CN105188781A - 用于制备微粒脱细胞组织的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了微粒脱细胞组织，其具有足够的组织再生效果且当用作细胞培养材料时不显示细胞毒性。通过用于产生微粒脱细胞组织的方法获得了微粒脱细胞组织，所述微粒脱细胞组织不显示细胞毒性，具有细胞诱导效果和分化诱导效果且还具有高组织再生效果，所述方法的特征在于包括将高流体静力压应用于介质中的来源于动物的组织的步骤。

Description

用于制备微粒脱细胞组织的方法
技术领域
本发明涉及用于制备可以合适地用于再生治疗、细胞培养等的微粒脱细胞组织的方法。
背景技术
当从其他的生物组织移植移植物时，接受移植物的主体的组织的排斥成为问题。为了解决此问题，预期开发假体。已经尝试各种大分子作为材料。然而，由于此材料和生物组织之间的相容性低，移植物可以从接合部位掉出或可能发生传染病。因此，为了改善与生物组织的相容性，已经开发技术以使用脱细胞生物组织，其是作为移植物的在从生物组织去除细胞之后保留的支持组织。对于生物组织的脱细胞，已知的方法是使用表面活性剂(例如参考专利参考文献1和2)，使用酶(例如参考专利参考文献3)，使用酸化剂(例如参考专利参考文献4)，用超高流体静力压处理(例如参考专利参考文献5至7)等。
粒状或粉状形式的脱细胞组织(微粒脱细胞组织)也是已知的。微粒脱细胞组织已经用于通过其向患病部位(affectedsites)注射而促进患病部位的再生和治愈，或模塑用作移植物(例如参考专利参考文献8至10)。迄今已知的微粒脱细胞组织已经通过使用表面活性剂来制备。然而，通过用超高流体静力压处理制备的微粒脱细胞组织是未知的。
专利参考文献1：日本专利公开号60-501540
专利参考文献2：日本专利公开号2003-518981
专利参考文献3：日本专利公开号2002-507907
专利参考文献4：日本专利公开号2003-525062
专利参考文献5：日本专利公开号2004-094552
专利参考文献6：WO2008/111530
专利参考文献7：日本专利公开号2013-502275
专利参考文献8：日本专利公开号07-509638
专利参考文献9：日本专利公开号2002-518319
专利参考文献10：日本专利公开号2012-505013。
发明公开内容
(本发明待解决的技术问题)
迄今已知的微粒脱细胞组织不引起移植物排斥，且可用于患病部位的再生和治愈。然而，存在其不显示足够有效的组织再生和当用作用于细胞培养的材料时显示细胞毒性的问题。
(用于解决问题的方式)
本发明人已经认真研究以解决上述问题，且作为结果，已经发现，通过在介质中应用高流体静力压而脱细胞的微粒动物组织显示细胞吸引的效果和诱导细胞分化的效果，但在细胞培养的同时不显示细胞毒性，从而完成了本发明。因此，本发明涉及用于制备微粒脱细胞组织的方法，其包括将高流体静力压应用于介质中的动物来源的组织的步骤。
具体地，本发明包括以下发明。
[1]用于制备微粒脱细胞组织的方法，其包括将高流体静力压应用于介质中的动物来源的组织的步骤。
[2]根据[1]的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中所述高流体静力压为2至1,500MPa。
[3]根据[1]或[2]的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中在粉碎动物来源的组织之后应用所述高流体静力压。
[4]根据[1]或[2]的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中粉碎通过将高流体静力压应用于介质中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。
[5]根据[1]至[4]中任一项的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中用不包含阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂的洗涤液洗涤通过将高流体静力压应用于介质中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。
[6]微粒脱细胞组织，其通过根据[1]至[5]中任一项的用于制备微粒脱细胞组织的方法制备。
[7]使用根据[6]的微粒脱细胞组织的用于移植或治疗的材料。
[8]使用根据[6]的微粒脱细胞组织的用于细胞培养的材料。
发明效果
根据本发明的方法，获得微粒脱细胞组织，其不显示细胞毒性，但显示细胞吸引的效果和诱导细胞分化的效果，且显示组织再生的高效果。由于其微粒形式，通过本发明的方法获得的微粒脱细胞组织，不限于其可应用的部位，而是可以应用于各种部位。
附图简述
图1显示不添加NGF的实施例2中的神经突增生测试的结果。
图2显示不添加NGF的实施例3中的神经突增生测试的结果。
图3显示不添加NGF的空白的神经突增生测试的结果。
图4显示添加NGF的空白的神经突增生测试的结果。
图5显示实施例1中的皮下填补法测试中在第28天的皮下囊袋(左图)和染色的大鼠组织的切片(右图)。
图6显示实施例1中的冻伤模型测试中的测试前外观(左上图)、测试后外观(右上图)和染色的大鼠组织的切片(下图)。
图7显示冻伤模型测试中的空白的测试前外观(左上图)、测试后外观(右上图)和染色的大鼠组织的切片(下图)。
实施本发明的最佳方式
下面详细解释本发明。
生物组织
本发明的用于制备微粒脱细胞组织的方法中使用的生物组织没有特别限制，只要它们包含来自脊椎动物的细胞，但鉴于低排斥优选地是来自哺乳动物或禽类的那些，且鉴于可用性更优选地是来自哺乳动物的家畜或禽类的家畜或人的那些。哺乳动物的家畜包括牛、马、骆驼、美洲驼、驴、牦牛、绵羊、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、狸、鼬鼠、狐狸、猫、兔、仓鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、浣熊等。禽类的家畜包括长尾鹦鹉、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、雉、鸵鸟、鹌鹑等。其中，鉴于稳定的可用性，来自猪、兔和人的生物组织是优选的。
由其获得生物组织的身体部位可以是具有细胞外基质结构的那些，包括肝、肾、输尿管、膀胱、尿道、舌、扁桃体、食管、胃、小肠、大肠、肛门、胰腺、心脏、血管、脾、肺、脑、骨、脊髓、软骨、睾丸、子宫、输卵管、卵巢、胎盘、角膜、骨骼肌、肌腱、神经、皮肤等。鉴于其高组织再生，由其获得生物组织的身体部位优选地是软骨、骨、肝、肾、心脏、肺、脑和脊髓。去除之后，优选处理生物组织，用于防止腐败或功能降低，包括用化学品杀菌处理，通过冷藏冷冻处理等，鉴于对组织的低伤害，优选冷冻处理。
粉碎步骤
在本发明的用于制备微粒脱细胞组织的方法中，可以在从去除生物组织、将高流体静力压应用于生物组织、洗涤和去除破坏的细胞至获得微粒脱细胞组织的任何阶段将生物组织(或脱细胞组织)粉碎成微粒。然而，它们可以优选至少在洗涤和去除细胞之前粉碎，因为微粒形式的破坏的细胞可以比其在形状得到维持的生物组织中更容易地洗涤和去除。
用于粉碎生物组织的方法包括，但不限于，当生物组织在常温时粉碎生物组织，冷藏生物组织和在冷冻条件下将其粉碎，等。然而，在常温下难以粉碎的生物组织诸如软组织(例如，肾)的情况下，它们优选在冷冻条件下进行粉碎。在冷冻条件下粉碎的情况下，由于组织有时由于在约0℃的冰晶生长而受损，粉碎温度优选为-80℃至-5℃，更优选-50℃至-10℃，最优选-40℃至-15℃。由于优选在冷冻条件下保存生物组织，因此在冷冻条件下保存的生物组织的粉碎将简化该步骤，且允许用高流体静力压处理微粒生物组织。
生物组织也可以在干燥之后粉碎，其中粉碎之后的分类是更容易的。生物组织的干燥方法包括用加热干燥、减压下干燥、冻干、用有机溶剂脱水等，优选冻干和用有机溶剂脱水，鉴于细胞和核酸的更容易洗涤，更优选冻干。用于脱水的有机溶剂包括乙醇、丙酮等。或者，生物组织可以在不粉碎的情况下脱细胞，且可以干燥和粉碎脱细胞的生物组织。
用于粉碎的方法包括球磨机、珠磨机、胶体磨机、锥形球磨机、盘式磨机、刃磨机、铣磨机(millingmills)、锤磨机、制粒磨机、切割磨机、滚压机、喷射磨机等，鉴于对生物组织的较小损伤，优选切割磨机。
当本发明的微粒脱细胞组织的大小太小时，组织再生的效果低。另一方面，当本发明的微粒脱细胞组织的大小太大时，变得难以使用组织作为用于移植或治疗的材料。因此，本发明的微粒脱细胞组织优选具有0.1至1,000μm、更优选0.5至500μm、最优选1至100μm的粒径。
高流体静力压处理的步骤
根据本发明的方法，将流体静力压应用于介质中的生物组织以便将组织脱细胞。当流体静力压小于100MPa时，从生物组织脱细胞是不足的。另一方面，应用流体静力压需要可耐受压力的应用的压力容器，且需要巨大能量。因此，应用于生物组织的流体静力压优选为2至1,500MPa，更优选10至1,000MPa，最优选80至500MPa。
当应用流体静力压时使用的介质包括水、盐水、丙二醇或其水溶液，甘油或其水溶液，糖类的水溶液，等。缓冲剂包括乙酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、Tris缓冲剂、HEPES缓冲剂、MES缓冲剂等。糖类的水溶液中的糖类包括赤藓糖、木糖、阿拉伯糖、阿洛糖、塔罗糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露醇、山梨糖醇、半乳糖醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡聚糖、海藻酸、透明质酸等。
实施高流体静力压处理的温度没有限制，只要不形成冰，且对组织没有热损伤，且优选为5至45℃，更优选10至40℃，且最优选15至35℃，其鉴于脱细胞的顺利处理和对组织的较小影响。当高流体静力压的处理时间太短时，细胞破碎是不足的，而高流体静力压的太长处理时间导致能量浪费。因此，高流体静力压的处理时间优选为5至60分钟，更优选7至30分钟。
洗涤步骤
从向其应用高流体静力压的生物组织，将破坏的细胞用洗涤液洗涤且去除。洗涤液与当应用流体静力压时所使用的可以是相同的或不同的，或者可以是多种类型的组合。洗涤液优选含有核酸酶、有机溶剂或螯合剂。核酸酶和有机溶剂可以分别改善核酸成分和脂质从向其应用流体静力压的生物组织的去除速率，而螯合剂可以通过失活脱细胞组织中的钙离子和镁离子而防止当将本发明的微粒脱细胞组织应用于患病部分时的钙化。
鉴于脂质的较高去除，有机溶剂优选是含水有机溶剂，且优选是乙醇、异丙醇、丙酮和二甲亚砜。螯合剂包括亚氨基羧酸螯合剂或其盐，诸如乙二胺四乙酸(EDTA)、次氮基三乙酸(NTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)、1,3-二氨基-2-羟基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、羟乙基-亚氨基二乙酸(HIDA)、二羟基乙基甘氨酸(DHEG)、乙二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)、二羧甲基谷氨酸(CMGA)、3-羟基-2,2'-亚氨基二琥珀酸(HIDA)、二羧甲基天冬氨酸(ASDA)；和羟基羧酸螯合剂或其盐，诸如柠檬酸、酒石酸、苹果酸和乳酸。这些螯合剂的盐包括钠盐或钾盐。
当洗涤液含有阴离子表面活性剂或非离子表面活性剂时，破坏的细胞组织、核酸和脂质的去除速率增加，但有时观察到细胞毒性或脱细胞组织的组织再生的降低。因此，优选不使用此类表面活性剂。对于洗涤，将高流体静力压处理之后获得的微粒组织浸没在可以根据需要振荡或搅拌的洗涤液中。
向其应用本发明的微粒脱细胞组织的患病部位没有特别限制，而可以是任何患病部位，只要它们包含细胞组织。本发明的微粒脱细胞组织可以应用于与微粒脱细胞组织所来源的生物组织相同的生物组织、或不同的生物组织。例如，当本发明的微粒脱细胞组织是来自肝脏的组织时，其可以用于肝脏或不同的部位，诸如肾、心脏、肺、脑和脊髓。
本发明的微粒脱细胞组织可以原样或作为盐水、5％葡萄糖溶液、Ringer氏溶液等中的分散液或作为具有纤维蛋白原的凝胶等应用于患病部位。本发明的微粒脱细胞组织可以单独或与对于患病部位的再生和治愈有效的其他成分组合应用。其他成分包括生长因子、蛋白聚糖或葡萄糖胺聚糖、细胞、β-1,3-葡聚糖、甲羟戊酸等。
生长因子包括，胰岛素类似物生长因子(IGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、骨形态发生蛋白(BMP)、血小板衍化生长因子(PDGF)、角质细胞生长因子(KGF)、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、造血加速因子(EPO)、粒细胞巨噬细胞生长因子(GM-CSF)、髁Fed321晶粒生长因子(graingrowthfactor)(G-CSF)、神经生长因子(NGF)、肝素-结合因子(EGF)等。蛋白聚糖或葡萄糖胺聚糖包括硫酸软骨素、硫酸乙酰肝素、硫酸角质素、硫酸皮肤素、透明质酸、肝素等。
细胞可以是可以用于再生治疗的任何细胞。此类细胞包括，例如，干细胞，诸如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰腺干细胞、皮肤干细胞、肌肉干细胞和生殖干细胞；母细胞，诸如成肌细胞、成骨细胞、成牙质细胞、成神经细胞瘤、成纤维细胞、成软骨细胞、成视网膜细胞瘤、成釉细胞和成牙骨质细胞(cementblasts)。细胞可以优选是自体细胞或可以是非自体细胞，只要它们当应用于患病部位时不诱导排斥。
本发明的微粒脱细胞组织具有促进细胞分化的效果和细胞吸引的效果，且对于患病部位的治愈和再生是高度有效的。因此，本发明的微粒脱细胞组织可用于皮肤病学用途，诸如皮肤的伤口或冻伤的治疗；用于手术用途，诸如当通过手术或事故去除组织或通过事故或疾病损伤组织或器官时组织的再生或替换；用于美容手术中使用，诸如组织的重构和校正。对于将本发明的微粒脱细胞组织应用于患病部位，其可以应用、粘附、喷雾、掩埋或用注射器注射等至患病部位。
本发明的微粒脱细胞组织具有较低细胞毒性，且具有促进和诱导细胞分化的效果。因此，本发明的微粒脱细胞组织可以合适地用作疾病的治疗材料、组织移植的辅助材料、用于再生治疗的支架材料、用于细胞培养的基础材料等。当本发明的微粒脱细胞组织用作疾病的治疗材料、组织移植的辅助材料或用于再生治疗的支架材料时，其可以原样或将其加工成凝胶、片材、三维结构等之后应用于患病部分。或者，本发明的微粒脱细胞组织可以用于细胞培养，然后应用于患病部分。
本发明借助以下实施例更详细解释，但不限于此。除非另有特别注明，实施例中的术语“份”或“％”是指质量对象。
实施例1
将猪肝冷冻且在-20℃用食品处理器粉碎，且用筛去除直径为500μm或以上的颗粒以得到猪肝的细粒(平均粒径50μm；粒径小于1μm的颗粒：5％或更少)。将五克细颗和15g作为高流体静力压处理的介质的盐水放入由聚乙烯制成的拉链袋。使用R&D的高压处理设备(KobeSteel,Ltd.;商品名:Dr.CHEF)，应用1,000MPa的流体静力压15分钟。然后，将高流体静力压处理之后获得的粉末转移至灭菌杯中。向杯子中添加20g作为洗涤液的盐水，且在25℃振荡5小时。将洗涤液替换为新的洗涤液，且将杯子再振荡2小时以得到实施例1的微粒脱细胞组织。
实施例2
重复实施例1的程序，除了将猪肝替换为猪脑以得到实施例2的微粒脱细胞组织。
实施例3
重复实施例1的程序，除了将猪肝替换为猪脊髓以得到实施例3的微粒脱细胞组织。
比较例1
向灭菌杯中添加5g如实施例1中粉碎的猪肝的细粒和作为脱细胞溶液的15g包含0.5％十二烷基硫酸钠的Hanks平衡盐溶液。将杯子在25℃储存5小时。然后，去除脱细胞溶液，且向杯子中添加20g作为洗涤液的不包含表面活性剂的Hanks平衡盐溶液，且在25℃振荡5小时。将洗涤液替换为新的洗涤液，且将杯子再振荡2小时以得到比较例1的微粒脱细胞组织。
比较例2
重复比较例1的程序，除了将猪肝替换为猪脑以得到比较例2的微粒脱细胞组织。
比较例3
重复比较例1的程序，除了将猪肝替换为猪脊髓以得到比较例3的微粒脱细胞组织。
细胞迁移测试
L929细胞(小鼠成纤维细胞)在37℃用MEM培养基培养24小时以进行饥饿。向24孔板培养皿中添加1mL含有5％粉末状脱细胞组织的MEM培养基，且在各孔中设置细胞培养插入物(孔径8μm)。将在MEM培养基中培养的L929细胞接种至插入物(1.0x105个细胞/孔)，且在37℃培养1至3小时，且测量迁移至插入物下的孔的细胞的数目。细胞数目的测量在DAPI染色之后用荧光显微镜实施，且计算5个孔的平均数目。包括不使用粉末状脱细胞组织的空白。结果显示于表1中。
表1
1小时后 2小时后 3小时后
实施例1 688 1523 1520
比较例1 642 612 628
空白 782 516 505
在细胞迁移测试中，本发明的粉末状脱细胞组织显示高细胞迁移，表明本发明的粉末状脱细胞组织具有细胞吸引的效果。在比较例1中，在部分细胞中观察到细胞死亡。
神经突增生测试
将PC12细胞(来自大鼠肾上腺髓质的嗜铬细胞瘤)接种至具有含有10％马血清和5％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基的胶原包被的24孔板培养皿(1.0x104个细胞/孔)，且在37℃培养24小时。将培养基更换为含有0.1％马血清的RPMI培养基，且在各孔中设置细胞培养插入物(孔径8μm)。向插入物中添加200μL含有5％脱细胞粉末的盐水，且在添加和不添加50ng神经生长因子的情况下继续培养24小时。用相差显微镜观察细胞以根据以下标准来估计神经突增生的效果。结果显示于表2中。
◎:明显观察到神经突增生的效果。
○:部分观察到神经突增生的效果。
△:没有观察到神经突增生的效果。
×:在部分或所有细胞中观察到细胞死亡。
表2
有NGF 没有NGF
实施例2 ◎ ◎
实施例3 ◎ ◎
比较例2 ○,× △,×
比较例3 ○,× △,×
空白 ◎ △
在神经突增生测试中，本发明的粉末状脱细胞组织明显显示神经突增生的效果，甚至在没有NGF的情况下，表明本发明的粉末状脱细胞组织具有诱导细胞分化的效果。在比较例中，观察到细胞死亡，表明比较例的粉末状脱细胞组织具有细胞毒性。
皮下填补法(enthesis)测试
将大鼠(Wistar大鼠，雄性，8至12周)麻醉，在背上剃毛，且剃光部分用聚维酮碘溶液消毒。用剪刀将大鼠的背部切开约1.5cm以生成皮下囊袋，向其中嵌入约20mg脱细胞的粉末。用缝合线缝合切开部分，且用聚维酮碘溶液再次消毒缝合部分。二十八天后，收集大鼠皮下囊袋且用苏木精/伊红染料染色用于组织学估计。包括在不嵌入脱细胞粉末的情况下进行缝合的空白。结果显示于表3中。
○:没有观察到炎症反应，且证实细胞吸引。
△:没有观察到炎症反应，但细胞吸引是不清楚的。
×:观察到炎症反应，且没有证实细胞吸引。
冻伤模型测试
将大鼠(Wistar大鼠，雄性，8至12周)麻醉，在背上剃毛，且剃光部分用聚维酮碘溶液消毒。在大鼠的背部，生成中皮层(mid-dermallayer)(直径15mm)的缺陷，且向其按压用液氮冷却的金属体60秒以生成冻伤伤口。向伤口应用实施例1或比较例2的脱细胞粉末，用粘合膏覆盖伤口区域，且用纱布覆盖大鼠的躯干的整个周长。七天后，收集伤口区域且用苏木精/伊红染料染色用于组织学估计。包括在不应用脱细胞粉末的情况下用粘合膏覆盖伤口区域的空白。结果显示于表3中。
◎:观察到组织再生，且没有观察到挛缩。
○:观察到组织再生，但在一定程度上观察到挛缩。
△:观察到组织再生，但明显观察到挛缩。
×:观察到患病部分的恶化。
表3
皮下填补法(enthesis)测试 冻伤模型测试
实施例1 ○ ◎
比较例1 △ ×
空白 △ △
皮下填补法测试和冻伤模型测试揭示，本发明的粉末状脱细胞组织对于再生和愈合是高度有效的。
产业实用性
本发明的微粒脱细胞组织具有较低细胞毒性，且具有促进细胞分化的效果和细胞吸引的效果。因此，本发明的微粒脱细胞组织可以合适地用作疾病的治疗材料、组织移植的辅助材料、用于再生治疗的支架材料、用于细胞培养的基础材料等。当本发明的微粒脱细胞组织用作疾病的治疗材料、组织移植的辅助材料或用于再生治疗的支架材料时，其可以原样或将其加工成凝胶、片材、三维结构等之后应用于患病部分。或者，本发明的微粒脱细胞组织可以用于细胞培养，然后应用于患病部分。

Claims (8)

1.用于制备微粒脱细胞组织的方法，其包括将高流体静力压应用于介质中的动物来源的组织的步骤。
2.根据权利要求1的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中所述高流体静力压为2至1,500MPa。
3.根据权利要求1或2的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中在粉碎动物来源的组织之后应用所述高流体静力压。
4.根据权利要求1或2的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中粉碎通过将高流体静力压应用于介质中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。
5.根据权利要求1至4中任一项的用于制备微粒脱细胞组织的方法，其中用不包含阴离子表面活性剂和/或非离子表面活性剂的洗涤液洗涤通过将高流体静力压应用于介质中的所述动物来源的组织而获得的动物来源的脱细胞组织。
6.微粒脱细胞组织，其通过根据权利要求1至5中任一项的用于制备微粒脱细胞组织的方法制备。
7.使用根据权利要求6的微粒脱细胞组织的用于移植或治疗的材料。
8.使用根据权利要求6的微粒脱细胞组织的用于细胞培养的材料。
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