KR102646027B1 - 그래핀 나노 구조체를 포함하는 고형장기 탈세포 지지체 제조용 조성물 - Google Patents
그래핀 나노 구조체를 포함하는 고형장기 탈세포 지지체 제조용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 나노 산화 그래핀을 포함하는 탈세포 지지체의 제조용 조성물에 관한 것으로, 본 발명자들은 탈세포 간 지지체에 나노 산화 그래핀을 가교결합 시킴으로써 지지체의 물성을 강화시키고 지지체의 단백질 분해 효소 활성 저해하였으며, 항염증 및 M2 대식세포로의 분극화 효과를 나타내는 최적의 가교 결합 조건을 확립하였다. 즉, 나노 산화 그래핀이 지지체의 내구성을 강화시켜 생분해를 억제하고 동시에 이식 후 발생할 수 있는 염증 반응을 최소화함을 확인하였는 바, 나노 산화 그래핀을 임상 적용이 가능한 인공 장기 제작 및 이식 시에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체 제조용 조성물 등에 관한 것이다.
장기 이식술은 기능 부전 장기를 대체할 수 있는 획기적인 치료법이지만, 심각한 장기 공여수 부족으로 인하여 이식 대기자 수는 매년 급증하고 있다. 공여 장기를 대체하기 위한 노력의 일환으로, 조직공학 혹은 3차원 프린팅 등 공학적 접근을 통한 인공 장기 생산이 많이 연구되고 있다. 특히, 탈세포 장기 지지체는 동물의 장기에서 세포를 모두 제거된 반면 세포외기질 성분 및 장기의 미세 구조를 보유하고 있어 인공 장기 제작에 적합한 지지체로 알려져 있다. 이를 이용해 다양한 인공 장기가 제작되고 있지만 실제 임상에 적용하기 위해서는 여러 기술적 한계를 극복해야 한다.
그러나, 탈세포 장기 지지체를 생체 내에 이식했을 시 체내 효소에 의해 빠르게 분해되고, 분해된 산물은 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서 생체 지지체의 물성을 강화시키고자 하는 연구가 진행되고 있다. 이러한 관점에서 글루타르알데히드(GA)는 매우 강력한 가교 결합제이나, 세포 독성이 강하고 지지체의 석회화를 유발한다는 단점이 있었다. 따라서 물성 강화와 동시에 생체적합성을 개선시킬 수 있는 가교 결합제의 개발의 필요성이 대두되고 있다.
또한, 간경화 등 만성 간 질환은 매년 약 2백만 명의 환자를 사망에 이르게 하는 질병이다. 최근 수십 년간 면역학과 장기이식술의 획기적인 발전에 의해 말기 간 질환에서 간 이식술이 많이 시행되고 있으며 현재 선천성 혹은 후천성 간 질환에서의 유일한 치료법은 간 이식술로 인식되어지고 있으나 공여수가 부족한 실정이다. 이러한 측면에서 조직공학을 통한 인공 간 생산은 공여 장기의 대체재로 각광받고 있다. 한국은 간 관련 질환에 의한 사망률이 다른 질환에 비해 매우 높고 이식용 장기 부족으로 인해 이식 대기자가 상당수에 이르며, 간 이식 최다국가 중 하나로 이러한 상황을 개선할 수 있는 기술 개발이 필요하다.
간 지지체 제작을 위해 조직공학이나 3차원 프린터 기술 응용 및 줄기세포를 이용한 장기 복원(organoid) 등 다양한 방법이 연구되고 있으나 장기 미세구조 모방불가와 크기의 제한이라는 기술적 한계를 극복하지 못하고 있다. 이를 극복하면서 안전성과 기능성을 갖는 인체 장기 모사 지지체로서 동물의 장기에서 세포를 모두 제거한 탈세포 지지체가 유용한 기질로 평가되고 있다. 면역 반응을 유발할 수 있는 세포 성분은 제거함과 동시에 지지체 내 미세 구조와 생화학적 신호 등 장기 특이적인 미세 환경이 조성되어 있어, 사람의 세포를 주입했을 시 지지체 내 세포의 3차원 조직화가 용이하다는 장점이 있다. 따라서 탈세포 지지체는 인공 장기를 생산해 내기 위한 적절한 기질로 이용될 수 있으며 탈세포 지지체를 이용해 다양한 장기를 재건하고자 하는 연구가 이루어지고 있다.
한편, 벌집 격자에 채워진 탄소 원자 시트인 그래핀과 그 파생물은 우수한 기계적 강성, 전기 전도성 및 화학적 기능화의 용이성과 같은 특수한 특성으로 인해 지난 10년 동안 재료 과학에서 광범위하게 연구되어오고 있다. 그래핀은 탄소의 동소체 중 하나이며 탄소 원자들이 모여 2차원 평면을 이루고 있는 구조이다. 각 탄소 원자들은 육각형의 격자를 이루며 육각형의 꼭짓점에 탄소 원자가 위치하고 있는 모양이다. 이 모양을 벌집구조(honeycomb structure) 또는 벌집격자(honeycomb lattice)라고 부르기도 한다. 원자 1개의 두께로 이루어진 얇은 막으로, 두께는 0.2 nm(1nm은 10억 분의 1m) 즉 100억 분의 2m 정도로 엄청나게 얇으면서 물리적·화학적 안정성도 높다. 그 중에서도 그래핀 나노 소재는 다양한 성능과 파급효과를 가지며 이를 이용한 부품 및 완제품, 관련 '원소재' 장비 등의 솔루션을 포함하는 산업으로서 응용분야가 무궁무진하다. 그러나 바이오폴리머를 강화하려는 여러 시도에도 불구하고 장기 스캐폴드의 가교제로서의 그래핀 나노 구조체의 정확한 생체 내 역할은 아직까지 밝혀진 바 없었다.
따라서, 본 기술에서는 나노 크기의 그래핀 구조체를 가교제로 사용하여 이식 후 생분해 및 염증 반응을 억제하며, 그에 따라 생분해 완화 및 이식 거부 반응이 완화된 인공 장기용 생체 지지체를 개발하였다.
S. Gao, Z. Yuan, W. Guo, M. Chen, S. Liu, T. Xi, Q. Guo, Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2017, 71, 891.
이에 본 발명자들은 인공 장기 제작 시 세포의 생착을 도와주는 지지체의 물성을 강화시킬 수 있을 뿐만 아니라 이식 후 면역 반응 조절이 가능한 나노 산화 그래핀을 탈세포 장기 지지체의 가교 결합제로 사용하였다. 나노 산화 그래핀은 물성을 강화시키고 세포외기질 분해 효소인 MMP를 직접적으로 억제할 뿐만 아니라, M2 대식세포로의 분극화를 촉진하였다. 이를 통해, 염증 완화와 동시에 MMP 억제제인 TIMP의 발현을 유도함으로써 이식 후 생분해 및 염증 반응을 억제하며, 그에 따라 생분해 완화 및 이식 거부 반응이 완화된 인공 장기용 생체 지지체를 개발하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체 제조용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체의 물성 강화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 인공 장기 제작용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 그래핀 나노 구조체를 이용하는 인공 기관의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 인공 기관을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체 제조용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체의 물성 강화용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 인공 기관 제작용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 나노 구조체의 탈세포 지지체 제조 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 나노 구조체의 인공 기관 제작 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 그래핀 나노 구조체를 처리하는 단계를 포함하는 인공 기관의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공 기관을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 나노크기의 산화 그래핀 또는 그래핀 양자점일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 나노크기의 산화 그래핀은 20 nm 이하의 두께; 또는 15 내지 50nm의 평균 직경을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체에 가교결합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 물성을 강화 또는 개선하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 물성은 하기 특성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
ⅰ) 탈세포 지지체의 탄성;
ⅱ) 탈세포 지지체의 분해 효소에 의한 중량 손실; 및
ⅲ) 탈세포 지지체의 인장 강도.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 MMP(Matrix metalloproteinase)를 직접 억제함으로써 탈세포 지지체의 생체 내 분해를 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 염증 반응 유발을 개선 또는 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 M2 대식세포로의 분극화를 촉진시킴에 따라, 이식 후 염증 반응을 완화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 상기 M2 대식세포로의 분극화는 M2c로의 분극화일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 인공 기관은 생체적합성일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 인공 기관은 예를 들어 혈관을 포함하는 기관이라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 줄기세포 유래 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 비실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 줄기세포는 역분화 줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 골수유래 줄기세포(Marrow-derived Stem Cell), 지방유래줄기세포(Adipose tissue-derived Stem Cells) 및 태반유래 줄기세포(Placenta-derived Stem Cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
a) 조직원으로부터 기관을 제공하는 단계;
b) 상기 제공된 기관을 탈세포화하는 단계; 및
c) 상기 탈세포화된 기관에 그래핀 나노 구조체를 처리하는 단계.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 제조방법은 하기 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 더 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
d-1) 탈세포화된 기관을 혈관내피세포로 재세포화시키는 단계;
d-2) 탈세포화된 기관을 실질세포로 재세포화시키는 단계; 및
d-3) 탈세포화된 기관을 비실질세포로 재세포화시키는 단계.
본 발명자들은 나노 산화 그래핀을 탈세포 지지체의 가교 결합제로 이용하는 경우, 탈세포 지지체의 물성이 강화될 뿐만 아니라 이식 후 지지체 내 혹은 전신적으로 유발되는 염증 반응을 완화함을 밝혀내었다. 또한, 나노 산화 그래핀은 M2c 대식세포로의 분극화를 촉진하여 항염증성 반응을 촉진할 뿐만 아니라 MMP 분비를 억제하여 지지체의 생분해를 억제한다는 새로운 기전을 확인하였으며, 이는 인공 장기 제작 시 이식체의 생착율을 높일 뿐만 아니라, 탈세포 지지체를 생체 내에서 장기간 유지시킬 수 있다는 측면에서 유용하다.
따라서, 나노 산화 그래핀을 사용하여 제작된 이식 가능한 지지체에 다양한 세포를 적용한 인공 장기 제작이 가능해지며, 이는 장기 이식에 대한 대체 치료제로서 국내외 환자의 삶의 질 개선 및 수명 연장에 기여할 것으로 기대된다. 또한, 나노 산화 그래핀은 탈세포 장기 지지체 뿐만 아니라, 합성 생체 재료에도 적용 등 조직공학적인 측면에서 광범위하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 NGO 시트 및 NGO의 흑연층 구조의 투과 전자 전기 검사 이미지를 나타낸 것이다.
도 1b는 TEM 결과에 따른 NGO의 규모 분포를 나타낸 것이다.
도 1c는 NGO의 AFM 이미지를 나타낸 것이다.
도 1d는 AFM 결과에 따른 NGO의 높이 분포 (n = 26)를 나타낸 것이다.
도 1e는 1350cm-1 및 1580cm-1에서 D 밴드 및 G 밴드를 보여주는 NGO의 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 1f는 NGO의 고해상도 XPS 분석 결과에 따라, C-C 결합 (51.4 %), C-O 결합 (38.76 %) 및 C = O 결합 (9.85 %)의 피크가 제시되었다.
도 1g는 하이드록실, 카르복실 및 에폭시기에 할당된 피크를 나타내는 NGO의 FTIR 투과 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 1h는 중간 정도(moderate)의 분산 안정성을 나타내는 NGO의 제타 전위를 나타낸 것이다.
도 2a는 천연 간 및 dECM 간 스캐폴드의 총 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b는 H&E 염색에 의한 천연 간(상단) 및 dECM 간(하단)의 조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 2c는 Picrosirius red 염색에 의한 천연 간(상단) 및 dECM 간(하단)의 조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 2d는 천연 간(상단) 및 dECM 간(하단)의 SEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 천연 간 및 dECM 간의 DNA 정량화 결과를 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 5, 평균 ± SD, *** p <0.001 vs 천연 간.
도 2f는 천연 간에서 상위 100 개 단백질의 KEGG 경로 및 Reactome 경로를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2g는 ECM 간에서 상위 100 개 단백질의 KEGG 경로 및 Reactome 경로를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2h는 dECM 간에서 상위 100 개 단백질 중 ECM으로 분류된 단백질을 나열하고 dECM 간에서 각 단백질의 분자 분율을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2i는 dECM 간에서 ECM 단백질의 상호 작용을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 가교된 스캐폴드의 전체 이미지로서, PBS(CTL, 대조군), 0.625 %의 GA, 1μg/mL의 NGO (NGO-1), 5μg/mL의 NGO (NGO-5) 및 10μg/mL의 NGO (NGO-10) 군의 이미지를 나타낸 것이다.
도 3b는 가교된 스캐폴드의 미세구조를 나타내는 SEM 분석 결과를 나타낸 것이다. ECM 섬유 내에 혼합된 NGO를 노란색 화살표로 표시하였다. 스케일 바, 1 μm.
도 3c는 CTL 스캐폴드 및 NGO-1, NGO-5 및 NGO-10과 가교된 스캐폴드의 라만 분광법 분석 결과를 나타낸 것이다. NGO의 피크는 1580cm-1에 나타났고 dECM 스캐폴드의 피크는 2930cm-1에 나타났다.
도 3d는 NGO-5와 가교된 CTL 스캐폴드 및 스캐폴드의 FTIR 투과 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3e는 각 그룹에서 스캐폴드의 대표적인 응력-변형 곡선을 나타낸 것이다.
도 3f는 5 % 변형률에서 각 스캐폴드의 영률을 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 4, 평균 ± SD, * p <0.05, ** p <0.01, n.s.는 CTL에 비해 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다.
도 3g는 각 스캐폴드가 견딜 수 있는 최대 스트레스 양을 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 7, 평균 ± SD, * p <0.05, *** p <0.001, n.s.는 CTL에 비해 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다.
도 4a는 CTL 및 GA 그룹에서 스캐폴드의 라만 스펙트럼을 나타낸 결과이다.
도 4b는 서로 다른 농도의 NGO로 가교된 스캐폴드의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것으로, NGO 농도에 관계없이 유사한 패턴을 보여준다.
도 4c는 각 그룹에서 가교된 스캐폴드의 팽윤 비율을 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 3, 평균 ± SD.
도 5a는 MMP-1을 2 시간 동안 처리한 후 가교된 스캐폴드의 SEM 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 1μm.
도 5b는 MMP-1 처리 후 분해된 스캐폴드의 조직학적 구조를 분석하기 위해 Picrosirius red 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 5c는 MMP-1 처리 후 각 그룹의 스캐폴드의 중량 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 5, 평균 ± SD, * p <0.05, ** p <0.01, n.s. CTL에 비해 통계적으로 유의하지 않음.
도 5d는 가교도를 정량하기 위해 Ninhydrin assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 MMP-1 처리 후 CTL, GA, NGO-1, NGO-5 및 NGO-10 그룹의 스캐폴드에서 불용성 콜라겐을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 NGO 단독, MMP-1 단독 및 NGO와 함께 배양된 MMP(MMP-1+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 NGO 단독, MMP-9 단독 및 NGO와 함께 배양된 MMP(MMP-9+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 NGO 및 각 참조 스펙트럼(하단, 흑색)의 존재 하에 MMP-1, MMP-2, 및 MMP-9의 STD-NMR 스펙트럼(상단, 적색)을 나타낸 것이다.
도 6d는 1μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL의 NGO, 비히클(증류수) 및 1,10-페난트롤린 (MMP-1 억제제)의 존재 하에서 MMP-1 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 1μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL의 NGO의 아연 킬레이트 활성을 평가한 결과를 나타낸 것으로, 좌측은 Zn2+와 함께 배양한 이미지이며, 우측은 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다. 강력한 아연 킬레이트제인 EDTA 10μM을 양성 대조군으로 사용하였다. 디티존(dithizone)과 함께 배양된 Zn2+ 농도의 흡광도는 DMSO(대조군)의 측정값으로 표준화하였다.
도 6f는 NGO 단독, 글루타메이트 단독 및 NGO와 함께 배양된 글루타메이트(Glutamate+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6h는 NGO 단독, 히스티딘 단독 및 NGO와 함께 배양된 히스티딘(Histidine+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 각 그룹에서 HepG2 세포로 분주된 가교된 스캐폴드의 배양 15 일차에서 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 각 그룹에서 HUVEC 세포로 분주된 가교된 스캐폴드의 배양 15 일차에서 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 각 그룹에서 가교된 스캐폴드 상 HepG2 세포의 생존율을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7d는 각 그룹에서 가교된 스캐폴드 상 HUVEC 세포의 생존율을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7e는 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HepG2 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 인간 알부민의 양을 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7f는 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HepG2 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 요소의 양을 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7g는 배양 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HUVEC 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 VEGF의 양을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7h는 배양 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HUVEC 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 NO(Nitric oxide)의 양을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 유동 세포 계측법을 사용하여 가교된 스캐폴드 내에서 편광된 M1과 같은 대식세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 유동 세포 계측법을 사용하여 가교된 스캐폴드 내에서 편광된 M2와 같은 대식세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 M1 대식세포의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다 (C-C 케모카인 수용체 7; CCR7; M1-특이적 마커; 녹색, CD68; 범-대식세포 마커; 빨간색).
도 8d는 M2 대식세포의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다 (CD206; M2-특이적 마커; 녹색, CD68).
도 8e는 CTL, NGO-1, NGO-5 및 NGO-10 그룹에서 CD68+ 집단에 대한 M1 (CD68+ CCR7+) 및 M2 (CD68+ CD206+) 비율을 나타낸 것이다.
도 9a는 각 스캐폴드의 이식 7일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 9b는 이식 7일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9c는 각 스캐폴드의 이식 21일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 9d는 이식 21일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9e는 이식 7일 및 21일차에 수득된 스캐폴드의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다 (I : 이식된 스캐폴드, S : 주변 조직). 스케일 바, 200 μm.
도 9f는 이식 7일차에 각 스캐폴드의 호중구 및 림프구를 포함한 염증 세포의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 9g는 이식 21일차에 각 스캐폴드의 호중구 및 림프구를 포함한 염증 세포의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 9h는 이식 7일차에 각 스캐폴드의 대표적인 면역 조직 화학적 이미지를 나타낸 것이다. 각각 M1(F4/80; 녹색, CCR7; 빨간색) 또는 M2(F4/80; 녹색, CD206; 빨간색) 마커로 프로브되었으며, 핵은 DAPI(파란색)로 대조염색되었다. 스케일 바, 100 μm.
도 9i는 이식 7일차에 이식된 스캐폴드 내에 침투된 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 9j는 이식 21일차에 각 스캐폴드의 대표적인 면역 조직 화학적 이미지를 나타낸 것이다. 각각 M1(F4/80; 녹색, CCR7; 빨간색) 또는 M2(F4/80; 녹색, CD206; 빨간색) 마커로 프로브되었으며, 핵은 DAPI(파란색)로 대조염색되었다. 스케일 바, 100 μm.
도 9k는 이식 21일차에 이식된 스캐폴드 내에 침투된 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 10a는 각 스캐폴드의 이식 35일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 10b는 이식 35일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10c는 이식 35일 후 수득된 스캐폴드의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다 (I : 이식된 스캐폴드, S : 주변 조직). 스케일 바, 200 μm.
도 10d는 이식된 스캐폴드 내 침윤성 호중구 및 림프구를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 10e는 DAPI (파란색), MMP-9 (녹색), F4/80 (빨간색) 및 CCR7 (흰색)으로 염색된 각 그룹에서 이식 35일 후 스캐폴드의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 10f는 DAPI (파란색), TIMP-1 (녹색), F4/80 (빨간색) 및 CD206 (흰색)으로 염색된 각 그룹에서 이식 35일 후 스캐폴드의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 10g는 이식된 스캐폴드 내에 침투한 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 10h는 각 그룹의 염색된 섹션에서 MMP-9 및 TIMP-1의 평균 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 11a는 각 스캐폴드의 이식 60일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 11b는 이식 60일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11c는 각 그룹의 스캐 폴드 잔재의 H & E 염색을 통해, 스캐폴드 내에서 염증 반응을 나타낸 것이다.
도 11d는 M1, M2 마커로 염색된 GA, NGO-5 및 NGO-10 그룹 스캐폴드의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다.
도 11e는 이식된 스캐폴드 내에 침투한 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 11f는 스캐폴드 이식에서 NGO의 중추적 역할에 대한 기전을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 TEM 결과에 따른 NGO의 규모 분포를 나타낸 것이다.
도 1c는 NGO의 AFM 이미지를 나타낸 것이다.
도 1d는 AFM 결과에 따른 NGO의 높이 분포 (n = 26)를 나타낸 것이다.
도 1e는 1350cm-1 및 1580cm-1에서 D 밴드 및 G 밴드를 보여주는 NGO의 라만 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 1f는 NGO의 고해상도 XPS 분석 결과에 따라, C-C 결합 (51.4 %), C-O 결합 (38.76 %) 및 C = O 결합 (9.85 %)의 피크가 제시되었다.
도 1g는 하이드록실, 카르복실 및 에폭시기에 할당된 피크를 나타내는 NGO의 FTIR 투과 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 1h는 중간 정도(moderate)의 분산 안정성을 나타내는 NGO의 제타 전위를 나타낸 것이다.
도 2a는 천연 간 및 dECM 간 스캐폴드의 총 이미지를 나타낸 것이다.
도 2b는 H&E 염색에 의한 천연 간(상단) 및 dECM 간(하단)의 조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 2c는 Picrosirius red 염색에 의한 천연 간(상단) 및 dECM 간(하단)의 조직학적 검사 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 2d는 천연 간(상단) 및 dECM 간(하단)의 SEM 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 천연 간 및 dECM 간의 DNA 정량화 결과를 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 5, 평균 ± SD, *** p <0.001 vs 천연 간.
도 2f는 천연 간에서 상위 100 개 단백질의 KEGG 경로 및 Reactome 경로를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2g는 ECM 간에서 상위 100 개 단백질의 KEGG 경로 및 Reactome 경로를 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 2h는 dECM 간에서 상위 100 개 단백질 중 ECM으로 분류된 단백질을 나열하고 dECM 간에서 각 단백질의 분자 분율을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 2i는 dECM 간에서 ECM 단백질의 상호 작용을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a는 가교된 스캐폴드의 전체 이미지로서, PBS(CTL, 대조군), 0.625 %의 GA, 1μg/mL의 NGO (NGO-1), 5μg/mL의 NGO (NGO-5) 및 10μg/mL의 NGO (NGO-10) 군의 이미지를 나타낸 것이다.
도 3b는 가교된 스캐폴드의 미세구조를 나타내는 SEM 분석 결과를 나타낸 것이다. ECM 섬유 내에 혼합된 NGO를 노란색 화살표로 표시하였다. 스케일 바, 1 μm.
도 3c는 CTL 스캐폴드 및 NGO-1, NGO-5 및 NGO-10과 가교된 스캐폴드의 라만 분광법 분석 결과를 나타낸 것이다. NGO의 피크는 1580cm-1에 나타났고 dECM 스캐폴드의 피크는 2930cm-1에 나타났다.
도 3d는 NGO-5와 가교된 CTL 스캐폴드 및 스캐폴드의 FTIR 투과 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도 3e는 각 그룹에서 스캐폴드의 대표적인 응력-변형 곡선을 나타낸 것이다.
도 3f는 5 % 변형률에서 각 스캐폴드의 영률을 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 4, 평균 ± SD, * p <0.05, ** p <0.01, n.s.는 CTL에 비해 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다.
도 3g는 각 스캐폴드가 견딜 수 있는 최대 스트레스 양을 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 7, 평균 ± SD, * p <0.05, *** p <0.001, n.s.는 CTL에 비해 통계적으로 유의하지 않음을 나타낸다.
도 4a는 CTL 및 GA 그룹에서 스캐폴드의 라만 스펙트럼을 나타낸 결과이다.
도 4b는 서로 다른 농도의 NGO로 가교된 스캐폴드의 FT-IR 스펙트럼을 나타낸 것으로, NGO 농도에 관계없이 유사한 패턴을 보여준다.
도 4c는 각 그룹에서 가교된 스캐폴드의 팽윤 비율을 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 3, 평균 ± SD.
도 5a는 MMP-1을 2 시간 동안 처리한 후 가교된 스캐폴드의 SEM 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 1μm.
도 5b는 MMP-1 처리 후 분해된 스캐폴드의 조직학적 구조를 분석하기 위해 Picrosirius red 염색을 수행한 결과를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 5c는 MMP-1 처리 후 각 그룹의 스캐폴드의 중량 감소를 측정한 결과를 나타낸 것이다. 각 그룹 n = 5, 평균 ± SD, * p <0.05, ** p <0.01, n.s. CTL에 비해 통계적으로 유의하지 않음.
도 5d는 가교도를 정량하기 위해 Ninhydrin assay를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 5e는 MMP-1 처리 후 CTL, GA, NGO-1, NGO-5 및 NGO-10 그룹의 스캐폴드에서 불용성 콜라겐을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 NGO 단독, MMP-1 단독 및 NGO와 함께 배양된 MMP(MMP-1+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6b는 NGO 단독, MMP-9 단독 및 NGO와 함께 배양된 MMP(MMP-9+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6c는 NGO 및 각 참조 스펙트럼(하단, 흑색)의 존재 하에 MMP-1, MMP-2, 및 MMP-9의 STD-NMR 스펙트럼(상단, 적색)을 나타낸 것이다.
도 6d는 1μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL의 NGO, 비히클(증류수) 및 1,10-페난트롤린 (MMP-1 억제제)의 존재 하에서 MMP-1 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6e는 1μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL의 NGO의 아연 킬레이트 활성을 평가한 결과를 나타낸 것으로, 좌측은 Zn2+와 함께 배양한 이미지이며, 우측은 흡광도 측정 결과를 나타낸 것이다. 강력한 아연 킬레이트제인 EDTA 10μM을 양성 대조군으로 사용하였다. 디티존(dithizone)과 함께 배양된 Zn2+ 농도의 흡광도는 DMSO(대조군)의 측정값으로 표준화하였다.
도 6f는 NGO 단독, 글루타메이트 단독 및 NGO와 함께 배양된 글루타메이트(Glutamate+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 6h는 NGO 단독, 히스티딘 단독 및 NGO와 함께 배양된 히스티딘(Histidine+NGO)의 1H NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 것이다.
도 7a는 각 그룹에서 HepG2 세포로 분주된 가교된 스캐폴드의 배양 15 일차에서 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7b는 각 그룹에서 HUVEC 세포로 분주된 가교된 스캐폴드의 배양 15 일차에서 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다.
도 7c는 각 그룹에서 가교된 스캐폴드 상 HepG2 세포의 생존율을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7d는 각 그룹에서 가교된 스캐폴드 상 HUVEC 세포의 생존율을 MTT assay로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 7e는 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HepG2 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 인간 알부민의 양을 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7f는 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HepG2 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 요소의 양을 ELISA로 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7g는 배양 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HUVEC 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 VEGF의 양을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 7h는 배양 3일, 6일, 9일 및 12일차에 HUVEC 세포가 접종된 각 스캐폴드에서 분비된 NO(Nitric oxide)의 양을 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 8a는 유동 세포 계측법을 사용하여 가교된 스캐폴드 내에서 편광된 M1과 같은 대식세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 8b는 유동 세포 계측법을 사용하여 가교된 스캐폴드 내에서 편광된 M2와 같은 대식세포를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 8c는 M1 대식세포의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다 (C-C 케모카인 수용체 7; CCR7; M1-특이적 마커; 녹색, CD68; 범-대식세포 마커; 빨간색).
도 8d는 M2 대식세포의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다 (CD206; M2-특이적 마커; 녹색, CD68).
도 8e는 CTL, NGO-1, NGO-5 및 NGO-10 그룹에서 CD68+ 집단에 대한 M1 (CD68+ CCR7+) 및 M2 (CD68+ CD206+) 비율을 나타낸 것이다.
도 9a는 각 스캐폴드의 이식 7일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 9b는 이식 7일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9c는 각 스캐폴드의 이식 21일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 9d는 이식 21일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 9e는 이식 7일 및 21일차에 수득된 스캐폴드의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다 (I : 이식된 스캐폴드, S : 주변 조직). 스케일 바, 200 μm.
도 9f는 이식 7일차에 각 스캐폴드의 호중구 및 림프구를 포함한 염증 세포의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 9g는 이식 21일차에 각 스캐폴드의 호중구 및 림프구를 포함한 염증 세포의 정량화 결과를 나타낸 것이다.
도 9h는 이식 7일차에 각 스캐폴드의 대표적인 면역 조직 화학적 이미지를 나타낸 것이다. 각각 M1(F4/80; 녹색, CCR7; 빨간색) 또는 M2(F4/80; 녹색, CD206; 빨간색) 마커로 프로브되었으며, 핵은 DAPI(파란색)로 대조염색되었다. 스케일 바, 100 μm.
도 9i는 이식 7일차에 이식된 스캐폴드 내에 침투된 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 9j는 이식 21일차에 각 스캐폴드의 대표적인 면역 조직 화학적 이미지를 나타낸 것이다. 각각 M1(F4/80; 녹색, CCR7; 빨간색) 또는 M2(F4/80; 녹색, CD206; 빨간색) 마커로 프로브되었으며, 핵은 DAPI(파란색)로 대조염색되었다. 스케일 바, 100 μm.
도 9k는 이식 21일차에 이식된 스캐폴드 내에 침투된 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 10a는 각 스캐폴드의 이식 35일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 10b는 이식 35일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 10c는 이식 35일 후 수득된 스캐폴드의 H&E 염색 결과를 나타낸 것이다 (I : 이식된 스캐폴드, S : 주변 조직). 스케일 바, 200 μm.
도 10d는 이식된 스캐폴드 내 침윤성 호중구 및 림프구를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 10e는 DAPI (파란색), MMP-9 (녹색), F4/80 (빨간색) 및 CCR7 (흰색)으로 염색된 각 그룹에서 이식 35일 후 스캐폴드의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 10f는 DAPI (파란색), TIMP-1 (녹색), F4/80 (빨간색) 및 CD206 (흰색)으로 염색된 각 그룹에서 이식 35일 후 스캐폴드의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다. 스케일 바, 200 μm.
도 10g는 이식된 스캐폴드 내에 침투한 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 10h는 각 그룹의 염색된 섹션에서 MMP-9 및 TIMP-1의 평균 형광 강도를 나타낸 것이다.
도 11a는 각 스캐폴드의 이식 60일 차에 수득된 대표 이미지를 나타낸 것이다.
도 11b는 이식 60일 후 수득된 스캐폴드의 잔재(remnants)의 단면적을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 11c는 각 그룹의 스캐 폴드 잔재의 H & E 염색을 통해, 스캐폴드 내에서 염증 반응을 나타낸 것이다.
도 11d는 M1, M2 마커로 염색된 GA, NGO-5 및 NGO-10 그룹 스캐폴드의 대표적인 공초점 이미지를 나타낸 것이다.
도 11e는 이식된 스캐폴드 내에 침투한 M1+ 세포 대 M2+ 세포의 비율을 나타낸 것이다.
도 11f는 스캐폴드 이식에서 NGO의 중추적 역할에 대한 기전을 개략적으로 나타낸 것이다.
본 발명자들은 나노크기의 산화 그래핀(NGO)을 합성한 결과, 육각형 탄소 구조를 가진 시트가 관찰되었으며, 30nm 직경을 갖고 3 내지 8 nm의 두께를 갖는 NGO를 관찰하였다(실시예 1 참조).
또한, 탈세포화된 간 스캐폴드를 제작한 결과, 탈세포화됨에 따라 간 대사보다는 ECM 조직과 관련된 단백질이 상위발현됨을 확인하였다(실시예 2 참조).
또한, NGO가 가교결합된 dECM 간 스캐폴드를 제작하고, NGO가 제작된 스캐폴드의 물리적 특성을 향상시킴을 확인하였다. 구체적으로 NGO에 의해 탄성 계수, 최대 인장 강도 등 기계적 특성이 강화됨을 확인하였다(실시예 3 참조).
또한, NGO 가교 스캐폴드는 콜라겐 분해 효소로 알려진 MMP-1의 처리에도 불구하고 미세 구조가 파괴되지 않고, 대조군과 비교하여 중량 손실 또한 현저히 감소함을 확인하였는 바, NGO의 가교가 스캐폴드의 효소 분해에 대한 내성을 강화시킴을 확인하였다(실시예 4 참조).
또한, NGO가 스캐폴드의 주요 구성 요소를 절단하는데 관여하는 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9 의 촉매 활성을 유의하게 감소시켜, NGO가 스캐폴드에 직접 결합함으로써 MMP 효소 활성을 직접적으로 억제하며, NGO가 아연 결합 모티프 내 구성인 글루타메이트 및 히스티딘을 직접 결합함으로써 MMP 효소 활성을 억제함을 확인하였다(실시예 5 참조).
또한, NGO 가교 스캐폴드에 간 실질 세포 및 혈관내피세포를 처리한 결과, NGO 가교 스캐폴드는 대조군과 비교하여 상기 세포들이 높은 생존율을 보이며, 증식성 세포 집단을 포함하고 있음을 확인하였다. 또한, NGO 가교 그룹의 알부민 분비, 요소 분비 및 글리코겐 합성을 포함한 간 기능이 비교군들과 비교하여 현저히 증가함을 확인하였다(실시예 6 참조).
또한, NGO 가교 스캐폴드가 인간 M2 분극화에 최적화된 환경을 제공할 수 있음에 따라, 이식된 스캐폴드의 분해 및 이식에 의해 유발되는 염증이 개선될 수 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).
또한, NGO 가교 스캐폴드를 마우스 생체 내에 이식한 결과, NGO 가교 스캐폴드가 이식 후 상당 기간 지난 후에도 분해되지 않고 면적 및 질량이 잘 유지되며, 호중구 및 림프구와 같은 염증 세포가 상당히 감소하였음을 확인하였다. 뿐만 아니라, NGO 가교 스캐폴드는 비교군들과 비교하여 M2 분극화 효과가 현저히 우수함을 확인하였다.(실시예 8 참조).
또한, NGO 가교 스캐폴드는 MMP와 TIMP를 모두 방출하여 구조적으로 조직 리모델링을 조절하는 M2c 대식세포 수준이 유의하게 높은 것을 확인하였는 바, NGO가 방출된 MMP와 상호작용하고 MMP의 활동을 억제하였음을 확인하였다(실시예 9 참조).
또한, NGO 가교 스캐폴드는 이식 후 60일 후에도 낮은 수준의 염증 반응을 나타내며, 분해 정도도 다른 비교군들보다 낮음을 확인하였다(실시예 10 참조)
따라서, 본 발명자들은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체 제조용 조성물 및 인공 기관 제작용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명자들은 그래핀 나노 구조체를 포함하는 탈세포 지지체 제조용 조성물 및 인공 기관 제작용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 용어, “그래핀”이란 복수개의 탄소 원자들이 서로 공유 결합으로 연결되어 폴리시클릭 방향족 분자를 형성한 것을 의미하는 것으로서, 상기 공유 결합으로 연결된 탄소 원자들은 기본 반복 단위로서 6 원환을 형성하나, 5 원환 및/또는 7 원환을 더 포함하는 것도 가능하다.
본 발명의 용어, “그래핀 나노 구조체”는 나노크기의 그래핀 유도체를 지칭하는 것으로, 나노크기의 산화 그래핀(nano-sized graphene oxide; nan-GO; NGO) 및 그래핀 양자점(graphene quantum dot; GQD)을 포함한다.
본 발명의 용어, "산화 그래핀"이란, 그래핀 옥사이드 (graphene oxides)라고도 불리우고, "GOs"로 약칭될 수 있다. 그래핀 상에 카르복실기, 히드록시기, 또는 에폭시기 등의 산소 원자를 함유하는 작용기가 결합된 구조를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "나노크기의 산화 그래핀(nano-sized graphene oxide; nano-GO)"이란, 나노미터 수준의 크기를 갖는 입자의 형태로 제조되는 산화 그래핀을 지칭하는 것으로, 그래핀 상에 카르복실기, 히드록시기, 또는 에폭시기 등의 산소 원자를 함유하는 작용기가 결합된 구조를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않을 수 있다. 상기 나노크기의 산화 그래핀은 20 nm 이하의 소정의 두께를 갖고 약 15 내지 50 nm의 평균 직경을 갖는 판상형의 입자를 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 나노크기의 산화 그래핀은 상업적으로 구입하여 사용하거나, 당업계에 공지된 방법으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 나노크기의 산화 그래핀은 15 내지 45 nm, 18 내지 45 nm, 20 내지 40 nm, 25 내지 35 nm, 또는 27 내지 33 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 나아가, 상기 나노입자는 1 내지 20 nm, 1 내지 19 nm, 1 내지 18 nm, 1 내지 17 nm, 1 내지 16 nm, 1 내지 15 nm, 1 내지 14 nm, 1 내지 13 nm, 1 내지 12 nm, 1 내지 11 nm, 1 내지 10 nm, 1 내지 9 nm, 2 내지 15 nm, 2 내지 14 nm, 2 내지 13 nm, 2 내지 12 nm, 2 내지 11 nm, 2 내지 10 nm, 2 내지 9 nm, 또는 3 내지 8 nm의 두께를 갖는 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 약 30nm의 평균 직경을 갖고, 3 내지 8nm의 두께를 갖는 나노크기의 산화 그래핀을 합성하였다.
본 발명의 용어, "그래핀 양자점(graphene quantum dot; GQD)"이란, 나노-크기 단편을 가진 그래핀을 의미하는 것으로, 상기 그래핀 양자점은 적절한 가공을 통해 제조되는, 수 nm 수준의 가로, 세로 및 높이를 갖는 그래핀 입자일 수 있으며, 탄소섬유를 열산화 절단(thermo-oxidative cutting)하여 획득할 수 있으나, 그 제조방법은 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 그래핀 양자점은 1 내지 5 nm의 평균 직경 및 0.5 내지 3 nm의 두께를 갖는 입자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예컨대, 상기 그래핀 양자점은 1 내지 3 nm 또는 3 내지 5 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 나아가, 상기 그래핀 양자점은 0.5 내지 2.5 nm, 0.5 내지 1.5 nm, 또는 1.5 내지 2.5 nm의 높이를 가질 수 있다.
본 발명에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 조성물에 0.1 내지 100 μg/mL, 0.1 내지 90 μg/mL, 0.1 내지 80 μg/mL, 0.1 내지 70 μg/mL, 0.1 내지 60 μg/mL, 0.1 내지 50 μg/mL, 0.1 내지 40 μg/mL, 0.1 내지 30 μg/mL, 0.1 내지 20 μg/mL, 0.5 내지 20 μg/mL, 0.5 내지 15 μg/mL, 1 내지 10 μg/mL, 1 내지 9 μg/mL, 1 내지 8 μg/mL, 1 내지 7 μg/mL, 1 내지 6 μg/mL, 2 내지 6 μg/mL, 3 내지 6 μg/mL, 4 내지 6μg/mL, 또는 약 5μg/mL로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
조직 공학(issue engineering)이란 세포와 여러 가지 물질들의 조합을 이용한 어떤 구조물(주형물)에 세포를 안착시키는 방법으로, 이러한 이 구조물(주형물)을 스캐폴드라고 부르고, 이것을 만드는 목적은 손상받은 조직이나 기관을 대체할 수 있는 구조물, 즉 기관을 만드는 것이다. 종류는 여러 가지가 있으나, 생체 구조물(즉, 장기)을 탈세포화(decellularization)시켜 세포를 제거한 후 미세구조 및 장기의 윤곽만을 남긴 구조물(주형물)을 바이오 스캐폴드 또는 탈세포 지지체라고 한다.
본 발명에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체에 가교결합되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, NGO의 카르복실기는 조직 내 ECM 단백질(콜라겐, 피브로넥틴 등) 내 아민기와 반응함으로써 펩타이드 결합을 형성함으로써 탈세포 지지체와 가교결합될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 (본 발명의 도 3d 참고).
본 발명에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체 내 조직의 가교결합을 유도하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 즉, 본 발명의 조성물은 탈세포 지지체 내 조직의 가교결합 유도용 조성물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 물성을 강화 또는 개선하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 물성은 전기적 물성, 기계적 물성, 열역학적 물성, 자기적 물성, 진동관련 물성 등 탈세포 지지체가 갖는 특성이다.
본 발명에서, 상기 물성은 하기 특성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
ⅰ) 탈세포 지지체의 탄성;
ⅱ) 탈세포 지지체의 분해 효소에 의한 중량 손실; 및
ⅲ) 탈세포 지지체의 인장 강도.
본 발명에서, 용어 “탄성”은 영률(Young’s modulus)로 표현되는 것일 수 있으며, 상기 영률은 고체 재료의 강성을 측정하는 역학적 특성이다. 본 발명의 탄성은 재료에서 하중이 제거되면, 압력 또는 장력에 의해 변형된 재료가 원래의 형태로 되돌아오는 특성을 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 “인장 강도(Tensile strength, TS)”는 재료의 세기를 나타내는 힘으로, 재료가 절단되도록 끌어당겼을 때 견뎌내는 최대 하중을 재료의 단면적으로 나눈 값을 말한다. 인장 강도는 장력 강도라고 하기도 한다.
본 발명에서, 상기 분해 효소는 생화학에서 가수 분해와 산화 이외의 다양한 화학 결합을 끊는 것을 촉매하는 효소를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 분해 효소는 예를 들어, 라이소자임, 세포외 기질 분해 효소(MMP), 콜라겐 분해 효소(collagenase) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서, 그래핀 나노 구조체인 나노 크기의 산화 그래핀은 세포외 기질 분해 효소(MMP-1, MMP-2, 및 MMP-9)를 직접적으로 억제함을 확인하였는 바, 탈세포 지지체가 생체 내에서 빠르게 분해되는 것을 억제할 수 있음을 확인하였다 (본 발명의 실시예 5 참조).
본 발명에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 염증 반응 유발을 개선 또는 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 그래핀 나노 구조체는 M2 대식세포로의 분극화를 촉진하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 용어 “염증”은 유해한 자극에 대한 생체반응 중 하나로 면역세포, 혈관, 염증 매개체들이 관여하는 보호반응이다. 본 발명의 염증은 선천 면역에 의해 매개되는 비특이적 반응일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 선천적 면역 반응은 외부에서 침입하는 병원균으로부터 우리 몸을 가장 먼저 보호하는 1차 방어 작용으로서, 비특이적 면역이라고도 한다. 선천적 면역 반응에는 호중구, 단핵구, 대식세포 등이 관여하며, 선천적 면역 반응은 병원균의 종류나 감염 경험의 유무와 관계없이 병원균 침입, 감염 시 신속하게 반응이 일어난다. 특히, 대식세포는 생체 내 모든 조직에 분포하여 면역을 담당하는 세포로서, 침입한 병원균의 제거, 바이러스에 감염된 자가세포와 암세포의 제거, 및 염증 반응의 유도에 관여한다. 대식세포는 발생과정에서 난황낭(YolkSac)이나 태아 간(Fetal Liver)에서 분화한 조직세포 유래 대식세포(tissue-resident macrophage)와, 혈액 내의 단핵구(골수세포에서 분화)가 염증반응이나 병원균 침입 등에 의해 분화한 단핵구 유래 대식세포(Monocyte derived macrophage)로 구분될 수 있다.
M1 대식세포는 Th1 세포의 사이토카인인 IFN-γ, TNF-α등에 의해 유도되며, Th1 반응 유도, 염증반응 유발, 암 성장 억제 등에 작용한다. M2 대식세포는 Th2 세포의 사이토카인인 IL-4, IL-10 등에 의해 유도되며, Th2 반응 유도, 염증반응 억제, 손상된 조직 복구 등에 작용한다. 이처럼, 골수유래 대식세포 및 단핵구 유래 대식세포는 사이토카인의 종류에 따라 서로 다른 작용을 하는 M1 또는 M2 대식세포로 분화될 수 있다.
염증의 해소 단계에서 대식세포 M1형에서 M2형으로의 전환(transition)은 필수적은 요소로 인식된다. 전환된 M2 대식세포는 면역 억제 사이토카인(TGF-β과 IL-10)을 분비하고, 주변의 죽은 면역세포들을 식세포 작용으로 제거함으로써 염증을 해소하고 조직의 수복을 촉진하는 것으로 알려져 있다. 염증성 질환에서도 M1 대식세포의 M2 대식세포로의 전환(M1→M2)을 조절함으로써 염증소실을 유도하여 염증을 개선 및 치료할 수 있는 것으로 보고된다. 따라서, 본 발명의 그래핀 나노 구조체는 M2 대식세포로의 분극화를 조절하므로, 탈세포 지지체 및 그로부터 제조된 인공 장기에 의한 생체 내 염증 반응을 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명의 일 실시예에서, 그래핀 나노 구조체인 나노 크기의 산화 그래핀이 M2 대식세포 중에서도 면역 조절 외 매트릭스 리모델링을 매개하는 것으로 알려진 M2c 대식세포로의 분극화를 촉진함을 확인하였는 바, 조직 리모델링을 통해 생체 내에서 장기간 탈세포 지지체를 유지할 수 있음을 확인하였다 (본 발명의 실시예 7 참조).
본 발명의 인공 기관은 탈세포 지지체에 그래핀 나노 구조체를 처리하여 물성이 강화되고 염증 반응이 억제 또는 완화된 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 조직 및 혈관 등과 가교결합되어 탈세포 지지체의 물성을 강화시키고, 탈세포 지지체가 이식 후 유발하는 염증 반응을 완화 또는 억제할 수 있다.
따라서, 본 발명의 인공 기관은 생체적합성일 수 있다. 본 발명의 용어 “생체적합성”은 "이식적합성"과 혼용되며, 장기 이식 시 면역거부 반응을 일으키지 않는 성질을 의미한다. 인공 기관 내 면역거부반응의 원인인 유전자, 단백질 또는 효소의 발현을 감소시킴으로써 세포, 조직, 또는 기관이 이식적합성을 갖도록 할 수 있으며, 이에 대한 비제한적 예시로, HLA 유전자의 발현, 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 활성 등을 억제함으로써 세포, 조직 또는 기관이 이식적합성을 갖도록 할 수 있다.
또한, 본 발명의 생체적합성은 비-영장류 포유류 유래 장기 조직 탈세포지지체에서 면역 반응 유발 에피토프로 알려진 단백질 또는 효소를 억제함으로써 얻어질 수 있으며, 그에 따라 야생형(WT) 뿐만 아니라 형질전환 동물 유래 탈세포 지지체에도 그래핀 나노 구조체를 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 발명에서, 상기 인공 기관은 예를 들어 혈관을 포함하는 기관이라면 제한되지 않으며, 구체적으로는 간(liver)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 통상적으로 생리적 조건(예를 들어, 37 ℃) 하에서 세포와 혼화 가능한 용액으로(예를 들어, 생리적 조성물로) 조직 또는 장기 매트릭스로 전달될 수 있다. 상기 조성물은 완충액, 영양소(예를 들어, 당, 탄수화물), 효소, 증식 및/또는 분화 배지, 시토카인, 항체, 억제인자, 성장 인자, 염류 용액, 또는 혈청-유래 단백질 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용된 용어 “실질세포”는 세포고유의 기능을 영위하는 주요부분을 이루는 세포를 의미한다. 본 발명에서, 상기 실질세포는 구체적으로 간 실질세포, 신장 실질세포, 각막 실질세포, 혈관내피세포 등 일 수 있으며, 바람직게는 간 실질세포, 즉 간세포(hepatocyte)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서, 간 실질(parenchymal hepatocyte) 세포는 비병적조건에서 간의 총 80%를 차지한다.
본 발명에서, 상기 실질세포는 수여자와 동일한 종에서 유래한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 줄기세포 유래 실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 줄기세포 유래 실질세포는 사람 백혈구 항원이 제거된 및/또는 공격 무력화 신호를 과발현하는 인간의 범용(universal) 유도 만능줄기세포에서 분화된 실질 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조성물은 비실질세포를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 비실질세포는 간의 내피 세포, Kupffer 세포, 간 성상 세포(hepatic stellate cell, Ito cell, lipocytes, fat-storing cell), 담관 세포, pit 세포, 혈관상피세포 및 섬유아세포(fibroblast)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어 “줄기세포”는 미분화 상태에서 일정기간 동안 자신과 동일한 세포를 지속적으로 만들어 낼 수 있는 성질과 적당한 조건하에서는 특정한 세포로 분화하는 성질을 가지고 있는 세포를 의미한다.
본 발명에서, 상기 줄기세포는 역분화 줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 골수유래 줄기세포(Marrow-derived Stem Cell), 지방유래줄기세포(Adipose tissue-derived Stem Cells) 및 태반유래 줄기세포(Placenta-derived Stem Cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 그래핀 나노 구조체를 처리하는 단계를 포함하는 인공 기관의 제조방법을 제공한다.
본 발명에서, 상기 인공 기관의 제조방법은 다음의 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:
a) 조직원으로부터 기관을 제공하는 단계;
b) 상기 제공된 기관을 탈세포화하는 단계; 및
c) 상기 탈세포화된 기관에 그래핀 나노 구조체를 처리하는 단계.
본 발명에서, 상기 방법은 d-1) 탈세포화된 기관을 혈관내피세포로 재세포화시키는 단계;
d-2) 탈세포화된 기관을 실질세포로 재세포화시키는 단계; 및
d-3) 탈세포화된 기관을 비실질세포로 재세포화시키는 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 조직원은 인간, 원숭이, 마우스, 랫트, 돼지, 소, 토끼 등의 각종 포유동물 군 중에서 선택할 수 있다.
본 발명에서, 상기 탈세포화는 당업계의 알려진 방법으로 수행될 수 있으나, 본 발명의 일실시예에서는 조직원으로부터 수득한 간의 간문맥을 탈이온수 및 PBS로 세척한 후 데옥시리보뉴클레아제로 세척한 후, 과산화아세트산으로 멸균하였다. 예를 들어, 이하의 참고문헌들은 폐, 간, 신장, 뇌 및 사지의 관류-기반 탈세포화를 기술하고 있다: Van Putte et al., 2002, Ann. Thorac. Surg., 74(3):893-8; den Butter et al., 1995, Transpl. Int., 8:466-71; Firth et al., 1989, Clin. Sci. (Lond.), 77(6):657-61; Mazzetti et al., 2004, Brain Res., 999(1):81-90; Wagner et al., 2003, J. Artif. Organs, 6(3):183-91. 관류-기반 탈세포화의 대안으로서, 세포를 제거하는 탈세포화 용액에 담금으로써 생물학적 조직 및 장기가 탈세포화될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,376,244호 및 제6,753,181호를 참고한다.
본 발명에서, 관류에 적합한 생리적 완충액은 이식을 포함한 저장 및/또는 장기 관류에 쓰일 수 있는 영양 공급물, 예를 들어 포도당이 있는 완충액, EGM-2, EGM-2MV, DMEM, 프로모 셀(Promocell) 내피세포 배지, 미디엄 200(Medium 200), DMEMF/12를 포함하나 이에 국한되지는 않는 내피세포 배양에 적합한 배양 배지 용액 또는 인산염 완충 염수(PBS)를 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
본 발명에서, 상기 탈세포화 시 관류의 방향 (예를 들어, 전행성 및 역행성)을 교대로 하는 것은 전체 기관 또는 조직에서 효과적으로 세포를 제거하는 것을 도와줄 수 있다. 본 명세서에 기술된 바와 같은 탈세포화는 본질적으로 기관을 내부에서부터 세포를 제거하여 ECM에 거의 손상을 야기하지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 기관 또는 조직은 4 내지 40℃ 사이의 적합한 온도에서 세포를 제거할 수 있다. 기관 또는 조직의 크기 및 중량 및 세포붕괴 매질 내의 특정한 세제(들) 및 세제(들)의 농도에 따라서, 기관 또는 조직은 일반적으로 고형 기관 또는 조직의 그램당, 약 2 내지 약 12 시간 동안 세포붕괴 매질로 관류시킨다. 세척액을 포함하는 기관은 조직의 그램당, 약 1 내지 약 12 시간 동안 관류될 수 있다. 관류는 일반적으로 박동성 혈류, 유속 및 압력을 포함하는 생리학적 조건으로 조정된다,
본 발명에서, 기관 또는 조직을 생성시키기 위한 재세포화는 탈세포화된 기관 내에 및 그 상에 도입되는 재생성 세포의 수가 기관 (예를 들어, 어떤 기관인지, 및 그 기관의 크기 및 중량) 또는 조직 및 재생성 세포의 유형 및 발육단계 모두에 따라서 상이할 수 있다. 상이한 유형의 세포는 이들 세포가 도달하는 개체군 밀도 (population density)에 관하여 상이한 경향을 가질 수 있다. 마찬가지로, 상이한 기관 또는 조직은 상이한 밀도로 재세포화될 수 있다. 예를 들어, 탈세포화된 기관 또는 조직은 적어도 1,000, 10,000, 100,000, 1,000,000, 10,000,000 또는 100,000,000 개)의 재생성 세포로 "접종"될 수 있거나; 또는 재세포화 후 약 1,000 세포/조직 ㎎ (습윤 중량, 즉 탈세포화 전의 중량) 내지 약 100,000,000 세포/조직 ㎎ (습윤 중량)을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 방법은 그래핀 나노 구조체가 처리된 기관을 생물반응기에서 1 내지 100일, 1 내지 90일, 1 내지 80일, 1 내지 70일, 1 내지 60일, 1 내지 50일, 1 내지 40일, 1 내지 1개월, 1 내지 3주, 1 내지 15일, 1 내지 2주, 5 내지 15일, 5 내지 2주, 1주 내지 3주 또는 약 2주 동안 배양시키는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 인공 기관을 제공한다.
상기 인공 기관은 이식용 장기로서 이식 후 수여자의 면역 거부 반응을 유발하지 않을 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인공 기관은 치료제 스크리닝 용도로 사용될 수 있으며, 바람직하게 간 질환 치료제 스크리닝 용도로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 “포함” 한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “약”, “실질적으로” 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본 발명의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
본원 명세서 전체에서, 마쿠시 형식의 표현에 포함된 “이들의 조합(들)”의 용어는 마쿠시 형식의 표현에 기재된 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 혼합 또는 조합을 의미하는 것으로서, 상기 구성 요소들로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 것을 의미한다.
본원 명세서 전체에서, “A 및/또는 B”의 기재는 “A 또는 B, 또는 A 및 B”를 의미한다.
어떤 실시예가 달리 구현 가능한 경우에 특정한 단계는 설명되는 순서와 다르게 수행될 수도 있다. 예를 들어, 연속하여 설명되는 두 단계는 실질적으로 동시에 수행될 수도 있고, 설명되는 순서와 반대의 순서로 수행될 수도 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험방법 및 재료
나노 산화 그래핀(Nano graphene oxide, NGO)의 준비 및 분석
NGO는 Taylor-Couette 흐름을 통해 흑연으로부터 쉽게 합성하였다. 합성된 NGO 입자의 형태와 크기 분포는 Cs 보정 투과 전자 현미경(JEM-ARM200F, Cold FEG, JEOL Ltd, Japan)으로 분석하였다. NGO는 400 메쉬 탄소 코팅 구리 그리드에로딩되고, 분석 전에 완전히 건조되었다. 다음으로, 사파이어 웨이퍼 위에 준비된 NGO를 비접촉 모드의 원자력 현미경(XE-100, Park Systems, Korea)으로 검사를 수행하였다. 25μm2의 면적을 스캔하였다. NGO의 라만 스펙트럼은 라만 분광기의 532nm 여기 레이저 (LabRAM HR Evolution, HORIBA, Japan)를 사용하여 얻었다. NGO의 분말은 X-선 광전자 분광기(AXIS-His, Kratos, USA)로 확인하였다. NGO의 FTIR 스펙트럼을 얻기 위해 FTIR 분광광도계(Nicolet 6700, Thermo Fisher Scientific, USA)를 기존의 KBr 펠릿 방법으로 수행하였다. NGO의 제타 전위는 Zetasizer Nano ZSP(Malvern Instruments, England)를 사용하여 분석하였다.
탈세포화된 간 스캐폴드의 제작 및 특성 검증
모든 랫트 실험은 서울대학교 동물 병원 동물 관리위원회(SNU-191208-1)의 승인된 지침에 따라 수행되었다. 탈세포화 된 랫트 간 스캐폴드의 제작을 위해, 문맥 및 담관의 카테터 삽입에 의해 암컷 스프라그-돌리 랫트 (200-250g)로부터 간을 수집하였다. 이어서 간을 문맥을 통해 0.1 % 소듐도데실설페이트 (SDS)의 관류에 의해 탈세포화하고, PBS로 세척하고 0.1 % 과초산(Sigma)으로 멸균하였다. 샘플은 조직학적 검사와 주사 전자 현미경 검사를 수행하였다. AccuPrep Genomic DNA 추출 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 샘플에서 DNA를 추출하였다 (Bioneer, 대한민국).
DNA 농도는 분광광도계(Nanodrop 2000c, Thermo Fisher Scientific)로 측정하고 각 샘플의 건조 중량으로 정규화하였다. 간 스캐폴드의 단백질 특성을 규명하기 위해 Liquid Chromatography Hybrid-FT orbitrap Mass Spectrometer(Korea Basic Science Institute, Ochang, Republic of Korea)를 이용하여 단백질체 분석을 수행하였다. 천연 간 및 dECM 간의 단백질체 프로파일은 MaxQuant를 사용하여 분석하였다. 상위 100개 단백질을 분류하고 STRING(string-db.org)을 사용하여 KEGG 경로 및 Reactome 경로 분석을 수행하였다. dECM 간에서 나타난 상위 100개 단백질 중 ECM 성분으로 분류된 단백질은 STRING을 사용하여 상호 작용체 분석을 수행하였다.
조직학적 검사
조직 샘플을 4% 포름 알데히드에 밤새 4 ℃에서 고정하고 조직 처리를 하였다. 탈수된 샘플을 파라핀에 포매하고 10μm 섹션으로 절단하였다. 조직 절편을 탈파라핀화하고 농도를 감소시키면서 일련의 에탄올 세척으로 수화시켰다. 조직슬라이드를 제조업체의 지침에 따라 피크로시리우스 레드(0.1 % Direct red 80, Sigma, 0.1 % Fast green FCF, Sigma) 및 헤마톡실린(Sigma)&에오신(Muto Pure Chemicals, Japan)으로 염색하였다. 과요오드산-쉬프 염색(PAS)을 위해 PAS 염색 키트(ab150680, Abcam)를 사용하였다. 염색 후, 슬라이드를 수돗물로 세척하고 70% 내지 100% 범위의 상승하는 일련의 에탄올로 탈수시킨 다음 자일렌으로 세척하였다. 샘플은 Nikon 광학 현미경과 NIS-Elements 소프트웨어(Nikon, Japan)로 시각화하였다.
주사 전자 현미경(SEM)
샘플 표본은 0.1M 카코딜산 완충액의 완충 용액에 4% 글루타르 알데히드 및 1% 파라포름 알데히드로 고정하였다. 그 다음, 샘플을 카코딜화된 완충액으로 헹구고 일련의 등급화된 에탄올을 사용하여 탈수시켰다. 임계점 건조 후, 스퍼터 코팅된 샘플은 가변 압력 FE-SEM(SUPRA55VP, Carl Zeiss, Germany)으로 시각화하였다.
NGO와의 가교
탈세포화된 간 스캐폴드를 멸균한 후, 각 가교제 50mL (PBS; 음성 대조군, 0.625% 글루타르 알데히드; 양성 대조군, 1 μg/mL, 5 μg/mL 및 10 μg/mL NGO)를 전체 간 스캐폴드의 담관 및 문맥을 통해 24 시간 동안 관류시켰다. 가교된 스캐폴드를 탈이온수로 세척한 다음, 피부 생검 펀치(P1250, Acuderm Inc., USA)를 사용하여 스캐폴드 디스크(r=6mm)를 제작하였다.
가교된 스캐폴드 디스크는 항생제가 함유된 PBS에 4 ℃에서 보관하여 사용하였다. 특성 검증을 위해, 각 가교된 스캐폴드의 동결건조된 가루를 FTIR 분석 (Nicolet 6700)에 적용허였다. 각 그룹의 라만 스펙트럼은 전체 건조된 스캐폴드 디스크로 수행되었으며 532 nm 레이저를 사용하여 기록되었다. 팽윤율을 측정하기 위해 가교된 스캐폴드 디스크를 밤새 건조시켰으며, 스캐폴드 디스크의 무게는 건조 전후에 측정되었다. 각 간 스캐폴드의 팽윤율은 하기 식 1에 따라 계산 하였다:
팽윤율 (%) = (Ws - Wd) / Wd X 100 (Ws : 건조 전 중량, Wd : 건조 후 중량)
영률
각 가교된 스캐폴드의 탄성 계수는 Univert(CellScale, Canada)를 사용하여 얻었다. 가교된 스캐폴드를 24 시간 동안 건조하고 1mm/min의 로딩 속도로 영률을 측정하였다. 최대 하중은 최종 파단까지 샘플을 늘려 측정하였다. 테스트 동안 변위 (mm) - 힘 곡선 (N)이 자동으로 기록되고, 이후 샘플의 초기 길이를 고려하여 변형 (%) - 응력 (kPa) 곡선으로 변환하였다.
In vitro 콜라겐 분해 효소(Collagenase) 내성 시험
스캐폴드의 체외 콜라겐 분해 효소 매개 생분해를 모방하기 위해, 제1형 콜라겐 분해 효소(MMP-1; Sigma)를 사용하였다. 각각의 가교된 스캐폴드 디스크는 37 ℃에서 2 시간 동안 0.1 M Tris-HCl 버퍼(pH 7.6)에서 100 μg의 MMP-1과 함께 배양하였다. 그 후 10mM EDTA 용액(Gibco, USA)을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 생분해 동안의 무게 감소를 계산하기 위하여, 각 스캐폴드 디스크의 무게는 MMP-1을 사용한 전처리 및 후처리에서 각각 측정하였다. 그런 다음 샘플을 추가 분석(예 : 닌히 드린 분석 및 불용성 콜라겐의 정량화)에 적용하였다.
닌히드린 분석
가교 정도를 추정하기 위해 MMP-1에 노출된 후 가교된 스캐폴드 내의 유리 아미노산 그룹을 닌히드린 반응을 사용하여 정량화하였다. 각 스캐폴드를 1mL의 닌히 드린 시약(N7285, Sigma)과 2mL의 증류수 혼합물에 담갔다. 샘플을 100 ℃에서 10 분간 끓인 후 상온으로 냉각시켰다. 각 튜브에 3mL의 95 % 에탄올을 첨가한 후 마이크로플레이트리더(Infinite M200 pro, Tecan, Switzerland)를 사용하여 파장 570nm에서의 흡광도를 측정하였다.
불용성 콜라겐의 정량화
MMP-1에 노출된 후 가교결합된 스캐폴드의 불용성 콜라겐은 제조업체의 지침에 따라 Sircol 불용성 콜라겐 분석(Biocolor, UK)을 사용하여 추출하였다. 추출된 불용성 콜라겐의 양은 550nm에서 흡광도를 판독하여 측정하였다. 얻어진 결과는 각 샘플의 건조 중량으로 정규화되었다. 이를 위해 탈세포화 된 간 스캐폴드의 제작 및 특성 검증에 설명된대로 정규화를 위해 각 그룹의 팽윤율을 측정하였다.
MMP 활성 분석
MMP-1의 활성 측정을 위해 콜라겐 분해 효소 활성 분석 키트(ab196999, Abcam)를 사용하였다. 서로 다른 NGO의 농도 (1μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL)로 37 ℃에서 10 분간 배양한 콜라겐 분해 효소와의 혼합물을 콜라겐 기질과 반응시켰다. 1,10-페난트롤린은 콜라겐 분해 효소 억제제 대조군으로 사용되었다. 제조업체의 지침에 따라 345 nm 파장에서의 흡광도는 마이크로플레이트리더기를 사용하여 운동 모드에서 측정하였다.
콜라겐 분해 효소의 활성은 효소 반응 5분 및 15분 후 측정한 흡광도를 이용하여 계산하였다. MMP-2 및 MMP-9의 활성을 측정하기 위해, 재조합 MMP-2(# 420-02, Peprotech, USA) 및 재조합 MMP-9(ab155704, Abcam)를 aminophenylmercuric acetate(APMA)로 각각 실험 전에 37℃에서 각각 1시간 및 2시간 동안 활성화하였다. 활성화된 MMP 서브 타입은 37℃에서 15분 동안 NGO의 다양한 농도(1μg/mL, 5μg/mL 및 10μg/mL)와 함께 배양하였다. 이 경우 독시사이클린을 MMP 억제제의 대조군으로 사용하였다. 이어서, MMP 활성 분석 키트(ab112146, Abcam)의 MMP 기질을 각 그룹의 혼합물에 첨가하였다. 다중플레이트리더기(Victor 3, Perkin Elmer, USA)를 사용하여 기질을 추가한 후, 490/525nm(Ex/Em)에서 형광 강도를 15분 후에 측정하였다.
1
H NMR 및 STD-NMR 분광법
37℃에서 850Hz NMR 분광기(AVANCE Ⅲ HD, Bruker, Germany)를 사용하여 NGO와 MMP의 촉매 도메인 간의 상호 작용을 조사하였다. 모든 1H 및 STD NMR 스펙트럼은 5mm TCI 극저온 프로브를 사용하여 850.22Hz에서 측정되었다. 100 μg/mL의 MMP-1(LS004217, Worthington, USA), MMP-2(#420-02, Peprotech) 및 MMP-9(17104019, Gibco)를 100 μg/mL의 NGO와 37 ℃에서 배양하였다. 그런 다음 NGO 단독, MMP 단독 및 10% D2O가 보충된 H2O에 배합된 NGO와 혼합된 MMP를 NMR 분석을 수행하였다. STD-NMR 분석을 위해 오프-공명 및 온-공명에 대한 스펙트럼을 수집하였다. STD 스펙트럼은 오프-공명 스펙트럼에서 온-공명을 빼서 수득하였다.
세포 배양 및 스캐폴드로의 분주
HepG2 세포와 HUVEC는 ATCC (USA)에서 구입하여 37℃에서 5% CO2 배양기에 보관하였다. HepG2 세포는 둘베코의 변형된 이글 배지(DMEM)-고포도당 (Hyclone, USA)에서 배양하였다. HUVEC는 내피성장배지-2(EGM-2, Lonza, Switzerland)에서 배양하였다. 모든 배양 배지에는 항생제(100U/mL 페니실린 및 100μg/mL 스트렙토마이신, Gibco) 및 10% 소 태아 혈청(FBS, Gibco)을 포함하였다.
가교된 스캐폴드의 생체 적합성을 평가하기 위해, HepG2 세포 및 HUVEC 2 X 105를 각각의 가교된 스캐폴드 디스크에 분주하였다. 2 시간의 정적 배양 후, 각 그룹의 세포가 분주된 스캐 폴드에 적합한 배양 배지를 보충하고 15일 동안 유지하였다. 표시된 시점에서 각 스캐폴드의 추가 분석을 수행하였다(예 : 조직학적 검사, MTT 분석, 레자주린 감소 분석 및 ELISA 등).
MTT 분석
각 그룹의 가교된 스캐폴드 내의 세포의 대사 활성은 MTT 분석(tetrazolium-based colorimetric assay)을 사용하여 측정하였다. 15 일째, 12-웰 플레이트 상의 세포 분주된 스캐폴드를 PBS로 세척한 후 각 배양액에 희석된 10 % MTT 시약(Sigma Aldrich)과 함께 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 4 시간 후 MTT 시약을 제거하고 디메틸설폭사이드를 첨가하였다. 그 다음, 세포가 충분히 용해될 때까지 혼합하기 위해 플레이트를 마이크로플레이트진탕기에 놓았다. 570 nm 파장에서 MTT 포르마잔의 흡광도는 마이크로플레이트리더기를 사용하여 측정하였다.
ELISA
각 그룹에서 가교된 간 스캐폴드의 생체 적합성을 평가하기 위해 각각 HepG2 세포 분주 스캐폴드 및 HUVEC 분주 스캐폴드에서 조정 배지를 수확하였다. HepG2 세포-분주 스캐폴드에서 알부민 및 요소의 분비는 Albumin ELISA 키트(E80-129, Bethyl Laboratories) 및 QuantiChrome Urea Assay 키트(DIUR-100, BioAssay Systems, USA)를 사용하여 정량화하였다.
말초 혈액 단핵세포(PBMC)에서 생체 외 대식세포 분극
인간 PBMC는 제조업체의 지침 (CC-2702, Lonza)에 따라 해동 및 유지 관리하였다. 안정화를 위해 hPBMC를 10% FBS가 보충된 RPMI1640(Gibco)에서 24시간 동안 배양한 다음 CD14 마이크로 비드(130-050-201, Miltenyi Biotec, Germany)를 사용하여 자기 활성 세포 분리법(MACS)을 수행하였다. 양성으로 분류된 CD14는 배지에 재현탁되었다. 2 X 105개의 CD14 + 세포를 멸균된 가교 디스크에 분주하였다 (PBS; 음성 대조군, GA; 양성 대조군, NGO-1, NGO-5 및 NGO-10).
세포 분주 후, 스캐폴드는 M1의 경우 20ng/mL GM-CSF 및 M2의 경우 20ng/mL M-CSF가 보충된 기본 배지와 함께 2 일 동안 배양되었다. M1 편광을 위해, 20ng/mL의 IFN-γ(Peprotech), 1μg/mL의 LPS(InvivoGen, USA)를 배지에 첨가하고 스캐폴드를 추가 5 일 동안 유지하였다. M2c 분극화를 위해 스캐폴드에 20ng/mL의 IL-10(Peprotech)과 20ng/mL의 TGF-β1(Peprotech)을 추가로 보충하고 5일 동안 유지하였다. 7일째에 스캐폴드를 고정하고 면역형광 염색 및 유세포 분석을 실시하였다.
면역 형광 염색
포르말린 고정 파라핀 포매 조직은 10μm로 절단하였다. 각 조직 절편을 자일 렌으로 탈파라핀화하고 에탄올 농도 감소시키면서 수화시켰다. 그런 다음 절편을 PBS에서 4% 포름 알데히드로 10분 동안 고정한 다음 나트륨시트레이트 완충액(pH 6.0, Sigma)으로 항원 검색을 수행하였다. 실온에서 1시간 동안 0.1% Triton X-100(Sigma Aldrich)에서 5% 정상 염소 혈청(Vector Laboratories, 스위스)으로 차단한 후 조직 절편을 다음 1 차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다 : 항-CD68(ab31630, Abcam), 항-F4/80(ab6640, Abcam), 항-CCR7(ab221209, Abcam), 항-CD206(ab64693, Abcam), 항-MMP-2(sc-13594, Santa Cruz Biotechnology, USA), 항-MMP-9(sc-13520, Santa Cruz Biotechnology), 항-TIMP-1(sc-21734, Santa Cruz Biotechnology), 및 항-TIMP-2(sc-5539, Santa Cruz Biotechnology). 0.025% Triton X-100을 포함하는 PBS로 세척한 후, 섹션을 형광 염료 접합 2차 항체(Alexa Flour 488-표지 및 594-표지, Invitrogen)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 섹션은 핵 검출을 위해 DAPI(sc-3598, Santa Cruz Biotechnology)로 염색한 다음 형광 마운팅 배지(S302380, DAKO, Denmark)로 마운팅하였다. 이미지는 Eclipse TE 2000 공초점 레이저 스캐닝 현미경(일본 니콘)으로 시각화하였다. CD68+ CCR7+ 세포는 M1 편광된 대식세포로 간주되었고, CD68+ CD206+ 세포는 M2 편광된 대식세포로 간주하였다. 무작위화된 필드에서 이미지를 시각화하고 M1 유사세포(CD68+ CCR7+)/CD68+ 세포, 및 M2 유사세포(CD68+ CD206+)/CD68+ 세포의 비율을 Image J 소프트웨어로 각각 정량화하였다.
유세포 분석
분주된 CD14+ 세포가 대식세포와 같은 M1 또는 M2로 분극화되었는지 여부를 분석하기 위해, 쥐 간의 소화에 관한 기존 프로토콜을 사용하여 스캐폴드에서 세포를 추출하였다. 먼저, 스캐폴드를 다져서 37℃, CO2 인큐베이터에서 20분 동안 2500 U/mL의 콜라겐 분해 효소 Ⅳ(17104019, Gibco) 및 1 mg/mL의 DNase 1 (10104159001, Roche, Switzerland)과 함께 배양하였다. 100μm 나일론 세포 스트레이너(352360, Falcon, USA)로 여과한 후 분리 완충액(4.8% 소 혈청 알부민 및 HBSS 중 2mM EDTA)으로 4℃에서 원심 분리하여 3 회 세척하였다. 그 후 세포 펠렛을 2% FBS를 포함하는 PBS에 현탁시킨 후 다음 항체와 함께 4 ℃에서 15분 동안 배양하였다:M1의 경우, CD14(555397) 및 CD86(555659); M2의 경우, CD14, CD163(563887) 및 CD206(555954). 모든 항체는 BD bioscience(미국)에서 구입하였다. 세포를 PBS로 세척하고 유세포 분석(FACS Calibur, BD bioscience)을 실시 하였다. 데이터는 FlowJo 소프트웨어(미국)를 사용하여 분석하였다.
가교된 스캐폴드의 생체 내 이식
멸균된 가교 스캐폴드 디스크(PBS; 음성대조군, GA(글루타르알데히드); 양성대조군, NGO-1, NGO-5, NGO-10)를 6주령 수컷 Balb/c 마우스(각 그룹에 대해 n = 20)의 등쪽 피하 주머니(dorsal subcutaneous pockets)에 이식하였다. 표시된 시점 (7일, 21일, 35일 및 60일)에 각 그룹에서 5 마리의 마우스를 희생시키고 추가 분석을 위해 이식된 스캐폴드를 수득하였다. 이식 후 유도된 면역 반응을 조사하기 위해 이식된 스캐폴드 내의 침윤된 호중구와 림프구를 조직학적 검사로 정량화하였다.
침윤된 대식세포의 분극화를 평가하기 위해 면역 형광 염색을 수행하였다.
F4/80+ CCR7+ M1 유사 대식세포 및 F4/80+ CD206+ M2 유사 대식세포의 수를 Image J 소프트웨어를 이용해 무작위 필드에서 정량화하고 M1/M2 대식세포의 비율을 계산하였다. 마우스에서 채취한 혈청 샘플은 전신 면역 반응을 분석하기 위해 세포 계산 비드 어레이를 사용하였다. 모든 마우스 실험은 서울대학교 동물 실험 실용위원회(SNU-191208-1)의 승인을 받아 수행되었다.
통계 분석
통계 분석을 수행하고 GraphPad Prism 버전 5.0을 사용하여 그래프를 생성하였다. 모든 값은 평균 ± 표준 편차를 사용하였다. 통계적 유의성은 Bonferroni 보정을 사용한 양방향 ANOVA에 이어, 쌍을 이루지 않는 양측 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정하였다. p <0.05의 값은 유의한 것으로 간주하였다 (* p <0.05; ** p <0.01; *** p <0.001). 모든 실험은 적어도 세 번 독립적으로 수행하였다.
실시예 1. NGO의 특성 검증
합성된 NGO의 특성을 파악하기 위해, 먼저 투과 전자 현미경 분석을 수행하였다.
NGO 시트의 육각형 탄소 구조가 관찰되었으며 NGO의 크기는 약 30nm로 나타났다 (도 1a 및 도 1b 참조). 원자력 현미경 분석에 따르면 NGO의 원자 두께는 3~8nm 범위였으며, 이는 NGO가 10개 미만의 층으로 쌓여있음을 시사하는 결과이다 (도 1c 및 도 1d 참조). 라만 분광법에서 피크는 약 1350cm-1(D 밴드) 및 1580cm-1(G 밴드)에서 나타 났으며, 이는 산화 그래핀의 특성 피크와 동일한 결과이다 (도 1e 참조).
NGO의 표면 조성은 X 선 광전자 분광법을 사용하여 조사하였다.
C1s 스펙트럼은 C-C(51.4 %), C-O(38.76 %) 및 C=O(9.85 %) 결합과 관련된 세 개의 피크를 나타냈다 (도 1f 참조). NGO의 푸리에 변환 적외선 분광법(FTIR) 스펙트럼은 각각 OH, C=O 및 CO 결합의 스트레칭 진동에 해당하는 3428cm-1, 1720cm-1 및 1049cm-1에서 피크를 나타냈다 (도 1g 참조). 이러한 결과는 하이드록실, 카르복실 및 에폭시 부분이 NGO에 존재함을 시사한다. 마지막으로 -38.6 ± 6.86 mV의 제타 전위값은 NGO의 중간 분산 안정성을 나타내는 결과이다 (도 1h 참조).
실시예 2. dECM 간 스캐폴드의 특성 검증
dECM 간 스캐폴드를 제작하기 위해 랫트 간을 0.1% SDS의 관류를 통해 탈세포화하였다 (도 2a 참조). dECM 간 스캐폴드의 구조 분석 결과, 탈세포화 후 완전히 제거된 기존 숙주 세포없이, 섬유질 구조의 보존을 나타냈다 (도 2b 내지 도 2d 참조).
간 조직의 단백질체 프로파일을 조사하기 위해 액체 크로마토그래피/질량 분석 (LC/MS)을 수행하였다. 결과적으로 상위 100개 단백질의 KEGG 경로 및 Reactome 경로 분석 결과, 천연 간은 주로 대사와 관련이 있는 반면, dECM 간은 대부분 ECM 조직과 관련된 단백질이 상위에 있음을 보였다 (도 2e 및 도 2f 참조). 특히 비글리칸(biglycan), 피브로넥틴(fibronectin), 제1형 콜라겐이 dECM 간 스캐폴드의 주요 ECM 성분으로 확인되었다 (도 2g 및 도 2h 참조).
실시예 3. NGO 가교 dECM 간 스캐폴드의 제작
가교를 위해 dECM 간 스캐폴드를 PBS (CTL, 음성 대조군), 0.625% GA (글루타르알데히드, 양성 대조군) 및 다양한 농도의 NGO (1μg/mL; NGO-1, 5μg/mL; NGO-5, 10μg/mL; NGO-10)로 관류하였다.
주사전자현미경(SEM) 분석 결과, 가교된 스캐폴드 내에서 NGO가 ECM의 섬유질 네트워크에 결합된 것으로 나타났다 (도 3a 참조). 라만 분광법 분석 결과, NGO 농도에 관계없이 NGO 가교된 스캐폴드의 피크는 dECM 스캐폴드 피크인 2930cm-1뿐만 아니라, NGO의 특징적인 피크인 1350cm-1 (D 밴드) 및 1580cm-1(G 밴드)에서도 나타났다. 이러한 결과는 가교 후 dECM 스캐폴드 내에 NGO가 존재함을 나타낸다 (도 3b 참조). 예상대로 NGO 피크는 GA-가교된 스캐폴드에서는 검출되지 않았다 (도 4a 참조).
다음으로 NGO와 스캐폴드의 화학 조성을 특성을 검증하기 위해 FTIR 분석을 수행하였다. NGO-5 그룹에서 피크는 NGO의 탄화수소 모이어티를 나타내는 1720cm-1, 1157cm-1 및 1060cm-1에 나타났다 (도 3c 참조).
한편, CTL 스캐폴드에 비해 NGO-5 스캐폴드에서 1차 아민기에 할당된 3085 cm-1 피크의 투과율이 감소하였으며, 이는 NGO의 카르복실기가 dECM 스캐폴드의 거대 분자에 존재하는 유리 아민기에 결합되어 가교 중에 펩티드 결합을 형성함을 시사한다. 또한, 다른 농도의 NGO로 가교된 스캐폴드는 정확히 동일한 패턴의 화학 결합을 보여주었다 (도 4b 참조). 상기 결과를 바탕으로 NGO가 결합된 dECM 간 스캐폴드를 성공적으로 개발하였다.
이후, NGO 가교가 dECM 스캐폴드의 물리적 강성을 향상시킬 수 있다고 가정하였다.
이에, NGO-가교된 스캐폴드의 탄성 계수가 GA-가교된 스캐폴드의 탄성 계수와 비슷하고, CTL 스캐폴드보다 훨씬 더 높음을 확인하였다. (도 3d 및 도 3e 참조).
또한 스캐폴드가 견딜 수 있는 최대 압력으로 확인된 최대 인장 강도는 CTL 스캐폴드보다 NGO 가교된 스캐폴드에서 더 높은 것으로 나타났다. (도 3f 참조).
상기 결과들로부터, NGO 가교를 통해 dECM 스캐폴드의 기계적 특성이 강화되었음을 확인하였다.
실시예 4. NGO 가교의 dECM 스캐폴드 시험관 내 분해 보호 효과
대식세포, 호중구 및 섬유아세포를 포함한 다양한 유형의 세포는 화학 주성을 통해 dECM 스캐폴드를 이식한 후 수집되며, 결과적으로 프로테아제를 분비하는 이러한 세포는 스캐폴드 분해에 기여할 수 있다. 따라서 NGO 가교된 스캐폴드가 ECM 구조를 효소 분해로부터 보호할 수 있는지 여부는 중요한 과제이다. 프로테오믹스 데이터를 고려할 때 제1형 콜라겐과 공존하는 것으로 알려져 있으며 콜라겐 기질 조립에 관여하는 비글리칸과 제1형 콜라겐이 dECM 간 지지체의 주요 구조 요소를 구성하는 것으로 나타났다 (도 2i 참조). 이에, 콜라겐 분해 효소-1이라고도 알려진 메탈로프로테이나제(MMP)-1이 시험관 내 스캐폴드의 분해를 재현하기 위해 이용되었다.
SEM 분석 결과, MMP-1에 노출된 대조군(CTL) 스캐폴드의 미세 구조가 파괴되었고 얇은 ECM 섬유만 남아있는 반면, NGO 또는 GA 가교된 스캐폴드의 미세 구조는 콜라겐 분해 효소 처리에 의해 감소되지 않은 것으로 나타났다(도 5a 참조). 이러한 결과는 CTL 스캐폴드에서 강력한 콜라겐 해리를 보여주는 피크로시리우스 레드 염색 결과와 일치한 것으로 나타났다 (도 5b 참조).
또한, MMP-1 처리 후 각 스캐폴드의 중량 손실은 PBS 대조군과 비교하여 가교제의 존재 하에 현저히 감소하였다 (도 5c참조).
또한 닌히드린 분석을 수행하여, 각 스캐폴드의 가교 정도를 측정하였다.
그 결과, 가교 중에 공유 결합 형성에 관여하지 않은 유리 아미노산의 농도가 NGO 가교 스캐폴드에서 GA-가교 스캐폴드만큼 낮은 수준으로 현저하게 감소했음을 확인하였다 (도 5d 참조). 이러한 결과는 FTIR 분석에서도 CTL 스캐폴드에 비해 감소된 유리 아민 그룹을 보여주는 NGO-가교된 스캐폴드에서 확인할 수 있었다. 다음으로, 콜라겐 섬유의 가교 형태인 불용성 콜라겐의 잔여량을 콜라겐 분해 효소에 노출된 가교된 스캐폴드에서 측정하고 각 스캐폴드의 건조 중량에 대해 정규화하였다 (도 4c 참조). NGO 그룹에서 유지된 불용성 콜라겐의 양은 GA-가교된 스캐폴드의 양과 비슷한 것으로 나타났다 (도 5e참조).
즉, NGO 가교된 스캐폴드는 콜라겐 분해 효소 매개 분해를 효과적으로 억제하고, CTL 스캐폴드에 비해 ECM 구성 요소의 손실을 완화한다는 것을 입증하였다.
종합하면, 상기 결과는 NGO의 가교가 dECM 스캐폴드의 효소 분해에 대한 내성을 강화시켰음을 시사한다.
실시예 5. 직접 상호 작용을 통한 MMP 활동에 대한 NGO의 억제 효과
NGO가 dECM 스캐폴드의 손상을 보호할 수 있는 메커니즘을 갖는지 추가로 조사하였다. 그래핀이 효소 고정화를 통해 효소의 활성에 영향을 미칠 수 있다는 것은 기존에 알려져 있었는 바, 핵 자기공명(NMR)을 이용하여 NGO와 dECM 스캐폴드의 주요 세포외기질 구성 요소를 절단하는 데 관여하는 활성화된 MMP(MMP-1, MMP-2 및 MMP-9) 간의 상호 작용을 조사하였다.
도 6a 및 도 6b에 나타난 바와 같이, 1H NMR 분석 결과 NGO의 존재 하에 MMP의 화학적 이동을 확인할 수 있었다.
도 6c에 나타난 바와 같이, NGO와 함께 배양된 NGO 및 MMP는 1H NMR 스펙트럼 상에서 1.19 및 3.37 ppm에서 피크를 확인할 수 있었으며, 이는 NGO가 MMP와 직접적으로 상호작용함을 시사하는 결과이다. 특히 MMP와 NGO의 상호 작용은 MMP 아형에 관계없이 동일한 지역 (1.19, 3.37ppm)에서 발생하는 경향이 있으며, 이는 NGO가 다양한 유형의 MMP 중에서 고도로 보존된 영역인 촉매 도메인에 결합 할 수 있음을 시사한다.
도 6d 및 도 6e에 나타난 바와 같이, NGO는 MMP-1, MMP-2 및 MMP-9의 촉매 활성을 용량 의존적으로 크게 감소시켰다. 즉, NGO가 MMP의 촉매 도메인에 직접 결합을 통해 MMP의 효소 활성을 억제할 수 있음을 확인하였다.
한편, 단백질 분해 메커니즘은 보존된 촉매 아연 이온과 보존된 아연 결합 모티프(HExxHxxGxxH)가 플랭크된 친핵성 물 분자를 필요로 한다. 3개의 히스티딘(H) 잔기가 촉매 아연의 구조적 배위에 참여하는 반면, 글루타메이트(G) 잔기는 물과 수소 결합을 형성하고 촉매 과정에서 일반적인 산/염기 역할을 한다.
이에, 디티존을 사용하여 NGO의 아연 킬레이트 효과를 조사하였다.
도 6f에 나타난 바와 같이, NGO가 아연 킬레이트제인 EDTA와 비교하여, 아연을 직접 킬레이트할 수는 없음을 확인하였다.
이에, NGO가 아연 결합 모티프에 영향을 미치는지 확인하였다.
그 결과, 도 6g 및 도 6h에 나타난 바와 같이, NGO는 아연 결합 모티프 내 구성인 글루타메이트 및 히스티딘과 상호작용함을 확인하였다.
MMP의 글루타메이트 잔기는 펩타이드 절단을 위한 기질의 카보닐 탄소에 대한 친핵성 공격에 관여하는데, 글루타메이트 잔기에 결합된 NGO가 산소 함유 작용기의 양성자 해리를 통해 친핵성 공격 후 양성자 전달 과정을 변경하여 MMP의 촉매 기능 장애를 초래할 가능성이 있다.
또한, 히스티딘 잔기는 구조적 안정성을 위한 촉매 아연을 보조하는데, 히스티딘 잔기에 결합된 NGO는 3D 형태 변화를 일으키고 MMP의 공간 제어를 파괴함으로써 아연의 촉매 기능 장애를 초래함을 나타낸다. 이에 따라, NGO는 Zinc-함유(harboring) 모티프에 대한 직접 결합을 통해 MMP의 효소 활성을 억제할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, NGO는 MMP 효소에 의한 단백질 분해를 억제하고, MMP 매개 병리 생리학적 반응에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
실시예 6. NGO 가교 스캐폴드의 높은 생체 적합성
실제 간 조직 공학에 적용하기 위한 필수 요소인 생체 적합성을 평가하기 위하여, 인간 간세포와 내피 세포를 이용하였다.
HepG2 세포 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 가교된 스캐폴드에 분주하고 14일 동안 유지하였다.
15일째에 H&E 염색 및 MTT 분석에서 얻은 결과에서, NGO와 가교된 스캐폴드가 다른 그룹과 비교하여 높은 생존력과 증식성 세포 집단을 보유하고 있음을 확인하였다 (도 7a 내지 도 7d 참조).
따라서 HepG2 세포가 분주된 NGO 가교 그룹의 알부민 및 요소 분비 및 글리코겐 합성을 포함한 간 특정 기능은 다른 그룹에 비해 현저하게 증가한 것으로 나타났다 (도 7e 및 도 7f 참조).
또한, 혈관계의 특성인 VEGF 및 NO의 분비는 HUVEC-분주된 NGO-5 그룹에서 급격히 증가한 것으로 나타났다 (도 7g 및 도 7h 참조). 반면, GA-가교된 스캐폴드는 많은 비생존성(nonviable) HepG2 세포와 HUVEC를 나타내어 기능성이 낮은 것으로 확인되었다. 즉, NGO-가교된 스캐폴드가 CTL 및 GA-가교된 스캐폴드보다 더 나은 생체 적합성을 가지고 있음을 확인하였으며, 특히 NGO-5는 세포 생존력과 기능성을 모두 만족하는 최적화된 조건으로 판단된다.
실시예7. NGO 가교 스캐폴드 내의 인간 M2c 대식세포 분극 확인
그래핀은 간염, 심근경색 및 대장염 모델에서 대식세포 분극을 조절함으로써 항염증 효과를 나타내는 것으로 확인된 바 있다.
이에, 본 발명자들은 스캐폴드 내의 NGO가 전염증성 M1을 항염증성 M2 대 식세포로 전환하는 것을 촉진할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 생체 외 대식세포 분화를 수행하였다. 특히, M2c 대식세포는 면역 조절 외에도 매트릭스 리모델링을 매개하는 것으로 알려져있다.
따라서, 인간 말초 혈액 유래 단핵 세포 (hPBMC) 유래 CD14 + 세포를 NGO 가교 스캐폴드에 접종하고 각각의 사이토카인 자극에 반응하여 M1 또는 M2c 대식세포로 분화시켰다.
각 스캐폴드 내에서 분화된 인간 대식세포의 유세포 분석 프로파일 결과, NGO 가교가 CD86을 발현하는 M1 유사 표현형으로의 이동을 억제했음을 나타내었다(도 8a 참조). 반면, CD163과 CD206을 모두 발현하는 M2c-유사 표현형으로의 대식세포 분극은 특히 NGO-5 그룹에서 상당히 촉진되었다 (도 8b 참조).
또한, 면역 염색 후 각 그룹에서 CCR7+(C-C 케모카인 수용체 7, M1-특이적 마커) 또는 CD206+ 대 CD68+ (판 대식세포 마커) 세포의 비율을 정량화하였다 (도 8c 내지 도 8e 참조). CTL 스캐폴드의 CD14+ 세포는 M1 대식세포로 우세하게 분극된 반면, NGO-5 및 NGO-10 그룹에서는 M1 대식세포가 거의 검출되지 않았다 (도 8c 참조). 또한, NGO-5 및 NGO-10에 의한 가교는 스캐폴드 내에서 M2 분극을 유도하였다 (도 8d 참조). NGO-1 그룹의 CD68+ 세포의 25.9 %가 M1과 유사한 표현형을 나타내었으나, CD68+ 세포의 47.4 %는 여전히 M2 대식세포로 분화되었다 (도 8e 참조).
종합하면, NGO-5 및 NGO-10 가교 스캐폴드는 인간 M2c 분극화에 최적화 된 환경을 제공할 수 있음을 나타내며, 이는 이식된 스캐폴드의 분해와 인간의 이식에 의해 유발되는 염증 반응이 NGO의 존재 하에서 M2c 대식세포 침윤을 통해 개선될 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. NGO 가교 스캐폴드의 생체 내 이식
dECM 스캐폴드는 이식시 점차적으로 분해되는 것으로 널리 알려져 있다. 효소, 사이토카인 및 케모카인과 같은 다양한 기계적 및 화학적 자극이 생체 내에서 작용하기 때문에, 가교 스캐폴드의 생체 내 분해에 대한 감수성을 철저히 평가하기 위해 각 가교 스캐폴드를 피하 이식하였다.
이식 후 7 일째에 정량화한 바와 같이, NGO 또는 GA 가교 스캐폴드의 단면적은 CTL 스캐폴드의 단면적보다 적어도 2 배 이상이었다 (도 9a 및 도 9b 참조).
특히, GA, NGO-5 및 NGO-10 가교 스캐폴드는 이식 후 21 일까지도 상당한 양이 남아있는 반면, CTL 스캐폴드는 급격히 분해되는 양상을 나타내었다 (도 9c 및 도 9d 참조).
또한, dECM 스캐폴드는 섬유아세포, 면역 세포 및 혈액 세포와 같은 다양한 세포 유형을 모집하는 것으로 알려져 있기 때문에, H&E 염색을 사용하여 스캐폴드 전체에 침입하는 호중구와 림프구를 관찰하였다. 그 결과, NGO 가교 스캐폴드는 7 일과 21 일에 CTL 스캐폴드에 비해 모집된 염증 세포가 상당히 감소된 것으로 나타났다(도 9f 및 도 9g 참조).
다음으로, 이식된 스캐폴드에 침투한 대식세포의 분극 프로파일을 조사하기 위해 F4/80 (마우스 판 대식세포 마커), CCR7 및 CD206의 면역 염색을 수행하였다. M1 (F4/80+ CCR7+ 세포) 대 M2 (F4/80+ CD206+ 세포)의 비율을 계산하여 각 그룹의 스캐폴드 내에서 우세한 대식세포 유형을 결정하였다. 이식 7 일 후 NGO 가교 스캐폴드는 NGO-1 그룹의 부분적인 M1 발현에도 불구하고 대부분 M2 대식세포를 나타냈다(도 9h 및 도 9i 참조). 21 일에 CTL 및 GA 그룹에서는 M1 발현이 현저하게 증가한 반면, M2 발현은 NGO 가교 스캐폴드에서 여전히 우세한 것으로 나타났다 (도 9j 및 도 9k 참조). 즉, 생체 외 대식세포 분극화 결과에 따라, 항염증 반응을 매개하는 생체 내 M2 분극화에 대해서 NGO-5 그룹이 가장 강력한 효과를 나타냄을 입증하였다.
실시예 9. M2c 대식세포에 의해 매개된 이식된 스캐폴드의 리모델링
NGO가 이식 후 스캐폴드를 분해로부터 보호하는 기본 메커니즘을 탐색하였다. M2 대식세포는 MMP와 TIMP(metalloproteinase의 조직 억제제)를 모두 방출하여 구조적 조직 리모델링을 조절하는 것으로 알려져 있다. 특히, TIMP-1은 M1 또는 M2a 대식세포에서도 부분적으로 발현되지만, M2c 대식세포에 의해 주로 발현된다. 따라서 이식 부위에서 MMP-9 및 TIMP-1의 발현 수준을 조사하였다.
그 결과, NGO-5 및 NGO-10 가교 스캐폴드는 TIMP-1을 발현하는 CD206+ M2c 대식세포의 침투는 현저한 반면, MMP-9 발현은 상대적으로 부족함을 나타내었다(도 10a 내지 10d 참조). 또한, TIMP-2는 NGO 가교 스캐폴드에서 고도로 발현된 반면 MMP-2 수준은 매우 낮았다 (도 10h 참조). 일부 M2 대식세포가 MMP를 발현한다는 점을 고려할 때, 상기 결과는 NGO가 방출된 MMP와 상호 작용하고 활동을 억제했음을 의미한다.
종합하면, NGO는 MMP를 직접 억제할 뿐만 아니라 MMP 활성화를 억제하는 TIMP의 공급원인 M2에 대한 대식세포 분극을 촉진함으로써, 생체 내 분해를 억제시키는 것으로 확인되었다.
실시예 10. 생체 내 NGO 가교 스캐폴드의 장기 유지 관리
NGO가 스캐폴드 분해 저항성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 이식을 장기간 유지하였다.
그 결과, NGO-5 및 NGO-10 가교 스캐폴드는 이식 60일 후에도 매우 안정된 반면, CTL 및 NGO-1 가교 스캐폴드는 완전히 분해되었다(도 11a 및 도 11b 참조). 또한, 다른 그룹과 비교할 때 NGO-5 그룹은 60일까지 상대적으로 낮은 수준의 염증 반응을 보였다 (도 11c 참조). 또한 NGO 가교 스캐 폴드는 주로 M2 대식세포로 이동하는 유리한 단핵 세포 반응을 통해, 스캐폴드의 분해 억제 효과를 나타내었다 (도 11d 및 11e 참조). GA 가교 스캐폴드는 60일까지 부분적으로 남아 있었지만, NGO 가교 스캐폴드와 전신적으로 비교하여 염증을 악화시키는 것으로 나타났다 (도 11a 내지 11c 참조). 또한, GA 가교 스캐폴드는 M1 대식세포가 강하게 침투하여 심각한 염증 반응과 MMP 매개 분해가 지속적으로 진행되고 있음을 나타내었다 (도 11d 및 11e 참조).
종합하면, 생체 내에서 스캐폴드의 구조적 완전성의 유지 및 이식 후 염증의 약화에 대하여, NGO 가교 결합이 유의한 효과를 가짐을 확인하였다. 더욱이 NGO-1은 분해 억제 효과가 미흡하였는 바, NGO-5가 가교 및 면역 조절 모두에 최적화된 조건임을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (19)
- 탈세포 지지체 제조용 조성물에 있어서,
상기 조성물은 산화 그래핀 나노 구조체를 포함하고,
상기 탈세포 지지체는 전체 간 탈세포 지지체인 것을 특징으로 하고,
상기 산화 그래핀 나노 구조체는 가교제이고, 상기 전체 간 탈세포 지지체의 맥관 구조를 통해 관류하여 가교 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 산화 그래핀 나노 구조체는 20 nm 이하의 두께; 또는 15 내지 50nm의 평균 직경을 갖는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체에 가교결합되는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 물성을 강화 또는 개선하는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 물성은 하기 특성으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
ⅰ) 탈세포 지지체의 탄성;
ⅱ) 탈세포 지지체의 분해 효소에 의한 중량 손실; 및
ⅲ) 탈세포 지지체의 인장 강도.
- 제1항에 있어서,
상기 그래핀 나노 구조체는 MMP(Matrix metalloproteinase)를 직접 억제함으로써 탈세포 지지체의 생체 내 분해를 억제하는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그래핀 나노 구조체는 탈세포 지지체의 염증 반응 유발을 개선 또는 억제하는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 그래핀 나노 구조체는 M2 대식세포로의 분극화를 촉진시킴에 따라, 이식 후 염증 반응을 완화시키는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체 제조용 조성물.
- 인공 기관 제작용 조성물에 있어서,
상기 조성물은 산화 그래핀 나노 구조체를 포함하고,
상기 인공 기관은 전체 간인 것을 특징으로 하고,
상기 산화 그래핀 나노 구조체는 가교제이고, 상기 전체 간 탈세포 지지체의 맥관 구조를 통해 관류하여 가교 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 인공 기관 제작용 조성물.
- 제10항에 있어서,
상기 조성물은 실질세포를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 인공 기관 제작용 조성물.
- 제11항에 있어서,
상기 실질세포는 줄기세포 유래 실질세포인 것을 특징으로 하는, 인공 기관 제작용 조성물.
- 제12항에 있어서,
상기 줄기세포는 역분화 줄기세포(Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC), 배아줄기세포(Embryonic Stem Cell), 골수유래 줄기세포(Marrow-derived Stem Cell), 지방유래줄기세포(Adipose tissue-derived Stem Cells) 및 태반유래 줄기세포(Placenta-derived Stem Cells)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 인공 기관 제작용 조성물.
- 인공 기관의 제조방법에 있어서,
상기 방법은 산화 그래핀 나노 구조체를 처리하는 단계를 포함하고,
상기 인공 기관은 전체 간인 것을 특징으로 하고,
상기 산화 그래핀 나노 구조체는 가교제이고, 상기 전체 간 탈세포 지지체의 맥관 구조를 통해 관류하여 가교 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 인공 기관의 제조방법.
- 제14항에 있어서,
상기 제조방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
a) 조직원으로부터 기관을 제공하는 단계;
b) 상기 제공된 기관을 탈세포화하는 단계; 및
c) 상기 탈세포화된 기관에 그래핀 나노 구조체를 처리하는 단계.
- 제15항에 있어서,
상기 제조방법은 하기 단계로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제조방법:
d-1) 탈세포화된 기관을 혈관내피세포로 재세포화시키는 단계;
d-2) 탈세포화된 기관을 실질세포로 재세포화시키는 단계; 및
d-3) 탈세포화된 기관을 비실질세포로 재세포화시키는 단계.
- 제14항의 방법으로 제조된 인공 기관으로서,
상기 인공 기관은 생체적합성인 것을 특징으로 하고,
상기 인공 기관은 간인 것을 특징으로 하는, 인공 기관.
- 삭제
- 탈세포 지지체의 물성 강화용 조성물에 있어서,
상기 조성물은 산화 그래핀 나노 구조체를 포함하고,
상기 탈세포 지지체는 전체 간 탈세포 지지체인 것을 특징으로 하고,
상기 산화 그래핀 나노 구조체는 가교제이고, 상기 전체 간 탈세포 지지체의 맥관 구조를 통해 관류하여 가교 결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 탈세포 지지체의 물성 강화용 조성물.
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Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JinPing Fu et al., Rduced graphene oxide incorporated acellular dermal composite scaffold enables efficient local delivery of mesenchymal stem cells for accelerating diabetic wound healing." ACS Biom* |
| Renu Geetha Ba et al., "Graphene-based 3D scaffolds in tissueengineering: fabrication, applications, and futurescope in liver tissue engineering." International Journal of Nanomedicine (2019), Vol. 14* |
| Seokyung Kang et al., "Covalent conjugation of mechanically stiff graphene oxide flakes to three-dimensional collagen scaffolds for osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells." CARBON* |
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