JP2008063258A - 組織保存液 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】酸素ナノバブルを含むことを特徴とする組織保存液である。
【選択図】なし
Description
酸素ナノバブル水は、前記したように、例えば、魚介類の環境変化に対する適応性を向上させたり、衰弱した個体を急速に回復させたりするなど、生物に対する種々の生理活性作用を有していることが既に知られており、注目を集めている。また、近年、ナノバブルを長期間安定に維持できる酸素ナノバブル水の製造方法も確立された(例えば、特開2005−246294号公報参照)。
しかしながら、前記酸素ナノバブル水が、従来の組織培養液と同様か、又はそれ以上の組織保存効果を奏することができ、そのため、優れた組織保存液として、医療、医学実験等の分野で好適に利用可能であることは従来全く知られておらず、本発明者らの新たな知見である。
本発明の組織保存液は、酸素ナノバブルを含むことを特徴とする。
本発明において、「酸素ナノバブル」とは、酸素を含有する気泡であり、かつ、その気泡径(直径)がナノサイズ(1μm以下)であるものをいい、「酸素ナノバブル水」とは、酸素を含有し、かつ、前記酸素が、前記酸素ナノバブルとして存在している水溶液をいう。即ち、前記酸素ナノバブル水は、本発明の組織保存液の好ましい一態様である。
前記酸素ナノバブルの気泡径は、例えば、逆浸透膜などを利用して所望のサイズに調整することができ、また、前記酸素ナノバブルの気泡径は、例えば、動的光散乱光学計を用いて測定することができる。
前記酸素ナノバブル水は、前記酸素ナノバブル以外にも、必要に応じて適宜その他の成分を含有してなる。前記その他の成分の具体例としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、鉄、マンガン、塩分などが挙げられる。
前記酸素ナノバブル水の製造方法としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、例えば、特開2005−246294号公報に記載の製造方法に従って製造することができる。前記公報に記載の製造方法によれば、数ケ月以上の長期にわたって酸素ナノバブルが安定して存在し、水溶液中から消滅することがない酸素ナノバブル水を製造することができる点で、好ましい。
前記組織保存液の保存対象としては、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができ、また、本発明の組織保存液は、「組織」のみでなく、「細胞」や「臓器」の保存にも好適である。
前記組織保存液の使用方法としては、特に制限はなく、従来の組織保存液と同様に、例えば、前記組織、細胞、臓器等を、生体から摘出後、前記組織保存液に所望の期間浸漬させることにより使用することができる。
また、前記組織保存液自体の保存方法としても、特に制限はなく、目的に応じて適宜選択することができる。
前記組織保存液は組織保存性に優れるので、例えば、医療、医学実験等の分野における組織保存液として、好適に利用可能である。
本発明の組織保存液の一態様である酸素ナノバブル水(株式会社REO研究所)は、特開2005−246294号公報に記載の製造方法を参照し、作製した。具体的には、1.0質量%の塩分濃度の硬水(地下水)を原材料として、50μm以下の酸素マイクロバブルを作製した上で、急速圧壊させて作製した。
得られた酸素ナノバブル水の組織保存効果について、生理食塩水と従来の組織培養液とを対照とし、ラット迷走神経を材料に用い、組織学的検討を行った。
−組織の保存/固定−
ラット(Std:Wistar/ST、10週齢、雄、300g)4頭(ラット1〜4)より、ネンブタール麻酔下に手術用顕微鏡を用いて、両側の迷走神経(計8本)を摘出した。次に、摘出した迷走神経のうち、ラット1頭(ラット1)より摘出した迷走神経(計2本)については、切断せずにそのまま以降の実験操作に用い、残りのラット3頭(ラット2〜4)より摘出した各迷走神経(計6本)については、それぞれ5等分に切断した。
次に、3頭(ラット2〜4)より摘出した各迷走神経の最中枢側(L2〜4、R2〜4)と、残りの1頭(ラット1)より摘出した迷走神経全体(L1、R1)を、正常対照迷走神経組織として、切断乃至摘出直後にザンボニ固定液(15%ピクリン酸、4%パラホルムアルデヒド、0.4Mリン酸緩衝液、pH7.4)を用いて4℃で1週間、固定処理した。また、3頭(ラット2〜4)より摘出した各迷走神経組織の残りの部分は、左側をA系列、右側をB系列として、中枢側から順に、それぞれ生理食塩水(C)、酸素ナノバブル水(NB)、ダルベッコ変法イーグル培地(Dulbecco’s Modified Eagle Medium:DMEM)、神経細胞培養用培地(Neuron Culture Medium:NCM)中にて4℃で組織保存し、1、3、7日後にザンボニ固定液に移して4℃で1週間、固定処理した(図1)。更に、固定処理した各迷走神経組織は、52℃低融点パラフィンを用いて包埋処理した。
[保存方法]
L1〜4、R1〜4 :切断乃至摘出直後に固定
C−A1、3、7、C−B1、3、7 :生理食塩水で保存
NB−A1、3、7、NB−B1、3、7 :酸素ナノバブル水で保存
DMEM−A1、3、7、DMEM−B1、3、7:DMEMで保存
NCM−A1、3、7、NCM−B1、3、7 :NCMで保存
[保存日数]
A1、B1:1日保存
A3、B3:3日保存
A7、B7:7日保存
パラフィン包埋した各迷走神経組織について、ミクロトームを用いて厚さ8μmに薄切した後、MASコーティングスライドガラスに貼り付けた。次いで、キシレン系列及びアルコール系列により脱パラフィン処理し、蒸留水中で5分間、脱アルコール処理した。その後、メイヤーのヘマトキシリン(Mayer’s Hematoxylin)液を用いて室温で30分間、核染色処理した。更に、流水中で15分間色出し処理後、10%エオシン(Eosin)液で5分間、線維、間質等の染色をし、流水中で1分間洗浄後に蒸留水に通した。その後、アルコール系列にてエオシン(Eosin)脱色及び脱水処理を行い、キシレン系列で透徹処理した後に、エンテランニューにより封入処理をして、H.E.染色組織標本を作製した(例えば、下記参考文献(1)〜(2)参照)。
次に、作製したH.E.染色組織標本について、光学顕微鏡を用いて鏡検し、各迷走神経組織の微細形態変性について、組織保存性を組織学的に判定した(例えば、下記参考文献(3)〜(8)参照)。
結果を図2〜4、及び表1に示す。
正常対照迷走神経組織の微細形態については、中枢側、中央部、末梢側で組織学的な差は認められなかった(図2)。また、左右間や個体間でも組織学的な差は認められなかった。
生理食塩水(C)中で保存した場合では、保存3日後以降で迷走神経組織の細胞質脱落による菲薄化が進行していた。また、DMEM中で保存した場合では、保存3日後にある程度の迷走神経組織の細胞質脱落がみられ、保存7日後で迷走神経組織の細胞質脱落による菲薄化が進行していた。一方、酸素ナノバブル水(NB)、NCM中で保存した場合では、組織保存性が比較的良好であり、保存7日後で弱度の細胞質脱落がみられたのみであった(図3、図4)。
各迷走神経組織の組織保存性について、下記評価基準に従い、組織学的に判定した結果を表1に示した。
[評価基準]
3+:良好な微細形態の維持
2+:弱度の細胞質脱落
+:細胞質脱落による菲薄化の進行
以上の結果から、酸素ナノバブルを含む本発明の組織保存液は、優れた組織保存性を有していることが示され、医療、医学実験等の分野における組織保存液としての応用の可能性が示された。
なお、本実施例中、各参考文献は以下の通りである。
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