TW201634689A

TW201634689A - 脫細胞化組織

Info

Publication number: TW201634689A
Application number: TW105105541A
Authority: TW
Inventors: Jun Negishi; Ken-Ichiro Hiwatari; Kyohei Ochiai
Original assignee: Adeka Corp
Priority date: 2015-02-27
Filing date: 2016-02-24
Publication date: 2016-10-01
Also published as: EP3263140A4; US20200114044A1; TWI769132B; EP3263140B1; EP3782629A1; KR102501235B1; CN115554474A; US20200324024A1; HK1245159A1; CA2977462A1; JPWO2016136633A1; EP3263140A1; JP6666898B2; KR20170122178A; WO2016136633A1; CN107249656A; US20180028722A1

Abstract

本發明之課題在於提供一種細胞黏著性優異之脫細胞化組織。本發明提供一種脫細胞化組織，其特徵在於：其係將源自生物體之組織進行脫細胞化而成者，且脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的藉由示差掃描熱量測定所測得的單位乾燥質量之吸熱量之比為0.70以上。脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的單位乾燥質量之DNA量之質量比可為0.300以下。

Description

脫細胞化組織

本發明係關於一種可用於再生醫學之脫細胞化組織。

於移植源自他人或異種動物之生物體組織之移植片的情形時，被移植者側組織對移植片之排斥反應成為問題。作為此種問題之解決方法，期待開發出人工組織。雖嘗試了各種高分子作為原材料，但由於該等原材料與生物體組織之相容性較低，故而有產生移植片與生物體組織之接合部位之脫落或感染病之情形。因此，為了提昇與生物體組織之相容性，正在開發如下技術：使用作為自生物體組織去除細胞而殘存之支持組織之脫細胞化生物體組織作為移植片。已知脫細胞化之程度可藉由脫細胞化組織中之DNA之含量進行判斷，脫細胞化組織中之DNA(deoxyribonucleic acid，脫氧核糖核酸)含量越少則越不易引起排斥反應(例如參照非專利文獻1)。又，作為將生物體組織進行脫細胞化之方法，已知有使用界面活性劑之方法(例如參照專利文獻1、2)；使用酵素之方法(例如參照專利文獻3)；使用氧化劑之方法(例如參照專利文獻4)；利用高靜水壓處理之方法(例如參照專利文獻5~7)；利用冷凍融解處理之方法(例如參照專利文獻8~9)；藉由高滲電解質溶液進行處理之方法(例如參照專利文獻10)等。

[先前技術文獻] [專利文獻]

[專利文獻1]日本專利特開昭60-501540號公報

[專利文獻2]日本專利特表2003-518981號公報

[專利文獻3]日本專利特表2002-507907號公報

[專利文獻4]日本專利特表2003-525062號公報

[專利文獻5]日本專利特開2004-094552號公報

[專利文獻6]國際公開第2008/111530號說明書

[專利文獻7]日本專利特表2013-502275號公報

[專利文獻8]日本專利特開2005-185507號公報

[專利文獻9]日本專利特開2005-211480號公報

[專利文獻10]日本專利特開2010-221012號公報

[非專利文獻]

[非專利文獻1]T. W. Gilbert, et al., J. of Surgical Research 152.1 (2009) 135-139

於在再生醫學中使用脫細胞化組織之情形時，除了不存在排斥反應以外，是否可快速進行組織之再生亦成為問題。即便為由源自同一生物體之生物體組織所獲得之脫細胞化組織，且為將細胞以相同之程度去除之脫細胞化組織，亦於脫細胞化之方法或順序不同之情形時，有宿主細胞對脫細胞化組織之黏著性、宿主細胞之誘導效應、宿主細胞對脫細胞化組織內之浸潤等之速度出現不同之情形，對組織之再生有較大之影響。

本發明係為了解決上述問題而完成者，其課題在於提供一種細胞黏著性優異之脫細胞化組織。

本發明者等人為了解決上述問題而進行努力研究，結果發現於使用源自生物體之組織之脫細胞化前後之示差掃描熱量測定中之吸熱量之變化較少之脫細胞化組織的情形時，組織快速再生，從而完成了本發明。具體而言，本發明提供下述內容。

(1)一種脫細胞化組織，其特徵在於：其係將源自生物體之組織進行脫細胞化而成者，且脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的藉由示差掃描熱量測定所測得的單位乾燥質量之吸熱量之比為0.70以上。

(2)如(1)記載之脫細胞化組織，其中脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的單位乾燥質量之DNA量之質量比為0.300以下。

根據本發明，提供一種細胞黏著性優異之脫細胞化組織。該脫細胞化組織被期待細胞毒性較低，具有細胞之誘導效應或分化誘導效應，組織之再生效果較高。

圖1係表示脫細胞化前之源自生物體之組織之DSC吸熱量的圖。

圖2係表示實施例1之脫細胞化組織之DSC吸熱量之圖。

圖3係表示實施例4之脫細胞化組織之DSC吸熱量之圖。

圖4係表示比較例2之脫細胞化組織之DSC吸熱量之圖。

以下，對本發明之實施形態進行說明，但本發明並不限定於以下之實施形態。

與脫細胞化前之組織相比，本發明之脫細胞化組織於以下方面具有特徵：藉由示差掃描熱量測定所測得之吸熱量不大變化。以下，於本說明書中，將藉由示差掃描熱量測定所測得之吸熱量稱為「DSC(differential scanning calorimetry，示差掃描熱量測定)吸熱量」。源自生物體之組織或其脫細胞化組織係於55~70℃之區域可觀察到吸熱。將脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的藉由示差掃描熱量測定所測得的單位乾燥質量之吸熱量之比稱為「脫細胞化吸熱量比」。又，將脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的單位乾燥質量之DNA量之質量比稱為「脫細胞化DNA比」。再者，由於源自生物體之組織或脫細胞化組織有質量因水分之吸收或乾燥而發生變化之情況，故而於本發明中，脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比均係以源自生物體之組織及其脫細胞化組織之乾燥質量為基準。

[脫細胞化吸熱量比]

本發明之脫細胞化組織之脫細胞化吸熱量比為0.70以上，於脫細胞化吸熱量比低於0.70之情形時，有對脫細胞化組織之細胞誘導性或細胞之分化誘導性不充分，對利用脫細胞化組織之再生治療造成不良影響之情形。脫細胞化吸熱量比較佳為0.72以上，進而較佳為0.74以上，最佳為0.77以上。若脫細胞化吸熱量比為0.77以上，則尤其容易提高對脫細胞化組織之細胞黏著性，就該方面而言較佳。

脫細胞化吸熱量比之上限值並無特別限定，但若為1.3以下、較佳為1.27以下、進而較佳為1.25以下、最佳為1.23以下，則對脫細胞化組織之細胞誘導性或細胞之分化誘導性容易變良好，就該方面而言較佳。

於算出脫細胞化吸熱量比之情形時，只要進行示差掃描熱量測定後，對用於測定之樣品之乾燥質量進行測定，算出單位乾燥質量之DSC吸熱量，根據相對於脫細胞化前之組織之單位乾燥質量之DSC吸熱量的脫細胞化組織之單位乾燥質量之DSC吸熱量，算出脫細胞化吸熱量比即可。再者，「對樣品進行乾燥」係指使樣品乾燥至樣品中之水分含量成為5質量%以下。作為使樣品乾燥之方法，並無特別限定，可列舉實施例中所進行之方法等。

(單位乾燥質量之DSC吸熱量)=(未乾燥試樣之DSC吸熱量)×(乾燥後之試樣之質量)/(乾燥前之試樣之質量)

(脫細胞化吸熱量比)=(脫細胞化組織之單位乾燥質量之DSC吸熱量)/(脫細胞化前之組織之單位乾燥質量之DSC吸熱量)

可認為，源自生物體之組織之示差掃描熱量測定中之55~70℃之區域的吸熱係因組織中之膠原蛋白之熱變形所引起。膠原蛋白雖為細胞外基質之主成分，但未必源自生物體之組織中之所有膠原蛋白保持於脫細胞化組織中，於進行脫細胞化之過程中，有膠原蛋白之一部分脫離之情形。本發明者等人設想脫細胞化組織之細胞之誘導效應或分化誘導效應與脫細胞化組織之膠原蛋白的含量相關，但發現未必相關，存在即便膠原蛋白之含量較高亦細胞之誘導效應或分化誘導效應較低之脫細胞化組織，或脫細胞化組織之細胞黏著性、細胞之誘導效應及分化誘導效應與脫細胞化組織之DSC吸熱量之間可能相關。

已知生物體組織中之膠原蛋白具有被稱為膠原蛋白螺旋之3重螺旋結構。本發明者等人推斷，源自生物體之組織或脫細胞化組織之55~70℃之區域之吸熱係由呈3重螺旋結構之膠原蛋白之、膠原蛋白與膠原蛋白或膠原蛋白與配位水之氫鍵的裂解所致，脫細胞化組織之DSC吸熱量與呈3重螺旋結構之膠原蛋白之含量相關，而並非與脫細胞化組織之膠原蛋白之含量相關。進而，本發明者等人推斷，越是與生物體組織中之膠原蛋白為相同結構之呈3重螺旋結構之膠原蛋白含量較高的脫細胞化組織，細胞之誘導效應或分化誘導效應越高。

[脫細胞化DNA比]

一般認為脫細胞化組織之DNA含量以少為佳，於本發明之脫細胞化組織中，脫細胞化DNA比較佳為0.300以下。於脫細胞化DNA比超過0.300之情形時，有用於再生醫學之情形時產生排斥反應之情形。就細胞之誘導效應或分化誘導效應之方面而言，本發明之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比較佳為0.200以下，進而較佳為0.150以下，最佳為0.080以下，尤佳為0.005以下。若脫細胞化DNA比為0.080以下，則尤其容易提高對脫細胞化組織之細胞黏著性，就該方面而言較佳。

脫細胞化DNA比之下限越低越佳，就容易實現之方面而言，較佳為0.001以上，進而較佳為0.002以上。

用以求出脫細胞化DNA比之DNA含量之測定方法並無特別限定，只要依據公知之方法即可，例如可藉由以下方法來測定：利用酵素等將分解去除蛋白質部分後，與和DNA特異性地結合之螢光試劑組織進行反應，測定螢光強度之方法(例如參照非專利文獻1)等。由於脫細胞化DNA比係以乾燥質量為基準之比，故而DNA含量之測定較佳為使組織乾燥後進行。

(脫細胞化DNA比)=(乾燥後之脫細胞化組織之DNA含量)/(乾燥後之脫細胞化前之組織之DNA含量)

但是，於對脫細胞化組織進行乾燥後測定DNA含量之情形時，有測定值之誤差變大之情形，故而亦可另外測定乾燥前後之組織之質量之比(乾燥減量比)，藉由該乾燥減量比對於未乾燥之狀態下測得之DNA含量進行修正而算出。

(乾燥減量比)=(乾燥後之質量)/(乾燥前之質量)

(乾燥後之組織之DNA含量)=(未乾燥之組織之DNA含量)/(乾燥減量比)

[生物體組織]

本發明之脫細胞化組織所使用之生物體組織只要為源自脊椎動物之生物體組織，則並無特別限定，就排斥反應較少之方面而言，較佳為源自哺乳類或鳥類之生物體組織，就容易獲取之方面而言，進而較佳為源自哺乳類之家畜、鳥類之家畜或人類之生物體組織。作為哺乳類之家畜，可列舉：牛、馬、駱駝、駱馬、驢、犛牛、綿羊、豬、山羊、鹿、羊駝、狗、狸、鼬、狐狸、貓、兔子、倉鼠、豚鼠、大鼠、小鼠、松鼠、洗熊等。又，作為鳥類之家畜，可列舉：鸚哥、鸚鵡、雞、鴨、火雞、鵝、珠雞、野雞、鴕鳥、鵪鶉、鴯鶓等。於該等中，就獲取之穩定性而言，較佳為牛、豬、兔子、人類之生物體組織。

作為生物體組織之部位，可使用於細胞外具有基質結構之部位，作為此種部位，例如可列舉：肝臟、腎臟、輸尿管、膀胱、尿道、舌頭、扁桃體、食道、胃、小腸、大腸、肛門、胰臟、心臟、血管、脾臟、肺、腦、骨、脊髓、軟骨、精巢、子宮、輸卵管、卵巢、胎盤、角膜、骨骼肌、腱、神經、皮膚等。作為生物體組織之部位，就組織再生之效果較高之方面而言，較佳為軟骨、骨、肝臟、腎臟、心臟、心包、血管、皮膚、小腸黏膜下組織、肺、腦及脊髓。

[獲得本發明之脫細胞化組織之方法]

獲得本發明之脫細胞化組織之方法只要為脫細胞化吸熱量比成為0.7~1.3之脫細胞化方法，則並無特別限定。

作為獲得本發明之脫細胞化組織之較佳方法，例如可列舉：利用高靜水壓處理之方法；利用冷凍融解處理之方法等，就容易降低脫細胞化DNA比之方面而言，較佳為利用高靜水壓處理之方法。

源自生物體之組織之高靜水壓處理較佳為於含有界面活性劑之清洗液中進行。此情形時之界面活性劑之含量係根據清洗之源自生物體之組織或界面活性劑之種類而不同，較佳為0.01質量%以上且2.00質量%以下，進而較佳為0.03質量%以上且1.00質量%以下，最佳為0.05質量%以上且0.50質量%以下。再者，若於經施加高靜水壓之源自生物體之組織之清洗中使用核酸分解酵素及界面活性劑，則可提高清洗效果。若於使用含有界面活性劑之清洗液後使用核酸分解酵素，則可進一步提高清洗效果。

於藉由利用高靜水壓處理之方法獲得本發明之脫細胞化組織之情形時，對源自生物體之組織於介質中施加50~1500MPa之靜水壓。於施加之靜水壓低於50MPa之情形時，有脫細胞化變得不充分之情形，於高靜水壓處理後藉由含有界面活性劑之清洗液進行清洗之步驟中之對組織的損害變大，於超過1500MPa之情形時，需要可耐受施加之壓力容器，需要巨大之能量，並且於施加所使用之介質為水性介質之情形時生成冰，有組織因生成之冰而受到損害之情形。施加之靜水壓較佳為80~1300MPa，進而較佳為90~1200MPa，最佳為95~1100MPa。

作為靜水壓之施加所使用之介質，可列舉：水、生理鹽水、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液、糖類水溶液等。作為緩衝液，可列舉：乙酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、三羥甲基胺基甲烷緩衝液、HEPES(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，4-(2-羥基乙基)-1-哌乙磺酸)緩衝液、MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid，2-(N-啉基)乙磺酸)緩衝液等。作為糖類水溶液之糖類，可列舉：赤藻糖、木糖、阿拉伯糖、阿洛糖、塔羅糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、赤藻糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡聚糖、海藻酸、玻尿酸等。

高靜水壓處理之溫度只要為不會生成冰、且不會因熱對組織造成損害之溫度，則並無特別限定，就順利地進行脫細胞處理且對組織之影響亦小之方面而言，較佳為0~45℃，進而較佳為4~37℃，最佳為15~35℃。若高靜水壓處理之時間過短，則未充分地進行細胞之破壞，於較長之情形時會造成能量之浪費，故而於高靜水壓處理中，維持目標施加壓力之時間較佳為5~60分鐘，進而較佳為7~30分鐘。

對於經施加高靜水壓之生物體組織而言，組織中之細胞受到破壞，該細胞係藉由清洗液而去除。清洗液可與高靜水壓處理之介質相同亦可不同。清洗液較佳為含有核酸分解酵素、有機溶劑或螯合劑。核酸分解酵素可提昇自經施加靜水壓之生物體組織中之核酸成分之去除效率，有機溶劑可提昇脂質之去除效率，螯合劑可藉由使脫細胞化組織中之鈣離子或鎂離子惰化，而防止將本發明之粒子化脫細胞化組織應用於疾患部位之情形時之鈣化。作為有機溶劑，就脂質之去除效果較高之方面而言，較佳為水溶性之有機溶劑，較佳為乙醇、異丙醇、丙酮、二甲基亞碸。作為螯合劑，可列舉：乙二胺四乙酸(EDTA)、氮基三乙酸(NTA)、二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、羥基乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,3-丙二胺四乙酸(PDTA)、1,3-二胺基-2-羥基丙烷四乙酸(DPTA-OH)、羥基乙基亞胺基二乙酸(HIDA)、二羥基乙基甘胺酸(DHEG)、二醇醚二胺四乙酸(GEDTA)、二羧基甲基麩胺酸(CMGA)、3-羥基-2,2'-亞胺基二丁二酸(HIDA)、二羧基甲基天冬胺酸(ASDA)等亞胺基羧酸系螯合劑或其鹽；檸檬酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸等羥基羧酸系螯合劑或其鹽，作為該等螯合劑之鹽，可列舉鈉鹽或鉀鹽。

就清洗效率提高之方面而言，清洗液可含有界面活性劑。作為界面活性劑，可列舉：脂肪酸皂、烷氧基羧酸鹽、聚氧乙烯烷氧基羧酸鹽、烷基磺酸鹽、烷基苯磺酸鹽、烷基硫酸酯鹽、聚氧乙烯烷基硫酸酯鹽、烷基磷酸酯鹽、α-磺基脂肪酸酯鹽、N-醯基麩胺酸鹽、醯基-N-甲基牛磺酸鹽、N-烷基肌胺酸鹽、膽酸鹽、去氧膽酸鹽等陰離子性界面活性劑；烷基二甲基胺、烷基二乙醇胺、烷基三甲基銨鹽、二烷基二甲基銨鹽、烷基吡啶鎓鹽、烷基苄基二甲基銨鹽等陽離子性界面活性劑；烷基二甲基氧化胺、烷基羧基甜菜鹼、烷基醯胺丙基甜菜鹼、烷基醯胺丙基磺基甜菜鹼、烷基咪唑鎓甜菜鹼、3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基銨基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽(CHAPSO)、3-[(3-膽醯胺丙基)二甲基銨基]-1-丙磺酸鹽(CHAPS)等兩性界面活性劑；甘油脂肪酸酯、山梨醇酐脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、海藻糖脂肪酸酯、聚乙二醇脂肪酸酯、聚氧乙烯甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯醚、烷基(聚)甘油醚、脂肪酸烷醇醯胺、聚氧乙烯脂肪酸烷醇醯胺、烷基(聚)糖苷、烷基麥芽糖苷、烷基硫葡糖苷、烷基麥芽吡喃糖苷、烷醯基-N-甲基-D-葡糖胺、N,N-雙(3-D-葡糖醯胺丙基)膽醯胺(BIGCHAP)、N,N-雙(3-D-葡糖醯胺丙基)去氧膽醯胺(deoxy-BIGCHAP)等非離子性界面活性劑。

作為界面活性劑，就去除細胞之方面而言，較佳為烷基磺酸鹽、硫酸烷基酯鹽、聚氧乙烯硫酸烷基酯鹽、α-磺基脂肪酸酯鹽、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、烷基(聚)糖苷，進而較佳為烷基磺酸鹽、聚氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、烷基(聚)糖苷。

對經施加高靜水壓之生物體組織進行清洗之情形時之溫度只要為不會因熱對組織造成損害之溫度，則並無特別限定，就清洗性較為良好且對組織之影響亦較小之方面而言，較佳為0~45℃，進而較佳為1~40℃，最佳為2~35℃。於進行清洗之情形時，視需要可振盪或攪拌清洗液。

於藉由利用冷凍融解處理之方法獲得本發明之脫細胞化組織之情形時，將如下步驟反覆進行1次或2次以上、較佳為2~5次：將源自生物體之組織於-80~-20℃、較佳為-80~-40℃之溫度下保持1~48小時、較佳為10~30小時而使其冷凍後，於20~37℃之溫度下進行融解。對於經冷凍融解處理之生物體組織而言，組織中之細胞受到破壞，該細胞係藉由清洗液而去除。清洗之方法可為與高靜水壓處理中之清洗相同之方法。

由於脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比之測定作為宿主細胞之誘導、黏著、浸潤等優異之脫細胞化組織之篩選方法而優異，故於製造脫細胞化之情形時，可藉由組入以下步驟而製造良好之脫細胞化組織：確認脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的單位乾燥質量之DNA量之質量比為0.3以下的步驟(即，確認脫細胞化DNA比為0.3以下之步驟)；及確認脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的藉由示差掃描熱量測定所測得之單位乾燥質量之吸熱量之比為0.7~1.3的步驟(即，確認脫細胞化吸熱量比為0.7~1.3之步驟)。確認脫細胞化DNA比為0.3以下之步驟及確認脫細胞化吸熱量比為0.7~1.3之步驟較佳為清洗脫細胞化組織之步驟之後，於具有對脫細胞化組織進行殺菌或滅菌之步驟之情形時，較佳為清洗脫細胞化組織之步驟之後、且進行殺菌或滅菌之步驟之前。

本發明之脫細胞化組織可單獨應用，亦可與具有疾患部位位之再生、治癒效果之其他成分一起應用。作為此種其他成分，可列舉：生長因子、蛋白多糖或葡糖胺聚糖、細胞、β-1,3-葡聚糖、甲基二羥戊酸等。

作為生長因子，可列舉：類胰島素生長因子(IGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、轉形生長因子-α(TGF-α)、轉形生長因子(TGF-β)、成骨蛋白質(BMP)、血小板衍化生長因子(PDGF)、角質細胞生長因子(KGF)、表皮細胞生長因子(EGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、造血促進因子(EPO)、顆粒巨噬細胞生長因子(GM-CSF)、顆粒細胞生長因子(G-CSF)、神經細胞生長因子(NGF)、肝素結合(EGF)等。作為蛋白多糖或葡糖胺聚糖，可列舉：硫酸軟骨素、硫酸乙醯肝素、硫酸角質素、硫酸皮膚素、玻尿酸、肝素等。

本發明之脫細胞化組織可直接用於移植，亦可播種細胞並培養後使用。又，本發明之脫細胞化組織可進行切斷、切割、粉碎而加工為片狀、粒狀、細粉末狀、凝膠狀等而使用，於脫細胞化組織為片狀之情形時，可將脫細胞化組織彼此或與其他片狀者組合進行多層化而使用，亦可加工為管狀。

根據本發明，提供一種細胞之誘導效應優異之脫細胞化組織。脫細胞化組織之細胞之誘導效應可藉由利用實施例所記載之方法對脫細胞化組織進行細胞黏著性試驗而評價。

[實施例]

以下，藉由實施例進一步說明本發明，但本發明並不受該等實施例之限定。再者，只要無特別限定，則實施例中之「份」或「%」係以質量為基準。

[實施例1]

於聚乙烯製附夾頭之袋中置入將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(以下，將該片狀之內膜稱為「內膜片」)、及作為高靜水壓處理之介質之生理鹽水，使用研究開發用高壓處理裝置(神戶製鋼製造，商品名：Dr.CHEF)，施加100MPa之靜水壓15分鐘。將經高靜水壓處理之內膜片於含有20ppm之作為核酸分解酵素之DNase(deoxyribonuclease，去氧核糖核酸酵素)的生理鹽水中於4℃下振盪96小時，藉此進行清洗，進而，於80%乙醇中於4℃下振盪72小時，然後於生理鹽水中於4℃下振盪2小時，獲得實施例1之脫細胞化組織。

[實施例2]

於實施例1中，將含有20ppm之DNase之生理鹽水中之振盪時間由96小時變更為8小時，除此以外，進行與實施例1相同之操作，獲得實施例2之脫細胞化組織。

[實施例3]

藉由乾冰使內膜片冷凍，於置入有乾冰之保冷箱中(約-78℃)保存20小時後，於25℃下使其溶解。將反覆進行3次該冷凍融解之內膜片於含有20ppm之作為核酸分解酵素之DNase的生理鹽水中於4℃下振盪96小時，藉此進行酵素處理，進而，於80%乙醇中於4℃下振盪72小時，然後於生理鹽水中於4℃下振盪2小時，獲得實施例3之脫細胞化組織。

[實施例4]

將內膜片於含有0.1質量%之十二烷基磺酸鈉(以下為SDS)之生理鹽水中於25℃下振盪96小時，藉此進行脫細胞。將經SDS處理之內膜片於含有20ppm之作為核酸分解酵素之DNase的生理鹽水中於4℃下振盪96小時，藉此進行酵素處理，進而，於80%乙醇中於4℃下振盪72小時，然後於生理鹽水中於4℃下振盪2小時，獲得實施例4之脫細胞化組織。

[實施例5]

利用與實施例1相同之方法，對內膜片施加1000MPa之靜水壓15分鐘。將經高靜水壓處理之內膜片於含有0.1質量%之十二烷基磺酸鈉(以下記作SDS)之生理鹽水中於25℃下振盪8小時，繼而，於含有20ppm之作為核酸分解酵素之DNase之生理鹽水中於25℃下振盪24小時，藉此進行清洗。進而，於80%乙醇中於4℃下振盪72小時後，於生理鹽水中於4℃下振盪2小時，獲得實施例5之脫細胞化組織。

[實施例6]

於實施例5中，將高靜水壓處理之靜水壓由1000MPa變更為400MPa，除此以外，進行與實施例5相同之操作，獲得實施例6之脫細胞化組織。

[實施例7]

於實施例5中，將高靜水壓處理之靜水壓由1000MPa變更為600MPa，除此以外，進行與實施例5相同之操作，獲得實施例6之脫細胞化組織。

[實施例8]

於實施例1中，將高靜水壓處理之靜水壓由100MPa變更為600MPa，除此以外，進行與實施例1相同之操作，獲得實施例8之脫細胞化組織。

[比較例1]

於實施例4中，將SDS之濃度由0.1質量%變更為1質量%，除此以外，進行與實施例4相同之操作，獲得比較例1之脫細胞化組織。

[比較例2]

於實施例4中，將含有0.1質量%之SDS之生理鹽水變更為含有1質量%之Triton X-100(聚氧乙烯辛基苯基醚：以下記作TX)之生理鹽水，除此以外，進行與實施例4相同之操作，獲得比較例2之脫細胞化組織。

[比較例3]

於比較例2中，將TX之濃度由1質量%變更為0.1質量%，除此以外，進行與比較例3相同之操作，獲得比較例3之脫細胞化組織。

[比較例4]

將內膜片於生理鹽水中進行超音波處理(強度：10W/cm²，頻率：10kHz，作用時間：2分鐘)。對經超音波處理之內膜片進行與比較例2相同之操作，獲得比較例4之脫細胞化組織。

[比較例5]

於比較例4中，將TX之濃度由1質量%變更為0.1質量%，除此以外，進行與比較例5相同之操作，獲得比較例5之脫細胞化組織。

[比較例6]

將於磷酸緩衝液中分別以成為8mmol/L、1mol/L、25mmol/L之方式添加CHAPS、氯化鈉及EDTA而成之溶液作為脫細胞化液。藉由將內膜片於該脫細胞化液中於25℃下振盪96小時而進行脫細胞，藉由在含有20ppm之作為核酸分解酵素之DNase之生理鹽水中於25℃下振盪24小時而進行酵素處理，進而，於80%乙醇中於4℃下振盪72小時，然後於生理鹽水中於4℃下振盪2小時，獲得比較例6之脫細胞化組織。

[脫細胞化DNA比之算出]

測定各脫細胞化組織之質量，將其作為試片，浸漬於蛋白質分解酵素溶液中而溶解後，利用苯酚/氯仿進行處理而去除蛋白質，藉由乙醇沈澱法回收DNA。藉由PicoGreen(Life Technologies公司)將回收之DNA進行螢光染色並測定螢光強度，藉此對DNA進行定量，根據試片之質量及DNA之量算出試片之DNA含量。再者，於DNA之定量中，使用利用PicoGreen所隨附之標準DNA所製作之校準曲線。使用另一試片，根據試片之質量及乾燥後之試片(於60℃之恆溫槽中保存12小時者)之質量求出乾燥減量比，根據試片之DNA含量及乾燥減量比算出試片之單位乾燥質量之DNA含量。

(試片之DNA含量)=(DNA之量)/(試片之質量)

(乾燥減量比)=(乾燥後之試片之質量)/(試片之質量)

(乾燥試片之DNA含量)=(試片之DNA含量)/(乾燥減量比)

根據內膜片之乾燥試片之DNA含量及脫細胞化組織之乾燥試片之DNA含量的比算出脫細胞化DNA比。將結果示於表1。

(脫細胞化DNA比)=(脫細胞化組織之乾燥試片之DNA含量)/(內膜片之乾燥試片之DNA含量)

[脫細胞化吸熱量比之算出方法]

將經切斷為3mm×3mm之試片置入至已測定質量之鋁製試樣鍋中，使用示差掃描熱量測定機(METTLER TOREDO公司製造，型式DSC1)，於測定開始溫度25℃、升溫速度3℃/分鐘、測定結束溫度90℃之條件下測定示差掃描熱量。由於在55~68℃之區域中可觀察到被視為源自膠原蛋白之吸熱，故而將該吸熱量作為試片之吸熱量。將脫細胞化前之源自生物體之組織、實施例1及4之脫細胞化組織、比較例2之脫細胞化組織之吸熱量分別示於圖1~4。將吸熱量之測定後之試樣鍋開孔，於60℃之恆溫槽中保存12小時並加以乾燥後，測定置入有經乾燥之試片之試樣鍋之質量，根據下述式算出試片之單位乾燥質量之吸熱量。

(試片之單位乾燥質量之吸熱量)=(吸熱量)/{(置入有經乾燥之試片之試樣鍋之質量)-(試樣鍋之質量)}

根據內膜片之單位乾燥質量之吸熱量及脫細胞化組織之單位乾燥質量之吸熱量，藉由下述式算出脫細胞化吸熱量比。將結果示於表1。

(脫細胞化吸熱量比)=(脫細胞化組織之單位乾燥質量之吸熱量)/(內膜片之單位乾燥質量之吸熱量)

[細胞黏著性試驗]

將使用直徑6mm之活檢有柄環鋸將實施例1~7或比較例1~6之脫細胞化組織裁切為圓盤狀者作為試片。使圓盤狀試片之內膜側朝上而設置於96孔板皿(96 well plate dish)中，於含有10%之胎牛血清(FBS)之MEM(minimum essential medium，最小必需培養基)培養基中於37℃下預培養12小時。於去除MEM培養基後，播種人類皮膚纖維母細胞(NHDF)(2.7×10³細胞/孔(well))，於37℃下培養3小時。使用磷酸緩衝生理鹽水自試片中將未附著之細胞清洗及去除後，藉由Wst-8(同人化學研究所製造)將試片染色，測定450nm下之吸光度。另外算出NHDF之數量，且製作藉由Wst-8進行染色之情形時之校準曲線，根據試片之吸光度及校準曲線，算出附著於試片之NHDF數。將結果示於表1。

由表1之結果啟示，實施例之脫細胞化組織與比較例之脫細胞化組織相比，均係細胞黏著數較多，細胞之誘導效應優異，組織之再生效果較高。

[實施例9~12、比較例7~10]

關於實施例1~8、比較例1~6中所使用之豬主動脈內膜片以外之生物體組織，將本發明之脫細胞化組織之製造例示於實施例9~12。又，將比較之製造例示於比較例7~10。實施例之脫細胞化組織與比較例之脫細胞化組織相比，均係細胞黏著數較多，細胞之誘導效應優異。

[實施例9]

於實施例8中，使用豬之主動脈本身代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與實施例8相同之操作，獲得實施例9之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[實施例10]

於實施例8中，使用豬之皮膚(包含真皮)代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與實施例8相同之操作，獲得實施例10之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[實施例11]

於實施例8中，使用豬之心包代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與實施例8相同之操作，獲得實施例11之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[實施例12]

於實施例8中，使用將牛之主動脈切開所採集之片狀之內膜代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與實施例8相同之操作，獲得實施例12之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[比較例7]

於比較例1中，使用豬之主動脈本身代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與比較例1相同之操作，獲得比較例7之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[比較例8]

於比較例1中，使用豬之皮膚(包含真皮)代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與比較例1相同之操作，獲得比較例8之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[比較例9]

於比較例1中，使用豬之心包代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與比較例1相同之操作，獲得比較例9之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

[比較例10]

於比較例1中，使用將牛之主動脈切開所採集之片狀之內膜代替將豬之主動脈切開所採集之片狀之內膜(內膜片)，除此以外，進行與比較例1相同之操作，獲得比較例10之脫細胞化組織。藉由上述方法算出所獲得之脫細胞化組織之脫細胞化DNA比及脫細胞化吸熱量比。將結果示於表2。

Claims

一種脫細胞化組織，其特徵在於：其係將源自生物體之組織進行脫細胞化而成者，且脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的藉由示差掃描熱量測定所測得的單位乾燥質量之吸熱量之比為0.70以上。
如請求項1之脫細胞化組織，其中脫細胞化組織相對於脫細胞化前之源自生物體之組織的單位乾燥質量之DNA量之質量比為0.300以下。