KR102501235B1 - 탈세포화 조직 - Google Patents

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Abstract

본 발명의 과제는, 세포 접착성이 뛰어난 탈세포화 조직을 제공하는 것이다. 본 발명은, 생체 유래 조직을 탈세포화한 탈세포화 조직으로서, 시차주사 열량 측정법에 의해 측정된, 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대한 탈세포화 조직의 건조질량 당 흡열량의 비가 0.70 이상인 것을 특징으로 하는 탈세포화 조직을 제공한다. 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대한 탈세포화 조직은, 건조 질량 당 DNA 량의 질량비가 0.300 이하인 것이 바람직하다.

Description

탈세포화 조직
본 발명은, 재생 의료에 유용한 탈세포화 조직에 관한 것이다.
타인 또는 이종의 동물의 생체 조직 유래의 이식편을 이식하는 경우, 피-이식자 측의 조직에서 이식편의 거부 반응이 문제가 된다. 이러한 문제의 해결 방법으로서, 인공 조직의 개발이 기대되고 있다. 소재로서 다양한 고분자가 시도되고 있지만, 이러한 소재와 생체 조직과의 적합성이 낮기 때문에, 이식편과 생체 조직과의 접합 부위에 있어서 탈락(떨어짐, 脫落) 또는 감염증이 발생하는 경우가 있다. 그래서, 생체 조직과의 적합성을 향상시키기 위해, 생체 조직으로부터 세포를 제거(removing)하여 잔존하는 지지 조직인 탈세포화 생체 조직을 이식편으로서 사용하는 기술이 개발되어 왔다. 탈세포화의 정도는, 탈세포화 조직 중의 DNA의 함량에 의해 판단될 수 있어, 탈세포화 조직 중의 DNA 함량이 적을수록 거부 반응이 일어나기 어려운 것으로 알려져 있다(예를 들면, 비특허문헌1을 참조). 또한, 생체 조직을 탈세포화 하는 방법으로서는, 계면활성제를 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 1,2를 참조), 효소를 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 3을 참조), 산화제를 사용하는 방법(예를 들면, 특허문헌 4를 참조), 높은 정수압(hydrostatic pressure, 高靜水壓) 처리에 의한 방법(예를 들면, 특허문헌 5~7을 참조), 동결융해법 처리에 의한 방법(예를 들면, 특허문헌 8~9를 참조), 고장(hypertonic) 전해질 용액에 처리하는 방법(예를 들면, 특허문헌 10을 참조) 등이 공지되어 있다.
특개소 60-501540호 공보 특표 2]003-518981호 공보 특표 2002-507907호 공보 특표 2003-525062호 공보 특개 2004-094552호 공보 국제공개 제2008/111530호 팜플렛 특표 2013-502275호 공보 특개 2005-185507호 공보 특개 2005-211480호 공보 특개 2010-221012호 공보
T.W.Gilbert, et al, J. of Surgical Research 152.1 (2009) 135-139
재생 의료에 있어서 탈세포화 조직을 사용하는 경우에는, 거부 반응이 없는 것에 더하여, 조직의 재생을 빠르게 수행할 수 있는지의 여부가 문제된다. 동일한 생체에서 유래한 생체 조직으로부터 수득한 탈세포화 조직으로서, 동일한 정도로 세포가 제거된 탈세포화 조직이라도, 탈세포화의 방법 또는 단계가 다른 경우에는, 탈세포화 조직으로의 숙주 세포의 접착성, 숙주 세포의 유인 효과, 탈세포화 조직 내로의 숙주 세포의 침윤 등의 속도에 차이가 있는 경우가 있어, 조직의 재생에 큰 영향이 있었다.
본 발명은, 상기 과제를 해결하기 위한 것으로서, 세포 접착성이 우수한 탈세포화 조직을 제공하는 것을 과제로서 한다.
본 발명자들은, 상기 과제를 해결하고자 열의있게 검토한 결과, 생체 유래 조직의 탈세포화 전후의 시차주사 열량 측정법에 있어서 흡열량의 변화가 적은 탈세포화 조직을 사용하는 경우에, 조직이 신속하게 재생될 수 있음을 발견하여, 본 발명을 완성하였다. 구체적으로, 본 발명은 하기의 것을 제공한다.
(1) 생체 유래 조직을 탈세포화한 탈세포화 조직으로서, 시차주사 열량 측정법에 의해 측정된, 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대해 탈세포화 조직의 건조질량 당 흡열량의 비가 0.70 이상인 것을 특징으로 하는, 탈세포화 조직.
(2) 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대하여 탈세포화 조직의, 건조 질량 당 DNA 양의 질량비가 0.300 이하인 것을 특징으로 하는, (1)에 기재된 탈세포화 조직.
본 발명에 의하면, 세포 접착성이 우수한 탈세포화 조직이 제공된다. 상기 탈세포화 조직은, 세포 독성이 낮고, 세포의 유인 효과 또는 분화 유도 효과를 가지며, 조직의 재생 효과가 높다는 것이 기대된다.
[도 1] 탈세포화 전의 생체 유래 조직의 DSC 흡열량을 나타내는 도이다. [도 2] 실시예 1의 탈세포화 조직의 DSC 흡열량을 나타내는 도이다. [도 3] 실시예 4의 탈세포화 조직의 DSC 흡열량을 나타내는 도이다. [도 4] 비교예 2의 탈세포화 조직의 DSC 흡열량을 나타내는 도이다.
이하, 본 발명의 실시형태에 대하여 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시형태에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 탈세포화 조직은, 탈세포화 전의 조직과 비교하여, 시차주사 열량 측정법에 의해 측정된 흡열량이 별로 변화하지 않는 것에 특징이 있다. 이하, 본 명세서에서는, 시차주사 열량 측정법에 의해 측정된 흡열량을 “DSC흡열량”이라 명명한다. 생체 유래 조직 또는 그 탈세포화 조직에서, 55 ~ 70℃의 영역에서 흡열이 나타난다. 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대해, 시차주사 열량 측정법에 의해 측정된, 탈세포화 조직의 건조질량 당 흡열량의 비를 “탈세포화 흡열량비”라고 명명한다. 또한, 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대한 탈세포화 조직의, 건조질량 당의 DNA 량의 질량비를 “탈세포화 DNA 비”로 칭한다. 또한, 생체 유래 조직 또는 탈세포화 조직은, 수분의 흡수 또는 건조에 의해, 질량이 변화하는 것이 있기 때문에, 본 발명에서는, 탈세포 DNA 비 및 탈세포화 흡열량 비를, 이 중 하나로도, 생체 유래 조직 및 그 탈세포화 조직의 건조 질량을 준비하는 것으로서 하고 있다.
[탈세포화 흡열량비] 본 발명의 탈세포화 조직의 탈세포화 흡열량비는, 0.7 이상이며, 탈세포화 흡열량비가 0.7보다도 낮은 경우에는, 탈세포화 조직으로의 세포 유인성이나 세포의 분화유도성이 충분하지 않고, 탈세포화 조직에 의한 재생 치료에 악영향이 되는 경우가 있다. 탈세포화 흡열량비가 0.72 이상이 바람직하며, 0.74 이상이 보다 바람직하고, 0.77 이상이 가장 바람직하다. 탈세포화 흡열량비가 0.77 이상이면, 탈세포화 조직으로의 세포 접착성을 보다 높이기 쉽다는 점에서 바람직하다.
탈세포화 흡열량 비의 상한값은 특별히 한정되지 않지만, 1.3 이하, 바람직하게는 1.27 이하, 보다 바람직하게는 1.25 이하, 가장 바람직하게는 1.23 이하라면, 탈세포화 조직으로의 세포 유인성 또는 세포의 분화 유도성이 양호해지기 쉽다는 점에서 바람직하다.
탈세포화 흡열량비를 산출하는 경우에는, 시차주사 열량 측정법을 수행하 후, 측정에 사용한 샘플의 건조질량을 측정하여, 건조질량 당의 DSC 흡열량을 산출하여, 탈세포화 전 조직의 건조질량 당 DSC 흡열량에 대해, 탈세포화 조직의 건조질량 당의 DSC 흡열량으로부터, 탈세포화 흡열량 비를 산출하는 것이 쉽다. 또한, “샘플을 건조한다”는 것은, 샘플 중의 수분 함량이 5 질량% 이하가 될 때까지 샘플을 건조시키는 것을 가리킨다. 샘플을 건조시키는 수단으로서는 특별히 한정되지 않지만, 실시예에서 수행한 방법 등을 들 수 있다. (건조질량당 DSC 흡열량) = (미건조시료의 DSC 흡열량) × (건조 후의 시료 질량/(건조 전의 시료의 질량)) (탈세포화 흡열량비) = (탈세포화 조직의 건조 질량당 DSC흡열량)/(탈세포화 전 조직의 건조 질량당 DSC 흡열량)
생체 유래 조직의 시차주사 열량 측정법에 있어서 55~70℃의 영역의 흡열은 조직 중의 콜라겐 열변형에 의한 것으로 생각할 수 있다. 콜라겐은 세포 외 매트릭스의 주성분이지만, 생체 유래 조직 중 전체의 콜라겐이 탈세포화 조직에 보존시키기 위해서는 제한되지 않고, 탈세포화하는 과정에서, 콜라겐 일부가 이탈하는 경우가 있다. 본 발명자들은, 탈세포화 조직의, 세포의 유인 효과 또는 분화유도효과는, 탈세포화 조직의 콜라겐 함량과 상관있는 것으로 예상되지만, 반드시 꼭 예상하지는 않고, 콜라겐의 함량이 높아도 세포의 유인효과 또는 분화 유도 효과가 낮은 탈세포화 조직이 있는 것이나, 탈세포화 조직의 세포 접착성, 세포의 유인 효과, 및 분화 유도 효과와, 탈세포화 조직의 DSC 흡열량과의 사이에서 관련되는 것을 발견하였다.
생체 조직 중의 콜라겐은 콜라겐 헬릭스(helix)로 불리는 3중 나선 구조를 가지는 것이 알려져 있다. 본 발명자들은, 생체 유래 조직의 탈세포화 조직에서 55~70 ℃인 영역의 흡열은, 3중 나선 구조를 가지는 콜라겐의, 콜라겐과 콜라겐 또는 콜라겐과 배위수(配位水, coordinated water)과 수소결합의 개열(cleavage)에 의한 것으로서, 탈세포화 조직의 DSC의 흡열량은, 탈세포화 조직의 콜라겐 함량이 아니라, 3중 나선 구조을 갖는 콜라겐의 함량과 상관되는 것으로 특정하고 있다. 추가로, 본 발명자들은, 생체 조직 중의 콜라겐과 동일한 구조인, 3중 나선 구조를 가지는 콜라겐 함량이 높은 탈세포화 조직만큼, 세포의 유인 효과 또는 분화 유도 효과가 높다고 특정되고 있다.
[탈세포화 DNA 비] 일반적으로 탈세포화 조직의 DNA함량은 적은 것이 바람직하다고 여겨지지만, 본 발명의 탈세포화 조직에서는, 탈세포화 DNA비는, 0.300 이하인 것이 바람직하다. 탈세포화 DNA 비가 0.300을 넘는 경우는, 재생 의료에 사용하는 경우에 거부반응이 발생하는 경우가 있다. 세포의 유인 효과나 분화 유도 효과라는 점에서 본 발명의 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA비는, 0.200 이하인 것이 바람직하고, 0.150 이하가 보다 바람직하며, 0.080 이하가 가장 바람직하고, 0.005 이하가 특히 바람직하다. 탈세포화 DNA 비가 0.080 이하이면, 탈세포화 조직으로의 세포 접착성을 특히 높이기 쉬운 점에서 바람직하다.
탈세포화 DNA 비의 하한점은, 적을수록 바람직하고, 실현하기 쉬운 것으로부터 바람직하게는 0.001 이상, 보다 바람직하게는 0.002 이상이다.
탈세포화 DNA 비를 구하기 위한 DNA 함량의 측정 방법은 특히 한정되지 않지만, 공지된 방법에 의하면, 단백질 부분을 효소 등으로 분해 소거한 후, DNA와 특이적으로 결합하는 형광시약 조직을 반응시켜, 형광 강도를 측정하는 방법(예를 들면, 비특허문헌 1을 참조) 등에 의해 측정하는 것이 가능하다. 탈세포화 DNA 비는, 건조 질량을 기준으로 한 비율이기 때문에, DNA 함량의 측정은 조직을 건조시킨 후부터 수행하는 것이 바람직하다. (탈세포화 DNA 비) = (건조한 탈세포화 조직의 DNA 함량) / (건조한 탈세포화 전의 조직의 DNA 함량)
그러나, 탈세포화 조직을 건조시킨 것으로부터 DNA 함량을 측정하는 경우는, 측정값의 오차가 커지는 경우가 있기 때문에, 별도의 건조 전후 조직의 질량비(건조 감소 중량비)를 측정하여두고, 미건조의 사태에 측정한 DNA 함량을 이 건조중량비로 보정하여 산출하여도 바람직하다. (건조 감소 질량비) = (건조 후 질량) / (건조 전 질량) (건조한 조직의 DNA 함량) = (미건조 조직의 DNA함량) / (건조감소 질량비)
[생체 조직] 본 발명의 탈세포화 조직에 사용하는 생체 조직은, 척추 동물 유래의 본 발명의 탈세포화 조직에 사용되는 생체 조직은 척추 동물 유래의 생체 조직이라면, 특히 한정되지 않지만, 거부반응이 적은 것으로부터, 포유류 또는 조류 유래의 생체 조직이 바람직하며, 구하기 용이한 것으로부터, 포유류인 가축, 조류인 가축 또는 사람 유래의 생체 조직이 보다 바람직하다. 포유류의 가축으로서는, 소, 말, 낙타, 라마, 당나귀, 야크, 양, 돼지, 염소, 사슴, 알파카, 개, 너구리, 족제비, 여우, 고양이, 토끼, 햄스터, 기니피그, 랫트, 마우스, 다람쥐, 아메리카너구리 등을 들 수 있다. 또한, 조류의 가축으로서는, 잉꼬, 앵무새, 닭, 오리, 칠면조, 거위, 뿔닭(helmeted guinea fowl), 꿩, 타조, 메추라기, 에뮤(emu) 등을 들 수 있다. 이들 중에도, 손에 넣는 것의 안전성으로부터, 소, 돼지, 토끼, 사람의 생체 조직이 바람직하다.
생체 조직의 부위로서는, 세포 외의 매트릭스 구조를 가지는 부위가 사용되며, 이러한 부위로서는, 예를 들면, 간장, 신장, 요관, 방광, 요도, 혀, 편도, 식도, 위, 소장, 대장, 항문, 췌장, 심장, 혈관, 비장, 폐, 뇌, 뼈, 척수, 연골, 정소, 자궁, 난관, 난소, 태반, 각막, 골격근, 건, 신장, 피부 등을 들 수 있다. 생체 조직의 부위로서는, 조직 재생의 효과가 높은 것으로부터, 연골, 뼈, 간장, 신장, 심장, 심막, 혈관, 피부, 소장점막하조직, 폐, 뇌, 및 척수가 바람직하다.
[본 발명의 탈세포화 조직을 얻는 방법] 본 발명의 탈세포화 조직을 얻는 방법은, 탈세포화 흡열량비가 0.7~1.3이 되는 탈세포화 방법이라면, 특히 한정되지 않는다.
본 발명의 탈세포화 조직을 얻는 데에 바람직한 방법으로서는, 예를 들면, 높은 정수압 처리에 의한 방법, 동결 융해 처리에 의한 방법 등을 들 수 있으며, 탈세포화 DNA비를 낮추는 것이 용이하다는 것으로부터, 높은 정수압 처리에 의한 방법이 바람직하다.
생체 유래 조직의 높은 정수압 처리는, 계면활성제를 함유하는 세정액 중에서 수행하는 것이 바람직하다. 관련된 경우의, 계면활성제의 함량은, 세정하는 생체 유래 조직이나, 계면활성제의 종류에 의해 달라지나, 0.01 질량% 이상 2.00 질량% 이하가 바람직하며, 0.03 질량% 이상 1.00 질량% 이하가 보다 바람직하고, 보다 바람직하고, 0.05 질량% 이상 0.50 질량% 이하가 가장 바람직하다. 또한, 높은 정수압이 인가된(applied) 생체 유래 조직의 세정에, 상기 핵산 분해 효소 및 계면활성제를 사용하면, 세정 효과를 높이는 것이 가능하다. 계면활성제를 함유하는 세정액을 사용한 후에, 핵산 분해효소를 사용하면, 보다 세정 효과를 높일 수 있다.
높은 정수압처리에 의한 방법으로 인해, 본 발명의 탈세포화 조직을 얻는 경우는, 생체 유래 조직에 매체(媒體, media, vehicle) 중에 50~1500 MPa의 정수압을 인가한다. 인가한 정수압이 50 MPa보다도 낮은 경우에는, 탈세포화가 불충분하게 되는 경우가 있어, 높은 정수압처리 후에 계면활성제를 함유하는 세정액에 세정하는 공정에서의 조직으로 데미지가 커질 수 있으며, 1500 MPa을 넘는 경우는 인가에 견딜만한 압력 용기가 필요하며, 큰 에너지를 필요로 함과 함께, 인가에 사용한 매체가 수용성 매체인 경우에는 얼음이 생성되고, 생성된 얼음에 의해 조직이 데미지를 받는 경우가 있다. 인가하는 정수압은 80~1300 MPa가 바람직하며, 90~1200 MPa가 보다 바람직하고, 95~1100 MPa가 가장 바람직하다.
정수압의 인가에 사용하는 매체로서는, 물, 생리식염수, 프로필렌글리콜 또는 이의 수용액, 글리세린 또는 이의 수용액, 포도당류 수용액 등을 들 수 있다. 완충액으로는, 초산완충액, 인산완충액, 구연산 완충액, 붕산완충액, 주석산 완충액, 트리스 완충액, HEPES 완충액, MES 완충액 등을 들 수 있다. 포도당류 수용액의 포포당으로는, 에리트로스(erythrose), 자일로스, 아라비노스, 알로오스, 탈로스, 글루코스, 만노오스, 갈락토오스, 에리스리톨(erythritol), 자일리톨, 만니톨, 솔비톨, 갈락리톨(galactitol), 수크로오스, 락토오즈, 말토오스, 트레할로오스(trehalose), 덱스트란, 알긴산, 히알루론산 등을 들 수 있다.
높은 정수압 처리의 온도는, 얼음이 생성되지 않고, 열에 의해 조직으로의 데미지가 없는 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 탈세포 처리가 완활하게 수행되어 조직으로의 영향 또한 적은 것으로부터 0~45 ℃가 바람직하며, 4~37 ℃가 보다 바람직하고, 15~35 ℃가 가장 바람직하다. 높은 정수압 처리의시간은, 너무 짧으면 세포의 파괴가 충분해 행해지지 않고, 긴 경우에는 에너지의 낭비로 연결될 수 있다는 것으로부터, 높은 정수압 처리에 있어서도, 목적으로 하는 인가 압력을 유지하는시간은, 5~60 분이 바람직하고, 7~30 분이 보다 바람직하다.
높은 정수압이 인가되는 생체 조직은, 조직 중의 세포가 파괴되고 말아, 이 세포는 세정액에 의해 제거된다. 세정액은, 높은 정수압 처리의 매체와 같아도 좋고, 달라도 좋다. 세정액은, 핵산 분해효소, 유기용액 또는 킬레이트제를 함유하는 것이 바람직하다. 핵산 분해 효소는, 정수압이 인가된 생체 조직으로부터의 핵산 성분, 유기용액이 지질, 각각의 소거 효율을 향상시킬 수 있고, 킬레이트제는, 탈세포화 조직 중의 칼슘 이온이나 마그네슘 이온을 불활성화하는 것으로 인해, 본 발명의 입자화 탈세포화 조직을 질환 부위에 적용하는 경우의 석회화를 방지하는 것이 가능하다. 유기용제로서는, 지질의 제거 효과가 높은 것으로, 수용액의 유기용제가 바람직하며, 에탄올, 이소프로판올, 아세톤, 디메틸술폭시드(Dimethyl sulfoxide)가 바람직하다. 킬레이트제로서는, 에틸렌디아민4산(EDTA), 나이트릴로트라이아세트산(nitrilotriacetic acid, NTA), 디에틸렌트리아미네펜타-아세트산(diethylenetriaminepentaacetic acid, DTPA), 히드록시에틸에틸렌디아민 트리아세트산(hydroxyethylethylenediamine triacetic acid, HEDTA), 트리에틸렌테트라민 헥사아세트산(Triethylenetetramine hexaacetic Acid, TTHA), 1,3-프로판디아민 테트라아세트산(1,3-Propanediamine tetraacetic acid, PDTA), 1,3-디아미노-2-히드록시프로판 테트라아세트산(1,3-diamino-2-hydroxypropane tetraacetic acid, DPTA-OH), 히드록시에틸렌이미노 디아세트산(hydroxyethyleneimino diacetic acid, HIDA), 디히드록시에틸글리신(dihydroxyethylglycine, DHEG), 글리콜에테르디아민 테트라아세트산(glycol ether diamine tetraacetic acid, GEDTA), 디카르복시에틸글루타민산(dicarboxyethyl-glutamic acid, CMGA), 3-히드록시-2,2’-이미노디숙신산(3-hydroxy-2,2’-iminodisuccinic acid, HIDA), 디카르복실에틸아스파르트산(dicarboxylethylaspartic acid, ASDA)등의 이미노카르본산(iminocarboxylic acid)계 킬레이트제 또는 이의 염; 구연선, 주석산, 사과산(malic acid), 젖산 등의 히드록시칼본산 계 킬레이트제 또는 이의 염을 들 수 있고, 이들 킬레이트제의 염으로서는, 나트륨염 또는 칼륨염을 들 수 있다.
세정 효율이 높아지는 것으로, 세정액은, 계면활성제를 함유하는 것도 좋다. 계면활성제로서는, 지방산 비누(fatty acid soap), 알콕시카르복시산 염(alkoxycarboxylate), 폴리옥시에틸렌알콕시카르복시산염(polyoxyethylenealkoxycarboxylate), 알킬술폰산염(alkylsulfonate), 알킬벤젠술폰산염(alkylbenzenesulfonate), 알킬술폰산 에스테르염(alkylsulfuric acid ester), 폴리옥시에틸렌알킬술폰산 에스테르염(polyoxyethylenealkylsulfuric acid ester), 알킬황산 에스테르염(alkyl phosphoric acid ester), α-술포지방산 에스테르염(α-Sulfofatty acid ester), N-아실글루타민산염(N-acylglutaminate), 아실-N-메틸타우린(acyl-N-methyltaurate), N-알킬사르코신염(N-alkylsarcosine), 콜산염(cholate), 데옥시콜산염(deoxycholate) 등의 음이온성 계면활성제；
알킬디메틸아민(alkyldimethylamine), 알킬디에탄올아민(alkyldiethanolamine), 알킬트리에틸암모늄 염(alkyltriethylammonium salt), 디알킬디메틸암모늄 염(dialkyldimethylammonium salt), 알킬피리듐 염(alkylpyridium salt), 알킬벤질디메틸암모늄 염(alkylbenzyldimethylammonium salt) 등의 양이온성 계면활성제；
알킬디메틸아민 옥시드(alkyldimethylamine oxide), 알킬카르복시베타인(akylcarboxybetaine), 알킬아미드프로필베타인(alkylamidopropylbetaine), 알킬아미드프로필술포베타인(alkylamidopropylsulfobetaine), 알킬이미다졸베타인(alkylimidazoliumbetaine), 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술폰산염(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-2-hydroxy-1-propanesulfonate, CHAPSO), 3-[(3-클라미드프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술폰산염((3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS) 등의 양이온성 계면활성제；
글리세린 지방산 에스테르, 솔비탄 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 트리할로오스 지방산 에스테르, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌솔비탄 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌알킬에테르(polyoxyethylenealkylether), 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌에테르, 알킬(폴리)글리세린에테르, 지방산알칸올아미드, 폴리옥시에틸렌지방산알칸올아미드, 알킬(폴리)글리코시드, 알킬말토오시드(alkylmaltoside), 알킬티오글리코시드(alkylthioglycoside), 알킬말토피라노시드(alkylmaltopyranoside), 알카노일-N-메틸-D-글루코사민(alkanoyl-N-methyl-D-glucosamine), N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)콜아미드(N,N-bis(3-D-gluconamidepropyl)colamide(BIGCHAP), N,N-비스(3-D-글루콘아미드프로필)데옥시콜아미드(N,N-bis(3-D-gluconamidepropyl)deoxycolamide, Deoxy-BIGCHAP) 등의 비이온성(nonion) 계면활성제를 들 수 있다.
계면활성제로서는, 세포 제거의 관점에서, 알킬술폰산염, 알킬황산에스테르염, 폴리옥시에틸렌알킬황산에스테르염, α-술포지방산에스테르염(α-sulfofatty acid ester), 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 알킬(폴리)글리코시드가 바람직하고, 알킬술폰산염, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, 폴리옥시에틸렌알킬페닐에테르, 알킬(폴리)글루코시드가 보다 바람직하다.
높은 정수압이 인가되는 생체 조직을 세정하는 경우의 온도는, 열에 의해 조직으로의 데미지가 없는 온도라면, 특별히 한정되지 않지만, 세정액이 양호하게 조직으로의 영향 또한 감소시킨다는 점에서 0~45 ℃가 바람직하며, 1~40 ℃가 보다 바람직하고, 2~35 ℃가 가장 바람직하다.세정하는 경우에는, 필요에 따라서, 세정액을 진탕 또는 교반하여도 좋다.
동결 융해 처리에 따른 방법 발명의 탈세포화 조직을 얻는 경우는, 생체 유래 조직을 -80 ~ -20 ℃, 바람직하게는 -80 ~ -40℃의 온도에서 1 ~ 48 시간, 바람직하게는 10 ~ 30 시간 유지하여 동결시킨 후, 20 ~ 37 ℃의 온도에서 융해하는 공정을, 1 회 또는 2 회 이상, 바람직하게는 2 ~ 5 회 반복하여 수행한다. 동결 융해 처리시킨 생체 조직은, 조직 중의 세포가 파괴되어 있어, 이 세포는 세정액에 의해 제거된다. 세정 방법은, 높은 정수압 처리에 있어서 세정과 동일한 방법이 좋다.
탈세포화 DNA비 및 탈세포화 흡열량비의 측정은, 숙주 세포의 유인, 접착, 침윤 등이 우수한 탈세포화 조직의 선별 방법으로서 우수한 것으로부터, 탈세포화를 제조하는 경우에는, 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대하여 탈세포화 조직의, 건조 질량 당의 DNA 양의 질량비가 0.3 이하인 것을 확인하는 공정(즉, 탈세포화 DNA 비가 0.3 이하인 것을 확인하는 공정)과 탈세포화 전의생체 유래 조직에 대한 탈세포화 조직의, 시차주사 열량 측정법에 의해 측정된, 건조 질량 당의 흡열량 비가 0.7 ~ 1.3인 것을 확인하는 공정(즉, 탈세포화 흡열량비가 0.7 ~ 1.3인 것을 확인하는 공정)을 포함시키는 것에 따라, 양호한 탈세포화 조직 수득을 제조하는 것이 가능하다. 탈세포화 DNA 비가 0.3 이하인 것을 확인하는 공정 및 탈세포화 흡열량비가 0.7 ~ 1.3인 것을 확인하는 공정은, 탈세포화 조직을 세정하는 공정 후인 것이 바람직하고, 탈세포화 조직을 살균 또는 멸균하는 공정인 경우에는, 탈세포화 조직을 세정하는 공정 후, 살균 또는 멸균하는 공정 전인 것이 바람직하다.
본 발명의 탈세포화 조직은, 단독으로 적용하여도 좋고, 질환 부위의 재생 및 치료 효과가 있는 다른 성분과 함께 적용하여도 좋다. 이러한 다른 성분으로서는, 성장인자, 프로테오글리칸 또는 글리코사민글리칸, 세포, β-1,3-클리칸, 메발론 산(mevalonic acid) 등을 들 수 있다.
성장 인자로서는, 인슐린류 유사 성장 인자(IGF), 염기성 섬유아세포성장 인자(bFGF), 산성 섬유아세포 성장 인자(aFGF), 형질 전환 성장 인자-α(TGF-α), 형질전환 성장 인자(TGF-β), 골형성 단백질(BMP), 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 각질 세포 성장 인자(KGF), 표피 세포 성장 인자(EGF), 혈관 내피 세포 성장 인자(VEGF), 조혈 촉진 인자(EPO), 과립 대식 세포성장 인자(GM-CSF), 과립 세포 성장 인자(G-CSF), 신경 세포 성장 인자(NGF), 헤파린 결합(EGF) 등이 들 수 있다. 프로테오글리칸 또는 글루코사민글리칸으로서는, 콘드로이틴황산(chondroitin sulfate), 헤파란황산(heparan sulfate), 케라탄 황산(keratan sultate), 황산데르마탄(dermatan sulfate), 히알루론산, 헤파린 등을 들 수 있다.
본 발명의 탈세포화 조직은, 그대로 이식에 사용하여도 좋고, 세포를 접종하여 배양한 후에 사용하여도 좋다. 또한, 본 발명의 탈세포화 조직은, 절단, 슬라이스, 분쇄하여 시트 상, 입자상, 미분말상, 젤상 등으로 가공하여 사용하여도 좋고, 탈세포화 조직이 시트 상인 경우에는, 탈세포화 조직끼리 또는 다른 시트 상의 것과 조합하여 다층화하여 사용하여도 좋고, 관상으로 가공하여도 좋다.
본 발명에 의하면, 세포의 유인 효과가 우수한(에 바람직한) 탈세포화 조직이 제공된다. 탈세포화 조직의 세포 유인 효과는, 실시예에 기재된 방법으로 탈세포화 조직을 세포 접착성 실험에 제공하는 것으로 평가할 수 있다.
실시예 이하, 실시예에 의해 본 발명을 보다 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다. 또한, 특히 한정되지 않는 한, 실시예 중의 “부”나 “%”는 질량 기준에 의한 것이다.
[실시예 1] 폴리에틸렌제 지퍼가 부착된 봉투에, 돼지의 대동맥을 절단하여 열고 채취한 시트 상의 내막(이하, 상기 시트 상의 내막을 “내막 시트”라고 한다.)과, 높은 정수압 처리의 매체로서 생리식염수를, 넣고, 연구 개발용 고압 처리장치(神製鋼製, 상품명: Dr. CHEF)을 사용하여, 100 MPa의 정수압을 10 분간 인가하였다. 높은 정수압을 처리한 내막 시트를, 핵산 분해 효소로서 DNAse를 20 ppm 함유하는 생리식염수 중, 4 ℃에서 96 시간 진탕하는 것에 의해 세정하여, 특히, 80 % 에탄올 중에, 4 ℃에서 72 시간 진탕한 다음, 생리식염수 중, 4 ℃에 2 시간 진탕하여, 실시예 1의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 2] 실시예 1에 있어서, DNAse를 20 ppm 함유하는 생리식염수 중에서 진탕시간을 96시간에서 8시간으로 변경한 것 이외는 실시예 1과 동일한 조작을 수행하여 실시예 2의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 3] 내막 시트를, 드라이아이스로 동결시켜, 드라이아이스를 넣은 보냉 상자 중(약 -78 ℃)에서 20 시간 보존한 후, 25 ℃에서 용해시켰다. 이 동결 융해를 3 회 반복한 내막 시트를, 핵산 분해 효소로서 DNAse를 20 ppm 함유하는 생리식염수 중에서, 4 ℃로 96 시간 진탕하는 것에 의해 효소 처리하고, 더하여, 80% 에탄올 중에서, 4 ℃로 72 시간 진탕한 후, 생리식염수 중에서, 4 ℃로 2 시간 진탕하여, 실시예 3의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 4] 내막 시트를, 0.1 질량%의 도데실술폰산 나트륨(Dodecanesulfonic Acid Sodium Salt; 이하, SDS)를 함유하는 생리 식염수 중에서, 25 ℃로 96 시간 진탕하는 것으로 탈세포하였다. SDS 처리한 내막 시트를, 핵산 분해 효소로서 DNAse를 20 ppm 함유하는 생리 식염수 중에서, 4 ℃로 96 시간 진탕하는 것으로 효소 처리하고, 추가로, 80％ 에탄올 중에서, 4 ℃로 72 시간 진탕한 후, 생리 식염수 중에서, 4 ℃로 2 시간 진탕한 후, 실시예 4의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 5] 실시예 1과 동일한 방법으로, 내막 시트에 대하여, 1000 MPa의 정수압을 15 분간 인가하였다. 높은 정수압 처리한 내막 시트를, 0.1 질량％의 도데실술폰산 나트륨(이하, SDS)를 함유하는 생리 식염수 중에서, 25 ℃로 8 시간 진탕하고, 이어서, 핵산 분해 효소로서 DNAse를 20 ppm 함유하는 생리 식염수 중에서, 25 ℃로 24 시간 진탕하는 것으로 세척하였다. 추가로, 80％ 에탄올 중에서, 4 ℃로 72 시간 진탕한 후, 생리 식염수 중에서, 4 ℃로 2 시간 진탕한 후, 실시예 5의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 6] 실시예 5에 있어서, 높은 정수압 처리의 정수압을 1000 MPa 부터 400 MPa로 변경한 것 이외에는 실시예 5와 동일한 조작을 수행하여 실시예 6의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 7] 실시예 5에 있어서, 높은 정수압 처리의 정수압을 1000 MPa 부터 600 MPa으로 변경한 것 이외에는 실시예 5와 동일한 조작을 수행하여 실시예 7의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[실시예 8] 실시예 1에 있어서, 높은 정수압 처리의 정수압을 100 MPa 부터 600 MPa로 변경한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 조작을 수행하여 실시예 8의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[비교예 1] 실시예 4에 있어서, SDS의 농도를 0.1 질량%부터, 1 질량%으로 변경한 것 이외에는 실시예 4과 동일한 조작을 수행하여 비교예 1의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[비교예 2] 실시예 4에 있어서, 0.1 질량%의 SDS를 함유하는 생리 식염수를 1 질량%의 트리톤 X-100(폴리오시에틸렌옥틸페놀에테르: 이하, TX)을 함유하는 생리 식염수으로 변경한 것 이외에는 실시예 4과 동일한 조작을 수행하여 비교예 2의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[비교예 3] 비교예 2에 있어서, TX의 농도를 1 질량%부터, 0.1 질량%으로 변경한 것 이외에는 비교예 3과 동일한 조작을 수행하여 비교예 3의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[비교예 4] 내막 시트를, 생리 식염수 중에서, 초음파 처리(강도: 10 Ｗ/cｍ2, 주파수: 10 kHz, 작용시간: 2 분간)하였다. 초음파 처리한 내막 시트에 대하여, 비교예 2와 동일한 조작을 수행하여, 비교예 4의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[비교예 5] 비교예 4에 있어서, TX의 농도를 1 질량％부터, 0.1 질량％으로 변경한 것 이외에는 비교예 5과 동일한 조작을 수행하여 비교예 5의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[비교예 6]
인산 완충액에, CHAPs, 염화 나트륨 및 EDTA를 각각, 8 mmol/L, 1 mol/L, 25 mmol/L이 되도록 첨가한 액을, 탈세포화액으로 하였다. 내막 시트를, 이 탈세포화 액체 중에, 25 ℃로 96 시간 진탕하는 것으로 탈세포하여, 핵산 분해 효소로서 DNAse를 20 ppm 함유하는 생리 식염수 중에서, 25 ℃로 24 시간 진탕하는 것으로 효소 처리하고, 추가로, 80％에탄올 중에서, 4 ℃로 72 시간 진탕한 후, 생리 식염수 중에서, 4 ℃로 2 시간 진탕한 후, 비교예 6의 탈세포화 조직을 수득하였다.
[탈세포화 DNA비의 산출] 각 탈세포화 조직의 질량을 측정하여, 이들을 시험편으로 하여, 단백질 분해 효소용액에 침지하여 용해한 후, 페놀/클로로포름을 처리하여 단백질을 제거하고, 에탄올 침전액에 의해 DNA을 회수하였다. 회수한 DNA를 피코글린(Life Technologies 사)에 의해 형광 염색하여 형광 강도를 측정하는 것으로 DNA를 정량하고, 시험편의 질량과 DNA의 양으로부터, 시험편의 DNA 함량을 산출하였다. 또한, DNA의 정량에는, 피코글린에 첨가된 표준 DNA를 사용하여 작성한 검량선을 사용하였다. 별토의 시험편을 사용하여, 시험편의 질량과 건조한 시험편(60 ℃의 항온조에서 12 시간 보존한 것)의 질량으로부터, 건조 감량비를 구하여, 시험편의 DNA 함량과 건조 감량비로부터, 시험편의 건조질량당 DNA 함량을 산출하였다. (시험편의 DNA 함량) = (DNA 양)/(시험편 질량) (건조 감량비) = (건조한 시험편의 질량)/(시험편의 질량) (건조 시험편의 DNA 함량)=(시험편의 DNA 함량)/(건조 감량비)
내막 시트의 건조 시험편의 DNA 함량과 탈세포화 조직의 건조 시험편의 DNA함량 비로부터 탈세포화 DNA 비를 산출하였다. 결과는 [표 1]에서 나타낸다. (탈세포화 DNA 비)＝(탈세포화 조직의 건조 시험편 DNA 함량)/(내막 시트의 건조 시험편 DNA 함량)
[탈세포화 흡열량 비의 산출 방법] 3 mm×3 mm로 절단한 시험편을, 질량을 측정한 알루미늄 제의 시표 판에 넣어, 시차주사 열량 측정기(METTLER TOREDO사 제작, 형식 DSC1)을 사용하여, 측정 개시온도 25 ℃, 승온 속도 3 ℃/분, 측정 종료 온도 90 ℃의 조건으로 시차주사열량을 측정하였다. 55~68 ℃의 영역에서 콜라겐 유래로 보이는 흡열이 나타나는 것으로부터, 이 흡열량을 시험편의 흡열량으로 하였다. 탈세포화 전의 생체 유래 조직, 실시예 1 및 4의 탈세포화 조직, 비교예 2의 탈세포화 조직의 흡열량을 각각 도 1 내지 4에서 나타낸다. 흡열량의 측정 후의 시료 판은 구멍을 열어서, 60 ℃의 항온조에 12 시간 유지하여 건조시키는 것으로, 건조한 시험편이 들어있는 시료판의 질량을 측정하여, 하기의 식에 의해 시험편의 건조질량 당 흡열량을 산출하였다. (시험편의 건조질량 당 흡열량)＝(흡열량)/｛(건조한 시험편이 들어있는 시료판의)-(시험판의 질량)｝
내막 시트의 건조질량 당 흡열량과 탈세포화 조직의 건조질량 당의 흡열량으로 하기 식에 의해 탈세포화 흡열량비를 산출하였다. 결과를 [표 1]에서 나타낸다. (탈세포화 흡열량비)＝(탈세포화 조직의 건조질량 당 흡열량)/(내막 시트의 건조 질량 당 흡열량)
[세포 접착성 실험] 실시예 1~7 또는 비교예 1~6의 탈세포화 조직을, 직경 6 ｍｍ의 생검 관상판(trephine)을 사용하여 동전 모양으로 잘라낸 것을 시험편으로 하였다. 동전 모양 시험편의 내막측을 위로 하여 96 well plate dish에 설치하여, 10%의 소태아혈청(FBS)을 함유하는 MEM 배지에서 37 ℃로 12 시간, 전배양하였다. MEM 배지를 제거한 후, 인간 피부섬유아세포(NHDF)를 접종(2.7 × 103 세포/well)하여, 37 ℃로 3 시간 배양하였다. 시험편으로부터, 부착하지 않은 세포를 인산염 완충 생리 식염수를 사용하여 세척 및 제거한 후, 시험편을 WSt-8(동인화학연구소 제작)으로 염색하고, 450 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 별도로, NHDF의 수와, WSt-8에 의해 염색된 경우의 검량선을 제작하여 두고, 시험편의 흡광도와 검량선으로부터, 시험편에 부착한 NHDF 수를 산출하였다. 결과를 표 1에서 나타낸다.
탈세포화 DNA 비 탈세포화 흡열량 비 접착세포 수
실시예 1 0.0043 0.98 2300
실시예 2 0.087 1.02 2100
실시예 3 0.071 0.77 1700
실시예 4 0.46 0.76 1100
실시예 5 0.0041 1.21 2400
실시예 6 0.0044 1.01 2300
실시예 7 0.0043 1.17 2300
실시예 8 0.0000 0.97 2500
비교예 1 0.12 0.0 500
비교예 2 0.30 0.68 750
비교예 3 0.38 0.61 910
비교예 4 0.014 0.65 790
비교예 5 0.021 0.66 820
비교예 6 0.0061 0.63 890
표 1의 결과로부터, 실시예의 탈세포화 조직은 모두, 비교예의 탈세포화 조직과 비교하여 세포 접착수가 많고, 세포의 유인효과가 우수하여, 조직 재생효과가 높은 것이 나타났다.
[실시예 9~12, 비교예 7~10] 실시예 1~8, 비교예 1~6에서 사용한 돼지의 대동맥 내막 시트 이외의 생체 조직에 대하여, 본 발명의 탈세포화 조직의 제조예를 실시예 9~12에서 나타낸다. 또한 비교의 제조예를 비교예 7~10에서 나타낸다. 실시예의 탈세포화 조직은 모두, 비교예의 탈세포화 조직과 비교하여 세포 접착성이 높고, 세포의 유인효과가 우수하였다.
[실시예 9] 실시예 8에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 돼지의 대동맥 그대로를 사용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 조작을 수행하여 실시예 9의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[실시예 10] 실시예 8에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 돼지의 피부(진피를 포함)를 사용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 조작을 수행하여 실시예 10의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[실시예 11] 실시예 8에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 돼지의 심장을 사용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 조작을 수행하여 실시예 11의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[실시예 12] 실시예 8에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 소의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막을 사용한 것 이외에는, 실시예 8과 동일한 조작을 수행하여 실시예 12의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[비교예 7] 비교예 1에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 돼지의 대동맥 그대로를 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 조작을 수행하여 비교예 7의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[비교예 8] 비교예 1에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 돼지의 피부(진피를 포함)를 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 조작을 수행하여 비교예 8의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[비교예 9] 비교예 1에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 돼지의 심장을 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 조작을 수행하여 비교예 9의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
[비교예 10] 비교예 1에 있어서, 돼지의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막(내막 시트) 대신에, 소의 대동맥을 잘라 열어서 채취한 시트 상의 내막을 사용한 것 이외에는, 비교예 1과 동일한 조작을 수행하여 비교예 10의 탈세포화 조직을 수득하였다. 수득된 탈세포화 조직의 탈세포화 DNA 비와 탈세포화 흡열량 비를, 상기 방법으로 산출하였다. 결과를 [표 2]에서 나타낸다.
탈세포화 DNA 비 탈세포화 흡열량 비
실시예 9 0.0000 0.87
실시예 10 0.00067 1.35
실시예 11 0.0021 0.98
실시예 12 0.0000 0.75
비교예 7 1.59 0.02
비교예 8 1.14 0.003
비교예 9 1.03 0.03
비교예 10 0.71 0.62

Claims (2)

  1. 생체 유래 조직을 탈세포화한 탈세포화 조직으로서,
    시차주사 열량 측정법에 의해 측정된, 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대해 탈세포화 조직의 건조질량 당 흡열량의 비가 0.70 이상인 것을 특징으로 하는, 탈세포화 조직.
  2. 제 1항에 있어서, 탈세포화 전의 생체 유래 조직에 대하여 탈세포화 조직의, 건조 질량 당 DNA 양의 질량비가 0.300 이하인 것을 특징으로 하는, 탈세포화 조직.
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