JP6505088B2 - インプラント及びその製造方法 - Google Patents
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Description
この発明は、インプラントとその製造方法に関する。本発明は、特に、気管、腱や骨などの軟骨性組織又は石灰化した組織に由来するインプラントの製造に有用である。
様々な異なる疾患や症状の治療において、生物学的に誘導されたスカフォールドから成るインプラントは、組織/器官の修復及び再生のための重要な選択肢になっている。継続する主要な障害は、後にスカフォールドになる組織から抗原提示細胞物質を除去する必要があることである。気管組織のような軟骨組織を含む、比較的高密度な間質組織、結合組織又は支持組織を脱細胞化する場合に、その組織から実質的に全ての抗原提示細胞を除去することは、不可能ではないにしろ、非常に困難である。
長期の気管病変を含む、間質組織、結合組織又は支持組織の損傷は、いまだに外科医への挑戦である。例えば、子供における、4.5〜6cm以上又は気管全長の30％以上の先天性欠損、外傷又は腫瘍に起因する損傷を、一時閉鎖（一時縫合）によって治療することはできない。そのため、これらの患者が外科的に治癒可能とはほとんど考えられず、気管組織由来のインプラントの使用が望ましい代替案である。気管の再構築は、外科的提示案を拡張するものであり、生活の質を改善する。
長期の気管病変を含む、間質組織、結合組織又は支持組織の損傷は、いまだに外科医への挑戦である。例えば、子供における、4.5〜6cm以上又は気管全長の30％以上の先天性欠損、外傷又は腫瘍に起因する損傷を、一時閉鎖（一時縫合）によって治療することはできない。そのため、これらの患者が外科的に治癒可能とはほとんど考えられず、気管組織由来のインプラントの使用が望ましい代替案である。気管の再構築は、外科的提示案を拡張するものであり、生活の質を改善する。
再生医療の分野における最近の進歩によれば、気管スカフォールドの組織工学的交換が特に顕著に有望であると考えられている。理想的な交換は、安定性及び非免疫原性特性を提供するように、可能な限り自然な構造に近くあるべきである。これらの基準を満たすために、多くの研究資源が、出発点として生体物質を使用することに向けられている。自己又は異種の材料のいずれかを用いて再生目的のスカフォールドを用意するためには、細胞の付着を支持し、換気のために十分な剛性を提供することができる程度に、細胞外マトリックスを維持しながら、すべての抗原を完全に除去することを必要とする。
既知の脱細胞化技術では、抗原提示細胞と細胞粒子を洗い流すために、化学的試薬と生物学的試薬という異なる試薬を使用する。気管組織を脱細胞化するする一つの確立されたプロトコルは、種々の洗剤、酵素及び他の試薬を用いて灌流することにより気管組織から細胞を除去するという洗剤−酵素−方法に基づいている。人道的理由に基づいて少数のケースで適切なスカフォールドの移植が成功しているが、それはまだ標準的な臨床実践には達していない。その一つの理由は、スカフォールドの準備に約3週間という長期を要し、患者にこの時間遅延に起因するリスクが伴うことである。
既知の脱細胞化技術では、抗原提示細胞と細胞粒子を洗い流すために、化学的試薬と生物学的試薬という異なる試薬を使用する。気管組織を脱細胞化するする一つの確立されたプロトコルは、種々の洗剤、酵素及び他の試薬を用いて灌流することにより気管組織から細胞を除去するという洗剤−酵素−方法に基づいている。人道的理由に基づいて少数のケースで適切なスカフォールドの移植が成功しているが、それはまだ標準的な臨床実践には達していない。その一つの理由は、スカフォールドの準備に約3週間という長期を要し、患者にこの時間遅延に起因するリスクが伴うことである。
臨床使用のための標準化された「既製」スカフォールドは、正しい解剖学的、機能的及び生体力学的特性だけでなく、適切な時間枠内で製造することが実現可能であることを必要とする。組織の脱細胞化を改善するために、酵素と洗剤の様々な組み合わせを含む、様々な方法が利用可能である。これらの試薬の大部分は細胞外マトリックスを改変することが知られているので、公知の技術には、依然として、細胞外マトリックスの変化を軽減又は防止する別のアプローチが望まれている。
軟骨などの間質組織、結合組織又は支持組織は顕著に高密度の組織であるので、特に気管インプラントを調製する場合には、比較的短時間で細胞外マトリックスの組織微細構造に影響を与えることなく、この組織に深く脱細胞化薬剤を送達する方法が必要とされている。
軟骨などの間質組織、結合組織又は支持組織は顕著に高密度の組織であるので、特に気管インプラントを調製する場合には、比較的短時間で細胞外マトリックスの組織微細構造に影響を与えることなく、この組織に深く脱細胞化薬剤を送達する方法が必要とされている。
従って、本発明は、特に気管のような軟骨組織を含む間質組織、結合組織又は支持組織に基づく、組織／臓器の修復のためのインプラントを製造するための改良された方法を提供する。その方法においては、そのインプラントは、比較的短時間で用意でき、細胞外マトリックスを実質的に完全に保ち、抗原提示細胞物質が実質的に全て除去されていることが可能である。
本発明の第一の態様によれば、組織からインプラントを製造する方法であって、実質的に灌流の全期間にわたって負圧下で、この組織を少なくとも一種の脱細胞化媒体で灌流する工程を含む方法が提供される。
本発明の第二の態様によれば、間質組織、結合組織又は支持組織からインプラントを製造する方法であって、実質的に灌流の全期間にわたって負圧下で、この組織を少なくとも一種の脱細胞化媒体で灌流する工程を含む方法が提供される。
適当な間質組織、結合組織又は支持組織には、気管、喉頭及び軟骨それ自体などの軟骨組織、線維軟骨組織及び石灰化軟骨組織、骨、腱、靭帯、骨、腱、骨、靱帯、神経組織、動脈や静脈のような大血管、並びに滑膜が含まれる。
本発明の方法に使用することができる非間質組織、結合組織又は支持組織には、脳、食道、腸（大腸と小腸）、膵臓、脾臓、肝臓、肺、腎臓、リンパ管、小血管が含まれる。
「負圧」には、周囲から減圧した圧力、及び部分的な又は実質的に完全な真空が含まれる。
本発明の第二の態様によれば、間質組織、結合組織又は支持組織からインプラントを製造する方法であって、実質的に灌流の全期間にわたって負圧下で、この組織を少なくとも一種の脱細胞化媒体で灌流する工程を含む方法が提供される。
適当な間質組織、結合組織又は支持組織には、気管、喉頭及び軟骨それ自体などの軟骨組織、線維軟骨組織及び石灰化軟骨組織、骨、腱、靭帯、骨、腱、骨、靱帯、神経組織、動脈や静脈のような大血管、並びに滑膜が含まれる。
本発明の方法に使用することができる非間質組織、結合組織又は支持組織には、脳、食道、腸（大腸と小腸）、膵臓、脾臓、肝臓、肺、腎臓、リンパ管、小血管が含まれる。
「負圧」には、周囲から減圧した圧力、及び部分的な又は実質的に完全な真空が含まれる。
その結果得られたスカフォールドは、組織の修復及び再生のための優れたインプラントを提供する。
この脱細胞化プロセスは、脱細胞化媒体による灌流工程（複数可）に加えて、一以上の洗浄工程を含んでもよい。その洗浄工程又は各洗浄工程もまた、洗浄工程のほぼ全期間にわたって負圧で行われることが好ましい。
いくつかの実施形態では、このインプラントの製造方法の実質的全体は、負圧で行われる。
この脱細胞化媒体は、組織から細胞及び細胞成分を除去する一方で、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質へのダメージを最小限に抑えて、細胞外マトリックス（ECM）の構造と機能が可能な限り保存されたスカフォールドが得られるように選択される。
適切な脱細胞化媒体には、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、デオキシコール酸ナトリウム（SOC）、例えば、トリトンX-100（RTM）のような親水性ポリオキシエチレンオキシド部分と疎水性炭化水素部分を含む洗剤、などの洗剤、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や、DNase IのようなデオキシリボヌクレアーゼやRNaseのようなリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼなどの酵素、及びこれらの組み合わせが含まれる。トリスブチル-n-ホスフェート（TnBP）もまた、この脱細胞化媒体に含まれる。TnBPは、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊する溶媒である。
この脱細胞化プロセスは、脱細胞化媒体による灌流工程（複数可）に加えて、一以上の洗浄工程を含んでもよい。その洗浄工程又は各洗浄工程もまた、洗浄工程のほぼ全期間にわたって負圧で行われることが好ましい。
いくつかの実施形態では、このインプラントの製造方法の実質的全体は、負圧で行われる。
この脱細胞化媒体は、組織から細胞及び細胞成分を除去する一方で、細胞外マトリックス（ECM）タンパク質へのダメージを最小限に抑えて、細胞外マトリックス（ECM）の構造と機能が可能な限り保存されたスカフォールドが得られるように選択される。
適切な脱細胞化媒体には、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、デオキシコール酸ナトリウム（SOC）、例えば、トリトンX-100（RTM）のような親水性ポリオキシエチレンオキシド部分と疎水性炭化水素部分を含む洗剤、などの洗剤、トリプシンのようなタンパク質分解酵素や、DNase IのようなデオキシリボヌクレアーゼやRNaseのようなリボヌクレアーゼなどのヌクレアーゼなどの酵素、及びこれらの組み合わせが含まれる。トリスブチル-n-ホスフェート（TnBP）もまた、この脱細胞化媒体に含まれる。TnBPは、タンパク質−タンパク質相互作用を破壊する溶媒である。
この方法は、好ましくは、複数の脱細胞化媒体で組織を灌流する工程を含む。適切には、この方法は、少なくとも1つの洗剤と少なくとも一つのヌクレアーゼを用いて組織を灌流する工程を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、洗剤を用いて組織を灌流する工程と、これとは別個のヌクレアーゼを用いて組織を灌流する工程を含み、この洗剤を用いた灌流工程は、ヌクレアーゼを用いた灌流工程の前に行ってもよい。またいくつかの実施形態では、各洗剤を用いた灌流工程が負圧下で行われ、一方他のいくつかの実施形態では、洗剤を用いた灌流工程とヌクレアーゼを用いた灌流工程の両方が負圧下で行われる。
各灌流工程は、15℃〜45℃又は30℃〜40℃の温度で行ってもよい。いくつかの実施形態では、この灌流工程は約37℃で行われてもよく、これは灌流工程がヌクレアーゼ材料を含む場合に特に有利である。灌流工程が洗剤を用いた灌流工程である場合には、周囲温度又は室温のような15℃〜40℃の温度で行ってもよい。
各灌流工程は、15℃〜45℃又は30℃〜40℃の温度で行ってもよい。いくつかの実施形態では、この灌流工程は約37℃で行われてもよく、これは灌流工程がヌクレアーゼ材料を含む場合に特に有利である。灌流工程が洗剤を用いた灌流工程である場合には、周囲温度又は室温のような15℃〜40℃の温度で行ってもよい。
いくつかの実施形態では、この方法は、各灌流工程の間に、洗浄工程を含んでもよい。この洗浄工程は、如何なる適切な１又は複数の洗浄媒体を使用してよく、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、ハンクス平衡塩溶液、又は滅菌水などを使用してもよい。洗浄工程（単数又は複数）は、1℃〜8℃又は2℃〜6℃の温度で行ってもよい。あるいは、各洗浄工程は、例えば、約37℃のような15℃〜40℃の温度で行ってもよいし、周囲温度又は室温付近で行ってもよい。灌流工程の間で行われる各洗浄工程は負圧下で行ってもよく、いくつかの実施形態では、洗浄工程の全てが負圧下で行われる。洗浄工程は、洗浄媒体中で組織をインキュベートする工程を含んでもよい。
灌流工程及び／又は洗浄工程は、抗生物質及び／又は抗真菌薬の存在下で行ってもよい。
灌流工程及び／又は洗浄工程は、抗生物質及び／又は抗真菌薬の存在下で行ってもよい。
この方法は、単一の洗剤又は洗剤の混合物を用いた少なくとも1回の灌流工程に続いて、ヌクレアーゼを用いた少なくとも2回の灌流工程から成り、各灌流工程の間に洗浄媒体で洗浄する工程を含む、一連の工程で組織を灌流することから成ってもよい。いくつかの実施形態では、この一連の工程は、イオン性洗剤と非イオン性洗剤の混合物を用いた灌流工程に続いて、デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼの混合物を用いた2回の灌流工程から成り、各灌流工程の間に生理食塩水で洗浄する工程を含んでもよい。好ましい実施形態では、この洗剤の混合物は、デオキシコール酸ナトリウム及びトリトンX-100（RTM）から成り、このデオキシリボヌクレアーゼはDNase Iであり、このリボヌクレアーゼはRNaseである。
好適には、各灌流工程は、1時間〜96時間、より好ましくは18時間〜84時間、最も好ましくは24時間〜72時間行われる。灌流工程が洗剤を用いた灌流を含む場合、その工程は、少なくとも12時間、18時間又は24時間行われてもよい。灌流工程がヌクレアーゼを用いた灌流を含む場合、その工程は、少なくとも1時間、18時間又は24時間行われてもよい。
好適には、各洗浄工程は、15分間〜96時間、例えば12時間〜96時間、より好ましくは18時間〜72時間又は24時間〜72時間行ってもよい。各灌流工程の間に、又は各灌流工程の後に、複数回の洗浄工程があってもよく、この複数回の洗浄工程は、それぞれ独立して、15分間〜96時間行ってもよい。
好適には、各灌流工程は、1時間〜96時間、より好ましくは18時間〜84時間、最も好ましくは24時間〜72時間行われる。灌流工程が洗剤を用いた灌流を含む場合、その工程は、少なくとも12時間、18時間又は24時間行われてもよい。灌流工程がヌクレアーゼを用いた灌流を含む場合、その工程は、少なくとも1時間、18時間又は24時間行われてもよい。
好適には、各洗浄工程は、15分間〜96時間、例えば12時間〜96時間、より好ましくは18時間〜72時間又は24時間〜72時間行ってもよい。各灌流工程の間に、又は各灌流工程の後に、複数回の洗浄工程があってもよく、この複数回の洗浄工程は、それぞれ独立して、15分間〜96時間行ってもよい。
この方法は、生理食塩水のような適切な媒体中で脱細胞化組織を保存する工程を含んでもよい。この生理食塩水は、少なくとも一つの抗生物質及び／又は抗真菌物質を含んでもよい。またこの生理食塩水は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）溶液又はハンクス平衡塩溶液（必要に応じて酸性Ca及び／又はMgを含む）から成ってもよく、また抗生物質及び抗真菌物質の両方を含んでもよい。保存は、1℃〜6℃、例えば約4℃、で行われることが好ましい。
灌流工程（１回又は複数回）は、負圧下で行われる。間質組織、結合組織又は支持組織を含む方法では、圧力は、周囲温度で、好ましくは10kPa、5kPa、2kPa、1kPa又は0.5kPa以下である。いくつかの実施形態では、この圧力は、1kPa以下、0.2kPa以下、又は0.1kPa以下である。このような減圧下で脱細胞化剤により組織を灌流することは、組織が灌流液と脱細胞化媒体（１又は複数）を取り込む速度を上げるだけでなく、この脱細胞化媒体（１又は複数）が、負圧下で行われない場合よりも、組織により深く浸透することを可能にし、その結果、組織の全体がこの媒体で灌流され、比較的短時間で実質的に完全な脱細胞化が可能になる。更に、洗浄工程が負圧下で行われると、この脱細胞化効果は維持され、強化される。
間質組織、結合組織又は支持組織以外の組織（例えば、食道、腸、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、肺及び小血管）を含む方法では、この圧力は80kPa、70kPa、60kPa、50kPa、40kPa、30kPa、20kPa、10kPa、5kPa、2kPa又は1kPa以下である。一般に、非間質組織、非結合組織又は非支持組織のための圧力は、間質組織、結合組織又は支持組織のための圧力より高い。
間質組織、結合組織又は支持組織以外の組織（例えば、食道、腸、肝臓、膵臓、腎臓、脾臓、肺及び小血管）を含む方法では、この圧力は80kPa、70kPa、60kPa、50kPa、40kPa、30kPa、20kPa、10kPa、5kPa、2kPa又は1kPa以下である。一般に、非間質組織、非結合組織又は非支持組織のための圧力は、間質組織、結合組織又は支持組織のための圧力より高い。
いくつかの実施形態では、この方法は以下の工程から成る：
ａ）組織をヌクレアーゼ媒体で1時間〜36時間灌流する工程
ｂ）この組織を12時間〜72時間洗浄する工程
ｃ）この組織を洗剤媒体で12時間〜36時間灌流する工程、及び
ｄ）この組織をヌクレアーゼ媒体で12時間〜36時間灌流する工程
この組織は、上述の間質組織、結合組織又は支持組織であってもよいし、非間質組織、結合組織又は支持組織であってもよい。
工程ａ）及びｄ）のヌクレアーゼ媒体は、同じヌクレアーゼ媒体であることが好ましく、DNase I及びRNaseから成ってもよい。
工程ｃ）の洗剤媒体は、非イオン性洗剤及びイオン性洗剤の混合物から成ってもよく、例えば、デオキシコール酸ナトリウム及びトリトンX-100（RTM）の混合物であってもよい。
ａ）組織をヌクレアーゼ媒体で1時間〜36時間灌流する工程
ｂ）この組織を12時間〜72時間洗浄する工程
ｃ）この組織を洗剤媒体で12時間〜36時間灌流する工程、及び
ｄ）この組織をヌクレアーゼ媒体で12時間〜36時間灌流する工程
この組織は、上述の間質組織、結合組織又は支持組織であってもよいし、非間質組織、結合組織又は支持組織であってもよい。
工程ａ）及びｄ）のヌクレアーゼ媒体は、同じヌクレアーゼ媒体であることが好ましく、DNase I及びRNaseから成ってもよい。
工程ｃ）の洗剤媒体は、非イオン性洗剤及びイオン性洗剤の混合物から成ってもよく、例えば、デオキシコール酸ナトリウム及びトリトンX-100（RTM）の混合物であってもよい。
灌流工程ａ）、ｃ）及びｄ）は、30℃〜40℃、例えば約37℃、で行ってもよい。洗浄工程は、2℃〜6℃、例えば4℃、又は15℃〜40℃、例えば約37℃、又は周囲温度又は室温付近で行ってもよい。
工程ｄ）の後に、1℃〜6℃、例えば約4℃で、生理食塩水中で脱細胞化組織を保存する工程ｅ）が存在してもよい。この生理食塩水は、抗生物質及び／又は抗真菌物質を含んでもよい。
工程ａ）、ｃ）及びｄ）は全て負圧下で行われてもよく、周囲温度で、10kPa、5kPa、2kPa、1kPa又は0.5kPa以下でもよく、間質組織、結合組織又は支持組織については、好ましくは0.2kPa以下、より好ましくは0.1kPa以下であり、任意の他の適切な組織については、80kPa、50kPa、30kPa又は10kPa以下である。
工程ａ）〜ｄ）は、それぞれ、負圧下で行われることが好ましく、周囲温度で、10kPa、5kPa、2kPa、1kPa又は0.5kPa以下でもよく、間質組織、結合組織又は支持組織については、好ましくは0.2kPa以下、より好ましくは0.1kPa以下であり、任意の他の適切な組織については、80kPa、50kPa、30kPa又は10kPa以下である。
各工程ａ）〜ｄ）の間、及び/又は工程ｄ）の後で、15分間〜72時間の他の洗浄工程があってもよい。
工程ｄ）の後に、1℃〜6℃、例えば約4℃で、生理食塩水中で脱細胞化組織を保存する工程ｅ）が存在してもよい。この生理食塩水は、抗生物質及び／又は抗真菌物質を含んでもよい。
工程ａ）、ｃ）及びｄ）は全て負圧下で行われてもよく、周囲温度で、10kPa、5kPa、2kPa、1kPa又は0.5kPa以下でもよく、間質組織、結合組織又は支持組織については、好ましくは0.2kPa以下、より好ましくは0.1kPa以下であり、任意の他の適切な組織については、80kPa、50kPa、30kPa又は10kPa以下である。
工程ａ）〜ｄ）は、それぞれ、負圧下で行われることが好ましく、周囲温度で、10kPa、5kPa、2kPa、1kPa又は0.5kPa以下でもよく、間質組織、結合組織又は支持組織については、好ましくは0.2kPa以下、より好ましくは0.1kPa以下であり、任意の他の適切な組織については、80kPa、50kPa、30kPa又は10kPa以下である。
各工程ａ）〜ｄ）の間、及び/又は工程ｄ）の後で、15分間〜72時間の他の洗浄工程があってもよい。
任意に、本発明の第一又は第二の態様の方法は、処理された組織を架橋する工程を含んでもよい。任意の適切な架橋剤を使用してもよく、例えば、ヘキサメチレンジイソシアネート（HMDI）、ゲニピン、ケルセチン又はヘパリンの一つ又はそれ以上を用いてもよい。この方法が架橋工程を含む場合、この架橋工程は、典型的には、組織の脱細胞化の後に行われる。
インプラントが、気管から製造される場合には、気管軟化から保護するのに役立つように、架橋は特に有効である。
インプラントが、気管から製造される場合には、気管軟化から保護するのに役立つように、架橋は特に有効である。
この方法を、細胞が実質的に除去された実質的な脱細胞化スカフォールドであって、有害な組織反応又は免疫反応がインビボで観察されないように、細胞物質及び関連構成要素が除去されたスカフォールドを提供するために使用することができる、この反応は、皮下注入により観察することができる。この脱細胞化スカフォールドには、倍率が40倍の顕微鏡によって観察可能な細胞が実質的に無い。
軟骨組織を使用する場合、本発明の方法を使用すると、その小腔中の軟骨細胞が実質的に全て除去されるように軟骨組織が脱細胞化される。更に、この軟骨材料が気管の場合、管腔上皮（粘膜）、粘膜下腺、気管筋及び外側外膜内の核は実質的に全て除去される。
軟骨組織を使用する場合、本発明の方法を使用すると、その小腔中の軟骨細胞が実質的に全て除去されるように軟骨組織が脱細胞化される。更に、この軟骨材料が気管の場合、管腔上皮（粘膜）、粘膜下腺、気管筋及び外側外膜内の核は実質的に全て除去される。
組織及び全臓器の脱細胞化プロセスの最近のレビュー(Crapo et al. (2011) Biomaterials 32: 3233-3243)では、以下の最小限の基準が、有害な生体内反応が無いことに加えて、細胞外マトリックス（ECM）脱細胞化の目的を満たすために十分であると提案されている：ECM乾燥重量1mgあたりdsDNAが<50ng；断片長が<200bp；DAPI又はH&Eで染色された組織切片に可視可能な核物質が無いこと。
これらの基準は、本発明の方法によって製造される脱細胞化組織により満たされる。
残りのスカフォールドは、細胞外マトリックス（ECM）、特にコラーゲン、を含む。この細胞外マトリックス（ECM）の構造は、好ましくは少なくとも部分的にスカフォールド中に保存され、より好ましくは実質的に保存されている。従って、このスカフォールドは、それが由来する天然の組織材料の原繊維構造と分子超微細構造を示すコラーゲン繊維を含んでもよい。これらの線維組織タンパク質の天然の三次元構造は好ましくは実質的に保持される。但し、スカフォールドの構造的完全性に影響を与えない限り、いくつかの緩み又はアンフォールディングは許容される。
これらの基準は、本発明の方法によって製造される脱細胞化組織により満たされる。
残りのスカフォールドは、細胞外マトリックス（ECM）、特にコラーゲン、を含む。この細胞外マトリックス（ECM）の構造は、好ましくは少なくとも部分的にスカフォールド中に保存され、より好ましくは実質的に保存されている。従って、このスカフォールドは、それが由来する天然の組織材料の原繊維構造と分子超微細構造を示すコラーゲン繊維を含んでもよい。これらの線維組織タンパク質の天然の三次元構造は好ましくは実質的に保持される。但し、スカフォールドの構造的完全性に影響を与えない限り、いくつかの緩み又はアンフォールディングは許容される。
脱細胞化組織又は器官内のこれらの繊維のポリマー構造が少なくとも部分的に無傷のままである場合に限り、スカフォールドの出所及び/又はその移植場所に特有の細胞成分が、細胞外マトリックス（ECM）の適切な建設的な再構築をもたらすことが知られている。従って、機能再生的再構築をもたらし、組織成長のために有効なスカフォールドを提供するために、細胞外マトリックスは任意の合成マトリックスよりも適している。
機能的な細胞外マトリックスタンパク質を維持することは、また、スカフォールドの生物学的活性、構造的完全性、耐久性及び物理的化学的性質を維持するために重要である。タンパク質とグリコサミノグリカンの分子構造から組織の巨視的な超微細構造に至る構造の階層を保持することは、固有の物理的機械的性質のために重要であり、また組織機能のために重要である。脱細胞化及び組織処理中に三次元構造を保持することは、また、組織の究極の細胞再生を改善し、細胞及び組織に特異的な機能の再生を改善する。
機能的な細胞外マトリックスタンパク質を維持することは、また、スカフォールドの生物学的活性、構造的完全性、耐久性及び物理的化学的性質を維持するために重要である。タンパク質とグリコサミノグリカンの分子構造から組織の巨視的な超微細構造に至る構造の階層を保持することは、固有の物理的機械的性質のために重要であり、また組織機能のために重要である。脱細胞化及び組織処理中に三次元構造を保持することは、また、組織の究極の細胞再生を改善し、細胞及び組織に特異的な機能の再生を改善する。
本発明は、好ましくは、細胞関連のグリコサミノグリカン（GAG）を実質的に除去しながら、細胞外マトリックス（ECM）由来の／に位置するグリコサミノグリカンを保持する。従って、脱細胞化プロセスは、一般に、細胞外マトリックス関連のグリコサミノグリカンが、好ましくは、その大部分が保存されたまま、総グリコサミノグリカンの減少をもたらす。細胞外マトリックスのグリコサミノグリカンと異なる細胞型との間に相互作用(cross talk)が存在し、細胞輸送及び細胞分化を助けるので、このことは重要である。この細胞外マトリックスのグリコサミノグリカンは、また、成長因子の保管場所又は溜め場所としても機能し、スカフォールド／インプラントの移植後に、組織の再生を指揮監督することを助ける。
灌流工程（単回又は複数回）は、真空ポンプ又は真空発生装置に接続されたポンプ装置を有する装置を用いて行ってもよい。この装置は、例えば、チューブ、ホース、パイプなどを含み、脱細胞化媒体を輸送するように構成されていてもよい灌流回路を含んでもよく、この灌流回路はまた１回又はそれ以上の洗浄工程を含む本発明の方法の実施形態において任意の洗浄媒体を輸送するために使用してもよい。
組織を収容するためにインキュベーションチャンバーを用いてもよく、またこのインキュベーションチャンバーを通して脱細胞化媒体をポンプ輸送してもよい。
組織を収容するためにインキュベーションチャンバーを用いてもよく、またこのインキュベーションチャンバーを通して脱細胞化媒体をポンプ輸送してもよい。
本発明の第三の態様によれば、本発明の第一又は第二の態様又は本明細書に記載された如何なる方法に従って製造されたインプラントが提供される。
本発明の第四の態様によれば、上述の装置を用いて、本発明の第一又は第二の態様に従ってインプラントを製造する方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、患者に本明細書に記載されたインプラントを外科的に移植することから成る治療方法が提供される。
本発明の第六の態様によれば、本明細書に記載のインプラントの手術における使用が提供される。
本発明の第七の態様によれば、外科手術に使用するための本明細書に記載のインプラントが提供される。
本発明の第八の態様によれば、手術用製品の製造における、本明細書に記載のインプラントの使用が提供される。
本発明の第四の態様によれば、上述の装置を用いて、本発明の第一又は第二の態様に従ってインプラントを製造する方法が提供される。
本発明の第五の態様によれば、患者に本明細書に記載されたインプラントを外科的に移植することから成る治療方法が提供される。
本発明の第六の態様によれば、本明細書に記載のインプラントの手術における使用が提供される。
本発明の第七の態様によれば、外科手術に使用するための本明細書に記載のインプラントが提供される。
本発明の第八の態様によれば、手術用製品の製造における、本明細書に記載のインプラントの使用が提供される。
本発明をより明確に理解できるようにするために、以下、その実施形態を、添付図面を参照しながら、単なる例として、説明する。
実施例１
本発明の脱細胞化気管スカフォールドと対照の作製
全ての動物手術とその取り扱いは、Northwick Park Institute for Medical Research（NPIMR）による倫理的承認後、1986年のUnited Kingdom Home Office Animals (Scientific Procedures) Actに基づいて行われた。気管は、標準的な実験室条件下で別の研究がされていた大ホワイト/ランドレース雑種ブタから採取された。麻酔薬の過剰投与による安楽死の後、気管を採取し、そのまま（対照）又は脱細胞化のいずれかに使用した。脱細胞化のために、全ての結合組織を除去し、気管をハンクス平衡塩溶液(Sigma-Aldrich UK)で濯いだ。その後、組織を−20℃で24時間以上保存した。ヒト気管は、NHS Blood and Transplant (NHSBT)から得た。気道疾患を有していなかったことが知られている2人のドナーから死体気管を回収した。初期輸送と保管は−80℃でハンクス緩衝溶液中で行われた。その後、脱細胞化のために両方の気管を−20℃に移した。
本発明の脱細胞化気管スカフォールドと対照の作製
全ての動物手術とその取り扱いは、Northwick Park Institute for Medical Research（NPIMR）による倫理的承認後、1986年のUnited Kingdom Home Office Animals (Scientific Procedures) Actに基づいて行われた。気管は、標準的な実験室条件下で別の研究がされていた大ホワイト/ランドレース雑種ブタから採取された。麻酔薬の過剰投与による安楽死の後、気管を採取し、そのまま（対照）又は脱細胞化のいずれかに使用した。脱細胞化のために、全ての結合組織を除去し、気管をハンクス平衡塩溶液(Sigma-Aldrich UK)で濯いだ。その後、組織を−20℃で24時間以上保存した。ヒト気管は、NHS Blood and Transplant (NHSBT)から得た。気道疾患を有していなかったことが知られている2人のドナーから死体気管を回収した。初期輸送と保管は−80℃でハンクス緩衝溶液中で行われた。その後、脱細胞化のために両方の気管を−20℃に移した。
本発明による脱細胞化と対照の脱細胞化
合計１１のブタ気管を脱細胞化した。そのうち７つを、本発明の方法を使用して脱細胞化し、残りの４つを、全く同じ脱細胞化プロトコルで脱細胞化したが、負圧ではなく、常圧下で脱細胞化した。２つのヒト気管を、本発明の方法を使用して脱細胞化した。各脱細胞化プロセスの都合で、長さが5cm以下の気管を使用した。
全脱細胞化プロセスは、小さいデシケーター(Sigma-Aldrich UK)を用いて行った。真空（負圧）を作り出すために、このデシケーターに、デジタル真空計(Pendle Refrigeration Wholesale Ltd, UK)を装着したテルスター真空ポンプ2F-10(Pendle Refrigeration Wholesale Ltd, UK)を取り付けた。真空は、1500 micronsレベルとした（真空計の1500 micronsは<1KPaに相当する）。次に、このデシケーターを、プロトコル内で必要とされる温度により4℃又は37℃のいずれかの温度の振盪インキュベーター（100RPMに設定した）に入れた。脱細胞化プロセスで使用される溶液は全て、1％ペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich UK)を含有する。
合計１１のブタ気管を脱細胞化した。そのうち７つを、本発明の方法を使用して脱細胞化し、残りの４つを、全く同じ脱細胞化プロトコルで脱細胞化したが、負圧ではなく、常圧下で脱細胞化した。２つのヒト気管を、本発明の方法を使用して脱細胞化した。各脱細胞化プロセスの都合で、長さが5cm以下の気管を使用した。
全脱細胞化プロセスは、小さいデシケーター(Sigma-Aldrich UK)を用いて行った。真空（負圧）を作り出すために、このデシケーターに、デジタル真空計(Pendle Refrigeration Wholesale Ltd, UK)を装着したテルスター真空ポンプ2F-10(Pendle Refrigeration Wholesale Ltd, UK)を取り付けた。真空は、1500 micronsレベルとした（真空計の1500 micronsは<1KPaに相当する）。次に、このデシケーターを、プロトコル内で必要とされる温度により4℃又は37℃のいずれかの温度の振盪インキュベーター（100RPMに設定した）に入れた。脱細胞化プロセスで使用される溶液は全て、1％ペニシリン/ストレプトマイシン(Sigma-Aldrich UK)を含有する。
組織を、1〜2時間室温で解凍し、次に37℃でPBS中に0.25％トリトンX-100 (Sigma-Aldrich UK)及び0.25％デオキシコール酸ナトリウム（Fluka）を含む洗剤溶液中で24時間インキュベートした。その後、この組織に4〜6℃でハンクス平衡塩溶液による15分間の洗浄を2回行った。洗浄後、この組織を、4〜6℃でハンクス平衡塩溶液を用いて24時間インキュベートし、続いて、37℃で2000 KU/l（クニッツ単位）のDNase(Sigma-Aldrich UK)及び0.1g/lのRNase（Roche社）を用いて24時間インキュベートし、核内容物を溶解し、DNAを分解した。更に4〜6℃でハンクス平衡塩溶液を用いて2回濯いだ後、この気管を24時間インキュベートし、4℃でハンクス平衡塩溶液を用いて洗浄した。この気管について、4〜6℃で1％の抗生物質及び抗真菌溶液を含むハンクス平衡塩溶液中で保存するか、又は必要に応じて更なる分析を行った。全脱細胞化プロセスは、負圧下で行われ、4〜5日かかった。これは既知の脱細胞化技術を使用するよりも実質的に短い。
インプラント／スカフォールドの分析
組織学的及び免疫組織化学的評価：
室温でサンプルを10％中性緩衝ホルマリン液中で24時間以上固定した。このサンプルを、段階的アルコールで脱水し、パラフィン中に包埋し、5μmの切片とした。この切片を、ヘマトキシリン及びエオシン染料（H&E）、アルシアンブルー、ピクロシリウスレッド−ミラーズエラスチン(PSR-ME)染料で染色した。
免疫組織化学的分析のために、パラフィン切片及び凍結切片の両方にMHC-Iの免疫染色を試した。5μmのパラフィン包埋切片を、（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン(Sigma-Aldrich UK)でコーティングしたスライド上にマウントした。凍結切片を氷冷アセトンで10分間固定した。パラフィン切片を脱ワックスし、2回交換のキシレンで再水和し、段階的勾配アルコールで濯いで、更に冷水道水で濯いだ。スライドを加湿チャンバーに入れ、室温で3％水素ペルオキシダーゼ(Sigma-Aldrich UK)を含むメタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼを30分間ブロックした。パラフィン切片について、37℃でトリプシンを用いて40分間抗原回復を行った。室温で2.5％ウマ血清(Vector Laboratories Ltd., Peterborough, UK)を用いて、非特異的結合部位を30分間ブロックした。ヒト組織切片については、室温で、モノクローナル一次抗体（ウサギから産生された抗ヒトMHCクラス抗体、EP1395Y, ab52922, Abcam, UK）を、リン酸緩衝生理食塩水で150倍希釈して用いて、1時間インキュベーションした。ブタ組織切片については、4℃で、一次抗体（抗ブタ抗体、MHCI, H17A, VMRD Inc. Pullman USA)を、リン酸緩衝生理食塩水で100倍希釈して用いて、一晩インキュベーションした。
組織学的及び免疫組織化学的評価：
室温でサンプルを10％中性緩衝ホルマリン液中で24時間以上固定した。このサンプルを、段階的アルコールで脱水し、パラフィン中に包埋し、5μmの切片とした。この切片を、ヘマトキシリン及びエオシン染料（H&E）、アルシアンブルー、ピクロシリウスレッド−ミラーズエラスチン(PSR-ME)染料で染色した。
免疫組織化学的分析のために、パラフィン切片及び凍結切片の両方にMHC-Iの免疫染色を試した。5μmのパラフィン包埋切片を、（3-アミノプロピル）トリエトキシシラン(Sigma-Aldrich UK)でコーティングしたスライド上にマウントした。凍結切片を氷冷アセトンで10分間固定した。パラフィン切片を脱ワックスし、2回交換のキシレンで再水和し、段階的勾配アルコールで濯いで、更に冷水道水で濯いだ。スライドを加湿チャンバーに入れ、室温で3％水素ペルオキシダーゼ(Sigma-Aldrich UK)を含むメタノールを用いて内因性ペルオキシダーゼを30分間ブロックした。パラフィン切片について、37℃でトリプシンを用いて40分間抗原回復を行った。室温で2.5％ウマ血清(Vector Laboratories Ltd., Peterborough, UK)を用いて、非特異的結合部位を30分間ブロックした。ヒト組織切片については、室温で、モノクローナル一次抗体（ウサギから産生された抗ヒトMHCクラス抗体、EP1395Y, ab52922, Abcam, UK）を、リン酸緩衝生理食塩水で150倍希釈して用いて、1時間インキュベーションした。ブタ組織切片については、4℃で、一次抗体（抗ブタ抗体、MHCI, H17A, VMRD Inc. Pullman USA)を、リン酸緩衝生理食塩水で100倍希釈して用いて、一晩インキュベーションした。
これらの切片を、PBSで3分間3回洗浄した後、室温で二次抗体(Impress抗マウス又はImpress抗ウサギ免疫グロブリンG/ペルオキシダーゼキット, Vector Laboratories)を用いて30分間インキュベートした。これらの切片をPBSで3分間3回再度洗浄した後、これらの切片に発色基質ジアミノベンジジン(Impact ペルオキシダーゼ基質, Vector Laboratories)を、室温で3分間かけて塗布した。これらの切片を洗浄した後、脱水し、洗浄し、クリア、脱水し、カバースリップをあてがう前に、30秒間ハリスのヘマトキシリンで対比染色した。陰性対照には、一次抗体を省略し、リン酸緩衝生理食塩水を使用して、同じプロトコルを適用した。陽性対照として、ブタ又はヒトの脾臓を用いた。
走査型電子顕微鏡（SEM）
脱細胞化マトリックス構造を定性的に評価するために、組織サンプルを3％（v/v）グルタルアルデヒド(Sigma-Aldrich UK) を含む0.1Mリン酸緩衝液で固定した。次に、この断片を、蒸留水で洗浄し、勾配無水エタノール中で脱水し、臨界点で乾燥した。次に、この試験片を、走査電子顕微鏡スタブに取り付けられた両面接着テープ上に載せ、金合金で被覆し、その後、写真撮影した。
脱細胞化マトリックス構造を定性的に評価するために、組織サンプルを3％（v/v）グルタルアルデヒド(Sigma-Aldrich UK) を含む0.1Mリン酸緩衝液で固定した。次に、この断片を、蒸留水で洗浄し、勾配無水エタノール中で脱水し、臨界点で乾燥した。次に、この試験片を、走査電子顕微鏡スタブに取り付けられた両面接着テープ上に載せ、金合金で被覆し、その後、写真撮影した。
分子解析
DNA分析：
GenElute哺乳類のゲノムDNAミニプレップキット(Sigma-Aldrich UK)を製造者の指示に従って使用して、DNA抽出及び定量を行った。簡単に述べると、そのまま又は脱細胞化した気管組織（ヒト及びブタ）の細かく刻んで湿潤した組織25mgを、プロテイナーゼKを含むマイクロ遠心管に入れ、55℃の水浴中で、30分間隔でボルテックスしながら、4時間インキュベートした。完全に消化されたことを肉眼で確認して、このサンプルをリボヌクレアーゼＡ溶液に室温で2分間さらした。このサンプルを、DNA抽出アッセイキットからの溶解試薬と共に70℃で10分間インキュベートした。この溶解物を、DNAと結合させるためのカラムに充填した。数回の洗浄工程により不純物を除去した後、最終的にトリス-エチレンジアミン四酢酸溶液200μlの中にDNAを溶出させた。自己マスキング石英マイクロキュベット及び分光光度計(Helios Alpha, Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK)を用いて260nm及び280nmにおける吸光度を読み取り、組織1mg当たりのDNA絶対量を算出した。
DNA0.8％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、抽出したDNAのサイズ、品質及び純度を決定した。この0.8％アガロースゲルは、0.5Xトリス-ホウ酸-エチレンジアミン四酢酸緩衝液中で電極間4-5 V/cmの電場で行われた。等量のDNA（2μl）を各ウェルに入れた。臭化エチジウムで染色することによって可視化を行い、紫外線透照により1 kbのDNAラダーに対するDNAを測定した(Q-Step 4 quantitative DNA ladder, Yorkshire Bioscience Ltd., York, UK)。
DNA分析：
GenElute哺乳類のゲノムDNAミニプレップキット(Sigma-Aldrich UK)を製造者の指示に従って使用して、DNA抽出及び定量を行った。簡単に述べると、そのまま又は脱細胞化した気管組織（ヒト及びブタ）の細かく刻んで湿潤した組織25mgを、プロテイナーゼKを含むマイクロ遠心管に入れ、55℃の水浴中で、30分間隔でボルテックスしながら、4時間インキュベートした。完全に消化されたことを肉眼で確認して、このサンプルをリボヌクレアーゼＡ溶液に室温で2分間さらした。このサンプルを、DNA抽出アッセイキットからの溶解試薬と共に70℃で10分間インキュベートした。この溶解物を、DNAと結合させるためのカラムに充填した。数回の洗浄工程により不純物を除去した後、最終的にトリス-エチレンジアミン四酢酸溶液200μlの中にDNAを溶出させた。自己マスキング石英マイクロキュベット及び分光光度計(Helios Alpha, Thermo Fisher Scientific, Loughborough, UK)を用いて260nm及び280nmにおける吸光度を読み取り、組織1mg当たりのDNA絶対量を算出した。
DNA0.8％アガロースゲル電気泳動を行うことにより、抽出したDNAのサイズ、品質及び純度を決定した。この0.8％アガロースゲルは、0.5Xトリス-ホウ酸-エチレンジアミン四酢酸緩衝液中で電極間4-5 V/cmの電場で行われた。等量のDNA（2μl）を各ウェルに入れた。臭化エチジウムで染色することによって可視化を行い、紫外線透照により1 kbのDNAラダーに対するDNAを測定した(Q-Step 4 quantitative DNA ladder, Yorkshire Bioscience Ltd., York, UK)。
グリコサミノグリカン（GAG）の定量：
Blyscan GAGアッセイキット（Biocolor）を用いて、そのまま及び脱細胞化したヒト及びブタの気管サンプルの硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含有量を定量した。簡単に述べると、細かく刻んで湿潤した組織50mgをマイクロ遠心管に入れ、65℃でパパイン消化緩衝液1mlと共に18時間インキュベートした。各サンプルのアリコート（分取）を1,9-ジメチルメチレンブルー色素及びGAGアッセイキットからの試薬と混合した。分光光度計を用いて656nmにおける吸光度を測定し、ウシ気管コンドロイチン-4-硫酸から作成された標準プロットと比較することにより、GAG絶対含有量を算出した。
Blyscan GAGアッセイキット（Biocolor）を用いて、そのまま及び脱細胞化したヒト及びブタの気管サンプルの硫酸化グリコサミノグリカン（sGAG）含有量を定量した。簡単に述べると、細かく刻んで湿潤した組織50mgをマイクロ遠心管に入れ、65℃でパパイン消化緩衝液1mlと共に18時間インキュベートした。各サンプルのアリコート（分取）を1,9-ジメチルメチレンブルー色素及びGAGアッセイキットからの試薬と混合した。分光光度計を用いて656nmにおける吸光度を測定し、ウシ気管コンドロイチン-4-硫酸から作成された標準プロットと比較することにより、GAG絶対含有量を算出した。
コラーゲンの定量：
Sircolコラーゲンアッセイキット(Biocolor, Carrickfergus, Northern Ireland)を用いて、そのまま及び脱細胞化したヒト及びブタの気管サンプルのコラーゲン含有量を定量した。簡単に述べると、細かく刻んで湿潤した組織50mgを、酸-ペプシン抽出媒体（ペプシン0.1mg/ml及び酢酸0.5mg/ml）1.5mlを含むマイクロ遠心管に入れた。各サンプルのアリコート（分取）を、酸中和試薬及びコラーゲン単離試薬と共に4℃で一晩インキュベートした。次に、これらのサンプルを、コラーゲンアッセイキットからのシリウスレッド色素にさらした。分光光度計で555nmにおける吸光度を測定した。コラーゲン肌ウシ型から作成された標準プロットと比較することにより、コラーゲン絶対含有量を算出した。
Sircolコラーゲンアッセイキット(Biocolor, Carrickfergus, Northern Ireland)を用いて、そのまま及び脱細胞化したヒト及びブタの気管サンプルのコラーゲン含有量を定量した。簡単に述べると、細かく刻んで湿潤した組織50mgを、酸-ペプシン抽出媒体（ペプシン0.1mg/ml及び酢酸0.5mg/ml）1.5mlを含むマイクロ遠心管に入れた。各サンプルのアリコート（分取）を、酸中和試薬及びコラーゲン単離試薬と共に4℃で一晩インキュベートした。次に、これらのサンプルを、コラーゲンアッセイキットからのシリウスレッド色素にさらした。分光光度計で555nmにおける吸光度を測定した。コラーゲン肌ウシ型から作成された標準プロットと比較することにより、コラーゲン絶対含有量を算出した。
生体力学的試験
試験片を、それが破壊するまで、一軸引張試験にかけ、負荷の低下と組織に引裂きが現れることを確認した。このプロセスの概略図を図10に示す。
各試験に、穴の開いた気管リング（ブタ又はヒト、そのまま又は脱細胞化）を一つ使用した。気管の試験片（2）を開いて、最大長が33mmの平坦な長方形片（4）を作製し、ホルダー(8,8'）に保持されたクランプ（6,6'）に固定し、100mm/分の一定の引張速度で引張り、最大500Nの力を適用した。これらの試験は、室温で、インストロンインスペック2200ベンチトップポータブルテスター（Instron In-Spec 2200 Benchtop Portable Tester）を用いて一軸張力を適用して行われた。
引張試験機は、リアルタイムで、組織の負荷と伸びを記録した。最大力（N）、破断力（N）、最大荷重における伸び(cm)等のパラメータが記録された。そして、弾性材料の剛性の尺度である、歪みに対する応力の比（ヤング率）を算出した。
試験片を、それが破壊するまで、一軸引張試験にかけ、負荷の低下と組織に引裂きが現れることを確認した。このプロセスの概略図を図10に示す。
各試験に、穴の開いた気管リング（ブタ又はヒト、そのまま又は脱細胞化）を一つ使用した。気管の試験片（2）を開いて、最大長が33mmの平坦な長方形片（4）を作製し、ホルダー(8,8'）に保持されたクランプ（6,6'）に固定し、100mm/分の一定の引張速度で引張り、最大500Nの力を適用した。これらの試験は、室温で、インストロンインスペック2200ベンチトップポータブルテスター（Instron In-Spec 2200 Benchtop Portable Tester）を用いて一軸張力を適用して行われた。
引張試験機は、リアルタイムで、組織の負荷と伸びを記録した。最大力（N）、破断力（N）、最大荷重における伸び(cm)等のパラメータが記録された。そして、弾性材料の剛性の尺度である、歪みに対する応力の比（ヤング率）を算出した。
脱細胞化スカフォールドの生体適合性
全ての動物手術とその取り扱いは、1986年のThe Animals (Scientific Procedures) Act及びHome Office Code of Practiceに基づいて行われた。関連する倫理承認は、Northwick Park Institute for Medical Researchにより付与された。
移植前に、各スカフォールドは紫外線を使用してさらに滅菌された。即ち、サンプルを、20分間2回UV光にさらした。合計６匹のスプラーグドーリーラットを使用した。全身麻酔下で無菌技術を用いて、腹壁に正中切開を行い、正中線の両側の、皮膚と筋肉との間に小さな空洞を作成した。その後、各空洞に、1cm×1cmの脱細胞化気管断片又は非脱細胞化気管断片のいずれかを入れた。2週間後、ペントバルビタールの致死量により、各動物を殺処分した。この移植された組織を外植し、組織学的評価のために処理した。
統計分析
データは平均±標準誤差として計算し、有意性は、事後テストとして、2両側スチューデントt-テストとボンフェローニを備えた通常一方向ANOVAを行って決定した(Prism 6: Graphpad Software, La Jolla, California)。0.05未満のp値を有意とみなした。
全ての動物手術とその取り扱いは、1986年のThe Animals (Scientific Procedures) Act及びHome Office Code of Practiceに基づいて行われた。関連する倫理承認は、Northwick Park Institute for Medical Researchにより付与された。
移植前に、各スカフォールドは紫外線を使用してさらに滅菌された。即ち、サンプルを、20分間2回UV光にさらした。合計６匹のスプラーグドーリーラットを使用した。全身麻酔下で無菌技術を用いて、腹壁に正中切開を行い、正中線の両側の、皮膚と筋肉との間に小さな空洞を作成した。その後、各空洞に、1cm×1cmの脱細胞化気管断片又は非脱細胞化気管断片のいずれかを入れた。2週間後、ペントバルビタールの致死量により、各動物を殺処分した。この移植された組織を外植し、組織学的評価のために処理した。
統計分析
データは平均±標準誤差として計算し、有意性は、事後テストとして、2両側スチューデントt-テストとボンフェローニを備えた通常一方向ANOVAを行って決定した(Prism 6: Graphpad Software, La Jolla, California)。0.05未満のp値を有意とみなした。
結果
ブタ11匹及びヒト2人のドナーから気管組織を採取し、本発明の脱細胞化（以下「DC」という。）プロセスで処理した。
DNA分析：
脱細胞化の後、おそらく赤血球の除去のため、組織は目視では無色に見える（図1）。
組織への溶液の浸透を補助するための真空を使用して又は使用せずに、ブタ気管を脱細胞化した。組織学的H&S染色スライド上では、本発明の真空補助脱細胞化を行った組織の、管腔上皮（粘膜）、粘膜下腺、気管筋及び外側外膜の中で、完全な核は全て除去されていた。軟骨内では、小腔内からすべての軟骨細胞が効率的に取り除かれていた。しかし、真空補助脱細胞化を行っていない組織では、全てではないがいくつかで完全な軟骨細胞を示した（図2）。この観察は、真空を使用して又は使用せずに行われた脱細胞化の後、残置されたDNA量が、対照組織と比較して、有意な減少を示した分子DNA定量測定により裏付けられている。更に、非真空と真空補助プロトコルとの間に、DNAの非有意な減少が観察された（図3、対照(n=7)は300.4±27.05ng/mg、非真空DC(n=3)は109.8±37.45 ng/mg、真空DC(n=6)は36.14±7.834 ng/mg, p<0.05.)。
すべて真空脱細胞化を行ったヒト気管もまた、組織学的解析及び分子DNA解析の両方において、組織全体にわたって核物質の完全な除去を示した(図3、対照(n=2)は304.4±8.268 ng/mg、DC(n=7)は50.04±6.003 ng/mg, p<0.05)。また、図15は全てのDNAが実質的に除去されたことを示す。
ブタ11匹及びヒト2人のドナーから気管組織を採取し、本発明の脱細胞化（以下「DC」という。）プロセスで処理した。
DNA分析：
脱細胞化の後、おそらく赤血球の除去のため、組織は目視では無色に見える（図1）。
組織への溶液の浸透を補助するための真空を使用して又は使用せずに、ブタ気管を脱細胞化した。組織学的H&S染色スライド上では、本発明の真空補助脱細胞化を行った組織の、管腔上皮（粘膜）、粘膜下腺、気管筋及び外側外膜の中で、完全な核は全て除去されていた。軟骨内では、小腔内からすべての軟骨細胞が効率的に取り除かれていた。しかし、真空補助脱細胞化を行っていない組織では、全てではないがいくつかで完全な軟骨細胞を示した（図2）。この観察は、真空を使用して又は使用せずに行われた脱細胞化の後、残置されたDNA量が、対照組織と比較して、有意な減少を示した分子DNA定量測定により裏付けられている。更に、非真空と真空補助プロトコルとの間に、DNAの非有意な減少が観察された（図3、対照(n=7)は300.4±27.05ng/mg、非真空DC(n=3)は109.8±37.45 ng/mg、真空DC(n=6)は36.14±7.834 ng/mg, p<0.05.)。
すべて真空脱細胞化を行ったヒト気管もまた、組織学的解析及び分子DNA解析の両方において、組織全体にわたって核物質の完全な除去を示した(図3、対照(n=2)は304.4±8.268 ng/mg、DC(n=7)は50.04±6.003 ng/mg, p<0.05)。また、図15は全てのDNAが実質的に除去されたことを示す。
コラーゲン評価
両方の断片からの組織の、ピクロシリウスレッド−ミラーエラスチンによる評価は、軟骨及びコラーゲンの良好な保持と形態を示した（図5、A〜D）。さらに、小動脈及び細静脈内の微細エラスチンもまた保存されていた（図5、E〜H）。その断面を偏光で観察すると、コラーゲンは明るい赤−橙−黄色の縁取りがされており、コラーゲンの優れた構造的完全性を示している（図5、I〜L）。
コラーゲン分解の分子解析に関して、対照と非真空補助ブタサンプルの間で著しい減少が認められた。コラーゲン分解の減少は、本発明の方法により調製したブタサンプルと対照サンプルの間で観察されず、また本発明の方法により調製したヒト脱細胞化組織と対照組織との間で如何なる違いも見られなかった(図6、ブタ：対照(n=9)は27.8±8.829μg/mg、非真空DC(n=2)は6.774±0.067μg/mg、真空DC(n=49)は23.03±3.897μg/mg、ヒト：対照(n=3)は12.86±3.657μg/mg、DC(n=9)は8.18±2.322μg/mg)。
またコラーゲンの超構造をSEMを用いて評価した。本発明に従って作製された脱細胞化ブタ組織内のコラーゲン繊維は、対照ブタ組織よりも、緩やかに結合しているように見えた。ヒト組織においても同様に観察された（図7）。
両方の断片からの組織の、ピクロシリウスレッド−ミラーエラスチンによる評価は、軟骨及びコラーゲンの良好な保持と形態を示した（図5、A〜D）。さらに、小動脈及び細静脈内の微細エラスチンもまた保存されていた（図5、E〜H）。その断面を偏光で観察すると、コラーゲンは明るい赤−橙−黄色の縁取りがされており、コラーゲンの優れた構造的完全性を示している（図5、I〜L）。
コラーゲン分解の分子解析に関して、対照と非真空補助ブタサンプルの間で著しい減少が認められた。コラーゲン分解の減少は、本発明の方法により調製したブタサンプルと対照サンプルの間で観察されず、また本発明の方法により調製したヒト脱細胞化組織と対照組織との間で如何なる違いも見られなかった(図6、ブタ：対照(n=9)は27.8±8.829μg/mg、非真空DC(n=2)は6.774±0.067μg/mg、真空DC(n=49)は23.03±3.897μg/mg、ヒト：対照(n=3)は12.86±3.657μg/mg、DC(n=9)は8.18±2.322μg/mg)。
またコラーゲンの超構造をSEMを用いて評価した。本発明に従って作製された脱細胞化ブタ組織内のコラーゲン繊維は、対照ブタ組織よりも、緩やかに結合しているように見えた。ヒト組織においても同様に観察された（図7）。
スカフォールドのグリコサミノグリカン（GAG）の評価
両種（ヒトとブタ）の脱細胞化スカフォールド上に保持されているGAGの量を、アルシアンブルー組織染色（図8）及び定量的分子検査を用いて評価した。ブタのスカフォールドは、真空を使用して又は使用せずに行われた脱細胞化プロセスの間に、そのGAGの70％以上が失われたのに対し(対照(n=14)は488.3±75.61ng/mg、非真空DC(n=10)は59.12±11.54 ng/mg、真空DC(n=8)は47.37±3.921, p<0.05)、ヒト組織では大きな差はなかった(対照(n=2)は44.03±0.89、DC(n=7)は57.64±3.12)。
両種（ヒトとブタ）の脱細胞化スカフォールド上に保持されているGAGの量を、アルシアンブルー組織染色（図8）及び定量的分子検査を用いて評価した。ブタのスカフォールドは、真空を使用して又は使用せずに行われた脱細胞化プロセスの間に、そのGAGの70％以上が失われたのに対し(対照(n=14)は488.3±75.61ng/mg、非真空DC(n=10)は59.12±11.54 ng/mg、真空DC(n=8)は47.37±3.921, p<0.05)、ヒト組織では大きな差はなかった(対照(n=2)は44.03±0.89、DC(n=7)は57.64±3.12)。
生体力学的分析
両種（ヒトとブタ）の本発明のみに従って脱細胞化されたものと対照の生体力学的分析を試みた(図10)。気管リング(2)を一つ取り出して、それを開いて、膜性部を除去し、組織の均質な長方形片（4）を作製し、ホルダー(8,8'）のサンドペーパーの間に固定した。引張強度、破断力、破断点伸び及びヤング率に有意な差はなかった。各データを表１に示す。
両種（ヒトとブタ）の本発明のみに従って脱細胞化されたものと対照の生体力学的分析を試みた(図10)。気管リング(2)を一つ取り出して、それを開いて、膜性部を除去し、組織の均質な長方形片（4）を作製し、ホルダー(8,8'）のサンドペーパーの間に固定した。引張強度、破断力、破断点伸び及びヤング率に有意な差はなかった。各データを表１に示す。
生体適合性
インビボでの生体適合性の研究を試みる前に、両種（ヒトとブタ）の脱細胞化サンプルをIHC染色し、それらが移植された場合、ホストに免疫応答を惹起する潜在的可能性があるかどうかを評価した。サンプルを、MHC I/HLA-1染色した。両種において、MHCで染色した切片は、表面を覆う筋膜/外膜で陽性を示した。軟骨性リングでは染色は、極僅か見られた又は全く見られなかった（図11）。MHC1/HLA-1で染色されたヒト切片は、軟骨、コラーゲン又は表面を覆う筋膜のいずれにおいても陽性を示さなかった(図11）。
脱細胞化気管の小片を、ラットの皮下に移植し、2週間放置した。外植時に、移植した各サンプルはまだ特定可能であった（図12）。移植されたDCヒト気管のすべての組織切片は、図13に示すように、少しの慢性を伴う急性のマイナー炎症反応（少量の好中球と好酸球、中程度の量のリンパ球の時折合胞体を有するマクロファージ）を示した。更に、図14に示すように、良好な血管新生と良好な統合が見られ、細胞外マトリックスは完全であった。
インビボでの生体適合性の研究を試みる前に、両種（ヒトとブタ）の脱細胞化サンプルをIHC染色し、それらが移植された場合、ホストに免疫応答を惹起する潜在的可能性があるかどうかを評価した。サンプルを、MHC I/HLA-1染色した。両種において、MHCで染色した切片は、表面を覆う筋膜/外膜で陽性を示した。軟骨性リングでは染色は、極僅か見られた又は全く見られなかった（図11）。MHC1/HLA-1で染色されたヒト切片は、軟骨、コラーゲン又は表面を覆う筋膜のいずれにおいても陽性を示さなかった(図11）。
脱細胞化気管の小片を、ラットの皮下に移植し、2週間放置した。外植時に、移植した各サンプルはまだ特定可能であった（図12）。移植されたDCヒト気管のすべての組織切片は、図13に示すように、少しの慢性を伴う急性のマイナー炎症反応（少量の好中球と好酸球、中程度の量のリンパ球の時折合胞体を有するマクロファージ）を示した。更に、図14に示すように、良好な血管新生と良好な統合が見られ、細胞外マトリックスは完全であった。
実施例２
本発明の脱細胞化骨及び腱のスカフォールド及び対照の作製
組織サンプルを、別の研究で殺処分したブタから得た。ブタはすべてのメスで、年齢は約5ヶ月、体重は50kgであった。骨サンプルをブタの踵骨から得た。腱サンプルを長指屈腱から得た。これらのサンプルを検死中に取り出し、プロトコルで使用に必要とされるまで、プラスチック製サンプルバッグ中で−20℃の冷凍庫に保存した。
骨及び腱のスカフォールドを作製するために、負圧条件下で行う脱細胞化剤として、SDS、TnBP（トリ-n-ブチルホスフェート）、トリトンX-100、DNase及びRNaseを用いて、上記の気管インプラント作製と同様のプロトコルを行った。負圧を使用せずに脱細胞化剤によって灌流された骨と腱の対照サンプルも使用され、得られた組織を組織学的に分析した。
使用されるプロトコルを表2に示す。すべての工程は、本発明の方法を用いて灌流された組織については0.2kPaの負圧下で行い、対照組織サンプルについては周囲圧力で行った。表2に示す各工程の間に、脱イオン水を用いた15分間の洗浄を3回行った。
骨と腱組織サンプルのための脱細胞化プロトコルを表２に示す。
本発明の脱細胞化骨及び腱のスカフォールド及び対照の作製
組織サンプルを、別の研究で殺処分したブタから得た。ブタはすべてのメスで、年齢は約5ヶ月、体重は50kgであった。骨サンプルをブタの踵骨から得た。腱サンプルを長指屈腱から得た。これらのサンプルを検死中に取り出し、プロトコルで使用に必要とされるまで、プラスチック製サンプルバッグ中で−20℃の冷凍庫に保存した。
骨及び腱のスカフォールドを作製するために、負圧条件下で行う脱細胞化剤として、SDS、TnBP（トリ-n-ブチルホスフェート）、トリトンX-100、DNase及びRNaseを用いて、上記の気管インプラント作製と同様のプロトコルを行った。負圧を使用せずに脱細胞化剤によって灌流された骨と腱の対照サンプルも使用され、得られた組織を組織学的に分析した。
使用されるプロトコルを表2に示す。すべての工程は、本発明の方法を用いて灌流された組織については0.2kPaの負圧下で行い、対照組織サンプルについては周囲圧力で行った。表2に示す各工程の間に、脱イオン水を用いた15分間の洗浄を3回行った。
骨と腱組織サンプルのための脱細胞化プロトコルを表２に示す。
脱細胞化後、残置核物質の存在を確認するために、ヘマトキシリン及びエオシン（H&E）染色を行った。また、細胞外マトリックス（ECM）内のコラーゲンとエラスチン線維の状態を評価するために、ピクロシリウスレッド−ミラーズエラスチン(P&M)染色を行った。40倍と200倍の倍率の光学顕微鏡を用いて全てのサンプルの代表的な写真を撮った。全てのP&Mスライドは、コラーゲンとエラスチン線維の状態を強調するために、偏光と非偏光の光を通して撮影した。図16と17は、本発明に従って調整された腱組織（図16）と対照腱組織（図17）のH&E染色の結果を示す。図18は、本発明による骨組織のH＆E染色の結果を示す。
本発明の方法に従った負圧状態下では、腱組織から核物質が除去された完全な脱細胞化が達成されたが（図16）、周囲圧力下で調製された対照腱サンプルにおいては、核物質がまだ可視可能であった（図17）。同様に、負圧下で本発明の方法に従って調整された骨組織サンプルは、図18のH&E染色したサンプルに示すように、目視で小腔が空であり、実質的に核物質が存在しないことが見出された。
本発明の方法に従った負圧状態下では、腱組織から核物質が除去された完全な脱細胞化が達成されたが（図16）、周囲圧力下で調製された対照腱サンプルにおいては、核物質がまだ可視可能であった（図17）。同様に、負圧下で本発明の方法に従って調整された骨組織サンプルは、図18のH&E染色したサンプルに示すように、目視で小腔が空であり、実質的に核物質が存在しないことが見出された。
実施例３
本発明の脱細胞化喉頭の作製
ヒトの死体から組織サンプルを得て、ビニール袋に−20℃で保存した。
喉頭サンプルについて、脱細胞化剤としてDNase、RNase、トリトンX-100、及びデオキシコール酸ナトリウム（SOC）を使用して、実施例1に記載したのと同様のプロトコルを行った。その方法の全ての工程は、実施例1に記載のデシケーターとテルスター真空ポンプ2F-10を使用して<1kPaの負圧条件下で行った（真空度1500 microns）。
プロトコルの構成要素を以下に示し、プロトコルを表3に示す。
本発明の脱細胞化喉頭の作製
ヒトの死体から組織サンプルを得て、ビニール袋に−20℃で保存した。
喉頭サンプルについて、脱細胞化剤としてDNase、RNase、トリトンX-100、及びデオキシコール酸ナトリウム（SOC）を使用して、実施例1に記載したのと同様のプロトコルを行った。その方法の全ての工程は、実施例1に記載のデシケーターとテルスター真空ポンプ2F-10を使用して<1kPaの負圧条件下で行った（真空度1500 microns）。
プロトコルの構成要素を以下に示し、プロトコルを表3に示す。
溶液の調製
粉末形ラトランキュリンB（Lat B）−1mgのLat B 395.51g/mol
これに高グルコースDMEM 25mlを添加して100μMストック溶液を生成した。これを25mlチューブに分注し、−20℃の冷凍庫に保存した。
１．高グルコースDMEM（グルコース4500mg）中にラトランキュリンB（Lat B）50nM − 高グルコースDMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)100ml中にLat B50μl
２．0.25％トリトンX及び0.25％SOC − 1リットルのPBSに、デオキシコール酸ナトリウム溶液（SOC）2.5グラムとトリトンX2.5ミリリットルを加えた。
３．緩衝生理食塩水（PBS） − ５つのPBS錠剤を脱イオン水1リットルに添加した。
４．カルシウムとマグネシウムを加えたハンクス平衡塩溶液 − Sigma-Aldrichから入手
５．0.6M塩化カリウム（KCl） − 1リットルのPBSに塩化カリウム44.73 gを加えた。
６．1Mヨウ化カリウム（KI） − 1リットルのPBSにヨウ化カリウム166 gを加えた。
７．インキュベーション緩衝液 − 1リットルのPBSに塩化マグネシウム（MgCl2）0.5 gと塩化カルシウム（CaCl2）0.055 gを加え、DNaseを使用直前にインキュベーション緩衝液の必要量を添加した。
８．デオキシリボヌクレアーゼ(DNase) −酵素2000kuのDNase1を含むバイアル瓶に脱イオン水1リットルを混合した。水5mlを、DNaseのバイアル瓶に入れ、5つの1ml Eppdorffチューブに分注した。インキュベーション緩衝液200mlに、調製した酵素溶液1mlを使用した。
９．リボヌクレアーゼ(RNase) − RNase 0.01 gをインキュベーション緩衝液100mlに混合した。
粉末形ラトランキュリンB（Lat B）−1mgのLat B 395.51g/mol
これに高グルコースDMEM 25mlを添加して100μMストック溶液を生成した。これを25mlチューブに分注し、−20℃の冷凍庫に保存した。
１．高グルコースDMEM（グルコース4500mg）中にラトランキュリンB（Lat B）50nM − 高グルコースDMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)100ml中にLat B50μl
２．0.25％トリトンX及び0.25％SOC − 1リットルのPBSに、デオキシコール酸ナトリウム溶液（SOC）2.5グラムとトリトンX2.5ミリリットルを加えた。
３．緩衝生理食塩水（PBS） − ５つのPBS錠剤を脱イオン水1リットルに添加した。
４．カルシウムとマグネシウムを加えたハンクス平衡塩溶液 − Sigma-Aldrichから入手
５．0.6M塩化カリウム（KCl） − 1リットルのPBSに塩化カリウム44.73 gを加えた。
６．1Mヨウ化カリウム（KI） − 1リットルのPBSにヨウ化カリウム166 gを加えた。
７．インキュベーション緩衝液 − 1リットルのPBSに塩化マグネシウム（MgCl2）0.5 gと塩化カルシウム（CaCl2）0.055 gを加え、DNaseを使用直前にインキュベーション緩衝液の必要量を添加した。
８．デオキシリボヌクレアーゼ(DNase) −酵素2000kuのDNase1を含むバイアル瓶に脱イオン水1リットルを混合した。水5mlを、DNaseのバイアル瓶に入れ、5つの1ml Eppdorffチューブに分注した。インキュベーション緩衝液200mlに、調製した酵素溶液1mlを使用した。
９．リボヌクレアーゼ(RNase) − RNase 0.01 gをインキュベーション緩衝液100mlに混合した。
プロトコルの結果、完全に脱細胞化され核物質が除去された脱細胞化喉頭組織が作製された。
上記実施形態は、単に例として説明されているだけであり、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく多くの変形が可能である。
上記実施形態は、単に例として説明されているだけであり、特許請求の範囲に規定される本発明の範囲から逸脱することなく多くの変形が可能である。
Claims (6)
- 間質組織、結合組織又は支持組織からインプラントを製造する方法であって、該組織は、気管、気管の部分又は気管組織；骨；腱；靭帯；骨−腱；軟骨；喉頭、咽頭の部分又は喉頭組織；大血管又はその一部；及び神経組織から成る群から選択され、この方法は、実質的に灌流の全期間にわたって負圧下で、この組織を少なくとも一種の脱細胞化媒体で灌流する工程を少なくとも１回含み、更にその灌流工程又は各灌流工程の後に洗浄工程を含み、本方法の全工程が、組織全体が１ｋＰａ以下の負圧下で行われる方法。
- 前記脱細胞化媒体の少なくとも一つが洗剤及び／又は酵素を含む請求項１に記載の方法。
- 前記方法が少なくとも２つの灌流工程を含み、少なくとも一つの灌流工程において脱細胞化媒体として洗剤を使用し、かつ少なくとも一つの灌流工程において脱細胞化媒体としてヌクレアーゼを使用する請求項１又は２に記載の方法。
- 各灌流工程の間に洗浄工程が行われ、かつ最後の灌流工程の後に洗浄工程が行われる請求項３に記載の方法。
- 前記方法が少なくとも３つの灌流工程を含み、１回目の灌流工程で脱細胞化媒体として洗剤を使用し、２回目の灌流工程で脱細胞化媒体としてヌクレアーゼを使用し、かつ３回目の灌流工程で脱細胞化媒体としてヌクレアーゼを使用する請求項３又は４に記載の方法。
- 前記インプラントに細胞を再播種する工程を含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
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