KR102566317B1 - 위 또는 위암 조직 배양을 위한 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법, 지지체 생성용 조성물 및 조직 배양 방법 - Google Patents
위 또는 위암 조직 배양을 위한 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법, 지지체 생성용 조성물 및 조직 배양 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 위 또는 위암 조직 배양을 위한 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법, 지지체 생성용 조성물 및 조직 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로 돼지의 위 점막 조직을 절단하고, 1차 처리, 2차 처리, 세척 및 3차 처리하는 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법, 이 방법으로 탈세포화된 돼지 위 점막 조직 탈세포화물, 이 탈세포화물의 펩신 소화물을 포함하는 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물 및 이 조성물에 위 또는 위암 세포를 첨가 및 성형하여 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 생성하고 이를 배지에서 배양하는 위 또는 위암 조직 배양 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조직 배양 방법에 따르면 돼지의 위 점막 조직을 사용하여 위 또는 위암 조직을 안전하고 효율적으로 배양할 수 있다. 본 발명의 탈세포화 방법에 따르면 DNase 등의 효소를 사용하지 않고 세포외기질 성분의 손실을 적게 하면서 돼지의 위 점막 조직을 효율적으로 탈세포화할 수 있으며, 본 발명의 조성물을 사용하면 위 또는 위암 세포에 위와 유사한 환경을 제공할 수 있는 조직 배양 지지체를 효율적으로 제작할 수 있다.
본 발명의 조직 배양 방법에 따르면 돼지의 위 점막 조직을 사용하여 위 또는 위암 조직을 안전하고 효율적으로 배양할 수 있다. 본 발명의 탈세포화 방법에 따르면 DNase 등의 효소를 사용하지 않고 세포외기질 성분의 손실을 적게 하면서 돼지의 위 점막 조직을 효율적으로 탈세포화할 수 있으며, 본 발명의 조성물을 사용하면 위 또는 위암 세포에 위와 유사한 환경을 제공할 수 있는 조직 배양 지지체를 효율적으로 제작할 수 있다.
Description
본 발명은 위 또는 위암 조직 배양을 위한 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법, 지지체 생성용 조성물 및 조직 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로 돼지의 위 점막 조직을 절단하고, 1차 처리, 2차 처리, 세척 및 3차 처리하는 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법, 이 방법으로 탈세포화된 돼지 위 점막 조직 탈세포화물, 이 탈세포화물의 펩신 소화물을 포함하는 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물 및 이 조성물에 위 또는 위암 세포를 첨가 및 성형하여 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 생성하고 이를 배지에서 배양하는 위 또는 위암 조직 배양 방법에 관한 것이다.
위암은 전세계적으로 높은 발병률과 사망률을 보이고 있으나 현재까지 수술만이 국소 종양을 완전히 제거하는 유일한 방법으로 행해지고 있다. 그러나 말기위암 환자들은 수술만으로 치료가 어렵기 때문에 약물치료가 필수적으로 병행되고 있으나, 높은 약물 내성을 보이며 효과적인 치료제의 부재로 낮은 생존율을 보인다.
위암 환자를 치료하기 위한 약물을 찾기 위하여 위 또는 위암 조직의 체외 배양 방법이 개발되어 왔으나 아직 원래 위암이 발병한 조직의 특이적인 구조, 기계적 물성, 생화학적 구성 성분, 종양 조직을 이루는 다양한 세포들 간의 작용 등과 같은 특성들을 재현할 수 없는 단점이 있다. 이에 위와 유사한 환경을 위 또는 위암 세포에게 제공하여 원래 조직의 특성을 재현할 수 있는 체외 위 또는 위암 조직 배양 기술의 개발이 필요하다.
조직 배양을 위해 동물의 조직을 탈세포화하여 제작한 바이오스캐폴드를 이용하는 기술들이 알려져 있다. 그러나 기존의 위 조직 배양 기술은 위 전조직체를 탈세포화하여 세포를 2차원적으로 단순하게 배양하는 기술로 충분한 탈세포화가 이루어지지 못하고, 탈세포화 과정에서 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG) 등의 세포외기질 성분의 손실이 크며, DNase라는 효소를 사용한다는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 위 또는 위암 세포에 위와 보다 유사한 환경을 제공하면서 보다 안전하고 효율적으로 위 또는 위암 조직 배양을 가능하게 하는 기술을 개발하고자 하였다.
Zambaiti, Elisa, et al. "Whole rat stomach decellularisation using a detergent-enzymatic protocol." Pediatric surgery international 35.1 (2019): 21-27.
따라서 본 발명의 주된 목적은 위 또는 위암 세포에 위와 보다 유사한 환경을 제공하면서 보다 안전하고 효율적으로 위 또는 위암 조직 배양을 가능하게 하는 방법을 제공하는데 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 다른 목적은 위 또는 위암 세포에 위와 유사한 환경을 제공하기 위한 지지체 제작에 관한 기술로, DNase와 같은 효소를 사용하지 않고도 충분한 탈세포화가 가능하며 세포외기질 성분의 손실을 줄일 수 있는 돼지의 위 점막 조직 탈세포화 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 탈세포화로 얻은 탈세포화물을 사용하여 효율적으로 위 또는 위암 조직 배양 지지체를 제작하기 위한 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 돼지의 위 점막 조직을 절단하는 절단 단계; 절단된 돼지의 위 점막 조직을 도데실 황산 나트륨 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액과 접촉시키는 1차 처리 단계; 상기 1차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 트리톤 X-100 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액과 접촉시키는 2차 처리 단계; 상기 2차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 세척하는 세척 단계; 및 상기 세척 단계를 거친 위 점막 조직을 과산화아세트산 및 에탄올 함유 용액과 접촉시키는 3차 처리 단계;를 포함하는 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법을 제공한다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 절단 단계는 돼지의 위 점막 조직을 1 내지 3㎜의 두께로 절단하는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 1차 처리 단계의 용액은 0.5 내지 2%(w/v) 도데실 황산 나트륨 및 10 내지 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 2차 처리 단계의 용액은 0.5 내지 2%(w/v) 트리톤 X-100 및 10 내지 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 3차 처리 단계의 용액은 0.05 내지 0.2%(w/v) 과산화아세트산 및 2 내지 8%(v/v) 에탄올 용액인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 1차 처리 단계는 상기 절단된 돼지의 위 점막 조직을 상기 도데실 황산 나트륨 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액에 담가서 12 내지 48시간 동안 유지시키는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 2차 처리 단계는 상기 1차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 상기 트리톤 X-100 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액에 담가서 12 내지 48시간 동안 유지시키는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 3차 처리 단계는 상기 세척 단계를 거친 위 점막 조직을 상기 과산화아세트산 및 에탄올 함유 용액에 담가서 1 내지 4시간 동안 유지시키는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법에 있어서, 상기 세척 단계는 상기 2차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 인산 완충 염수로 세척하는 단계인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 방법으로 탈세포화된 돼지 위 점막 조직 탈세포화물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 탈세포화물의 펩신 소화물을 포함하는 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물을 제공한다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 아세트산 함유 용액에 상기 탈세포화물을 첨가하고 펩신을 첨가하여 제조된 것이 바람직하다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물에 있어서, 상기 조성물은 0.25 내지 1M 아세트산 용액에 상기 탈세포화물을 0.5 내지 4%(w/w)로 첨가하고 펩신을 0.025 내지 0.8%(w/w)로 첨가하여 제조된 것이 바람직하다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물에 위 또는 위암 세포를 첨가하여 성형하는 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체 생성 단계; 및 상기 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 배지에서 배양하는 배양 단계;를 포함하는 위 또는 위암 조직 배양 방법을 제공한다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 방법에 있어서, 상기 성형은 3D 프린팅으로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 방법에 있어서, 상기 배양 단계 전에, 상기 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 35 내지 40℃로 열처리하는 열가교 단계;를 더 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조직 배양 방법에 따르면 돼지의 위 점막 조직을 사용하여 위 또는 위암 조직을 안전하고 효율적으로 배양할 수 있다. 본 발명의 탈세포화 방법에 따르면 DNase 등의 효소를 사용하지 않고 세포외기질 성분의 손실을 적게 하면서 돼지의 위 점막 조직을 효율적으로 탈세포화할 수 있으며, 본 발명의 조성물을 사용하면 위 또는 위암 세포에 위와 유사한 환경을 제공할 수 있는 조직 배양 지지체를 효율적으로 제작할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법을 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화물(st-dECM)에 포함된 DNA, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(GAG)의 농도를 생화학적 분석 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)의 점탄성 분석 결과(A 내지 C) 및 졸-겔 거동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)에 위암 세포를 봉입하여 프린팅한 결과(A) 및 프린팅된 위암 세포 함유 조직 배양 지지체의 장기간 배양 시의 세포 생존률을 분석한 결과(B 및 C)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)에 위암 세포를 봉입하여 프린팅한 위암 세포 함유 조직 배양 지지체, 위암 세포 함유 마트리젤 및 위암 세포 함유 콜라겐 배양 시 조직학적 염색을 통한 위암 세포 형태 확인 결과(A), 위암 세포의 악성 형질 발현도 확인 결과(B) 및 위암 세포의 약물 저항성 확인 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 탈세포화물(st-dECM)의 농도를 다르게 하여 제조한 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)에 위암 세포(KATO3 또는 SNU-1)를 봉입하여 배양한 위암 세포의 뭉침 결과(A 및 B) 및 악성 형질 발현도 확인 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 탈세포화물(st-dECM)에 포함된 DNA, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(GAG)의 농도를 생화학적 분석 방법으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)의 점탄성 분석 결과(A 내지 C) 및 졸-겔 거동 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)에 위암 세포를 봉입하여 프린팅한 결과(A) 및 프린팅된 위암 세포 함유 조직 배양 지지체의 장기간 배양 시의 세포 생존률을 분석한 결과(B 및 C)를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)에 위암 세포를 봉입하여 프린팅한 위암 세포 함유 조직 배양 지지체, 위암 세포 함유 마트리젤 및 위암 세포 함유 콜라겐 배양 시 조직학적 염색을 통한 위암 세포 형태 확인 결과(A), 위암 세포의 악성 형질 발현도 확인 결과(B) 및 위암 세포의 약물 저항성 확인 결과(C)를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 탈세포화물(st-dECM)의 농도를 다르게 하여 제조한 조직 배양 지지체 생성용 조성물(st-dECM bioink)에 위암 세포(KATO3 또는 SNU-1)를 봉입하여 배양한 위암 세포의 뭉침 결과(A 및 B) 및 악성 형질 발현도 확인 결과(C)를 나타낸 것이다.
본 발명의 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법은, 돼지의 위 점막 조직을 절단하는 절단 단계; 절단된 돼지의 위 점막 조직을 도데실 황산 나트륨 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액과 접촉시키는 1차 처리 단계; 상기 1차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 트리톤 X-100 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액과 접촉시키는 2차 처리 단계; 상기 2차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 세척하는 세척 단계; 및 상기 세척 단계를 거친 위 점막 조직을 과산화아세트산 및 에탄올 함유 용액과 접촉시키는 3차 처리 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 탈세포화 방법은 DNase와 같은 효소를 사용하지 않고도 특히 위 또는 위암 조직 배양 지지체 소재로 사용하기에 충분한 탈세포화가 가능한 방법으로, DNase를 사용함에 따른 문제, 예를 들어 결합 조직 섬유의 파괴 등의 문제를 방지할 수 있다.
또한, 본 발명의 탈세포화 방법은 탈세포화 과정 중 발생하는 글리코사미노글리칸(GAG)과 같은 세포외기질 성분의 손실을 줄여, 보다 효율적인 조직 배양을 가능하게 한다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 탈세포화의 대상인 돼지의 위 점막 조직은 바람직하게는 점막층(mucosa)의 조직이다. 점막층은 위를 크게 4가지 층, 즉 점막층(mucosa), 점막하층(submucosa), 근육층(muscularis externa) 및 장막층(serosa)으로 구분할 때의 층 중 하나이다. 상기와 같은 점막층만을 사용하는 것이 바람직하지만, 다른 층들이 일부 포함되더라도 탈세포화될 수 있다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 상기 절단 단계는 동물 유래 조직을 절단하는데 사용되는 통상의 기구, 장치 등을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 위 점막 조직을 0.5 내지 5㎜의 두께로, 보다 바람직하게는 1 내지 3㎜의 두께로 절단한다. 이러한 절단 단계에 따르면, 이후의 단계에서 위 점막 조직과 용액의 접촉 면적을 넓혀 보다 효율적으로 탈세포화할 수 있다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 상기 1차 처리 단계는 절단된 돼지의 위 점막 조직을 도데실 황산 나트륨(Sodium dodecyl sulfate, SDS) 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA) 함유 용액, 즉 1차 처리 용액과 접촉시키는 단계로, 생체 조직 또는 세포와 용액의 반응을 위해 이들을 접촉시키는데 사용되는 통상의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 조직을 상기 1차 처리 용액에 담그는 방법을 사용하며, 바람직하게는 조직을 1차 처리 용액에 담그고 교반하는 방법을 사용한다. 이때 교반은 바람직하게는 10 내지 200rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 20 내지 150rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 30 내지 100rpm의 회전속도로 한다. 이때 1차 처리 용액의 부피는 바람직하게는 조직 부피의 2배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 5배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 10배 이상의 부피로 한다. 조직과 1차 처리 용액의 접촉 시간은 바람직하게는 1 내지 100시간, 보다 바람직하게는 5 내지 50시간, 보다 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다 바람직하게는 20 내지 30시간으로 한다. 접촉 시의 온도는 바람직하게는 0 내지 20℃, 보다 바람직하게는 2 내지 16℃, 보다 바람직하게는 4 내지 16℃로 한다. 상기 1차 처리 용액은 바람직하게는 0.5 내지 2%(w/v) 도데실 황산 나트륨의 10 내지 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이고, 보다 바람직하게는 0.7 내지 1.5%(w/v) 도데실 황산 나트륨의 10 내지 50mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이고, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.2%(w/v) 도데실 황산 나트륨의 20 내지 30mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 상기 2차 처리 단계는 상기 1차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 트리톤 X-100(Triton X-100) 및 에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA) 함유 용액, 즉 2차 처리 용액과 접촉시키는 단계로, 이 또한 생체 조직 또는 세포와 용액의 반응을 위해 이들을 접촉시키는데 사용되는 통상의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 조직을 상기 2차 처리 용액에 담그는 방법을 사용하며, 바람직하게는 조직을 2차 처리 용액에 담그고 교반하는 방법을 사용한다. 이때 교반은 바람직하게는 10 내지 200rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 20 내지 150rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 30 내지 100rpm의 회전속도로 한다. 이때 2차 처리 용액의 부피는 바람직하게는 조직 부피의 2배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 5배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 10배 이상의 부피로 한다. 조직과 2차 처리 용액의 접촉 시간은 바람직하게는 1 내지 100시간, 보다 바람직하게는 5 내지 50시간, 보다 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다 바람직하게는 20 내지 30시간으로 한다. 접촉 시의 온도는 바람직하게는 0 내지 20℃, 보다 바람직하게는 2 내지 16℃, 보다 바람직하게는 4 내지 16℃로 한다. 상기 2차 처리 용액은 바람직하게는 0.5 내지 2%(w/v) 트리톤 X-100의 10 내지 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이고, 보다 바람직하게는 0.7 내지 1.5%(w/v) 트리톤 X-100의 10 내지 50mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이고, 보다 바람직하게는 0.8 내지 1.2%(w/v) 트리톤 X-100의 20 내지 30mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 상기 세척 단계는 위 점막 조직에 존재하는 상기 1차 처리 및 2차 처리에 사용된 화합물을 제거하기 위한 단계로, 생체 조직 또는 세포의 화합물 처리 후 이들 화합물을 세척하는데 사용되는 통상의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 인산 완충 염수(phosphate buffered saline, PBS)로 세척한다. 바람직하게는 조직을 세척 용액, 예를 들어 인산 완충 염수에 담그는 방법을 사용하며, 바람직하게는 조직을 세척 용액에 담그고 교반하는 방법을 사용한다. 이때 교반은 바람직하게는 10 내지 200rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 20 내지 150rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 30 내지 100rpm의 회전속도로 한다. 이때 세척 용액의 부피는 바람직하게는 조직 부피의 2배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 5배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 10배 이상의 부피로 한다. 세척 시간, 예를 들어 조직을 세척 용액에 담그는 시간은 바람직하게는 1 내지 100시간, 보다 바람직하게는 5 내지 50시간, 보다 바람직하게는 12 내지 48시간, 보다 바람직하게는 20 내지 30시간으로 한다. 세척 시의 온도는 바람직하게는 0 내지 20℃, 보다 바람직하게는 2 내지 16℃, 보다 바람직하게는 4 내지 16℃로 한다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 상기 3차 처리 단계는 상기 세척 단계를 거친 위 점막 조직을 과산화아세트산 및 에탄올 함유 용액, 즉 3차 처리 용액과 접촉시키는 단계로, 이 또한 생체 조직 또는 세포와 용액의 반응을 위해 이들을 접촉시키는데 사용되는 통상의 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 조직을 3차 처리 용액에 담그는 방법을 사용하며, 바람직하게는 조직을 3차 처리 용액에 담그고 교반하는 방법을 사용한다. 이때 교반은 바람직하게는 10 내지 200rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 20 내지 150rpm의 회전속도, 보다 바람직하게는 30 내지 100rpm의 회전속도로 한다. 이때 3차 처리 용액의 부피는 바람직하게는 조직 부피의 2배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 5배 이상의 부피, 보다 바람직하게는 10배 이상의 부피로 한다. 조직과 3차 처리 용액의 접촉 시간은 바람직하게는 10분 내지 8시간, 보다 바람직하게는 30분 내지 6시간, 보다 바람직하게는 1 내지 4시간, 보다 바람직하게는 1 내지 3시간으로 한다. 접촉 시의 온도는 바람직하게는 0 내지 20℃, 보다 바람직하게는 2 내지 16℃, 보다 바람직하게는 4 내지 16℃로 한다. 상기 3차 처리 용액은 바람직하게는 0.05 내지 0.2%(w/v) 과산화아세트산의 2 내지 8%(v/v) 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 0.07 내지 0.15%(w/v) 과산화아세트산의 2 내지 6%(v/v) 에탄올 용액이고, 보다 바람직하게는 0.08 내지 0.12%(w/v) 과산화아세트산의 3 내지 5%(v/v) 에탄올 용액이다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 바람직하게는 상기 1차 처리 단계 이전에 절단된 돼지의 위 점막 조직을 세척하는 1차 처리 전 세척 단계를 더 포함한다. 이때 바람직하게는 물로 세척한다. 구체적인 사항은 상기 세척 단계를 참조하되, 세척 시간은 바람직하게는 1분 내지 2시간, 보다 바람직하게는 5분 내지 1시간, 보다 바람직하게는 10분 내지 50분, 보다 바람직하게는 20분 내지 40분으로 한다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 바람직하게는 상기 3차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 동결 건조하는 동결 건조 단계를 더 포함한다. 이때 동결 건조는 생물 유래의 물질을 동결 건조하는데 사용되는 통상의 방법, 기구, 장치 등을 사용하여 실시할 수 있다.
본 발명의 탈세포화 방법에서, 바람직하게는 상기 동결 건조 단계 이전에 상기 3차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 세척하는 동결 건조 전 세척 단계를 더 포함한다. 이때 바람직하게는 인산 완충 염수 또는 물로 세척하며, 보다 바람직하게는 인산 완충 염수로 세척한 다음 물로 세척한다.
본 발명의 탈세포화물은 상기와 같은 탈세포화 방법에 의해 탈세포화된 것으로, 탈세포화 이전의 위 점막 조직에 비해 DNA의 농도가 5% 이하, 보다 바람직하게는 3% 이하이며, 글리코사미노글리칸의 농도가 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상일 수 있다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물은 상기와 같은 탈세포화물의 펩신 소화물을 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물은 바람직하게는 바이오잉크(bio-ink)이며, 보다 바람직하게는 3D 프린팅용 바이오잉크이다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물은 바람직하게는 아세트산 함유 용액에 상기 탈세포화물을 첨가하고 펩신을 첨가하여 제조된 것이다. 이때 상기 아세트산 함유 용액은 바람직하게는 0.25 내지 1M 아세트산 용액, 보다 바람직하게는 0.3 내지 0.8M 아세트산 용액, 보다 바람직하게는 0.4 내지 0.6M 아세트산 용액이다. 바람직하게는 상기 아세트산 함유 용액에 상기 탈세포화물을 0.5 내지 4%(w/w)로 첨가하고 펩신을 0.025 내지 0.8%(w/w)로 첨가하고, 보다 바람직하게는 상기 아세트산 함유 용액에 상기 탈세포화물을 0.5 내지 3%(w/w)로 첨가하고 펩신을 0.05 내지 0.4%(w/w)로 첨가하고, 보다 바람직하게는 상기 아세트산 함유 용액에 상기 탈세포화물을 1 내지 2%(w/w)로 첨가하고 펩신을 0.1 내지 0.2%(w/w)로 첨가한다. 이에 따른 조성물은 특히 3D 프린팅에 유용한 특성을 가질 수 있다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 방법은 상기 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물에 위 또는 위암 세포를 첨가하여 성형하는 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체 생성 단계; 및 상기 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 배지에서 배양하는 배양 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 방법에서, 상기 성형은 상호 응집가능한 물질이 함유된 유동성 조성물을 성형 원료로 사용하여 특정한 형태로 성형하는 통상의 성형 방법을 사용하여 실시할 수 있다. 바람직하게는 3D 프린팅으로 성형한다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 방법에서, 바람직하게는 상기 배양 단계 전에 상기 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 35 내지 40℃로 열처리하는 열가교 단계;를 더 포함한다. 이때 열처리 온도는 바람직하게는 36 내지 39℃, 보다 바람직하게는 36 내지 38℃로 한다. 이에 따르면 조직 배양 지지체를 특히 위암 조직 배양에 적합한 특성을 갖도록 만들 수 있다.
본 발명의 위 또는 위암 조직 배양 방법에서, 상기 위 또는 위암 세포는 상기 조성물 중 예를 들어 105 내지 107 cells/㎖의 농도로 첨가할 수 있다.
본 발명에서 상기 위 또는 위암 세포는 포유동물, 예를 들어 침팬지 등과 같은 비인간 영장류, 인간, 소, 양, 돼지, 염소, 말, 개, 고양이, 마우스 및 기니아피그와 같은 포유동물 유래의 위 또는 위암 세포일 수 있다. 보다 바람직하게는 인간의 위 또는 위암 조직에서 단리된 위 또는 위암 세포이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
[실시예]
1. 위 점막 조직 탈세포화 및 하이드로젤 제작
위 점막 조직의 탈세포화를 다음의 과정을 통해 실시하였다(도 1).
1) 위 점막 조직 준비 : 돼지의 위에서 위 점막 조직(mucosa)을 채취하고 1 내지 3㎜ 두께의 작은 단편으로 잘게 썰었다.
2) 잘게 썬 위 점막 조직을 30분 동안 물에 담가서 세척하였다.
3) 세척한 위 점막 조직을 1%(w/v) SDS(도데실 황산 나트륨)의 25mM EDTA(에틸렌다이아민테트라아세트산) 용액에 24시간 동안 담가서 1차 처리하였다.
4) 1차 처리된 위 점막 조직을 1%(w/v) 트리톤 X-100(Triton X-100)의 25mM EDTA 용액에 24시간 동안 담가서 2차 처리하였다.
5) 2차 처리된 위 점막 조직을 PBS(인산 완충 염수)에 24시간 동안 담가서 세척하였다.
6) PBS로 세척한 위 점막 조직을 0.1%(w/v) 과산화아세트산의 4%(v/v) 에탄올 용액에 2시간 동안 담가서 3차 처리하였다.
7) 3차 처리된 위 점막 조직을 PBS로 3회 세척하고 물로 1회 세척하였다.
8) 세척한 위 점막 조직을 동결건조하였다.
상기 모든 단계는 섭씨 16도 이하의 온도에서 실시하였으며, 세척 및 1 ~ 3차 처리는 교반기를 이용하여 30 내지 200rpm의 회전속도로 교반시키는 방식으로 실시하였다. 또한 세척 및 1 ~ 3차 처리에서 사용한 용액은 위 점막 조직 부피의 최소 10배 이상으로 사용하였다.
상기와 같은 방법으로 위 점막 조직을 탈세포화하여 탈세포화 세포외기질(st-dECM)(본 발명의 탈세포화물)을 얻었다.
생화학적 분석 방법을 통해 st-dECM에 포함된 DNA, 콜라겐 및 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans, GAG)을 정량한 결과, 탈세포화 후 DNA 잔존량은 탈세포화 전 조직에 비해 2.7%로 탈세포화 과정을 통해 세포가 충분히 제거되고 있음을 알 수 있으며, GAG 및 콜라젠 잔류량은 각각 82%, 178%로 나타났다(도 2).
GAG는 위 세포의 성장에 관련 있을 뿐만 아니라 위암에서 신생혈관생성, 암전이와 관련된 위 고유의 세포외기질 분자 집합체이다. 따라서 이러한 결과는 본 발명의 탈세포화 방법이 위 또는 위암 세포 행동에 중요한 세포외기질 성분의 유지를 확보한다는 것을 나타낸다.
2. 탈세포화 세포외기질을 이용한 바이오잉크 제작 및 3D 프린팅
상기 st-dECM의 펩신 소화 매개 세포외기질 액화 과정을 통해 바이오잉크(본 발명의 조직 배양 지지체 생성용 조성물)를 제작하였다.
본 실시예에서는 0.5M 아세트산 용액과 st-dECM 대비 10% 무게의 펩신(pepsin)을 처리하여 st-dECM을 용액화하였다. 구체적으로, 0.5M 아세트산 용액에 st-dECM을 1%(w/w)로 펩신을 0.1%(w/w)로 첨가하여 바이오잉크를 제작하였다.
압출 기반 3D 셀 프린팅 시스템과의 호환성과 조직 유사체에 기계적 물성을 제공하는데 필수적인 특성인 열가교(thermal crosslinking) 및 전단 박리 거동의 능력이 있는지를 확인하기 위해, 제작된 바이오잉크의 유동학적(rheological) 특성을 조사하였다.
바이오잉크의 점도를 4℃에서 전단율을 점점 증가시키며 측정했을 때 바이오잉크의 점도가 감소하는 현상을 보였다(도 3A). 이는 본 발명의 바이오잉크가 전단 박리 동작을 보인다는 것을 의미하며, 이는 소직경 노즐을 통과하는데 필수적이다.
다음으로 바이오잉크의 교화 운동학(gelation kinetics)을 4℃에서 37℃로 온도를 높이는 동시에 복잡한 계량 성분을 측정하여 평가하였다. 바이오잉크의 복소 탄성률(complex modulus)은 37℃에 도달한 후 10분간 급격히 증가하다가 증가 속도가 느려졌다(도 3B). 또한 액체상태의 바이오잉크를 37℃에서 30분간 배양하게 되면 손실 탄성률(loss modulus)보다 저장 탄성률(storage modulus)이 높은 것으로 나타났다(도 3C). 이는 액체 위상이었던 본 발명의 바이오잉크가 37℃에서 열가교(thermal crosslinking) 거동을 보인다는 것을 뒷받침한다.
바이오잉크의 인쇄 가능성을 확인하기 위해 사전에 정해진 패턴에 따라 위암 세포가 봉입된 바이오잉크를 3D 프린팅하였으며(도 3D), 3D 프린팅 및 열가교 후 7일간 배양하였다. 생존하고 있는 위암 세포를 표지하는 칼세인(calcein) AM을 이용하여 구조체를 염색하였을 때 세포들이 살아있는 상태를 유지하고 있는 것을 확인하였다. 이는 본 발명의 바이오잉크가 위암 세포를 인쇄하는 것과 각종 위암 조직 모델 제작에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
바이오잉크를 이용하여 위암 조직을 배양한 방법은 다음과 같다.
1) 5x106 cells/㎖의 농도로 위암 세포를 1% st-dECM 바이오잉크 안에 봉입하였다.
2) 설계된 모형으로 프린팅하였다(도 4A).
3) 37℃ 인큐베이터에서 1시간 정도 열가교를 유도하였다.
4) 위암 세포의 배양을 위하여 RPMI 1640(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충) 배양액을 사용하여 배양하였다.
상기와 같은 방법으로 위암 조직의 장기간 배양이 가능하였다(도 4B 및 C).
배양된 위암 세포의 형태를 조직학적 얼룩을 통해 마트리젤, 콜라겐 실험군과 비교하였을 때, 상기 st-dECM 바이오잉크를 사용한 본 발명의 배양 방법으로 배양된 위암 세포들이 실제 암 환자에게서와 같이 뭉쳐 자라는 것을 확인할 수 있었다. 반면 마트리젤과 콜라젠에서는 뭉쳐 자라지 않았다(도 5A).
또한 암의 악성 형질 발현 정도를 β-카테닌(catenin)(세포-세포 상호작용 마커), MMP2(조직 리모델링 마커), 인테그린(integrin) β1(세포??ECM 상호작용 마커)을 통해 확인하였고, st-dECM 바이오잉크를 사용한 본 발명의 배양에서 발현이 더 높은 것을 확인하였다(도 5B). 더불어 위암에서 보편적으로 사용되는 약물 5-FU를 각 하이드로젤에서 배양된 위암 조직에 처리하였고, st-dECM 바이오잉크를 사용한 본 발명의 배양에서 가장 높은 약물 저항도를 보여주었다(도 5C). 이는 본 발명의 배양 방법으로 배양한 조직은 마트리젤, 콜라젠에 배양한 조직에 비해 약물 저항성이 높기 때문에 체내 종양 조직의 반응을 예측하는데 활용될 수 있음을 시사한다. 이와 같이 본 발명의 배양 방법에서 더 높은 악성 형질 정도를 보여주는 결과는 향후 신약 개발, 환자 맞춤형 종양 모델 개발 분야에 보다 효과적인 재료로 활용될 수 있음을 시사한다.
3. 바이오잉크의 농도를 이용한 위암 조직 배양
실제 위암 환자의 종양 조직은 정상 조직에 비해 단단하다. 이를 모사하기 위하여 위암 세포의 물리적인 배양 환경을 단단하게 하고자 상기 st-dECM 바이오잉크의 농도를 조절하여 위암세포를 배양하였다. 배양 방법은 아래와 같다.
1) 5x106 cells/㎖의 농도로 위암 세포를 1%(w/v)와 2%(w/v) st-dECM 바이오잉크 안에 각각 봉입하였다.
2) 설계된 모형으로 프린팅하였다.
3) 37℃ 인큐베이터에서 1시간 정도 열가교를 유도하였다.
4) 위암 세포의 배양을 위하여 RPMI 1640(10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충) 배양액을 사용하여 배양하였다.
1% st-dECM 바이오잉크를 사용한 경우(129.8 Pa) 보다 약 3배가량 높은 강도를 가지고 있는 2% st-dECM 바이오잉크를 사용한 경우(376.6 Pa)에서 위암 세포가 더 크게 뭉쳐 자라는 것을 조직학적 얼룩을 통해 확인하였으며, 악성 형질 발현 정도 또한 더 높이 발현하는 것을 확인하였다(도 6). 이를 통해 본 발명의 바이오잉크만을 이용하여 물리적 환경을 제공해줄 수 있는 것을 검증하였고, 이는 향후 체외 위암 모델 제작에 보다 효과적인 재료로 활용될 수 있음을 시사한다.
Claims (12)
- 돼지의 위 점막 조직을 절단하는 절단 단계;
절단된 돼지의 위 점막 조직을 0.5 내지 2%(w/v) 도데실 황산 나트륨 및 10 내지 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액에 담가서 12 내지 48시간 동안 유지시키는 1차 처리 단계;
상기 1차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 0.5 내지 2%(w/v) 트리톤 X-100 및 10 내지 100mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액에 담가서 12 내지 48시간 동안 유지시키는 2차 처리 단계;
상기 2차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 세척하는 세척 단계; 및
상기 세척 단계를 거친 위 점막 조직을 0.05 내지 0.2%(w/v) 과산화아세트산 및 2 내지 8%(v/v) 에탄올 함유 용액에 담가서 1 내지 4시간 동안 유지시키는 3차 처리 단계;를 포함하고,
상기 위 점막 조직은 위 점막층(mucosa)의 조직인, 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 절단 단계는 돼지의 위 점막 조직을 0.5 내지 5㎜의 두께로 절단하는 단계인, 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법. - 제1항에 있어서,
상기 1차 처리 단계의 용액은 0.8 내지 1.2%(w/v) 도데실 황산 나트륨 및 20 내지 30mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이고,
상기 2차 처리 단계의 용액은 0.8 내지 1.2%(w/v) 트리톤 X-100 및 20 내지 30mM 에틸렌다이아민테트라아세트산 용액이고,
상기 3차 처리 단계의 용액은 0.08 내지 0.12%(w/v) 과산화아세트산 및 3 내지 5%(v/v) 에탄올 용액인, 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법. - 제3항에 있어서,
상기 1차 처리 단계는 상기 절단된 돼지의 위 점막 조직을 상기 도데실 황산 나트륨 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액에 담가서 20 내지 30시간 동안 유지시키고 교반하는 단계이고,
상기 2차 처리 단계는 상기 1차 처리 단계를 거친 위 점막 조직을 상기 트리톤 X-100 및 에틸렌다이아민테트라아세트산 함유 용액에 담가서 20 내지 30시간 동안 유지시키고 교반하는 단계이고,
상기 3차 처리 단계는 상기 세척 단계를 거친 위 점막 조직을 상기 과산화아세트산 및 에탄올 함유 용액에 담가서 1 내지 3시간 동안 유지시키고 교반하는 단계인, 돼지 위 점막 조직 탈세포화 방법.
- 삭제
- 제1항의 방법으로 탈세포화된 돼지 위 점막 조직 탈세포화물.
- 제6항의 탈세포화물의 펩신 소화물을 포함하는 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 조성물은 아세트산 함유 용액에 상기 탈세포화물을 첨가하고 펩신을 첨가하여 제조된 것인, 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물. - 제8항에 있어서,
상기 조성물은 0.25 내지 1M 아세트산 용액에 상기 탈세포화물을 0.5 내지 4%(w/w)로 첨가하고 펩신을 0.025 내지 0.8%(w/w)로 첨가하여 제조된 것인, 위 또는 위암 조직 배양 지지체 생성용 조성물. - 제7항의 조성물에 위 또는 위암 세포를 첨가하여 성형하는 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체 생성 단계; 및
상기 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 배지에서 배양하는 배양 단계;를 포함하는 위 또는 위암 조직 배양 방법. - 제10항에 있어서,
상기 성형은 3D 프린팅으로 이루어지는 것인, 위 또는 위암 조직 배양 방법. - 제10항에 있어서,
상기 배양 단계 전에,
상기 위 또는 위암 세포가 포함된 조직 배양 지지체를 35 내지 40℃로 열처리하는 열가교 단계;를 더 포함하는, 위 또는 위암 조직 배양 방법.
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