JP2016063804A

JP2016063804A - ミトコンドリア活性化組成物

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Publication number: JP2016063804A
Application number: JP2015000580A
Authority: JP
Inventors: 亀井一郎; Ichiro Kamei
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-27
Filing date: 2015-01-05
Publication date: 2016-04-28
Also published as: CN105593363A; WO2015099201A1; HK1223975A1

Abstract

【課題】水素、酸素、窒素を含有するナノバブルを含有する組成物とその用途の提供。
【解決手段】水素０．４５〜０．５５ｐｐｍ、酸素１０〜１２．５ｐｐｍ、窒素７〜８ｐｐｍ含有する、粒径３０マイクロメートル以下のナノバブルを有効成分として含有する組成物、及び前記組成物を含有する、ミトコンドリア活性化組成物、細胞増殖促進剤、細胞保存液又は凍結保存液、前記組成物、剤又は液の使用方法、並びに前記組成物を使用して製造した飲食物又は飲食物原料。
【選択図】図１

Description

本発明は、ミトコンドリアを活性化する組成物に関する。より詳しくは、ナノバブルを含有するミトコンドリアを活性化する組成物に関する。

マイクロバブル、ナノバブルの技術を用いて気体を液体中に溶存させ、培養細胞の増殖を促進する方法としては、例えば、特許文献１のような方法が開示されている。しかしながら、特許文献１には、どのような大きさ、組成のマイクロバブル、ナノバブルを用いれば、どのような種類の細胞の増殖がどの程度促進されるか、などが具体的に詳細に開示されておらず、より実用的な組成物、方法、装置の開発が求められていた。また、さらに効率のよい増殖促進方法も求められていた。

飲料水にマイクロバブル、ナノバブルを用いて気体を混入した製品としては、水素水、水素酸素水等が知られている（例えば、特許文献２）。しかしながら、これらの飲料水では、十分満足できる効果を感じる人は一部に限られ、あまり普及していないのが現状である。したがって、十分な効果を実感できるマイクロバブル、ナノバブル飲料水が求められていた。また、新機能を有するマイクロバブル、ナノバブル飲料水も求められていた。

一方、ミトコンドリアはエネルギーを生み出す器官であり、ミトコンドリアの活性を上げることで、エネルギー生産を増やし、より活力のある体にすることができると考えられる。しかしながら、ミトコンドリアを活性化する飲料水についてはまだ開発されておらず、ミトコンドリアを活性化する飲料水の開発が求められていた。

また、細胞を凍結保存する際に生存率が低下したり、細胞が破壊されて内容物が漏出し、食感が悪化したり、風味が悪くなるという問題があった。そこで、生存率を高くし、風味を良くする細胞保存液の開発が望まれていた。

特願２００９−２３４６８３号公報特願２００８−５６７４１号公報

本発明は、水素、酸素、窒素を含有するナノバブルを含有する組成物とその用途を提供する。

本明細書によれば、以下の発明が提供される。
（１）水素0.45〜0.55ppm、酸素10〜12.5ppm、窒素7〜8ppm含有する、粒径３０マイクロメートル以下のナノバブルを有効成分として含有する組成物。ここで、各気体の濃度は溶存気体とナノバブルの両方を合わせた濃度である。
（２）（１）の組成物を有効成分として含有するミトコンドリア活性化剤組成物。ここで、ミトコンドリア活性化組成物はミトコンドリア活性化剤と同じ意味である。

（３）（１）または（２）の組成物を有効成分として含有する細胞増殖促進剤。この場合、細胞増殖促進剤は（１）および（２）の両方の組成物を含有していてもよい。
（４）（１）〜（３）のいずれか１の組成物又は剤を有効成分として含有する細胞保存液。ここで、剤は、（３）の細胞増殖促進剤を意味する。ただし、（２）のミトコンドリア活性化組成物がミトコンドリア活性化剤と補正された場合はミトコンドリア活性化剤も剤に含まれる。また、「いずれか１の」とは、「少なくともいずれか１の」という意味であり、「いずれか１のみの」という意味ではない。したがって、（１）〜（３）のうち２以上又は３以上の組成物または剤を含むものも技術的範囲に含まれる。以下も同様であり、「いずれか１の」は「（少なくとも）いずれか１の」の意味である。
（５）（１）〜（４）のいずれか１の組成物、剤又は液を有効成分として含有する凍結保存液。ここで、剤は（４）と同じ意味であり、液は、（４）の細胞保存液を意味する。

（６）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液を含有する飲食物。ここで、液は（４）の細胞保存液に加えて（５）の凍結保存液も含む。
（７）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液で処理した原材料を使用して製造された飲食物。
（８）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液を用いてミトコンドリアを活性化する方法。
（９）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて細胞増殖を促進する方法。

（１０）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて細胞を保存する方法。
（１１）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて凍結保存する方法。
（１２）（１）〜（５）のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて飲食物またはその原材料を処理する工程を含む、飲食物の製造方法。
（１３）（１）の組成物を用いて調製した細胞培養用培地。
（１４）（１）の組成物を用いて調製した植物水耕栽培用溶液。
（１５）（１３）の培地を用いて動物細胞を増殖させる方法。
（１６）動物細胞が免疫系細胞である、（１５）の動物細胞を増殖させる方法。

（１７）（１）もしくは（２）に記載の組成物、または（３）に記載の細胞増殖促進剤を有効成分とする動脈硬化症の予防・治療剤。
（１８）（１）もしくは（２）に記載の組成物、または（３）に記載の細胞増殖促進剤を有効成分とする糖尿病の予防・治療剤。
（１９）（１）または（２）に記載の組成物を含む注射液。この場合、該組成物を有効成分として含んでいてもよい。

本発明の組成物によれば、ミトコンドリアを活性化し、細胞増殖を促進し、細胞の保存、凍結保存の際の細胞へのダメージが少なくなるという効果が得られる。

図１は、本発明の組成物の細胞培養の増殖促進効果を表す図である。図２は、本発明の組成物の抗酸化作用を表す図である。図３は各種薬剤に対するＡＴＰ産生量の影響を表す図である。図４は本発明の組成物を摂取する前後のＧＰＴの変化を表す図である。図５は、本発明の組成物を摂取する前後のＨＥＬの生成速度を表す図である。図６は、本発明の組成物を摂取する前後のＳＴＡＳの変化を表す図である。図７は、本発明の組成物のＥＳ細胞の細胞培養の増殖促進効果を表す図である。図８は、ＦＡＣＳ解析によるリンパ球中の各細胞の分布割合を示す図である。図９は、本発明のＭＣＰを添加した際のＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞の増殖促進効果を対照区を１として比率で示した図である。図１０は、本発明の組成物の免疫細胞の増殖促進効果を表す図である。図１１は、本発明の組成物の免疫細胞の増殖促進効果を表す図である。図１２は、本発明の組成物の免疫細胞の増殖促進効果を表す図である。図１３は、本発明の組成物の免疫細胞の増殖促進効果を表す図である。図１４は、本発明の組成物の動脈硬化症に対する効果を表す図である。図１５は、本発明の組成物の動脈硬化症に対する効果を表す図である。図１６は、本発明の組成物のII型糖尿病に対する効果を表す図である。図１７は、ＭＣＰ摂取後の血液検査の結果を示す図である。図１８は、本発明の組成物の繊維芽細胞の増殖促進効果を表す図である。図１９は、本発明の組成物の炎症治癒効果を表す図である。

本発明は、水素0.45〜0.55ppm、酸素10〜12.5ppm、窒素7〜8ppm含有する、粒径３０マイクロメートル以下のマイクロバブルおよび／またはナノバブルを有効成分として含有する組成物を提供する。この組成物は、ミトコンドリア活性化、細胞増殖促進、細胞保存、細胞凍結保存、飲食物、注射液等に利用することができる。

本発明の組成物に含まれる気体の好ましい濃度は、水素0.1〜3.0ppm、酸素5〜20ppm、窒素3〜20ppm、より好ましくは、水素0.3〜1.0ppm、酸素7〜15ppm、窒素4〜15ppm、さらに好ましくは、水素0.4〜0.6ppm、酸素9〜13ppm、窒素5〜10ppm、特に好ましくは、水素0.45〜0.55ppm、酸素10〜12.5ppm、窒素7〜8ppmである。なお、これらの濃度は、それぞれの濃度でそれなりの効果を有するため、この範囲内であれば、どこで区切っても本発明の効果を有するものである。なお、ppmとはパート・パー・ミリオンを意味し、溶存気体の濃度を表す。
本発明の組成物に含まれる気体は、粒径が０より大きく、３０マイクロメートル以下が好ましく、より好ましくは２０マイクロメートル以下、さらに好ましくは１０マイクロメートル以下、よりさらに好ましくは１マイクロメートル以下、特に好ましくは１００マイクロメートル以下、最も好ましくは３０ナノメートル以下である。
植物の水耕栽培などにおいては、ナノバブルに加えて、マイクロバブルの気体を用いることで増殖効率を上げることができる。その場合、マイクロバブルの大きさとしては、
１〜１００マイクロメートルが好ましく、より好ましくは５〜８０マイクロメートル、さらに好ましくは１０〜７０マイクロメートル、特に好ましくは１５〜６０マイクロメートル、最も好ましくは２０〜５０マイクロメートルである。これらは全てのマイクロバブルまたはナノバブルがこの大きさに含まれることを意味するわけではなく、マイクロバブルまたはナノバブル全体の６０％以上がこの大きさであればよい。

本発明のナノバブルを含有する組成物は、水素、酸素、窒素ガスをナノバブル化して水（例えば、超純水）に混入させることにより製造される。ガスの純度は特に限定されないが、飲料水等に用いる場合は、高純度ガスを用いることが好ましい。

ナノバブルは、例えば、液体中に導入した気体を剪断破壊して微細化すること等により発生させることができ、種々のナノバブル発生装置が開発されている。本発明においてナノバブル発生装置は、一般的なナノバブル発生装置であれば特に制限なく使用できるが、例えば、ナノバブル発生装置バヴィタス（登録商標、株式会社Ｌｉｇａｒｉｃ社製）や、ナノバブル発生装置ナノアクア（登録商標、株式会社テックコーポレーション製）等が好適に用いられる。
本発明のナノバブルを含有する組成物の形態は特に限定されないが、典型的には水であり、飲料水、培地調製用の水、魚類の生簀の水、植物の散布用水等に使用できる。

機能水（ナノバブル水）を製造するための器機の構成は以下のものを含む。水素ガスボンベ、酸素ガスボンベ、窒素ガスボンベ又は窒素ガス発生装置、デジタル制御型レギュレーター、オゾン水発生装置。ナノバブル発生装置、注水タンク、各種フィルター群。
まず、１ppm程度のオゾン水を使用して、ナノバブル発生装置、注水タンク、配管等を殺菌洗浄する。機能水の原水として淡水を使用する場合、通過させるフィルターの構成は中空糸膜フィルター、活性炭フィルター、中空糸膜フィルターをこの順に配列したものを１ユニットとして使用し、水道水が原水の場合は通常２ユニットを使用する。ユニットの数は、原水の不純物の程度により適宜増減させることができる。この濾過ユニットを通過させた濾過水を、0.25μm〜0.45μmのメンブレンフィルター（目的によっては逆浸透膜フィルター）を通過させ、さらに濾過し注水タンクに注水する。
デジタル制御型レギュレーターにより調整した濃度のガス体を各ボンベ等からナノバブル発生装置に送り込み、注水タンク内の濾過水に各ガス体とナノバブルを、ナノバブル発生装置と注水タンクとの間で循環させながら、各ガス体が目的の容存量の数値に成るまで容存させる。各種検査器機で、水中のガス体が目的の容存量に達した状態のものを、注水タンクから0.25μm〜0.45μmのメンブレンフィルターを通過させて使用する。

本発明は、ミトコンドリアを活性化する活性化剤を提供する。ミトコンドリアの活性化はＡＴＰ産生量を測定することにより、ＡＴＰ産生量の増加として測定できる。
本明細書において、「ミトコンドリア活性化」とは、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生量が対照区よりも高くなることを言う。対照区とは、典型的には通常の水（超純水）を言うが、これに限られず本発明のナノバブルを含まない以外は同じ組成の組成物を用いる実験区を意味する。本発明の組成物を使用することにより、酸化ストレス負荷時において、ミトコンドリアにおけるＡＴＰ産生量が対照区よりも高くなる効果を有する。

本発明の組成物によれば、高い細胞増殖促進効果が得られる。例えば、本発明の組成物（水溶液）を用いて細胞培養用培地を調製し、細胞を培養した場合、通常の水（超純水）を用いた培地に比べ高い増殖促進効果が得られる。

例えば、iPS細胞（induced pluripotent stem cells、誘導多能性幹細胞）の培養において、72時間培養で、通常の超純水を用いた培地で培養した場合の約２倍の増殖促進効果が得られた（図１）。この細胞増殖促進剤は、他の培養細胞、例えば、初代培養細胞、未分化細胞、造血細胞、繊維芽細胞、不死化細胞、幹細胞等、増殖可能な細胞にも使用できる。ここで培養細胞とは、特に限定されないが、１次体細胞、株化細胞、不死化細胞、幹細胞等分裂可能な細胞を言う。幹細胞とは、胚性幹細胞および体性幹細胞を含み、例えば、神経幹細胞、肝幹細胞、皮膚幹細胞、生殖幹細胞、iPS細胞等を言うがこれらに限られない。増殖可能な細胞とは、増殖能を有する細胞をいい、１次体細胞の培養細胞、未分化細胞、前駆細胞等が含まれる。

培養細胞作製のための出発材料として用いることのできる体細胞は、哺乳動物（例えば、マウスまたはヒト）由来の生殖細胞以外のいかなる細胞であってもよく、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Tリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞（組織前駆細胞）等が挙げられる。細胞の分化の程度に特に制限はなく、未分化な前駆細胞（体性幹細胞も含む）であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。

また、本発明の組成物を用いることで植物細胞の増殖促進効果も得られる。本発明の組成物を用いて培地または水耕栽培溶液を調製し、植物に使用することにより、増殖促進効果が得られる。特に水耕栽培では本発明の組成物とともに空気のマイクロバブル（サイズ１０ｎｍ〜３０ｎｍ）を加えることで、地上部乾物重、地上部新鮮重、地下部乾物重、地下部新鮮重とも１０〜２０％増加した（実施例１４、表７参照）

本発明の組成物によれば、細胞の活性を高く保った状態で細胞を保存することができる。例えば、魚類を本発明の組成物を含む水で生育させ、または保存することで、ミトコンドリアの活性を高く保つことができ、風味のよい食品を提供することができる。これは、ミトコンドリアが活性化されるとＡＴＰの産生量が増加し、その分解物であるイノシン酸（ＩＭＰ）等の旨味成分も増加するためと考えられる。すなわち、本発明の組成物によれば、旨味の増加した食品を提供することができる。

本発明の組成物は、飲食物にそのまま添加することもでき、飲食物の原料として使用したり、飲食物又は飲食物原料の加工用に使用することもできる。ここで、飲食物とは、限定されないが、人が食する飲み物および食べ物を意味する。例えば、健康補助食品、低カロリー食品、ダイエット食品、パン、乳製品（例えば、無脂肪乳、ヨーグルト、プリン、豆乳など）、麺（例えば、うどん、中華麺、ワンタン、餃子の皮、蕎麦など）、菓子（例えば、クッキー、和菓子、蒸しパン、ポテトチップス、チョコレート、カスタードクリームなど）、飲料（例えば、スープ、野菜飲料、ダイエットドリンク、紅茶、コーヒーなど）、デザート（例えば、ケーキ、ムースなど）、冷菓子（例えば、ゼリー、アイスクリームなど）、惣菜（例えば、つみれ、伊達巻、から揚げなど）、シリアル、フィリング、ドレッシング、焼き食物、肉製品（例えば、ソーセージなど）が挙げられる。

本発明の組成物は、飼料に添加して使用することもできる。飼料とは、限定されないが、人を除く動物、好ましくは、魚類、家畜、愛玩動物などの飲み物および食べ物を意味する。また、魚のえさなども含む。より好ましくは、魚類用の生簀、水槽、池等の水、牛、豚、羊、鶏、馬、イヌ、ネコなどの飲み物および食べ物である。
また、本発明の組成物は、注射用剤（点滴剤も含む）としても使用できる。例えば、ペット、家畜、実験動物および／またはヒトなどに注射することで、免疫細胞の増殖促進作用、糖尿病・動脈硬化症・炎症などの予防および／または治療薬としても用いることができる。または、注射液を調製するために本発明の組成物を使用してもよい。

以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明の範囲は何らこれらの実施例により制限されるものではない。

（実施例１）
iPS細胞培地は、以下のようにして調製した。1Lの蒸留水（DW）または本発明の組成物（APAS）に12.5gのGlasgow minimum essential medium (Sigma;G6148)と2.75 gのSodium bicarbonate (Sigma;S5761)を加え攪拌した。この溶液に、以下の終濃度になるように各試薬を添加した：0.1mM MEM Non-Essential Amino Acids Solusion (Gibco;11140)と1mM Sodium pyruvate solution (Sigma;S8636)、1% Fetal bovine serum (CCB;171012)、1% PenicillinStreptomycin (Gibco;15140)、5.4% Knockout Serum Replacement (Gibco;10828)、0.1mM 2-Mercaptoethanol (Wako;137-06862)、2000 U/ml Leukemia inhibitor factor (Millipore;ESG1107)。均一になるまで撹拌し、溶解した後、0.45μmフィルターで濾過滅菌し細胞維持培地とした。
培養の結果を図１に示す。その結果、本発明の組成物を用いて培地を作成した場合、通常の超純水を用いて作成した培地を用いた場合とでは、本発明の組成物を用いて作成した培地の方が、対照の超純水培地に比べ約２倍の増殖量が得られた。

（実施例２）マウス血管内皮細胞株（ＭＡＥＣ）を用いた抗酸化作用の検討
本発明の組成物を含む水、ナノバブル水（空気を含むナノバブル水）、水素ナノバブル水（水素を溶存気体、マイクロバブルおよびナノバブルの合計の７０％以上含むナノバブル水）をそれぞれ用いて、Ｍ１９９培地（ＳＩＧＭＡ）を作製し、１０％ウシ胎児血清、１００ＩＵ／ｍｌペニシリン、及び１００μｌ／ｍｌストレプトマイシンを加え、培養用培地とした。それぞれの水を用いた培地でＭＡＥＣを２４時間培養した後、新鮮な培地に交換してさらに２時間培養した。その後３０μｇ／ｍｌアンチマイシンを各々の培地に添加し、３０分間培養した。対照として溶媒として用いたエタノールをアンチマイシン溶液に含まれる用量と同量である０．０６ｖ／ｖ％になるように加えた。アンチマイシンは、ミトコンドリアの電子伝達系を抑制することにより細胞にＲＯＳ（活性酸素種、Reactive Oxygen Species)を産生させる作用があることが知られている。エタノールは一般にアンチマイシンの溶媒として用いられるもので、その溶媒の影響を知るためにアンチマイシンを含まないエタノールのみを加えた場合についてもテストした。産生されたＲＯＳの量を知るために、蛍光強度を指標として、その蛍光強度を有する細胞の数を計測した。具体的には、ＲＯＳを検出するためのプローブとしてＣＭ−Ｈ２ＤＣＦＤＡを用い、各細胞からの蛍光の強度をフローサイトメーター（ＶａｎｔａｇｅＳＥ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）により検出した。

ＲＯＳの検出結果を図２に示す。図２の各グラフは、ある蛍光強度を示す細胞数を示すものであり、ＭＦＩの値は平均蛍光強度を示す。ナノバブル水（ＮＢ；上段）を用いた培地でＭＡＥＣ細胞を培養した場合は、無刺激時（左列）と溶媒コントロールのエタノールのみを添加した場合（真中列）とで平均蛍光強度に殆ど変化が認められなかったが、ＲＯＳ産生作用をもつアンチマイシンを添加した場合（右列）には平均蛍光強度が顕著に増強した。これに対して本発明の組成物を含む水（Ｏ２・Ｈ２・Ｎ２ＮＢ；下段）で培養した場合には、ナノバブル水を用いた培地で培養したときよりも、無刺激とアンチマイシン添加のいずれの場合にも低い平均蛍光強度が得られた。また、水素ナノバブル水（Ｈ２ＮＢ；中段）を用いた培地で培養したときと本発明の組成物を含む水を用いた培地で培養したときとを比較すると、本発明の組成物を含む水の方を用いた培地で培養した方が、無刺激の場合、エタノールのみを添加した場合、アンチマイシンを添加した場合の全てにおいて、低い平均蛍光強度を示していた。この結果から本発明の組成物を含む水の強い抗酸化作用が認められた。

（実施例３）マウス血管内皮細胞株（ＭＡＥＣ）における酸化ストレス負荷時のＡＴＰ産生の検討
次に、ＭＡＥＣにおいて酸化ストレス負荷時に低下するミトコンドリアの機能へのＡＴＰ産生活性水の作用を確認するために、細胞内ＡＴＰ産生について検討を行った。ＭＡＥＣ細胞は上記実験と同様に本発明の組成物を含む水、ナノバブル水、水素ナノバブル水を用いて作製した培養用培地にて培養した。それぞれの水を用いた培地でＭＡＥＣを２４時間培養した後、培地をそれぞれの水を用いた新鮮な培地に交換してさらに２時間培養した。次いで、５０μｇ／ｍｌアンチマイシン、０．０６ｖ／ｖ％エタノール、５００μｍｏｌ／Ｌ過酸化水素をそれぞれの培地に添加した。また、抗酸化作用のコントロールとして、広汎な活性酸素種に作用する抗酸化剤のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）を用いた。抗酸化作用のコントロール用の培地は、通常の水を用いて作製した。この培地に、ＭＡＥＣ細胞を２４時間培養し、通常の水を用いた新鮮な培地に交換してさらに２時間培養した。次いで、ＮＡＣを、終濃度が５ｍｍｏｌ／Ｌとなるようにアンチマイシンあるいは過酸化水素水処理の３０分前に培地に添加した。その後、細胞内のＡＴＰ量の変化をルシフェラーゼ活性を指標に測定した（ＡＴＰｌｉｔｅ、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。

細胞内のＡＴＰ量の測定結果を図３に示す。ナノバブル水（ＮＢ）を用いた培地で培養した細胞では、ＡＴＰ量は、エタノール処理と、アンチマイシン処理、過酸化水素処理の全てで、無刺激の場合と比較して低下が認められた。この結果から、エタノール、アンチマイシン、及び過酸化水素は、ＡＴＰ産生活性の抑制効果を有することがわかる。

アンチマイシン処理では過酸化水素処理よりも強いＡＴＰ産生活性の低下が認められた。水素ナノバブル水（Ｈ２ＮＢ）、本発明の組成物を含む水（Ｏ２・Ｈ２・Ｎ２ＮＢをそれぞれ用いた培地で培養した細胞では、いずれの処理を行った場合もＡＴＰ産生活性の増加が認められた。すなわち、水素ナノバブル水と本発明の組成物を含む水は、アンチマイシン等によるＡＴＰ産生活性の抑制効果を、抗酸化剤であるＮＡＣと同等もしくはそれ以上に低減させることが認められた。さらに、本発明の組成物を含む水は、エタノール又は過酸化水素で処理した場合に、水素ナノバブル水よりも、有意にＡＴＰ産生活性の抑制効果を低減させた。

（実施例３）ヒトにおける飲用効果の検討
本発明の組成物を含む水をヒトが飲用した場合の生体に与える効果を明らかにすることを目的とし、ヒトにおける飲用実験を実施した。実験に参加したヒトは、４０〜６９歳（平均年齢５１．８歳）の男性４名、女性１名であった。各々の参加者の年齢と性別を表１に示す。全ての参加者は健康な状態であった。

各々の参加者が本発明の組成物を含む水を１Ｌ／日、４週間飲用し、通常と変わらない生活を心がけた。参加者は、飲用開始前に血液を採取され、飲用開始後４週間目に再び血液を採取された。採血の当日は本発明の組成物を含む水を飲用しないこととした。検査は、肝障害の指標であるＧＰＴ（ｇｌｕｔａｍｉｃｐｙｒｕｖｉｃｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ）、過酸化脂質マーカーであるＨＥＬ（ｈｅｘａｎｏｙｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、及び水溶性総抗酸化物質として知られているＳＴＡＳ（ＳｅｒｕｍＴｏｔａｌＡｎｔｉｏｘｉｄａｎｔＳｔａｔｕｓ）について行った。

（１）ＧＰＴ
ＧＰＴは、主に肝臓に存在する酵素である。肝細胞が破壊されると特異的に血中に漏出することから肝炎ウイルスや薬物などによる肝障害の指標として利用される。この他、肝脂肪ではＧＯＴ、ＧＰＴの値が軽度の異常であることが多く、肥満による脂肪肝は、ＧＯＴよりＧＰＴがやや高くなることも知られている。ＧＰＴは、血清中の濃度をシリカリキッドＡＬＴ試薬（関東化学株式会社製）を使用し、ＢｉｏＭａｊａｓｅｓｔｙ（ＪＣＡ−ＢＭ８０６０）（日本電子株式会社製）とオリンパスＡＵ５４３１型生化学自動分析装置（オリンパス株式会社製）を用いて測定した。血清は、採取した血液を凝固させて、遠心分離して分離、回収した。測定結果を図４に箱ひげ図で示す。図４を参照すると、本発明の組成物を含む水の摂取後では、ＧＰＴの値が摂取前と比較して明らかに減少していた（Ｐ＝０．０４２）。従って、本発明の組成物を含む水の飲用により、脂肪肝の改善傾向が認められた。

（２）ＨＥＬ
ＨＥＬは、活性酸素種による脂質の過酸化過程において、脂質ペルオキシド（１３−Ｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｙ−ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄ、１３−ＨＰＯＤＥ）に由来する安定な初期生成物であり、従来用いられてきた４−ＨＮＥやＭＤＡ等のアルデヒド系脂質過酸化マーカーとは異なり、脂質過酸化の初期段階を捉えることが可能なマーカーである。ＨＥＬは、血清中の濃度を、ヘキサノイルリジン測定用ＥＬＩＳＡキット（ＫＨＬ−７００、日研ザイル株式会社製）を使用し、全自動マイクロプレートＥＩＡ分析装置ＡＰ９６０（協和メディックス株式会社製）を用いて測定した。測定結果を図５に箱ひげ図で示す。図５を参照すると、ＨＥＬはＡＴＰ産生活性水の飲用後に有意に減少した（Ｐ＝０．０２８）。従って、本発明の組成物を含む水は、ヒトにおいて脂質過酸化を抑制する効果があることが示された。

（３）ＳＴＡＳ
ＳＴＡＳは、血清中の水溶性抗酸化物質であり、酸化ストレスに対する総合的な抗酸化能が測定可能である。ＳＴＡＳは、血清について、ＴＯＴＡＬＡＮＴＩＯＸＩＤＡＮＴＳＴＡＴＵＳ（ＮＸ２３３２、ＲＡＮＤＯＸ社製）を使用して、７０２０形日立自動分析装置（株式会社日立ハイテクノロジーズ製）を用いて測定した。測定の結果を図６に箱ひげ図で示す。図６を参照すると、ＳＴＡＳは摂取後に有意に低い値を示していた（Ｐ＝０．０４２）。この結果から、ＳＴＡＳは水溶性の抗酸化物質を総合的に評価していることから、本発明の組成物を含む水により酸化ストレスの消去効果が期待されるヒドロキシラジカルや過酸化亜硝酸以外の活性酸素種の還元に本発明の組成物を含む水が作用していることが推測された。

（実施例４）
２名の被験者（O, I）に本発明の組成物を含む水（ＡＰＡＳ、Ｏ２・Ｈ２・Ｎ２ＮＢ水、ＭＣＰともいう）を１日５００ｍL、１か月間摂取させ、その前後に血液検査を行った。
結果
・被験者 O
本発明の組成物を含む水の摂取前の値を比較すると、摂取後ではALP（アルカリホスファターゼ)、ALT、γ-GTPで値が改善していた。また、総コレステロール、LDLコレステロール、遊離脂肪酸の値においても改善していた。
・被験者 I
本発明の組成物を含む水の摂取前の値を比較すると、摂取後ではALP（アルカリホスファターゼ)、ALT、γ-GTPで値が改善していた。また、総コレステロール、LDLコレステロール、遊離脂肪酸、中性脂肪の値においても改善していた。

２人の結果から総合的に判断すると、本発明の組成物を含む水を摂取することにより、肝機能の改善が成されたことから、脂質系の臨床検査値が改善したと考えられる。

（実施例５）
ＥＳ細胞の増殖率に関するin vitro実験
ＤＷまたはＡＰＡＳを用いて調製した培地（実施例１のiPS細胞培地と同じ組成）におけるマウスＥＳ細胞の増殖を調べたところ、培養３日目の増殖率を１とした場合に、ＡＰＡＳを用いて培地を調製すると、約１．５倍の増殖率が観察された（図７）。

（実施例６）
ＭＣＰによる免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）の増殖促進に関するin vivo実験
培地に添加した水の種類
実験Ａ
（１）原水（ＭＣＰ作成用原水）
（２）原水＋ガス体（フィルタ濾過無し）
（３）原水＋ガス体＋０．２２μｍフィルタ
ラットの飼育方法実験動物としてはSDラット（12w）オスを用いた。ラットへの水の与え方は経口と腹腔内投与の両方で行った。腹腔内投与は腹腔内注射により行った。経口投与用には0.22μｍフィルターで滅菌したMCPを用いた。その一方で、コントロール群には、備え付けのDWを投与した。腹腔内投与は10×PBSに対してMCPもしくは培養用DWを1×に希釈して用いた（1ml×2/日）。水交換と注射は朝と夜の1日2回ずつ行った。
実験期間試験開始から3日目と7日目で評価した。コントロール群（n=2）と試験群（n=2）を1回の評価で使用した。

実験方法
ラットの心採血（4ml）を行い、血液を15mlチューブに加えた。このチューブに1/5倍量のHetaSep（800μl）を加えてよく混合し、インキュベート（37℃, over 2h）した。その後、赤血球層の分離確認を行った。2時間後に、リンパ球成分がチューブ周辺に、赤血球成分がチューブ中央に凝固したため、この時点でピペットで約2mlのリンパ球成分を分離した。次に、リンパ球成分を15mlチューブに 2ml/sampleで回収、遠心（3,000 rpm, 8 min, RT）した。PBS（RT）で 30μl/sampleに調整してエッペンチューブに30μl/tubeで分注、余りはコントロール用に用いた。IOTest（30μl）を各チューブに加え、ピペッティング（Sample:IOTest = 1:1）した。その後、抗体反応を20min/RTで行い、FACS buffer（1×）で洗浄し、遠心（3,000 rpm, 5 min, RT）した。上清を除去後、遮光下でVersaLyse（500μl/tube）を加え、RTで 10min静置した。その後、総細胞数カウントとFACSによる免疫細胞比率の計測を行った。

結果
FACS解析の結果を図８に示す。また、図９に示すように、MCP投与群でDW投与群を１として比較した場合、T細胞、B細胞、NK細胞の全ての増加が認められた。それぞれの細胞数の増加の割合にはあまり大きな差は認められなかったが、その中でもB細胞のMCP投与群での増加率が大きかった。本実施例より、本発明のＭＣＰは注射剤としても使用できることが示された。

（実施例７）
この実験では、（１）原水:MCP作成用原水、（２）MCP、（３）MCP+ 0.22ミクロンフィルター:MCPを0.22ミクロンフィルターに通したものの3種類の水を、経口投与および腹腔内注射（1ml×2/日、朝、夜）でラットに投与し、7日間の飼育後のラット血液リンパ球中の各画分の量の比較を行った。
試験開始7日後の観察では、どの個体も注射の過剰量投与による腹の膨らみや下痢といった症状は認められず元気だった。

結果（7日目）顕微鏡下での細胞数計測時に（２）および（３）を投与した場合にリンパ球数に有意の増加を認めた（図１０）。このことから、MCPは血中リンパ球数を増加させる作用を持つことが明らかになった。具体的な総リンパ球数は、（１）では、50.2x10⁴、（２）では161x10⁴、（３）では83x10⁴であり、（１）を1とした時の比率は、（２）で3.21、（３）で1.66であった。すなわち、MCPを投与した場合のリンパ球数の増加率は、実験に供した3個体の平均で321%であった。3種類の水を投与した場合のリンパ球内のT細胞、B細胞、NK細胞数、および（１）投与群での細胞数を1とした場合の（２）および（３）投与群での各細胞数の比率を図１１および図１２に示す。図１２によるT細胞、B細胞、NK細胞数の比率は、通常のラットで知られている比率に類似したものであった。図１２によると、MCP投与群でのDW投与群に比較したこれら3種類の細胞数の増加率では、B細胞の増加率が他の2種類の細胞の増加率と比較して大きかった。リンパ球内の各細胞画分のうち、NK細胞数の（１）を基準１とした（２）および（３）での比率を図１２に示す。図１２によると、（２）でのNK細胞増加率は計測した3個体の平均で348%であった。実験（１）と（２）の結果の比較検討いずれの実験においても、MCPを投与した場合に、ガスを加えていない水（DWあるいはMCP作成用原水）を投与した場合と比べて、血液中にT細胞、B細胞、NK細胞の全てが増加していた。これは、MCPの中核成分であるガス体にリンパ球増殖促進作用のあることを示している。また、両実験とも、それぞれの細胞数の増加の割合にはあまり大きな差を示さなかったが、その中でもB細胞の増加率が大きい特徴を示した。

（実施例８）
実験Ｂ
（１）原水（ＭＣＰ作成用原水）
（２）原水＋ガス体＋０．４５μｍフィルタ
（３）原水＋ガス体＋０．２２μｍフィルタ
実験Ｂでは、フィルタを通さない、原水＋ガス体の区で、原水の３．２１倍の総リンパ球数が観察された（図１３）。このことは、増殖量が約３倍以上になったことを意味する。これに対し、原水＋ガス体をフィルタで濾過した培地では、０．４５μｍフィルタでは１．７６倍、０．２２μｍフィルタで濾過した培地では、１．６６倍の増殖量の増加が認められた。フィルタ濾過により、マイクロバブルが除去されるためにこのような結果になった可能性がある。ガス体の直径は、１０ｎｍ〜３０ｎｍである。

（実施例９）
Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞へのガス体投与の影響を測定した。フィルタ無しの系では、Ｂ細胞が最もよく増殖し、次いでＮＫ細胞、Ｔ細胞であった（図９）。

（実施例１０）
原水＋ガス投与個体でのＮＫ細胞数を比較した。その結果を図１２に示す。図１２に示すように、フィルタなしの場合、原水の約３．５倍増殖した。フィルタありの場合は、０．４５μｍフィルタでは１．９３倍、０．２２μｍフィルタでは、１．６４倍の増殖を示した。

（実施例１１）
81歳女性両下肢閉塞性動脈硬化症に対する効果
平成23年春より両膝の骨壊死を伴った変形性膝関節症で通院していたが、平成25年秋より主に右下肢に浮腫を来すようになった。平成26年2月に右下肢血栓血管炎で入院で血栓融解療法を行った。平成26年3月よりミトコンドリア水を500ml/day飲用を開始した。
その結果、浮腫の軽減、炎症の改善を認めた。動脈硬化の指標であるABI値（足関節/上腕血圧比）の変化においてミトコンドリア水飲用後左側の値の改善が認められた。baPWV（動脈コンプライアンスを評価する指標である上腕−足首間脈波伝播速度）の推移では両側に改善が認められた（表３および図１４〜１５参照）。
併用薬は、三月のミトコンドリア水飲用以前からの抗凝固製剤は無く、5月より抗血小板凝集剤の投与を始めたので、この度の2014年5月24日のbaPWVの改善についてはミトコンドリア水の影響が関与している可能性が大であると考えられる。すなわち、この症例の動脈硬化改善にはミトコンドリア水の効果が関与していることが示唆された。

（実施例１２）
被験者：８１歳女性 II型糖尿病
平成２０年２月II型糖尿病発症。
内服薬、生活指導が中心で治療経過を診ていた。
内服薬はスルフォニル製剤であるダオニール1.25ｍｇ（３錠分３後）および食後過血糖改善剤ベイスン0.2ｍｇ（３錠分３前）を内服。
合併症として高脂血症、軽度腎機能低下を認めていた。
高脂血症にはアトルバスタチンカルシウム製剤１０ｍｇ眠前に内服されていた。

ミトコンドリア水投与の効果
５月８日より５月１６日まで、さらに９月１日より６日まで、入院のうえウロキナーゼ点滴静注による血栓融解療法を行った。上記の間を含め現在に至るまで、ミトコンドリア水500ｍｌ／日の飲用を継続した。ＨｂＡ１ｃ（赤血球の中で体内に酸素を運ぶ役目のヘモグロビンと、血液中のブドウ糖が結合したもの）の値が、飲用前2014/1/8 7.8→2014/9/1 5.8と劇的に改善した（表４および図１６）。内服量は同じで４年間変化がなかった。ミトコンドリア水の影響によりII型糖尿病が改善されたと考えられる。

（実施例１３)
ヒトが飲用した場合のＭＣＰが生体に与える効果を明らかにすることを目的として、ヒトでのＭＣＰ飲用試験を実施した。被験者は以下のとおりである。
１. ５０歳男性、２. ４５歳男性、３. ６０歳女性、４. ３５歳女性、５. ６３歳女性、６. ６６歳男性、７２５歳女性
各々の参加者は、通常と変わらない生活を送りながら、ＭＣＰを0,5-1,0Ｌ／日、４週間飲用した。参加者は、飲用開始前に血液を採取され、飲用開始後４週間目および８週間目に再び血液を採取された。検査は、白血球、肝機能、脂質関連、糖尿病関連のそれぞれの項目について行った。その結果、肝機能、コレステロール値、中性脂肪値、糖尿病関連の数値などの幅広い項目の数値に改善が認められた。数値の改善は異常値で顕著であるが、正常値についても、より理想的な数値への改善傾向が認められた。とくに数値の改善が顕著に認められる項目はコレステロール値であり、検査したほぼ全ての被験者で改善が認められた。また、ＨＤＬ値について、過去２０年間の健診時に一度も40を上回ったことがない被験者６の数値が４５となったことから、現在、特効薬のないＨＤＬ値の上昇にもＭＣＰが寄与する可能性がある（表５）。

（実施例１４）
コマツナ（Brassica rapa var. perviridis、わかみ）を用いて植物への影響を調べた。
栽培期間２０１４年３月７日〜２０１４年４月７日（３２日間）
方法：コンテナに脱塩素水を３０Ｌ入れ、水耕栽培肥料タンクミックスＦ＆Ｂ（表６、ＯＡＴアグリオ株式会社製）を溶解させた。培養液は、栽培期間中、ＥＣ２．４に調整し、２４時間エアレーションを行った。

ウレタンに種子を播種し、グロスチャンバーにて育苗１０日後、各コンテナに９個体ずつ定植し、３反復（３コンテナ）試験を行った。定植３週間後に収穫した。
処理区対照区、空気マイクロバブル（ＭＢ）区、ＡＰＡＳ＋ＭＢ区
空気ＭＢ区では、空気ＭＢを２０分間、ＡＰＡＳ＋ＭＢ区もＭＢ化した気体を２０分間、培養中に、定植１週間後から週に３回、発生を行った（計６回の処理）
調査項目草丈、最大葉長、最大根長、地上部新鮮重、地下部新鮮重、地上部乾物重、地下部乾物重

結果を表７に示す。草丈、最大葉長、最大根長、地上部乾物重および地下部乾物重では、処理区間で有意差は認められなかった。しかしながら、APAS+MB区の地上部新鮮重および地下部新鮮重では、対照区およびMB区と比較して、有意に増加した。APAS+MBで、生育促進効果が認められた。

（ＯＡＴアグリオ株式会社ＨＰの記載より）

（実施例１５）
MCP添加培地中での繊維芽細胞増殖促進作用に関する実験
培地の調製
１．コントロール
ＤＷ２８５ｇ
ＤＭＥＭ粉末３ｇ
ＮａＨＣＯ３１．１１ｇ
全体３００ｍｌ
上記を混合後、０．４５μｍフィルタでろ過滅菌した。１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清）は１０ｍｌずつまたは５０ｍｌずつ調製し、培地に１０分の１容量添加した。
２．１×ＭＣＰ
ＭＣＰ４７．５ｍｌ
ＤＭＥＭ粉末０．５ｇ
ＮａＨＣＯ_３０．１８５ｇ
全体５０ｍｌ
上記を混合後、フィルタでろ過した。上記溶液（ＤＭＥＭ（ＭＣＰ）を９ｍｌとＦＢＳ１ｍｌを混合して培養に使用した。
３．２×ＤＭＥＭ＋ＭＣＰ
ＤＷ９５ｍｌ
ＤＭＥＭ粉末２ｇ
ＮａＨＣＯ_３０．７４ｇ
全体１００ｍｌ
上記を混合後、フィルタろ過した。その後、ＭＣＰで２倍に希釈した。
ろ過ＭＣＰ４．５ｍｌ
２×ＤＭＥＭ４．５ｍｌ
ＦＢＳ１ｍｌ
合計１０ｍｌ

凍結保存されたマウス繊維芽（MEF)細胞を起こしてから継代を３回以上行ってから本実験に用いた。上述のように終濃度１０％FBSで調製したDMEM（High Glucose）で培養した。培地交換は３日に１回行い、コンフルエントの時点で継代を行った。

本実験はまず、１２ウェルプレートにMEF細胞を１ウェルに１万細胞となるように継代を行った。継代翌日、MEF細胞をPBSで一度洗浄し、DWとMCPを用いて終濃度１０％FBSとPenicillin/Streptmycinで調製したDMEM（High Glucose)を加えた。MCPを加えた日を０日目として、３日目に解析を行った。培地はMCPを加えてから毎日交換した。

細胞数測定は０．２５％トリプシンを加え、トリパンブルー染色によって生細胞のみを数えた。
培養実験は、２連で行い、２日間と８日間の培養を行った。これら２回の実験の結果から、MCPには、繊維芽細胞増殖促進作用があることが示唆された（図１８）。その増殖率はDWを培地に加えた場合と比べて１２５〜２００％であった（表８）。

実験結果に認められた多少のばらつきは、実験に用いた細胞のロットの違いによるもの、あるいは実験条件の揺らぎなどに起因すると考えられる。

繊維芽細胞は上皮でのコラーゲン、エラスチン、ヒアルロン酸などを作り出す働きがある。また、コラーゲンを繊維束にし、真皮構造を形成する役目を持つ。紫外線を大量に浴びたり老化が進むと、規則性をもった繊維が生成できなくなり、シワやたるみなどが生じる。繊維芽細胞増殖機能を持つMCPが、このような皮膚の老化に対する有効な抑制効果を示すことが期待される。

（実施例１４）
膝に炎症を起こした６３歳女性は約２年に渡って炎症が続いていたが、ＭＣＰを飲用することで１カ月目には炎症が大幅に改善され、３か月目には炎症がほぼ消失した（図１９）。飲用する量としては、１日１５０ｍｌ以上が好ましく、より好ましくは３００ｍｌ以上、さらに好ましくは５００ｍｌ以上、よりさらに好ましくは１Ｌ以上である。１日に摂取する水分を全てＭＣＰとしてもよい。

（実施例１５）
ペットにＭＣＰを毎日３０日間飲用させたところ、表９のように、疾患の指標数値の改善が認められた。

Claims

水素0.45〜0.55ppm、酸素10〜12.5ppm、窒素7〜8ppm含有する、粒径３０マイクロメートル以下のナノバブルを有効成分として含有する組成物。
請求項１の組成物を有効成分として含有するミトコンドリア活性化組成物。
請求項１又は２の組成物を有効成分として含有する細胞増殖促進剤。
請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物又は剤を有効成分として含有する細胞保存液。
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物、剤又は液を有効成分として含有する凍結保存液。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液を含有する飲食物。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液で処理した原材料を使用して製造された飲食物。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液を用いてミトコンドリアを活性化する方法。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて細胞増殖を促進する方法。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて細胞を保存する方法。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて凍結保存する方法。
請求項１〜５のいずれか１の組成物、剤又は液を用いて飲食物またはその原材料を処理する工程を含む、飲食物の製造方法。
請求項１の組成物を用いて調製した細胞培養用培地。
請求項１の組成物を用いて調製した植物水耕栽培用溶液。
請求項１３の培地を用いて動物細胞を増殖させる方法。
動物細胞が免疫系細胞である、請求項１５の動物細胞を増殖させる方法。
請求項１もしくは２に記載の組成物、または請求項３に記載の細胞増殖促進剤を有効成分とする動脈硬化症の予防・治療剤。
請求項１もしくは２に記載の組成物、または請求項３に記載の細胞増殖促進剤を有効成分とする糖尿病の予防・治療剤。
請求項１または２に記載の組成物を含む注射液。