JP2012525396A - インスリン耐性および真性糖尿病を治療するための組成物および方法 - Google Patents

インスリン耐性および真性糖尿病を治療するための組成物および方法 Download PDF

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Abstract

細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む、界面動電的に改変された流体（ガス富化された界面動電流体）、ならびに糖尿病および糖尿病に関連する状態または障害（例えば、インスリン耐性）、あるいはその症状の治療において使用するための治療組成物および方法を提供する。他の治療剤と任意に組み合わせた、界面動電的に改変されたイオン水性流体を提供する。特定の態様は、細胞膜、膜電位、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）が挙げられるが、これに限定されない膜受容体等の膜タンパク質、ならびに細胞間結合（例えば、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソーム）のうちの少なくとも１つの調節による、前記炎症反応と関連する細胞内シグナル変換の調整または調節を提供する。

Description

本明細書に開示のある実施形態は、本明細書に開示されるように、少なくとも１つの界面動電的に改変された流体を含む治療組成物を投与することによって、対象における、インスリン耐性および／または糖尿病の状態もしくは障害、またはその少なくとも１つの症状を治療することに関する。本明細書に開示の特定の実施形態は、細胞膜、膜電位、Ｇタンパク質共役型受容体が挙げられるが、これに限定されない膜受容体等の膜タンパク質、ならびに細胞間結合（例えば、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソーム）のうちの少なくとも１つの調節により細胞内シグナル変換を調整または調節することに関する。ある態様は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含む界面動電的に改変された流体（ガス富化された界面動電流体）に関する。
関連出願の相互参照
本願は、２００９年４月２７日に出願の米国特許仮出願第６１／１７３，１３４号の優先権の利益を主張する。
真性糖尿病は、血中グルコースの慢性的に上昇したレベル（高血糖症）の存在によって定義される重篤な生涯にわたる代謝性疾患である。この疾患は、しばしば、失明、心臓・血管病、脳梗塞、腎不全、手足の切断、および神経損傷をもたらす。管理不良の糖尿病は、妊娠を複雑化し得、糖尿病に罹患している女性から生まれた新生児には、出生異常がより多く見られる。糖尿病は、米国において、死亡および身体障害の主な原因の１つとして広く認識されている。糖尿病は、例えば、糖尿病性網膜症等の重篤な早期の合併症をもたらし得る。
最近の科学的発見は、慢性炎症とインスリン耐性および／または糖尿病との関連を示唆している。炎症は、外傷、または細菌またはウイルス等の微生物による感染症に対する免疫および／または血管反応であり、それは、急性もしくは慢性、および／または局在性もしくは全身性であり得る。炎症性反応は、一般的に、対象における、有害な物質および損傷組織を破壊、弱化、または限局する。炎症は、特に急性型では、疼痛、発熱、発赤、膨張、および可能性として機能喪失の、古典的な兆候を特徴とする。組織学的レベルでは、炎症は、細動脈、肺毛細血管、および小静脈の拡張、透過性および血流の増加、血漿タンパク質を含む流体の浸出、ならびに炎症、特に、局在反応がある領域への白血球遊走を含む、一連の複雑な事象を含む。
糖尿病疾患に対する治療処置は、多様な調合薬を含む。しかしながら、今日利用可能な治療の大部分は、腹痛、下痢、嘔気、ガス、腫脹、食欲不振、体重増加、低血糖症、および体液貯留等の、少なからぬ副作用を有する。したがって、より良好な糖尿病の治療薬および治療方法の必要性がある。炎症とインスリン耐性および糖尿病との関連から、抗炎症薬および糖尿病薬の双方を合わせて使用する併用治療が、優れた治療をもたらす可能性が高い。
特定の態様は、糖尿病または糖尿病に関連する状態もしくは疾患、あるいはその症状を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含み、糖尿病または糖尿病に関連する状態もしくは疾患、あるいはその少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量で、前記イオン水性流体中に安定的に構成された、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を投与することを含む、方法を提供する。ある実施形態では、該帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体中で主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。特定の態様では、該帯電安定化した酸素含有のナノ構造として、流体中に存在する溶解酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。ある実施形態では、全ての溶解酸素が、該帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する。特定の態様では、該帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する。好ましい態様では、該イオン水溶液は、食塩溶液を含む。ある実施形態では、該流体は、超酸素化である。特定の実施形態では、該流体は、溶媒和電子の形態を含む。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の暴露を含む。特定の実施形態では、該局在界面動電効果への暴露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの暴露を含む。ある態様では、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の暴露は、該流体を生成するために使用される装置の界面動電効果を誘起する構造特性への該流体の暴露を含む。
ある実施形態では、該糖尿病関連状態もしくは障害は、糖尿病、インスリン依存性糖尿病もしくはＩＤＤＭ（１型）、非インスリン依存性糖尿病もしくはＮＩＤＤＭ（２型）、インスリン耐性、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される少なくとも１つを含む。好ましい態様では、該糖尿病関連状態もしくは障害は、糖尿病およびインスリン耐性の少なくとも１つを含む。好ましくは、該糖尿病関連状態もしくは障害は、インスリン耐性を含む。ある態様では、該糖尿病関連状態もしくは障害の少なくとも１つの症状は、慢性炎症、急性炎症、インスリン耐性からなる群から選択される少なくとも１つの状態に関する。
ある態様では、該界面動電的に改変された水性流体は、一酸化窒素の局在または細胞レベルを調節する。
特定の実施形態では、該界面動電的に改変された水性流体は、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの、投与部位での局在低下を促進する。
ある態様では、本方法は、同時にまたは補助的に別の抗炎症剤で対象を治療することによる、炎症の相乗的または非相乗的阻害または減少を更に含む。好ましくは、前記他の抗炎症剤は、ステロイドまたはグルココルチコイドステロイドを含む。特定の実施形態では、グルココルチコイドステロイドは、ブデソニドまたはその活性誘導体を含む。
ある実施形態では、本方法は、少なくとも１つの追加の治療剤が患者に投与される、併用療法を更に含む。特定の態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ビグアニド（メトホルミン、ブホルミン、およびフェンホルミンを含む）、インスリン、αグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、ＤＰＰ−４阻害剤、メグリチニド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、αグルコシダーゼ阻害剤（アカルボースおよびミグリトールを含む）、ＤＰＰ−４阻害剤（ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、およびアログリプチンを含む）、スルホニル尿素（アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリプジド、グリクラジド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリキドン、グリコピラミド、およびグリメピリドを含む）、メグリチニド（ナテグリニド、ミチグリニド、およびレパグリニドを含む）、チアゾリジンジオン（トログリタゾン、ピオグリタゾン、およびロジグリタゾンを含む）、ＭＭＰの阻害剤（ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の阻害剤）、短時間作用型β２−アゴニスト、長時間作用型β２−アゴニスト、抗コリン作用薬、コルチコステロイド、全身性コルチコステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン修飾剤、メチルキサンチン、β２−アゴニスト、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、ホルモテロール、サルメテロール、抗コリン作用薬（イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む）、コルチコステロイド（ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む）、ロイコトリエン修飾剤（モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジレウトンを含む）、マスト細胞安定剤（クロモリンおよびネドクロミルを含む）、メチルキサンチン（テオフィリンを含む）、併用薬物（イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む）、抗ヒスタミン剤（ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む）、免疫系調節剤（タクロリムスおよびピメクロリムスを含む）、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される。
ある態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストである。好ましくは、該ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストは、ＴＳＬＰおよび該ＴＳＬＰ受容体に対して特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、およびＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択され、１つより多い受容体鎖の構成要素をコードするＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む。ある態様では、治療は、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性のうちの少なくとも１つの改変を含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つの改変を含む。特定の実施形態では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、インテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある態様では、膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む。特定の態様では、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニットと相互作用する。好ましくは、Ｇタンパク質αサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む。好ましくは、少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットは、Ｇαｑである。
特定の態様では、該帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。ある態様では、細胞膜伝導性を調節することは、全細胞伝導性を調節することを含む。特定の態様では、全細胞伝導性の調節は、全細胞伝導性の少なくとも１つの電位依存性寄与の調節を含む。特定の態様は、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。特定の態様は、慢性炎症、急性炎症、およびインスリン耐性からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内シグナル変換の調節を含む。
本方法の特定の態様は、細胞ネットワークまたは層への投与を含み、その中の細胞間結合（例えば、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソームからなる群から選択される少なくとも１つ）の調節を更に含む。ある態様では、該細胞ネットワークまたは層は、ＣＮＳ血管の内皮細胞および内皮星状細胞密着結合、血液脳脊髄流体密着結合または関門、肺上皮型結合、気管支上皮型結合、および腸上皮型結合からなる群から選択される少なくとも１つを含む。
本方法の特定の実施形態では、該界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の前記酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する。ある態様では、該界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態の少なくとも１つを含む。ある態様では、該溶媒和電子または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。本方法の特定の実施形態では、該界面動電的に改変された含酸素水性流体は、分子酸素により、少なくとも部分的に安定化された溶媒和電子を含む。
ある態様は、気密性容器内で、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、またはそれ以上の長期間持続する細胞内シグナル変換の調節を提供するのに十分な、細胞膜構造または機能を改変する能力を含む。
本方法の特定の実施形態では、該界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造に存在する酸素量は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である。
更なる態様は、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤を製剤化する方法を提供し、該方法は、対象の、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤を得ることと、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含み、炎症またはそれらの少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成された、界面動電的に改変された水性流体量を治療剤と組み合わせることと、を含み、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤を製剤化することができる。特定の実施形態では、該帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される。
なお更なる態様は、医薬組成物を提供し、これには、対象の、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤、および約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含み、炎症またはそれらの少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成された、界面動電的に改変された水性流体量を含む。特定の態様は、請求項４８に記載の方法によって調製される、医薬組成物を提供する。ある態様は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む。
特定の態様では、膜結合タンパク質は、ＣＣＲ３を含む。ある態様では、治療は、ＮＦ−κＢ発現および／または活性の調節を含む。
先行技術の混合デバイスの部分断面図、部分ブロック図である。 混合デバイスの例示的な実施形態のブロック図である。 図２の混合デバイスに第１の材料を送達するための例示的なシステムの図解である。 図２の混合デバイスの上部の断片的な部分断面図である。 図２の混合デバイスの第１の側部の断片的な断面図である。 図２の混合デバイスの第２の側部の断片的な断面図である。 図５の第１の側部と図６の第２の側部との間に位置した図２の混合デバイスの側部の断片的な断面図である。 図２の混合デバイスの回転子および固定子の透視図である。 図２の混合デバイスの第１のチャンバの内部の透視図である。 ポンプ４１０の代替的な実施形態を含む、図２の混合デバイスの第１のチャンバの内部の断片的な断面図である。 図２の混合デバイスの第２のチャンバの内部の透視図である。 混合デバイスの代替的実施形態の側部の断片的な断面図である。 混合デバイスの代替的実施形態で用いるハウジングの中心部の代替的実施形態の透視図である。 混合デバイスの代替的実施形態で用いるベアリングハウジングの代替的実施形態の断片的な断面図である。 回転子のスルーホールが、固定子のアパーチャに接近する（が整合しない）際の、キャビテーション気泡により生じる環流パターンを示す回転軸に直交する面を貫通する図２の混合デバイスの混合チャンバの断面図である。 回転子のスルーホールが、固定子のアパーチャと整合する際の、キャビテーション気泡により生じる環流パターンを示す回転軸に直交する面を通過する図２の混合デバイスの混合チャンバの断面図である。 以前は固定子のアパーチャと整合した回転子のスルーホールが、それとはもはや整合しない際の、キャビテーション気泡により生じる環流パターンを示す回転軸に直交する面を通過する図２の混合デバイスの混合チャンバの断面図である。 回転子の代替的実施形態の側面図である。 回転子に形成されたスルーホールおよび固定子に形成されたスルーホールの代替的構造を示す回転子の回転軸に直交する面を通過する拡大された断片的な断面図である。 回転子に形成されたスルーホールおよび固定子に形成されたスルーホールの構造を示す回転子の回転軸を通過し、該軸に沿って延在する面を通過する拡大された断片的な断面図である。 回転子に形成されたスルーホールおよび固定子に形成されたスルーホールの代替的オフセット構造を示す回転子の回転軸を通過し、該軸に沿って延在する面を通過する拡大された断片的な断面図である。 回転子のスルーホールおよび／または固定子のアパーチャを構築するために使用され得る形状の図解である。 回転子のスルーホールおよび／または固定子のアパーチャを構築するために使用され得る形状の図解である。 回転子のスルーホールおよび／または固定子のアパーチャを構築するために使用され得る形状の図解である。 回転子のスルーホールおよび／または固定子のアパーチャを構築するために使用され得る形状の図解である。 表面付近に形成された電気二重層（「ＥＤＬ」）の図解である。 混合チャンバの内部のモデルの透視図である。 図２７のモデルの断面図である。 実験装置の図解である。 図２の混合デバイスにおいて酸素で処理され、華氏６５度でそれぞれ栓をした５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１，０００ｍＬのガラス瓶に保管された、水中の溶解酸素レベルを示す。 図２の混合デバイスにおいて酸素で処理され、華氏３９度で共に冷蔵した５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１，０００ｍＬのガラス瓶に保管された、水中の溶解酸素レベルを示す。 図２の混合デバイスにおいて酸素で処理された５００ｍＬの飲料用流体の溶解酸素保持率を示す。 図２の混合デバイスにおいて酸素で処理された５００ｍＬのブラウン平衡塩類溶液の溶解酸素保持率を示す。 図２の混合デバイスを使用して、図２の混合デバイスにおいて、窒素を用いて水を処理することにより、水から酸素を散布する、更なる実験を示す。 標準温度と標準気圧で、図２の混合デバイスによる水からの酸素の散布を示す。 例示的なナノケージの図解である。 酸素富化流体のレイリー散乱効果を示す。 ガス富化流体および脱イオン化対照流体の存在下での、マイトジェニックアッセイのサイトカインプロファイルを示す。 様々な溶解酸素飽和度での、シュードモナス属細菌の増殖率の差異を示す。 酸素富化培地および非ガス富化培地を用いた、生体外の創傷治癒を示す。 生体内の創傷治癒の皮膚および表皮の組織学的断面図を示す。 生体内の創傷治癒の皮膚および表皮の組織学的断面図を示す。 ヒアルロン酸等の酸性ムコ多糖類を検出するために使用される、処理された、および対照治癒創傷のＨａｌｅｓ染色の発現を示す。 処理された、および対照治癒創傷の、血管形成を検出するために使用される、フォンヴィレブランド因子染色の発現を示す。 処理された、および対照治癒創傷のエラスチンを検出するために使用される、ルナ染色の検出を示す。 処理された、および対照治癒創傷に対する、視野あたりのマスト細胞の数を示す。 本発明のガス富化培地および対照培地を用いた、角膜線維芽細胞アッセイの別々の時点での死細胞率を示す。 ポリマー袋中の本発明のガス富化流体の保存寿命を示す。 加圧ポットの含酸素流体（１）、本発明のガス富化流体（２）、または対照脱イオン化流体（３）の存在下で、ＭＯＧと脾細胞を接触させた結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 サイトカインの全血サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 相当するサイトカインの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 ブラジキニンＢ２膜受容体が、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された研究を示す。図６９に指定されるように、サンプルプレートの設定を行い、図７１に指定されるように、サンプルの設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定される設定に従い、更に滴定された。図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 制御性Ｔ細胞に影響を及ぼす本明細書に開示される特定の実施形態の能力を示すデータを示す。研究は、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することを含んだ。 本発明の界面動電的に生成された流体が、サーモンカルシトニンおよび動物モデルの血清摂取を低減したことを示す。結果は、密着結合の増強と一致する。 図８４のデータを生成するために使用された動物モデルからの肺組織の密着結合関連タンパク質の発現レベルを示す。 図８４のデータを生成するために使用された動物モデルからの肺組織の密着結合関連タンパク質の発現レベルを示す。 図８４のデータを生成するために使用された動物モデルからの肺組織の密着結合関連タンパク質の発現レベルを示す。 図８４のデータを生成するために使用された動物モデルからの肺組織の密着結合関連タンパク質の発現レベルを示す。 図８４のデータを生成するために使用された動物モデルからの肺組織の密着結合関連タンパク質の発現レベルを示す。 ＮＯＳ１および３、ならびにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の上方調節を示す、ＲＤＣ１６７６−０１（本開示の独自のデバイスを通して処理されて、追加の酸素が添加された滅菌食塩水、本開示のガス富化された界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））に暴露されたヒト包皮ケラチン生成細胞から得たデータを示す。 ＮＯＳ１および３、ならびにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の上方調節を示す、ＲＤＣ１６７６−０１（本開示の独自のデバイスを通して処理されて、追加の酸素が添加された滅菌食塩水、本開示のガス富化された界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））に暴露されたヒト包皮ケラチン生成細胞から得たデータを示す。 ＮＯＳ１および３、ならびにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の上方調節を示す、ＲＤＣ１６７６−０１（本開示の独自のデバイスを通して処理されて、追加の酸素が添加された滅菌食塩水、本開示のガス富化された界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））に暴露されたヒト包皮ケラチン生成細胞から得たデータを示す。 ＮＯＳ１および３、ならびにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の上方調節を示す、ＲＤＣ１６７６−０１（本開示の独自のデバイスを通して処理されて、追加の酸素が添加された滅菌食塩水、本開示のガス富化された界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））に暴露されたヒト包皮ケラチン生成細胞から得たデータを示す。 ＮＯＳ１および３、ならびにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の上方調節を示す、ＲＤＣ１６７６−０１（本開示の独自のデバイスを通して処理されて、追加の酸素が添加された滅菌食塩水、本開示のガス富化された界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））に暴露されたヒト包皮ケラチン生成細胞から得たデータを示す。 界面動電流体の生成時、電圧／電流効果の検出を可能にさせる絶縁回転子および固定子特性を含む混合デバイスにおいて生じる局在界面動電効果（電圧／電流）を支持するデータを示す。 界面動電流体の生成時、電圧／電流効果の検出を可能にさせる絶縁回転子および固定子特性を含む混合デバイスにおいて生じる局在界面動電効果（電圧／電流）を支持するデータを示す。 本発明の界面動電的に生成された流体の基本的性質を更に特徴付けるために行われた核磁気共鳴（ＮＭＲ）研究の結果を示す。界面動電的に生成された流体は、該レポーターのトレハロース溶質の１３Ｃ−ＮＭＲ線幅を増加した。 本発明の界面動電的に生成された流体の基本的性質を更に特徴付けるために行われたボルタンメトリー試験（即ち、矩形波ボルタンメトリー（図９８）およびストリッピングポーラログラフィー（図９９））の結果を示す。界面動電的に生成された流体に特有の矩形波ボルタンメトリーのピーク差異（対照に対して）が、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖで観察された。顕著なポーラログラフのピークが、界面動電的に生成されたＲｅｖｅｒａおよびＳｏｌａｓ流体に対して、−０．９ボルトで見られ、非界面動電的に生成されたブランクおよび生理食塩水対照流体は、界面動電的に生成された流体に対するスペクトルに不在である、−０．１９および−０．３ボルトで特性ピークを示す。 本発明の界面動電的に生成された流体の基本的性質を更に特徴付けるために行われたボルタンメトリー試験（即ち、矩形波ボルタンメトリー（図９８）およびストリッピングポーラログラフィー（図９９））の結果を示す。界面動電的に生成された流体に特有の矩形波ボルタンメトリーのピーク差異（対照に対して）が、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖで観察された。顕著なポーラログラフのピークが、界面動電的に生成されたＲｅｖｅｒａおよびＳｏｌａｓ流体に対して、−０．９ボルトで見られ、非界面動電的に生成されたブランクおよび生理食塩水対照流体は、界面動電的に生成された流体に対するスペクトルに不在である、−０．１９および−０．３ボルトで特性ピークを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体試験の効果を評価したパッチクランプ法の結果を示す。結果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性寄与に影響を及ぼすことを示す。 界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）は、オスのモルモットにおいて、単独で、または硫酸アルブテロールの希釈剤として投与される場合、メタコリン誘発気管支収縮対して保護することを示すデータを示す。 界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）は、オスのモルモットにおいて、単独で、または硫酸アルブテロールの希釈剤として投与される場合、メタコリン誘発気管支収縮対して保護することを示すデータを示す。 Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動電的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われたブデソニド実験の結果を示す。本発明の界面動電的に生成された流体は、好酸球数を低下させ、好酸球数の低下、Ｐｅｎｈ値の低下、１回換気量の増加、エオタキシンの血液レベルの低下において、ブデソニドとの強力な相乗効果を示し、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後、２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンガンマの血液レベルを有意に増強し、Ｒａｎｔｅｓの全身性レベルを低下させた。このデータは、ブデソニド７５０μｇ／ｋｇと本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）の、かなりの相乗効果があることを示す。 Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動電的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われたブデソニド実験の結果を示す。本発明の界面動電的に生成された流体は、好酸球数を低下させ、好酸球数の低下、Ｐｅｎｈ値の低下、１回換気量の増加、エオタキシンの血液レベルの低下において、ブデソニドとの強力な相乗効果を示し、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後、２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンガンマの血液レベルを有意に増強し、Ｒａｎｔｅｓの全身性レベルを低下させた。このデータは、ブデソニド７５０μｇ／ｋｇと本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）の、かなりの相乗効果があることを示す。 Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動電的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われたブデソニド実験の結果を示す。本発明の界面動電的に生成された流体は、好酸球数を低下させ、好酸球数の低下、Ｐｅｎｈ値の低下、１回換気量の増加、エオタキシンの血液レベルの低下において、ブデソニドとの強力な相乗効果を示し、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後、２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンガンマの血液レベルを有意に増強し、Ｒａｎｔｅｓの全身性レベルを低下させた。このデータは、ブデソニド７５０μｇ／ｋｇと本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）の、かなりの相乗効果があることを示す。 Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動電的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われたブデソニド実験の結果を示す。本発明の界面動電的に生成された流体は、好酸球数を低下させ、好酸球数の低下、Ｐｅｎｈ値の低下、１回換気量の増加、エオタキシンの血液レベルの低下において、ブデソニドとの強力な相乗効果を示し、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後、２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンガンマの血液レベルを有意に増強し、Ｒａｎｔｅｓの全身性レベルを低下させた。このデータは、ブデソニド７５０μｇ／ｋｇと本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）の、かなりの相乗効果があることを示す。 Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動電的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われたブデソニド実験の結果を示す。本発明の界面動電的に生成された流体は、好酸球数を低下させ、好酸球数の低下、Ｐｅｎｈ値の低下、１回換気量の増加、エオタキシンの血液レベルの低下において、ブデソニドとの強力な相乗効果を示し、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後、２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンガンマの血液レベルを有意に増強し、Ｒａｎｔｅｓの全身性レベルを低下させた。このデータは、ブデソニド７５０μｇ／ｋｇと本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）の、かなりの相乗効果があることを示す。 Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットのオボアルブミン感作モデルにおける、本発明の界面動電的に生成された流体の気道抗炎症特性を評価するために行われたブデソニド実験の結果を示す。本発明の界面動電的に生成された流体は、好酸球数を低下させ、好酸球数の低下、Ｐｅｎｈ値の低下、１回換気量の増加、エオタキシンの血液レベルの低下において、ブデソニドとの強力な相乗効果を示し、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後、２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンガンマの血液レベルを有意に増強し、Ｒａｎｔｅｓの全身性レベルを低下させた。このデータは、ブデソニド７５０μｇ／ｋｇと本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ６０）の、かなりの相乗効果があることを示す。 気管支上皮細胞（ＢＥＣ）における本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖｅｒａ６０およびＳｏｌａｓ）は、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現をそれぞれ、約９０％および５０％低下させる一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果のみあったことを示す。 本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖｅｒａ６０およびＳｏｌａｓ）は、それぞれ、気管支上皮細胞のＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ−９レベルを約８０％および７０％阻害する一方で、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果のみあったことを示す。 ２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性について、界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。 ２つの時点（１５分間（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコルで、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性について、界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。 図１１７Ａ〜Ｃに連する実験に関連して、３つの電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。 異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。 異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性に対する、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。 図１１９Ａ〜Ｄに関する実験に関連して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図１１９に示す）の減算から生じるグラフを示す。 図１１９Ａ〜Ｄに関する実験に関連して、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２（ひし形）および４０ｍＭ ＣａＣｌ２（黒四角）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図１１９に示す）の減算から生じるグラフを示す。 ＲＮＳ６０−１（ｒｎｓ６０−１ １μｍ ３Ｄ．ｊｐｇ）に対する１ｍｍ２ ＡＦＭスキャンを示す。小ピーク（「１」）は、約２０ｎｍ幅および約１．５ｎｍ高さ以下である、疎水性ナノバブルを示す。 ＰＮＳ６０−１（ｐｐ６０−１ １ｕｍ ３ｄ．ｊｐｇ）に対する１ｍｍ２を示す。このスキャンは、ＲＮＳ６０−１で視的なものよりも実質的に大きい（約６０ｎｍ幅および約５ｎｍ高さ）、ピーク（「２」）（疎水性ナノバブル）を示す。 白血球における、細胞表面受容体のＣＤ１９３（ＣＣＲ３）の発現レベルを、生理食塩水あるいはＲＮＳ−６０のいずれかを用いて比較した場合の蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は、試料の対数蛍光を示し、Ｙ軸は、試料中に生じる蛍光の事象を示す。 白血球における、細胞表面受容体のＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）（パネルＡ）、ＣＤ１１Ｂ（パネルＢ）、およびＣＤ３（パネルＣ）の発現レベルを、生理食塩水あるいはＲＮＳ−６０のいずれかを用いて比較した、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析の結果を示す。Ｘ軸は、試料の対数蛍光を示し、Ｙ軸は、試料中に生じる蛍光の事象を示す。 ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞のＮＦκＢの活性化に対するＲＮＳ６０の効果を検査した、２つのゲルシフト実験（パネルＡおよびＢ）ならびにルシフェラーゼ活性（レポーター遺伝子）アッセイ（パネルＣ）からの結果を示す。
本明細書に開示のある実施形態は、ガス富化流体を含む治療組成物を、対象に投与することによるインスリン耐性および／または糖尿病の状態もしくは障害、あるいはそれらの少なくとも１つの症状に対する治療組成物および治療方法を提供することに関する。ある特定の実施形態では、ガス富化流体は、酸素富化水を含む。
糖尿病の障害もしくは状態
本明細書のある実施形態は、インスリン耐性および／または糖尿病関連状態もしくは疾患のうちの少なくとも１つの症状を予防するまたは緩和することによる対象に対する治療組成物および治療方法に関する。
本明細書の更なる実施形態では、例えば、糖尿病性網膜症の症状を緩和することを含む、インスリン耐性および／または糖尿病関連状態に関する合併症を予防するまたは緩和するための治療組成物および治療方法に関する。
界面動電的に生成された流体：
本明細書で使用する「界面動電的に生成された流体」とは、本明細書に詳述される、例示的な混合デバイスにより、本明細書の実施例のために生成された、出願者の発明の界面動電的に改変された流体を指す（第ＵＳ２００８０２１９００８８号および第ＷＯ２００８／０５２１４３号も参照のこと、双方は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。本明細書に開示され、示されるデータにより示されるように、界面動電流体は、先行技術の含酸素非界面動電流体（例えば、加圧ポットの含酸素流体等）を含む、先行技術の非界面動電流体と比較して、新規の根本的に異なる流体を示す。本明細書の様々な態様に開示されるように、界面動電的に生成された流体は、以下のものを含むが、これらに限定されない、独特かつ新規の物理的および生物学的特性を有する。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造および流体により生細胞に接触し、少なくとも１つの細胞膜電位および細胞膜伝導性の調節を提供するのに十分な量のイオン水性流体中に安定に設定された、イオン水溶液を含む。
特定の態様では、界面動電的に生成された流体とは、本明細書に記載されるように、デバイス機能局在効果等の流体力学的に誘発された、局在（例えば、全流体容量に対して不均一）界面動電効果（例えば、電圧／電流パルス）の存在下で生成される流体を指す。特定の態様では、前記流体力学的に誘発された、局在界面動電効果は、本明細書に開示され、論じられるように、表面に関連した二重層および／または荷電電流効果と組み合わせる。
特定の態様では、投与される本発明の界面動電的に改変された流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む。ある実施形態では、界面動電的に改変された流体は、超酸素化される（例えば、標準食塩水中に、それぞれ、２０ｐｐｍ、４０ｐｐｍ、および６０ｐｐｍの溶解酸素を含むＲＮＳ−２０、ＲＮＳ−４０、およびＲＮＳ−６０）。特定の実施形態では、界面動電的に改変された流体は、超酸素化されない（例えば、１０ｐｐｍ（例えば、標準食塩水においてほぼ環境レベルの溶解酸素）を含む、ＲＮＳ−１０またはＳｏｌａｓ。ある態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の塩分、滅菌状態、ｐＨ等は、流体が界面動電的に産生される時に構築され、滅菌流体は、適切な経路により投与される。代替として、該流体の塩分、滅菌状態、ｐＨ等の少なくとも１つは、流体の投与前に、投与経路に生理学的に適合するように、（例えば、滅菌食塩水または適切な希釈剤を用いて）適切に調整される。好ましくは、該流体の塩分、滅菌状態、ｐＨ等の少なくとも１つを調節するのに使用された希釈剤および／または食塩溶液および／または緩衝液組成はまた、界面動電流体であるか、またはそうでなければ適合するものである。
特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、食塩水（例えば、１つ以上の塩；例えば、アルカリ金属ベースの塩（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｒｂ＋、Ｃｓ＋等）、アルカリ土類ベースの塩（例えば、Ｍｇ＋＋、Ｃａ＋＋）等、または遷移金属ベースの陽イオン（例えば、Ｃｒ、Ｆｅ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｚｎ等）を、それぞれの場合において、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、Ｉ−、ＰＯ４−、ＳＯ４−、および窒素ベースのアニオンが含まれるが、これらに限定されない、任意の好適なアニオン成分と共に含む。特定の態様は、種々の組み合わせおよび濃度において、および任意に対イオンの混合物と共に、混合塩ベースの界面動電流体（例えば、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｃａ＋＋、Ｍｇ＋＋、遷移金属イオン等）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、標準食塩水（例えば、約０．９％ ＮａＣｌ、または約０．１５Ｍ ＮａＣｌ）を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体は、少なくとも０．０００２Ｍ、少なくとも０．０００３Ｍ、少なくとも０．００１Ｍ、少なくとも０．００５Ｍ、少なくとも０．０１Ｍ、少なくとも０．０１５Ｍ、少なくとも０．１Ｍ、少なくとも０．１５Ｍ、または少なくとも０．２Ｍの濃度で食塩水を含む。特定の態様では、本発明の界面動電的に改変された流体の伝導性は、少なくとも１０μＳ／ｃｍ、少なくとも４０μＳ／ｃｍ、少なくとも８０μＳ／ｃｍ、少なくとも１００μＳ／ｃｍ、少なくとも１５０μＳ／ｃｍ、少なくとも２００μＳ／ｃｍ、少なくとも３００μＳ／ｃｍ、または少なくとも５００μＳ／ｃｍ、少なくとも１ｍＳ／ｃｍ、少なくとも５ｍＳ／ｃｍ、１０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも４０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも８０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも１５０ｍＳ／ｃｍ、少なくとも２００ｍＳ／ｃｍ、少なくとも３００ｍＳ／ｃｍ、または少なくとも５００ｍＳ／ｃｍである。特定の態様では、任意の塩を、それらが、本明細書に開示されるような、生物活性のある塩を安定化したナノ構造（例えば、塩で安定化した酸素含有のナノ構造）の形成を可能にさせるならば、本発明の界面動電的に改変された流体を調製するのに使用することができる。
特定の態様によれば、帯電安定化したガス含有のナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、流体のイオン成分を変えることにより、または流体のガス成分を変えることにより、調節する（例えば、増加させる、減少させる、調整）ことができる。
特定の態様によれば、帯電安定化したガス含有のナノ構造を含む本発明の流体組成物の生物学的効果は、流体のガス成分を変えることにより、調節する（例えば、増加させる、減少させる、調整する）ことができる。好ましい態様では、酸素が、本発明の界面動電流体を調製するのに使用される。更なる態様では、酸素の混合物は、窒素、酸素、アルゴン、二酸化炭素、ネオン、ヘリウム、クリプトン、水素、およびキセノンから選択される少なくとも１つの他のガスを含む。上述のように、ガス構成物を変化させることを伴うことを含み、これらのイオンを変化させることもできる。
本明細書に開示の教示およびアッセイシステム（例えば、細胞ベースのサイトカインアッセイ、パッチクランプアッセイ等）を考えると、当業者は、容易に、本明細書に開示の生物活性を達成するために、適切な塩およびその濃度を選択することができよう。
本開示は、糖尿病および糖尿病関連障害の治療に有用な、ガス富化イオン水溶液、水性食塩溶液（例えば、標準水性食塩溶液、および本明細書に論じられ、当技術分野に認識されるような、任意の生理学的相溶性食塩溶液を含む他の食塩溶液）、細胞培養培地（例えば、最少培地、および他の培養培地）が含まれるが、これらに限定されない、新規のガス富化流体を記述する。培地または複数の培地は、成長にとって必須の栄養素のみを含む場合、「最少」と称する。原核生物の宿主細胞に関しては、最少培地は、一般に、炭素、窒素、リン、マグネシウムの源、ならびに微量の鉄およびカルシウムを含む（Ｇｕｎｓａｌｕｓ ａｎｄ Ｓｔａｎｔｅｒ，Ｔｈｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ，Ｖ．１，Ｃｈ．１ Ａｃａｄ．Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．（１９６０））。ほとんどの最少培地は、炭素源としてグルコース、窒素源としてアンモニア、およびリン源としてオルトリン酸塩（例えば、ＰＯ４）を使用する。標的タンパク質産生を阻害することなく、最適成長を促すために、成長した特定の原核生物または真核生物に従って、培地を変化させるか、または補完することができる（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇ．２７：８１８−８２４（１９８５））。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、その中に溶解されるレポーター溶質（例えば、トレハロース）の１３Ｃ−ＮＭＲ線幅を調節するのに適している。ＮＭＲ線幅効果は、特定の実施例において、本明細書に記載されるように、例えば、試験流体において溶質の「回転」を測定するための間接法である。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖのうちのいずれかにおける、特有の矩形波ボルタンメトリーのピーク、−０．９ボルトでのポーラログラフピーク、ならびに−０．１９および−０．３ボルトでの、ポーラログラフピークの不在のうちの少なくとも１つによって特徴付けられ、これらは、特定の実施例において、本明細書に開示されるように、界面動電的に生成された流体に対して特有である。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞膜伝導性（例えば、本明細書に開示のパッチクランプ試験において測定される、全細胞伝導性の電位依存性寄与）を改変するのに適している。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、大気圧で、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの溶解酸素の量で存在する。特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、大気圧で、またはほぼ大気中の酸素レベルで、１５ｐｐｍ未満、１０ｐｐｍ未満の溶解酸素を有する。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の酸素は、約８ｐｐｍ〜約１５ｐｐｍの量で存在し、この場合、場合により、本明細書で、「Ｓｏｌａｓ」と称される。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子（例えば、分子酸素により安定化された）、ならびに界面動電的に修飾された、および／または荷電された酸素種のうちの少なくとも１つを含み、ある実施形態では、溶媒和電子、および／または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル変換の調節を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する（例えば、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性を改変する）のに適しており、特定の態様では、膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、ＴＳＬＰ受容体、β２アドレナリン受容体、ブラジキニン受容体等）、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む。ある態様では、影響を受けたＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニット（例えば、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２）と相互作用する。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、細胞内シグナル変換を調節するのに適しており、カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節（例えば、ホスホリパーゼＣ活性の調節、またはアデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節）を含む。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、実施例および本明細書のいずれかの箇所で記載される、種々の生物学的活性（例えば、サイトカイン、受容体、酵素および他のタンパク質、ならびに細胞内シグナル経路の調節）を特徴とする。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、メトホルミンとの相乗効果および／または相加活性を示す。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）におけるＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体は、本明細書の実施例に示されるように、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）のＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルを阻害する。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の生物学的効果は、ジフテリア毒素により阻害され、これは、本明細書の実施例に示されるように、β遮断薬、ＧＰＣＲ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬が、（例えば、制御性Ｔ細胞機能における）界面動電的に改変された水性流体の活性に影響を及ぼすことを示す。
特定の態様では、界面動電的に改変された水性流体の物理的および生物学的効果（例えば、細胞内シグナル変換の調整を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する能力）は、密閉された容器内（例えば、密閉された気密性容器内）において、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、またはそれ以上の長期間持続する。
したがって、更なる態様は、前記界面動電的に生成された溶液および界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を生産する方法を提供し、該方法は、相対運動で、２つの離間した表面間で流体物質の流れを提供し、それらの間に混合容量を画定することであって、混合容量内およびそれを通して流動流体物質の単一パスの滞留時間は、０．０６秒以上、または０．１秒以上である、ことと、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を該物質に溶解し、流体または溶液を界面動電的に改変するのに適する条件下で、混合容量内で流動流体物質に酸素（Ｏ２）を導入することと、を含む。ある態様では、該酸素は、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満で、該物質に注入される。特定の実施形態では、表面積の容量に対する比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
なお更なる態様は、界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を生産する方法を提供し、該方法は、２つの離間した表面間で流体物質の流れを提供し、それらの間に混合容量を画定することと、１００ミリ秒未満、２００ミリ秒未満、３００ミリ秒未満、または４００ミリ秒未満において、該物質に、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、もしくは少なくとも６０ｐｐｍの酸素を注入するのに適する条件下で、混合容量内で流動流体に酸素を導入することと、を含む。ある態様では、混合容量内で流動物質の滞留時間は、０．０６秒超、または０．１秒超である。特定の実施形態では、表面積の容量に対する比は、少なくとも１２、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、または少なくとも５０である。
追加の実施形態は、界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を生産する方法を提供し、該方法は、第１の物質と第２の物質を混合することにより出力混合物を作製するための混合デバイスの使用を含み、該デバイスは、第１の物質の源から第１の物質を受容するように構成された第１のチャンバと；固定子と；回転軸を有する回転子であり、該固定子内部に配設され、その中の回転軸の周囲を回転するように構成され、回転子および固定子のうちの少なくとも１つは、複数のスルーホールを有する、回転子と；回転子と固定子の間に画定される混合チャンバであり、第１のチャンバと流体連通しており、そこから第１の物質を受容するように構成され、第２の物質は、回転子および固定子のうちの１つに形成された複数のスルーホールを介して混合チャンバに提供される、混合チャンバと；混合チャンバと流体連通しており、そこから出力物質を受容するように構成される、第２のチャンバと；第１のチャンバ内部に格納された第１の内部ポンプであり、第１のチャンバから混合チャンバに、第１の物質を送出するように構成される、内部ポンプと、を含む。ある態様では、該第１の内部ポンプは、第１の物質が混合チャンバに流入する前に、第１の物質に周速度を与えるように構成される。
更なる実施形態は、界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を生産する方法を提供し、該方法は、第１の物質と第２の物質を混合することにより出力混合物を作製するための混合デバイスの使用を含み、該デバイスは、固定子と；回転軸を有する回転子であり、該固定子内部に配設され、その中の回転軸の周囲を回転するように構成される、回転子と；回転子と固定子の間に画定される混合チャンバであり、それを通って、第１の物質が混合チャンバに入る第１の開口末端と、それを通って、出力物質が混合チャンバを出る第２の開口末端と、を有し、第２の物質が回転子および固定子のうちの少なくとも１つを通って混合チャンバに流入する、混合チャンバと；混合チャンバの第１の開口末端の少なくとも大部分と連通する第１のチャンバと；混合チャンバの第２の開口末端と連通する第２のチャンバと、を含む。
追加の態様は、上記の方法のいずれかに従って作製された、界面動電的に改変された含酸素水性流体または溶液を提供する。
糖尿病およびインスリン耐性
真性糖尿病は、血中グルコースの慢性的に上昇したレベル（高血糖症）の存在によって定義される重篤な生涯にわたる代謝性疾患である。高血糖症のこの状態は、ペプチドホルモンであるインスリンの活性の相対的もしくは絶対的欠乏の結果である。インスリンは、膵臓のβ細胞によって産生され、分泌される。インスリンは、グルコースの利用、タンパク質の合成、およびグリコーゲンとして炭水化物エネルギーの形成および保存を促進する。グルコースは、身体中でグリコーゲンとして、すなわち代謝要件に適合させるようにグルコースに変換され得る、重合したグルコースの形態で保存される。通常の条件下では、インスリンは、基礎速度およびグルコース刺激後の促進速度の双方で分泌されて、どの場合でもグルコースのグリコーゲンへの変換により、代謝の恒常性を維持する。
真性糖尿病という用語は、幾つかの異なる高血糖性状態を含む。これらの状態は、１型（インスリン依存性真性糖尿病またはＩＤＤＭ）および２型（非インスリン依存性真性糖尿病またはＮＩＤＤＭ）糖尿病を含む。１型糖尿病は、生理学的範囲内の血中グルコースレベルを維持するには不十分である、欠乏した、低下した、または存在しないインスリンのレベルと関連している。
２型糖尿病は、老化するにつれてますますよく見られる疾患である。最初に、インスリンへの感受性の低下またはインスリン耐性、および循環型インスリン濃度の補償増加を特徴とし、この後者は、正常な血中グルコースレベルを維持するために必要とされる。インスリンレベルの増加は、膵臓β細胞からの分泌増加により生じ、得られた高インスリン血は、糖尿病の心血管系の合併症と関連する。インスリン耐性が悪化すると、膵臓β細胞における要求は、膵臓が、インスリンの適切なレベルをもはや提供できなくなるまで、着実に増加し、血液中のグルコースのレベルの増加をもたらす。最終的に、顕性の高血糖および脂質異常症を生じ、心臓血管疾患、腎不全、および失明を含む糖尿病と関連する壊滅的な長期にわたる合併症をもたらす。
ＩＩ型糖尿病に起因する心臓血管系の循環障害がもたらす１つの特定の合併症は、糖尿病性網膜症であり、眼、更に具体的には、網膜が、低下した心臓血管機能により損傷を受ける。網膜において、循環の欠如からの損傷は、最初は、それらを漏出させる動脈の弱体化によって、現れる。この漏出は、小さな点状の出血および腫れをもたらす。疾患が進行すると、循環系の問題は、網膜の一部に、虚血、または酸素不足を生じ、これにより、循環系は、網膜内の適切な酸素レベルを維持しようとして、新しい、脆弱な血管発生をもたらす。新血管形成と称する、このプロセスは、新しい血管が、壊れやすく、容易に大出血するため、網膜への血液の頻回の漏出を引き起こす。糖尿病の後期において、異常な血管の増殖が続き、瘢痕組織が発生する。脆弱な血管および瘢痕組織からの結果は、極めて重篤で、しばしば、網膜剥離、緑内障、および失明を引き起こし得る。
２型糖尿病を生じる正確な機序は、知られていないが、不適切なインスリン反応に加えて、骨格筋へのグルコース輸送の障害および肝臓でのグルコース産生の増加をもたらす。食習慣の改善は、多くの場合、効果がなく、したがって、大部分の患者は、最終的に、疾患の合併症の進行を予防および／または遅延するために、医薬介入を必要とする。多くの患者は、インスリン、αグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、ＤＰＰ−４阻害剤、メグリチニド、スルホニル尿素、およびチアゾリジンジオンを含む、利用可能な多くの経口抗糖尿病剤のうちの１つ以上で治療され得る。
αグルコシダーゼ阻害剤（アカルボースおよびミグリトールを含む）は、炭水化物を消化するある酵素、具体的には、小腸におけるαグルコシダーゼ酵素を競合的に阻害する単糖類であり、膜結合αグルコシダーゼは、オリゴ糖、三糖、および二糖をグルコースおよび他の単糖に加水分解する。
ビグアニド（メトホルミン、ブホルミン、およびフェンホルミン等）は、肝臓グルコース新生を阻害することにより、および血流に既に存在するグルコースの吸収を増加させることにより、血清グルコースのレベルを低下させる。ＤＰＰ−４阻害剤（ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、およびアログリプチンを含む）は、インクレチンレベル（ＧＬＰ−１およびＧＩＰ）を増加させると考えられている。インクレチンは、グルカゴンの放出を阻害し、それによりグルコースレベルを制限し、インスリン分泌を増加させ、胃内容排出を低下させる。
スルホニル尿素（アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリプジド、グリクラジド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリキドン、グリコピラミド、およびグリメピリドを含む）は、膵臓β細胞の細胞膜上のＡＴＰ依存性Ｋ＋（ＫＡＴＰ）チャンネルに結合し、それによって、（プロ）インスリンの分泌を増加させる。また、スルホニル尿素は、１）グルコースに対してβ細胞を過敏にする、２）肝臓におけるグルコース産生を制限する、３）脂肪分解（脂肪組織による脂肪酸の分解および放出する）を低下させる、ならびに４）肝臓によるインスリンのクリアランスを低下させるとも考えられている。
メグリチニド（ナテグリニド、ミチグリニド、およびレパグリニドを含む）の作用機序は、スルホニル尿素の作用機序に類似する。メグリチニドは、膵臓β細胞の細胞膜上のＡＴＰ依存性Ｋ＋（ＫＡＴＰ）チャンネルに結合し、これは、次いで、（プロ）インスリンの分泌を増加させる。
チアゾリジンジオン（トログリタゾン、ピオグリタゾン、およびロジグリタゾンを含む）は、細胞核内の受容体分子の一群であるペルオキシソーム増殖剤活性化受容体に結合する。これらの受容体に対する正常なリガンドは、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）およびエイコサノイドである。活性化されると、この受容体は、ＤＮＡに移動し、いくつかの特定の遺伝子の転写を活性化する。これらの異なる遺伝子の活性化は、１）インスリン耐性の低下、２）脂肪細胞分化の改善、３）ＶＥＧＦ誘発の血管形成の阻害、４）レプチンレベルの低下（食欲の増加をもたらす）、５）あるインターロイキン（例えば、ＩＬ−６）レベルの低下、および６）アディポネクチンレベルの増加をもたらす。
最近の科学的発見は、慢性炎症と糖尿病の前兆であるインスリン耐性との関連を示唆している。Ｓｏｌｉｎａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ６，３８６−３９７（２００７）（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｄｕｎｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５２，１７９９−１８０５（２００３）（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）、Ｋａｔｈｒｙｎ Ｅ．Ｗｅｌｌｅｎ ａｎｄ Ｇoｋｈａｎ Ｓ．Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５，１１１１−１１１９（２００５）（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。更に具体的には、炎症は、インスリン受容体基質−１（ＩＲＳ−１）のセリンリン酸化反応を促進することによりインスリン耐性を誘発し、これにより、インスリンシグナルを弱める。インスリンシグナルを減弱することにより、個々の細胞は、血清インスリンに対して更に耐性を示し、むしろ、血流へのグルコース（グリコーゲンから）の放出をさせるようになる。これは、炎症の薬理学的標的が、特に、インスリン耐性を低減し、それによって、糖尿病を予防し得ることを示唆している。加えて、糖尿病の薬物治療と抗炎症治療療法を組み合わせる、双対アプローチを用いて、インスリン耐性および糖尿病の症状の緩和の増大をもたらし得る。
炎症
炎症は、異物、特に、微生物起源からの対象への侵入による防衛反応として生じ得る。更に、物理的外傷、毒素、および新生組織形成が、炎症反応を誘発し得る。白血球の蓄積およびその後の活性化が、炎症のほとんどの形態の発症原因における主要な事象である。炎症による欠失は、宿主を弱化させ、感染症または創傷を悪化させやすい状態にさせ得る。長期的炎症反応等の重度の炎症は、インスリン耐性、糖尿病、動脈硬化症、白内障、慢性皮膚疾患、再かん流傷害、および癌が挙げられるが、これらに限定されない炎症性疾患、感染性髄膜炎、リウマチ熱等の感染後症候群、全身性エリテマトーデスおよびリウマチ性関節炎等のリウマチ性疾患を引き起こし得る。これらの疾患は、毎年世界中の何百万人の人々に影響を及ぼし、死亡率および罹患率の増加を引き起こす。これらの異なる疾患の進行における炎症反応の共通性は、その制御をヒト疾患の予防または治療における主要な要素にする。
炎症性サイトカインの過剰産生は、多数の炎症性および自己免疫疾患の発症原因に関連付けられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症カスケードの開始において、初期事象であり（Ｂｒｅｎｎａｎ Ｆ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，１９８９，２：２４４−７、Ｈａｗｏｒｔｈ Ｃ，ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，２１：２５７５−２５７９）、これらの疾患の開始および維持の直接的な一因となる。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＦＮ−γ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびＩＬ−１０を含む、他のサイトカインもまた、一因となる。これらのサイトカインのうちの一部（例えば、ＩＬ−８）は、炎症反応を増加させる、または悪化させ得るが、他（例えば、ＩＬ−１０）は、炎症反応を軽減させる、または緩和させ得る。
免疫系の細胞、特に、マクロファージは、活性化する刺激に反応してこれらのサイトカインの多くを分泌する。サイトカインの標的細胞は、何らかの身体要素に局在され得、長距離機序を介して作用し得る、または隣接細胞において作用し得る。したがって、サイトカインは、局在された、または全身的な方法において、炎症を制御し得る。
胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ） 胸腺間質リンホポエチン（ＴＳＬＰ）は、樹状細胞媒介したＴｈ２型炎症反応の引き金となり、アレルギー性炎症の主幹スイッチと見なれるＩＬ−７様サイトカインである。ＴＳＬＰは、ＢおよびＴ細胞の双方の成長および成熟に対する不可欠な成長因子である。特に、マウスＴＳＬＰは、Ｂリンパ球産生を支援し、Ｂ細胞増殖に必要である。マウスＴＳＬＰは、Ｔ細胞受容体γ（ＴＣＲγ）遺伝子座の再構成を制御する重要な役割を果たし、胸腺細胞および成熟Ｔ細胞に対して大きい促進作用がある。例えば、Ｆｒｉｅｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐ． Ｈｅｍａｔｏｌ．，２２：３２１−３２８，１９９４、Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：１０−１６，１９９６、Ｃａｎｄｅｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５７：９−１４，１９９７を参照のこと。
ＴＳＬＰは、ＩＬ−７に類似したサイトカイン活性を有する。例えば、ＴＳＬＰは、Ｂ細胞増殖反応を刺激する際には、ＩＬ−７の代わりをすることが可能である（Ｆｒｉｅｎｄら、上記を参照）。ＴＳＬＰおよびＩＬ−７は、標的細胞の類似の効果を仲介するが、異なるシグナル経路を有するようであり、それらの生物学的反応において異なる可能性が高い。例えば、ＴＳＬＰは、ＳＴＡＴ５の活性を調節するが、Ｊａｎｕｓファミリーサイトカインキナーゼメンバーのいずれも活性化しない（Ｌｅｖｉｎ ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：６７７−６８３，１９９９）。
樹枝状細胞およびＴＮＦ産生に対するＴＳＬＰ効果 ヒトＴＳＬＰおよびヒトＴＳＬＰ受容体が、２００１年にクローン化された後、ヒトＴＳＬＰは、未成熟ＣＤ１１ｃ＋骨髄樹状細胞（ｍＤＣ）を強く活性化したことが発見された（例えば、Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３３６−３４３，２００１およびＳｏｕｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：６７３−６８０，２００２を参照のこと）。Ｔｈ２細胞は、概して、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３、およびＩＬ−１０を産生する、ＣＤ４＋Ｔ細胞として免疫学の教科書および文献に定義され、ＣＤ４＋Ｔ細胞等のＴｈ１細胞は、ＩＦＮ−γ、および場合によっては、ＴＮＦを産生する。ＴＳＬＰ−ＤＣを使用して、体外で、未感作同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞を刺激すると、古典的なＴｈ２サイトカインＩＬ−４、ＩＬ−５、およびＩＬ−１３、ならびに大量のＴＮＦを産生するが、ＩＬ−１０またはインターフェロン-γはほとんど、または全く産生しない、独特型のＴｈ２細胞が誘発される（Ｒｅｃｈｅら、上記を参照）（例えば、Ｓｏｕｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：６７３−６８０，２００２も参照のこと）。ＴＮＦは、一般に、Ｔｈ２サイトカインとは見なされない。しかしながら、ＴＮＦは、喘息気道において顕著であり、ＴＮＦ分泌の増加と相関する遺伝子型が、喘息のリスク増加と関連するしている。Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ．，２５：１０３８−１０４４，１９９５およびＭｏｆｆａｔｔ，Ｍ．Ｆ．ａｎｄ Ｃｏｏｋｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，６：５５１−５５４，１９９７を参照のこと。
ＴＳＬＰは、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの双方で、ヒトｍＤＣが、ＴＮＦスーパーファミリータンパク質ＯＸ４０Ｌを発現するように誘発する（Ｉｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：１２１３−１２２３）。ＴＳＬＰ−ＤＣによるＯＸ４０Ｌの発現は、炎症性Ｔｈ２細胞の生成に重要である。したがって、ＴＳＬＰ活性化ＤＣは、Ｔｈ１分極サイトカインの産生を誘発することなく、上方調節ＯＸ４０ＬによりＴｈ２許容型微環境を生成する。同上。
ＴＳＬＰ発現、アレルゲン特異反応、および喘息 初期の研究では、ＴＳＬＰ ｍＲＮＡは、ヒト一次皮膚ケラチン生成細胞、気管支上皮細胞、平滑筋細胞、および肺線維芽細胞により高度に発現することが示されている（Ｓｏｕｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：６７３−６８０，２００２）。ＴＳＬＰは、主に、表皮の上層のケラチン生成細胞に発現し、これは、ＴＳＬＰ産生が完全に分化したケラチン生成細胞の特徴であることを示唆している。アトピー性皮膚炎に罹患している患者におけるＴＳＬＰ発現は、原位置でランゲルハンス細胞の移動および活性化と関連し得、これは、ＴＳＬＰが、流入領域リンパ節および主要なアレルゲン特異反応に移動し得る、これらの細胞の活性化に直接寄与し得ることを示唆している。同上。更に最近の研究では、ＴＳＬＰ発現は、喘息気道を増加させ、Ｔｈ２誘引性サイトカインの発現と、疾病重症度との双方に相関することが、原位置ハイブリッド形成法により示され、これはＴＳＬＰと喘息との関連を提供する（Ｙｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７４：８１８３−８１９０，２００５）。
ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）、アレルギー、および喘息 ＴＳＬＰ受容体（ＴＳＬＰＲ）は、約５０ｋＤａタンパク質であり、共通γ鎖との著しい類似点を有する。ＴＳＬＰＲは、新型１サイトカイン受容体であり、これは、ＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）と組み合わされ、例えば、Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１：５９−６４，２０００に記載されるように、ＴＳＬＰ受容体複合体の構成要素となる。ＴＳＬＰＲは、そのカルボキシル末端付近でチロシン残基を有し、これは、リン酸化ＳＴＡＴ５と関連し、ＴＳＬＰと関与する際、複数の生物学的機能を媒介する（Ｉｓａｋｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：３２８８−３２９４，２００２）。
ヒトＴＳＬＰＲは、単球およびＣＤ１１ｃ＋樹枝状細胞により発現され、ＴＳＬＰ結合は、ＴＨ２細胞誘引性ケモカインＣＣＬ１７およびＣＣＬ２２を誘発する。更に、上記のように、ＴＳＬＰＲ誘発された樹枝状細胞の活性化は、ＴＨ２サイトカインＩＬ−４、−５、および−１３の分泌の増加を間接的にもたらし、これは、ＣＤ４＋Ｔ細胞ホメオスタシスの調節に必要であり得る。マウスにおいて、ＴＳＬＰＲの欠損は、リンパ球数に影響を及ぼさない。しかしながら、ＴＳＬＰＲおよび共通γ鎖の欠損は、共通γ鎖のみを欠損するマウスと比較する際、より少ないリンパ球をもたらす。Ｒｅｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３３６−３４３，２００１およびＳｏｕｍｅｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３：６７３−６８０，２００２を参照のこと。
研究は、ＴＳＬＰおよびＴＳＬＰＲが、マウスにおいて、アレルギー性疾患の発症に重要な役割を果たすことを見出している。ある１つの研究では、皮膚において、ＴＳＬＰを過剰発現するように改変されたマウスは、炎症性浸潤を含む湿疹性皮膚病変、循環型Ｔｈ２細胞の劇的な増加、および血清ＩｇＥの上昇を特徴とするアトピー性皮膚炎を発症することが実証された（Ｙｏｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：５４１−５４９，２００５）。その研究は、ＴＳＬＰが、マウスにおいて、ＤＣを直接活性化し得ることを示唆した。Ｌｉらにより行われた別の研究では、該グループは、皮膚において、ＴＳＬＰを過剰発現する遺伝子導入マウスが、アトピー性皮膚炎を発症することを確認し、これは、ＴＳＬＰとアトピー性皮膚炎の発症との関連を確固にした。
別の研究集団は、ＴＳＬＰが、生体内で、アレルギー性気道炎症の発症に必要であることを実証した。ある研究では、Ｚｈｏｕらは、白血球（Ｔｈ２細胞を含む）の広範囲の浸潤、杯細胞の異常増殖、上皮下繊維症、および血清ＩｇＥレベルの増加を特徴とする、ＴＳＬＰ導入遺伝子の肺特異的発現がアレルギー性気道炎症（喘息）を誘発することを実証した（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：１０４７−１０５３，２００５）。しかしながら、対照的に、ＴＳＬＰＲを欠損するマウスは、吸入抗原に反応して喘息を発症しなかった（Ｚｈｏｕら、上記参照およびＡｌ−Ｓｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０２：８２９−８３９，２００５）。したがって、これらの研究は共に、ＴＳＬＰが、マウスにおいて、アレルギー性気道の発症に必要であることを実証した。
更に、Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎらにより行われた研究では、上皮細胞由来のＴＳＬＰは、ヒトにおいて、ＤＣ媒介炎症性Ｔｈ２反応の引き金となり、これは、ＴＳＬＰが上皮細胞ＤＣ界面でアレルギー性炎症の主幹スイッチを示すことを示唆する（Ｙｏｎｇ−Ｊｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２０３：２６９−２７３，２００６）。
最近の研究では、ＴＳＬＰＲを阻害することによるＤＣ機能の調節は、マウスにおいて重症度を減少することを示した（Ｌｉｙｕｎ Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２９：２０２−２１０，２００８）。別の研究集団では、ＴＳＬＰＲは、ＤＣにおいてのみ発現するだけでなく、マクロファージ、マスト細胞、およびＣＤ４＋Ｔ細胞においても発現することを実証した（Ｒｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８：６７２０−６７２４，２００７およびＯｍｏｒｉ Ｍ．ａｎｄ Ｚｉｅｇｌｅｒ Ｓ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７８：１３９６−１４０４，２００７）。アレルギー性炎症におけるＣＤ４＋Ｔ細胞または他のエフェクター細胞におけるＴＳＬＰＲ中和反応の直接の効果を除外するために、Ｌｉｙｕｎ Ｓｈｉらは、ＯＶＡ充填したＤＣをナイーブマウスの気道への養子免疫伝達前に、体外において、抗−ＴＳＬＰＲで処置する、実験を行った。ＯＶＡ−ＤＣは、強い好酸性気道炎症の引き金となり、ＩＬ−４およびＩＬ−５等のＴｈ２サイトカインの大量産生を伴うことが以前に見出されている（Ｓｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：１２６１−１２７１およびＬａｍｂｒｅｃｈｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０６：５５１−５５９，２０００）。しかしながら、抗−ＴＳＬＰＲを用いてＯＶＡ−ＤＣを前処理することにより、好酸球およびリンパ球浸潤、ならびにＩＬ−４およびＩＬ−５レベルの著しい減少をもたらし、ＤＣ抗原刺激を受けたアレルギー性疾患において、ＴＳＬＰＲが果たす役割を更に明らかにした。この結果はまた、ＤＣにおけるＴＳＬＰＲの遮断が、気道炎症の抑制を助けることも支持する（Ｌｉｙｕｎ Ｓｈｉら、上記を参照）。
種々の生理学的および病理学的プロセスにおける、ＴＳＬＰ／ＴＳＬＰＲの役割を示唆する一連の実験が増大している。ＴＳＬＰの生理的役割は、特に、ＢおよびＴ細胞増殖、発育、および成熟を刺激する際に、免疫系を調節することを含む。ＴＳＬＰは、アレルギー性疾患を緩和するために、アレルギー性喘息の病理生理学およびＴＳＬＰ受容体機能の妨害を媒介した局所抗体に極めて重要な役割を果たす。したがって、ＴＳＬＰとＴＳＬＰ受容体との相互作用は、アレルギー性炎症、アトピー性皮膚炎またはアトピー性湿疹に罹患している患者の皮膚病変、インスリン耐性または糖尿病、および喘息等の多くの生理学的疾患プロセスにおいて重要であると考えられる。
炎症関連状態または疾患
本明細書のある実施形態は、ある状態または疾患と関連する炎症の少なくとも１つの症状を予防するまたは緩和することによる対象に対する治療組成物および治療方法に関する。例えば、本明細書に開示の治療組成物および／または方法は、インスリン耐性および糖尿病を治療または予防するために有用であり得る。
治療方法
「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」という用語は、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害する、または予防することを指し、かつこれらの意味を含意し、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「治療的に（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ）」とは、本明細書に定義されるように、治療の行為を指す。
「治療有効量」は、疾患、障害、もしくは状態、またはそれらの１つ以上の症状を正常化、緩和、その進行を阻害する、または予防するために十分である、本明細書に提供される本発明を実践する過程において利用されるいずれかの化合物の任意の量である。
本明細書のある実施形態は、糖尿病に関連する状態もしくは疾患、あるいはその症状の治療組成物および治療の方法に関する。例えば、本明細書に開示される治療組成物および／または方法は、糖尿病、インスリン依存性糖尿病もしくはＩＤＤＭ（１型）、非インスリン依存性糖尿病もしくはＮＩＤＤＭ（２型）、インスリン耐性、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される１つ以上の状態または疾患の治療または予防に有用であり得る。
炎症と関連する多くの状態または疾患は、ステロイド、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、アザチオプリン、およびレフルノミド等を含む免疫抑制剤、アスピリン、アセトアミノフェンおよびＣＯＸ−２阻害剤等の非ステロイド系抗炎症剤、金剤、ならびに抗マラリア治療剤を用いて治療されている。これらの医薬品は、種々の欠点を有し、副作用には、注射部位反応、発疹、上気道感染、自己免疫疾患および感染に対する感受性の増加等が含まれる。加えて、多くの抗炎症性調合薬は、より便利でかつより適合した経口経路または局所皮膚経路とではなく、静脈内（ＩＶ）、あるいは皮下（ＳＣ）投与を必要とする。したがって、炎症に関連する状態および疾患に対する新規の薬剤および治療方法の開発に対する必要性が未だに存在する。
併用療法：
追加の態様は、本明細書に開示される本発明の方法を提供し、これには、併用療法を更に含み、少なくとも１つの追加の治療剤を患者に投与する。ある態様では、少なくとも１つの追加の治療剤は、インスリン、αグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、ＤＰＰ−４阻害剤、メグリチニド、スルホニル尿素、およびチアゾリジンジオンからなる群から選択される。
特定の実施形態では、該少なくとも１つの追加の治療剤は、アカルボースおよびミグリトールからなるαグルコシダーゼ阻害剤；メトホルミン、ブホルミン、およびフェンホルミンからなるビグアニド；ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、およびアログリプチンからなるＤＰＰ−４阻害剤；アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリプジド、グリクラジド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリキドン、グリコピラミド、およびグリメピリドからなるスルホニル尿素；ナテグリニド、ミチグリニド、およびレパグリニドからなるメグリチニド；トログリタゾン、ピオグリタゾン、およびロジグリタゾンからなるチアゾリジンジオン；ならびにこれらの組み合わせ、からなる群から選択される。
追加の態様は、本明細書に開示される本発明の方法を提供し、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニスト（例えば、１つより多い受容体鎖の構成要素をコードし、それによって、生理学的受容体ヘテロ二量体または高次オリゴマーを模倣する、ＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチド等のＴＳＬＰおよびそのＴＳＬＰ受容体に対して特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、およびＴＳＬＰ受容体融合タンパク質。この受容体は、１つよりも多いポリペプチド鎖を含む場合、一本鎖融合を利用することができる）との併用療法を更に含む。
炎症および／または糖尿病に対する治療処置は、静脈内に、皮下に、局所に、または経口で投与される多様な調合薬を含み、これは、求められる結果により異なる。しかしながら、今日、利用可能な抗炎症治療の多くは、注射部位での激しい反応、感染症への感受性の増加、発疹、または他の副作用を含む、考慮すべき欠点がある。したがって、より良好な抗炎症治療剤および治療方法の必要性がある。
界面動電的に生成されたガス富化流体および溶液の抗炎症活性：
本発明のある態様によれば、本明細書に開示されるガス富化流体および／または溶液は、抗炎症特性および効果を有し、炎症に関する疾患または障害に苦しんでいる対象の治療のための抗炎症剤として使用され得る。図３８は、健常な献血者からの刺激されたリンパ球のサイトカインプロファイルの実験結果を示す。図３８に見られ得るように、本発明の酸素富化流体（水）は、特定のサイトカイン、特に、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＩＬ−１βの下方調節に影響を及ぼした。
炎症性サイトカインの産生増加は、多くの炎症性および自己免疫疾患の発症原因に関連付けられている。ＴＮＦαの分泌は、炎症カスケードの開始において、初期事象であり（Ｂｒｅｎｎａｎ Ｆ．Ｍ．，ｅｔ．ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，１９８９，２：２４４−７、Ｈａｗｏｒｔｈ Ｃ，ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９１，２１：２５７５−２５７９）、炎症性および自己免疫疾患の開始および維持の直接的な一因となる。インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦを含む、他の炎症性サイトカインもまた、ある役割を果たす一方で、ＩＬ−１０等の抗炎症サイトカインは、疾患を軽減させ得る。免疫系の細胞、具体的には、マクロファージは、活性化する刺激に反応してこれらのサイトカインの多くを分泌する。
様々な細胞型は、炎症過程に関与する。単球、マクロファージ、および他の免疫細胞によるＴＮＦαの過剰産生は、数多くの疾患の発症原因における主要素である。具体的には、マクロファージおよびＴ細胞は、免疫応答の開始および維持において、中心的な役割を果たす。病理学または免疫原性の刺激により活性化されると、マクロファージは、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、一酸化窒素（ＮＯ）、ＩＬ−６、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ等を含む、サイトカインの宿主を放出することにより応答する。Ｔ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＮＦ−γ、および他の炎症性サイトカインを放出する。これらのサイトカインは、他の免疫細胞を活性化し、一部は、独立した細胞毒性剤としての役割も果たし得る。マクロファージおよびＴ細胞由来の炎症性メディエータの過剰放出は、特に、正常細胞および周辺組織の損傷をもたらす。
炎症性サイトカインは、糖尿病を含む多くの疾患および疾患症状の一因であるとされている。平滑筋細胞からの一酸化窒素の誘発は、敗血症性ショック中、平均動脈圧および全身血管抵抗の減少を介在することから、一酸化窒素に対する基本的役割が示唆される。したがって、ＩＬ−８、ＩＬ−１β、および一酸化窒素における下方調節作用を標的とする療法は、敗血症、敗血症性ショック、内毒素性ショック、および糖尿病を含む、炎症性疾患または障害の治療に有用となり得る。
ＴＮＦαの過剰産生は、糖尿病およびリウマチ性関節炎等の多くの自己免疫疾患の臨床上の徴候の一因となる。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）もまた、ＩＬ−１βおよびＴＮＦαレベルの増加によって促進される。狼瘡患者においては、血清Ｃ反応性タンパク質、ＩＬ−１β、およびＴＮＦαレベルは、対照よりも高く、これは、炎症反応の増加が、疾患においてある役割を果たしていることを示唆している（Ｌｉｏｕ Ｌ．Ｂ．Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２００１，１９：５１５−５２３）。ＳＬＥの１つの形態である、神経精神的紅斑性狼瘡（ＮＰＬＥ）の患者の研究により、ＴＮＦαに対するｍＲＮＡを発現する末梢血単核細胞数、および一酸化窒素代謝物質の脳脊髄液濃度が、ＮＰＬＥ疾患の重症度と相関のあることが示された（Ｓｖｅｎｕｎｇｓｓｏｎ Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ａｎｎ．Ｒｈｅｕｍ．Ｄｉｓ．２００１，６０：３７２−９）。
ＩＬ−１およびＴＮＦαは、動物モデルにおいて、様々な急性および慢性反応において、中心的な役割を果たす。さらに、ＩＬ−１１、ＩＦＮα、およびＩＦＮβはまた、炎症性反応を上方調節し得る。反対に、幾つかのサイトカインは、炎症反応の下方調節に関与する（即ち、特に、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３）。実施例１に記述されているように、本発明のガス富化流体と接触した細胞は、Ｔ３抗原を有する対照培地においてよりもＴ３抗原を有するＩＦＮ−γレベルの増加を示し、一方、ＩＬ−８は、Ｔ３抗原を有する対照培地においてよりもＴ３抗原を有する本発明のガス富化培地において低かった。さらに、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αレベルは、ＰＨＡを有する対照培地においてよりも、ＰＨＡを有する本発明のガス富化培地において低く、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡを有する対照培地と比較した際、ＰＨＡを有する本発明のガス富化流体培地において低かった。本発明のガス富化培地単独では、ＩＦＮ−γレベルは、対照培地においてよりも高かった。これらの結果は、抗炎症微環境と一致している。
一酸化窒素は、炎症反応のメディエータおよびレギュレータとして認識されている。病原体に対する細胞毒性作用を有するが、対象自身の組織に対する悪影響も有し得る（Ｋｏｒｈｏｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ Ｉｎｆｌａｍｍ Ａｌｌｅｒｇｙ ４（４）：４７１−９，２００５）。一酸化窒素は、可溶性グアニル酸シクラーゼと反応して、環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）を形成し、これは多くの一酸化窒素の効果を介在する。一酸化窒素はまた、分子酸素およびスーパーオキシドアニオンと相互作用して、様々な細胞機能を修飾することができる活性酸素種を産生することもできる。一酸化窒素のこれらの間接的な効果は、炎症において重要な役割を持ち、一酸化窒素は、誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）による高量で産生され、活性酸素種は、活性化された炎症細胞により合成される。実際、ＮＯの過剰産生は、肥満における筋細胞のインスリン作用およびβ細胞機能の両方の障害の一因となり、インスリン耐性および糖尿病に至る場合がある。
一酸化窒素は、ケラチン生成細胞、線維芽細胞、内皮細胞、および可能性のあるその他により産生され得る。一酸化窒素の血管作用の一部には、血管拡張、血管内皮への血小板粘着の阻害、血管内皮への白血球粘着の阻害、およびスーパーオキシドの補足が含まれる（Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ Ｐｅｒｓｐ．ｖ．１０６（５）：１１３９−１１４３）。
更に、一酸化窒素合成酵素の阻害は、創傷収縮を遅延し、コラーゲン組織を改変し、新表皮の厚さ（ｎｅｏｅｐｉｄｅｒｍｉｓ ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ）を改変することが示されている（Ａｍａｄｅｕ ａｎｄ Ｃｏｓｔａ，Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．３３：４６５−４７３，２００６）。創傷におけるマスト細胞移動および血管形成はまた、一酸化窒素の阻害によっても影響を受ける。（同上）。いずれの特定の理論機構にも拘束されるわけではないが、ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、局在性および／もしくは細胞内一酸化窒素産生、または分解を調節し得、本明細書に開示される実施例部分に例示される創傷治癒効果のスペクトルと一致する。可変の調節経路により、ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、一酸化窒素産生を増加する、および／または一酸化窒素分解を遅延させ得る一方で、他のある実施形態では、本発明のガス富化流体は、一酸化窒素産生を減少させる、および／または一酸化窒素分解を加速し得る。
特に、本明細書の実施例８に記述されているように、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、４日目〜１１日目で創傷治癒が増加し、３日目〜１１日目で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷の新表皮は、生理食塩水で処置した創傷の表皮の２倍〜４倍の速度で移動したことを示した。試験はまた、１５日〜２２日で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、更に成熟した表皮層の早期形成により証明されるように、更に高速で分化したことも示した。全ての段階で、通常の治癒と関連する表皮に生じる肥厚は、酸素富化食塩溶液により処置した創傷内で生じなかった。
したがって、一連の創傷治癒効果の範囲に従い、いかなる特定の理論に拘束されることを意図してはいないが、酸素富化食塩溶液は、創傷内で、一酸化窒素の局在性および／または細胞内レベルを調節し得ると考えられる。一酸化窒素は、創傷治癒において、成長因子、コラーゲン沈着、炎症、マスト細胞移動、表皮肥厚、および新血管形成を調節する。更に、一酸化窒素は、酸素により調節される誘導酵素により産生される。
マスト細胞移動の場合は、酸素富化溶液に対する初期および後期移動のにおける差異も生じる。これは、一酸化窒素合成の阻害に関する当技術分野において既知のものと一致する（Ａｍａｄｅｕ ａｎｄ Ｃｏｓｔａ，Ｊ．Ｃｕｔａｎ Ｐａｔｈｏｌ ３３：４６５−４７３，２００６）。
ここで、図４１Ａ〜４１Ｆを参照すると、様々な図解は、酸素富化食塩溶液を用いた、および用いない、ブタの表皮組織の創傷治癒結果を比較する。図に示すように、酸素富化食塩溶液を用いる対照創傷および創傷の治癒を、１日目、４日目、および１６日目で追跡した。
図４１Ａは、１日目における、対照創傷の創傷治癒を示す。そこで見られるように、創傷は、表皮／皮膚の肥厚および輪郭の喪失を示す。図４１Ｂは、酸素富化食塩溶液を用いて処置した創傷に対する１日目における創傷治癒を示す。創傷は、正常な表皮／皮膚の肥厚を示し、正常な輪郭（ｃｏｎｔｏｕｒｉｎｇ）は、新規の創傷において典型的である。
ここで、図４１Ｃおよび４１Ｄを参照すると、４日目における、対照創傷に対する創傷治癒、および４日目における、酸素富化食塩溶液で処置した創傷に対する創傷治癒が示されている。図４１Ｃに例示される対照創傷に関しては、創傷は、６００ミクロンの表皮突起を示す。図４１Ｄ中の酸素富化食塩溶液で処置された創傷では、１２００ミクロンの表皮突起が示されている。したがって、実験の開始から４日間では、酸素富化食塩溶液を用いて処置された創傷に形成された表皮突起は、酸素富化食塩溶液で処置されなかった創傷のものの２倍の表皮増殖速度を示す。
ここで、図４１Ｅを参照すると、１６日目での対照創傷が示されている。創傷は、図４１Ｆに示される、酸素富化食塩溶液で処置した創傷によって示されたものよりも表皮／皮膚の輪郭の喪失を有する分化した表皮が少ないことを示す。図４１Ｆは、創傷において、更に分化した表皮および更に正常の表皮／皮膚の輪郭を示す。
炎症プロセスの最初の２相において、外来体は、破壊されるか（例えば、外来体が有機体である場合）、あるいは、その周辺の組織が弛緩する（ｌｏｏｓｅｎ）（例えば、外来体が断片（ｓｐｌｉｎｔｅｒ）である場合）かのいずれかである。治癒相において、炎症が鎮静しはじめ、個体の血管および脈管パターンが、再び正常になり、創傷の修復が開始する。修復プロセスにおける３つの主事象は、（１）線維芽細胞を増殖することによる新結合組織の形成、（２）上皮の再生、および（３）新しい毛細血管の増生である。
炎症が鎮静する前でさえ、線維芽細胞は、通常、休眠状態で存在する、周囲の正常組織から損傷領域への移動を開始する。それらは、アメーバ様運動でフィブリンのストランドに沿って移動し、自身を治癒領域全体に分布させる。一旦、損傷組織中の位置に固定されると、線維芽細胞は、コラーゲンを合成し始め、このタンパク質を分泌し、これがそれ自身を繊維として配列する。該繊維は、その長軸で応力が最も高い方向に自身を配向させる。コラーゲンの束が成長して堅固になるにつれ、線維芽細胞は、次第に変性し、この束に密接に付着し、損傷領域は、瘢痕組織に変形する。
瘢痕組織の形成と同時に、創傷の端の無傷の上皮細胞が増殖し始め、１枚のシートとして損傷領域の中心に向かって動き始める。炎症が鎮静するにつれ、血液の直接供給の必要性が生じ、血管形成が創傷部位に生じる。
炎症は、多数の細胞型を含む複合プロセスである。例えば、マスト細胞は、初期相の血管拡張の引き金となるメディエータを放出し、これに内皮細胞の分離および内皮下層中のコラーゲン繊維の露出が伴う。血管中に形成される細胞間の空隙の線維が血小板を捕捉し、これらの細胞からのメディエータの放出の引き金となる。
血小板に加えて、露出したコラーゲン繊維もまた、拡張した血管壁の孔を通って濾過される血漿のタンパク質と相互作用し、これは血液凝固カスケードの引き金となる因子、血管拡張の増加、血管の浸透性および走化性の増加を含む。
また、補体カスケードは、以下の幾つかの刺激により活性化され得る：損傷した血管、傷害を受けた細胞により放出されるタンパク質分解酵素、いずれかの関与する細菌の膜成分、および抗原−抗体複合体。活性化された補体成分のうちの幾つかは、走化因子として作用し、白血球が炎症領域へと流入する原因となる一方、他のものは、食作用を促進し、細胞溶解に関与する。
加えて、本発明のガス富化流体または溶液はまた、炎症の少なくとも１つの態様に関与する少なくとも１つのサイトカインを調節し得、該サイトカインには、ＭＡＦ（マクロファージ活性化因子）、ＭＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）、ＭＣＦ（マクロファージ走化因子）、ＬＭＩＦ（白血球遊走阻止因子）、ＨＲＦ（ヒスタミン放出因子）、ＴＦ（伝達因子）、インターロイキン（ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５等）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−ζ、ＩＦＮ−δ等）、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージＣＳＦ）、Ｍ−ＣＳＦ（マクロファージＣＳＦ）、ｍｕｌｔｉ−ＣＳＦ（ＩＬ−３）、線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ）、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）、形質転換増殖因子（ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β等）、ＮＡＰ−２（好中球活性化タンパク質２）、ＰＦ−４（血小板因子４）、トロンボグロブリン、ＭＣＰ−１（単球走化性タンパク質１）、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β−＋（マクロファージ炎症性タンパク質）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化において調節された、正常Ｔ発現および恐らく分泌されたケモカイン）、ＨＳＰ（熱ショックタンパク質）、ＧＲＰ（グルコース調節タンパク質）、ユビキチン等が挙げられるが、これらに限定されない。
したがって、ある実施形態では、ガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症分子もしくはサイトカインの産生および／または分泌を増加させる、または抗炎症分子もしくはサイトカインの分解を低下させ、それにより、炎症の少なくとも１つの症状を緩和または予防し得る。他の実施形態では、本発明のガス富化流体および／または治療組成物は、抗炎症分子もしくはサイトカインの産生および／または分泌を低下させる、または抗炎症分子もしくはサイトカインの分解を増加させ、それにより、炎症の少なくとも１つの症状を緩和または予防し得る。
以前の研究は、リウマチ性関節炎のヒト自己免疫疾患に対する動物モデル系で、脱髄の増加およびＥＡＥ（実験的自己免疫性脳脊髄炎）の悪化における、抗−ＭＯＧ抗体の重要な役割を示した（Ｌｉｎｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．１９９２．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２１９−２２４）。また、ＭＯＧに対する抗体は、多発性硬化症の発症原因に関与している（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００３ Ｊｕｌ １０；３４９（２）：１３９−４５）。
図４８および実施例１２に記述されているように、本発明のガス富化流体は、動物が事前に抗原刺激を受けた抗原に対するリンパ球応答を増幅する。図４８に示されるように、リンパ球増殖は、加圧された含酸素流体（加圧ポット）または対照脱イオン流体と比較して、溶媒和電子を含む本発明のガス富化流体を用いて再構成される流体中に培養した場合、ＭＯＧ刺激に反応して、増加した。
本発明のガス富化流体および溶液
別の流体の拡散または富化は、２つの流体の溶液または懸濁液を生じ得る。特に、ガス（例えば、酸素）を用いた液体の富化は、治療処置を含む、ある用途に対して有用であり得る。本明細書に利用されるように、任意の特定の開示される実施形態に関しては、「流体」とは、該して、液体、ガス、気体、液体および／もしくはガスの混合物、またはこれらのいずれかの組み合わせを指し得る。更に、ある実施形態では、「液体」とは、概して、純正液体を指し得る、またはゲル、ゾル、エマルジョン、流体、コロイド、分散、ならびにこれらのいずれかの組み合わせを指し得、これらのいずれかは、粘度により異なり得る。
本明細書に開示される特定の実施形態では、溶解ガスは、環境大気を含む。好適な実施形態では、溶解ガスは、酸素を含む。別の実施形態では、溶解ガスは、一酸化窒素を含む。
ガス富化液体（酸素富化水等）の幾つかの当該技術分野において認識されている方法がある。例えば、タービン曝気システムは、羽根車の一連の動翼付近の大気を放出し得、これは、大気または酸素と水を混合し、水は、その酸素含有量を増加させるために大気に噴霧され得る。また、市販の他のシステムは、大気または酸素を水に吹き込み、大規模な渦に水／ガスを供する。水中の酸素の自然発生レベルは、一般的に、１０ｐｐｍ（１００万分の１）以下であり、これは、１００％の溶解酸素のレベルであると見なされる。あるデバイスにおける試験は、理想的な条件下で、デバイスが、約２０ｐｐｍ、または水の天然酸素レベルの２倍の上昇を得ることができることを示している。ある実施形態では、酸素レベルは、更に上昇し得る。
本明細書に開示されるある実施形態では、本発明のガス富化流体は、抗炎症に利点を提供する。本明細書に開示されるある実施形態は、本発明のガス富化流体を含む治療組成物、ならびに調合薬、金属、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、炭水化物もしくは糖化タンパク質、脂肪（油もしくはワックスを含む）のような、任意に、少なくとも１つの追加の治療剤、または炎症と関連する状態または疾患の少なくとも１つの症状を予防する、または緩和する他の薬剤に関する。
更に、本明細書に開示されるある実施形態は、創傷の炎症に関連する治療組成物および方法を含む。創傷ケアは、健康および下層の皮膚組織の外観を改善するために望ましい。創傷は、切傷、擦り傷、または水疱等の損傷起因、あるいは、切開痕または瘻孔等の外科的起因のいずれであっても、患部を治療し、更なる皮膚損傷を予防するための局所治療を必要とする。創傷が適切に処置されない場合、炎症等の更なる皮膚刺激が生じる可能性があり、二次感染をもたらし、対象を更に不快にさせ得る。
本明細書に提供される特定の実施形態は、本明細書に定義されるように、拡散器で処理された治療流体に関し、流体ホスト物質と、該ホスト物質に拡散された注入物質と、任意に、該ホスト物質中に拡散された少なくとも１つの治療剤と、を含み、該注入物質は、ホスト流体中の酸素超微粒気泡を含み、超微粒気泡の大部分は、０．２ミクロン未満、または好ましくは、０．１ミクロン未満の大きさである。ある実施形態では、注入された流体ホスト物質中の溶解酸素レベルは、少なくとも１３時間、大気圧で、約３０ｐｐｍを超えて維持され得る。他の特定の実施形態では、注入された流体ホスト物質中の溶解酸素レベルは、少なくとも３時間、大気圧で、約４０ｐｐｍを超えて維持され得る。
追加の実施形態では、注入された流体ホスト物質は、食塩溶液を更に含む。更なる実施形態では、注入された流体ホスト物質は、大気圧で、密閉容器内で、少なくとも１００日間、好ましくは、少なくとも３６５日間、少なくとも約２０ｐｐｍ〜約４０ｐｐｍの溶解酸素レベルを維持する。ある実施形態では、注入された流体ホスト物質は、大気圧で、少なくとも５０ｐｐｍの溶解酸素レベルを有し得る。
ある実施形態では、注入された流体ホスト物質は、酸素がその中に拡散された後、選択された期間、そこを通して輝くレーザー光線に対するレイリー散乱を示す。
表３は、酸素富化食塩溶液で処置された治癒創傷、および本発明のガス富化酸素富化食塩溶液のサンプルにおいて得られた、様々な分圧測定を示す。
気泡サイズ測定
実験は、混合デバイス１００により流体内で拡散されるガスの気泡サイズを決定するために行われた。実験は、気泡のサイズを直接測定するように行われなかったが、流体内で大部分のガス気泡の気泡サイズが、０．１ミクロンよりも小さかったことを確定する実験が、行われた。言い換えれば、実験は、大部分の気泡サイズが収まる以下のサイズ閾値を決定した。
このサイズ閾値またはサイズ限界は、混合デバイス１００において、流体およびガスを処理することにより形成された出力物質１０２を、０．２２ミクロンフィルタおよび０．１ミクロンフィルタを通過させることにより確定された。これらの試験を行う際、第１の物質１１０、この場合、流体、の容量、および第２の物質１２０、この場合、ガス、の容量は、混合デバイス１００を通過させられ、出力物質１０２（即ち、本明細書に拡散されるガスを有する流体）の容量を生成した。６０ミリリットルの出力物質１０２は、６０ｍＬの注射器に流出した。次いで、注射器内の流体の溶解酸素レベルは、オリオン８６２ａを用いて測定された。Ｏｒｉｏｎ８６２ａは、流体内の溶解酸素レベルを測定することが可能である。注射器内の流体は、０．２２ミクロンフィルタを通して、５０ｍＬのビーカーに注入された。フィルタは、Ｍｉｌｉｐｏｒ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ５０フィルタを含んだ。次いで、５０ｍＬのビーカー中の物質の溶解酸素レベルを測定した。実験は、下の表４に示される結果を達成するために、３回行われた。
表に見られるように、注射器内で測定された溶解酸素レベルおよび５０ｍＬのビーカー内で測定された溶解酸素レベルは、出力物質１０２を０．２２ミクロンフィルタに通過させることにより激変しなかった。本実験により推測されることは、出力物質１０２内の溶解ガスの気泡は、０．２２ミクロンよりも大きくない、そうでなければ、０．２２ミクロンフィルタを通過した出力物質１０２において、溶解酸素レベルの有意に大きな低下があることである。
０．２２ミクロンフィルタの代わりに０．１ミクロンフィルタを使用する第２の試験を、行った。本実験において、食塩溶液は、混合デバイス１００において、酸素で処理され、出力物質１０２のサンプルは、濾過されていない溶液中に収集された。濾過されていないサンプルの溶解酸素レベルは、４４．７ｐｐｍであった。０．１ミクロンフィルタを用いて、出力物質１０２を濾過し、２つの追加サンプルを収集した。第１のサンプルの溶解酸素レベルは、４３．４ｐｐｍであった。第２のサンプルの溶解酸素レベルは、４１．４ｐｐｍであった。次いで、フィルタを除去し、濾過されていない１０２から最終サンプルを得た。最終サンプルは、４５．４ｐｐｍの溶解酸素レベルを有した。これらの結果は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ０．２ミクロンフィルタを用いて見られたものと一致した。これらの結果により、処理された食塩溶液中の大部分の気泡が、０．１ミクロン以下の大きさである表示を提供する、０．１ミクロンフィルタを通過した出力物質１０２の溶解酸素レベルのわずかな低下があるという結論に至る。ウインクラー滴定法を用いた、上記の溶解酸素レベル試験結果を達成した。
当該技術分野において理解されるように、二重層（界面）（ＤＬ）は、液体に入れられる場合、物体の表面上に現れる。例えば、本物体は、固体表面（例えば、回転子および固定子表面）、固体粒子、気泡、溶滴、または多孔質体のものであり得る。混合デバイス１００において、気泡表面は、界面動電二重層効果に利用可能であり得る、混合チャンバ内に存在する全表面領域のかなりの部分を示す。したがって、本明細書のいずれかの箇所で論じられる表面積および保持時間に加えて、先行技術のデバイス１０と比較して、混合器１００内に生成された比較的小さい気泡サイズはまた、本明細書に開示される全界面動電効果および出力流体特性に、少なくともある程度、寄与し得る。特に、好ましい実施形態では、混合器１００に示されるように、ガスの全ては、回転子上のアパーチャを介して導入されている（固定子の開口を通して導入されているガスはない）。回転子が、回転子表面で、およびその付近で、実質的なせん断力を生成する高速（例えば、３，４００ｒｐｍ）で回転しているため、回転する回転子表面アパーチャを介して、およびそれに隣接して導入される、気泡の気泡サイズは、不動固定子を介して、およびその付近で、導入されるものよりも実質的に小さい（例えば、２〜３倍小さい）ことが期待され得る。したがって、先行技術のデバイス１０の平均気泡サイズは、ガスの少なくとも半分が、不動固定子アパーチャから混合チャンバに導入されるため、実質的に大きくなり得る。球体表面の表面積が、ｒ２により異なるため、混合デバイス１００のいずれのこのような気泡構成要素の界面動電表面積は、先行技術の拡散デバイス１０のものよりも実質的に大きくなり得る。
したがって、理論に拘束されるわけではないが、混合デバイス１００の混合チャンバは、（ｉ）先行技術のデバイス１０の容量に対する面積の比が実質的に高い（先行技術のデバイス１０は、容量に対する面積の比が、１０．９である一方、本混合器１００は、容量に対する面積の比が３９．４である）、および（ｉｉ）滞留時間が７倍長いだけでなく、（ｉｉｉ）本出力溶液の独特の特性が、混合デバイス１００において、実質的に大きい気泡表面積からの貢献に更に反映し得る。これらの特徴的な態様は、本混合器１００の特徴的な特長に反映され、本発明の出力物質／流体の独特の界面動電特性に、それぞれ貢献すると考えられる。
ここで、図３０を参照すると、混合デバイス１００において、酸素で富化され、少なくとも３６５日、５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１０００ｍＬのガラス瓶中に保管された水中の溶解酸素レベルを示す。瓶のそれぞれは、栓をし、華氏６５度で保管された。図で見られるように、酸素富化流体の溶解酸素レベルは、少なくとも３６５日、ほぼ一定を保った。
図３１を参照すると、混合デバイス１００において、酸素で富化され、５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１０００ｍＬのガラス瓶中に保管された水中の溶解酸素レベルを示す。双方の瓶は、華氏３９度で冷蔵保存された。更に、酸素富化流体の溶解酸素レベルは、少なくとも３６５日、安定した状態のままであり、わずかに低下した。
本発明のプロセスにより本発明の組成物に与えられる水和（溶媒和）電子の形態を含む組成物
ある実施形態では、本明細書に記載されるように（「二重層」の項目を参照のこと）、ガス富化流体は、分子酸素が、流体に拡散される、あるいは混合され、流体に与えられる帯電（例えば、水和（溶媒和）電子）を安定化するように作用し得る、開示された電気機械的プロセスにより生成される。理論または機序に拘束されるわけではないが、本発明のある実施形態は、第１の物質が、混合した出力物質を提供するために、本発明の混合デバイスにおいて、酸素と混合する際に、物質に添加される帯電（例えば、水和（溶媒和）電子）を含む、酸素富化流体（出力物質）に関する。特定の態様によれば、これらの水和（溶媒和）電子（または、「溶媒和電子」として本明細書に称される）は、これらの水和（溶媒和）電子により媒介された測定可能な効果の持続により証明されるように、本発明の溶液中で安定化される。ある実施形態は、水和（溶媒和）電子および／または水電子構造、クラスター等に関連し得る（例えば、Ｌｅｅ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｂｕｌｌ．Ｋｏｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，ｖ．２４，６；８０２−８０４；２００３を参照のこと）。
西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）効果 西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）は、西洋ワサビの根（Ａｍｏｒａｃｉａ ｒｕｓｔｉｃａｎａ）から単離され、ペルオキシダーゼのフェロプロトポルフィリン基（ヘム基）に属する。ＨＲＰは、ピロガロール基質を酸化するために、過酸化水素または他の水素供与体と容易に化合する。また、当該技術分野において認識されるように、ＨＲＰは、過酸化水素の不在下で、インドール−３−酢酸の自己酸化的分解反応を促進する（例えば、自己酸化は、高効率の分岐機構を含むことが記載されている、Ｈｅｍｅ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅｓ，Ｈ．Ｂｒｉａｎ Ｄｕｎｆｏｒｄ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，１９９９，Ｃｈａｐｔｅｒ ６，ｐａｇｅｓ １１２−１２３を参照のこと；参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＨＲＰ反応は、酵素活性単位で測定され得、比活性度は、ピロガロール単位の点から表される。１つのピロガロール単位は、ｐＨ６．０、２０℃で、２０秒間でピロガロールから１．０ｍｇのプルプロガリンを形成し得る。プルプロガリン（２０秒）単位は、２５℃で、１分間あたり約１８μＭ単位に相当する。
西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素は、流体中で分子酸素との反応を促成することにより、ピロガロールの自己酸化を触媒することが知られている。（Ｋｈａｊｅｈｐｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，ＰＲＯＴＥＩＮＳ：Ｓｔｒｕｃｔ，Ｆｕｎｃｔ，Ｇｅｎｅｔ．５３：６５６−６６６（２００３））。酸素は、酵素の疎水性細孔領域（Ｐｈｅ６８とＰｈｅ１４２との間）を通して西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素のヘムポケットを結合し、この立体配座が、内部への酸素の接近可能性を決定する可能性があることも知られている。特定の態様によれば、機構に拘束されるわけではないが、タンパク質における表面電荷が、タンパク質構造に影響を及ぼすことがタンパク質分野において知られているため、本発明のガス富化流体に存在する溶媒和電子は、より多くの酸素の接近可能性がもたらされるように、西洋ワサビペルオキシダーゼの立体配座を改変する役目を果たし得る。西洋ワサビペルオキシダーゼ酵素の人工ヘムポケットに対するより多くの酸素の接近可能性は、先行技術の含酸素流体（加圧ポット、微粒子気泡）と比較する場合、同様に、ＨＲＰ反応を増加させ得る。
いずれの場合においても、特定の態様によれば、本発明の方法およびデバイスを用いた出力物質の産生は、以下の電荷勾配を提供する界面二重層、および摩擦電気効果に基づいて表面から離れた電荷（例えば、電子）を引抜く表面に対して物質の移動を含む、プロセスを含み、物質の流れは、溶媒和電子の流れを産生する。更に、追加の態様によれば、機構に拘束されるわけではないが、二原子酸素の軌道構造は、流体物質（水）内で、水素結合配置において、電荷不均衡（例えば、水の水素結合に影響を及ぼす２つの不対電子）を生成し、電子は、不均衡内で溶媒和され、安定化される。
過酸化水素の存在について、本発明の酸素富化流体の幾つかの化学的試験が、以下に記述されるように行われ、これらの試験のいずれも陽性ではなかった（０．１ｐｐｍの過酸化水素の検出感度）。したがって、本願の本発明の酸素富化流体は、過酸化水素がない、または０．１ｐｐｍ未満の過酸化水素を含有する。
特定の態様によれば、過酸化水素の不在にもかかわらず、現在、特許請求されたデバイスの二重層および構成により与えられる本発明の酸素富化電子と溶媒和電子との組み合わせは、西洋ワサビペルオキシダーゼへの接近可能性がある立体配座および／またはヘム基を改変する役割を果たし得る。
グルタチオンペルオキシダーゼ試験
本発明の酸素富化出力流体物質を、過酸化水素の存在について、標準アッセイ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、グルタチオンペルオキシダーゼとの反応性を試験することにより試験した。簡潔に述べると、グルタチオンペルオキシダーゼ酵素カクテルは、脱イオン水および適切な緩衝液において、構成された。水サンプルは、酵素カクテルを添加し、逆さにすることにより試験された。連続分光測光速度決定は、Ａ３４０ｎｍで、室温（摂氏２５度）でなされた。試験されたサンプルは、１．脱イオン水（負の制御）、２．低濃度の本発明の酸素富化流体、３．高濃度の本発明の酸素富化流体、４．過酸化水素（正の制御）であった。過酸化水素の正の制御は、強力な反応性を示したが、試験した他の流体は、グルタチオンとの反応を示さなかった。
ガス富化流体または溶液を生成するためのデバイス
関連技術の説明
図１は、米国特許第６，３８６，７５１号（参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）から複製された、別の気体または液体物質（「ホスト物質」）に１つまたは２つの気体または液体物質（「注入物質」）を拡散するため、または乳化するための先行技術のデバイス１０の部分ブロック図、部分断面図を提供する。デバイス１０は、固定子３０および回転子１２を格納するように構成されるハウジングを含む。固定子３０は、回転子１２を包含する。管状チャネル３２は、回転子１２と固定子３０との間で画定される。通常の円筒形状の回転子１２は、直径約７．５００インチのおよび長さ約６．０００インチを有し、約０．８の長さと直径の比を提供する。
回転子１２は、概して、両端で閉口される、中空の円筒を含む。ギャップは、回転子１２の第１および第２の末端のそれぞれと一部のハウジング３４との間に存在する。モータ１８により駆動される回転シャフト１４は、回転子１２の第２の末端に連結される。回転子１２の第１の末端は、入口１６に連結される。第１の注入物質は、入口１６を通って、回転子１２の内部に通過する。第１の注入物質は、回転子１２の内部から回転子１２中に形成された複数の開口２２を通ってチャネル３２に通過する。
固定子３０はまた、その周辺に形成された開口２２を有する。入口３６は、固定子３０とハウジング３４との間の領域３５に第２の注入物質を通過させる。第２の注入物質は、領域３５から開口２２を通ってチャネル３２に通過する。
外部ポンプ（図示せず）を使用して、ホスト物質を単一入口ポート３７に送出する。ホスト物質は、単一入口ポート３７を通って、チャネル３２に通過し、ここで、第１および第２の注入物質に遭遇し、開口２２を通って、チャネル３２に入る。注入物質は、ホスト物質が開口２２を通過することを妨害するようにそれらの源で加圧され得る。
入口ポート３７は、環状の入口チャネル３２の比較的小さい部分（＜約５％）のみに沿って配置されるように構成され、かつ位置決めされ、ホスト物質へのチャネル３２の一部分に向かって軸流を与えるように、回転子１２の回転軸に対して実質的に平行である。
残念ながら、管状チャネル３２に流入する前に、ホスト物質は、軸流の方向以外の蛇行方向（例えば、それに実質的に直交する方向を含む）に、および回転子１２の第１の末端とハウジング３４との間に形成されたギャップ内下方へと、ギャップ間とを移動しなければならない（即ち、回転子１２の末端とハウジング３４との間の入口１６に隣接した回転子の第１の末端の下方へ）。非軸および直交流れ、ならびに回転子１２の第１の末端とハウジング３４との間のギャップにおけるホスト物質の存在は、望ましくない、不必要な摩擦を生じる。更に、ホスト物質の一部を、回転子の第１の末端とハウジングとの間で渦流する渦電流に捕捉することは可能である。また、デバイス１０において、ホスト物質は、管状チャネル３２の環状入口のいずれの態様に流入するように少なくとも２つの直角を通り抜けなければならない。
単一出口ポート４０は、ハウジング３４中に形成される。混合したホスト物質および注入物質（単数または複数）は、出口４０を介してチャネル３２を流出する。管状チャネル３２の環状出口の制限された部分（＜約５％）のみに沿っても配置される、出口ポート４０は、管状チャネル３２の環状出口の制限された部分から離れて出口ポート４０に混合物質の軸流を与える、または可能にするように、回転子１２の回転軸に対して実質的に平行である。外部ポンプ４２を使用して、出口ポート４０を介して出口流体を送出する。
残念ながら、管状チャネル３２を流出する前に、出力物質のかなりの部分が、軸流の方向以外の蛇行方向（例えば、それに実質的に直交する方向を含む）に、および回転子１２の第２の末端とハウジング３４との間に形成されたギャップ内下方へと、ギャップ間とを移動しなければならない（即ち、回転子１２の末端とハウジング３４との間のシャフト１４に隣接した回転子の第２の末端の下方へ）。上記のように、非軸および直交流れ、ならびに回転子１２の末端（この場合、第２の末端）とハウジング３４との間の他のギャップにおけるホスト物質の存在は、更に望ましくない、不必要な摩擦を生じる。更に、ホスト物質の一部を、回転子の第２の末端とハウジングとの間で渦流する渦電流に捕捉することは可能である。また、デバイス１０において、出口混合物質の実質的な一部は、管状チャネル３２の管状出口から出口ポート４０に流出するように、少なくとも２つの直角を通り抜けなければならない。
当業者には明らかであるように、入口ポート３７は、ホスト物質に軸流のみを与える。回転子２１のみが、ホスト物質に環状流を与える。更に、出口ポート４０は、出口物質に軸流のみを与える、または提供する。また、環状流速ベクトルは、管状チャネル３２の管状入口３７に流入した後のみ、物質に与えられ、次いで、該環状流ベクトルは、物質が出口ポート４０に流入する場合、低下される、または除去されなければならない。したがって、チャネル３２を通って軸方向に通過する場合、チャネル３２からの物質の出口において、物質の進行性の環状加速および環状減速を必要とする。物質が、入口ポート３７から出口ポート４０に搬送する蛇行経路と組み合わせて、これらの態様は、入口ポート３７と出口ポート４０との間の実質的な圧力差（６０ガロン／分の流速で、２６ｐｓｉ）を伴う経路上で実質的な摩擦および流れ抵抗を作成し、これらの要因は、とりわけ、システムの全効率を軽減するように混合される。
界面動電的に酸素富化された水性流体および溶液
図２は、混合デバイス１００の構成要素の幾つかおよびデバイスへの、デバイス内で、およびデバイスから外への物質の流れを示すブロック図を提供する。混合デバイス１００は、２つ以上の入力物質を混合して、出力物質１０２を形成し、出力物質１０２は、そこから保管容器１０４へと受容され得る。混合デバイス１００は、新規の方法で、２つ以上の物質を撹拌して、新しい特徴を有する出力物質１０２を産生する。出力物質１０２は、他の入力物質（例えば、エマルジョン）のうちの少なくとも１つにおいて、入力物質のうちの少なくとも１つの懸濁液だけでなく、入力物質の新規の組み合わせ（例えば、静電気的組み合わせ）、入力物質間の化学反応から生じる化合物、新しい静電気的組み合わせを有する組み合わせ、およびこれらの組み合わせを含み得る。
入力物質は、第１の物質の源１１２により提供される第１の物質１１０、第２の物質の源１２２により提供される第２の物質１２０、および第３の物質の源１３２により提供される第３の物質１３０を含み得る。第１の物質１１０は、水、食塩溶液、化学懸濁液、極性液体、非極性液体、コロイド懸濁液、細胞増殖培地等の液体を含み得る。幾つかの実施形態では、第１の物質１１０は、混合デバイス１００に戻る出力物質１０２を含み得る。第２の物質１２０は、酸素、窒素、二酸化炭素、一酸化炭素、オゾン、硫黄ガス、亜酸化窒素、一酸化窒素、アルゴン、ヘリウム、臭素、およびこれらの組み合わせ等のガスからなる、または含み得る。好ましい実施形態では、ガスは、酸素である、または酸素を含む。任意の第３の物質１３０は、液体あるいは気体のいずれかを含み得る。幾つかの実施形態では、第３の物質１３０は、混合デバイス１００に（例えば、ポンプ２１０、２２０もしくは２３０、ならびに／またはチャンバ３１０、および／もしくは３３０のうちの１つ以上に）戻る出力物質１０２であり得る、またはそれを含み得る。
任意に、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意の第３の物質１３０は、それぞれ、外部ポンプ２１０、外部ポンプ２２０、および外部ポンプ２３０により混合デバイス１００に送出し得る。代替として、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意の第３の物質１３０のうちの１つ以上は、それぞれ、源１１２、源１２２、および源１３２において、圧力下で保管され得、圧力により混合デバイス１００に送出し得る。本発明は、それぞれ、源１１２、源１２２、および源１３２から混合デバイス１００に、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に、第３の物質１３０を移行させるために使用される方法により限定されない。
混合デバイス１００は、混合チャンバ３３０の側面に位置する第１のチャンバ３１０および第２のチャンバ３２０を含む。３つのチャンバ３１０、３２０、および３３０は相互に連結され、連続容量を形成する。
第１の物質１１０は、第１のチャンバ３１０に移行させられ、そこから混合チャンバ３３０に流れる。第１のチャンバ３１０中の第１の物質１１０は、内部ポンプ４１０により第１のチャンバ３１０に送出され得る。第２の物質１２０は、混合チャンバ３３０に移行させられる。任意に、第３の物質１３０は、混合チャンバ３３０に移行させられ得る。混合チャンバ３３０中の物質は、その中で混合され、出力物質１０２を形成する。その後、出力物質１０２は、出力物質１０２が混合デバイス１００に存在する第２のチャンバ３２０に流れる。混合チャンバ３３０中の出力物質１０２は、内部ポンプ４２０により第２のチャンバ３２０に送出し得る。任意に、第２のチャンバ３２０中の出力物質１０２は、そこから外部ポンプ４３０（例えば、単独で、または内部ポンプ４１０および／または４２０と組み合わせて）により保管容器１０４に送出し得る。
特定の態様では、汎用駆動シャフト５００は、内部ポンプ４１０および内部ポンプ４２０の双方の動力を供給する。駆動シャフト５００は、混合チャンバ３３０を通過し、その中に第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に、第３の物質１３０を一緒に混合するために使用される、回転力を提供する。駆動シャフト５００は、そこに連結されるモータ５１０により動力を供給される。
図３は、混合デバイス１００に第１の物質１１０を供給し、混合デバイス１００から出力物質１０２を除去するためのシステム５１２を提供する。システム５１２において、出力物質１０２の保管容器１０４および第１の物質１１０の源１１２を組み合わせる。外部ポンプ２１０は、ホース、管等の流体管５１４により、一体化した保管容器１０４および源１１２に連結される。外部ポンプ２１０は、流体管５１４を通って、および混合デバイス１００に外部ポンプ２１０を接続する流体管５１６に、一体化した保管容器１０４および源１１２からの一体化した第１の物質１１０および出力物質１０２を送出する。出力物質１０２は、流体管５１８を通って混合デバイス１００に流出する。流体管５１８は、一体化した保管容器１０４および源１１２に連結され、一体化した保管容器１０４および源１１２に、混合デバイス１００を流出する出力物質１０２を輸送する。流体管５１８は、混合デバイス１００内で作動圧力または背圧を確立する弁５１９を含む。
図２、４〜９、および１１を参照すると、混合デバイス１００の一実施形態の様々な構成要素の更なる詳細な説明が、提供される。混合デバイス１００は、サイズ変更可能である。したがって、様々な構成要素について提供される寸法は、デバイスの一実施形態を構成するために使用され得る、または選択された大きさの混合デバイスを構成するためにサイズ変更され得る。
図４を参照すると、混合デバイス１００は、第１のチャンバ３１０、混合チャンバ３３０、および第２のチャンバ３２０のそれぞれを格納するハウジング５２０を含む。上記のように、混合デバイス１００は、駆動シャフト５００を含み、これは、デバイスの操作中、回転する。したがって、混合デバイス１００は、振動する、またはそうでなければ移動し得る。任意に、混合デバイス１００は、底部１０６に連結され得、これは、実質的に定位置において、混合デバイス１００を維持するように床等の表面に取り付けられ得る。
ハウジング５２０は、２つ以上のハウジング部分から組み立てられ得る。例として、ハウジング５２０は、第１の機械的密閉ハウジング５２４および第２の機械的密閉ハウジング５２６により側面に配置される中央部分５２２を含み得る。ベアリングハウジング５３０は、中央部分５２２の反対側の第１の機械的密閉ハウジング５２４に連結され得る。ベアリングハウジング５３２は、中央部分５２２の反対側の第２の機械的密閉ハウジング５２６に連結され得る。任意に、ハウジング部分５５０は、ベアリングハウジング５３０に連結され得る。
ベアリングハウジング５３０および５３２のそれぞれは、ベアリングアセンブリ５４０を格納し得る（図５および６を参照のこと）。ベアリングアセンブリ５４０は、ｗｗｗ．ｓｋｆ．ｃｏｍで、ウェブサイトを運営するＫｕｌｐｓｖｉｌｌｅ，ＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａのＳＫＦ ＵＳＡ Ｉｎｃにより製造されるモデル番号「２０２ＳＺＺＳＴ」を含む、当該技術分野において既知の任意の好適なベアリングアセンブリを含み得る。
密閉は、隣接したハウジング部分間で提供され得る。例えば、ｏリング５６０（図５を参照のこと）は、ハウジング部分５５０とベアリングハウジング５３０との間に配設され得、ｏリング５６２（図５を参照のこと）は、第１の機械的密閉ハウジング５２４と中央部分５２２との間に配設され得、ｏリング５６４（図６を参照のこと）は、第２の機械的密閉ハウジング５２６と中央部分５２２との間に配設され得る。
混合チャンバ３３０
ここで、図７を参照すると、混合チャンバ３３０は、第１の機械的密閉ハウジング５２４と第２の機械的密閉ハウジング５２６との間のハウジング５２０の中央部分５２２の内部に配設される。混合チャンバ３３０は、混合デバイス１００の２つの構成要素である回転子６００と固定子７００との間に形成される。回転子６００は、通常、中空の内部６１０を画定する内表面６０５および外表面６０６を有する側壁６０４を有し得る。側壁６０４は、厚さ約０．２０インチ〜約０．７５インチであり得る。幾つかの実施形態では、側壁６０４は、厚さ約０．２５インチであり得る。しかしながら、混合デバイス１００は、特定の用途に適合するようにサイズ変更され得るため、本教示の範囲内で、値よりも薄いまたは厚い側壁６０４を有するデバイスの実施形態を提供する。側壁６０４は、第１の末端部６１２および第２の末端部６１４、ならびに第１の末端部６１２と第２の末端部６１４との間に形成される複数のスルーホール６０８を含む。任意に、側壁６０４の外表面６０６は、アパーチャ、突起、テクスチャ等の他の特性を含み得る。第１の末端部６１２は、カラー６１８を受容するように設定される解放部６１６を有し、第２の末端部６１４は、カラー６２２を受容するように構成される解放部６２０を有する。
回転子６００は、固定子７００の内部に配設される。固定子７００は、回転子６００が配設される、一般に中空の内部７１０を画定する内部７０５を有する側壁７０４を有する。側壁７０４は、厚さ約０．１インチ〜約０．３インチであり得る。幾つかの実施形態では、側壁６０４は、厚さ約１．５インチである。固定子７００は、実質的に不動位置において、ハウジング５２０に非回転自在に連結され得る。代替として、固定子７００は、ハウジング５２０と一体化して形成され得る。側壁７０４は、第１の末端部７１２および第２の末端部７１４を有する。任意に、複数のアパーチャ７０８は、第１の末端部７１２と第２の末端部７１４との間の固定子７００の側壁７０４に形成される。任意に、側壁７０４の内表面７０５は、スルーホール、突起、テクスチャ等の他の特性を含み得る。
回転子６００は、図９において、矢印「Ｃ３」に示される方向に回転軸「α」周辺に不動固定子７００に対して回転する。回転子６００および固定子７００のそれぞれは、概して、円筒状で、縦方向軸を有し得る。回転子６００は、外径「Ｄ１」を有し、固定子７００は、内径「Ｄ２」を有し得る。直径「Ｄ１」は、例えば、約０．５インチ〜約２４インチの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、直径「Ｄ１」は、約３．０４インチである。幾つかの実施形態では、直径「Ｄ１」は、約１．７インチである。直径「Ｄ１」よりも大きい、直径「Ｄ２」は、約０．５６インチ〜約２４．２５インチの範囲であり得る。幾つかの実施形態では、直径「Ｄ２」は、約４インチである。したがって、混合チャンバ３３０は、厚さ約０．０２インチ〜約０．１２５インチ（即ち、直径「Ｄ２」と直径「Ｄ１」の差）のリング状の断面形状を有し得る。特定の実施形態では、混合チャンバ３３０は、厚さ約０．０２５インチである。先行技術のデバイス１０の回転子１２と固定子３４との間のチャネル３２（図１を参照のこと）は、厚さ約０．０９インチのリング状の断面形状を有する。したがって、特定の実施形態では、混合チャンバ３３０の厚さは、先行技術のデバイス１０のチャネル３２の約１／３未満である。
回転子６００の縦方向軸は、その回転軸「α」と整合し得る。回転子６００の縦方向軸は、固定子７００の縦方向軸と整合し得る。回転子６００は、回転軸「α」に沿って長さ約３インチ〜約６インチを有し得る。幾つかの実施形態では、回転子６００は、回転軸「α」に沿って長さ約５インチを有し得る。固定子７００は、回転軸「α」に沿って長さ約３インチ〜約６インチを有し得る。幾つかの実施形態では、固定子７００は、回転軸「α」に沿って長さ約５インチを有し得る。
回転子６００および固定子７００は、概して、円筒形状を有するように示されているが、当業者は、代替的な形状が使用され得ることを理解されよう。例えば、回転子６００および固定子７００は、円錐形、球状、任意形状等であり得る。更に、回転子６００および固定子７００は、同一の形状である必要はない。例えば、回転子６００は、円筒形状であり、固定子７００が、長方形状である、またはその逆であってもよい。
図４〜７に示される、固定子７００およびスルーホール６０８のアパーチャ７０８は、概して、円筒形状である。スルーホール６０８の直径は、約０．１インチ〜約０．６２５インチの範囲であり得る。アパーチャ７０８の直径は、約０．１インチ〜約０．６２５インチの範囲であり得る。固定子７００の１つ以上のアパーチャ７０８は、他のアパーチャ７０８の直径とは異なる直径を有し得る。例えば、アパーチャ７０８は、固定子７００の第１の末端部７１２から固定子７００の第２の末端部７１４の直径を増加し得る、あるいはアパーチャ７０８は、固定子７００の第１の末端部７１２から固定子７００の第２の末端部７１４の直径を減少し得る、またはアパーチャ７０８の直径は、固定子７００に沿って別の方法において異なり得る。回転子６００の１つ以上のスルーホール６０８は、他のスルーホール６０８の直径とは異なる直径を有し得る。例えば、スルーホール６０８は、回転子６００の第１の末端部６１２から回転子６００の第２の末端部６１４の直径を増加し得る、あるいは、スルーホール６０８は、回転子６００の第１の末端部６１２から回転子６００の第２の末端部６１４の直径を減少し得る、またはスルーホール６０８の直径は、回転子６００に沿って別の様式で異なり得る。
代替的実施形態を参照して以下に記述されるように、アパーチャ７０８およびスルーホール６０８は、概して、円筒形状以外の形状を有し得、このような実施形態は、本発明の範囲内である。例えば、スルーホール６０８は、狭小部、弓形部、先細部等を含み得る。図７を参照すると、スルーホール６０８は、外部６０８Ａ、狭小部６０８Ｂ、および外部６０８Ａと狭小部６０８Ｂとの間の遷移を提供する先細部６０８Ｃを含む。同様に、アパーチャ７０８は、狭小部、弓形部、狭小部等を含み得る。
図８は、固定子７００のアパーチャ７０８および回転子６００のスルーホール６０８の好適な配置の限定されない例を提供する。固定子７００のアパーチャ７０８は、回転軸「α」に実質的に直交する、実質的に平行な横方向列「ＳＬＡＴ−１」から「ＳＬＡＴ−６」に配置され得る。固定子７００のアパーチャ７０８はまた、回転軸「α」に実質的に平行である、実質的に平行な縦方向列「ＳＬＯＮＧ−１」から「ＳＬＯＮＧ−７」に配置され得る。言い換えれば、固定子７００のアパーチャ７０８は、回転軸「α」に実質的に平行である、縦方向列「ＳＬＯＮＧ−１」から「ＳＬＯＮＧ−７」を有する、格子様パターンの直交列（即ち、横方向列は、縦方向列に直行する）に配置され得る。
固定子７００のアパーチャ７０８と同様に、回転子６００のスルーホール６０８は、回転軸「α」に実質的に直交する、実質的に平行な横方向列「ＲＬＡＴ−１」から「ＲＬＡＴ−６」に配置され得る。しかしながら、格子様パターンの直交列に配置される代わりに、回転子６００のスルーホール６０８はまた、らせん状経路に沿って縦方向に延在する、実質的に平行な列「ＲＬＯＮＧ−１」から「ＲＬＯＮＧ−７」に配置され得る。代替として、回転子６００のスルーホール６０８はまた、回転軸「α」と平行以外の角度で縦方向に延在する、実質的に平行な列「ＲＬＯＮＧ−１」から「ＲＬＯＮＧ−７」に配置され得る。
固定子７００のアパーチャ７０８および回転子６００のスルーホール６０８は、回転子６００が、固定子７００内部に配設される場合、横方向列「ＳＬＡＴ−１」から「ＳＬＡＴ−６」が、それぞれ、横方向列「ＲＬＡＴ−１」から「ＲＬＡＴ−６」と少なくとも部分的に整合するように構成され得る。このように、回転子６００が、固定子７００内部で回転する際、スルーホール６０８は、アパーチャ７０８を通過する。
横方向列「ＲＬＡＴ−１」から「ＲＬＡＴ−６」のそれぞれにおいて、スルーホール６０８は、横方向列のスルーホール６０８の全てが、同時に、固定子７００の横方向列「ＳＬＡＴ−１」から「ＳＬＡＴ−６」のうちの対応する１つにおいて、アパーチャ７０８と少なくとも部分的に整合するように、横方向に離間され得る。縦方向に延在する列「ＲＬＯＮＧ−１」から「ＲＬＯＮＧ−６」は、最後の横方向列「ＲＬＡＴ−６」のスルーホール６０８が、固定子７００の対応する最後の横方向列「ＳＬＡＴ−６」のアパーチャ７０８と少なくとも部分的に整合し始める前に、縦方向に延在する列のそれぞれにおいて、第１の横方向列「ＲＬＡＴ−１」のスルーホール６０８が、対応する横方向列「ＳＬＡＴ−１」のアパーチャ７０８を完全に通過するように構成され得る。
図８において、６つの横方向列および６つの縦方向に延在する列は、回転子６００に対して示され、６つの横方向列および７つの縦方向に延在する列は、固定子７００に対して示されるが、代替数の横方向列および／または縦方向列は、本教示から逸脱することなく、回転子６００および／または固定子７００に対して使用され得ることは、当業者には明らかである。
対応する横方向列間の一対の開口のみが、いかなる一時点おいても一致することを確実にするために、固定子７００上の横方向列「ＳＬＡＴ−１」から「ＳＬＡＴ−６」のそれぞれにおけるアパーチャ７０８の数は、回転子６００上の対応する横方向列「ＲＬＡＴ−１」から「ＲＬＡＴ−６」のそれぞれにおけるスルーホール６０８と、既定の数（例えば、１つ、２つ等）だけ異なり得る。したがって、例えば、横方向列「ＲＬＡＴ−１」が、回転子６００の外周辺に均一に離間した２０のスルーホール６０８を有する場合、横方向列「ＳＬＡＴ−１」は、固定子７００の外周辺に均一に離間した２０のアパーチャ７０８を有し得る。
再び図７を参照すると、混合チャンバ３３０は、第１の開放末端部３３２および第２の開放末端部３３４を有する。回転子６００の側壁６０４に形成されたスルーホール６０８は、回転子６００の内部６１０を混合チャンバ３３０と接続する。
回転子６００は、回転子６００の回転軸「α」と整合した駆動シャフト５００により固定子７００内部で回転する。駆動シャフト５００は、回転子６００の第１の末端部６１２および第２の末端部６１４に連結され、その中空の内部６１０を通って延在し得る。言い換えれば、駆動シャフト５００の部分７２０は、回転子６００の中空の内部６１０に配設される。
カラー６１８は、中空の内部６１０に配設される駆動シャフト５００の部分７２１を受容するように構成され、カラー６２２は、中空の内部６１０に配設される駆動シャフト５００の部分７２２を受容するように構成される。
部分７２１は、約０．５インチ〜約２．５インチの範囲であり得る外径「Ｄ３」を有する。幾つかの実施形態では、直径「Ｄ３」は、約０．６２５インチである。部分７２２は、直径「Ｄ３」と実質的に類似し得る外径「Ｄ４」を有するが、これは必須ではない。直径「Ｄ４」は、約０．３７５インチ〜約２．５インチの範囲であり得る。
回転子６００は、カラー６１８およびカラー６２２のそれぞれにより、駆動シャフト５００の部分７２１および部分７２２に、非回転で取り付けられ得る。例として、カラー６１８および６２２のそれぞれは、それぞれ、解放部６１６および６２０内部に設置され得る。次いで、一体化した回転子６００ならびにカラー６１８および６２２を加熱して、それらを拡張し得る。次に、駆動シャフト５００をカラー６１８および６２２を通して挿入し、アセンブリを冷却させる。冷却時、カラー６１８および６２２が収縮するにつれて、それらは、それぞれ、駆動シャフト５００の部分７２２Ａおよび７２２Ｂの周辺で堅締し、駆動シャフト５００が回転子６００に対して回転するのを妨害するように十分に堅く把持する。カラー６１８は、部分７２１あるいは、解放部６１６のいずれに対しても回転せず回転子６００の第１の末端部６１２に、駆動シャフト５００の回転を伝達する。部分７２２あるいは、解放部６２０のいずれかに対して回転しない、カラー６２２は、回転子６００の第２の末端部６１４に、駆動シャフト５００の回転を平行移動する。駆動シャフト５００および回転子６００は、単一単位として一緒に回転する。
駆動シャフト５００は、第１の末端部７２４（図５を参照のこと）および第２の末端部７２６（図６を参照のこと）を有し得る。第１の末端部７２４は、約０．５インチ〜約１．７５インチの直径「Ｄ５」を有し得る。特定の実施形態では、直径「Ｄ５」は、約１．２５インチであり得る。第２の末端部７２６は、直径「Ｄ５」と実質的に同様であり得る直径「Ｄ６」を有し得る。
第２の物質１２０は、回転駆動シャフト５００の第１の末端部７２４および第２の末端部７２６のうちの一方を通って混合チャンバ３３０に輸送され得る。駆動シャフト５００の第１の末端部７２４および第２の末端部７２６の他方は、モータ５１０に連結され得る。図５および６に示される実施形態では、第２の物質１２０は、第１の末端部７２４を通って混合チャンバ３３０に輸送され、駆動シャフト５００の第２の末端部７２６は、モータ５１０に連結される。
図５を参照すると、駆動シャフト５００は、第１の末端部７２４から、回転子６００の内部６１０に配設される部分７２０へと延在する、その中に形成されるチャネル７２８を有し得る。チャネル７２８は、第１の末端部７２４中に形成された開口７３０を有する。混合デバイス１００が動作する場合、第２の物質１２０は、開口７３０を通ってチャネル７２８に導入される。
弁７３２は、駆動シャフト５００の第１の末端部７２４に配置されたチャネル７２８の一部の内部に配設され得る。弁７３２は、中空の内部６１０の内部からチャネル７２８を通る第２の物質１２０の逆流、および／またはチャネル７２８への第２の物質１２０の前方流を制限する、または制御し得る。弁７３２は、逆止弁を含む、当該技術分野において既知の任意の弁を含み得る。好適な逆止弁としては、Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡに事務所を有し、ｗｗｗ．ｔｈｅｌｅｅｃｏ．ｃｏｍでウェブサイトを運営する、Ｔｈｅ Ｌｅｅ Ｃｏｍｐａｎｙ ＵＳＡにより製造される、部品番号「ＣＫＦＡ１８７６２０５Ａ」、自由流の順方向への逆止弁（ｆｒｅｅ ｆｌｏｗ ｆｏｒｗａｒｄ ｃｈｅｃｋ ｖａｌｖｅ）が挙げられる。
駆動シャフト５００は、チャネル７２８と回転子６００の内部６１０を接続する回転子６００の内部６１０に配置されるアパーチャ７４０を含み得る。単一アパーチャ７４０のみが、図５に示されるが、複数の開口が、チャネル７２８と回転子６００の内部６１０を接続するために使用され得ることは、当業者には明らかである。
図２を参照すると、任意に、外部ポンプ２２０は、第２の物質１２０を混合デバイス１００に送出し得る。限定されない例として、ポンプ２２０には、ダイヤフラムポンプ、ケミカルポンプ、蠕動ポンプ、重力送りポンプ、ピストンポンプ、ギアポンプ、前述のポンプの任意の組み合わせ等が挙げられ得る。第２の物質１２０がガスである場合、ガスは、源１２２からのガスを放出することにより、駆動シャフト５００の第１の末端部７２４に形成された開口部７３０に加圧され、送り込まれ得る。
ポンプ２２０または源１２２は、弁７３２によりチャネル７２８に連結される。チャネル７２８内部に輸送された第２の物質１２０は、アパーチャ７４０を通って、回転子６００の内部６１０へのチャネル７２８に流出する。次いで、第２の物質１２０は、回転子６００の側壁６０８に形成されたスルーホール６０８を通って回転子６００の内部６１０に流出する。
図５を参照すると、混合デバイス１００は、駆動シャフト５００の第１の末端部７２４に連結された密閉アセンブリ７５０を含み得る。密閉アセンブリ７５０は、ハウジング５２０に画定されたチャンバ７５２内に維持される。チャンバ７５２は、第２の末端部７５６からチャンバを横断して離間した第１の末端部７５４を有する。チャンバ７５２はまた、チャンバ７５２へのアクセスを提供する入力ポート７５８および出力ポート７５９も含む。チャンバ７５２は、ハウジング部分５５０およびベアリングハウジング５３０により画定され得る。第１の末端部７５４は、ハウジング部分５５０に形成され得、第２の末端部７５６は、ベアリングハウジング５３０に隣接され得る。入力ポート７５８は、ベアリングハウジング５３０に形成され得、出力ポート７５９は、ハウジング部分５５０に形成され得る。
密閉アセンブリ７５０は、ハウジング部分５５０およびベアリングハウジング５３０において、チャンバ７５２の第１の末端部７５４に設置された第１の不動密閉部７６０を含む。第１の不動密閉部７６０は、駆動シャフト５００の第１の末端部７２４の部分７６２周辺に延在する。密閉アセンブリ７５０はまた、ベアリングハウジング５３０において、チャンバ７５２の第２の末端部７５６に設置された第２の不動密閉部７６６も含む。第２の不動密閉部７６６は、駆動シャフト５００の第１の末端部７２４の部分７６８周辺に延在する。
密閉アセンブリ７５０は、部分７６２と部分７６８の間で駆動シャフト５００の第１の末端部７２４に非回転自在に連結された回転アセンブリ７７０を含む。回転アセンブリ７７０は、ユニットとしてそれと共に回転する。回転アセンブリ７７０は、第２の密閉部７７４の反対側に第１の密閉部７７２を含む。バイアス部材７７６（例えば、バネ）は、第１の密閉部７７２と第２の密閉部７７４との間に配置される。バイアス部材７７６は、第１の密閉部７７２を、第１の不動密閉部７６０に対してバイアスをかけ、第２の密閉部７７４を、第２の不動密閉部７６６に対してバイアスをかける。
冷却潤滑剤は、チャンバ７５２に、および回転アセンブリ７７０周辺に供給される。潤滑剤は、入力ポート７５８を通ってチャンバ７５２に流入し、出力ポート７５９を通ってチャンバ７５２に流出する。潤滑剤は、ベアリングハウジング５３０により格納されたベアリングアセンブリ５４０を潤滑化し得る。チャンバ５７０は、ベアリングハウジング５３０と機械的密閉ハウジング５２４との間で配設され得る。ベアリングハウジング５３０はまた、潤滑剤を送出し得るチャンバ５７０に接続された第２の入力ポート７５９も含み得る。チャンバ５７０に送出された潤滑剤は、ベアリングアセンブリ５４０を潤滑化し得る。密閉アセンブリ７５０は、大幅にとはいかないまでも、回転子６００の回転により生じるデバイスのこの部分内で摩擦力を有意に軽減し得、密閉部７７０の活性寿命を増加し得る。密閉部は、炭化ケイ素を用いて構築された表面を含み得る。
図９を参照すると、回転子６００が、矢印「Ｃ１」により示された方向に、回転軸「α」周辺を回転すると、回転子は、混合チャンバ３３０に第２の物質１２０を排出する。第２の物質１２０の排出された気泡、溶滴、粒子等は、回転子６００から流出し、回転子６００により（矢印「Ｃ３」により示された方向に）周速度が与えられる。第２の物質１２０は、ポンプ２２０（図２を参照のこと）、回転する回転子６００の遠心力、第１の物質１１０に対する第２の物質１２０の浮力、およびこれらの組み合わせにより混合チャンバ３３０から押し込まれ得る。
モータ５１０
図６を参照すると、駆動シャフト５００の第２の末端部７２６は、連結器９００によりモータ５１０の回転支軸７８０に連結され得る。支軸７８０は、概して、約０．２５インチ〜約２．５インチの直径「Ｄ７」を有する、環状断面形状を有し得る。特定の実施形態では、直径「Ｄ７」は、約０．２５インチ〜約１．５インチであり得る。図６に示される実施形態では、駆動シャフト５００の第１の末端部７２４の直径「Ｄ５」は、実質的に、直径「Ｄ７」および支軸７８０に相当するが、直径「Ｄ５」および直径「Ｄ７」のうちの１つがもう一方よりも大きい実施形態は、本発明の範囲内である。
図４も参照すると、連結器９００を被覆する、または遮蔽することが望ましい場合がある。図４および６に示される実施形態では、ドライブガード９１０は、連結器９００を被覆する。ドライブガード９１０一対の実質的に直線部分９１５および９１６により側面に配置された湾曲部分９１４を有するＵ字形であり得る。ドライブガード９１０の実質的に直線部分９１５および９１６のそれぞれの遠位末端は、それぞれ、フランジ９１８および９１９を有し得る。ドライブガード９１０は、そのフランジ９１８および９１９のそれぞれにより、底部１０６に締結され得る。
モータ５１０は、支持部材９２０により、底部１０６に支持され得る。支持部材９２０は、支軸７８０付近のモータ５１０に連結され得る。示された実施形態では、支持部材９２０は、支軸７８０を通過するスルーホールを含む。支持部材９２０は、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて、モータ５１０に連結され得、これは、１つ以上のボルト９４０を用いてモータ５１０に支持部材９２０をボルトで固定することを含む。
連結器９００は、固定子７００内部で回転子６００を回転させるために、支軸７８０から駆動シャフト５００への十分なトルク量を伝達するのに適している任意の連結器を含み得る。図４および６に示される実施形態では、連結器９００は、ベローズ連結器である。ベローズ連結器は、支軸７８０と駆動シャフト５００が正しく整合されていない場合、有用であり得る。更に、ベローズ連結器は、本来ならば支軸７８０に伝達される、駆動シャフト５００上に加えられた軸力の吸収を助長し得る。好適なベローズ連結器としては、ｗｗｗ．ｒｕｌａｎｄ．ｃｏｍでウェブサイトを運営する、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡのＲｕｌａｎｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．により製造されたモデル「ＢＣ３２−８−８−Ａ」が挙げられる。
モータ５１０は、約０．１毎分回転数（「ｒｐｍ」）〜約７２００ｒｐｍで、回転子６００を回転し得る。モータ５１０は、本教示に従って、固定子７００内部で回転子６００を回転するのに適しているいずれのモータを含み得る。限定されない例として、好適なモータは、２３０／４６０ボルトで、３４５０ｒｐｍで動作する、１／２馬力の電気モータを含み得る。好適なモータとしては、ｗｗｗ．ｌｅｅｓｏｎ．ｃｏｍでウェブサイトを運営する、Ｇｒａｆｔｏｎ，ＷＩのＬＥＥＳＯＮ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎにより製造されたモデル「Ｃ４Ｔ３４ＮＣ４Ｃ」が挙げられる。
第１のチャンバ３１０
図４および７を参照すると、第１のチャンバ３２０は、第１の機械的密閉ハウジング５２４と、回転子６００および固定子７００のそれぞれの第１の末端部６１２および７１２との間のハウジング５２０の中央部分５２２内部に配設される。第１のチャンバ３１０は、環状であり、実質的に円形の断面形状を有し得る。第１のチャンバ３１０および混合チャンバ３３０は、連続容量を形成する。駆動シャフト５００の部分１０２０は、第１のチャンバ３１０を通って延在する。
図４から最も分かるように、第１のチャンバ３１０は、第１の物質１１０が混合デバイス１００に流入する入力ポート１０１０を有する。第１の物質１１０は、外部ポンプ２１０により第１のチャンバ３１０内部に送出し得る（図２を参照のこと）。外部ポンプ２１０は、第１のチャンバ３１０を供給するのに十分な速度で、第１の物質１１０を送出すために、当該技術分野において既知の任意のポンプを含み得る。
入力ポート１０１０は、回転軸「α」に対して実質的に直交するように配向される。したがって、第１の物質１１０は、第１のチャンバ３１０を通って延在する駆動シャフト５００の部分１０２０に接線する速度で第１のチャンバ３１０に流入する。第１のチャンバ３１０に流入する第１の物質１１０の接線方向は、矢印「Ｔ１」により識別される。図４および７に示される実施形態では、入力ポート１０１０は、回転軸「α」からのオフセットであり得る。当業者には明らかであるように、駆動シャフト５００の回転方向（図９中の矢印「Ｃ１」により識別される）は、接線の構成要素を有する。入力ポート１０１０は、第１の物質１１０が、第１のチャンバ３１０に流入するように配置され、駆動シャフト５００の回転方向の接線の構成要素と実質的に同一の方向に移動する。
第１の物質１１０は、第１のチャンバ３１０に流入し、駆動シャフト５００の部分１０２０周辺に第１のチャンバ３１０内部により偏向される。第１のチャンバ３１０が実質的に円形断面形状を有する実施形態では、第１のチャンバ３１０内部は、駆動シャフト５００の部分１０２０周辺に実質的に円形路（図９中の矢印「Ｃ２」により識別される）で、第１の物質１１０を偏向し得る。このような実施形態では、第１の物質１１０の接線速度は、接線速度により少なくともある程度決定される周速度で、回転軸「α」周辺にそれを移動させ得る。
第１のチャンバ３１０内部に流入すると、第１の物質１１０は、第１のチャンバ３１０内部に存在するポンプ４１０により、第１のチャンバ３１０から混合チャンバ３３０に送出し得る。外部ポンプ２１０（図２を参照のこと）を含む実施形態では、外部ポンプ２１０は、ポンプ４１０が第１のチャンバ３１０から第１の物質１１０を送出する速度と少なくとも同一の高速度で、第１のチャンバ３１０に第１の物質１１０を送出するように構成され得る。
第１のチャンバ３１０は、混合チャンバ３３０の第１の開放末端部３３２と連通し、第１のチャンバ３１０内部の第１の物質１１０は、混合チャンバ３３０の第１の開放末端部３３２に自由に流れ得る。このように、第１の物質１１０は、いかなる隅部を通り抜けない、または混合チャンバ３３０と第１のチャンバ３１０との間を屈曲する。示される実施形態では、第１のチャンバ３１０は、混合チャンバ３３０の全第１の開放末端部３３２と連通する。第１のチャンバ３１０は、第１の物質１１０で完全に充填され得る。
ポンプ４１０は、第１のチャンバ３１０を通って延在する駆動シャフト５００の部分１０２０により動力を供給される。ポンプ４１０は、不動ハウジング（即ち、ハウジング５２０）により画定されるチャンバ（即ち、第１のチャンバ３１０）内部に格納された回転ポンプ部材２０２２を有する当該技術分野に既知の任意のポンプを含み得る。好適なポンプの限定されない例は、前進空洞ポンプ、単一ねじポンプ（例えば、アルキメデスねじポンプ）等の回転式容積式ポンプを含む。
図７および９に示されるポンプ４１０は、概して、単一ねじポンプと称される。本実施形態では、ポンプ部材２０２２は、駆動シャフト５００の部分１０２０周辺に配設されるカラー部２０３０を含む。カラー部２０３０は、単位として、駆動シャフト５００の部分１０２０と共に回転する。カラー部２０３０は、１つ以上の流体置換部材２０４０を含む。図７および９に示される実施形態では、カラー部２０３０は、らせん状経路に沿ってカラー部２０３０に外接するらせん形状を有する単一流体置換部材２０４０を含む。
図９を参照すると、第１のチャンバ３１０の内部を示す。ポンプ４１０は、混合チャンバ３３０の第１の開放末端部３３２に向かって、第１のチャンバ３１０内部の第１の物質１１０において、軸流（矢印「Ａ１」および矢印「Ａ２」により識別される）を与える。ポンプ４１０により与えられる第１の物質１１０の軸流は、先行技術のデバイス１０（図１を参照のこと）の外部ポンプにより得られる圧力を超え得る圧力を有する。
ポンプ４１０はまた、混合チャンバ３３０の第１の開放末端部３３２に向かって、移動する際、第１の物質１１０において、環状流（矢印「Ｃ２」により識別される）を与えるようにも構成され得る。第１の物質１１０において与えられる環状流は、それが混合チャンバ３３０に流入する前に、初期周速度で所望の方向に既に移動している第１の物質１１０を混合チャンバ３３０に流入させる。図１に示される先行技術のデバイス１０において、第１の物質１１０は、周速度なしで、先行技術のデバイス１０のチャネル３２に流入した。したがって、先行技術のデバイス１０の回転子１２は、単独で、第１の物質１１０への環状流を与えなければならなかった。第１の物質１１０が軸方向に移動するため、先行技術のデバイス１０において、第１の物質１１０よりも低周速度で、回転子１２と固定子３０との間に形成されたチャネル３２の少なくとも一部を横断した第１の物質１１０は、混合デバイス１００の混合チャンバ３３０を横断する。言い換えれば、第１の物質１１０の軸流速度が、先行技術のデバイス１０および混合デバイス１００の双方において同一である場合、第１の物質１１０は、チャネル３２の軸長を横断する前に完了するよりも、混合チャンバ３３０の軸長を横断する前に回転軸「α」周辺で更に旋回を完了し得る。更なる旋回は、固定子７００の有効な内表面７０６（図７を参照のこと）の実質的に更に大きな部分に、第１の物質１１０（ならびに一体化した第１の物質１１０および第２の物質１２０）を暴露する。
外部ポンプ２１０（図２を参照のこと）を含む実施形態では、本教示に従って配向される入力ポート１０１０と組み合わせた、外部ポンプ２１０により与えられる周速度は、単独で、回転軸「α」周辺に第１の物質１１０（ならびに一体化した第１の物質１１０および第２の物質１２０）の旋回を十分に増加させ得る。更に、幾つかの実施形態では、ポンプ２１０により与えられる周速度およびポンプ４１０により与えられる周速度を組み合わせて、回転軸「α」周辺に第１の物質１１０（ならびに一体化した第１の物質１１０および第２の物質１２０）の十分な数の旋回を達成する。当業者により理解されるように、第１のチャンバ３１０の断面形状等の他の構造構成要素は、ポンプ２１０、ポンプ４１０、およびこれらの組み合わせにより与えられる周速度に寄与し得る。
図１０に示される代替的実施形態では、ポンプ４１０は、混合チャンバ３３０の第１の開放末端部３３２に向かって移動する際、第１の物質１１０において、環状流を与えるように構成される１つ以上の翼２０４２を含み得る。
第２のチャンバ３２０
ここで、図４および７を参照すると、第２のチャンバ３２０は、第２の機械的密閉ハウジング５２６と、回転子６００および固定子７００のそれぞれの第２の末端部６１４および７１４との間のハウジング５２０の中央部分５２２内部に配設される。第２のチャンバ３２０は、第１のチャンバ３１０と実質的に同様であり得る。しかしながら、入力ポート１０１０の代わりに、第２のチャンバ３２０は、出力ポート３０１０を含み得る。駆動シャフト５００の部分３０２０は、第２のチャンバ３２０を通って延在する。
第２のチャンバ３２０および混合チャンバ３３０は、連続容量を形成する。更に、第１のチャンバ３１０、混合チャンバ３３０、および第２のチャンバ３２０は、連続容量を形成する。第１の物質１１０は、第１のチャンバ３１０から混合チャンバ３３０まで、最終的に、第２のチャンバ３２０まで、混合デバイス１００を貫流する。混合チャンバ３３０において、第１の物質１１０を第２の物質１２０と混合し、出力物質１０２を形成する。出力物質１０２は、出力ポート３０１０を通って混合デバイス１００に流出する。任意に、出力物質１０２は、入力ポート１０１０に返流し、追加量の第２の物質１２０、第３の物質１３０、またはこれらの組み合わせと混合され得る。
出力ポート３０１０は、回転軸「α」に実質的に直交するように配向され、第１のチャンバ３１０に形成された入力ポート１０１０と反対側に配置され得る。出力物質１０２は、回転子６００によりそこに与えられる周速度を有する混合チャンバ３３０から第２のチャンバ３２０に（図９中の矢印「Ｃ３」により示される方向に）流入する。周速度は、第２のチャンバ３２０を通って延在する駆動シャフト５００の部分３０２０に対して接線方向に位置する。図４、６、および７に示される実施形態では、出力ポート３０１０は、回転軸「α」からのオフセットであり得る。駆動シャフト５００が回転する（矢印「Ｃ１」により図９に識別される）、実質的に同一方向に移動する第２のチャンバ３２０に流入する、出力物質１０２は、出力ポート３０１０に向かって移動するように、出力ポート３０１０は、配置される。
出力物質１０２は、第２のチャンバ３２０に流入し、駆動シャフト５００の部分３０２０周辺に第２のチャンバ３２０内部により偏向される。第２のチャンバ３２０が実質的に円形断面形状を有する実施形態では、第２のチャンバ３２０内部は、駆動シャフト５００の部分３０２０周辺に実質的に円形路において、出力物質１０２を偏向し得る。
図２を参照すると、任意に、出力物質１０２は、外部ポンプ４３０により第２のチャンバ３２０から送出し得る。外部ポンプ４３０は、混合デバイス１００の処理量を制限するのを避けるのに十分な速度で、出力物質１０２を送出するために、当該技術分野において既知の任意のポンプを含み得る。このような実施形態では、外部ポンプ４３０は、外部ポンプ４３０が、第２のチャンバ３２０から出力物質１０２を送出する際、出力物質１０２の少なくとも一部に、（図４および１１において矢印「Ｔ２」により示される方向に）接線速度を導入し得る。出力物質１０２の一部の接線速度は、接線速度によりある程度決定される周速度で、回転軸「α」周辺にそれを移動させ得る。
ポンプ４２０
図６および７を参照すると、第２のチャンバ３２０に存在するポンプ４２０は、出力ポート３０１０に第２のチャンバ３２０から、および／または第２のチャンバ３２０に混合チャンバ３３０から出力物質１０２を送出し得る。外部ポンプ４３０を含む実施形態では、外部ポンプ４３０は、ポンプ４２０が出力ポート３０１０に出力物質１０２を送出する速度と少なくとも同一の高速度で、第２のチャンバ３２０から出力物質１０２を送出するように構成され得る。
第２のチャンバ３２０は、混合チャンバ３３０の第２の開口末端部３３４と連通し、混合チャンバ３３０内部の出力物質１０２は、第２の開口末端部３３４から第２のチャンバ３２０に自由に流れ得る。このように、出力物質１０２は、いかなる隅部も通り抜けない、または混合チャンバ３３０と第２のチャンバ３２０との間を屈曲する。示される実施形態では、第２のチャンバ３２０は、混合チャンバ３３０の全第２の開口末端部３３４と連通する。第２のチャンバ３２０は、出力物質１０２で完全に充填され得る。
ポンプ４２０は、第２のチャンバ３２０を通って延在する駆動シャフト５００の部分３０２０により動力を供給される。ポンプ４２０は、ポンプ４１０と実質的に同一であり得る。ポンプ４１０として使用するのに好適であるとして上で説明したあらゆるポンプが、ポンプ４２０に対して使用され得る。ポンプ４１０が第１の物質１１０を混合チャンバ３３０に送出する一方、ポンプ４２０は、混合チャンバ３３０から出力物質１０２を送出する。したがって、ポンプ４１０およびポンプ４２０は共に、同一方向に送出するように配向され得る。
当業者に理解されるように、第１の物質１１０は、出力物質１０２とは異なり得る。例えば、第１の物質１１０および出力物質１０２のうちの１つは、もう一方よりも更に粘性であり得る。したがって、ポンプ４１０は、ポンプ４２０とは異なり得る。ポンプ４１０は、第１の物質１１０の特性に適合するように構成され得、ポンプ４２０は、出力物質１０２の特性に適合するように構成され得る。
図６および７に示されるポンプ４２０は、概して、単一ねじポンプと称される。本実施形態では、ポンプ部材４０２２は、駆動シャフト５００の部分３０２０周辺に配設されるカラー部４０３０を含む。カラー部４０３０は、単位として、駆動シャフト５００の部分３０２０と共に回転する。カラー部４０３０は、１つ以上の流体置換部材４０４０を含む。カラー部４０３０は、らせん状経路に沿ってカラー部４０３０に外接するらせん形状を有する単一流体置換部材４０４０を含む。
図１１を参照すると、第２のチャンバ３２０の内部を示す。ポンプ４２０は、混合チャンバ３３０の第２の開口末端部３３４から離れて第２のチャンバ３２０内部に出力物質１０２において、軸流（矢印「Ａ３」および矢印「Ａ４」により識別される）を与える。
ポンプ４２０は、混合チャンバ３３０の第２の開口末端部３３４から離れて移動する際、出力物質１０２において、環状流（矢印「Ｃ４」により識別される）を与えるように構成され得る。出力物質１０２において与えられる環状流は、回転子６００により必要とされる仕事量を軽減するのに役立ち得る。環状流はまた、出力ポート３０１０に向かって出力物質１０２を誘導する。
代替的実施形態では、ポンプ４２０は、実質的に、図１０に示されるポンプ４１０と同一の構成を有し得る。このような実施形態では、１つ以上の翼２０４２は、混合チャンバ３３０の第２の開口末端部３３４から離れて移動する際、出力物質１０２において、環状流を与えるように構成される。
当業者には理解されるように、混合デバイス１００の様々なパラメータを修正して、異なる混合特徴を得てもよい。修正され得る例示的なパラメータは、スルーホール６０８の大きさ、スルーホール６０８の形状、スルーホール６０８の配置、スルーホール６０８の数、アパーチャ７０８の大きさ、アパーチャ７０８の形状、アパーチャ７０８の配置、アパーチャ７０８の数、回転子６００の形状、固定子７００の形状、混合チャンバ３３０の幅、混合チャンバ３３０の長さ、駆動シャフト５００の回転速度、内部ポンプ４１０により与えられる軸流速度、内部ポンプ４１０により与えられる周速度、内部ポンプ４２０により与えられる軸流速度、内部ポンプ４２０により与えられる周速度、回転子６００の外表面６０６上に形成された擾乱構成（例えば、テクスチャ、突起、凹部、開口等）、固定子７００の内表面７０６上に形成された擾乱構成（例えば、テクスチャ、突起、凹部、開口等）等を含む。
代替的実施形態
図１２を参照して、混合デバイス５０００を示す。混合デバイス５０００は、混合デバイス１００の代替的実施形態である。同一の参照番号は、混合デバイス１００の実質的に同様の対応する構成要素である混合デバイス５０００の構成要素を識別するために、本明細書に使用されている。混合デバイス１００の構成要素とは異なる混合デバイス５０００の要素のみを説明する。
混合デバイス５０００は、回転子６００および固定子５７００を格納するためのハウジング５５００を含む。固定子５７００は、その第１の末端部５７１２およびその第２の末端部５７１４により、ハウジング５５００に非回転自在に連結され得る。チャンバ５８００は、ハウジング５５００と、第１の末端部５７１２および第２の末端部５７１４により側面に配置される固定子５７００の部分５８２０との間に画定される。ハウジング５５００は、チャンバ５８００へのアクセスを提供する、入力ポート５８３０を含む。入力ポート５８３０は、回転軸「α」に実質的に直交するように配向されるが、これは必須ではない。
固定子５７００は、チャンバ５８００および混合チャンバ３３０を接続する複数のスルーホール５７０８を含む（回転子６００と固定子５７００との間で画定される）。外部ポンプ２３０を使用して、入力ポート５８３０を介して、チャンバ５８００に、第３の物質１３０（第２の物質１２０と同一であり得る）を送出し得る。チャンバ５８００に送出される第３の物質１３０は、固定子５７００に形成されるスルーホール５７０８を介して、混合チャンバ３３０に流入し得る。第３の物質１３０は、ポンプ２３０、第１の物質１１０に対する第３の物質１３０の浮力、およびこれらの組み合わせによりチャネル５８００から強制移動させられ得る。回転子６００が回転する際、チャネル５８００から混合チャンバ３３０に第３の物質１３０を引き出してもよい。第３の物質１３０は、気泡、溶滴、粒子等として混合チャンバ３３０に流入し得、回転子６００により周速度が与えられ得る。
代替的実施形態
混合デバイス１００の代替的実施形態は、図１３に示される中央部分５９００、および図１４に示されるベアリングハウジング５９２０を用いて、構成され得る。図１３は、その内部に固定子７００（図７を参照のこと）を有する中央部分５９００を示す。同一の参照番号が、混合デバイス１００の実質的に同様の対応する構成要素である中央部分５９００と関連する構成要素を識別するために、本明細書に使用されている。中央部分５２２の構成要素とは異なる中央部分５９００の構成要素のみが記載され得る。中央部分５９００および固定子７００は共に、金属（例えば、ステンレス鋼）等の導電物質から構成される。入力ポート１０１０および出力ポート３０１０は共に、プラスチック（例えば、ＰＥＴ、テフロン（登録商標）、ナイロン、ＰＶＣ、ポリカーボネート、ＡＢＳ、デルリン、ポリサルフォン等）等の非導電物質から構成される。
電気接点５９１０は、中央部分５９００に連結され、そこに電荷を伝達するように構成される。中央部分５９００は、固定子７００に電気接点５９１０に印加される電荷を伝導する。更なる実施形態では、中央部分５９００は、非導電物質から構築され得る。このような実施形態では、電気接点５９１０は、中央部分５９００を通過し、固定子７００に連結される。固定子７００への電気接点５９１０により印加される電荷は、混合チャンバ３３０内での酸化還元または他の化学反応を促進するのに役立ち得る。
任意に、絶縁体（図示せず）は、環境からそれを電気的に絶縁するように中央部分５９００周辺に配設され得る。更に、絶縁体は、中央部分５９００と、混合デバイスの他の構成要素からそれを電気的に絶縁するように、側面に配置する第１および第２の機械的密閉部５２４および５２６との間で使用され得る。
ここで、図１４を参照して、ベアリングハウジング５９２０が説明される。ベアリングハウジング５９２０は、駆動シャフト５００の部分７２６周辺に配設される。電気接点５９２２は、ベアリングハウジング５９２０に連結される。回転ブラシ接点５９２４は、駆動シャフト５００と電気接点５９２２との間に電気的接続を提供する。
この実施形態では、駆動シャフト５００および回転子６００は双方とも、金属（例えば、ステンレス鋼）等の導電物質から構成される。ベアリングハウジング５９２０は、導電物質あるいは非導電物質のいずれかから構成され得る。電荷は、電気接点５９２２および回転ブラシ接点５９２４により駆動シャフト５００に印加される。電荷は、駆動シャフト５００により回転子６００に伝導される。
図１３に示される中央部分５９００および図１４に示されるベアリングハウジング５９２０を用いて構成される混合デバイス１００の代替的実施形態は、少なくとも２つの方法において、作動され得る。第１に、電気接点５９１０および５９２２は、それぞれ、固定子７００および回転子６００に電荷を提供しないように構成され得る。言い換えれば、電気接点５９１０および５９２２のいずれも、電流源、電圧源等に接続されない。
代替として、電気接点５９１０および５９２２は、それぞれ、固定子７００および回転子６００に電荷を提供するように構成され得る。例えば、電気接点５９１０および５９２２は、電気接点５９１０および５９２２にわたって定常電圧または定電圧を供給するＤＣ電圧源（図示せず）に連結され得る。ＤＣ電圧源の負極は、電気接点５９１０および５９２２のいずれかに連結され得、ＤＣ電圧源の正極は、電気接点５９１０および５９２２のもう一方に連結され得る。電気接点５９１０および５９２２にわたって供給された電圧は、約０．０００１ボルト〜約１０００ボルトの範囲であり得る。特定の実施形態では、電圧は、約１．８ボルト〜約２．７ボルトの範囲であり得る。別例として、約１％〜約９９％の負荷サイクルを有するパルスＤＣ電圧を使用し得る。
混合デバイスを操作するための方法の上記の例は、電気接点５９１０および５９２２にわたってＤＣ電圧を印加するが、当業者には明らかであるように、様々な形状および大きさを有する、対称ＡＣ電圧または非対称ＡＣ電圧は、電気接点５９１０および５９２２にわたって印加され得、このような実施形態は、本発明の範囲内である。
混合チャンバ３３０内部での混合
上記のように、先行技術のデバイス１０（図１に示される）において、第１の物質１１０は、チャネル３２の第２の開口末端の一部分のみに沿って配置される単一の限定された入力ポート３７を介して回転子１２と固定子３０との間のチャネル３２に流入した。同様に、出力物質１０２は、チャネル３２の第１の開口末端の一部分のみに沿って配置される単一の限定された出力ポート４０を介してチャネル３２に流出した。この配置は、望ましくない、不必要な摩擦を生じた。単一の限定された入口ポート３７および単一の限定された出口ポート４０をチャンバ３１０および３２０にそれぞれ差し替えることにより、摩擦は軽減されている。更に、第１の物質１１０は、混合チャンバ３３０を流入する前に、隅部を通り抜けることがなく、出力物質１０２は、混合チャンバ３３０を流出する前に、隅部を通り抜けない。更に、チャンバ３１０および３２０は、チャネル３２を流入する前、および流出した後、物質の周速度を提供する。
したがって、混合デバイス１００にわたる圧力降下が、実質的に軽減されている。図２、４〜９、および１１に示される実施形態では、入力ポート１０１０と出力ポート３０１０との間の圧力降下は、混合デバイス１００が、毎分約６０ガロンの出力物質１０２を産生するように構成される場合、わずか約１２ｐｓｉである。これは、毎分約６０ガロンの出力物質を産生する場合には、少なくとも２６ｐｓｉであった、図１に示される先行技術のデバイス１０を超える改善である。言い換えれば、混合デバイス１００にわたる圧力降下は、先行技術のデバイス１０により経験したものよりも半分以下である。
追加の態様によれば、駆動シャフト５００により動力を供給される、ポンプ４１０および４２０の含有物は、混合物質において、実質的に更に有効であり、先行技術において使用された外部ポンプよりも少ないエネルギーを要する、構成を提供する。
マイクロキャビテーション
混合デバイス１００の動作時、入力物質は、第１の物質１１０（例えば、流体）および第２の物質１２０（例えば、ガス）を含み得る。第１の物質１１０および第２の物質１２０は、回転子６００と固定子７００との間に形成される混合チャンバ３３０内部で混合される。固定子７００内部での回転子６００の回転は、混合チャンバ３３０内部で第１の物質１１０および第２の物質１２０を撹拌する。回転子６００に形成されたスルーホール６０８および／または固定子７００に形成されたアパーチャ７０８は、混合チャンバ３３０内部で第１の物質１１０および第２の物質１２０の流れにおいて乱流を与える。
理論に制限されるわけではないが、第１の物質１１０への第２の物質１２０の有効性および持続性は、マイクロキャビテーションにより部分的に生じると考えられ、これは、図１５〜１７に関連して説明される。物質が平滑面上を流れる際は何時でも、動流体と不動表面との間の表面張力のため、幾分の層流が、不動または超低速で移動する薄膜境界層によって構築される。スルーホール６０８、および任意に、アパーチャ７０８は、層流を妨害し、第１の物質１１０の局部圧縮および減圧を生じ得る。減圧サイクル時の圧力が、十分低い場合、空隙（キャビテーション気泡）は、物質に形成され得る。キャビテーション気泡は、低圧の局在領域が、図１５に示されるように、ホスト物質および注入物質を引き出すため、竜巻のような、環流パターン５９９０を生成する。キャビテーション気泡が内破する場合、非常に高い圧力が生じる。２つの整合した開口（例えば、アパーチャ７０８の１つおよびスルーホール６０８の１つ）が互いに通過する場合、有意なエネルギーを生成する、振盪（衝撃波）が生じる。キャビテーションおよび振盪と関連するエネルギーは共に、恐らく、非常に高度な分子レベルまで、第１の物質１１０および第２の物質１２０を混合する。
回転子６００の接線速度および回転ごとに互いに通過する開口数が、混合デバイス１００での周波数を決定し得る。超音波周波数の範囲内で混合デバイス１００を動作させることは、多くの用途において有用であり得ることが判断されている。超音波の周波数領域において混合デバイス１００を動作させることは、流体分子の結合角度を変化させるために最大振盪衝撃エネルギーを提供し、これは、通常、保持することが不可能な第２の物質１２０の追加量を輸送することが可能である。混合デバイス１００を拡散器として使用する場合、混合デバイス１００が操作される周波数は、撹拌の程度に影響を及ぼすように思われ、第１の物質１１０（ホスト物質）において、第２の物質１２０（注入物質）の更に長い持続性をもたらす。
ここで、図１５を参照すると、回転子６００の代替的実施形態である、回転子６０００を提供する。混合チャンバ３３０において、第１の物質１１０内に作成されたキャビテーションは、混合チャンバ３３０の長さに沿って異なる周波数で生じるように構成され得る。キャビテーションの周波数は、回転子６００の長さに沿ってスルーホール６６０８の数および／または配置を改変することにより改変され得る。スルーホール６６０８のそれぞれは、スルーホール６０８に実質的に同様であり得る（上記で論じられた）。
限定されない例として、回転子６０００は、３つの別々の例示的な部分６１００、６２００、および６３００に更に分割され得る。スルーホール６６０８は、部分６１００から部分６２００へと密度を増加し、部分６１００のホール数は、部分６２００のホール数よりも多い。スルーホール６６０８はまた、部分６２００から部分６３００へと密度を増加し、部分６２００のホール数も、部分６３００のホール数よりも多い。部分６１００、６２００、および６３００のそれぞれは、そこに形成されたスルーホール６６０８の数が異なるため、異なる周波数でそれらの特定領域内で振盪を生じる。
特定領域において適切に配列された所望の複数のスルーホール６６０８を用いて回転子６０００を製造することにより、混合チャンバ３３０内で所望の振盪周波数を決定し得る。同様に、所望のキャビテーションの周波数は、回転子６００が回転する固定子７００上に特定領域に適切に配列された所望の複数のアパーチャ７０８により決定され得る。更に、混合チャンバ３３０内で所望の振盪周波数（単数または複数）は、固定子７００に形成されたアパーチャ７０８の特定数および配置と、回転子６００に形成されたスルーホール６０８の特定数および配置の双方を選択することにより達成され得る。
図１９〜２１は、作成されたキャビテーションに対して異なる結果を達成するように構成される、固定子７００に形成されたアパーチャ７０８および回転子６００に形成されたスルーホール６０８の様々な代替的な配置を示す。図１９は、アパーチャ７０８およびスルーホール６０８が、回転子６００の回転軸「α」を通って引き出されるいずれの線（例えば、線７０１０）とは平行ではない軸７０００に沿って整合される構造を示す。言い換えれば、回転子６００が、円筒状を有する場合、軸７０００は、回転子６００の中央を通って通過しない。したがって、混合チャンバ３３０内の第１の物質１１０は、アパーチャ７０８およびスルーホール６０８により作成された圧縮および減圧に対して垂直に配向され得ない。代わりに、圧縮および減圧は、混合チャンバ３３０内の第１の物質１１０の円周流（図９の矢印「Ｃ３」の方向）に平行な、少なくとも１つの構成要素を有する力ベクトルを有し得る。
アパーチャ７０８およびスルーホール６０８の相対的な整合はまた、混合チャンバ３３０においてキャビテーションの作成にも影響を及ぼし得る。図２０は、アパーチャ７０８が、スルーホール６０８を有する混合チャンバ３３０にわたって整合される、実施形態を示す。本実施形態では、回転子６００の回転は、固定子７００のアパーチャ７０８を有する直接整合に、回転子のスルーホール６０８をもたらす。互いに直接整合中である場合、アパーチャ７０８およびスルーホール６０８により作成された圧縮力および減圧力は、互いに直接整列される。
図２１に示された実施形態では、アパーチャ７０８およびスルーホール６０８は、回転軸「α」に沿ってオフセット量「Ｘ」でオフセットされる。限定されない例として、オフセット量「Ｘ」は、アパーチャ７０８の大きさの関数として決定され得る。例えば、オフセット量「Ｘ」は、アパーチャ７０８の直径のほぼ半分に相当し得る。代替として、オフセット量「Ｘ」は、スルーホール６０８の大きさの関数として決定され得る。例えば、オフセット量「Ｘ」は、スルーホール６０８の直径のほぼ半分に相当し得る。スルーホール６０８およびアパーチャ７０８以外、またはこれに加えて特長（例えば、凹部、突起等）が、回転子６００あるいは固定子７００のいずれかに含まれる場合、オフセット量「Ｘ」は、このような特長の大きさの関数として決定され得る。このように、固定子７００のアパーチャ７０８および回転子６００のスルーホール６０８により生じた圧縮力および減圧力は、混合チャンバ３３０内で追加の回転およびねじり力を生じるわずかなオフセットで衝突する。これらの追加の力は、混合チャンバ３３０内で第１の物質１１０への第２の物質１２０の混合（例えば、拡散作用）を増加させる。
ここで、図２２〜２５を参照して、アパーチャ７０８およびスルーホール６０８に対する好適な断面形状の限定されない例を提供する。アパーチャ７０８および／またはスルーホール６０８の断面形状は、図２２に示されるような正方形であり、図２３に示されるような円等であり得る。
アパーチャ７０８および／またはスルーホール６０８の様々な断面形状が、回転子６００が、固定子７００内で回転する際、第１の物質１１０の流れを改変するために使用され得る。例えば、図２４は、広い部分７０２２の反対側に狭い部分７０２０を有する涙滴型の断面形状を示す。スルーホール６０８が、この涙滴型形状を有する場合、回転子６００を回転する際（矢印「Ｆ」により概して示される方向に）、混合チャンバ３３０内で第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に第３の物質１３０上に圧力を加えた力は、涙型の広い部分７０２２から狭い部分７０２０へ通過する際に増加する。
追加の回転力は、図２５に示されるように、らせん状構造を有するアパーチャ７０８および／またはスルーホール６０８を形成することにより混合チャンバ３３０に導入され得る。らせん状構造を有する、アパーチャ７０８および／またはスルーホール６０８に流入する、および流出する物質は、らせん状構造により誘発された回転力を経験する。混合デバイス１００内で採用され得る代替的実施形態の限定されない例示として図２２〜２５に示される例を提供する。当業者の適用により、アパーチャ７０８および／またはスルーホール６０８は、多くの方法において、混合チャンバ３３０内で物質を混合するのに適切である様々な振盪および撹拌力を達成するように構成され得る。
二重層効果
混合デバイス１００は、複合体との第１の物質１１０および第２の物質１２０の複合かつ非線形流体動的相互作用によって、出力物質１０２を生成するように構成され、動的乱流は、界面動電効果に更に有利に働く混合複合体をもたらし得る（以下に記述される）。これらの界面動電効果の結果は、電荷再分配および酸化還元反応として出力物質１０２内で観察され得、これには、出力物質内で安定化される可溶化電子の形態が含まれる。
表面基のイオン化または解離および／または液体からのイオン吸収は、液体と接触してほとんどの固体表面を荷電させる。図２６を参照すると、電気二重層（「ＥＤＬ」）７１００は、液体７１２０と接触して例示的な表面７１１０周辺に形成される。ＥＤＬ７１００において、ある電荷のイオン７１２２（この場合は、負の電荷を持つイオン）が、表面７１２０に吸着し、スターン層（Ｓｔｅｒｎ ｌａｙｅｒ）として一般に称される、表面層７１２４を形成する。表面層７１２４は、反対電荷かつ均等の大きさの対イオン７１２６（この場合、正の電荷を持つイオン）を誘引し、これは、拡散層として一般に称される、表面層７１２４の下に対イオン層７１２８を形成する。対イオン層７１２８は、表面層７１２４よりも更に拡散分布され、下のバルク物質７１３０において、両イオンの均一かつ同等な分布上にある。中性水中のＯＨ−およびＨ＋イオンに関しては、Ｇｏｕｙ−Ｃｈａｐｍａｎモデルは、拡散対イオン層が水中に約１ミクロン延在することを示唆し得る。
特定の態様によれば、上記の界面動電効果は、荷電表面７１１０に隣接する液体７１２０の移動により生じる。液体７１２０（例えば、水、食塩溶液等）内で、表面層７１２４を形成する吸収イオン７１２２は、液体７１２０が運動している（例えば、矢印「Ｇ」で示される方向に流れる）場合でさえ、表面７１２０に固定される。しかしながら、せん断面７１３２は、表面７１２０から離間した拡散対イオン層７１２８内で存在する。このように、液体７１２０が移動すると、拡散対イオン７１２６の幾つかは、表面７１２０から離れて輸送され、一方、吸収イオン７１２２は、表面７１２０で維持される。これにより、いわゆる「荷電電流」を生じる。
混合チャンバ３３０内で、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に、第３の物質１３０は、固定子７００の内面７０５および／もしくは回転子６００の外面６０６により生成された電磁場、内面７０５と外面６０６との間の電圧、ならびに／または第１の物質１１０に形成された、少なくとも１つのＥＤＬにより生じる界面動電効果（例えば、荷電電流）を受ける。少なくとも１つのＥＤＬは、固定子７００の内面７０５および回転子６００の外面６０６のうちの少なくとも１つにより、第１の物質１１０に導入され得る。
表面擾乱（例えば、スルーホール６０８およびアパーチャ７０８）に対して混合チャンバ３３０を通過する第１の物質１１０の移動は、混合チャンバ３３０内で第１の物質１１０においてキャビテーションを作成し、これは、第２の物質１２０を第１の物質１１０に拡散し得る。これらのキャビテーションは、固定子７００の内面７０５に形成された電気二重層および／もしくは回転子６００回転子６００の外面６０６に形成される電気二重層で、第１の物質１１０および／もしくは第２の物質１２０の間での接触を増強し得る。混合チャンバの容量比に対する表面積が大きいほど、混合チャンバ内で混合した物質の滞留時間が増加し、更に、小さい平均気泡サイズ（および故に、実質的に更に大きい気泡表面積）と組み合わせて、本発明の出力物質に対してＥＤＬ媒介効果の効果的付与をもたらす。
内面７０５および外面６０６が、ステンレス鋼等の金属物質から構成される実施形態では、液体７１２０および／または荷電電流（単数または複数）の運動は、内面７０５および外面６０６で、Ｈ２Ｏ、ＯＨ−、Ｈ＋、およびＯ２を含む、酸化還元反応を促進する。
図２７を参照すると、理論に制限されるわけではないが、内面７０５と外面６０６との間の混合チャンバ３３０の部分７１４０は、一組の平行板７１４２および７１４４としてモデル化され得る。第１の物質１１０が液体である場合、第１の物質１１０は、入口「ＩＮ」を通って部分７１４０に流入し、出口「ＯＵＴ」を通って部分７１４０に流出する。入口「ＩＮ」および出口「ＯＵＴ」は、部分７１４０の流入および流出を限定する。
図２８を参照すると、平行板７１４２と７１４４との間の領域は、高い表面積対容量比を有する。したがって、対イオン層７１２８（および対イオン７１２６）の実質的な部分は、第１の物質１１０が、板７１４２と７１４４との間を移動する際、運動している場合がある。運動している対イオン７１２６の数は、入口「ＩＮ」により部分７１４０に流入することができる数、および出口「ＯＵＴ」により部分７１４０に流出することができる数を超え得る。第１の物質１１０を供給する、および部分７１４０から第１の物質１１０を除去する、入口「ＩＮ」および出口「ＯＵＴ」は、それぞれ、平行板７１４２および７１４４よりもはるかに小さい表面積（およびより小さい表面積対容量比）を有し、それによって、部分７１４０に流入するおよび流出する第１の物質１１０において、運動している対イオン７１２６の部分を軽減する。したがって、部分７１４０からの流入および流出は、局所的に荷電電流を増加させる。いずれかの表面にわたって第１の物質１１０を流れることにより生じるバックグラウンド荷電電流（矢印「ＢＳＣ」により識別される）が、常に、混合デバイス１００内部に存在するが、板７１４２および７１４４は、部分７１４０内で増加した「過剰」荷電電流（矢印「ＥＳＣ」により識別される）を導入する。
第１の物質１１０の流れと反対方向の板７１４２および７１４４において、導電性反流（矢印「ＲＣ」により識別される）なしに、吸収イオン７１２２と同一の符号を有する過剰電荷７１４６は、入口「ＩＮ」付近で蓄積し、対イオン７１２６と同一の符号を有する過剰電荷７１４８は、出口「ＯＵＴ」付近で蓄積し得る。このような蓄積電荷７１４６および７１４８が、反対であって、かつそれ故に互いに誘引しあうために、導電手段により結合しようとする蓄積電荷を無制限に蓄積することはできない。板７１４２および７１４４が、完全に電気的に絶縁される場合、蓄積電荷７１４６および７１４８は、第１の物質１１０それ自体を通してのみ移動することができる。導電性反流（矢印「ＲＣ」により識別される）が、部分７１４０において、過剰荷電電流（矢印「ＥＳＣ」により識別される）と実質的に同等である場合、ゼロ正味（ｚｅｒｏ ｎｅｔ）の過剰荷電電流を有する定常状態を達成し、入口「ＩＮ」付近の過剰電荷７１４６と出口「ＯＵＴ」付近の過剰電荷７１４８との間の静電電位差は、その間に別々の定常状態の電荷を生成する。
電荷分離量、およびひいては、入口「ＩＮ」付近の過剰電荷７１４６と出口「ＯＵＴ」付近の過剰電荷７１４８との間の静電電位差は、イオン（即ち、イオン７１２２および７１２６）のない液体により得られる流速に近似する液体流速を生成するように、電荷を、反電場（電荷分離により生成された）に対して「プッシュ（ｐｕｓｈ）」する、ポンプ（例えば、回転子６００、内部ポンプ４１０、および／もしくは外部ポンプ２１０）により供給される、単位電荷あたりの追加のエネルギーにより異なる。板７１４２および７１４４が絶縁体である場合、静電電位差は、ポンプ（例えば、回転子６００、内部ポンプ４１０、および／もしくは外部ポンプ２１０）が生成することができる、ＥＭＦの直接測定である。この場合は、入口「ＩＮ」付近の第１の物質１１０において、リード線の一方と、出口「ＯＵＴ」付近の第１の物質１１０において、他方のリード線を設置することによる、一組のリード線を有する電圧計を用いて、静電電位差を測定することができ得る。
絶縁板７１４２および７１４４では、いずれの反流も、反流が、第１の物質１１０を通ってイオンの伝導のみに関与するという点において、純粋にイオン電流（またはイオンの流れ）である。更に導電経路を通って他の導電機構が、入口「ＩＮ」付近の過剰電荷７１４６と出口「ＯＵＴ」付近の過剰電荷７１４８との間に存在する場合、反流は、更にこれらの導電経路を使用し得る。例えば、導電性金属板７１４２および７１４４は、更に導電経路を提供し得るが、これらの更なる導電経路は、電子電流のみ送信し、イオン電流は送信しない。
当業者には明らかであるように、金属中の１つ以上の電子へとイオンにより担持される電荷を搬送するために（逆も然り）、１つ以上の酸化還元反応は、金属の表面で生じ、反応生成物を生成するはずである。第１の物質１１０は、水（Ｈ２Ｏ）であり、第２の物質１２０は、酸素（Ｏ２）であると仮定すると、導電性板７１４２および７１４４へと負電荷を注入し得る酸化還元反応の限定されない例は、以下の既知の半電池反応を含む。
Ｏ２＋Ｈ２Ｏ→Ｏ３＋２Ｈ＋＋２ｅ
ここでも、第１の物質１１０は、水（Ｈ２Ｏ）であり、第２の物質１２０は、酸素（Ｏ２）であると仮定すると、酸化還元反応の限定されない例は、導電性板７１４２および７１４４から負電荷を除去し得る、以下の既知の半電池反応を含む。
２Ｈ＋＋ｅ−→Ｈ２
導電性金属板７１４２および７１４４では、第１の物質１１０（限定要因にならないように十分迅速な酸化還元反応を提供する）よりも更に導電性があるため、ほとんどの反流は、電子電流であると考えられる。導電性金属板７１４２および７１４４に関しては、更に小さい電荷分離が、入口「ＩＮ」と出口「ＯＵＴ」との間で蓄積し、より小さい静電電位が、その間に存在する。しかしながら、これは、ＥＭＦが更に小さいという意味ではない。
上記のように、ＥＭＦは、ポンプが、電荷分離により生成された反対の電場に対して第１の物質１１０の流れを促進するように提供する、単位電荷あたりのエネルギーに関連する。静電電位は更に小さいため、該ポンプは、第１の物質１１０の流れが生じるのに、単位電荷あたりより少ないエネルギーを供給し得る。しかしながら、上記の例示的な酸化還元反応は、必ずしも自発的に生じず、ひいては、ポンプにより供給され得る、作業入力を必要とする場合がある。したがって、ＥＭＦの一部分（より小さい静電電位差に反映しない）を使用して、酸化還元反応を起こすのに必要なエネルギーを提供し得る。
言い換えれば、絶縁板７１４２および７１４４に対して電荷分離により生成された反対の電場に対して押動するようにポンプにより提供される同一の圧力差を用いて、導電性板７１４２および７１４４を通して電荷を「押動し」、かつ酸化還元反応を起こし得る。
図２９を参照すると、発明者により行われた実験に対する実験装置を提供する。実験は、一対の実質的に同一の離間した５００ｍＬの標準の三角フラスコ７１５０および７１５２を含み、それぞれは、多量の脱イオン水７１５３を含有した。ゴム栓７１５４は、それぞれのフラスコ７１５０および７１５２の開口端に挿入された。栓７１５４には、３つの経路である、中空管７１５６、陽極７１５８、および陰極７１６０をそれぞれ１つずつ含んだ。フラスコ７１５０および７１５２に関して、中空管７１５６、陽極７１５８、および陰極７１６０のそれぞれは、全て、フラスコの外部から、栓７１５４を貫通して、フラスコ内部の脱イオン水７１５３に延在した。陽極７１５８および陰極７１６０は、ステンレス鋼で構成された。双方のフラスコ７１５０および７１５２において、中空管７１５６は、共通の酸素供給７１６４に連結された開口端部７１６２を有した。陽極７１５８および陰極７１６０は、直流電源７１６８の陽極および負極にそれぞれ連結された、フラスコ７１５２に挿入した。全く同一のスパージャーをそれぞれのフラスコに使用した。
酸素は、約１ＳＣＦＨ〜約１．３ＳＣＦＨの流速（供給）（混合した流速）で、中空管７１５６から、フラスコ７１５０および７１５２の双方に流れた。フラスコ７１５２に挿入された陽極７１５８および陰極７１６０にわたって印加した電圧は、約２．５５ボルトであった。全ての酸素種に作用するのに十分な電気化学的電圧値であると考えられるため、この値が、選択された。供給７１６４からの酸素が、フラスコ７１５０および７１５２のそれぞれにおいて、脱イオン水７１５３に吹き込まれる、３〜４時間にわたって、この電圧を、継続的に印加した。
ＨＲＰおよびピロガロールを用いたフラスコ７１５０中での脱イオン水７１５３の試験は、本明細書に記載の代替的な回転子／固定子の実施形態を用いて生成した、流体の特性と一致する、ＨＲＰ媒介したピロガロール反応活性を与えた。ＨＲＰの光学密度は、同等の酸素含有量の加圧ポットまたは微粒子気泡と比較して、約２０％高かった。この実験の結果は、混合チャンバ３３０内の混合は、酸化還元反応を伴うことを示す。特定の態様によれば、本発明の混合チャンバは、本発明の出力溶液内で酸素富化水構造、あるいは、プロセス内での電気的効果により存在する幾つかの型の酸素種のいずれかにより安定化される、追加の電子を含む出力物質を提供する。
また、フラスコ７１５０および７１５２の双方において、脱イオン水７１５３は、過酸化水素に対して０．１ｐｐｍおよびオゾンに対して０．６ｐｐｍの感度を有する、業界標準比色試験アンプルを採用して、オゾンおよび過酸化水素の双方に対して試験した。これらのアンプルの検出限界までいずれの種の陽性反応もなかった。
滞留時間
滞留時間は、混合チャンバ３３０において費やす、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に第３の物質１３０の時間である。混合チャンバ３３０の直径に対する混合チャンバ３３０の長さの比が、滞留時間に有意に影響を及ぼし得る。比が大きくなるほど、滞留時間は長くなる。背景技術の項において言及されるように、先行技術のデバイス１０（図１を参照のこと）の回転子１２は、直径に対する長さの比の約０．８を提供する、約７．５００インチの直径および約６．０００インチの長さを有した。対照的に、特定の実施形態では、混合デバイス１００の混合チャンバ３３０の長さは、約５インチであり、回転子６００の直径「Ｄ１」は、約１．６９インチであり、これは、直径に対する長さの比の約２．９５をもたらす。
滞留時間は、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に第３の物質１３０が、本明細書に記載の界面動電現象と相互作用することが可能である、時間を示す。先行技術のデバイス１０は、毎分約６０ガロンの出力物質１０２を生成するように構成され、混合デバイス１００は、毎分約０．５ガロンの出力物質１０２を生成するように構成され、先行技術のデバイス１０（図１を参照のこと）は、約０．０５秒の流体滞留時間を有し、一方、混合デバイス１００の実施形態は、約０．３５秒の実質的により長い（約７倍長い）滞留時間を有する。このより長い滞留時間は、第１の物質１１０、第２の物質１２０、および任意に、第３の物質１３０を、先行技術のデバイス１０において可能であったよりも約７倍長く、混合チャンバ３３０内で、互いに、および表面６０６および７０５（図７を参照のこと）と相互作用することを可能にする。追加の実施形態では、滞留時間は、先行技術のデバイス１０において、可能であったよりも少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、またはそれ以上である。
下の表５を参照すると、上記の滞留時間は、毎秒のガロンにおいて、各デバイスに対する流速を第１に決定することにより計算された。先行技術のデバイス１０の場合は、毎分約６０ガロンの出力物質で操作するように構成され、一方、混合デバイス１００は、毎分約０．５ガロンの出力物質の最適範囲を含む、より広範囲の流速にわたって操作するように構成される。次いで、流速は、１ガロン当たりの立方インチ数（即ち、２３１立方インチ）で、毎秒のガロンの流速を乗算することにより、毎秒立方インチに変換された。次いで、先行技術のデバイス１０のチャネル３２の容量（１２．８７６立方インチ）を、デバイスの流速（２３１立方インチ／秒）で除算し、滞留時間（秒単位）を得、混合デバイス１００の混合チャンバ３３０の容量（０．６７３立方インチ）を、デバイス（毎秒立方インチにおける）の流速（１．９２５立方インチ／秒）で除算し、滞留時間（秒単位）を得た。
注入速度
混合デバイス１００の特定の態様は、先行技術のデバイス１０（図１を参照のこと）をを含む、先行技術を超える、改善された酸素注入速度を提供する。第１の物質１１０は、水であり、第２の物質１２０は、酸素であり、これらの双方は、摂氏２０℃で、またはほぼ摂氏２０℃で、単一パス（即ち、図２の戻りのブロックが、「ＮＯ」に設定される）において、混合デバイス１００により処理され、出力物質１０２は、約４３．８ｐｐｍ（１００万分の１）の溶解酸素レベルを有する。ある態様では、約４３．８ｐｐｍの溶解酸素を有する出力物質は、本発明の非加圧（非加圧ポット）法を介した本発明の流動を経由して、約３５０ミリ秒で生成される。対照的に、第１の物質１１０（水）および第２の物質１２０（酸素）が共に、先行技術のデバイス１０により、摂氏２０℃で、またはほぼ摂氏２０℃で、単一パスにおいて、処理され、出力物質は、５６ミリ秒の単一パスで、わずか３５ｐｐｍ（１００万分の１）の溶解酸素レベルを有した。
出力物質１０２
第１の物質１１０が、液体（例えば、淡水、食塩水、ＧＡＴＯＲＡＤＥ（登録商標）等）であり、第２の物質１２０が、気体（例えば、酸素、窒素等）である場合、混合デバイス１００は、第１の物質１１０に第２の物質１２０を拡散し得る。以下は、出力物質１０２に行われた分析の結果を論じ、混合デバイス１００により処理されているものに由来する出力物質１０２の１つ以上の特性を特徴付ける。
第１の物質１１０が、食塩溶液であり、第２の物質１２０が、酸素ガスである場合、実験は、食塩溶液内で生成した酸素気泡の大部分が、０．１ミクロン以下の大きさであることを示している。
溶解酸素レベルの減衰
ここで、図３０を参照すると、混合デバイス１００において、酸素で処理され、５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１０００ｍＬのガラス瓶中に保管された、溶解酸素レベルを示す。瓶のそれぞれは、栓をし、華氏６５度で保管された。点７９００は、瓶詰めでの溶解酸素レベルである。線７９０２は、Ｈｅｎｒｙ法の平衡状態を示し（即ち、華氏６５度で、水中であるべき溶解酸素量）、これは、わずか１０ｐｐｍ未満の溶解酸素レベルである。点７９０４および７９０６は、それぞれ、６５日および９５日でのプラスチックボトル内の水中の溶解酸素レベルである。点７９０４に示されるように、プラスチックボトルが、瓶詰めから約６５日後に開口される場合、水中の溶解酸素レベルは、約２７．５ｐｐｍである。該ボトルが、瓶詰めから約９５日後に開口される場合、点７９０６で示されるように、溶解酸素レベルは、約２５ｐｐｍである。同様に、ガラス瓶に関しては、溶解酸素レベルは、点７９０８で示されるように、６５日で、約４０ｐｐｍであり、点７９１０で示されるように、９５日で、約４１ｐｐｍである。このようにして、図３０は、プラスチックボトルおよびガラス瓶の双方の溶解酸素レベルは、華氏６５度で相対的に高い状態にあることを示す。
ここで、図３０を参照すると、混合デバイス１００において、酸素で富化され、少なくとも３６５日、５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１０００ｍＬのガラス瓶中に保管された水中の溶解酸素レベルを示す。瓶のそれぞれは、栓をし、華氏６５度で保管された。図で見られるように、酸素富化流体の溶解酸素レベルは、少なくとも３６５日、ほぼ一定を保った。
図３１を参照すると、混合デバイス１００において、酸素で富化され、５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１０００ｍＬのガラス瓶中に保管された水中の溶解酸素レベルを示す。双方の瓶は、華氏３９度で冷蔵保存された。更に、酸素富化流体の溶解酸素レベルは、少なくとも３６５日、安定した状態のままであり、わずかに低下した。
分子間相互作用
従来、量子的特性は、１０−１０メートル未満の素粒子に属すると考えられ、一方、日常生活の巨視的世界は、ニュートンの運動の法則に従い、素粒子が運動するという点において、古典的であると称される。
最近、分子は、希釈と共に大きさが増加するクラスターを形成するように記載されている。これらのクラスターは、直径において、幾つかのマイクロメートルを測定し、希釈と共に非線形に大きさが増加することが報告されている。直径で１００ナノメートルを測定する量子のコヒーレントドメインが、純水中に発生すると仮定され、コヒーレントドメインにおける水分子の集団振動が、最終的に、電磁場変動に固定される相になり得、水中で安定振動を提供し、水の集合構造を変化させる水中の溶解物質に特異的な長続きするコヒーレント振動の励起の形態において、「記憶」の一形態を提供し、これは、同様に、発達する特異的なコヒーレント振動を決定し得る。これらの振動は、連結する磁場相により安定化される場合、希釈する際の水は、更に、「種（ｓｅｅｄ）」コヒーレント振動を運び得る。分子のクラスターの大きさが増加すると、その電磁的な特徴が、対応して増幅され、水により運ばれるコヒーレント振動を増強する。
溶解分子のクラスターサイズの変化、および水の詳細な微視的構造にもかかわらず、コヒーレント振動の特異性は、なお、存在し得る。水の特性の変化を考慮するための１つのモデルは、結晶化に関与する考慮に基づいている。
図３６を参照すると、ナノスケールケージ８７００を形成する、簡易プロトン化水クラスターを示す。プロトン化水クラスターは、一般に、Ｈ＋（Ｈ２０）ｎの形態をとる。幾つかのプロトン化水クラスターは、電離層等に自然発生する。任意の特定の理論に拘束されるわけではないが、特定の態様に従って、水クラスターまたは構造の他の型（クラスター、ナノケージ等）が可能であり、これには、本発明の出力物質に与えられる、酸素および安定化した電子を含む構造が含まれる。酸素原子８７０４は、得られる構造８７００に取り込まれ得る。セミ結合ナノケージの化学反応は、酸素８７０４および／または安定化した電子を、長期間、溶解したままにすることが可能である。医薬化合物等の他の原子または分子は、徐放目的のためにケージされ得る。溶液物質および溶解化合物の特異的化学反応は、これらの物質の相互作用により異なる。
混合デバイス１００により処理された流体を、クラスター構造において流体の分析と一致する異なる構造特性を示すように実験を介して示している。
混合デバイス１００を通して処理された水は、通常の未処理の水と比較される場合、検出可能な構造差を有することが示されている。例えば、処理された水は、未処理の水に観察される、更に、レイリー散乱を有することが示されている。行われた実験において、処理された水および未処理の水のサンプルは、調製され（別々の瓶中にそれぞれ密閉することにより）、コードされ（処理サンプルおよび未処理サンプルの後の識別のために）、分析のために独立した試験室に送られた。試験が完了した後のみ、どのサンプルが、混合デバイス１００により処理されたものであるかを示すコードが解釈された。
試験室で、２つのサンプルを、６３３ナノメートルの波長を有するレーザー光線に置いた。流体は、試験前の約１週間、ガラス瓶中に密閉されていた。処理されたサンプルに関しては、サンプルＢは、レーザー光線と相対的なその位置にかかわらず光を散乱させた。しかしながら、サンプルＡには行わなかった。瓶を開口してから２〜３時間後、サンプルＢの散乱効果は、消失した。これらの結果は、水にその特性を保持させ、かつ時間と共に消失する、記憶を水が示したことを意味する。これらの結果はまた、処理された水の構造が、未処理の流体の構造とは光学的に異なることも意味する。最後に、これらの結果は、実験の開始時の溶解酸素レベルが、４５ｐｐｍであり、実験の終了時は、約３２ｐｐｍであることが推測されたため、光学的効果は、溶解酸素レベルには、直接に関連しないことを意味する。
帯電安定化したナノ構造（例えば、帯電安定化した酸素含有のナノ構造）：
「二重層効果」、「滞留時間」、「注入速度」、「気泡サイズ測定」の項目にて本明細書に上記されるように、混合デバイス１００は、複合体と第１の物質１１０および第２の物質１２０の独特の、非線形流体動的相互作用、本明細書に記載される、新規の界面動電効果を提供する効果的に膨大な表面積（デバイスの面積および１００ｎｍ未満の例外的に小さい気泡の面積を含む）と接触して混合する複合体を提供する、動的乱流をおよそミリ秒で作成する。また、絶縁回転子および固定子を含む、特別に設計された混合デバイスを用いて、機能局在界面動電効果（電圧／電流）を、本明細書（実施例２０を参照のこと）に実証した。
当該技術分野においてよく認識されるように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、水溶液中で、極めて不安定であることが知られている。特定の態様によれば、出願の界面動電効果（例えば、特定の態様では、溶媒和電子を含む、電荷再分配）は、出力物質（例えば、食塩溶液、イオン溶液）内で、驚くほど安定化される。実際には、本明細書に記載されるように、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ）の特性および生物活性の安定性は、気密性容器内において、数ヶ月間、維持され得、本発明の溶液の特性および活性を精製する、および／もしくは維持する、および／もしくは媒介するように役立てることに、溶解ガス（例えば、酸素）の関与を示す。有意に、本明細書の実施例に記載されるように、電荷再分配および／または溶媒和電子は、流体により生細胞（例えば、哺乳類細胞）と接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、本発明の界面動電イオン水性流体中に安定的に構成される（例えば、細胞パッチクランプの実施例２３および２４を参照のこと）。
本発明の界面動電流体（例えば、界面動電食塩溶液）の安定性および生物学的適合性を説明するために、「分子間相互作用」の項において本明細書で記載されるように、出願者は、水分子と水中に溶解された物質（例えば、酸素）の分子との間の相互作用が、水の集合構造を変化させ、ナノスケールケージクラスターを提供することが提案され、これには、本発明の出力物質に与えられる、酸素および／または安定化した電子を含むナノ構造が含まれる。機構に拘束されるわけではないが、本明細書に記載の特性および活性に従って、特定の態様では、ナノ構造の構造は、それらが、溶解ガス（例えば、酸素）を（少なくとも、形成および／もしくは安定性および／もしくは生物活性のために）含む；細胞膜もしくはその関連した構成要素と接触する際に、界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０またはＳｏｌａｓ食塩流体）が、電荷および／もしくは電荷効果を調節する（例えば、与えるまたは受容する）のを可能にする；ならびに、特定の態様では、生物学的に関連した形態において、溶媒和電子の安定化を提供する（例えば、運ぶ、持つ、捕獲する）。
特定の態様によれば、本開示により支持されるように、イオンまたは食塩（例えば、標準食塩水、ＮａＣｌ）溶液において、本発明のナノ構造は、帯電安定化した水和殻内で、少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を含み得る、帯電安定化したナノ構造（例えば、平均直径１００ｎｍ未満）を含む。追加の態様によれば、本明細書のいずれかの箇所で記載されるように、帯電安定化した水和殻は、該少なくとも１つの溶解ガス分子（例えば、酸素）を持つケージまたは空隙を含み得る。更なる態様によれば、好適な帯電安定化した水和殻の供給によって、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、溶媒和電子（例えば、安定化した溶媒和電子）を更に含み得る。
機構または特定の理論に拘束されるわけではないが、この優先日後、周囲（大気）気体と平衡状態にある水性液体中のイオンにより安定化された帯電安定化超微粒気泡が、提案されている（Ｂｕｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｐｈｙｓｉｃｓ，１０４：４８６−４９８，２００７；参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる）。本発明の特定の態様によれば、出願者の新規の界面動電流体は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の新規の生物学的活性形態を含み、そして、このような構造の新規の配列、クラスター、または会合を更に含み得る。
帯電安定化した超微粒気泡モデルによれば、水構造の短距離分子秩序は、ガス分子の存在により破壊され（例えば、非吸着イオンと初期に複合した溶解ガス分子は、短距離秩序の欠陥をもたらす）、これは、イオン性溶滴の濃縮を提供し、欠陥は、水分子の第１および第２の配位圏により取り囲まれ、配位圏において、それぞれ、６および１２の空孔を占める、吸着イオン（例えば、電気二重層を形成するためのＮａ＋イオンの「スクリーニングシェル（ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｈｅｌｌ）」の捕捉）および非吸着イオン（例えば、第２の配位圏を占めるＣｌ−イオン）により代替的に充填される。不飽和イオン溶液（例えば、不飽和食塩溶液）において、この水和した「細胞核」は、第１および第２の配位圏が、それぞれ、６つの吸着イオンおよび５つの非吸着イオンにより充填されるまで、安定した状態を保ち、次いで、ガス分子を含有する内部空隙を生成するクーロン爆発を受け、吸着イオン（例えば、Ｎａ＋イオン）は、得られる空隙の表面に吸着され、一方、非吸着イオン（またはそれらの幾つかの部分）は、溶液に拡散する（Ｂｕｎｋｉｎら、上記を参照）。このモデルにおいて、ナノ構造における空隙は、その表面に吸着されたイオン（例えば、Ｎａ＋イオン）間でのクーロン爆発により崩壊されない。空隙含有のナノ構造の安定性は、空隙／気泡表面への同電荷との溶解イオンの選択的吸着、および溶解ガスと気泡内部のガスとの間の拡散平衡によるものであると仮定され、負の静電圧（得られる電気二重層により与えられる外部からの静電圧）は、界面張力に対して安定補償を提供し、気泡内部のガス圧力は、周囲圧力により均衡を保つ。該モデルによれば、このような超微粒気泡の形成は、イオン成分を必要とし、ある態様では、粒子間の衝突媒介した会合は、より大きな秩序クラスター（配列）の形成を提供し得る（同上）。
帯電安定化した超微粒気泡モデルは、粒子が、ガス超微粒であり得ることを示唆するが、周囲大気と平衡状態にあるイオン溶液中のこのような構造の自然形成のみ企図し、酸素が、このような構造を形成することができるかどうかに関して、特性化されておらず、かつ未特定のままであり、同様に、溶媒和電子が、このような構造により会合および／または安定化され得るかどうかに関しても、未特定のままである。
特定の態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む本発明の界面動電流体は、新規であり、超微粒気泡モデルに従って、仮定非界面動電、大気の帯電安定化超微粒気泡構造とは基本的には異なる。注目すべきは、対照食塩溶液は、本明細書に開示される生物学的特性を持たないが、その一方で、出願者の帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の新規の生物学的活性形態を提供するという事実に、少なくとも一部分において由来する、本結論は、避けられない状態である。
本発明の特定の態様によれば、出願者の新規の界面動電デバイスおよび方法は、大気と平衡状態にあるイオン流体、またはいずれの非界面動電的に生成された流体中で自発的に発生し得る、または発生し得ない、任意の量を超えて、かなりの量の帯電安定化したナノ構造を含む、新規の界面動電的に改変された流体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造は、帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含む。追加の態様では、帯電安定化したナノ構造は、全て、もしくは実質的に全ての帯電安定化した酸素含有のナノ構造である、または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、界面動電流体中で主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である。
なお更なる態様によれば、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、溶媒和電子を含む、または持ち得、それによって、新規の安定化した溶媒和電子担体を提供する。特定の態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、電極の新型（または逆電極）を提供し、単一の有機配位カチオンを有する従来の溶質電極と対照的に、むしろ、空隙または酸素原子を含有する空隙周辺に安定的に配列された複数のカチオンを有し、配列されたナトリウムイオンは、有機分子によってよりはむしろ、水の水和殻によって配位される。特定の態様によれば、溶媒和電子は、水分子の水和殻により収容され得る、または好ましくは、全てのカチオンにわたって分布するナノ構造の空隙内で収容され得る。ある態様では、本発明のナノ構造は、複数の配列したナトリウムカチオンにわたって溶媒和電子（一連のナトリウム原子および少なくとも１つの酸素原子にわたって分布する溶媒和電子）の分布／安定化を提供するだけでなく、空隙中の閉じ込め（ｃａｇｅｄ）酸素分子（単数または複数）と溶媒和電子の会合または部分会合を提供することにより、溶液中の新規の「スーパー電極」を提供する。したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電流体と関連して現在開示されるように、「溶媒和電子」は、水分子による直接水和を含む従来のモデルにおいて溶媒和され得ない。代替として、乾燥電極塩を用いた限定された例では、本発明の界面動電流体中の溶媒和電子は、水溶液中の高度な秩序配列を安定化させるために、「格子接着（ｌａｔｔｉｃｅ ｇｌｕｅ）」を提供するように複数の帯電安定化したナノ構造にわたって分布され得る。
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用することが可能である。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用することが可能である。
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、帯電および／もしくは帯電効果提供者（送達）として、ならびに／または帯電および／もしくは帯電効果受容者として、細胞膜もしくはその構成要素、またはタンパク質等と相互作用する。特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または溶媒和電子を持つ帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、生物学的活性を媒介するために、帯電および／もしくは帯電効果提供者として、ならびに／または帯電および／もしくは帯電効果受容者として、細胞膜と相互作用する。
特定の態様では、本発明の帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、本発明の界面動電流体の観察された安定性および生物学的特性と一致し、かつ説明し、そして、イオン水溶液（例えば、食塩溶液、ＮａＣｌ等）中の安定化した溶媒和電子を提供する、新規の電極（または逆電極）を更に提供する。
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、帯電安定化した酸素含有ナノバブルを実質的に含み、その形態をとる、またはそれを発生させることができる。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有クラスターは、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の相対的に大きい配列、および／または帯電安定化した酸素含有ナノバブルもしくはそれらの配列の形成を提供する。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、疎水性表面と接触する際、疎水性ナノバブルの形成を提供することができる（実施例２５の項で、本明細書のいずれかの箇所を参照のこと）。
特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、実質的に、少なくとも１つの酸素分子を含む。ある態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、実質的に、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、またはそれ以上の酸素分子を含む。特定の態様では、帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、約２０ｎｍ×１．５ｎｍのナノバブル（例えば、疎水性ナノバブル）を含む、または発生し、約１２個の酸素分子（例えば、酸素分子の大きさ（約０．３ｎｍ×０．４ｎｍ）、理想気体の状態方程式ｎ＝ＰＶ／ＲＴに基づき、ここで、Ｐ＝１ａｔｍ、Ｒ＝０．０８２ ０５７ ｌ．ａｔｍ／ｍｏｌ．Ｋ；Ｔ＝２９５Ｋ；Ｖ＝ｐｒ２ｈ＝４．７×１０−２２Ｌ、ここで、ｒ＝１０×１０−９ｍ、ｈ＝１．５×１０−９ｍ、およびｎ＝１．９５×１０−２２モル）を含む。
ある態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、このようなナノ構造、またはそれらの配列にある流体中に存在する、酸素分子の割合は、０．１％、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である。好ましくは、この割合は、約５％以上、約１０％以上、約１５％以上、または約２０％以上である。追加の態様では、イオン水性流体中の帯電安定化構造を有する、帯電安定化した酸素含有のナノ構造の実質的な大きさ、またはそれらの配列は、１００ｎｍ、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、５ｎｍ、４ｎｍ、３ｎｍ、２ｎｍ、および１ｎｍ未満からなる群から選択される大きさである。好ましくは、この大きさは、約５０ｎｍ未満、約４０ｎｍ未満、約３０ｎｍ未満、約２０ｎｍ未満、または約１０ｎｍ未満である。
ある態様では、本発明の界面動電流体は、溶媒和電子を含む。更なる態様では、本発明の界面動電流体は、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列を含み、これらは、溶媒和電子（単数または複数）、および特異な電荷分布（極性、対称、非対称の電荷分布）のうちの少なくとも１つを含む。ある態様では、帯電安定化したナノ構造および／または帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列は、常磁性を有する。
対照的に、本発明の界面動電流体に関連して、対照加圧ポット含酸素流体（非界面動電流体）等は、このような帯電安定化した生物学的活性ナノ構造および／または生物学的活性帯電安定化した酸素含有のナノ構造、および／またはそれらの配列を含まず、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調整が可能である。
ガス富化流体を生成するシステム
現在開示されるシステムおよび方法は、最小の受動的損失を伴う高濃度で、ガス（例えば、酸素）を安定的に富化させることが可能である。このシステムおよび方法は、多種多様の流体に、高い割合で、多種多様のガスを富化するために効果的に使用され得る。例示のみとして、室温で、一般に、約２〜３ｐｐｍ（ｐｐｍ）の溶解酸素のレベルを有する、脱イオン水は、開示されたシステムおよび／または方法を用いて、少なくとも約５ｐｐｍ、少なくとも約１０ｐｐｍ、少なくとも約１５ｐｐｍ、少なくとも約２０ｐｐｍ、少なくとも約２５ｐｐｍ、少なくとも約３０ｐｐｍ、少なくとも約３５ｐｐｍ、少なくとも約４０ｐｐｍ、少なくとも約４５ｐｐｍ、少なくとも約５０ｐｐｍ、少なくとも約５５ｐｐｍ、少なくとも約６０ｐｐｍ、少なくとも約６５ｐｐｍ、少なくとも約７０ｐｐｍ、少なくとも約７５ｐｐｍ、少なくとも約８０ｐｐｍ、少なくとも約８５ｐｐｍ、少なくとも約９０ｐｐｍ、少なくとも約９５ｐｐｍ、少なくとも約１００ｐｐｍ、またはいずれかの値以上もしくはそれらの間の範囲の溶解酸素のレベルを達成することができる。特定の例示的な実施形態に従って、酸素富化水は、溶解酸素の約３０〜６０ｐｐｍのレベルで生成され得る。
投与経路および形態
本明細書で使用される「対象」は、いずれの生物体、好ましくは、動物、更に好ましくは、哺乳類、およびなお更に好ましくは、ヒトを指し得る。
特定の例示的な実施形態では、本発明のガス富化流体は、治療組成物が、インスリン耐性および／または糖尿病に関連する障害のうちの少なくとも１つの症状を予防または緩和するように、単独で、または別の治療剤と組み合わせて、治療組成物として機能することができる。本発明の治療組成物は、それを必要とする対象に投与することができる、組成物を含む。ある実施形態では、治療組成物製剤はまた、担体、アジュバント、乳化剤、懸濁剤、甘味料、香味料、香料、および結合剤からなる群から選択される、少なくとも１つの添加剤も含むことができる。
本明細書で使用される「医薬的に許容可能な担体」および「担体」は、概して、非毒性の、不活性固体、半固体、もしくは液体の充填剤、希釈剤、封入物質、またはあらゆる型の製剤補助物質を指す。医薬的に許容可能な担体としての機能を果たし得る物質の幾つかの限定されない例としては、ラクトース、グルコース、およびスクロース等の糖類；コーンスターチおよびポテトスターチ等のデンプン；セルロース、およびその誘導体である、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース等；トラガカント粉末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび坐薬用ワックス等の賦形剤；ピーナッツオイル、綿実油、紅花油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油等の油類；プロピレングリコール等のグリコール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル等のエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水、リンゲル液、エチルアルコールおよびリン酸緩衝溶液；ならびにラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム等の他の非毒性の適合する滑沢剤；着色剤；放出剤；コーティング剤；甘味料；香味料および香料であり、配合者の判断に従って、保存料および抗酸化剤もまた、組成物中に存在してもよい。特定の態様では、このような担体および賦形剤は、本発明のガス富化流体または溶液であってもよい。
本明細書に記載の医薬的に許容可能な担体としては、例えば、ビヒクル、アジュバント、賦形剤、または希釈剤は、当業者には既知である。一般に、医薬的に許容可能な担体は、治療剤に対して化学的に不活性であり、使用条件下で、有害な副作用または毒性がない。医薬的に許容可能な担体は、ポリマーおよびポリマーマトリックス、ナノ粒子、超微粒気泡等を含み得る。
本発明の治療ガス富化流体に加えて、治療組成物は、追加の非ガス富化水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油（特に、綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚芽油、オリーブ油、ひまし油、およびごま油）、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタンの脂肪酸エステル、ならびにこれらの組み合わせを更に含み得る。当業者により明らかであるように、特定の治療組成物の新規の改善された製剤、新規のガス富化治療流体、および新規のガス富化治療流体を送達する新規の方法は、同一の、同様の、または異なる組成物のガス富化流体と１つ以上の不活性希釈剤を差し替えることにより得られ得る。例えば、従来の水は、ガス富化流体を提供するために、水もしくは脱イオン水に酸素を混合することにより生成されたガス富化流体により差し替える、または補完され得る。
ある実施形態では、本発明のガス富化流体は、１つ以上の治療剤と組み合わせ得る、および／または単独で使用され得る。特定の実施形態では、ガス富化流体を抱合することは、脱イオン水、食塩溶液等の当該技術分野において既知の１つ以上の溶液を、１つ以上のガス富化流体を差し替えることを含み、それによって、対象に送達するための改善された治療組成物を提供し得る。
ある実施形態は、本発明のガス富化流体、医薬組成物、もしくは他の治療剤、またはその医薬的に許容可能な塩もしくは溶媒、ならびに少なくとも１つの医薬担体もしくは希釈剤を含む、治療組成物を提供する。これらの医薬組成物は、前述の疾患または状態の予防および治療、ならびに上記のように、治療法において、使用され得る。好ましくは、担体は、医薬的に許容可能であらなければならず、適合する、即ち、組成物中の他の成分において有害効果がないものでなければならない。担体は、固体または液体であり得、好ましくは、単位用量の製剤、例えば、０．０５〜９５重量％の活性成分を含有し得る錠剤として、製剤化される。
可能な投与経路としては、経口、舌下、口腔、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内腹腔内、膀胱内、髄腔内、または静脈内）、直腸、局所（経皮、膣内、眼球内、耳内、鼻腔内、移植可能なデバイスまたは物質の吸入、および注射もしくは挿入を含む）が含まれる。
投与経路
特定の対象に対する投与の最適な手段は、治療され得る疾患もしくは状態の性質および重症度、または使用され得る治療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療剤の性質により異なり得る。ある実施形態では、経口または局所投与が好ましい。
経口投与に好適な製剤は、それぞれ既定量の活性化合物を含有する、錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、トローチ剤、またはゲルコーティングされたアンプルのような個別単位として、粉末または顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、提供し得る。
舌下または口腔投与等による経粘膜的方法に好適な製剤は、活性化合物および一般に香味ベース、例えば、砂糖およびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤、パッチ剤、錠剤等、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースアカシアのような不活性ベース中に活性化合物を含むペーストリー剤を含む。
非経口投与に好適な製剤は、一般に、既定濃度の活性ガス富化流体および可能な別の治療剤を含有する滅菌水溶液を含み、溶液は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液と等張である。非経口投与に好適な更なる製剤は、界面活性剤およびシクロデキストリン等の生理的に好適な共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤を含む。水中油型乳剤はまた、ガス富化流体の非経口投与用の製剤に好適であり得る。このような溶液は、好ましくは、静脈内投与されるが、皮下または筋肉内注射により投与されてもよい。
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤は、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、吸収性固形物質、潅水等を含む。該製剤は、座薬ベースを形成する１つ以上の固体担体、例えば、ココアバター中に、活性成分を含む、単位用量座薬として提供するのが好ましい。代替として、本発明のガス富化流体を用いた結腸洗浄は、結腸または直腸投与用に製剤化され得る。
局所、眼球内、または鼻内投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ゲル剤（ヒドロゲル等）、スプレー剤、分散性粉末および顆粒、エマルジョン、流動噴射剤を用いたスプレー剤またはエアロゾル（例えば、リポソームスプレー剤、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤等）、ならびに油を含む。このような製剤に好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせを含む。経鼻または鼻腔内投与は、定量のこれらの製剤またはその他のいずれかを含み得る。同様に、鼻内または眼球内は、点滴剤、軟膏、刺激流体（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ）等を含み得る。
本発明の製剤は、あらゆる好適な方法、一般に、液体もしくは微粉化した固体担体、またはその双方を有する活性化合物を、ガス富化流体と、必要とされる比率で均一かつ緊密に任意に混合し、次いで、必要であれば、得られた混合物を所望の形状に付形することにより調製され得る。
例えば、錠剤は、活性成分の粉末または顆粒、および１つ以上の任意成分、例えば、結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む均質混合物を圧縮するか、または粉末活性成分および本発明のガス富化流体の均質混合物を成形することにより調製し得る。
吸入による投与に好適な製剤は、種々の型の定量加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含む。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
口からの肺投与に関しては、気管支樹への送達を確実にするために、粉末または溶滴の粒度は、一般に、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。鼻投与に関しては、鼻腔における保留を確実にするために、１０〜５００μＭの粒度が好ましい。
定量吸入器は、液化噴射剤中の治療剤の懸濁液または溶液製剤を一般に含有する加圧エアロゾルディスペンサーである。ある実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明のガス富化流体が、標準液化噴射剤に加えて、またはその代わりに、使用され得る。使用の際に、これらのデバイスは、計量した量、一般に１０〜１５０μＬを送達するように適合させた弁を経て製剤を放出して、治療剤およびガス富化流体を含有する微粒子噴霧を生じる。好適な噴射剤は、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物を含む。
製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、エタノール界面活性剤、例えば、オレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、酸化防止剤、および好適な風味剤を更に含有し得る。ネブライザーは、商業的に入手可能なデバイスであり、それは、狭いベンチュリ穴を通る圧縮ガス（一般に空気または酸素）の加速によるか、あるいは超音波撹拌のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療エアロゾルミストに変換するデバイスである。ネブライザーで用いるのに好適な製剤は、ガス富化流体中の別の治療剤からなり、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満を含む。加えて、他の担体は、一般に、蒸留水、滅菌水、または希釈水性アルコール溶液等を利用し、好ましくは、例えば、塩化ナトリウム等の塩の添加により、体液と等張にされるものであり得る。任意の添加剤は、特に、製剤が滅菌調製されていない場合は、防腐剤を含み、メチルヒドロキシ−ベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、および界面活性剤を含み得る。
吸入による投与に好適な製剤は、吸入器により送達されるか、または鼻からの吸入により鼻腔に取り入れられ得る微粉砕散剤を含む。吸入器において、散剤を、一般にゼラチンまたはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに入れ、それらを原位置で突き刺すかまたは開けて、散剤が、吸入時にデバイスから引き出される空気によるか、または手動ポンプにより送達される。吸入器において採用される散剤は、活性成分だけからなるか、または活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトース、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、一般に、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。
上に具体的に言及された成分に加えて、本発明の製剤は、課題となる製剤の型を考慮して、当業者には既知の他の薬剤を含み得る。例えば、経口投与に好適な製剤は、香味料を含み得、経鼻投与に好適な製剤は、香料を含み得る。
本発明の治療組成物は、個々の治療剤として、あるいは、治療剤と組み合わせて、調合薬と共に使用可能なあらゆる従来の方法により投与され得る。
当然のことながら、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびに投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態、および体重；症状の性質および範囲；同時治療の種類；治療頻度；ならびに所望の効果のような既知の要因により異なり得る。活性成分の１日投与量は、体重の１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量であることが期待され得る。
用量形態（投与に好適な組成物）は、単位あたり活性成分の約１ｍｇ〜約５００ｍｇを包含する。これらの医薬組成物では、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づいて、約０．５〜９５重量％の量で存在し得る。
軟膏、ペースト剤、フォーム剤、咬合剤（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、クリーム剤、およびゲル剤はまた、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、シリカ酸、およびタルク、またはこれらの混合物のような賦形剤も含有し得る。散剤およびスプレー剤はまた、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物のような賦形剤も含有し得る。ナノ結晶抗菌性金属の溶液は、エアロゾル医薬品を製造するために日常的に使用される既知の手段のいずれかによりエアロゾルまたはスプレー剤に変換され得る。概して、このような方法は、通常、不活性担体ガスを用いて、溶液の容器を加圧すること、または加圧するための手段を提供すること、および小さい穴から加圧したガスを通過させることを含む。スプレー剤は、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガス等の常用の噴射剤を更に含有し得る。加えて、ミクロスフェアまたはナノ粒子は、対象に治療化合物を投与するために必要とされるいずれかの経路において、本発明のガス富化治療組成物または流体と共に採用され得る。
注射用製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量を密閉した容器中に存在し得、使用直前に、滅菌液体賦形剤、またはガス富化流体の添加物のみに必要とされるフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。注射可能な組成物のために効果的な医薬担体の必要条件は、当業者には公知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照のこと。
局所投与に好適な製剤としては、本発明のガス富化流体および任意に追加の治療および香味、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性ベース中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むパステル剤；好適な液体キャリア中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むうがい薬または含嗽液；ならびにクリーム剤、エマルジョン、ゲル剤等が挙げられる。
さらに、直腸投与に好適な製剤は、乳化ベースまたは水溶性ベースのような様々なベースと混合することにより座薬として示され得る。膣内投与に好適な製剤としては、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、または活性成分に加えて、キャリア等を含有するスプレー剤として示され得る。
好適な医薬担体は、本分野における標準的な参照テキスト「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）」に記載されている。
本発明の文脈において、対象、特に、動物、具体的には、ヒトへの投与される用量は、適当なタイムフレームにおいて動物の治療反応に影響を及ぼすのに十分であるべきである。当業者は、投与量は、動物の状態、動物の体重、ならびに治療されるべき状態を含む、様々な要因により異なり得ることを理解されよう。好適な用量は、所望の反応に影響を及ぼすことが知られている、対象における、治療組成物の濃度をもたらし得るものである。
用量の大きさはまた、投与の経路、タイミングおよび頻度、ならびに治療組成物の投与および所望の生理的効果を伴い得る、いかなる副作用の存在、性質、および範囲によっても決定され得る。
特定の対象に対する投与の最適な手段は、治療され得る疾患もしくは状態の性質および重症度、または使用され得る治療法の性質、ならびに治療組成物もしくは追加の治療剤の性質により異なり得る。ある実施形態では、経口または局所投与が好ましい。
経口投与に好適な製剤は、それぞれ既定量の活性化合物を含有する、錠剤、カプセル、カシェ剤、シロップ、エリキシル剤、チューインガム、「ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）」剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、トローチ剤、またはゲルコーティングされたアンプルのような個別単位として、粉末または顆粒として、水性もしくは非水性液体中の溶液もしくは懸濁液として、または水中油型乳剤もしくは油中水型乳剤として、提供し得る。
経口投与に好適な更なる製剤は、多種の定量加圧エアロゾル、噴霧器、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る、微粒子粉末またはミスト剤を含むように提供され得る。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
舌下または口腔投与等による経粘膜的方法に好適な製剤は、活性化合物および一般に香味ベース、例えば、砂糖およびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤、パッチ剤、錠剤等、ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースアカシアのような不活性ベース中に活性化合物を含むパステル剤を含む。
非経口投与に好適な製剤は、一般に、既定濃度の活性ガス富化流体および可能な別の治療剤を含有する滅菌水溶液を含み、溶液は、好ましくは、対象とするレシピエントの血液を含んだ等張液である。非経口投与に好適な更なる製剤は、界面活性剤およびシクロデキストリン等の生理的に好適な共溶媒および／または錯化剤を含有する製剤を含む。水中油型乳剤はまた、ガス富化流体の非経口投与用の製剤に好適であり得る。このような溶液は、好ましくは、静脈内投与されるが、皮下または筋肉内注射により投与されてもよい。
尿道、直腸、または膣内投与に好適な製剤は、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤、水性もしくは油性懸濁液、分散性粉末もしくは顆粒、エマルジョン、吸収性固形物質、潅水等を含む。該製剤は、座薬ベースを形成する１つ以上の固体担体、例えば、ココアバター中に、活性成分を含む、単位用量座薬として提供するのが好ましい。代替として、本発明のガス富化流体を用いた結腸洗浄は、結腸または直腸投与用に製剤化され得る。
局所、眼球内、または鼻内投与に好適な製剤は、軟膏、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤、ゲル剤（ヒドロゲル等）、スプレー剤、分散性粉末および顆粒、エマルジョン、流動噴射剤を用いたスプレー剤またはエアロゾル（例えば、リポソームスプレー剤、点鼻剤、鼻腔用スプレー剤等）、ならびに油を含む。このような製剤に好適な担体は、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびこれらの組み合わせを含む。経鼻または鼻腔内投与は、定量のこれらの製剤またはその他のいずれかを含み得る。同様に、鼻内または眼球内は、点滴剤、軟膏、刺激流体（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ ｆｌｕｉｄ）等を含み得る。
本発明の製剤は、あらゆる好適な方法、一般に、液体もしくは微粉化した固体担体、またはその双方を有する活性化合物を、ガス富化流体と、必要とされる比率で均一かつ緊密に任意に混合し、次いで、必要であれば、得られた混合物を所望の形状に付形することにより調製され得る。
例えば、錠剤は、活性成分の粉末または顆粒、および１つ以上の任意成分、例えば、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤または界面活性分散剤を含む均質混合物を圧縮するか、または粉末活性成分および本発明のガス富化流体の均質混合物を成形することにより調製し得る。
吸入による投与に好適な製剤は、種々の型の定量加圧エアロゾル、噴霧器、ネブライザー、または吸入器を用いて発生し得る微粒子粉末またはミスト剤を含む。特に、治療剤の粉末または他の化合物は、本発明のガス富化流体中に溶解または懸濁され得る。
口からの肺投与に関しては、気管支樹への送達を確実にするために、粉末または溶滴の粒度は、一般に、０．５〜１０μＭ、好ましくは１〜５μＭである。鼻投与に関しては、鼻腔における保留を確実にするために、１０〜５００μＭの粒度が好ましい。
定量吸入器は、液化噴射剤中の治療剤の懸濁液または溶液製剤を一般に含有する加圧エアロゾルディスペンサーである。ある実施形態では、本明細書に開示されるように、本発明のガス富化流体は、標準液化噴射剤に加えて、またはその代わりに、使用され得る。使用の際に、これらのデバイスは、計量した量、一般に１０〜１５０μＬを送達するように適合させた弁を経て製剤を放出して、治療剤およびガス富化流体を含有する微粒子噴霧を生じる。好適な噴射剤は、特定のクロロフルオロカーボン化合物、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、およびこれらの混合物を含む。
製剤は、１つ以上の共溶媒、例えば、エタノール界面活性剤、例えば、オレイン酸または三オレイン酸ソルビタン、酸化防止剤、および好適な風味剤を更に含有し得る。ネブライザーは、商業的に入手可能なデバイスであり、それは、狭いベンチュリ穴を通る圧縮ガス（一般に空気または酸素）の加速によるか、あるいは超音波撹拌のいずれかにより、活性成分の溶液または懸濁液を治療エアロゾルミストに変換するデバイスである。ネブライザーで用いるのに好適な製剤は、ガス富化流体中の別の治療剤からなり、製剤の４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗ未満を含む。加えて、他の担体は、蒸留水、滅菌水、または希釈水性アルコール溶液等を利用し、好ましくは、例えば、塩化ナトリウム等の塩の添加により、体液と等張にされるものであり得る。任意の添加剤は、特に、製剤が滅菌調製されていない場合は、防腐剤を含み、メチルヒドロキシ−ベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発油、緩衝剤、および界面活性剤を含み得る。
吸入による投与に好適な製剤は、吸入器により送達されるか、または鼻からの吸入により鼻腔に取り入れられ得る微粉砕散剤を含む。吸入器において、散剤を、一般にゼラチンまたはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジに入れ、それらを原位置で突き刺すかまたは開けて、散剤が、吸入時にデバイスから引き出される空気によるか、または手動ポンプにより送達される。吸入器において採用される散剤は、活性成分だけからなるか、または活性成分、好適な粉末希釈剤、例えばラクトース、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、一般に、製剤の０．１〜１００ｗ／ｗを含む。
上に具体的に言及された成分に加えて、本発明の製剤は、課題となる製剤の型を考慮して、当業者には既知の他の薬剤を含み得る。例えば、経口投与に好適な製剤は、香味料を含み得、経鼻投与に好適な製剤は、香料を含み得る。
本発明の治療組成物は、個々の治療剤として、あるいは、治療剤と組み合わせて、調合薬と共に使用可能なあらゆる従来の方法により投与され得る。
当然のことながら、投与される用量は、特定の薬剤の薬力学的特性、ならびに投与の様式および経路；レシピエントの年齢、健康状態、および体重；症状の性質および範囲；同時治療の種類；治療頻度；ならびに所望の効果のような既知の要因により異なり得る。活性成分の１日投与量は、体重の１キログラム（ｋｇ）あたり約０．００１〜１０００ミリグラム（ｍｇ）であり、好ましくは、０．１〜約３０ｍｇ／ｋｇの用量であることが期待され得る。ある態様によれば、活性成分の１日投与量は、０．００１リットル〜１０リットルであり、好ましくは約０．０１リットル〜１リットルであり得る。
用量形態（投与に好適な組成物）は、単位あたり活性成分の約１ｍｇ〜約５００ｍｇを包含する。これらの医薬組成物では、活性成分は、通常、組成物の総重量に基づいて、約０．５〜９５重量％の量で存在し得る。
軟膏、ペースト剤、フォーム剤、咬合剤（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）、クリーム剤、およびゲル剤はまた、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、シリコン、ベントナイト、シリカ酸、およびタルク、またはこれらの混合物のような賦形剤も含有し得る。散剤およびスプレー剤はまた、ラクトース、タルク、シリカ酸、水酸化アルミニウム、およびケイ酸カルシウム、またはこれらの物質の混合物のような賦形剤も含有し得る。ナノ結晶抗菌性金属の溶液は、エアロゾル医薬品を製造するために日常的に使用される既知の手段のいずれかによりエアロゾルまたはスプレー剤に変換され得る。概して、このような方法は、通常、不活性担体ガスを用いて、溶液の容器を加圧すること、または加圧するための手段を提供すること、および小さい穴から加圧したガスを通過させることを含む。スプレー剤は、窒素、二酸化炭素、および他の不活性ガス等の常用の噴射剤を更に含有し得る。加えて、ミクロスフェアまたはナノ粒子は、対象に治療化合物を投与するために必要とされるいずれかの経路において、本発明のガス富化治療組成物または流体と共に採用され得る。
注射用製剤は、アンプルおよびバイアル等の単位用量または多用量を密閉した容器中に存在し得、使用直前に、滅菌液体賦形剤、またはガス富化流体の添加物のみに必要とされるフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保管され得る。即時注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒、および錠剤から調製され得る。注射可能な組成物のために効果的な医薬担体の必要条件は、当業者には公知である。例えば、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，Ｅｄｓ．，２３８−２５０（１９８２）およびＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，６２２−６３０（１９８６）を参照のこと。
局所投与に好適な製剤としては、本発明のガス富化流体および任意に追加の治療および香味、通常、スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むトローチ剤；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性ベース中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むパステル剤；好適な液体キャリア中のガス富化流体および任意に追加の治療剤を含むうがい薬または含嗽液；ならびにクリーム剤、エマルジョン、ゲル剤等が挙げられる。
さらに、直腸投与に好適な製剤としては、乳化ベースまたは水溶性ベースのような様々なベースと混合することにより座薬として示され得る。膣内投与に好適な製剤としては、ペッサリー、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、ペースト剤、フォーム剤、または活性成分に加えて、担体等を含有するスプレー剤として示され得る。
好適な医薬担体は、本分野における標準的な参照テキスト「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ）」に記載されている。
本発明の文脈において、対象、特に、動物、具体的には、ヒトへの投与される用量は、適当なタイムフレーム上で動物の治療反応に影響を及ぼすのに十分であるべきである。当業者は、投与量は、動物の状態、動物の体重、ならびに治療されるべき状態を含む、様々な要因により異なり得ることを理解されよう。好適な用量は、所望の反応に影響を及ぼすことが知られている、対象における、治療組成物の濃度をもたらし得るものである。
用量の大きさはまた、投与の経路、タイミングおよび頻度、ならびに治療組成物の投与および所望の生理的効果を伴い得る、いかなる副作用の存在、性質、および範囲によっても決定され得る。
組み合わせの化合物は、（１）共製剤における化合物の組み合わせにより同時に、または（２）別々の医薬製剤において、交代で、即ち、連続的に、順次に、並行で、または同時に、送達することにより、投与され得ることが認識されよう。交互の治療において、第２、および任意に第３の活性成分の投与の遅延が、活性成分の組み合わせの相乗的な治療効果の利益を損失するべきではない。（１）あるいは（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態によれば、理想的には、組み合わせは、最も有効な結果を達成するように投与されるべきである。（１）あるいは（２）のいずれかの投与方法によるある実施形態では、理想的には、組み合わせは、活性成分のそれぞれのピーク血漿濃度を達成するように投与されるべきである。組み合わせ共製剤の投与による１日に１回１錠レジメン（ｏｎｅ ｐｉｌｌ ｏｎｃｅ−ｐｅｒ−ｄａｙ ｒｅｇｉｍｅｎ）は、炎症性神経変性疾患に罹患している何人かの患者に実行可能であり得る。ある実施形態によれば、組み合わせの活性成分の効果的なピーク血漿濃度は、約０．００１〜１００μＭの範囲であり得る。最適なピーク血漿濃度は、特定の患者について処方される製剤および投与レジメンにより達成され得る。本発明の流体およびグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブ、またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体は、同時に与えられるか、または順次与えられるかいずれにせよ、個々に、複数で、または任意のこれらの組み合わせで、投与され得ることもまた理解されよう。概して、交互の治療（２）の間、有効投与量の各化合物は連続的に投与され、共製剤治療（１）においては、有効投与量の２つ以上の化合物が、一緒に投与される。
本発明の組み合わせは、単位投薬形態において、医薬製剤として都合よく示され得る。都合の良い単位投与製剤は、それぞれ、１ｍｇ〜１ｇの任意の量（例えば、１０ｍｇ〜３００ｍｇであるが、これに限定されない）で活性成分を含む。グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブと組み合わせた、本発明の流体の相乗効果は、広い比にわたって、例えば、１：５０〜５０：１（本発明の流体：グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブ）実現され得る。１つの実施形態では、該比は、１：１０〜１０：１の範囲であり得る。別の実施形態では、丸剤、錠剤、キャプレット、またはカプセル剤のような共製剤の組み合わせ投与形態における、グラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブに対する本発明の流体の重量／重量比は、約１、即ち、ほぼ等量の本発明の流体ならびにグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブであり得る。他の例示的な共製剤では、より多いか、または少ない本発明の流体ならびにグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブが存在し得る。１つの実施形態では、各化合物は、単独で使用される場合に抗炎症活性を示す量で組み合わせて利用され得る。前記組み合わせの化合物の他の比および量は、本発明の範囲内で企図される。
単位投薬形態は、本発明の流体ならびにグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブ、またはこれらのいずれかの生理学的に機能的な誘導体、ならびに医薬的に許容し得るキャリアを更に含み得る。
処置で使用するのに必要とされる本発明の組み合わせ中の活性成分の量は、処置されている状態の性質、ならびに患者の年齢および状態を含む、様々な要因に従って変化し、最終的には、主治医または健康管理者の自由裁量であることが、当業者には、認識されよう。考慮されるべき要因としては、投与経路および製剤の性質、動物の体重、年齢および全身状態、ならびに処置されるべき疾患の性質および重篤度が挙げられる。
同時投与または順次投与のための単位投与形態にある任意の２つの活性成分と、第３の活性成分とを組み合わせることも可能である。３つの部分の組み合わせは、同時にまたは順次投与され得る。順次投与される場合、この組み合わせは、２つまたは３つの投与物で投与され得る。ある実施形態によれば、本発明の流体ならびにグラチラマー酢酸塩、インターフェロン−β、ミトキサントロン、および／もしくはナタリズマブの３つの部分の組み合わせは、任意の順序で投与され得る。
以下の実施例は、例示のためののみに意図され、決して限定することは意図されない。
実施例１
溶解酸素安定性
図３０に示されるように、それぞれ栓をし、華氏６５度で保管された、５００ｍＬの薄壁のプラスチックボトルと１，０００ｍＬのガラス瓶中の溶解酸素レベルが示されている。
図に示されるように、瓶詰めしてから約６５日後、プラスチックボトルを開口する場合、水中の溶解酸素レベルは、約２７．５ｐｐｍであった。瓶詰めしてから約９５日後、第２のボトルを開口する場合、該溶解酸素レベルは、約２５ｐｐｍである。同様に、ガラス瓶に関しては、該溶解酸素レベルは、６５日で、約４０ｐｐｍで、９５日で、約４１ｐｐｍであった。したがって、このチャートは、プラスチックボトルおよびガラス瓶内での双方の溶解酸素レベルは、記載されたシステムおよび方法を用いて、酸素を流体内で拡散する場合、華氏６５度で、相対的に高率で維持されることを示す。
実施例２
平衡塩類溶液中の減衰した酸素含有量
図３３は、最初に、５ｐｐｍの溶解酸素レベルを有した５００ｍＬの平衡塩類溶液の溶解酸素保持率を示す。本発明の拡散器を用いて、標準温度と標準気圧で溶液の富化をした後、溶解酸素レベルは、約４１ｐｐｍであった。該溶液は、別のガラス瓶中に保管した。１時間後、溶解酸素レベルは、４０ｐｐｍ、２時間後、３６ｐｐｍ、３時間後、３４ｐｐｍ、約４時間半後、３０ｐｐｍをわずかに超えた。６時間少し前に、最終測定を行い、この時点で、溶解酸素レベルは、約２８ｐｐｍであった。
実施例３
超微粒気泡サイズ
実験は、ガス超微粒気泡サイズの限界を決定するために、本発明の拡散器を用いることにより、ガス富化流体を使用して行われた。超微粒気泡サイズの限界は、ガス富化流体を０．２２〜０．１ミクロンのフィルタに通過させることにより確定された。これらの試験を行う際、多量の流体が、本発明の拡散器を通過し、ガス富化流体を生成した。６０ミリリットルの本流体は、６０ｍＬの注射器に流出した。その後、注射器内の流体の溶解酸素レベルは、ウインクラー滴定法により測定された。注射器内の流体は、０．２２ミクロンのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｌｅｘ ＧＰ５０フィルタを通して、５０ｍＬのビーカーに注入された。その後、５０ｍＬのビーカー中の物質の酸素の溶解速度を測定した。実験を３回行って、下の表６に示される結果を達成した。
表に見られるように、注射器内で測定された溶解酸素レベルおよび５０ｍＬのビーカー内で測定された溶解酸素レベルは、拡散された物質を０．２２ミクロンフィルタに通過させることにより有意に変化せず、これは、流体内の溶解ガスの超微粒気泡は、０．２２ミクロン以上ではなかったことを意味する。
食塩溶液のバッチが、本発明の拡散器で富化され、出力溶液のサンプルが、濾過されていない状態で収集された、２回目の試験を行った。濾過されていないサンプルの溶解酸素レベルは、４４．７ｐｐｍであった。０．１ミクロンフィルタを使用して、本発明の拡散器からの酸素富化溶液を濾過し、２つの追加のサンプルを得た。第１のサンプルに関しては、溶解酸素レベルは、４３．４ｐｐｍであった。第２のサンプルに関しては、溶解酸素レベルは、４１．４ｐｐｍであった。最後に、フィルタを除去し、濾過されていない溶液から最終サンプルを得た。この際、最終サンプルは、４５．４ｐｐｍの溶解酸素レベルがあった。これらの結果は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅの０．２２ミクロンフィルタを使用したものと一致した。したがって、気泡、または食塩溶液内の超微粒気泡の大部分は、約０．１ミクロン未満の大きさであった。
実施例４
スパージング効果
図３４および３５は、それを通過する流体における本発明の拡散器のスパージング効果を示す。酸素富化水のスパージングは、標準温度と標準気圧で、８ガロンのタンク中で発生した。示されるように、最初に、酸素富化水は、約４２ｐｐｍの溶解酸素レベルであった。拡散器を通過させてから２分後、溶解酸素レベルが、その後、２０ｐｐｍをわずかに超えるように、窒素は、酸素富化水をスパージングした。６分間で、溶解酸素レベルは、約６ｐｐｍであった。酸素富化水の溶解酸素レベルは、過程の開始から約１４分後、最小値のゼロ（０）をわずかに超えた。これらの図は、酸素を水からスパージングするように、窒素が、水に拡散され得る方法を示す。しかしながら、いずれのガスをいかなる流体内に使用しても、あるガスを他のガスからスパージングし、かつ流体に他のガスを拡散することが可能であった。同一の実験は、いかなる流体ホスト物質、およびいかなる流体注入物質に利用し得た。
実施例５
レイリー効果
本明細書に記載される拡散器を通して処理された流体は、通常の未処理水と比較した際、水の構造内での差異を示す。本明細書に開示される実施形態により作られたガス富化水は、未処理水と比較して、更にレイリー散乱を有することが示されている。
実行された実験では、ガス富化および不富化水のサンプルが調製され、光学的分析のために送られた。これらの試験の目的は、通常の（未処理の）脱イオン水と本発明の拡散デバイスにより富化された水との間で、何らかの全体の光学的差異があるかどうかを決定することである。
２つのサンプルは、秘密に特定を維持するためにコード化され、試験が完了した後のみ、サンプルを特定した。２つのサンプルは、図３７Ａに示される、略図に従って、６３３ナノメートルのレーザー光線に置いた。本明細書に開示のある実施形態に従って、ガス富化流体であるサンプルＢは、レーザー光線と相対的なその位置にかかわらず散乱光を示した。サンプルＢの流体は、約１週間、ガラス瓶中に密閉されていた。瓶を開口してから２〜３時間後、散乱効果は、消失した。したがって、ガス富化流体の構造は、未処理流体の構造とは光学的に異なる。光学的効果は、実験の開始時、溶解酸素レベルは、約４５ｐｐｍであり、実験の終了時は、約３２ｐｐｍであると推定されたため、溶解酸素レベルには、直接に関連しない。結果を図３７Ｂに示す。
実施例６
溶媒和電子の生成
また、追加の証拠は、本発明の拡散デバイスにより生成された富化過程が、ガス富化流体内で溶媒和電子をもたらすことを示している。ポーラログラフの溶解酸素プローブの結果により、拡散した流体は、電子捕獲効果を示すと考えられ、したがって、該流体は、ガス富化物質内に溶媒和電子を含んだ。
溶解酸素レベルを電気的に測定するための２つの基礎的技術：ガルバニック測定法およびポーラログラフ測定がある。各プロセスは、試験された溶液内の溶解酸素レベルを、電流を発生させるためにプローブのカソードと反応させる電極系を使用する。溶解酸素レベルセンサーは、２つの電極であるアノードおよびカソードから構成され、これらは共に、センサー本体内で電解質中に浸漬する。酸素透過性膜は、試験される溶液からアノードおよびカソードを分離する。酸素は、膜を横断して拡散し、電流を発生するためにプローブの内部成分と相互作用する。カソードは、水素電極であり、アノードに対して負電位を担持する。電解質溶液は、電極対に取り囲まれ、膜により含有される。酸素が存在しない場合、カソードは、水素により偏極され、電流の流れに抵抗する。酸素が膜を通過する場合、カソードは消極され、電子は消費される。カソードは、以下の等式に従って、水酸基イオンに酸素を電気化学的に還元される。
Ｏ２＋２Ｈ２Ｏ＝４Ｅ−＝４ＯＨ−
本発明のシステムに従って、ガス富化溶液の溶解酸素レベル測定を行う場合、オーバーフロー条件は、繰り返し認められ、溶解酸素メーターは、読み出し可能であるメーターよりも高い示度値を示す。しかしながら、ウインクラー滴定法によるガス富化溶液の評価は、プローブにより示されたものよりも溶液に対する溶解酸素（ＤＯ）レベルが低いことを示す。典型的には、ＤＯプローブ（これらの実験に使用されるオリオン８６２等）は、６０ｐｐｍの最大示度値がある。しかしながら、該メーターが、本発明のガス富化水に残留する場合、それは、溢出する。
行為のいかなる特定の機構に拘束されるわけではないが、メーターの機構は、酸素が反応する電子に反応する。しかしながら、電子スピン共鳴に従って、自由イオンは、流体中には存在しない。したがって、流体は、流体中にも存在する酸素種により安定化された溶媒和電子を含有すると推定される。
実施例７
体外の創傷治癒
ガス富化流体の効果（酸素で富化された）は、培養されたヒト表皮角化細胞が創傷をふさぐ能力に対して試験された。
ヒト表皮角化細胞は、通常の陰核切除から得、脱特定された、新生児包皮から単離された。包皮は、ＰＢＳ中で２回洗浄され、表皮から真皮を分離させるために、２．４Ｕ／ｍＬのＤｉｓｐａｓｅ ＩＩ中でインキュベートした。該表皮は、０．２５％トリプシン／１ｍＭ ＥＤＴＡでインキュベートし、大豆トリプシンインヒビターで中和し、撹拌し、７０ｕｍの篩を通過させ、細胞を分離した。次に、細胞懸濁液を遠心分離し、０．０７ｍＭ ＣａＣｌ２、ヒトケラチン生成細胞増殖補助剤（０．２％ヒドロコルチゾン、０．２ｎｇ／ｍＬヒト上皮細胞増殖因子）、およびペニシリン／ストレプトマイシン、アンフォテラシン（ａｍｐｈｏｔｅｒａｃｉｎ）抗生物質カクテルが補充された細胞培地（Ｍ１５４）中に再懸濁した。ケラチン生成細胞懸濁液は、コーティングしていない１２ウェル培養皿上に平板培養し、初期播種してから２４時間後、および４８時間ごとに、培地を取り換えた。
細胞合流に到達してから、無菌のｐ１０００ピペットチップを用いて線状の引っかき傷を形成し、均一の無細胞創傷を生じた。単層は、あらゆる細胞残屑を除去するために、ダルベッコＰＢＳで洗浄した。次いで、創傷単層を以下の培地でインキュベートした。ｉ）完全増殖培地（本実施例に上記される）、ｉｉ）酸素のないせん断されたバージョンの食塩水を用いて１：１で希釈された完全増殖培地（開示される拡散デバイスを用いて処理される対照流体であるが、ガスを添加しない）、およびｉｉｉ）酸素富化食塩水を用いて１：１で希釈された完全増殖培地。各研究は、３重に行われた。
インキュベーション前、ウェルは、それぞれの培地で充填され、各ウェルの上部に２５×２５ｍｍのガラス製のカバースリップを置くことにより密閉された。創傷してから６、１２、２４、および４８時間後、酸素測定を行い、培養物を推測した。
創傷してから６時間後、食塩水およびガス富化培地中の創傷の端部は、本明細書に開示される拡散デバイスを用いて処理されるが、ガスを添加しない対照培地中のものよりも更にひだ状であった。創傷してから１２時間後、全て３つの培地中の創傷の端部は、創傷の中心部に向かって移動する縁に沿ってケラチン生成細胞を有する、凸凹が現れた。ケラチン生成細胞を移動する定量化は、食塩水およびガス富化培地中のケラチン生成細胞移動とほぼ同レベルを示した。実験の結果を図４０Ａおよび４４Ｂに示す。
実施例８
改善された創傷治癒
試験は、本明細書に開示される実施形態に従って処理された酸素富化食塩溶液に暴露された創傷の改善された治癒特性を決定するために行われた。この実験において、ブタの皮膚切除生検創傷上に包帯をした。包帯は、酸素富化食塩溶液に浸潤した、または、対照群の包帯は、酸素富化されていない食塩水に浸潤した。顕微鏡により、以下の１）表皮化、２）新血管形成、３）表皮分化、４）マスト細胞移動、および５）有糸分裂を含む、幾つかの要因を、研究により評価した。
外面的に、創傷は、異なる速度で、治癒するように思われた。酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、４日目〜１１日目で、創傷治癒の増加を示した。しかしながら、創傷は共に、ほぼ同時に治癒を完了すると考えられた。試験は、３日目〜１１日目で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷の新表皮は、生理食塩水で処置した創傷の表皮の２倍〜４倍の速度で移動したことを示した。試験はまた、１５日〜２２日で、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、更に成熟した表皮層の早期形成により証明されるように、更に高速で分化したことも示した。全ての段階で、通常の治癒と関連する表皮に生じる肥厚は、酸素富化食塩溶液により処置した創傷内で生じなかった。
いずれかの特定の理論機構に拘束されるわけではないが、酸素富化食塩溶液は、創傷内の一酸化窒素の局在レベルを増加し得ることが考えられる。一酸化窒素は、創傷治癒において、成長因子、コラーゲン沈着、炎症、マスト細胞移動、表皮肥厚、および新血管形成を調節する。更に、一酸化窒素は、酸素により調節される誘導酵素により産生される。
したがって、いずれかの特定の理論機構に拘束されるわけではないが、本発明のガス富化流体は、一酸化窒素産生を刺激し得、これは、創傷治癒効果のスペクトルに従って、これらの実験に見られる。
治癒するブタの表皮は、１５日目〜２２日目で、酸素富化食塩水群において、早期分化を経験した。マスト細胞移動の場合は、酸素富化溶液に対する初期および後期移動においても差異が生じた。有糸分裂のレベルに対する最終的な結果は、染色の困難により確認できなかった。
ここで、図４１Ａ〜４１Ｆを参照すると、様々な図解は、酸素富化食塩溶液を用いた、また用いなかった、ブタの表皮組織の創傷治癒結果を比較する。したがって、酸素富化食塩溶液を用いる対照創傷および創傷の治癒を、１日目、４日目、および１６日目で追跡した。図４１Ａは、１日目における、対照創傷の創傷治癒を示す。図に示すように、創傷は、表皮／皮膚の肥厚および輪郭の喪失を示す。図４１Ｂは、酸素富化食塩溶液を用いて処置した創傷に対する１日目における創傷治癒を示す。創傷は、正常な表皮／皮膚の肥厚を示し、正常な輪郭（ｃｏｎｔｏｕｒｉｎｇ）は、新規の創傷において典型的である。
ここで、図４１Ｃおよび４１Ｄを参照すると、４日目における、制御創傷に対する創傷治癒、および４日目における、酸素富化食塩溶液で処置した創傷に対する創傷治癒を例示する。図４１Ｃに例示される対照創傷に関しては、創傷は、６００ミクロンの表皮突起を示す。図４１Ｄ中の酸素富化食塩溶液で処置された創傷では、１２００ミクロンの表皮突起が示されている。したがって、実験の開始から４日間では、酸素富化食塩溶液を用いて処置された創傷に形成された表皮突起は、酸素富化食塩溶液で処置されなかった創傷のものの２倍の表皮増殖速度を示す。
ここで、図４１Ｅを参照すると、１６日目での制御創傷が示されている。創傷は、図４１Ｆに示される、酸素富化食塩溶液で処置した創傷により示されたものよりも表皮／皮膚の輪郭の喪失を有する分化した表皮が少ないことを示す。図４１Ｆは、創傷において、更に分化した表皮および更に正常の表皮／皮膚の輪郭を示す。
したがって、図４１Ａ〜４１Ｆについて示されるように、酸素富化食塩溶液で処置した創傷は、処置しなかった創傷よりもはるかに高い治癒特性を示し、更に正常の表皮／皮膚の輪郭を有する、更に分化した表皮を示す。
実施例９
グルタチオンペルオキシダーゼ試験
本発明の酸素富化流体は、過酸化水素の存在下で、標準アッセイ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、グルタチオンペルオキシダーゼとの反応性を試験することにより試験された。水サンプルは、酵素カクテルを添加し、逆さにすることにより試験された。連続分光測光速度決定は、Ａ３４０ｎｍで、室温（摂氏２５度）でなされた。試験されたサンプルは、１）脱イオン水（負の制御）、２）低濃度の本発明の酸素富化流体、３）高濃度の本発明の酸素富化流体、および４）過酸化水素（正の制御）であった。過酸化水素の正の制御は、強力な反応性を示したが、試験した他の流体は、グルタチオンペルオキシダーゼとの反応を示さなかった。
実施例１０
（界面動電的に生成された超酸素化流体およびＳｏｌａｓは、ヒト気管支収縮（ヒト喘息モデル）の当該技術分野において認識されている動物モデルにおいて、生体内でアルブテロールを用いて、相乗延長効果（例えば、気管支収縮の抑制）を提供することが示された）
実験１：
初期実験において、メタコリン誘発された気管収縮と共に気道機能における気管支拡張剤の効果について、１６頭のモルモットを評価した。最適用量の決定後、各動物は、１動物あたり２５０μＬにおいて、標的用量の１２．５μｇの硫酸アルブテロールを送達するように、投薬された。
試験は、体重およびベースラインＰｅｎＨ値に対して無作為化ブロック設計であった。２つの群（ＡおよびＢ）には、１つまたは２つの希釈剤中の５０μｇ／ｍＬ硫酸アルブテロールの２５０μＬの気道内注入を与えた：Ａ群は、酸素を添加せずに、本発明のデバイスを通過させた脱イオン水であり、一方、Ｂ群は、本発明のガス富化水であった。各群は、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを用いて、溶液と共に気管内に投薬された。加えて、動物は、プレチスモグラフおよび記録ユニットを供給するネブライザー内で均一に示されるように、ＢＵＸＣＯプレチスモグラフユニットにわたって階層化された。
アルブテロールを投与してから２時間後、それらのベースラインＰｅｎＨ値の少なくとも７５％を示した動物は、データ分析には含まれなかった。この除外基準は、気管支拡張剤を用いた気管支保護を観察するための欠陥が、投与エラーと関連し得る過去の試験に基づく。結果として、対照群から１頭の動物が、データ分析から除外された。
動物は、５０％以上の気管支収縮があると、該動物は、保護されていないと見なされた。下の表７に記述されているように、Ｂ群の動物のうちの５０％（影付き）は、１０時間まで（試験が終了する時点）、気管支収縮から保護された。
実験２：オスのハートレー系モルモットにおける、硫酸アルブテロールを用いたＲＤＣ１６７６の気管支収縮評価。
オスのモルモットにおける、硫酸アルブテロールの単独投与、または希釈剤として投与する際、メタコリン誘発された気管支収縮に対する本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）の保護効果を評価するために、より多数の動物を用いて、追加の一連の実験を行った。
材料：
モルモット（Ｃａｖｉａ ｐｏｒｃｅｌｌｕｓ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｃａｎａｄａ Ｉｎｃ．（Ｓｔ．Ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ）からのハートレー系アルビノ、Ｃｒｌ：（ＨＡ）ＢＲであった。体重：処置の開始時で、約３２５±５０ｇ。群数は、１群あたり７頭のオス動物を有する、３２頭であった（加えて、２４頭の予備が、動物の同一バッチを形成する）。食事：全ての動物は、指定された処置時を除いては、標準の認定されたペレット式の市販の実験食（ＰＭＩ Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ Ｇｕｉｎｅａ Ｐｉｇ ５０２６；ＰＭＩ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｃ．）を自由に摂食させた。
方法：
投与経路は、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを介した気道内注入および全身吸入を介したメタコリン刺激であった。気管内経路は、試験物質／対照溶液への肺暴露を最大限にするように選択された。全身吸入刺激は、上気道過敏性反応（即ち、気管支収縮）を引き起こすために、メタコリン刺激に対して選択されている。
処置の継続は、１日であった。
表８は、実験設計を示す。全ての動物は、ＴＡ／対照投与してから２時間後、メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）の吸入暴露を行った。全ての動物は、２５０μＬの用量容量を受容した。したがって、硫酸アルブテロールは、（対照物質および４つの試験物質において）０、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬの濃度まで希釈された。
投薬する３０分前、４つの異なる濃度（０、２５、５０、および１００μｇ／ｍＬ）の硫酸アルブテロール溶液は、これらの４つの試験物質溶液（ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０１、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ１６７６−０３）のそれぞれにおいて、ｌ Ｏｘストック（５００μｇ／ｍＬ）中で作製された。これらの濃度の硫酸アルブテロールはまた、非界面動電的に生成された対照流体（対照１）中でも作製された。投与溶液は、適切な希釈の各ストック溶液を作製することにより調製された。全てのストックおよび投与溶液は、調製されるとすぐに、氷上で維持した。試験／対象物質を作製してから１時間以内に、投与を完了した。メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）の溶液は、投与日に調製した。
各動物に、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒを用いて、試験または対照物質の気道内注入を行った。動物は、一晩絶食させ、イソフルレンを用いて麻酔をかけ、喉頭を、喉頭鏡（または好適な代替物）下で可視化し、マイクロ噴霧器（ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ）の先端を気管に挿入した。試験物質または対照物質の用量容量の２５０μＬ／動物を投与した。
メタコリンエアロゾルは、Ｂｕｘｃｏバイアス流動ポンプからの空気が供給されたエアロネブ超音波ネブライザーを用いて、混合チャンバの空気吸入口に生成された。同様に、この混合チャンバは、４つの個々の全身無拘束プレチスモグラフを供給し、わずかに負圧下で動作されたそれぞれは、排気ラインに位置する仕切り弁によって維持した。真空ポンプを使用して、必要とされる流速で、吸入チャンバを排出した。
試験の主相を開始する前に、１２頭の予備動物を、３つの群（ｎ＝４／群）に割り付けて、動物が、重症であるが、非致命的急性気管支収縮を誘発するようにメタコリンに暴露され得る、最大暴露期間を決定した。４頭の動物は、３０秒間、メタコリン（５００μｇ／ｍＬ）に暴され、エアロゾルを開始してから１０分後まで、呼吸パラメータを測定した。メタコリンネブライザー濃度および／またはエアロゾル化の暴露時間は、Ｐｅｎｈの一過性増加を特徴とするように、重症であるが、非致命的急性／可逆性気管支収縮を誘発するように適切に調整された。
試験物質投与前（１日目）、また、投薬してから２、６、１０、１４、１８、２２、および２６時間後の時点で、動物をチャンバ内に入れ、メタコリンへのエアロゾル刺激の開始後、換気パラメータ（１回換気量、呼吸速度、誘導分時排出量）およびｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ Ｐｅｎｈを、Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ ＸＡシステムを用いて、１０分間測定した。動物がチャンバ内にいる時点で、ベースラインの値は、１分間記録され、次いで、メタコリンネブライザー濃度の５００ｕｇ／ｍＬを、３０秒間、エアロゾル化し、動物は、換気パラメータを連続的に評価した際、更に１０分間、エアロゾルに暴された。Ｐｅｎｈは、気管支収縮の指標として使用され、Ｐｅｎｈは、ピーク吸気流、ピーク呼気流、および呼気時間から得られた誘導値である。Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流／ピーク吸気流）＊（呼気時間／呼気容量の６５％を呼気するため時間−１）
メタコリン刺激の事前投与時、重症の急性気管支収縮を示さなかった動物は、差し替えられた。投与してから２時間後、それらのベースラインＰｅｎｈＰｅｎｅｓ値の少なくとも７５％を示す、どの動物も、データ分析には含まれなかった。呼吸パラメータは、２０秒法として記録された。
非生理的であると見なされたデータは、更に分析から除外された。
Ｐｅｎｈの変化は、１５分間にわたりプロットされ、Ｐｅｎｈ値は、濃度曲線下面積として表された。数値データは、群平均値および標準偏差（適用され得る場合）の算出がなされた。
結果：
図１０７Ａ〜Ｄに示されるように、アルブテロールの不在下で、本発明の界面動電的に生成された流体の投与は、２６時間まで測定した際、ベースライン平均のｐｅｎｈ値における明らかな効果がなかった。
しかしながら、驚いたことには、図１０８Ａ〜Ｄに示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体中で製剤化されたアルブテロールの投与（２５μｇのアルブテロール／動物群に対して代表的なデータを示す）（試験した全ての酸素レベルで；周囲（図１０８Ａ）、２０ｐｐｍ（図１０８Ｂ）、４０ｐｐｍ（図１０８Ｃ）、および６０ｐｐｍ（図１０８Ｄ））は、対照流体と比較して、アルブテロールの抗気管支収縮作用の顕著な延長を生じた。つまり、メタコリンの結果は、少なくとも２６時間で、アルブテロールの気管支拡張の延長を示した。図１０８Ａ〜Ｄは、ＲＤＣ１６７６と生理食塩水対照との間の全ての酸素レベルで一貫した差異があったことを示す。全て４つのＲＤＣ１６７６流体を合成すると、全処置と生理食塩水との差異であるｐ値は、０．０３であった。
したがって、本発明の特定の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された溶液は、アルブテロールとの相乗的延長作用を提供し、故に、患者のアルブテロール使用量の軽減を提供し、更に効率的な費用効率が高い薬物使用を可能にし、かつアルブテロールによる治療に応答して、患者を治療し得る期間を増大させる。
実施例１１
サイトカインプロファイル
混合リンパ球を、１人の健常なヒトボランティアドナーから得た。淡黄色のコーティングサンプルを標準手順に従って洗浄し、血小板を除去した。リンパ球は、本発明のガス富化流体あるいは蒸留水（対照）のいずれかで希釈した、ＲＰＭＩ培地（＋５０ｍｍ ＨＥＰＥＳ）中で１プレートあたり２×１０６の濃度で、平板培養した。細胞は、１マイクログラム／ｍＬのＴ３抗原、もしくはは１マイクログラム／ｍＬのフィトヘムアグルチニン（ＰＨＡ）レクチン（ｐａｎ−Ｔ細胞活性剤）で刺激したか、または刺激しなかった（陰性対照）。２４時間のインキュベーション後、細胞は、生存能力を確認し、浮遊物を抽出し、冷凍した。
浮遊物を解凍し、遠心分離を行い、ＸＭＡＰ（登録商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ）ビーズＬＩＴＥプロトコルおよびプラットフォームを用いて、サイトカイン発現を試験した。とりわけ、ＩＦＮ−γレベルは、Ｔ３抗原を有する対照培養培地においてよりも、Ｔ３抗原を有する本発明のガス富化培養培地において高く、一方、ＩＬ−８は、Ｔ３抗原を有する対照培養培地においてよりも、Ｔ３抗原を有する本発明のガス富化培養培地において低かった。また、ＩＬ−６、ＩＬ−８、およびＴＮＦ−αレベルは、ＰＨＡを有する対照培地においてよりも、ＰＨＡを有する本発明のガス富化培地において低く、一方、ＩＬ−１βレベルは、ＰＨＡを有する対照培地と比較した際、ＰＨＡを有する本発明のガス富化流体培地において低かった。本発明のガス培地単独では、ＩＦＮ−γレベルは、対照培地においてよりも高かった。
２００万の細胞を、本発明の酸素富化流体（水）（ウェル１、３、および５）、あるいは蒸留水（２、４、および６）（１×を作製するために水に希釈された１０×ＲＰＭＩ）を用いて、全ＲＰＭＩ＋５０ｍｍ Ｈｅｐｅｓ中で２４ウェルプレートの６ウェルに平板培養した。細胞は、１ｕｇ／ｍＬのＴ３抗原（ウェル１および２）またはＰＨＡ（ウェル３および４）で刺激された。対照ウェル５および６は、刺激しなかった。２４時間後、細胞は、生存能力を確認し、浮遊物を抽出し、冷凍した。次に、浮遊物を解凍し、沈殿させるために、８，０００ｇで回転させた。浄化した浮遊物を、ＬＵＭＩＮＥＸ ＢＥＡＤ ＬＩＴＥ（商標）プロトコルおよびプラットフォームを用いて、列挙したサイトカインに対してアッセイした。数値データは、表９に示され、対応する棒グラフを図３８に示す。
実施例１２
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）
図４８に記述されているように、ＭＯＧ抗原ペプチドに反応してリンパ球増殖は、加圧された含酸素流体（加圧ポット）または対照脱イオン流体と比較する場合、本発明のガス富化流体の存在下で培養される際、増加した。したがって、本発明のガス富化流体は、細胞が事前に抗原刺激を受けた抗原に対してリンパ球応答を増幅する。
既知のマウス配列に対応する、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質ペプチド３５−５５（ＭＯＧ３５−５５）（Ｍ−Ｅ−Ｖ−Ｇ−Ｗ−Ｙ−Ｒ−Ｓ−Ｐ−Ｆ−Ｓ−Ｒ−Ｏ−Ｖ−Ｈ−Ｌ−Ｙ−Ｒ−Ｎ−Ｇ−Ｋ）（配列番号１；本配列番号１のためのものを含む、公開第ＵＳ２００８０１３９６７４号を参照のこと、本明細書に参照することにより組み込まれる）を、合成した。次に、５×１０５脾臓細胞を、ＭＯＧの免疫を事前に持つ、ＭＯＧ Ｔ細胞受容体トランスジェニックマウスから除去し、本発明のガス富化流体、加圧された含酸素水（加圧ポット水）または対照脱イオン水で再構成した０．２ｍＬのＴＣＭ流体中で培養した。膵細胞を、それぞれ、４８または７２時間、ＭＯＧ ｐ３５−５５で培養した。培養物を、１Ｃｉ［３Ｈ］−チミジンでパルス化し、１６時間後収穫した。三重培養の［３Ｈ］チミジン組み込みの平均値ｃｐｍを算出した。結果を図４８に示す。
実施例１３
サイトカイン発現
特定の態様では、ヒト混合リンパ球は、界面動電的に生成された、酸素富化された流体、または対照流体中のＴ３抗原またはＰＨＡで刺激し、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、エオタキシン、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、Ｇ−ＣＳＦ、ＦＧＦｂ、ＶＥＧＦ、ＴＮＦ−α、ＲＡＮＴＥＳ、レプチン、ＴＮＦ−β、ＴＦＧ−β、およびＮＧＦの変化を評価した。図３８に示すように、試験した、炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＧＭ−ＣＳＦ）、ケモカイン（ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＲＡＮＴＥＳ、およびエオタキシン）、炎症性酵素（ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、およびＭＭＰ−９）、アレルゲン応答（ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ２３、Ｂ７−１、およびＢ７−２）、およびＴｈ２サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１３、およびＩＬ−５）は、試験流体対対照流体において、減少した。対照的に、試験した抗炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ１Ｒ−α、ＴＩＭＰ）は、試験流体対対照流体において、増加した。
これらのデータを拡大するために、出願者は、アレルギー性超過敏反応を評価するために、オボアルブミン感作を含む、当該技術分野において認識されているモデル系を使用した。研究されたエンドポイントは、反応の特定の細胞学的かつ細胞成分、ならびにタンパク質およびＬＤＨの血清学測定であった。エオタキシン、ＩＬ−１Ａ、ＩＬ−１Ｂ、ＫＣ、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、ＭＩＰ−１Ａ、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−Ａ、およびＶＣＡＭの分析を含む、サイトカイン分析を行った。
簡潔に述べると、オスのＢｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットは、１日目、２日目、および３日目のそれぞれで１回、水酸化アルミニウム（Ａｌ（ＯＨ）３）（２００ｍｇ／ｍＬ）を含有する溶液（２．０ｍｇ／ｍＬ）中で０．５ｍＬのオボアルブミン（ＯＶＡ）グレードＶ（Ａ５５０３−１Ｇ、Ｓｉｇｍａ）を腹腔内注射した。研究は、２×２要因配置無作為化（４群）の処置であった。免疫反応を生じさせるまでの２週間の待機期間後、ラットは、ＲＤＣ１６７６−００（前記混合デバイスによって処理した滅菌食塩水）、およびＲＤＣ１６７６−０１（更に酸素を添加した前記混合デバイスによって処理した滅菌食塩水）のいずれかを用いて、１週間曝露または治療のいずれかを受けた。１日１回の１週間の処置の終了時に、２つの群は、半分に分けられ、各群において、ラットの５０％は、吸入により食塩水あるいはＯＶＡ刺激のいずれかを受容した。
特に、初期シリアル化してから１４日後、１２頭のラットを、連続７日間、毎日３０分間、吸入によりＲＤＣ１６７６−００に暴した。システムを通して気流速度を、１０リットル／分で設定した。計１２頭のラットを、噴霧物質をエアロネブの１２のサブチャンバに入れ、均一に分布させる単一ポートを有する、パイチャンバ中に整列させた。
初期シリアル化してから１５日後、１２頭のラットを、連続７日間、毎日３０分間、吸入によりＲＤＣ１６７６−０１に暴した。気流はまた、１０リットル／分で設定され、同一のネブライザーおよびチャンバを使用した。第１に、ＲＤＣ１６７６−００を噴霧し、ＲＤＣ１６７６−０１を噴霧する前に、エアロネブチャンバを完全に乾燥させた。
最終の噴霧処置をしてから約２時間後、ＲＤＣ１６７６−００群からの６頭のラットを、Ｐｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏｓｐｒａｙｅｒ（モデル１Ａ−１Ｂ）を用いて、気管内注入により送達されるＯＶＡ（食塩水中１％）で、再刺激した。ＲＤＣ１６７６−００群からの他の６頭のラットを、気管内注入経由により送達される対照群として食塩水で刺激した。翌日、手順をＲＤＣ１６７６−０１群で繰り返した。
再刺激してから２４時間後、各群において全てのラットは、ペントバルビタールナトリウムを過剰摂取させることにより安楽死させた。全血サンプルは、下大静脈から採血し、２つの別個の採血管のＱｉａｇｅｎ ＰＡＸｇｅｎｅ（商標） Ｂｌｏｏｄ ＲＮＡ ＴｕｂｅおよびＱｉａｇｅｎ ＰＡＸｇｅｎｅ（商標） Ｂｌｏｏｄ ＤＮＡ Ｔｕｂｅに入れた。このモデルにおいて、肺の炎症と関連することで既知のサイトカイン発現のマーカーの変化を評価するために、肺の臓器を処置して、ＲＴ−ＰＣＲのための気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）流体および肺組織を得た。肺の右側上の４つの肺葉の整合性を保つために、片側洗浄技術を採用した。左「大」葉を洗浄し、一方、４つの右葉は、縛られ、ＴＲＩ−ｚｏｌ（商標）を直ちに入れられ、均質化され、更なる処置のために実験室に送られた。
ＢＡＬ分析 肺洗浄物を、収集し、細胞を沈殿させるために、４℃で、６００〜８００ｇで、１０分間遠心分離を行った。浮遊物を、新しい管に移し、−８０℃で冷凍させた。気管支洗浄液（ＢＡＬ）を、２つのアリコートに分取した。第１のアリコートを沈降させ、浮遊物を破砕したドライアイス上で急冷凍し、−８０℃中に入れ、更なる処置のために実験室に出荷した。タンパク質およびＬＤＨの示す量は、それぞれ、血清タンパク質のレベル（タンパク質は、本実験等の場合、刺激される際、膜を漏出する血清成分である）および細胞死を示す。独自の試験側は、対照物よりもわずかに少ないタンパク質を示した。
気管支洗浄液（ＢＡＬ）の第２のアリコートは、総タンパク質およびＬＤＨ含有量について評価し、細胞学的検査に供された。処置群は、総細胞が、食塩水対照群よりも多いことを示した。更に、対照群に対して処置群において、好酸球の増加があった。対照群に対して処置群においてもわずかに異なる多形核球細胞もあった。
血液分析 １つの管に１．２〜２．０ｍＬの血液を移すことにより、全血を分析し、少なくとも３０分間、血液を凝固させた。残りの血液サンプル（約３．５〜５．０ｍＬ）は、ＴＲＩ−ｚｏｌ（商標）またはＰＡＸｇｅｎｅ（商標）を用いて、ＲＮＡ抽出のために保存した。次に、凝固させた血液サンプルを、室温で、１２００ｇで、１０分間、遠心分離を行った。血清（浮遊物）を除去し、２つの新しい管に入れ、血清を−８０℃で保存した。
ＴＲＩ−Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＢ−１２６、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を利用するＲＮＡ抽出に関しては、０．２ｍＬの全血または血漿あたり２０μＬの５Ｎ酢酸が補完される、０．７５ｍＬのＴＲＩ Ｒｅａｇｅｎｔ ＢＤに、０．２ｍＬの全血または血漿を、添加した。管を振盪し、−８０℃で保存した。ＰＡＸｇｅｎｅ（商標）を利用して、管を、約２時間、室温でインキュベートした。次いで、管をそれらの側に置き、−２０℃の冷凍庫で２４時間保存し、次いで、長期保存のため、−８０℃へ移動させた。
Ｌｕｍｉｎｅｘ分析 Ｌｕｍｉｎｅｘプラットフォームにより、マイクロビーズ分析は、抗体関連の結合反応に対する基質として利用され、これは、光度単位において、読み出され、定量化標準と比較することができる。各血液サンプルは、２つのサンプルを同時に検査した。測定単位は、光度単位であり、群は、ＯＶＡ刺激された対照群、ＯＶＡ刺激された処置群、および食塩水刺激された独自の流体による処置群に分けられた。
アジレント遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ試薬（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）中に浸水した。簡潔に述べると、約１ｍＬのＴＲＩ試薬を、各管中の５０〜１００ｍｇの組織に添加した。サンプルは、ガラス製Ｔｅｆｌｏｎ（商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ試薬中で均質化された。サンプルは、−８０℃で保存した。
血液サンプル：
図４９〜５８は、全血サンプルの評価結果を示す。
例示的な図４９は、血液サンプルデータに対する基本的な光度データの表示書式を示す。測定したサイトカインの識別を指定する文字（この場合は、ＫＣ）は、各データ図の右上にある。データは、個々のサンプルのデータ点（上部グラフ）および棒グラフ（下部グラフ）として共に示される。いずれの場合にも、グラフは、４つの群におて、左から右に分割される。初めの２つの群（それぞれ、ＲＤＣ１６７６−００ ＯＶＡおよびＲＤＣ１６７６−０１ ＯＶＡ）は、吸入によりＯＶＡで再刺激されたものであり、一方、最後の２つの群（それぞれ、ＲＤＣ１６７６−００ ＯＶＡおよびＲＤＣ１６７６−０１ ＯＶＡ）は、食塩水対照のみで再刺激されたものであった。また、末尾００は、食塩水処置を示し、末尾０１は、本発明の界面動電的に生成された流体処置群を示す。
各血液サンプルは、２つのサンプルに分けられ、該サンプルは、同時に検査された。測定の単位は、光度の単位であり、群は、左から右に向かって、ＯＶＡ刺激された対照、ＯＶＡ刺激された界面動電的に生成された流体処置、次いで、食塩水刺激された処置、および食塩水刺激された界面動電的に生成された流体処置である。概説を容易にするために、ＲＤＣ１６７６−０１群は共に、グレーで強調表示された影付き背景であり、一方、食塩水対照処置群は、影なし背景である。
概して、２つの左の群と比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群データの広がりは、若干大きい、一方、全体として、特に、ＲＤＣ１６７６−０１群のサイトカインレベルは、対照処置群のサンプルよりも小さく、一般に、２群間での約３０％の数値の差異がある。概して、最右の２つの群を比較すると、ＲＤＣ１６７６−０１群は、ＲＤＣ１６７６−００群と比較して、わずかに高い数値を有する。
図５０は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＲＡＮＴＥＳ（ＩＬ−８スーパーファミリー）の分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、また、２つの群間で３０〜３５％の差異を示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５１は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＭＣＰ−１の分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５２は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＴＮＦαの分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５３は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＭＩＰ−１αの分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５４は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＩＬ−１αの分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５５は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＶｃａｍの分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５６は、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のＩＬ−１βの分析を示す。最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
図５７および５８は、それぞれ、特定の例示的な態様に従って、血液サンプルデータ中のエオタキシンおよびＭＣＰ−３の分析を示す。それぞれの場合において、最左の２つの群（ＯＶＡ刺激群）に対する光度単位は、上のグラフ部分のドットプロットで示されるように、ＲＤＣ１６７６−０１処置群の値が、一般に、ＲＤＣ１６７６−００対照群よりも低いことを示し、一方、食塩水のみで暴露された群において、サイトカインレベル値は、ほぼ同一であるか、またはＲＤＣ１６７６−０１処置群において、恐らく若干増加したことを示す。
気管支洗浄サンプル：
図５９〜６８は、相当する気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）サンプルの評価結果を示す。
図５９は、特定の例示的な態様に従って、ＢＡＬデータ中のＫＣの分析を示す。この場合には、サンプル用変動性と相まって感度レベルは、ＲＤＣ１６７６−０１とＲＤＣ１６７６−００処置群との間の差異に対して決定的ではない；つまり、ＫＣは、２群間で比較的小さい差異を示したが、光度単位は非常に低かった。
同様に、図６０は、特定の例示的な態様に従って、ＢＡＬデータ中のＲＡＮＴＥＳの分析を示し、ＲＤＣ１６７６−０１群において、１つの読み出しが、他のものよりも著しく高い、著しいばらつきを示し、結果が非対称になっている。
同様に、図６１は、特定の例示的な態様に従って、ＢＡＬデータ中のＴＮＦαの分析を示し、ＲＤＣ１６７６−０１とＲＤＣ１６７６−００処置群との差異に関して比較的小さい有意性を示す。
図６２は、特定の例示的な態様に従って、ＢＡＬデータ中のＭＣＰ−１の分析を示し、ＲＤＣ１６７６−０１とＲＤＣ１６７６−００処置群との差異に関して比較的小さい有意性を示す。
図６３〜６８は、それぞれ、特定の態様に従って、ＢＡＬデータ中のＭＩＰ１−Ａ、ＩＬ−１α、Ｖｃａｍ、ＩＬ−１β、ＭＣＰ−３、およびエオタキシンの分析を示し、ＲＤＣ１６７６−０１とＲＤＣ１６７６−００処置群との差異に関して比較的小さい有意性を示す。
要約すると、既知の感作に対する炎症反応のこの標準アッセイは、少なくとも血液サンプルにおいて、著しい臨床的かつ血清学的作用を生じた。加えて、著しい数の対照動物が、該プロセスにおいて、生理的にストレスを感じ、危うく死亡するところであったが、ＲＤＣ１６７６−０１処置群のいずれも、このような臨床的なストレス効果を示さなかった。次いで、これは、ＲＤＣ１６７６−０１処置群と、ＯＶＡ刺激群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群との間で約３０％の差異を有する、サイトカインの血中濃度において、反映した。対照的に、ＲＤＣ１６７６−０１処置群と、ＯＶＡ無刺激群におけるＲＤＣ１６７６−０１処置群との間でのサイトカイン、細胞、および血清学的プロファイルの小量、かつごくわずかな変化があり、これは、流体自体の最小限のベースラインの変化を単に示すと考えられる。
実施例１４
ブラジキニンＢ２受容体の親和結合
Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー、Ｏｃｔｅｔ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＥＤ）（ｆｏｒｔｅＢｉｏ（商標））は、ブラジキニンＢ２受容体とのブラジキニンリガンドの膜受容体の親和結合を調べるために、利用した。バイオセンサーシステムは、先端でセンサー特異的化学反応があるポリプロピレンハブ部に埋め込まれた研磨光ファイバーからなる。バイオセンサー設定は、検出器で干渉パターンを生成する光ファイバーの先端に接着する一層の分子を有する。分子結合数の任意の変化は、光パターンにおいて、測定偏移を生じる。
図６９に示されるように、ブラジキニンＢ２膜受容体は、アミノプロピルシラン（ＡＰＳ）バイオセンサーに固定化された。サンプルプレート設定は、図６９に指定し、図７０に分析した。次に、図７１に指定されるように、サンプル設定に従い、固定化受容体へのブラジキニンの結合を評価した。ブラジキニン結合の結果を図７２に示す。受容体へのブラジキニン結合は、図７３に指定されるように、設定に従い、更に滴定された。
図７４に示されるように、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して本開示の独自のガス富化食塩水流体で増加した。Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を図７５に示す。
実施例１５
（制御性Ｔ細胞アッセイを使用して、制御性Ｔ細胞アッセイにおけるサイトカイン（Ｉｌ−１０）および他のタンパク質（例えば、ＧＩＴＲ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ、およびＦｏｘｐ３））のＴ細胞増殖および同化の調節において、本発明の界面動電的に生成された流体の効果、ならびに例えば、ＰＢＭＣ中のトリプターゼの効果を示した）
Ｔ細胞を制御するために本明細書に開示される特定の実施形態の能力を、抗原提示細胞を照射し、抗原およびＴ細胞を導入することにより研究した。一般に、これらの刺激を受けたＴ細胞は増殖する。しかしながら、制御性Ｔ細胞の導入において、通常のＴ細胞増殖は、抑制される。
方法：
簡潔に述べると、選別に使用されるＦＩＴＣ共役型抗ＣＤ２５（ＡＣＴ−１）抗体は、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）から購入した。使用した他の抗体は、以下の通りであった。ＣＤ３（可溶条件に対してＨＩＴ３ａ）、ＧＩＴＲ（ＰＥ共役型）、ＣＤ４（Ｃｙ−５およびＦＩＴＣ共役型）、ＣＤ２５（ＡＰＣ共役型）、ＣＤ２８（ＣＤ２８．２クローン）、ＣＤ１２７−ＡＰＣ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ（ＰＥ共役型）、ＦｏｘＰ３（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、マウスＩｇＧ１（イソタイプ制御）、およびＸＣＬ１抗体。全ての抗体は、製造業者の取扱説明書に従って使用した。
ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｒｏｓｅｔｔｅキット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、末梢全血から単離された。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗ＣＤ１２７−ＡＰＣ、抗ＣＤ２５−ＰＥ、および抗ＣＤ４−ＦＩＴＣ抗体でインキュベートした。細胞は、ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏ／ｎＴｒｅｇおよびＣＤ４＋ＣＤ２５反応性Ｔ細胞にＦＡＣＳＡｒｉａを用いて、フローサイトメトリーにより選別された。
丸底９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて、抑制アッセイを行った。指示されたように、３．７５×１０３ ＣＤ４＋ＣＤ２５陰性反応性Ｔ細胞、３．７５×１０３自己Ｔ制御性、３．７５×１０４同種照射ＣＤ３減損ＰＢＭＣを添加した。全てのウェルは、抗ＣＤ３（５．０ｕｇ／ｍＬで、クローンＨＩＴ３ａ）で補完した。Ｔ細胞は、１０％ウシ胎仔血清で補完したＲＰＭＩ１６４０培地中で、３７℃で、７日間、培養された。インキュベーションが終了する１６時間前、１．０ｍＣｉの３Ｈ−チミジンを、各ウェルに添加した。プレートは、Ｔｏｍｔｅｃ細胞ハーベスターを用いて収穫し、３Ｈ−チミジン組み込みは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒシンチレーションカウンターを用いて決定した。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＳｔｅｍＳｅｐヒトＣＤ３＋Ｔ細胞枯渇（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、次いで、４０Ｇｙの照射を用いて、Ｔ細胞を枯渇した末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）からなった。
制御性Ｔ細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８条件で刺激を受け、次いで、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ ｒｅｄ生存能の染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、表面マーカーＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７を染色した。細胞は、Ｌｙｚｅ／Ｆｉｘ ＰｈｏｓＦｌｏｗ（商標）緩衝液中で固定し、変性Ｐｅｒｍｂｕｆｆｅｒ ＩＩＩ（登録商標）中で透過した。次いで、細胞をそれぞれの特定の選択された分子に対して抗体で染色した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、統計的分析を行った。両側の対応のないスチューデントのｔ検定を使用することにより２群間の比較はなされた。１方向ＡＮＯＶＡを使用することにより３群間の比較はなされた。０．０５未満のＰ値が、有意であると見なされた（両側）。２群間の相関は、ｒ値が、０．７以上または−０．７未満である場合、スピアマン係数を介して統計的に有意であることを決定した（両側）。
結果：
図７６に示されるように、制御性Ｔ細胞の増殖は、ディーゼル排出微粒子状物質（ＥＰＡからのＰＭ）で細胞を刺激することにより研究された。図７６のｘ軸は、実線の黒いバーとして、活性化自己ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（反応性細胞）を、および灰色バーとして、制御性Ｔ細胞のみ（アネルギーの確認のために示す）を示し、これは、白色バーとして示されるように、１：１の比率で混合された。ｙ軸は、３Ｈ−チミジンの摂取により測定されるように、増殖を示す。ｘ軸に沿って左から右に示されるように、「ＰＭ」は、ディーゼル排出微粒子状物質を示し、「ＰＭ＋Ｒｅｖ」は、ＰＭ＋本開示のガス富化界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ）を示し、「Ｓｏｌｉｓ」は、雰囲気を超えて、ガス富化しない、本開示の界面動電的に生成された流体およびデバイスのみ（ＰＭを添加しない）を示し、「Ｒｅｖ」は、上で定義されるように、Ｒｅｖのみ（ＰＭを添加しない）を示し、「Ｍｅｄｉａ」は、細胞成長培地のみの対照（−ＰＭ；Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）を示し、「Ｓａｌｉｎｅ Ｃｏｎ」は、食塩水対照（−ＰＭ；Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）を示し、「Ｖ」は、ベラパミルを示し、「Ｐ」は、プロパノロールを示し、および「ＤＴ」は、１：５０でのＤＴ３９０である。
図７７に示されるように、ＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）で刺激された細胞は、分泌されるＩＬ−１０の低下を生じたが、一方、本開示の流体の存在下で、ＰＭに暴される細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、ＩＬ−１０の維持された産生またはわずかに低下した産生を生じた。更に、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、先端ジフテリア毒素分子；標準市販濃度の１：５０の希釈）を、本発明の流体サンプルに滴定され、図７７において、ＩＬ−１０のＲｅｖ媒介された効果の増加を遮断した。Ｒｅｖのみによる処置が、食塩水および培地対照と比較して、より高いＩＬ−１０レベルを生じることに留意されたい。
同様に、図７８〜８２に示される、類似の結果を、それぞれ、ＧＩＴＲ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ、およびＦｏｘｐ３で得た。図において、「ＮＳＣ」は、「Ｓｏｌｉｓ」と同一である（ＰＭなし）。
図８３は、ＡＡ ＰＢＭＣデータを示し、トリプターゼを評価する末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイルから得られた。ＡＡ ＰＢＭＣデータは、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された細胞が、高レベルのトリプターゼを示した際、上記のＴ制御性細胞データと一致したが、一方、本開示の流体の存在下で、ＰＭによる処置した細胞（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）は、食塩水および培地対照のものと同様に有意に低いトリプターゼレベルを生じた。Ｔ制御性細胞からのデータと一致して、ＤＴ３９０への暴露はトリプターゼレベルにおけるＲｅｖ媒介効果を遮断し、ＰＭのみ（−Ｒｅｖ、Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）に見られたように、細胞中に上昇したレベルのトリプターゼを生じた。Ｒｅｖのみによる処置は、食塩水および培地対照と比較して低いトリプターゼレベルを生じたことに留意されたい。
要約すると、図７６のデータは、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、増殖の低下を示し、アッセイにおいて、比較的に低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖが、制御性Ｔ細胞を改善したことを示す。更に、本実施例および図７６〜８３の証拠は、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断は、Ｔｒｅｇ機能におけるＲｅｖｅｒａの活性に影響を及ぼすことを示す。
実施例１６
（本発明の界面動電的に生成された流体による一次気管支上皮細胞（ＢＥＣ）の処置は、気道炎症性経路のＭＭＰ９およびＴＳＬＰの２つの主要なタンパク質の発現および／または活性の軽減を生じた）
概略 上の実施例１４に示されるように（例えば、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー、Ｏｃｔｅｔ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＥＤ）（ｆｏｒｔｅＢｉｏ（商標））を用いて、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を示す図７５）、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して、本開示の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ、ガス富化した界面動電的に生成された流体）で増加した。追加として、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ）で刺激されたＴ制御性細胞の文脈において実施例１５に示されるように、データは、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、Ｔ制御性細胞の増殖の低下を示し（図７６）、（例えば、アッセイにおいて、比較的低下した増殖により示されるように）本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖは、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示した。更に、本発明の流体への暴露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、維持されたＩＬ−１０の産生または若干低下した産生を生じた。同様に、粒子状物質（ＰＭ）で刺激された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイル細胞の文脈において、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への暴露は、食塩水および培地対照のレベルと同様の有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことを示した。追加として、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０、先端ジフテリア毒素分子；標準市販濃度の１：５０の希釈）効果を、実施例１５および図７６〜８３に示し、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断は、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能における界面動電的に生成された流体の活性に影響を及ぼすことを示す。更に、追加の態様によれば、実施例１８のデータは、本発明の流体に暴露されると、密着結合関連タンパク質が、肺組織中で上方調節されたことを示す。図８５〜８９は、それぞれ、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）の上方調節を示す。更に、実施例２３のパッチクランプ試験に示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０）は、気管支上皮細胞（ＢＥＣ；例えば、Ｃａｌｕ−３）において、全細胞伝導性の調節（例えば、過分極条件下で）に影響を及ぼし、追加の態様によれば、全細胞伝導性の調節は、イオンチャネルの調節に反映する。
本実施例において、出願者は、気道炎症性経路の２つの主要なタンパク質の産生の効果を測定するために、追加の実験を行うことによりこれらの発見を拡大している。具体的には、ＭＭＰ９およびＴＳＬＰは、一次気管支上皮細胞（ＢＥＣ）においてアッセイされた。
材料および方法：
市販の一次ヒト気管支上皮細胞（ＢＥＣ）（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ，ＧｅｒｍａｎｙからのＨＢＥｐＣ−ｃ）を、これらの研究のために使用した。約５０，０００細胞を、約８０％の密集度に到達するまで、１２ウェルプレートの各ウェル中に平板培養した。次いで、本明細書の実施例８に記載されるように、ＦＡＣＳ分析のために引き上げられる前に、ディーゼル排出微粒子状物質（ＤＥＰまたはＰＭ）と共に、１：１０の希釈（１ｍＬの気道上皮成長培地中の１００ｕＬ）で、生理食塩水、対照流体Ｓｏｌａｓまたは試験流体Ｒｅｖｅｒａ６０を用いて、細胞を、６時間処置した。ＭＭＰ９およびＴＳＬＰ受容体抗体は共に、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得し、製造業者の仕様書のように使用した。
結果：
図１１５および１１６において、ＤＥＰは、ディーゼル排出微粒子状物質（ＰＭ、標準の市販源）単独で、暴された細胞を示し、「ＮＳ」は、生理食塩水単独で、暴された細胞を示し、「ＤＥＰ＋ＮＳ」は、生理食塩水の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を示し、「Ｒｅｖｅｒａ６０」とは、試験材料にのみ暴された細胞を指し、「ＤＥＰ＋Ｒｅｖｅｒａ６０」とは、試験材料Ｒｅｖｅｒａ６０の存在下で、微粒子状物質で処置された細胞を指す。加えて、「Ｓｏｌａｓ」および「ＤＥＰ＋Ｓｏｌａｓ」は、それぞれ、対照流体Ｓｏｌａｓ単独で、または微粒子状物質と組み合わせて、暴された細胞を示す。
図１１５は、試験材料Ｒｅｖｅｒａ６０が、気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において、ＤＥＰ誘発されたＴＳＬＰ受容体の発現を約９０％低下させることを示す。Ｓｏｌａｓは、ＴＳＬＰ受容体の発現の５５％の低下をもたらしたが、一方、生理食塩水は、ＴＳＬＰ受容体の発現の同様のレベルの低下（約２０％低下）を生じなかった。ＴＳＬＰ受容体の発現を低下させる本発明の溶液の効果は、ＴＳＬＰが、アレルギー性疾患を緩和するアレルギー喘息の病理生物学およびＴＳＬＰ受容体機能の妨害を媒介した局所抗体において極めて重要な役割を果たす（Ｌｉｕ，ＹＪ，Ｔｈｙｍｉｃ ｓｔｒｏｍａｌ ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ：Ｍａｓｔｅｒ ｓｗｉｔｃｈ ｆｏｒ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０３：２６９−２７３，２００６、Ａｌ−Ｓｈａｍｉ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ＴＳＬＰ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ａｓｔｈｍａ ｍｏｄｅｌ，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２０２：８２９−８３９，２００５、およびＳｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｃａｌ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ＴＳＬＰ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｌｅｖｉａｔｅｄ ａｌｌｅｒｇｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ ｂｙ ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ ａｉｒｗａｙ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ，Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，Ａｕｇ ２９．（Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ））。
同様に、図１１６は、ＤＥＰ媒介されたＭＭＰ９の増加における、Ｒｅｖｅｒａ６０、Ｓｏｌａｓおよび生理食塩水の効果を示す。具体的には、Ｒｅｖｅｒａ６０は、気管支上皮細胞において、ＤＥＰ誘発された細胞表面結合ＭＭＰ９レベルの約８０％を阻害し、Ｓｏｌａｓは、約７０％の阻害効果があり、一方、生理食塩水（ＮＳ）は、限界効果の約２０％の低下があった。ＭＭＰ−９は、喘息において、気道炎症および気管支リモデリングに関与する主要なプロテイナーゼのうちの１つである。近年では、ＭＭＰ−９のレベルは、健常な対照対象と比較して、安定した喘息に罹患する患者において、有意に増加し、急性喘息患者において更に高いことを示している。ＭＭＰ−９は、気道炎症細胞の侵入および気道過敏性の誘発に重要な役割を果たし、ＭＭＰ−９が、喘息を誘発し、保持するのに重要な役割を果たし得ることを示す（Ｖｉｇｎｏｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｐｕｔｕｍ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９／ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｒａｔｉｏ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｗｉｔｈ ａｉｒｆｌｏｗ ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｂｒｏｎｃｈｉｔｉｓ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １５８：１９４５−１９５０，１９９８、Ｈｏｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｈａｌｅｄ ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｏｉｄｓ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｓｕｂｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｏｌｌａｇｅｎ ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−９ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０４：３５６−３６３，１９９９、Ｓｉｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｉｃ ａｎｄ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌｉｃ ａｓｔｈｍａ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ １７２：５５９-５６５，２００５、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ ｃａｎ ｂｅ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １０８：１０２１−１０２６，２００１、およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｅｌｌ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ＩＣＡＭ−１ ａｎｄ ＶＣＡＭ−１ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｍｕｒｉｎｅ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｔｏｌｕｅｎｅ ｄｉｉｓｏｃｙａｎａｔｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ ａｓｔｈｍａ，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００３；１１１：１２７８−１２８４）。
したがって、追加の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された流体は、ＴＳＬＰ受容体の発現を調節するため（例えば、低下させる）、および／またはＭＭＰ−９の発現および／もしくは活性を阻害するために、実質的な治療的有用性を有し、これには、例えば、炎症および喘息の治療のためを含む。
実施例１７
（本発明の界面動電的に生成された流体は、アレルギー喘息に対する当該技術分野において認識されている動物モデルにおいて、ブデソニドを用いて、相乗抗炎症効果を有することを示した）
本実施例は、Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットオボアルブミン感作モデルにおいて、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ−１６７６−０３）の気道抗炎症特性を評価するために行われた実験を説明する。Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットは、気道機能における試験材料の効果を決定するための当該技術分野において認識されているモデルであり、この系統は、例えば、アレルギー喘息のモデルとして幅広く使用されている。このモデルにおいてオボアルブミン感作により誘発された気道病変および生化学的変化は、ヒトに観察されたものと類似している（Ｅｌｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｌｌｅｒｇｙ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏ ８８：９５１-６０，１９９１、Ｓｉｒｏｉｓ ＆ Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ，Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２６：９-１５，２００１）。吸入経路は、試験材料または対照溶液への肺暴露を最大限にするように選択された。オボアルブミン感作動物は、オボアルブミン刺激する前の７日間、ブデソニド単独で、または試験材料ＲＤＣ１６７６−０３と組み合わせて、処置された。刺激してから６時間および２４時間後、全血数ならびに幾つかの炎症性および抗炎症サイトカインのレベル、ならびに様々な呼吸パラメータを測定して、様々な炎症性パラメータにおける試験材料を投与する任意の有益な効果を推定した。
材料および方法：
実験の開始時で、約２７５±５０ｇの体重がある、Ｂｒｏｗｎ Ｎｏｒｗａｙラットの系統Ｂｎ／Ｃｒｌを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｋｉｎｇｓｔｏｎから取得した。全ての動物研究は、ＰＣＳ−ＭＴＬ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによる承認を得て行われた。研究時、動物の使用およびケアは、ＵＳＡ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＣｏｕｎｃｉｌならびにＣａｎａｄｉａｎ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅのガイドラインに従って行われた。
感作 実験の１日目に、動物（各処置群において１４頭の動物）は、１ｍＬの０．９％塩化ナトリウムあたり２ｍｇオボアルブミン／１００ｍｇ水酸化アルミニウムの新しく調製された溶液の１ｍＬの腹腔内注射の投与により感作され、次いで、３日目に注射を繰り返した
処置 初期感作から１５日後、動物は、対照（生理食塩水）または試験溶液（界面動電的に生成された流体ＲＤＣ１６７６−００、ＲＤＣ１６７６−０２、およびＲＤＣ−１６７６−０３）への噴霧暴露を施し、連続７日間、１日１回１５分間、単独で、またはブデソニドと組み合わせて投与される。動物は、約２０Ｌの全身チャンバ中で投薬され、試験環境は、Ｂｕｘｃｏバイアス流動ポンプからの空気が供給されたエアロネブ超音波ネブライザーを用いて、チャンバの空気入口に生成された。気流速度は、１０リットル／分で設定された。
オボアルブミン刺激 ２１日目に、試験溶液で処置してから２時間後、全ての動物は、１％オボアルブミン噴霧溶液で、１５分間、刺激された（気流２Ｌ／分で全身チャンバ中）。
サンプル収集 オボアルブミン刺激してから６および２４時間の時点で、血液サンプルは、全および差動血液細胞数、ならびに様々な炎症性および抗炎症サイトカインのレベルを測定するために、採血された。加えて、オボアルブミン刺激してから６および２４時間直後、ｅｎｈａｎｃｅｄ ｐａｕｓｅ Ｐｅｎｈおよび１回換気量を、Ｂｕｘｃｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍ ＸＡシステムを用いて、１０分間測定した。
結果：
好酸球数：予想され、図１０９に示されるように、ブデソニドによる処置（「ＮＳ＋ブデソニド７５０μｇ／Ｋｇ」；細かい斜線の棒グラフ）は、生理食塩水単独での対照による処置（白抜きの棒グラフ）と比較して、刺激された動物における全好酸球数を低下させた。追加として、本発明の流体「ＲＤＣ１６７６−０３」単独による処置（粗い斜線の棒グラフ）は、好酸球数の有意に低下しなかったが、とはいえ、好酸球数を低下させる際、ブデソニドとの実質的な相乗効果（「ＲＤＣ１６７６−０３＋ブデソニド７５０μｇ／Ｋｇ」、黒ベタ塗りの棒グラフ）を示した。同様に、図１１０において、好酸球率はまた、同様の傾向を示した。ＲＤＣ１６７６−０３（粗い斜線の棒グラフ）またはブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇ（細かい斜線の棒グラフ）単独では、刺激された動物において、好酸球率において有意な効果を有さなかったが、組み合わせた２つは、好酸球率を有意に低下させた（黒ベタ塗りの棒グラフ）。
したがって、本発明の特定の態様によれば、図１０９および１１０は、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＤＣ１６７６−０３）は、ヒトアレルギー喘息に対する当該分野において認識されているラットモデルにおいて、好酸球数（「好酸球率」および全数）を有意に低下させるように、ブデソニドと組み合わせて、実質的な相乗的有用性を有することが立証されたことを示す。
呼吸パラメータ：
図１１１Ａ〜Ｃおよび１１２Ａ〜Ｃは、オボアルブミン刺激から６および２４時間後、直後に測定されるように、Ｐｅｎｈおよび１回換気量における試験流体の観察された効果を示す。Ｐｅｎｈは、ピーク吸気流、ピーク呼気流、および呼気時間から得られた誘導値であり、ｐｅｎｈ値の低下は、肺機能の有益な結果を反映する。
Ｐｅｎｈ＝（ピーク呼気流／ピーク吸気流）＊（呼気時間／呼気容量の６５％を呼気するため時間−１）
図１１１Ａ〜Ｃから明らかであるように、ブデソニド（５００および７５０ｕｇ／ｋｇの双方で）単独で、または試験流体のいずれかとの組み合わせによる処置は、刺激直後のＰｅｎｈ値に有意に影響を及ぼさなかった。しかしながら、刺激から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独で、またはブデソニド５００もしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせによる処置を行った動物は、Ｐｅｎｈ値の大幅な低下を示した。この低下の範囲は、刺激してから２４時間後には消失したが、ブデソニドおよびＲＤＣ流体の相乗効果の傾向は、この時点で更に観察された。
１回換気量は、呼気終末位から吸気中の肺に吸い込まれる空気容量であり、これは、安静呼吸の間の呼気中、受動的に肺を排気される。図１１２Ａ〜Ｃに示されるように、ブデソニド単独により処置される動物は、刺激直後、１回換気量の変化がないことを示した。しかしながら、ＲＤＣ１６７６−０３単独では、この初期時点でさえ、１回換気量における有意な促進効果があった。また一方では、ブデソニド（５００および７５０ｕｇ／ｋｇの双方）と組み合わせたＲＤＣ１６７６−０３は、この時点で、１回換気量の測定における更になお顕著な効果があった。刺激から６時間後、ＲＤＣ１６７６−０３単独では、１回換気量の有意な増加を生じるのに十分であり、単独で、または組み合わせた、治療レジメンへのブデソニドの添加は、１回換気量における更なる効果がなかった。しかしながら、これらの早期時点で観察された任意の効果は、２４時間の時点までに消失した。
総合すれば、刺激してから６時間後、１回換気量の増加およびＰｅｎｈ値の低下により証明されるように、これらのデータは、ＲＤＣ１６７６−０３単独で、またはブデソニドと組み合わせて、気道炎症の著しい緩和を提供することを示す。
サイトカイン分析：
上記で論じられた生理学的パラメータに見られる効果の機構を分析するために、多数の炎症性ならびに抗炎症サイトカインは、刺激してから６および２４時間後、次いで、生理学的測定の直後、採血された血液サンプルにおいて測定された。
図１１３Ａおよび１１３Ｂは、Ｒｅｖ６０（またはＲＤＣ１６７６−０３）単独では、刺激してから６および２４時間後の双方で、有意にエオタキシンの血液レベルを低下させたことを明らかに示す。ブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇはまた、これらの時点の双方で、血液エオタキシンレベルを軽減したが、一方、ブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇ単独は、後の時点で、顕著な効果があった。しかしながら、試験溶液Ｒｅｖ６０単独では、双方の時点で、ブデソニドの双方の濃度よりも更に著しく強力な（血液エオタキシンレベルを低下させる際）効果を示した。エオタキシンは、喘息の肺およびアレルギー反応における他の組織（例えば、クローン病の腸）に好酸球を蓄積し、かつ好酸球を誘引することで知られている、小量のＣ−Ｃケモカインである。エオタキシンは、Ｇタンパク質共役型受容体ＣＣＲ３に結合する。ＣＣＲ３は、Ｔｈ２リンパ球、好塩基球およびマスト細胞等の多くの細胞型により発現されるが、Ｔｈ２リンパ球によるこの受容体の発現は、これらの細胞が、好酸球動員を調節する際、特定の対象となる。幾つかの研究は、喘息肺における、エオタキシンおよびＣＣＲ３の産生増加、ならびにこれらの分子と気道過敏性の間の関連を構築することを示している（エオタキシンおよび喘息肺への好酸球の誘引において概説、Ｄｏｌｏｒｅｓ Ｍ Ｃｏｎｒｏｙ ａｎｄ Ｔｉｍｏｔｈｙ Ｊ Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２００１，２：１５０−１５６）。これらの研究は、好酸球数における図１０９および１１０の結果と完全に一致することを留意することは特に興味深い。
総合すれば、これらの結果は、ＲＤＣ１６７６−０３単独で、またはブデソニドと組み合わせた処置が、オボアルブミン刺激から２４時間後、総好酸球数および血中濃度を著しく低下させることができることを強く示唆する。これは、刺激してから早ければ６時間後に観察された、血液中のエオタキシンレベルの大幅な低下と相関する。
２つの主要な抗炎症サイトカインである、ＩＬ１０およびインターフェロンγの血液レベルはまた、Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニドと組み合わせた治療の結果として、刺激してから６時間後に、著しく増強される。図１１３Ｃおよび１１３Ｄは、それぞれ、インターフェロンγおよびＩＬ１０における効果を示す。Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニド２５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせたＲｅｖ６０は、刺激してから最長６時間、刺激された動物において、ＩＬ１０の血液レベルを著しく増加させることが、これらの図から明白である。同様に、Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニド２５０もしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせたＲｅｖ６０は、刺激してから６時間後、ＩＦＮγの血液レベルを著しく増加させた。これらの抗炎症サイトカインの増加は、刺激してから６時間後に見られる、生理学的呼吸パラメータに見られる有益な効果を、少なくともある程度、十分に説明し得る。これらのサイトカインにおける効果は、刺激してから２４時間後、もはや観察されなかった（データは示さず）。
ＲａｎｔｅｓまたはＣＣＬ５は、循環型Ｔ細胞により発現したサイトカインであり、Ｔ細胞、好酸球および好塩基球に対して走化性であり、炎症性部位に白血球を動員するのに積極的な役割を果たす。Ｒａｎｔｅｓはまた、例えば、好酸球カチオン性タンパク質を放出する好酸球を活性化する。好酸球の密度を変化させ、好酸球を低濃度にし、これは、一般的な細胞活性化の状態を示すと考えられる。Ｒａｎｔｅｓはまた、好酸球に対して特異的な酸化的代謝の強力な活性剤でもある。
図１１４に示されるように、Ｒａｎｔｅｓの全身レベルは、Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニド２５０もしくは７５０ｕｇ／ｋｇと組み合わせて処置された動物において、刺激してから６時間後、著しく低下したが、２４時間後は、低下しなかった。前と同様に、このデータのセットに言及される、ブデソニド７５０ｕｇ／ｋｇおよびＲｅｖ６０の明らかな相乗効果がある。同様の下方傾向は、ＫＣまたはＩＬ８、ＭＣＰ３、ＩＬ１ｂ、ＧＣＳＦ、ＴＧＦｂ、ならびにＮＧＦ等の多くの他の炎症性サイトカインにおいて観察され、Ｒｅｖ６０単独で、またはブデソニドと組み合わせて処置された動物において、刺激してから６時間後、あるいは２４時間後のいずれかで観察された。
実施例１８
（本発明の治療流体は、細胞間密着結合を調節するために実質的な有用性を有する）
特定の態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、細胞間密着結合を調節するための実質的な有用性を有し、これには、肺および全身送達と関連するもの、ならびに例示的なポリペプチドサケカルシトニン（ｓＣＴ）を含む、ポリペプチドのバイオアベイラビリティを含む。
実施例の概略 サケカルシトニン（ｓＣＴ）は、３，４３２ダルトンの分子量を有する、３２個のアミノ酸ペプチドである。カルシトニンの肺送達は、モデル系（例えば、げっ歯類モデル系、ラットモデル系等）において、肺薬物送達（例えば、気管内薬物送達）を強化するための方法を調査するために、広範囲にわたって研究されている。特定の例示的な態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、細胞間密着結合、例えば、ラットモデル系において、肺および全身送達と関連するもの、ならびにｓＣＴのバイオアベイラビリティを調節する（例えば、強化する）ために実質的な有用性を有する。
方法：
気管内薬物送達 特定の実施形態によれば、ｓＣＴは、本発明の治療流体中で製剤化され、気管内薬物送達デバイスを用いて、ラットに投与される。ある態様では、げっ歯類気管内薬物送達のために設計されたＰｅｎｎ Ｃｅｎｔｕｒｙ Ｍｉｃｒｏ−Ｓｐｒａｙｅｒデバイスを使用して、良好な肺送達を可能にさせるが、当該技術分野において理解されるように、ペプチドの不良な全身バイオアベイラビリティをもたらす比較的低い肺胞沈着がある。特定の態様によれば、この当該分野において認識されているモデル系を使用して、本発明の拡散処理した治療流体が、細胞間密着結合（肺および全身送達と関連するもの、ならびにポリペプチドのバイオアベイラビリティを含む）を調節する（例えば、強化する）ために実質的な有用性を有することを確認した。
動物群および用量 ある態様では、ラットは、以下の３つの群のうちの１つに割り付けられる（１群あたりｎ＝６）：ａ）滅菌食塩水、ｂ）Ｏ２富化しない基礎液（「基礎液」）、またはｃ）本発明の拡散処理された治療流体（「本発明の富化ベースの溶液」）。本発明の富化ベースの溶液は、例えば、０．９％食塩水中で酸素を注入することにより形成される。好ましくは、基礎液は、上皮細胞の低浸透圧崩壊の可能性を最小化するように、約０．９％食塩水を含む。ある実施形態では、ｓＣＴは、基礎液および本発明の富化ベースの溶液において、別々に再構成され、６０分間以内で、それぞれの動物に気道内注入により送達される（１動物あたり２００μＬ中の１０μｇ ｓＣＴ）。
アッセイ 特定の態様では、血液サンプル（例えば、２００μＬ）を採取し、投薬する前、ならびに投薬してから５、１０、２０、３０、６０、１２０、および２４０分間後、ＥＤＴＡコーティングされた管に挿入した。血漿を、収穫し、ＥＬＩＳＡを用いて、ｓＣＴのアッセイを行うまで、−７０℃以下で保存した。
アジレント遺伝子アレイデータ生成のために、肺組織を単離し、ＴＲＩ試薬（ＴＲ１１８、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｉｎｃ．）中に浸水した。簡潔に述べると、約１ｍＬのＴＲＩ試薬を、各管中の５０〜１００ｍｇの組織に添加した。サンプルは、ガラス製Ｔｅｆｌｏｎ（商標）またはＰｏｌｙｔｒｏｎ（商標）ホモジナイザーを用いて、ＴＲＩ試薬中で均質化された。サンプルは、−８０℃で保存した。
結果：
密着結合の強化 図８４は、ＲＤＣ１６７６−０１（更に添加された酸素を用いて、本開示の独自のデバイスを通して処理した滅菌食塩水、本開示のガス富化界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））が、全身送達およびｓＣＴのバイオアベイラビリティを低下させることを示す。特定の態様によれば、全身送達の低下は、ｓＣＴの吸着の低下に由来し、肺密着結合の強化に由来する可能性が最も高い。ＲＤＣ１６７６−００は、本開示の方法に従って処理したが、酸素化されていない、滅菌食塩水を示す。
追加として、特定の態様によれば、密着結合関連タンパク質は、肺組織中で上方調節された。図８５〜８９は、それぞれ、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）の上方調節を示す。
実施例１９
（本発明の治療流体は、一酸化窒素レベルを調節するために実質的な有用性を有する）
特定の態様によれば、本発明の拡散処理された治療流体は、一酸化窒素レベル、および／または関連酵素を調節するために実質的な有用性を有する。図９０〜９４は、ＮＯＳ１および３、ならびにＮｏｓｔｒｉｎ、ＮＯＳ３の上方調節を示す、ＲＤＣ１６７６−０１（添加された追加の酸素を用いて本開示の独自のデバイスを通して処理された滅菌食塩水、本開示のガス富化された界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖ））に暴露されるヒト包皮ケラチン生成細胞から得たデータを示す。対照的に、ラット肺組織（上記の実施例の表題「サイトカイン発現」の組織）から得たデータを、Ｒｅｖを有する、ＮＯＳ２および３、Ｎｏｓｔｒｉｎ、ならびにＮＯＳ１ＡＰを示す（図９３、９４）。
実施例２０
（絶縁回転子および固定子機能を含む、特別に設計された混合デバイスを用いて、局在界面動電効果（電圧／電流）を示した）
本実施例では、絶縁回転子および固定子機能を含む、特別に設計された混合デバイスを用いて、機能局在界面動電効果（電圧／電流）を示した。
概略 「二重層効果」の項で本明細書の上記で詳細に論じられるように（図２６および２８も参照のこと）、混合デバイス１００は、複合体との第１の物質１１０および第２の物質１２０の複合かつ非線形流体動的相互作用によって、出力物質１０２を生成するように構成され、動的乱流は、界面動電効果に更に有利に働く混合複合体をもたらし得る。特定の態様によれば、これらの界面動電効果の結果は、電荷再分配および酸化還元反応として出力物質１０２内で観察され得、これには、出力物質内で安定化される可溶化電子の形態が含まれる。
混合チャンバ中の一般の表面に関連した二重層効果に加えて、出願者は、更に、局在界面動電効果が、機能の近くに機能誘発したマイクロキャビテーション、ならびに流体加速および減速によって与えられ得る理由を付した。本実施例の研究は、故に、前記追加の界面動電態様を更に調査し、確認するために行われた。
材料：
本明細書に記載の本発明の混合デバイスに類似する試験デバイスを構成し、これには、２つの機能１８を有するステンレス製の回転子１２（１８０度で配設される）、ならびに回転子機能１８および固定子機能１６に対して、回転で対置できるように配置された、単一機能１６を有する固定子１４を含む。注目すべきは、いずれの場合にも、回転子および固定子機能は、それぞれの回転子および固定子本体から絶縁されている（図９５）。デバイスは、本明細書のいずれかの箇所で開示されるデバイスと一致するように、０．０２０インチの一貫した回転子と固定子の間隙２０を提供するために機械加工した。回転子表面および絶縁回転子機能のための電気路を提供する、回転子軸（図示せず）の末端で、回転接点（図示せず）がある。同様に、固定子は、類似の絶縁機能１６（図９５）を有し、ここで、固定子内表面および絶縁ステンレス製機能は、固定子の外側でそれぞれの接点に接続される。
演算増幅器（ＯｐＡｍｐ）回路（Ｍ）２２は、接点間で接続される。演算増幅器（ＯｐＡｍｐ）回路は、このような増幅器が高入力インピーダンスを活用することにより超低電圧測定の収集を提供するように構成された。ＯｐＡｍｐの出力は、オシロスコープ（例えば、Ｐｉｃｏ Ｓｃｏｐｅ ３０００（商標）を用いてオシロスコープアプリケーションを起動する電池式ラップトップ型コンピュータ）の入力を供給する。
デバイスの試験中、いかなる周囲雑音（例えば、ワイヤレスネットワーク信号、および６０Ｈｚ電力線からのＲＦ波）の導入をも除外するために、微細な銅メッシュ、ファラデーシールド要素（約３×４×５フィート）で構成して、ファラデー箱を供給した。６０Ｈｚ ＡＣ騒音（例えば、約２ボルト）からの干渉信号および高周波ＲＦが、対象の信号をはるかに下回って低下した場合、この構成は、実験試験中、優れた信号対騒音比を提供した。Ｐｉｃｏ Ｓｃｏｐｅ３０００を用いてオシロスコープアプリケーションを起動する電池式ラップトップ型コンピュータを使用して、試験デバイスの機能により生成された３０ｍＶ信号の検出を可能にした（図９６等の場合）。加えて、変速ＤＣモータは、ファラデー箱の外側に配置し、試験デバイスから離れてモータ騒音を効果的に絶縁するように非金属シャフトを介して回転可能な試験デバイスに連結された。
方法：
ＯｐＡｍｐ回路を使用して、固定子内表面１２と絶縁固定子機能１６を接続する接点間の電位を測定した。特定の回路装置を用いて、電位のみを測定した。デバイスの回転速度は、約７００〜約２８００ｒｐｍ（約１８００ｒｐｍで起動するデバイスを用いて測定された図９６のデータを用いて）の間で変化させ得た。
ポンプまたは蠕動ポンプによる任意の外来の電圧発生を避けるために、デバイスを通して流体流動は、デバイスに接続されるタンク中の流体に作用する不活性窒素または空気またはアルゴンを用いて達成された。流動機構からの知覚可能な電圧寄与はなく、一般に、デバイスを通して流体流動を提供するためのポンプ力として、空気を使用した。
デバイスを通る流体流動率は、約１Ｌ／分であった。
固定子本体１２と絶縁機能１６との間の任意の電圧の存在を評価するために、デバイスチャンバを通るが、回転子を回転することなく、流体流動を誘導することにより、初期セットの非回転実験を行った。双方の流動方向に対して、別々の実験を行った。
次いで、同一の流速で、約３００〜約１８００ｒｐｍの様々な速度で回転する、デバイス回転子を用いて、追加のセットの回転実験を行った。任意の既定の実験のために、流速および回転速度を一定に保った。
結果：
非回転実験に関して、デバイスを通して流動する流体があり、回転子が回転しないいずれの方向において、固定子の本体と絶縁機能との間の知覚可能な電圧はほとんどなかった（例えば、１〜２ｍＶ）。
回転実験に関して、図９６を参照すると、電圧パルス（電位パルス）、回転子固定子機能に相対する回転配列との時間的な相関（この場合は、約１８００ｒｐｍで）は、動作する試験デバイスにおいて、ＯｐＡｍｐを用いて測定可能であったことが見られ得る。更に、このような周期電圧パルス、機能整合との相関は、約２５０または３００ｒｐｍ〜約１８００ｒｐｍの範囲にわたり観察され得た。追加として、流体流動の有無にかかわらず、このような電圧パルスは、デバイスの空洞／流体チャンバが、流体で充填される限り、回転実験において観察された。特定の態様によれば、機構に拘束されるわけではないが、反復的に回転整合した機能付近で、流体流動の急速な、激しい圧縮（例えば、キャビテーション）、加速、および減速は、回転周期と正確に相関する、それぞれの局在電圧パルスを生成し、これは、本発明に従って、少なくともある程度、界面動電的に生成された流体を提供した。追加の実験は、電圧パルスの振幅（ピーク形状および高さ）は、この特定の試験デバイスにおいて、回転速度の増加と共に増加し、約２５０〜３００ｒｐｍで当初観察することができ、少なくとも約２８００ｒｐｍまで増加する。回転整合した機能付近で、流体流動の激しい加速および減速等の大きさは、一般に、少なくとも最大値が、形状により与えられた反映する物理的限界に達するまで、回転速度の増加と共に増加することが期待され得る。追加の態様によれば、局在電圧ノイズが存在するため、局在電流流動（例えば、電流パルス）は、機構付近で生成され、本発明に従って、少なくともある程度、界面動電的に生成された流体を提供する（例えば、機構に拘束されるわけではないが、本明細書のいずれかの箇所で論じられるように、電気化学反応を提供する）。
追加の態様によれば、機構に拘束されるわけではないが、「二重層効果」の項で本明細書の上記で詳細に論じられるように（図２６および２８も参照のこと）、このような機能局在効果（例えば、電圧パルスならびに電流および／または電流パルス）は、更に一般的な表面関連二重層と組み合わせて、界面動電的に生成された流体の生成および荷電電流効果に寄与する。
実施例２１
（非界面動電的に生成された対照流体と比較して、本発明の界面動電的に生成された流体は、溶解溶質のα，α−トレハロースの１３Ｃ ＮＭＲ分析において、特異的に影響された線幅を示した）
概略 本明細書のいずれかの箇所で開示された出願者のデータは、有用性および機構を支援し、ここで、本発明の界面動電的に生成された流体は、細胞膜、細胞膜電位／伝導性、膜タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体等の膜受容体）、カルシウム依存性細胞シグナルシステム、ならびに細胞間結合（例えば、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソーム）のうちの少なくとも１つの調節により、細胞内シグナル変換の制御および調節を媒介する。具体的には、様々な当該分野において認識されている生物学的試験システムおよびアッセイを用いて、出願者のデータは、対照流体と比較して、例えば、制御性Ｔ細胞増殖；サイトカインおよびタンパク質レベル（例えば、ＩＬ−１０、ＧＩＴＲ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、Ｆｏｘｐ３、トリプターゼ、密着結合関連タンパク質、ＴＳＬＰ受容体、ＭＭＰ９等）；ブラジキニンＢ２受容体とのブラジキニンリガンドの結合；ＴＳＬＰ受容体の発現、全細胞伝導性等における、本発明の流体の差動効果を示す。更に、本明細書に示されるジフテリア毒素（ＤＴ３９０）効果は、β遮断（β２アドレナリン受容体）、および／またはＧＰＣＲ遮断、および／またはＣａチャネル遮断は、例えば、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能における界面動電的に生成された流体の活性に影響を及ぼす。
総合すれば、これらの効果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、先行技術の流体とは基本的に異なるだけでなく、本明細書に現在開示され、かつ特許請求されるもの等の新規組成物および実質的な有用性を提供することを示す。
本実施例において 出願者は、本実施例において、本発明の界面動電的に生成された流体の基本的性質を更に特徴付けるために核磁気共鳴（ＮＭＲ）研究を行っている。具体的には、出願者は、非界面動電的に生成された流体中の溶解と比較して、界面動電的に生成された流体中の溶解されたα，α−トレハロースの１３Ｃ ＮＭＲスペクトルを分析している。トレハロース（参照のために番号付けされた炭素を用いて以下に示す）は、コスモトロピック溶質であり、例えば、冷凍等の際、タンパク質の変性、膜乾燥、生物の生存を保護することで知られている。上記の要約されたデータを考えると、出願者は、α，α−トレハロースが、本発明の界面動電的に生成された流体の特性／構造を更に精査するための効果的なツールを提供し得ると判断した。出願者は、ＮＭＲ関連の「化学シフト」および「線幅」における効果を使用して、本発明の流体の特性を評価することができた。これらの研究のために、非超酸素化された本発明の界面動電的に生成された流体（本明細書では、「Ｓｏｌａｓ」と称する）を利用して、溶解酸素等の常磁性不純物が、分析される効果に対抗する、または別様に遮蔽するように作用する可能性を最小限にした。
材料および方法：
溶液調製 リン酸塩（ナトリウム塩）およびＤ−（＋）−トレハロース二水和物（Ｔ９５３１−１０Ｇ、金属含有量の低下）、ならびに１％ＤＳＳを含有する９９．９％Ｄ２Ｏは、Ｓｉｇｍａから購入した。「生理食塩水」は、Ｈｏｓｐｉｒａからの０．９％塩化ナトリウム、ｐＨ５．６（４．５〜７．０）である。０．２５Ｍ α，α−トレハロース溶液を、９６５μＬ生理食塩水および３５ｍＬリン酸緩衝生理食塩水に、０．９４９ｇトレハロースを溶解することにより調製した（３５μＬのこの緩衝液を１．０ｍＬトレハロース溶液に添加して、ｐＨが６．９３になるような方法で調製された０．９％ＮａＣｌ中の１００ｍＭリン酸緩衝液）。
核磁気共鳴スペクトル収集 スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ ＢＢＯ：Ｘ｛１Ｈ｝プローブおよび起動するＸＷＩＮＮＭＲ３．５を装着した、５００ＭＨｚあるいは３００ＭＨｚのＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅシリーズの器具を用いて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＮＭＲ施設で収集した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、６４Ｋまたは１２８Ｋのデータ点、および１２８または２５６スキャンを用いて、１４０００Ｈｚまたは７９００Ｈｚの掃引幅を用いて、１２５．７ＭＨｚまたは７５．４６ＭＨｚで収集した。得られたＦＩＤは、２回、ゼロ充填され、１．０Ｈｚ線幅拡大因子で処理された。温度は、Ｂｒｕｋｅｒ Ｂｉｏｓｐｉｎ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅユニットを用いて制御された。同軸ＮＭＲ挿入管中に、９９．９％Ｄ２Ｏ＋１％ＤＳＳ＋微量のアセトンを挿入することにより、Ｗｉｌｍａｄから購入した外部重水素化ロッキング（Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｄｅｕｔｅｒｉｕｍ ｌｏｃｋｉｎｇ）を利用した。ＮＭＲデータは、Ｍｅｓｔｒｅｌａｂ ＲｅｓｅａｒｃｈからのｉＮＭＲソフトウェアｖ．２．６．４を用いて処理した。
結果：
サンプルスペクトル 図９７Ａ〜Ｃは、ＤＳＳ信号が、−２．０４ｐｐｍで一列に整列するように、互いの上部で覆われた、６つの１３Ｃ−ＮＭＲスペクトルの拡張を示す。図の極右にＤＳＳ信号を示し、３０．９ｐｐｍ近くでアセトンメチル信号を示す。残りの信号は、上のα，α−トレハロース構造に示されるように、トレハロースの６個の炭素に対応する。図に見られるように、Ｓｏｌａｓ溶液中の炭素信号は、対照溶液と比較して、小量の化学シフト（一般に、高磁場）を示す。
線幅測定 下の表１０は、Ｓｏｌａｓ食塩水（本発明の界面動電的に生成された流体）に対して、３つの異なる温度で、トレハロースの６個の炭素およびアセトンのメチル炭素に対して測定した１３Ｃ ＮＭＲ線幅を示す。対応する生理食塩水サンプルは、各温度で、非界面動電対照溶液を示す。Ｓｏｌａｓ溶液中の該線幅は、各炭素原子に対して、対照溶液中の線幅とは著しく異なる。低温でＳｏｌａｓ溶液中のより小量の線幅は、対照溶液と比較して、全体としてトレハロース分子（任意の溶媒和水分子を含む）のより高速の回転率に由来する可能性が高い。
アセトン線に対して正規化されたいずれの場合にも、Ｓｏｌａｓおよび生理食塩水中のα，α−トレハロースに対する１３Ｃ ＮＭＲ線幅は、図９７Ａにグラフを使用して示す。結論として、Ｓｏｌａｓおよび生理食塩水中のα，α−トレハロースに対する１３Ｃ ＮＭＲ線幅のＮＭＲデータは、本発明の溶液が溶質の回転を変化させる特性があることを示す。
上記および本明細書のいずれの箇所の生物活性の概要を総合すれば、これらの１３Ｃ ＮＭＲ線幅効果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、溶質相互作用の点から見て先行技術の流体とは基本的に異なるだけでなく、本明細書に現在開示され、かつ特許請求されるもの等の新規の組成物および実質的な有用性を提供することを示す。
実施例２２
（非界面動電的に生成された対照流体と比較して、本発明の界面動電的に生成された流体は、差動矩形波ボルタンメトリープロファイルを生成し、ストリッピングポーラログラフィー下で、独特の電気化学的特性を示した）
概略 本明細書のいずれかの箇所で開示された出願者のデータは、有用性および機構を支援し、ここで、本発明の界面動電的に生成された流体は、細胞膜、細胞膜電位／伝導性、膜タンパク質（例えば、Ｇタンパク質共役型受容体等の膜受容体）、カルシウム依存性細胞シグナルシステム、ならびに細胞間結合（例えば、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソーム）のうちの少なくとも１つの調節により、細胞内シグナル変換の制御および調節を媒介する。具体的には、様々な当該分野において認識されている生物学的試験システムおよびアッセイを用いて、出願者のデータは、対照流体と比較して、例えば、制御性Ｔ細胞増殖、サイトカインおよびタンパク質レベル（例えば、ＩＬ−１０、ＧＩＴＲ、Ｇｒａｎｚｙｍｅ Ａ、ＸＣＬ１、ｐＳｔａｔ５、Ｆｏｘｐ３、トリプターゼ、密着結合関連タンパク質、ＴＳＬＰ受容体、ＭＭＰ９等）、ブラジキニンＢ２受容体とのブラジキニンリガンドの結合、ＴＳＬＰ受容体の発現、および全細胞伝導性等における、本発明の流体の差動効果を示す。更に、本明細書に示されるジフテリア毒素（ＤＴ３９０）効果は、β遮断（β２アドレナリン受容体）、および／またはＧＰＣＲ遮断、および／またはＣａチャネル遮断は、例えば、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能における界面動電的に生成された流体の活性に影響を及ぼす。
総合すれば、これらの効果は、本発明の界面動電的に生成された流体が、先行技術の流体とは根本的に異なるだけでなく、本明細書に現在開示され、かつ特許請求されるもの等の新規組成物および実質的な有用性を提供することを示す。
本実施例において 出願者は、本実施例において、本発明の界面動電的に生成された流体の基本的性質を更に特徴付けるためにボルタンメトリー研究を行っている。ボルタンメトリーは、酸化還元電位を決定するか、または流体の運動速度および定数を測定するために、よく使用される。全てのボルタンメトリー法の共通する特徴は、電極への電位の適用を伴うことと、得られる電流流動は、電気化学細胞を通してモニタリングされることである。印加された電位は、電気活性種を電気化学的に還元するか、または酸化することにより、電極表面で電気活性種の濃度の変化を生じる。
具体的には、出願者は、対照食塩水流体と本発明の界面動電的に生成された試験流体（例えば、ＳｏｌａｓおよびＲｅｖｅｒａ）との間で基本的な相違を更に特徴付けるために、ボルタンメトリー法（即ち、矩形波ボルタンメトリーおよびストリッピングポーラログラフィー）を利用している。上記の要約された生物学的および膜効果のデータを考えると、出願者は、矩形波ボルタンメトリーおよびストリッピングポーラログラフィーが、本発明の界面動電的に生成された流体の独特の特性を更に特徴付けるための効果的な手段を提供し得ると判断した。
出願者は、特定の電圧での電流差、電気活性酸化還元化合物の異なる濃度の生成、新規の酸化還元化合物の作製、および独特の電気化学特性の所有を使用して、本発明の流体の特性を評価し、かつ特徴付けることができた。これらの研究のために、超酸素化界面動電的に生成された流体（Ｒｅｖｅｒａ）および非超酸素化された本発明の界面動電的に生成された流体（Ｓｏｌａｓ）を共に、使用した。
材料および方法：
材料および溶液調製 実験は、ＥＧ ＆ Ｇ ＳＭＤＥ ３０３Ａ ｐｏｌａｒｏｇｒａｐｈｅｒ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）において行われた。矩形波ボルタンメトリー実験において使用された、電解液のＮａＯＨは、Ｓｉｇｍａから購入した。１０ｍＬの本発明の流体溶液のサンプルは、１００μＬのＮａＯＨを９．９ｍＬのＲｅｖｅｒａ食塩水に添加することにより調製し、０．１８モル溶液を作製した。ストリッピングポーラログラフィー実験に対して、追加の電解液は利用しなかった。
矩形波ボルタンメトリー 上記のように、ボルタンメトリーは、酸化還元電位を決定するか、または流体の運動速度および定数を測定するために、使用される。矩形波ボルタンメトリー実験において、０．０〜約−１．７５Ｖの電位を、電極に印加し、電気化学細胞を通して得られた電気流動をモニタリングした。
ストリッピングポーラログラフィー ストリッピングポーラログラフ法は、矩形波ボルタンメトリー法に類似する。しかしながら、上記のように、電解液は利用せず、また前ステップを必要とした。前ステップにおいて、静的水銀滴下電極は、水銀中で溶解した還元型の任意の化合物をアマルガムにするために、−１．１Ｖで、３０秒間、維持した。次いで、−１．１Ｖ〜０．０Ｖの電位をスキャンし、電気化学細胞を通して得られた電気流動をモニタリングした。このアマルガム上の負電位への線形スキャンは、これらの化合物の感度の高い測定を提供した。
結果：
矩形波ボルタンメトリー 図９８から明らかであるように、−０．１４Ｖ、−０．４７Ｖ、−１．０２Ｖ、および−１．３６Ｖでの電流プロファイルは、様々な試験剤間で異なる。特定の態様によれば、様々な特定の電圧で生成された電流差は、電気活性酸化還元化合物の異なる濃度、および／または新規もしくは独特の酸化還元化合物、および／または水銀滴下を取り囲む拡散限界の変化のうちの少なくとも１つを示す。
ストリッピングポーラログラフィー 図９９は、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖｅｒａおよびＳｏｌａｓが、−０．９ボルトで顕著なピークを有する独特のスペクトルを示し、これらは、非界面動電的に生成されたブランクおよび食塩水対照流体中に存在しないことを示す。追加として、非界面動電的に生成されたブランクおよび食塩水対照流体のスペクトルは、−０．１９および−０．３ボルトで特徴のあるピークを示し、これらは、界面動電的に生成されたＳｏｌａｓおよびＲｅｖｅｒａ流体に対するスペクトル中で不在である。
したがって、特定の態様によれば、これらの結果は、非界面動電的に生成された食塩水対照流体と比較して、本発明の界面動電的に生成されたＳｏｌａｓおよびＲｅｖｅｒａ流体の独特の電気化学特性を示す。追加の態様によれば、該結果は、界面動電的に生成された流体対非界面動電的に生成された流体において、電気活性酸化還元化合物の異なる濃度、ならびに新規および／もしくは独特の酸化還元化合物のうちの少なくとも１つの存在または生成を示す。
本明細書のいずれかの箇所で示された様々な生物学的データに加えて、特に、全細胞伝導性における差動効果の変化に従って考慮される際、この差動ボルタンメトリーデータ、１３ＣＮＭＲ線幅分析、および混合デバイスの機能局在効果（例えば、電圧パルスならびに電流および／または電流パルス）は、本発明の界面動電的に生成された流体が、先行技術の流体とは基本的に異なるだけでなく、本明細書に現在開示され、かつ特許請求されるもの等の新規組成物および実質的な有用性を提供することを示す。
実施例２３
（本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０）で灌流された気管支上皮細胞（ＢＥＣ）において行われたパッチクランプ分析は、ＲＮＳ−６０への暴露が、全細胞伝導性の低下、およびｃＡＭＰ刺激「カクテル」での刺激をもたらし、これは、全細胞伝導性を劇的に増加させ、また、全細胞伝導性の薬物感受性部分も増加させ、これは、基本条件下で観察されたものよりも１０倍高かった）
本実施例において、パッチクランプ研究を行い、細胞膜構造、膜電位、または膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、ならびにカルシウム依存性細胞伝達システムのうちの少なくとも１つの調節により細胞内シグナル変換を調節するための本発明の界面動電的に生成された流体の有用性を更に確認した。
概略 上の実施例１４に示されるように（例えば、Ｂｉｏ−Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙバイオセンサー、Ｏｃｔｅｔ Ｒａｐｉｄ Ｅｘｔｅｎｄｅｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（ＲＥＤ）（ｆｏｒｔｅＢｉｏ（商標））を用いて、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合の安定化を示す、図７５）、Ｂ２受容体へのブラジキニン結合は、濃度依存性であり、結合親和性は、生理食塩水と比較して、本開示の界面動電的に生成された流体（例えば、Ｒｅｖ、ガス富化した界面動電的に生成された流体）で増加した。追加として、ＰＭで刺激されたＴ制御性細胞の文脈において実施例１５に示されるように、データは、対照流体中のＰＭ（Ｒｅｖなし、Ｓｏｌｉｓなし）と比較して、ＰＭおよびＲｅｖの存在下で、Ｔ制御性細胞の増殖の低下を示し（図７６）、例えば、アッセイにおいて、比較的低下した増殖により示されるように、本発明の界面動電的に生成された流体のＲｅｖは、制御性Ｔ細胞機能を改善したことを示した。更に、本発明の流体への暴露は、食塩水および培地対照（ＰＭなし）と比較して、維持されたＩＬ−１０の産生または若干低下した産生を生じた。同様に、ＰＭで刺激された末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）のアレルギー喘息（ＡＡ）プロファイル細胞の文脈において、データは、本開示の流体（「ＰＭ＋Ｒｅｖ」）への暴露は、食塩水および培地対照のレベルと同様の有意に低いトリプターゼレベルをもたらすことを示した。追加として、ジフテリア毒素（ＤＴ３９０）効果を、実施例１５および図７６〜８３に示し、β遮断、ＧＰＣＲ遮断、およびＣａチャネル遮断は、ＴｒｅｇおよびＰＢＭＣ機能における界面動電的に生成された流体の活性に影響を及ぼすことを示す。更に、追加の態様によれば、実施例１８のデータは、本発明の流体に暴露されると、密着結合関連タンパク質が、肺組織中で上方調節されたことを示す。図８５〜８９は、それぞれ、結合接着分子ＪＡＭ２および３、ＧＪＡ１、３、４および５（結合接着）、ＯＣＬＮ（オクリーディン）、クローディン（例えば、ＣＬＤＮ３、５、７、８、９、１０）、ＴＪＰ１（密着結合タンパク質１）の上方調節を示す。
パッチクランプ研究を行い、前記有用性を更に調査し、かつ確認した。
材料および方法：
気管支上皮細胞株Ｃａｌｕ−３は、パッチクランプ研究に使用した。Ｃａｌｕ−３気管支上皮細胞（ＡＴＣＣ ＃ＨＴＢ−５５）は、実験する時まで、ガラス製のカバースリップ上に１０％ＦＢＳで補完した、１：１のＨａｍ Ｆ１２とＤＭＥＭ培地の混合物において、増殖させた。簡潔に述べると、全細胞電圧クランプデバイスを使用して、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に生成された生理食塩水、場合によっては、本実施例において「薬物」と称される）に暴露された、Ｃａｌｕ−３細胞における効果を測定した。
パッチクランプ法を利用して、上皮細胞膜の極性およびイオンチャネル活性における試験材料（ＲＮＳ−６０）の効果を評価した。具体的には、全細胞電圧クランプは、１３５ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１．２ｍＭ ＣａＣｌ２、０．８ｍＭ ＭｇＣｌ２、および１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−メチルＤ−グルカミンでｐＨを７．４まで調整）からなる浸液中で、気管支上皮細胞株Ｃａｌｕ−３上で行った。基礎電流は、ＲＮＳ−６０が細胞に灌流された後、測定された。
更に具体的には、パッチピペットは、２段階のＮａｒｉｓｈｉｇｅ ＰＢ−７ｖｅｒｔｉｃａｌ ｐｕｌｌｅｒを用いて、ホウケイ酸ガラス（Ｇａｒｎｅｒ Ｇｌａｓｓ Ｃｏ，Ｃｌａｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）から引き上げ、次いで、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ ＭＦ−９マイクロフォージ（Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＵＳＡ，Ｅａｓｔ Ｍｅａｄｏｗ，ＮＹ）を用いて、６〜１２メガオームの抵抗までファイヤーポリッシュされた。ピペットは、１３５ＫＣｌ、１０ＮａＣｌ、５ＥＧＴＡ、１０Ｈｅｐｅｓを含有する細胞内液（ｍＭ中）で充填され、ＮＭＤＧ（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）を用いてｐＨを７．４まで調整した。
培養されたＣａｌｕ−３細胞は、以下の細胞外溶液（ｍＭ）：１３５ＮａＣｌ、５ＫＣｌ、１．２ＣａＣｌ２、０．５ＭｇＣｌ２、および１０Ｈｅｐｅｓ（遊離酸）を含有する、チャンバ中に入れ、ＮＭＤＧを用いてｐＨを７．４まで調整した。
細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７１顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｉｎｃ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）の４０Ｘ ＤＩＣ対物レンズを用いて見た。細胞接着型偽がシールを構築した後、軽度の吸引を適用して、全細胞構成をならし運転し、全細胞構成を得た。ならし運転した直後、細胞は、−１２０、−６０、−４０、および０ｍＶで電圧クランプされ、±１００ｍＶ間の電圧ステップ（５００ｍｓ／ステップ）で刺激された。対照条件下で、全細胞電流を収集した後、同一の細胞を、上記の対照流体と同一の細胞外溶質およびｐＨを含む、試験流体を用いて、浴槽を通して灌流し、異なる保持電位で全細胞電流を、同一のプロトコルを用いて記録した。
電気生理学的データは、Ａｘｏｎ Ｐａｔｃｈ ２００Ｂ増幅器を用いて取得し、１０ｋＨｚで低域フィルタリングして、１４００Ａ Ｄｉｇｉｄａｔａ（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｕｎｉｏｎ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いてデジタル化した。ｐＣＬＡＭＰ１０．０ソフトウェア（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、データを取得し、分析した。電流（Ｉ）−電圧（Ｖ）関係（全細胞伝導性）は、該ステップに、約４００ミリ秒で実際の電流値、対保持電位（Ｖ）をプロットするにより得た。Ｉ／Ｖ関係の傾きは、全細胞伝導性である。
薬物および薬品 示される時にはいつでも、細胞は、８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（５００ｍＭ）、ＩＢＭＸ（イソブチル−１−メチルキサンチン、２００ｍＭ）、およびホルスコリン（１０ｍＭ）を含有する、ｃＡＭＰ刺激カクテルで刺激された。Ｈ２Ｏ溶液中の２５ｍＭストックからｃＡＭＰ類似体８−Ｂｒ−ｃＡＭＰ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．）を、使用した。１０ｍＭホルスコリンおよび２００ｍＭ ＩＢＭＸストック溶液の双方を含有するＤＭＳＯ溶液からホルスコリン（Ｓｉｇｍａ）およびＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ）を、使用した。
パッチクランプの結果：
図１００は、基礎（ｃＡＭＰなし）条件下で、０ｍＶの保持電位から＋／−１００ｍＶをステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示す。代表的な透写図は、ｎ＝１２細胞の平均である。左にある透写図は、対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図（中央）である。右にある透写図は、対照条件下での値から、試験平均値の残算により得た複合差分である。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、少量ではあるが、試験条件による、伝導性の著しい変化に反映する。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体）により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶである。過分極条件下で、全細胞伝導性の低下がある。
図１０１は、基礎条件下で、−４０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶをステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示す。代表的な透写図は、ｎ＝１２細胞の平均である。左にある透写図は、対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図（中央）である。右にある透写図は、対照条件下での値から、試験平均値の残算により得た複合差分である。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、少量ではあるが、試験条件による、伝導性の著しい変化に反映する。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体）により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶである。値は、０ｍＶプロトコルを用いて得たものと比較的同様である。
図１０２は、基礎条件下で、−６０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶをステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示す。代表的な透写図は、ｎ＝１２細胞の平均である。左にある透写図は、対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図（中央）である。右にある透写図は、対照条件下での値から、試験平均値の残算により得た複合差分である。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、微量であるが、試験条件による、伝導性の著しい変化に反映する。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶである。値は、０ｍＶプロトコルを用いて得たものと比較的同様である。
図１０３は、基礎条件下で、−１２０ｍＶの保持電位から±１００ｍＶをステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示す。代表的な透写図は、ｎ＝１２細胞の平均である。左にある透写図は、対照であり、次いで、試験溶液を灌流する間の全細胞透写図（中央）である。右にある透写図は、対照条件下での値から、試験平均値の残算により得た複合差分である。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、双方の条件下で、高線形であり、微量であるが、試験条件による、伝導性の著しい変化に反映する。全細胞伝導性への寄与、即ち、薬物により阻害された成分はまた、線形であり、逆転電位は、ほぼ０ｍＶである。値は、０ｍＶプロトコルを用いて得たものと比較的同様である。
図１０４は、ｃＡＭＰ刺激された条件下で、様々な保持電位から±１００ｍＶをステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示す。代表的な透写図は、ｎ＝５細胞の平均である。左にある透写図は、対照であり、ｃＡＭＰ刺激し、次いで、薬物含有溶液で灌流した後の全細胞透写図である。右にある透写図は、対照条件下（ｃＡＭＰのみ）での値から、ｄｒｕｇ＋ｃＡＭＰの試験平均値の残算により得た複合差分である。上部にある透写図は、０ｍＶでの、電圧プロトコルから得たものであり、下のものは、−４０ｍＶでのものである。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、全ての条件下で、高線形であり、試験条件による、伝導性の変化に反映する。
図１０５は、ｃＡＭＰ刺激された条件下で、様々な保持電位から±１００ｍＶをステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を示す。代表的な透写図は、ｎ＝５細胞の平均である。左にある透写図は、対照であり、ｃＡＭＰ刺激し、次いで、薬物含有溶液で灌流した後の全細胞透写図である。右にある透写図は、対照条件下（ｃＡＭＰのみ）での値から、ｄｒｕｇ＋ｃＡＭＰの試験平均値の残算により得た複合差分である。上部にある透写図は、−６０ｍＶでの、電圧プロトコルから得たものであり、下のものは、−１２０ｍＶでのものである。電流−電圧関係から得た全細胞伝導性は、全ての条件下で、高線形であり、試験条件による、伝導性の変化に反映する。
図１０６は、ｃＡＭＰ活性化電流における保持電位の効果を示す。全細胞伝導性における薬物（本発明の界面動電的に生成された流体、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）の効果は、異なる電圧プロトコル（０、−４０、−６０、−１２０ｍＶの保持電位）下で観察された。基礎条件下で、薬物感受性全細胞電流は、全ての保持電位（電圧感度の低い寄与、左上パネル）で同一であった。しかしながら、ｃＡＭＰ活性化条件において、薬物感受性電流は、更に高く、印加した電圧プロトコルに対して感受性があった。電流−電圧関係は、高度に非線形である。これは、減算された電流において更に観察され（下パネル）、０ｍＶでの全細胞伝導性の寄与は、各プロトコル（ｎ＝５）に更に減算された。
実施例の概要 したがって、特定の態様によれば、データは、基礎条件下で、薬物（本発明の界面動電的に生成された流体、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）の少量ではあるが、一貫した効果があることを示す。全細胞伝導性における薬物の効果を増強するために、実験はまた、ｃＡＭＰ刺激「カクテル」での刺激後、薬物を灌流することにより行われ、これは、全細胞伝導性を劇的に増加させた。興味深いことに、このプロトコルはまた、全細胞伝導性の薬物感受性部分も増加させ、これは、基礎条件下で観測されたものよりも１０倍高かった。追加として、ｃＡＭＰ刺激の存在下で、薬物は、様々な電圧プロトコルに対して異なる効果を示し、界面動電的に生成された流体が、全細胞伝導性の電位依存性の寄与に影響を及ぼすことを示す。伝導性の線形成分の減少もあり、これは、別の経路（例えば、イオンチャネル、電位依存陽イオンチャネル等）の阻害への薬物の少なくとも１つの寄与を更に示唆している。
特定の態様では、機構に拘束されるわけではないが、出願者のデータは、原形質膜から遮断されるか、または回収される、チャネル（単数または複数）の変化を生成する、本発明の界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０、６０ｐｐｍの溶解酸素を含む界面動電的に処理された生理食塩水）と一致する。
出願者の他のデータ（例えば、実施例のデータ）を総合すれば、本発明の特定の態様は、細胞膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、およびカルシウム依存性の細胞内シグナリングシステムのうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞内シグナル変換を調節するための組成物および方法を提供し、これには、ＧＰＣＲおよび／またはｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない、細胞膜構造（例えば、膜および／もしくは膜タンパク質、受容体、または他の成分）の電気化学および／または立体構造の変化を与えるための本発明の界面動電的に生成された溶液の使用を含む。追加の態様によれば、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個々の伝達成分等の半減期において、持続、依存し得る。
実施例２４
（本発明の界面動電的に生成された流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）で灌流されたＣａｌｕ−３細胞において行われたパッチクランプ分析は、（ｉ）ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓへの暴露が、全細胞伝導性の増加をもたらした、（ｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露が、１５分間のインキュベーション時間で明らかな、非線形伝導性の増加を生じた、および（ｉｉｉ）ＲＮＳ−６０への細胞の暴露が、カルシウム透過性チャネルにおけるＲＮＳ−６０食塩水の効果を生じたことを示した）
概略 本実施例において、パッチクランプ研究を行い、本明細書に記載されるように、全細胞電流を調節するための有用性を含む、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。２セットの実験を行った。
第１のセットの実験のデータの概要は、Ｓｏｌａｓ食塩水を用いて得た全細胞伝導性（電流−電圧関係）は、双方のインキュベーション時間（１５分間、２時間）、および全ての電圧プロトコルに対して、高度な線形であることを示す。しかしながら、Ｓｏｌａｓを用いた、更に長時間のインキュベーション（２時間）が、全細胞伝導性を増加させることは明らかである。ＲＮＳ−６０への細胞の暴露は、デルタ電流（Ｒｅｖ−Ｓｏｌ減算）に示されるように、非線形伝導性の増加を生じ、これは、１５分間のインキュベーション時間でのみ明らかである。この非線形電流におけるＲＮＳ−６０の効果は、消失し、その代わりに、２時間のインキュベーション時間での高度な線形がある。全ての電圧プロトコルで存在するが、非線形全細胞伝導性の寄与は、上で観察されるように、電圧感受性があった。
第２のセットの実験のデータの概要は、非線形電流において、ＲＮＳ−６０食塩水の効果があることを示し、これは、外液中の高カルシウムにおいて明らかにされた。非線形全細胞伝導性の寄与は、電圧感受性ではあるが、双方の電圧プロトコルに存在し、カルシウム透過性チャネルにおけるＲＮＳ−６０食塩水の効果を示す。
第１の実験（伝導性の増加、および非線形電圧調節された伝導性の活性化）
第１のセットの実験のための方法：
一般的なパッチクランプ法に関しては、実施例２３を参照のこと。以下の第１のセットの実験において、パッチクランプ研究を行い、基礎条件下で、Ｃａｌｕ−３細胞を用いて、０ｍＶ保持電位、−１２０ｍＶあるいは−６０ｍＶのいずれかからステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を調節するために、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。
いずれの場合にも、全細胞伝導性は、１５分間、あるいは２時間のいずれかでインキュベートされた細胞から得た、電流−電圧関係から得られ、実施例２３の結果を更に確認した。本研究において、群は、ＳｏｌａｓあるいはＲＮＳ−６０食塩水溶液に対して、既定の時間で得た。得られたデータは、５〜９個の細胞に対して、平均値±ＳＥＭ全細胞電流として表す。
結果：
図１１７Ａ〜Ｃは、２つの時点（１５分（左パネル）および２時間（右パネル））で、および異なる電圧プロトコル（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における界面動電的に生成された流体（例えば、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。結果は、ＲＮＳ−６０（黒丸）は、Ｓｏｌａｓ（白丸）よりも全細胞伝導性におけるより大きな効果があることを示す。実験において、同様の結果が、３つの電圧プロトコルにおいて、および１５分および２時間のインキュベーション時点で見られた。
図１１８Ａ〜Ｃは、３つの電圧プロトコル（「デルタ電流」））（Ａ．０ｍＶからのステッピング、Ｂ．−６０ｍＶからのステッピング、Ｃ．−１２０ｍＶからのステッピング）で、および２つの時点（１５分間（白丸）および２時間（黒丸））で、ＲＮＳ−６０電流データからＳｏｌａｓ電流データの減算から生じるグラフを示す。これらのデータは、ＲＮＳ−６０を用いた１５分間の時点で、２時間の時点で、不在する非線形電位依存性成分があることを示した。
前の実験等の場合、「生理」食塩水を用いたデータは、参照として使用された、非常に一貫した、時間依存性伝導性を得た。本結果は、ＳｏｌａｓあるいはＲＮＳ−６０食塩水のいずれかと群を一致させることにより得られ、基礎条件（ｃＡＭＰなし、または任意の他の刺激なし）下で、ＲＮＳ−６０食塩水へのＣａｌｕ−３細胞の暴露は、時間依存性効果を生成し、より短期のインキュベーション時間（１５分間）で、電圧調節された伝導性の活性化と一致することを示す。この現象は、２時間のインキュベーション時点では明らかではなかった。本明細書のいずれかの箇所で記載されるように、線形成分は、伝導性が、ｃＡＭＰ「カクテル」での刺激により増加する際、更に明らかである。それでもなお、２時間のインキュベーション時間は、ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ食塩水の双方に対してより高い線形伝導性を示し、この場合、ＲＮＳ−６０食塩水は、Ｓｏｌａｓ単独と比較して、全細胞伝導性が倍になった。この証拠は、全細胞伝導性への少なくとも２つの寄与、即ち、非線形電圧調整された伝導性および線形伝導性の活性化が、ＲＮＳ−６０食塩水により影響を及ぼし、これは、更に長時間のインキュベーション時間で、更に明らかである。
第２のセットの実験（カルシウム透過性チャネルにおける効果）
第２のセットの実験のための方法：
一般的なパッチクランプ法に関しては、実施例２３を参照のこと。以下の第２のセットの実験において、なお更なるパッチクランプ研究を行い、基礎条件下で、Ｃａｌｕ−３細胞を用いて、０ｍＶあるいは−１２０ｍＶのいずれかの保持電位からステッピングするプロトコルを用いて、全細胞電流を調節するために、本発明の界面動電的に生成された食塩水流体（ＲＮＳ−６０およびＳｏｌａｓ）の有用性を更に確認した。
いずれの場合にも、全細胞伝導性は、いずれかの食塩水を用いて、１５分間、インキュベートされた細胞から得た電流−電圧関係から得た。全細胞伝導性へのカルシウム透過性チャネルの寄与があるかどうか、および全細胞伝導性のこの部分に、ＲＮＳ−６０食塩水を用いたインキュベーションにより影響を及ぼすかどうかを決定するために、細胞は、インキュベーション期間後、生理食塩水中にパッチされた（高ＮａＣｌの外部溶液を伴うが、内部溶液は、高ＫＣｌを含有する）。次いで、外部食塩水は、ＮａＣｌをＣｓＣｌにより置換した溶液と置換し、主要な外部陽イオンを置換することにより、伝導性の変化があるかどうかを判定した。これらの条件下で、同一の細胞は、次いで、カルシウム入力ステップが、更に明らかにされるように、カルシウムの濃度を増加させるように暴露された。
結果：
図１１９Ａ〜Ｄは、異なる外部食塩水を用いて、異なる電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣは、０ｍＶからのステッピングを示し、パネルＢおよびＤは、−１２０ｍＶからのステッピングを示す）、上皮細胞膜極性およびイオンチャネル活性における、界面動電的に生成された流体（例えば、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ））の効果を評価した、パッチクランプ実験の一連の結果を示す。これらの実験において、１５分間の一時点を使用した。Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）に関して、結果は、１）外部溶液として、ＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角印）を用いて、対照（ひし形印）と比較した際、線形挙動と共に全細胞伝導性が増加したこと、ならびに２）２０ｍＭ ＣａＣｌ２（丸印）および４０ｍＭ ＣａＣｌ２（三角印）の双方で、ＣａＣｌ２は、非線形法において、全細胞伝導性が増加したことを示す。ＲＮＳ−６０（パネルＣおよびＤ）に関して、結果は、１）外部溶液として、ＮａＣｌの代わりにＣｓＣｌ（四角印）を用いて、対照（ひし形印）と比較した際、全細胞伝導性における効果がほとんどなかったこと、ならびに２）４０ｍＭでのＣａＣｌ２（三角印）は、非線形法において、全細胞伝導性を増加したことを示す。
図１２０Ａ〜Ｄは、Ｓｏｌａｓ（パネルＡおよびＢ）ならびにＲｅｖｅｒａ６０（パネルＣおよびＤ）に対する２つの電圧プロトコルで（パネルＡおよびＣ．０ｍＶからのステッピング、ＢおよびＤ．−１２０ｍＶからのステッピング）、２０ｍＭ ＣａＣｌ２（ひし形印）および４０ｍＭ ＣａＣｌ２（四角印）電流データからのＣｓＣｌ電流データ（図１１９に示す）の減算から生じるグラフを示す。結果は、ＳｏｌａｓおよびＲＮＳ−６０溶液は共に、カルシウム誘発された非線形全細胞伝導性を活性化したことを示す。ＲＮＳ−６０（投与量反応性を示す）を用いた場合の効果が、より大きく、ＲＮＳ−６０を用いた場合のみ、より高いカルシウム濃度で増加した。更に、より高いカルシウム濃度で、非線形カルシウム依存性伝導性はまた、電圧プロトコルにより増加した。
この第２のセットの実験のデータは、Ｃａｌｕ−３細胞中で得られた全細胞伝導性データに対して、ＲＮＳ−６０食塩水およびＳｏｌａｓ食塩水の効果を更に示す。データは、いずれかの食塩水を用いた１５分間のインキュベーションは、全細胞伝導性における明らかな効果を生じ、これは、ＲＮＳ−６０を用いた場合、最も明らかであり、外部カルシウムが増加する際、ＲＮＳ−６０食塩水は、全細胞伝導性のカルシウム依存性非線形成分を増加することを示す。
蓄積された証拠は、イオンチャネルのＲｅｖａｌｅｓｉｏ食塩水による活性化を示唆し、これは、基底細胞伝導性への異なる寄与をなす。
出願者の他のデータ（例えば、出願者の他の実施例のデータ）を総合すれば、本発明の特定の態様は、細胞膜構造、膜電位もしくは膜伝導性、膜タンパク質もしくは受容体、イオンチャネル、脂質成分、または細胞により置換可能な細胞内成分（例えば、カルシウム依存性の細胞シグナリングシステム等のシグナル経路）のうちの少なくとも１つの調節を含む、細胞内シグナル変換を調節するための組成物および方法を提供し、これには、ＧＰＣＲおよび／またはｇタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない、細胞膜構造（例えば、膜および／もしくは膜タンパク質、受容体、または他の膜成分）の電気化学および／または立体構造の変化を与えるための本発明の界面動電的に生成された溶液の使用を含む。追加の態様によれば、これらの効果は、遺伝子発現を調節し、例えば、個々の伝達成分等の半減期において、持続、依存し得る。
実施例２５
（本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）の原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）測定は、制御「加圧ポット」に存在するもの（ＰＮＳ−６０）流体）よりも実質的に小さかった疎水性表面ナノバブルの存在および／または形成を示した
概略 出願者は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）において、疎水性ナノバブルを特徴付けるために、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）測定を使用した。
材料および方法：
ＡＦＭ研究 ＡＦＭ研究は、当該分野において認識されているＮａｎｏｔｅｃｈ Ｕｓｅｒ Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＮＴＵＦ）で行われた。ＡＦＭ研究のために、極細で精密な針を、疎水性表面に置かれた水の液滴に浸漬する。次いで、針を、約１５分間、１ｍｍ２等の速度で水／表面干渉上でスキャンする。針は、表面形状において、何らかの欠陥を記録し、小量の気泡の存在を記録するのに十分精密である。
水滴を置いたシリコン基板を、トリクロロ（１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロオクテル）シラン）を用いて調製し、得られる疎水性表面は、約９５度の接触角で、水にビーズ形成（ｂｅａｄ ｕｐ）させる。このコーティングは、特に耐久性があるため、ある程度、多くのＡＦＭ研究において使用される。
溶液調製 ２つの試験溶液：ＲＮＳ−６０およびＰＮＳ−６０を研究した。ＲＮＳ−６０は、６０ｐｐｍの酸素を含む、本発明の界面動電流体であり、一方、ＰＮＳ−６０は、加圧酸素ヘッド（即ち、加圧ポット含酸素流体）への従来の暴露により調製された６０ｐｐｍの酸素を含む、非界面動電対照流体である。各試験溶液を、最初に、少量の中性リン酸緩衝（ｐＨ７）溶液の添加により緩衝化し、約６０〜７０ｕＬの各緩衝化された試験溶液（約２２℃）を予め調製したシリカプレート上に置いた。
結果：
ＡＦＭの元で、ＲＮＳ−６０の液滴は、幅約２０ｎｍ、高さ約１．５ｎｍ以下の寸法を有する、１ｍｍ２の面積において、約２０個の疎水性ナノバブルを示した（図１２１Ａ）。対照的に、ＡＦＭの元で、ＰＮＳ−６０の液滴は、幅約６０ｎｍ、高さ約５ｎｍの寸法を有する、１ｍｍ２の面積において、約５個の疎水性ナノバブルを示した（図１２１Ｂ）。したがって、ＰＮＳ−６０の液滴は、ＲＮＳ６０の液滴と比較して、更に少なく、更に大きい疎水性ナノバブルを得た。
したがって、特定の態様によれば、ＲＮＳ−６０とＰＮＳ−６０試験溶液との間で、疎水性表面ナノバブルの大きさ分布において実質的な差異があり、ナノバブルは、ＡＦＭ測定中、試験流体中に当初から存在する、および／または試験流体内で形成されるかのいずれかである。
本明細書のいずれかの箇所で論じられるように、本発明の特定の態様において、本発明の界面動電的に改変された水性流体は、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造および流体によって生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成された、イオン水溶液を含む。
しかしながら、出願者は、ＡＦＭ実験において観察されるもの等の疎水性気泡（疎水性表面上に形成する）は、本明細書に開示される本発明の生物学的活性帯電安定化したナノ構造とは基本的には異なる可能性があることを指摘する。したがって、特定の態様によれば、大きさおよび分布疎水性気泡形成に基づいて、本発明の界面動電流体（例えば、ＲＮＳ−６０）が、非界面動電対照流体とは基本的には異なる、本実施例におけるＡＦＭ実験は、支援するが、疎水性気泡は、本明細書のいずれかの箇所で詳細の本発明の帯電安定化した酸素含有のナノ構造とは異なる、および／または由来する可能性がある。いずれにしても、本発明の界面動電流体に関して、対照加圧ポット含酸素流体は、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つを調節することが可能な帯電安定化した酸素含有のナノ構造を含まない。
実施例２６
（ＲＮＳ−６０は、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析により、細胞表面受容体：ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１１Ｂ、およびＣＤ３の発現への顕著な効果があったことを示した）
概略 出願者は、本発明の界面動電流体（ＲＮＳ−６０）あるいは生理食塩水対照流体のいずれかを用いてインキュベートした白血球における、細胞表面受容体のＣＤ１９３（ＣＣＲ３）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ１１Ｂ、およびＣＤ３の発現レベルを比較するために、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を使用した。
方法：
フィコールハイパックで分離したＰＢＭＣ（アフェレーシス−全ての細胞）を、ＲＮＳ６０または生理食塩水（ＮＳ）の３０％ 溶液中で、約１時間プレインキュベートした。
ＰＢＭＣは、２４時間または４０時間、２μｇ／ｍＬのＰＨＡ−Ｌで活性化した。
細胞は、収集し、遮断／染色緩衝液で洗浄し、染色し、固定した。
フローサイトメトリーにより細胞を分析した。
結果：
ＣＤ１９３（ＣＣＲ３）について、図１２２Ｂに示されるように、この受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で、生理食塩水対照の受容体発現レベルと比較して、実質的に下方調節される。この下方調節は、ＭＡＰＫ ｐ３８のリン酸化反応に影響を及ぼし（データは示さず）、同様に、エオタキシンを下方調節し（例えば、実施例１３および図５７を参照のこと）、同様に、ＩＬ５を下方調節し（データは示さず）、その上、好酸球数も変化させ（例えば、実施例１３を参照のこと）、このような例は、気管支収縮反応を変化させる、要因の一つである。
オホアルブミン刺激モデルの文脈において実施例１３において上記で論じられ、図５７に示されるように、ＲＮＳ−６０は、生理食塩水の効果と比較して、ＯＶＡ刺激群における血清エオタキシンレベルを低下させた。したがって、特定の態様によれば、ＲＮＳ−６０は、リガンドエオタキシンおよびその受容体ＣＣＲ３の双方を低下させる可能性がある。
ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）に関しては、図１２３Ａに示されるように、この受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で、生理食塩水の受容体発現レベルと比較して、下方調節される。
ＣＤ１１Ｂに関しては、図１２３Ｂに示されるように、この受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で、生理食塩水の受容体発現レベルと比較して、下方調節される。
ＣＤ３に関しては、図１２３Ｃに示されるように、この受容体は、ＲＮＳ−６０の存在下で、生理食塩水の受容体発現レベルと比較して、下方調節される。
実施例２７
（ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦκの活性化を減衰したが、生理食塩水（ＮＳ）は、減衰しなかった）
本実施例は、ＲＮＳ６０は、ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦκの活性化を減衰したが、生理食塩水（ＮＳ）は、減衰しなかったことを示す。したがって、特定の態様によれば、本発明の界面動電的に生成された流体は、糖尿病および関連代謝性障害、インスリン耐性、神経変性疾患（例えば、多発性硬化症（Ｍ．Ｓ．）、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠状動脈性疾患、網膜および／もしくは黄斑変性、消化系障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病等）が含まれるが、これらに限定されない、炎症および炎症を媒介した状態および疾患を治療するために、実質的な実用性を有する。
概略：
インスリン受容体シグナル経路の阻害は、炎症およびストレス反応が、インスリン耐性を媒介する中枢機序であることは、より一層明らかである（例えば、Ｗｅｌｌｅｎ ＆ Ｈｏｔａｍｉｓｌｉｇｉｌ，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１１５：１１１１−１１１９，２００５による概説を参照のこと）。
代謝および免疫経路のオーバーラップ 幾つかのセリン／トレオニンキナーゼは、炎症またはストレス刺激によって活性化され、ＪＮＫ、ＮＦ−κＢキナーゼ（ＩＫＫ）の阻害剤、およびＰＫＣ−θを含む、インスリンシグナルの阻害に寄与する（Ｚｉｃｋ，Ｙ．２００３．Ｒｏｌｅ ｏｆ Ｓｅｒ／Ｔｈｒ ｋｉｎａｓｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｕｎｃｏｕｐｌｉｎｇ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２７（Ｓｕｐｐｌ．３）：Ｓ５６−Ｓ６０）。更に、肥満におけるこれらのキナーゼの活性化は、代謝および免疫経路のオーバーラップを明らかにし、これらは、ＬＰＳ、ペプチドグリカン、二本鎖ＲＮＡ、および他の微生物産物に応答して、トール様受容体（ＴＬＲ）シグナルによる生得的免疫応答において活性化されるものと同じキナーゼ、特に、ＩＫＫおよびＪＮＫである（Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．２００１．Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１：１３５−１４５）。したがって、ＴＬＲシグナル経路の構成要素はまた、強力な代謝活性も示す可能性がある。
ＰＫＣおよびＩＫＫは、細胞脂質の代謝産物により活性化される。特に、脂質の代謝産物に応答して、インスリン作用に拮抗するのに大きな役割を果たす、２つの他の炎症性キナーゼは、ＩＫＫおよびＰＫＣ−θである。脂質注入は、ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）および脂肪酸アシルＣｏＡ等の細胞内脂肪酸の代謝産物のレベルの増加をもたらすことを実証している。この増加は、ＰＫＣ−θの活性化に相関し、ＩＲＳ−１のＳｅｒ３０７リン酸化反応を増加させる（Ｙｕ，Ｃ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄｓ ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｎｓｕｌｉｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−１（ＩＲＳ−１）−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ ３−ｋｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：５０２３０−５０２３６）。ＰＫＣ−θは、別のセリン／トレオニンキナーゼのＩＫＫβまたはＪＮＫの活性化によりインスリン作用を低下させ得る（Ｐｅｒｓｅｇｈｉｎ，Ｇ．，Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．，ａｎｄ Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｇ．Ｉ．２００３．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｌｉｎｋｓ ｗｉｔｈ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２７（Ｓｕｐｐｌ．３）：Ｓ６−Ｓ１１）。他のＰＫＣアイソフォームはまた、脂質により活性化されることが報告されており、また、インスリンシグナルの阻害にも関与し得る（Ｓｃｈｍｉｔｚ−Ｐｅｉｆｆｅｒ，Ｃ．２００２．Ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ Ｃ ａｎｄ ｌｉｐｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｓｋｅｌｅｔａｌ ｍｕｓｃｌｅ．Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９６７：１４６−１５７）。
ＩＫＫβは、ＮＦ−κＢを活性化することによりインスリンシグナルに影響を与えることができる。ＩＫＫβは、少なくとも２つの経路を通ってインスリンシグナルに影響を与えることができる。第一に、セリン残基において、ＩＲＳ−１を直接リン酸化することができる（Ｙｉｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｙ．，ａｎｄ Ｇａｙｎｏｒ，Ｒ．Ｂ．１９９８．Ｔｈｅ ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ ａｓｐｉｒｉｎ ａｎｄ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ ｉｎｈｉｂｉｔ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＩκＢ ｋｉｎａｓｅ−β．Ｎａｔｕｒｅ．３９６：７７−８０、Ｇａｏ，Ｚ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｓｅｒｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ １ ｂｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｋａｐｐａ Ｂ ｋｉｎａｓｅ ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４８１１５−４８１２１）。
第二に、ＩＫＫβは、ＮＦ−κＢ（ＩκＢ）の阻害剤をリン酸化し、ひいては、他の標的のうちで、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を含む、複数の炎症性メディエータの産生を刺激する転写因子のＮＦ−κＢを活性化することができる（Ｓｈｏｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｅ．，Ｌｅｅ，Ｊ．，ａｎｄ Ｙｕａｎ，Ｍ．２００３．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ＩＫＫβ／ＩκＢ／ＮＦ−κＢ ａｘｉｓ ｉｎ ｏｂｅｓｉｔｙ− ａｎｄ ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２７（Ｓｕｐｐｌ．３）：Ｓ４９−Ｓ５２）。ＩＫＫβに対するマウスヘテロ接合体は、脂質注入、高脂肪食、または遺伝的肥満により、インスリン耐性に対して、部分的に保護される（Ｙｕａｎ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ｏｂｅｓｉｔｙ− ａｎｄ ｄｉｅｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ ｏｒ ｔａｒｇｅｔｅｄ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＩＫＫβ Ｓｃｉｅｎｃｅ．２９３：１６７３−１６７７、Ｋｉｍ，Ｊ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．２００１．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｆａｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｂｙ ｓａｌｉｃｙｌａｔｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：４３７−４４６、ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００１１１５５９）。
更に、高用量のアスピリン治療によるヒト糖尿病におけるＩＫＫβの阻害はまた、インスリンシグナルを向上するが、この用量で、他のキナーゼも影響を及ぼすかどうかは明らかではない（Ｈｕｎｄａｌ，Ｒ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．２００２．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｙ ｗｈｉｃｈ ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ ａｓｐｉｒｉｎ ｉｍｐｒｏｖｅｓ ｇｌｕｃｏｓｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｉｎ ｔｙｐｅ ２ ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０９：１３２１−１３２６．ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００２１４９５５）。最近の研究はまた、インスリン耐性の発症における個々の組織または細胞型のＩＫＫの重要性を探り出し始めている。肝細胞および骨髄性細胞におけるＩＫＫの活性化は、肥満によって誘発されたインスリン耐性に寄与するように思われるが、この経路は、筋肉においてはあまり重要ではないかもしれない（Ｃａｉ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．２００５．Ｌｏｃａｌ ａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｓｕｌｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｈｅｐａｔｉｃ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＫＫβ ａｎｄ ＮＦ−κＢ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１８３−１９０、Ａｒｋａｎ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．２００５．ＩＫＫβ ｌｉｎｋｓ ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ ｔｏ ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：１９１−１９８、およびＲｏｈｌ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２００４．Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ ｏｆ ＩκＢ ｋｉｎａｓｅ ２ ｆａｉｌｓ ｔｏ ｐｒｅｖｅｎｔ ｏｂｅｓｉｔｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：４７４−４８１、ｄｏｉ：１０．１１７２／ＪＣＩ２００４１８７１２）。
方法 図１２４Ａおよび１２４Ｂに示される実験に関しては、ＭＢＰの免疫マウスから単離したＴ細胞は、ＭＢＰで再度抗原刺激を受け、２４時間後、細胞は、異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳを得た。処置から２時間後、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）においてモニターした。
図１２４Ｃに示される実験に関しては、ＭＢＰの免疫マウスから単離したＴ細胞は、ＮＦ−κＢ依存性レポーター構築物のＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃでトランスフェクトし、続いて、ＭＢＰで再度抗原刺激を受けた。ＭＢＰで再度抗原刺激を受けてから２４時間後、異なる濃度のＲＮＳ６０およびＮＳで、２時間、細胞を処理し、続いて、ルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）により全細胞抽出物のルシフェラーゼ活性のアッセイを行なった。別の場合では、ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞はまた、３０ｎＭ ＰＭＡで１時間刺激を受けた。これらの場合では、ＲＮＳ６０およびＮＳで事前に処理してから１時間後、ＰＭＡを添加した。結果は、３つの異なる実験の平均値＋標準偏差である。
結果 図１２４Ａ〜Ｃは、ＲＮＳ６０が、ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減衰したが、生理食塩水（ＮＳ）は、減衰しなかったことを示す。具体的には、図１２４Ａおよび１２４Ｂは、ＲＮＳ６０（図１２４Ａおよび１２４Ｂの真ん中の３つのレーンを参照のこと）が、用量反応法において、ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減衰したが、ＮＳ（図１２４Ａおよび１２４Ｂの最右のレーンを参照のこと）は、減衰しなかったことを示す。
同様に、図１２４Ｃの棒グラフは、ＲＮＳ６０（図１２４Ａおよび１２４Ｂの２番目、３番目、および４番目の棒を参照のこと）が、用量反応法において、ＭＢＰ抗原刺激を受けたＴ細胞におけるＮＦ−κＢの活性化を減衰したが、ＮＳ（図１２４Ａおよび１２４Ｂの５番目の棒を参照のこと）は、減衰せず、ひいては、全細胞抽出物のＮＦ−κＢ依存性レポーター構築物（ＰＢＩＩＸ−Ｌｕｃ）からのトランスフェクトしたルシフェラーゼ活性も減衰した。
したがって、特定の態様によれば、本開示の界面動電的に生成された流体は、糖尿病および関連代謝性障害、インスリン耐性、神経変性疾患（例えば、多発性硬化症（Ｍ．Ｓ．）、パーキンソン病、アルツハイマー病等）、喘息、嚢胞性線維症、血管／冠状動脈性疾患、網膜および／もしくは黄斑変性、消化系障害（例えば、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、クローン病等）が含まれるが、これらに限定されない、炎症および炎症を媒介した状態および疾患を治療するために、実質的な実用性を有する。
参照による組み込み
本願において言及される、および／または出願データシートに挙げられている、上記の米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、および非特許刊行物の全ては、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書の図面および詳細な説明は、制限的方法よりむしろ例示的なものであると見なされ、開示される特定の形態および例に対して本発明を限定することを意図しない。それとは逆に、本発明には、以下の特許請求により定義されるように、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、当業者には明らかな任意の更なる修正、変更、再配置、置換、代替、設計選択、および実施形態が含まれる。したがって、以下の特許請求は、全てのこのような修正、変更、再配置、置換、代替、設計選択、および実施形態を包含すると解釈されるべきであることを意図する。
前述の実施形態は、異なる他の成分内に含有された、または接続された、異なる成分を示す。このような示された構築物は、単に例示的であり、かつ同一の機能性を達成する多くの他の構築物が実施され得るという事実は、理解されるものとする。概念的な意味において、同一の機能性を達成するための成分の任意の配置は、所望の機能性を達成するように、効果的に「会合」される。故に、特定の機能性を達成するために組み合わせた本明細書の２つの成分は、構築物または媒介の成分に関係なく、所望の機能性を達成するように、互いに「会合する」と見なされ得る。同様に、このように会合された２つの成分はまた、所望の機能性を達成するように、互いに、「操作可能に接続される」または「操作可能に連結される」ものとして見られ得る。
本発明の特定の実施形態を示し、記載するが、本明細書の教示に基づいて、本発明およびその広範な態様から逸脱することなく、変更および修正がなされ得ることは、当業者には明らかであるため、それらの範囲内で全てのこのような変更および修正を包含する添付の特許請求の範囲は、本発明の真の精神および範囲内にある。更に、本発明が、単に添付の特許請求の範囲により定義されるものであることを理解されよう。一般に、本明細書、および特に、添付の特許請求の範囲（例えば、添付の特許請求の範囲の主要部）に使用される用語は、一般的に、「開放的な（ｏｐｅｎ）」用語（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「〜が含まれるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｂｕｔ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるものとし、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語は、「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ ａｔ ｌｅａｓｔ）」として解釈されるものとし、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」という用語は、「〜が含まれるが、これらに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ ｂｕｔ ｉｓ ｎｏｔ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ）」として解釈されるものとする等）として、意図されるものであることは、当業者には理解されよう。特定の数の導入される特許請求の範囲の詳述が意図される場合、このような意図は、特許請求の範囲中に明確に引用され、このような詳述がない場合、このような意図は存在しないことは、当業者には更に理解されよう。例えば、理解を助けるために、以下の添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲の詳述を導入するために、前置きの語句「少なくとも１つの（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ）」および「１つ以上（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）」の使用を含有し得る。しかしながら、このような語句の使用は、同一の請求項が前置きの語句「１つ以上」または「少なくとも１つの」、および「ａ」または「ａｎ」等の不定冠詞を含むときでさえも、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による特許請求の範囲の詳述の導入が、ただ１つのこのような詳述を含む発明のこのような導入された特許請求の範囲の詳述を含むいかなる特定の特許請求の範囲を制限することを意味すると解釈するべきではない；同じことが特許請求の範囲の詳述の導入に使用される定冠詞の使用にも当てはまる。加えて、特定の数の導入される特許請求の範囲の詳述が明確に引用される場合であっても、このような詳述は、少なくとも引用される数（例えば、他の修飾語句なしの「２つの詳述」の単なる詳述は、一般に少なくとも２つの詳述、または２つ以上の詳述を意味する）等を意味すると一般に解釈すべきことは、当業者には認識されよう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲による場合を除いて限定されない。

Claims (53)

  1. 糖尿病または糖尿病に関連する状態もしくは疾患、あるいはその症状を治療するための方法であって、それを必要とする対象に、約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含み、糖尿病または糖尿病に関連する状態もしくは疾患、あるいはその少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量で、前記イオン水性流体中に安定的に構成された、治療有効量の界面動電的に改変された水性流体を投与することを含む、方法。
  2. 前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体中での主要な帯電安定化したガス含有のナノ構造種である、請求項１に記載の界面動電流体。
  3. 前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造として流体中に存在する溶解酸素分子の割合は、０．０１％、０．１％、１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、および９５％超からなる群から選択される割合である、請求項１に記載の界面動電流体。
  4. 全ての溶解酸素は、前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造に実質的に存在する、請求項１に記載の界面動電流体。
  5. 前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、９０ｎｍ、８０ｎｍ、７０ｎｍ、６０ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１０ｎｍ、および５ｎｍ未満からなる群から選択される大きさより小さい平均直径を実質的に有する、請求項１に記載の界面動電流体。
  6. 前記イオン水溶液は、食塩溶液を含む、請求項１に記載の界面動電流体。
  7. 前記流体は、超酸素化されている、請求項１に記載の界面動電流体。
  8. 前記流体は、溶媒和電子の形態を含む、請求項１に記載の界面動電流体。
  9. 前記界面動電的に改変された水性流体の改変は、流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の暴露を含む、請求項１に記載の方法。
  10. 前記局在界面動電効果への暴露は、電圧パルスおよび電流パルスのうちの少なくとも１つへの暴露を含む、請求項９に記載の方法。
  11. 流体力学的に誘起された、局在界面動電効果への前記流体の暴露は、前記流体を生成するために使用される装置の界面動電効果を誘起する構造特性への前記流体の暴露を含む、請求項９に記載の方法。
  12. 前記糖尿病に関連する状態もしくは疾患は、糖尿病、インスリン依存性糖尿病もしくはＩＤＤＭ（１型）、非インスリン依存性糖尿病もしくはＮＩＤＤＭ（２型）、インスリン耐性、および糖尿病性網膜症からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の方法。
  13. 前記糖尿病に関連する状態もしくは疾患は、糖尿病およびインスリン耐性の少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の方法。
  14. 前記糖尿病に関連する状態もしくは疾患は、糖尿病を含む、請求項１３に記載の方法。
  15. 前記糖尿病に関連する状態もしくは疾患の前記少なくとも１つの症状は、慢性炎症、急性炎症、インスリン耐性からなる群から選択される少なくとも１つの状態に関連する、請求項１に記載の方法。
  16. 前記界面動電的に改変された水性流体は、一酸化窒素の局在性または細胞内レベルを調節する、請求項１に記載の方法。
  17. 前記界面動電的に改変された水性流体は、投与部位で、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＴＮＦ−α、およびＴＮＦ−βからなる群から選択される少なくとも１つのサイトカインの局在性の低下を促進する、請求項１に記載の方法。
  18. 別の抗炎症剤を用いて、同時に、または補助的に前記対象を治療することにより炎症の相乗的または非相乗的阻害または減少を更に含む、請求項１に記載の方法。
  19. 前記他の抗炎症剤は、ステロイドまたはグルココルチコイドステロイドを含む、請求項１８に記載の方法。
  20. 前記グルココルチコイドステロイドは、ブデソニドまたはその活性誘導体を含む、請求項１９に記載の方法。
  21. 少なくとも１つの追加の治療剤が、前記患者に投与される、併用療法を更に含む、請求項１に記載の方法。
  22. 前記少なくとも１つの追加の治療剤は、ビグアニド（メトホルミン、ブホルミン、およびフェンホルミンを含む）、インスリン、αグルコシダーゼ阻害剤、ビグアニド、ＤＰＰ−４阻害剤、メグリチニド、スルホニル尿素、チアゾリジンジオン、αグルコシダーゼ阻害剤（アカルボースおよびミグリトールを含む）、ＤＰＰ−４阻害剤（ビルダグリプチン、シタグリプチン、サクサグリプチン、リナグリプチン、およびアログリプチンを含む）、スルホニル尿素（アセトヘキサミド、クロルプロパミド、トルブタミド、トラザミド、グリプジド、グリクラジド、グリベンクラミド（グリブリド）、グリキドン、グリコピラミド、およびグリメピリドを含む）、メグリチニド（ナテグリニド、ミチグリニド、およびレパグリニドを含む）、チアゾリジンジオン（トログリタゾン、ピオグリタゾン、およびロジグリタゾンを含む）、ＭＭＰの阻害剤（ＭＭＰ−９およびＭＭＰ−２の阻害剤を含む）、短時間作用型β２−アゴニスト、長時間作用型β２−アゴニスト、抗コリン作用薬、コルチコステロイド、全身性コルチコステロイド、マスト細胞安定剤、ロイコトリエン修飾剤、メチルキサンチン、β２−アゴニスト、アルブテロール、レバルブテロール、ピルブテロール、アルホルモテロール、ホルモテロール、サルメテロール、抗コリン作用薬（イプラトロピウムおよびチオトロピウムを含む）、コルチコステロイド（ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、モメタゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾンを含む）、ロイコトリエン修飾剤（モンテルカスト、ザフィルルカスト、およびジレウトンを含む）、マスト細胞安定剤（クロモリンおよびネドクロミルを含む）、メチルキサンチン（テオフィリンを含む）、併用薬物（イプラトロピウムおよびアルブテロール、フルチカゾンおよびサルメテロール、ブデソニドおよびホルモテロールを含む）、抗ヒスタミン剤（ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、ロラタジン、セチリジン、およびヒドロコルチゾンを含む）、免疫系調節剤（タクロリムスおよびピメクロリムスを含む）、シクロスポリン、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、ならびにこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
  23. 前記少なくとも１つの追加の治療剤は、ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストである、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記ＴＳＬＰおよび／またはＴＳＬＰＲアンタゴニストは、ＴＳＬＰおよび前記ＴＳＬＰ受容体に対して特異的な中和抗体、可溶性ＴＳＬＰ受容体分子、およびＴＳＬＰ受容体融合タンパク質からなる群から選択され、１つより多い受容体鎖の構成要素をコードするＴＳＬＰＲ免疫グロブリンＦｃ分子またはポリペプチドを含む、請求項２３に記載の方法。
  25. 治療は、膜結合タンパク質の立体配座、リガンド結合活性、または触媒活性のうちの少なくとも１つの改変を含む、細胞膜構造または機能のうちの少なくとも１つの改変を含む、請求項１に記載の方法。
  26. 前記膜結合タンパク質は、受容体、膜貫通受容体、イオンチャネルタンパク質、細胞内付着タンパク質、細胞接着タンパク質、およびインテグリンからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の方法。
  27. 前記膜貫通受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）を含む、請求項２６に記載の方法。
  28. 前記Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、Ｇタンパク質αサブユニットと相互作用する、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記Ｇタンパク質αサブユニットは、Ｇαｓ、Ｇαｉ、Ｇαｑ、およびＧα１２からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の方法。
  30. 前記少なくとも１つのＧタンパク質αサブユニットは、Ｇαｑである、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、前記イオン水性流体による生細胞の接触時に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量で、前記イオン水性流体中に安定的に構成される、請求項１に記載の方法。
  32. 細胞膜伝導性の調節は、全細胞伝導性の調節を含む、請求項３１に記載の方法。
  33. 全細胞伝導性の調節は、前記全細胞伝導性のうちの少なくとも１つの電位依存性寄与の調節を含む、請求項３３に記載の方法。
  34. カルシウム依存性の細胞伝達経路またはシステムの調節を含む、請求項３１に記載の方法。
  35. ホスホリパーゼＣ活性の調節を含む、請求項３１に記載の方法。
  36. アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）活性の調節を含む、請求項３１に記載の方法。
  37. 慢性炎症、急性炎症、インスリン耐性からなる群から選択される少なくとも１つの状態または症状に関連する細胞内シグナル変換の調節を含む、請求項３１に記載の方法。
  38. 細胞ネットワークまたは層への投与を含み、その中の細胞間結合の調節を更に含む、請求項１に記載の方法。
  39. 前記細胞間結合は、密着結合、ギャップ結合、接着帯、およびデスモソーム（ｄｅｓｍａｓｏｍｅ）からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記細胞ネットワークまたは層は、ＣＮＳ血管の内皮細胞、内皮星状細胞密着結合、血液脳脊髄流体密着結合または関門、肺上皮型結合、気管支上皮型結合、および腸上皮型結合からなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記界面動電的に改変された水性流体は、含酸素であり、流体中の前記酸素は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素の量で存在する、請求項１に記載の方法。
  42. 前記界面動電的に改変された水性流体は、溶媒和電子、および界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種の形態の少なくとも１つを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 前記溶媒和電子、または界面動電的に修飾された、もしくは荷電された酸素種は、少なくとも０．０１ｐｐｍ、少なくとも０．１ｐｐｍ、少なくとも０．５ｐｐｍ、少なくとも１ｐｐｍ、少なくとも３ｐｐｍ、少なくとも５ｐｐｍ、少なくとも７ｐｐｍ、少なくとも１０ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、または少なくとも２０ｐｐｍの量で存在する、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記界面動電的に改変された含酸素水性流体は、分子酸素により、少なくとも部分的に安定化された溶媒和電子を含む、請求項４３に記載の方法。
  45. 細胞内シグナル変換の調節を提供するのに十分な細胞膜構造または機能を改変する能力は、密閉された気密性容器内において、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、またはそれ以上の長期間持続する、請求項１に記載の方法。
  46. 前記界面動電的に改変された流体の帯電安定化した酸素含有のナノ構造に存在する酸素量は、大気圧で、少なくとも８ｐｐｍ、少なくとも１５ｐｐｍ、少なくとも２０ｐｐｍ、少なくとも２５ｐｐｍ、少なくとも３０ｐｐｍ、少なくとも４０ｐｐｍ、少なくとも５０ｐｐｍ、または少なくとも６０ｐｐｍの酸素である、請求項１に記載の方法。
  47. 糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤を製剤化する方法であって、
    対象の、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤を得ることと、
    約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含み、炎症またはそれらの少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成された、界面動電的に改変された水性流体量を、治療剤と組み合わせることと、を含み、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤を製剤化することができる、方法。
  48. 前記帯電安定化した酸素含有のナノ構造は、流体により生細胞に接触した際に、細胞膜電位および細胞膜伝導性のうちの少なくとも１つの調節を提供するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成される、請求項４８に記載の方法。
  49. 医薬組成物であって、対象の、糖尿病、または糖尿病関連状態もしくは障害、またはその症状を治療するのに適している治療剤、および約１００ナノメートル未満の平均直径を実質的に有する帯電安定化した酸素含有のナノ構造のイオン水溶液を含み、炎症またはそれらの少なくとも１つの症状を治療するのに十分な量において、イオン水性流体中に安定的に構成された、界面動電的に改変された水性流体量を含む、医薬組成物。
  50. 請求項４８の方法によって調製される、医薬組成物。
  51. 治療は、局所、吸入、鼻腔内、および静脈内のうちの少なくとも１つによる投与を含む、請求項１に記載の方法。
  52. 前記膜結合タンパク質は、ＣＣＲ３を含む、請求項２５に記載の方法。
  53. 治療は、細胞内ＮＦ−κＢ発現および／または活性の調節を含む、請求項１に記載の方法。
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