KR101829407B1 - 인공 장기의 혈관내피화 및 혈관재생 증진 방법 - Google Patents

인공 장기의 혈관내피화 및 혈관재생 증진 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈관내피화 및 혈관재생 증진 방법에 관한 것으로, 본 발명의 방법에 따라 탈세포화된 생체 조직 유래의 스캐폴드에 생분해성 지지체 및 생체활성인자의 혼합물로 코팅하고 내피세포 및 실질세포를 공배양 및 생착하여 혈관내피화시킨 스캐폴드는 내피세포의 생존 및 생착을 위한 생체모방적인(biomimetic) 2D 및 3D 미세환경을 제공하여 혈관내피화 및 혈관재생을 증진시킬뿐만 아니라 혈전 형성을 억제시킬 수 있음을 보여준다.

Description

인공 장기의 혈관내피화 및 혈관재생 증진 방법{Methods for Improving Endothelization and Vascular Regeneration in Bioartificial Organs}
본 발명은 인공 장기의 혈관내피화 및 혈관재생 증진 방법에 관한 것이다.
말기 간 질환 (End-stage liver disease, ESLD)은 세계 각지에서 심각한 문제이다. 비록 간 이식이 ESLD의 치료를 위한 유일한 최종 선택이라고 하더라도, 이식 가능한 장기의 심각한 부족은 환자에게 이용가능한 이러한 치료 선택권을 막는다. 장기 조달과 이식 네트워크(2012)의 보고서에 따르면, 미국의 17,000 명 이상의 사람들이 대기자 명단에 있다. 매년 대기 환자의 약 40%는 간 이식을 받지 못하고, 이러한 환자의 상당수는 사망하거나 또는 이식 동안 매우 고통을 느끼게 된다. 이 문제를 극복하기 위해, 과학자들은 조직 공학을 통한 대체 요법을 추구하기 위해 노력하고 있다. 중요한 방법으로서 탈세포화 기법은 생화학적 조성물, 생물학적 활성, 입체 조직 및 세포 외 매트릭스의 보전성(integrity)을 유지하면서 조직 및 기관으로부터 세포 및 데브리스가 제거되도록 설계되었고, 이는 재분주된 세포들에게 필수적인 기본 ECM-함유 신호들의 유지를 나타낸다. 중요한 것은, 조직공학된 단단한 장기, 예를 들어, 간, 신장 및 심장은 구조적 및 기능적으로 원래 상태와 유사해야 한다. 탈세포화된 간은 내피세포 층이 부족하고, 이로 인한 혈전형성은 체외 혈액 관류 동안 또는 생체내 이식 후 예상되는 합병증이다. EC에 의한 혈관층은 탈세포화된 기관 내 비-혈전증 장벽을 제공하고, 생체 내 혈류가 혈관 공간으로 인해 제한되어 실질세포가 상기 흐름에 의해 생성된 전단 응력(shear stress)으로부터 보호되도록 하는데 필수적이다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 돼지 간의 탈세포화된 오른쪽 측면 간엽을 효율적으로 재-혈관내피화(re-endothelization)할 수 있는 간단하고 안전한 기술을 개발하였다.
탈세포화된 간 내의 혈관은, 재세포화(recellularization)에 따라 내피세포가 접착시킬 수 있는 중요한 성장 인자를 유지하고 있으나 여전히 천연 내피세포 층의 부재로 인해 혈관으로의 부착 대신 실질조직으로의 세포 이동을 초래할 수 있다. 따라서, 본 발명은 젤라틴을 이용하여 보다 점성이 있는 혈관을 만들어서, 이후 혈관 표면상의 재분주된 내피세포의 접착을 촉진하고 실질조직으로의 이동을 감소시키는 것이다. 또한, 세포 부착 및 확산을 유도하는 혈관 표면의 능력을 증가시키기 위해, 혈관 표면으로의 세포-접착성 분자를 이용할 수 있다. 헤파린은 비-혈전성 특성 및 내피세포 결합능을 갖기 때문에 적용할 수 있는 좋은 방법이다. 높은 전하으로 인해, 헤파린은 비-특이적 방식으로 피브로넥틴, 비트로넥틴, 혈소판 유래 성장 인자와 같은 다양한 혈장 단백질과 다양한 상호 작용한다.
분자량 및 전하 밀도가 내피세포에 결합하는 헤파린의 효율을 결정하는 중요한 요소이다. 헤파린의 더 높은 전하 밀도 및 고분자량은 내피세포과의 결합 정도를 향상시키는 것으로 나타났다. 본 발명은 헤파린-젤라틴 혼합물을 사용하여 돼지 간의 탈세포화된 오른쪽 측면 간엽의 맥관구조 표면을 코팅한 후, 혈관내피세포를 주입하여 전체 내피세포화된 인간-크기 기관을 생체공학적으로 제작하는 것이다.
본 발명자들은 탈세포화된 생체 조직 유래의 스캐폴드를 이용한 조직공학용 생체 인공 간을 제작하기 위한 방법을 개발하고자 예의 노력하였다. 그 결과, 헤파린-젤라틴 혼합물로 코팅한 후 혈관내피세포를 주입하여, 간 세포외 매트릭스로부터 지략적인 플랫폼으로서 생체 적합한 탈세포화된 생체 조직 유래의 생체적합성 스캐폴드인 3-차원 바이오 매트릭스를 제공하고 탁월한 상기 혈관내피세포의 생체 적합성 및 이식생존율 뿐만 아니라 혈전 생성 방지 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 탈세포화 조직의 혈관내피화(endothelialization) 또는 혈관재생 증진 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 혈관내피화된 탈세포화 조직을 제공하는 데 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 탈세포화 조직의 혈관내피화(endothelialization) 또는 혈관재생 증진 방법을 제공한다:
(a) 생체 조직을 탈세포화(decellularization)하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 탈세포화된 조직을 생분해성 지지체 및 생체활성인자의 혼합물로 코팅하여 스캐폴드를 제작하는 단계; 및
(c) 상기 (b) 단계의 상기 스캐폴드에 1 종 이상의 세포를 접종하고 배양하여 혈관내피화시키는 단계.
또한, 본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법에 따라 혈관내피화 및 혈전 생성이 억제된 탈세포화 조직, 스캐폴드 또는 이를 포함하는 인공 장기를 제공한다.
본 발명의 방법은 상기 (c) 단계에서 한 가지 유형 이상의 세포(즉, 세포의 칵테일) 집단을 스캐폴드에 도입시킬 수 있다.
즉, 상기 혈관내피화에 이용하기 위하여 특정 세포주와 동일 및/또는 상이한 세포주와 공동-배양하는 단계를 추가적으로 실시할 수 있으며, 상기 세포주는 당업계에 공지된 어떠한 세포도 이용될 수 있으며, 생착을 유도하고자 하는 세포의 유형 및 단계에 따라 다양하게 단독 또는 조합하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 세포 집단은 내피세포를 포함하고, 보다 바람직하게는 내피세포 및 상기 내피세포와 동일 또는 상이한 종류의 1 종 이상의 세포주를 포함하며, 가장 바람직하게는 내피세포 및 상기 내피세포와 상이한 종류의 1 종 이상의 세포주를 포함한다.
상기 상이한 종류의 1 종 이상의 세포주는 동종 또는 이종일 수 있고 바람직하게는 동종으로부터 유래한 세포주이다.
상기 동종의 상이한 세포주는 해당 장기의 구성세포인 실질세포(parenchymal cell)를 의미하며, 본 발명에서 상기 해당 실질세포로 간 실질세포로서 간세포(hepatocytes)를 포함하는 것이 바람직하다.
상기 (a) 단계의 생체 조직은 포유류로부터 분리된 조직으로, 탈세포화시켜 세포외 기질(ECM, Extracellular Matrix)을 수득할 수 있는 한 어떠한 포유류의 조직도 포함할 수 있다.
바람직하게는, 돼지, 소, 말, 토끼, 개, 고양이, 양, 염소, 인간, 비인간 영장류, 기니 피크, 또는 설치류으로부터 분리된 조직이고, 보다 바람직하게는 돼지 또는 소이며, 가장 바람직하게는 돼지이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 생체 조직은 포유류로부터 분리된 간, 심장, 신장, 위, 소장, 대장, 비장, 방광, 폐 또는 피부일 수 있고, 보다 바람직하게는 간 또는 심장이며, 가장 바람직하게는 간이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "스캐폴드(scaffold)"란, 조직공학(Tissue engineering)에 사용되는 용어로서, 생체 세포를 안착시켜 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용하는 구조물을 말하며, 바이오 스캐폴드란 생체 구조물 즉, 생체 장기를 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후, 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 의미한다.
본 명세서에서 본 발명의 방법에 따라 제작된 혈관내피화된 탈세포화 조직 을 언급하면서 사용되는 용어 "인공 장기"는 본 명세서에서 스캐폴드와 혼용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "혈관내피화(endothelialization)"는 탈세포화된 스캐폴드의 생체적합성을 향상시키기 위해 내피세포를 스캐폴드 벽에 부착배양하여 세포외기질층을 형성시켜서 자연혈관과 유사한 형태의 환경을 제공하는 것이다.
본 발명에 따르면, 본 발명의 혈관내피화 스캐폴드는 1) 탈세포화로 인하여 세포 구성물이 제거되어 이식시 면역 거부 반응이 최소화되고, 2) 세포 성장과 분화에 관여하는 세포외기질 및 단백질이 보존되고, 3) 간소엽 구조가 보존되어 세포 주입 후 산소 및 영양 공급이 가능하고, 원래 장기 그대로의 형태와 구조가 유지될 뿐만 아니라 4) 헤파린-젤라틴 혼합물 코팅층이 내피세포 및/또는 실질세포의 생착을 도우며 5) 혈전 생성을 막는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonic solution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 계면활성제는 통상의 계면활성제가 이용될 수 있으며, 이의 농도는 0.1 내지 10%가 바람직하다.
바람직하게는, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상이고, 보다 바람직하게는 SDS(sodium dodecyl sulfate) 또는 Triton-X이고, 가장 바람직하게는 SDS (sodium dodecyl sulfate)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "생분해성 고분자"는 생체 내에서 일정 기간 후 자발적으로 서서히 분해되는 것으로, 생체적합성, 혈액친화성, 항(抗)석회화 특성, 세포의 영양성분 및 세포간 기질 형성능 중에서 하나 이상의 특성을 갖춘 고분자를 의미한다. 이러한 생분해성 고분자는 본 발명에서 특별히 그 종류를 한정하지는 않으나, 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 생분해성 고분자는 젤라틴, 콜라겐, 피브린, 키토산, 알지네이트, 히알루론산, 덱스트란, 폴리락트산, 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리(락트산-co-글리콜산)(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤), 폴리안하이드리드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐알코올, 폴리에틸렌글리콜, 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용할 수 있고, 보다 바람직하게는 젤라틴, 콜라겐, 피브린 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 젤라틴이다.
이때 생분해성 고분자의 함량은 5 내지 99 중량%인 것이 바람직하다. 만약 상기 생분해성 고분자의 함량이 상기 범위 미만이면 코팅층의 기계적 강도가 약해지는 반면, 이의 함량이 상기 범위를 초과하면 세포의 파종이 어려워지는 문제점이 발생할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (b) 단계의 생체활성인자는 항혈전제, 항생제, 또는 호르몬이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항혈전제는 헤파린이다.
혈관을 포함하고 있는 본 발명의 스캐폴드의 생체적합성 향상에 있어서 중요한 것은 혈전생성을 막는 것이다.
본 발명에 적합한 헤파린은 혈전 생성 억제능을 갖는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 헤파린은 1 ㎍/㎖ 내지 100 ㎎/㎖의 농도로 이용될 수 있다.
본 발명에 따르면, 생분해성 고분자 및 항혈전제는 1:1 내지 100의 중량비로 혼합 후 처리하거나 또는 생분해성 고분자 및 항혈전제는 1:1 내지 100의 중량비로 개별 처리할 수 있으며, 바람직하게는 1:1 중량비로 혼합 처리하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계의 스캐폴드는 혈관내피 성장인자(VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장 인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF) 및 인슐린 유사 성장인자 (IGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 성장인자를 포함하여 내피세포의 부착성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 적합한 성장인자는 세포에 접착활성을 갖는 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 상기 성장인자는 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 이용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 스캐폴드 내에 존재하는 VEGF 및 bFGF의 함량을 확인하였고 상기 성장인자들은 세포에 존재하는 수용체와 결합하여 내피세포의 배양 시 이들의 생착에 중요한 생물학적 기능을 발휘할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 (c) 단계의 혈관내피화된 스캐폴드는 혈전 형성에 관련된 유전자인 THBS1(thrombospondin 1), TBXAS1(thromboxane A synthase 1), 및 PLSCR1(phospholipid scramblase 1) 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 감소된다.
본 발명에서, 상기 (c) 단계의 혈관내피화는 하기 단계로 실시될 수 있다:
(c1) 탈세포화된 스캐폴드를 대상으로 세포배양 배지로 관류시키는 단계;
(c2) 실질세포를 주입시키는 단계;
(c3) 상기 실질세포가 실질 내에 고정되도록 인큐베이션시키는 단계;
(c4) 상기 인큐베이터 동안 상기 스캐폴드에 세포배양액으로 관류시키는 단계;
(c5) 상기 스캐폴드에 헤파린-젤라틴 혼합제를 관류하여 혈관내벽을 코팅시키는 단계;
(c6) 상기 스캐폴드에 헤파린-젤라틴 혼합제가 고정되도록 인큐베이션시키는 단계;
(c7) 상기 스캐폴드에 내피세포를 주입하여 혈관에 분포시키는 단계; 및
(c8) 상기 스캐폴드에 내피세포가 고정되도록 인큐베이션시키는 단계.
본 발명의 목적에 따라 원하는 각 단계 중 소요되는 시간, 횟수 등은 당업자에 의해 변형 및 조절될 수 있다.
따라서, 본 발명의 방법에 따른 결과물인, 탈세포화된 후 생분해성 지지체 젤라틴 및 생체활성인자 헤파린의 혼합물로 사전 코팅처리하고 내피 세포 및 간 실질 세포주를 공-배양 및 생착하여 혈관내피화시킨 스캐폴드는 내피세포 생착 또는 배양을 위한 미세환경을 조성하여 세포의 생존율을 증가시킬 뿐만 아니라 항-혈전 형성 효과를 나타낸다.
본 발명의 방법에 따라 탈세포화된 생체 조직 유래의 스캐폴드에 생분해성 지지체 및 생체활성인자의 혼합물로 코팅하고 내피세포 및 실질세포를 공배양 및 생착하여 혈관내피화시킨 스캐폴드는 내피세포의 생존 및 생착을 위한 생체모방적인(biomimetic) 2D 및 3D 미세환경을 제공하여 혈관내피화 및 혈관재생을 증진시킬뿐만 아니라 혈전 형성을 억제시킬 수 있음을 보여준다.
도 1은 돼지 오른쪽 간엽의 탈세포화를 보여준다.
도 2는 간문맥 디스크상에서의 EC 부착능 및 이동성에 대한 헤파린-젤라틴(HG) 혼합물의 효능을 보여준다.
도 3은 EA.hy926 EC를 이용한 돼지 간의 재-내피세포화를 보여준다.
도 4는 재-내피세포화된 돼지 스캐폴드의 체외 혈액 관류를 보여준다.
도 5는 HepG2 및 EA.hy926의 공동-배양을 보여준다.
도 6은 이식 1 시간 후의 스캐폴드의 특성을 보여준다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실험 방법 및 재료
간 획득 및 간 절편의 탈세포화
모든 절차는 강원대학교의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. 40kg 내지 50kg 무게의 성돈을 직접 도축하고 내장을 제거한 후, 간을 획득하였다. 공지된 프로토콜에 따라 탈세포화를 실시하였다.
간략하게, 문맥의 오른쪽 분기에 삽관하고, 오른쪽 측면 간엽을 헤파린 인산염 완충 식염수 (PBS)로 플러싱하여 혈액을 제거하였다. 연동 펌프를 이용하여 9 ± 2.5 시간 동안 60 ㎖/100g 간엽/분의 유속으로 멸균 증류수에 녹인 0.1% SDS(sodium dodecyl sulfate; BioShop Canada, Inc, Burlington, Ontario Canada)로 간엽 맥관을 관류시켰다. 이후, 간엽에 12 시간 동안 PBS를 주입하여 잔류 SDS를 플러싱하였다. 간엽의 분리 및 절단면 봉합 후, 간엽을 침지시키고, 0.1% PAA (peracetic acid; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)로 2 시간 동안 관류시켜 살균 하였다. 최종적으로, 간엽을 6 시간 동안 PBS로 광범위하게 세척하고, 1% 페니실린 스트렙토마이신 항생제(P/S; Gibco, Grand Island, NY, USA)를 함유하는 PBS로 4℃에서 재세포화(recellularization)까지 보존하였다.
조직학적 및 면역조직화학 검사
정상 및 탈세포화된 간의 샘플들을 10% 중성 포르말린에 고정시킨 후 파라핀에 포매하였다. 4-마이크론 두께로 섹션을 절단한 후 헤마톡실린-에오신(hematoxylin-eosin)이나 베르회프 반 기슨(Verhoeff-van Gieson)으로 염색하였다. 핵 및 세포질 물질을 제거하는 본 발명의 효율을 확인하기 위해, 4',6- 디아미디노-2-페닐인돌을 이용하여 핵 물질의 존재를 평가하였다.
웨스턴 블롯 분석
정상 및 탈세포화된 조직 샘플들을 프로테아제 억제제 칵테일(Intron Biotechnology, Sungnam, South Korea)이 함유된 PRO-PREP 단백질 추출 용액)에 용해시켰다. 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)를 사용하여 측정하였다. 동일한 양의 단백질(30 ㎍/웰)을 10% SDS-PAGE에 로딩하여 전기영동하였다. 분리된 단백질들을 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막(Pall Co., Ann Arbor, MI, USA)에 트랜스퍼하고, 블롯들을 항-α gal 항체(1:3000, ALX-801-090-L002, clone M86; Enzo Life Sciences, Switzerland)로 탐지하였다. 항-actin (1:5000, Sigma-Aldrich)을 대조군 및 세포질 마커로서 사용하였다. 막들을 종 특이 고추냉이퍼옥시다제가 결합된 이차 항체(1:4000, Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)로 배양하였다. 최종적으로 막들을 ECL 플러스 웨스턴 블롯 검출 키트(GE Healthcare, Pittsburgh, PA)로 배양하고, 밴드들은 X-선 필름(GE Healthcare, Waukesha, WI, USA)에 대한 노출에 의해 가시화하였다.
성장 인자 분석법
정상 및 탈세포화된 간문맥(portal veins)을 동결건조시킨 후 우레아-헤파린 추출 완충액에 현탁하였다. 추출 완충액은 2M 우레아 및 pH 7.4의 프로테아제 억제제가 포함된 50 mM 트리스에 녹인 5 ㎎/㎖ 헤파린으로 구성된다. 추출 혼합물을 30 시간 동안 4℃에서 진탕한 후 30 분 동안 13,000g에서 원심분리 하였다. 상층액을 수집하고, 각 상층액 내 총 단백질의 농도를 제조사의 프로토콜에 따라 브래드 포드(Bradford) 단백질 분석으로 측정하였다. 혈관 내피 성장 인자 (Vascular endothelial growth factor, VEGF)와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (basic fibroblast growth factor, bFGF)를 돼지 VEGF (Biotain Pharma Co., Ltd., China) 및 인간 bFGF (Sigma-Aldrich) 효소 결합 면역 분석 키트(ELISA)을 이용하여 정량하였다.
인간 EA . hy926 내피 세포주 및 간암 세포( HepG2 세포)의 배양
ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)로부터 획득한 EA.hy926 내피세포/ HepG2 간암세포주를 10% FBS(fetal bovine serum; Hyclone, Logan, UT, USA) 및 1% P/S가 보충된 DMEM에서 37℃ 및 5% CO2의 습도 배양기에서 배양하였다. 트립신/EDTA 용액(0.05% trypsin, 0.53 mM EDTA·4Na; Gibco/BRL)을 이용하여 EA.hy926 세포/HepG2의 현탁액을 컨플루엔트 배양 접시로부터 획득한 후 혈구계산기를 이용하여 세포 농도를 결정 하였다.
시험관내 세포 부착 분석
EA.hy926 내피세포의 접착을 지지하는 혈관의 능력을 평가하기 위해, 오른쪽 측면 간엽의 탈세포화 및 살균 후 간문맥을 분리한 후 디스크 형태로 절단하여 48-웰 플레이트로 배치시켰다. 이러한 디스크들에 0.1 wt% 헤파린 소디윰 염(H4784; Sigma-Aldrich)을 함유하는 0.1% 젤라틴(Sigma-Aldrich), 또는 0.1% 젤라틴 단독으로 1 시간 동안 처리하였다. PBS로 처리된 혈관의 디스크는 음성 대조군으로 보관하였다. 1 시간 처리 후, 사용된 용액을 흡입한 후, 물질의 표면 상에 20 x 103 EA.hy926 내피세포를 포함하는 세포 현탁액 300 ㎕을 상기 물질의 표면에 첨가하고, 플레이트를 3 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하여 세포가 부착될 수 있도록 한다. 물질 기판을 PBS를 사용하여 세척하고, 3 시간 후에 다른 플레이트로 트랜스퍼하여, 물질에 부착된 세포가 방해 받지 않고 남아있을 수 있도록 하였다. 이어서, 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 배양하였다. 16 시간 후, 5 mg/mL 3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐테트라브로마이드(MTT; Sigma-Aldrich) 30 ㎕을 각 웰에 첨가한 후 4 시간 동안 5% CO2, 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 배지를 흡입하고, 300 ㎕ 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 각 웰에 첨가하여 포르마잔을 용해하였다. 10 분 인큐베이션 후, 각 기판 웰로부터 100 ㎕ 용액을 다른 96-웰 플레이트에 피펫팅하였다. 그 후, 570 ㎚ 테스트 파장 및 630 nm 참조 파장으로 분광 광도계를 사용하여 흡광도를 측정하여 샘플의 시그널을 획득하였다.
또한, 제조사의 지침에 따라 Live/Dead assay kit (calcein-AM/ethidium Bromide homodimer, Invitrogen)을 이용하여 세포 생존율을 측정하고, 면역형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)을 이용하여 이미지를 획득하였다.
0.1%wt 헤파린 및 0.1% 젤라틴의 혼합물로 혈관을 코팅하는데 필요한 시간을 최적화하기 위해, 본 발명자들은 30, 60 또는 120 분 동안 혈관에 처리한 후, 물질의 표면 상에 20 x 103 EA.hy926 내피세포를 포함하는 세포 현탁액 300 ㎕을 상기 물질의 표면에 첨가하고, 플레이트를 3 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션하여 세포가 부착될 수 있도록 한다. 이어서, 플레이트를 5% CO2, 37℃에서 16 시간 동안 인큐베이션한 후, MTT 분석을 실시하였다. 또한, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole; Sigma-Aldrich)로 세포를 표지하여 형광 현미경을 이용하여 기판에 부착된 세포를 관찰하였다. ImageJ 소프트웨어(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)를 이용하여 웰당 2 구역의 DAPI-표지 세포를 계수하였다.
EC 이동성 분석
EC의 이동성을 자극하는 비코팅- 및 코팅-탈세포화 혈관의 능력을 확인하기 위해, 8 ㎛의 공극 크기 Millicell Cell Culture Inserts (EMD Millipore, Billerica, MA, USA)를 사용하여 트랜스 웰 챔버 분석을 실시하였다.
간략하게, 헤파린-젤라틴 혼합물 또는 젤라틴 단독 또는 PBS로 전처리한 탈세포화된 혈관 디스크를 24 웰 플레이트의 하부 챔버의 바닥에 놓았다. 0.5 % FBS를 넣은 DMEM 600 ㎕을 하부 챔버에 첨가하였다. DAPI로 표지한 100 ㎕ 1 x 105 EA.hy926 내피 세포의 현탁액을 상부 챔버 내에 씨딩하였다. 플레이트는 세포가 이동할 수 있도록 6 시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 6 시간 배양 후, 상기 멤브레인의 상측에 남아있는 세포를 면봉으로 닦아냈다. 트랜스 웰 막을 PBS로 세정한 후, ImageJ 소프트웨어를 이용하여 임의의 5 현미경 부분의 하부 구획에서 형광을 측정함으로써 하부 챔버로 이동한 세포들을 평가하였다.
생물 반응기 설계 및 간엽 배양
맞춤 제작한 폐쇄 관류 시스템을 인큐베이터 안에 구축하여 탈세포화된 돼지 간엽의 재-혈관내피화(re-endothelization)를 위한 생물 반응기로 사용하였고, 이는 간엽의 챔버로서 2L 유리병, 연동 펌프를 사용하여 실리콘 튜브를 통해 배지 순환하는 0.5L 배지 저장 병으로 구성된다. 배지는 교반기로 교반되면서 저장 병의 배지 내로 산소가 직접 펌핑된다. 배지는 각각 5-8 mL의 유동 속도 및 분당 1 mL로 스캐폴드의 간문맥 및 간동맥의 오른쪽 분기를 통해 관류 및 순환시켰다. 출구는 장기 챔버 내로 수동적으로 배수시킨다. 배지로 30 분 관류 후, 3 방향 스톱 콕을 사용하여 IVC를 닫은 상태에서 중력 흐름 하에 젤라틴과 헤파린 혼합물을 간문맥 및 간동맥 모두를 통해 주입하고, 스캐폴드는 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 간 스캐폴드는 IVC를 통해 배수시켜 10 분 동안 PBS로 관류하여 세척 하였다. 15 ~ 20 분 간격으로 4 단계의 중력 흐름 하에서 총 350 x 106 및 150 x 106 세포를 간문맥 및 간동맥 각각으로 주입한 후, 1 시간 동안 배양하여 세포가 부착되도록 하였다. 문맥을 통한 5-8 mL/분의 유속을 10 일의 인큐베이터에서 재-혈관내피화 처리과정 동안 유지하였다. 이어서, 간 매트릭스는 추가 분석을 위해 관류 시스템으로부터 제거하였다.
생체 전체-혈액 관류
스캐폴드 혈전형성 및 혈관내피화의 효율을 측정하기 위하여, 사전코팅/비코팅 재-혈관내피화 스캐폴드를 생물 반응기에서 10 일 후 회수한 후, 관류 배지(1:1)와 혼합한 새롭게 획득한 돼지의 혈액으로 24 시간 관류시켰다. 비-씨팅 탈세포화된 스캐폴드는 대조군으로 사용하였다. 혈액으로 24 시간 배양 후, 바이오스캐폴드를 PBS로 세정하여, 스캐폴드의 조각을 10% 완충 포르말린에 고정시켰다. 혈액 샘플을 상이한 시점에서 채취하여 표준 방법에 따라 혈구 계수기를 사용하여 혈소판 세포를 계수하였다. 또한, 조직 샘플을 이용하여 PCR 분석하였다.
내피 세포 및 HepG2 세포로 씨딩한 돼지 스캐폴드
450 x 106 HepG2 세포들을 간문맥을 통해 2 ㎖/분의 유속 하에서 15 분 간격으로 세 단계로 주입하였다. 60 분이 끝날 무렵, 관류물을 수집하고, 간에서 유지되지 않은 세포 수를 혈구 계산기로 확인하였다. 탈세포화된 간에 이식된 총 세포수는 최초 씨딩된 세포수 및 재씨딩후 관류물에서 확인된 세포수 간의 차이로 계산되었다. 생물반응기를 1 시간 동안 인큐베이터에 위치시켜서 세포가 부착되도록 하였다. 1 시간 후, 본 발명자들은 24 시간 동안 5-8 mL/분의 유속으로 스캐폴드에 배양 배지를 순환시켰다. 이어서, 스캐폴드는 상술한 바와 같은 헤파린-젤라틴 코팅 후 혈관내피세포 관류를 실시하였고, 10 일 동안 인큐베이터에 보관하였다. HepG2 세포로 재씨딩한 스캐폴드는 대조군으로 사용 하였다. 실험은 3 회 이상 반복하였다. 관류물으로부터 샘플을 3, 5, 7, 8 및 10 일에 수집하여, 알부민 정량을 위해 -80℃에 저장하였다.
면역조직화학
재-혈관내피화된 간 스캐폴드로부터의 파라핀 섹션을 탈 파라핀, 재수화시키고 항원 회복을 실시하였다. 슬라이드는 혈소판 내피세포 부착 분자-1 (Sigma-Aldrich)에 대한 항체 및 Ki-67 항체(Abcam)로 배양하였다. 슬라이드는 고트 항-마우스 IgG-FITC 또는 텍사스 레드 고트 항-래빗 IgG(Invitrogen)으로 한 시간 동안 배양하였다. 또한, 혈액 관류 후 재-혈관내피화된 스캐폴드의 절편을 항- 인테그린 aIIb 항체 (Santa Cruz Biotechnology Inc.) 및 텍사스 레드 고트 항- 래빗 IgG 2차 항체를 사용하여 혈소판 표지에 대하여 염색하였다. 본 발명자들은 DAPI-함유 마운팅 배지(Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)로 마운팅하고 면역형광 현미경으로 확인하였다.
세포사 (Cell death) 평가
세포사를 검출하기 위해, 제조업체의 프로토콜에 따른 인 시츄 세포 사멸 검출 키트(Roche Diagnostics Gmbh, Mannheim, Germany)를 사용하여 TUNEL(transferase-mediated uridine 5-triphosphatebiotin nick end-labeling)를 실시하여 재-혈관내피화 간 스캐폴드의 파라핀-포매 절편에 있는 닉이 생긴 DNA(nicked DNA)를 염색하였다. DAPI를 함유한 벡타쉴드 마운팅 배지로 슬라이드들을 마운팅하고 면역형광 현미경을 이용하여 이미지화하였다.
PCR 분석
3 차원 스캐폴드 상의 내피세포의 기능과 세포 자멸(apoptosis)을 평가하기 위하여, 제조업체의 지시에 따라, 트리졸 용액 (Invitrogen)를 이용하여 재-혈관내피화 간 스캐폴드 및 단층으로 배양된 세포들부터 총 RNA를 추출하였다. 또한, RNA 분리를 위한 혈액 샘플을 수집하여 하이브리드-RTM 혈액 RNA 키트 (GeneAll, Seoul, Korea)를 사용하여 혈전형성을 확인하였다. 전체 RNA 중 1 ㎍, 랜덤 프라이머, 및 GoScript 역전사효소를 사용하여 cDNA를 합성하였다(Promega, Seoul, South Korea). TProfessional 96 표준 구배 기계 (Biometra)를 사용하여 추출한 cDNA 50 ng을 이용하여 PCR 분석하였다. 프라이머 서열은 표 1에 요약하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 94℃에서 3 분 후 94℃에서 30 초 34 사이클, 어닐링 온도에서 30 초, 및 72℃에서 45 초, 최종 연장 72℃에서 10 분. PCR 산물을 에티듐 브로마이드로 염색된 1.5% 아가로스겔에서 분석하였다. 상대적인 유전자 발현을 Image J 소프트웨어로 정량하고, GAPDH를 내인성 대조군으로 이용하였다.
프라이머 서열 어닐링 온도(℃)
Human ALB F 5'-TGCTAATTTCCCTCCGTTTG-3' (서열번호 1)
R 5'-CTGAGCAAAGGCAATCAACA-3' (서열번호 2)		 56.4
Human CYP2E1 F 5'-CGTGGAAATGGAGAAGGAAA-3' (서열번호 3)
R 5'-GGTGATGAACCGCTGAATCT-3' (서열번호 4)		 57.6
Human GPX1 F5'-CGCCAAGAACGAAGAGATTC-3' (서열번호 5)
R 5'-CCCACCAGGAACTTCTCAAA-3' (서열번호 6)		 58.4
Human HMGCR F 5'-TACCATGTCAGGGGTACGT-3' (서열번호 7)
R 5'-CAAGCCTAGAGACATAATCAT-3' (서열번호 8)		 56.8
Human LDLR F 5'-CAATGTCTCACCAAGCTCT-3' (서열번호 9)
R 5'-TCTGTCTCGAGGGGTAGCT-3' (서열번호 10)		 58.1
CDH1 F 5'-GCCCTGCCAATCCCGATGAA-3' (서열번호 11)
R 5'-CGCCGCCTCCGTACAT-3' (서열번호 12)		 56.6
Human CD34 F 5'- TCCAGA GACAACCTTGAAGC-3' (서열번호 13)
R 5'-CTTCTTAAACTCCGCACAGC-3' (서열번호 14)		 61.4
Human VE-CAD F 5'-GGCAAGATCAAGTCAAGCGTG-3' (서열번호 15)
R 5'-ACGTCTCCTGTCTCTGCATCG-3' (서열번호 16)		 58.3
Human eNOS F 5'-CAGTGTCCAACATGCTGCTGGAAATTG-3' (서열번호 17)
R 5'-TAAAGGTCTTCTTCCTGGTGATGCC-3' (서열번호 18)		 57.2
Human VEGF F 5'-GGCAGAAGGAGGAGGGACAGAATC-3' (서열번호 19)
R 5'-CATTTACACGTCTGCGGATCTTGT-3' (서열번호 20)		 59.7
Human GAPDH F 5'-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3' (서열번호 21)
R 5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3' (서열번호 22)		 59.7
Porcine THBS 1 F 5'- AATGGGAAGCCATGTGAGGG -3' (서열번호 23)
R 5'- GCAGGCATCAGGGACTTCTT-3' (서열번호 24)		 60
Porcine TBXAS F 5'- ACATCCAGAGGTGCTACTGC-3' (서열번호 25)
R 5'- GTGACGAAGGACAGGGTGTT-3' (서열번호 26)		 59.4
Porcine PLSCR 1 F 5'- CTAGAAACTGCTGTGGGCCT-3' (서열번호 27)
R 5'- CATGGGTGCCAGGTTTGAGT-3' (서열번호 28)		 59.6
Pig GAPDH F 5'-ACTCACTCTTCTACCTTTGATGCT-3' (서열번호 29)
R 5'-TGTTGCTGTAGCCAAATTCA-3' (서열번호 30)		 57
ALB, albumin; GPX1, cytochrome P450 family 2 subfamily E, polypeptide 1; glutathione peroxidase transcript variant 1; CYP2E1, HMGCR, 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase; LDLR, low-density lipoprotein receptor; CDH1, E-cadherin; VE-CAD, vascular endothelial cadherin; eNOS, endothelial nitric oxide synthase; VEGF, vascular endothelial growth factor; THBS 1, thrombospondin 1; TBXAS, thromboxane A synthase; PLSCR 1, phospholipid scramblase 1; GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase transcript variant 1
통계 분석
데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현된다. 통계 분석을 SPSS 19.0 소프트웨어 (Chicago, IL, USA)를 사용하여 실시하였다. Student’s t-test를 이용하여 유의한 차이를 식별하였다. p 값<0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주 하였다.
실시예 1. 탈세포화
완전히 탈세포화된 우측 간엽은 9 ± 2.5 시간 동안 60 ㎖/간엽 100g/분의 유속으로 0.1% SDS로 관류 후 투명해진 ECM 스캐폴드로 획득하였다. 간은 탈세포화 절차 종료에 의해 천연 간의 부피와 형태를 유지하였다(도 1A).
본 발명의 탈세포화된 간은 천연 간 구조는 보존하면서 핵은 남아있지 않음을 헤마톡실린 및 에오신을 이용한 조직학적 검사로 확인하였다. 각 소엽은 인접 소엽 사이 모서리에 있는 중간 및 문맥삼분지의 중심 정맥의 횡단면에서 일반적으로 육각형이었다(도 1B). VVG 염색은 근절 간세포(eradicated hepatocytes)를 모양을 보여주는 잘 보존된 핑크색으로 염색된 콜라겐 섬유뿐만 아니라 혈관 벽에 어둡게 염색된 탄성 섬유의 존재를 보여준다(도 1C).
스캐폴드의 DAPI 염색은 간 스캐폴드 절편에서 어떠한 양성 DAPI-염색 핵도 확인되지 않은 반면, 천연 간 절편에서는 풍부한 양성 DAPI 시그널이 나타났다(도 1D). ECM은 SEM을 이용하여 관찰 중 잔여 세포와 망-유사 형태를 나타내지 않았다(도 1E). 이 프레임 워크는 체외에서 재세포화(recellularization)를 위한 플랫폼을 제공할 수 있다.
또한, DNA 함량을 확인하였다.
스캐폴드의 DNA의 잔류 함량은 천연 간에 비해 약 1 % 미만이었다(스캐폴드의 건조 중량 53.59 ± 29.36 ng/mg 대 천연 간의 건조 중량 6753.6 ± 384.2 ng/mg)(도 1F).
또한, 웨스턴 블롯을 실시하였다.
그 결과, α-gal에 대한 면역블롯팅은 올리고당 쇄가 돼지 조직의 초급성 거부 반응을 일으켰다는 것 뿐만 아니라 액틴 단백질은 탈세포화된 간 매트릭스에서 완전히 이들 세포 마커가 고갈됐다는 것을 확인하였다(도 1G).
또한, 성장인자 함량을 확인하였다.
그 결과, 탈세포화된 문맥 혈관의 VEGF 함량은 천연 간문맥의 VEGF 함량(57.09 ± 4.87 ng/g 건조중량)의 약 52%를 나타내는 29.64 ± 3.6 ng/g 건조 중량이었다(도 2C). 천연 간문맥의 bFGF 함량이 26.74 ± 5.1 ng/g 건조 중량인 반면, 탈세포화된 혈관에서는 8.15 ± 2.52이었고, 이는 천연 혈관과 비교하여 30%의 보존을 나타낸다(도 1I).
실시예 2. 혈관내피화에 따른 효과
본 발명자들은 상기 실시예 1에서 제작된 탈세포화된 스캐폴드에 헤파린 소디윰 염을 함유하는 젤라틴, 또는 0.1% 젤라틴 단독으로 1 시간 동안 처리하였다. 1 시간 처리 후, 20 x 103 EA.hy926 내피세포(EC, endothelial cells)를 포함하는 세포 현탁액을 첨가하고, 인큐베이션하여, 세포가 부착된 헤파린-젤라틴 혼합물이 코팅되었을 뿐만 아니라 내피세포가 부착되어 혈관내피화를 구현하였다.
도 2A에 본 발명의 혈관내피화를 개략적으로 나타냈다.
2-1. 세포 접착능 확인
MTT 분석은 비코팅 혈관과 비교하여, 헤파린-젤라틴 혼합물을 사용하여 혈관을 사전코팅하는 것은 세포 부착능에 있어 유의한 증가(3.8배)를 초래하는 반면, 젤라틴으로만 코팅하는 것은 세포 부착능을 2.5배 증가시킬 수 있다는 것을 보여준다(도 2B).
또한, 본 발명자들은 60 또는 120 분 동안 헤파린-젤라틴 혼합물을 사용하여 탈세포화된 혈관을 사전코팅하는 것이 30 분 동안 사전코팅하는 것보다 부착된 세포의 수를 증가시키는 것을 확인하였다(도 2C). 이러한 결과는 탈세포화된 간 스캐폴드에 있는 혈액 맥관 구조를 사전코팅하는 것이 혈관 표면으로의 EC의 부착을 유도하고 재-혈관내피화의 효율을 증가시킬 것이란 것을 제시한다.
2-2. EC 이동성 확인
ECM 성장 인자는 내피세포의 이동을 촉진할 수 있는 것으로 잘 알려져 있다. 본 발명자들은 상술한 헤파린 및/또는 젤라틴으로 사전코팅한 탈세포화된 혈관 또는 비코팅 탈세포화된 혈관이 내피세포의 이동성 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하였다.
그 결과, 도 2D에 나타낸 바와 같이, 탈세포화된 혈관의 ECM 구조는 젤라틴 으로만 코팅한 혈관의 것과 유의한 차이 없이 내피세포를 접착시킬 수 있다는 것을 보여준다(비코팅 혈관 그룹에서 27-34 세포/면적, 젤라틴 처리 혈관 그룹에서 41-51 세포/면적). 반면, 헤파린-젤라틴 사전코팅한 혈관은 비코팅 혈관과 비교하여, EC의 접착(129-153 세포/면적)을 4.9 배나 탁월하게 증가시키는 것을 보여주었다(도 2E).
또한, 형광 측정은 헤파린-젤라틴 코팅 그룹이 바닥 챔버로의 가장 많은 이동세포수를 가지고 있음을 확인하였다. 이러한 결과는 헤파린-젤라틴 혼합물의 사전코팅이 화학주성 효과를 가지며, 재세포화에 따른 내피세포의 이동을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
2-3. 탈세포화된 돼지 간 스캐폴드의 재- 혈관내피화
EA.hy926를 10 일간 배양 후 스캐폴드의 H&E 및 DAPI 염색은 EC의 단일층의 형성과 함께 간문맥, 동맥 및 중심정맥의 혈관 표면을 따라 회복 및 부착된 내피세포를 보여준다. 이는 상기 스캐폴드가 비코팅 간 스캐폴드에 비하여 스캐폴드의 실질조직을 침투하지 않고 혈관 표면에 대한 내피세포의 접착성을 확인하였다(도 3A). HG(heparin-gelatin 혼합물)-사전 코팅한 스캐폴드의 EC의 생착 효율은 비-사전코팅한 재씨딩에 비해 유의하게 높았다(HG-사전 코팅 스캐폴드에서 94.25% ± 2.54% 및 비코팅 스캐폴드에서 84.5% ± 3.87%).
내피세포의 마커로서 PECAM의 발현은 간 스캐폴드 전체에 걸쳐 혈관의 내부 표면 상에 위치하는 EC에서 검출되었다(도 3Ba). 탈세포화된 간 스캐폴드에 재씨딩된 EC의 세포증식 능력을 조사하기 위하여, Ki67 염색을 수행하여 상기 세포가 증식할 수 있다는 것을 확인하였고, 이는 간 스캐폴드에 의해 제공된 조건이 재씨딩된 EC의 생존 및 증식에 적합하다는 것을 나타낸다(도 3Bb). 재씨딩된 세포의 약 6%는 세포 사멸된 것으로 TUNEL 분석에서 확인되었다(도 3Bc).
CD34, VEGF, eNOS(endothelial nitric oxide synthase) 및 VE-CAD(vascular endothelial-cadherin)은 내피세포, 특히 혈관 신생 과정의 기능에 관여하는 내피 세포의 유전자이다. 입체 구조 및 ECM 함량이 내피 세포에서 이러한 유전자의 발현에 영향을 미치는지 여부를 조사하기 위해, 본 발명자들은 RT-PCR을 실시하였다. 도 3Bd에 나타낸 바와 같이, 탈세포화된 간 스캐폴드 내에서 배양된 EC에서 CD34, VE-CAD, eNOS 및 VEGF의 발현 수준은, 단층에서 배양된 EC에 비해, 각각 3.3 ± 0.2, 2.4 ± 0.3, 3.8 ± 0.5, 및 5.3 ± 0.4 배 증가하였다.
2-4. 생체 전체-혈액 관류
혈관 내강의 완벽한 EC 라이닝은 비-혈전형성 표면을 만든다. 본 발명자들은 신선한 돼지 헤파린-처리 혈액으로 재-혈관내피화 및 비-혈관내피화 스캐폴드 모두를 관류시켰다(도 4).
조영제가 관류될 수 없는 경우 스캐폴드 맥관구조 내 임의의 내피세포의 부족으로 약 6 시간 후 비-혈관내피화 스캐폴드(탈세포화만 시킨 스캐폴드)의 혈관 나무는 혈전에 의해 완전히 막혔다(도 4Aa). 24 시간 후 HG-코팅 혈관내피화 스캐폴드의 방사선 결과는 스캐폴드 혈관 내 조영제의 균일한 분포를 보여주는 반면(도 4Ac), 비코팅 혈관내피화 스캐폴드의 경우 16 시간 후 조영제가 가장자리의 혈관을 투과하지 못하였으며, 이는 혈관 내부에 혈전이 형성되었음을 의미한다(도 4Ab). HG-코팅을 사전에 코팅하지 않은 탈세포화 스캐폴드 및 혈관내피화 스캐폴드의 경우, 혈전이 명확하게 관찰된 반면, HG-코팅 혈관내피화 스캐폴드는 어떠한 혈전도 관찰되지 않았다(도 4Ad-Af).
혈액 관류 6 시간 후 PCR 분석은 혈액 관류 재-혈관내피 스캐폴드와 비교하여, 혈액 관류 비-혈관내피화(탈세포화) 스캐폴드에서는 혈전형성-관련 유전자들의 높은 발현 수준을 보여준다(THBS1; thrombospondin 1, TBXAS1; thromboxane A synthase 1, PLSCR1; phospholipid scramblase 1)(도 4B). HG-사전 코팅한 혈관내피화 스캐폴드는 혈전(응고) 마커의 낮은 발현 수준을 보여준다. 이러한 데이터는 HG와 혈관내피화의 조합이 효과적으로 응고 과정을 억제하거나 지연시킨다는 것을 나타낸다.
또한, 6 시간 후 혈액 관류 비-혈관내피 스캐폴드의 경우, 상이한 시점에서의 혈소판 계수는 256 ± 11에서 64 ± 8로의 혈소판 수의 급격하고 상당한 감소를 나타내었다(도 4C). 대조적으로, HG-사전 코팅(229 ± 13) 및 비코팅(195 ± 3) 혈액 관류 재-혈관내피 스캐폴드에서는 혈소판의 수가 약하게 감소하였다.
또한, 항-인테그린 aIIb 항체를 이용하여 혈액 관류 후 비-혈관내피화 스캐폴드의 면역염색은 맥관 나무 내부 및 주변의 강한 혈소판 접착 및 응집을 보여준 반면, 재-혈관내피화된 스캐폴드에서는 일부에서 강하게 염색된 혈소판이 확인되었으며, 이는 비혈전형성 장벽을 제공하는 데 혈관내피화의 필요성 및 혈관 공간에서 혈류를 제한시킬 수 있는 능력을 의미한다(도 4Da-c).
2-5. 헤파린-젤라틴 전처리 후 재- 혈관내피화에 의한 간 실질세포의 기능 개선 효과 확인
도 5는 생체장기를 이용하여 인공 간을 만드는 과정에서 가장 문제시되는 혈관내 혈전의 방지를 위해 본 발명에서 제시한 헤파린-젤라틴 합제의 전처리 기법이 혈관내피화를 증진하는 효과 뿐만 아니라, 함께 재세포화되는 간의 실질세포 (본 연구에서는 간 실질세포를 대신해 연구에 사용되는 HepG2 세포주를 사용)의 생존과 기능개선 효과도 있다는 것을 증명하는 실험결과이다. 기존의 연구는 재-혈관내피화가 실질세포의 생존률을 증진시킨다는 결과를 보여주었으나, 본 연구에서는 재 혈관내피화 이전에 헤파린-젤라틴으로 생체장기의 스캐폴드를 전처리 하는 기법이 간 실질세포의 기능보존 효과가 더욱 증가함을 밝혔다. 이를 검증하기 위해, 헤파린-젤라틴을 사용하지 않고 재-혈관내피화한 군을 대조군으로 비교하였다.
도 5A는 실험방법의 모식도이며, 상세하게 다음과 같다:
(1) 탈세포화한 간 스캐폴드를 대상으로 세포배양 배지로 30분간 관류한다;
(2) 간 실질세포(본 실시예에서 생체 간의 실질세포는 지속적으로 증식이 가능한 세포이므로 이와 유사한 능력을 보유한 세포로 현재 가장 많이 연구용으로 사용되는 간암세포주인 HePG2를 대신 사용)를 2시간에 걸쳐 주입한다;
(3) 간 실질세포를 주입 후 1시간 동안 제세포화된 간 실질세포가 실질내에 고정되도록 인큐베이터에서 인큐베이션한다;
(4) 21 시간 동안 인큐베이터 내에서 스캐폴드의 간문맥을 통해 세포배양액으로 관류한다;
(5) 1 시간 동안 인큐베이터 내에서 스캐폴드의 간문맥을 통해 헤파린-젤라틴 혼합제를 관류하여 간의 간문맥, 간정맥등의 혈관내벽을 코팅한다;
(6) 1 시간 동안 헤파린-젤라틴 혼합제가 잘 코팅되도록 인큐베이터에서 인큐베이션한다;
(7) 1 시간 동안 혈관내피세포를 간문맥에 주입하여 간의 모든 혈관에 골고루 분포되도록 한다;
(8) 1 시간 동안 간문맥을 통해 주입된 혈관내피세포가 간의 모든 혈관에 골고루 분포되도록 한다.
도 5B는 헤파린-젤라틴으로 전처리한 후 혈관내피화한 군에서 혈관내피세포가 혈관에만 재세포화되었고 (우측사진의 화살표가 지시하는 붉은색 띠모양은 혈관내피세포가 생착되어 생존하는 혈관들을 나타낸다), 간의 실질부분에서는 생착되지 않은 것으로 보아, 헤파린 젤라틴의 전처리가 혈관에만 국한되어 혈관내피화를 유도하는 효과를 보이는 결과이다.
그러나, 헤파린-젤라틴을 전처리하지 않고 혈관내피화한 군(중앙사진)은 혈관내피화를 위해 주입한 세포가 혈관이 아닌 간의 실질에도 분산되어 분포하는 문제점을 보여주었다.
또한, 헤파린-젤라틴의 전처리 기법은 생착된 혈관내피세포(도 5C의 PCR 결과 데이터) 뿐만 아니라, 간 실질세포 (도 5 D 및 E)의 기능을 개선하는 효과를 보였다.
결론적으로, 본 발명에서 제시한 헤파린-젤라틴의 전처리 기법은 스캐폴드의 혈관내피화 혈관에 국한시키는 효과를 통해 공배양된 간 실질세포들의 기능개선효과를 나타낸다는 것이다.
2-6. 재- 혈관내피화에 의한 인공장기 내 재세포화된 실질세포 기능 향상 및 혈액 응고 지연 효과 확인
도 6은 도 5의 결과인 헤파린-젤라틴의 전처리 기법이 재-혈관내피화를 통해 간의 실질세포기능을 개선하는 효과 뿐만 아니라, 혈관내 혈전을 방지하는 효과를 동물실험을 통해 증명한 것이다. 도 6A, 6C 및 6E는 대조군으로 헤파린 젤라틴의 전처리 기법을 사용하지 않고 재-혈관내피화와 간 실질세포를 공배양해서 인공 장기를 만든 군이고, 도 6B, 6D, 및 6E는 헤파린-젤라틴의 전처리 기법을 사용한 군이다. 헤파린 젤라틴의 전처리 기법을 사용하여 만든 인공장기를 돼지의 복강대동맥과 복강대정맥에 이식하고 1 시간 후의 인공간에서 헤파린-젤라틴의 전처리 기법을 사용하지 않은 인공 간에 비해 혈관내 혈전이 적었고(도 6B), 혈전 발생이 적었기 때문에 초음파 검사에서도 주요혈관에 혈액흐름이 관찰되었다(도 6D). 또한, 이식된 간을 적출하여 혈관내 막힘정도를 평가하기 위해 양성 조영제를 투여한 후 방사선 사진을 촬영한 결과, 헤파린 젤라틴의 전처리 기법을 사용하여 만든 인공장기에서 대부분의 혈관이 막히지 않은 것을 확인하였다(도 6F).
결론적으로, 본 발명에서는 인공장기를 만드는 과정에 사용된 헤파린-젤라틴의 전처리 기법이 재-혈관내피화를 통해 간의 실질세포기능을 개선하는 효과 뿐만 아니라, 이식 후에 혈관내 혈전을 방지하는 효과가 있다는 것을 동물실험을 통해 증명하였다.
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Claims (15)

  1. 다음 단계를 포함하는 인간을 제외한 동물의 탈세포화 간 조직의 혈관내피화(endothelialization) 또는 혈관재생 증진 방법:
    (a) 간 조직을 탈세포화(decellularization)하여 스캐폴드를 제작하고 상기 탈세포화된 스캐폴드에 간세포(hepatocytes)를 주입시키는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계의 주입된 간세포가 스캐폴드 내에 고정되도록 인큐베이션시키는 단계;
    (c) 상기 (b) 단계의 스캐폴드에 헤파린-젤라틴 혼합제를 관류하여 혈관내벽을 코팅시키는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계의 스캐폴드에 헤파린-젤라틴 혼합제가 고정되도록 인큐베이션시키는 단계; 및
    (e) 상기 (d) 단계의 스캐폴드에 내피세포(EC, endothelial cells)를 주입하여 혈관내피화하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 방법은 혈전 생성이 방지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 (a) 단계의 탈세포화는 용해 용액(lysis solution), 저장성 용액(hypotonic solution), 계면활성제, RNase A 및 DNase I으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 계면활성제는 SDS (sodium dodecyl sulfate), Triton-X, DNase 및 CHAPS (3-(3-cholamidopropyl)dimethylammonio)-1-propane sulfonate)로 이루어진 군 중에서 선택된 1 종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 제 1 항에 있어서, 상기 (e) 단계의 스캐폴드는 혈관내피 성장인자(VEGF), 염기성 섬유아세포 성장인자(bFGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장 인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF) 및 인슐린 유사 성장인자 (IGF)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 성장인자를 포함하여 내피세포의 부착성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 상기 (e) 단계의 혈관내피화된 스캐폴드는 THBS1(thrombospondin 1), TBXAS1(thromboxane A synthase 1), 및 PLSCR1(phospholipid scramblase 1) 유전자; 또는 이의 단백질의 발현 수준이 감소된 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 삭제
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