CN114269385A - 转染方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种将诸如核酸或蛋白质等靶物质安全且有效地引入细胞(不包括免疫细胞)的新颖方法。具体来说，提供了：一种使靶物质进入细胞(不包括免疫细胞)的递送系统，所述递送系统通过组合超细气泡水或超细气泡水溶液与超声发生器而制备，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包括具有200nm或更小的平均直径的不含磷脂的超细气泡；以及一种用于通过使用所述超细气泡水等和超声波提高核酸、蛋白质或低分子量化合物至细胞(不包括免疫细胞)的递送能力的方法。

Description

转染方法
[技术领域]
本发明涉及一种用于将靶物质递送至细胞(不包括免疫细胞)的系统，所述系统包括含有超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合；一种用于通过使用所述超细气泡水或水溶液和超声增加核酸、蛋白质或低分子量化合物至细胞(不包括免疫细胞)的递送的方法；一种含有核酸、蛋白质或低分子量化合物和所述超细气泡水或水溶液的组合的制剂，用于通过与超声辐照组合使用将所述核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至细胞(不包括免疫细胞)；以及一种用于通过使细胞与所述制剂接触并且将所述细胞用超声处理将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至所述细胞(不包括免疫细胞)的方法；等。
(背景技术)
超声在医学领域一直主要用作超声成像方式。微气泡作为超声造影剂正在超声诊断中取得划时代的进展。最近，有可能将超声用于诊断以外的目的。例如，将通过将超声能量聚焦在患处并且仅加热所述患处进行的无创癌症热疗在临床上应用于子宫肌瘤和前列腺癌。此外，专注于无创性和易于空间和时间控制的研究也在进行中，以将超声辐照用作将基因和药物递送至靶细胞的药物递送系统(DDS)的工具(声孔效应)。
迄今为止，已经报道了作为其中融合了气泡脂质体和超声技术的用于骨骼肌的基因递送系统的气泡脂质体，其中全氟丙烷被封装在聚乙二醇(PEG)修饰的脂质体中(非专利文献1)。此外，还已经报道了用于杜氏肌营养不良症的治疗性药物，所述治疗性药物用于将表面结合有特定吗啉代寡聚体、封装全氟代烃并且具有50-500nm的平均粒度的PEG修饰的气泡脂质体(气泡脂质多聚复合物(lipopolyplex))施用至肌肉组织或血管内，然后超声辐照体外的肌肉组织，以实现将吗啉代寡聚体高效引入肌肉组织(专利文献1)。还已经报道了，气体封装的微气泡和超声可以用于将药物和基因递送至脑(非专利文献2)。
已经报道了，使用全氟丙烷气体作为填充气体，获得在尺寸方面比使用全氟丁烷气体或氮气气体的气泡脂质体更小的气泡脂质体(非专利文献3)。此外，已经报道了，向ddY小鼠施用作为纳米气泡和质粒的组合的气泡脂质多聚复合物并且超声辐照脑组织可将所述质粒引入血管内皮或血管外区域，并且引入位点根据气体封装效率而变化(非专利文献4)。
然而，害怕使用气泡脂质体会导致由脂质引起的抗原性问题。此外，输出强度为1.5至2.5W/cm2的超声辐照产生对超声诊断的安全性的顾虑，导致实用性方面存在问题。
本发明的诸位发明人已经阐明了以不少于2.0×108个气泡/mL含有不含磷脂的纳米气泡的纳米气泡水具有优异的抗菌作用(专利文献2)。然而，不存在关于通过组合纳米气泡水与超声而将靶物质(诸如核酸、蛋白质等)引入细胞的报道。
[文献列表]
[专利文献]
专利文献1：WO 2012/153635
专利文献2：WO 2015/182647
[非专利文献]
非专利文献1：YAKUGAKU ZASSHI 130(11)1489-1496(2010)
非专利文献2：NATURE REVIEWS 12 161-174(2016)
非专利文献3：Drug Delivery 24(1)320-327(2017)
非专利文献4：“Evaluation of pharmacokinetics in the brain byultrasound-responsive nano-bubbles in brain-directed DDS”,Yuki Fuchigami等人,Nagasaki University,Abstracts of the 137th Annual Meeting of thePharmaceutical Society of Japan(2017年3月)
[发明内容]
[技术问题]
本发明的目的是提供一种用于将诸如核酸、蛋白质等靶物质安全且有效地引入细胞(不包括免疫细胞)的新颖方法。
[问题的解决方案]
为了实现上文提及的目的，本发明的诸位发明人注意到这样的事实，即本发明的诸位发明人先前开发的具有优异抗菌作用的纳米气泡水(参见上文提及的专利文献2；由于ISO将小于1μm(1000nm)的气泡定义为“超细气泡”，在本说明书中在下文它们被称为“超细气泡”而不是“纳米气泡”)不含磷脂。在此超细气泡水中所含的超细气泡的平均直径不大于200nm，这比常规直径小。通常，认为当破碎时，与微气泡相比，超细气泡对细胞膜的破坏更严重。然而，本发明的诸位发明人敢于将此超细气泡水与超声辐照组合，并且研究将核酸和蛋白质引入骨骼肌细胞。因此，已出乎意料地显示，与单独用这些中的任一种处理相比，超细气泡水和超声的组合可以显著提高核酸引入效率。引入效率优于常规微气泡脂质体的引入效率。此外，已显示，通过单独用超细气泡水处理，超声可以显著提高蛋白质引入效率，并且通过超细气泡水和不大于500mW/cm2的低输出强度的超声的组合，可以将蛋白质有效地引入细胞。
基于这些发现，本发明的诸位发明人已经进一步研究并且完成了本发明。
也就是说，本发明涉及
[1]一种用于将靶物质递送至细胞(不包括免疫细胞)的系统，所述系统包含含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合；
[2]根据[1]所述的系统，其中所述超细气泡水溶液包含选自一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲液的一种或多种组分，所述一种或多种的表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂；
[3]根据[1]或[2]所述的系统，其中所述超细气泡水溶液由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成；
[4]根据[1]至[3]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡由全氟代烃或空气构成；
[5]根据[1]至[4]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡具有50nm-200nm的平均直径；
[5-1]根据[1]至[4]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡具有75nm-165nm的平均直径；
[6]根据[1]至[5]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡具有不大于5的d90/d10比；
[6-1]根据[1]至[5-1]中任一项所述的系统，其中所述超细气泡具有不大于4的d90/d10比；
[7]根据[1]至[6-1]中任一项所述的系统，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有不小于1.0×108个气泡/mL的密度；
[7-1]根据[1]至[6-1]中任一项所述的系统，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有1.0×108-2.0×109个气泡/mL的密度；
[8]根据[1]至[7-1]中任一项所述的系统，其中在所述超声发生器中的超声输出强度不大于720mW/cm2；
[9]根据[1]至[8]中任一项所述的系统，其中在所述超声发生器中，超声输出强度是50-500mW/cm2并且超声频率是0.5-10MHz；
[10]根据[1]至[9]中任一项所述的系统，其中所述靶物质是核酸、蛋白质或低分子量化合物；
[10A]根据[1]至[9]中任一项所述的系统，其中所述靶物质核酸具有10mer-30mer的分子量；
[10B]根据[1]至[9]中任一项所述的系统，其中所述靶物质蛋白质具有25kDa-900kDa的分子量；
[10C]根据[1]至[9]中任一项所述的系统，其中所述靶物质具有不小于25kDa的分子量，并且所述超细气泡带正电；
[10D]根据[1]至[9]中任一项所述的系统，其中所述靶物质具有小于25kDa的分子量；
[11]根据[1]至[10D]中任一项所述的系统，其中所述细胞是骨骼肌细胞或神经细胞；
[12]一种用于增加核酸、蛋白质或低分子量化合物至细胞(不包括免疫细胞)的递送的方法，所述方法通过使用包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声；
[12-1]根据[12]所述的方法，其中所述超细气泡水溶液包含选自一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲液的一种或多种组分，所述一种或多种的表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂；
[12-2]根据[12]或[12-1]所述的方法，其中所述超细气泡水溶液由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成；
[12-3]根据[12]至[12-2]中任一项所述的方法，其中所述超细气泡由全氟代烃或空气构成；
[12-4]根据[12]至[12-3]中任一项所述的方法，其中所述超细气泡具有50nm-200nm的平均直径；
[12-5]根据[12]至[12-3]中任一项所述的方法，其中所述超细气泡具有75nm-165nm的平均直径；
[12-6]根据[12]至[12-5]中任一项所述的方法，其中所述超细气泡具有不大于5的d90/d10比；
[12-7]根据[12]至[12-5]中任一项所述的方法，其中所述超细气泡具有不大于4的d90/d10比；
[12-8]根据[12]至[12-7]中任一项所述的方法，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有不小于1.0×108个气泡/mL的密度；
[12-9]根据[12]至[12-7]中任一项所述的方法，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有1.0×108-2.0×109个气泡/mL的密度；
[12-10]根据[12]至[12-9]中任一项所述的方法，其中在所述超声发生器中的超声输出强度不大于720mW/cm2；
[12-11]根据[12]至[12-9]中任一项所述的方法，其中在所述超声发生器中，超声输出强度是50-500mW/cm2并且超声频率是0.5-10MHz；
[12-12]根据[12]至[12-11]中任一项所述的方法，其中所述靶物质是核酸、蛋白质或低分子量化合物；
[12-12A]根据[12]至[12-11]中任一项所述的方法，其中所述靶物质核酸具有10mer-30mer的分子量；
[12-12B]根据[12]至[12-11]中任一项所述的方法，其中所述靶物质核酸具有25kDa-900kDa的分子量；
[12-12C]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中所述靶物质核酸具有不小于25kDa的分子量，并且所述超细气泡带正电；
[12-12D]根据[1]至[9]中任一项所述的方法，其中所述靶物质具有小于25kDa的分子量；
[12-13]根据[12]至[12-12D]中任一项所述的方法，其中所述细胞是骨骼肌细胞或神经细胞；
[13]一种制剂，所述制剂包含核酸、蛋白质或低分子量化合物和超细气泡水或超细气泡水溶液的组合，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡，用于将所述核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至细胞(不包括免疫细胞)，其中通过与超声辐照组合使用将有效量的所述核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至所述细胞(不包括免疫细胞)；
[13-1]根据[13]所述的制剂，其中所述超细气泡水溶液包含选自一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲液的一种或多种组分，所述一种或多种的表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂；
[13-2]根据[13]或[13-1]所述的制剂，其中所述超细气泡水溶液由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成；
[13-3]根据[13]至[13-2]中任一项所述的制剂，其中所述超细气泡由全氟代烃或空气构成；
[13-4]根据[13]至[13-3]中任一项所述的制剂，其中所述超细气泡具有50nm-200nm的平均直径；
[13-5]根据[13]至[13-3]中任一项所述的制剂，其中所述超细气泡具有75nm-165nm的平均直径；
[13-6]根据[13]至[13-5]中任一项所述的制剂，其中所述超细气泡具有不大于5的d90/d10比；
[13-7]根据[13]至[13-5]中任一项所述的制剂，其中所述超细气泡具有不大于4的d90/d10比；
[13-8]根据[13]至[13-7]中任一项所述的制剂，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有不小于1.0×108个气泡/mL的密度；
[13-9]根据[13]至[13-7]中任一项所述的制剂，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有1.0×108-2.0×109个气泡/mL的密度；
[13-10]根据[13]至[13-9]中任一项所述的制剂，其中在所述超声发生器中的超声输出强度不大于720mW/cm2；
[13-11]根据[13]至[13-9]中任一项所述的制剂，其中在所述超声发生器中，超声输出强度是50-500mW/cm2并且超声频率是0.5-10MHz；
[13-12]根据[13]至[13-11]中任一项所述的制剂，其中所述靶物质是核酸、蛋白质或低分子量化合物；
[13-12A]根据[13]至[13-11]中任一项所述的制剂，其中所述靶物质核酸具有10mer-30mer的分子量；
[13-12B]根据[13]至[13-11]中任一项所述的制剂，其中所述靶物质蛋白质具有25kDa-900kDa的分子量；
[13-12C]根据[1]至[9]中任一项所述的制剂，其中所述靶物质具有不小于25kDa的分子量，并且所述超细气泡带正电；
[13-12D]根据[1]至[9]中任一项所述的制剂，其中所述靶物质具有小于25kDa的分子量；
[13-13]根据[13]至[13-12D]中任一项所述的制剂，其中所述细胞是骨骼肌细胞或神经细胞；
[14]一种用于将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至细胞(不包括免疫细胞)的方法，所述方法通过使所述细胞与根据[13]至[13-13]中任一项所述的制剂接触，并且将它们用超声处理；
[15]根据[1]至[11]中任一项所述的系统，所述系统包括培养所述细胞(不包括免疫细胞)的步骤；
[16]根据[1]至[11]和[15]中任一项所述的系统、根据[12]至[12-3]中任一项所述的方法或根据[14]所述的方法，其中所述系统或所述方法在-10℃-50℃的温度下进行；
[17]根据[13]至[13-13]中任一项所述的制剂，其中将所述制剂施用至0-80岁的患者；
[18]根据[13]至[13-13]中任一项所述的制剂，其中所述制剂是用于治疗疾病的药剂；
等。
[发明的有益效果]
根据本发明的用于将靶物质递送至细胞(不包括免疫细胞)的系统，通过以不会对活体产生不利影响的输出强度辐照超声，可以将靶物质(诸如核酸、蛋白质、低分子量化合物等)无创且选择性地引入细胞(不包括免疫细胞)。因此，可以提供高度安全的引入系统。在所述系统中，由于不需要使用脂质体，因此不需要添加特殊添加剂(诸如磷脂)，可以实现低成本生产，并且不会出现由磷脂引起的抗原性问题。
通常，认为当破碎时，与微气泡相比，超细气泡对细胞膜的破坏更严重，并且因此不适用于细胞转染。出乎意料地，根据本发明，与使用微气泡的情况相比，使用超细气泡可以显著提高靶物质向细胞的引入效率。
此外，在超细气泡水或超细气泡水溶液中，具有不大于200nm的平均直径的超细气泡是长期稳定的。
[附图说明]
图1显示通过组合超细气泡水溶液与超声提高了siRNA向骨骼肌细胞的引入效率。(A)示出了荧光显微镜下的FAM荧光观察图像。将核用DAPI染色。(B)示出了FAM荧光的相对强度。
图2示出了在超细气泡水溶液与常规微气泡脂质体(Sonazoid)之间当各自与超声组合时的siRNA的引入效率的比较结果。
图3显示通过组合超细气泡水溶液与超声提高了IgG-FITC向骨骼肌细胞的引入效率。
An：带负电的超细气泡
Cat：带正电的超细气泡
图4示出了通过组合超细气泡水溶液与具有多种输出强度的超声，FITC向骨骼肌细胞的引入效率的比较结果。
图的水平轴线的上部分示出了超声的存在或不存在以及输出强度，并且下部分示出了超细气泡的存在或不存在。
(具体实施方式)
I.本发明的系统
本发明提供了用于将靶物质递送至细胞(不包括免疫细胞)的系统，所述系统包含含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合(在下文也将被称为“本发明的系统”)。
在本说明书中，“将靶物质递送至细胞(不包括免疫细胞)”意指原本难以穿过细胞膜的物质(例如，可溶于水且不会被动扩散的化合物、具有大分子量的化合物、不含选择性转运蛋白或受体的化合物)穿过细胞膜并且被转移到细胞中。因此，本发明的系统可以通过任何机制将靶物质递送至细胞，并且所述机制的例子包括但不限于暂时打开细胞膜中的孔。
本发明的系统所应用的“细胞(不包括免疫细胞)(在下文也将被称为“非免疫细胞”)”没有特别限制，只要它是免疫细胞(例如，淋巴细胞诸如T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞等，粒细胞诸如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞等，单核细胞，巨噬细胞，树突细胞等，以及能够最终分化成它们的单能或多能干细胞或祖细胞(不包括胚胎和其他全能或多能干细胞))以外的细胞即可。其例子包括神经细胞(包括脑神经细胞)、骨骼肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、间皮细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、眼细胞、不包括免疫系统的主要腺体或器官(例如，睾丸、肝脏、肺、心脏、胃、胰腺、肾脏、皮肤等)的细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、成纤维细胞、胰岛细胞、源自神经元和其他神经组织的细胞、可以分化为任一种上文提及的细胞的具有单能性或多能性的祖细胞和组织干细胞、胚胎和其他全能或多能干细胞(例如，iPS细胞、ES细胞、ES样细胞、胚胎生殖细胞等)和其他细胞[上皮细胞、间充质细胞和高纯度间充质干细胞(快速扩增细胞：REC)]等。优选骨骼肌细胞、神经细胞、心肌细胞、肝细胞、肾脏细胞和胰腺细胞，并且更优选骨骼肌细胞或神经细胞。
将通过本发明的系统递送至非免疫细胞的靶物质没有特别限制，只要它是由于递送至细胞而能够赋予细胞优选的生理活性的物质即可。其例子包括但不限于聚合物化合物[例如，核酸，小RNA/DNA诸如siRNA(例如，FAM-siRNA，由NIPPON GENE CO.,LTD.制造)、ssRNA、shRNA、miRNA、S-寡DNA(硫代磷酸酯)等)、基因(例如，质粒DNA、mRNA等)等、蛋白质(包括肽)(例如，抗体(例如，IgG(例如，Alexa-IgG，由Invitrogen制造))等)、多糖(例如，右旋糖酐、异硫氰酸荧光素右旋糖酐等)等]、低分子量化合物(例如，荧光素、荧光素钠等)等。其中，可以优选提及聚合物化合物和低分子量化合物。它们进一步优选地是聚合物化合物。它们进一步优选地是核酸和蛋白质。它们特别优选地是核酸和抗体。
在本说明书中，“超细气泡”可以含有具有一般大气压或高于一般大气压的压力的气体，并且超细气泡的内部可以是真空。如本文所用，“真空”意指用压力低于正常大气压的气体填充的空间状态。
在本发明中，“不含磷脂的超细气泡”是指气泡的外壳不形成磷脂双分子层结构的超细气泡。
在本发明中，“超细气泡水”是指含有超细气泡的水。
在本发明中，“超细气泡水溶液”是指含有超细气泡的水溶液。构成超细气泡水溶液的水溶液含有例如选自以下的一种或多种的物质：
1)选自以下的一种或多种的表面活性剂：阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂，
2)亲水性树脂以及
3)缓冲液
作为组分。
本发明中的“阴离子表面活性剂”的例子包括月桂基硫酸钠等。
本发明中的“非离子表面活性剂”的例子包括甘油脂肪酸酯(例如，甘油单硬脂酸酯等)、蔗糖脂肪酸酯、脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯等)、聚甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯(氢化)蓖麻油、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(例如，脱水山梨糖醇聚氧乙烯月桂酸酯(例如，聚山梨醇酯20等)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸酯(例如，聚山梨醇酯80等)等)、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯月桂基醚等)、聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如，聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚等)、聚氧乙烯烷基苯基醚(例如，聚氧乙烯壬基苯基醚等)、聚乙二醇(macrogol)、聚氧乙烯聚氧丙烯二醇(例如，泊洛沙姆407、泊洛沙姆235、泊洛沙姆188、泊洛沙胺(poloxamine)等)等。其中，优选聚氧乙烯脱水山梨糖醇月桂酸酯(例如，聚山梨醇酯20等)、聚氧乙烯脱水山梨糖醇油酸酯(例如，聚山梨醇酯80等)。进一步优选聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，并且特别优选聚山梨醇酯80。
本发明中的“阳离子表面活性剂”的例子包括苯扎氯胺、苄索氯铵、西吡氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、地喹氯铵等。
本发明中的“两性表面活性剂”的例子包括椰油酰胺丙基甜菜碱、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱等。
可以单独使用上文提及的表面活性剂，或者可以组合使用其两种或更多种。
本发明中的“亲水性树脂”的例子包括丙烯酸树脂(例如，聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸甲酯)、乙烯基树脂(例如，聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙烯醇)(PVA)、聚乙烯基乙醚)；多糖(例如，黄芪胶、卡拉亚胶(caraya gum)、甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、透明质酸、琼脂糖、凝结多糖等)。其中，优选聚(乙烯醇)、羟丙基纤维素。它更优选地是聚(乙烯醇)。
可以单独使用上文提及的亲水性树脂，或者可以组合使用其两种或更多种。
本发明中的“缓冲液”的例子包括酸性缓冲液(例如，乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、稀释的Mclivaine缓冲液)、中性缓冲液(例如，4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、磷酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲盐水(PBS))。作为缓冲液，优选稀释的Mclivaine缓冲液。
作为构成本发明中的“超细气泡水溶液”的水溶液优选地是由以下构成的水溶液：1)选自以下的一种或多种的表面活性剂：阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂；和/或2)亲水性树脂。其中，例如，优选由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂构成的水溶液。此外，还优选由非离子表面活性剂构成的水溶液。进一步优选由1)选自聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20的一种或两种和/或2)聚(乙烯醇)构成的水溶液。进一步优选由聚山梨醇酯80和/或聚(乙烯醇)构成的水溶液。特别优选由聚山梨醇酯80构成的水溶液。
构成本发明中的超细气泡的“气体”的例子包括但不限于选自全氟代烃(例如，全氟丙烷(C3F8)、全氟丁烷等)、空气、氮气、臭氧、氧气、氩气、二氧化碳和氦气等的一种或者两种或更多种的混合物。其中，优选全氟代烃(例如，全氟丙烷、全氟丁烷等)、空气、氮气、臭氧、氧气、氩气。更优选全氟代烃(例如，全氟丙烷、全氟丁烷等)、空气。当使用空气时，可以以低成本容易地产生超细气泡。进一步优选全氟丙烷和空气。
本发明中的“超细气泡水溶液”优选地是由以下构成的超细气泡水溶液：(A)由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂构成的水溶液和(B)由选自全氟代烃、空气等的一种或多种的气体构成的超细气泡。进一步优选由以下构成的超细气泡水溶液：(A)由1)选自聚山梨醇酯80和聚山梨醇酯20的一种或两种和/或2)聚(乙烯醇)构成的水溶液和(B)由选自全氟代烃和空气的一种或多种的气体构成的超细气泡。进一步优选由以下构成的超细气泡水溶液：(A)由聚山梨醇酯80和/或聚(乙烯醇)构成的水溶液和(B)由全氟代烃和/或空气构成的超细气泡。特别优选由以下构成的超细气泡水溶液：聚山梨醇酯80和由全氟丙烷或空气构成的超细气泡。
本发明中的“超细气泡”不含两亲性磷脂(诸如脂质体等)。因此，可以提供不显示抗原性的更安全的制剂。
本发明中的“超细气泡”具有约不大于200nm的平均直径。平均直径优选地是10nm-200nm，进一步优选地是50nm-200nm，更优选地是100nm-180nm。
在另一个实施方案中，本发明中的“超细气泡”的平均直径的优选平均直径不大于约175nm，进一步优选地是25nm-175nm，更优选地是75nm-165nm。
本说明书中的“平均直径”意指与最频繁的分布值(个数％的最大值)对应的粒度(众数直径)。
在本说明书中，“超细气泡水”或“超细气泡水溶液”意指具有不大于1000nm的直径的气体粒子(超细气泡)稳定存在的水或水溶液。本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液(在下文也将被称为“本发明中的超细气泡水等”)典型地含有平均直径不大于约200nm的超细气泡。
在本发明中，超细气泡理想地具有均一的尺寸。例如，当与距离基于超细气泡数的分布的小直径侧的累积10％和累积90％对应的超细气泡直径分别是d10和d90时，“d90/d10比”优选不大于5，进一步优选不大于4.5，更优选不大于4。
在本发明中，超细气泡水等中所含的超细气泡数意指在1mL的超细气泡水或超细气泡水溶液中存在的超细气泡的数目，其在本说明书中有时将被称为“超细气泡密度”。本发明中的超细气泡水等中所含的超细气泡数没有特别限制。“超细气泡密度”的下限是例如不小于1.0×108个气泡/mL，优选不小于2.0×108个气泡/mL，更优选不小于2.5×108个气泡/mL。“超细气泡密度”的上限是例如不大于2.0×109个气泡/mL，优选不大于1.0×109个气泡/mL。本发明中的“超细气泡密度”是例如1.0×108-2.0×109个气泡/mL，优选2.0×108-1.0×109个气泡/mL，进一步优选2.5×108-1.0×109个气泡/mL。
超细气泡直径(包括超细气泡平均直径，下文同)、基于超细气泡数的分布(包括d90/d10比，下文同)和超细气泡数可以通过以下方法测量：基于布朗运动使用激光束散射的方法(例如，NanoSight Ltd，LM20、LM10等)、基于电阻变化的方法(例如，BeckmanCoulter，Multisizer4等)、基于激光衍射散射法的方法(例如，Shimadzu Corporation，SALD-7100H等)、使用米氏散射的方法(例如，NIPPON DENSHOKU INDUSTRIES CO.,LTD.，NP-500T等)等。本发明中使用的超细气泡直径和基于超细气泡数的分布是通过使用由NanoSight Ltd.制造的NanoSight(仪器名称LM10)的激光束散射的追踪方法(追踪方法)或根据所述方法测量的那些。
超细气泡直径、基于超细气泡数的分布和超细气泡数通常可以在超细气泡水等产生后立即测量，或者在长期储存后测量。本发明中的超细气泡水等的超细气泡直径、基于超细气泡数的分布和超细气泡数在极长的时间(例如，约6个月至2年)内稳定保持，并且因此，超细气泡直径、基于超细气泡数的分布和超细气泡数可以在超细气泡水产生后密封储存一定时间后在使用前立即测量。
在本说明书中，含有超细气泡的“水”(以及用作含有超细气泡的“水溶液”的“水”)没有特别限制，并且例如，可以使用自来水、去离子水、蒸馏水、无菌蒸馏水、注射用纯净水、超纯水等。对于注射用途，优选无菌蒸馏水、注射用纯净水等。
本说明书中的含有超细气泡的“水溶液”的例子包括含有一种或多种以上提及的选自一种或多种的表面活性剂(所述表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂)、亲水性树脂和缓冲剂的组分并且进一步含有例如药物制剂领域中常用的任何添加剂的水。“添加剂”的例子包括电解质、赋形剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、增溶剂、助悬剂、分散剂、等渗剂、安抚剂(soothing agent)、防腐剂、抗氧化剂、着色剂、甜味剂、pH调节剂、稳定剂、酸化剂、调味剂、流化剂等。优选药理学上可接受的添加剂。更优选使用选自助悬剂、稳定剂、分散剂、等渗剂等的一种或多种的添加剂。
可以以适当比率在混合物中使用上文提及的添加剂中的两种或更多种。
这些添加剂(包括选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲剂)也可以直接溶解于水中以制备超细气泡水溶液，只要它们不影响超细气泡的产生、稳定性等即可；或者在不含添加剂的水中产生超细气泡以得到超细气泡水，并且当使用时将添加剂溶解以得到超细气泡水溶液。
作为水溶液，可以使用不带电的超细气泡水溶液、带正电的超细气泡水溶液和带负电的超细气泡水溶液中的任一种。它们可以根据靶细胞的种类、它们的周围微环境或靶物质的尺寸或种类等正确选择。在本发明的用于通过使用超细气泡水溶液和超声将靶物质递送至非免疫细胞的方法中，当靶物质是聚合物化合物时，超细气泡水溶液优选地是带正电的超细气泡水溶液。例如，当药物为聚合物化合物时，超细气泡水溶液的pH优选地是1-4。
特别地，当靶物质是具有高分子量(例如，分子量不小于25kDa)的蛋白质等时，优选使用带正电的超细气泡水溶液。
在本发明的用于通过使用超细气泡水溶液和超声将靶物质递送至非免疫细胞的方法中，当靶物质的分子量不高(例如，分子量小于25kDa)时，带正电的超细气泡水溶液和带负电的超细气泡水溶液均可以用作超细气泡水溶液。
超细气泡水溶液的电荷可以通过例如将使用的缓冲液的pH适当调整。例如，为了使超细气泡水溶液带正电，超细气泡水溶液的pH优选地是1-4。另一方面，为了使超细气泡水溶液带负电，超细气泡水溶液的pH优选地是7-14。
超细气泡水的产生方法大致分为以下方法：包括在水中同时产生微气泡(具有约1-60μm的直径的气体粒子)和超细气泡，并且将微气泡浮选分离以仅留下超细气泡的方法；以及包括直接产生超细气泡的方法，并且前者是目前的主流。前一种方法包括高速旋流型，其中将气体通过高速旋流破碎以产生大量微气泡，并且将微气泡浮选分离以将超细气泡留在水中；加压溶解型，其中将气体加压至过饱和溶解，将溶液快速减压以产生微气泡和超细气泡，将微气泡浮选分离以将超细气泡留在水中；等。超细气泡水溶液的产生方法与上文提及的相同。
加压溶解型优选用作用于产生本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液的方法。例如，可以提及以下步骤1)至3)；1)在通过加压泵加压至约0.2至0.5MPa的加压容器中，将气体强制溶解于这样的液体中，其中有(i)选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂，(ii)亲水性树脂和/或(iii)缓冲溶液；2)通过喷嘴进行在水中的闪蒸操作以将减压且过饱和的气体以微气泡或超细气泡释放到废水中，从而产生微气泡水和超细气泡水的混合物；3)停止曝气，并且将混合物静置以允许微泡通过漂浮自然分离。因此，产生了在其中仅剩超细气泡的澄清超细气泡水。
用于产生本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液的超细气泡发生器的例子包括加压溶解型装置(例如，由IDEC制造的nanoGALFTM、由AURA TEC CO.,LTD.制造的OM4-MD5-045、由Nikuni Corporation制造的微气泡发生器等)、高速旋流型装置(例如，由Bi-clean制造的YJ、由AQUA AIR制造的微气泡发生器、由ROYAL ELECTRIC CO.,LTD.制造的MICROBLADE等)等。作为超细气泡发生器，优选加压溶解型装置(例如，由IDEC制造的nanoGALFTM)。
在本发明中，将选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和/或缓冲溶液用于产生超细气泡水或超细气泡水溶液，从而可以增加在上文提及的超细气泡水或超细气泡水溶液中的超细气泡数。
本发明中使用的选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和/或缓冲溶液在水中的含量没有特别限制。上限优选不大于50％(W/V)，更优选不大于20％(W/V)，进一步优选不大于10％(W/V)。下限优选不小于0.01％(W/V)，更优选不小于0.05％(W/V)，进一步优选不小于0.1％(W/V)。如本文所用，(W/V)意指g/mL。
当两种或更多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲溶液组合使用时，其总量即是水中的含量。
将如上文提及产生的本发明中的超细气泡水等紧紧密封在小瓶或安瓿中并且保存。优选在遮荫条件下进行保存。保存温度优选不大于室温，并且更优选的是不大于10℃。
本发明中的超细气泡水或超细气泡水溶液优选在选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和/或缓冲溶液的存在下产生。因此，可以将超细气泡水等中的超细气泡数维持在不小于1.0×108个气泡/mL持续需要维持本发明中的超细气泡水等的作用效果(例如，当超细气泡水等和超声处理组合使用时对非免疫细胞的细胞膜穿孔效果、通过使用超细气泡水等和超声增加靶物质至非免疫细胞的递送的效果等)的一段时间(例如，当用作需要将通过细胞膜等递送的靶物质的基质时，持续其有效期(例如，不小于3个月，更优选不小于6个月，进一步优选不小于一年))。
本发明中的超细气泡水等可以通过加热灭菌，并且即使加热灭菌后，超细气泡数也可以维持在不小于1.0×108个气泡/mL。
当本发明中的超细气泡水等中的超细气泡数不小于1.0×108个气泡/mL时，展现优异的抗菌作用和保存效果。因此，它们也可用作多次施用类型的液体药物制剂的基质，所述液体药物制剂在某一时间段内从相同容器重复施用，例如注射(例如，皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、滴注输注、脑内注射、脑脊液内注射、眼内注射等)。
本发明中的超细气泡水等优选在选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂的一种或多种的表面活性剂(优选聚山梨醇酯80和/或聚山梨醇酯20，进一步优选聚山梨醇酯80)的存在下产生，并且在产生的超细气泡水等中的超细气泡具有更小的平均直径和更均一的尺寸(即，d90/d10比小)。因此，在本发明的系统中获得了将靶物质递送至非免疫细胞的更安全的效果。
作为本发明的系统中使用的“超声发生器”，可以使用任一种，只要当与本发明中的超细气泡水等组合使用时，它可以产生满足足以将靶物质递送至非免疫细胞的条件的超声波即可。例如，可以适当使用在临床环境中通常用于超声诊断的任何装置、可商购的超声基因转移装置(例如，Sonitron GTS(由Nepa Gene Co.,Ltd.制造)等)等。
本发明中的“超声发生器”的条件包括例如超声输出强度(在单位时间内穿过垂直于声波行进方向的单位面积(cm2)的声能)不小于10mW，优选不小于30mW，更优选不小于50mW(例如，不小于100mW、不小于150mW、不小于200mW等)。没有特别设置输出强度的上限。考虑到本发明的系统以将靶物质递送至哺乳动物(包括人)体内的靶细胞为目的之一，优选将不会对动物产生不利影响(例如，细胞毒性)的范围作为上限。例如，修订的药事法的第三方认证标准(2005)增加了“不超过720mW/cm2”的要求(与美国FDA的Track 3的上限相同)，并且控制日本的超声诊断装置以便不超过所述上限。因此，本发明的系统中的超声输出强度的上限优选地是720mW/cm2。优选地，输出强度不大于500mW/cm2(例如，不大于450mW/cm2、不大于400mW/cm2、不大于300mW/cm2等)。因此，超声输出强度优选地是50-720mW/cm2，更优选地是50-500mW/cm2，进一步优选地是55-450mW/cm2。用于常规基因转移的超声输出强度显著高于上文提及的用于超声诊断应用的标准(例如，1.5-2.5W/cm2)，因此存在很高的安全性风险。在本发明的系统中，无论靶物质的分子量如何，都可以以小的输出强度(优选50-500mW/cm2)将靶物质有效地递送至非免疫细胞，并且它是一种非常安全的递送系统。
作为本发明中的“超声发生器”的条件，超声频率没有特别限制，并且可以适当选择，例如在0.5-10MHz的范围内。目前广泛采用的频率是约1MHz。然而，由于认为较高的频率对身体的不利影响较小，因此可以在1至5MHz、更优选1至3MHz、进一步优选1至2.5MHz的范围内适当选择频率。
作为使用本发明中的“超声发生器”的条件，超声辐照时间没有特别限制，只要足以将靶物质递送至非免疫细胞即可，并且根据超声输出强度变化。例如，即使当输出强度是50mW/cm2时，也可以通过10秒的辐照时间实现靶物质至非免疫细胞的递送。超声辐照时间可以是例如1至60秒，优选1至30秒，更优选1至20秒，进一步优选1至10秒。
作为使用本发明中的“超声发生器”的条件，例如，可以提及(i)50至720mW/cm2(优选50至500mW/cm2)的超声输出强度、(ii)0.5至10MHz的超声频率和(iii)1至60秒的超声辐照时间的组合。其中，优选(i)50至500mW/cm2的超声输出强度、(ii)1至5MHz的超声频率和(iii)1至60秒的超声辐照时间等的组合，并且更优选(i)55至450mW/cm2的超声输出强度、(ii)1至2.5MHz的超声频率和(iii)1至10秒的超声辐照时间等的组合。
当本发明的系统用于从动物分离的非免疫细胞的转染时，它可以包括在转染处理后培养非免疫细胞的步骤。因此，本发明的系统可以进一步包括用于培养非免疫细胞的工具(例如，培养容器(例如，皿、烧瓶等)、培养基、培养装置(例如，CO2培养箱等))。上文提及的培养步骤还包括传代培养步骤。当将细胞通过本发明的系统进行传代培养时，可以维持引入细胞的靶物质的表达强度。
II.本发明的增加递送方法
本发明还提供了用于增加核酸、蛋白质或低分子量化合物至非免疫细胞的递送的方法，所述方法通过使用含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声(在下文也将被称为“本发明的增加递送方法”)。所述方法包括将本发明中的超细气泡水等施用至受试者以将其递送至非免疫细胞附近，并且对非免疫细胞进行超声辐照，从而将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至非免疫细胞。如本文所用，“非免疫细胞”的含义与针对上文提及的本发明的系统所定义的相同。
作为将在“本发明的增加递送方法”中使用的超细气泡水或超细气泡水溶液，可以使用上文提及的本发明中的超细气泡水等。“本发明的增加递送方法”中的超声辐照可以在与上文提及的本发明的系统中的超声发生器的使用的条件类似的条件下进行。
通过本发明的增加递送方法增加至非免疫细胞的递送的核酸、蛋白质或低分子量化合物没有特别限制，并且可以是例如由于递送至细胞而能够赋予非免疫细胞优选的生理活性的物质。核酸的例子包括但不限于小RNA/DNA诸如siRNA(例如，FAM-siRNA，由NIPPONGENE CO.,LTD.制造)、ssRNA、shRNA、miRNA、S-寡DNA(硫代磷酸酯)等)、基因(例如，质粒DNA、mRNA等)等。蛋白质的例子包括抗体(例如，IgG(例如，Alexa-IgG，由Invitrogen Corp.制造)等)、肽等。低分子量化合物的例子包括但不限于已知或新颖的药剂化合物、荧光物质(诸如荧光素、荧光素钠)等。其中，优选小RNA/DNA等(诸如siRNA和反义寡核酸)作为核酸，优选抗体等作为蛋白质，并且优选药剂化合物、荧光染料等作为低分子量化合物。
核酸中的核苷酸数和蛋白质的分子量没有特别限制。例如，在核酸(小RNA/DNA，诸如siRNA、反义寡核酸等)的情况下，它是10mer-30mer，优选15mer-25mer；在蛋白质的情况下，它是25kDa-900kDa，优选25kDa-320kDa。
III.本发明的制剂
本发明还提供了制剂，所述制剂包含核酸、蛋白质或低分子量化合物和超细气泡水或超细气泡水溶液的组合，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡，用于将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至非免疫细胞，其中通过与超声辐照组合使用将有效量(非免疫细胞发挥所需效果的量)的核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至非免疫细胞(在下文也将被称为“本发明的制剂”)。如本文所用，“非免疫细胞”的含义与针对上文提及的本发明的系统所定义的相同。
在本发明的制剂中，核酸、蛋白质或低分子量化合物可以是在上文提及的“本发明的增加递送方法”中例示的核酸、蛋白质或低分子量化合物。作为本发明的制剂中的超细气泡水或超细气泡水溶液，可以使用上文提及的“本发明的系统”中描述的超细气泡水或超细气泡水溶液。
在本发明的配制品中，核酸、蛋白质或低分子量化合物可以与本发明中的超细气泡水等混合，并且以单一制剂施用至受试者，或者它们可以分开配制并且通过相同或不同的途径在同一时间或不同时间施用，只要它们可以同时与非免疫细胞相邻共存即可。
当核酸、蛋白质或低分子量化合物与本发明中的超细气泡水等分开配制时，可以将核酸、蛋白质或低分子量化合物与药学上可接受的载体以人或其他哺乳动物可以耐受的量混合。
药学上可接受的载体的例子包括pH调节剂，诸如磷酸一钠、磷酸二钾、磷酸二钠、磷酸一钾、氢氧化钠、盐酸等；抗生素，诸如硫酸卡那霉素、乳糖酸红霉素、青霉素G钾等；稳定剂，诸如乳糖、谷氨酸钾、D-山梨糖醇、氨基乙酸、人血清白蛋白等；着色剂，诸如酚红等；等渗剂，诸如氯化钠、氯化钾等；等。
本发明的制剂中的核酸、蛋白质或低分子量化合物的含量没有特别限制，只要当通过超声辐照将它们递送至非免疫细胞时可以赋予所述细胞优选的特性(诸如所需的生理活性等)即可。例如，含量可以是0.0001mg-1000mg，优选0.001-10mg。另一方面，超细气泡水等的量没有特别限制，只要它通过超声辐照足以将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至非免疫细胞即可。例如，允许递送一定量的超细气泡，使得非免疫细胞附近的超细气泡密度是1×108-10×108个气泡/mL，优选2×108-5×108个气泡/mL。
IV.本发明的递送方法
本发明还提供了用于将核酸或蛋白质递送至非免疫细胞的方法，所述方法包括使细胞与上文提及的本发明的制剂接触，并且将细胞用超声处理。如本文所用，“非免疫细胞”的含义与针对上文提及的本发明的系统所定义的相同。
“本发明的增加递送方法”或“本发明的递送方法”所应用的靶标没有特别限制，只要它是从活体收集的非免疫细胞(例如，神经细胞(包括脑神经细胞)、骨骼肌细胞、内皮细胞、上皮细胞、间皮细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌腱细胞、眼细胞、不包括免疫系统的主要腺体或器官(例如，睾丸、肝脏、肺、心脏、胃、胰腺、肾脏、皮肤等)的细胞、外分泌细胞、内分泌细胞、成纤维细胞、胰岛细胞、源自神经元和其他神经组织的细胞、可以分化为任一种上文提及的细胞的具有单能性或多能性的祖细胞和组织干细胞、胚胎和其他全能或多能干细胞(例如，iPS细胞、ES细胞、ES样细胞、胚胎生殖细胞等)和其他细胞[上皮细胞、间充质细胞和高纯度间充质干细胞(快速扩增细胞：REC)]等)(在本说明书中也将被称为“离体非免疫细胞”)或含有这些的动物组织或身体中的非免疫细胞(在本说明书中也将被称为“体内非免疫细胞”)即可。例如，可以提及人和其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、兔、犬、猫、牛、马、猪、猴等)、源自它们或含有它们的组织的非免疫细胞等。用于将本发明中的超细气泡水等施用至受试者的手段没有特别限制，只要它是能够将超细气泡递送至非免疫细胞附近的施用途径即可。以下分开描述了离体非免疫细胞和体内非免疫细胞。
(a)靶物质至离体非免疫细胞的递送
根据本发明的递送方法，通过组合本发明中的超细气泡水等与超声将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至离体非免疫细胞。因此，可以产生通过核酸、蛋白质或低分子量化合物的作用赋予有利特性(诸如生理活性等)的离体非免疫细胞。
离体非免疫细胞可以从含有细胞的人或非人哺乳动物的组织/器官收集。当将已经引入本发明的制剂的离体非免疫细胞(例如，离体骨骼肌细胞、离体神经细胞)用于治疗疾病(诸如癌症等)时，优选从将治疗的受试者自身或与将治疗的受试者的MHC类型匹配的供体收集细胞群体。
离体非免疫细胞可以是未分化的细胞，诸如多能干细胞、免疫系统以外的组织干细胞等。例如，可以提及胚胎干细胞(ES细胞)、诱导性多能干细胞(iPS细胞)、胚胎癌细胞(EC细胞)、胚胎生殖细胞(EG细胞)、神经干细胞、骨骼肌祖细胞等。未分化的细胞(诸如多能干细胞等)可以通过本身已知的方法分化成各种非免疫细胞，例如骨骼肌细胞、神经细胞等。
用于使本发明的制剂与离体非免疫细胞接触的方法没有特别限制，并且例如，可以将本发明的制剂添加到非免疫细胞的通用培养基中。通过使用关于本发明的系统描述的超声发生器和辐照条件，可以对离体非免疫细胞进行超声辐照。
(b)靶物质至体内非免疫细胞的递送
根据本发明的递送方法，将本发明的制剂施用至哺乳动物(人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猴)，优选人)，并且将含有非免疫细胞的组织或器官(例如，骨骼肌、脑等)暴露于超声，从而将核酸、蛋白质或低分子量化合物引入在动物体内的非免疫细胞(例如，骨骼肌细胞、神经细胞等)并且实现靶物质的作用效果。例如，将能够跳过导致MDS的突变的反义核酸递送至肌营养不良症(MDS)患者的体内骨骼肌细胞并且使其在细胞中表达，从而降低细胞毒性并且可以展现对疾病的治疗效果。
呈例如注射剂形式的本发明的制剂可以通过皮下注射、静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、滴注注射、脑内注射、脑脊液内注射等将核酸、蛋白质或低分子量化合物、超细气泡水等递送至体内非免疫细胞附近。此外，可以通过常规用于超声诊断的操作，通过将靶区域替换为含有体内非免疫细胞的组织或器官来进行超声辐照。
在另一个实施方案中，施用具有不同平均直径的超细气泡的混合溶液，并且组合具有不同频率或输出强度的多个超声波，以允许在多个阶段中使核酸、蛋白质或低分子量化合物穿过细胞膜屏障，并且依次递送至靶非免疫细胞。
当“本发明的增加递送方法”或“本发明的递送方法”应用于离体非免疫细胞(即，从动物分离的非免疫细胞或通过使用本身已知的方法诱导干细胞(诸如iPS细胞等)的分化而获得的非免疫细胞)时，可以包括在转染处理后培养非免疫细胞的步骤。可以使用本身已知的培养容器(例如，皿、烧瓶等)和培养装置(例如，CO2培养箱等)在通常用于非免疫细胞的维持培养并且诱导未分化的干细胞分化为其他非免疫细胞的培养基中进行培养步骤。只要本发明中的转染是在非免疫细胞(也包括免疫系统以外的多能干细胞和组织干/祖细胞)上进行的，本发明不消除转染后通过直接重编程对非免疫细胞分化的诱导或免疫细胞的诱导。
此外，上文提及的培养步骤还包括传代培养步骤。当将细胞通过“本发明的增加递送方法”或“本发明的递送方法”进行传代培养时，可以维持引入细胞的靶物质的表达强度。
V.含有已经通过本发明引入靶物质的离体非免疫细胞的药剂
已经使用本发明的系统或通过本发明的递送方法引入靶物质的离体非免疫细胞通过靶物质的作用提供所需的效果(例如，获得新的生理活性)。因此，可以将它直接或通过与已知的药学上可接受的载体(包括赋形剂、稀释剂、填充剂、粘合剂、润滑剂、助流剂、崩解剂、表面活性剂等等)、常用的添加剂等混合而配制成药物组合物。赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且还可以使用佐剂(诸如润湿剂或乳化剂等)和pH缓冲剂。此外，还可以使用配制佐剂(诸如助悬剂、防腐剂、稳定剂、分散剂等等)。上文提及的药物组合物可以是呈干燥形式，将在使用前用合适的无菌液体重构。药物组合物可以全身或局部口服或肠胃外施用，取决于制剂的形式(口服药剂，诸如片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂、混悬剂等；肠胃外药剂，诸如注射剂、滴注输注剂、外用制剂、栓剂等)等。在肠胃外施用的情况下，静脉内施用、皮内施用、皮下施用、直肠施用、经皮施用等是可能的。此外，当以注射剂形式使用时，还可以添加可接受的缓冲剂、增溶剂、等渗剂等。
含有已经通过本发明引入靶物质的离体非免疫细胞的药剂可以是各种疾病的预防剂或治疗剂，并且目标疾病的例子包括癌症和遗传性疾病。例如，当靶物质是能够跳过导致MDS的突变的反义核酸时，高细胞毒性剪接变体的表达被抑制，并且可以在已经引入靶物质并且在其中已经表达的离体骨骼肌细胞中降低细胞毒性。
含有已经通过本发明引入靶物质的离体非免疫细胞的药剂可以安全地施用至人或其他哺乳动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、兔、猫、犬、牛、羊、猴)，优选人。
优选将含有已经通过本发明引入靶物质的离体非免疫细胞的药剂肠胃外施用至受试者。肠胃外施用方法包括静脉内、动脉内、肌内、腹膜内和皮下施用方法等。根据受试者的病症、体重、年龄等适当选自剂量。通常，施用它使得每次施用至体重为60kg的受试者时，细胞数通常是1×106-1×1010个细胞，优选1×107-1×109个细胞，更优选5×107-5×108个细胞。此外，它可以一次施用或分多次施用。
以下通过参考实施例和实施例进一步描述本发明；然而，本发明在任何意义上都不限于它们。
除非另有规定，否则在以下参考实施例和实施例中，“％”指示重量/体积％。
[实施例]
参考实施例1：超细气泡水的制备
将聚山梨醇酯80(2g)(0.1％聚山梨醇酯80)溶解于注射用水(2L)或稀释的Mclivaine缓冲液(pH 3.0，2L)中，并且用以下设置使用由IDEC制造的超细气泡发生器(nanoGALFTM FZ1N-02)制备超细气泡水溶液。当使用酸性缓冲液(稀释的Mclivaine缓冲液：pH 3.0)时可以产生带正电的超细气泡，并且当使用注射用水时可以产生带负电的超细气泡。
用于制备的气体：空气(实施例3)、C3F8(实施例1、2、4)
气泡水流量：约4.0L/min
溶解压力：300KPa±5％
在121℃-124℃下，适当地使用高压釜使制备的超细气泡水经受高压蒸汽灭菌30min。在灭菌后，通过利用使用LM10(NanoSight Ltd.)的激光束散射的追踪方法测量超细气泡平均直径、超细气泡密度和d90/d10比。
结果在下文中示出。
超细气泡平均直径：120nm±16nm
超细气泡密度：4×108个气泡/mL
d90/d10比：3.3
实施例1siRNA向骨骼肌细胞的引入
将在含10％FBS的DMEM培养基中的C2C12细胞(3×104个细胞，0.5mL)接种在48个孔中。在去除培养基后，添加0.5mL的含5μg的用FAM荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)的超细气泡/DMEM培养基。将通过以下方式制备的超细气泡/DMEM培养基用作转染培养基：将在参考实施例1中制备的1L的超细气泡水溶液添加到DMEM培养基粉末中，并且添加2g/L NaHCO3和10％FBS。
在添加含FAM-siRNA的培养基后，使用超声发生器(NEPAGENE)以1MHz的频率和500mW/cm2的输出强度进行超声辐照持续10s。在超声辐照后，将细胞培养2h，然后去除转染培养基，并且将细胞在DMEM培养基(培养培养基)中培养48h。
在培养完成后，将细胞用DAPI染色并且在荧光显微镜(由KEYENCE制造)下观察。结果在图1A中示出。在单独用超细气泡的情况下，未观察到siRNA向细胞的递送。超声辐照显示出siRNA的轻微细胞内递送。通过组合超细气泡与超声明显提高了siRNA向细胞的引入效率。
在培养完成后，将细胞收集，用0.5mL的细胞裂解溶液完全裂解，并且用荧光分光光度计测量FAM-siRNA的荧光强度。通过以对照(单独的超细气泡)的测量值为1按比例计算来以相对量评价FAM-siRNA摄取的量。结果在图1B中示出。定量确认荧光显微镜观察的结果。
图1示出了带负电的超细气泡(使用注射用水产生)的结果。在siRNA的情况下，用带正电的超细气泡(使用稀释的Mclivine缓冲液(pH 3.0)产生)获得类似的效果。
实施例2用微气泡的比较引入
将在含10％FBS的DMEM培养基中的C2C12细胞(3×104个细胞，0.5mL)接种在48个孔中。在去除培养基后，添加0.5mL的含5μg的用FAM荧光标记的siRNA(FAM-siRNA)的超细气泡/DMEM培养基或微气泡/DMEM培养基。将通过以下方式制备的超细气泡/DMEM培养基和微气泡/DMEM培养基用作转染培养基：将在参考实施例1中制备的1L的超细气泡水溶液或可商购的微气泡水添加到DMEM培养基粉末中，并且添加2g/L NaHCO3和10％FBS。作为微气泡水，使用在组成组分中含有作为磷脂的磷脂酰丝氨酸的Sonazoid(平均直径：3μm)。
在添加每种含FAM-siRNA的培养基后，使用超声发生器(NEPAGENE)以1MHz的频率和500mW/cm2的输出强度进行超声辐照持续10s。在超声辐照后，将细胞培养2h，然后去除转染培养基，并且将细胞在DMEM培养基(培养培养基)中培养48h。
在培养完成后，将细胞收集，用0.5mL的细胞裂解溶液完全裂解，并且用荧光分光光度计测量FAM-siRNA的荧光强度。通过以对照(单独的超细气泡)的测量值为1按比例计算来以相对量评价FAM-siRNA摄取的量。结果在图2中示出。与微气泡水相比，超细气泡水更明显地提高了siRNA向细胞的引入效率。
图2示出了带负电的超细气泡(使用注射用水产生)的结果。在siRNA的情况下，用带正电的超细气泡(使用稀释的Mclivine缓冲液(pH 3.0)产生)获得类似的效果。
实施例3蛋白质向骨骼肌细胞的引入
将在含10％FBS的DMEM培养基中的C2C12细胞(6×104个细胞，1mL)接种在48个孔中。在去除培养基后，添加1mL的用超细气泡/DMEM培养基稀释100倍的IgG-FITC溶液。将通过以下方式制备的超细气泡/DMEM培养基用作转染培养基：将在参考实施例1中制备的1L的超细气泡水溶液添加到DMEM培养基粉末中，并且添加2g/L NaHCO3和10％FBS。
在添加含IgG-FITC的培养基后，以500mW/cm2的输出强度和0.5MHz或3MHz的频率并且使用超声发生器(NEPAGENE)进行超声辐照持续10s。在超声辐照后，将细胞培养2h，然后去除转染培养基，并且将细胞在DMEM培养基(培养培养基)中培养48h。
在培养完成后，用荧光分光光度计测量IgG-FITC的荧光强度。还测量了存活细胞的数目，将其转换为每个存活细胞的荧光强度，并且进行比较。结果在图3中示出。通过组合超细气泡与超声明显提高了IgG-FITC向细胞的引入效率。在所检查的范围内，超声的频率不影响引入效率。
实施例4低分子量化合物向骨骼肌细胞的引入
将在含10％FBS的DMEM培养基中的C2C12细胞(3×104个细胞，0.5mL)接种在48个孔中。在去除培养基后，添加0.5mL的含0.38μg的FITC的超细气泡/DMEM培养基。将通过以下方式制备的超细气泡/DMEM培养基用作转染培养基：将在参考实施例1中制备的1L的超细气泡水溶液添加到DMEM培养基粉末中，并且添加2g/L NaHCO3和10％FBS。
在添加含FITC的培养基后，以1MHz的频率和100、250、500mW/cm2的输出强度并且使用超声发生器(NEPAGENE)进行超声辐照持续10s。在超声辐照后，将细胞培养2h，然后去除转染培养基，并且将细胞在DMEM培养基(培养培养基)中培养48h。
在培养完成后，将细胞收集，用0.5mL的细胞裂解溶液完全裂解，并且用荧光分光光度计测量FITC的荧光强度。通过以对照(单独的超细气泡)的测量值为1按比例计算来以相对量评价FITC摄取的量。结果在图4中示出。通过组合超细气泡与超声明显提高了FITC向细胞的引入效率。超声的输出强度极大地影响了引入效率，并且即使在100mW/cm2下也观察到增加的趋势。FITC的引入效率在250或500mW/cm2下显著提高，并且在250mW/cm2下显示出特别优异的引入效率。
图4示出了带负电的超细气泡(使用注射用水产生)的结果。在低分子量化合物的情况下，用带正电的超细气泡(使用稀释的Mclivine缓冲液(pH 3.0)产生)获得类似的效果。
[工业实用性]
本发明的系统可以通过低输出强度的超声辐照将靶物质(诸如核酸、蛋白质、低分子量化合物等)有效地递送至非免疫细胞，并且因此可以提供用于将药物递送至非免疫细胞的高度安全的系统。与使用常规微气泡相比，使用超细气泡可以明显提高靶物质向细胞的引入效率。此外，由于所述系统不需要使用脂质体，因此它可以以低成本制造并且是高度安全的。综上所述，本发明的系统尤其可用作进入非免疫细胞的新颖DDS。

Claims (14)

1.一种用于将靶物质递送至细胞(不包括免疫细胞)的系统，所述系统包含含有平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声发生器的组合。
2.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡水溶液包含选自一种或多种的表面活性剂、亲水性树脂和缓冲液的一种或多种组分，所述一种或多种的表面活性剂选自阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、阳离子表面活性剂和两性表面活性剂。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡水溶液由非离子表面活性剂和/或亲水性树脂组成。
4.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡由全氟代烃或空气构成。
5.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡具有50nm-200nm的平均直径。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述超细气泡具有不大于5的d90/d10比。
7.根据权利要求1所述的系统，其中在所述超细气泡水或超细气泡水溶液中的所述超细气泡具有不小于1.0×108个气泡/mL的密度。
8.根据权利要求1所述的系统，其中在所述超声发生器中的超声输出强度不大于720mW/cm2。
9.根据权利要求1所述的系统，其中在所述超声发生器中，超声输出强度是50-500mW/cm2并且超声频率是0.5-10MHz。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述靶物质是核酸、蛋白质或低分子量化合物。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述细胞是骨骼肌细胞或神经细胞。
12.一种用于增加核酸、蛋白质或低分子量化合物至细胞(不包括免疫细胞)的递送的方法，所述方法通过使用包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡的超细气泡水或超细气泡水溶液和超声。
13.一种制剂，所述制剂包含核酸、蛋白质或低分子量化合物和超细气泡水或超细气泡水溶液的组合，所述超细气泡水或超细气泡水溶液包含平均直径不大于200nm且不含磷脂的超细气泡，用于将所述核酸、所述蛋白质或所述低分子量化合物递送至细胞(不包括免疫细胞)，其中通过与超声辐照组合使用将有效量的所述核酸、所述蛋白质或所述低分子量化合物递送至所述细胞(不包括免疫细胞)。
14.一种用于将核酸、蛋白质或低分子量化合物递送至细胞(不包括免疫细胞)的方法，所述方法通过使所述细胞与根据权利要求13所述的制剂接触，并且将它们用超声处理。
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