KR20180095913A - 탈세포화된 태반막 및 이의 제조 방법 및 용도 - Google Patents

탈세포화된 태반막 및 이의 제조 방법 및 용도 Download PDF

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KR20180095913A
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Abstract

탈세포화된 태반 막을 제조하는 방법이 제공된다. 방법은 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화전 태반 막으로부터 세포를 제거하여 융모막 층으로부터 양막 층을 분리하지 않으면서 탈세포화된 태반 막을 생성하는 것을 포함한다. 탈세포화전 태반 막은 양막 낭으로부터 수득되며, 탈세포화된 태반 막은 양막 층 및 융모막 층을 포함한다. 또한, 탈세포화된 태반 막 및 탈세포화된 태반 막을 포함하는 태반-유래된 이식편이 제공된다. 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편의 용도가 또한 제공된다.

Description

탈세포화된 태반막 및 이의 제조 방법 및 용도
관련 출원에 대한 상호-참조
본 출원은 2015년 12월 23일 출원된 미국 가출원 번호 62/387,155에 관한 것이며 이의 이익을 청구하고, 이의 내용은 본원에 참조로 통합된다.
본 발명은 탈세포화된 태반 막, 양막 낭으로부터의 탈세포화된 태반 막을 제조하는 방법, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
발명의 개요
본 발명은 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화된 태반 막 및 이의 제조 사용 방법에 관한 것이다.
탈세포화된 태반 막을 제조하는 방법이 제공된다. 방법은 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화전 태반 막으로부터 세포를 제거하여 융모막 층으로부터 양막 층을 분리하지 않으면서 탈세포화된 태반 막을 생성하는 것을 포함한다. 탈세포화전 태반 막은 양막 낭으로부터 수득되며, 탈세포화된 태반 막은 양막 층 및 융모막 층을 포함한다.
제조 방법에 따르면, 탈세포화된 태반 막은 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양과 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 합보다 적어도 10% 많은 양으로 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 적어도 20%인 양으로 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화된 태반 막의 건조 중량 mg 당 100 ng 미만의 dsDNA를 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막 중의 DNA의 10% 미만인 양으로 DNA를 포함할 수 있다.
제조 방법에 따르면, 탈세포화된 태반 막의 양막 층은 섬유아세포 층을 포함할 수 있으며, 탈세포화된 태반 막의 융모막 층은 망상 층을 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막의 양막 층은 상피, 기저막, 치밀(compact) 층, 섬유아세포 층 및 해면 층을 포함할 수 있는 반면, 탈세포화된 태반 막의 융모막 층은 세포 층, 망상 층, 위-기저막(pseudo-basement membrane), 및 영양막 층을 포함할 수 있다.
제조 방법은 공여체로부터 양막 낭을 수확하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 탈세포화전 태반 조직을 세척하고 소독하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 하나 이상의 변성 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 하나 이상의 비-변성 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 탈세포화된 태반 막을 냉동 또는 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 탈세포화된 태반 막을 멸균시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 실온, 10℃ 또는 그 미만의 온도, 냉동 또는 냉동보존으로 탈세포화된 태반 막을 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 저장된 탈세포화된 태반 막은 탈세포화된 태반 막의 총 중량을 기준으로 하여 0.5 중량% 미만의 수분 함량을 가질 수 있다. 저장된 탈세포화된 태반 막은 탈세포화된 태반 막의 총 중량을 기준으로 하여 5-95 중량%의 수분 함량을 가질 수 있다.
제조 방법은 물 대체제로 탈세포화된 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 물 대체제는 글리세롤(글리세린 USP), 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함할 수 있다.
제조 방법은 탈세포화된 태반 막이 기판 상에 고정되도록 세포를 제거하기 전에 기판 상에 탈세포화전 태반 막을 고정시키고, 고정된 탈세포화된 태반 막을 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 제조 방법은 고정된 탈세포화된 태반 막을 냉동 또는 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법에 의해 제조된 탈세포화된 태반 막이 또한 제공된다.
양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화된 태반 막이 추가로 제공된다. 양막 층과 융모막 층은 융모막 층으로부터 양막 층의 분리 없이 태반 막으로부터 유래된다.
본 발명의 탈세포화된 태반 막은 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양과 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 합보다 적어도 10% 많은 양의 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 적어도 20%인 양으로 하나 이상의 성장 인자를 포함할 수 있으며; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막 중의 PDGF의 양의 적어도 20%인 양으로 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)를 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막 중의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 양의 적어도 20%인 양으로 bFGF를 포함할 수 있거나; 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막 중의 DNA의 20% 미만인 양으로 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 태반 막 및 하나 이상의 제제를 포함하는 태반-유래된 이식편이 제공된다. 하나 이상의 제제는 보존제, 물 대체제, 기타 연질 조직, 합성 물질, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편의 존재하에 세포를 배양시키는 것을 포함하는 방법이 제공된다. 세포는 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 후근신경절 세포, 췌장 섬 세포, 심근세포, 간세포, iPSC, 암세포 및 제정맥 내피 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 배양 방법은 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편의 존재하에 배양된 세포를 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 세포는 냉동보존에 의해 저장될 수 있다.
만능성 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하는 방법이 제공된다. 방법은 유효량의 본 발명의 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편의 존재하에 만능성 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
조직 결함을 수복하는 방법이 제공된다. 본 방법은 결함 부위를 유효량의 본 발명의 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편과 접촉시키는 것을 포함한다.
도 1은 세척 및 세포 제거 없이 2개의 상이한 형상의 프레임 상에 봉합된 예시적인 탈세포화전 태반 막을 묘사한다.
도 2는 세척 및 세포 제거(a) 및 냉동 건조(b) 후 고정부 상에 봉합된 예시적인 탈세포화된 태반 막을 묘사한다.
도 3은 H&E(10x)으로 염색된 예시적인 태반 막 탈세포화전(a) 및 탈세포화(b)를 묘사한다.
도 4는 예시적인 탈세포화전 및 탈세포화된 태반 막에서 PDGF-AA 정량화를 묘사한다.
도 5는 예시적인 탈세포화전 및 탈세포화된 태반 막에서 bFGF 정량화를 묘사한다.
도 6은 기판 상의 탈세포화전 태반 막을 고정시키는 예시적인 계획을 묘사한다(a: 양막 및 융모막 둘 모두를 갖는 예시적인 탈세포화전 태반 막 제조하기; b: 막 상단에 여러 크기의 메쉬 프레임 놓기; c: 매칭 프레임 주위로 막 자르기; d: 피부 스테플로 막을 프레임과 고정시키기; 및 e: 프레임과 스테플을 지닌 탈세포화전 태반 막 조각을 세척하기).
도 7은 기판 상의 탈세포화전 태반 막을 고정하는 예시적인 계획을 묘사한다.
도 8은 기판 상에 탈세포화전 태반 막을 고정시키는 또 다른 예시적인 계획을 묘사한다.
도 9는 탈세포화전 융모 막(CM)으로부터 분리되는 분리된 탈세포화전 양막(AM)을 묘사한다.
도 10은 탈세포화 후 동일한 크기의 온전한 태반 막(WM), 분리된 양막(AM), 및 분리된 융모막(CM) 중의 PDGF-AA(a) 및 bFGF(b)의 양 비교를 묘사한다. 분리된 양막(AM)으로부터의 PDGF-AA의 양은 ELISA 키트의 검출 한계 미만이었다.
도 11은 탈세포화된 태반 막 추출물을 갖는 배지 또는 배지 대조군에서 배양시킨 인간 피부 섬유아세포(HDF) 세포 중의 DNA의 정량화를 묘사한다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 양막 층과 융모막 층을 분리하지 않으면서 세포를 제거함으로써 양막 층과 융모막 층을 포함하는 탈세포화전 태반 막으로부터 탈세포화된 태반 막을 제조하는 방법에 관한 것이다. 탈세포화된 태반 막을 태반-유래된 이식편 제조, 세포 배양, 분화 촉진 및/또는 만능성 줄기 세포 또는 조직-특이적 세포의 자가-재생 능력 유지, 및 조직 결함 수복에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "양막 낭"은 배아 및 나중에 태아가 발생하는 양수를 보유하는 얇지만 거친 태반 막을 나타낸다. 양막낭은 내층(즉, 양막 층) 및 외층(즉, 융모막 층)을 포함한다. 양막 층은 수개의 하위-층 예를 들어, 상피, 기저막, 치밀 층, 섬유아세포 층, 및 해면 층을 포함한다(안쪽에서 바깥쪽으로). 유사하게는, 융모막 층은 수개의 하위 층 예를 들어, 세포 층, 망상층, 위-기저막, 및 영양막 층을 포함한다(안쪽에서 바깥쪽으로). 양막 층 및 융모막 층은 각각 세포는 물론 세포 및 세포외 분자(예를 들어, 성장 인자, 효소, 및 세포외 매트릭스 분자)를 포함한다. 양막 낭은 공여체로부터 수득될 수 있다. 공여체는 포유동물 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 쥣과동물, 양, 말, 개, 염소 및 고양이, 바람직하게는, 인간일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "탈세포화전 태반 막"은 양막 낭의 막 조각을 나타낸다. 탈세포화전 태반 막은 양막 낭에서 양막 층 및 융모막 층을 갖는 태반 막의 전체, 완전체 또는 일부일 수 있다. 탈세포화전 태반 막은 임의의 방법에 의해 양막 낭으로부터 수득될 수 있으며, 임의의 크기 또는 형상일 수 있다. 탈세포화전 태반 막의 양막 층은 수개의 하위-층 예를 들어, 상피, 기저막, 치밀 층, 섬유아세포 층, 및 해면 층을 포함할 수 있다(안쪽에서 바깥쪽으로). 탈세포화전 태반 막의 양막 층은 적어도 섬유아세포 층을 포함할 수 있다. 탈세포화전 태반 막의 융모막 층은 수개의 하위 층 예를 들어, 세포 층, 망상층, 위-기저막, 및 영양막 층을 포함할 수 있다(안쪽에서 바깥쪽으로). 탈세포화전 태반 막의 융모막 층은 적어도 망상 층을 포함할 수 있다. 탈세포화전 태반 막의 양막 층 및 융모막 층은 각각 세포는 물론 세포 분자 및 세포외 분자(예를 들어, 성장 인자, 효소, 및 세포외 매트릭스 분자)를 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같은 용어 "탈세포화된 태반 막"은 탈세포화전 태반 막으로부터 상당한 양 예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 또는 99.999%의 세포를 제거함으로써 수득된 태반 막을 나타낸다. 본 발명의 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막의 양막 층 및 융모막 층을 포함한다. 양막 태반 막은 상피, 기저막, 치밀 층, 섬유아세포 층 및/또는 해면 층을 포함할 수 있는 반면, 탈세포화된 태반 막의 융모막은 세포 층, 망상 층, 위-기저막 및/또는 영양막 층을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 양막"은 탈세포화전 태반 막의 융모막으로부터 분리된 양막 층의 막을 나타낸다. 분리는 임의의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 양막 층은 융모막 층으로부터 벗겨지거나 당겨질 수 있거나 고염 용액을 포함하는 화학적 처리에 의해 융모막 층으로부터 떼어질 수 있다. 분리된 양막은 상피, 기저막, 치밀 층, 섬유아세포 층 및/또는 해면 층을 포함할 수 있다. 분리된 양막은 양막으로부터 상당한 양 예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 또는 99.999%의 세포를 제거함으로써 탈세포화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리된 융모막"은 탈세포화전 태반 막의 양막으로부터 분리된 융모막 층의 막을 나타낸다. 분리는 임의의 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 융모막 층은 양막 층으로부터 벗겨지거나 당겨질 수 있거나 고염 용액을 포함하는 화학적 처리에 의해 양막 층으로부터 떼어질 수 있다. 분리된 융모막은 세포층, 망상 층, 위-기저막 및/또는 영양막 층을 포함할 수 있다. 분리된 융모막은 상당한 양 예를 들어, 적어도 약 70, 80, 90, 95, 99, 99.9 또는 99.999%의 세포를 융모막으로부터 제거함으로써 탈세포화될 수 있다.
본 발명은 탈세포화된 태반 막을 제조하는 방법을 제공한다. 방법은 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화전 태반 막으로부터 세포를 제거하여 융모막 층으로부터 양막 층을 분리하지 않으면서 탈세포화된 태반 막을 생성하는 것을 포함한다. 탈세포화전 태반 막은 양막 낭으로부터 수득된다. 탈세포화전 태반 막은 양막 층 및 융모막 층을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "분리 없이"는 양막 층과 융모막 층이 탈세포화된 태반 막을 생성하기 위해 탈세포화전 태반 막으로부터 세포를 제거하는 단계 동안 예를 들어, 적어도 약 1, 10, 100, 1,000 또는 10,000 mm2의 접촉 표면으로 서로 접촉된채 유지됨을 나타낸다. 양막 층과 융모막 층 사이의 접촉 표면은 융모막 층에 면하는 양막 층의 표면의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%와 중첩될 수 있다. 접촉 표면은 양막층에 면하는 융모막 층의 표면의 적어도 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98 또는 99%와 중첩될 수 있다.
본원에 기재된 세포 제거 또는 탈세포화 과정은 미국 특허 번호 6,734,018, 7,338,757, 8,574,826, 6,743,574, 및 8,563,232, 및 미국 특허 출원 공개 번호 2014/0065238A1 및 2014/0154663A1에 기술된 방법에 따라 수행될 수 있으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 통합된다. 탈세포화 과정은 태반 막의 기질 및/또는 조직 구조에 대한 손상 없이 수행될 수 있고, 사르코시네이트 및 소독제를 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 탈세포화 과정은 세정제, 엔도뉴클레아제, 및/또는 프로테아제를 사용하는 것을 포함할 수 있거나 없다. 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편은 기타 성분 중에서 콜라겐, 히알루로닌, 엘라스틴, 뮤코다당류 및 프로테오글리칸을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편은 콜라겐, 콜라겐 타입 I, 및/또는 콜라겐 타입 IV 이외에 하나 초과 유형의 콜라겐 및/또는 하나 초과의 단백질을 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 탈세포화된 태반 막은 탈세포화된 태반 막의 건조 중량 mg 당 약 1000, 500, 100, 80, 50 또는 10 ng 미만의 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 포함한다. 기타 구체예에서, 탈세포화된 태반 막 중의 DNA 양은 탈세포화전 태반 막 중의 DNA 양과 비교하여 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99% 또는 그 초과; 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99, 100% 또는 그 미만; 및/또는 약 50 내지 100%, 약 70 내지 100%, 약 90 내지 100%, 약 90 내지 95% 만큼 감소한다. 탈세포화된 태박 막은 탈세포화전 태반 막 중의 DNA의 약 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 1% 미만인 양으로 DNA를 포함할 수 있다.
탈세포화된 태반 막은 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토킨(예를 들어, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 상피 성장 인자(EGF), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 태반 성장 인자(PIGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 대식세포 염증 단백질, 인터류킨, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP))을 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양과 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 합보다 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 많은 양으로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한 면적"은 대조군의 면적 예를 들어, 탈세포화된 분리된 양막 또는 융모막의 면적과 약 20, 15, 10, 5 또는 1% 미만으로 차이나는 탈세포화된 태반 막의 면적 예를 들어, 단면적을 나타낸다. 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 및 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막은 탈세포화된 태반 막을 제조하는데 사용된 양막 낭으로부터 제조될 수 있다.
탈세포화된 태반 막은 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토킨(예를 들어, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 상피 성장 인자(EGF), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 태반 성장 인자(PIGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 대식세포 염증 단백질, 인터류킨, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP))을 탈세포화전 태반 막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30%인 양으로 포함할 수 있다.
제조 방법은 공여체로부터 양막 낭을 수확하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 공여체는 포유동물 예를 들어, 인간, 소, 돼지, 쥣과동물, 양, 말, 개, 염소 및 고양이, 바람직하게는, 인간일 수 있다.
제조 방법은 예를 들어, 태반 스커트 주위의 태반으로부터 양막 낭을 절단함으로써 태반으로부터 탈세포화전 태반 막을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
제조 방법은 탈세포화전 태반 막을 세척하고 소독하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 방법은 탈세포화전 태반 막과 결합된 외인성 조직을 제거하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 탈세포화전 태반 막은 절단되고 증류된/탈이온화된 내독소-비함유 물 및/또는 수용액 예컨대, 특히 등장성 염수로 세척될 수 있다. 처리 시, 일부 구체예에서, 처리되는 조직의 대략적 부피의 2, 5 또는 10배인 수용액의 부피를 이용하여 다중 "세척" 또는 "세정"이 수행될 수 있다. 3개의 이러한 처리 단계의 사용은 결합된 가용화 요소를 약 1:100, 1:500 또는 1:1000 희석시켜 조직이 이러한 가용화 요소를 본질적으로 함유하지 않게 한다. 탈세포화전 태반 막 및 탈세포화된 태반 막 조각은 특정 구체예에서 약 30, 20, 15, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05 mm 또는 그 미만의 두께를 가질 수 있다. 탈세포화전 태반 막 및 탈세포화된 태반 막 조각은 또한 약 30, 20, 10, 8, 5, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.05 mm 또는 그 초과의 두께를 가질 수 있다. 또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반 유래된 이식편을 멸균시키는 것을 또한 포함할 수 있다. 멸균화는 일부 구체예에서, 이온화 방사선의 사용을 포함할 수 있다. 기타 구체예에서, 이온화 방사선의 흡수 선량은 약 1.0 KGy 내지 약 50 KGy, 약 8.0 KGy 내지 약 50 KGy, 약 8.0 KGy 내지 약 25 KGy, 또는 약 8.0 KGy 내지 약 18 KGy일 수 있다. 일부 구체예에서, 멸균 단계는 탈세포화된 태반 막을 포함하는 패키징된 조직 수복 임플란트를 드라이 아이스 위에 놓고 패키징된 조성물을 조사하는 것을 포함할 수 있다. 특정 구체 예에서, 살균은 약 -20℃ 내지 -50℃의 온도에서 수행될 수 있다. 본 발명의 임플란트는 감마 조사, 초임계 이산화탄소, 에틸렌 옥사이드, 플라즈마, 또는 전자 빔을 사용하여 멸균될 수 있다.
제조 방법은 예를 들어, 실온, 저온 또는 냉동보존으로 탈세포화된 태반 막을 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 탈세포화된 태반 막은 습식 또는 건조 상태로 저장될 수 있다. 저장된 탈세포화된 태반 막은 탈세포화된 태반 막의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.5 중량%(예를 들어, 약 0.01-5 중량%) 미만 또는 약 5-95 중량%의 수분 함량을 가질 수 있다. 방법은 물 대체제로 탈세포화된 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 물 대체제는 글리세롤(글리세린 USP), 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
방법은 탈세포화된 태반 막을 냉동 또는 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함할 수 있다. 탈세포화된 태반 막은 냉동-건조된 단편이 약 10, 5, 4, 3, 2, 1, 0.5 또는 0.1 중량% 미만의 평균 잔류 수분을 갖는 지점으로 냉동-건조될 수 있다.
방법은 하나 이상의 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 세제의 예로는 담즙산염 및/또는 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함하는 음이온 세제; 세틸 트리메틸-암모늄 브로마이드(CTAB)를 포함하는 양이온 세제 및 BRIJ®, TRITON® 및 CHAPS를 포함하는 비-이온성 또는 찌비터이온 세제를 포함한다.
방법은 하나 이상의 변성 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 변성 세제의 예로는 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 포함한다. 방법은 하나 이상의 비-변성 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 비-변성 세제의 예는 N-라우로일사르코시네이트, n-옥틸-b-D-글루코피라노시드, 폴리옥시에틸렌 알콜, 폴리옥시에틸렌 이소알콜, 폴리옥시에틸렌 p-t-옥틸 페놀, 폴리옥시에틸렌 노니페놀, 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 및 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르를 포함한다.
방법은 탈세포화된 태반 막이 기판 상에 고정되도록 세포를 제거하기 전에 기판 상에 탈세포화전 태반 막을 고정시키고, 고정된 탈세포화된 태반 막을 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다(도 6-8 참조). 탈세포화된 태반 막은 기판 상에 저장될 수 있다. 기판은 비제한적으로, 폴리머, 플라스틱, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 금속 및 목재를 포함하는 다양한 성분으로 제조될 수 있다. 기판은 각각 세포 제거 또는 저장을 위해 사용된 액체(예를 들어, 용액)에 노출된 탈세포화전 태반 막 또는 탈세포화된 태반 막의 표면적을 최대화시키기 위해 중공될 수 있다. 예를 들어, 기판은 프레임일 수 있다 (도 6-8 참조). 방법은 기판상에 고정된 탈세포화된 태반 막을 냉동, 냉동건조, 또는 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
방법은 분해 용액에서 탈세포화전 태반 막 또는 탈세포화된 태반 막을 분해하는 것을 포함하지 않을 수 있다. 본원에 기술된 분해 용액은 탈세포화전 태반 막의 단백질의 적어도 일부를 분해하기 위해 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 분해 용액은 산 예컨대, HCl 및 기타 강산 및 약산, 및 파파인, 펩신, 펩시노겐, 트립신, 콜라게나제, 및/또는 디스파제를 비제한적으로 포함하는 프로테아제를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "및/또는"은 관련 열거 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다.
본 발명은 또한 본 발명의 제조 방법에 따라 제조된 탈세포화된 태반 막을 제공한다.
본 발명은 또한 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화된 태반 막을 제공한다. 양막 층과 융모막 층은 융모막 층으로부터 양막 층의 분리 없이 태반 막으로부터 유래된다. 탈세포화된 태반 막의 양막 층은 상피, 기저막, 치밀 층, 섬유아세포 층 및/또는 해면 층을 포함할 수 있다. 탈세포화된 태반 막의 융모막 층은 세포 층, 망상 층, 위-기저막 및/또는 영양막 층을 포함할 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 태반 막은 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토킨(예를 들어, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 상피 성장 인자(EGF), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 태반 성장 인자(PIGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 대식세포 염증 단백질, 인터류킨, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP))을 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 중의 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토킨의 양과 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중의 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토킨의 양의 합보다 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30% 많은 양으로 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로 동일한 면적"은 대조군의 면적 예를 들어, 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 또는 융모막의 면적과 약 20, 15, 10, 5 또는 1% 미만으로 차이나는 탈세포화된 태반 막의 면적 예를 들어, 단면적을 나타낸다. 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 및 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막은 탈세포화된 태반 막을 제조하는데 사용된 양막 낭으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 태반 막은 하나 이상의 성장 인자 및/또는 사이토킨(예를 들어, 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 상피 성장 인자(EGF), 과립구-콜로니 자극 인자(GCSF), 태반 성장 인자(PIGF), 섬유아세포 성장 인자(FGF), 형질전환 성장 인자(TGF), 대식구 염증 단백질, 인터류킨, 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 및 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질(IGFBP))을 탈세포화전 태반 막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 적어도 약 1, 5, 10, 15, 20, 25 또는 30%인 양으로 포함할 수 있다.
본 발명의 탈세포화된 태반 막은 탈세포화된 태반 막의 건조 중량 mg 당 약 1000, 500, 100, 80, 50 또는 10 ng 미만의 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 포함할 수 있다. 탈세포화된 태반 막 중의 DNA 양은 탈세포화전 태반 막 중의 DNA 양과 비교하여 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99% 또는 그 초과; 약 60, 70, 80, 85, 90, 95, 99, 100% 또는 그 미만; 및/또는 약 50 내지 100%, 약 70 내지 100%, 약 90 내지 100%, 약 90 내지 95% 만큼 감소할 수 있다. 탈세포화된 태박 막은 탈세포화전 태반 막 중의 DNA의 약 50, 40, 30, 20, 10, 5 또는 1% 미만인 양으로 DNA를 포함할 수 있다.
본 발명은 태반-유래된 이식편을 추가로 제공한다. 태반-유래된 이식편은 본 발명의 탈세포화된 태반 막 및 하나 이상의 제제를 포함한다. 하나 이상의 제제는 이식편 이식에 적합한 임의의 제제일 수 있으며, 보존제, 물 대체제, 기타 연질 조직, 합성 물질, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
태반-유래된 이식편은 자가이식, 동종이식, 또는 이종이식일 수 있다.
예를 들어, 치수, 부피, 조성물 중 성분의 양, 농도, 처리 온도, 처리 시간, 수율, 유속, 압력 및 기타 값 및 이의 범위를 수식하는 본원에 사용된 바와 같은 용어 "약"은 예를 들어, 화합물, 조성물, 농축물 또는 사용 포뮬레이션을 제조하는데 사용된 전형적인 측정 및 처리 절차를 통해; 이들 절차의 부주의한 실수를 통해; 방법을 수행하는데 사용된 출발 물질 또는 성분의 매뉴팩쳐, 공급원 또는 순도에서의 차이를 통해; 및 기타 고려사항을 통해 발생할 수 있는 수치적 양의 변화를 나타낸다. 용어 "약"은 또한 예를 들어, 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물, 포뮬레이션 또는 세포 배양물의 노화로 인해 달라지는 양 및 특정 초기 농도 또는 혼합물을 갖는 조성물 또는 포뮬레이션을 혼합 또는 처리함으로 인해 달라지는 양을 포함한다. 용어 "약"에 의해 수식되든지, 본원에 첨부된 청구범위는 이들 양에 대해 등가인 값을 포함한다. 추가로, 용어 "약"은 언급된 참조 값과 유사한 값의 범위를 나타낼 수 있다. 특정 구체예에서, 용어 "약"은 언급된 참조 값의 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 퍼센트 또는 그 미만 내에 속하는 값의 범위를 나타낸다.
일부 구체예에서, 방법은 (i) C-절편으로부터 양막 낭과 함께 태반을 수집하는 단계, (ii) 태반으로부터 탈세포화전 태반 막을 포함하는 양막 낭을 절단하는 단계로서, 양막 층 및 융모막 층이 탈세포화 공정 전 및/또는 동안에 서로 접촉된채 유지되는 단계, 및/또는 (iii) 탈세포화 전에 탈세포화전 태반 막을 절단하는 단계를 추가로 포함한다. 추가의 구체예에서, 절단은 약 1000, 500, 300, 100, 50, 30 또는 10 cm2의 평균 크기 및/또는 평균 약 0.5, 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 mm 또는 그 초과의 치수를 갖도록 탈세포화전 태반 막 조각을 생성하였다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 또한 평균 약 1 mm 내지 약 60 cm, 약 1 mm 내지 약 50 cm, 약 1 cm 내지 약 60 cm, 약 1 cm 내지 약 50 cm, 또는 약 1 cm 내지 약 10 cm의 치수를 갖도록 탈세포화전 태반 막 또는 탈세포화된 태반 막을 절단하는 것을 포함할 수 있다. 더욱 추가의 구체예에서, 방법은 약 1000, 500 또는 100 미크론 미만의 평균 직경을 갖도록 양막 층 및 융모막 층을 균질화시키는 것을 배제한다.
일부 구체예에서, 태반-유래된 이식편은 하이드로겔일 수 있거나 없다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 하이드로겔은 이의 기술의 이해되는 의미를 가지며, 물을 흡수하여 팽창되고 다양한 탄성의 겔을 형성할 수 있는 폴리머 기질을 나타낸다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 (i) 탈세포화전 태반 막으로부터의 자연 가교 이외에 추가적인 가교, (ii) 탈세포화전 태반 막으로부터의 자연 담체 이외의 부가적인 담체 및/또는 (iii) 광활성제를 탈세포화된 태반 막 또는 태반-유래된 이식편에 첨가하는 것을 포함할 수 있거나 없다. 또 다른 양태에서, 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 하나 이상의 태반 막(들)으로부터의 자연 담체(들) 및 자연 크로스링커(들) 이외에 추가적인 담체 또는 크로스링커를 포함할 수 있거나 없다.
본원에 기술된 탈세포화전 태반 막은 예를 들어, 탈세포화전 태반 막을 수확하고/거나, 탈세포화전 태반 막을 냉동시키고/거나 냉동-건조시키기 전 또는 후에 탈세포화전 태반 막의 적어도 두 부분(예를 들어, 양막 층 및 융모막 층) 간의 물리적 및/또는 화학적 결합을 생성하도록 구성된 자연 발생 크로스링커를 포함할 수 있다. 화학 결합은 이온, 공유 및/또는 금속 결합을 포함할 수 있다. 예를 들어, 탈세포화전 태반 막의 자연 크로스링커는 탈세포화 전 또는 후에 화학적, 물리적 및/또는 온도 처리에 의해 물리적 및/또는 화학적 결합을 형성하도록 가교될 수 있다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 비-자연 발생 크로스링커를 사용한 비-자연 발생 결합에 의한 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편을 가교시키는 것을 포함할 수 없다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 본원에서 가교제로도 불리는 자연-발생적 크로스링커를 배제할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화된 태반 막은 비-자연 발생 크로스링커를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기술된 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 프로필렌 글리콜 알기네이트, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜)디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피오니미데이트(DTBP), 아크릴 아지드, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 비-자연 발생 크로스링커를 배제할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 크산텐 염료, 나프탈이미드 화합물, 리보플라빈-5-포스페이트, N-하이드록시피리딘-2-(1H)-티온, N-(20-에틸아미노에틸)-4-아미노-1,8-나프탈이미드, 비스-디아조피루브아미드 - N,N9-비스(3-디아조피루보일)-2,29-(에틸렌디옥시)비스-(에틸아민)(DPD), 디아조피루보일(DAP), 메틸렌 블루, 에리트로신, 플록심, 티오닌, 메틸렌 그린, 로즈 벵갈, 아크리딘 오렌지, 크산틴 염료, 티옥산틴 염료, 에틸 에오신, 에오신 Y 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 광활성제를 배제할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 탈세포화전 태반 막은 또한 자연 담체를 포함할 수 있다. 본원에 기재된 담체는 상처, 결함 및/또는 수술 부위에 주입되거나 이식되도록 삼차원 골격을 형성하도록 구성된다. 일부 구체예에서, 상처는 개방된 상처 또는 터널 상처일 수 있다. 자연 담체는 태반 막에서 자연 발생하는 담체이며, 예를 들어, 세포외 기질 예컨대, 콜라겐 및 히우론산 또는 엘라스틴을 포함한다. 일부 구체예에서, 탈세포화된 태반 막은 겔라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 가교된 또는 작용기화된 히알루로난-기반 콜라겐 및 알기네이트, 폴리우레탄, 폴리락트산, 또는 상기 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 조합물로 구성된 군으로부터 선택된 비-자연 발생 담체를 배제할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 또는 철의 염, 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC); 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 아크릴 아지드, 및 이들의 조합물을 배제할 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 태반 막으로부터의 자연 담체(들) 이외에 추가적인 크로스링커를 포함하지 않는다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 태반 막으로부터의 자연 담체(들) 이외에 추가적인 담체를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기술된 탈세포화된 태박 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 알기네이트, 프로필렌 글리콜 알기네이트, 자연 또는 가교된 키토산, 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 저급 메톡실펙틴, 또는 카라기난을 포함하지 않을 수 있다.
탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 담체 용액을 포함할 수 있거나 없다. 담체 용액은 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 또는 철의 염; 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC); 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP), 또는 아크릴 아지드를 포함할 수 있다. 담체 용액은 또한, 태반 막으로부터의 자연 담체(들) 외에 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 히알루로난-기반 콜라겐 및 알기네이트의 가교결합 또는 작용기(cross-linkage or functionalization), 폴리우레탄, 폴리락트산, 또는 상기 폴리머 중 적어도 하나를 포함하는 조합물을 포함하는 군으로부터 선택된 자연 및/또는 합성 폴리머를 포함할 수 있다. 추가 구체예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 탈세포화된 태박 막 및/또는 태반-유래된 이식편은 태반 막으로부터의 자연 담체(들) 외에 임의의 담체를 포함할 수 있거나 없으며, 담체는 자연 콜라겐, 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 알기네이트, 게니핀, 키토산, 전분, 글루코스 또는 리보스, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 저급 메톡실 펙틴, 카라기난, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다. 또한, 추가 구체예에서, 본원에 기재된 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 기질은 태반 막으로부터의 자연 크로스링커(들) 외에 크로스링커를 포함할 수 있거나 없으며, 이때 크로스링커는 알기네이트, 전분, 셀룰로스 및 이의 유도체(예컨대, 셀룰로스 아세테이트, 카르복시메틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스), 크산탄 검, 덱스트란, 카라기난, 게니핀, 히알루론산, 콘드로이틴 설페이트, 로커스트 빈 검, 트래거칸트 검, 아라비아 검, 커들란, 풀루란, 스클레로글루칸, 및 저급 메톡실펙틴, 글루코스 또는 리보스, 자연 콜라겐, 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 키토산, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택된다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 태반-유래된 이식편은 탈세포화된 태반 막을 필수적으로 포함하여 구성되고/거나 이로 구성된다. 용어 "~을 필수적으로 포함하여 구성되는"은 요소 또는 제제 없이 태반-유래된 이식편의 단백질 조성 및/또는 겔화에 실질적으로 영향을 미치지 않는 추가의 요소 또는 제제를 포함하는 것으로 이식편의 범위를 규정한다. 예를 들어, 탈세포화된 태반 막을 필수적으로 포함하여 구성되는 태반-유래된 이식편은 탈세포화된 태반 막으로 구성된 태반-유래된 이식편의 겔화 및/또는 단백질 조성물에 실질적으로 영향을 미치지 않는, 탈세포화된 태반 막 이외의 요소를 포함할 수 있다. 본원에서 단백질 조성물에 실질적으로 영향을 미친다는 것은 단백질 조성을 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 또는 40% 만큼 변화시킨다는 것을 의미한다. 본원에서 이식편의 겔화에 실질적으로 영향을 미친다는 것은 이식편의 점도를 적어도 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 또는 40% 만큼 변화시킨다는 것을 의미한다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 하나 이상의 처리 용액으로 탈세포화전 태반 막, 탈세포화된 태반 막, 및/또는 태반-유래된 이식편을 처리하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 방법은 이식 전 냉동 및/또는 냉동 건조 후 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편을 하나 이상의 처리 용액으로 처리하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 처리 용액은 이온성, 효소적, 또는 화학적 가교제, 광활성제, 폴리머 또는 이들의 조합물을 포함한다. 이온성 가교제는 칼슘, 바륨, 알루미늄, 스트론튬, 구리, 아연, 마그네슘, 망간, 코발트, 및 철로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 효소적 가교제는 트랜스글루타미나제, 에틸렌디아민, 리실 옥시다제 패밀리, 헥사메틸렌 디이소시아네이트(HMDIC), 디메틸 수베르이미데이트(DMS), 및 디메틸-3-3'-디티오비스프로피온이미데이트(DTBP)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 화학적 가교제는 글루타르알데하이드, 글리세르알데하이드, 게니핀, 글루코스 또는 리보스, 폴리(에틸렌 글리콜) 디에폭사이드 크로스링커, 폴리(에틸렌 글리콜) 디글리시딜 에테르, EDC 및 NHS, 및 아크릴 아지드로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함한다. 폴리머는 자연 또는 변형된 콜라겐, 젤라틴, 아가로스, 변형된 히알루론산, 피브린, 키틴, 비오틴, 아비딘, 탈광물화된 골 기질, MATRIGEL®, 프로테오글리칸, 라미닌, 피브로넥틴, 엘라스틴, 헤파린, 글리세롤, 수크로스 옥타설페이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리우레탄, 아크릴로일모르폴린, N,N-디메틸 아크릴아미드, N-비닐 피롤리돈 및 테트라하이드로푸르푸릴 메타크릴레이트, 하이드록시아파타이트, 폴리우레탄, 및 폴리락트산으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기술된 방법은 또한 탈세포화전 태반 막, 탈세포화된 태반 막 및/또는 태반-유래된 이식편에 하나 이상의 생리활성 보충제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 하나 이상의 생리활성 보충제(들)는 FGF 패밀리, TGF-패밀리, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh, 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS, 또는 아스코르베이트의 성장 또는 분화 인자로 구성된 군으로부터 선택된다. 생리활성 보충제는 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제 또는 항-염증제일 수 있다. 성장 또는 분화 인자는 예를 들어, FGF-패밀리 또는 TGF-패밀리의 성장 인자, IGF-1, PDGF, EGF, VEGF, HGF, PTHrP, Ihh(인디안 헤지호그 호몰로지(Indian Hedgehog Homolog)), 덱사메타손, 인슐린, 트랜스페린, 셀레늄, ITS 보충물, 아스코르베이트, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 사이토킨은 GM-CSF, G-CSF, TNF-α, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, SLP1, MCP1, MIP-1α, MIP-2, IL-18, 안지오포이에틴, KGF, 엔도텔린, IFN-α, 또는 IFN-β를 포함할 수 있다. 항염증제의 예는 IL-1βR 항체, TNF-α 수용체 길항제, 사이클로옥시게나제-2 특이적 억제제, MAP 키나제 억제제, NO 신타제 억제제, NF-κB 억제제, 또는 MMP의 억제제를 포함할 수 있다. 다양한 섬유아세포 성장 인자가 존재한다. 예로서, 인간 FGF-패밀리는 FGF-1 내지 FGF-23의 22개의 구성원을 포함한다. (FGF-15는 인간 FGF-19의 마우스 오솔로그이기 때문에 인간 FGF-15는 없다). TGF-패밀리의 구성원의 예는 TGF-α 및 TGF-β 슈퍼패밀리를 포함할 수 있다. TGF-β 슈퍼패밀리는 TGF-β (예컨대, TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3), 액티빈, 인히빈, 골 형태발생 인자(bone morphogenic factor: BMP), 변형된 BMP, 항-뮬러리안 호르몬(AMH), 마이오스타틴 및 기타를 포함한다. BMP의 20개 아이소타입이 존재한다. 이들은, 예를 들어, (1) BMP2 및 BMP4; (2) BMP3 및 BMP3B (성장/분화 인자 10 (GDF10)으로도 알려짐); (3) BMP 5, 6, 7 및 8; 및 (4) GDF 5, 6, 및 7의 4개의 서브패밀리로 분류될 수 있다. 추가적인 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 탈광물화된 골 기질, 기저막, 또는 점막하 기질을 포함하는 조직으로부터 추출된 하나 이상의 생리활성 보충제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 방법은 또한 산소-라디칼-유발 손상 항산화제로부터 생리활성 성분을 보호하기 위해 예를 들어, 소듐 니트로프루시드, 연골 기질 글리코단백질(CMGP), 비타민 C, 비타민 E, 셀레늄, N-아세틸시스테인(NAC) 에스트라디올, 글루타티온, 멜라토닌, 레스베라트롤, 플라보노이드, 카로텐, 아미노글루아니딘, 또는 리코펜을 포함하는 하나 이상의 항산화제를 첨가함을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본원에 기재된 방법은 또한 탈세포화전 태반 막, 탈세포화된 태반 막, 및/또는 태반-유래된 이식편에 대한 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 지니는 하나 이상의 제제(들)를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 지니는 제제는 히알루로난, 헤파린, 헤파린 설페이트, 케라틴 설페이트, 데르마탄 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 베타글리칸, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 신데칸, 바이글리칸, 또는 데코린을 포함할 수 있다. 추가적인 구체예에서, 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 지니는 제제(들)는 탈세포화전 태반 막, 탈세포화된 태반 막, 및/또는 태반-유래된 이식편에 대한 성장 인자, 분화 인자, 사이토킨, 항-미생물제, 또는 항염증제의 친화성을 증가시킨다.
일부 구체예에서, 태반-유래된 이식편 중의 탈세포화된 태반 막의 중량%는 태반-유래된 이식편의 총 중량을 기준으로 하여 건조 상태로 약 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 92, 94, 96, 98, 100% 또는 그 초과이다. 추가의 구체예에서, 태반-유래된 이식편의 탈세포화된 태반 막의 중량%는 태반-유래된 이식편의 총 중량을 기준으로 하여 건조 상태로 약 3, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 91, 93, 95, 97, 99, 100% 또는 그 미만이다. 추가의 구체예에서, 태반-유래된 이식편의 탈세포화된 태반 막의 중량%는 태반-유래된 이식편의 총 중량을 기준으로 하여 건조 상태로 약 2% 내지 약 100%, 약 50% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 80%, 60% 내지 100%, 80% 내지 약 100%, 또는 약 90% 내지 약 100%이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 분리되어 있거나 접촉되어 있는 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화된 태반 막을 포함하는 태반-유래된 이식편에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 태반-유래된 이식편에 관한 것이다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 태반-유래된 이식편을 포함하는 스캐폴드에 관한 것이다. 스캐폴드는 생체내에서 이식되도록 구성된 스캐폴드인 임플란트를 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 탈세포화된 태반 막은 양막 층 및 융모막 층이 접촉된 채 유지되는 영역(들)에서 탈세포화전 태반 막으로부터 약 1, 5, 10, 15, 20, 25. 30, 40, 50, 60, 70, 또는 80% 미만의 PDGF 및/또는 bFGF를 제거함으로써 생성된다. 일부 구체예에서, PDGF 및/또는 bFGF의 농도는 양막 층 및 융모막 층이 접촉된 채 유지되는 영역(들)에서 각각 탈세포화전 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 98, 또는 99%의 초기 농도의 PDGF 및/또는 bFGF를 유지한다. 일부 구체예에서, 탈세포화된 태반 막 중의 PDGF 및/또는 bFGF의 수준은 탈세포화 후 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 및 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중 PDGF 및/또는 bFGF의 수준의 합보다 적어도 약 10% 내지 300%, 10% 내지 200%, 10% - 150%, 또는 10% - 100% 더 크다. 추가의 구체예에서, 본원에 기재된 태반-유래된 이식편은 타입 I 콜라겐, 타입 IV 콜라겐, 라미닌 감마-1, 피브로넥틴, 융모 소마토맘모트로핀, FGF-12, FGF-13, IGF-2, EGFL-7, PDGF-AA, EGF, PIGF, GCSF 및 bFGF를 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래된 이식편 중 타입 I 콜라겐의 농도는 이식편의 총 중량을 기준으로 하여 약 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45% 또는 그 초과; 약 20, 25, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45% 또는 그 미만; 및/또는 약 20 내지 50%, 25 내지 45%, 30 내지 40%, 또는 33 내지 38%이다.
본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 몸체 전반에 걸쳐 발견된 ECM 단백질 및 당단백질이 풍부할 수 있으며, 이는 주요 세포 사건 예컨대, 세포 이동, 부착, 분화, 증식 및 생존을 유발하는데 필수적인 역할을 담당한다. 태반-유래된 이식편에 존재하는 단백질 예컨대, 콜라겐 IV, 인간 기저막에서 발견된 가장 일반적인 유형의 콜라겐, 라미닌, 피브로넥틴, 및 프로테오글리칸(예를 들어, 헤파란 설페이트)은 세포를 지지하고, 세포를 하부의 콜라겐성 기질에 결합시키고, 중간엽/하부 결합 조직으로부터 상피를 분리할 수 있는 인장 강도를 기저막에 제공할 수 있다. 일부 구체예에서, 탈세포화된 태반 막은 탈세포화전 태반 막보다 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100% 또는 그 초과의 다공성을 갖는다. 한 양태에서, 동결건조되거나, 탈수되거나 냉동-건조된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막은 0.001 내지 0.1mg/mm2, 0.005 내지 0.1mg/mm2, 또는 0.01 내지 0.1mg/mm2 범위의 밀도를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 동결건조되거나, 탈수되거나 냉동-건조된 태반-유래된 이식편은 0.005 내지 0.2mg/mm3, 0.01 내지 0.2mg/mm3, 0.05 내지 0.2mg/mm3, 또는 0.05 내지 0.15mg/mm3 범위의 밀도를 갖는다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 존재하에 세포를 배양시키는 것을 포함하는 세포 배양 방법에 관한 것이다. 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막은 2-차원 또는 3-차원 스캐폴드를 제공할 수 있다. 배양된 세포는 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막에 있을 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 세포 배양은 일반적으로 시험관내 환경으로 지칭되는 인공 환경에서의 세포 유지를 나타낸다. 용어 세포 배양은 일반적인 용어이며, 개별 세포뿐만 아니라 조직, 기관, 기관계 또는 전체 유기체의 배양을 포함하도록 사용될 수 있다. 본원에 기술된 배양 방법에 사용되는 세포는 임의의 원핵 세포 또는 진핵 세포일 수 있다. 본원에서 기술되는 배양 방법에 사용되는 세포 유형은 세포 지지체 조성물이 유래하는 동일한 종으로부터 유래될 필요는 없다. 또한, 세포는 확립된 세포주로부터 유래 될 수 있거나, 일차 세포 또는 유전자 조작된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 후근신경절 세포, 췌장 베타 섬 세포, 심근세포, 간세포, iPSC, 암세포, 및 제대 정맥 내피 세포로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상의 또는 내의 세포 성장 및/또는 배양을 제공한다. "본원에 기술된 태반-유래된 이식편 상의 또는 내의 세포 성장 및/또는 배양"은 자연 또는 합성 생체적합성 기질 또는 조직과 같은 임의의 환경에서 본원에 기술된 태반-유래된 이식편의 표면 상에 배치하는 것뿐만 아니라 전통적인 세포 배양 방법을 포함한다. 세포는 포유동물, 예컨대 사람, 소, 돼지, 쥣과동물, 양, 말, 개, 고양이 및 기타일 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다. 일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에 배양되는 세포는 줄기 세포이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 줄기 세포는 당업계에서와 같이 사용되고, 분열하여 적어도 부분적으로 분화될 수 있는 하나의 딸 세포 및 모세포의 발달 가능성을 보유한 또 다른 딸 세포를 발생시킬 수 있는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 줄기 세포는 지방 유래 줄기 세포, 치과용 줄기 세포, 성체 줄기 세포(ASC), 배아 줄기 세포(ESC), 조직-특이적 전구 세포 및/또는 유도 만능성 줄기 세포(iPSC)일 수 있다. ASC는 비제한적으로, 조혈 줄기 세포, 유방 줄기 세포, 장 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포, 내피 줄기 세포, 신경 줄기 세포, 후각 성체 줄기 세포, 신경관 줄기 세포 및 고환 세포를 포함 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 배양된 줄기 세포에서 골형성, 연골형성 또는 인대/힘줄 기원과 같은 분화 유지 또는 촉진을 증가시키기 위한, 뿐만 아니라 세포 성장 및 증식을 지지하기 위한 시험관내 방법에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에 배양된 세포는 심근세포, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 유도 만능성 줄기 세포(iPSC), 간세포, 조골세포, 연골세포, 후근 신경절(DRG) 세포, 중간엽 줄기 세포, 지방-유래 줄기 세포, 배아 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 비분화 세포 및/또는 -만능성 줄기 세포일 수 있다. 적합한 세포는 또한 외배엽 계통의 세포, 중배엽 계통의 세포 및 내배엽 계통의 세포를 포함할 수 있지만, 이로 제한되는 것은 아니다. 외배엽 계통의 세포의 예는 각질형성세포, 뉴런을 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 중배엽 계통의 세포의 예는 근육 아세포, 지방 세포, 섬유아세포, 내피 세포, 골모세포, 연골 세포 또는 간질 세포를 포함하나 이로 제한되는 것은 아니다. 내배엽 계통의 세포의 예는 청각관, 호흡기, 예컨대 기관(trachea), 기관지, 및 폐의 폐포, 위장관, 요로 방광의 상피 세포 및 모든 땀샘 내막의 상피 세포를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 세포는 조직 또는 기관으로부터 유래된 일차 세포일 수 있다. 본 발명에 사용되는 적합한 세포주는 간질 세포주, 전골모세포 세포주, 조골 세포주 및 연골 세포주를 포함할 수 있지만 이로 제한되는 것은 아니다.
일부 구체예에서, 세포는 자가 또는 동종 기원으로부터 유래될 수 있다. 세포는 연골 세포, 골모세포, 파골 세포, 내피 세포, 상피 세포, 섬유아세포 및 골막 세포를 포함하는 분화된 세포일 수 있다. 추가로, 세포는 전능, 만능, 다능, 전구 세포, 조직-특이적 전구 세포, 또는 성체 체세포 줄기 세포일 수 있다. 줄기 세포는 배아, 태반, 골수, 지방 조직, 혈관, 양수, 활액, 활막, 심장 막, 골막, 경질, 말초 혈액, 제대혈, 태반막, 월경혈, 치아, 수핵, 뇌, 신생아 포피, 피부, 모낭, 장내 담낭, 신경 조직, 간, 췌장, 또는 근육으로부터 유래될 수 있다. 세포는 골격근, 평활근, 및 심근으로부터 유래될 수 있다. 줄기 세포는 유도된 만능성 줄기 세포 (iPSC)와 같은 성숙한 세포의 유전자 재프로그래밍(genetic reprogramming)으로부터 유래될 수 있다. 모든 세포는 추가로 살아 있거나 최근에 사망한 공여체로부터 추가로 유래될 수 있다.
본원에서 기술된 임의의 세포는 특정 구체예에서 약 15분 내지 약 1년, 약 15분 내지 약 6개월, 약 15분 내지 약 3개월, 약 15분 내지 약 4주, 약 2시간 내지 약 2주, 약 2시간 내지 약 1주, 약 2시간 내지 약 72시간, 약 24시간 내지 약 72시간, 또는 약 24시간 내지 약 96시간 동안, 약 20℃ 내지 약 40℃ 또는 약 30℃ 내지 약 37℃에서, 약 1% CO2 내지 약 10% CO2 또는 약 4% CO2 내지 약 6% CO2를 함유하는 분위기 하에 본원에서 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에서 배양될 수 있다. 본 발명의 일부 구체예에서, 세포는 본원에서 기술된 하나 이상의 성장 인자 및 (1) 조직 또는 기관, (2) 기질, 또는 (3) 이들의 조합의 존재 하에 또는 부재 하에 배양될 수 있다. 세포 배양 배지에서 본원에서 기술된 하나 이상의 성장 인자의 존재 하에 또는 부재 하에 배양된 세포는 이후 특정 구체예에서, 기질, 조직, 기관 또는 이들의 조합물에 적용될 수 있다.
세포 배양 방법은 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에 세포를 저장하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 태반-유래된 이식편 상에 또는 내의 세포는 실온 (즉, 약 24℃), 약 4℃, 약 -20℃에서 또는 냉동보존으로 저장된다. 기타 구체예에서, 태반-유래된 이식편 상의 또는 내의 세포는 약 -200, -180, -100, -50, -45, -40, -35, -30, -25, -20, -10, -5, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 36, 37, 38, 또는 39℃ 내지 약 -150, -140, -130, -90, -40, -35, -30, -25, -20, -15, -10, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 25, 30, 35, 36, 37, 38, 또는 40℃의 온도에서 저장된다. 기타 구체예에서, 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상의 또는 내의 세포는 약 -200 내지 50℃, 약 -160 내지 36℃, 약 -160 내지 25℃, 약 -160 내지 5℃, 약 -5 내지 23℃, 약 0 내지 30℃, 또는 약 15 내지 40℃의 온도에서 저장된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 줄기 세포(예를 들어, 만능성 줄기 세포) 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 본원에 기술된 방법에 의해 제조된 유효량의 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 존재하에 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 줄기 세포(예를 들어, 만능성 줄기 세포) 또는 조직-특이적 전구 세포는 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에 존재할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포(예를 들어, 만능성 줄기 세포) 또는 조직-특이적 전구 세포는 골모세포, 연골세포, 심근세포, 췌장 세포, 신경 세포, 인대 또는 힘줄로 분화될 수 있다. 일부 구체예에서, 조직-특이적 전구 세포는 성장 인자를 첨가하지 않으면서 관심 조직으로 분화된다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한, 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 혈관, 근육성 또는 신경성 분화를 촉진하는 방법에 관한 것이며, 본 방법은 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에서 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 조직-특이적 전구 세포에서 줄기능(즉, 확장된 배양을 통해 특정 조직으로 증식 및/또는 분화하는 능력)의 유지 및/또는 조직-특이적 전구 세포의 자가-재생 능력을 확장시키기 위한 시험관내 방법에 사용될 수 있으며, 방법은 선택적으로, 세포의 유지를 유도하기 위해 성장 인자 또는 또 다른 2차 인자를 첨가하지 않으면서, 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 또한 세포의 분화를 유도하기 위해 추가의 성장 인자 또는 또 다른 2차 인자를 첨가하지 않으면서 만능성 줄기 세포의 분화를 촉진하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 사용될 수 있다. 기타 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 또한 세포의 유지 또는 분화를 유도하기 위해 하나 이상의 성장 인자 또는 기타 2차 인자의 추가와 만능성 줄기 세포 및/또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진하기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 사용될 수 있다. 추가의 구체예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편은 또한 만능성 줄기 세포 및/또는 조직-특이적 전구 세포의 분화 촉진에서 세포의 유지 또는 분화를 유도하기 위해 하나 이상의 성장 인자 또는 기타 2차 인자의 효과를 향상시키기 위한 시험관내 또는 생체내 방법에 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명은 또한 골유도성(osteoinductivity)을 촉진시키는 방법으로서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "골유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 골모 세포와 유사한 세포 또는 골막 세포와 더욱 유사한 세포로 분화되도록 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 골모 세포, 골막 세포, 또는 이 둘 모두의 증식을 증대시키는 것을 나타낼 수 있다. 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 태반-유래된 이식편의 골유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
한 양태에서, 본 발명은 또한 유효량의 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막으로 결함 부위를 덮거나 이와 접촉시키는 것을 포함하는 조직 내 또는 상에서 결함을 수복시키는 방법에 관한 것이다. 수복 방법은 결함 부위 상에 본원에 기술된 태반-유래된 이식편을 이식하는 것을 포함할 수 있다. 결함이 있는 조직은 골 조직, 연골, 연 조직, 척수, 경막, 막 및 점막일 수 있다. 결함이 있는 연조직의 예는 힘줄, 인대, 진피, 피부, 성대, 신경, 방광, 질, 요도, 심장, 피하 조직, 근막, 유방, 근육, 태반막, 태반, 및 회전근개를 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 결함이 있는 조직은 근골격계, 소화계, 심혈관계, 호흡계, 비뇨기계, 생식계, 신경계, 및/또는 면역계에 있을 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 이식 전에 태반-유래된 이식편의 재수화를 배제하여 상기 태반-유래된 이식편이 원위치에서 혈액, 체액 및/또는 자가 세포를 흡수하도록 한다. 대안적으로, 태반-유래된 이식편의 인간 또는 동물로의 이식은 태반-유래된 이식편을 재수화 용액으로 재수화시키고; 임의로 바이탈 세포를 태반-유래된 이식편 상에 시딩하여 태반-유래된 이식편에 생기를 부여하고; 임의로 이식 전에 세포-시딩된 태반-유래된 이식편을 배양하고; 태반-유래된 이식편을 결함부에 이식함으로써 수행될 수 있다. 일부 구체예에서, 재수화 용액은 혈액 또는 골수 흡입액, 혈소판 풍부 혈장, 뇌척수액, 활액, 효소, 생리활성 보충제, 자연 폴리머, 합성 폴리머, 광활성제, 항산화제, 가교제, 항미생물제, 바이탈 세포, 및 생리활성 보충제 결합 부위(들)를 갖는 하나 이상의 제제로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 추가의 구체예에서, 바이탈 세포는 자가이식 또는 동종이식 골수 흡입물로부터의 세포; 골수로부터의 간질 세포; 지방, 윤활막, 골막, 연골막, 근육, 진피, 제대혈, 태반, 태반막, 및 바르톤 젤리로부터의 간질 세포; 및 혈관주위세포로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함한다. 본 발명은 또한, 결함 부위에 본원에 기술된 태반-유래된 이식편을 위치시키는 것을 포함하는, 세포 혈관형성, 지혈, 생체적합성, 감염 내성, 항-염증, 항-흉터, 부착, 증식을 촉진하거나, 분화된 상태를 유지시키거나 본원에 기술된 골모세포, 연골세포, 인대 세포, 힘줄 세포, 섬유아세포, 지방세포, 및/또는 임의의 세포 타입의 탈-분화를 방지하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 연골유도성(chondroinductivity)을 촉진하는 방법으로서, 유효량의 본원에서 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "연골유도성"은 세포가 표현형에서 더욱 연골 세포와 유사한 세포로 분화되게 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 연골 세포의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 연골유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 인대/힘줄 분화를 촉진시키는 방법으로서, 유효량의 본원에서 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다. 본원에서 사용되는 "인대/힘줄 분화"는 세포가 표현형에서 더욱 인대 및/또는 힘줄과 유사한 세포로 분화되게 하는 것을 나타내거나, 이 용어는 인대 및/또는 힘줄의 증식을 증대시키는 것을 나타내거나, 둘 모두를 나타낼 수 있다. 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 배양하기 전에 세포는, 비분화되거나 부분적으로 분화된 세포일 수 있다. 세포는 배양물에 또는 조직, 기관 또는 이의 일부에, 또는 유기체에 존재할 수 있다. 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 인대/힘줄 분화 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 증가된 활성을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
골유도성, 연골유도성, 또는 인대/힘줄 분화를 각각 평가하기 위해 측정될 수 있는 다양한 골모세포, 연골세포, 인대/힘줄 분화 마커가 존재한다. 예를 들어, 세포는 골모세포 계통 쪽으로의 분화의 초기 단계 동안 알칼리 포스파타제를 발현시킨다. 따라서, 시험관내 알칼리 포스파타제 검정은 유효량의 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 존재하에 배양된 세포에서의 골유도성을 평가하는데 사용될 수 있다. 그 밖의 비-골 형성 세포, 예를 들어, 근아세포(C2C12 세포)에서 알칼리 포스파타제 발현을 자극시키거나 유도하는 태반-유래된 이식편의 능력은 태반-유래된 이식편이 골유도 활성을 가짐을 나타낼 것이다. 이러한 검정에서, 태반-유래된 이식편 상에 또는 내에 그리고 대조군 표면 상에서 배양된 세포는 비-골 형성 세포 상의 기준선 알칼리 포스파타제 발현을 보여주기 위한 음성 대조군으로서 사용된다. 음성 대조군에서 골모세포성 마커의 기준선은 0(zero)일 필요는 없는데, 이는 음성 대조군에서의 세포가 적어도 어느 수준의 표현형 마커(들)를 가질 수 있음을 의미한다. 따라서, 태반-유래된 이식편의 "골유도성" 표면은 단순하게 실험 세포에서 골모세포 마커의 증가를 야기시킬 것이다. 유사하게, 몇 가지만 예를 들면, 타입 X 콜라겐, 타입 II 콜라겐, Sox 9, 아그레칸(Aggrecan), 마트릴린(Matrilin)-1 및 CEP-68을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 연골세포 마커는 연골유도 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다. 또한, 스클레락시스(scleraxis)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 인대/힘줄 마커는 인대/힘줄 분화 가능성을 평가하는데 사용될 수 있다.
또한, 골유도성, 연골유도성, 및 인대/힘줄 분화는 일차 세포, 세포주, 또는 외식편과 같은 배양된 세포에서, 골모세포 표현형, 연골세포 표현형, 인대/힘줄 세포 표현형을 분화시키거나 유도하는 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 능력을 조사함으로써 조직 배양물에서 결정될 수 있다. 예를 들어, 세포는 알칼리 포스파타제, 등과 같은, 골모세포에 대해 특징적인 마커의 증가된 생성을 나타낼 수 있다. 예를 들어, 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 골유도, 연골유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조군보다 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10배 넘게 더 클 수 있다. 또 다른 예에서, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 골유도, 연골유도, 인대/힘줄 분화 가능성은 대조군 스캐폴드의 가능성보다 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 500 또는 심지어 1000배 넘게 더 클 수 있다.
근육과 같은 위치에서 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막에 의해 유도된 골, 연골, 인대 또는 힘줄 형성 가능성을 평가하기 위한, 골유도성, 연골유도성, 인대/힘줄 분화는 또한, 적합한 동물 모델을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 설치류에 근육내 이식은 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 골유도 활성을 평가하기 위한 모델로서 사용되었다.
본 발명은 또한, 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 존재하에 세포를 배양시키는 것을 포함하는 방법을 이용하여, 세포 혈관형성, 지혈, 생체적합성, 감염 내성, 항-염증, 항-흉터, 부착, 증식을 촉진하거나, 분화된 상태를 유지시키거나 본원에 기술된 골모세포, 연골세포, 인대 세포, 힘줄 세포, 섬유아세포, 지방세포, 및/또는 임의의 세포 타입의 탈-분화를 방지하는 방법에 관한 것이다. 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 증식 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 본 발명은 추가로 지방세포, 섬유아세포, 상피세포 및/또는 혈관 내피세포의 지방 조직 형성을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 혈관형성, 지혈 기능, 생체적합성, 항-흉터 작용, 항-염증 및/또는 감염 내성을 증가시키거나 촉진하는 방법에 관한 것이다.
미토겐성(mitogenicity)은 MTT [3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드 검정, alamarBlue® 검정, 등과 같은 대사 활성을 측정하는 다양한 시험관내 검정을 이용하여 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막에 의해 유도된 세포 증식을 조사함으로써 평가될 수 있다. alamarBlue® 검정은 세포 대사 활성을 측정하기 위한 비-세포독성 환원-산화 지시제를 사용하며, 이는 본원에 기술된 태반-유래된 이식편의 미토겐 활성을 평가하기 위한 비파괴적 검정이 되게한다. 증식은 또한, DNA 정량화를 측정함으로써, 예를 들어, PicoGreen™ DNA 검정, DNA 합성의 방사성 라벨링, 예를 들어, [3H]티미딘 라벨링 또는 BrdU 도입을 이용함으로써 평가될 수 있다. 증식은 또한, 수동 세포 계수를 통해, 예컨대, 트리판 블루로 세포를 염색하고, 혈구계로 계수함으로써 평가될 수 있다.
본 발명은 또한, 세포에서 골 형성, 연골 형성, 또는 인대/힘줄 형성을 증가시키거나 촉진시키는 방법에 관한 것이다. 본 방법은 본원에 기술된 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막 상에 또는 내에 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "골 형성"은 막내 골 형성 및 연골내 골 형성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는, 새로운 골 물질의 침적 또는 새로운 골의 형성이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "연골 형성"은 새로운 연골 물질의 침적 또는 새로운 연골의 형성이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "인대/힘줄 형성"은 새로운 인대 및/또는 힘줄 물질의 침적 또는 새로운 인대 및/또는 힘줄의 형성이다. 태반-유래된 이식편 또는 탈세포화된 태반 막의 골형성, 연골형성, 인대, 또는 힘줄 유도 활성은 변경되거나 변경되지 않을 수 있으며, 이러한 변경은 대조군 표면에 비해 향상된 활성을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 세포는 골, 연골, 인대, 또는 힘줄 형성이 요망되는 임의의 조직, 예를 들어, 비제한적으로, 골, 연골, 인대, 근육, 힘줄, 등에서의 세포를 포함할 수 있다.
실시예 1. 회수 후 탈세포화전 태반 막의 준비
제왕 절개 후 기증자의 합의 하에 인간 장기 태반 및 양막 낭을 수득하고, 무균 상태 하에 가공 시설로 옮겼다.
양막 층 및 융모막 층 둘 모두를 갖는 태반 막을 포함하는 양막 낭을 태반 스커트 주위로 절단하고 염수 또는 락테이트화된 링거(Lactated Ringer)와 같은 등장성 용액으로 적어도 3회 헹궈 느슨하게 결합된 혈액을 제거하였다. 접촉된 양막 층과 융모막 층 둘 모두를 갖는 헹군 태반 막을 양막 상피 층이 위로 향하게 하여 멸균 보드 위에 놓았다. 상이한 크기 및 형상의 메쉬 프레임을 태반 막 위에 놓았다. 태반 막을 매칭되는 프레임의 크기 및 형상에 맞춰 상이한 크기 및 형상으로 절단하였다. 양막 층 및 융모막 층 둘 모두를 갖는 태반 막의 각 조각을 봉합 또는 클립을 사용하여 메쉬 프레임과 고정시켰다(도 1). 제조된 태반 막 조각을 무균 용기에 평평하게 놓고 추가의 처리까지 -20℃ 또는 -80℃ 냉동기에 저장하였다. 이에 따라, 탈세포화전 태반 막을 준비하였다.
실시예 2. 탈세포화전 태반 막으로부터의 세포 제거 - 탈세포화
방법 1: 프레임과 함께 다양한 태반 막 조각을 주변 온도에서 해동시키고, 무균 칭량하고, 별도의 멸균 플라스크에 넣었다. 태반 막 조각을 교반하면서 3회 각 5분 등장성 염수로 헹구고, 이어서 멸균 흡수 타월로 조직을 닦아내고 다시 멸균 플라스크에 넣었다. 트리스 완충액 중 소듐 라우로일 사르코시네이트 및 DNA아제를 함유하는 제조된 탈활 용액을 조직의 중량에 따라 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 주변 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 탈활 용액을 제거하고, 태반 막을 멸균 흡수 타월로 닦아 과량의 유체를 제거하였다. 태반 막 조각을 플라크스에 다시 넣고 1시간 동안 등장성 염수로 헹구고, 이어서 교반하면서 2회 더 각 1시간 염수로 헹구었다. 염수로 헹군 후, 태반 막 조각을 교반하면서 3회 각 15분 멸균 초순수 물로 헹구었다(도 2의 항목 A).
방법 2: 프레임과 함께 다양한 태반 막 조각을 주변 온도에서 해동시키고, 무균 칭량하고, 별도의 멸균 플라스크에 넣었다. 태반 막 조각을 주변 온도에서 교반하면서 트리스-HCl 및 NH4Cl을 함유하는 적혈구 세포 용해 완충액으로 15분 동안 헹구고, 이어서 교반하면서 3회 각 5분 등장성 염수로 헹구었다. 트리스 완충액 중 소듐 라우로일 사르코시네이트 및 DNA아제를 함유하는 제조된 탈활 용액을 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 주변 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 탈활 용액을 제거하고, 태반 막을 멸균 흡수 타월로 닦아 과량의 유체를 제거하였다. 태반 막 조각을 플라크스에 다시 넣고 1시간 동안 등장성 염수로 헹구고, 이어서 교반하면서 밤새 또 다른 염수로 헹궜다. 염수로 헹군 후, 태반 막 조각을 교반하면서 3회 각 15분 동안 멸균 초순수 물로 헹구었다.
방법 1 또는 방법 2로 제조된 탈세포화된 태반 막을 멸균 용기에 넣고 48-96시간 동안 냉동-건조시켰다(도 2의 항목 B).
실시예 3. 탈세포화된 태반 막의 특성 규명
탈세포화된 태반 막 조각을 실시예 1 및 실시예 2에 기술된 처리 단계에 따라 제조하였다. 대표적인 샘플을 하기 특성 규명을 위해 탈세포화전 또는 탈세포화된 태반 막으로부터 펀칭하였다.
탈세포화된 태반 막의 조직학: 세척 및 탈세포화 처리되거나 그렇지 않은 탈세포화전 태반 막으로부터의 대표적인 샘플을 10% 중성 완충된 포르말린에 고정시킨 후, 탈수/세척/파라핀 침투 처리하였다. 각 샘플을 양분하고 두 단면 모두가 아래로 향하게 하여 임베딩(embedding)시켰다. 조직을 염샘을 위해 5 미크론으로 절단하였다. 헤마톡실린 및 에오신 염색은 세척/탈세포화 과정 후 세포 제거를 보여주었다(도 3). 결론적으로, 탈세포화 과정은 두 방법 모두로 온전한 탈세포화전 태반 막으로부터 세포를 효과적으로 제거하였다.
탈세포화된 태반 막 중의 잔류 DNA: 세척 및 탈세포화 처리되거나 그렇지 않은 태반 막으로부터의 대표적인 샘플을 LifeNet Health 표준 작동 프로토콜에 따라 PicoGreeen® DNA 검정 키트(Invitrogen P11496)를 사용한 프로테아제 K 분해 및 DNA 정량화에 사용하였다. PicoGreen dsDNA 시약은 용액에서 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 정량하기 위한 매우 민감한 형광 핵산 염료이다. 측정되고 계산된 결과는 동일한 기증자로부터의 탈세포화전 태반 막과 비교하여 dsDNA 감소 퍼센트로서 나타내었다. 6명의 개별 기증자로부터의 평균 DNA 제거율은 94.7+2.34%였다.
탈세포화된 태반 막 중의 성장 인자: 세척 및 탈세포화 처리하거나 그렇지 않은 태반 막으로부터의 대표적인 샘플을 작은 조각으로 자르고 콜라게나제, 히알루로니다제, 프로테아제 억제제, 및 Triton X-100을 함유하는 HEPES 완충액과 37℃에서 20-24시간 동안 교반하면서 인큐베이션하였다. 샘성된 샘플을 간략하게 초음파 처리한 후, 15분 동안 4℃에서 10,000g로 원심분리하였다. 상청액을 분취하고 bFGF 및 PDGF-AA에 대한 ELISA 키트(Ray Biotech, Inc.)의 설명서에 따라 성장 인자 정량화에 사용하였다. 6명의 개별 기증자로부터의 bFGF 및 PDGF-AA 결과를 계산하고 도 4 및 5에 제시하였다.
실시예 4. 탈세포화된 태반 막의 피하 이식
탈세포화된 태반 막을 실시예 1-2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 임플란트 샘플은 냉동 건조된 또는 냉동 건조되지 않은 태반 막으로부터 8mm 생검 펀치를 취함으로써 생성시켰다. 샘플의 반은 드라이 아이스 상에서 10-20kGy 흡수 선량에서의 감마 조사에 의해 최종 멸균시켰다.
약 6주령의 수컷 흉선 마우스(Nu/Nu Foxn1nu)를 본 연구에 사용하였다. 동물을 가장 가까운 0.1g까지 칭량하고 마취는 이소플루란(효과를 나타내기 위해 O2 중1 내지 5%)으로 유도하고 수술을 위해 O2 중에서 2 내지 3%로 유지하였다. 각 동물에 피하 주사를 통해 수술전 진통제 Buprenorphine SR®를 0.5 내지 1.0 mg/kg으로 투여하고 안연고를 눈 위에 놓았다. 등 부위를 베타딘 및 알콜로 두 번 닦았다. 등 중간선의 각 측면 상에 대략 1cm 절개부를 하나씩 생성시켰다. 무딘 박리를 이용하여 이들 절개부로부터 대략 0.15cc의 2개 피하 포켓을 형성시켰다. 탈세포화된 태반 막의 임플란트 샘플을 이식 전에 최소 5분 동안 등장성 염수로 재수화시켰다. 임플란트를 피하 포켓에 삽입하고 이식된 태반 막의 한쪽 가장자리와 근접한 마우스 근육 사이를 봉합하여 이식됨 샘플이 정위되는 것을 도왔다. 각 동물에 총 2개의 임플란트를 이식하였다. 절개부는 4-0 프롤렌 결절 봉합으로 봉합하였다. 각 동물은 개끗한 우리에 개별적으로 수용하고 동물이 정신이 들고 움직일 때까지 모니터링하였다.
이식 2 또는 4주 후, 동물을 CO2 흡입에 의해 안락사시키고 이들의 체중을 기록하였다. 임플란트로부터 약 5mm 떨어진 피부 및 피하 조직을 절단하여 임플란트 부위를 조심스럽게 노출시켰다. 이식된 샘플 및 3-5mm의 주위 조직을 절제하고 최소 4일 동안 10% 중성 완충된 포르말린(NBF)에 고정시켜 완전 고정을 달성하였다.
각 체외 샘플을 이의 가장 긴 중간선을 따라 절단하여 2개 반쪽을 만들었다. 생성된 조각은 동일한 파라핀 블록에 함께 (절단면이 아래로 향하게) 임베딩하고 조직 절편을 준비하였다. 각 군으로부터의 2개 절편을 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 임플란트 물질의 가장 큰 단면적을 갖는 절편을 등급 매기기에 사용하였다. 조직 절편을 임플란트의 섬유아세포 침윤, 신생혈관형성 정도, 염증 세포 반응(대식세포/거대 세포, 호중구), 및 섬유 조직/캡슐화에 대해 반-정량적으로 평가하였다. 섬유아세포 침윤 및 혈관신생은 이식된 태반 막에서 발견될 수 있다. 이식된 태반 막에는 염증이 전혀 없거나 최소로 발견되었다.
실시예 5. 탈세포화된 태반 막으로의 토끼 요도성형
탈세포화된 태반 막을 실시예 1-2에 기술된 바와 같이 제조하였다. 임플란트 샘플을 냉동 건조되거나 냉동 건조되지 않은 태반 막으로부터 1cm x 2cm 조각으로 잘라냄으로써 생성시켰다. 샘플의 절반은 드라이 아이스 상에서 10-20kGy 흡수 선량에서의 감마 조사에 의해 최종 멸균시켰다.
수컷 뉴질랜드 흰 토끼(3-3.5kg, 3-4주령)를 본 연구에 사용하였다. 토끼를 가장 가깝게 10g으로 칭량하고 케타민(35mg/kg, IM) 및 자일라진(5mg/kg, IM)으로 마취시키고, 수술 절차 기간 동안 이소플루란(O2 중 2 내지 3%) 상에 두었다. 요도 카테터 삽입 후, 음경 요도를 복부 중앙선 피부 절개를 통해 노출시키고 아래 해면체로부터 집결시켰다. 복부 요도 조직의 1 x 2 cm2(폭 x 길이) 영역을 절개하고 동일 크기의 태반 막을 6-0 폴리글락틴 결절 봉합을 사용하여 결함 부위로 봉합시켰다. 흡수 불가능한 6-0 폴리프로필렌 봉합사를 이식편 경계 확인을 위해 이식 영역의 근위, 원위 및 측방 경계부에 위치시켰다. 후속하여 피부 절개부는 연속되는 봉합사로 봉합하였다. 또한, 요도 절개술 단독으로 처리된 동물의 대조군(N=3)을 동시에 유사하게 처리하였다. 절차 후 동물에 1회 용량의 부프레넥스 SR(0.12 mg/kg, SQ) 및 절차 후 7일에 항생제 Baytril(5mg/kg, IM)을 투여하였다. 모든 실험 군에 있어서, 8 French Firlit-Kluge 요도 스텐트(Cook Urological, Spencer, IN)를 요도에 고정시켜 수술 절차 후 7일 동안 회복 부위 보강 및 도뇨를 통한 자유 소변 배액을 허용하였다. 스텐트 제거 후, 연구 완료 까지 동물이 자발적으로 배설하게 하였다. 3개월 후, 토끼를 전신 마취하에 방광요도경 검사를 시행하여 요도 개방을 평가하였다. 대조군 및 임플란트 이식된 토끼를 이식 후 3개월에 안락사시키고, 분리된 요도 표본을 조직학적, 면역조직화학적 및 조직형태학적 분석 처리하였다. 3개월 이식 후 내강 쪽으로의 태반 막의 재상피화가 예상되었다.
실시예 6. 분리된 양막, 융모막, 및 온전한 태반 막으로부터의 세포 제거 - 탈세포화
제왕 절개 후 기증자의 합의 하에 인간 장기 태반 및 양막 낭을 수득하고, 무균 상태 하에 가공 시설로 옮겼다.
양막 층 및 융모막 층 둘 모두를 갖는 태반 막을 포함하는 양막 낭을 태반 스커트 주위로 절단하고 염수 또는 락테이트화된 링거(Lactated Ringer)와 같은 등장성 용액으로 적어도 3회 헹궈 느슨하게 결합된 혈액을 제거하였다. 헹군 태반 막을 멸균 보드 위에 놓고 반으로 잘랐다. 태반 막의 한 반쪽에 있어서 양막을 부착된 융모막으로부터 분리하였다(도 9). 양막은 상피 세포를 아래로 향하게 하여 보드 위에 놓고, 융모막은 영양막을 아래로 향하게 하여 보드 위에 놓았다. 상이한 크기 및 형상의 메쉬 프레임을 분리된 양막 또는 분리된 융모막 위에 놓았다. 막을 매칭되는 프레임의 크기 및 형상에 맞춰 상이한 크기 및 형상으로 절단하였다. 분리된 양막 또는 융모막의 각 조각을 클립을 사용하여 메쉬 프레임과 고정시켰다. 또 다른 반의 태반 막은 그대로 유지하고 양막 상피 층이 위로 향하게 하여 보드 위에 놓았다. 상이한 크기 및 형상의 메쉬 프레임을 온전한 태반 막 위에 놓았다. 태반 막을 매칭되는 프레임의 크기 및 형상에 맞춰 상이한 크기 및 형상으로 절단하였다. 양막 층 및 융모막 층 둘 모두를 갖는 온전한 태반 막의 각 조각을 클립을 사용하여 메쉬 프레임과 고정시켰다. 준비된 온전한 또는 분리된 태반 막 조각을 무균 용기에 평평하게 놓고 추가의 처리까지 -80℃ 냉동기에 저장하였다. 프레임과 함께 다양한 온전한 또는 분리된 태반 막 조각을 주변 온도에서 해동시키고, 무균 칭량하고, 별도의 멸균 플라스크에 넣었다. 태반 막 조각을 주변 온도에서 교반하면서 트리스-HCl 및 NH4Cl을 함유하는 적혈구 세포 용해 완충액으로 15분 동안 헹구고, 이어서 교반하면서 3회 각 5분 등장성 염수로 헹구었다. 트리스 완충액 중 소듐 라우로일 사르코시네이트 및 DNA아제를 함유하는 준비된 탈활 용액을 플라스크에 첨가하고, 플라스크를 주변 온도에서 2시간 동안 교반하였다. 탈활 용액을 제거하고, 온전한 및 분리된 태반 막을 멸균 흡수 타월로 닦아 과량의 유체를 제거하였다. 태반 막 조각을 플라크스에 다시 넣고, 교반하면서 3회 30분 동안 등장성 염수로 헹구었다. 염수로 헹군 후, 태반 막 조각을 교반하면서 3회 각 15분 동안 멸균 초순수 물로 헹구었다.
상기 제시된 바와 같이 제조된 5개의 상이한 기증자로부터의 탈세포화된 분리된 양막, 분리된 융모막, 및 온전한 태반 막을 멸균 용기에 넣고 48-96시간 동안 냉동-건조시켰다.
실시예 7. 탈세포화되고 분리된 양막, 융모막 및 온전한 태반 막의 특성 규명
탈세포화된 태반 막 조각을 실시예 6에 기술된 처리 단계에 따라 제조하였다. 대표적인 샘플을 하기 특성 규명을 위한 세척/탈세포화 단계 전 및 후에 양막, 융모막 및 온전한 태반 막으로부터 펀칭하였다.
탈세포화된 양막, 융모막 및 온전한 태반 막 중의 잔류 DNA: 세척 및 탈세포화 처리되거나 그렇지 않은 양막, 융모막 및 온전한 태반 막으로부터의 대표적인 샘플을 LifeNet Health 표준 작동 프로토콜에 따라 PicoGreeen® DNA 검정 키트 (Invitrogen P11496)를 사용한 프로테아제 K 분해 및 DNA 정량화에 사용하였다. PicoGreen dsDNA 시약은 용액에서 이중-가닥 DNA(dsDNA)를 정량하기 위한 매우 민감한 형광 핵산 염료이다. 측정되고 계산된 결과는 동일한 기증자로부터의 비-탈세포화된 양막, 융모막 및 온전한 태반 막과 비교하여 dsDNA 감소 퍼센트로서 나타내었다. 5명의 개별 기증자로부터의 평균 DNA 제거 퍼센트는 분리된 양막, 분리된 융모막, 및 온전한 태반 막에 있어서 각각 95.96+2.03%, 95.79+5.56%, 및 93. 74+5.07%이다. 이들 군 간에 유의한 차이는 없었다 (p>0.05).
탈세포화된 태반 막 중의 성장 인자: 세척 및 탈세포화 후 분리된 양막, 분리된 융모막, 및 온전한 태반 막으로부터의 대표적인 샘플을 작은 조각으로 자르고, 콜라게나제, 히알루로니다제, 프로테아제 억제제, 및 Triton X-100을 함유하는 HEPES 완충액과 교반하면서 37℃에서 20-24시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 샘플을 간단하게 초음파 처리한 후, 15분 동안 4℃에서 10,000g로 원심분리하였다. 상청액을 분취하고 bFGF 및 PDGF-AA에 대한 ELISA 키트(Ray Biotech, Inc.)의 설명서에 따라 성장 인자 정량화에 사용하였다. 5명의 개별 기증자로부터의 bFGF 및 PDGF-AA 결과를 측정하고 계산하였다. 탈세포화 후, 온전한 태반 막으로부터의 전체 PDGF-AA는 동일한 크기의 분리된 양막과 융모막으로부터의 PDGF-AA의 합보다 약 18% 더 많았다(도 10a). 온전한 태반 막으로부터의 총 bFGF는 동일한 크기의 분리된 양막과 융모막으로부터의 bFGF의 합보다 약 140% 더 많았다(도 10b). 이는 양막과 융모막의 분리가 온전한 태반 막과 비교하여 성장 인자 함량을 감소시킬 수 있음을 시사한다. 접촉된 양막 층과 융모막 층 둘 모두를 갖는 온전한 태반 막은 분리된 양막 층 및 융모막 층보다 생활성 인자를 더 잘 유지시킬 수 있다. 또한, 본 발명자들의 데이터는 양막보다는 융모막에서 현저하게 높은 양의 PDGF-AA 및 bFGF를 보여주었다.
실시예 8. 탈세포화된 온전한 태반 막의 활성
탈세포화된 태반 막 조각을 실시예 6에 기술된 처리 단계에 따라 제조하였다. 세정/탈세포화 단계 후 대표적인 샘플을 온전한 태반 막으로부터 펀칭하고 무균 칭량하였다. 온전한 태반 막을 37℃에서 완만하게 교반하면서(75RPM) 2mg/mL로 24시간 동안 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM)에서 추출하였다. 또한, 배지 대조군(태반 조직 없이 DMEM만 함유)을 태반 막 추출물과 함께 인큐베이션하였다. 2개의 상이한 군으로부터의 배지를 전날에 3500 세포/cm2로 시딩된 인간 피부 섬유아세포(HDF)의 48웰 플레이트에 첨가하였다.
1, 3 및 6일에, 세포를 플레이트로부터 분리하고, 5분 동안 10000 RPM으로 원심분리하고, 세포 펠렛을 PicoGreen DNA 검정 키트(Invitrogen Cat# P11496)를 사용하여 DNA 정량화에 사용하였다. 총 염색체 DNA의 양을 HDF 세포 수의 지표로서 사용하였다. 결과는 태반 막 추출 배지와 1일 내지 6일 배양된 HDF 세포 증식을 보여주며(도 11), 1일 내지 6일 증가된 DNA의 백분율은 240%였다. 대조군 배지 단독과 배양된 HDF 세포는 동일한 배양 기간에 걸쳐 어떠한 유의적인 증식도 보이지 않았으며, 1일에서 6일까지 증가된 DNA의 백분율은 약 18%였다.
본 발명은 상기 설명되고 예시된 구체예로 제한되지 않으며, 첨부된 청구범위의 균등 영역 및 범위 내에서 변형 및 수정이 가능하다.

Claims (35)

  1. 탈세포화된 태반 막을 제조하는 방법으로서, 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 탈세포화전 태반 막으로부터 세포를 제거하여 융모막 층으로부터 양막 층을 분리하지 않으면서 탈세포화된 태반 막을 생성시키는 것을 포함하며, 탈세포화전 태반 막은 양막 낭으로부터 수득되고, 탈세포화된 태반 막은 양막 층 및 융모막 층을 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양과 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 합보다 적어도 10% 더 많은 양의 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화전 태반 막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 적어도 20%인 양으로 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화된 태반 막의 건조 중량 mg 당 100 ng 미만의 dsDNA를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화전 태반 막 중의 DNA의 10% 미만인 양으로 DNA를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막의 양막 층이 섬유아세포 층을 포함하며, 탈세포화된 태반 막의 융모막 층은 망상 층을 포함하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막의 양막 층이 상피, 기저막, 치밀 층(compact layer), 섬유아세포 층 및 해면 층을 포함하며, 탈세포화된 태반 막의 융모막 층은 세포 층, 망상 층, 위(pseudo)-기저막 및 영양막 층을 포함하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 공여체로부터 양막 낭을 수확하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  9. 제1항에 있어서, 탈세포화전 태반 막을 세척하고 소독하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 하나 이상의 변성 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 하나 이상의 비-변성 세제를 포함하는 시약으로 탈세포화전 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막을 냉동 또는 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 탈세포화된 태반 막을 멸균시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제1항에 있어서, 실온 또는 냉동보존 하에 탈세포화된 태반 막을 저장하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 저장된 탈세포화된 태반 막이 탈세포화된 태반 막의 총 중량을 기준으로 하여 0.5 중량% 미만의 수분 함량을 갖는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 저장된 탈세포화된 태반 막이 탈세포화된 태반 막의 총 중량을 기준으로 하여 5-95 중량%의 수분 함량을 갖는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 물 대체제(water replacing agent)로 탈세포화된 태반 막을 처리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 물 대체제가 글리세롤(글리세린 USP), 아도니톨, 소르비톨, 리비톨, 갈락티톨, D-갈락토스, 1,3-디하이드록시프로판올, 에틸렌 글리콜, 트리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글루코스, 수크로스, 만니톨, 자일리톨, 메소-에리트리톨, 아디프산, 프롤린, 하이드록시프롤린, 폴리에틸렌 글리콜, 알콜, 및 지질로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 제제를 포함하는 방법.
  19. 제1항에 있어서, 세포를 제거하기 전에 기판 상에 탈세포화전 태반 막을 고정시켜 탈세포화된 태반 막이 기판 상에 고정되게 하고, 고정된 탈세포화된 태반 막을 저장하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  20. 제19항에 있어서, 고정된 탈세포화된 태반 막을 냉동 또는 냉동-건조시키는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항에 방법에 의해 제조된 탈세포화된 태반 막의 존재하에 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 세포가 줄기 세포, 지방 유래 줄기 세포, 후근신경절 세포, 췌장 섬 세포, 심근세포, 간세포, iPSC, 암세포 및 제정맥 내피 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  23. 제21항에 있어서, 탈세포화된 태반 막의 존재하에 배양된 세포를 저장하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 세포가 냉동보존에 의해 저장되는 방법.
  25. 만능성 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포의 분화를 촉진시키는 방법으로서, 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 유효량의 탈세포화된 태반 막의 존재하에 만능성 줄기 세포 또는 조직-특이적 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 방법.
  26. 결함 부위를 유효량의 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 탈세포화된 태반 막과 접촉시키는 것을 포함하여, 조직에서 결함부를 수복시키는 방법.
  27. 제1항 내지 제20항 중의 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 탈세포화된 태반 막.
  28. 양막 층과 융모막 층을 포함하는 탈세포화된 태반 막으로서, 양막 층과 융모막 층은 융모막 층으로부터 양막 층의 분리 없이 태반 막으로부터 유래되는 탈세포화된 태반 막.
  29. 제28항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 실질적으로 동일한 면적을 갖는 탈세포화된 대조군의 분리된 양막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양과 탈세포화된 대조군의 분리된 융모막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 합보다 적어도 10% 더 많은 양의 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 탈세포화된 태반 막.
  30. 제28항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화전 태반 막 중의 하나 이상의 성장 인자의 양의 적어도 20%인 양으로 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 탈세포화된 태반 막.
  31. 제28항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화전 태반 막 중의 혈소판-유래된 성장 인자(PDGF)의 양의 적어도 20%인 양으로 PDFG를 포함하는 탈세포화된 태반 막.
  32. 제28항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화전 태반 막 중의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)의 양의 적어도 20%인 양으로 bFGF를 포함하는 탈세포화된 태반 막.
  33. 제28항에 있어서, 탈세포화된 태반 막이 탈세포화전 태반 막 중의 DNA의 20% 미만인 양으로 DNA를 포함하는 탈세포화된 태반 막.
  34. 제27항 내지 제33항 중의 어느 한 항의 탈세포화된 태반 막 및 하나 이상의 제제를 포함하는 태반-유래된 이식편.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 제제가 보존제, 물 대체제, 및 이들의 조합물로 구성된 군으로부터 선택되는 태반-유래된 이식편.
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