CN112190758A - 一种快速制备脱细胞气管支架的方法 - Google Patents

一种快速制备脱细胞气管支架的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112190758A
CN112190758A CN202010978119.1A CN202010978119A CN112190758A CN 112190758 A CN112190758 A CN 112190758A CN 202010978119 A CN202010978119 A CN 202010978119A CN 112190758 A CN112190758 A CN 112190758A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acellular
stent
group
trachea
tracheal
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010978119.1A
Other languages
English (en)
Inventor
史宏灿
王志豪
卢丹
孙飞
卢毅
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yangzhou University
Original Assignee
Yangzhou University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yangzhou University filed Critical Yangzhou University
Priority to CN202010978119.1A priority Critical patent/CN112190758A/zh
Publication of CN112190758A publication Critical patent/CN112190758A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3641—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the site of application in the body
    • A61L27/3679—Hollow organs, e.g. bladder, esophagus, urether, uterus, intestine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/22—Materials or treatment for tissue regeneration for reconstruction of hollow organs, e.g. bladder, esophagus, urether, uterus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2430/00—Materials or treatment for tissue regeneration
    • A61L2430/40—Preparation and treatment of biological tissue for implantation, e.g. decellularisation, cross-linking

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

本发明公开一种快速制备脱细胞气管支架的方法，制备时使用无底物的一次性真空采血管作为容器进行脱细胞处理，通过配备显示器的真空泵将该容器抽真空至1/2标准大气压；将无菌分离获取的气管在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解，在4％脱氧胆酸钠溶液中孵育，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，置于含有6KU/mL DNaseI的NaCl溶液中，摇床孵育，将样本转移至磷酸缓冲盐溶液中后于室温下超声，随后磷酸缓冲盐溶液冲洗3次去除组织碎片即完成制备。真空负压状态加快去污剂和酶进入组织的进程，优化的DNase I的浓度，提高脱细胞的效果和效率，从而显著缩短了制备气管脱细胞支架的时间，降低支架的制备成本。

Description

一种快速制备脱细胞气管支架的方法
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种快速制备脱细胞气管支架的方法。
背景技术
临床发现，气管常因狭窄、肿瘤、创伤和感染等因素发生病变损伤，当损伤部分气管长度小于成人气管全长的1/2或儿童的1/3时，手术切去并端端吻合是其治疗的“金标准”。但当气管损伤超过这一长度时，常规内镜或开放手术无法满足病情需求，需进一步进行气管替代治疗。由脱细胞支架、合成支架和复合支架构成的组织工程支架为气道重建提供了新途径。理想的气管支架应保留气管的主要结构和细胞外基质，且密闭性和力学性能等应与正常气管功能相似，同时应去除免疫原性，减少移植后免疫反应和排斥反应等并发症。通过对供体气管进行脱细胞处理，可在去除支架核成分的同时保留气管的解剖结构和功能，是气管组织工程进行气管替代治疗的有效方法。
目前，去污剂联合酶法(DEM)制备的脱细胞气管支架已应用于临床案例中，并取得较理想的治疗结果，是气管组织工程进行替代治疗的有效途径，但气管脱细胞基质的制备需要几周到几个月的时间。由于制备周期较长，使得该方案具有局限性，其并不适合临床上需进行气管替代治疗的急性气管疾病患者，如气管发育不全、闭锁等需要紧急气管替换的患者。气管组织工程的快速临床化不仅需要气管支架的良好特性，还需适宜的生产周期。通过缩短制备时间不仅可以降低支架的生产成本和时间成本，还可以增加气管支架的临床应用前景。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一种可以快速制备气管脱细胞支架的方法。通过真空负压状态加快去污剂和酶进入组织的进程，通过优化脱细胞过程DNaseI的浓度，提高脱细胞的效果和效率，显著缩短了制备气管脱细胞支架的时间，降低支架的制备成本。
本发明的技术方案为：一种快速制备脱细胞气管支架的方法，具体制备步骤为：
(1)使用无底物的一次性真空采血管作为容器进行脱细胞处理，通过配备显示器的真空泵将该容器抽真空至1/2标准大气压；
(2)将无菌分离获取的气管在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解，在4％脱氧胆酸钠溶液中孵育，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，置于含有6KU/mL DNaseI的NaCl溶液中，摇床孵育，将样本转移至磷酸缓冲盐溶液中后于室温下超声，随后磷酸缓冲盐溶液冲洗3次去除组织碎片。
作为优选，步骤(2)中，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解的时间为24h。
作为优选，步骤(2)中，在4％脱氧胆酸钠溶液中孵育的时间为4h。
作为优选，步骤(2)中，NaCl溶液的浓度为1mol/L。
作为优选，摇床孵育过程是真空负压环境下、于37℃、100r/min的条件下进行的，孵育时间为12-24h。
本发明的有益效果为：
本发明公开一种快速制备脱细胞气管支架的方法，通过真空负压状态加快去污剂和酶进入组织的进程，通过综合对比真空下不同DNase I浓度制备的各组兔气管脱细胞支架性能，发现6KU组仅需要2d即可快速制备脱细胞效果良好的兔气管支架，显著缩短了脱细胞支架的制备周期，降低了制备成本，为气管和其他器官的紧急替代治疗提供新思路。
附图说明
图1为真空下利用不同浓度DNase I脱细胞处理后气管支架的形貌图；
图2为脱细胞气管支架的H&E、Masson三色和阿利新蓝结果图；
图3为脱细胞气管支架的DAPI染色结果图和免疫组化染色结果图；
图4中A小图为脱细胞气管支架的DNA残留量统计图、B小图为脱细胞气管支架的sGAG含量统计图、C小图为脱细胞气管支架的II型胶原定量分析结果图、D小图为将脱细胞气管支架压缩50％后的变形应力统计图，其中*代表与对照组相比，p<0.05；
图5为脱细胞化前后气管支架扫描电镜示意图；
图6为脱细胞气管支架的CCK-8实验结果统计图；
图7中A小图为将支架包埋于SD大鼠大网膜内的照片、B小图为30d后将移植物从受体大网膜内取出后的照片、C小图为6KU组支架CD31免疫荧光染色结果图；
图8为各脱细胞组的H&E染色结果图和CD68染色结果图；
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。
实施例一
1.实验分组：采用随机算术法将30只新西兰大白兔分为5组：
A组(n＝6)：原生对照组(天然气管)；
B组(n＝6)：2KU DNase Ⅰ组；
C组(n＝6)：4KU DNase Ⅰ组；
D组(n＝6)：6KU DNase Ⅰ组；
E组(n＝6)：8KU DNase Ⅰ组。
2.各组气管基质的制备：将各组新西兰兔耳缘静脉空气栓塞处死，无菌原则下快速分离组织获取气管。将原生对照组气管浸泡于含1％抗生素、抗真菌药物AA(AA指青霉素-链霉素溶液)的4℃磷酸盐缓冲液(PBS)中待测。
以下脱细胞过程均在真空条件下进行，使用一次性真空采血管(无底物)作为容器进行脱细胞处理，通过配备显示器的真空泵将该容器抽真空至1/2标准大气压(50.66kPa)。
实验组在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解24h后，在4％脱氧胆酸钠溶液中孵育4h，再用PBS缓冲液冲洗3次(10min/次)，然后分别置于含有2KU/mL、4KU/mL、6KU/mL和8KU/mLDNaseI的1mol/L NaCl溶液中，在真空负压条件下于37℃摇床孵育12h(100r/min)，将样本转移至PBS溶液中于室温下超声30min，随后PBS冲洗3次(10min/次)去除组织碎片。样品脱细胞后保存在含1％AA的4℃PBS缓冲液中待测。
相关性能测试
1.组织学染色
室温下将样本用10％中性甲醛(pH 7.4)固定24h，常规石蜡包埋、切片(4μm)。为了探究脱细胞基质的特性，进行H&E、Masson三色和阿利新蓝染色，在光学显微镜(Olympus)下观察组织形态学变化。
2.脱细胞化效果的评估
4’-6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)可以与双链DNA结合发出较强的蓝色荧光，通过荧光显微镜观察各组间DAPI染色后蓝色荧光的变化，评估脱细胞后细胞核成份的去除情况。各组气管基质行DNA量化分析，按组织基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)操作步骤提取DNA，通过酶标仪对洗脱的DNA进行定量。所有样品的260/280比在1.8和2.0之间。
免疫组化法检测气管组织中MHC-I和MHC-II标记物的存在，评价脱细胞方案的效果。简而言之，山羊血清工作液封闭，加一抗(MHC-Ⅰ或MHC-Ⅱ，稀释浓度1∶200)4℃孵育过夜，二抗(羊抗兔/小鼠IgG)孵育10min，DAB显色，比较各组样本MHC-I和MHC-II抗原的表达量。
3.酶标仪定量sGAG、II型胶原(细胞外基质组成)
通过糖胺聚糖测定试剂盒进行硫酸化糖胺聚糖(sGAG)定量分析。各组样品称湿重，取等量浸泡在1mL木瓜蛋白酶提取液中于65℃孵育18h。染料试剂与sGAG结合形成颗粒状复合物，再加解离试剂溶解。取200μL样品在656nm处读取吸光度，并根据标准曲线获得sGAG浓度。
采用兔II型胶原ELISA试剂盒对样本内II型胶原进行定量，称取各组样本湿重，组织匀浆后提取上清并进行II型胶原含量测定。上清与HRP标记的II型胶原抗体结合形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经彻底洗涤后加底物TMB显色。使用酶标仪在450nm处检测吸光度并根据标准曲线计兔II型胶算浓度。
4.脱细胞基质的生物物理性质评价
4.1扫描电子显微镜(SEM)
通过SEM观察气管脱细胞基质的表面形貌。样品用2.5％戊二醛固定24h，梯度乙醇脱水，CO2临界点干燥，喷金后在扫描电子显微镜下观察分析。
4.2生物力学试验
宏观下观察各组气管基质的大体形态；万能试验机检测各组样本的力学性能，室温下以3mm/min的恒定速率压缩，记录管径压缩至50％时的应变压力、弹性模量数值。
5.支架的细胞相容性
根据现有的骨髓间充质干细胞(BMSCs)培养方案，将BMSCs培养至第4代，接植于0.5cm×0.5cm2的各组气管上，细胞密度0.5×104/孔，于第1、3、5、7d使用CCK-8法检测各组细胞的增殖和贴附状态。
6.支架的体内植入
为探究气管脱细胞支架的体内生物相容性，进行体内植入实验。将各组气管分别包埋于成年雄性SD大鼠大网膜内，30d后取出移植物进行组织病理学分析。HE染色观察术后各组基质结构变化，CD68免疫组化染色标记基质内巨噬细胞，CD31免疫荧光染色评估移植后脱细胞基质的血运重建。使用免疫组化染色试剂盒对脱细胞支架内CD68和CD31进行标记，一级抗体CD68(稀释度1：200，)或CD31(稀释度1：200)孵育1h，CD68苏木素复染后DAB显色，CD31荧光染色行DAPI复染，通过光学或荧光显微镜观察并获取图像。
7.统计学分析
采用SPSS19.0统计软件进行数据分析，各组数据以均值±标准差(Mean±SD)表示。两组间比较采用t检验，3组及以上使用方差分析，p<0.05则差异有统计学意义。
结果
1组织学分析
真空脱细胞处理后，宏观下可见整个气管颜色完全变成白色，可能是由于去除了组织内的红细胞，如图1所示。随着真空脱细胞过程中DNase I的浓度增加，8KU组气管管腔可见轻微收缩塌陷。宏观观察显示通过真空下不同浓度DNase I脱细胞处理后，可制备保留主要解剖结构的脱细胞气管支架。
2.为了评估脱细胞后细胞外基质(ECM)结构的改变，进行了H&E、Masson三色和阿利新蓝，如图2所示。H&E染色结果显示对照组黏膜层有紧密排序的纤毛，黏膜下层、软骨和外膜也存在大量的散在细胞核。脱细胞处理后，气管腔面纤毛消失，管腔上皮(黏膜)、黏膜下层和外膜等非软骨结构的细胞核基本被清除。随着DNase I处理浓度的增加，软骨区的胞核被逐渐去除，当DNase I浓度为8KU/mL时软骨区细胞核几乎被完全去除。Masson三色显示与对照组相比，真空脱细胞后各组气管支架内胶原纤维含量未见明显变化，软骨、基底膜和黏膜下层等主要组织结构均被保留。采用阿利新蓝染色对ECM内GAG进行评估，染色显示脱细胞处理后基质内GAG出现缺损，且随着DNase I浓度增加GAG缺损进一步扩大，8KU组基质内GAG含量损耗最多，着色最浅。
2脱细胞化的效果
DAPI染色结果如图3所示，对照组原生气管黏膜上可见密集的蓝色荧光，管腔上皮存在大量高度浓缩的DNA碎片，黏膜下层、软骨和外膜内也存在大量散在分布的蓝色荧光。脱细胞后黏膜、黏膜下层和外膜细胞核基本完全去除，未发现残留DNA碎片，而软骨内仍可见较多的残留DNA荧光染色。随着DNase I浓度的增加，荧光信号的强度逐渐减弱，6KU组荧光信号暗淡，DNA残留量明显下降，8KU组软骨区域内蓝色荧光信号基本消失，软骨环内DNA几乎被完全清除。
为了进一步评估脱细胞的效果，进行DNA定量分析，结果如图4中A小图所示，与对照组原生气管(447.51±20.76ng/mg)相比，6KU组支架内DNA残留含量(46.52±5.11ng/mg，p<0.05)显著下降，8KU组DNA残留量(12.57±7.31ng/mg，p<0.05)进一步减少。
如图3所示，免疫组化染色显示对照组MHC-I和MHC-II表达阳性，主要分布在气管黏膜上皮细胞内，脱细胞处理后气管支架内无主要组织相容性复合物(MHC-I和MHC-II)残留。
3细胞外基质定量
sGAG定量分析显示，真空脱细胞处理后sGAG含量出现大量损耗，如图4中B小图所示。与对照组(20.82±1.63ug/mg)相比，6KU组(6.62±0.66ug/mg，p<0.05)sGAG含量明显下降，而随着脱细胞过程中DNase I浓度的增加，8KU组(3.72±0.85ug/mg)sGAG含量进一步丢失。
II型胶原定量分析结果如图4中C小图所示，2KU组、4KU组和6KU组II型胶原的含量(2.61±0.85ng/mg、2.64±0.34ng/mg和2.45±0.65ng/mg，p>0.05)与对照组(2.67±1.15ng/mg)相比无明显差异，8KU组II型胶原的含量(2.23±0.18ng/mg，p<0.05)较对照组相比有一定损失，与DEM脱细胞一致。
4扫描电镜
扫描电子显微镜(SEM)观察脱细胞化前后气管三维结构和ECM微观结构的改变。如图5所示，镜下可见对照组管腔表面存在大量纤毛，摆动一致，2KU、4KU、6KU和8KU组基质管腔表面纤毛均被去除。真空脱细胞处理后各组脱细胞基质保留组织的层次结构，基质基底膜较完整，但随着脱细胞过程中DNase I浓度的增加，6KU组基底膜出现较多细小缝隙、胶原纤维暴露，8KU组基底膜裂隙进一步扩大、结构疏松。
5生物力学特性
支架机械性能的维持是气管组织工程体内移植的重要指标。为了评估真空脱细胞过程是否损害支架的力学性能，将不同DNase I浓度处理的支架与对照组气管进行比较。结果显示真空脱细胞处理后兔气管的抗压缩性能减弱，压缩50％变形应力(N)逐步降低，且随着DNase I浓度的增加浓度增高，8KU组则力学性能下降更加明显，如图4中D小图所示。压缩后各组气管支架均能恢复至测试前相似形态。
6脱细胞气管的细胞相容性
脱细胞支架的生物相容性亦是气管支架体内移植的重要指标，通过体外细胞增殖试验对支架的生物相容性进行初步评估。骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有多种分化潜能，易于分离、纯化和增殖，是组织工程种子细胞的重要来源。在体外将BMSC接种于支架内表面进行细胞增殖试验，CCK-8实验结果显示，各组细胞数量在第1-7天内持续增加。分析各组OD值，可见与对照组相比，6KU组和8KU组细胞数明显增多，表明经真空脱细胞处理后气管基质的生物相容性增加，支持细胞在其表面粘附、生长及增殖，如图6所示。
7脱细胞支架的体内反应
为进一步评估真空下不同DNase I浓度处理后支架的生物相容性，将支架包埋于SD大鼠大网膜内，术后30d取出，如图7中A小图所示。实验过程中大鼠行为正常，无不良反应，无死亡和植入物排出迹象。30d后移植物从受体大网膜内取出，可见脱细胞气管支架表面有肉眼可见的新生血管附着，表面光洁，移植物周围有受体组织渗入，无化脓感染现象，如图7中B小图所示。组织学分析显示，体内移植实验后对照组和各脱细胞组气管移植物周围均有相似的中性粒细胞反应，如图8所示。CD68染色结果表明，各脱细胞组CD68染色呈阴性，几乎无巨噬细胞浸润，而对照组原生气管内可见较多巨噬细胞浸润，排斥反应较重，如图8所示。CD31免疫荧光染色进一步证实6KU组支架表面可见较明显的新生血管浸润，血管化效果较好，如图7C所示。
结论
本实施方式在保证脱细胞效果和不增加化学试剂前提下，通过加入真空技术和提高脱细胞过程中DNase I浓度，负压下加快去污剂和酶进入气管组织的效率，缩短气管脱细胞支架的制备时间并且提高了脱细胞效果。
组织学分析显示脱细胞处理后，各组气管层次结构保持不变，非软骨细胞被有效去除。免疫组化染色结果表明各脱细胞组主要组织相容性复合体染色阴性。6KU DNase I组DAPI染色显示仅需1个脱细胞周期兔气管软骨内细胞几乎被完全清除，每mg湿重ECM含DNA残留量均值为46.52ng dsDNA，8KU DNase I组DAPI染色显示软骨环内无荧光信号，H&E染色证实脱细胞支架软骨环内未见软骨细胞，每mg ECM内DNA残留量均值仅为12.57ng dsDNA。脱细胞支架内DNA含量的临床应用标准是组织DNA残留量为50ng/mg。6KU DNase I组和8KUDNase I组真空辅助脱细胞后支架DNA残留量均达到此标准，而且进一步加快了脱细胞的过程，从气管获取到脱细胞完成仅需2d。这些结果证明真空辅助法比常压下脱细胞的效率更快，DNase I浓度优化后脱细胞效果也比常规DEM处理更彻底，本研究缩短了脱细胞周期，提高了气管脱细胞的效率。
良好的生物相容性是支架进行体内移植的关键指。应用于临床气管替代治疗的方案采用自体细胞进行支架重建，包括上皮细胞、间充质基质细胞(MSCs)和MSCs来源的软骨细胞。因此，脱细胞支架在保证脱细胞效果的前提下，支持细胞粘附和增殖也是至关重要的。
扫描电镜显示6KU组基底膜出现较小缝隙，8KU组基底膜缝隙变大，可见胶原纤维暴露。真空脱细胞后，各组细胞基质内糖氨聚糖含量明显降低，Ⅱ型胶原含量未有明显变化，6KU组脱细胞支架具有良好细胞相容性。CCK-8试验结果显示兔气管经过真空下不同DNase I浓度处理后，支架的细胞生物相容性均得到一定的改善，支持BMSCs粘附和增殖。体内移植时，受体的巨噬细胞在体内脱细胞支架的免疫应答中起关键作用。CD68免疫组化染色证实真空DNase I脱细胞后，脱细胞支架的免疫原性被有效去除，具有良好的体内生物相容性，除对照组外，未见各脱细胞支架内巨噬细胞表达。
本研究的体内实验采用异种异体大网膜包埋，30d后将兔气管脱细胞支架从大鼠大网膜内取出，6KU DNase I组支架表面可见新生血管附着，CD31染色也进一步证实支架内有新生血管浸润。实验证明真空辅助下优化DNase I浓度方案制备的脱细胞支架支持血管快速生成反应和良好的生物相容性。
综上，6KU组为效果最为理想的实验组。临床上人气管供体是非常紧缺的，而异种移植可为这一问题提供有效解决方案。本研究通过兔气管脱细胞支架异种异体大网膜包埋实验的探究，希望可以为未来解决临床气管供体短缺问题提供一些数据支持。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。

Claims (5)

1.一种快速制备脱细胞气管支架的方法，其特征在于，具体制备步骤为：
(1)使用无底物的一次性真空采血管作为容器进行脱细胞处理，通过配备显示器的真空泵将该容器抽真空至1/2标准大气压；
(2)将无菌分离获取的气管在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解，在4％脱氧胆酸钠溶液中孵育，用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，置于含有6KU/mL DNaseI的NaCl溶液中，摇床孵育，将样本转移至磷酸缓冲盐溶液中后于室温下超声，随后磷酸缓冲盐溶液冲洗3次去除组织碎片。
2.如权利要求1所述的一种快速制备脱细胞气管支架的方法，其特征在于，步骤(2)中，在4℃无菌蒸馏水中渗透溶解的时间为24h。
3.如权利要求1所述的一种快速制备脱细胞气管支架的方法，其特征在于，步骤(2)中，在4％脱氧胆酸钠溶液中孵育的时间为4h。
4.如权利要求1所述的一种快速制备脱细胞气管支架的方法，其特征在于，步骤(2)中，NaCl溶液的浓度为1mol/L。
5.如权利要求1所述的一种快速制备脱细胞气管支架的方法，其特征在于，摇床孵育过程是在真空负压环境下、于37℃、100r/min的条件下进行的，孵育时间为12-24h。
CN202010978119.1A 2020-09-17 2020-09-17 一种快速制备脱细胞气管支架的方法 Pending CN112190758A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010978119.1A CN112190758A (zh) 2020-09-17 2020-09-17 一种快速制备脱细胞气管支架的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010978119.1A CN112190758A (zh) 2020-09-17 2020-09-17 一种快速制备脱细胞气管支架的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN112190758A true CN112190758A (zh) 2021-01-08

Family

ID=74015266

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010978119.1A Pending CN112190758A (zh) 2020-09-17 2020-09-17 一种快速制备脱细胞气管支架的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112190758A (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014202958A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 Videregen Limited Implant and method of producing an implant by decellularising an tissue by perfusion under negative pressure
CN106581770A (zh) * 2016-12-29 2017-04-26 北京桀亚莱福生物技术有限责任公司 一种硬脑膜补片、制备方法及在硬脑膜损伤修复中的应用
CN108904884A (zh) * 2018-08-07 2018-11-30 中国人民解放军第二军医大学 一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法
CN109954164A (zh) * 2019-04-02 2019-07-02 扬州大学 一种制备兔脱细胞气管基质的方法
CN111084904A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 中南大学湘雅医院 一种组织工程支架的脱细胞方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014202958A1 (en) * 2013-06-17 2014-12-24 Videregen Limited Implant and method of producing an implant by decellularising an tissue by perfusion under negative pressure
CN106581770A (zh) * 2016-12-29 2017-04-26 北京桀亚莱福生物技术有限责任公司 一种硬脑膜补片、制备方法及在硬脑膜损伤修复中的应用
CN108904884A (zh) * 2018-08-07 2018-11-30 中国人民解放军第二军医大学 一种猪主动脉脱细胞基质的制备方法
CN109954164A (zh) * 2019-04-02 2019-07-02 扬州大学 一种制备兔脱细胞气管基质的方法
CN111084904A (zh) * 2019-12-31 2020-05-01 中南大学湘雅医院 一种组织工程支架的脱细胞方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
COLIN R. BUTLER等: "Vacuum-assisted decellularization: an accelerated protocol to generate tissue-engineered human tracheal scaffolds", 《BIOMATERIALS》 *
P. LANGE等: "Pilot study of a novel vacuum-assisted method for decellularization of tracheae for clinical tissue engineering applications", 《JOURNAL OF TISSUE ENGINEERING AND REGENERATIVE MEDICINE》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Partington et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds
Baiguera et al. Development of bioengineered human larynx
Zhao et al. The development of a tissue-engineered artery using decellularized scaffold and autologous ovine mesenchymal stem cells
Baiguera et al. Tissue engineered human tracheas for in vivo implantation
Haag et al. Biomechanical and angiogenic properties of tissue-engineered rat trachea using genipin cross-linked decellularized tissue
Berg et al. RETRACTED: replacement of a tracheal stenosis with a tissue-engineered human trachea using autologous stem cells: a case report
Baiguera et al. Dynamic decellularization and cross-linking of rat tracheal matrix
Sun et al. Structural integrity, immunogenicity and biomechanical evaluation of rabbit decelluarized tracheal matrix
AU2014283031B2 (en) Implant and method of producing an implant by decellularising an tissue by perfusion under negative pressure
Friedrich et al. Residual sodium dodecyl sulfate in decellularized muscle matrices leads to fibroblast activation in vitro and foreign body response in vivo
Friedrich et al. Preservation of aortic root architecture and properties using a detergent-enzymatic perfusion protocol
Tan et al. Human amnion as a novel cell delivery vehicle for chondrogenic mesenchymal stem cells
JP5881711B2 (ja) 無細胞血管製品
Wang et al. Rapid preparation method for preparing tracheal decellularized scaffolds: vacuum assistance and optimization of DNase I
US20200121828A1 (en) Bioactive scaffold for inducting tendon regeneration, preparation method therefor and use thereof
Li et al. Highly interconnected inverse opal extracellular matrix scaffolds enhance stem cell therapy in limb ischemia
Inglis et al. Harnessing human decellularized blood vessel matrices and cellular construct implants to promote bone healing in an ex vivo organotypic bone defect model
CN109954164B (zh) 一种制备兔脱细胞气管基质的方法
JP2008228744A (ja) 生体由来移植用組織の石灰化を抑制するための処理方法および処理された組織
Kiani et al. Formation of organoid-like structures in the decellularized rat testis
CN114870088B (zh) 一种Wnt信号激活骨细胞脱细胞基质及其表衬的骨修复支架的制备方法与应用
Singh et al. Establishment of decellularized extracellular matrix scaffold derived from caprine pancreas as a novel alternative template over porcine pancreatic scaffold for prospective biomedical application
CN112190758A (zh) 一种快速制备脱细胞气管支架的方法
Zhao et al. In vitro study of bioactivity of homemade tissue-engineered periosteum
Xiao et al. Novel perfusion-decellularized method to prepare decellularized ureters for ureteral tissue-engineered repair

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20210108