ES2881079T3 - Método de descelularización de injertos de tejidos - Google Patents

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Abstract

Un método para descelularizar un injerto de tejido en donde dicho método comprende poner en contacto un injerto de tejido con una composición de extracción que comprende un detergente anfótero a una concentración, y durante un tiempo de contacto, que es suficiente para romper las células en el tejido, y en donde el método se realiza en ausencia de un detergente aniónico.

Description

DESCRIPCIÓN
Método de descelularización de injertos de tejidos
Referencia cruzada a una solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica el beneficio de la solicitud provisional de Estados Unidos con núm. de serie 61/794,012, presentada el 15 de marzo de 2013.
Antecedente de la invención
La ingeniería biomédica se enfrenta a muchos desafíos en el desarrollo de tejidos que pueden usarse para facilitar la cicatrización. Por ejemplo, un tejido de "reemplazo" debería promover la regeneración del tejido. Al hacerlo, el tejido nuevo debe ser compatible con el tejido receptor para que las células vecinas acepten el reemplazo. Es importante destacar que el tejido de reemplazo debe superar (o evitar) las respuestas inmunológicas típicamente provocadas por la adición de un "cuerpo extraño" a un sistema biológico.
Además, el tejido de reemplazo debe exhibir las propiedades y la función del tejido que está reemplazando. Por ejemplo, el tejido de reemplazo debería exhibir propiedades mecánicas y estructurales similares al tejido original o, como mínimo, no interferir con el entorno nativo. El tejido de reemplazo puede actuar como una armazón y/o conservar las propiedades biológicas para promover la regeneración celular. Finalmente, el tejido de reemplazo no debe estimular la formación de cicatrices que limitan la regeneración del tejido o inhiben la función natural del tejido subyacente.
Una modalidad particularmente desafiante de la ingeniería de tejidos es la producción de injertos de nervios que pueden usarse para ayudar a la regeneración de nervios cortados. En la reparación nerviosa directa, cuando los extremos de un nervio cortado se vuelven a conectar (sin un injerto interposicional), los axones intentarán volver a crecer desde el nervio proximal al nervio distal. En este contexto, a continuación de una lesión nerviosa, el nervio distal sufre un proceso conocido como degeneración Walleriana, que implica la degradación y eliminación de elementos nerviosos, que incluyen los axones distales no funcionales y sus vainas de mielina. En parte debido a este proceso, se ha creído desde hace mucho tiempo que los restos axonales y de mielina tienen efectos inhibidores del crecimiento que reducen la regeneración nerviosa y pueden ser una barrera mecánica para el crecimiento axonal.
Una amplia evidencia indica que la regeneración nerviosa es más lenta cuando se retrasa el proceso de degeneración walleriana. Por consiguiente, se ha aceptado ampliamente que la eliminación de elementos nerviosos mejora el crecimiento axonal en el nervio distal. Esta premisa se ha extrapolado al injerto de nervios y ha fomentado la creencia de que los restos celulares también deben eliminarse de los injertos de nervios para promover el crecimiento axonal. También se ha pensado que la eliminación del material celular residual es necesaria para minimizar los patógenos en el tejido y eliminar el material inmunogénico que podría conducir al inmunorrechazo del injerto. En consecuencia, los métodos de procesamiento usados para los injertos de nervios involucran rutinariamente técnicas de descelularización rigurosas, incluso a expensas de alterar las estructuras de la matriz extracelular (MEC) y la integridad del injerto de nervio que apoyan el proceso regenerativo.
El daño a los nervios a menudo da como resultado la pérdida de los extremos limpios para la reparación directa o en un espacio creado por el daño del tejido nervioso. En este caso, la reparación del nervio requiere un injerto interposicional para salvar el déficit y restaurar la continuidad del nervio.
Por ejemplo, la patente de Estados Unidos núm. 7,402,319 describe un aloinjerto de nervio acelular que puede restablecer la continuidad del nervio y, en las circunstancias adecuadas, puede conducir a la regeneración nerviosa. Este tipo de injerto de nervio se obtiene al empapar tejido nervioso en varias series de soluciones con sulfobetaínas y detergentes tensioactivos aniónicos (por ejemplo, Triton X-200), que se usan para descelularizar el tejido nervioso. El documento US 2005/043819 A1 describe un método para descelularizar un injerto de tejido tal como un injerto de nervio. En dicho proceso se usa una solución que comprende Triton X-200 y sulfobetaínas (10 o 16).
Hudson y otros aplicaron una técnica de descelularización que contenía Triton X-200™, sulfobetaína-16 y sulfobetaína-10 en nervios de rata e informaron niveles muy altos de extracción. (Hudson TW, Liu SY, Schmidt CE. Tissue Eng. 10: 1346-58, 2004). Sin embargo, los nervios de los roedores contienen un solo haz de nervios (fascículo) y las vainas nerviosas externas de los nervios de los roedores tienen poca semejanza con los nervios de los animales más grandes. La mayoría de los nervios de animales más grandes (por ejemplo, conejos, humanos) tienen múltiples haces de nervios incrustados en un epineuro interno de colágeno (tejido conectivo que rodea los haces de nervios). La vaina y las estructuras intrafasciculares de los nervios humanos son expansivas y tienen una profunda influencia en la integridad y permeabilidad del nervio, que incluye las propiedades que afectan la extracción de tejido. Por tanto, el conocimiento sobre la descelularización y extracción del nervio del roedor sugiere, en el mejor de los casos, la extracción esperada cuando se aplica a los nervios de animales más grandes.
En resumen, sigue existiendo la necesidad de mejorar los reemplazos de tejido, particularmente en el contexto del tejido nervioso. El reemplazo de tejido mejorado debe mantener las características bioactivas y estructurales nativas del tejido que reemplaza, que incluyen, por ejemplo, la actividad de laminina, y ser capaz de incorporar compuestos o moléculas bioactivos cuando sea necesario para promover una rápida regeneración, y estimular la reparación y regeneración de tejidos sin dejar cicatrices que pueden reducir la movilidad e integridad de los tejidos.
Breve resumen de la invención
La presente invención proporciona un método para descelularizar un injerto de tejido en donde dicho método comprende poner en contacto un injerto de tejido con una composición de extracción que comprende un detergente anfótero a una concentración, y durante un tiempo de contacto, que es suficiente para romper células en el tejido, y en donde el método se realiza en ausencia de un detergente aniónico. La presente invención proporciona también injertos de tejidos obtenidos mediante dicho método así como también estuches que comprenden dichos injertos. Los injertos de tejido de la presente invención proporcionan un injerto o tejido de reemplazo natural que puede obtenerse mediante sencillas etapas de preparación. Los métodos de la invención alteran específicamente los componentes celulares inmunogénicos sin alterar significativamente la estructura extracelular natural. Ventajosamente, el tejido conserva propiedades biológicas para promover la regeneración celular a través del injerto. La estructura de la matriz extracelular nativa (MEC) se conserva, específicamente, en el caso de los injertos de nervios, la lámina basal y la capa de endoneuro/endotelio conservan su estructura natural y generalmente original.
De esta manera, en una modalidad, la invención proporciona un injerto de nervio que apoya la regeneración axonal, guía los axones hacia el extremo distal del nervio y se tolera inmunológicamente. El injerto de nervio acelular puede ser, por ejemplo, un isoinjerto, un autoinjerto, un aloinjerto o un xenoinjerto.
En una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar el reemplazo de tejido que incluye las etapas de: lavar el tejido de reemplazo, en ausencia de cualquier detergente iónico (que incluye cualquier detergente aniónico), en una solución que comprende al menos un detergente anfótero y luego lavar el tejido de reemplazo en soluciones seriadas de una sal tamponada para eliminar el exceso de detergente anfótero. Este proceso es más simple y menos costoso que los procesos de la técnica actual y da como resultado un tejido de reemplazo con mejores propiedades de manipulación y con mejores propiedades promotoras de la regeneración.
En una modalidad específica, el o los detergentes anfóteros usados de acuerdo con la presente invención son sulfobetaína-10 (SB-10) y/o sulfobetaína-16 (SB-16).
La presente invención también proporciona un tejido de reemplazo descelurarizado. En una modalidad, el tejido de reemplazo puede formar parte de una sutura, tubo, hoja, película o armazón para su administración a un receptor. Preferentemente, el tejido de reemplazo conserva componentes biológicos que promueven la regeneración y/o no provoca respuestas inmunológicas después del trasplante en el receptor.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un estuche para el reemplazo de tejidos que comprende un tejido de reemplazo descelurarizado. El estuche también puede incluir una o más soluciones útiles para resuspender el tejido de reemplazo de la presente invención, por ejemplo, una solución salina estéril tamponada que es farmacológicamente aceptable. Además, el estuche también puede incluir un vial de solución con células, u otros agentes activos, que pueden añadirse para estimular la regeneración de tejidos (por ejemplo, células de Schwann y/o citocinas). El estuche puede incluir además una hoja de instrucciones o un folleto que proporcione al usuario instrucciones detalladas para el tejido de reemplazo sin células.
En una modalidad específica, la presente invención proporciona un injerto que apoya la regeneración axonal, guía los axones hacia el extremo distal del nervio y se tolera inmunológicamente. En un ejemplo, el injerto es un injerto de nervio. El injerto puede congelarse antes de la descelularización y luego almacenarse y colocarse en estantes para su uso congelado. Otra modalidad es cuando el injerto de nervio se prepara para una aplicación particular cuando no se requiere conservación por congelación; en ese caso, la temperatura puede ser más baja o más alta en dependencia de la solución en la que se almacena el injerto antes de su uso que incluye, por ejemplo, uno o más agentes conservantes y/o antimicrobianos.
En una modalidad, un injerto que apoya la regeneración también puede incluir uno o más materiales que ayuden a regular negativamente la respuesta inmunológica del receptor a la implantación del injerto. Por ejemplo, un injerto de la presente invención puede incluir éster de forbol acetato de miristato de forbol (PMA) para estimular la implantación del injerto con una respuesta inmunológica mediada por células T CD4+ reducida.
Breve descripción de los dibujos
Figura 1. Tinción con hematoxilina y eosina de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 2. Tinción de Hoescht de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 3. Inmunotinción de S-100 de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 4. Tinción con negro de Sudán de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 5. Tinción de neurofilamentos NAP-4 de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 6. Inmunotinción de laminina de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 7. Tinción con hematoxilina y eosina de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 8. Tinción de Hoescht de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 9. Inmunotinción de S-100 de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 10. Tinción con negro de Sudán de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 11. Inmunotinción de neurofilamentos NAP-4 de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 12. Inmunotinción de laminina de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método de la presente invención (DC3; panel C).
Figura 13A. Ensayo de criocultivo de injertos de nervio de rata descelularizados por (A) tampón solo y (B) descelularización con detergente descrito por Hudson y otros (sulfobetaína-10, sulfobetaína-16 y Triton X-200™). Los nervios se crioseccionaron en el eje longitudinal y se montaron en cubreobjetos. Se sembraron neuronas disociadas en las secciones de tejido y se cultivaron durante 24 h. Luego, se fijaron los criocultivos y se inmunotiñeron las neuronas de prueba. Se observó un crecimiento axonal extenso en la condición de tampón solo, mientras que la actividad promotora del crecimiento de los injertos de nervios se eliminó virtualmente mediante la descelularización rigurosa con detergente.
Figura 13B. Efectos de Triton X-200™ sobre la actividad promotora de neuritas de los injertos de nervios. Las muestras de injerto de nervio se descelularizaron mediante el método de Hudson y otros con y sin Triton X-200™. Los nervios se crioseccionaron en el eje longitudinal y se montaron en cubreobjetos. Se sembraron neuronas disociadas en las secciones de tejido y se cultivaron durante 24 h. Las longitudes de las neuritas se puntuaron mediante análisis de imágenes digitales. Los datos representan las puntuaciones medias (± SE) de más de 500 axones de 4 secciones de tejido en 2 experimentos separados.
Figura 14. Efectos de los detergentes individuales sobre la actividad promotora de neuritas de la laminina purificada. La laminina-1 purificada se mezcló con detergentes individuales como sigue: Control (solo tampón), sulfobetaína-10 (125 mM), sulfobetaína-16 (0,6 mM) y Triton X-200 (0,14 %). Las mezclas se dializaron ampliamente y luego se añadieron a pocilios de cultivo de tejidos para formar un sustrato sobre el que se sembraron neuronas disociadas. Después de 24 horas en cultivo, se midió la longitud de las neuritas. Los datos representan las actividades específicas (DE50) calculadas a partir de puntuaciones medias de series de diluciones realizadas por duplicado en 4 experimentos separados
Figura 15. Regeneración nerviosa exitosa en un modelo de aloinjerto de nervio de conejo. Se reparó un espacio de 0,5 cm en el nervio peroneo del conejo con un injerto de nervio de 1,2 cm procesado por el método de la presente invención. Después de 4 semanas se examinaron los injertos. A) La tinción con hematoxilina y eosina indicó una excelente integridad e incorporación del injerto en el nervio receptor. La revascularización y la infiltración celular son evidentes dentro del injerto. No se encontraron signos de inflamación o rechazo del injerto en ninguno de los 24 receptores. B) El inmunomarcaje de p-tubulina III (específico para axones) reveló abundante regeneración axonal en todo el injerto. C) El inmunomarcaje de S100 reveló que abundantes células de Schwann de tejido receptor se habían infiltrado en el injerto en estrecha asociación con axones en crecimiento, indicativo de la regeneración funcional del nervio.
Figura 16. Regeneración exitosa mediante aloinjertos de nervios muy largos. Se reparó un espacio de 5 cm en el nervio peroneo de conejo con un injerto de nervio de 7 cm procesado por el método de la presente invención. Después de 26 semanas se examinaron los injertos. A) La tinción con hematoxilina y eosina indicó una excelente integridad e incorporación del injerto en el nervio receptor. La revascularización y la infiltración celular son evidentes dentro del injerto. No se encontraron signos de inflamación o rechazo del injerto en ninguno de los 10 receptores. B) El inmunomarcaje de neurofilamentos NAP-4 (específico para axones) reveló abundante regeneración axonal en todo el injerto. C) El inmunomarcaje de S100 reveló que abundantes células de Schwann de tejido receptor se habían infiltrado en el injerto en estrecha asociación con axones en crecimiento, indicativo de la regeneración funcional del nervio. D) Se encontraron abundantes axones inmunopositivos de neurofilamentos en el nervio receptor distal al injerto, lo que indica que la regeneración nerviosa atravesó con éxito el injerto de 7 cm y procedió distalmente a los tejidos diana.
Descripción detallada de la invención
Los términos usados en la presente descripción tienen los significados que los entendidos comúnmente por un experto en los campos relevantes para la presente invención. Los términos como "un", "una" y "el/la" no pretenden hacer referencia a una entidad singular, sino que incluyen la clase general de la que puede usarse un ejemplo específico como ilustración. La terminología en la presente descripción se usa para describir modalidades específicas de la invención, pero su uso no limita la invención, excepto como se indica en las reivindicaciones. A menos que se defina de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen los mismos significados que los entendidos comúnmente por un experto en la técnica a los que pertenece esta invención.
En una modalidad, la presente invención proporciona un aloinjerto de nervio que conserva la estructura extracelular así como también las propiedades biológicas del tejido nervioso periférico. El aloinjerto se prepara mediante un tratamiento de descelularización exclusivo mejorado. El proceso de descelularización solubiliza las membranas celulares del tejido nervioso, para eliminar de esta manera los antígenos que generan el rechazo del aloinjerto. La presente invención proporciona además métodos para preparar un injerto a base de tejido natural que se tolera inmunológicamente y conserva la estructura y arquitectura intrínsecas del tejido nativo. Como se usa en la presente descripción, el término "tejido de reemplazo" se usa para describir un tejido que se ha extraído de un animal donante (vivo o cadavérico) y que se ha tratado de acuerdo con la presente invención.
Los usos de los injertos en la presente invención incluyen, pero no se limitan a: 1) como biomaterial biocompatible que generalmente no es inmunogénico; 2) como base estructural para los factores que promueven la regeneración de tejidos específicos del tejido y del receptor; y 3) como herramienta de investigación para estudiar la respuesta del receptor a la estructura del tejido de reemplazo. La presente invención también proporciona un tejido de reemplazo que es generalmente tejido acelular con características procesables, biológicas, bioactivas y/o biodegradables. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto ahora que, contrariamente a las preocupaciones convencionales, la gran mayoría de los componentes celulares residuales en un injerto de tejido no son problemáticos; las células huésped eventualmente las eliminan después del injerto. Incluso las moléculas MHC residuales que podrían provocar rechazo no son un problema. Para provocar una respuesta inmunológica significativa, los componentes del MHC deben conservarse como complejos estrechamente asociados en las membranas celulares. Dado que las membranas celulares y los complejos de MHC se solubilizan fácilmente mediante detergentes suaves (no iónicos y anfóteros) de acuerdo con la presente invención, estas preocupaciones se alivian.
Las tecnologías de descelularización convencionales requieren agentes agresivos y potentes detergentes aniónicos. De acuerdo con la presente invención, se ha determinado de manera sorprendente y ventajosa que la extracción celular extensa no es beneficiosa, sino que, de hecho, es perjudicial para el proceso de injerto. Más bien, una extracción moderada es suficiente para hacer que un aloinjerto de tejido sea inmunocompatible y es beneficiosa para la conservación de la ECM del injerto necesaria para promover la reparación del tejido.
Desafortunadamente, se ha demostrado que lavar los tejidos nerviosos con detergentes iónicos (como Triton X-200™) reduce la actividad de la laminina. Las lamininas son proteínas principales en la lámina basal que son importantes para la regeneración de tejidos al influir en la diferenciación, migración y adhesión celular. Por ejemplo, la laminina es un sustrato principal a lo largo del cual crecen los axones nerviosos.
De esta manera, de acuerdo con la presente invención, los detergentes anfóteros suaves son suficientes para dispersar los elementos celulares suficientemente, y hacer simplemente que un injerto de tejido sea inmunocompatible, sin desnaturalización de las bioactividades intrínsecas esenciales.
Definiciones
Como se usa en la presente descripción, el término "acelular" se refiere a tejidos sin células vivas.
El término "descelular" se refiere a tejidos en los que las células se desintegran y se extrae el material celular. El nivel de eliminación de células dependerá de la fuente exacta de tejido, la metodología usada para extraer la célula y la necesidad de eliminar las células. Mediante la eliminación de células puede usarse una amplia gama de extracción con la presente invención. La cantidad de eliminación de células puede variar desde muy poco hasta casi el 100 por ciento. La desintegración y/o extracción celular lograda hace que el injerto se tolere inmunológicamente cuando se usa una fuente de tejido no autólogo o una fuente de tejido que no coincide en términos de histocompatibilidad. El aloinjerto requiere menos extracción de tejido que el xenoinjerto para reducir las preocupaciones de rechazo inmunológico por parte del receptor. Por tanto, se indican tiempos de contacto más prolongados con detergentes anfóteros.
El término "injerto", como se usa en la presente descripción, se refiere a material biológico derivado de un donante para trasplante en un receptor. El injerto puede derivarse de cualquier fuente animal, que incluye el humano, ya sea de cadáveres o donantes vivos. El donante es preferentemente un mamífero.
El término "mamífero" se refiere a cualquier receptor animal clasificado como mamífero, que incluyen humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, deportivos o de compañía, como perros, caballos, gatos, cerdos y vacas.
Método de descelularización de injertos de tejido
El tejido que se va a usar de acuerdo con la presente invención puede recolectarse mediante el uso de técnicas estándar que son bien conocidas por los expertos en la técnica. En una modalidad preferida, el tejido, que puede ser, por ejemplo, tejido nervioso, se congela después de su recolección.
En modalidades preferidas, se usa al menos un detergente en una sal y una solución tamponada en los métodos de la presente invención. El componente detergente comprende preferentemente al menos un detergente anfótero y excluye el uso de cualquier cantidad significativa de detergentes aniónicos. En una modalidad preferida, el método no usa Triton X-200™.
Los detergentes usados en la presente invención son aquellos que rompen específicamente células dentro del tejido pero no desintegran estructuras extracelulares o proteínas estructurales (aquellas que incluyen, por ejemplo, la matriz extracelular y o laminina). Los restos celulares pueden eliminarse como se describe en la presente descripción, por ejemplo, mediante el lavado con soluciones tamponadas y/o eliminación física de otros restos no estructurales como la grasa. En comparación con un injerto de tejido no tratado, el tejido de reemplazo de la presente invención provoca una respuesta inmunológica significativamente reducida porque los antígenos de las células de superficie se han desintegrado o eliminado.
En una modalidad específica, se obtiene un tejido nervioso y se somete a una solución de lavado que comprende al menos un detergente anfótero. El término "detergente" se usa en esta solicitud de manera intercambiable con el término "tensioactivo".
El detergente anfótero puede describirse ampliamente como que comprende moléculas (o iones) que pueden reaccionar tanto como un ácido así como también, una base. Los tensioactivos anfóteros pueden incluir moléculas anfipróticas que pueden donar o aceptar un protón (H+). Estos se ven muy afectados por los cambios en el pH. Se comportan como detergentes aniónicos a valores de pH superiores o igual a 8. Se comportan como detergentes no iónicos a valores de pH entre 8 y 6. Se comportan como detergentes catiónicos a un pH inferior a 4. A un pH elevado, aumentan los poderes de detergencia; a pH bajo, los poderes de detergencia se reducen. En una modalidad preferida, el tejido se pone en contacto con un detergente que es anfótero a un pH de 6 a 8. En una modalidad específica, el contacto del tejido con un detergente anfótero se realiza a un valor de pH entre y 8.
Una lista de clases anfóteras y especies de estos tensioactivos se proporciona en la patente de Estados Unidos núm. 3,929,678 expedida a Laughlin y Heuring el 30 de diciembre de 1975. Se dan más ejemplos en "Surface Active Agents and Detergents" (Volumen I y II de Schwartz, Perry y Berch).
Los tensioactivos de ion híbrido son un subconjunto de tensioactivos anfóteros que incluyen anfolitos. Normalmente, un tensioactivo de ion híbrido comprende una molécula neutra que tiene una carga eléctrica positiva y negativa (no dipolos) en diferentes ubicaciones dentro de la molécula. Los iones híbridos generalmente contienen grupos catiónicos y aniónicos que se ionizan en un grado casi igual en la región isoeléctrica de la molécula y que pueden desarrollar una fuerte atracción de "sal interna" entre los centros de carga positiva-negativa. Los tensioactivos de betaína y sultaína son tensioactivos de ion híbrido ejemplares para su uso en la presente descripción. En una modalidad, el tensioactivo que se usa no es un tensioactivo de ion híbrido.
Las concentraciones de detergentes (que incluyen las sulfobetaínas anfóteras y el Triton X-200™ aniónico) que se usan en los esquemas de descelularización de tejidos se basan en su "concentración micelar crítica". Esta concentración se informa en la literatura o en las hojas de especificaciones del fabricante y es un requisito mínimo para la eficacia del detergente. La única razón fundamental del tampón de la presente invención es que las micelas más grandes extraen mejor. Las concentraciones de sal más altas aumentan el tamaño de las micelas.
De esta manera, por ejemplo, se forman micelas grandes en el tampón de extracción de la presente invención, que preferentemente tiene salinidad fisiológica o mayor. Estas micelas grandes son ventajosas para solubilizar componentes celulares. En modalidades preferidas, la concentración del detergente está en la concentración micelar crítica o superior.
Se forman micelas más pequeñas en el tampón de enjuague, que tiene baja (por debajo de la salinidad fisiológica), o ninguna, tonicidad/salinidad/osmolaridad. De acuerdo con la presente invención, se ha encontrado que las micelas pequeñas son mejores para difundirse fuera del tejido y el enjuague de baja tonicidad/salinidad/osmolaridad (después de un lavado de alta salinidad) crea un flujo de salida y ayuda a la extracción.
En modalidades preferidas de la presente invención, uno o más lavados iniciales de tejido con una solución que tiene una alta concentración de NaCl mantiene la solubilidad y facilita la extracción al proporcionar micelas grandes. Los enjuagues posteriores con una solución que tenga una concentración más baja de NaCl disminuyen el tamaño de las micelas y mejoran la difusión fuera del tejido.
En modalidades preferidas, los nervios se ponen en contacto con una composición de extracción (preferentemente una composición acuosa) que comprende un componente detergente que comprende, o consiste en, uno o más detergentes anfóteros. Preferentemente, en el componente detergente de la composición de extracción hay ausencia de detergente aniónico. Una "ausencia" de un detergente aniónico, como se establece en la presente descripción, significa que no hay suficiente detergente iónico para degradar la ECM del tejido. De esta manera, no se requiere necesariamente una ausencia total (es decir, 0 %). Preferentemente, la cantidad de detergente aniónico es menor que 0,14, 0,10, 0,05, 0,01 o 0,005 %.
El detergente anfótero puede ser, por ejemplo, SB-10 y/o SB-16. La concentración del detergente(s) debe ser al menos la concentración micelar crítica. La concentración de SB-10 puede ser, por ejemplo, 100, 125, 150, 175, 200 o más mM. La concentración de SB-16 puede ser, por ejemplo, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 o más mM.
La composición de extracción puede comprender, además del componente detergente, una o más sales y/o sistemas tamponantes. La concentración de sal debe ser igual o superior a la salinidad fisiológica. El límite inferior de la concentración de sal puede ser, por ejemplo, 100, 125, 150, 175, 200 o más mM de NaCl y el límite superior puede ser, por ejemplo, 500, 450, 400, 350, 250 o menos mM de NaCl. El pH puede ser, por ejemplo, de 6,5 a 8,5. Preferentemente, el pH es fisiológico. En una modalidad, se usa un tampón de fosfato de sodio para mantener un pH de aproximadamente 7,2.
El tejido puede ponerse en contacto con esta composición con agitación suave durante un período de tiempo que es, preferentemente, 5, 10, 15 o más horas.
Opcionalmente, pueden usarse una o más etapas de extracción adicionales con composiciones de extracción frescas, cuyos ingredientes pueden ser iguales o diferentes a la primera composición de extracción. Esta composición de extracción posterior, con el tejido contenido en ella, puede agitarse luego durante 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más horas.
Preferentemente, las etapas de extracción van seguidas de lavados con tampón de extracción y/o solución salina fisiológica, preferentemente, seguidos de un lavado con tampón de enjuague. El tampón de enjuague puede tener el mismo o diferente sistema de tampón que el tampón de extracción y también suele tener el mismo pH o uno similar. Sin embargo, la concentración de sal de la composición de enjuague es preferentemente menor que la salinidad de la composición de extracción. En una modalidad, la composición de enjuague no tiene salinidad.
Las etapas del proceso se realizarán típicamente entre 20 °C y 30 °C y, preferentemente, a o cerca de la temperatura ambiente (por ejemplo, 25 °C).
En una modalidad preferida, el método comprende un lavado final con un gran volumen de tampón de enjuague y el tejido puede resuspenderse en tampón de enjuague, luego se coloca en solución salina tamponada fisiológica y, preferentemente, se congela hasta su uso.
El sistema tampón y los detergentes anfóteros usados en la presente invención logran una descelularización equivalente, o mejor, a la de Hudson y otros, que usan extracción con detergente aniónico agresivo. Los nervios humanos procesados por el método de Hudson y otros, mostraron sustancialmente más residuos celulares que los informados para los nervios de rata. Además, los métodos usados por Hudson y otros y la presente invención logran niveles casi idénticos de extracción celular cuando se aplica a los nervios del conejo y del ser humano. Por tanto, la adición del detergente aniónico Triton X-200™ como describen Hudson y otros no tiene ninguna ventaja aparente en la descelularización y, como se describió anteriormente, es perjudicial para las propiedades promotoras del crecimiento de las estructuras de la vaina nerviosa. Además, Hudson y otros usan nervios "frescos" en comparación con la presente invención que, preferentemente, usa nervios congelados inmediatamente después de la adquisición, lo que también permite un uso más eficaz de los nervios de donantes de cadáveres humanos.
Ventajosamente, el método de descelularización de la presente invención produce injertos de tejido con excelentes propiedades fisiológicas y estructurales para facilitar y promover la regeneración de tejido. Por ejemplo, se conserva un alto porcentaje de matriz extracelular. En modalidades preferidas, este porcentaje es superior al 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 %.
En el caso específico de los injertos de nervios, tras el proceso de descelularización se conserva más del 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % de laminina. Esto puede medirse, por ejemplo, mediante puntuación observacional (con doble enmascaramiento) o análisis de imágenes digitales en comparación con el nervio donante de control no procesado.
Las propiedades ventajosas de los injertos de nervios producidos de acuerdo con la presente invención también pueden medirse en términos de su actividad promotora de neuritas medida por un bioensayo. Uno de esos bioensayos es el ensayo de criocultivo. En modalidades preferidas, los injertos de nervios producidos de acuerdo con las técnicas de descelularización de la presente invención conservan el 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99 % de su actividad promotora de neuritas, en comparación con los nervios de control que se tratan, por ejemplo, con lavados de tampón solamente.
En una modalidad, los tejidos que incluyen nervios, músculos, placenta y vasculares se descelularizan de acuerdo con la presente invención y se usan como injertos para reparar nervios. En una modalidad preferida, los nervios descelularizados de acuerdo con la presente invención se usan como injertos ortotópicos para reparar nervios. En una modalidad, los nervios descelularizados de acuerdo con la presente invención se usan en aplicaciones alogénicas veterinarias, que incluyen, pero no se limitan a, injertos de nervios de caballos en caballos, injertos de nervios de gatos en gatos e injertos de nervios de perros en perros.
En otra modalidad, los nervios descelularizados de acuerdo con la presente invención se usan en aplicaciones de xenoinjerto, que incluyen nervios de donantes animales injertados en receptores humanos y nervios de donantes animales injertados en receptores animales de una especie diferente.
El presente método de descelularización también puede usarse para injertos de tejido distintos a la reparación de nervios, que incluyen, pero no se limitan a, injertos óseos, injertos intestinales, injertos vasculares, injertos de ligamentos, injertos de tendones e injertos de válvulas cardíacas.
En una modalidad preferida de la presente invención, los injertos se congelan después de la descelularización. Esto facilita un estado favorable para la irradiación gamma (el medio más común de esterilización). Además, el envío y almacenamiento del producto de injerto final congelado es más práctico.
Repoblación celular de injertos
Aunque las células se desintegran y extraen del tejido de la presente invención, puede ser aceptable y, a menudo, necesario reintroducir uno o más tipos diferentes de células en el tejido de reemplazo. Estas células pueden obtenerse directamente de un donante, de un cultivo de células de un donante o de un cultivo celular. Las células del donante se obtienen generalmente mediante biopsia y se hacen crecer hasta la confluencia en cultivo mediante el uso de condiciones estándar. El receptor puede inmunodeprimirse según sea necesario, por ejemplo, mediante el uso de un programa de esteroides y/u otros fármacos inmunodepresores, si es necesario. La inmunodepresión del receptor puede proporcionar inmunoprotección de los trasplantes de tejido de reemplazo mientras crece un tejido nuevo o equivalente.
Además, un tejido de reemplazo de la presente invención puede usarse para proporcionar múltiples tipos de células, que incluyen células, clones o trasplantes genéticamente alterados, dentro de la arquitectura/estructura tridimensional del tejido de reemplazo con el propósito de injerto de trasplante, inmunoterapia, función cognitiva, regeneración, reparación o reconstrucción de tejidos. Los ejemplos de tales células incluyen, pero no se limitan a, condrocitos, osteoblastos, células musculares, células tiroideas, células paratiroideas, células inmunitarias, células pancreáticas, fibroblastos, hepatocitos, células epiteliales, células de los islotes, células nerviosas y otras células que actúan principalmente para sintetizar y secretar o metabolizar materiales, así como también células de biopsia o clonadas de los intestinos, riñón, corazón, cerebro, médula espinal, músculo, esqueleto, hígado, estómago, piel, pulmón, sistema reproductivo, sistema nervioso, sistema inmunológico, bazo, médula ósea, ganglios linfáticos, glándulas.
Injertos como portadores de moléculas bioactivas
Un tejido de reemplazo de la presente invención también puede incluir moléculas bioactivas formuladas con una o más especies activas de modo que el tejido de reemplazo se convierta en un portador de una o más especies activas. Un estuche o tejido de reemplazo de la invención puede incluir agentes activos incorporados en un polímero o solución de polímero añadida (por ejemplo, una armazón de polímero) o puede unirse directamente a la superficie o dentro del tejido de reemplazo mediante el uso de técnicas fácilmente evidentes para los expertos en la técnica. Por ejemplo, los agentes activos pueden añadirse por curado sobre y dentro del tejido de remplazo libre de células, unidos iónicamente, covalentemente y/o mediante el uso de un agente de reticulación, por ejemplo, un agente de reticulación escindible.
El agente activo puede ser un fármaco u otro compuesto biológicamente activo; de esta manera, un tejido de remplazo de la presente invención puede ser un microportador para la administración de fármacos u otros compuestos biológicamente activos cuando se usan en el cuerpo. Ejemplos de compuestos biológicamente activos son proteínas, péptidos, polisacáridos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, moléculas orgánicas o inorgánicas naturales y sintéticas, y aquellas moléculas biológicas usadas con fines terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico. Los fármacos pueden incluir antibióticos, antivirales, agentes quimioterapéuticos, agentes inmunodepresores, factores de crecimiento, agentes antiangiogénicos, hormonas, agentes antiinflamatorios, fármacos que tienen un efecto sobre el flujo vascular, metabolismo celular o que son eficaces contra una o más enfermedades y/o combinaciones de los mismos.
También pueden incluirse otros agentes activos con un tejido de reemplazo o estuche de la presente invención, por ejemplo, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE) tales como derivados del ácido propiónico; derivados del ácido acético; derivados del ácido fenámico; derivados del ácido bifenilcarboxílico; y oxicams. Los analgésicos para su uso con un estuche o tejido de reemplazo de la presente invención incluyen acetaminofén y fenacetina.
A continuación se muestran ejemplos que ilustran los procedimientos para poner en práctica la invención. Estos ejemplos no deben interpretarse como limitantes. Todos los porcentajes son en peso y todas las proporciones de mezcla de solventes son en volumen a menos que se indique de otro modo.
Ejemplo 1 - Proceso de descelularización
Todos los procedimientos deben emplear técnicas asépticas y soluciones estériles. A continuación se muestran las etapas de una modalidad del proceso de descelularización de la presente invención.
1. Resecar el nervio de un donante y almacenarlo congelado.
2. Descongelar el nervio a temperatura ambiente. Enjuagar con agua helada. Sumergir en un gran volumen de agua helada. Agitar suavemente a 4 °C durante 6 h (o más).
3. Sumergir los nervios en un gran volumen de Sulfobetaína-10 a 125 mM (o más concentrada) en tampón de extracción (tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2 NaCl 150 mM) o cualquier solución salina fisiológica. Agitar suavemente a 25 °C (cerca de la temperatura ambiente) durante 15 h (o más).
4. Reemplazar con un gran volumen de Sulfobetaína-10 fresca a 125 mM (o más concentrada) en tampón de extracción o cualquier solución salina fisiológica. Agitar durante 6 h (o más) a 25 °C.
5. Lavar con una gran cantidad de tampón de extracción o cualquier solución salina fisiológica. Agitar a 25 °C durante 60 min (o más).
6. Lavar con un gran volumen de tampón de enjuague (tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 7,2) o cualquier tampón con tonicidad muy baja (sin salinidad). Agitar durante 60 min (o más) a 25 °C.
7. Sumergir los nervios en un gran volumen de Sulfobetaína-16 a 0,6 mM (o más concentrado) en tampón de extracción o cualquier solución salina fisiológica. Agitar durante 15 h (o más) a 25 °C.
8. Reemplazar con un gran volumen de Sulfobetaína-16 fresca a 0,6 mM (o más concentrada) en tampón de extracción o cualquier solución salina fisiológica. Agitar durante 6 h (o más) a 25 °C.
9. Lavar con una gran cantidad de tampón de extracción o cualquier solución salina fisiológica. Agitar suavemente los nervios durante 30 minutos (o más) y luego reemplazarlos con tampón de extracción fresco o con cualquier solución salina fisiológica. Lavar durante 15 h con agitación a 4 °C.
10. Lavar con una gran cantidad de tampón de enjuague. Agitar suavemente para resuspender los nervios y luego reemplazarlo con tampón de enjuague fresco o cualquier tampón con tonicidad muy baja (sin salinidad). Lavar durante 3 h con agitación a 4 °C.
11. Colocar en solución salina tamponada fisiológica y almacenar congelado.
Ejemplo 2 - Comparación del método de descelularización con nervios de conejo
Los injertos preparados de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente se denominan injertos DC3. Los injertos DC3 se compararon con nervio de conejo normal (sin procesar) y con injertos de nervio de conejo procesados por el protocolo descrito por Hudson y otros, (Tissue Engineering 10:1346-1358, 2004) y la patente de Estados Unidos núm. 7,402,319; denominados en la presente descripción como injertos DC2.
Los injertos DC2 y DC3 de los dos métodos de procesamiento se evaluaron mediante varias técnicas histológicas. Los resultados de cada evaluación se puntuaron semicuantitativamente (0 = no extraído, 1 = parcialmente extraído, 2 = mayoritariamente extraído, 3 = totalmente extraído y R = redistribuido). Los resultados de los dos esquemas de procesamiento de detergente (DC2, DC3) y el nervio control normal se muestran en las Figuras 1-6.
La Figura 1 ilustra las tinciones con hematoxilina y eosina (H&E) de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C). El panel A tuvo una puntuación de cero. Los paneles B (DC2) y C (DC3) tenían cada uno una puntuación de 2. La tinción H&E es un método de tinción para histología general. Estos paneles y puntuaciones demuestran que los métodos de procesamiento para DC2 y DC3 lograron una extracción celular extensa y la conservación de la integridad general de la vaina nerviosa.
La Figura 2 ilustra la tinción de Hoescht de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C). El panel A tuvo una puntuación de cero. Los paneles B (DC2) y C (DC3) tenían cada uno una puntuación de 1R. La tinción de Hoescht es un método de tinción para el ADN. Estos paneles y puntuaciones muestran que los métodos de procesamiento para DC2 y DC3 no eliminaron el ADN, sino que dispersaron y redistribuyeron el ADN.
La Figura 3 ilustra la inmunotinción de S-100 del tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C). El panel A tuvo una puntuación de cero. Los paneles B (DC2) y C (DC3) tenían cada uno una puntuación de 3. El inmunomarcaje de S-100 (una proteína citoplasmática en las células de Schwann) mostró que los métodos de procesamiento DC2 y DC3 son igualmente eficaces para extraer el citoplasma de las células de Schwann.
La Figura 4 ilustra la tinción con negro de Sudán de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C). El panel A tuvo una puntuación de cero. Los paneles B (DC2) y C (DC3) tenían cada uno una puntuación de 3. La tinción con negro de Sudán es un método de tinción para la mielina. Estos paneles y puntuaciones demuestran que los métodos de procesamiento para DC2 y DC3 fueron igualmente y altamente eficaces para extraer mielina.
La Figura 5 ilustra la inmunotinción de neurofilamentos NAP-4 de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C). El panel A tuvo una puntuación de cero. Los paneles B (DC2) y C (DC3) tenían cada uno una puntuación de 1R. El inmunomarcaje de neurofilamentos (un marcador del citoesqueleto neuronal/axonal) mostró que los métodos de procesamiento para DC2 y DC3 solo extraían y redistribuían parcialmente el citoesqueleto axonal.
La Figura 6 ilustra la inmunotinción de laminina de tejido nervioso de conejo (control; panel A), tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso de conejo procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C). El panel A tuvo una puntuación de cero. Los paneles B (DC2) y C (DC3) tenían cada uno una puntuación de 1R. La laminina es un componente principal de las vainas nerviosas, que incluyen la importante lámina basal que rodea a los axones. El inmunomarcaje de laminina mostró que los métodos de procesamiento de DC3 no extraían sustancialmente la estructura de la lámina basal.
Ejemplo 3 - Inmunocompatibilidad de los injertos de nervios
Se han realizado extensas pruebas in vivo en conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW) con injertos de nervios procesados por el método de Hudson y otros y el de la presente invención. Los resultados muestran que ambos tipos de injertos de nervios descelularizados eran inmunológicamente compatibles y no se observó rechazo del injerto.
Los conejos NZW son una cepa exógena. Se conoce en la bibliografía que el aloinjerto de tejidos vivos o celulares de un donante de conejo NZW a un receptor NZW da como resultado un inmunorrechazo del injerto.
Por tanto, la falta de rechazo de injertos observada en los aloinjertos de NZW, demuestra que los aloinjertos de nervios preparados por la presente invención son inmunocompatibles.
Ejemplo 4 - Comparación del método de descelularización con nervios humanos
Se preparó tejido nervioso humano de acuerdo con la presente invención como se describió anteriormente y se denominó injertos DC3. Los injertos DC3 se compararon con injertos de nervios humanos normales (sin procesar) y humanos procesados por el protocolo descrito por Hudson y otros, (Tissue Engineering 10:1346-1358, 2004) y la patente de Estados Unidos núm. 7,402,319; denominados en la presente descripción injertos DC2. Los injertos DC2 y DC3 de los dos métodos de procesamiento se evaluaron mediante varias técnicas histológicas.
La Figura 7 ilustra una tinción con hematoxilina y eosina de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C).
La Figura 8 ilustra una tinción de Hoechst de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C).
La Figura 9 ilustra una inmunotinción de S-100 de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C).
La Figura 10 ilustra una tinción con negro de Sudán de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C).
La Figura 11 ilustra una inmunotinción de neurofilamentos NAP-4 de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C).
La Figura 12 ilustra una inmunotinción de laminina de tejido nervioso humano (control; panel A), tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el proceso enseñado por Hudson y otros. (DC2; panel B) y tejido nervioso humano procesado de acuerdo con el método enseñado por la presente invención (DC3; panel C).
Ejemplo 5 - Repoblación de neuronas de injertos de nervios de ratas
Los nervios se crioseccionaron en el eje longitudinal y se montaron en cubreobjetos. Se sembraron neuronas disociadas en las secciones de tejido y se cultivaron durante 24 h. Luego, se fijaron los criocultivos y se inmunotiñeron las neuronas de prueba.
La Figura 13A ilustra un ensayo de criocultivo de injertos de nervio de rata descelularizados por (A) tampón solo y (B) descelularización con detergente descrito por Hudson y otros (sulfobetaína-10, sulfobetaína-16 y Triton X-200™). Se observó un crecimiento axonal extenso en la condición de tampón solo, mientras que la actividad promotora del crecimiento de los injertos de nervios se eliminó virtualmente mediante la descelularización rigurosa con detergente. Los ensayos de criocultivo se realizaron en nervios descelularizados por el método de Hudson y otros con y sin Triton X-200™ (Figura 13B). Los nervios de control (tratados solo con lavados de tampón) tenían una alta actividad promotora de neuritas. La descelularización de los nervios con sulfobetaína-10 y sulfobetaína-16 (sin Triton X-200™) tuvo una actividad promotora de neuritas igualmente alta. En contraste, la descelularización con la adición de Triton X-200™ redujo significativamente la actividad promotora de neuritas. Estos resultados muestran que Triton X-200™ tiene un efecto deletéreo persistente sobre las propiedades biológicas de los injertos de nervios descelularizados. Ejemplo 6:- Efectos de los detergentes sobre la actividad promotora de neuritas de la laminina
Se sabe que la matriz extracelular del nervio promueve el crecimiento de axones. En particular, los tubos de la lámina basal que recubren los axones proporcionan un potente estímulo para el crecimiento axonal en la regeneración nerviosa. El ensayo de criocultivo usado en los experimentos descritos anteriormente se basa en la estructura y la actividad promotora del crecimiento de la lámina basal. Está bien documentado que la laminina es el principal componente promotor de neuritas de la lámina basal del nervio. Esto se demuestra fácilmente en el ensayo de criocultivo en donde el crecimiento de neuritas se inhibe eficazmente mediante el pretratamiento de secciones de tejido nervioso con anticuerpos antilaminina que bloquean la función. Por tanto, se realizaron pruebas para examinar los efectos de detergentes individuales sobre la laminina purificada. La actividad de la laminina no se modificó con SB-10. La exposición a SB-16 redujo la actividad de la laminina aproximadamente en un 50 %. TrX200 (un detergente aniónico) eliminó esencialmente la actividad promotora de neuritas de la laminina (Figura 14).
La descripción en la presente descripción de cualquier aspecto o modalidad de la invención mediante el uso de términos como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos está destinada a proporcionar apoyo para un aspecto o modalidad similar de la invención que "consiste en", "consiste esencialmente en" o "comprende sustancialmente" ese elemento o elementos en particular, a menos que se indique de otro modo o que el contexto lo contradiga claramente (por ejemplo, una composición descrita en la presente descripción que comprende un elemento en particular debe entenderse como que también describe una composición que consiste en ese elemento, a menos que se indique de otro modo o que el contexto lo contradiga claramente).
El término "que consiste esencialmente en", como se usa en la presente descripción, limita el alcance de los ingredientes y las etapas a los materiales o etapas especificados y aquellos que no afectan materialmente a las características básicas y novedosas de la presente invención, es decir, composiciones y métodos de descelularización de injertos de tejido. Por ejemplo, al usar "que consiste esencialmente en", las composiciones no contienen ningún ingrediente no especificado que incluye, pero no se limitan a, tensioactivos que tienen un efecto beneficioso o adverso directo sobre la descelularización del tejido.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un método para descelularizar un injerto de tejido en donde dicho método comprende poner en contacto un injerto de tejido con una composición de extracción que comprende un detergente anfótero a una concentración, y durante un tiempo de contacto, que es suficiente para romper las células en el tejido, y en donde el método se realiza en ausencia de un detergente aniónico.
2. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde después de la descelularización, las estructuras de la matriz extracelular permanecen intactas y la conservación es mediblemente igual o mejor que cuando se descelulariza mediante métodos que incluyen un detergente aniónico.
3. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el Triton X-200™ no se aplica al tejido.
4. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el injerto de tejido se pone en contacto con sulfobetaína-10 (SB-10) y/o sulfobetaína-16 (SB-16), en donde preferentemente el injerto de tejido se pone en contacto con una composición de extracción que tiene un componente detergente que consiste en SB-10 y el injerto de tejido también se pone en contacto con una segunda composición de extracción que tiene un componente detergente que consiste en SB-16.
5. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la concentración del(de los) detergente(s) anfótero(s) es al menos la concentración micelar crítica.
6. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición de extracción tiene salinidad fisiológica o mayor.
7. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además al menos una etapa de enjuague que comprende poner en contacto el tejido con una solución que tiene menos de la salinidad fisiológica, en donde la solución de enjuague preferentemente no tiene salinidad.
8. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además eliminar físicamente del tejido los restos no estructurales.
9. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además congelar el injerto de tejido antes o después del proceso de descelularización.
10. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, usado para preparar un injerto de tejido seleccionado de injertos de nervios, huesos, intestinales, vasculares, de ligamentos, tendones y corazón, en particular un injerto de nervio, en donde preferentemente el tejido usado para preparar el injerto de nervio se selecciona de tejido nervioso, muscular, placentario y vascular.
11. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además introducir en el injerto de tejido una o más células o moléculas bioactivas.
12. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la actividad promotora de neuritas del injerto de tejido se conserva después de la descelularización en comparación con los nervios tratados solo con lavado con tampón.
13. El método, de acuerdo con la reivindicación 1, en donde después de la descelularización se conserva la actividad promotora de neuritas del injerto de tejido y la conservación es mediblemente igual o mejor que cuando se descelulariza mediante métodos que incluyen un detergente aniónico.
14. Un injerto de tejido preparado mediante el método de la reivindicación 1.
15. Un estuche que comprende un injerto de tejido de la reivindicación 14.
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