TW202306575A - 去細胞化細胞結構體 - Google Patents

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武藤美音
日渡謙一郎
熊谷光倫
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日商Ａｄｅｋａ股份有限公司
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Abstract

本發明目的在於提供一種具有任意的厚度或特定的形狀之經去細胞化的移植片。 前述課題可藉由一種去細胞化細胞結構體來解決，該去細胞化細胞結構體係本發明之將培養細胞結構體去細胞化之去細胞化細胞結構體，其特徵為空隙率為30%～80%。

Description

去細胞化細胞結構體
本發明係有關於一種去細胞化細胞結構體。
要移植取自他人或不同種動物之生物組織的移植片時，常有被移植者方組織對移植片產生排斥反應的問題。因此，為了提升與生物組織的相容性，有人開發出使用去細胞化組織作為移植片之技術，其中該去細胞化組織係由支持組織(細胞外基質，ECM)所構成，而該支持組織則是由生物組織移除細胞所殘留者。去細胞化係指對被移植者去除具抗原性之核酸等細胞成分，由此可避免免疫排斥。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本特表2005-514971號公報 [專利文獻2]國際公開第2016/136633號 [專利文獻3]日本特開2012-139541號公報 [專利文獻4]日本再表2014-148321號公報 [專利文獻5]日本再表2018-051415號公報 [專利文獻6]日本特開2004-357694號公報 [專利文獻7]日本特開2020-198794號公報 [專利文獻8]日本專利第4517125號公報
[發明所欲解決之課題]
前述去細胞化組織，在藉由將生體組織去細胞化而得到無排斥反應的移植片方面係屬有用。然而，為了得到既定的厚度，有時需要積層步驟之程序。又，亦不易製作特定的形狀。而且，不易維持移植片本身的強度。 從而，本發明目的在於提供一種具有任意的厚度，且可維持硬度之經去細胞化的移植片。 [解決課題之手段]
本案發明人等針對具有任意的厚度或特定的形狀之去細胞化移植片致力進行研究的結果，意外發現藉由將由培養而得之培養細胞結構體(專利文獻3～7)去細胞化，可獲得具有任意的厚度，且可維持硬度的去細胞化移植片。 本發明係基於此種見解者。 從而，本發明係有關於： [1]一種去細胞化細胞結構體，其係將培養細胞結構體去細胞化之去細胞化細胞結構體，其特徵為空隙率為30%～80%； [2]如[1]之去細胞化細胞結構體，其中去細胞化結構體之硬度為0.20～5.00(N)； [3]如[1]或[2]之去細胞化細胞結構體，其中去細胞化細胞結構體之每單位乾燥質量的DNA含量為0.020質量%以下； [4]如[1]或[2]之去細胞化細胞結構體，其係含有(a)分子量：45,000～53,000及(b)等電點：pI 4.00～4.90的蛋白質； [5]如[4]之去細胞化細胞結構體，其中前述蛋白質為微管蛋白； [6]一種去細胞化細胞結構體之製造方法，其包含： 培養細胞結構體形成步驟，係藉由培養細胞而使培養細胞結構體形成；及 去細胞化步驟，係將前述培養細胞結構體去細胞化而使空隙率成為30%～80%； [7]如[6]之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在培養細胞結構體形成步驟中，係於形成培養細胞結構體前，或與其同時將細胞培養成任意形狀； [8]如[7]之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在前述培養細胞結構體形成步驟中，於培養細胞結構體形成前將細胞培養成任意形狀之培養係片狀之細胞的培養、或細胞凝集體的培養； [9]如[6]之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在培養細胞結構體形成步驟後，將細胞培養成任意形狀； [10]如[6]～[9]中任一項之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中前述去細胞化係藉由高靜水壓處理來進行； [11]如[6]～[9]中任一項之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中前述去細胞化步驟中之去細胞前與去細胞化後的厚度維持率為90%以上。 [發明之效果]
根據本發明之去細胞化細胞結構體，可提供一種具有任意的厚度，且可維持硬度的去細胞化移植片。又，本發明之製造方法可維持去細胞化後相對於去細胞化前的厚度，而能夠維持去細胞化前後的形狀。亦即，由於可提供任意厚度之去細胞化材料，由此可提供具有特定形狀的去細胞化材料，而能夠依據移植片或細胞治療等的目標用途，分別使用去細胞化材料。而且，可製作具有強度且無排斥反應的去細胞化材料。
[實施發明之形態]
[1]去細胞化細胞結構體 本發明之去細胞化細胞結構體係將培養細胞結構體去細胞化之去細胞化細胞結構體，其空隙率為30%～80%。
《培養細胞結構體》 本發明之培養細胞結構體係藉由in vitro培養而得的細胞結構體。培養細胞結構體係細胞藉由在細胞外產生細胞外基質(Extracellular matrix，ECM)，而使細胞黏著；只要可維持三維形狀則不特別限定，最小三維距離(厚度)較佳為50μm以上，更佳為100μm以上。其他二維大小亦不特別限定，例如為1mm以上，較佳為6mm以上。藉此，可有效製作去細胞化細胞結構體。 培養細胞結構體的強度亦只要可維持一定的三維形狀，則不特別限定，較佳具有在濕潤狀態下能以鑷子操作處理或可縫合的強度。培養細胞結構體的形狀不特別限定，可舉出例如片狀、管狀或塊狀。藉此，即容易依據移植片或細胞治療等的目標用途，分別製作去細胞化細胞結構體。
本發明之去細胞化細胞結構體可為濕潤狀態或乾燥狀態。以濕潤狀態提供之去細胞化細胞結構體，可於移植時立即使用。另一方面，以乾燥狀態提供之去細胞化細胞結構體則可長期保存且易於運送，可於使用時復原而使用。
細胞可粗分為浮游系細胞及黏著性細胞；培養細胞結構體之細胞不予限定，基於容易製作培養細胞結構體之觀點，較佳為黏著性細胞。 黏著性細胞不特別限定，可依據培養結構體的使用目的適宜選擇。例如分化之黏著細胞可舉出肝細胞、星形膠質細胞、柯弗氏細胞、血管內皮細胞、血竇內皮細胞、內皮細胞、纖維母細胞、成骨細胞、破骨細胞、牙周膜衍生細胞、表皮細胞、氣管上皮細胞、消化道上皮細胞、子宮頸上皮細胞、上皮細胞、乳腺細胞、外被細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、肌細胞、腎細胞、胰島朗格漢斯細胞、末梢神經細胞、神經細胞、軟骨細胞或骨細胞。例如未分化之黏著細胞可舉出胚胎幹細胞(ES細胞)、胚胎生殖細胞(EG細胞)、生殖細胞系列幹細胞(GS細胞)、誘導多能幹細胞(iPS細胞)、間葉系幹細胞、造血系幹細胞、神經系幹細胞、心肌前驅細胞、血管內皮前驅細胞、神經前驅細胞、脂肪前驅細胞、皮膚纖維母細胞、骨骼肌肌母細胞、成骨細胞或生齒細胞。基於容易製作培養細胞結構體之觀點，較佳為皮膚纖維母細胞、間葉系幹細胞、心肌前驅細胞。 細胞的來源亦不特別限定，包含真核細胞、原核細胞、多細胞生物細胞或單細胞生物細胞。真核細胞可舉出動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、真菌、藻類或原生動物。動物細胞不予限定，可舉出取自人類、猴、狗、貓、兔、雪貂、綿羊、山羊、牛、豬、馬、駱駝、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠或沙鼠之細胞。
培養細胞結構體不予限定，較佳為藉由細胞外基質而黏著。藉由黏著於細胞外基質，培養細胞結構體可獲得一定的強度。細胞外基質可舉出例如膠原蛋白、層黏連蛋白、纖連蛋白、硫酸軟骨素、硫酸肝素、硫酸角質素、玻尿酸等，隨細胞的種類而異，不特別限定。
《DNA含量》 去細胞化細胞結構體之每單位乾燥質量的DNA含量為0.020質量%以下，較佳為0.015質量%以下，更佳為0.010質量%以下，再更佳為0.008質量%以下，再更佳為0.006質量%以下，再更佳為0.004質量%以下，再更佳為0.002質量%以下，再更佳為0.0018質量%以下，再更佳為0.0015質量%以下。藉此，可獲得適切地經去細胞化，且移植時排斥反應較少的去細胞化細胞結構體。 DNA含量可藉由PicoGreen法來測定。將去細胞化細胞結構體組成物之乾燥試片(以下有稱為試樣)浸漬於蛋白質分解酵素溶液中予以溶解後，用酚/氯仿進行處理去除蛋白質，並藉由乙醇沉澱法回收DNA。將回收之DNA藉由PicoGreen(Life Technologies公司)進行螢光染色並測定螢光強度，將DNA定量，而算出試樣的DNA含量(質量)。定量係採用使用PicoGreen所附標準DNA所作成的檢量線。由試樣的乾燥質量與DNA含量，依下式計算DNA比： (每單位乾燥質量的DNA含量(以下有稱為去細胞化DNA比)=(去細胞化細胞結構體之乾燥試片的DNA含量)/(去細胞化細胞結構體之乾燥試片的質量)
《空隙率》 本發明之去細胞化細胞結構體的空隙率為30%～80%。空隙率的下限較佳為33%，更佳為37%，再更佳為40%，又更佳為42%，又更佳為44%，又更佳為47%，最佳為50%。空隙率的上限較佳為77%，更佳為73%，再更佳為70%，又更佳為68%，又更佳為66%，又更佳為64%，最佳為55%。透過處於前述範圍，可獲得具有充分強度，且無排斥反應的移植片。又，可提供具有任意的厚度或特定的形狀之去細胞化移植片。 於本說明書中，空隙率的計算係如下進行。將去細胞化細胞結構體的切片，藉由供細胞外基質染色的天狼星紅進行染色。用影像處理軟體解析顯微鏡組織影像，將未經天狼星紅染色的部分判斷為空隙，來計算空隙率。 天狼星紅染色係如下進行。對去細胞化細胞結構體的切片試樣進行去石蠟處理。其次，對切片試樣以鐵蘇木精進行處理。其次，進行採鹽酸/乙醇溶液之處理，及採磷鉬酸水溶液之處理。接著，以天狼星紅(Direct Red 80)實施處理，進行脫水處理並予以封入。 以顯微鏡觀察所得天狼星紅染色切片，使用影像處理軟體(ImageJ)算出空隙率。以倍率10倍對切片進行拍攝，分別量測去細胞化細胞結構體全體的面積與天狼星紅染色部分的面積(圖3)。根據下式計算空隙率。 空隙率(%)=(去細胞化細胞結構體全體的面積-天狼星紅染色部分的面積)/去細胞化細胞結構體全體的面積×100
[2]去細胞化細胞結構體之製造方法 本發明之去細胞化細胞結構體之製造方法係包含：培養細胞結構體形成步驟，係藉由培養細胞而使培養細胞結構體形成；及去細胞化步驟，係將前述培養細胞結構體去細胞化而使空隙率成為30%～80%。
《培養細胞結構體形成步驟(1)》 於前述培養細胞結構體形成步驟(1)中，係藉由培養細胞而形成培養細胞結構體。所用細胞只要是能以in vitro培養之細胞則不特別限定，可為例如由組織或器官直接採取之初代細胞，亦可為由組織或器官直接採取之初代細胞經數代或繼代而得之繼代細胞。又，也可為經長時間繼代而得之繼代細胞。具體而言，可非限定前述「[1]去細胞化細胞結構體」所記載之細胞地使用。 培養細胞結構體可藉由細胞於細胞外產生細胞外基質(Extracellular matrix、ECM)，使細胞彼此黏著、結合而形成，係維持三維形狀。培養細胞結構體之形成方法，只要是利用細胞外基質所產生之黏著者則不特別限定，可採用例如專利文獻3～8所記載之方法。具體而言，可舉出：不使用支架而製造片狀三維結構體之方法(專利文獻3)；積層多個細胞片之方法(專利文獻4)；對藉由多根絲線或者針狀構件形成網目狀空間之支持體，供給細胞凝集體而製造結構體之方法(專利文獻5)；藉由在腔室中培養細胞凝集體而製造之方法(專利文獻6)；藉由培養模具培養細胞凝集體而製造三維細胞結構體之方法(專利文獻7)；或藉由具備貫穿細胞凝集體之絲狀體或針狀體的支持體進行培養而製造之方法(專利文獻8)。此等結構體之製造方法皆為利用由細胞分泌之細胞外基質，使細胞彼此黏著，而使細胞結構體形成之方法。細胞外基質可舉出前述「[1]去細胞化細胞結構體」所記載者，但不特別限定。
例如，藉由如下培養細胞凝集體(球狀體)，可形成培養細胞結構體。用於培養之培養基可依據所用細胞選擇合適的培養基。將細胞凝集體投入至比細胞凝集體的大小更細微之間隙的網狀或梳齒狀支持體所包圍的空腔。空腔係根據網狀或梳齒狀的支持體及平板形成為期望的形狀，支持體有多個開口部分。可由此開口部分使培養基接觸細胞凝集體。在細胞凝集體保持於空腔內的狀態下將搖晃培養用容器搖晃，可使培養基有效地接觸細胞凝集體，而良好地培養出細胞凝集體。細胞凝集體可產生細胞外基質，而製作細胞凝集體彼此黏著並具有期望形狀之三維構造的培養細胞結構體。
在前述培養細胞結構體形成步驟(1)中，可於例如形成培養細胞結構體前，或與其同時將細胞培養成任意形狀。培養成任意形狀係指培養成任意的厚度或俯視形狀。例如可調整面積，使細胞培養成任意的俯視形狀。可積層任意俯視形狀的細胞，調整成任意的厚度及形狀而培養。又，亦可將培養之細胞切成期望的形狀。於前述培養細胞結構體形成步驟(1)中，可與形成培養細胞結構體同時進行培養而形成任意的形狀。例如可與進行形成上述培養細胞結構體之方法同時培養成任意形狀。例如亦可藉由在含有細胞外基質的凝膠中將細胞進行三維(3D)培養，而形成培養細胞結構體。
又，亦可於使培養細胞結構體形成前，以任意的形狀培養細胞。於培養細胞結構體形成步驟中，於培養細胞結構體形成前將細胞培養成任意形狀之培養較佳為例如片狀之細胞的培養或細胞凝集體(球狀體)的培養。培養細胞結構體形成前之培養可舉出例如將細胞培養成任意的俯視形狀，或積層多個專利文獻4所記載之細胞片(片狀之細胞)，並於培養細胞結構體形成前，將此積層之細胞片進行培養。細胞片之培養可依循本領域中通常進行之使用培養盤等之細胞片的製作來實施。將所得細胞片積層並培養，可將細胞培養成任意的厚度及形狀。此後，透過由細胞分泌細胞外基質，使積層之細胞片黏著，可得到維持三維形狀的培養細胞結構體。
進而使培養細胞結構體形成前之培養可舉出例如專利文獻5或7所記載之在使細胞黏著前藉由培養而製作細胞凝集體(球狀體)。黏著性細胞，在漂浮於溶液中的狀態下無法長期生存。將黏著性細胞置於非黏著環境下，細胞便尋求立足處而相互黏著，而形成細胞凝集體。 具體而言，藉由使多個細胞凝集，可製造細胞凝集體(球狀體)。細胞經單層培養後，移至撥水性或細胞非黏著性的圓底多井孔或U字型盤(凹孔盤)進行培養，則細胞會凝集而生成細胞凝集體。至生成細胞凝集體前的培養時間，由效率性觀點而言，較佳為6～48小時，更佳為6～24小時。然而，細胞凝集體之製造方法非限定於前述方法，可採用：將細胞懸浮液置入旋轉中之溶液中的旋轉培養法；於試管中置入細胞懸浮液，以離心分離器使其沉澱的方法，或者海藻酸鹽珠粒法、專利文獻5、6或8所記載之製造方法。基於可大量處理均勻的細胞凝集體之觀點，於撥水性或細胞非黏著性的多井孔中置入細胞懸浮液之方法較為有效而較佳。 藉由調整細胞凝集體(球狀體)的培養時間，可將細胞凝集體培養成任意厚度。又，藉由使細胞凝集體(球狀體)彼此相連，可將細胞凝集體培養成任意的厚度及形狀。進一步培養如此所得之細胞凝集體(球狀體)，而由細胞分泌細胞外基質，使細胞彼此黏著，可得到維持三維形狀的培養細胞結構體。又，透過以如上述投入至空腔的方法培養細胞凝集體(球狀體)，可正確地製作期望三維形狀的培養細胞結構體。 培養細胞結構體形成前將細胞培養成任意形狀時之細胞外基質(Extracellular matrix、ECM)的量較佳少於培養細胞結構體形成時之細胞外基質的量。
又，亦可在培養細胞結構體形成步驟後，將細胞培養成任意形狀。例如可進行形成上述培養細胞結構體之方法後，進一步培養成任意的形狀，又，可舉出以細胞外基質塗覆細胞後，積層成任意形狀而進行培養。 培養細胞結構體形成步驟後將細胞培養成任意形狀時之細胞外基質(Extracellular matrix、ECM)的量較佳與培養細胞結構體形成時之細胞外基質的量相同或較其更多。
《去細胞化步驟(2)》 於前述去細胞化步驟(2)中，係將前述細胞結構體去細胞化而使空隙率成為30%～80%。亦即，去細胞化後之細胞結構體的空隙率為30%～80%。空隙率的下限較佳為33%，更佳為37%，再更佳為40%，又更佳為42%，又更佳為44%，又更佳為47%，最佳為50%。空隙率的上限較佳為77%，更佳為73%，再更佳為70%，又更佳為68%，又更佳為66%，又更佳為64%，最佳為55%。透過處於前述範圍，可獲得具有充分強度，且無排斥反應的移植片。又，可提供具有任意的厚度或特定的形狀之去細胞化移植片。
去細胞化步驟可使用向來週知之方法。去細胞化之方法，只要可獲得本發明之效果則不特別限定，可舉出例如採高靜水壓處理之方法、採冷凍-解凍處理之方法、藉由超音波處理進行處理之方法、使用酵素之方法或以高張電解質溶液進行處理之方法、採物理攪拌之方法、高張溶液低張溶液法、採使用蛋白分解酵素或核酸分解酵素等的酵素處理之方法、採醇溶劑之處理等；可組合此等的2種以上，而為了有效獲得去細胞化細胞結構體，且為了發揮本案發明之效果，較佳為採高靜水壓處理之方法。
藉由前述採高靜水壓處理之方法而得到前述去細胞化結構體時，係對所得細胞結構體於介質中施加50～1500MPa的靜水壓。基於充分進行去細胞化之觀點，施加之靜水壓較佳為50MPa以上；基於不需要可耐加壓之壓力容器、不需要大量能量，同時防止用於施加之介質為水性介質時生成冰，且生成的冰導致細胞結構體受損之觀點，較佳為1500MPa以下。施加之靜水壓更佳為80～1300 MPa，再更佳為90～1200MPa，再更佳為95～1100MPa，再更佳為95～700MPa，基於發揮去細胞化效果、減菌效果及病毒去活化效果且容易施加之觀點，最佳為400～700MPa。
施加靜水壓所使用之介質可舉出水、生理食鹽水、注射用水、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液、糖類水溶液等。緩衝液可舉出乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、HEPES緩衝液、MES緩衝液等。此等介質亦可含有界面活性劑。
高靜水壓處理的溫度只要是不會生成冰，且不會因熱而損傷細胞結構體的溫度則不特別限定，由可順利進行去細胞處理且對細胞結構體的影響較少而言，較佳為0～45℃，更佳為4～37℃，最佳為15～36℃。高靜水壓處理的時間過短的話，無法充分進行細胞的破壞；較長時則會導致能量的浪費；由此，於高靜水壓處理中，維持目標施加壓力之時間較佳為1～120分鐘，更佳為5～60分鐘，再更佳為7～30分鐘。
經前述高靜水壓處理之細胞結構體較佳進行核酸分解酵素處理。核酸分解酵素係供去除來自經施加靜水壓之細胞結構體的核酸成分者，不特別限定，可舉出例如源自胰臟、源自脾臟或源自大腸菌的DNAse(例如DNaseI、DNaseII)。 核酸分解酵素可添加於前述高靜水壓處理所使用之介質(例如水、生理食鹽水、注射用液或緩衝液等)而使其作用。添加之酵素量係隨酵素的種類或單位數(U)之定義而異，只要是本業者則可適宜設定。若例如為DNaseI，只要以50～1000U/mL使用即可。處理溫度亦隨所用核酸分解酵素而異，只要設定為例如1℃～40℃的溫度即可。處理時間亦不特別限定，可為例如1～120小時(較佳為1～96小時，更佳為1～48小時)，如為低溫時，可採長時間處理；如為高溫時則可為短時間之處理。
經前述高靜水壓處理之細胞結構體係經洗淨液洗淨。洗淨液可與高靜水壓處理之介質相同或相異。洗淨液較佳含有有機溶媒或螯合劑。有機溶媒可提升脂質的去除效率，螯合劑則可藉由使去細胞化細胞結構體中的鈣離子或鎂離子去活化，而防止本發明之粒子化去細胞化細胞結構體施用於患部時的石灰化。作為有機溶劑，由脂質之高去除效果而言，較佳為水溶性有機溶劑，宜為乙醇、異丙醇、丙酮、二甲基亞碸。螯合劑可舉出乙二胺四乙酸(EDTA)、氮基三乙酸(NTA)、二伸乙三胺五乙酸(DTPA)、羥乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三伸乙四胺六乙酸(TTHA)、1,3-丙烷二胺四乙酸(PDTA)、1,3-二胺基-2-羥基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、羥乙基亞胺基二乙酸(HIDA)、二羥乙基甘胺酸(DHEG)、二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)、二羧甲基麩胺酸(CMGA)、3-羥基-2,2’-亞胺基二琥珀酸(HIDA)、二羧甲基天冬胺酸(ASDA)等亞胺基羧酸系螯合劑或其鹽；檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸等羥基羧酸系螯合劑或其鹽；此等螯合劑之鹽可舉出鈉鹽或鉀鹽。 洗淨溫度只要是不會因熱而對細胞結構體造成損傷的溫度則不特別限定，由洗淨性良好且對細胞結構體的影響較少而言，較佳為0～45℃，更佳為1～40℃，最佳為2～35℃。進行洗淨時，亦可視需求將洗淨液搖晃或攪拌。
藉由採冷凍-解凍處理之方法而得到前述去細胞化細胞結構體時，係重複進行以下步驟1次或2次以上(較佳為2～5次)：將細胞結構體保持於-85～-20℃(較佳為-82～-40℃)的溫度15分鐘～48小時(較佳為20分鐘～15小時)使其冷凍後，以20～40℃的溫度予以解凍。其後，宜進行核酸分解酵素處理，核酸分解酵素處理可為與前述高靜水壓處理中之處理同樣的方法。經冷凍-解凍處理之細胞結構體，其細胞結構體中的細胞被破壞，將此細胞用洗淨液去除。洗淨之方法可為與高靜水壓處理中之洗淨同樣的方法。
藉由採超音波處理進行處理之方法而得到前述去細胞化細胞結構體時，係將細胞結構體於例如生理食鹽水中進行超音波處理(例如強度：10W/cm 2、頻率：10kHz、作用時間：2分鐘)。其後，較佳用界面活性劑溶液(例如1%質量%Triton X(聚氧乙烯辛基苯基醚)溶液)，以2～10℃(較佳為4℃)搖晃1～120小時(較佳為12～120小時)。進而，宜進行核酸分解酵素處理，核酸分解酵素處理可為與前述高靜水壓處理中之處理同樣的方法。其後，較佳採用與高靜水壓處理中之洗淨同樣的方法進行洗淨。
所得去細胞化細胞結構體不特別限定，較佳進行冷凍乾燥處理。冷凍乾燥可根據細胞結構體的部位而省略。又，所得去細胞化細胞結構體可藉由照射伽瑪射線、照射UV等進行滅菌。
《厚度維持率》 於本發明之去細胞化細胞結構體之製造方法中，在前述去細胞化步驟(2)之去細胞化的前後，可維持厚度。去細胞化前後的厚度維持率不予限定，例如90%以上，更佳為92%以上，再更佳為94%以上。 厚度維持率可如下計算： 厚度維持率(%)=(去細胞化細胞結構體的厚度/去細胞化前之培養細胞結構體的厚度)×100
《硬度試驗》 本發明之去細胞化細胞結構體的硬度，只要可獲得本發明之效果則不特別限定，例如為0.20～5.00(N)。硬度的下限較佳為0.30(N)，更佳為0.40(N)，再更佳為0.50(N)，又更佳為0.60(N)，又更佳為0.65(N)，又更佳為0.70(N)，最佳為0.73(N)。硬度的上限較佳為3.00(N)，更佳為1.00(N)，再更佳為0.95(N)，又更佳為0.90(N)，又更佳為0.87(N)，又更佳為0.83(N)，最佳為0.80(N)。透過處於前述範圍，可獲得具有更充分的強度，且無排斥反應的移植片。將本發明作為移植片而移植時，容易進行以鑷子夾取或以縫合用之外科用針穿刺等操作處理。又，可提供具有任意的厚度或特定的形狀之去細胞化移植片。 於本發明中，硬度的測定係如下進行質地剖面分析(TPA，Texture Profile Analysis)。於室溫下，藉由具備P/4圓柱探針(直徑4mm)的質地分析儀TA.XT plus(英弘精機(股))來測定。將對探針施加0.01(N)之荷重的點設為0點，以0.02mm/秒的速度壓縮0.5mm的距離2次。將最初壓縮循環時的最大力(N)定為硬度。
《蛋白質》 本發明之去細胞化細胞結構體，只要可獲得本發明之效果則不特別限定，包含例如(a)分子量：45,000～53,000及(b)等電點：4.00～4.90的蛋白質。藉此，可進一步發揮本發明之效果。 前述蛋白質的分子量及等電點(pI)可例如將蛋白質進行二維電泳來進行，蛋白質的鑑定則可藉由質譜分析來進行。 於二維電泳法中，可先進行等電點分離及分子量分離之任一項(作為第一維)，而基於提升測定的精確度之觀點，係以第一維進行等電點分離、第二維進行分子量分離為佳。二維電泳法可依循常用方法來進行，可使用市售套組及裝置。例如能以毛細凝膠或條帶凝膠等作為分離介質進行等電點電泳，並將經電泳之凝膠，使用平面狀凝膠(例如SDS-聚丙烯醯胺凝膠)朝與等電點電泳之展開方向垂直的方向進行電泳而進行分子量分離。藉由將經二維電泳之凝膠依循常用方法予以染色，可確認有無蛋白質、分子量、等電點。
前述蛋白質的分子量，基於發揮本發明之效果之觀點，較佳為45,000～53,000，更佳為47,000～51,000，再更佳為50,000～50,500。前述蛋白質的等電點(pI)，較佳為4.00～4.90，更佳為4.40～4.85，再更佳為4.60～4.80。
前述蛋白質較佳可舉出微管蛋白，更佳為α-微管蛋白或β-微管蛋白，再更佳為β-微管蛋白。人體中的微管蛋白存在α(alpha)、β(beta)、γ(gamma)、δ(delta)、ε(spsilon)此5種。微管蛋白係於種間高度保存，形成異二聚體，進而經多聚體化而形成微絲。α-微管蛋白及β-微管蛋白之異二聚體係參與細胞分裂之微管的基本結構單元。α-微管蛋白及β-微管蛋白具有約55000的分子量而雷同。 人類經鑑定有至少7種的β-微管蛋白同型。此等同型，依據羧基末端區之序列，可分類為類型I(HM40)、類型II(Hβ9)、類型III(Hβ4)、類型IVa(H5β)、類型IVb(Hβ2)、類型V及類型VI(Hβ1)(羅馬數字表示蛋白質同型、括弧內標示表示人類基因分類)。類型III(Hβ4)，即tubulin beta-4B chain(Homo sapiens)係形成主要由細胞骨架蛋白質構成之微管的蛋白質，據稱具有維持細胞外形或生理活動之作用。tubulin beta-4B chain係由445個胺基酸所構成的蛋白質(序列編號1)，分子量為50255、pI為4.79。
去細胞化細胞結構體所含微管蛋白的來源，只要是源自於真核生物則不特別限定，較佳為源自於哺乳類或鳥類的微管蛋白。哺乳類可舉出牛、馬、駱駝、羊駝、驢、犛牛、綿羊、豬、山羊、鹿、羊駝、狗、貉、黃鼠狼、狐狸、貓、兔子、倉鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠或浣熊等。又，鳥類可舉出鸚鵡科、鸚鵡、雞、鴨、火雞、鵝、珍珠雞、野雞、鴕鳥、鵪鶉或鴯鶓等。
再者，本發明之去細胞化細胞結構體不予限定，只要可獲得本發明之效果，則可包含微管蛋白之突變體。微管蛋白突變體可舉出例如： (1)於微管蛋白之胺基酸序列(例如以序列編號1表示之胺基酸序列)的一處或多處，整體包含1或多個(較佳為1～10個，更佳為1～7個，再更佳為1～5個)，例如整體包含1～數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列，且具有微管蛋白之活性的多肽或 (2)具有與微管蛋白之胺基酸序列(例如以序列編號1表示之胺基酸序列)的相同性為90%以上的胺基酸序列，且具有微管蛋白之活性的多肽。 微管蛋白之活性可舉出本發明之去細胞化細胞結構體，與不含突變體者相比，使維持去細胞化後的厚度及硬度之能力提升者。
(1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列) 前述突變體亦可為由微管蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列中，1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列所構成的多肽。而且，前述突變體之多肽可維持去細胞化後的厚度及硬度。亦即，未顯示可維持去細胞化後的厚度及硬度之能力之多肽不包含於前述突變體之多肽。於本說明書中，「1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列」係指因胺基酸的取代等而發生突變之意。胺基酸的突變個數可為例如1～30個、1～20個、1～15個、1～10個，較佳為1～8個，更佳為1～6個，再更佳為1～5個，最佳為1～2個。可用於本發明之突變體之胺基酸序列的實例較佳可為其胺基酸具有1或數個(較佳為1、2、3或4個)保存性取代的胺基酸序列。
(與胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列) 前述突變體亦可為由相對於微管蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列，與胺基酸序列之同一性為90%以上的胺基酸序列所構成的多肽。而且，前述突變體之多肽可維持去細胞化後的厚度及硬度。亦即，未顯示可維持去細胞化後的厚度及硬度之能力之多肽不包含於前述突變體之多肽。更佳為由該同一性為95%以上的胺基酸序列，更佳為96%以上的胺基酸序列，更佳為97%以上的胺基酸序列，更佳為98%以上的胺基酸序列，更佳為99%以上的胺基酸序列所構成的多肽，且顯示可維持去細胞化後的厚度及硬度之能力之多肽。
前述微管蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列中「1或數個胺基酸缺失、取代、插入及/或加成之胺基酸序列」或「同一性為90%以上的胺基酸序列」係微管蛋白(例如序列編號1)之胺基酸序列經取代者；此胺基酸序列之取代係維持本發明所使用之微管蛋白之機能的保存性取代。換言之，「保存性取代」係指未喪失微管蛋白之優良效果的取代。亦即，縱為經前述插入、取代或缺失或者加成時，仍可維持去細胞化後的厚度及硬度的取代。具體而言，係指將胺基酸殘基以其他化學上類似的胺基酸殘基替代之意。可舉出例如將某一疏水性殘基由別的疏水性殘基取代的情形、將某一極性殘基由帶有相同電荷的別的極性殘基取代的情形等。可藉由進行此種取代而形成之機能上類似的胺基酸係依每種胺基酸於該技術領域中週知者。非極性(疏水性)胺基酸可舉出例如丙胺酸、纈胺酸、異白胺酸、白胺酸、脯胺酸、色胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸等。極性(中性)胺基酸可舉出例如甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、麩醯胺酸、天門冬醯胺、半胱胺酸等。帶正電荷(鹼性)胺基酸可舉出精胺酸、組胺酸、離胺酸等。又，帶負電荷(酸性)胺基酸可舉出天冬胺酸、麩胺酸等。
前述蛋白質(例如微管蛋白)係形成主要由細胞骨架蛋白質構成之微管的蛋白質，推斷具有可維持細胞外形之作用。亦即，雖不予限定，維持細胞外形之機能研判與維持去細胞化後的厚度及硬度有關。從而，研判前述蛋白質(例如微管蛋白)可有效對去細胞化細胞結構體的強度發揮作用。
本案中，可舉出以下樣態。其係有關於： [1]一種去細胞化細胞結構體，其係將培養細胞結構體去細胞化之去細胞化細胞結構體，其特徵為空隙率為30%～80%； [2]如[1]之去細胞化細胞結構體，其中去細胞化結構體之硬度為0.20～5.00(N)； [3]如[1]或[2]之去細胞化細胞結構體，其中去細胞化細胞結構體之每單位乾燥質量的DNA含量為0.020質量%以下； [4]如[1]～[3]中任一項之去細胞化細胞結構體，其係含有(a)分子量：45,000～53,000及(b)等電點：pI 4.00～4.90的蛋白質； [5]如[4]之去細胞化細胞結構體，其中前述蛋白質為微管蛋白； [6]一種去細胞化細胞結構體之製造方法，其包含： 培養細胞結構體形成步驟，係藉由培養細胞而使培養細胞結構體形成；及去細胞化步驟，係將前述培養細胞結構體去細胞化而使空隙率成為30%～80%； [7]如[6]之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在培養細胞結構體形成步驟中，係於形成培養細胞結構體前，或與其同時將細胞培養成任意形狀； [8]如[7]之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在前述培養細胞結構體形成步驟中，於培養細胞結構體形成前將細胞培養成任意形狀之培養係片狀之細胞的培養、或細胞凝集體的培養； [9]如[6]之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在培養細胞結構體形成步驟後，將細胞培養成任意形狀； [10]如[6]～[9]中任一項之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中前述去細胞化係藉由高靜水壓處理來進行；及 [11]如[6]～[10]中任一項之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中前述去細胞化步驟中之去細胞前與去細胞化後的厚度維持率為90%以上。
本發明非限定於上述實施形態。上述實施形態僅為例示，具有與本發明申請專利範圍所記載之技術思想實質上相同構成，且發揮同樣作用效果者均包含於本發明技術範圍內。 [實施例]
以下藉由實施例具體說明本發明，惟此等非限定本發明之範圍。
《實施例1》 於本實施例中，係使用纖維母細胞，來製造去細胞化細胞結構體。 (培養細胞結構體的製作) 以T-175燒瓶(排氣帽、175cm 2、VIOLAMO公司製)培養NHDF-Neo-皮膚纖維母細胞(CC-2509、Lonza公司製)。在達到約90-100%的滿盤率狀態時予以剝離，調製成細胞懸浮液(10mL)(約2.0×10 7cells)。將凹孔盤設置於10cm培養皿上，添加100%乙醇(10mL)，使其浸潤佈滿於凹孔盤的整個表面，確認無氣泡後加以去除。使用磷酸緩衝液(PBS、0.01M、pH7.4)重複此操作2次。對凹孔盤添加10mL的FKCM培養基(纖維母細胞用無血清培養基、FUKOKU公司製)，充分加入上述細胞懸浮液，於37℃、5%CO 2恆溫箱(IP400、Yamato Scientific)中進行培養。培養一夜，以倒置顯微鏡(CKX31、Olympus)確認凹孔盤內的球狀體(細胞凝集)。進行吸量管吸放以將球狀體自凹孔盤的凹孔中去除，移至10cm培養皿中。使10cm培養皿旋轉，將球狀體集中至中心部加以回收，投入至網模(網模菌元套組V6、TISSUE By NET公司製)中。將網模移至裝有FKCM培養基(80mL)的60mL安全容器(WATSON公司製)，設置於37℃、5%CO 2恆溫箱內的搖動器(OS-762、Optima)，於搖晃下(45rpm)開始培養。以每週1～2次更換培養基的半量，持續進行培養。培養約3週後移去網模，而得到培養細胞結構體。 上述培養細胞結構體之形成方法係表示採用：請求項中，在培養細胞結構體形成步驟中，於形成培養細胞結構體前，將細胞培養成任意形狀之方法；在前述培養細胞結構體形成步驟中，於培養細胞結構體形成前將細胞培養成任意形狀之培養為細胞凝集體(球狀體)的培養之方法所形成之實例者。上述培養細胞結構體之形成方法係表示藉由在將細胞凝集體(球狀體)保持於空腔內的狀態下進行培養，使細胞凝集體產生細胞外基質(Extracellular matrix、ECM)，而形成培養細胞結構體之實例者。
(培養細胞結構體之去細胞化處理) 將由網模取出之培養細胞結構體與FKCM培養基置入尼龍塑膠真空袋(橿美人、KURILON Chemicals公司製)中，以封口機密封四邊成雙層。以FKCM培養基為介質，使用研究開發用高壓處理裝置(Dr.CHEF、神戶製鋼所公司製)以600MPa進行10分鐘高靜水壓處理。高靜水壓處理係於最低溫度：23.3℃、最高溫度：35.9℃的溫度帶實施。將培養細胞結構體自尼龍塑膠真空袋中取出，移至包埋盒(TISSUE-TEK公司製)後，浸漬於生理食鹽水中，以4℃搖晃洗淨5分鐘以上。其後，將培養細胞結構體浸漬於核酸分解酵素的DNaseI溶液(800U/mL)中，以4℃搖晃洗淨18小時以上。其後，將培養細胞結構體浸漬於生理食鹽水中，重複4℃、5分鐘以上的搖晃洗淨3次，而得到去細胞化細胞結構體。
《實施例2》 於本實施例中，係使用纖維母細胞，以200MPa實施高靜水壓處理，而製成去細胞化細胞結構體。 除進行200MPa的高靜水壓處理來替代600MPa的高靜水壓處理以外係重複實施例1之操作，而得到去細胞化細胞結構體。
《實施例3》 於本實施例中，係使用纖維母細胞，以400MPa實施高靜水壓處理，而製成去細胞化細胞結構體。 除進行400MPa的高靜水壓處理來替代600MPa的高靜水壓處理以外係重複實施例1之操作，而得到去細胞化細胞結構體。
《實施例4》 於本實施例中，細藉由冷凍-解凍處理來製造去細胞化細胞結構體。 將由網模取出之培養細胞結構體以乾冰或冷凍庫冷凍，保存於-80℃達30分鐘以上後，在加熱至37℃的磷酸緩衝液(PBS、0.01M、pH7.4)中使其溶解。將經重複此冷凍-解凍3次之培養細胞結構體浸漬於核酸分解酵素的DNaseI溶液(800U/mL)中，以4℃搖晃洗淨24小時。進而，於生理食鹽水中，以4℃搖晃洗淨2小時以上，而得到去細胞化細胞結構體。
《比較例1》 於本比較例中，去細胞化處理係藉由界面活性劑處理來進行。將實施例1中所得之細胞結構體，藉由以下界面活性劑處理去細胞化。 將由網模取出之培養細胞結構體以注射用水於4℃洗淨1小時。其後，將培養細胞結構體以0.25質量%的十二烷基硫酸鈉溶液(10mMTris、pH8.0)於4℃進行處理24小時。接著，將培養細胞結構體以0.5質量%Triton-X(聚氧乙烯辛基苯基醚)溶液(10mM Tris、pH8.0)於4℃進行處理24小時。其後，將培養細胞結構體浸漬於生理食鹽水中，重複4℃、5分鐘以上的搖晃洗淨3次，而得到去細胞化細胞結構體。
《去細胞化DNA比的算出》 測定實施例1～4及比較例1之去細胞化細胞結構體的質量，將其作為試樣，浸漬於蛋白質分解酵素溶液中予以溶解後，用酚/氯仿進行處理去除蛋白質，並藉由乙醇沉澱法回收DNA。將回收之DNA藉由PicoGreen(Life Technologies公司)進行螢光染色並測定螢光強度，將DNA定量，由試樣的質量與DNA的量，算出試樣的DNA含量。此外，DNA的定量係採用使用PicoGreen所附標準DNA所作成的檢量線。使用別的試樣，由試樣的質量(水分量70%)與乾燥之試樣(保存於60℃恆溫槽12小時者)的質量求出乾燥減量比，再由試樣的DNA含量與乾燥減量比，算出試樣每單位乾燥質量的DNA含量。將結果示於表1。 (去細胞化DNA比)=(去細胞化細胞結構體之乾燥試片的DNA含量)/(去細胞化細胞結構體之乾燥試片的質量)
Figure 02_image001
《石蠟包埋組織標本及切片染色試樣的製作》 作為前處理，係將實施例1～4或比較例1中所得之去細胞化細胞結構體浸漬於4質量%PFA(4質量%多聚甲醛磷酸緩衝液、組織固定用FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司製)48小時以上。其後，將去細胞化細胞結構體浸漬於磷酸緩衝液(PBS、0.01M、pH7.4)中，於4℃搖晃洗淨30分鐘以上。接著，將去細胞化細胞結構體浸漬於70質量%乙醇中，於4℃搖晃洗淨30分鐘以上，作成石蠟包埋組織標本製作用之試樣。
依以下程序由上述試樣製作石蠟包埋組織標本，製成染色用之切片染色試樣(後述)。用自來水沖淋組織30分～40分鐘而去除甲醛。使用石蠟包埋裝置(CT-Pro20、Genostaff公司製)，於乙醇浴中按以下順序將試樣脫水。 70質量%乙醇20分鐘(×1)→ 95質量%乙醇20分鐘(×2)→ 100質量%乙醇20分鐘(×2) 進而，於二甲苯中將試樣洗淨2次各20分鐘。將試樣於65℃的石蠟浴中分別培養30分鐘2次。將溶解石蠟注入模具中，再將試樣置於模具中使其冷卻15-20分鐘，製成石蠟包埋組織標本。然後，使用石蠟包埋組織標本，於Microtome上以5μm的厚度連續製作切片，使其浮游於裝有去離子水的37℃水槽中。使切片各以1片載置於載玻片上的蒸餾水上，於伸展台加溫(30-40℃)伸展，置於恆溫器(37℃)中1-2晚使其乾燥，而作成切片染色試樣。
(天狼星紅染色) 依以下程序進行切片染色試樣的天狼星紅染色，而將細胞外基質(Extracellular matrix、ECM)染色。 首先，對切片染色試樣進行脫石蠟處理，使其水合於蒸餾水，以蒸餾水沖洗。其次，將切片染色試樣以鐵蘇木精(鐵蘇木精I(1質量%蘇木精(SIGMA-ALDRICH公司製)/95質量%乙醇)與鐵蘇木精II(武藤化學公司製)以等量混合)進行2分鐘處理，以蒸餾水沖洗。然後，以0.5質量%鹽酸/70質量%乙醇溶液實施3分鐘處理。接著，以0.2質量%磷鉬酸水溶液實施5分鐘處理。接著，以0.1質量%Direct Red80(天狼星紅、SIGMA-ALDRICH公司製)/飽和苦味酸溶液實施90分鐘處理。接著，以0.01N鹽酸施予浸漬處理3次。其後，將切片染色試樣脫水，藉由滲透以二甲苯脫水，並以封入劑(MOUNT-QUICK：大道產業公司製)封入。
《空隙率的算出》 以顯微鏡觀察所得天狼星紅染色切片，以倍率10倍對切片進行拍攝，並使用影像處理軟體(ImageJ)，算出實施例1～4及比較例1之去細胞化細胞結構體的空隙率。讀取切片染色試樣的影像，分別量測去細胞化細胞結構體全體的面積與天狼星紅染色部分(ECM)的面積。 依循下式算出去細胞化細胞結構體的空隙率。作為測定區域，係設定四邊形(310μm×310μm)區域，求出3處的空隙率平均。為了去除大的空洞，而設定不含34,000(約35%)μm 2以上之空洞的區域。 空隙率(%)=(去細胞化細胞結構體全體的面積(測定區域)-實施例或比較例之天狼星紅染色部分的面積)/去細胞化細胞結構體全體的面積(測定區域)×100
《厚度維持率的算出》 由培養細胞結構體的厚度與實施例1～4及比較例1之去細胞化細胞結構體的厚度，算出厚度維持率。此外，培養細胞結構體的厚度，於後述圖2中，係指未處理。 厚度維持率(%)=(去細胞化細胞結構體的厚度/培養細胞結構體的厚度)×100
將空隙率之結果示於圖1、算出厚度維持率之結果示於圖2。就空隙率，實施例1～4為30～80%，比較例1則為更大的值。又，就厚度維持率，實施例1～4，與比較例1相比，可維持去細胞化後相對於去細胞化前的厚度，可知可維持去細胞化前後的形狀。由此可知，藉由使去細胞化細胞結構體的空隙率成為既定值，可維持細胞結構體之去細胞化前後的形狀，而能夠使去細胞化細胞結構體成為任意的形狀。
《硬度試驗》 為測定實施例以及比較例中所得之去細胞化細胞結構體的硬度，而如下進行質地剖面分析(TPA，Texture Profile Analysis)。 TPA係於室溫下，藉由具備P/4圓柱探針(直徑4mm)的質地分析儀TA.XT plus(英弘精機(股))來進行。將對探針施加0.01(N)之荷重的點設為0點，以0.02mm/秒的速度壓縮0.5mm的距離2次。最初壓縮循環時的最大力(N)定係表示硬度。 對於以下製造例1、2亦同樣地進行測定。
(製造例1) 將牛心膜切開成片狀，去除全部脂肪(以下將此片狀牛心膜稱為「心膜片」)。以其為製造例1之心膜片。
(製造例2) 將製造例1之心膜片置入尼龍塑膠真空袋中，對注射用水添加磷酸緩衝液(PBS，0.01M，pH7.4)後以其為介質，使用研究開發用高壓處理裝置，以600MPa進行10分鐘的高靜水壓處理。將經高靜水壓處理之心膜片浸漬於核酸分解酵素的DNaseI(125U/mL)中，於4℃搖晃洗淨18小時以上，接著在80%乙醇中於4℃實施1小時以上之處理，最終於4℃以4L的注射用水進行洗淨。進行冷凍乾燥處理後，照射伽瑪射線(25kGy)。以其為製造例2之去細胞化心膜片(去細胞化組織)。
將試驗結果分別示於圖4。製造例1之心膜片的硬度為10.13(N)、製造例2之去細胞化心膜片(去細胞化組織)的硬度為13.62(N)。 可知實施例與比較例相比，可維持硬度，可作為移植片穩定地利用。尤其可知實施例1，就作為移植片的穩定性，可獲得良好的結果。又，可知實施例比製造例1之心膜片及製造例2之去細胞化組織更加柔軟，具有與此等不同的硬度。
《蛋白質的解析》 以二維電泳解析前述實施例1之去細胞化細胞結構體及比較例1之去細胞化細胞結構體之組成的差異。 對實施例及比較例之去細胞化細胞結構體添加0.3mL蛋白質溶解溶液(含尿素及界面活性劑)，於室溫下以1,400rpm搖晃2小時。以Polytron型均質機予以均質化後，以20,000Xg於室溫下進行離心30分鐘並回收上清液。使用2-D Clean-Up Kit(cytiiva、Global Life Sciences Technologies Japan公司)進行試樣溶液的純化。其後，進行蛋白質定量、導電度測定，確認測定值處於二維電泳實施容許範圍內，而作成二維電泳用試料。 對二維電泳用試料添加緩衝液後，添加蛋白質溶解溶液(含尿素及界面活性劑)而將總量調製成0.34mL而製成試料溶液。將試料溶液倒入膨潤用托盤中，使第一維電泳預製凝膠(Immobiline DryStrip、cytiiva、Global Life Sciences Technologies Japan公司)覆於溶液上。進而疊加乾揭膜液(PlusOne DryStrip Cover Fluid、cytiiva、Global Life Sciences Technologies Japan公司)並靜置一夜。將膨潤之預製凝膠裝設於電泳裝置(Multiphor II Electrophoresis Unit、cytiiva、Global Life Sciences Technologies Japan公司)進行電泳(500V下1分鐘、3500V下7.5小時、20℃)。 使用具有10～20%之濃度梯度的丙烯醯胺凝膠。製作後靜置24小時，使丙烯醯胺完全聚合。將達平衡之第一維電泳預製凝膠放置於丙烯醯胺凝膠上，以含0.125%溴酚藍之1%瓊脂糖溶液固定。對凝膠左端施打分子量標記，作為分子量的標準。以80V進行電泳17小時至凝膠下端可見溴酚藍之譜帶。
《蛋白質染色》 電泳後的凝膠係使用全蛋白質檢測用螢光染色劑(SYPRO Ruby protein gel stain, S21900, Thermo Fisher Scientific Inc.)染色，並使用螢光掃描器保存影像。使用掃描器之影像的讀取係以激發波長：488nm、螢光濾光片：640nm Bandpass、解析度：100micrometer進行。 將所得螢光染色像的tiff影像檔匯入ImageMaster Platinum(cytiiva、Global Life Sciences Technologies Japan公司)，進行數值化解析。於數值化解析，係首先對各凝膠的共同色點按手冊附加標記。按每個凝膠進行標記附加作業至340個色點後，進行凝膠的匹配。根據該作業，對在兩片凝膠(施打實施例1之凝膠及施打比較例1之凝膠)上展開的色點賦予共同的色點ID。其後，進行凝膠的色點檢測，算出色點訊號濃度(%Volume)。 色點訊號濃度係由色點訊號相對於凝膠內全部色點訊號的總和所占的比例來算出。%Volume值係採百分率標示，最小標示係定為0.001%。 將符合下述2條件之色點作為蛋白質鑑定之條件。 ・SYPRO Ruby染色像之色點訊號濃度的合計(以各2片組合時之凝膠彼此的和)為0.1以上。 ・色點的濃度變化量(以各2片組合時之凝膠間的變化量)為0.5倍以下或2倍以上。 將二維電泳的結果示於圖5。就實施例1，於等電點pI 4.00～4.90、分子量45,000～53,000處驗出1個色點(1)。相對於此，比較例1則未驗出實施例1中所驗出的色點。可知實施例1含有比較例1未有的特定蛋白質。
(色點的鑑定) 讀取螢光染色像後，使用硝酸銀(195-09382, FUJIFILM Wako Chemicals股份有限公司)進行銀染色。 切取藉由銀染色而可辨識的色點，對切成1mm見方大小的凝膠片添加15mM鐵氰化鉀、50mM硫代硫酸鈉各100μL並搖晃10分鐘。移除溶液，添加Milli-Q水並搖晃，洗淨至由凝膠片褪色。對凝膠片添加乙腈並脫水。添加100mM碳酸氫銨、0.02μg/μL胰蛋白酶的酵素溶液各10μL使凝膠片膨潤，放置於37℃16小時。添加50μL的0.1%TFA、50%乙腈並搖晃20分鐘，萃取出胜肽。萃取係進行2次。以真空離心機濃縮至胜肽萃取液成為約10μL。使試樣吸附於ZipTip C18(millipore、ZTC18S960)，以60%乙腈、0.1%TFA溶液2.5μL使胜肽溶出。將試樣溶液1μL與CHCA基質溶液1μL混合，滴加至目標盤並使其乾燥後，以質譜儀(ultrafleXtreme)進行測定。基於所得質量值進行登載於資料庫(NCBI RefSeq)之蛋白質的鑑定。 分析裝置 ultrafleXtreme(Bruker Daltonics) 目標盤 MTP Anchorchip 600/384(209513, Bruker Daltonics) 極性 positive mode 檢測模式 reflector mode(300-6,000 m/z) CHCA基質溶液 0.3g/L CHCA、33%丙酮、66%乙醇 MS/MS Ion Search 搜尋條件 鑑定軟體 Mascot(Matrix Science) 資料庫 NCBI RefSeq 搜尋生物物種 human(Genome assembly GRCh38.p13) 酵素 胰蛋白酶 固定修飾 脲甲基化
將實施例1之色點經使用質譜儀進行鑑定的結果示於表2。表2之色點編號係與圖5之色點編號對應。色點經鑑定為微管蛋白。
Figure 02_image003
[產業上可利用性]
本發明之去細胞化細胞結構體可作為無排斥反應之移植片而使用於各種疾病的治療。
[圖1]為表示實施例1～4及比較例1之去細胞化細胞結構體的空隙率的圖表。 [圖2]為表示實施例1～4及比較例1之去細胞化細胞結構體的厚度維持率的圖表。 [圖3]為去細胞化細胞結構體經天狼星紅染色的顯微鏡照片。 [圖4]為表示實施例1～4及比較例1之去細胞化細胞結構體之硬度試驗的結果的圖表。 [圖5]為表示實施例1(A)及比較例1(B)之二維電泳所產生之蛋白質之色點的照片。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003
Figure 12_A0101_SEQ_0004

Claims (11)

  1. 一種去細胞化細胞結構體，其係將培養細胞結構體去細胞化之去細胞化細胞結構體，其特徵為空隙率為30%～80%。
  2. 如請求項1之去細胞化細胞結構體，其中去細胞化結構體之硬度為0.20～5.00(N)。
  3. 如請求項1或2之去細胞化細胞結構體，其中去細胞化細胞結構體之每單位乾燥質量的DNA含量為0.020質量%以下。
  4. 如請求項1或2之去細胞化細胞結構體，其係含有(a)分子量：45,000～53,000及(b)等電點：pI 4.00～4.90的蛋白質。
  5. 如請求項4之去細胞化細胞結構體，其中前述蛋白質為微管蛋白。
  6. 一種去細胞化細胞結構體之製造方法，其包含： 培養細胞結構體形成步驟，係藉由培養細胞而使培養細胞結構體形成；及 去細胞化步驟，係將前述培養細胞結構體去細胞化而使空隙率成為30%～80%。
  7. 如請求項6之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在培養細胞結構體形成步驟中，係於形成培養細胞結構體前，或與其同時將細胞培養成任意形狀。
  8. 如請求項7之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在前述培養細胞結構體形成步驟中，於培養細胞結構體形成前將細胞培養成任意形狀之培養係片狀之細胞的培養、或細胞凝集體的培養。
  9. 如請求項6之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中在培養細胞結構體形成步驟後，將細胞培養成任意形狀。
  10. 如請求項6～9中任一項之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中前述去細胞化係藉由高靜水壓處理來進行。
  11. 如請求項6～9中任一項之去細胞化細胞結構體之製造方法，其中前述去細胞化步驟中之去細胞前與去細胞化後的厚度維持率為90%以上。
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