CN110740762A - 移植用脱细胞化材料制造方法及由包含该材料的生物相容性材料组成的移植片组成物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的在于，提供一种制造移植用脱细胞化材料的方法，该移植用脱细胞化材料能够利用于移植片组成物，并将线的缝合部抑制为最小限度。为了达成上述目的，本发明提供一种移植用脱细胞化材料的制造方法，其包括：工序(a)，从脊椎动物(供体)采集具有分支的血管；工序(b)，对该血管进行脱细胞化；以及工序(c)，通过蛋白质变性处理将切除了分支的部分粘接而进行闭管。而且，本发明还提供一种由包含该移植用脱细胞化材料的生物相容性材料组成的移植片组成物。

Description

移植用脱细胞化材料制造方法及由包含该材料的生物相容性 材料组成的移植片组成物

技术领域

本发明涉及一种能够用于移植的脱细胞化材料的制造方法以及由包含该材料的生物相容性材料组成的移植片组成物。

背景技术

在移植源自他人生物体组织的移植片的情况下，被移植者侧组织对移植片的排斥反应成为问题。作为这种问题的解决方法，期待开发人工组织。作为原材料尝试了各种高分子，但由于这些原材料与生物体组织的相容性低，因此有时会发生移植片与生物体组织的接合部位的脱落、感染症。因此，为了提高与生物体组织的相容性，开发了一种将从生物体组织中去除细胞而残存的支持组织即脱细胞化生物体组织用作移植片的技术。

作为对脱细胞化材料要求的性质，可列举出：(i)作为移植片的强度；(ii)引起排斥反应的脱细胞化组织中的DNA被去除；(iii)自体细胞在移植后容易浸润；等。为了得到满足这些性质的脱细胞化材料，研究了各种制造方法。例如，已知有：使用表面活性剂的方法(例如，参照专利文献1、2)、使用酶的方法(例如，参照专利文献3)、使用氧化剂的方法(例如，参照专利文献4)、利用高静水压处理的方法(例如，参照专利文献5～7)、利用冻融处理的方法(例如，参照专利文献8～9)、利用高渗电解质溶液进行处理的方法(例如，参照专利文献10)等。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开昭60-501540号公报

专利文献2：日本特表2003-518981号公报

专利文献3：日本特表2002-507907号公报

专利文献4：日本特表2003-525062号公报

专利文献5：日本特开2004-094552号公报

专利文献6：国际公开第2008/111530号

专利文献7：日本特表2013-502275号公报

专利文献8：日本特开2005-185507号公报

专利文献9：日本特开2005-211480号公报

专利文献10：日本特开2010-221012号公报

非专利文献

非专利文献1：JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH A,OCT2015Vol.103A,10

发明内容

发明所要解决的问题

一般而言，为了维持作为脱细胞化组织的功能性，重要的是，保持表面状态，就是说尽量抑制该组织的形态损伤(例如非专利文献1)，即使是比较轻微的伤害也会影响自体细胞的浸润。因此，本发明人进行了被认为对脱细胞化组织的损伤较少的缝合加工，结果发现了会妨碍自体细胞的浸润。基于这样的结果，认为在源自生物体组织的移植片组成物中将缝合部控制为所需最小限度是重要的。

用于解决问题的方案

具体而言，在将由具有分支(分支血管)的血管得到的脱细胞化组织用作移植片组成物的情况下，需要切除分支部分并进行闭管。发现了：作为这样的对分支的切除部进行闭管的方法，当通过进行蛋白质变性处理来闭管而不是通过缝合来闭管时，不会妨碍脱细胞化组织的自体细胞的浸润，会再生出移植部的组织。

就是说，本发明提供一种移植用脱细胞化材料的制造方法，其包括：工序(a)，从脊椎动物(供体)采集具有分支的血管；工序(b)，对该血管进行脱细胞化；以及工序(c)，通过蛋白质变性处理将切除了分支的部分粘接而进行闭管。

另外，本发明的移植用脱细胞化材料的制造方法还可以包括：对在工序(a)中采集的血管的分支部进行切除的工序。

另外，本发明还提供一种移植片组成物，其由包含移植用脱细胞化材料的生物相容性材料组成，所述移植用脱细胞化材料由脊椎动物(供体)的被切除了分支的血管形成，并且具有至少一个以上通过蛋白质变性进行了闭管的分支切除部。

发明效果

在本发明的制造方法中，能够提供一种用于自体细胞在移植后容易浸润的移植片组成物的移植用脱细胞化材料。并且，就在至少一部分包含通过本发明的制造方法得到的移植用脱细胞化材料的移植片组成物而言，移植后的自体细胞容易湿润，因此移植后也能够作为正常的生物体组织发挥功能。

附图说明

图1表示具有分支的血管的概略图。(i)的1表示具有分支的血管，2表示分支部分(分支血管)，虚线表示切除分支部分的位置的一个例子。该虚线优选距血管1mm～2mm。另外，作为另一实施方案，该虚线的位置可以距血管5mm～几cm。(ii)的3表示蛋白质变性部。

图2是表示在实施例中从猪采集的被切除了分支部分的胸廓内动脉片的图。需要说明的是，在以下的实施例中，将图2中(3)的胸廓内动脉片用作比较例。

图3中(α)是对采集的猪的胸廓内动脉片进行苏木精/伊红染色后的剖视图的放大照片。另外，图3中(β)是对采集的猪的胸廓内动脉片进行脱细胞化，并进行苏木精/伊红染色后的移植用脱细胞化材料的剖视图的放大照片。能够确认到：不存在核酸，被脱细胞化。需要说明的是，各比例尺表示1000μm。另外，在以下的实施例中，将图3中(3)的胸廓内动脉片用作比较例。

图4是将作为移植用脱细胞化材料的脱细胞化猪胸廓内动脉片移植给兔子3个月后的通过苏木精/伊红染色(HE染色)或弹性纤维范吉森染色(EVG染色)进行染色后的切片的放大照片。在比较例中，由圆包围的部分的箭头所指的白色小圆是脯氨酸线穿过的痕迹。脯氨酸线与纸面垂直地穿过。能够认识到：在脯氨酸线穿过的周边未观察到细胞的浸润。需要说明的是，各比例尺表示500μm。

图5中左侧的图是对作为移植前的本发明的移植用脱细胞化材料的脱细胞化猪胸廓内动脉片进行HE染色后的分支部分的切片的放大照片。图5中右侧的图是移植1个月后的进行HE染色后的分支部分的切片的放大照片。移植后观察到细胞的浸润。需要说明的是，各比例尺表示500μm。

具体实施方式

对本发明的移植用脱细胞材料的制造方法进行说明。

本发明从脊椎动物(供体)采集具有分支的血管。

在此所说的采集是指，将具有分支的血管从供体中分离。另外，“具有分支的血管”是在供体中具有分支的血管的意思，也包含在采集时切除了分支的血管。

在本发明中，脊椎动物不特别限定，但优选能够容易地获取血管，因此，优选为人以外的动物，特别优选哺乳类家畜、鸟类家畜。作为哺乳类家畜，可列举出牛、马、骆驼、美洲驼(Llama)、驴、牦牛、绵羊(Ovis aries)、猪、山羊、鹿、羊驼、狗、貉、鼬、狐、猫、兔子、仓鼠、豚鼠、大鼠(Rat)、松鼠以及浣熊等。另外，作为鸟类家畜，可列举出鹦哥、鹦鹉、鸡、鸭、火鸡、鹅、珍珠鸡、野鸡、鸵鸟、鸸鹋以及鹌鹑等。其中，从获取的稳定性考虑，优选猪、兔子或牛。

在本发明的移植用脱细胞材料的制造方法中，使用具有分支的血管。在此，具有分支的血管是指，如图1所示具有至少一个以上分支部分(分支血管)的血管。

具有分支结构的血管的血管为复杂的形状，因此，即使进行脱细胞化也并不适合加工，此外还具有分支结构，因此作为移植用血管用途也几乎没被利用。通过本发明，使血管的分支部分粘接而进行闭管，由此能够利用为没有分支的血管。能够将以往难以利用的具有分支的血管利用为移植片组成物的意义是极大的。

作为具有分支的血管，具体而言，可列举出胸廓内动脉、腹壁动脉、胃网膜动脉、颈动脉、桡动脉、肋间动脉、肌膈动脉、股动脉、股深动脉、主动脉、尺动脉、肱动脉、胫前动脉、胫后动脉、肠系膜动脉、脾动脉、胸廓内静脉、肋间前静脉、奇静脉、半奇静脉、颈静脉、肠道静脉、股静脉、隐静脉、肠系膜静脉、脾静脉等。若考虑作为移植片组成物的物理特性(伸长率、生物相容性、强度等)，则优选动脉，更优选胸廓内动脉。

就具有分支的血管而言，在麻醉或屠宰脊椎动物后，切开胸部、腹部、脚部等身体的一部分，切除作为采集对象的具有分支的血管。麻醉方法、屠宰方法可以直接使用本领域技术人员以往进行的方法。

在切开脊椎动物的身体的一部分时，可以使用动物实验、外科用手术中通常使用的手术刀或剪刀等。

同样地，在采集具有分支的血管的情况下，可以使用动物实验、外科用手术中通常使用的手术刀或剪刀等。在切除血管的情况下，优选使用超声波手术刀、电手术刀。它们能够在切除血管的部位通过超声波振动或高频电流使血液凝固，同时切除血管。特别是，由于切除部分的蛋白质变性的程度是适度的，因此优选使用超声波手术刀。

需要说明的是，在本说明书中，“超声波手术刀”和“超声波振动手术刀”以相同的含义使用。

就能够在本发明中使用的电手术刀而言，可列举出ERBE公司制的VIO系列、泉工医科工业公司制的SHAPPER系列社等。就能够在本发明中使用的超声波手术刀而言，可列举出Stryker MedTech公司制的SONOPET UST-2001、Ethicon Endo-Surgery公司制的HarmonicScalpel等。

在(a)工序中采集的血管可以为已经切除了分支部分的状态，也可以为分支部分以足够的长度残留的状态(例如，5mm～几cm)。在分支部分以足够的长度残留的情况下，适当对其进行切除。

需要说明的是，进行蛋白质变性处理的分支部分的长度优选为距血管的分支部分1mm～10mm的位置，更优选为距血管的分支部分2mm～7mm的位置，最优选为距血管的分支部分3mm～5mm的位置。通过在上述范围进行蛋白质变性处理，能够将利用本发明的移植用脱细胞材料时的伴随变性处理而产生的影响(物性的变化以及不妨碍血流、抗血栓性等)抑制为最小限度，促进再组织化。

从脊椎动物采集的上述血管被进行脱细胞化处理。就脱细胞化处理而言，可举例示出表面活性剂处理(Singelyn J.M.,et al.,Biomaterials,2009,30,5409-5416；Singelyn J.M,,et al.,J.Am.Coll.Cardiol.,2012,59,751-763；Sonya B.,et al.,Sci.Transl.Med.,2013,5,173ra25)、酶处理、渗透压处理、冻融处理、氧化剂处理、高静水压处理(Sasaki S.,et al.,Mol.Vis.,2009,15,2022-2028；Yoshihide H.,et al.,Biomaterials,2010,31,3941-3949；Seiichi F.,et al.,Biomaterials,2010,31,3590-3595；Negishi J.,et al.,J.Artif.Organs,2011,14,223-231；日本专利第4092397号公报；日本再公表2008-111530号公报；日本特开2009-50297号公报)以及它们的组合，但优选通过高静水压处理进行脱细胞化处理。

关于进行高静水压处理时的压力，只要为源自作为脊椎动物的供体的细胞、病原体被破坏的程度的压力即可，可以根据供体的动物种类、血管的种类适当选择。作为静水压，可举例示出2～1500MPa。在施加的静水压高于50MPa的情况下，会充分地进行从血管的脱细胞化。因此，优选为50～1500MPa，进一步优选为80～1300MPa，更进一步优选为90～1200MPa，最优选为95～1100MPa。

作为用于施加高静水压的介质，可列举出水、生理盐水、缓冲液、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液、以及糖类水溶液等。作为缓冲液，可列举出醋酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、酒石酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液以及MES缓冲液等。作为糖类水溶液的糖类，可列举出赤藓糖、木糖、阿拉伯糖、阿洛糖、塔洛糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、赤藓糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、葡聚糖、海藻酸以及透明质酸等。

高静水压处理的介质的温度只要为不生成冰、不会由热对组织造成损伤的温度，就不特别限定。由于会顺利地进行脱细胞化处理、对组织的影响也少，因此，优选为0～45℃，进一步优选为4～40℃，更进一步优选为10～37℃，最优选为15～35℃。

若高静水压处理的时间过短，则无法充分进行脱细胞化处理，在高静水压处理的时间较长的情况下，会导致能量的浪费，因此优选为5分钟～12小时，更优选为7分钟～5小时，进一步优选为10分钟～3小时。

脱细胞化的适当与否可以通过组织学染色(苏木精-伊红染色)或残存DNA定量进行确认。

就被施加了高静水压的血管而言，组织中的细胞被破坏，该细胞成分通过清洗液来去除。清洗液既可以为与用于施加高静水压的介质相同的液体，也可以为与其不同的清洗液，还可以组合使用多种清洗液。清洗液优选含有核酸分解酶、有机溶剂或螯合剂。核酸分解酶能够提高来自被施加了静水压的血管的核酸成分的去除效率，有机溶剂能够提高来自被施加了静水压的血管的脂质的去除效率，螯合剂使脱细胞化组织中的钙离子、镁离子失活，由此能够防止将脱细胞化组织应用于患部时的钙化。

在本发明中，对切除了分支的部分进行蛋白质变性处理而闭管。在此，作为对蛋白质进行变性的方法并不特别限定，但从操作的简易性和效率、减少对组织的损伤的观点考虑，优选使用超声波手术刀、电手术刀，从对组织的损伤少、并且使分支断端的封闭性变得可靠的方面考虑，优选使用超声波手术刀。

超声波手术刀具有刀尖进行机械性超声波振动的构造，刀尖所接触的生物体组织附近产生摩擦热，生物体组织内部的蛋白质发生变性。切除分支血管而开管的部分因该蛋白质发生变性进行粘接而闭管。

需要说明的是，上述“对切除了分支的部分进行蛋白质变性处理而闭管”是指，还包含同时进行“分支的切除”和“进行蛋白质变性处理而闭管”的情况。

如上所述使用超声波进行处理时的频率优选为20kHz～100kHz，更优选为约30kHz～约60kHz。输出优选为50～500mA，更优选为100～400mA，进一步优选为200～300mA(利用100VAC时)。

进行超声波处理的时间根据频率、输出而各种各样，并不特别限定，但优选为0.1秒～10分钟，更优选为1秒～5分钟，进一步优选为3秒～60秒。

接着，对本发明的移植用脱细胞化材料的制造方法的各工序的顺序进行说明，所述移植用脱细胞化材料的制造方法包括：工序(a)，从脊椎动物(供体)采集具有分支的血管；工序(b)，对该血管进行脱细胞化；以及工序(c)，通过蛋白质变性处理将切除了分支的部分粘接而进行闭管。

在该实施方式中，(a)、(b)、(c)的各个工序不限定于上述的顺序。

例如，除了按照顺序进行工序(a)、工序(b)以及工序(c)之外，也可以在工序(a)之后进行工序(c)，然后进行工序(b)。另外，作为另一方案，也可以将具有分支的血管的分支部分在从作为供体的脊椎动物采集之前切除，对该切除了分支的部分进行蛋白质变性处理，从供体采集，之后进行工序(b)的脱细胞化。就是说，按工序(c)、工序(a)、工序(b)的顺序包括各工序的方案也包含于本发明。

作为另一方案，在工序(a)中采集的具有分支的血管的分支部分以足够的长度存在的情况下(例如，分支部分的长度为5mm～几cm)，可以还包括对该分支部分进行切除的工序(d)。什么时候进行该工序(d)也不特别限定。

例如，也可以按工序(a)、工序(d)、工序(b)以及工序(c)的顺序，工序(a)、工序(b)、工序(d)以及工序(c)的顺序进行。

在本发明中，从能够不漏掉分支血管地闭管、另外操作更高效的方面考虑，更优选的是，在工序(c)中同时进行“分支的切除”和“进行蛋白质变性处理而闭管”，进而连续地进行工序(c)和工序(a)。需要说明的是，即使在该情况下，也可以在工序(b)的前后再次进行工序(c)。

在本发明中，还提供一种移植片组成物，其由包含移植用脱细胞化材料的生物相容性材料组成，所述移植用脱细胞化材料由脊椎动物(供体)的被切除了分支的血管形成，并且具有至少一个以上通过蛋白质变性进行了闭管的分支切除部。

本发明的移植片组成物中的脊椎动物不特别限定，但优选能够容易地获取血管，因此，优选为人以外的动物，特别优选哺乳类家畜、鸟类家畜。在此的哺乳类家畜、鸟类家畜与在本发明的移植用脱细胞化材料的制造方法中使用的哺乳类家畜、鸟类家畜的具体例中列举出的家畜相同。其中，从获取的稳定性考虑，优选猪、兔子或牛。

在本发明的移植片组成物中，“被切除了分支的血管”是指，用于制造本发明的移植用脱细胞化材料的、从具有分支的血管切除了分支部分的血管。具有分支的血管可以使用与上述制造方法中使用的血管相同的血管，若考虑作为移植片组成物的物理特性(伸长率、生物相容性、强度等)，则优选动脉，更优选胸廓内动脉。

本发明的移植片组成物所使用的移植用脱细胞化材料具有蛋白质变性部。具体而言，分支部分的切除部位变成开管的状态，通过进行蛋白质变性处理能够堵塞开管部。

蛋白质变性处理的具体方法与上述的移植用脱细胞化材料同样地不特别限定，但可以使用超声波手术刀、电手术刀。由于对组织的损伤少，因此优选使用超声波手术刀。

在本发明的移植片组成物中，关于用于使蛋白质变性的超声波的频率和处理时间的条件与上述的移植用脱细胞化材料的制造方法中的超声波的频率和处理时间的条件相同。

关于本发明的移植片组成物所使用的移植用脱细胞化材料，脱细胞化处理可以进行与上述的脱细胞化处理同样的脱细胞化处理，优选通过高静水压处理进行脱细胞化处理。

关于进行高静水压处理时的压力，只要为源自作为脊椎动物的供体的细胞、病原体被破坏的程度的压力即可，可以在与上述的静水压的条件相同的条件下进行。另外，作为用于施加高静水压的介质，可列举出水、生理盐水、缓冲液、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液以及糖类水溶液等，作为各溶剂的具体例，可以使用与上述的溶剂的具体例相同的溶剂。

本发明的移植片组成物由特定的生物相容性材料组成。在此，“生物相容性”是指，移植片被被移植组织接受，不会诱发毒性、显著的免疫排斥。

生物相容性材料只要为不具有流动性而呈固体状的材料，就不特别限定，但可列举出非再吸收性聚合物、吸收性聚合物、金属类、玻璃类、陶瓷类。

作为上述非再吸收性聚合物，可列举出聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚丁烯、聚对苯二甲酸丁二醇酯、聚丙烯、丙烯酸、聚酰胺-酰亚胺、聚醚醚酮、聚芳醚酮、聚碳酸酯、聚酰胺、聚氟乙烯、聚偏氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯、以及它们的组合和等价物，但并不限定于它们。

作为上述吸收性聚合物，可以为合成聚合物也可以为天然聚合物，可列举出聚氨基酸、聚酰胺、脂肪酸聚酯，作为天然聚合物，可列举出胶原蛋白、弹性蛋白、透明质酸、层粘连蛋白、以及明胶、角蛋白、硫酸软骨素、以及脱细胞化组织。

作为上述金属类，可列举出钽、钽合金、不锈钢、钛、钛合金、钴铬合金等，可以使用以往在医疗设备等中使用的生物相容性金属类。

作为上述玻璃类或陶瓷类，可列举出：磷酸四钙、α-磷酸三钙以及β-磷酸三钙、磷酸八钙、羟基磷灰石、取代磷灰石、三斜磷钙石、偏磷酸盐、焦磷酸盐、磷酸盐玻璃等磷酸盐；钙和镁的碳酸盐、硫酸盐以及氧化物；以及它们的组合，但并不限定于它们。

本发明的移植片组成物由在至少一部分包含特定的移植用脱细胞化材料的生物相容性材料组成。在此，“在至少一部分包含”是指，该移植用脱细胞化材料可以在生物相容性材料中存在一个以上、多个。从更有效地达成自体细胞的浸润的方面考虑，更优选的是生物相容性材料仅由脱细胞化材料构成。

本发明的移植片组成物在移植后能够作为生物体组织的一部分发挥功能。特别是，能够作为移植用的血管代用物发挥功能。

[实施例]

1.脱细胞化猪胸廓内动脉的制作

猪胸廓内动脉的采集(分支血管的处理)

在麻醉下对月龄为3～4个月的食用猪(SPF(specific pathogen free：无特定病原体)猪、雌性、体重约50千克)进行开胸，使胸廓内动脉露出。将超声波手术刀(Harmonicscalpel II，Harmonic SYNERGY，Ethicon Endo-Surgery公司)设定为55500Hz、输出电平2，使其接触分支血管而使分支血管凝固，同时从胸壁剥离(采集)出胸廓内动脉。

从两头猪采集了四根胸廓内动脉。

2.猪胸廓内动脉的观察

测定出采集的四根猪胸廓内动脉的长度和内径。分别为(1)长度：140mm、内径：3.2mm；(2)长度：135mm、内径：2.6mm；(3)长度：95mm、内径：2.9mm；(4)长度：105mm、内径：2.8mm。在图2中示出所得到的猪胸廓内动脉(1)～(4)。另外，在图3中示出其剖视图(HE染色)。

3.猪胸廓内动脉的脱细胞化处理

[使用试剂]

·DNs溶液

含有DNase I(Roche，Grade II)50mg/L、MgCl₂·6H₂O(Wako，试剂特级)2.55g/L的大冢生理盐水

·EtOH溶液

将药典乙醇和大冢生理盐水制备成体积比为80％的溶液

·柠檬酸溶液

将柠檬酸三钠二水合物(Calbiochem，Molecular Biology Grade)和柠檬酸酐(Wako，特级)加入大冢生理盐水，并制备成pH7.4的溶液

以水为介质通过超高静水压装置(Dr.Chef，神户制钢(株)制)对上述的猪胸廓内动脉进行了处理。超高静水压处理在施加压力600MPa、升压时间9分钟、压力维持时间120分钟、降压时间9分钟、压力介质(pressurization medium)温度30℃的条件下进行。

在超高压处理后，用50mg/L的DNase I溶液清洗4天，用EtOH溶液清洗3天，用柠檬酸溶液清洗4天，完成了脱细胞化。

脱细胞化通过如下方式进行：进行苏木精/伊红染色(Hematoxylin-Eosin染色，以下有时也称为HE染色)，用显微镜确认在HE染色切片图像中没有核酸。

需要说明的是，HE染色是使用苏木精和伊红这两种色素将细胞核和细胞核以外的组织、成分染上不同颜色的方法，能够用苏木精将细胞核染成靛蓝色，用伊红将细胞质/纤维类、红血球染成粉红色。

4.耐压强度的测定

在脱细胞化后，用夹子(clamp)夹住各猪胸廓内动脉的一端，从相反侧使用20mL注射器输送生理盐水，测定出耐压强度。在使用了除了上述的(3)以外的(1)、(2)、(4)的猪胸廓内动脉的移植用脱细胞化材料中，耐压强度为150mmHg以上。

另外，在分支部分的一部分未被闭塞的(3)中，能够确认到生理盐水泄漏。

需要说明的是，对于耐压强度的测定而言，用注射泵(YSP-101)从20mL注射器以3mL/min的速度向猪胸廓内动脉内输送生理盐水，用数字压力计(KDM30)计测出此时的压力。

在以后的实验中，将(1)、(2)、(4)作为实施例，将(3)作为比较例。

5.比较例的血管的缝合

对于(3)的移植用脱细胞材料，将能够确认到生理盐水泄漏的切除了分支血管的部分用6-0脯氨酸线进行了结扎。结扎以如下方式进行：使缝合线穿过血管外膜部分之后，从外侧捆绑分支的管状部分。

6.脱细胞化猪胸廓内动脉(由移植用脱细胞化材料组成的移植片组成物)向兔子主动脉的长期移植

·移植方法

对体重3.70-4.00kg的兔子(品种：日本白兔，月龄5个月，雄性)皮下注射了戊巴比妥钠盐酸盐(商品名：Somnopentyl(注册商标)0.2ml)、生理盐水(1.8ml/兔子)、盐酸美托咪啶(商品名：Dorbene Injection 1ml)。在确认不动后，对腹部皮肤进行了剃毛。作为呼吸麻醉使其吸入异氟烷(导入时2％，手术时1％)，保定于保定台后，用浸渍有聚维酮碘制剂的纱布对皮肤进行了消毒。接着，将生理盐水3倍稀释的利多卡因注射液(商品名：XYLOCAINE(注册商标))注射至腹部皮下，从耳静脉取点滴线(infusion line)，静脉注射了SOLITA(注册商标)T-3。使用电手术刀、剪刀切开皮肤、腹膜而使腹部主动脉露出，从点滴线静脉注射肝素1000单位(1000单位/mL肝素1mL)，然后确认在静脉注射肝素后经过了3分钟，隔断了腹部主动脉中枢侧。将分流管插入腹部主动脉后，解除了血流隔断。用分流管确保血流的同时，使用8-0脯氨酸线通过端侧吻合法使脱细胞化猪胸廓内动脉与腹部主动脉中枢部吻合。接着，通过同样的方法使脱细胞化猪胸廓内动脉与腹部主动脉末梢部吻合，制作出旁路血管。此外，为了使血流流向旁路血管，用6-0脯氨酸线对中枢吻合部与末梢吻合部之间的腹部主动脉进行了结扎。在移植了脱细胞化猪胸廓内动脉后，用4-0PDS线缝合腹膜，用2-0PDS缝合肌肉层，用4-0PDS线缝合皮肤，闭合了腹部。施用0.5mL作为抗生素的Baytril(注册商标)，将作为盐酸美托咪啶拮抗剂的盐酸阿替美唑(商品名：Atipame Injection 1ml)注射至大腿部皮下。确认清醒后，将兔子移至饲养笼。

·尸体剖检(Necropsy)

对移植脱细胞化猪胸廓内动脉后1个月或3个月的兔子进行了尸体剖检。不从兔子取下点滴线，通过与移植时同样的方法使腹部主动脉(移植的脱细胞化猪胸廓内动脉)露出。接着，进行了血管未闭(vascular patency)评价、血栓形成评价。对于血管未闭评价而言，切断腹部主动脉的末梢侧，通过有无放血进行了判断。在所有的样品中确认放血，显示出血管未闭。在血管未闭评价后，对耳静脉注射戊巴比妥钠(Somnopentyl(注册商标)5mL)，使其死亡。在心脏、呼吸停止后，取出脱细胞化猪胸廓内动脉。将脱细胞化猪胸廓内动脉内部用生理盐水进行清洗后，沿长轴方向切开，通过目视观察了血栓形成。在脱细胞化猪胸廓内动脉的内腔面未附着血栓，显示出抗血栓性高。需要说明的是，“未闭”是指，血管的内腔没有闭塞，维持了中空的状态。

·病理标本制作

移植的脱细胞化猪胸廓内动脉的病理标本的制作由(株)新组织科学研究所进行。此时，在脱细胞化猪胸廓内动脉的能够确认到用超声波手术刀或者6-0脯氨酸线使其闭塞的分支血管部分的组织结构的部分，进行了HE染色切片、弹性纤维范吉森染色(Elasticavan Gieson染色，以下有时也称为EVG染色)、EVG染色切片的制作。具体而言，沿血管的长轴方向以大约5μm厚连续地制成切片，在能够确认到用超声波手术刀或者6-0脯氨酸线使其闭塞的分支血管部分的组织结构的部分制成切片。

需要说明的是，EVG染色是鉴定弹性纤维的染色方法，能够分别将结缔组织中的弹性蛋白染成黑紫色，将胶原蛋白染成红紫色。

以下示出实施例样品的HE染色图像、EVG染色图像(3个月)，比较例样品的HE染色图像、EVG染色图像(3个月)(图4)。可知：在实施例样品中，在用EVG染色染成黑紫色的脱细胞化猪胸廓内动脉组织部分也浸润了细胞。另一方面，在比较例样品中，在用EVG染色染成黑紫色的脱细胞化猪胸廓内动脉组织部分未观察到细胞的浸润。

另外，在实施例样品中，发现了在移植后1个月的阶段由兔子细胞覆盖了分支血管的台阶(level variation)(图5)。

7.

由源自流通食用猪的肉块，将超声波手术刀(EES Generator，Harmonic SYNERGY，Harmonic FOCUS+，＜使用蓝色机头(Blue hand piece)＞，Ethicon Endo-Surgery公司)设定为55500Hz、输出电平5和2，使其接触分支血管而使分支血管凝固，同时从胸壁剥离(采集)出胸廓内动脉。分支血管的凝固在距血管的分支部分3-5mm的位置进行，剥离(采集)了五根胸廓内动脉。通过上述“3”所记载的方法进行了脱细胞化处理之后，通过上述“4”所记载的方法进行了耐压强度的测定。其结果是，确认到：在所有五根样品中，耐压强度为250mmHg以上。

附图标记说明

1：具有分支的血管，2：分支部分(分支血管)，3：蛋白质变性部。

Claims (7)

1.一种移植用脱细胞化材料的制造方法，其包括：

工序(a)，从作为供体的脊椎动物采集具有分支的血管；

工序(b)，对该血管进行脱细胞化；以及

工序(c)，通过蛋白质变性处理将切除了分支的部分粘接而进行闭管。

2.根据权利要求1所述的移植用脱细胞化材料的制造方法，其中，

在所述工序(a)之后，包括：

工序(d)，对采集的血管的分支进行切除。

3.根据权利要求1或2所述的移植用脱细胞化材料的制造方法，其中，

所述蛋白质变性处理为超声波振动处理。

4.根据权利要求1～3中任一项所述的移植用脱细胞化材料的制造方法，其中，

工序(b)的脱细胞化包括超高静水压处理。

5.一种移植片组成物，其由包含移植用脱细胞化材料的生物相容性材料组成，所述移植用脱细胞化材料由作为供体的脊椎动物的被切除了分支的血管形成，并且具有至少一个以上通过蛋白质变性进行了闭管的分支切除部。

6.根据权利要求5所述的移植片组成物，其中，

所述血管包含胸廓内动脉。

7.一种移植片组成物，其由包含猪的胸廓内动脉的血管的脱细胞化组织组成，具有通过蛋白质变性进行了闭管的分支切除部。

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