JP6515304B2 - 粒子状脱細胞化組織の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、再生医療や細胞培養等に好適に使用できる脱細胞化組織の製造方法に関する。
他人の生体組織由来の移植片を移植する場合、被移植者側組織による移植片の拒絶反応が問題となる。このような問題の解決方法として、人工組織の開発が期待されている。素材として種々の高分子が試されているが、これら素材と生体組織との適合性が低いため、移植片と生体組織との接合部位における脱落や感染症が発生する場合がある。そこで、生体組織との適合性を向上すべく、生体組織から細胞を除却して残存する支持組織である脱細胞化生体組織を移植片として使用する技術が開発されてきた。生体組織からの脱細胞方法としては、界面活性剤を使用する方法（例えば、特許文献１、２を参照）、酵素を使用する方法（例えば、特許文献３を参照）、酸化剤を使用する方法（例えば、特許文献４を参照）、超高静水圧処理による方法（例えば、特許文献５〜７を参照）等が知られている。
また、このような脱細胞化生体組織を粒状化または粉体化したもの（粒子状脱細胞化組織）も知られており、粒子状脱細胞化組織は、疾患部位に注入して疾患部位の再生・治癒を促したり、成形して移植片として使用されている（例えば、特許文献８〜１０を参照）。従来知られた粒子状脱細胞化組織は、界面活性剤を使用する方法で製造されているが、超高静水圧処理による方法により製造された粒子状脱細胞化組織は、知られていなかった。
特許文献１：特開昭６０−５０１５４０号公報
特許文献２：特表２００３−５１８９８１号公報
特許文献３：特表２００２−５０７９０７号公報
特許文献４：特表２００３−５２５０６２号公報
特許文献５：特開２００４−０９７５５２号公報
特許文献６：国際公開第２００８／１１１５３０号パンフレット
特許文献７：特表２０１３−５０２２７５号公報
特許文献８：特表平０７−５０９６３８号公報
特許文献９：特表２００２−５１８３１９号公報
特許文献１０：特表２０１２−５０５０１３号公報
特許文献２：特表２００３−５１８９８１号公報
特許文献３：特表２００２−５０７９０７号公報
特許文献４：特表２００３−５２５０６２号公報
特許文献５：特開２００４−０９７５５２号公報
特許文献６：国際公開第２００８／１１１５３０号パンフレット
特許文献７：特表２０１３−５０２２７５号公報
特許文献８：特表平０７−５０９６３８号公報
特許文献９：特表２００２−５１８３１９号公報
特許文献１０：特表２０１２−５０５０１３号公報
従来知られた、粒子状脱細胞化組織は、移植片の拒絶反応もなく、疾患部位の再生・治癒に有用であるが、組織の再生効果が十分ではなく、細胞培養用材料として使用した場合には細胞毒性を示す場合があると言う問題があった。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、媒体中で高静水圧を印加することにより脱細胞化した粒子状の動物組織が、細胞の誘引や分化誘導と言った効果を有しており、細胞培養時の細胞毒性もないということを見出し、本発明を完成させた。すなわち、本発明は、動物由来組織に、媒体中で高静水圧を印加する工程を有することを特徴とする粒子状脱細胞化組織の製造方法である。
具体的には、本発明は以下を含む。
［１］動物由来組織に、媒体中で高静水圧を印加する工程を有することを特徴とする粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［２］高静水圧が２〜１,５００ＭＰａであることを特徴とする［１］記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［３］動物由来組織を粉砕した後に、媒体中で高静水圧を印加することを特徴とする［１］又は［２］記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［４］媒体中で高静水圧を印加した動物由来脱細胞化組織を粉砕することを特徴とする［１］又は［２］記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［５］媒体中で高静水圧を印加した動物由来脱細胞化組織を、アニオン性界面活性剤及び/又はノニオン性界面活性剤を含有しない洗浄液で洗浄することを特徴とする［１］〜［４］の何れか１項に記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［６］［１］〜［５］の何れか１項に記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法より製造された粒子状脱細胞化組織。
［７］［６］に記載の粒子状脱細胞化組織を使用した移植用又は治療用の材料。
［８］［６］に記載の粒子状脱細胞化組織を使用した細胞培養用材料。
［１］動物由来組織に、媒体中で高静水圧を印加する工程を有することを特徴とする粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［２］高静水圧が２〜１,５００ＭＰａであることを特徴とする［１］記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［３］動物由来組織を粉砕した後に、媒体中で高静水圧を印加することを特徴とする［１］又は［２］記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［４］媒体中で高静水圧を印加した動物由来脱細胞化組織を粉砕することを特徴とする［１］又は［２］記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［５］媒体中で高静水圧を印加した動物由来脱細胞化組織を、アニオン性界面活性剤及び/又はノニオン性界面活性剤を含有しない洗浄液で洗浄することを特徴とする［１］〜［４］の何れか１項に記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法。
［６］［１］〜［５］の何れか１項に記載の粒子状脱細胞化組織の製造方法より製造された粒子状脱細胞化組織。
［７］［６］に記載の粒子状脱細胞化組織を使用した移植用又は治療用の材料。
［８］［６］に記載の粒子状脱細胞化組織を使用した細胞培養用材料。
本発明の製造方法により、細胞毒性がなく、細胞の誘引効果や分化誘導効果を有し、細胞毒性がなく、組織の再生効果が高い粒子状脱細胞化組織が得られる。本発明の製造方法により得られた粒子状脱細胞化組織は、粒子状であることから、適用対象となる部位が限定されず、種々の部位に使用可能である。
以下、本発明について詳細に説明する。
〔生体組織〕
本発明の粒子状脱細胞化組織の製造方法に使用する生体組織は、脊椎動物由来の細胞を有する生体組織であれば、特に限定されないが、拒絶反応が少ないことから、哺乳類又は鳥類由来の生体組織が好ましく、入手が容易であることから、哺乳類の家畜、鳥類の家畜またはヒト由来の生態組織が更に好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ等が挙げられる。これらの中でも、入手の安定性から、ブタ、ウサギ、ヒトの生体組織が好ましい。
〔生体組織〕
本発明の粒子状脱細胞化組織の製造方法に使用する生体組織は、脊椎動物由来の細胞を有する生体組織であれば、特に限定されないが、拒絶反応が少ないことから、哺乳類又は鳥類由来の生体組織が好ましく、入手が容易であることから、哺乳類の家畜、鳥類の家畜またはヒト由来の生態組織が更に好ましい。哺乳類の家畜としては、ウシ、ウマ、ラクダ、リャマ、ロバ、ヤク、ヒツジ、ブタ、ヤギ、シカ、アルパカ、イヌ、タヌキ、イタチ、キツネ、ネコ、ウサギ、ハムスター、モルモット、ラット、マウス、リス、アライグマ等が挙げられる。また、鳥類の家畜としては、インコ、オウム、ニワトリ、アヒル、七面鳥、ガチョウ、ホロホロ鳥、キジ、ダチョウ、ウズラ等が挙げられる。これらの中でも、入手の安定性から、ブタ、ウサギ、ヒトの生体組織が好ましい。
生体組織の部位としては、細胞外にマトリックス構造を持った部位が使用でき、このような部位としては、例えば、肝臓、腎臓、尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃、食道、胃、小腸、大腸、 肛門、膵臓、心臓、血管、脾臓、肺、脳、骨、脊髄、軟骨、精巣、子宮、卵管、卵巣、胎盤、角膜、骨格筋、腱、神経、皮膚等が挙げられる。生体組織の部位として、組織再生の効果が高いことから軟骨、骨、肝臓、腎臓、心臓、肺、脳、及び脊髄が好ましい。生体組織は採取後、腐敗や機能の低下を防ぐための処理を行うことが好ましい。このような処理としては、薬剤による殺菌処理、冷凍による凍結処理等が挙げられ、組織へダメージが少ないことから凍結処理が好ましい。
〔粉砕工程〕
本発明の粒子状脱細胞化組織の製造方法では、生体組織を採取し、生体組織に高静水圧を印加し、破壊された細胞を洗浄除去し、粒子状の脱細胞化組織を得るまでの間の、どの段階で生体組織（または脱細胞化組織）を粉砕して粒子状にしてもよいが、破壊された細胞を洗浄除去する場合に、生体組織の形状が保たれた状態よりは粒子状である方が、破壊された細胞の洗浄除去が容易に行えることから、少なくとも細胞の洗浄除去の前に、粉砕することが好ましい。
本発明の粒子状脱細胞化組織の製造方法では、生体組織を採取し、生体組織に高静水圧を印加し、破壊された細胞を洗浄除去し、粒子状の脱細胞化組織を得るまでの間の、どの段階で生体組織（または脱細胞化組織）を粉砕して粒子状にしてもよいが、破壊された細胞を洗浄除去する場合に、生体組織の形状が保たれた状態よりは粒子状である方が、破壊された細胞の洗浄除去が容易に行えることから、少なくとも細胞の洗浄除去の前に、粉砕することが好ましい。
組織を粉砕する方法としては、生体組織をそのまま常温で粉砕する方法、生体組織を冷凍し凍結状態で粉砕する方法等が挙げられ、特に限定されないが、常温では粉砕が困難な生体組織、例えば、腎臓等の軟組織の場合には、凍結状態で粉砕することが好ましい。凍結状態で粉砕する場合、０℃付近の温度では氷の結晶の成長により組織にダメージが残る場合があることから、凍結状態で粉砕する場合の粉砕の温度は−８０〜−５℃が好ましく、−５０〜−１０℃が更に好ましく、−４０〜−１５℃が最も好ましい。生体組織は凍結して保存することが好ましいことから、保存している凍結状態の生体組織を粉砕すれば工程が簡略化でき、粒子状の生体組織に対して高静水圧処理することができる。
生体組織は、粉砕後の分級が容易であることから、乾燥してから粉砕してもよい。生体組織の乾燥方法としては、加熱乾燥、減圧乾燥、凍結乾燥、有機溶媒による脱水等が挙げられ、細胞や核酸の洗浄が容易に行えることから、凍結乾燥、有機溶媒による脱水が好ましく、凍結乾燥が更に好ましい。有機溶媒を用いて脱水する場合の有機溶媒としては、エタノール、アセトン等が挙げられる。この他、生体組織を粉砕することなく脱細胞化し、脱細胞化した生体組織を乾燥して粉砕してもよい。
粉砕方法としては、ボールミル、ビーズミル、コロイドミル、コニカルミル、ディスクミル、エッジミル、製粉ミル、ハンマーミル、ペレットミル、カッティングミル、ローラーミル、ジェットミル等が挙げられ、生体組織へのダメージが少ないことから、カッティングミルが好ましい。
本発明の粒子状脱細胞化組織の大きさがあまりにも小さい場合には、組織再生の効果が低く、またあまりに大きい場合には、移植や治療の基材として使用しにくいことから、本発明の粒子状脱細胞化組織は粒径が０.１〜１,０００μｍが好ましく、０.５〜５００μｍが更に好ましく、１〜１００μｍが最も好ましい。
〔高静水圧処理工程〕
本発明の製造方法では、生体細胞に媒体中で静水圧を印加ことにより生体組織が脱細胞化される。印加する静水圧が１００ＭＰａよりも低い場合には、生体組織からの脱細胞が不十分となる。一方、静水圧の印加には印加に耐えられる圧力容器が必要であり、多大なエネルギーを要する。このため、生体組織に印加する静水圧は、２〜１,５００ＭＰａが好ましく、１０〜１,０００ＭＰａが更に好ましく、８０〜５００ＭＰａが最も好ましい。
本発明の製造方法では、生体細胞に媒体中で静水圧を印加ことにより生体組織が脱細胞化される。印加する静水圧が１００ＭＰａよりも低い場合には、生体組織からの脱細胞が不十分となる。一方、静水圧の印加には印加に耐えられる圧力容器が必要であり、多大なエネルギーを要する。このため、生体組織に印加する静水圧は、２〜１,５００ＭＰａが好ましく、１０〜１,０００ＭＰａが更に好ましく、８０〜５００ＭＰａが最も好ましい。
また、静水圧の印加に使用する媒体としては、水、生理食塩水、プロピレングリコール又はその水溶液、グリセリン又はその水溶液、糖類水溶液等が挙げられる。緩衝液としては、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＥＳ緩衝液等が挙げられる。糖類水溶液の糖類としては、エリトロース、キシロース、アラビノース、アロース、タロース、グルコース、マンノース、ガラクトース、エリスリトール、キシリトール、マンニトール、ソルビトール、ガラクチトール、スクロース、ラクトース、マルトース、トレハロース、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸等が挙げられる。
高静水圧処理の温度は、氷が生成せず、熱による組織へのダメージがない温度であれば、特に限定されないが、脱細胞処理が円滑に行われ組織への影響も少ないことから５〜４５℃が好ましく、１０〜４０℃が更に好ましく、１５〜３５℃が最も好ましい。高静水圧処理の時間は、短すぎると細胞の破壊が十分行われず、長い場合にはエネルギーの浪費につながることから、５〜６０分が好ましく、７〜３０分が更に好ましい。
〔洗浄工程〕
高静水圧が印加された生体組織は、洗浄液により破壊された細胞を洗浄除去される。洗浄液は、静水圧の印加に使用した媒体と同じ液でもよいし、異なる洗浄液でもよく、複数の種類の洗浄液を組み合わせて用いてもよい。洗浄液は、核酸分解酵素、有機溶媒又はキレート剤を含有することが好ましい。核酸分解酵素は、静水圧が印加された生体組織からの核酸成分、有機溶媒は脂質、それぞれの除去効率を向上させることができ、キレート剤は、脱細胞化組織中のカルシウムイオンやマグネシウムイオンを不活性化することにより、本発明の粒子化脱細胞組織を疾患部に適用した場合の石灰化を防ぐことができる。
高静水圧が印加された生体組織は、洗浄液により破壊された細胞を洗浄除去される。洗浄液は、静水圧の印加に使用した媒体と同じ液でもよいし、異なる洗浄液でもよく、複数の種類の洗浄液を組み合わせて用いてもよい。洗浄液は、核酸分解酵素、有機溶媒又はキレート剤を含有することが好ましい。核酸分解酵素は、静水圧が印加された生体組織からの核酸成分、有機溶媒は脂質、それぞれの除去効率を向上させることができ、キレート剤は、脱細胞化組織中のカルシウムイオンやマグネシウムイオンを不活性化することにより、本発明の粒子化脱細胞組織を疾患部に適用した場合の石灰化を防ぐことができる。
有機溶剤としては、脂質の除去効果が高いことから、水溶性の有機溶剤が好ましく、エタノール、イソプロパノール、アセトン、ジメチルスルホキシドが好ましい。キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ジエチレントリミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，３−プロパンジアミン四酢酸（ＰＤＴＡ）、１，３−ジアミノ−２−ヒドロキシプロパン四酢酸（ＤＰＴＡ−ＯＨ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸（ＧＥＤＴＡ）、ジカルボキシメチルグルタミン酸（ＣＭＧＡ）、３−ヒドロキシ−２，２’−イミノジコハク酸（ＨＩＤＡ）、ジカルボキシメチルアスパラギン酸（ＡＳＤＡ）等のイミノカルボン酸系キレート剤またはその塩；クエン酸、酒石酸、リンゴ酸、乳酸等のヒドロキシカルボン酸系キレート剤またはその塩が挙げられ、これらのキレート剤の塩としては、ナトリウム塩又はカリウム塩が挙げられる。
なお、洗浄液にアニオン性界面活性剤やノニオン性界面活性剤を含有させると、破壊された細胞組織や核酸、脂質等の除去効率が上がるが、細胞毒性が出たり、脱細胞化組織の組織再生効果が下がる場合があることから、このような界面活性剤は使用しないことが好ましい。洗浄する場合には、高静水圧処理された粒子状組織を洗浄液に浸漬するが、必要に応じて、洗浄液を振盪または撹拌してもよい。
本発明の粒子状脱細胞化組織が適用される疾患部位は、細胞組織を有する疾患部位であれば、特に限定されず使用できる。また、原料となった生体組織と同様の疾患部位に適用してもよいし、異なる部位に適用してもよい。たとえば、本発明の粒子状脱細胞化組織が、肝臓由来の脱細胞化組織である場合には、肝臓に使用してもよいし、異なる部位、例えば、腎臓、心臓、肺、脳、脊髄等に適応してよい。
本発明の粒子状脱細胞化組織は、疾患部位にそのまま適用してもよいし、生理食塩水、５％ブドウ糖液、リンゲル液等に分散して適用してもよいし、フィブリノゲン等によりゲル状にして適用してもよい。また、本発明の粒子状脱細胞化組織は、単独で適用してもよいし、疾患部位の再生・治癒効果のある他の成分とともに適用してもよい。このような他の成分としては、成長因子、プロテオグリカン又はグリコサミノグリカン、細胞、β−１，３−グルカン、メバロン酸等が挙げられる。
成長因子としては、インシュリン類似成長因子（ＩＧＦ）、塩基性繊維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、酸性繊維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、角質細胞成長因子（ＫＧＦ）、表皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、造血促進因子（ＥＰＯ）、顆粒大食細胞成長因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆ふぇｄ３２１粒細胞成長因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）、ヘパリン結合因子（ＥＧＦ）等が挙げられる。プロテオグリカン又はグリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、デルマタン硫酸、ヒアルロン酸、ヘパリン等が挙げられる。
細胞は、再生医療に使用可能な細胞であれば、特に限定されない。このような細胞としては。たとえば、神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、皮膚幹細胞、筋幹細胞、生殖幹細胞等の幹細胞；筋芽細胞、骨芽細胞、象牙芽細胞、神経芽細胞腫、線維芽細胞、軟骨芽細胞、網膜芽細胞腫、エナメル芽細胞、セメント芽細胞等の芽細胞等が挙げられる。細胞は自家細胞であることが好ましいが、疾患部位に適用した場合に拒絶反応が起こらなければ他家細胞でもよい。
本発明の粒子状脱細胞化組織は、細胞の分化促進効果及び誘引効果を有しており、疾患部位の治癒・再生効果が高いことから、皮膚の創傷や凍傷の治療等の皮膚科的な用途；手術や事故等により組織が除去された場合、事故や病気によりが損傷を受けた場合の、組織の再生又は置換等の外科的な用途；組織の再建、補正等の美容外科的な用途等に用いることができる。本発明の粒子状脱細胞化組織を疾患部位に適用する場合は、疾患部位に塗布、付着、噴霧、埋入又は注射器等を用いて注入すればよい。
本発明の粒子状脱細胞化組織は、細胞毒性が少なく、細胞の分化促進効果及び誘引効果を有していることから、疾患の治療材、組織移植の補助剤、再生医療の足場材料、細胞培養の基材等として好ましく使用できる。本発明の粒子状脱細胞化組織を疾患の治療材、組織移植の補助剤、再生医療の足場材料として使用する場合には、そのまま患部に適用してもよいし、ゲル状物、シート状物、三次元構造物等に加工してから適用してもよい。また、本発明の粒子状脱細胞化組織を用いて細胞培養したものを、患部に適用してもよい。
以下、実施例により本発明を更に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。尚、特に限定のない限り、実施例中の「部」や「％」は質量基準によるものである。
〔実施例１〕
ブタの肝臓を冷凍し、−２０℃で、フードプロセッサーを用いて粉砕し、ふるいを用いて直径５００μｍ以上の粒子を除去して、ブタの肝臓の微細粒子（平均粒径５０μｍ、粒径１μｍ未満の成分は５％以下）を得た。ポリエチレン製チャック付き袋に、この微細粒子５ｇと、高静水圧処理の媒体として生理食塩水１５ｇとを入れ、研究開発用高圧処理装置（神戸製鋼製、商品名：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）を用いて、１,０００ＭＰａの静水圧を１５分間印加した。この後、高静水圧処理した粉末を滅菌カップに移し、洗浄液として生理食塩水２０ｇを入れて、２５℃で５時間振盪し、洗浄液を更新して更に２時間浸透して、実施例１の粒子状脱細胞化組織を得た。
ブタの肝臓を冷凍し、−２０℃で、フードプロセッサーを用いて粉砕し、ふるいを用いて直径５００μｍ以上の粒子を除去して、ブタの肝臓の微細粒子（平均粒径５０μｍ、粒径１μｍ未満の成分は５％以下）を得た。ポリエチレン製チャック付き袋に、この微細粒子５ｇと、高静水圧処理の媒体として生理食塩水１５ｇとを入れ、研究開発用高圧処理装置（神戸製鋼製、商品名：Ｄｒ．ＣＨＥＦ）を用いて、１,０００ＭＰａの静水圧を１５分間印加した。この後、高静水圧処理した粉末を滅菌カップに移し、洗浄液として生理食塩水２０ｇを入れて、２５℃で５時間振盪し、洗浄液を更新して更に２時間浸透して、実施例１の粒子状脱細胞化組織を得た。
〔実施例２〕
ブタの肝臓をブタの大脳に変えた以外は、実施例１と同様の操作を行い実施例２の粒子状脱細胞化組織を得た。
ブタの肝臓をブタの大脳に変えた以外は、実施例１と同様の操作を行い実施例２の粒子状脱細胞化組織を得た。
〔実施例３〕
ブタの肝臓をブタの脊髄に変えた以外は、実施例１と同様の操作を行い実施例３の粒子状脱細胞化組織を得た。
ブタの肝臓をブタの脊髄に変えた以外は、実施例１と同様の操作を行い実施例３の粒子状脱細胞化組織を得た。
〔比較例１〕
滅菌カップに、実施例１と同様の方法で粉砕したブタの肝臓の微細粒子５ｇと、脱細胞溶液として０.５％のドデシル硫酸ナトリウムを含有するハンクスの平衡塩溶液１５ｇを入れ、２５℃で５時間保存した。この後、脱細胞溶液を除去し、洗浄液として界面活性剤を含有しないハンクスの平衡塩溶液２０ｇを入れて、２５℃で５時間振盪し、洗浄液を更新して更に２時間振盪することにより、比較例１の粒子状脱細胞化組織を得た。
滅菌カップに、実施例１と同様の方法で粉砕したブタの肝臓の微細粒子５ｇと、脱細胞溶液として０.５％のドデシル硫酸ナトリウムを含有するハンクスの平衡塩溶液１５ｇを入れ、２５℃で５時間保存した。この後、脱細胞溶液を除去し、洗浄液として界面活性剤を含有しないハンクスの平衡塩溶液２０ｇを入れて、２５℃で５時間振盪し、洗浄液を更新して更に２時間振盪することにより、比較例１の粒子状脱細胞化組織を得た。
〔比較例２〕
ブタの肝臓をブタの大脳に変えた以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例２の粒子状脱細胞化組織を得た。
ブタの肝臓をブタの大脳に変えた以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例２の粒子状脱細胞化組織を得た。
〔比較例３〕
ブタの肝臓をブタの脊髄に変えた以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例３の粒子状脱細胞化組織を得た。
ブタの肝臓をブタの脊髄に変えた以外は、比較例１と同様の操作を行い比較例３の粒子状脱細胞化組織を得た。
〔細胞遊走性試験〕
Ｌ９２９細胞（マウス繊維芽細胞）をＭＥＭ培地を用いて、３７℃で２４時間培養し、飢餓状態にした。２４ well plate dishに５％の粉末化脱細胞化組織を含有するＭＥＭ培地１ｍＬを添加し、セルカルチャーインサート（孔径８μｍ）を各ｗｅｌｌにセットした。インサート内に、ＭＥＭ培地で培養したＬ９２９細胞を播種し（１.０×１０５細胞／ｗｅｌｌ）、３７℃で１〜３時間培養し、インサート下のｗｅｌｌ部に移動した細胞数を計測した。細胞数の計測は、ＤＡＰＩで染色した後、蛍光顕微鏡を用いて行い、５のｗｅｌｌ部の平均数を求めた。なお、粉末化脱細胞化組織を使用しないものをブランクとした。結果を表１に示す。
Ｌ９２９細胞（マウス繊維芽細胞）をＭＥＭ培地を用いて、３７℃で２４時間培養し、飢餓状態にした。２４ well plate dishに５％の粉末化脱細胞化組織を含有するＭＥＭ培地１ｍＬを添加し、セルカルチャーインサート（孔径８μｍ）を各ｗｅｌｌにセットした。インサート内に、ＭＥＭ培地で培養したＬ９２９細胞を播種し（１.０×１０５細胞／ｗｅｌｌ）、３７℃で１〜３時間培養し、インサート下のｗｅｌｌ部に移動した細胞数を計測した。細胞数の計測は、ＤＡＰＩで染色した後、蛍光顕微鏡を用いて行い、５のｗｅｌｌ部の平均数を求めた。なお、粉末化脱細胞化組織を使用しないものをブランクとした。結果を表１に示す。
細胞遊走性試験では、本発明の粉末化脱細胞化組織で高い細胞遊走性が見られた。これは、本発明の粉末化脱細胞化組織が、細胞の誘引効果を有することを示すものである。なお、比較例１では一部の細胞に細胞死が見られた。
〔神経突起伸長試験〕
コラーゲンコート24 well plate dishに、１０％のHorse serumと５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ)を含有するＲＰＭＩ培地を用いて、ＰＣ１２細胞（ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫）を播種（１.０×１０4細胞／ｗｅｌｌ）し、３７℃で２４時間培養した。培地を０.１％のHose serumを含有するＲＰＭＩ培地に変更し、セルカルチャーインサート（孔径８μｍ）を各ｗｅｌｌにセットした。インサート内に５％の脱細胞化粉末を含有する生理食塩水を２００μＬ添加し、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）を５０ｎｇ添加した場合と添加しない場合について２４時間培養した。位相差顕微鏡で細胞を観察し、以下の基準で神経突起伸長効果を評価した。結果を表２に示す。
◎：明らかな神経突起伸長効果が見られる。
○：一部に神経突起伸長効果が見られる。
△：神経突起伸長効果が見られない。
×：一部または全部の細胞に、細胞死が観察された。
コラーゲンコート24 well plate dishに、１０％のHorse serumと５％のウシ胎児血清（ＦＢＳ)を含有するＲＰＭＩ培地を用いて、ＰＣ１２細胞（ラットの副腎髄質由来の褐色細胞腫）を播種（１.０×１０4細胞／ｗｅｌｌ）し、３７℃で２４時間培養した。培地を０.１％のHose serumを含有するＲＰＭＩ培地に変更し、セルカルチャーインサート（孔径８μｍ）を各ｗｅｌｌにセットした。インサート内に５％の脱細胞化粉末を含有する生理食塩水を２００μＬ添加し、神経細胞成長因子（ＮＧＦ）を５０ｎｇ添加した場合と添加しない場合について２４時間培養した。位相差顕微鏡で細胞を観察し、以下の基準で神経突起伸長効果を評価した。結果を表２に示す。
◎：明らかな神経突起伸長効果が見られる。
○：一部に神経突起伸長効果が見られる。
△：神経突起伸長効果が見られない。
×：一部または全部の細胞に、細胞死が観察された。
神経突起伸長試験では、本発明の粉末化脱細胞化組織は、ＮＧＦを添加しない場合でも明らかな神経突起伸長効果が見られた。これは本発明の粉末化脱細胞化組織が、細胞の分化誘導効果を有することを示すものである。比較例では、細胞死が観察され、比較例の粉末化脱細胞化組織が細胞毒性を有することが示唆された。
〔皮下埋植試験〕
ラット（Wistar rat、オス、８〜１２週齢）を麻酔処理し、背部を剃毛し、剃毛部をポビドンヨード溶液で消毒した。このラットの背部をハサミで約１.５ｃｍ切開して皮下ポケットを作成した。この皮下ポケットに脱細胞化粉末約２０ｍｇを埋入し、縫合糸を用いて切開部を縫合し、縫合部をポビドンヨード溶液で再度消毒した。２８日後に、ラットの皮下ポケット部を回収し、ヘマトキシリン・エオシン染色により染色して組織学的評価を行った。なお、脱細胞化粉末を埋入せずに縫合したものをブランクとした。結果を表３に示す。
○：炎症反応が見られず、細胞の誘引が確認できる。
△：炎症反応は見られないが、細胞の誘引が明確でない。
×：炎症反応が見られ、細胞の誘引も確認できない。
ラット（Wistar rat、オス、８〜１２週齢）を麻酔処理し、背部を剃毛し、剃毛部をポビドンヨード溶液で消毒した。このラットの背部をハサミで約１.５ｃｍ切開して皮下ポケットを作成した。この皮下ポケットに脱細胞化粉末約２０ｍｇを埋入し、縫合糸を用いて切開部を縫合し、縫合部をポビドンヨード溶液で再度消毒した。２８日後に、ラットの皮下ポケット部を回収し、ヘマトキシリン・エオシン染色により染色して組織学的評価を行った。なお、脱細胞化粉末を埋入せずに縫合したものをブランクとした。結果を表３に示す。
○：炎症反応が見られず、細胞の誘引が確認できる。
△：炎症反応は見られないが、細胞の誘引が明確でない。
×：炎症反応が見られ、細胞の誘引も確認できない。
〔凍傷モデル試験〕
ラット（Wistar rat、オス、８〜１２週齢）を麻酔処理し、背部を剃毛し、剃毛部をポビドンヨード溶液で消毒した。このラットの背部に、真皮中層までの欠損（直径１５ｍｍ）を作成し、更に、液体窒素で冷却した金属体を６０秒間押し付けて、凍傷した創傷を作成した。この創傷に、実施例１又は比較例２の脱細胞化粉末を塗布し、創傷部を絆創膏で被覆し、さらにラットの胴体全周をガーゼを用いて被覆した。７日後、創傷部を回収し、ヘマトキシリン・エオシン染色により染色して組織学的評価を行った。なお、脱細胞化粉末を塗布せずに絆創膏で被覆したものをブランクとした。結果を表３に示す。
◎：組織の再生が認められ、拘縮は認められない。
○：組織の再生が認められるが、やや拘縮が認められる。
△：組織の再生が認められるが、明らかな拘縮が認められる。
×：患部の悪化が認められる。
ラット（Wistar rat、オス、８〜１２週齢）を麻酔処理し、背部を剃毛し、剃毛部をポビドンヨード溶液で消毒した。このラットの背部に、真皮中層までの欠損（直径１５ｍｍ）を作成し、更に、液体窒素で冷却した金属体を６０秒間押し付けて、凍傷した創傷を作成した。この創傷に、実施例１又は比較例２の脱細胞化粉末を塗布し、創傷部を絆創膏で被覆し、さらにラットの胴体全周をガーゼを用いて被覆した。７日後、創傷部を回収し、ヘマトキシリン・エオシン染色により染色して組織学的評価を行った。なお、脱細胞化粉末を塗布せずに絆創膏で被覆したものをブランクとした。結果を表３に示す。
◎：組織の再生が認められ、拘縮は認められない。
○：組織の再生が認められるが、やや拘縮が認められる。
△：組織の再生が認められるが、明らかな拘縮が認められる。
×：患部の悪化が認められる。
皮下埋植試験及び凍傷モデル試験から本発明の粉末化脱細胞化組織に高い再生・治癒効果があることがわかる。
本発明の粒子状脱細胞化組織は、細胞毒性が少なく、細胞の分化促進効果及び誘引効果を有していることから、疾患の治療材、組織移植の補助剤、再生医療の足場材料、細胞培養の基材等として好ましく使用できる。本発明の粒子状脱細胞化組織を疾患の治療材、組織移植の補助剤、再生医療の足場材料として使用する場合には、そのまま患部に適用してもよいし、ゲル状物、シート状物、三次元構造物等に加工してから適用してもよい。また、本発明の粒子状脱細胞化組織を用いて細胞培養したものを、患部に適用してもよい。
Claims (5)
- 動物由来組織に、媒体中で２〜１,５００ＭＰａの高静水圧を印加する工程を有することを特徴とする細胞誘引性粒子状脱細胞化組織の製造方法で得られた細胞誘引性粒子状脱細胞組織を用いた、インビトロでの細胞の誘引方法。
- 該製造方法が、動物由来組織を粉砕した後に、媒体中で高静水圧を印加することを特徴とする方法である、請求項１に記載の誘引方法。
- 該製造方法が、媒体中で高静水圧を印加した動物由来脱細胞化組織を粉砕することを特徴とする方法である、請求項１に記載の誘引方法。
- 該製造方法が、媒体中で高静水圧を印加した動物由来脱細胞化組織を、アニオン性界面活性剤及び/又はノニオン性界面活性剤を含有しない洗浄液で洗浄することを特徴とする方法である、請求項１〜３の何れか１項に記載の誘引方法。
- 該製造方法が、動物由来組織に、媒体中で２〜１,５００ＭＰａの高静水圧を印加する工程と、動物由来組織を粉砕する工程と、高静水圧を印加し、破壊された動物由来組織の細胞を洗浄除去する工程とを有し、少なくとも細胞の洗浄除去の前に、粉砕することを特徴とする方法である、請求項１〜４の何れか１項に記載の誘引方法。
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