KR102181811B1

KR102181811B1 - 조직의 탈세포화 방법

Info

Publication number: KR102181811B1
Application number: KR1020180056623A
Authority: KR
Inventors: 김재광
Original assignee: 재단법인 아산사회복지재단
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2020-11-23
Also published as: KR20190131790A; WO2019221564A1

Abstract

본 발명은 재생 의료에서 사용되는 조직의 탈세포화를 위한 것으로, 본 발명의 실시예에 따른 조직의 탈세포화 방법은, 탈세포화 대상이 되는 조직을 준비하는 단계와, 상기 조직에 포함된 세포를 제거하기 위하여, 계면활성제를 포함하는 제 1 탈세포액으로 상기 조직을 1차로 처리하는 제 1 세포제거 단계와, 상기 제 1 세포제거 단계를 진행한 상기 조직에 포함된 DNA 및 RNA를 제거하기 위하여, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소가 포함된 제 2 탈세포액으로 상기 조직을 2차로 처리하는 제 2 세포제거 단계;를 포함할 수 있다.

Description

조직의 탈세포화 방법{Method for Decellularization of Tissue}

본 발명은 재생의료에서 사용되는 외부 조직의 탈세포화를 위한 것으로, 보다 구체적으로 계면활성제와 핵산 분해효소 등을 사용하여 탈세포화 효과가 우수하며, 탈세포화시 조직의 손상도 최소화될 수 있는 조직의 탈세포화 방법에 관한 것이다.

인공적으로 장기를 재생하기 위하여 세포가 배양되는 지지체를 형성하는 방법의 하나로 동물이나 사람의 조직 또는 장기에서 세포를 제거한 후 환자에게 이식할 세포를 배양하는 것이 하나의 방법으로 제시되고 있다. 이를 위하여, 기존의 생체장기에서 세포를 제거하고 환자의 세포 또는 면역조절이 가능한 세포를 접종 (seeding)한 후 원래의 장기 모양으로 형성을 유도하는 방법이 제시되었다. 기존의 장기에서 세포를 제거하는 과정을 탈세포화라고 하며, 세포를 다시 배양하는 것을 재세포화라고 한다. 탈세포화 과정의 주된 목적은 장기의 원래 혈관구조 등을 온전히 유지하면서 세포가 제거된 세포외지지체(Extracellular matrix)를 획득하는 것이다.

한편, 타인 또는 이종의 동물의 생체 조직 유래의 이식편을 이식하는 경우, 피-이식자 측의 조직에서 이식편의 거부 반응이 문제가 된다. 이러한 문제의 해결 방법으로서, 인공 조직의 개발이 기대되고 있다. 소재로서 다양한 고분자가 시도되고 있지만, 이러한 소재와 생체 조직과의 적합성이 낮기 때문에, 이식편과 생체 조직과의 접합 부위에 있어서 탈락(떨어짐, 脫落) 또는 감염증이 발생하는 경우가 있다. 그래서, 생체 조직과의 적합성을 향상시키기 위해, 생체 조직으로부터 세포를 제거(removing)하여 잔존하는 지지 조직인 탈세포화 생체 조직을 이식편으로서 사용하는 기술이 개발되어 왔다

공개특허공보 제10-2017-0143465호

한편, 재생 의료에 있어서 탈세포화 조직을 사용하는 경우에는, 거부 반응이 없는 것에 더하여, 조직의 재생을 빠르게 수행할 수 있는지의 여부가 문제된다. 동일한 생체에서 유래한 생체 조직으로부터 수득한 탈세포화 조직으로서, 동일한 정도로 세포가 제거된 탈세포화 조직이라도, 탈세포화의 방법 또는 단계가 다른 경우에는, 탈세포화 조직으로의 숙주 세포의 접착성, 숙주 세포의 유인 효과, 탈세포화 조직 내로의 숙주 세포의 침윤 등의 속도에 차이가 있는 경우가 있어, 조직의 재생에 큰 영향이 있었다.

본 발명이 해결하고자 하는 과제는 탈세포 효과가 탁월하면서도, 탈세포화시 조직의 손상이 방지되는 조직의 탈세포화 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기 해결하려는 과제를 달성하기 위한 본 발명의 일 실시예에 따른 조직의 탈세포화 방법은, 탈세포화 대상이 되는 조직을 준비하는 단계와, 상기 조직에 포함된 세포를 제거하기 위하여, 계면활성제를 포함하는 제1 탈세포액으로 상기 조직을 1차로 처리하는 제1 세포제거 단계와, 상기 제1 세포제거 단계를 진행한 상기 조직에 포함된 DNA 및 RNA를 제거하기 위하여, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소가 포함된 제2 탈세포액으로 상기 조직을 2차로 처리하는 제2 세포제거 단계를 포함할 수 있다.

상기 계면활성제는 양쪽성 또는 비이온성 계면활성제이다.

상기 양쪽성 계면활성제는 알킬디메틸아민 옥시드(alkyldimethylamine oxide), 알킬카르복시베타인(akylcarboxybetaine), 알킬아미드프로필베타인(alkylamidopropylbetaine), 알킬아미드프로필술포베타인(alkylamidopropylsulfobetaine), 알킬이미다졸베타인(alkylimidazoliumbetaine), 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산염(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate, CHAPSO) 및 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산염((3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS)에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합이다.

상기 비이온성 계면활성제는, 글리세린 지방산 에스테르, 솔비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 트리할로오스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르(polyoxyethylenealkylether), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌에테르, 알킬(폴리)글리세린에테르, 지방산알칸올아미드, 폴리옥시에틸렌지방산알칸올아미드, 알킬(폴리)글리코시드, 알킬말토오시드(alkylmaltoside), 알킬티오글리코시드(alkylthioglycoside), 알킬말토피라노시드(alkylmaltopyranoside), 알카노일-N-메틸-D-글루코사민(alkanoyl-N-methyl-D-glucosamine), N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)콜아미드(N,N-bis(3-D-gluconamidepropyl)colamide(BIGCHAP) 및 N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)데옥시콜아미드(N,N-bis(3-D-gluconamidepropyl)deoxycolamide, Deoxy-BIGCHAP)에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합이다.

상기 제1 탈세포액은 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질분해 억제제와, TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼, TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 제1 버퍼액을 더 포함할 수 있다.

상기 제2 탈세포액은 TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼, TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 제2 버퍼액을 더 포함할 수 있다.

상기 제2 탈세포액 전체에서, 상기 DNA 분해효소 5 내지 15㎍/ml이 포함될 수 있다.

상기 제2 탈세포액 전체에서, 상기 RNA 분해효소 150 내지 250㎍/ml이 포함될 수 있다.

상기 조직준비 단계와 상기 제1 세포제거 단계 사이에, 상기 조직을 세척액으로 세척하는 제1 세척단계를 더 포함할 수 있다.

상기 세척액은 증류수와 항생제를 포함할 수 있다.

상기 제1 세포제거 단계와 상기 제2 세포제거 단계 사이에, 1차로 처리된 상기 조직을 식염수로 세척하는 제2 세척단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 의할 경우, 탈세포 효과가 탁월하면서도, 탈세포화시 조직의 손상이 방지되는 조직의 탈세포화 방법이 제공된다.

도 1은 본 발명의 실시예에 따른 조직의 탈세포화 방법을 나타낸 순서도이다.
도 2 내지 도 4는 탈세포화를 나타낸 실험결과이다.
도 5 내지 도 9는 탈세포화 과정에서 조직의 손상여부를 나타낸 실험결과이다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 아래 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시를 위한 구체적인 내용을 상세히 설명한다. 도면에 관계없이 동일한 부재번호는 동일한 구성요소를 지칭하며, "및/또는"은 언급된 아이템들의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소 외에 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.

다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다.

이하, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직의 탈세포화 방법을 설명한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 조직의 탈세포화 방법을 나타낸 순서도이다. 도 1을 참고하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 조직의 탈세포화 방법은, 조직준비 단계와, 제1 세척단계, 제1 세포제거 단계와, 제2 세척단계와, 제2 세포제거 단계를 포함할 수 있다. 이하에서는 각 단계를 구체적으로 설명한다.

먼저, 탈세포화의 대상이 되는 조직을 준비한다(S10).

본 발명의 탈세포화 조직에 사용하는 생체 조직은, 척추 동물 유래의 본 발명의 탈세포화 조직에 사용되는 생체 조직은 척추 동물 유래의 생체 조직이라면, 특히 한정되지 않지만, 거부반응이 적은 것으로부터, 포유류 또는 조류 유래의 생체 조직이 바람직하며, 구하기 용이한 것으로부터, 포유류인 가축, 조류인 가축 또는 사람 유래의 생체 조직이 보다 바람직하다. 포유류의 가축으로서는, 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니피그, 랫드 , 마우스, 다람쥐, 아메리카너구리 등을 들 수 있다. 또한, 조류의 가축으로서는, 잉꼬, 앵무새, 닭, 오리, 칠면조, 거위, 뿔닭(helmeted guinea fowl), 꿩, 타조, 메추라기, 에뮤(emu) 등을 들 수 있다. 이들 중에도, 안전성의 관점에서, 소, 돼지, 토끼, 사람의 생체 조직이 바람직하다.

생체 조직의 부위로서는, 세포 외의 매트릭스 구조를 가지는 부위가 사용되며, 이러한 부위로서는, 예를 들면, 간장, 신장, 요관, 방광, 요도, 혀, 편도, 식도, 위, 소장, 대장, 항문, 췌장, 심장, 혈관, 비장, 폐, 뇌, 뼈, 척수, 연골, 정소, 자궁, 난관, 난소, 태반, 각막, 골격근, 건, 신장, 피부 등을 들 수 있다. 생체 조직의 부위로서는, 조직 재생의 효과가 높은 것으로부터, 연골, 뼈, 간장, 신장, 심장, 심막, 혈관, 피부, 소장점막하조직, 폐, 뇌, 및 척수가 바람직하다.

예를 들어, 준비된 조직은 좌골신경 조직일 수 있다. 구체적으로, 탈세포화 시키기 위한 좌골신경 조직은 랫드 의 신경 조직으로부터 획득될 수 있다. 수급이 용이한 SD (Sprague-Dawley) 랫드 의 좌골신경조직 을 이용하며, 랫드의 허벅지 피부 및 근육을 절개한 후 좌골신경 조직을 획득할 수 있다.

다음으로, 준비된 조직을 세척한다(S20). 조직에 잔류하는 혈액이나 불순물 등을 제거하기 위하여, 준비된 조직을 세척한다. 세척은 이후에도 추가로 진행되는 바, 현 단계의 세척단계를 편의상 제 1 세척단계라 한다.

제1 세척단계에서는 조직을 증류수를 포함하는 세척액으로 세척할 수 있다. 보다 구체적으로, 제1 세척단계는 이차 증류수(double distilled water)를 이용할 수 있다. 여기서 이차 증류수는 세포질에 비해 삼투압이 낮기 때문에 세포의 용혈 현상을 유도할 수 있다. 그리고 동물의 조직을 원재료로 사용하므로 세척액은 살균과 소독을 위해 항생제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항생제로는 페니실린 스트랩토마이신(penicillin/streptomycin)이 사용될 수 있다. 항생제는 세척액 전체에 대해 0.5% 내지 2.0%의 농도로 포함될 수 있다. 항생제의 농도가 0.5% 미만인 경우, 항생제의 항생효과가 충분히 발휘되니 못할 수 있다. 항생제의 농도가 2.0%를 초과할 경우, 초과된 만큼에 대한 항생효과가 현저하지 않을 수 있다. 즉, 2.0%의 농도와 이를 초과한 농도 간에 항생효과 차이가 크지 않다.

제1 세척단계는 대략 7시간 이내로 수행될 수 있다. 이러한 과정을 통해 준비된 조직에 잔류하는 혈액이나 불순물이 1차로 제거된다.

계속해서 세척된 조직에서 세포를 제거하기 위해, 계면활성제를 포함하는 제1 탈세포액으로 세척된 조직을 1차로 처리한다. 1차 처리를 편의상 제1 세포제거 단계라 한다(S30).

제1 세포제거 단계에서는 준비된 조직을 제1 탈세포액으로 처리하는데, 제1 탈세포액은 계면활성제, 단백질분해 억제제 및 이들을 용해시키는 제1 버퍼액을 포함할 수 있다.

계면활성제는 양친성을 갖기 때문에 조직의 세포막과 핵막을 용해하여 세포를 제거할 수 있다. 계면활성제는 이온성 및 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있고, 이온성 계면활성제는 음이온성, 양이온성, 양쪽성 계면활성제로 이루어질 수 있다. 여기서, 음이온성 계면활성제는 친수성 부분이 음이온 원자단인 경우이고, 양이온성 계면활성제는 동일 분자 내에 양이온기와 음이온기 양쪽을 갖는 계면활성제이다. 한편, 비이온성 계면활성제는 물에 이온화되지 않고 용해되는 계면활성제이다. 일반적으로, 이온성 계면활성제는 친수성기에 양이온이나 음이온을 띄는 작용기를 가지고 있어, 비이온성 계면활성제에 비해 상대적으로 강한 계면활성 작용을 가질 수 있다. 이 가운데, 양쪽성 계면활성제와 비이온성 계면활성제가 사용되는 것이 바람직하다.

한편, 음이온성 계면활성제는 지방산 비누(fatty acid soap), 알콕시카르복시산염(alkoxycarboxylate), 폴리옥시에틸렌알콕시카르복시산염(polyoxyethylenealkoxycarboxylate), 알킬술폰산염(alkylsulfonate), 알킬벤젠술폰산염(alkylbenzenesulfonate), 알킬술폰산 에스테르염(alkylsulfuric acid ester), 폴리옥시에틸렌알킬술폰산 에스테르염(polyoxyethylenealkylsulfuric acid ester), 알킬황산 에스테르염(alkyl phosphoric acid ester), α-술포지방산 에스테르염(α-Sulfofatty acid ester), N-아실글루타민산염(N-acylglutaminate), 아실-N-메틸타우린(acyl-N-methyltaurate), N-알킬사르코신염(N-alkylsarcosine), 콜산염(cholate), 데옥시콜산염(deoxycholate) 에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.

양이온성 계면활성제는 알킬디메틸아민(alkyldimethylamine), 알킬디에탄올아민(alkyldiethanolamine), 알킬트리에틸암모늄 염(alkyltriethylammonium salt), 디알킬디메틸암모늄 염(dialkyldimethylammonium salt), 알킬피리듐염(alkylpyridium salt), 알킬벤질디메틸암모늄 염(alkylbenzyldimethylammonium salt)에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.

양쪽성 계면활성제는 알킬디메틸아민 옥시드(alkyldimethylamine oxide), 알킬카르복시베타인(akylcarboxybetaine), 알킬아미드프로필베타인(alkylamidopropylbetaine), 알킬아미드프로필술포베타인(alkylamidopropylsulfobetaine), 알킬이미다졸베타인(alkylimidazoliumbetaine), 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산염(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate, CHAPSO), 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산염((3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS)에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.

비이온성 계면활정세는 글리세린 지방산 에스테르, 솔비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 트리할로오스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르(polyoxyethylenealkylether), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌에테르, 알킬(폴리)글리세린에테르, 지방산알칸올아미드, 폴리옥시에틸렌지방산알칸올아미드, 알킬(폴리)글리코시드, 알킬말토오시드(alkylmaltoside), 알킬티오글리코시드(alkylthioglycoside), 알킬말토피라노시드(alkylmaltopyranoside), 알카노일-N-메틸-D-글루코사민(alkanoyl-N-methyl-D-glucosamine), N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)콜아미드(N,N-bis(3-D-gluconamidepropyl)colamide(BIGCHAP), N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)데옥시콜아미드(N,N-bis(3-D-gluconamidepropyl)deoxycolamide, Deoxy-BIGCHAP)에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합일 수 있다.

제1 탈세포액에 포함된 단백질분해 억제제는 세포제거시 조직에 포함된 단백질이 분해되는 것을 방지할 수 있다. 예를 들어, 세포외 기질의 다양한 단백질과 당단백질 등의 손상을 최소화시킬 수 있다. 단백질 분해 억제제로는 류펩틴(leupeptin) 또는 아프로티닌(aprotinin)이 사용될 수 있다.

제1 탈세포액은 제1 버퍼액을 포함할 수 있다. 제1 버퍼액은 계면활성제와 단백질 분해 억제제가 용해되는 베이스로 작용한다. 제1 버퍼액으로 예를 들어, TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼 및 TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나가 사용될 수 있다.

제1 탈세포액으로 준비된 조직에 대해 1차 처리가 진행되면, 파괴된 세포의 부산물이나 조직에 잔류하는 불순물을 제거하기 위하여 제2 세척단계(S40)를 진행한다.

제2 세척단계에서 세척에 사용되는 세척액은 증류수에 NaCl이 포함된 용액일 수 있다. NaCl은 예를 들어, 1M의 농도이다. 또한 세척액에는 살균과 소독을 위해 항생제가 포함될 수 있다. 예를 들어, 항생제로는 페니실린 스트랩토마이신(penicillin/streptomycin)이 사용될 수 있다.

계속해서, 제1 세포제거 단계를 진행한 상기 조직에 포함된 DNA 및 RNA를 제거하기 위하여, DNA 분해효소 및 RNA 분해효소가 포함된 제2 탈세포액으로 상기 조직을 2차로 처리하는 제1 세포제거 단계(S50)를 진행한다.

제2 세포제거 단계에서 사용되는 제2 탈세포액은 제2 버퍼액과 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소를 포함한다.

제2 버퍼액은 DNA 분해효소 및 RNA 분해효소가 용해되는 베이스로 작용한다. 버퍼액으로는 예를 들어, TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼 및 TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나가 사용될 수 있다.

DNA 분해효소 및 RNA 분해효소는 각각 DNA 성분과 RNA 성분을 분해하여, 이들의 소거를 돕는다. DNA 분해효소는 제2 탈세포액 전체에서 5 내지 15㎍/ml가 포함될 수 있다. DNA 분해효소의 함량이 5㎍/ml 미만이면, 조직 내의 DNA 성분을 충분히 분해하기 어려울 수 있다. DNA 분해효소의 함량이 15㎍/ml를 초과하면, 초과되는 함량대비 이상으로 DNA 성분을 분해하는 효과가 발현되지 않을 수 있다.

한편, RNA 분해효소는 제2 탈세포액 전체에서 150 내지 250㎍/ml가 포함될 수 있다. RNA 분해 효소의 함량이 150㎍/ml 미만이면, 조직 내의 DNA 성분을 충분히 분해하기 어려울 수 있다. RNA 분해효소의 함량이 250㎍/ml를 초과하면, 초과되는 함량대비 이상으로 RNA 성분을 분해하는 효과가 발현되지 않을 수 있다.

필요에 따라, 제 1 또는 제 2 탈세포액은 킬레이트제 및/또는 유기용제를 추가로 포함할 수 있다.

킬레이트제는 탈세포화 조직 중의 칼슘 이온이나 마그네슘 이온을 불활성화하는 것으로 인해, 분 발명의 입자화 탈세포화 조직을 질환 부위에 적용하는 경우의 석회화를 방지하는 것이 가능하다.

킬레이트제로는 에틸렌디아민4산(EDTA), 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid, NTA), 디에틸렌트리아미네펜타-아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA), 히드록시에틸에틸렌디아민 트리아세트산(hydroxyethylethylenediamine triacetic acid, HEDTA), 트리에틸렌테트라민 헥사아세트산(Triethylenetetramine hexaacetic Acid, TTHA), 1,3-프로판디아민 테트라아세트산(1,3-Propanediamine tetraacetic acid, PDTA), 1,3-디아미노-2-히드록시프로판 테트라아세트산(1,3-diamino-2-hydroxypropane tetraacetic acid, DPTA-OH), 히드록시에틸렌이미노 디아세트산(hydroxyethyleneimino diacetic acid, HIDA), 디히드록시에틸글리신(dihydroxyethylglycine, DHEG), 글리콜에테르디아민 테트라아세트산(glycol ether diamine tetraacetic acid, GEDTA), 디카르복시에틸글루타민산(dicarboxyethyl-glutamic acid, CMGA), 3-히드록시-2,2'-이미노디숙신산(3-hydroxy-2,2'-iminodisuccinic acid, HIDA), 디카르복실에틸아스파르트산(dicarboxylethylaspartic acid, ASDA)등의 이미노카르본산(iminocarboxylic acid)계 킬레이트제 또는 이의 염; 구연산 , 주석산, 사과산(malic acid), 젖산 등의 히드록시칼본산 계 킬레이트제 또는 이의 염등이 사용될 수 있다.

유기용제는 지질의 제거 효과가 높은 것으로, 수용액의 유기용제가 바람직하며, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 디메틸술폭시드(Dimethyl sulfoxide)가 바람직하다.

제2 세포제거 단계를 거친 조직에 대해, 세포 제거 후, 조직에 잔류하는 불순물을 제거하기 위하여, 세척액으로 조직을 세척할 수 있다. 세척작업은 상술한 제1 세척단계와 유사하게, 항생제가 포함된 증류수를 이용하여 세척작업을 진행할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예: 신경조직 준비 및 탈세포화 진행

신경조직의 탈세포화를 진행하기 위하여, 신경 조직을 랫드 로부터 획득하였다. 수급이 용이한 SD (Sprague-Dawley) 랫드의 좌골신경 조직을 이용하며, 랫드 의 허벅지 피부 및 근육을 절개하여 좌골신경 조직을 획득하였다. 획득한 신경 조직을 1mm*20mm 정도의 사이즈로 준비하였다.

준비된 신경조직을 바탕으로 하기 표 1의 조건 및 단계로 실험을 진행하였다. 시약들은 sigma사에서 시판하는 제품을 사용하였다.

[표 1]

*제1 세척: 7시간동안 상온에서 진행

*제1 세포제거: 계면활성제를 이용하여 24시간 동안 상온에서 진행

*제2 세척: 1M의 NaCl용액으로 15시간동안 상온에서 진행

*제2 세포제거: 실시예 - DNA/RNA 분해효소로 24시간 동안 37℃에서 진행

비교예 - 계면활성제를 이용하여 24시간 동안 진행(상온)

*보관: PBS(phosphate buffered saline)로 세척후 보관(상온)

실험예 1: 탈세포화 여부 측정

상기 실시예들에 의해 진행된 신경 조직의 탈세포화 정도를 측정하였다. 탈세포화가 진행된 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 조직에 대해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 염색처리를 하였다. 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2를 확인하면, 본 발명의 일 실시예에 따라 탈세포화 처리된 조직에서는, DAPI에 의해 염색된 세포 핵이 거의 발견되지 않았다. 반면에 도 3을 확인하면, 비교예에 의해 처리된 조직에서는 DAPI에 의해 염색된 세포 핵이 실시예에 비해 다수 발견되었음을 확인할 수 있었다.

한편, 도 4를 참조하면, 실시예에 의해 처리된 조직에서는 비교예에 의해 처리된 조직에 비해 DNA 함량과 면적당 핵의 수가 현저히 적다는 것을 알 수 있었다. 즉, 본 발명의 실시예에 의할 경우, 조직 내의 탈세포화가 현저함을 알 수 있었다.

실험예 2: 탈세포화 처리과정에서 조직의 유지 여부 측정

상기 실시예들에 의해 진행된 탈세포화 처리 후, 신경 조직의 유지여부를 측정하였다. 이를 위해, 탈세포화가 진행된 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 조직에 대해 공지의 H&E 염색을 이용하여 염색처리를 하였다. 그 결과를 각각 도 5 및 도 6에 나타내었다.

도 5를 확인하면, 본 발명의 일 실시예에 따라 탈세포화 처리된 조직은 조직의 깨짐이 거의 없이 탈세포화가 진행되었음을 알 수 있었다. 반면에 도 6을 확인하면, 비교에에 의해 처리된 조직에서는 비교적 조직의 깨짐이 실시예에 비해 현저히 나타났음을 알 수 있었다.

한편, 신경 조직내 extracellular matrix가 보존되는지 여부를 측정하기 위하여, 실시예 1 내지 2 및 비교예 1 내지 3의 조직에 대해 공지의 laminin 항체를 이용한 염색을 진행하였다. 그 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타내었다.

도 7을 확인하면, 본 발명의 일 실시예에 따라 탈세포화 처리된 조직에서는 조직내 extracellular matrix가 비교적 잘 보존된 것을 확인할 수 있었다. 반면에 도 8을 확인하면, 비교예에 의해 처리된 조직에서는 실시예에 비해 조직내 extracellular matrix의 보존 상태가 좋지 않았다.

한편, 도 9를 참조하면, 실시예에 의해 처리된 조직에서는 비교예에 의해 처리된 조직에 비해 콜라겐 함량 및 조직 완성도가 더 높음을 알 수 잇었다. 즉, 본 발명의 실시예에 의할 경우, 조직이 유지되며, 탈세포화가 진행됨을 알 수 있었다.

결론적으로 본 발명의 일 실시예에 의할 경우, 탈세포화 효과가 우수하며, 탈세포화시 조직의 손상도 최소화됨을 알 수 있었다.

재생 의료에 있어서 탈세포화 조직을 사용하는 경우, 거부 반응이 없어야 하므로, 재생 조직의 탈세포화는 필수적이라 하겠다. 또한, 재생 조직의 이용시 조직의 기능이 원활하게 수행되려면, 탈세포화시 조직의 변형이나 소실이 최소로되어야 한다. 본 발명은 현저한 탈세포화 효과가 있고, 탈세포 진행시 조직의 손상도 최소화되므로, 재생 의료에 필수적으로 필요한 재생 조직의 제조에 최적화되어 있다고 하겠다.

이상 본 발명의 실시예들을 설명하였으나, 본 발명은 상기 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 제조될 수 있으며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

탈세포화 대상이 되는 포유류 조직을 준비하는 단계;
상기 조직에 포함된 세포를 제거하기 위하여, 양쪽성 계면활성제 및 류펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질분해 억제제를 포함하는 제1 탈세포액으로 상기 조직을 1차로 처리하는 제1 세포제거 단계; 및
상기 제1 세포제거 단계를 진행한 상기 조직에 포함된 DNA 및 RNA를 제거하기 위하여, DNA 분해효소 5 내지 15㎍/ml 및 RNA 분해효소 150 내지 250㎍/ml가 포함된 제2 탈세포액으로 상기 조직을 2차로 처리하는 제2 세포제거 단계;를 포함하는, 조직의 탈세포화 방법.
삭제
제1 항에 있어서,
상기 양쪽성 계면활성제는 알킬디메틸아민 옥시드(alkyldimethylamine oxide), 알킬카르복시베타인(akylcarboxybetaine), 알킬아미드프로필베타인(alkylamidopropylbetaine), 알킬아미드프로필술포베타인(alkylamidopropylsulfobetaine), 알킬이미다졸베타인(alkylimidazoliumbetaine), 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산염(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate, CHAPSO) 및 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산염((3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS)에서 선택된 어느 하나 또는 이들의 조합인 조직의 탈세포화 방법.
삭제
제1 항에 있어서,
상기 제1 탈세포액은 TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼, TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 제1 버퍼액을 더 포함하는 조직의 탈세포화 방법.
제1 항에 있어서,
상기 제2 탈세포액은 TNM(Tris NaCl MgCl2) 버퍼, PBS(Phosphate Buffered Saline) 버퍼, Tris-Cl 버퍼, SSC(Saline Sodium Citrate) 버퍼, HEN(Hepes EDTA Neocuproine) 버퍼, TEN(Tris EDTA NaCl) 버퍼 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된 제2 버퍼액을 더 포함하는 조직의 탈세포화 방법.
삭제
삭제
제1 항에 있어서,
상기 조직을 준비하는 단계와 상기 제1 세포제거 단계 사이에, 상기 조직을 세척액으로 세척하는 제1 세척단계를 더 포함하는 조직의 탈세포화 방법.
제9 항에 있어서,
상기 세척액은 증류수와 항생제를 포함하는 조직의 탈세포화 방법.
제1 항에 있어서,
상기 제1 세포제거 단계와 상기 제2 세포제거 단계 사이에, 1차로 처리된 상기 조직을 식염수로 세척하는 제2 세척단계를 더 포함하는 조직의 탈세포화 방법.