开始合成胶原并分泌此蛋白，该蛋白将其自身布置到纤维当中。纤维自身定向成其纵轴在最大应力方向。随着胶原束硬度增加，成纤维细胞逐渐退化并紧密地附着于胶原束，损伤区转化为疤痕组织。
疤痕组织形成的同时，伤口边缘未受损的表皮细胞开始增殖，并作为一个片层向损伤区中心移动。随着炎症的消退，需要进行直接供血，并且在伤口部位发生血管生成。
炎症是涉及多种细胞类型的复杂过程。例如，肥大细胞释放引发早期血管舒张的介质，伴有内皮细胞的分离和内皮下层中的胶原纤维暴露。血管内形成的细胞间隙中的纤维捕获血小板并引发介质从这些细胞中的释放。
除血小板之外，暴露的胶原纤维还与经扩张的血管壁的孔滤过的血浆的蛋白相互作用，所述血浆蛋白包括凝血级联、增加的血管舒张、增加的血管通透性和趋化性的引发因子。
另外，补体级联可由以下几种刺激物激活：受伤的血管、损伤细胞释放的蛋白水解酶、任何参与的细菌的膜组分和抗原-抗体复合物。一些激活的补体组分充当趋化因子，负责白细胞向发炎区的流入，而其它的则促进吞噬功能并参与细胞裂解。
此外，据信本发明的富含气体的流体或溶液还可调控涉及炎症的至少一方面的至少一种细胞因子，所述细胞因子包括但不限于MAF(巨噬细胞激活因子)、MMIF(巨噬细胞迁移抑制因子)、MCF(巨噬细胞趋化因子)、LMIF(白细胞迁移抑制因子)、HRF(组胺释放因子)、TF(转移因子)、白介素(IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15等)、TNF-α、TNF-β、干扰素(IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ζ、IFN-δ等)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)、GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞CSF)、M-CSF(巨噬细胞CSF)、多能CSF(IL-3)、成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、EGF(表皮生长因子)、NGF(神经生长因子)、PDGF(血小板源性生长因子)、VEGF(血管内皮生长因子)、转化生长因子(TGF-α、TGF-β等)、NAP-2(中性粒细胞激活蛋白2)、PF-4(血小板因子4)、血小板球蛋白、MCP-1(单核细胞趋化蛋白1)、MCP-3、MIP-1α、MIP-1β-+(巨噬细胞炎性蛋白)、RANTES(经激活调控的正常T细胞表达和可能分泌的细胞因子)、HSP(热休克蛋白)、GRP(葡萄糖调节蛋白)、泛素等。
因此，在某些实施方案中，富含气体的流体和/或治疗组合物可增加抗炎分子或细胞因子的产生和/或分泌或降低抗炎分子或细胞因子的降解，从而缓解或预防至少一种炎症症状。在其它实施方案中，本发明的富含气体的流体和/或治疗组合物可降低促炎性分子或细胞因子的产生和/或分泌，或者增加促炎性分子或细胞因子的降解，从而缓解或预防至少一种炎症症状。
以往的研究显示了抗MOG抗体在脱髓鞘作用的增大和EAE(实验性自身免疫脑脊髓炎)恶化中的关键作用，EAE是用于类风湿性关节炎的人自身免疫疾患的动物模型系统(Linington等，1992.J.Neuroimmunol.40：219-224)。另外，抗MOG的抗体牵涉多发性硬化病的发病机制(Berger等，N.Engl.J.Med.2003 Jul 10；349(2)：139-45)。
如图48和实施例12中所示，本发明所发明的富含气体的流体放大了淋巴细胞对之前动物所引发的抗原的反应。如图48中所示，当在用本发明包含溶剂化电子的富含气体的流体重构的流体中培养时，与加压的氧合流体(压力罐)或对照去离子流体相比，淋巴细胞增殖对MOG激发的反应更多。
本发明的富含气体的流体和溶液
一种流体用另一种流体扩散或富集可产生这两种流体的溶液或悬浮液。具体而言，用气体(例如氧)富集液体可能对包括治疗剂治疗的某些应用是有益的。如本文所用，对于任何具体公开的实施方案，″流体″通常可指液体、气体、蒸汽、液体和/或气体的混合物或其任意组合。此外，在某些实施方案中，″液体″通常可指纯的液体或可指凝胶、溶胶、乳液、流体、胶体、分散体或混合物及其任意组合；其中任何一种的粘度可有所不同。
在本文所公开的具体实施方案中，溶解的气体包括环境空气。在优选的实施方案中，溶解的气体包括氧。在另一实施方案中，溶解的气体包括一氧化氮。
有若干领域认可的气体富集液体(例如氧富集水)的方法。例如，涡轮机充气系统可在叶轮的一组转动叶片附近释放空气，叶轮将空气或氧与水混合，或可将水喷洒到空气当中以提高其氧含量。另外，市场上的其它系统将空气或氧注入到水中并使水/气体进行大尺度涡旋。水中氧的天然水平通常不超过10ppm(百万分率)，这被视为是100％溶解氧水平。某些装置上的测试已证实，在理想条件下，装置的氧水平可上达大约20ppm或为水的天然氧水平的两倍。在某些实施方案中，氧水平可能甚至更高。
在本文所公开的某些实施方案，本发明的富含气体的流体提供了抗炎益处。本文所公开的某些实施方案涉及包含本发明的富含气体的流体和任选至少一种附加治疗剂的治疗组合物，所述附加治疗剂例如为药品、金属、肽、多肽、蛋白质、核苷酸、碳水化合物或糖基化蛋白、脂肪(包括油或蜡)或预防或缓解与炎症有关的病症或疾病的至少一种症状的其它药剂。
此外，本文所公开的某些实施方案包括涉及伤口发炎的治疗组合物和方法。伤口护理对于改善皮下组织的健康和外观是可取的。需要对伤口(无论是损伤所致，如割伤、擦伤或水疱，或者是外科手术引起的，如外科手术切口或造口)进行局部治疗以医治受感染的区域并防止皮肤的进一步损害。如果伤口得不到妥善的处理，则可能导致进一步的皮肤刺激，如炎症，并可能导致继发感染，进一步使受试者不适。
本文提供的特定实施方案涉及如本文所定义的扩散器处理的治疗性流体，其包含：流体主物质；扩散到主物质中的输注物；和任选分散在主物质中的至少一种治疗剂，其中输注物包含主流体中的氧微泡，其中大部分微泡的尺寸小于0.2微米，或优选小于0.1微米。在某些实施方案中，输注流体主物质中的溶解氧水平在大气压下可保持大于约30ppm达至少13小时。在其它特定实施方案中，输注流体主物质中的溶解氧水平在大气压下保持大于40ppm达至少3小时。
在另外的实施方案中，输注流体主物质还包括盐水溶液。在进一步的实施方案中，输注流体主物质在大气压下于密封容器内保持至少约20ppm到约40ppm的溶解氧水平达至少100天、优选至少365天的时间。在某些实施方案中，输注流体主物质在大气压下可具有至少50ppm的溶解氧水平。
在某些实施方案中，输注流体主物质在氧己扩散到其中之后对通过其中的激光束照耀表现出瑞利散射达选定的一段时间。
表3示出在用富氧盐水溶液处理的愈合伤口和在本发明富含气体的富氧盐水溶液的样本中进行的各种分压测量。
表3
  组织氧测量
  探针Z082BO
  空气中：171mmHg   23℃
  列                分压(mmHg)
  B1                32-36
  B2                169-200
  B3                20-180*
  B4                40-60
  *伤口深度最小，大多数＞150，偶尔为20s
泡尺寸测量
通过混合装置100进行实验来确定流体内扩散的气体的气泡尺寸。虽然进行的实验不直接测量泡的尺寸，但进行的实验可确定流体内大多数气泡的泡尺寸小于0.1微米。换句话讲，实验确定的是尺寸阈值，大多数泡的尺寸低于该阈值。
使由在混合装置100中处理流体和气体而形成的输出物102通过0.22过滤器和0.1微米过滤器确定此尺寸阈值或尺寸限值。在进行这些测试时，使一定量的第一物质110(此例中为流体)和一定量的第二物质120(此例中为气体)通过混合装置100以产生一定量的输出物102(即其中具有扩散的气体的流体)。排出六十毫升输出物102进入60ml注射器。然后使用Orion 862a测量注射器内流体的DO水平。Orion 862a能够测量流体内的DO水平。将注射器内的流体穿过0.22微米过滤器注入到50ml烧杯中。过滤器包括Milipor Millex GP50过滤器。然后测量50ml烧杯中的物质的DO水平。进行三次实验得到下表4中所示的结果。
表4
Figure BDA0000102298890000451
可以看出，在注射器内测量的DO水平和在50ml烧杯内测量的DO水平并未因使输出物102通过0.22微米过滤器而出现大幅度变化。此实验表明输出物102内溶解气体的泡不大于0.22微米，否则在通过0.22微米过滤器的输出物102中DO水平会有显著较大的降低。
进行第二项测试，其中用0.1微米过滤器替换0.22微米过滤器。在此实验中，在混合装置100中用氧对盐水溶液进行处理，并且收集未过滤状态的输出物102的样本。未过滤样本的DO水平为44.7ppm。使用0.1微米过滤器过滤输出物102并收集两份另外的样本。第一份样本的DO水平为43.4ppm。第二份样本的DO水平为41.4ppm。然后移除过滤器，最后的样本取自未过滤的输出物102。最后样本的DO水平为45.4ppm。这些结果与使用Millipore 0.2微米过滤器所看到的结果是一致的。由这些结果得出结论，通过0.1微米过滤器的输出物102的DO水平有轻微的降低，表明经处理盐水溶液中大多数泡的尺寸不大于0.1微米。采用Winkler滴定法得到上述DO水平测试的结果。
正如本领域中所理解的那样，当将物体置于液体中时，其表面上出现(界面的)双层(DL)。此物体例如可为固体表面(例如转子和定子表面)、固体颗粒、气泡、液滴或多孔体。在混合装置100中，泡表面代表存在于混合室内可用于电动双层效应的总表面积的很大一部分。因此，除了本文中其它地方讨论的表面积和保留时间方面之外，混合器100内所产生的与现有技术装置10比较而言相对较小的泡尺寸至少在某种程度上也可有助于本文公开的总体电动效应和输出流体特性。具体地讲，在优选的实施方案中，如混合器100所示，通过转子上的孔隙引入所有气体(没有气体通过定子孔隙引入)。因为转子高速转动(例如3,400rpm)，在转子表面及其附近产生相当大的剪切力，预期经由和邻接旋转的转子表面孔隙引入的泡的泡尺寸将比经由和接近静止的定子引入的泡的泡尺寸小很多(例如小2到3倍)。因此，现有技术装置10的平均泡尺寸可能相当大，因为至少有一半的气体是由静止的定子孔隙引入到混合室中的。因为球体表面的表面积随／而变化，所以混合装置100的任何这种泡组分的电动表面积可能比现有技术扩散装置10的泡组分要大很多。
因此，不受理论的约束，与现有技术装置10相比，混合装置100的混合室不仅具有(i)高很多的表面积与体积比(现有技术装置10的表面积与体积比为10.9，而本混合器100的表面积与体积比为39.4)以及(ii)长7倍的停留时间，而且(iii)电流输出方案的独特性质可另外反映混合装置100中相当大的泡表面积的贡献。这些区别方面反映了本混合器100的区别特征，并且每个均可有助于本发明输出物/流体的独特电动特性。
现参考图30，其中示出混合装置100中的富氧水中的DO水平，其在500ml的薄壁塑料瓶中储存至少365天，塑料瓶外面是1000ml玻璃瓶。封住每个瓶并储存在华氏65°下。从图中可以看出，富氧流体的DO水平保持相当稳定达至少365天。
参考图31，其中示出混合装置100中的富氧水中的DO水平，其储存在500ml薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中。两瓶均在华氏39°下冷藏。同样，富氧流体的DO水平保持稳定，达至少365天，仅略有降低。
包含通过本发明方法赋予本发明组合物的水合(溶剂化)电子的 组合物
在如本文所述的某些实施方案中(参见″双层″下方)，通过所公开的机电方法产生富含气体的流体，其中分子氧被扩散或混合到流体当中，并且可起到稳定赋予流体的电荷(例如水合(溶剂化)电子)的作用。不受理论或机制约束，本发明的某些实施方案涉及包含电荷(例如水合(溶剂化)电子)的富氧流体(输出物)，所述电荷是当第一物质在本发明的混合器装置中与氧混合时加到物质当中的，从而得到组合的输出物。根据特定的方面，这些水合(溶剂化)电子(在本文中或称″溶剂化电子″)在本发明的溶液中是稳定化的，这可由这些水合(溶剂化)电子介导的可测定效应的持久性所证明。某些实施方案可涉及水合(溶剂化)电子和/或水-电子结构、簇等(参见例如，Lee和Lee，Bull.Kor.Chem.Soc.2003，v.24，6；802-804；2003)。
辣根过氧化物酶(HRP)的影响。辣根过氧化物酶(HRP)分离自辣根(山葵，Amoracia rusticana)，属于亚铁原卟啉组的过氧化物酶(血红素组)。HRP容易与过氧化氢或其它氢供体结合以氧化连苯三酚底物。另外，正如本领域中所公认，HRP在没有过氧化氢的情况下促进吲哚-3-乙酸的自动氧化降解(参见例如Heme Peroxidases，H.BrianDunford，Wiley-VCH，1999，第6章，第112-123页，描述自动氧化涉及高效支链机制；该文献以引用的方式整体并入本文)。可以酶活性单位测量HRP反应，其中按连苯三酚单元表示比活性。在20℃和pH6.0下，一个连苯三酚单元在20秒内由连苯三酚形成1.0mg红棓酚。此红棓酚(20秒)单元相当于25℃下每分钟大约18μM单元。
Figure BDA0000102298890000481
已知辣根过氧化物酶通过促进与流体中的分子氧进行反应来催化连苯三酚的自动氧化(Khajehpour等，PROTEINS：Struct，Funct，Genet.53：656-666(2003))。还已知氧通过辣根过氧化物酶的疏水孔区域(在Phe68与Phe142之间)结合该酶的血红素袋(heme pocket)，该疏水孔区域的构象可能决定氧对内部的可及性。根据特定方面并且不受机制约束，因为在蛋白质领域中己知蛋白质上的表面电荷影响蛋白质结构，所以在本发明的富含气体的流体中存在的溶剂化电子可起到改变辣根过氧化物酶构象的作用，以便可导致更大的氧可及性。当与现有技术的氧合流体(压力罐，细泡的)相比时，氧对辣根过氧化物酶的修复性血红素袋的更大可及性进而可允许提高HRP反应性。
在任何情况下，根据特定方面，用本发明方法和装置产生输出物包括涉及以下的过程：提供电荷梯度的界面双层；和物质相对于表面借助摩擦带电效应牵引电荷(例如电子)离开该表面的运动，其中物质的流动产生溶剂化电子流。此外，根据另外的方面且不受机制约束，双原子氧的轨道结构在流体物质(水)内的氢键合排列中产生电荷不平衡(例如，影响水的氢键合的两个不成对的电子)，其中电子在这些不平衡中是溶剂化且稳定化的。
按以下所述对本发明的富氧流体进行几项化学测试，用于测试过氧化氢的存在与否，这些测试均不呈阳性(0.1ppm过氧化氢的灵敏度)。因此，本申请发明的富氧流体不含过氧化氢或含不到0.1ppm的过氧化氢。
根据特定方面，尽管不存在过氧化氢，但本发明由双层效应赋予的富氧和溶剂化电子与目前要求保护的装置构造的组合可起到改变辣根过氧化物酶构象和/或血红素基可及性的作用。
谷胱甘肽过氧化物酶的研究
通过采用标准测定法(Sigma)测试与谷胱甘肽过氧化物酶的反应性来测试本发明的富氧输出流体物质，用于测试过氧化氢的存在与否。简言之，在去离子水和适当的缓冲液中组成谷胱甘肽过氧化物酶混合物。通过加入该酶混合物并翻转来测试水样本。在A340nm和室温(摄氏25度)下进行连续的分光率测定。所测试的样本为：1.去离子水(阴性对照)；2.低浓度的本发明富氧流体；3.高浓度的本发明富氧流体；4.过氧化氢(阳性对照)。过氧化氢阳性对照显示出强反应性，而所测试的其它流体均不与谷胱甘肽反应。
产生富含气体的流体或溶液的装置
相关技术说明
图1提供现有技术装置10的部分框图、部分截面视图，装置10用于将一种或两种气体或液体物质(″输注物″)分散或乳化到另一种气体或液体物质(″主物质″)当中，其再现美国专利No.6,386,751，该专利以引用的方式整体并入本文。装置10包括配置成容纳定子30和转子12的壳体。定子30围绕转子12。转子12与定子30之间限定了管状通道32。一般为圆柱形的转子12具有约7.500英寸的直径和约6.000英寸的长度，使长度与直径之比为约0.8。
转子12包括一般在两端封闭的中空圆柱体。在转子12的第一端和第二端中的每一者与壳体34的一部分之间存在间隙。由电机18驱动的转轴14连接至转子12的第二端。转子12的第一端连接至入口16。第一输注物穿过入口16并进入转子12的内部。第一输注物通过形成于转子12中的多个开口22从转子12的内部穿过并进入通道32。
定子30还具有在其周围形成的开口22。入口36将第二输注物传递到定子30与壳体34之间的区域35。第二输注物通过开口22流出区域35并进入通道32。
使用外部泵(未示出)将主物质泵送到单个入端口37中。主物质穿过单个入端口37并进入通道32，在此处遇到通过开口22进入通道32的第一输注物和第二输注物。可以在输注物的来源处对输注物加压以防止主物质穿过开口22。
入端口37被配置并放置成使其仅沿环状入口通道32的相对较小部分(＜约5％)定位，并且基本上与转子12的转轴平行，以赋予向着通道32的一部分进入主物质的轴向流。
遗憾的是，在进入管状通道32之前，主物质必须在非轴向流的曲折方向(例如，包括基本上与其垂直的方向)上行进，并向下进入在转子12的第一端与壳体34之间形成的间隙内和间隙之间(即，沿转子12的末端与壳体34之间邻近入口16的转子的第一端的一部分向下)。非轴向垂直流以及主物质在转子12的第一端与壳体34之间的间隙中的存在会导致不期望和不必要的摩擦。此外，一部分主物质有可能被截留到在转子的第一端与壳体之间旋转的涡流中。另外，在装置10中，主物质必须顺利通过至少两个直角以进入管状通道32的环形入口的环的任一方位。
单个出端口40形成于壳体34中。合并的主物质和输注物经由出端口40离开通道32。出端口40也仅沿管状通道32的环形出口的有限部分(＜约5％)定位，其基本上与转子12的转轴平行，以赋予或容许合并物质轴向流动离开管状通道32的环形出口的有限部分进入出端口40。使用外部泵42泵送离开的流体通过出端口40。
遗憾的是，在离开通道32之前，相当一部分的离开物必须在非轴向流的曲折方向(例如，包括基本上与其垂直的方向)上行进，并向下进入在转子12的第二端与壳体34之间形成的间隙内和间隙之间(即，(即，沿转子12的末端与壳体34之间邻近轴14的转子的第二端的一部分向下)。如上所述，非轴向垂直流以及主物质在转子12的末端(此例中为第二端)与壳体34之间的其它间隙中的存在会导致另外不期望和不必要的摩擦。此外，一部分主物质有可能被截留到在转子的第二端与壳体之间旋转的涡流中。另外，在装置10中，相当一部分离开的合并物在其离开管状通道32的环形出口进入出端口40时必须顺利通过至少两个直角。
对本领域中的普通技术人员而言明显的是，入端口37仅对主物质赋予轴向流。只有转子21向主物质当中赋予绕流。此外，出端口40仅向离开物当中赋予或提供轴向流。另外，仅在物质进入管状通道32的环形入口37之后对其赋予绕流速度矢量，随后在物质进入离开端口40时，必须降低或消除绕流矢量。因此，当物质轴向穿过通道32时需要渐进的绕向加速，并且物质离开通道32后绕向减速。这些方面与物质从入端口37至出端口40采取的曲折路径相结合在路径上产生相当的摩擦力和流动阻力，在入端口37与出端口40之间伴有相当的压差(在60加仑/分钟流速时为26psi)，并且这些因素(尤其是)相结合而减少了系统的总效率。
电动富氧含水流体和溶液
图2提供的框图示出混合装置100的一些组件和物质进入装置、在装置内和离开装置的流动。混合装置100合并两种或更多种输入物以形成输出物102，输出物102可由其接收进入储存容器104。混合装置100以新颖的方式搅动两种或更多种输入物，以产生具有新颖特征的输出物102。输出物102不仅可包括至少一种输入物在至少一种其它输入物中的悬浮液(例如，乳液)，还可包括输入物的新型组合(例如，静电组合)、由输入物间的化学反应产生的化合物、具有新型静电特征的组合以及它们的组合。
输入物可包括由第一物质源112提供的第一物质110、第二物质源122提供的第二物质120以及任选第三物质源132提供的第三物质130。第一物质110可包括液体，如水、盐水溶液、化学悬浮液、极性液体、非极性液体、胶状悬浮液、细胞生长培养基等。在一些实施方案中，第一物质110可包括循环返回混合装置100的输出物102。第二物质120可由以下气体组成或包括以下气体：例如氧、氮、二氧化碳、一氧化碳、臭氧、硫气、一氧化二氮、一氧化氮、氩、氦、溴及其组合等。在优选的实施方案中，所述气体为氧或包含氧。任选的第三物质130可包括液体或气体。在一些实施方案中，第三物质130可为循环返回混合装置100的输出物102或包含循环返回混合装置100的输出物102(例如，循环返回至泵210、220或230中的一个或多个；和/或循环返回至室310和/或330中)。
任选地，第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130可分别通过外部泵210、外部泵220和外部泵230泵送到混合装置100中。或者，第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130中的一种或多种可在压力下分别储存在源112、源122和源132中，并且可通过压力迫使其进入混合装置100。本发明并不限于分别用来将第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130从源112、源122和源132转移到混合装置100中的方法。
混合装置100包括位于混合室330侧面的第一室310和第二室320。三个室310、320和330相互连接并形成连贯的体积。
第一物质110被转移到第一室310中，并从第一室310流入混合室330。第一室310中的第一物质110可以通过内部泵410被泵送到第一室310中。第二物质120被转移到混合室330中。任选地，第三物质130可以被转移到混合室330中。混合室330中的物质在其中混合形成输出物102。然后，输出物102流入第二室320，输出物102从第二室320离开混合装置100。在混合室330中的输出物102可通过内部泵420被泵送到第二室320中。任选地，在第二室320中的输出物102可以通过外部泵430(例如，单独或与内部泵410和/或420组合)从第二室320被泵送到储存容器104中。
在特定方面，由常见的驱动轴500为内部泵410和内部泵420两者提供动力。驱动轴500穿过混合室330并在其中提供用于将第一物质110、第一物质120和任选的第三物质130混合在一起的转动力。驱动轴500由与其连接的电机510提供动力。
图3提供了将第一物质110提供给混合装置100并将输出物102从混合装置100中移除的系统512。在系统512中，使输出物102的储存容器104与第一物质110的源112相组合。外部泵210通过流体导管514(如软管、筒管等)连接至组合的储存容器104和源112。外部泵210将合并的第一物质110和输出物102从组合的储存容器104和源112中泵送穿过流体导管514并进入连接外部泵210至混合装置100的流体导管516。输出物102穿过流体导管518离开混合装置100。流体导管518连接至组合的储存容器104和源112，并将离开混合装置100的输出物102运送到组合的储存容器104和源112中。流体导管518包括在混合装置100内建立操作压力或背压的阀519。
参考图2、图4-9和图11，提供了对混合装置100的实施方案的各种组件的更详细的描述。混合装置100可按比例缩放。针对各种组件所提供的尺寸可用于构造该装置的实施方案或可用于成比例地构造选定尺寸的混合装置。
转向图4，混合装置100包括容纳第一室310、混合室330和第二室320中每一者的壳体520。如上所述，混合装置100包括在装置操作期间转动的驱动轴500。因此，混合装置100可以振动或以其它方式移动。任选地，混合装置100可连接至底座106，后者可固定在诸如地板之类的表面上以将混合装置100保持在基本固定的位置上。
壳体520可以由两个或更多个壳体部分装配。举例而言，壳体520可包括侧面为第一机械密封壳体524和第二机械密封壳体526的中心部分522。轴承壳530可对着中心部分522连接至第一机械密封壳体524。轴承壳532可对着中心部分522连接至第二机械密封壳体526。任选地，壳体部分550可连接至轴承壳530。
轴承壳530和532中的每一者可容纳轴承组件540(参见图5和6)。轴承组件540可包括本领域中内已知的任何合适的轴承组件，包括Kulpsville，Pennsylvania的SKF USA Inc制造的型号″202SZZST″，该公司运营网站为www.skf.com。
可在邻接的壳体部分之间提供密封件。例如，在壳体部分550与轴承壳530之间可设置O形环560(参见图5)，并且在第一机械密封壳体524与中心部分522之间可设置O形环562(参见图5)，并且在第二机械密封壳体526与中心部分522之间可设置O形环564(参见图6)
混合室330
现转向图7，混合室330设置在第一机械密封壳体524与第二机械密封壳体526之间的壳体520的中心部分522里面。混合室330在混合装置100的转子600与定子700两个部件之间形成。转子600可具有侧壁604，侧壁604具有限定出通常中空的内部分610的内表面605以及外表面606。侧壁604可为约0.20英寸至约0.75英寸厚。在一些实施方案中，侧壁604为约0.25英寸厚。然而，由于混合装置100可按比例缩放以适应具体的应用，所以具有比所提供的值厚或薄的侧壁604的装置的实施方案属于本教导的范围内。侧壁604包括第一端部612和第二端部614以及在第一端部612与第二端部614之间形成的多个通孔608。任选地，侧壁604的外表面606可以包括其它特征，如孔隙、突出、纹理等。第一端部612具有配置成接收轴环618的松弛部分616，并且第二端部614具有配置成接收轴环622的松弛部分620。
转子600设置在定子700内部。定子700具有侧壁704，其具有限定出里面设置转子600的通常中空的内部分710的内表面705。侧壁704可为约0.1英寸至约0.3英寸厚。在一些实施方案中，侧壁604为约1.5英寸厚。定子700可以在基本上固定的位置上非转动地连接至壳体520。或者，定子700可与壳体520一体形成。侧壁704具有第一端部712和第二端部714。任选地，多个孔隙708形成在定子700的侧壁704的第一端部712与第二端部714之间。任选地，侧壁704的内表面705可以包括其它特征，如通孔、突出、纹理等。
转子600相对于固定的定子700绕转轴″α″以图9中箭头″C3″所指示的方向转动。转子600和定子700中的每一者通常可为圆柱形并具有纵轴。转子600具有外径″D1″，且定子700可具有内径″D2″。直径″D1″可在例如约0.5英寸至约24英寸的范围内。在一些实施方案中，直径″D1″为约3.04英寸。在一些实施方案中，直径″D1″为约1.7英寸。大于直径″D1″的直径″D2″可在约0.56英寸至约24.25英寸的范围内。在一些实施方案中，直径″D2″为约4英寸。因此，混合室330可具有约0.02英寸至约0.125英寸厚(即，直径″D2″和直径″D1″的差值)的环形截面形状。在特定实施方案中，混合室330为约0.025英寸厚。现有技术装置10(参见图1)的转子12与定子34之间的通道32具有约0.09英寸厚的环形截面形状。因此，在特定实施方案中，混合室330的厚度小于现有技术装置10的通道32的约三分之一。
转子600的纵轴可与其转轴″α″对齐。转子600的纵轴可与定子700的纵轴对齐。转子600沿转轴″α″可具有约3英寸至约6英寸的长度。在一些实施方案中，转子600沿转轴″α″可具有约5英寸的长度。定子700沿转轴″α″可具有约3英寸至约6英寸的长度。在一些实施方案中，定子700沿转轴″α″可具有约5英寸的长度。
虽然转子600和定子700被描述为具有通常是圆柱形的形状，但本领域的普通技术人员理解的是，可以采用替代的形状。例如，转子600和定子700可以为圆锥形、球形、任意形状等。此外，转子600和定子700无需为相同形状。例如，转子600可为圆柱形，定子700为矩形，反之亦然。
图4-7中所描绘的定子700的孔隙708和通孔608通常为圆柱形。通孔608的直径可在约0.1英寸至约0.625英寸的范围内。孔隙708的直径可在约0.1英寸至约0.625英寸的范围内。定子700的一个或多个孔隙708可具有与其它孔隙708不同的直径。例如，孔隙708的直径可从定子700的第一端部712至定子700的第二端部714增加，孔隙708的直径可以从定子700的第一端部712至定子700的第二端部714减少，或孔隙708的直径可沿定子700以另一种方式变化。转子600的一个或多个通孔608可具有与其它通孔608的直径不同的直径。例如，通孔608的直径可从转子600的第一端部612至转子600的第二端部614增加，通孔608的直径可从转子600的第一端部612至转子600的第二端部614减少，或通孔608的直径可沿转子600以另一种方式变化。
如下面参考替代实施方案所述，孔隙708和通孔608可具有不同于通常的圆柱形以外的形状，并且这种实施方案在本发明的范围内。例如，通孔608可包括较窄部分、弓形部分、锥形部分等。参考图7，每个通孔608包括外部分608A、窄部分608B和在外部分608A与窄部分608B之间提供过渡的锥形部分608C。类似地，孔隙708可以包括较窄部分、弓形部分、锥形部分等。
图8提供定子700的孔隙708和转子600的通孔608的合适排列的非限制性实例。定子700的孔隙708可以布置在基本上垂直于转轴″α″的基本上平行的侧排″SLAT-1″至″SLAT-6″上。定子700的孔隙708也可以布置在基本上平行于转轴″α″的基本上平行的纵排″SLONG-1″至″SLONG-7″上。换句话讲，定子700的孔隙708可以布置成具有基本上平行于转轴″α″的纵排″SLONG-1″至″SLONG-7″的垂直排(即，侧排与纵排垂直)的格栅样模式。
与定子700的孔隙708类似，转子600的通孔608可以布置在基本上垂直于转轴″α″的基本上平行的侧排″RLAT-1″至″RLAT-6″上。然而，不是布置成垂直排的格栅模式，转子600的通孔608也可以布置在沿螺旋状路径纵向延伸的基本上平行的″RLONG-1″至″RLONG-7″排上。或者，转子600的通孔608也可以布置在与转轴″α″成角度而非平行地纵向延伸的基本上平行的″RLONG-1″至″RLONG-7″排上。
定子700的孔隙708和转子600的通孔608可配置成使得当将转子600设置在定子700内部时，侧排″SLAT-1″至″SLAT-6″分别至少与侧排″RLAT-1″至″RLAT-6″对齐。这样，当转子600在定子700内转动时，通孔608经过孔隙708。
侧排″RLAT-1″至″RLAT-6″的每一排中的通孔608可侧向间隔开，使得侧排中的所有通孔608至少部分地与定子700的侧排″SLAT-1″至″SLAT-6″中对应的一排中的孔隙708同时对齐。纵向延伸的″RLONG-1″至″RLONG-6″排可配置成使得每个纵向延伸的排中的第一侧排″RLAT-1″中的通孔608在最后侧排″RLAT-6″中的通孔608开始与定子700的对应最后侧排″SLAT-6″的孔隙708部分对齐之前完全经过对应侧排″SLAT-1″的孔隙708。
虽然在图8中关于转子600示出6个侧排和6个纵向延伸的排，关于定子700示出6个侧排和7个纵向延伸的排，但是对于本领域的普通技术人员而言明显的是，在不脱离本教导的情况下对转子600和/或定子700可使用替代数目的侧排和/或纵排。
为了确保在任一时刻在对应侧排之间仅有一对开口相合，在定子700上的侧排SLAT-1″至″SLAT-6″的每一排中的孔隙708的数目可与转子600上的对应侧排″RLAT-1″至″RLAT-6″的每一排中的通孔608的数目相差预定的数目(例如，1个、2个等)。因此，例如，如果侧排″RLAT-1″具有绕转子600的圆周均匀间隔的20个通孔608，则侧排″SLAT-1″可具有绕定子700的圆周均匀间隔的20个孔隙708。
再转向图7，混合室330具有敞开的第一端部332和敞开的第二端部334。转子600的侧壁604中形成的通孔608连接转子600的内部分610与混合室330。
转子600通过与转子600的转轴″α″对齐的驱动轴500在定子700内转动。驱动轴500可连接至转子600的第一端部612和第二端部614并延伸穿过其中空内部分610。换句话讲，驱动轴500的720部分设置在转子600的中空内部分610中。
轴环618配置成接收驱动轴500设置在中空内部分610中的721部分，且轴环622配置成接收驱动轴500设置在中空内部分610中的722部分。
721部分具有可在约0.5英寸至约2.5英寸范围的外径″D3″。在一些实施方案中，直径″D3″为约0.625英寸。722部分具有可基本上类似于直径″D3″的外径″D4″，尽管这不是必需的。直径″D4″的范围可为约0.375英寸至约2.5英寸。
转子600可分别通过轴环618和轴环622非转动地固定至驱动轴500的721部分和722部分。举例而言，轴环618和轴环622中的每一个可分别安装到松弛部分616和松弛部分620内部。然后可加热组合的转子600和轴环618和轴环622来使其膨胀。接着，将驱动轴500穿过轴环618和轴环622插入，并使组件冷却。随着轴环618和轴环622在冷却过程中收缩，它们分别绕着驱动轴500的722A部分和722B部分紧固，充分地将其抓紧以防止驱动轴500相对于转子600转动。不相对于721部分转动也不相对于松弛部分616转动的轴环618将驱动轴500的转动转移至转子600的第一端部612。不相对于722部分转动也不相对于松弛部分620转动的轴环622将驱动轴500的转动转移至转子600的第二端部614。驱动轴500和转子600作为单个装置一起转动。
驱动轴500可具有第一端部724(参见图5)和第二端部726(参见图6)。第一端部724可具有约0.5英寸至约1.75英寸的直径″D5″。在特定实施方案中，直径″D5″可为约1.25英寸。第二端部726可具有可基本上与直径″D5″类似的直径″D6″。
第二物质120可通过转动的驱动轴500的第一端部724和第二端部726之一运送到混合室330中。驱动轴500的第一端部724和第二端部726中的另一个可连接至电机510。在图5和图6中所描绘的实施方案中，通过第一端部724将第二物质120运送到混合室330中，驱动轴500的第二端部726连接至电机510。
转向图5，驱动轴500可以具有在其中形成的通道728，通道728从第一端部724延伸进入设置在转子600的内部分610中的720部分。通道728具有在第一端部724中形成的开口730。当操作混合装置100时，通过开口730将第二物质120引入通道728。
阀732可设置在通道728位于驱动轴500的第一端部724中的一部分内。阀732可限制或以其它方式控制第二物质120从中空内部分610穿过通道728的逆向流动和/或第二物质120进入通道728的正向流动。阀732可包括本领域内已知的任何阀，包括止回阀。合适的止回阀包括The Lee Company USA制造的零件号为″CKFA1876205A″的自由流动正向止回阀，该公司在Bothell，WA有办事处并且运营网站为www.theleeco.com。
驱动轴500可包括位于转子600的内部分610中的孔隙740，其连接通道728与转子600的内部分610。尽管图5中仅图示出了单个孔隙740，但是对于本领域的普通技术人员而言明显的是，可使用多个孔隙连接通道728与转子600的内部分610。
参考图2，任选地，外部泵220可以将第二物质120泵送到混合装置100中。作为非限制性实例，泵220可包括本领域内已知的任何合适的泵，包括隔膜泵、化学泵、蠕动泵、重力供料泵(gravity fedpump)、活塞泵、齿轮泵、上述泵的任意组合等。如果第二物质120为气体，则可通过由源122释放气体来将气体加压并迫使其进入形成在驱动轴500的第一端部724中开口730。
泵220或源122通过阀732连接至通道728。运送到通道728内部的第二物质120通过孔隙740离开通道728进入转子600的内部分610。第二物质120随后通过转子600的侧壁608中所形成的通孔608离开转子600的内部分610。
参考图5，混合装置100可包括连接至驱动轴500的第一端部724的密封组件750。密封组件750保持在壳体520所限定的室752内。室752具有横过该室与第二端部756间隔开的第一端部754。室752还包括提供进入室752的输入端口758和输出端口759。室752可以由壳体部分550和轴承壳530限定。第一端部754可在壳体部分550内形成，第二端部756可以与轴承壳530相邻。输入端口758可在轴承壳530中形成，输出端口759可在壳体部分550中形成。
密封组件750包括安装在壳体部分550和轴承壳530中的室752的第一端部754中的第一固定密封件760。第一固定密封件760绕驱动轴500的第一端部724的762部分延伸。密封组件750还包括安装在轴承壳530中的室752的第二端部756中的第二固定密封件766。第二固定密封件766绕驱动轴500的第一端部724的768部分延伸。密封组件750包括非转动地连接至762部分与768部分之间的驱动轴500的第一端部724的转动组件770。转动组件770与其作为一个装置转动。转动组件770包括与第二密封件774相对的第一密封件772。偏置构件776(例如弹簧)设置在第一密封件772与第二密封件774之间。偏置构件776使第一密封件772对第一固定密封件760偏置，并使第二密封件774对第二固定密封件766偏置。给室752和转动组件770周围供应冷却润滑剂。润滑剂通过输入端口758进入室752，并通过输出端口759离开室752。润滑剂可润滑由轴承壳530所容纳的轴承组件540。室570可设置在轴承壳530与机械密封壳体524之间。轴承壳530还可包括连接至室570的第二输入端口759，润滑剂可被泵送到室570中。泵送到室570中的润滑剂可润滑轴承组件540。密封组件750可显著(即便不是极大地)减小装置的此部分内由转子600转动造成的摩擦力，并且可延长密封件770的有效寿命。这些密封件可包括使用碳化硅构造的表面。
参考图9，在转子600绕转轴″α″以箭头″C1″所指示的方向转动时，转子将第二物质120排入混合室330。第二物质120的排出泡、小滴、颗粒等离开转子600，并且由转子600赋予了圆周速度(在箭头″C3″所指示的方向上)。可通过泵220(参见图2)、转动转子600的离心力、第二物质120相对于第一物质110的浮力及其组合从混合室330中驱逐第二物质120。
电机510
再转向图6，驱动轴500的第二端部726可通过联轴器900连接至电机510的转动心轴780。心轴780可具有通常为圆形的截面形状，其直径″D7″为约0.25英寸至约2.5英寸。在特定实施方案中，直径″D7″可为约0.25英寸至约1.5英寸。尽管在图6中所描绘的实施方案中，驱动轴500的第一端部724的直径″D5″基本上等于心轴780的直径″D7″，但直径″D5″和直径″D7″中的一个大于另一个的实施方案在本发明的范围内。
还参考图4，覆盖或遮蔽联轴器900可能是可取的。在图4和图6中所示出的实施方案中，驱动装置护罩910覆盖联轴器900。驱动装置护罩910可通常为U形，其具有侧面为一对基本上线型的部分915和916的弯曲部分914。驱动装置护罩910的基本上线型的部分915和916中的每一部分的远端可分别具有法兰918和法兰919。
驱动装置护罩910可通过其法兰918和法兰919中的每一个紧固至底座106。
电机510可通过支撑构件920支撑在底座106上。支撑构件920可连接至靠近心轴780的电机510。在所描绘的实施方案中，支撑构件920包括心轴780所通过的通孔。可使用本领域中己知的任何方法将支撑构件920连接至电机510，包括使用一个或多个螺栓940将支撑构件920栓连至电机510。
联轴器900可包括适于将足量的扭矩从心轴780传送至驱动轴500以转动定子700内的转子600的任何联轴器。在图4和6所示出的实施方案中，联轴器900为波纹管联轴器。如果心轴780和驱动轴500不对齐，则波纹管联轴器是有利的。此外，波纹管联接器可有助于吸收施加到驱动轴500上的轴向力，否则该轴向力将传递给心轴780。合适的波纹管联轴器包括由Marlborough，MA的RulandManufacturing Company，Inc.制造的″BC32-8-8-A″型联轴器，该公司的运营网站为www.ruland.com。
电机510可以约0.1转/分钟(″rpm″)至约7200rpm转动转子600。电机510可包括根据本教导适于转动定子700内的转子600的任何电机。作为非限制性实例，合适的电机可包括以230/460伏特和3450rpm操作的一个半马力电动机。合适的电机包括Grafton，WI的LEESONElectric Corporation所制造的″C4T34NC4C″型电机，该公司的运营网站为www.leeson.com。
第一室310
转向图4和图7，第一室310分别设置在第一机械密封壳体524与转子600的第一端部612之间的壳体520的中心部分522内和第一机械密封壳体524与定子700的第一端部712之间的壳体520的中心部分522内。第一室310可为环形的并具有基本上圆形的截面形状。第一室310和混合室330形成连贯的体积。驱动轴500的1020部分延伸穿过第一室310。
如在图4中所最佳地观察到的，第一室310具有输入端口1010，第一物质110穿过输入端口1010进入混合装置100。可通过外部泵210将第一物质110泵送到第一室310内(参见图2)。外部泵210可包括本领域中已知用于以足够的速率泵送第一物质110以供应给第一室310的任何泵。
输入端口1010基本上垂直于转轴″α″定向。因此，第一物质110以与延伸穿过第一室310的驱动轴500的1020部分切向的速度进入第一室310。第一物质110进入第一室310的流动切向方向由箭头″Tl″标示。在图4和图7中所描绘的实施方案中，输入端口1010可与转轴″α″有偏移。对于本领域的普通技术人而言明显的是，驱动轴500的转动方向(图9中由箭头″C1″标示)具有切向分量。输入端口1010设置成使得第一物质110以基本上与驱动轴500的转动方向的切向分量相同的方向行进进入第一室310。
第一物质110进入第一室310并且向围绕驱动轴500的1020部分的第一室310的内部偏转。在其中第一室310具有基本上圆形截面形状的实施方案中，第一室310的内部可以围绕驱动轴500的1020部分以基本上圆形的路径(图9中由箭头″C2″标示)使第一物质110偏转。在这种施方案中，第一物质110的切向速度可使其以至少部分由切向速度决定的圆周速度绕转轴″α″运送。
第一物质110一旦在第一室310内部，便可由位于第一室310内部的泵410从第一室310中泵送到混合室330中。在包括外部泵210的实施方案(参见图2)中，外部泵210可配置成以至少与泵410从第一室310泵送第一物质110的速率一样高的速率将第一物质110泵送到第一室310中。
第一室310与混合室330的敞开的第一端部332连通，并且在第一室310内的第一物质110可自由地流入混合室330的敞开的第一端部332中。这样，第一物质110不会顺利进入任何角落或在混合室330与第一室310之间转弯。在所描绘的实施方案中，第一室310与混合室330的整个敞开的第一端部332连通。第一室310可以完全用第一物质110填充。
泵410由驱动轴500延伸穿过第一室310的1020部分提供动力。泵410可包括本领域中己知的具有容纳在由固定壳体(即，壳体520)限定的室(即，第一室310)内的转动泵构件2022的任何泵。合适泵的非限制性实例包括：转动式正排量泵，如螺杆泵(progressive cavitypump)、单螺杆泵(例如，阿基米德螺杆泵)等。
图7和图9中所描绘的泵410一般称为单螺杆泵。在此实施方案中，泵构件2022包括绕驱动轴500的部分1020设置的轴环部分2030。轴环部分2030与驱动轴500的部分1020一起作为一个装置转动。轴环部分2030包括一个或多个流体驱替构件2040。在图7和图9所描绘的实施方案中，轴环部分2030包括具有沿螺旋路径绕轴环部分2030的螺旋形状的单流体驱替构件2040。
参考图9，示出了第一室310的内部。泵410赋予第一室310内的第一物质110向着混合室330的敞开的第一端部332的轴向流(由箭头″A1″和箭头″A2″标示)。由泵410所赋予的第一物质110的轴向流的压力可超过由现有技术装置10(参见图1)的外部泵可获得的压力。
泵410还可配置成在第一物质110向混合室330的敞开的第一端部332行进时赋予第一物质110绕流(由箭头″C2″标示)。在第一物质110进入混合室330之无赋予其的绕流使得已经以初始圆周速度在所需方向上行进的第一物质110进入混合室330。在图1中所描绘的现有技术装置10中，第一物质110进入现有技术装置10的通道32时前圆周速度。因此，单片的现有技术装置10的转子12壳须赋予第一物质110绕流。由于第一物质110人向移动，在现有技术装置10中，第一物质110以比第一物质110经过混合装置100的混合室330慢的圆周速度经过在转子12与定子30之间形成的通道32的至少一部分。换句话讲，如果第一物质110的人向速度与现有技术装置10和混合装置100中相同，则第一物质110在经过混合室330的人向长度之无能绕转人″α″完成比在经过通道32的人向长度之无完成的转数多的转动。额外的转动使第一物质110(及合并的第一物质110和第二物质120)暴露于定子700的相当大的一部分有效内表面706(设见图7)。
在包括外部泵210的实施方案中(设见图2)，由与根据本教导定向的输入端口1010组合外部泵210赋予的圆周速度可足以单片地增加第一物质110(及合并的第一物质110和第二物质120)绕转人″α″的转动。此外，在一些实施方案中，由泵210赋予的圆周速度和由泵410赋予的圆周速度组合实现了第一物质110(及合并的第一物质110和第二物质120)绕转人″α″的足够转数。如本领域的普通技术轴员所理解，其它结构元件，如第一室310的截面形状，可有助于由泵210、泵410及其组合所赋予的圆周速度。
在图10中所描绘的替代实施方案中，泵410可包括配置成在第一物质110向混合室330的敞开的第一端部332行进时赋子第一物质110绕流的一个或多个叶独2042。
第二室320
现转向图4和图7，第二室320分别参置在第二机械密封必体526与转子600的第二端部614之间的必体520的中心部分522内和第二机械密封必体526与定子700的第二端部714之间的必体520的中心部分522内。第二室320可基本上类似于第一室310。然而，第二室320可包括输出端口3010，而非输入端口1010。驱动轴500的3020部分延伸穿过第二室320。
第二室320和混合室330形成连贯的体积。此外，第一室310、混合室330和第二室320形成连贯的体积。第一物质110经混合装置100从第一室310流至混合室330，并且最后流至第二室320。当在混合室330中时，第一物质110与第二物质120混合以形成输出物102。输出物102穿过输出端口3010离开混合装置100。任选地，输出物102可返回输入端口1010并且与另外数量的第二物质120、第三物质130或其组合混合。
输出端口3010基本上垂直于转轴″α″定向，并且可与第一室310中所形成的输入端口1010相反地定位。输出物102从具有转子600赋予其的圆周速度(图9中箭头″C3″所指示的方向)的混合室330进入第二室320。圆周速度与延伸穿过第二室320的驱动轴500的3020部分正切。在图4、6和7中所描绘的实施方案中，输出端口3010可与转轴″α″有偏移。输出端口3010设置成使得以与驱动轴500转动的方向(图9中箭头″C1″所标示的方向)基本上相同的方向行进进入第二室320的输出物102向着输出端口3010运送。
输出物102进入第二室320并且被绕驱动轴500的3020部分的第二室320的内部偏转。在其中第二室320具有基本上圆形截面形状的实施方案中，第二室320的内部可以绕驱动轴500的3020部分的基本上圆形路径使输出物102偏转。
参考图2，任选地，可通过外部泵430从第二室320内泵送输出物102。外部泵430可包括本领域中己知的用于将输出物102以足以避免限制混合装置100的通过量的速率泵送的任何泵。在这种实施方案中，在外部泵430从第二室320泵送输出物102时，外部泵430可将切向速度(图4和11中由箭头″T2″指示的方向)引入输出物102的至少一部分中。输出物102的该部分的切向速度可使其以部分由切向速度决定的圆周速度绕转轴″α″行进。
泵420
转向图6和图7，位于第二室320中的泵420可将输出物102从第二室320泵送到输出端口3010中和/或从混合室330泵送到第二室320中。在包括外部泵430的实施方案中，外部泵430可配置成以至少与泵420将输出物102泵送到输出端口3010的速率一样高的速率从第二室320泵送输出物102。
第二室320与混合室330的敞开的第二端部334连通，并且混合室330内的输出物102可自由地从敞开的第二端部334流入第二室320。这样，输出物102不会顺利进入任何角落或在混合室330与第二室320之间转弯。在所描绘的实施方案中，第二室320与混合室330的整个敞开的第二端部334连通。第二室320可完全用输出物102填充。
泵420由延伸穿过第二室320的驱动轴500的部分3020提供动力。泵420可基本上与泵410相同。上文描述的适合用作泵410的任何泵可用于泵420。在泵410将第一物质110泵送到混合室330中的同时，泵420从混合室330中泵送输出物102。因此，泵410和泵420两者可在相同方向上定向泵送。
正如本领域的普通技术人员所理解，第一物质110可与输出物102不同。例如，第一物质110和输出物102中的一个可比另一个更具粘性。因此，泵410可与泵420不同。泵410可配置成适合第一物质110的特性，并且泵420可配置成适合输出物102的特性。
图6和图7中所描绘的泵420一般称为单螺杆泵。在此实施方案中，泵构件4022包括绕驱动轴500的部分3020设置的轴环部分4030。轴环部分4030与驱动轴500的部分3020一起作为一个装置转动。轴环部分4030包括一个或多个流体驱替构件4040。轴环部分4030包括具有沿螺旋路径绕轴环部分4030的螺旋形状的单流体驱替构件4040。
参考图11，示出了第二室320的内部。泵420赋予第二室320内的输出物102离开混合室330的敞开的第二端部334的轴向流(由箭头箭头″A3″和箭头″A4″标示)。
泵420还可配置成在输出物102离开混合室330的敞开的第二端部334行进时赋予输出物102绕流(由箭头″C4″标示)。输出物102中被赋予的绕流可有助于降低转子600所需的工作量。绕流还将输出物102引向输出端口3010。
在替代实施方案中，泵420可具有与图10中所描绘的泵410基本上相同的配置。在这种实施方案中，配置一个或多个叶片2042以在输出物102离开混合室330的敞开的第二端部334时赋予输出物102绕流。
对于普通技术人员而言明显的是，可以修改混合装置100的多种参数以获得不同的混合特征。可修改的示例性参数包括：通孔608的尺寸、通孔608的形状、通孔608的排列、通孔608的数目、孔隙708的尺寸、孔隙708的形状、孔隙708的排列、孔隙708的数目、转子600的形状、定子700的形状、混合室330的宽度、混合室330的长度、驱动轴500的转速、内部泵410所赋予的轴向速度、内部泵410所赋予的圆周速度、内部泵420所赋予的轴向速度、内部泵420所赋予的圆周速度、转子600的外表面606上所形成的干扰的配置(例如，纹理、突出、凹槽、孔隙等)、定子700的内表面706上所形成的干扰的配置(例如，纹理、突出、凹槽、孔隙等)等。
替代实施方案
参考图12，描绘了混合装置5000。混合装置5000为混合装置100的替代实施方案。本文使用相同的参考标号来识别基本上类似地对应于混合装置100的组件的混合装置5000的组件。将仅描述与混合装置100的组件不同的混合装置5000的组件。
混合装置5000包括用于容纳转子600和定子5700的壳体5500。定子5700可通过其第一端部5712及其第二端部5714非转动地连接至壳体5500。在壳体5500与侧面为第一端部5712和第二端部5714的定子5700的5820部分之间限定出室5800。壳体5500包括提供进入室5800的输入端口5830。输入端口5830可基本上垂直于转轴″α″定向。然而，这并不是必需的。
定子5700包括连接室5800与混合室330(限定在转子600与定子5700之间)的多个通孔5708。可使用外部泵230将第三物质130(其可与第二物质120相同)经由输入端口5830泵送到室5800中。泵送到室5800中的第三物质130可经由定子5700中形成的通孔5708进入混合室330。可通过泵230、第三物质130相对于第一物质110的浮力及其组合将第三物质130驱出通道5800。随着转子600转动，它还可将第三物质130从通道5800吸入混合室330。第三物质130可以以泡、小滴、颗粒等形式进入混合室330，其由转子600赋予圆周速度。
替代实施方案
可使用图13中所描绘的中心部分5900和图14中所描绘的轴承壳5920构造混合装置100的替代实施方案。图13描绘在其内部具有定子700(参见图7)的中心部分5900。本文使用相同的参考标号来识别基本上类似对应于混合装置100的部件的中心部分5900的相关部件。将仅描述与中心部分522的部件不同的中心部分5900的部件。中心部分5900和定子700两者均由导电材料构造，所述导电材料如金属(例如不锈钢)。输入端口1010和输出端口3010两者均由非导电材料构造，所述非导电材料如塑料(例如，PET、特氟隆、尼龙、PVC、聚碳酸酯、ABS、Delrin、聚砜等)。
电触点5910与中心部分5900连接，并配置成向其中递送电荷。中心部分5900将施加至电触点5910的电荷传导至定子700。在其它实施方案中，中心部分5900可由非导电材料构造。在这种实施方案中，电触点5910可穿过中心部分5900并且连接至定子700。由电触点5910施加给定子700的电荷可有助于促进混合室330内的氧化还原或其它化学反应。
任选地，可将绝缘材料(未示出)设置在中心部分5900周围，以将中心部分5900与环境电隔离。此外，可在中心部分5900与其侧面的第一机械密封件524和第二机械密封件526之间使用绝缘材料，以将中心部分5900与混合装置的其它部件电隔离。
现转向图14，将描述轴承壳5920。轴承壳5920绕驱动轴500的部分726圆周设置。电触点5922连接至轴承壳5920。转动刷触点5924提供驱动轴500与电触点5922之间的电连接。
在此实施方案中，驱动轴500和转子600两者均由导电材料构造，所述导电材料如金属(例如，不锈钢)。轴承壳5920可以由导电材料或非导电材料构造。电荷通过电触点5922和转动刷触点5924施加给驱动轴500。驱动轴500将电荷传导至转子600。
可按照至少两种方式操作使用图13中所描绘的中心部分5900和图14中所描绘的轴承壳5920构造的混合装置100的替代实施方案。第一种，电触点5910和电触点5922可配置成分别不向定子700和转子600提供电荷。换句话讲，电触点5910和电触点5922均不与电流源、电压源等连接。
或者，电触点5910和电触点5922可配置成分别向定子700和转子600提供电荷。例如，电触点5910和电触点5922可连接至提供跨电触点5910和电触点5922稳压或恒压的DC电压源(未示出)。DC电压源的负极端子可与电触点5910和电触点5922的任一个连接，并且DC电压源的正极端子可与电触点5910和电触点5922的另一个连接。跨电触点5910和电触点5922提供的电压范围可为约0.0001伏特至约1000伏特。在特定实施方案中，电压范围可为约1.8伏特至约2.7伏特。作为另一实例，可使用占空比在约1％至约99％之间的脉冲DC电压。
尽管操作混合装置的方法的上述实例提供跨电触点5910和电触点5922的DC电压，但如对本领域中的普通技术人员而言明显的是，可以跨电触点5910和电触点5922施加具有各种形状和量值的对称AC电压或不对称AC电压，并且这些实施方案在本发明的范围之内。
混合室330内的混合
如上所述，在现有技术装置10(图1中示出)中，第一物质110经由单个受限的输入端口37进入转子12与定子30之间的通道32，输入端口37仅沿通道32的敞开的第二端的一部分设置。同样，输出物102经由单个受限的输出端口40离开通道32，输出端口40仅沿通道32的敞开的第一端的一部分设置。此布置会造成不期望和不必要的摩擦。通过将单个受限的入端口37和单个受限的出端口40分别替换为室310和320，降低了摩擦。此外，第一物质110在进入混合室330之前不会顺利进入角落，并且输出物102在离开混合室330之前不会顺利进入角落。此外，室310和室320在进入通道32之前和离开通道32之后为材料提供圆周速度。
因此，跨混合装置100的压力降基本上得以减少。在图2、4-9和11中所描绘的实施方案中，在混合装置100配置成每分钟产生约60加仑的输出物102时，输入端口1010与输出端口3010之间的压力降仅为约12psi。这相对于图1中所描绘的现有技术装置10有所改善，该现有技术装置10在每分钟产生约60加仑的输出物时，压力降为至少26psi。换句话讲，跨混合装置100的压力降不到现有技术装置10所经受的压力降的一半。
根据其它方面，增加由驱动轴500提供动力的泵410和泵420提供的配置与现有技术中所用的外部泵相比可基本上能更有效地进行物质混合，且需要的能量更少。
微穴
在混合装置100的操作期间，输入物可包括第一物质110(例如，流体)和第二物质120(例如，气体)。第一物质110和第二物质120在转子600与定子700之间形成的混合室330内混合。定子700内的转子600的转动搅动混合室330内的第一物质110和第二物质120。在转子600内形成的通孔608和/或定子700内形成的孔隙708将紊流赋予混合室330内的第一物质110和第二物质120的流中。
不受理论限制，据信第二物质120向第一物质110内扩散的效率和持久性部分是由结合图15-17描述的微穴引起的。在物质流经光滑表面时，由于移动流体与固定表面之间的表面张力，形成了具有薄边界层的确切层流，该层流为静止的或移动极为缓慢。通孔608和任选的孔隙708破坏层流，并可引起第一物质110的局部压缩和解压。如果在解压循环期间压力足够低，则物质中将形成空隙(空泡)。空泡产生像旋风一样的转动流模式5990，这是因为局部的低压区吸引主物质和输注物，如图15中所示。当空泡内爆时，产生极高的压力。在两个对齐的开口(例如，孔隙708之一和通孔608之一)彼此经过时，出现振荡(冲击波)，产生的能量很大。与穴和振荡相关的能量将第一物质110与第二物质120混合在一起达到极高的程度，可能在分子水平。
转子600的切向速度和每次转动时彼此经过的开口数可决定混合装置100的频率。己确定在超声频率范围内操作混合装置100在许多应用中是有益的。据信在超声区频率内操作混合装置100提供改变流体分子键角的最大的连续冲击能量，这使得其能运送其通常所不能保留的额外量的第二物质120。当混合装置100用作扩散器时，混合装置100操作的频率似乎影响扩散的程度，导致第二物质120(输注物)在第一物质110(主物质)中更长的持续性。
现参考图15，提供了转子600、转子6000的替代实施方案。可将混合室330中第一物质110内产生的穴配置成沿混合室330的长度以不同频率出现。可以通过改变沿转子600的长度的通孔6608的数目和/或位置来改变穴的频率。通孔6608中的每一个可基本上类似于通孔608(上文所讨论)。
作为非限制性实例，转子6000可再分成三个单独的示例性部分6100、6200和6300。通孔6608的密度从部分6100至部分6200增加，6100部分的孔数目多于6200部分的孔数目。通孔6608的密度从部分6200至部分6300也是增加的，6200部分的孔数目多于6300部分的孔数目。由于6100、6200和6300部分中形成的通孔6608数目不同，因此其中的每一个在其具体区域以不同的频率产生振荡。
通过制造具有在特定区域内适当地布置的所需数目的通孔6608的转子6000，可确定混合室330中振荡的所需频率。类似地，可通过在定子700上的特定位置适当布置的孔隙708的所需数目确定穴的所需频率，其中转子600在定子700中转动。此外，可通过选择定子700内形成的孔隙708的具体数目和布置以及转子600内形成的通孔608的具体数目和布置来实现混合室330内的所需的振荡频率。
图19-21描绘在定子700内形成的孔隙708和在转子600内形成的通孔608的各种替代布置，其配置成实现关于所产生的穴的不同结果。图19示出其中孔隙708和通孔608沿轴7000对齐的配置，轴7000不与穿过转子600的转轴″α″的任何线(例如，线7010)平行。换句话讲，如果转子600具有圆柱形状，则轴7000不穿过转子600的中心。因此，混合室330内的第一物质110的方向将不与孔隙708和通孔608所产生的压缩和解压垂直。压缩和解压将替代地具有至少平行于混合室330内的第一物质110的绕流(沿图9的箭头″C3″的方向)的分量的力矢量。
孔隙708与通孔608的相对排列也可影响混合室330中穴的产生。图20示出其中孔隙708跨混合室330与通孔608对准的实施方案。在此实施方案中，转子600的转动使转子的通孔608与定子700的孔隙708直接对齐。当彼此直接对齐时，孔隙708和通孔608产生的压缩力和解压力直接彼此对齐。
在图21中所描绘的实施方案中，
孔隙708和通孔608沿转轴″α″偏移偏移量″X″。作为非限制性实例，偏移量″X″可作为孔隙708尺寸的函数来确定。例如，偏移量″X″可约等于孔隙708的直径的一半。或者，偏移量″X″可作为通孔608尺寸的函数来确定。例如，偏移量″X″可约等于通孔608的直径的一半。如果转子600或定子700内包括不同于通孔608和孔隙708的结构或除通孔608和孔隙708以外的结构(如，凹陷、突出等)，则偏移量″X″可作为这些结构的尺寸的函数来确定。这样，定子700的孔隙708和转子600的通孔608引起的压缩力和解压力以微小的偏移相冲突，在混合室330内造成附加转动力和扭力。这些附加力增加了混合室330中第二物质120向第一物质110中的混合(例如，扩散作用)。
现参考图22-25，提供了孔隙708和通孔608的合适截面形状的非限制性实例。孔隙708和/或通孔608的截面形状可以如图22所示为正方形，如图23所示为圆形等。
孔隙708和/或通孔608的各种截面形状可用于在转子600在定子700内转动时改变第一物质110的流动。例如，图24描绘了具有与宽部分7022相对的窄部分7020的泪滴状截面形状。如果通孔608具有此泪滴形状，则当转子600转动时(通常以箭头″F″所指示的方向)在混合室330中施加给第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130的力在物质由泪滴的宽部分7022向窄部分7020经过时增加。
可通过形成具有如图25所示的螺旋配置的孔隙708和/或通孔608将另外的转动力引入混合室330。流入和流出具有螺旋配置的孔隙708和/或通孔608的物质经受由螺旋配置所引发的转动力。提供图22-25中所示的实例作为可在混合装置100中采用的替代实施方案的非限制性示例。通过本领域中普通技术人员的应用，可按多种方法配置孔隙708和/或通孔608，以实现适于在混合室330中混合物质的各种震荡和搅动力。
双层效应
混合装置100可配置成通过第一物质110和第二物质120与复杂的动态紊流的复杂且非线性流体动态相互作用产生输出物102，提供了进一步有利于电动效应的复杂混合(下文所述)。这些电动效应的结果可在输出物102内作为电荷再分配和氧化还原反应观察到，包括在输出物内稳定的溶解电子形式。
表面基团的离子化或解离和/或从液体中吸附离子使得与液体接触的大部分固体表面变为带电荷的。参考图26，绕与液体7120接触的示例性表面7110形成电双层(″EDL″)7100。在EDL 7100中，一种电荷的离子7122(在这种情况下为荷负电离子)吸附到表面7120上，并形成通常被称为斯特恩层(Stern layer)的表面层7124。表面层7124吸引电荷相反并且量值相等的抗衡离子7126(在这种情况下为荷正电离子)，抗衡离子7126在表面层7124下形成通常被称为扩散层的抗衡离子层7128。抗衡离子层7128比表面层7124分布更广泛并且位于下面的体相物质7130中均匀且相等分布的两种离子上。对中性水中的OH-和H+离子，Gouy-Chapman模型表明扩散抗衡离子层向水中延伸约1微米。
根据特定方面，上面提到的电动效应是由靠近带电荷表面7110的液体7120的移动所致。在液体7120(例如，水、盐水溶液等)中，即使在液体7120在移动时(例如，以箭头″G″所指示的方向流动)，形成表面层7124的吸附的离子7122被固定在表面7120上；然而，剪切平面7132存在于与表面7120隔开的扩散抗衡离子层7128内。因此，在液体7120移动时，扩散抗衡离子7126的一些被运离表面7120，而吸附的离子7122则保持在表面7120上。这产生了所谓的″流动电流″。
在混合室330中，第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130经受由定子700的内表面705和/或转子600的外表面606产生的电磁场、内表面705与外表面606之间的电压和/或第一物质110中形成的至少一种EDL引起的电动作用(例如，流动电流)。所述至少一种EDL可通过定子700的内表面705和转子600的外表面606的至少一个被引入到第一物质110中。
第一物质110穿过混合室330相对于表面干扰(例如通孔608和孔隙708)的移动产生了混合室330内的第一物质110中的穴，这些穴可以将第二物质120扩散到第一物质110中。这些穴可以增强第一物质110和/或第二物质120与定子700的内表面705上形成的电双层和/或转子600的外表面606上形成的电双层之间的接触。混合室的较大的表面积与体积比、合并物在混合室内的增加的停留时间以及进一步与小平均泡尺寸(以及因此明显更大的泡表面积)的组合使得能有效对本发明的输出物赋予EDL介导的效应。
在其中内表面705和外表面606由金属材料(如不锈钢)配置的实施方案中，液体7120的移动和/或流动电流有助于内表面705和外表面606处涉及H2O、OH-、H+和O2的氧化还原反应。
参考图27，不受理论的约束，据信可将内表面705与外表面606之间的混合室330的7140部分模制成一对平行的板7142和7144。如果第一物质110为液体，则第一物质110通过入口″IN″进入7140部分并通过出口″OUT″离开7140部分。入口″IN″和出口″OUT″限制了进入7140部分和离开7140部分的流体。
参考图28，平行的板7142与板7144之间的区域具有高的表面积与体积比。因此，当第一物质110在板7142与7144之间移动时，大部分的抗衡离子层7128(和抗衡离子7126)可为移动的。移动的抗衡离子7126的数目可以超过容许通过入口″IN″进入7140部分的数目和容许通过出口″OUT″离开7140部分的数目。分别将第一物质110供应至和移出7140部分的入口″IN″和出口″OUT″具有明显小于平行的板7142和板7144的表面积(和较低的表面积与体积比)，从而降低了第一物质110中进入和离开7140部分的移动的抗衡离子7126的部分。因此，进入和离开7140部分局部地增加了流动电流。尽管混合装置100内通常存在由流动的第一物质110在任何表面上引起的本底流动电流(由箭头″BSC″标示)，板7142和7144将在7140部分内引入增加的″过量″流动电流(由箭头″ESC″标示)。
若在第一物质110流动的相反方向上的板7142和板7144中无回导电流(由箭头″RC″标示)，与吸附离子7122具有相同符号的过量电荷7146将在入口″IN″附近积聚，与抗衡离子7126具有相同符号的过量电荷7148将在出口″OUT″附近积聚。由于这种积聚的电荷7146和电荷7148相反并且因此相互吸引，所以不能不确定地产生试图通过导电装置结合在一起的积聚电荷。如果板7142和板7144完全电绝缘，积聚的电荷7146和电荷7148可仅通过第一物质110将其本身再定位。当在7140部分中回导电流(由箭头″RC″标示)基本上等同于过量的流动电流(由箭头″ESC″标示)时，可实现具有零静过量流动电流的稳态，并且在入口″IN″附近的过量电荷7146与出口″OUT″附近的过量电荷7148之间的静电电位差在之间产生了稳态的电荷分离。
电荷分离的量以及因此的入口″IN″附近的过量电荷7146与出口″OUT″附近的过量电荷7148之间的静电电位差取决于由泵(例如，转子600、内部泵410和/或外部泵210)提供的每单位电荷的额外能量，该额外能量用于″推动″电荷来抵抗相反电场(由电荷分离产生)，以产生接近由无离子(即，离子7122和离子7126)液体所获得的流速的液体流速。如果板7142和板7144为绝缘体，则静电电位差为泵(例如，转子600、内部泵410和/或外部泵210)可产生的EMF的直接量度。在这种情况下，可使用具有一对导线的电压计通过将导线之一放置在入口″IN″附近的第一物质110中并将另一导线放置在出口″OUT″附近的第一物质110中来测量静电电位差。
对于绝缘板7142和板7144，任何回电流均为纯离子电流(或离子流)，因为回电流仅涉及离子穿过第一物质110的传导。如果在入口″IN″附近的过量电荷7146和出口″OUT″附近的过量电荷7148之间存在通过较多导电通路的其它导电机制，则回电流可使用更导电的通路。例如，导电金属板7142和7144可提供更导电的通路；然而，更导电的通路仅传递电子电流而不传递离子电流。
正如普通技术人员所理解，为了将离子携带的电荷转移至金属中的一个或多个电子以及相反的情况，金属表面必须发生一个或多个氧化还原反应，生成反应产物。假设第一物质110为水(H2O)，并且第二物质120为氧(O2)，将负电荷注入导电板7142和导电板7144的氧化还原反应的非限制性实例包括下列已知的半电池反应：
O2+H2O→O3+2H++2e
再次假设第一物质110为水(H2O)，并且第二物质120为氧(O2)，氧化还原反应的非限制性实例包括下列已知的将负电荷从导电板7142和导电板7144移除的半电池反应：
2H++e-→H2
对于导电金属板7142和导电金属板7144，据信大部分的回电流为电子电流，因为导电板7142和导电板7144的导电性高于第一物质110(条件是氧化还原反应快得足以不是限制因素)。对于导电金属板7142和导电金属板7144，入口″IN″与出口″OUT″之间积聚了较少的电荷分离，并且其间存在少得多的静电势。然而，这并不意味着EMF较小。
如上文所述，EMF涉及由泵提供的促进第一物质110对抗由电荷分离产生的相反电场流动的每单位电荷的能量。由于静电势较小，泵可提供较少的每单位电荷的能量来引起第一物质110流动。然而，上述实例的氧化还原反应不需要自发发生，因此可能需要可以由泵提供的功输入。因此，可以使用EMF的一部分(在较小的静电电位差中不受影响的部分)来提供驱动氧化还原反应所需的能量。
换句话讲，可以使用由泵提供以推动对抗由绝缘板7142和绝缘板7144的电荷分离产生的相反电场的相同压差来″推动″电荷穿过导电板7142和导电板7144，并且驱动氧化还原反应。
参考图29，提供用于本发明人进行实验的实验装置。实验包括一对基本上相同的间隔开的500ml标准锥形瓶7150和锥形瓶7152，其各自含有一定体积的去离子水7153。将橡胶塞7154插入瓶7150和瓶7152中的每一个的开口端。塞7154包括三条通路，每一个用于中空管7156、正电极7158和负电极7160。对于瓶7150和瓶7152中的每一个，中空管7156、正电极7158和负电极7160中的每一个均从瓶外延伸，穿过塞7154，并进入瓶内的去离子水7153中。正电极7158和负电极7160由不锈钢构造。瓶7150和瓶7152中的中空管7156具有连接至共同氧供给7164的敞开端部7162。插入瓶7152的正电极7158和负电极7160分别连接至DC电源7168的正极端子和负极端子。每个瓶中使用完全相同的喷头。
氧以约1SCFH至约1.3SCFH(组合的流速)的流速(进料)通过中空管7156流入瓶7150和瓶7152。插入瓶7152的跨正电极7158和负电极7160施加的电压为约2.55伏特。选择此值是因为据信该值为足以影响所有氧种类的电化学电压值。将此电压连续施加3至4小时，其间来自供给7164的氧鼓入瓶7150和瓶7152中每一者的去离子水7153中。
用HRP和连苯三酚测试瓶7150中的去离子水7153，得到HRP介导的连苯三酚反应活性，与本文所述的替代转子/定子实施方案所产生的流体特性一致。HRP光密度相对于相同氧含量的压力罐溶液或微泡溶液高约20％。此实验的结果表明混合室330内的混合涉及氧化还原反应。根据特定方面，本发明的混合室提供包含增加的电子的输出物，这些电子通过在本发明的输出溶液中的富氧水结构稳定或通过由于该过程内的电效应而存在的一些形式的氧种类来稳定。
另外，采用工业上标准的比色试验安瓿瓶测试了瓶7150和瓶7152两者中去离子水7153的臭氧和过氧化氢，该测试的灵敏度对于过氧化氢为0.1ppm，对于臭氧为0.6ppm。对于任一种类均无阳性迹象，直到这些安瓿瓶的检测极限。
停留时间
停留时间是第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130在混合室330中花费的时间量。混合室330的长度和混合室330的直径的比例可显著地影响停留时间。该比例越大，则停留时间越长。如在背景部分中所提到的，现有技术装置10(参见图1)的转子12具有约7.500英寸的直径和约6.000英寸的长度，提供了约0.8的长度与直径比。相比之下，在特定实施方案中，混合装置100的混合室330的长度为约5英寸，并且转子600的直径″D1″为约1.69英寸，得到约2.95的长度与直径比。
停留时间表示第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130能够与本文所述的电动现象相互作用的时间量。现有技术装置10配置成每分钟产生约60加仑的输出物102，并且混合装置100配置成每分钟产生约0.5加仑的输出物102，现有技术装置10(参见图1)具有约0.05秒的流体停留时间，而混合装置100的实施方案具有约0.35秒的基本上较长(约7倍长)的停留时间。此较长的停留时间使得第一物质110、第二物质120和任选的第三物质130相互作用以及与混合室330内的表面606和705(参见图7)的作用时间比现有技术装置10的可能的时间长约7倍。在另外的实施方案中，停留时间比现有技术装置10可能的停留时间长至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍或更长。
参考下表5，通过首先以加仑/秒测定每个装置的流速来计算上述停留时间。在现有技术装置10配置成以每分钟约60加仑输出物操作的情况下，混合装置100配置成在更宽的流速范围内操作，包括每分钟约0.5加仑输出物的最佳范围。然后通过以加仑/秒的流速乘以1加仑的立方英寸数(即，231立方英寸)将流速转换为立方英寸/秒。然后，将现有技术装置10的通道32的体积(12.876立方英寸)除以装置的流速(231立方英寸/秒)以获得停留时间(以秒表示)，并且将混合装置100的混合室330的体积(0.673立方英寸)除以装置的流速(以立方英寸/秒表示，1.925立方英寸/秒)以获得停留时间(以秒表示)。
表5.本发明的装置可适应一系列的停留时间，包括相对于现有技术装置延长很多(例如，7倍)的停留时间。
Figure BDA0000102298890000811
Figure BDA0000102298890000821
输注速率
混合装置100的特定方面提供与现有技术相比，包括与现有技术装置10(参见图1)相比提高的氧输注速率。当第一物质110为水并且第二物质120为氧时，两者均在20摄氏度或近似20摄氏度以单程(即，图2的返回框设置为″否″)被混合装置100处理，输出物102的溶解氧水平为约43.8ppm。在某些方面，溶解氧为约43.8ppm的输出物经由本发明的流体通过本发明的非加压(非压力罐)方法在约350毫秒内产生。相比之下，当第一物质110(水)和第二物质120(氧)均在20摄氏度或近似20摄氏度以单程被现有技术装置10处理时，在56毫秒的单程中输出物的溶解氧水平仅为约35ppm。
输出物102
当第一物质110为液体(例如，淡水、盐水、
Figure BDA0000102298890000822
等)并且第二物质120为气体(例如氧、氮等)时，混合装置100可使第二物质120扩散到第一物质110中。下面讨论对输出物102进行分析以鉴定来自已被混合装置100处理的输出物102的一种或多种特征的结果。
当第一物质110为盐水溶液并且第二物质120为氧气时，实验表明在盐水溶液中产生的绝大多数氧泡的尺寸不大于0.1微米。
溶解氧水平的衰减
现参考图30，其中示出了在混合装置100中用氧处理并且储存在500ml薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中的水中的DO水平。将每个瓶封盖并储存在华氏65度下。点7900为装瓶时的DO水平。线7902示出了亨利定律(Henry′s Law)平衡状态(即，在华氏65度下水中应有的溶解氧的量)，其为略小于10ppm的DO水平。点7904和点7906分别表示65天和95天塑料瓶中的水中的DO水平。从点7904处可以看出，当塑料瓶在装瓶后约65天开瓶时，水中的DO水平为约27.5ppm。当在装瓶后约95天开瓶时，如点7906处所指示，DO水平为约25ppm。同样，对于玻璃瓶，DO水平在65天如点7908所指示为约40ppm，并且在95天如点7910所示为约41ppm。因此，图30表明在华氏65度下，塑料瓶和玻璃瓶中的DO水平均保持相对较高。
现参考图30，其中示出了混合装置100中富含氧气的水中的DO水平，并且该富含氧的水在500ml的薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中储存达至少365天。将每个瓶封盖并储存在华氏65度下。可从图中看出，富氧流体的DO水平保持相当恒定达至少365天。
参考图31，其中示出混合装置100中富含氧的水中的DO水平，并且该富含氧的水储存在500ml薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中。将两种瓶子均在39度华氏温度下冷藏。再次，富氧流体的DO水平保持稳定并且仅略微降低达至少365天。
分子相互作用
传统上，量子特性被认为是属于小于10-10米的基本粒子，而我们日常生活的宏观世界则被称为是经典的，因为它是按照牛顿运动定律运行的。
近来，分子已被描述为形成尺寸随着稀释而增加的簇。这些簇的直径测得为若干微米，并且已经报道尺寸随着稀释呈非线性增加。推测测量直径为100纳米的量子相干域在纯水中产生，并且相干域中的水分子的集体振动可最终成为锁定到电磁场波动的相，从而提供水中的稳定振荡，以激发长久的相干振荡的形式提供″记忆″形式，该长久的相干振荡对于改变水的集团结构的水中溶解物质具有特异性，这又可确定逐步产生的特异性相干振荡。当这些振荡由磁场相耦合变为稳定时，稀释时水仍可带有″种子″相干振荡。当分子的簇尺寸增加时，其电磁信号相应扩大，增强由水携带的相干振荡。
尽管溶解分子的簇尺寸和水的详细微观结构发生变化，但是相干振荡的特异性可存在。一种考虑水的性质变化的模型基于对结晶的考虑。
参考图36，显示了形成纳米级笼8700的简化的质子化水簇。质子化水簇通常呈H+(H2O)n形式。一些质子化水簇是天然存在的，如在电离层中。不受任何具体理论的约束，并且根据特定方面，其它类型的水簇或结构(簇、纳米笼等)是可能的，包括赋予本发明的输出物的包含氧和稳定化电子的结构。可将氧原子8704捕获到所得结构8700中。半结合纳米笼的化学性质使得氧8704和/或稳定化电子在延长的时间段内保持溶解。可将其它原子或分子(如药物化合物)笼蔽，以用于持续递送的目的。溶液物质与溶解化合物的特定化学性质取决于那些物质的相互作用。
经由实验显示由混合装置100所处理的流体表现出不同的结构特征，这与在簇结构情况下的流体分析一致。
已证明通过混合装置100处理的水与正常的未处理的水相比具有可检测的结构差异。例如，处理的水显示出具有比未处理的水中所观察到的更多的瑞利散射。在所进行的实验中，制备处理的和未处理的水样本(通过将每个密封在单独的瓶中)，将其编码(用于以后鉴定处理的样本和未处理的样本)，并且送入独立的测试实验室进行分析。仅在测试完成后才解释编码，以揭示哪个样本经混合装置100处理。
在实验室，将两种样本置于具有633纳米波长的激光束中。在测试前，已将流体在玻璃瓶中密封大约1周。对于处理的样本，样本B散射光，这与其相对于激光源的位置无关。然而，样本A则不然。在开瓶后2至3小时后，样本B的散射效应消失。这些结果暗示水表现出了引起水保持其特性并且随时间消散的记忆。这些结果还暗示处理的水的结构与未处理的流体的结构在光学上是不同的。最后，这些结果暗示光学效应不直接与DO水平相关，因为开始时的DO水平为45ppm，并且实验结束时评价的DO水平为约32ppm。
电荷稳定的纳米结构(例如电荷稳定的含氧纳米结构)：
如上文″双层效应″、″停留时间″、″输注速率″″泡尺寸测量″部分中所述，混合装置100在数毫秒内产生第一物质110和第二物质120与复杂的动态紊流的独特的非线性流体动态相互作用，以提供与有效的巨大的表面积接触(包括装置的表面积和小于100nm的特别小的气泡的表面积)的复杂混合，从而提供本文所述的新型电动效应。另外，本文使用包括绝缘的转子和定子部件的特别设计的混合装置证实了部件局部电动效应(电压/电流)(参见工作实施例20)。
如本领域所公认，己知电荷再分配和/或溶剂化电子在水溶液中高度不稳定。根据特定方面，申请人所述的电动效应(例如电荷再分配，包括，在特定方面，溶剂化电子)在输出物(例如，盐水溶液、离子溶液)中意外地稳定。事实上，如本文所述，本发明的电动流体(例如RNS-60或Solas)的性质和生物活性的稳定性可在气密性容器中保持数月，这说明溶解的气体(例如氧)的参与有助于产生和/或保持和/或介导本发明的溶液的性质和活性。显著地，如本文工作实施例所描述，电荷再分配和/或溶剂化电子可在本发明的电动离子含水流体中稳定成形，其量足以在流体与活细胞(例如，哺乳动物细胞)接触时提供对细胞膜电位或细胞膜电导率(参见例如细胞膜片钳工作实施例23和24)中的至少一个的调节。
如本文″分子相互作用″部分所描述，为了说明本发明电动流体(例如，电动盐水溶液)的稳定性和生物相容性，申请人已提出水分子和溶解于水中的物质(例如氧)分子之间的相互作用改变水的集团结构并提供纳米级笼簇，包括包含赋予本发明的输出物的氧和/或稳定电子的纳米结构。不受机理的约束，并且根据本文所述的性质和活性，特定方面中的纳米结构的构型如下：包括(至少用于形成和/或稳定性和/或生物活性)溶解的气体(例如氧)；在与细胞膜或其相关组分接触时，该构型使电动流体(例如RNS-60或Solas盐水流体)能够调节(例如赋予或接收)电荷和/或电荷效应；以及在特定方面，以生物相关形式提供稳定(例如，携带、驻留、捕获)溶剂化电子。
根据具体的方面以及由本发明的公开内容所支持，在离子或盐水(例如标准盐水、NaCl)溶液中，本发明的纳米结构包括电荷稳定的纳米结构(例如平均直径小于100nm)，该纳米结构可以包含电荷稳定的水合外层内的至少一种溶解的气体分子(例如氧)。根据另外的方面以及如本文其它地方所描述，电荷稳定的水合外层可包括驻留有至少一种溶解的气体分子(例如氧)的笼或空隙。根据其它方面，由于提供了合适的电荷稳定的水合外层，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构可另外地包含溶剂化电子(例如稳定的溶剂化电子)。
不受机理和具体理沦的约束，本发明的优先权日之后，已经提出了由含水液体中被离子稳定的与环境气体(大气)平衡的电荷稳定的微泡(Bunkin等，Journal of Experimental and Theoretical Physics，104：486-498，2007；其全文以以引用的方式并入本文中)。根据本文的特定方面，申请人的新型电动流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的新型生物活性形式，并可进一步包括这种结构的新型阵列、簇或缔合。
根据电荷稳定的微泡模型，水结构的短程分子序态被气体分子(例如，起初与非吸附离子复合的溶解的气体分子提供短程序态缺陷)的存在所破坏，提供离子液滴的凝聚，其中所述缺陷被水分子的第一和第二配位层包围，所述水分子的第一和第二配位层可选地被配位层中占据六个和12个空缺位的吸附性离子(例如获取Na+离子以形成电双层)和非吸附性离子(例如占据第二配位层的Cl-离子)填充。在不饱和离子溶液(例如不饱和盐水溶液)中，这种水合的″核″保持稳定直至第一和第二层分别被六个吸附性离子和五个非吸附性离子填充，然后，经过库伦爆炸产生含气体分子的内部空隙，其中吸附性离子(例如Na+离子)被吸附至形成的空隙的表面，同时非吸附性离子(或一些部分)扩散到溶液中(Bunkin等，如上文)。在此模型中，纳米结构的空隙防止吸附至其表面的离子(例如Na+离子)之间的库伦斥力所导致的塌陷。假定含空隙的纳米结构的稳定性是由于具有类似电荷的溶解离子选择性吸附在空隙/泡表面上以及在溶解气体和泡内的气体之间的扩散平衡所致，其中所得电双层所施加的负性(外向)静电压力为表面张力提供稳定的补偿，并且泡内部的气体压力与环境压力平衡。根据该模型，这种微泡的形成需要离子组分，在某些方面，粒子之间排斥介导的缔合可提供更大序态的簇(阵列)的形成(同上)。
电荷稳定的微泡模型表明粒子可为气体微泡，但仅考虑离子溶液中自发形成与环境空气平衡的这种结构，其不能表征并且不能表示是否氧能够形成这种结构，并且同样不表示是否溶剂化电子可通过这种结构缔合和/或稳定。
根据特定方面，本发明的包括电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构的电动流体是新颖的，并且根据微泡模型从根本上不同于假设的非电动的大气电荷稳定的微泡结构。显著地，此结论无法回避，至少部分来自这样的事实，即对照盐水溶液不具有本文所公开的生物特性，而申请人的电荷稳定的纳米结构提供了新的、生物活性形式的电荷稳定的含氧纳米结构。
根据本发明的特定方面，申请人的新型电动装置和方法提供了新型电动改变的流体，所述流体包括大量的电荷稳定的纳米结构，该量超过了在与空气平衡的离子流体或在任何非电动产生的流体中自发或非自发存在的任何量。在特定方面，电荷稳定的纳米结构包括电荷稳定的含氧纳米结构。在另外的方面，电荷稳定的纳米结构为所有或基本上所有电荷稳定的含氧纳米结构，或电荷稳定的含氧纳米结构为电动流体中主要的电荷稳定的含气体纳米结构形式。
根据其它方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构可包括或驻留溶剂化电子，从而提供新的稳定的溶剂化电子载体。在特定方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构提供新型电极(或倒置电极)，这与常规的具有单一有机配位阳离子的溶质电极相反，其具有多个绕空隙或含氧原子的空隙稳定排列的阳离子，其中所排列的钠离子可与水合外层配位，而非与有机分子配位。根据特定方面，溶剂化电子可由水分子的水合外层来容纳，或优选地容纳在分布于所有阳离子上的纳米结构空隙中。在某些方面，本发明的纳米结构提供溶液中的新型″超级电极″结构，其不仅通过提供溶剂化电子在多个阵列的钠阳离子上的分布/稳定，还提供溶剂化电子与空隙中捕获的(多个)氧分子的缔合或部分缔合-溶剂化电子分布在钠原子和至少一个氧原子的阵列上。根据特定方面，因此，作为本发明公开的与本发明的电动流体缔合的″溶剂化电子″在包括被水分子直接水合的常规模型中可能不被溶剂化。或者，与干燥的电极盐相同之处有限，本发明的电动流体中的溶剂化电子可分布在多个电荷稳定的纳米结构上，以提供″格点胶″以稳定水溶液中的高序态阵列。
在特定方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构能够与细胞膜或其组分或蛋白质等发生相互作用以介导生物活性。在特定方面，驻留了溶剂化电子的本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构能够与细胞膜或其组分或蛋白质等发生相互作用以介导生物活性。
在特定方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构作为电荷和/或电荷效应供体(递送)和/或作为电荷和/电荷效应受体与细胞膜或其组分或蛋白质等发生相互作用以介导生物活性。在特定方面，驻留了溶剂化电子的本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构作为电荷和/或电荷效应供体和/或作为电荷和/或电荷效应受体与细胞膜发生相互作用以介导生物活性。
在特定方面，本发明的电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构与所观察到的本发明的电动流体的稳定性和生物特性一致，并且解释了所观察到的本发明的电动流体的稳定性和生物特性，并且进一步提供新型电极(或倒置电极)，所述电极提供水性离子溶液(例如盐水溶液、NaCl等)中稳定的溶剂化电子。
在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包括电荷稳定的含氧纳米泡，呈电荷稳定的含氧纳米泡形式，或产生电荷稳定的含氧纳米泡。在特定方面，电荷稳定的含氧簇提供形成电荷稳定的含氧纳米结构的相对较大的阵列和/或电荷稳定的含氧纳米泡或其阵列。在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构可提供在与疏水表面(参见本文下面实施例25)接触时形成疏水性纳米泡。
在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含至少一个氧分子。在某些方面，电荷稳定的含氧纳米结构基本上包含至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10、至少15个、至少20个、至少50个、至少100个或更多个氧分子。在特定方面，电荷稳定的含氧纳米结构包含或产生约20nm×l.5nm的纳米泡(例如疏水纳米泡)，含有约12个氧分子(例如基于氧分子的尺寸(约0.3nm×0.4nm)，假设为理想气体并应用n＝PV/RT，其中P＝1atm，R＝0.082□057□l.atm/mol.K；T＝295K；V＝pr2h＝4.7×10-22L，其中r＝10×10-9m，h＝1.5×10-9m，且n＝1.95×10-22摩尔)。
在某些方面，流体中存在的氧分子的百分数选自：0.1％、1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％以及大于95％，所述氧分子存在于离子含水流体中具有电荷稳定的构型的纳米结构或其阵列中。优选地，此百分数大于约5％、大于约10％、大于约15％，或大于约20％。在另外的方面，在离子含水流体中具有电荷稳定结构的电荷稳定的含氧纳米结构或其阵列的大致尺寸选自小于下列的尺寸：100nm、90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm、5nm、4nm、3nm、2nm以及1nm。优选地，此尺寸小于约50nm、小于约40nm、小于约30nm、小于约20nm或小于约10nm。
在某些方面，本发明的电动流体包括溶剂化电子。在其它方面，本发明的电动流体包括电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列，其包括下列中的至少一种：溶剂化电子；和独特的电荷分布(极性、对称、非对称电荷分布)。在某些方面，电荷稳定的纳米结构和/或电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列具有顺磁性。
相反，相对于本发明的电动流体，对照压力罐氧合流体(非电动流体)等不包含这种能够调节细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一种的电荷稳定的生物活性纳米结构和/或生物活性的电荷稳定的含氧纳米结构和/或其阵列。
用于制备富含气体的流体的系统
本发明公开的系统和方法允许以高浓度稳定地富集气体(例如氧)而具有最小限度的无源损耗。此系统和方法可有效用于将多种气体以较高的百分比富集到多种流体中。仅举例而言，使用所公开的系统和/或方法，在室温下通常具有约2-3ppm(ppm)的溶解氧的去离子水可达到如下范围内的溶解氧水平：至少约5ppm、至少约10ppm、至少约15ppm、至少约20ppm、至少约25ppm、至少约30ppm、至少约35ppm、至少约40ppm、至少约45ppm、至少约50ppm、至少约55ppm、至少约60ppm、至少约65ppm、至少约70ppm、至少约75ppm、至少约80ppm、至少约85ppm、至少约90ppm、至少约95ppm、至少约100ppm或更高或在它们之间的任何值。根据具体的示例性实施方案，可以产生具有约30-60ppm溶解氧水平的富氧的水。
施用途径和形式
如本文所用，″受试者″可指任何生物，优选地为动物，更优选地为哺乳动物，并且甚至更优选地为人。
在具体的示例性实施方案中，本发明的富含气体的流体可单独作为治疗组合物或与另一种治疗剂组合发挥作用，使得该治疗组合物可防止或缓解至少一种与胰岛素抵抗和/或糖尿病相关的疾病症状。本发明的治疗组合物包括能够被施用给有需要的受试者的组合物。在某些实施方案中，治疗组合物制剂还可包含至少一种选自以下的其它药剂：载体、佐剂、乳化剂、悬浮剂、甜味剂、调味剂、香料和粘合剂。
如本文所用，″药学上可接受的载体″和″载体″通常是指无毒的惰性固体、半固体或液体的填料、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂助剂。可用作药学上可接受的载体的材料的一些非限制性实例为糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可油和栓剂蜡；油类，如花生油、棉籽油、红花油、芝蔴油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，如丙二醇；酯类，如油酸乙酯和十二酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热源的水、等渗盐水、林格溶液、乙醇和磷酸盐缓冲溶液；以及其它非毒性相容的润滑剂，如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁；以及着色剂；释放剂；涂层剂；甜味剂、调味剂和加香剂；并且根据配制者的判断，防腐剂和抗氧化剂也可存在于组合物中。在特定方面，这种载体和赋形剂可以是本发明的富含气体的流体或溶液。
本文所述的药学上可接受的载体例如媒介物(vehicle)、佐剂、赋形剂或稀释剂为本领域熟练技术人员所熟知。通常，药学上可接受的载体对治疗剂具有化学惰性并且在使用的条件下无有害的副作用或毒性。药学上可接受的载体可包括聚合物和聚合物基质、纳米颗粒、微泡等。
除了本发明的治疗性富含气体的流体之外，治疗组合物还可包含惰性稀释剂，如另外的非富含气体的水或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油类(具体而言，棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇和去水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。正如本领域的普通技术人员所理解，具体治疗组合物的新型及改进的制剂、新型富含气体的治疗流体和递送新型富含气体的治疗流体的新型方法可通过用相同、相似或不同的组合物的富含气体的流体代替一种或多种惰性稀释剂而获得。例如，常规的水可以由富含气体的流体代替或补充，所述富含气体的流体是通过将氧混合到水或去离子水中来制备。
在某些实施方案中，本发明的富含气体的流体可与一种或多种治疗剂组合在一起和/或单独使用。在特定实施方案中，并入富含气体的流体可包括用一种或多种富含气体的流体代替一种或多种本领域已知的溶液，所述本领域已知的溶液例如去离子水、盐水溶液等，从而提供用于递送给受试者的改进的治疗组合物。
某些实施方案提供了治疗组合物，所述治疗组合物包含本发明的富含气体的流体、药物组合物或其它治疗剂或其药学上可接受的盐或溶剂化物以及至少一种药物载体或稀释剂。这些药物组合物可用在前述疾病或病症的预防和治疗中以及以上提及的治疗法中。优选地，载体必须是药学上可接受的并且必须与组合物中的其它成分相容，即对组合物中的其它成分无有害影响。载体可为固体或液体，且优选地被配制为单位剂量制剂，例如可包含0.05重量％至95重量％活性成分的片剂。
可能的施用途径包括口服、舌下、口腔、肠胃外(例如皮下、肌内、动脉内、腹膜内、池内、膀胱内、鞘内或静脉内)、直肠、局部(包括经皮、阴道内、眼内(intraoccular)、耳内(intraotical)、鼻内)、吸入以及可植入装置或材料的注射或插入。
施用途径
对于特定受试者的最适合的施用手段将取决于待治疗的疾病或病症的性质和严重度或使用的治疗法的性质，以及治疗组合物或另外的治疗剂的性质。在某些实施方案中，优选的是口服或局部施用。
适于口服施用的制剂可作为离散的单位提供，如片剂、胶囊、扁囊剂、糖浆剂、酏剂、口香糖、″棒糖(lollipop)″制剂、微乳剂、溶液、悬浮液、锭剂或凝胶涂覆的安瓿剂，每种都包含预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒来提供；作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液来提供；或作为水包油或油包水乳剂来提供。
适于经粘膜方法例如通过舌下或口腔施用的制剂包括包含活性化合物和典型的调味基质例如糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的锭剂贴剂、片剂等，以及包含处于惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖阿拉伯胶)中的活性化合物的软锭剂。
适于肠胃外施用的制剂通常包括包含预定浓度的活性的富含气体的流体和可能的另一种治疗剂的无菌水溶液；所述溶液优选地与预期接受者的血液等渗。适于肠胃外施用的另外的制剂包括包含生理学上适合的共溶剂和/或络合剂，如表面活性剂和环糊精的制剂。水包油乳剂也可能适于富含气体的流体的肠胃外施用的制剂。尽管这种溶液优选地由静脉内施用，但其也可通过皮下注射或肌内注射来施用。
适于尿道、直肠或经阴道施用的制剂包括凝胶、乳膏、洗剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、可溶性固体材料、灌洗剂等。所述制剂优选地作为单位剂量栓剂来提供，所述栓剂包含在形成栓剂基质(例如可可油)的一种或多种固体载体中的活性成分。或者，可配制具有本发明的富含气体的流体的结肠清洗液用于结肠或直肠施用。
适于局部、眼内、耳内或鼻内应用的制剂包括软膏、乳膏、糊剂、洗剂、凝胶(如水凝胶)、喷雾剂、可分散的粉末和颗粒、乳剂、使用流动推进剂的喷雾剂或气溶胶剂(如脂质体喷雾剂、滴鼻剂、鼻喷雾剂类)以及油类。适于这种制剂的载体包括石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、醇及其组合。鼻腔递送或鼻内递送可包括计量剂量的任何这些制剂或其它制剂。同样，耳内或眼内可包括滴剂、软膏、冲洗液(irritation fluid)等。
本发明的制剂可通过任何适合的方法制备，通常通过任选地将具有活性化合物的富含气体的流体与液体或细碎的固体载体或二者以需要的比例进行均一地且紧密地混合，然后(如果需要的话)将生成的混合物塑型成所需形状。
例如，片剂可通过对包含活性成分的粉末或颗粒和一种或多种任选的成分例如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性分散剂的紧密混合物进行压制，或通过对粉末状活性成分与本发明的富含气体的流体的紧密混合物进行模制来制备。
适于通过吸入施用的制剂包括可凭借各种类型的计量剂量的加压气溶胶、雾化器或吹入器而产生的细粒粉剂或雾剂。具体而言，治疗剂的粉末或其它化合物可被溶解或悬浮在本发明的富含气体的流体中。
对于经口腔的肺部施用，所述粉末或小滴的粒度通常在0.5-10μM的范围内，优选1-5μM，以确保递送到支气管树中。对于鼻腔施用，在范围10-500μM中的粒度是优选的，以确保驻留在鼻腔中。
计量剂量的吹入器是加压型气溶胶分配器，通常包含在液化推进剂中的治疗剂的悬浮液或溶液制剂。在某些实施方案中，如本文所公开，本发明的富含气体的流体可以除标准的液化推进剂以外一起使用或代替标准的液化推进剂使用。在使用过程中，这些装置通过适合于递送计量体积(通常从10至150μL)的阀排出制剂，以产生包含治疗剂和富含气体的流体的细粒喷雾。合适的推进剂包括某些含氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。
所述制剂可另外包含一种或多种共溶剂，例如乙醇表面活性剂如油酸或去水山梨糖醇三油酸酯；抗氧化剂和合适的调味剂。雾化器是商购装置，该装置凭借压缩的气体(通常为空气或氧)加速通过一个狭窄的文式孔(venturi orifice)或凭借超声搅拌将活性成分的溶液或悬浮液转变为气溶胶雾。供雾化器中使用的合适的制剂由富含气体的流体中的另一种治疗剂组成并且构成该制剂的多达40％w/w，优选地小于20％w/w。此外，可利用其它载体，例如蒸馏水、无菌水或稀释的水性醇溶液，优选地通过加入盐例如氯化钠使它们与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂(特别是如果制剂未被无菌制备时)，并且可包括羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和表面活性剂。
适于通过吹入法施用的制剂包括可凭借吹入器递送或以鼻吸入的方式被摄入鼻腔的细微粉碎的粉末。在吹入器中，粉末被包含在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中，所述胶囊或药筒在原位被刺穿或打开，并且在吸入时粉末由通过该装置抽入的空气递送或凭借手工操作的泵递送。在吹入器中采用的粉末只由活性成分组成或由包括活性成分、合适的粉末稀释剂(例如乳糖)和任选的表面活性剂的粉末共混物组成。活性成分通常包括0.1至100w/w的制剂。
除了以上具体提到的成分之外，本发明的制剂还包括本领域的技术人员已知的其它剂，同时考虑到组织中的制剂类型。例如，适合于口服施用的制剂可包括调味剂，并且适合于鼻内施用的制剂可包括香料。
本发明的治疗组合物可通过可用于与药物一起使用的任何常规方法进行施用，作为单独的治疗剂或者治疗剂的组合。
当然，所施用的剂量将根据己知的因素而改变，所述因素例如具体药剂的药效学特点及其施用方式和途径；接受者的年龄、健康和重量；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗的频度；和期望的效果。活性成分的每日剂量可预期为每千克(kg)体重约0.001至1000毫克(mg)，其中优选的剂量为0.1至约30mg/kg。
剂型(适于施用的组合物)包含每单位约1mg至约500mg的活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以基于组合物的总重量的约0.5-95重量％的量存在。
软膏、糊剂、泡沫、包含体、乳膏和凝胶也可以包含赋形剂，例如淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、硅、膨润土、硅酸和滑石或其混合物。粉末和喷雾剂也可以包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝和硅酸钙，或这些物质的混合物。可通过制造气溶胶药物常规使用的任何已知手段将纳米晶体抗微生物金属的溶液转换成气溶胶或喷雾。一般而言，这种方法包括加压或提供一种工具，该工具通常用惰性载体气体对溶液的容器进行加压并使该加压的气体通过一个小孔。喷雾剂可另外地包含常规推进剂，例如氮气、二氧化碳及其它惰性气体。此外，可将微球或纳米颗粒与本发明的富含气体的治疗组合物或流体以施用该治疗化合物给受试者所需要的任何途径一起利用。
注射用制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器例如安瓿和管形瓶中，并且可被储存在仅需要在立即使用前添加无菌液体赋形剂或富含气体的流体的冷冻干燥的(冻干)的条件下。临时性注射溶液和悬浮液可由无菌的粉末、颗粒和片剂制备。注射性组合物用的有效的药物载体的需求为本领域的普通技术人员所熟知。参见例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，Banker和Chalmers编，238-250(1982)；和ASHP Handbook onInjectable Drugs(注射药物的ASHP手册)，Toissel，第四版，622-630(1986)。
适于局部施用的制剂包括包含本发明的富含气体的流体和任选的另外的治疗剂和调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)的锭剂；包含富含气体的流体和处于惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中的任选的另外的治疗剂的软锭剂；和包含富含气体的流体和处于合适的液体载体中的任选的另外的治疗剂的漱口剂或口腔漱洗剂；以及乳膏、乳剂、凝胶剂等。
另外，适于直肠施用的制剂可通过与各种基质例如乳化基质或水溶性基质相混合作为栓剂而提供。适于阴道施用的制剂可作为阴道栓剂、止血栓、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂配方而提供，其除了活性成分以外还包含本领域已知的合适的这种载体。
合适的药物载体描述于该领域的一本标准参考教科书Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company。
施用给受试者(特别是哺乳动物，特别是人)的剂量在本发明的背景中应该足以经合理的时段在动物中实现治疗反应。本领域的技术人员将认识到剂量将取决于各种因素，包括动物的状态、动物的体重以及待治疗的病症。合适的剂量是在受试者中产生己知实现期望的反应的治疗组合物的浓度。
剂量的大小还将由施用的途径、计时和频率以及可能伴随治疗组合物的施用和期望的生理学效应的任何不利的副作用的存在、性质和程度决定。
对于特定受试者的最适合的施用手段将取决于待治疗的疾病或病症的性质和严重度或使用的治疗法的性质，以及治疗组合物或另外的治疗剂的性质。在某些实施方案中，优选的是口服或局部施用。
适于口服施用的制剂可作为离散的单位提供，如片剂、胶囊、扁囊剂、糖浆剂、酏剂、口香糖、″棒糖(lollipop)″制剂、微乳剂、溶液、悬浮液、锭剂或凝胶涂覆的安瓿剂，每种都包含预定量的活性化合物；作为粉末或颗粒来提供；作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液来提供；或作为水包油或油包水乳剂来提供。
可提供适于口服施用的另外的制剂，其包括可凭借各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器、雾化器或吹入器而产生的细粒粉剂或雾剂。具体而言，治疗剂的粉末或其它化合物可被溶解或悬浮在本发明的富含气体的流体中。
适于经粘膜方法例如通过舌下或口腔施用的制剂包括包含活性化合物和典型的调味基质例如糖和阿拉伯胶或黄蓍胶的锭剂贴剂、片剂等，以及包含处于惰性基质(例如明胶和甘油或蔗糖阿拉伯胶)中的活性化合物的软锭剂。
适于肠胃外施用的制剂通常包括包含预定浓度的活性的富含气体的流体和可能的另一种治疗剂的无菌水溶液；所述溶液优选地与预期接受者的血液等渗。适于肠胃外施用的另外的制剂包括包含生理学上适合的共溶剂和/或络合剂(如表面活性剂和环糊精)的制剂。水包油乳剂也可能适于富含气体的流体的肠胃外施用的制剂。尽管这种溶液优选地由静脉内施用，但其也可通过皮下注射或肌内注射来施用。
适于尿道、直肠或经阴道施用的制剂包括凝胶、乳膏、洗剂、水性或油性悬浮液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、可溶性固体材料、灌洗剂等。所述制剂优选地作为单位剂量栓剂来提供，所述栓剂包含在形成栓剂基质(例如可可油)的一种或多种固体载体中的活性成分。或者，可配制具有本发明的富含气体的流体的结肠清洗液用于结肠或直肠施用。
适于局部、眼内、耳内或鼻内应用的制剂包括软膏、乳膏、糊剂、洗剂、凝胶(如水凝胶)、喷雾剂、可分散的粉末和颗粒、乳剂、使用流动推进剂的喷雾剂或气溶胶剂(如脂质体喷雾剂、滴鼻剂、鼻喷雾剂类)以及油类。适于这种制剂的载体包括石油凝胶、羊毛脂、聚乙二醇、醇及其组合。鼻腔递送或鼻内递送可包括计量剂量的任何这些制剂或其它制剂。同样，耳内或眼内可包括滴剂、软膏、冲洗液等。
本发明的制剂可通过任何适合的方法制备，通常通过任选地将具有活性化合物的富含气体的流体与液体或细碎的固体载体或二者以需要的比例进行均一地且紧密地混合，然后(如果需要的话)将生成的混合物塑型成所需形状。
例如，片剂可通过对包含活性成分的粉末或颗粒和一种或多种任选的成分例如粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂或表面活性分散剂的紧密混合物进行压制，或通过对粉末状活性成分与本发明的富含气体的流体的紧密混合物进行模制来制备。
适于通过吸入施用的制剂包括可凭借各种类型的计量剂量的加压气溶胶、喷雾器、雾化器或吹入器而产生的细粒粉剂或雾剂。具体而言，治疗剂的粉末或其它化合物可被溶解或悬浮在本发明的富含气体的流体中。
对于经口腔的肺部施用，所述粉末或小滴的粒度通常在0.5-10μM的范围内，优选1-5uM，以确保递送到支气管树中。对于鼻腔施用，在范围10-500μM中的粒度是优选的，以确保驻留在鼻腔中。
计量剂量的吹入器是加压型气溶胶分配器，通常包含在液化推进剂中的治疗剂的悬浮液或溶液制剂。在某些实施方案中，如本文所公开，本发明的富含气体的流体可以除标准的液化推进剂以外一起使用或代替标准的液化推进剂使用。在使用过程中，这些装置通过适合于递送计量体积(通常从10至150μL)的阀排出制剂，以产生包含治疗剂和富含气体的流体的细粒喷雾。合适的推进剂包括某些含氯氟烃化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷及其混合物。
所述制剂可另外包含一种或多种共溶剂，例如乙醇表面活性剂如油酸或去水山梨糖醇三油酸酯；抗氧化剂和合适的调味剂。雾化器是商购装置，该装置凭借压缩的气体(通常为空气或氧)加速通过一个狭窄的文式孔(venturi orifice)或凭借超声搅拌将活性成分的溶液或悬浮液转变为气溶胶雾。供雾化器中使用的合适的制剂由富含气体的流体中的另一种治疗剂组成并且构成该制剂的多达40％w/w，优选地小于20％w/w。此外，可利用其它载体，例如蒸馏水、无菌水或稀释的水性醇溶液，优选地通过加入盐例如氯化钠使它们与体液等渗。任选的添加剂包括防腐剂(特别是如果制剂未被无菌制备时)，并且可包括羟基苯甲酸甲酯、抗氧化剂、调味剂、挥发性油、缓冲剂和表面活性剂。
适于通过吹入法施用的制剂包括可凭借吹入器递送或以鼻吸入的方式被摄入鼻腔的细微粉碎的粉末。在吹入器中，粉末被包含在通常由明胶或塑料制成的胶囊或药筒中，所述胶囊或药筒在原位被刺穿或打开，并且在吸入时粉末由通过该装置抽入的空气递送或凭借手工操作的泵递送。在吹入器中采用的粉末只由活性成分组成或由包括活性成分、合适的粉末稀释剂(例如乳糖)和任选的表面活性剂的粉末共混物组成。活性成分通常包括0.1至100w/w的制剂。
除了以上具体提到的成分之外，本发明的制剂还包括本领域的技术人员已知的其它剂，同时考虑到组织中的制剂类型。例如，适合于口服施用的制剂可包括调味剂，并且适合于鼻内施用的制剂可包括香料。
本发明的治疗组合物可通过可用于与药物一起使用的任何常规方法进行施用，作为单独的治疗剂或者治疗剂的组合。
当然，所施用的剂量将根据己知的因素而改变，所述因素例如具体药剂的药效学特点及其施用方式和途径；接受者的年龄、健康和重量；症状的性质和程度；并行治疗的种类；治疗的频率；和期望的效果。活性成分的每日剂量可预期为每千克(kg)体重约0.001至1000毫克(mg)，其中优选的剂量为0.1至约30mg/kg。根据某些方面，活性成分的每日剂量可为.001升至10升，其中优选的剂量为约.01升至1升。
剂型(适于施用的组合物)包含每单位约1mg至约500mg的活性成分。在这些药物组合物中，活性成分将通常以基于组合物的总重量的约0.5-95重量％的量存在。
软膏、糊剂、泡沫、包含体、乳膏和凝胶也可以包含赋形剂，例如淀粉、黄蓍胶、纤维素衍生物、硅、膨润土、硅酸和滑石或其混合物。粉末和喷雾剂也可以包含赋形剂，例如乳糖、滑石、硅酸、氢氧化铝和硅酸钙，或这些物质的混合物。可通过制造气溶胶药物常规使用的任何已知手段将纳米晶体抗微生物金属的溶液转换成气溶胶或喷雾。一般而言，这种方法包括加压或提供一种工具，该工具通常用惰性载体气体对溶液的容器进行加压并使该加压的气体通过一个小孔。喷雾剂可另外地包含常规推进剂，例如氮气、二氧化碳及其它惰性气体。此外，可将微球或纳米颗粒与本发明的富含气体的治疗组合物或流体以施用该治疗化合物给受试者所需要的任何途径一起利用。
注射用制剂可存在于单位剂量或多剂量密封的容器例如安瓿和管形瓶中，并且可被储存在仅需要在立即使用前添加无菌液体赋形剂或富含气体的流体的冷冻干燥的(冻干)的条件下。临时性注射溶液和悬浮液可由无菌的粉末、颗粒和片剂制备。注射性组合物用的有效的药物载体的需求为本领域的普通技术人员所熟知。参见例如Pharmaceutics and Pharmacy Practice，J.B.Lippincott Co.，Philadelphia，Pa.，Banker和Chalmers编，238-250(1982)；和ASHP Handbook onInjectable Drugs(注射药物的ASHP手册)，Toissel，第四版，622-630(1986)。
适于局部施用的制剂包括包含本发明的富含气体的流体和任选的另外的治疗剂和调味剂(通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)的锭剂；包含富含气体的流体和处于惰性基质(例如明胶和甘油、或蔗糖和阿拉伯胶)中的任选的另外的治疗剂的软锭剂；和包含富含气体的流体和处于合适的液体载体中的任选的另外的治疗剂的漱口剂或口腔漱洗剂；以及乳膏、乳剂、凝胶剂等。
另外，适于直肠施用的制剂可通过与各种基质例如乳化基质或水溶性基质相混合作为栓剂而提供。适于阴道施用的制剂可作为阴道栓剂、止血栓、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫或喷雾剂配方而提供，其除了活性成分以外还包含本领域已知的合适的这种载体。
合适的药物载体描述于该领域的一本标准参考教科书Remington′s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing Company。
施用给受试者(特别是哺乳动物，特别是人)的剂量在本发明的背景中应该足以经合理的时段在动物中实现治疗反应。本领域的技术人员将认识到剂量将取决于各种因素，包括动物的状态、动物的体重以及待治疗的病症。合适的剂量是在受试者中产生己知实现期望的反应的治疗组合物的浓度。
剂量的大小还将由施用的途径、计时和频率以及可能伴随治疗组合物的施用和期望的生理学效应的任何不利的副作用的存在、性质和程度决定。
应理解的是可以进行组合化合物的施用：(1)以处于共制剂中的化合物的组合同时施用或(2)交替地施用，即连续地、相继地、平行地或同时地以独立的药物制剂递送化合物。在交替疗法中，例如，在施用第二种、任选地第三种活性成分时的延迟不应丧失活性成分的组合的协同疗效的益处。根据利用(1)或(2)施用方法的特定实施方案，该组合理想地应使施用达到最有效的结果。在利用(1)或(2)施用方法的某些实施方案中，该组合理想地应使施用达到每种活性成分的血浆峰值浓度。通过施用组合的共制剂的每天一次一丸的方案对于一些患有炎性神经变性疾病的患者可能是可行的。根据某些实施方案，该组合的活性成分的有效血浆峰值浓度范围为大约0.001至100μM。最佳的血浆峰值浓度可通过为具体患者所开的制剂和剂量方案来实现。还应当埋解的是，本发明的流体和乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醌和/或那他珠单抗或其任何的生理学功能性衍生物，不论同时或相继地提供，均可单独施用、多次施用或其任意组合。一般而言，在交替疗法(2)期间，连续地施用有效剂量的每种化合物，而在共制剂疗法(1)中，一同施用有效剂量的两种或多种化合物。
本发明的组合可方便地提供为单位剂型中的药物制剂。方便的单位剂型包括每个单一剂型1mg至1g范围内任何量的活性成分，例如但不限于10mg至300mg。本发明的流体与乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醒和/或那他珠单抗组合的协同效应可在广泛比例范围内实现，例如1∶50至50∶1(本发明流体：乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醒和/或那他珠单抗)。在一个实施方案中，该比例可在约1∶10至10∶1的范围内。在另一实施方案中，在共同配制组合剂型(例如丸剂、片剂、囊片或胶囊)中，本发明流体与乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醌和/或那他珠单抗的重量/重量比为约1，即本发明流体与乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醌和/或那他珠单抗的量大约相等。在其它示例性的共制剂中，可存在或多或少的本发明流体与乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醌和/或那他珠单抗。在一种实施方案中，每种化合物将以当单独使用时展示抗炎活性时的量在组合中使用。所述组合的化合物的其它比例和量包括在本发明的范围内。
单一剂型可进一步包括本发明的流体和乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醌和/或那他珠单抗或它们任一种的生理学功能性衍生物和药学上可接受的载体。
本领域技术人员将会理解的是，需要用于治疗的本发明的组合中活性成分的量根据各种因素而变化，这些因素包括待治疗的病症的性质和患者的年龄和状况，并且最后由主治医师或保健医生来判断。待考虑的因素包括施用途径、制剂的性质、动物的体重、年龄和一般状况以及待治疗的病症的性质和严重程度。
也可将单一剂型中活性成分中的任何两种组合用于与第三种活性成分同时或相继地施用。三组分组合可同时或相继地施用。当相继地施用时，该组合可分两次或三次施用。根据某些实施方案，本发明的流体和乙酸格拉默、干扰素β、米托蒽醌和/或那他珠单抗的三个部分组合可以任何顺序施用。
以下实施例仅是旨在说明而不以任何方式进行限制。
实施例
实施例1
溶解氧稳定性
如图30中所示，示出各封盖且储存在华氏65度下的500ml薄壁塑料瓶和1000ml玻璃瓶中的溶解氧水平。
可以看出当塑料瓶在装瓶后约65天打开时，水中的溶解氧水平为约27.5ppm。当第二个瓶子在装瓶后约95天打开时，溶解氧水平为约25ppm。同样，对于玻璃瓶，溶解氧水平在第65天时为约40ppm，并且在第95天时为约41ppm。因此，该图表明当使用所述系统和方法将氧扩散到流体中时，在塑料瓶和玻璃瓶两者中的溶解氧水平在华氏65度下均保持相对高的比例。
实施例2
平衡盐溶液中的衰减的氧含量
图33示出500ml平衡盐溶液的溶解氧保留，该平衡盐溶液最初具有5ppm的溶解氧水平。在标准温度和压力下，用本发明的扩散器富集溶液后，溶解氧水平为约41ppm。将溶液保持在琥珀色玻璃瓶。1小时后，溶解氧水平为40ppm；2小时后为36ppm；3小时后为34ppm；约4.5小时后为略高于30ppm。快到6小时进行最终测量，此时溶解氧水平为约28ppm。
实施例3
微泡尺寸
通过使用本发明的扩散器用富含气体的流体进行实验，以测定气体微泡的尺寸限值。通过使富含气体的流体通过0.22微米和0.1微米过滤器来确定微泡的尺寸限值。在进行这些测试中，使大量流体通过本发明的扩散器并产生富含气体的流体。将60毫升此流体抽入60ml注射器中。然后通过温克勒尔滴定测量注射器中流体的溶解氧水平。通过0.22微米Millipore Millex GP50过滤器将注射器内的流体注入50ml烧杯中。然后测量50ml烧杯中的物质的溶解氧比例。将该实验进行三次以得到下表6中示出的结果。
表6：溶解氧
Figure BDA0000102298890001051
可以看出通过将扩散的物质通过0.22微米过滤器并未显著改变注射器内测量的溶解氧水平和在50ml烧杯内测量的溶解氧水平，这暗示流体内的溶解气体的微泡不大于0.22微米。
进行第二项测试，其中用本发明的扩散器富集一组盐水溶液并且以未过滤状态收集输出溶液样本。未过滤样本的溶解氧水平是44.7ppm。使用0.1微米的过滤器过滤来自本发明的扩散器的富氧溶液并且取另外两份样本。对于第一份样本，溶解氧水平为43.4ppm。对于第二份样本，溶解氧水平为41.4ppm。移除过滤器，并且从未过滤的溶液中取最后样本。在这种情况下，最后样本具有45.4ppm的溶解氧水平。这些结果与使用Millipore 0.22微米过滤器的结果是一致的。因此，盐水溶液中大部分的气泡或微泡的尺寸约小于0.1微米。
实施例4
喷射效应
图34和图35示出本发明的扩散器对通过的流体的喷射效果。富氧水的喷射在标准的温度和压力下于8加仑的罐中进行。如所示，开始的富氧水具有约42ppm的溶解氧水平。通过扩散器流动2分钟后，用氮气喷射富氧水，使得使此后的溶解氧水平略高于20ppm。在第6分钟，溶解氧水平为约6ppm。在该过程开始后约14分钟后，富氧水的溶解氧水平达到略高于零(0)的最低值。这些图示出氮气可以扩散到水中以从水中喷射氧的方法。然而，可以在任何流体内使用任何气体来将一种气体从另一种中进行喷射，并将该另一种气体扩散到流体中。该实验可以利用任何主流体物质和任何流体输注物。
实施例5
瑞利效应
通过本文所述的扩散器装置处理的流体与正常的未处埋的水相比时，表现出水结构的差异。已显示本文所公开的实施方案所制备的富含气体的水与未处理的水相比具有更多的瑞利散射。
在所进行的实验中，制备富含气体的水样本和不富含气体的水样本并将其送去进行光学分析。这些测试的目的是测定在正常的(末处理的)去离子水与通过本发明的扩散器装置富集的水之间是否存在任何总的光学差异。
将两种样本编码以保密其身份，只在完成测试后才标示样本。根据图37A所示的图将两种样本置于633纳米的激光束中。根据本文所公开的某些实施方案为富含气体的流体的样本B表现出散射光，这与其相对于激光源的位置无关。将样本B流体在玻璃瓶中密封约1周。开瓶后2至3小时后，散射效应消失。因此，富含气体的流体结构与末处理的流体的结构在光学上是不同的。光学效应并不直接与溶解氧水平相关，因为开始的溶解氧水平为约45ppm，并且实验结束时评估的溶解氧水平为约32ppm。结果在图37B中示出。
实施例6
溶剂化电子的产生
其它证据也已表明本发明的扩散器装置所产生的富集过程形成富含气体的流体内的溶剂化电子。由于极谱溶解氧探针的结果，据信扩散的流体表现出电子俘获效应，因此流体在富含气体的材料内可以包括溶剂化电子。
存在两种用电学方法测量溶解氧水平的基本技术：电镀测量技术和极谱测量法。每种方法使用一个电极系统，其中被测试的溶液内的溶解氧水平与该探针的阴极反应以产生电流。溶解氧水平传感器由两个电极组成，一个阳极和一个阴极，所述阳极和阴极均浸入传感器主体内的电解质中。氧可渗透的膜将阳极和阴极与被测试的溶液分隔开。氧在整个膜上扩散并且与探针的内部组分相互作用以产生电流。阴极是氢电极并且相对于阳极携带负电位。电解质溶液包围电极对并且被膜包含。当没有氧存在时，阴极被氢极化并阻抗电流的流动。当氧通过膜时，阴极去极化并且电子被消耗。阴极根据以下等式将氧电化学还原成羟基离子：
O2+2H2O＝4E-＝4OH-
当对根据本发明的系统的富含气体的溶液的溶解氧水平进行测量时，反复经历溢出状态，其中溶解氧测量仪显示出比该测量仪能够读出的更高的读数。然而，通过温克勒尔滴定对富含气体的溶液的评估表明该溶液的溶解氧(DO)水平比通过探针指示的更低。通常，DO探针(例如在这些实验中使用的Orion 862)具有60ppm的最大读数。然而，当将该测量仪放在本发明的富含气体的水中时，其会溢出。
不期望受任何具体的作用机制约束，该测量仪的机制在氧发生反应处响应电子。然而，根据电子自旋共振，在流体中不存在游离的离子。因此，流体可能包含由也存在于该流体中的氧形式稳定的溶剂化电子。
实施例7
体外伤口愈合
针对培养的人表皮角质形成细胞愈合伤口的能力测试了富含气体的流体(用氧富集)的作用。
从新生儿包皮中分离人表皮角质形成细胞，新生儿包皮是从常规的包皮环切术获得的并且经过去标识。将包皮在PBS中洗涤两次，并在2.4U/mL分散酶II中培育以将真皮与表皮分离。将表皮用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA培育，用大豆胰蛋白酶抑制剂中和，搅拌并通过70um筛以分离细胞。接着，将细胞悬液离心并在补充有下列物质的细胞培养基(M154)中再悬浮：0.07mM CaCl2和人角质形成细胞生长补充物(0.2％氢化可的松、0.2ng/mL人表皮生长因子)以及青霉素/链霉素、两性霉素抗生素混合物。将角质形成细胞悬液涂布在未涂覆的12孔培养皿中并在24小时后更换培养基，并且开始接种后每48小时更换培养基。
达到细胞汇合后，用无菌的p1000移液管头进行线性刮擦，产生均匀的无细胞伤口。用Dulbecco’s PBS洗涤单层几次，以移除任何的细胞碎片。然后在下列培养基中培育受伤的单层：i)完全生长培养基(如此实施例中上面所述)；ii)用无氧的剪切型(sheared)盐水(使用所公开的扩散器装置处理但不添加气体的对照流体)1∶1稀释的完全生长培养基；以及iii)用富氧盐水1∶1稀释的完全生长培养基。每个研究均重复三次。
培育前，用各培养基填充孔，并通过将25×25mM玻璃盖玻片置于各孔上方来密封孔。伤口后6、12、24和48小时，进行氧测量，并对培养物照相。
在伤口后6小时，盐水中和富含气体的培养基中的伤口边缘均比培养基对照中的那些更皱褶，所述培养基对照用本文所公开的扩散器装置处理过但未添加气体。在伤口后12小时，在所有三种培养基中的伤口边缘似乎均不平整，其中沿边界处的角质形成细胞向着伤口中心迁移。迁移的角质形成细胞的定量表明角质形成细胞迁移在盐水和富含气体的培养基中水平基本上相同。实验结果在图40A和44B中示出。
实施例8
改善的伤口愈合
进行研究以测定暴露于根据本文所公开的实施方案处理的富氧盐水溶液的伤口的改善的愈合特征。在此实验中，将绷带置于猪皮肤切除的活组织检查伤口上。将绷带浸泡在富氧盐水溶液或将对照组的绷带浸泡在非富氧盐水溶液中。微观上，研究评估了几种因素，包括：1)表皮形成；2)新血管形成；3)表皮分化；4)肥大细胞迁移；和5)有丝分裂。
从外表上看，伤口似乎以不同的速率愈合。用富氧盐水溶液处理的伤口显示在第4天至第11天伤口愈合增加。然而，两种伤口似乎在基本上相同的时间完全愈合。研究显示，在第3天和第11天之问，用富氧盐水溶液处理的伤口中新表皮迁移速度为用生理盐水溶液处理的伤口的表皮迁移速度的2至4倍。该研究还显示在第15天与第22天之间，用富氧盐水溶液处理的伤口以较快的速率分化，正如通过较早地形成较成熟的表皮层所证明。在所有阶段，在用富氧盐水溶液处理的伤口内没有出现与正常愈合相伴随的表皮中所出现的增厚。
不受任何具体理论的约束，据信富氧盐水溶液可以增加伤口内NO的局部水平。NO在伤口愈合中调节生长因子、胶原沉积、炎症、肥大细胞迁移、表皮增厚和新血管形成。此外，NO是由受氧调节的诱导型酶产生的。
因此，尽管不期望受具体理论的约束，本发明的富含气体的流体可以刺激NO产生，这与这些实验中所看到的伤口愈合效果谱一致。
愈合的猪表皮在富氧盐水组中在第15天至第22天经历了较早的分化。在肥大细胞迁移的情况下，富氧溶液的早期迁移和晚期迁移也出现差异。由于染色困难，有丝分裂水平的结论性结果尚不能确定。
现在参考图41A至41F，各示图比较了存在或不存在富氧盐水溶液的猪表皮组织的伤口愈合结果。因此，在第1、4和16天进行了对照伤口和使用富氧盐水溶液的伤口的愈合观察。图41A示出第1天对照伤口的伤口愈合。可以看出，伤口显示出表皮/真皮增厚和轮廓消失。图41B示出第1天使用富氧盐水溶液处理的伤口的伤口愈合。伤口显示出通常在新伤口上正常的表皮/真皮厚度和正常的轮廓。
现在参考图41C和41D，示出第4天对照伤口的伤口愈合和第4天用富氧盐水溶液处理的伤口的伤口愈合。对于图41C中所示的对照伤口，伤口显示出600微米的表皮突出物。在图41D中用富氧盐水溶液处理的伤口中，示出1200微米的表皮突出物。因此，在实验的前4天，使用富氧盐水溶液处理的伤口中产生的表皮突出物显示出为未用富氧盐水溶液处理的伤口两倍的表皮生长速率。
现参考图41E，示出第16天的对照伤口。该伤口与图41F中所示的用富氧盐水溶液处理的伤口所示出的相比，显示出具有表皮/真皮轮廓消失的较低分化的表皮。图41F在伤口中显示出更加分化的表皮和更正常的表皮/真皮轮廓。
因此，关于图41A至41F所示，用富氧盐水溶液处理的伤口显示出比未处理的伤口更好的愈合特征，并且显示出具有更正常的表皮/真皮轮廓的更加分化的表皮。
实施例9
谷胱甘肽过氧化物酶研究
通过使用标准测定法(Sigma)测试与谷胱甘肽过氧化物酶的反应性来测试本发明的富氧流体的过氧化氢的存在。通过加入该酶混合物并颠倒来测试水样本。在A340nm和室温(25摄氏度)下进行连续的分光率测定。所测试的样本为：1)去离子水(阴性对照)；2)低浓度的本发明富氧流体；3)高浓度的本发明富氧流体，4)过氧化氢(阳性对照)。过氧化氢阳性对照显示出强反应性，而所测试的其它流体均未与谷胱甘肽过氧化物酶反应。
实施例10
(电动产生的超氧合流体和Solas显示在本领域认可的人支气管收缩的动物模型(人哮喘模型)中提供了与沙丁胺醇的体内协同延长效应(例如支气管收缩的抑制))
实验1：
在开始的实验中，评估十六只豚鼠中支气管扩张剂对呼吸道功能连同乙酰甲胆碱诱导的支气管收缩的影响。在确定最佳给药后，以50μg/mL对每只动物进行给药以递送每只动物在250μL中的12.5μg的硫酸沙丁胺醇的靶剂量。
该研究是重量和基线PenH值的随机区组设计。两个组(A和B)接受了一种或两种稀释剂中的250μL的50μg/mL硫酸沙丁胺醇的气管内灌注：组A是已通过本发明装置、未添加氧的去离子水；而组B是本发明的富含气体的水。使用Penn Century微型喷雾器以溶液对每组进行气管内给药。此外，使动物分批通过BUXCO体积描记设备以便在供给该体积描记器和该记录设备的喷雾器内同等地代表每个治疗组。
在沙丁胺醇施用后2小时显示其基线PenH值的至少75％的动物不包括在数据分析中。此排除标准是基于过去的研究，其中未能观察到支气管扩张剂的支气管保护可能与给药错误有关。作为结果，将对照组的一只动物从数据分析中除去。
一旦动物的支气管收缩超过50％，则认为该动物未受到保护。如以下表7中所列出的那样，组B动物的50(阴影的)受保护免于支气管收缩达10小时(在这个时间终止测试)。
表7：用乙酰甲胆碱激发所测量的支气管收缩保护。
组A
按动物编号的支气管收缩保护百分比
组B
按动物编号的支气管收缩保护百分比
Figure BDA0000102298890001122
Figure BDA0000102298890001131
实验2：在雄性Hartley豚鼠中用硫酸沙丁胺醇进行了RDC1676的支气管收缩评估。
使用更大数目的动物进行另外一组实验来评估本发明的电动产生的流体(例如，RDC1676-00、RDC1676-01、RDC1676-02和RDC1676-03)在雄性豚鼠中单独施用或作为硫酸沙丁胺醇的稀释剂时针对乙酰甲胆碱诱导的支气管收缩的保护作用。
材料：
豚鼠(Cavia porcellus)为得自Charles River Canada Inc.(St.Constant，Quebec，Canada)的Hartley白化病种Crl：(HA)BR。重量：在治疗的开始为大约325±50g。组的数目为32，其中每组7只雄性动物(加上来自同一批次动物的24只备用动物)。饮食：除了在指定的程序期间以外所有动物自由享用标准的检定合格的颗粒状商品化实验室饮食(PMI检定合格的豚鼠5026；PMI Nutrition International Inc.)。
方法：
施用途径是通过Penn Century微型喷雾器的气管内灌注和通过全身吸入的乙酰甲胆碱的激发。选择气管内途径以对测试物品/对照溶液的肺部暴露最大化。己选择全身吸入激发用于乙酰甲胆碱的激发，以激起上气道超敏反应(即支气管收缩)。
治疗的持续时间为一天。
表8示出实验设计。在TA/对照施用后2小时，使所有动物经历乙酰甲胆碱(500μg/ml)的吸入接触。所有动物均接受250μl剂量体积。因此，将硫酸沙丁胺醇稀释(在对照物品和4个测试物品中)至0、25、50和100g/ml的浓度。
在给药前二十分钟，在这四种测试物品溶液(RDC1676-00、RDC1676-01、RDC1676-02和RDC1676-03)的每一种中在l Ox储备液(500μg/mL)中配制4种不同浓度的硫酸沙丁胺醇的溶液(0、25、50和100g/ml)。硫酸沙丁胺醇的这些浓度也被配制在非电动产生的对照流体(对照1)中。通过对每种储备溶液进行适当稀释来制备给药溶液。所有储备液和给药溶液一旦制备即被保持在冰上。在制作测试/对照物品之后一小时内完成给药。在给药当天制备乙酰甲胆碱的溶液(500μg/ml)。
使用Penn Century微型喷雾器使每只动物接受测试物品或对照物品的气管内灌注。对动物整夜禁食并使用异氟烷麻醉，借助喉镜(或合适的替代物)使喉可见，并且将微型喷雾器的尖端插入到气管中。施用250μL/动物的剂量体积的测试物品或对照。
使用补充来自Buxco bias流泵的空气的aeroneb超声喷雾器使乙酰甲胆碱气溶胶产生进入到混合室的空气入口中。此混合室又供给四个单独的全身无限制的体积描记器，每个运行在依靠位于排气线中的门阀而保持的微小的负压下。使用真空泵来以所需的流速抽空吸入室。
在该研究的主要阶段开始之前，将12只备用动物分配成3组(n＝4/组)，以确定动物可能暴露于乙酰甲胆碱以引导严重的但非致命的急性支气管收缩的最大暴露时间。将四只动物暴露于乙酰甲胆碱(500μg/mL)中30秒，并且在气溶胶开始后测量呼吸参数达10分钟。适当地调整乙酰甲胆碱喷雾器浓度和/或气溶胶化的暴露时间以诱导严重的但非致命的急性/可逆的支气管收缩，如通过阴茎中的瞬时提高所表征。
在测试物品施用之前一次(-1天)并且在给药后2、6、10、14、18、22和26小时再次将动物放在所述室中，并且在针对乙酰甲胆碱的气溶胶激发开始后使用Buxco Electronics BioSystem XA系统测量通气参数(潮气量、呼吸速率、导出的分钟量)和增强暂停Penh持续10分钟的时间。一旦动物在室的基线之内，则将些值记录1分钟，然后将乙酰甲胆碱、500μg/mL的喷雾器浓度气溶胶化30秒，将动物在气溶胶中暴露另外10分钟，在此期间连续地评定通气参数。将Penh用作支气管收缩的指标；Penh是从最大吸气流量、最大呼气流量和呼气时间获得的导出值。Penh＝(最大呼气流量/最大吸气流量)*(呼气时间/呼出65％的呼气量的时间-1)。
在给药前的乙酰甲胆碱激发过程中未显示严重的急性支气管收缩的动物被替换。在给药后2小时显示基线PenhPenes值的至少75％的任何动物不包括在数据分析中。以20秒的方式记录呼吸参数。
由进一步分析排除被认为是非生理学的数据。
对经15分钟时间段的Penh改变进行作图，并且将Penh值表达为曲线下的面积。对数字数据进行组平均值和标准偏差的计算(当适用时)。
表8。实验设计；每组7雄性豚鼠。
Figure BDA0000102298890001151
结果：
如图107A-D所示，在不存在沙丁胺醇的情况下，当经26小时时段测量时，本发明的电动产生的流体的施用对基线Penh值的平均百分比无明显影响。
然而意外的是，如图108A-D所示，在本发明的电动产生的流体(在测试的所有氧水平的值；环境的(图108-A)、20ppm(图108-B)、40ppm(图108-C)和60ppm(图108-D))中配制的沙丁胺醇的施用(示出25μg沙丁胺醇/动物的各组的代表数据)与对照流体相比导致沙丁胺醇的抗支气管收缩效应的惊人的延长。即，乙酰甲胆碱结果显示沙丁胺醇延长支气管扩张达至少26小时。图108A-D示出在RDC1676与生理盐水对照之间在所有的氧水平存在一致的差异。结合所有的4种RDC1676流体，总的治疗与生理盐水的差异的p值是为0.03。
因此，根据本发明的特定方面，本发明的电动产生的溶液提供了与沙丁胺醇的协同延长效应，因此使患者的沙丁胺醇用量减少，从而实现了更有效的高性价比的药物使用、更小的副作用，并且增加了可对患者进行治疗且响应于沙丁胺醇的治疗所经过的时段。
实施例11
细胞因子分布
从单个健康的志愿者供体获得混合的淋巴细胞。按去除血小板的标准程序洗涤血沉棕黄层样本。将淋巴细胞以每板2×106个的浓度在用本发明的富含气体的流体或蒸馏水(对照)稀释的RPMI培养基(+50mM HEPES)中铺板。细胞用1微克/毫升T3抗原或1微克/毫升植物凝集素(PHA)(全T细胞活化剂)刺激，或不刺激细胞(阴性对照)。在24小时培育后，检查细胞的存活力，提取并冷冻上清液。
将上清液解冻、离心并使用
Figure BDA0000102298890001161
(Luminex)bead lite方案和平台测试细胞因子的表达。显著地，在具有T3抗原的本发明的富含气体的培养基中的IFN-γ水平高于具有T3抗原的对照培养基，而在具有T3抗原的本发明的富含气体的培养基中的IL-8水平则低于具有T3抗原的对照培养基。此外，在具有PHA的本发明的富含气体的培养基中IL-6、IL-8和TNF-α水平低于具有PHA的对照培养基，而具有PHA的本发明的富含气体的流体中的IL-1b水平与具有PHA的对照培养基相比时则较低。在单独的本发明的富含气体的培养基中，IFN-γ水平高于对照培养基。
在具有本发明的富氧流体(水)(孔1、3和5)或蒸馏水(2、4和6)的完全RPMI+50mM Hepes中将两百万个细胞铺到24孔板的6个孔中(将10X RPMI稀释到水中成为l×)。用1μg/ml T3抗原(孔1和2)或PHA(孔3和4)刺激细胞。对照孔5和6未受刺激。在24小时后，检查细胞的存活力，收集并冷冻上清液。然后，将上清液解冻并且在8,000g下离心以沉淀。使用LUMINEX BEAD LITE方案和平台对于所列出的细胞因子测定澄清的上清液。数字数据在表9中列出。
表9。
  样本  IFN   IL-10   IL-12p40   IL-12p70   II-2   IL-4   IL-5   IL-6   IL-8   IL-1β   IL-10   TNFa
  1  0   0   0   2.85   0   0   7.98   20.3   1350   7.56   11500   15.5
  2  0   0   0   3.08   0   0   8   15.2   8940   3.68   4280   7.94
  3  0   581   168   3.15   0   0   8   16400   2200   3280   862   13700
  4  0   377   56.3   4.22   0   0   8.08   23800   22100   33600   558   16200
  5  0   0   0   2.51   0   0   7.99   24   1330   7.33   5900   8.55
  6  0   0   0   2.77   0   0   8   5.98   3210   4.68   3330   0
实施例12
髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)
如在图48中所示，与加压氧合流体(压力罐)或去离子对照流体相比，当在存在本发明的富含气体的流体下培养时，反应于MOG抗原肽的淋巴细胞增殖增加。因此，本发明的富含气体的流体放大了淋巴细胞对之前首次免疫细胞的抗原的增殖反应。
合成了对应于己知的小鼠序列的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55(MOG 35-55)(M-E-V-G-W-Y-R-S-P-F-S-R-O-V-H-L-Y-R-N-G-K)(SEQ ID NO：1；参见公开US20080139674，通过引用结合于此，包括此SEQ ID NO：1的目的)。然后，从之前用MOG免疫的MOGT细胞受体转基因小鼠中移除5×105个脾细胞，并且将其在用本发明的富含气体的流体重构的、加压氧合的水(压力罐水)重构的或用对照去离子水重构的0.2ml TCM流体中培养。用MOG p35-55分别培养脾细胞48小时或72小时。用1Ci[3H]-胸苷对培养物加以脉冲，并在16小时后收获。计算三份培养物的[3H]胸苷掺入的平均cpm。结果在图48中示出。
实施例13
细胞因子表达
用电动产生的富氧流体或对照流体中的T3抗原或PHA刺激人的混合淋巴细胞，并且评估了IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12(p40)、IL-12(p70)、IL-13、IL-17、嗜酸细胞活化趋化因子、IFN-γ、GM-CSF，MIP-1β、MCP-1，G-CSF，FGFb，VEGF，TNF-α、RANTES、瘦素、TNF-β、TFG-β和NGF的变化。从图38可以看出，所测试的促炎性细胞因子(IL-1β、TNF-α、IL-6和GM-CSF)、趋化因子(IL-8、MIP-1α、RANTES和嗜酸细胞活化趋化因子)、炎性酶(iNOS、COX-2和MMP-9)、过敏原反应(MHC II类、CD23、B7-1和B7-2)以及Th2细胞因子(IL-4、IL-13和IL-5)相比对照流体在测试流体中减少。相比之下，所测试的抗炎细胞因子(例如IL1R-α、TIMP)相比对照流体在测试流体中增加。
为了详述这些数据，申请人使用涉及卵白蛋白敏化作用的领域认可的用于评定过敏性超敏反应的模型系统。研究的终点是该反应的具体细胞学和细胞组分以及蛋白和LDH的血清学测量。进行细胞因子分析，包括嗜酸细胞活化趋化因子、IL-1A、IL-1B、KC、MCP-1、MCP-3、MIP-1A、RANTES、TNF-A和VCAM的分析。
简言之，将雄性挪威大鼠经腹膜内注射0.5mL包含氢氧化铝(Al(OH)3)(200mg/mL)的溶液(2.0mg/mL)中的0.5ml卵白蛋白(OVA)Grade V(A5503-1G，Sigma)，在第1、2和3天各一次。该研究是随机化2×2因子排列的处理(4组)。在允许免疫反应发生的两周等待时段之后，将大鼠暴露于RDC1676-00(通过混合装置处理的无菌盐水)和RDC1676-01(通过添加了额外氧的混合装置处理的无菌盐水)或用上述物质处理一周。在每天一次的一周的处理结束时，将2个组一分为二并且每个组中50％的大鼠通过吸入接受盐水或OVA激发。
具体而言，在开始的系列化后十四天，通过吸入将12只大鼠暴露于RDC 1676-00连续7天，每天30分钟。将通过该系统的空气流速设定在10升/分钟。将全体12只大鼠排列在饼式室(pie chamber)中，该饼式室具有雾化材料以进入并均等地分布到Aeroneb的12个子室的单入口。
在开始敏化后的十五天，通过超声雾化将12只大鼠暴露于RDC1676-01连续7天，每天30分钟。使用相同的喷雾器和室，也将气流设定为10升/分钟。首先将RDC 1676-00雾化并且在RDC 1676-01雾化之前使Aeroneb室彻底干燥。
在最终雾化处理后大约2小时，将RDC 1676-00组的6只大鼠用OVA(盐水中1％)再次激发，所述OVA通过是用Penn Century微型喷雾器(1A-1B型)通过气管内灌注来递送。RDC 1676-00组的另外6只大鼠用盐水激发作为通过气管内灌注递送的对照组。第二天，RDC1676-01组重复该程序。
再次激发后二十四小时，通过超剂量的戊巴比妥钠使每组中的所有大鼠安乐死。从下腔静脉采集全血样本并置于两个不等的血液采集管中：Qiagen PAXgeneTM血液RNA管和Qiagen PAXgeneTM血液DNA管。处理肺器官以获得用于RT-PCR的支气管肺泡灌洗(BAL)流体和肺组织，以评定己知与此模型中肺部炎症有关的细胞因子表达的标记物的变化。采用单侧灌洗技术以保存肺右侧4个肺叶的完整性。灌洗左边的″大″肺叶，而将右侧4个肺叶扎起来并立即置于TRI-zolTM中，均质化，并送到实验室做进一步处理。
BA分析。收集肺灌洗液并且在4℃下以600-800g离心10分钟以使细胞沉淀。将上清液转移到新管中并且在-80℃冷冻。将BAL流体分成两等份。将第一等份离心下来，并且将上清液在碎干冰上迅速冷冻，置于-80℃下，并且运送到实验室进行进一步处理。存在的蛋白和LDH的量分别表明血液血清蛋白(该蛋白是当其在这个实验中被激发时渗漏通过膜的血清组分)的水平和细胞死亡。专有的测试边示出比对照略少的蛋白。
对第二等份的BAL流体的总蛋白和LDH含量进行评估，并且使其经历细胞学检查。处理组显示总细胞大于盐水对照组。此外，相比对照组在处理组中存在嗜酸性粒细胞的增加。处理组相比对照组也存在多形核细胞的略微不同。
血液分析。通过将1.2-2.0ml血液转移到管中并且使其凝结成块至少30分钟来分析全血。保存剩余的血液样本(大约3.5-5.0mL)，以使用TRI-zolTM或PAXgeneTM的RNA提取。然后，在室温下，将凝结成块的血液样本在1200g下离心10分钟。将血清(上清液)移除并且置于两个新管中，并且将血清储存在-80℃下。
对于利用TRI试剂(TB-126，Molecular Research Center，Inc.)的RNA提取，将0.2mL的全血或血浆添加到0.75mL的TRI试剂BD中，每0.2mL的全血或血浆补充20μL的5N乙酸。将管摇动并储存在-80℃下。利用PAXgeneTM，将管在室温下培育大约两小时。然后将管放置在其一侧并且在-20℃制冷器中储存24小时，然后转移至-80℃下长期储存。
Luminex分析。通过Luminex平台，利用微珠分析作为抗体相关结合反应的底物，其以光度单位读数并且可与量化标准进行比较。每个血液样本作为两份样本同时操作。测量的单位是光度单位并且将这些组分分成OVA激发的对照、OVA激发的处理和用专有流体的盐水激发的处理。
对于Agilant基因阵列数据的产生，将肺组织分离并浸在TRI试剂(TR118，Molecular Research Center，Inc.)中。简言之，将大约1ml的TRI试剂添加到每个管中50-100mg组织中。使用玻璃-TeflonTM或PolytronTM均质器使样本在TRI试剂中均质化。将样本储存在-80℃下。
血样：
图49-58示出全血样本评估的结果。
示例性的图49示出血液样本数据的基本亮度数据呈现形式。指明所测量的细胞因子身份的字母(在这种情况下为KC)位于每个数据图的右上方。数据作为单个样本的数据点(上图)和条形图(下图)呈现。在每种情况下，从左到右将图分成四组。前两组(分别是RDC1676-00OVA和RDC1676-01)是用卵白蛋白(OVA)通过吸入重激发的组，而后两组(分别是RDC1676-00OVA和RDC1676-01OVA)是只用盐水对照重激发的组。再一次，后缀00代表盐水处理，而后缀01代表本发明的电动流体处理组。
将每个血液样本分为2份样本，并且2份样本同时操作。测量的单位是光度单位，这些组从左到右为：OVA激发的对照；OVA激发的电动产生的流体处理；接着为盐水激发的盐水处理；和盐水激发的电动产生的流体处理。为了有利于查看，两个RDC1676-01组用灰色阴影的背景凸显，而对照盐水处理组具有无阴影的背景。
通常，在左边两组的比较中，尽管RDC1676-01组数据的扩展稍大，RDC1676-01组中的具体细胞因子水平整体上小于对照处理组中的样本；通常两组之间存在约30％的数值差异。通常，在最右侧两组的比较中，RDC1676-01组与RDC1676-00组相比具有略高的数值。
图50示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的RANTES(IL-8超家族)分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，所示散点图再一次示出这两组之间30-35％的差异，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图51示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的MCP-1分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图52示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的TNFα分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图53示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的MIP-1α分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图54示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的IL-1α分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图55示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的Vcam分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图56示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的IL-1β分析。最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
图57和图58分别示出根据具体示例性方面的血液样本数据中的嗜酸细胞活化趋化因子和MCP-3的分析。在每种情况下，最左侧两组(OVA激发的组)的光度单位表明，通常在RDC1676-01处理组中的值小于RDC1676-00对照组，如通过上图部分中的散点图所示，而在只暴露于盐水的组中，细胞因子水平的值基本上相同，或可能在RDC1676-01处理组中略微升高。
支气管灌洗样本：
图59-68示出BAL流体样本评估的对应结果。
图59示出根据具体示例性方面的BAL数据中的KC分析。在这种情况下，与取样差异性结合的反应水平就RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异而言是非决定性的；即，KC显示出在这两组之间相对小的差异，但光度的单位非常小。
同样，图60示出根据具体示例性方面的BAL数据中的RANTES分析，并且示出RDC1676-01组中显著的可变性，其中一个读数显著高于其它读数，从而使结果偏差。
同样，图61示出根据具体示例性方面的BAL数据中TNFα的分析，并目示出RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面相对小的显著性。
图62示出根据具体示例性方面的BAL数据中MCP-1的分析，并且示出RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面相对小的显著性。
图63至图68分别示出根据具体示例性方面的BAL数据中MIP1-A、IL-1α、Vcam、IL-1β、MCP-3和嗜酸细胞活化趋化因子的分析，并且示出RDC1676-01与RDC1676-00处理组之间的差异方面相对小的显著性。
概括地说，针对已知的敏化作用的炎症反应的此标准测定至少在血液样本中产生显著的临床影响和血清学影响。另外，尽管大量的对照动物在这个过程中具有生理上的应激并且几乎死亡，RDC1676-01处理组均未示出这种临床应激效应。然后这反映在细胞因子的循环水平中，其中在OVA激发组的RDC1676-01处理组与RDC1676-01处理组之间大约30％的差异。相比之下，在非OVA激发组的RDC167601处理组与RDC1676-01处理组之间的细胞因子、细胞和血清学概况上存在小的并且相当不显著的改变，这可能只代表流体本身的最小基线变化。
实施例14
缓激肽B2受体亲和力结合
利用Bio-Layer Interferometry生物传感器Octet Rapid ExtendedDetection(RED)(forteBioTM)来检查缓激肽配体与缓激肽B2受体的膜受体亲和力结合。该生物传感器系统由嵌入到聚丙烯集线器中的、尖端具有传感器特异性化学性质的抛光光学纤维组成。该生物传感器装置具有连接到光学纤维尖端的分子层，该分子层在检测器产生干涉图。所结合的分子数目的任何改变引起光图像的测量位移。
如图69所示，缓激肽B2膜受体被固定到氨丙基硅烷(APS)生物传感器上。在图69中指定样本板装置，并且在图70中进行分析。接着，根据如图71中所指定的样本装置对缓激肽与固定化受体的结合进行评定。缓激肽结合的结果示于图72中。根据在图73中所指定的装置进一步滴定与受体结合的缓激肽。
如图74所示，与B2受体结合的缓激肽是浓度依赖性的，并且与生理盐水相比在本发明专利的富含气体的盐水流体中亲和力增加。与B2受体结合的缓激肽的稳定示于图75中。
实施例15
(将调节性T细胞测定用于显示在调节性T细胞测定中本发明的电动产生的流体在T细胞增殖和细胞因子(Il-10)及其它蛋白(例如GITR、Granzyme A、XCL1、pStat和Foxp3)的调节和例如PBMC中的类胰蛋白酶的调节中的作用)
通过辐照抗原呈递细胞并且引入抗原和T细胞研究了本文公开的具体实施方案调节T细胞的能力。通常，这些受刺激的T细胞会增殖。然而，在引入调节性T细胞时，通常的T细胞增殖受到抑制。
方法：
简言之，在分选中使用的FITC-缀合的抗CD25(ACT-1)抗体购自DakoCytomation(Chicago，IL)。所使用的其它抗体如下：CD3(可溶条件的HIT3a)、GITR(PE缀合的)、CD4(Cy-5和FITC缀合的)、CD25(APC缀合的)、CD28(CD28.2克隆)、CD127-APC、粒酶A(PE缀合的)、FoxP3(BioLegend)、小鼠IgG1(同种型对照)和XCL1抗体。所有抗体均根据制造商的说明书使用。
CD4+T细胞是用CD4+Rosette Kit(Stemcell Technologies)从周围全血中分离的。将CD4+T细胞与抗CD127-APC、抗CD25-PF和抗CD4-FITC抗体一起培育。使用FACS Aria、通过流式细胞术将细胞分选为CD4+CD25hiCD127lo/nTreg和CD4+CD25-反应T细胞。
在圆底96孔微量滴定板中进行抑制测定。如所示添加3.75×103CD4+CD25neg反应T细胞、3.75×103自体T reg、3.75×104同种异体-受辐射的去除CD3的PBMC。对所有孔补充抗CD3(在5.0μg/ml下克隆HIT3a)。在补充10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中于37℃下将T细胞培养7天。在培育结束之前十六小时，向每个孔添加1.0mCi的3H-胸苷。使用Tomtec细胞收集器对板进行收集，并且使用PerkinElmer闪烁计数器确定3H-胸苷的掺入。抗原呈递细胞(APC)由外周血单核细胞(PBMC)组成，采用StemSep人CD3+T细胞去除法(干细胞技术)去除T细胞，接下来进行40Gy的辐射。
用抗CD3和抗CD28条件刺激调节性T细胞，然后用live/dead red存活力染料(Invitrogen)和表面标记物CD4、CD25和CD127染色。将细胞固定在Lyze/Fix PhosFlowTM缓冲液中并且在变性的Permbuffer
Figure BDA0000102298890001261
中透化。然后将细胞用针对每种具体选定分子的抗体染色。
使用GraphPad Prism软件进行统计分析。通过使用双尾、不成对的Student检验对两个组作比较。通过使用单因子方差分析(1-wayANOVA)对三组进行比较。认为小于0.05的P值是显著的(双尾)。如果r值大于0.7或小于-0.7(双尾)，通过斯皮尔曼系数确定两组之间的相关性在统计学上是显著的。
结果：
如图76中所示，通过用柴油机排气微粒物(PM，来自EPA)刺激细胞研究了调节性T细胞的增殖。图76的X轴示出作为实心黑条的激活的自体CD4+效应T细胞(反应细胞)和灰色条的单独的调节性T细胞(为证实无反应性(anergy)而示出)，二者以1∶1的比例混合，如白色条所示。y轴示出如由3H-胸苷的摄入所测量的增殖。如沿着X轴从左到右所示，″PM″表示柴油机排气获得的微粒物；″PM+Rev″表示PM加上本发明公开的富含气体的电动产生的流体(Rev)；″Solis″表示本发明公开的电动产生的流体和除了仅环境气体之外不富含气体的装置(未添加PM)；″Rev″表示如以上所定义的单独Rev(未添加PM)；″培养基″表示单独细胞生长培养基的对照(减去PM；无Rev，无Solis)，并且″盐水Con″表示盐水对照(减去PM；无Rev，无Solis)；″V″表示维拉帕米(verapamil)，并且″P″表示心得安(propanolol)，并且″DT″为1∶50的DT390。
如图77中所示，用PM(无Rev，无Solis)刺激的细胞导致分泌的IL-10减少，而在本发明公开的流体的存在下暴露于PM的细胞(″PM+Rev″)导致与盐水和培养基对照(无PM)相比IL-10的产生持平或仅略微减少。此外，将白喉毒素(DT390，一种截短的白喉毒素分子；饱和商品化浓度的1∶50稀释)滴定到本发明的流体样本中，并且阻断图77中Rev介导的IL-10增加的效应。注意，用Rev单独处理导致与盐水和培养基对照相比更高的IL-10水平。
同样，用GITR、Granzyme A、XCL1、pStat和Foxp3分别获得图78-82中所示的类似结果。在各图中，″NSC″与″Solis″相同(无PM)。
图83示出从评估类胰蛋白酶的外周血单核细胞(PBMC)的过敏性哮喘(AA)的概况获得的AA PBMC数据。该AA PBMC数据与以上T调节性细胞数据一致，因为用PM刺激的细胞显示出高水平的类胰蛋白酶，而在本发明公开的流体的存在下用PM处理的细胞(″PM+Rev″)导致类似于盐水和培养基对照的显著降低的类胰蛋白酶水平。与来自T调节性细胞的数据一致，暴露于DT390阻断了Rev介导的对类胰蛋白酶水平的影响，导致如对于单独的PM(减去Rev，无Rev，无Solis)所看到细胞中升高的类胰蛋白酶水平。注意，用Rev单独处理导致与盐水和培养基对照相比更低的类胰蛋白酶水平。
总之，图76的数据(示出在对照流体(无Rev，无Solis)中存在PM和Rev相比PM减少的增殖)表明本发明的电动产生的流体Rev改善了调节性T细胞的功能，如通过该测定中相对减少的增殖所示。此外，此实施例和图76-83的证据表明β阻断、GPCR阻断和钙通道阻断影响Revera对Treg功能的活性。
实施例16
(用本发明的电动产生的流体治疗主支气管上皮细胞(BEC)导致气道炎症途径的两种主要蛋白MMP9和TSLP的表达和/或活性降低)
综述。如以上实施例14中所示(例如图75，其示出使用Bio-LayerInterferometry生物传感器、Octet Rapid Extended Detection(RED)(forteBioTM)与B2受体结合的缓激肽的稳定作用)，与B2受体结合的缓激肽为浓度依赖性的，并且与生理盐水相比在本发明公开的电动产生的流体(例如Rev；富含气体的电动产生的流体)中增加了结合亲和力。另外，如在用柴油排气微粒物PM刺激的T调节性细胞的背景下的实施例15中所示，数据示出在对照流体(无Rev，无Solis)中存在PM和Rev相比PM减少了T调节性细胞的增殖(图76)，这表明本发明的电动产生的流体Rev改善了调节性T细胞的功能(例如，如通过该测定中相对减少的增殖所示)。此外，暴露于本发明的流体导致与盐水和培养基对照(无PM)相比IL-10的产生持平或仅略微减少。同样，在PM刺激的PBMC的AA概况的背景下，数据示出暴露于本发明公开的流体(″PM+Rev″)导致类似于盐水和培养基对照的类胰蛋白酶水平的显著降低。另外，在实施例15和图76-83中示出的白喉毒素(DT390，一种截短的白喉毒素分子；1∶50稀释的饱和商品化浓度)的效应表明β阻断、GPCR阻断和钙通道阻断影响电动产生的流体对Treg和PBMC功能的活性。此外，实施例18中的数据示出根据另外的方面，当暴露于本发明的流体时，紧密连接相关蛋白在肺组织中被上调。图85-89分别示出连接粘附分子JAM 2和JAM 3、GJA1、GJA3、GJA4和GJA5(连接黏附素)、OCLN(闭合蛋白)、密蛋白(例如CLDN 3、5、7、8、9、10)、TJP1(紧密连接蛋白1)的上调。此外，如实施例23的膜片钳研究中所示，本发明的电动产生的流体(例如RNS-60)影响支气管上皮细胞(BEC；例如Calu-3)全细胞电导的调节(例如在超极化条件下)，并且根据另外的方面，全细胞电导的调节反映了离子通道的调节。
在此实施例中，申请人已通过进行另外的实验来测量气道炎症途径的两种主要蛋白产生的效应，从而扩展了这些发现。具体而言，在主支气管上皮细胞(BEC)中测定了MMP9和TSLP。
材料和方法：
将商购获得的人BEC(来自Promocell，Germany的HBEpC-c)用于这些研究。将大约50,000个细胞铺在12孔板的每个孔中直至它们达到～80％的汇合。然后用生理盐水、对照流体Solas或1∶10稀释(1ml气道上皮生长培养基中100μl)的测试流体Revera 60连同柴油机排气微粒物DEP或PM)一起在细胞被运送用于FACS分析之前将这些细胞处理6小时，如在本文实施例8中所述。MMP9和TSLP受体抗体两者均得自BD Biosciences并且按照制造商的说明书使用。
结果：
在图115和图116中，DEP表示暴露于单独的柴油机排气微粒物PM的细胞；″NS″表示暴露于单独的生理盐水的细胞；″DEP+NS″表示用PM在生理盐水的存在下处理的细胞；″Revera 60″是指仅暴露于测试材料的细胞，″DEP+Revera 60″是指在测试材料Revera 60的存在下用微粒物处理的细胞。此外，″Solas″和″DEP+Solas″分别表示暴露于单独的对照流体Solas或与微粒物联合的细胞。
图115示出测试材料Revera 60降低BEC中DEP诱导的TSLP受体表达大约大约90％。Solas导致TSLP受体表达降低55，而生理盐水不能产生TSLP受体表达的相似水平的降低(大约20％的降低)。考虑到最近的发现成果，本发明的溶液在降低TSLP受体表达中的效应是一项重要发现，这些成果示出TSLP在过敏性哮喘的病理学和TSLP受体功能缓解的过敏性疾病的局部抗体介导的阻断中起关键作用(Liu，YJ，Thymic stromal lymphopoietin：Master switch for allergicinflammation(胸腺基质淋巴细胞生成素：过敏性炎症的主开关)，J ExpMed 203：269-273，2006；A1-Shami等，A role for TSLP in thedevelopment of inflammation in an asthma model(TSLP在哮喘模型的炎症发展中的作用)，J Exp Med 202：829-839，2005；和Shi等，TSLPreceptor alleviated allergic disease by regulating airway dendritic cells(通过调控气道树突细胞TSLP受体缓解的过敏性疾病的局部阻断)，ClinImmunol。2008年8月29日(印刷前的电子版))。
同样，图116示出Revera 60、Solas和生理盐水对DEP介导的MMP 9的增加的影响。具体而言，Revera 60抑制支气管上皮细胞中DEP诱导的细胞表面结合的MMP9水平大约80％，并且Solas具有大约70％的抑制效应，而生理盐水(NS)具有约20％的降低的边际效应。MMP-9为涉及哮喘中的气道炎症和支气管重塑的主要蛋白酶之一。最近，已显示MMP-9的水平在患有稳定哮喘的患者中显著提高并且与健康的对照受试者相比在急性哮喘患者中甚至更高。在气道炎症细胞的浸润和气道高反应性的诱导中起至关重要的作用，表明MMP-9可能在诱导和维持哮喘中具有重要作用(Vignola等，Sputummetalloproteinase-9/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 ratiocorrelates with airflow obstruction in asthma and chronic bronchitis(痰金属蛋白酶-9/金属蛋白酶-1的组织抑制剂的比例与哮喘和慢性支气管炎中的气流阻塞相关)，Am J Respir Crit Care Med 158：1945-1950，1998；Hoshino等，Inhaled corticosteroids decrease subepithelial collagendeposition by modulation of the balance between matrixmetalloproteinase-9 and tissue inhibitor of metalloproteinase-1 expressionin asthma(吸入的皮质类固醇通过调节哮喘中基质金属蛋白酶-9和金属蛋白酶-1的组织抑制剂的表达平衡来减少上皮下的胶原沉积)，JAllergy Clin Immunol 104：356-363，1999；Simpson等，Differentialproteolytic enzyme activity in eosinophilic and neutrophilic asthma(在嗜酸性和嗜中性哮喘中不同的蛋白水解酶活性)，Am J Respir Crit CareMed 172：559-565，2005；Lee等，A murine model of toluenediisocyanate-induced asthma can be treated with matrix metalloproteinaseinhibitor(甲苯二异氰酸酯诱导的哮喘的鼠类模型可用基质金属蛋白酶抑制剂处理)，J Allergy Clin Immunol 108：1021-1026，2001；和Lee等，Matrix metalloproteinase inhibitor regulates inflammatory cellmigration by reducing ICAM-1 and VCAM-1 expression in a murinemodel of toluene diisocyanate-induced asthma(基质金属蛋白酶抑制剂通过降低ICAM-1和VCAM-1在甲苯二异氰酸酯诱导的哮喘的鼠类模型中的表达来调控炎症细胞的迁移)，J Allergy Clin Immunol2003；111：1278-1284)。
因此，根据另外的方面，本发明的电动产生的流体具有用于调节(例如降低)TSLP受体表达和/或用于抑制MMP-9的表达和/或活性的大量的治疗效用，包括例如炎症和哮喘的治疗。
实施例17
(本发明的电动产生的流体显示出在领域认可的过敏性哮喘的动物模型中具有与布地奈德的协同抗炎效应)
此工作实施例描述了如下实验：进行这些实验来评定本发明的电动产生的流体(例如RDC-1676-03)在棕色挪威大鼠卵白蛋白敏化模型中的气道抗炎特性。棕色挪威大鼠是用于确定测试材料对气道功能的影响的领域认可的模型，并且此品系己被泛地用作例如过敏性哮喘的模型。在这个模型中由卵白蛋白敏化所诱导的气道病理学和生物化学的改变与在人类中观察到的改变相似(Elwood等，J Allergy ClinImmuno 88：951-60，1991；Sirois & Bissonnette，Clin Exp Immunol126：9-15，2001)。选择吸入途径以使对测试材料或对照溶液的肺部暴露最大化。在卵白蛋自激发之前将卵自蛋白敏化的动物用布地奈德单独处理或者与测试材料RDC 1676-03组合处理7天。在激发后6小时和24小时，测量了总的血细胞计数和几种蛋白质及抗炎细胞因子的水平以及各种呼吸参数，以估计施用该测试材料对各种炎症参数的任何有益的影响。
材料和方法：
Bn/Crl品系的棕色挪威大鼠得自Charles River Kingston，在实验的开始重大约大约275±50g。所有动物研究均在PCS-MTL国际动物照管和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)的批准下进行。在该研究期间，动物的使用和照管根据美国国家研究委员会以及加拿大动物照管委员会的准则进行。
敏化。在实验的第1天，通过施用1ml腹膜内注射的新鲜制备的每1ml 0.9％氯化钠对2mg卵白蛋白/100mg氢氧化铝的溶液对动物(每个处理组中14只动物)进行敏化，接着在第3天重复注射。
处理。在开始敏化后十五天，使动物经历对照(生理盐水)或测试溶液(电动产生的流体RDC1676-00、RDC1676-02和RDC-1676-03)下的喷雾接触，单独施用或者与布地奈德组合施用，连续7天每天一次持续15分钟。以大约20L的全身室对动物给药，并且使用补充来自Buxco偏流泵的空气的aeroneb超声喷雾器产生测试气氛并使之进入室的空气入口。将气流速度设定在10升/分。
卵白蛋白激发。在第21天，在用测试溶液处理后2小时，所有动物用1％卵白蛋白雾化溶液激发15分钟(在全身室中以2L/min的气流)。
样本采集。在卵白蛋白激发后6小时和24小时的时间点，采集血液样本用于总血细胞计数和分类血细胞计数以及用于测量各种蛋白质和抗炎细胞因子的水平。此外，在卵白蛋白激发后立即使用和在卵白蛋白激发后6小时及24小时使用Buxco Electronics BioSystemXA系统来测量增强的暂停Penh和潮气量并持续10分钟的时段。
结果：
嗜酸性粒细胞计数：如预期和图109中所示，用布地奈德(″NS+布地奈德750μg/Kg″；浓密交叉阴影线的条形图)进行的处理与用生理盐水NS单独的对照(空心的条形图)进行的处理相比，在激发的动物中降低了总嗜酸性粒细胞计数。另外，而用本发明的流体″RDC1676-03″单独处理(少许交叉阴影线的条形图)未显著降低嗜酸性粒细胞计数，尽管如此，其表现出在降低嗜酸性粒细胞计数中与布地奈德的明显协同效应(″RDC1676-03+布地奈德750μg/K″，实心黑色条形图)。类似地，在图110中，嗜酸性粒细胞百分比也反映了相似的趋势。而单独的RDC1676-03(少许交叉阴影线的条形图)或布地奈德750μg/kg(浓密交叉阴影线的条形图)对激发的动物中的嗜酸性粒细胞百分比计数并不具有显著效应，这二者结合显著地降低了嗜酸性粒细胞百分比(实心黑色条形图)。
因此，图109和图110根据本发明的特定方面示出本发明的电动产生的流体(例如RDC1676-03)显示出在人类过敏性哮喘的领域认可的大鼠模型中具有显著降低嗜酸性粒细胞计数(″嗜酸性粒细胞％″和总计数)的与布地奈德联合的显著协同效用。
呼吸参数：
图111A-C和图112A-C显示在卵白蛋白激发后立即测量、在6小时和24小时测量的测试流体对Penh和潮气量的观察到的作用。Penh是从最大吸气流量、最大呼气流量和呼气时间获得的导出值，并且penh值的下降反映了有利于肺功能的结果。
Penh＝(呼气流量峰值/吸气流量峰值)*(呼气时间/呼出65％的呼气量的时间-1)。
从图111A-C中可明显看出，用布地奈德(以500μg/kg和750μg/kg)单独处理或与任何测试流体联合处理不能在激发后立即显著影响Penh值。然而，在激发后6小时，用RDC1676-03单独处理或与布地奈德500μg/kg和750μg/kg联合处理的动物显示Penh值的显著下降。尽管这种下降程度到激发后24小时减小，但在此时间点仍观察到布地奈德与RDC流体的协同效应的趋势。
潮气量是在平静呼吸过程中吸气期间从终末呼气位置吸入到肺中的空气的容积，该空气在呼气期间被动地离开肺。如图112A-C所示，用布地奈德单独处理的动物显示在激发后即刻潮气量没有改变。然而，甚至在此早期时间点单独的RDC1676-03对潮气量也无显著的刺激作用。并且再次，与布地奈德(500μg/kg和750μg/kg)联合的RDC1676-03对此时间点的潮气量测量具有更加显著的影响。在激发后六小时，单独的RDC1676-03足以引起潮气量的显著增加，并且单独或组合地将布地奈德加入到处理方案中对潮气量无附加的效应。然而，在这些早期时间点所观察到的任何效应到24小时的时间点消失。
合在一起，这些数据显示RDC1676-03单独或与布地奈德联合一起提供了对气道炎症的显著缓解，如通过在激发后6小时潮气量的增加和Penh值的减少所证明。
细胞因子分析：
为了分析在以上讨论的生理学参数上看到的效应的机制，在生理学测量之后立即测量在激发后6小时和24小时所采集的血液样本中的许多蛋白质以及抗炎细胞因子。
图113A和图113B清楚地显示单独的Rev 60(或RDC1676-03)在激发后6小时和24小时均显著降低了嗜酸细胞活化趋化因子的血液水平。布地奈德750μg/kg在这两个时间点也降低了血液嗜酸细胞活化趋化因子水平，而布地奈德250μg/kg在后面的时间点仅有值得注意的作用。然而，单独的测试溶液Rev 60显示出比在两个时间点的两种布地佘德的浓度显著更有力(在降低血液嗜酸细胞活化趋化因子水平中)的作用。嗜酸细胞活化趋化因子是已知积聚和吸引嗜酸性粒细胞到过敏性反应中的哮喘性肺和其它组织(例如在克隆氏病中的肠)中的小的C-C趋化因子。嗜酸细胞活化趋化因子与G蛋白偶联受体CCR3结合。CCR3由许多细胞类型例如Th2淋巴细胞、嗜碱粒细胞和肥大细胞表达，但此受体被Th2淋巴细胞表达尤其令人关注，因为这些细胞调控嗜酸性细胞的募集。几项研究已经显示在哮喘性肺中嗜酸细胞活化趋化因子和CCR3的产生增加以及在这些分子与气道高反应性之间建立联系(综述于Eotaxin and the attraction of eosinophilsto the asthmatic lung，Dolores M Conroy and Timothy J WilliamsRespiratory Research 2001，2：150-156)。尤其令人关注的是注意到这些研究完全符合图109和110中关于嗜酸性粒细胞计数的结果。
这些结果合在一起强烈地表明，用RDC1676-03单独或与布地奈德组合进行的处理可显著地降低在卵白蛋白激发后24小时血液中的嗜酸性粒细胞的总计数和百分比。这与早在激发后6小时所观察到的血液中嗜酸细胞活化趋化因子水平水平的显著下降相关。
作为Rev 60单独或与布地奈德组合处埋的结果，两种主要关键抗炎细胞因子、IL10和干扰素γ的血液水平也在激发后6小时显著增强。图113C和图113D分别示出对干扰素γ和IL 10的这种效应。从这些图中明显可以看出，单独的Rev 60或与布地奈德250μg/kg联合的Rev 60在直至激发后6小时显著提高激发动物的IL10的血液水平。类似地，Rev 60单独或与布地奈德250μg/kg或750μg/kg联合在激发后6小时显著提高IFNγ的血液水平。这些抗炎细胞因子的增加可能至少部分地充分解释在激发后6小时在生理学呼吸参数下所看到的有益效应。在激发后24小时不再观察到对这些细胞因子的作用(数据未示出)。
Rantes或CCL5是由循环T细胞表达的细胞因子并且对于T细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱粒细胞是趋化性的，并且具有募集白细胞到炎症部位中的活性作用。Rantes还激活嗜酸性粒细胞，以释放例如嗜酸性阳离子蛋白。其改变嗜酸性粒细胞的密度并且使其具有低密度，这被认为代表全身化的细胞激活状态。其还为对嗜酸性粒细胞特异的氧化代谢的有力激活剂。
如图114中所示，在用Rev 60单独或与布地奈德250μg/kg或750μg/kg联合处理的动物中激发后6小时而非24小时显著降低了Rantes的全身水平。再次，这组数据显示布地奈德750μg/kg与Rev 60有清楚的协同效应。对于其它促炎性细胞因子(如KC或IL8、MCP3、IL1b、GCSF、TGFb以及NGF)而言，在用Rev60单独或与布地奈德联合处理的动物中在激发后6小时或24小时观察，观察到类似的向下趋势。
实施例18
(本发明的治疗性流体具有调节细胞间紧密连接的实质效用)
根据特定方面，本发明的扩散器处理的治疗性流体具有调节细胞间紧密连接的实质效用，包括与多肽(包括示例性多肽鲑降钙素(sCT))的肺部和全身递送以及生物利用度相关的效用。
实施例综述。鲑降钙素(sCT)是具有3,432道尔顿分子量的32个氨基酸的肽。降钙素的肺部递送已经在模型系统(例如，啮齿动物模型系统、大鼠模型系统等)中被广泛研究，以调查增强肺部药物递送的方法(例如，气管内药物递送)。根据具体的示例性方面，本发明的扩散器处理的治疗性流体具有调节(例如增强)细胞间紧密连接的实质效用，例如与大鼠模型系统中sCT的肺部和全身递送及生物利用度相关的效用。
方法：
气管内药物递送。气管内药物递送。根据具体的实施方案，将sCT配制在本发明的治疗性流体中，并且使用气管内药物递送装置给大鼠施用。在某些方面，使用为啮齿动物气管内药物递送设计的PennCentury微型喷雾器装置，允许良好的肺部递送，但是如本领域所理解，其中相对低的肺泡沉积导致肽的全身生物利用度不良。根据特定方面，使用该领域认可的模型系统来证实本发明的扩散器处理的治疗性流体具有调节(例如增强)细胞间紧密连接的实质效用，包括与多肽的肺部和全身递送及生物利用度相关的效用。
动物组及给药。在某些方面，将大鼠分配给1-3组之一(每组n＝6)：a)无菌盐水；b)无O2富集的底液(″底液″)；或c)本发明的扩散器处理的治疗性流体(″本发明的富集的底液″)。本发明的富集的底液是例如通过在0.9％的盐水中注入氧而形成的。优选地，该底液包含约0.9％的盐水以使上皮细胞的低渗破坏的可能性减到最小。在某些实施方案中，将sCT分别重溶在底液和本发明的富集的底液中，并且将各自的溶液在60分钟之内通过气管内灌注递送到各自的动物组(每只动物递送200μL中的10μg sCT)。
测定。在特定方面，采集血液样本(例如200μL)，并且在给药之前以及在给药后5、10、20、30、60、120和240分钟放到EDTA涂覆的管中。收集血浆并且储存在≤-70℃直至使用ELISA测定sCT。
对于Agilant基因阵列数据的产生，将肺组织分离并浸在TRI试剂(TR118，Molecular Research Center，Inc.)中。简言之，将大约1ml的TRI试剂添加到每个管中50-100mg组织中。使用玻璃-TeflonTM或PolytronTM均质器使样本在TRI试剂中均质化。将样本储存在-80℃下。
结果：
紧密连接的增强。图84示出RDC1676-01(通过添加额外氧的本专利装置处理的无菌盐水；本发明公开的富含气体的电动产生的流体(Rev))减少了sCT的全身递送和生物利用度。根据特定方面，减少的全身递送源于sCT的吸附减少，最可能源于肺部紧密连接的增强。RDC1676-00表示根据本发明公开的方法处理但未氧合的无菌盐水。
另外，根据特定方面，紧密连接相关蛋白在肺组织中被上调。图85-89分别示出连接粘附分子JAM 2和JAM 3、GJA 1、GJA 3、GJA4和GJA 5(连接黏附素)、OCLN(闭合蛋白)、密蛋白(例如CLDN 3、5、7、8、9、10)、TJP1(紧密连接蛋白1)的上调。
实施例19
(本发明的治疗性流体具有调节一氧化氮水平的实质效用)
根据特定方面，本发明的扩散器处理的治疗性流体具有调节一氧化氮水平和/或相关酶的实质效用。图90-94示出从暴露于RDC1676-01(通过具有添加的额外的氧的本专利装置处理的无菌盐水；本发明的富含气体的电动产生的流体(Rev))的人包皮角质形成细胞获得的数据，其显示出NOS1和NOS3、以及Nostrin、NOS3的上调。相比之下，从大鼠肺组织(以上名为″细胞因子表达″的实施例的组织)获得的数据示出用Rev的NOS2和NOS 3、Nostrin和NOS1AP的下调(图93、图94)。
实施例20
(使用包括绝缘的转子和定子部件的特别设计的混合装置显示局部电动效应(电压/电流))
在此实施例中，使用包括绝缘的转子和定子部件的特别设计的混合装置显示部件-局部电动效应(电压/电流)。
综述。如本文以上在″双层效应″(也参见图26和图28)中所详细讨论。混合装置100可被构造成通过第一材料110和第二材料120的复杂且非线性流体动态相互作用产生输出材料102，复杂的动态紊流提供了进一步有利于电动效应的复杂混合。根据特定方面，这些电动效应的结果可在输出材料102内以电荷再分配和氧化还原反应而存在，包括以稳定在输出材料内的溶解电子形式存在。
除了混合室中一般表面相关双层效应之外，申请人另外推断可借助在所述部件附近的部件诱导的微穴和流体加速及减速来赋予局部电动效应。因此进行这个实施例的研究来进一步调查和证实所述额外的电动方面。
材料：
构造了类似于本文所述的本发明的混合装置的测试装置，其包括具有两个部件18(以180度排列)的不锈钢转子12和具有单个部件16的定子14，其被旋转地与转子部件18和定子部件16相对设置。重要的是，该转子和定子部件在每种情况下与各自的转子和定子的主体绝缘(图95)。将该装置制造成提供一致的0.020英寸的转子：定子间隙20以符合本文其它地方公开的装置。在转子轴(未示出)的末端有旋转触点(未示出)，该旋转接触器为转子表面和绝缘的转子部件提供电通路。同样，定子具有类似的绝缘部件上16(图95)，其中定子的内表面和绝缘的不锈钢部件连接在定子外部上各自的触点上。
运算放大器(OpAmp)电路(M)22连接在触点之间。构造运算放大器(OpAmp)电路，以提供通过利用这种放大器的高输入阻抗采集非常低的电压测量结果。OpAmp的输出供给示波器(例如具有Pico Scope3000TM的电池供电的便携式电脑运行示波器的应用程序)的输入)。
为了在该装置的测试过程中消除任何环境噪声的引入(例如，来自无线网络信号和来自60Hz电源线的RF辐射)，构造细铜网的、RF屏蔽的隔室(大约三乘四乘四英尺)来提供法拉第笼。当来自60Hz AC噪声(例如大约2伏特)和高频RF的干扰信号完全降到所关注的信号之下时，这种构造在实验测试过程中提供优异的信噪比。使用具有Pico Scope 3000的电池供电的便携式电脑运行示波器的应用程序，使得由该测试装置的部件所产生的30mV信写的检测(如图96中)成为可能。此外，将变速DC电机设置在法拉第笼的外侧，并且通过一个非金属轴连接至该可旋转的测试装置，以有效隔离电机的噪声使其远离测试装置。
方法：
OpAmp电路用于测量将定子内表面12与绝缘定子部件16连接的触点之间的电压电位。对于具体的电路布置，仅测量了一个电位。该装置的转速可在约700至约2800rpm之间变化(其中图96的数据通过以约1800rpm操作的装置测量)。
为避免由于泵或蠕动泵产生任何外来电压，使用作用于与该装置相连接的槽中流体的惰性氮气或空气或氢气实现使流体流过该装置。从流动机制中未察觉到电压的贡献，并且通常空气被用作泵送力来使流体流过该装置。
通过该装置的流体流速为约1L/min。
通过引导流体流过该装置的室而无旋转转子进行初始的一组非旋转实验，以评定在定子主体12与绝缘部件16之间任何电压的存在。对于两个流动方向进行单独的实验。
然后以相同的流体流速进行另外一组旋转实验，并且其中该装置的转子以约300至约1800rpm的不同速度旋转。对于任何给出的实验，流速和转速均保持恒定。
结果：
对于非旋转实验而言，其中流体在任一方向流过装置而无任何转子旋转，在定子的主体与绝缘的部件之间仅有几乎察觉不到的电压(例如1至2mV)。
对于旋转实验而言，并参考图96，可以看出与相对的转子定子部件的旋转排列在时间上相关的电压脉冲(电压脉冲)(在该情况下为约1800rpm)可用该操作测试装置中的OpAmp测量。此外，经从约250或300rpm至约1800rpm的范围可观察到与部件的排列相关的这种周期性电压脉冲。另外，在存在或不存在流体流动的情况下，只要该装置的腔/流体室灌注有流体，就可在旋转实验中观察到这种电压脉冲。根据特定方面，并且不受机制约束，在重复的旋转排列的部件附近的流体流动的快速、剧烈的挤压(例如气穴现象)、加速和减速产生了与旋转周期确切相关的对应的局部电压脉冲，至少部分地提供了根据本发明的电动产生的流体。其它的实验揭示电压脉冲的波幅(峰的形状和高度)随转速的增加而增加，最初在此具体测试装置中可在约250rpm至300rpm观察到并且增加到至少约2800rpm。在旋转排列的部件附近的流体流动的剧烈加速和减速等的幅度将预期一般随转速的增加而增加，至少达到最大值，反映由该装置的几何形状、构造和/或流速施加的物理限值。根据另外的方面，因为局部电压尖峰存在，在这些部件附近产生了局部电流流动(例如，电流脉冲)，至少部分地提供了根据本发明的电动产生的流体(例如，不受机制限制，提供本文其它地方所讨论的电化学反应)。
根据另外的方面，并且不受机制约束，这种部件局部效应(例如电压脉冲和/电流和/或电流脉冲)有助于产生电动产生的流体联合更普遍的表面相关双层和以上在″双层效应″之下本文其它地方所讨论的流动电流效应(也参见图26和28)。
实施例21
(相对于非电动产生的对照流体，本发明的电动产生的流体示出在溶解的溶质α，α-海藻糖的13C NMR分析中差别地影响线宽)
综述。本文其它地方公开的申请人的数据支持效用和机制，其中本发明的电动产生的流体通过调节如下的至少一者来介导细胞内信号转导的调控或调节：细胞膜、膜电位/电导、膜蛋白(例如G蛋白偶联受体的膜受体)、钙依赖性细胞信号转导系统和细胞间连接(例如紧密连接、间隙连接、粘附带和桥粒)。具体而言，使用多个领域认可的生物测试系统和测定法，申请人的数据显示与对照流体相比本发明的流体对例如下列具有不同的作用：调节性T细胞增殖；细胞因子和蛋白质水平(例如、IL-10、GITR、Granzyme A、XCL1、pStat5和Foxp3、类胰蛋白酶、紧密连接相关蛋白、TSLP受体、MMP9等)；缓激肽配体与缓激肽B2受体的结合；TSLP受体的表达、全细胞电导等。此外，本文示出的白喉毒素(DT390)的作用表明β阻断(β2肾上腺素能受体)和/或GPCR阻断和/或钙通道阻断影响电动产生的流体对例如Treg和PBMC功能的活性。
合在一起，这些作用表明本发明的电动产生的流体不仅从根本上区别于现有技术的流体，而且其提供了如本文目前公开和要求保护的新颖组合物和实质效用。
在此实施例中。申请人已在此实施例中进行核磁共振(NMR)研究，以进一步表征本发明的电动产生的流体的基本性质。具体而言，申请人已分析相比溶解在非电动产生的流体中，溶解在电动产生的流体中的α，α-海藻糖的13C NMR谱。海藻糖(以下示出碳编号作参考)是一种亲液(cosmotrophic)溶质并且已知例如可保护免于蛋白质变性、膜干燥、冷冻时器官的存活力等。给出以上概述数据的申请人推断α，α-海藻糖可提供一种有效工具来进一步探索本发明的电动产生的流体的特性/结构。申请人推断NMR相关的″化学位移″和对″线宽″的作用可用于评定本发明的流体的特性。对于这些研究，采用一种非超氧合的本发明的电动产生的流体(本文称作″Solas″)来使顺磁性杂质(如溶解氧)可起作用以对抗或以其它方式掩蔽被分析的作用的可能性降到最小。
α，α-海藻糖
Figure BDA0000102298890001421
材料和方法：
溶液制备。磷酸盐(钠盐)和D-(+)-海藻糖二水合物(T9531-10G，降低的金属含量)和包含1％DSS的99.9％D2O购自Sigma。″生理盐水″为来自Hospira的pH 5.6(4.5-7.0)的0.9％氯化钠。通过将0.949g海藻糖溶解在965μL NS和35mL磷酸盐缓冲盐水(以如下方式制备的0.9％NaCl中的100mM磷酸盐缓冲液：使得当35μL的这种缓冲液添加到1.0ml海藻糖溶液中时pH变为6.93)中制备0.25M α，α-海藻糖溶液。
核磁共振谱采集。通过在华盛顿大学NMR设备室使用配有Bruker BBO：×{1H}探针和操作的XWINNMR 3.5.的500MHz或300MHz Bruker Avance系列仪器采集谱。使用14000Hz或7900Hz的扫探宽度在125.7MHz或75.46MHz采集13C NMR谱，使用64K或128K数据点和128或256扫描。所得FID用零填允两次并且用1.0Hz的线扩张因子(line broadening factor)进行处理。使用Bruker Biospin变温仪器控制温度。通过将99.9％D2O+1％DSS+痕量丙酮放在购自Wilmad的共轴的NMR插入管中，采用外部氘锁定。使用来自Mestrelab Research的iNMR软件v.2.6.4。
结果：
样本谱。图97A-C示出在彼此顶部重叠的六个13C-NMR谱的扩展，使得DSS信号在-2.04ppm列为一排。DSS信号显示在图的最右侧，而丙酮的甲基信号显示在30.9ppm附近。剩余的信号对应于在以上α，α-海藻糖结构中示出的海藻糖的6个碳。可以看出，Solas溶液中的碳信号显示出与对照溶液相比的小化学位移(一般高磁场)。
线宽测量。下表10示出对于Solas盐水(本发明的电动产生的流体)在3种不同温度海藻糖的六个碳和丙酮的甲基碳的测量的13CNMR线宽。对应的NS样本代表在每个温度的非电动的对照溶液。在Solas溶液中，线宽显著不同于每个碳原子在对照溶液中的线宽。与对照溶液相比，在较低温度下Solas溶液中的较小线宽可能产生于海藻糖分子整体上(包括任何溶剂化水分子)较快的翻滚率。
表10：在Solas和生理盐水a，b中α，α-海藻糖的13C NMR线宽
Figure BDA0000102298890001441
a由于在处理过程中使用的1.0Hz线展宽，从所有线宽值中减去1.0Hz。此外，相对于在外部参考管中的丙酮信号将线宽值标准化以补偿磁场的不均一性。这通过从生理盐水的线宽中减去丙酮峰在对应的Solas盐水谱中被加宽的量而完成。
b线宽测量中的误差估计在+/-0.30Hz之内
在图97A中以图的方式示出在每种情况下相对于丙酮线进行标准化的Solas和生理盐水中的α，α-海藻糖的13C NMR线宽。总之，Solas和生理盐水中的α，α-海藻糖的13C NMR线宽的NMR数据表明存在改变溶质翻滚的本发明的溶液的特性。
综观以上和本文其它地方概述的生物活性，这些13C NMR线宽作用表明本发明的电动产生的流体不仅在溶质相互作用方面从根本上区别于现有技术的流体，而且其提供了本文目前所公开并要求保护的新颖组合物和实质效用。
实施例22
(相对于非电动产生的对照流体，本发明的电动产生的流体产生了有差别的方波伏安曲线并且展示出在溶出极谱之下独特的电化学特性)
综述。本文其它地方公开的申请人的数据支持效用和机制，其中本发明的电动产生的流体通过调节如下的至少一者来介导细胞内信号转导的调控或调节：细胞膜、膜电位/电导、膜蛋白(例如G蛋白偶联受体的膜受体)、钙依赖性细胞信号转导系统和细胞间连接(例如紧密连接、间隙连接、粘附带和桥粒)。具体而言，使用多种本领域认可的生物测试系统和测定法。申请人的数据显示与对照流体相比本发明的流体对例如下列具有不同的作用：调节性T细胞增殖；细胞因子和蛋白质水平(例如、IL-10、GITR、Granzyme A、XCL1、pStat5和Foxp3、类胰蛋白酶、紧密连接相关蛋白、TSLP受体、MMP9等)、缓激肽配体与缓激肽B2受体的结合、TSLP受体的表达、全细胞电导等。此外，本文示出的白喉毒素(DT390)的作用表明β阻断(β2肾上腺素能受体)和/或GPCR阻断和/或钙通道阻断影响电动产生的流体对例如Treg和PBMC功能的活性。
合在一起，这些作用表明本发明的电动产生的流体不仅从根本上区别于现有技术的流体，而且其提供了如本文目前公开和要求保护的新颖组合物和实质效用。
在此实施例中。申请人已在这个实施例中进行伏安法研究以进一步表征本发明的电动产生的流体的基本性质。伏安法频繁用于确定氧化还原电位或测量流体的动态速率和常数。所有伏安方法的普遍特征是其涉及将电位施加于电极并且通过电化学电池监测生成的电流。施加的电位通过以电化学方式还原或氧化电活性形式而在电极表面处产生该电活性形式的浓度改变。
具体而言，申请人已利用伏安方法(即方波伏安法和溶出极谱法)来进一步表征对照盐水流体与本发明的电动产生的测试流体(例如Solas和Revera)之间的根本区别。给出以上概述的生物和膜效应数据的申请人推断方波伏安法和溶出极谱法将提供有效工具来进一步表征本发明的电动产生的流体的独特特性。
申请人还推断在特定电压下的电流的不同、不同浓度的电活性氧化还原化合物的产生、新氧化还原化合物的产生和独特的电化学特性的拥有可用于评定和表征本发明的流体的特性。对于这些研究，使用超氧合的电动产生的流体(Revera)和非超氧合的本发明的电动产生的流体(Solas)。
材料和方法：
材料和溶液制备。所述实验在EG&g SMDE 303A极谱仪(Princeton Applied Research)上进行。在方波伏安法实验中使用的电解质NaOH购自Sigma。通过添加100μL的NaOH到9.9ml Revera盐水中制成0.18摩尔溶液来制备本发明的流体溶液的10ml样本。关于溶出极谱法实验，未利用另外的电解质。
方波伏安法。如以上所述，伏安法用于确定氧化还原电位或测量流体中的动态速率和常数。在方波伏安法实验中，将0.0至大约-1.75V的电位施加于电极并且监测流过该电化学电池的生成的电流。
溶出极谱。溶出极谱方法类似于方波伏安法。然而，然而，如以上所述未利用电解质并且还涉及预步骤。在该预步骤中，将静态滴汞电极在-1.1V保持30秒以使还原形式在汞中可溶的任何化合物汞齐化。然后，扫描在-1.1V与0.0V之间的电位并且监测流过该电化学电池的生成的电流。此汞齐上的负电位中的线性扫描提供了对这些化合物的敏感测量。
结果：
方波伏安法。从图98中可明显看出，在-0.14V、-0.47V、-1.02V和-1.36V的电流特征在各种测试的试剂之间有差别。根据特定方面，在各种特定电压下产生的电流的不同指示至少一种不同浓度的电活性氧化还原化合物和/或新的或独特的电活性氧化还原化合物和/或包围该汞滴的扩散限制电双层上的改变。
溶出极谱。图99示出本发明的电动产生的流体Revera和Solas显示出在-0.9伏特具有显著的峰的独特波谱，所述显著的峰在非电动产生的空白和盐水对照流体中不存在。另外，非电动产生的空白和盐水对照流体在-0.19和-0.3伏特显示出在电动产生的Solas和Revera流体的波谱中不存在的特征峰。
根据特定方面，这些结果示出本发明的电动产生的Solas和Revera流体与非电动产生的盐水对照流体相比的独特的电化学特性。根据另外的方面，所述结果表明相对非电动产生的流体，电动产生的流体中存在或产生不同浓度的电活性氧化还原化合物和新的和/或独特的电活性氧化还原化合物中的至少一者。
除了在本文其它地方呈现的各种生物数据外，这种有差别的伏安数据尤其在连同对全细胞电导的差别效应13C NMR线宽分析和混合装置的部件局部效应(例如电压脉冲和电流和/或电流脉冲)一起考虑时表明本发明的电动产生的流体不仅在根木上区别于现有技术的流体，而且提供了本文目前所公开并要求保护的新颖组合物和实质效用。
实施例23
(在灌注了本发明的电动产生的流体(RNS-60)的支气管上皮细胞(BEC)上进行的膜片钳分析揭示暴露于RNS-60导致全细胞电导的降低，并且用急剧提高全细胞电导的cAMP刺激的″混合物″进行的刺激也提高了全细胞电导的药物敏感部分，其比在基础条件下观察到的高十倍)
在此实施例中，进行膜片钳研究以进一步证实本发明的电动产生的流体通过调节以下至少一者来调节细胞内信号转导的效用：膜结构、膜电位或膜电导率、膜蛋白或受体、离子通道和钙依赖性细胞通信系统。
综述。如以上实施例14中所示(例如图75，其示出使用Bio-LayerInterferometry生物传感器、Octet Rapid Extended Detection(RED)(forteBioTM)与B2受体结合的缓激肽的稳定作用)，与B2受体结合的缓激肽为浓度依赖性，并且与生理盐水相比在本发明公开的电动产生的流体(例如Rev；富含气体的电动产生的流体)中增加了结合亲和力。另外，如在用PM刺激的T调节性细胞的背景下的实施例15中所示，数据示出在对照流体(无Rev，无Solis)中存在PM和Rev相比PM减少了T调节性细胞的增殖(图76)，这表明本发明的电动产生的流体Rev改善了调节性T细胞的功能(例如，如通过该测定中相对减少的增殖所示)。此外，暴露于本发明的流体导致与盐水和培养基对照(无PM)相比IL-10的产生持平或仅略微减少。同样，在PM刺激的PBMC的AA概况的背景下，数据示出暴露于本发明公开的流体(″PM+Rev″)导致类似于盐水和培养基对照的类胰蛋白酶水平的显著降低。另外，实施例15和图76-83示出的白喉毒素(DT390)效应表明β阻断、GPCR阻断和钙通道阻断影响电动产生的流体对Treg和PBMC功能的活性。此外，实施例18中的数据示出根据另外的方面，当暴露于本发明的流体时，紧密连接相关蛋白在肺组织中被上调。图85-89分别示出连接粘附分子JAM 2和JAM 3、GJA1、GJA3、GJA4和GJA5(连接黏附素)、OCLN(闭合蛋白)、密蛋白(例如CLDN 3、5、7、8、9、10)、TJP1(紧密连接蛋白1)的上调。
进行膜片钳研究以进一步调查和确认所述效用。
材料和方法：
在膜片钳研究中使用支气管上皮细胞系Calu-3。使Calu-3支气管上皮细胞(ATCC #HTB-55)生长在补充有10％FBS到玻璃盖片上的Ham’s F12和DMEM培养基的1∶1混合物中直到实验时间。简言之，使用全细胞电压钳装置来测量对暴露于本发明的电动产生的流体(例如RNS-60；包含60ppm溶解氧的电动处理的生理盐水；有时在此实施例中被称作″药物″)的Calu-3细胞的作用。
利用膜片钳技术来评定测试材料(RNS-60)对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。具体而言，在由以下组成的浴溶液中对支气管上皮细胞系Calu-3进行全细胞电压钳：135mM NaCl、5mM KCl、1.2mM CaCl2、0.8mM MgCl2和10mM HEPES(用N-甲基D-葡萄糖胺将pH调整到7.4)。对基础电流进行测量，在这之后将RNS-60灌注到细胞上。
更具体而言，用两阶段的Narishige PB-7垂直拉出器将膜片移液管从硼硅玻璃(Garner Glass Co，Claremont，CA)中拉出，然后用Narishige MF-9显微拉制仪(Narishige International USA，East Meadow，NY)将其火抛光(fire-polished)到6-12莫姆之间的阻抗。使所述移液管充满细胞内溶液，该细胞内溶液包含(以mM计)：135KCl、10NaCl、5EGTA、10Hepes，用NMDG(N-甲基-D-葡糖胺)将pH调整到7.4。
将培养的Calu-3细胞放在包含以下细胞外溶液(以mM计)的室中：135NaCl、5KCl、1.2CaCl2、0.5MgCl2和10Hepes(游离酸)，用NMDG将pH调整到7.4。
使用Olympus IX71显微镜(Olympus Inc.，Tokyo，Japan)的40XDIC物镜观察细胞。在建立细胞附着的千兆欧封口后，施加轻缓的泵送以破入并获得全细胞构型。在破入时立即对细胞给予-120、-60、-40和0mV的电压钳位，并且用±100mV之间的电压阶跃(500ms/阶跃)进行刺激。在采集对照条件下的全细胞电流后，使测试流体将相同的细胞通过浴槽灌注，所述测试流体包含与以上对照流体相同的细胞外溶质和pH，并且用相同的方案记录不同保持电位的全细胞电流。
用在10kHz低通过滤的Axon Patch 200B放大器获取电生理数据，并且用1400A Digidata(Axon Instruments，Union City，CA)进行数字化。使用pCLAMP 10.0软件(Axon Instruments)来获取并分析该数据。通过到这一步将大约400毫秒的实际电流值对保持电位(V)作图获得电流(I)与电压(V)的关系(全细胞电导)。I/V关系的斜率为全细胞电导。
药物和化学品。无论何时指出，用包含8-Br-cAMP(500mM)、IBMX(异丁基-1-甲基黄嘌呤，200mM)和福斯高林(10mM)的cAMP刺激性混合物刺激细胞。从水溶液中的25mM原液中使用cAMP的类似物8-Br-cAMP(Sigma Chem.Co.)。从包含10mM福斯高林和200mM IBMX储备溶液的DMSO溶液中使用福斯高林(Sigma)和IBMX(Sigma)。
膜片钳结果：
图100示出在基础(无cAMP)条件下的全细胞电流，具有从零mV保持电位阶跃到+/-100mV的方案。代表性描记为n＝12个细胞的平均值。左侧的描记为对照，然后为灌注测试溶液时的全细胞描记(中间)。右侧的描记是通过从对照条件下减去测试的平均值而获得的复合物δ。从电流与电压的关系获得的全细胞电导在两种条件下均为高度线性的并且反映出归因于测试条件的电导的适中但显著的改变。对全细胞电导的贡献即由药物(本发明的电动产生的流体)抑制的分量也为线性，并且逆转电位在零mV附近。在超极化条件下存在全细胞电导的降低。
图101示出在基础条件下的全细胞电流，具有从-40mV保持电位阶跃到±100mV的方案。代表性描记为n＝12个细胞的平均值。左侧的描记为对照，然后为灌注测试溶液时的全细胞描记(中间)。右侧的描记是通过从对照条件下减去测试的平均值而获得的复合物δ。从电流与电压的关系获得的全细胞电导在两种条件下均为高度线性的并且反映出归因于测试条件的电导的适中但显著的改变。对全细胞电导的贡献即由药物(本发明的电动产生的流体)抑制的分量也为线性，并且逆转电位在零mV附近。各个值与零mV方案获得的值比较相似。
图102示出在基础条件下的全细胞电流，具有从-60mV保持电位阶跃到±100mV的方案。代表性描记为n＝12个细胞的平均值。左侧的描记为对照，然后为灌注测试溶液时的全细胞描记(中间)。右侧的描记是通过从对照条件下减去测试的平均值而获得的复合物δ。从电流与电压的关系获得的全细胞电导在两种条件下均为高度线性的并且反映出归因于测试条件的电导的较小但显著的改变。对全细胞电导的贡献即由药物抑制的分量也为线性，并且逆转电位在零mV附近。各个值与零mV方案获得的值比较相似。
图103示出在基础条件下的全细胞电流，具有从-120mV保持电位阶跃到±100mV的方案。代表性描记为n＝12个细胞的平均值。左侧的描记为对照，然后为灌注测试溶液时的全细胞描记(中间)。右侧的描记是通过从对照条件下减去测试的平均值而获得的复合物δ。从电流与电压的关系获得的全细胞电导在两种条件下均为高度线性的并且反映出归因于测试条件的电导的较小但显著的改变。对全细胞电导的贡献即由药物抑制的分量也为线性，并且逆转电位在零mV附近。各个值与零mV方案获得的值比较相似。
图104示出在cAMP刺激条件下的全细胞电流，用从各个保持电位阶跃至±100mV的方案获得。代表性描记为n＝5个细胞的平均值。左侧的描记为对照，然后为cAMP刺激之后的全细胞描记，接着为用包含药物的溶液灌注。右侧的描记为通过从对照条件下(单独的cAMP)减去药物+cAMP的测试平均值而获得的复合物δ。在顶部的描记是从0mV电压方案获得的描记，并且下面的那些是在-40mV的描记。从电流与电压的关系获得的全细胞电导在所有条件下均为高度线性的并且反映了归因于测试条件的电导改变。
图105示出在cAMP刺激条件下的全细胞电流，用从各个保持电位阶跃至±100mV的方案获得。代表性描记为n＝5个细胞的平均值。左侧的描记为对照，然后为cAMP刺激之后的全细胞描记，接着为用包含药物的溶液灌注。右侧的描记为通过从对照条件下(单独的cAMP)减去药物+cAMP的测试平均值而获得的复合δ。在顶部的描记是从-60mV电压方案获得的描记，并且下面的那些是在-120mV的描记。从电流与电压的关系获得的全细胞电导在所有条件下均为高度线性的并且反映了归因于测试条件的电导改变。
图106示出保持电位对cAMP激活电流的作用。在不同电压方案(0、-40、-60、-120mV保持电位)下观察到药物(本发明的电动产生的流体；RNS-60；包含60ppm溶解氧的电动处理的生理盐水)对全细胞电导的作用。在基础条件下，药物敏感的全细胞电流在所有保持电位均相同(电压不敏感的贡献，左上图)。然而，在cAMP激活的情况中，药物敏感的电流要高得多，并且对施加的电压方案敏感。电流与电压的关系是高度非线性的。这也可在减去的电流(底图)中观察到，其中对于每一个方案(n＝5)进一步减去全细胞电导在零mV的贡献。
实施例概述。因此，根据特定方面，数据表明在基础条件下存在适中但一致的药物(本发明的电动产生的流体；RNS-60；包含60ppm溶解氧的电动处理的生理盐水)作用。为了增强药物对全细胞电导的作用，通过在刺激后使药物灌注cAMP刺激的″混合物″(这急剧提高了全细胞电导)也进行了实验。有趣的是，这个方案也提高了全细胞电导的药物敏感部分，其比在基础条件下所观察到的高十倍。另外，在cAMP刺激的存在下，药物对于各种电压方案示出不同的作用，表明所述电动产生的流体影响全细胞电导的电压依赖性贡献。电导的线性分量也存在降低，进一步表明至少药物有助于抑制另一途径(例如，离子通道、电压门控的阳离子通道等)。
在特定方面并且不受机制约束，申请人的数据与本发明的电动产生的流体(例RNS-60；包含60ppm溶解氧的电动处理的生埋盐水)一致，所述电动产生流体在被阻断或从质膜收回的通道上产生改变。
将申请人的其它数据(例如，工作实施例的数据)合在一起，本发明的特定方面提供了用于调节细胞内信号转导的组合物和方法，包括对膜结构、膜电位或膜电导率、膜蛋白或膜受体、离子通道和钙依赖性细胞信号传导系统中至少一者的调节，包括使用本发明的电动产生的溶液来赋予膜结构(例如膜和/或膜蛋白、受体或其它组分)中的电化学和/或构象的改变，所述膜结构包括但不限于GPCRs和/或g蛋白。根据另外的方面，这些效应调节基因表达，并且可维持对例如个体通信组分的半衰期等的依赖性。
实施例24
(对灌注了本发明电动产生的流体(RNS-60和Solas)的Calu-3细胞进行的膜片钳分析表明(i)暴露于RNS-60和Solas使得全细胞电导增加；(ii)培育15分钟时证明，细胞暴露于RNS-60使非线性电导增加；和(iii)细胞暴露于RNS-60使RNS-60盐水对钙离子可通透通道产生作用)
综述。在本实施例中，进行膜片钳研究，以进一步证实本文中所描述的本发明电动产生的盐水流体(RNS-60和Solas)的效用，包括调节全细胞电流的效用。进行了两组实验。
第一组实验数据的汇总表明，Solas盐水中获得的全细胞电导(电流与电压关系)在两个培育时间(15分钟，2小时)和所有的电压方案中均是高度线性的。然而，明显的是用Solas培育较长时间(2小时)使全细胞电导增加。如δ电流(Rev减去Sol)所示，细胞暴露于RNS-60使非线性电导增加，这仅在培育15分钟时是明显的。而培育2小时时，RNS-60对此非线性电流的作用消失，反而是高度线性的。如之前所观察到的，非线性全细胞电导的贡献是电压敏感性的，尽管其存在于所有的电压方案中。
第二组实验的数据汇总表明，RNS-60盐水对非线性电流有作用，这在外部溶液钙离子浓度较高时很明显。非线性全细胞电导的贡献存在于所有的电压方案中，尽管其是电压敏感性的，并且其显示RNS-60盐水对钙离子可通透通道产生作用。
第一组实验(电导增加；和非线性电压调节的电导的活化)
第一组实验的方法：
常规的膜片钳方法参见实施例23。在下列第一组实验中，利用Calu-3细胞在基础条件下并利用从0mV保持电位、-120mV或-60mV阶跃的方案进行膜片钳研究，以进一步证实本发明电动产生的盐水流体(RNS-60和Solars)调节全细胞电流的效用。
在每种情况下，从培育15分钟或2小时的细胞中获得电流与电压关系，并从该关系中得到全细胞电导，以进一步证实实施例23的结果。在本研究中，对于Solas或RNS-60盐水溶液，在给定时间获得数据组。所获得的数据以5-9个细胞中全细胞电流的平均值±SEM表示。
结果：
图117A-C示出一系列膜片钳实验的结果，这些实验在两个时间点(15分钟(左图)和2小时(右图))和不同的电压方案中((A，从omV阶跃；B，从-60mV阶跃；C，从-120mV阶跃)评价电动产生的流体(例如RNS-60和Solas)对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。这些结果表明，RNS-60(实心圆)比Solas(空心圆)对全细胞电导具有较大作用。在实验中，在3种电压方案中以及15分钟和2小时培育时间点均观察到了相似的结果。
图118A-C示出在3种电压方案(″δ电流″)(A，从0mV阶跃；B，从-60mV阶跃；C，从-120mV阶跃)和2个时间点(15分钟(空心圆)和2小时(实心圆))，RNS-60电流数据减去Solas电流数据所得到的结果图。这些数据表明，RNS-60在15分钟的时间点时具有非线性电压依赖性分量，而在2小时时间点则没有。
在此前的实验中，″生理″盐水的数据作为参照显示出非常一致的非时间依赖性电导。通过将数据组与Solas或RNS-60盐水配对得到本结果，该结果表明使Calu-3细胞暴露于RNS-60盐水在基础条件下(无cAMP，或者任何其它刺激)产生了时间依赖性效应，其与培育时间较短(15分钟)时电压调节的电导的活化相一致。此现象在2小时的培育时间点并不明显。如本文另外所描述，当电导在用cAMP″混合物″刺激下增加时，线性分量更加明显。然而对于RNS-60和Solas，培育2小时均表现出更高的线性电导，并且在这种情况下，与单独的Solas相比，RNS-60盐水的电导加倍。该证据表明，至少全细胞电导的两种贡献受到RNS-60盐水的影响，即非线性电压调节之电导的活化以及线性电导，所述影响在培育时间较长时更加明显。
第二组实验(对钙离子可通透通道的作用)
第二组实验的方法：
常规的膜片钳方法参见实施例23。在下列第二组实验中，利用Calu-3细胞在基础条件下并利用从0mV保持电位、-120mV保持电位阶跃的方案进行附加的膜片钳研究，以进一步证实本发明电动产生的盐水流体(RNS-60和Solars)调节全细胞电流的效用。
在每种情况下，从培育15分钟的细胞中获得电流与电压关系，并从该关系中得到全细胞电导。为了确定钙离子通道对全细胞电导是否有贡献以及在RNS-60盐水中培育是否影响这部分全细胞电导，培育期后将细胞在正常盐水中钳接(patched)(使外部溶液中NaCl浓度较高，而内部溶液含有高浓度KCl)。随后用以CsCL替换NaCl的溶液替代外部盐水，以确定替换了主要的外部离子后电导是否发生变化。在这些条件下，随后使相同的细胞暴露于浓度逐渐增加的钙离子中，以使钙离子进入的步骤更加明显。
结果：
图119A-D显示一系列膜片钳实验的结果，该实验利用不同的外部盐溶液和在不同的电压方案(图A和C显示从0mV的阶跃，而图B和D显示从-120mV的阶跃)评价电动产生的流体(例如Solars(图A和B)和RNS-60(图C和D))对上皮细胞膜极性和离子通道活性的作用。在这些实验中使用15分钟的一个时间点。对于Solas(图A和B)，结果表明：1)与对照(菱形符号)相比，利用CsCl(方形符号)而非NaCl作为外部溶液使全细胞电导以线性方式增加；和2)20mM CaCl2(圆形符号)和40mM CaCl2(三角形符号)的CaCl2均使全细胞电导以非线性方式增加。对于RNS-60(图C和D)，结果表明：1)与对照(菱形符号)相比，利用CsCl(方形符号)而非NaCl作为外部溶液对全细胞电导几乎没有作用；和2)40mM(三角形符号)的CaCl2使全细胞电导以非线性方式增加。
图120A-D显示对于Solas(图A和B)和RNS-60(图C和D)，在两种电压方案中(图A和C，从0mV阶跃；以及图B和D，从-120mV阶跃)从20mM CaCl2(菱形符号)和40mM CaCl2(方形符号)电流数据中减去CsCl电流数据(在图119中示出)所得到的结果图。结果表明，Solas和RNS-60溶液均能够活化钙诱导的非线性全细胞电导。RNS-60的作用更显著(显示出剂量反应性)，并且RNS-60的作用仅在钙浓度较高时增加。此外，电压方案使得钙浓度较高时非线性钙依赖性电导也得以增加。
对于Calu-3细胞中获得的全细胞电导数据，第二组实验的数据进一步表明RNS-60盐水和Solas盐水的作用。数据显示，在任一盐水中培育15分钟对全细胞电导产生不同的作用，该作用在RNS-60中以及当外部钙离子增加时最为明显，并且进一步表明RNS-60使全细胞电导的钙依赖性非线性分量增加。
累计证据表明了Revalesio盐水对离子通道的活化作用，其对基础细胞电导产生不同的贡献。
与申请人的其它数据(例如申请人其它工作实施例的数据)合在一起，本发明的特定方面提供了调节细胞内信号转导(包括调节膜结构、膜电位或膜电导率、膜蛋白或受体、离子通道、脂质组分或细胞可交换的细胞内组分(例如信号转导途径，如钙依赖性细胞信号转导系统)中的至少一者)的组合物和方法，包括利用本发明电动产生的溶液使膜结构(例如膜和/或膜蛋白、受体或其它膜组分)发生电化学和/或构象变化，所述膜结构包括但不限于GPCRs和/或g蛋白。根据另外的方面，这些效应调节基因表达，并且可维持对例如个体通信组分的半衰期等的依赖性。
实施例25
(对本发明电动产生的流体(RNS-60)的原子力显微镜(AFM)测量表明疏水性表面纳米泡的存在和/或形成，所述纳米泡基本上小于对照″压力罐″PNS-60)流体中存在的纳米泡)
综述。申请人利用原子力显微镜(AFM)测量对本发明的电动流体(RNS-60)中的疏水性纳米泡进行表征。
材料和方法：
AFM研究。AFM研究在本领域认可的Nanotech User Facility(NTUF)处进行。对于AFM研究，将非常小并且灵敏的探针浸入到置于疏水性表面的水滴中。随后探针在如～15分钟中1mm2的速率下扫描水/表面界面。探针记录表面几何形状的任何缺陷，并且足够灵敏以记录小气泡的存在。
利用三氯(1H，1H，2H，2H-全氟辛基)硅烷)制备水滴置于其上的硅基板，产生的疏水性表面使水起泡并具有大约95度的接触角。此涂层用于很多AFM研究中，部分是由于其特别耐用。
溶液制备。研究了两种测试溶液：RNS-60和PNS-60。RNS-60是包含60ppm氧的本发明电动流体，而PNS-60为包含60ppm氧的非电动对照流体，其通过常规暴露于加压氧喷头(即压力罐氧合流体)来制备。每种测试溶液最初通过加入少量的中性磷酸盐缓冲液(pH 7)进行缓冲，并将大约60-70μL经缓冲的每种测试溶液(大约22℃)置于此前制备的硅板上。
结果：
在AFM下，RNS-60水滴显示在1mm2的区域内分布大约20个疏水性纳米泡，其具有～20nm宽和～1.5nm高的尺寸或更小(图121A)。相比之下，在AFM下，PNS-60水滴显示在1mm2的区域内分布大约5个疏水性纳米泡，其具有～60nm宽和～5nm高的尺寸(图121B)。因此，与RNS-60水滴相比，PNS-60水滴具有较少并且较大的疏水性纳米泡。
因此，根据特定方面，RNS-60和PNS-60测试溶液之间疏水性表面纳米泡的尺寸和分布具有显著差异，其中纳米气泡最初存在于和/或在AFM测定过程中形成于测试流体中。
如本文其它地方所讨论，根据本发明的特定方面，本发明电动改变的流体是包含电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定形成，其量足以提供在所述细胞接触活细胞时对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一种的调节。
然而，申请人指出，疏水性泡(形成于疏水性表面)，如在AFM实验中所观察到的，可能与本文公开所发明的具有生物活性、电荷稳定的纳米结构从根本上不同。因此，根据特定方面，基于疏水性泡形成的尺寸和分布，本工作实施例中的AFM实验表明本发明电动流体(例如RNS-60)与非电动对照流体从根本上不同，疏水性泡可能与本文另外详细描述的电荷稳定的含氧纳米结构不同，和/或来源于所述纳米结构。在任何情沉下，相对于本发明的电动流体，对照压力罐氧合流体不包含能够调节细胞膜电位和细胞膜电导率中至少一者的电荷稳定的含氧纳米结构。
实施例26
(荧光激活细胞分选(FACS)分析显示RNS-60对下列细胞表面受体的表达具有显著作用：CD193(CCR3)；CD154(CD40L)；CD11B和CD3)
综述。申请人使用荧光激活细胞分选(FACS)分析来比较细胞表面受体CD193(CCR3)；CD154(CD40L)；CD11B；和CD3在用本发明的电动流体(RNS-60)或生理盐水对照流体培育的白细胞上的表达水平。
方法：
将聚蔗糖-泛影葡胺分离的PBMC(血浆分离置换法-所有细胞)在30％的RNS60溶液或生理盐水(NS)中预培育大约1小时；
将PBMC用2μg/ml PHA-L活化24或40小时；
将细胞采集并洗涤到封闭/染色缓冲液中，染色并固定；并且
通过流式细胞术对细胞进行分析。
结果：
对于CD193(CCR3)，如图122B所示，当与生理盐水对照中的受体表达水平相比时，受体在存在RNS-60的情况下基本上下调。此下调影响MAPK p38的磷酸化(未示出数据)，这又下调嗜酸细胞活化趋化因子(例如参见实施例13和图57)，其又下调IL 5(未示出数据)以及改变嗜酸性粒细胞计数(例如参见实施例13)，这是该实施中改变支气管收缩反应的因素之一。
如上述卵白蛋白激发模型背景下的实施例13中所述以及图57中所示，RNS-60相比对生理盐水的作用而言降低了OVA激发组中血清嗜酸细胞活化趋化因子水平。因此，根据特定方面，RNS-60具有降低配体嗜酸细胞活化趋化因子及其受体CCR3的潜力。
对于CD154(CD40L)，如图123A所示，当与生理盐水对照中的受体表达水平相比时，受体在存在RNS-60的情况下基本上下调。
对于CD11B，如图123B所示，当与生理盐水对照中的受体表达水平相比时，受体在存在RNS-60的情况下基本上下调。
对于CD3，，如图123C所示，当与生理盐水对照中的受体表达水平相比时，受体在存在RNS-60的情况下基本上下调。
实施例27
(RNS60而非生理盐水(NS)降低了MBP活化的T细胞中NFκB的活化)
此实施例显示RNS60而非生理盐水(NS)降低了MBP活化的T细胞中NFκB的活化。根据特定方面，因此，本发明的电动产生的流体对治疗包括但不限于下列的炎症以及炎症介导的病症和疾病具有实质效用：糖尿病和相关代谢障碍、胰岛素抵抗、神经变性疾病(例如M.S.，Parkinson’s，Alzheimer’s等)、哮喘、囊性纤维化、血管/冠心病、视网膜和/或黄斑变性、消化障碍(例如炎性肠疾病、溃疡性结肠炎，Crohn’s等)。
综述：
越趋明显的是胰岛素受体信号转导途径的抑制为炎症和应激反应介导胰岛素抵抗的中心机制(参见例如Wellen & Hotamisligil，TheJournal of Clinical Investigation，115：1111-1119，2005中所综述)。
代谢和免疫通路的重叠。若干种丝氨酸/苏氨酸激酶由炎症或应激刺激活化并且有助于抑制胰岛素信号转导，包括JNK、NF-κB激酶抑制剂(IKK)和PKC-θ(Zick，Y.2003.Role of Ser/Thr kinases in theuncoupling of insulin signaling(丝氨酸/苏氨酸激酶在胰岛素信号转导解偶联中的作用)，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.27(增刊3)：S56-S60))。再次，肥胖症中这些激酶的活化凸显了代谢和免疫通路的重叠；这些激酶为相同的激酶，特别是IKK和JNK，其通过Toll样受体(TLR)信号转导在天然免疫反应中被活化，以反应LPS、肽聚糖、双链RNA和其它微生物产物(Medzhitov，R.2001，Toll-likereceptors and innate immunity(Toll样受体和天然免疫)，Nat.Rev.Immunol.1：135-145)。因此，很可能TLR信号转导途径的元件还会表现出强的代谢活性。
PKC和IKK由细胞脂质代谢物活化。在对抗胰岛素作用(特别是反应脂质代谢物)方面起到很大作用的两种其它炎症激酶为IKK和PKC-θ。已证实脂质输注导致细胞内脂肪酸代谢物例如二酰甘油(DAG)和脂肪酰CoAs的水平的升高。此升高与PKC-θ的活化和IRS-1的升高的Ser307磷酸化相关(Yu，C.等，2002，Mechanism by whichfatty acids inhibit insulin activation of insulin receptor substrate-1(IRS-1)-associated phosphatidylinositol 3-kinase activity in muscle(脂肪酸对与肌内胰岛素受体底物-1(IRS-1)相关的磷脂酰肌醇3-激酶活性的胰岛素活化进行抑制的机制)，J.Biol.Chem.277：50230-50236)。PKC-θ可通过活化另一种丝氨酸/苏氨酸激酶IKKβ或JNK来削弱胰岛素作用(Perseghin，G.，Petersen，K.和Shulman，G.I.2003，Cellularmechanism of insulin resistance：potential links with inflammation(胰岛素抵抗的细胞机制：与炎症的潜在联系)，Int.J.Obes.Relat.Metab.Disord.27(增刊3)：S6-S11)。还报导其它PKC同种型由脂质活化并且也参与胰岛素信号转导的抑制(Schmitz-Peiffer，C.2002.Proteinkinase C and lipid-induced insulin resistance in skeletal muscle(骨肌中蛋白激酶C和脂质诱导的胰岛素抵抗)，Ann.N.Y.Acad.Sci。967：146-157)。
IKKβ可通过活化NF-κB影响胰岛素信号转导。IKKβ可通过至少2条通路影响胰岛素信号转导。首先，其可直接使IRS-1在丝氨酸残基上磷酸化(Yin，M.J.、Yamamoto，Y.和Gaynor，R.B.1998。Theanti-inflammatory agents aspirin and salicylate inhibit the activity of IκBkinase-β(抗炎剂阿斯匹林和水杨酸盐抑制IκB激酶-β的活性)，Nature.396：77-80，Gao，Z.等，2002；Serine phosphorylation of insulin receptorsubstrate 1 by inhibitor kappa B kinase complex(通过抑制剂k B激酶复合物对胰岛素受体底物1进行丝氨酸磷酸化)，J.Biol.Chem.277：48115-48121)。
其次，其可，使NF-κB(IκB)的抑制剂磷酸化，从而活化NF-κB，一种尤其靶向、刺激多种炎症介质(包括TNF-α和IL-6)的转录因子(Shoelson，S.E.、Lee，J.和Yuan，M.2003。Inflammation and theIKKβ/IκB/NF-κB axis in obesity-and diet-induced insulin resistance(肥胖症和饮食诱导的胰岛素抵抗中的炎症和IKKβ/IκB/NF-κB轴)，Iht.J.Obes.Relat.Metab.Disord.27(增刊3)：S49-S52)。IKKβ呈杂合的小鼠部分免于由脂质输注、高脂饮食或遗传性肥胖症所引起的胰岛素抵抗(Yuan，M.等，2001。Reversal of obesity-and diet induced insulinresistance with salicylates or targeted disruption of IKKβ(用水杨酸盐或IKKβ的靶向断裂逆转肥胖症和饮食诱导的胰岛素抵抗)，Science.293：1673-1677；Kim，J.K.等，2001；Prevention of fat-induced insulinresistance by salicylate(通过水杨酸盐预防脂肪诱导的胰岛素抵抗)，J.Clin.Invest.108：437-446；doi：10.1172/JCI200111559)。
此外，通过高剂量阿斯匹林治疗抑制人类糖尿病中的IKKβ还改善了胰岛素信号转导，尽管在此剂量下，尚未明确其它激酶是否也会受影响(Hundal，R.S.等，2002，Mechanism by which high-dose aspirinimproves glucose metabolism in type 2diabetes(高剂量阿斯匹林改善2型糖尿病中葡萄糖代谢的机制)，J.Clin.Invest.109：1321-1326.doi：10.1172/JCI200214955)。最近的研究已开始研究IKK在各个组织或细胞类型中形成胰岛素抵抗的重要性。肝脏和髓细胞中IKK的活化似乎有助于肥胖症诱导的胰岛素抵抗，尽管此通路在肌肉中可能并非如此重要(Cai，D.等，2005，Local and systemic insulin resistanceresulting from hepatic activation of IKKβ and NF-κB(由IKKβ和NF-κB的肝活化造成的局部和全身性胰岛素抵抗)，Nat.Med.11：183-190；Arkan，M.C.等，2005；(IKKβ links inflammation to obesity-inducedinsulin resistance)IKKβ使炎症与肥胖症诱导的胰岛素抵抗相关，Nat.Med.11：191-198；和Rohl，M.等，2004，Conditional disruption of IκBkinase 2 fails to prevent obesity-induced insulin resistance(IκB激酶2的条件性中断无法预防肥胖症诱导的胰岛素抵抗)，J.Clin.Invest.113：474-481；doi：10.1172/JCI200418712)。
方法。对于图124A和图124B中示出的实验，将从MBP免疫细胞分离的T细胞用MBP预先活化，并且在24小时后，使细胞接受不同浓度的RNS60和NS。处理2小时后，通过电泳迁移率变动分析(EMSA)监测核提取物中的NF-κB的DNA结合活性。
对于图124C所示出的实验，将从MBP免疫细胞中分离的T细胞用PBIIX-Luc(NF-κB依赖性报告基因构造体)转染，然后用MBP再次活化。用MBP活化24小时后，将细胞用不同浓度的RNS60和NS处理2小时，然后通过荧光素酶测定试剂盒(Promega)测定总细胞提取物中的荧光素酶活性。在其它情况下，还将MBP活化的T细胞用30nM PMA活化1小时。在这些情况下，在用RNS60和NS预处理1小时后添加PMA。结果为三个不同实验的平均+SD。
结果。图124A-C显示RNS60而非生理盐水(NS)降低了MBP活化的T细胞中NF-κB的活化。具体地讲，图124A和124B显示RNS60(参见图124A和124B的中间三个泳道)而非NS(参见图124A和124B的最右侧泳道)以剂量反应的方式降低了MBP活化的T细胞中NF-κB的活化。
同样，图124C的条形图显示RNS60(参见图124A和124B中第二、第三和第四个条带)而非NS(参见图124A和124B中第五个条带)降低了MBP活化的T细胞中NF-κB的活化，并且因此还以剂量反应的方式降低了总细胞提取物中转染NF-κB依赖报告基因构造体(PBIIX-Luc)的荧光素酶活性。
根据特定方面，因此，本发明公开的电动产生的流体对治疗包括但不限于下列的炎症以及炎症介导的病症和疾病具有实质效用：糖尿病和相关代谢障碍、胰岛素抵抗、神经变性疾病(例如M.S.，Parkinson’s，Alzheimer’s等)、哮喘、囊性纤维化、血管/冠心病、视网膜和/或黄斑变性、消化障碍(例如炎性肠疾病、溃疡性结肠炎，Crohn’s等)。
以引用方式并入
在本说明书中提到和/或在本申请的数据单中列出的以上所有的美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均通过引用的方式整体并入本文。
应当理解附图和详细描述，应理解为进行说明而非限制，并且并非旨在将本发明限制为所公开的具体的形式和实例。相反，本发明包括对于本领域的普通技术人员明显的任何其它的修改、改变、重排、更换、替代、设计的选择和实施方案，而不背离本发明的精神和范围，如下列权利要求所定义。因此，应将下列权利要求解释为包括所有这些其它的修改、改变、重排、更换、替代、设计的选择和实施方案。
上述实施方案描绘了包含不同的其它部件之内或与其连接的不同部件。应该理解这种描绘的结构仅是示例性的，并且事实上可实施实现相同功能的许多其它结构。在概念的意义上，将实现相同功能的任何部件的排列有效地″关联″，以使得期望的功能得以实现。因此，若不考虑结构或中间部件，联合实现具体功能的本文的任何两个部件可视为彼此″相关联″，使得期望的功能得以实现。同样，如此关联的任何两个部件也可视作彼此″可操作地相连″或″可操作地连接″来实现期望的功能。
尽管已经对本发明的具体实施方案进行了显示和描述，对本领域的熟练技术人员将明显的是，基于本文的教导，可以进行改变和修改而不背离本发明及其较广泛的方面，因此，所附的权利要求在其范围之内涵盖如本发明的真正精神和范围之内的所有这种改变和修改。此外，必须理解本发明仅由所附的权利要求限定。本领域内技术人员将理解，一般而言，本文且尤其在所附权利要求(例如所附权利要求的主体)中所使用的术语一般旨在作为″开放式″术语(例如，术语″包括″应解释为″包括但不限于″，术语″具有″应解释为″至少具有″，术语″包含″应解释为″包含但不限于″等)。本领域内的技术人员还将理解，如果介绍的权利要求的陈述内容的具体数目是预期的，这种预期将明确地在该权利要求中陈述，并且在不存在此陈述时就不存在这种预期。例如，作为对理解的辅助，下列所附权利要求可包含介绍性短语″至少一种″和″一种或多种″的使用以介绍权利要求的陈述内容。然而，这种短语的使用不应解释为暗示通过不定冠词″一(a)″或″一(an)″介绍一项权利要求陈述内容将包含这种介绍的权利要求陈述内容的任何具体的权利要求限制成仅包含一项这种陈述内容的发明，即使当相同的权利要求包括介绍性短语″一种或多种″或″至少一种″和不定冠词例如″一(a)″或″一(an)″时(例如，″一(a)″或″一(an)″通常应解释为表示″至少一种″或″一种或多种″)；对于用来介绍权利要求陈述内容的定冠词的使用同样也是如此。此外，即使明确地陈述介绍的权利要求陈述内容的具体数目，本领域的技术人员也会认识到这种陈述应通常被解释为表示至少所陈述的数目(例如，无其它修饰语的″两种陈述内容″的单纯陈述通常表示至少种陈述内容或两种或更多种陈述内容)。因此，本发明仅受所附权利要求限制。
Figure IDA0000102298950000011

Claims (53)

1.一种治疗糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的方法，所述方法包括对有需要的受试者施用治疗有效量的电动改变的含水流体，所述电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地成形，其量足以治疗糖尿病或糖尿病相关的病症或疾患或至少其一种症状。
2.根据权利要求1所述的电动流体，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构是所述流体中主要的电荷稳定的含气体的纳米结构物质。
3.根据权利要求1所述的电动流体，其中所述流体中作为电荷稳定的含氧纳米结构存在的溶解氧分子的百分比选自大于以下的百分比：0.01％、0.1％、1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％和95％。
4.根据权利要求1所述的电动流体，其中总的溶解氧基本上存在于所述电荷稳定的含氧纳米结构中。
5.根据权利要求1所述的电动流体，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于选自以下尺寸的平均直径：90nm、80nm、70nm、60nm、50nm、40nm、30nm、20nm、10nm；以及小于5nm。
6.根据权利要求1所述的电动流体，其中所述离子水溶液包括盐水溶液。
7.根据权利要求1所述的电动流体，其中所述流体是超氧合的。
8.根据权利要求1所述的电动流体，其中所述流体包括溶剂化电子的形式。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动改变的含水流体的改变包括使所述流体暴露于流体动力诱导的局部化电动效应。
10.根据权利要求9所述的方法，其中暴露于所述局部化电动效应包括暴露于电压脉冲和电流脉冲中的至少一种。
11.根据权利要求9所述的方法，其中使所述流体暴露于流体动力诱导的局部化电动效应包括使所述流体暴露于用以产生所述流体的装置的诱导电动效应的结构特征。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖尿病相关病症或疾患包括选自以下中的至少一种：糖尿病、胰岛素依赖型糖尿病或IDDM(1型)、非胰岛素依赖型糖尿病或NIDDM(2型)、胰岛素抗性；和糖尿病性视网膜病。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述糖尿病相关病症或疾患包括糖尿病和胰岛素抗性中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述糖尿病相关病症或疾患包括糖尿病。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述糖尿病相关病症或疾患的至少一种症状与至少一种选自以下的病症相关：慢性炎症、急性炎症、胰岛素抗性。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动改变的含水流体调节一氧化氮的局部或细胞水平。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动改变的含水流体促进至少一种选自以下的细胞因子在施用部位的局部减少：IL-1β、IL-8、TNF-α和TNF-β。
18.根据权利要求1所述的方法，还包括通过同时或辅助地用另外的抗炎剂治疗受试者来协同或非协同地抑制或减轻炎症。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述其它抗炎剂包括类固醇或糖皮质激素类固醇。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述糖皮质激素类固醇包括布地奈德或其活性衍生物。
21.根据权利要求1所述的方法，还包括联合疗法，其中对患者施用至少一种附加治疗剂。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂选自：双胍类，包括二甲双胍、丁双胍和苯乙双胍；胰岛素；α-葡糖苷酶抑制剂；双胍类；DPP-4抑制剂；氯茴苯酸类；磺脲类；噻唑烷二酮类；α-葡糖苷酶抑制剂，包括阿卡波糖和米格列醇；DPP-4抑制剂，包括维格列汀、西他列汀、沙格列汀、利拉利汀和阿格列汀；磺脲类，包括乙酰苯磺酰环己脲、氯磺丙脲、甲苯磺丁脲、甲磺吖庚脲、格列甲嗪、格列齐特、格列本脲(优降糖)、格列喹酮、格列吡脲和格列美脲；氯茴苯酸类，包括那格列奈、米格列奈和瑞格列奈；噻唑烷二酮类，包括曲格列酮、吡格列酮和罗西格列酮；MMP抑制剂，包括MMP-9和MMP-2的抑制剂；短效β2-激动剂、长效β2-激动剂；抗胆碱能类；皮质类固醇类、全身性皮质类固醇类；肥大细胞稳定剂；白三烯调节剂；甲基黄嘌呤；β2-激动剂；沙丁胺醇、左旋沙丁胺醇；吡布特罗、阿福特罗、福莫特罗、沙美特罗；抗胆碱能类，包括异丙托铵和噻托溴铵；皮质类固醇类，包括倍氯米松、布地奈德、氟尼缩松、氟替卡松、莫米松、去炎松、甲基强的松龙、泼尼松龙、强的松；白三烯调节剂，包括孟鲁司特、扎鲁司特和弃白通；肥大细胞稳定剂，包括色甘酸和萘多罗米；甲基黄嘌呤类，包括茶碱；组合药物，包括异丙托铵和沙丁胺醇、氟替卡松和沙美特罗、布地奈德和福莫特罗；抗组胺剂，包括羟嗪、苯海拉明、氯雷他定、西替立嗪和氢化可的松；免疫系统调节药物，包括他克莫司和吡美莫司；环孢霉素；硫唑嘌呤；麦考酚酸酯；及其组合。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述至少一种附加治疗剂为TSLP和/或TSLPR拮抗剂。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述TSLP和/或TSLPR拮抗剂选自对TSLP和TSLP受体特异性的中和抗体、可溶性TSLP受体分子和TSLP受体融合蛋白，包括TSLPR-免疫球蛋白Fc分子或编码一个以上受体链的组分的多肽。
25.根据权利要求1所述的方法，其中治疗包括改变细胞膜结构或功能中的至少一者，包括改变膜相关蛋白的构象、配体结合活性或催化活性中的至少一者。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述膜相关蛋白包括选自以下的至少一种：受体、跨膜受体、离子通道蛋白、细胞内附着蛋白、细胞粘附蛋白和整联蛋白。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述跨膜受体包括G-蛋白偶联受体(GPCR)。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述G-蛋白偶联受体(GPCR)与G蛋白质α亚单位相互作用。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述G蛋白质α亚单位包括选自以下的至少一种：Gαs、Gαi、Gαq和Gα12。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述至少一种G蛋白质α亚单位为Gαq。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构在所述离子含水流体中稳定地成形，其量足以在所述流体接触活细胞时对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一者提供调节。
32.根据权利要求31所述的方法，其中调节细胞膜电导率包括调节全细胞电导。
33.根据权利要求33所述的方法，其中调节全细胞电导包括调节全细胞电导的至少一种电压依赖性贡献。
34.根据权利要求31所述的方法，包括调节钙依赖性细胞通信途径或系统。
35.根据权利要求31所述的方法，包括调节磷脂酶C活性。
36.根据权利要求31所述的方法，包括调节腺苷酸环化酶(AC)活性。
37.根据权利要求31所述的方法，包括调节与至少一种选自以下的病症或症状相关的细胞内信号转导：慢性炎症、急性炎症和胰岛素抗性。
38.根据权利要求1所述的方法，包括施用至细胞网或细胞层，并且还包括调节其中的细胞间连接
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述细胞内连接包括选自紧密连接、间隙连接、粘着带和桥粒中的至少一种。
40.根据权利要求38所述的方法，其中所述细胞网或层包括选自以下的至少一种：CNS血管中的内皮细胞、内皮星形胶质细胞紧密连接、血-脑脊髓液紧密连接或屏障、肺上皮细胞型连接、支气管上皮细胞型连接和肠上皮细胞型连接。
41.根据权利要求1所述的方法，其中所述电动改变的含水流体是氧合的，并且其中在大气压下所述流体中氧的存在量为至少8ppm、至少15ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
42.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述电动改变的含水流体包括溶剂化电子形式和电动改性或带电氧物质中的至少一种。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述溶剂化电子或电动改性或带电氧物质的存在量为至少0.01ppm、至少0.1ppm、至少0.5ppm、至少1ppm、至少3ppm、至少5ppm、至少7ppm、至少10ppm、至少15ppm或至少20ppm。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述电动改变的氧合含水流体包含至少部分地由分子氧稳定的溶剂化电子。
45.根据权利要求1所述的方法，其中所述改变能够足以对细胞内信号转导提供调节，所述调节在封闭的气密容器中持续至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少12个月或更长的时间。
46.根据权利要求1所述的方法，其中氧在所述电动改变的流体的电荷稳定的含氧纳米结构中的存在量在大气压下为至少8ppm、至少15ppm、至少20ppm、至少25ppm、至少30ppm、至少40ppm、至少50ppm或至少60ppm氧。
47.一种配制适用于治疗糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂的方法，包括：
获得适用于治疗受试者的糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂；以及
将所述治疗剂与一定量的电动改变的含水流体相组合，所述电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地成形，其量足以治疗炎症或其至少一种症状，其中能够配制适用于治疗糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂。
48.根据权利要求48所述的方法，其中所述电荷稳定的含氧纳米结构在所述离子含水流体中稳定地成形，其量足以在所述流体接触活细胞时对细胞膜电位和细胞膜电导率中的至少一者提供调节。
49.一种药物组合物，包含：适用于治疗受试者的糖尿病或糖尿病相关病症或疾患或其症状的治疗剂；一定量的电动改变的含水流体，所述电动改变的含水流体包括电荷稳定的含氧纳米结构的离子水溶液，所述电荷稳定的含氧纳米结构基本上具有小于约100纳米的平均直径，并且在离子含水流体中稳定地成形，其量足以治疗炎症或其至少一种症状。
50.按权利要求48所述的方法制备的药物组合物。
51.根据权利要求1所述的方法，其中治疗包括通过局部、吸入、鼻内和静脉内途径中的至少一种进行施用。
52.根据权利要求25所述的方法，其中所述膜相关蛋白包括CCR3。
53.根据权利要求1所述的方法，其中治疗包括调节细胞内NF-κB表达和/或活性。
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