TW201906586A - 移植用去細胞化材料之製造方法以及包含該材料之生體適合性材料而成之移植片組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明之目的為提供製造能夠利用於移植片組成物且最小限度地抑制經由線之縫合部之移植用去細胞化材料之方法。 　　為了達成上述目的，本發明係提供移植用去細胞化材料之製造方法，其包含(a)自脊椎動物(供體)採取具有分枝之血管之步驟；(b)將該血管進行去細胞化之步驟；以及(c)將已切除分枝之部分藉由蛋白質變性處理來黏接並閉管之步驟。再者，本發明亦提供包含該移植用去細胞化材料之生體適合性材料而成之移植片組成物。

Description

移植用去細胞化材料之製造方法以及包含該材料之生體適合性材料而成之移植片組成物
本發明係關於可用於移植之去細胞化材料之製造方法以及包含該材料之生體適合性材料而成之移植片組成物。
在移植源自他人的生體組織之移植片之情況，被移植者側組織所引發之移植片的排斥反應會成為問題。作為此種問題之解決方法，正期待人工組織的開發。雖然已嘗試各種高分子作為素材，但由於此等素材與生體組織之適合性較低，因而有時會發生在移植片與生體組織之接合部位之脫落或感染症。於是，為了提升與生體組織之適合性，正開發使用屬於自生體組織除卻細胞所殘存之支持組織之去細胞化生體組織作為移植片之技術。
作為去細胞化材料所要求之性質，可列舉(i)作為移植片之強度、(ii)去除引起排斥反應之去細胞化組織中之DNA、(iii)移植後自體細胞易於浸潤等。為了獲得滿足此等之去細胞化材料，已檢討各種製造方法。已知例如使用界面活性劑之方法(參照例如專利文獻1、2)、使用酵素之方法(參照例如專利文獻3)、使用氧化劑之方法(參照例如專利文獻4)、經由高靜水壓處理之方法(參照例如專利文獻5～7)、經由凍結融解處理之方法(參照例如專利文獻8～9)、以高張電解質溶液進行處理之方法(參照例如專利文獻10)等。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]日本專利特開昭60-501540號公報 　　[專利文獻2]日本專利特表2003-518981號公報 　　[專利文獻3]日本專利特表2002-507907號公報 　　[專利文獻4]日本專利特表2003-525062號公報 　　[專利文獻5]日本專利特開2004-094552號公報 　　[專利文獻6]國際公開第2008/111530號 　　[專利文獻7]日本專利特表2013-502275號公報 　　[專利文獻8]日本專利特開2005-185507號公報 　　[專利文獻9]日本專利特開2005-211480號公報 　　[專利文獻10]日本專利特開2010-221012號公報 [非專利文獻]
[非專利文獻1] JOURNAL OF BIOMEDICAL MATERIALS RESEARCH A, OCT 2015 Vol.103A, 10
[發明所欲解決之課題]
一般而言，為了維持作為去細胞化組織之機能性，重要的是保持表面狀態，即，極力抑制該組織之形態上的損傷(例如非專利文獻1)，即便是比較微小的損害，亦會對自體細胞的浸潤產生影響。於是，本發明者施行經由一般認為對去細胞化組織之損傷較少之縫合之加工，結果得知會妨礙自體細胞的浸潤。若依據此種結果，一般認為重要的是源自於生體組織之移植片組成物於其中必要最小限度地抑止縫合部。 [解決課題之手段]
具體而言，在使用由具有分枝(分枝血管)之血管所獲得之去細胞化組織作為移植片組成物之情況，必須將分枝部分切除並閉管。經發現，作為此種將分枝的切除部進行閉管之手段，若不進行縫合而是藉由施行蛋白質變性處理來進行閉管，則移植部的組織會在不妨礙去細胞化組織之自體細胞的浸潤之情形下進行再生。
即，本發明係提供移植用去細胞化材料之製造方法，其包含 　　(a)自脊椎動物(供體)採取具有分枝之血管之步驟； 　　(b)將該血管進行去細胞化之步驟；以及 　　(c)將已切除分枝之部分藉由蛋白質變性處理來黏接並閉管之步驟。
此外，本發明之移植用去細胞化材料之製造方法亦可進一步包含切除(a)步驟中所採取之血管的分枝部之步驟。
此外，本發明亦提供移植片組成物，其係包含移植用去細胞化材料之生體適合性材料而成，該移植用去細胞化材料係由脊椎動物(供體)之已切除分枝之血管而成，且具有至少1個以上藉由蛋白質變性而閉管之分枝切除部。 [發明效果]
在本發明之製造方法中，可提供用於移植後自體細胞易於浸潤之移植片組成物之移植用去細胞化材料。且，至少一部分包含藉由本發明之製造方法所獲得之移植用去細胞化材料之移植片組成物係由於移植後之自體細胞易於浸潤，因而即便是移植後亦可作為正常的生體組織而發揮機能。
針對本發明之移植用去細胞材料之製造方法進行說明。 　　本發明係自脊椎動物(供體)採取具有分枝之血管。 　　在此處所謂之採取，係意味自供體分離出具有分枝之血管。此外，「具有分枝之血管」係在供體中具有分枝之血管之意，亦包含在採取時切除分枝者。
在本發明中，所謂脊椎動物，並無特別限定，較佳係可輕易地取得血管，因而較佳為人類以外之動物，特佳為哺乳類家畜或鳥類家畜。作為哺乳類家畜，可列舉牛、馬、駱駝、大羊駝、驢、氂牛、綿羊、豬、山羊、鹿、羊駝、犬、狸、鼬、狐狸、貓、兔、倉鼠、豚鼠、大鼠、松鼠及浣熊等。此外，作為鳥類家畜，可列舉鸚哥、鸚鵡、雞、鴨、火雞、鵝、珠雞、雉、鴕鳥、鴯鶓及鵪鶉等。在此等之中，由取得的安定性而言，較佳為豬、兔或牛。
在本發明之移植用去細胞材料之製造方法中，係使用具有分枝之血管。在此處，所謂具有分枝之血管，係指如圖1所示，具有至少1個以上分枝部分(分枝血管)之血管。 　　具有分岔結構血管之血管呈複雜的形狀，因而即便進行去細胞化，亦被認為不適合加工，除此以外，由於具有分枝結構，因而亦幾乎未利用作為移植用血管用途。根據本發明，藉由將血管的分枝部分黏接並閉管，便可利用作為無分枝之血管。可將以往難以利用之具有分枝之血管利用作為移植片組成物之意義極為重大。
作為具有分枝之血管，具體而言，可列舉內胸動脈、腹壁動脈、胃網膜動脈、頸動脈、橈骨動脈、肋間動脈、肌隔動脈、股動脈、股深動脈、大動脈、尺骨動脈、肱動脈、前脛骨動脈、後脛骨動脈、腸繫膜動脈、脾動脈、內胸靜脈、前肋間靜脈、奇靜脈、半奇靜脈、頸靜脈、腸管靜脈、股靜脈、隱靜脈、腸繫膜靜脈、脾靜脈等。若考慮到作為移植片組成物之物理特性(伸展性、生體適合性、強度等)，則較佳為動脈，更佳為內胸動脈。
關於具有分枝之血管，係將脊椎動物麻醉或屠宰後，切開胸部、腹部、腳部等身體的一部分，並切除成為採取對象之具有分枝之血管。麻醉方法或屠宰方法可照樣使用熟習該項技術者以往所施行之方法。 　　切開脊椎動物的身體的一部分時，能夠使用動物實驗或外科用手術中通常所使用之手術刀或剪刀等。
同樣地，在採取具有分枝之血管之情況，能夠使用動物實驗或外科用手術中通常所使用之手術刀或剪刀等。在切除血管之情況，較佳係使用超音波手術刀或電動手術刀。此等能夠在切除血管之處藉由超音波振動或高頻電流一面使血液凝固一面切除血管。特定而言，由於切除部分之蛋白質的變性程度較適度，因而較佳係使用超音波手術刀。 　　另外，在本說明書中，將「超音波手術刀」與「超音波振動手術刀」作為同義使用。
本發明中能夠使用之電動手術刀可列舉Erbe公司製之VIO series或泉工醫科工業公司製之SHAPPER series等。本發明中能夠使用之超音波手術刀可列舉Stryker Medtech公司製之Sonopet UST-2001、Ethicon Endo-Surgery公司製之Harmonic Scalpel等。
(a)步驟中所採取之血管可為已切除分枝部分之狀態，亦可為以充分的長度留下分枝部分之狀態(例如5mm～數cm)。在以充分的長度留下分枝部分之情況，將其適宜地切除。 　　另外，施行蛋白質變性處理之分枝部分的長度較佳為離血管的分岔部分1mm～10mm之位置，更佳為離2mm～7mm之位置，最佳為離3～5mm之位置。藉由在上述範圍中施行蛋白質變性處理，可最小限度地抑制利用本發明之移植用去細胞材料時之伴隨著變性處理之影響(不妨礙物性變化及血流、抗血栓性等)，促進再組織化。
採取自脊椎動物之上述血管係施行去細胞化處理。去細胞化處理可例示界面活性劑處理(Singelyn J.M., et al., Biomaterials, 2009, 30, 5409-5416；Singelyn J.M,, et al., J. Am. Coll. Cardiol., 2012, 59, 751-763；Sonya B., et al., Sci. Transl. Med., 2013, 5, 173ra25)、酵素處理、滲透壓處理、凍結融解處理、氧化劑處理、高靜水壓處理(Sasaki S., et al., Mol. Vis., 2009, 15, 2022-2028；Yoshihide H., et al., Biomaterials, 2010, 31, 3941-3949；Seiichi F., et al., Biomaterials, 2010, 31, 3590-3595；Negishi J., et al., J. Artif. Organs, 2011, 14, 223-231；日本專利第4092397號公報；日本專利再公表2008-111530號公報；日本專利特開2009-50297號公報)及此等之組合，較佳係藉由高靜水壓處理進行去細胞化處理。
關於施行高靜水壓處理時之壓力，只要是會破壞源自屬於脊椎動物之供體之細胞或病原體之程度的壓力即可，可因應供體的動物種或血管的種類而適宜選擇。作為靜水壓，可例示2～1,500MPa。在所施加之靜水壓高於50MPa之情況，自血管之去細胞化係充分地施行。因此，較佳為50～1,500MPa，更佳為80～1,300MPa，再更佳為90～1,200MPa，最佳為95～1,100MPa。
作為施加高靜水壓時所使用之介質，可列舉水、生理食鹽水、緩衝液、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液以及糖類水溶液等。作為緩衝液，可列舉醋酸緩衝液、磷酸緩衝液、檸檬酸緩衝液、硼酸緩衝液、酒石酸緩衝液、Tris緩衝液、HEPES緩衝液及MES緩衝液等。作為糖類水溶液之糖類，可列舉赤藻糖、木糖、阿拉伯糖、阿洛糖、塔羅糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、赤藻糖醇、木糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇、蔗糖、乳糖、麥芽糖、海藻糖、葡聚醣、海藻酸及玻尿酸等。
高靜水壓處理之介質的溫度只要是不會生成冰，沒有熱所引發之對組織之傷害之溫度，即無特別限定。由順利地施行去細胞化處理，對組織之影響亦較少而言，較佳為0～45℃，更佳為4～40℃，再更佳為10～37℃，最佳為15～35℃。
高靜水壓處理的時間若太短，則去細胞化處理未充分地施行，在較長之情況，會涉及能量的浪費，故較佳為5分鐘～12小時，更佳為7分鐘～5小時，再更佳為10分鐘～3小時。
去細胞化的適當與否可藉由組織學染色(蘇木精-伊紅染色)或殘存DNA定量予以確認。
經施加高靜水壓之血管，組織中之細胞被破壞，此細胞成分係藉由洗淨液去除。洗淨液可為與施加高靜水壓時所使用之介質相同的液體，亦可為不同的洗淨液，亦可組合使用複數種類的洗淨液。洗淨液較佳係含有核酸分解酵素、有機溶媒或螯合劑。核酸分解酵素可針對來自經施加靜水壓之血管之核酸成分，有機溶媒可針對脂質，使各自之去除效率提升，螯合劑可藉由將去細胞化組織中之鈣離子或鎂離子去活化，而防止將去細胞化組織應用於患部之情況之石灰化。
在本發明中，係將已切除分枝之部分施行蛋白質變性處理而閉管。在此處，作為將蛋白質進行變性之手段，並無特別限定，由作業的簡易性或效率、減少對組織之損傷之觀點而言，較佳係使用超音波手術刀或電動手術刀，由對組織之損傷較少，且使分枝斷端的閉鎖性確實之方面而言，較佳係使用超音波手術刀。
超音波手術刀具有刀尖會進行機械性超音波振動之結構，刀尖所接觸之生體組織附近產生摩擦熱，生體組織內部之蛋白質便進行變性。將分枝血管切除並開管之部分係藉由使該蛋白質進行變性而黏接並閉管。 　　另外，上述所謂「將已切除分枝之部分施行蛋白質變性處理而閉管」，係設為亦包含同時施行「分枝的切除」及「施行蛋白質變性處理而閉管」之情況。
如上述般使用超音波施行處理時之頻率較佳為20kHz～100kHz，更佳為約30kHz～約60kHz。輸出較佳為50～500mA，更佳為100～400mA，再更佳為200～300mA(利用100VAC時)。
施行超音波處理之時間係因應頻率或輸出而呈多樣，並無特別限定，較佳為0.1秒～10分鐘，更佳為1秒～5分鐘，再更佳為3～60秒。
其次，針對本發明之移植用去細胞化材料之製造方法之各步驟之順序進行說明，該移植用去細胞化材料之製造方法包含 　　(a)自脊椎動物(供體)採取具有分枝之血管之步驟； 　　(b)將該血管進行去細胞化之步驟；以及 　　(c)將已切除分枝之部分藉由蛋白質變性處理來黏接並閉管之步驟。
在此實施形態中，(a)、(b)、(c)各步驟並不限定於上述順序。 　　例如，依序施行步驟(a)、步驟(b)及步驟(c)，除此以外，亦可在步驟(a)之後，施行步驟(c)，然後，施行步驟(b)。此外，作為另一態樣，亦能夠在自屬於供體之脊椎動物採取前切除具有分枝之血管的分枝部分，將該已切除分枝之部分進行蛋白質變性處理，並自供體採取，之後，施行步驟(b)之去細胞化。即，以步驟(c)、步驟(a)、步驟(b)之順序包含之態樣亦含括在本發明中。
作為另一態樣，在步驟(a)中所採取之具有分枝之血管的分枝部分係以充分的長度存在之情況(例如分枝部分的長度為5mm～數cm)，可進一步包含切除此分枝部分之步驟(d)。何時施行此步驟(d)亦無特別限定。 　　例如，亦能夠以步驟(a)、步驟(d)、步驟(b)及步驟(c)之順序、步驟(a)、步驟(b)、步驟(d)及步驟(c)之順序施行。 　　在本發明中，就可在未忽略分枝血管之情形下進行閉管，此外，作業變得更有效率之方面而言，更佳係在(c)步驟中同時施行「分枝的切除」及「施行蛋白質變性處理並閉管」，並且連續地施行(c)步驟及(a)步驟。另外，即便在此情況，亦可在(b)步驟之前後再度施行步驟(c)。
在本發明中，亦提供移植片組成物，其係包含移植用去細胞化材料之生體適合性材料而成，該移植用去細胞化材料係由脊椎動物(供體)之已切除分枝之血管而成，且具有至少1個以上藉由蛋白質變性而閉管之分枝切除部。
所謂本發明之移植片組成物中之脊椎動物，並無特別限定，較佳係可輕易地取得血管，因而較佳為人類以外之動物，特佳為哺乳類家畜或鳥類家畜。在此處之哺乳類家畜或鳥類家畜係與本發明之移植用去細胞化材料之製造方法中所使用之哺乳類家畜或鳥類家畜之具體例中所列舉之家畜相同。在此等之中，由取得的安定性而言，較佳為豬、兔或牛。
在本發明之移植片組成物中，所謂「已切除分枝之血管」，係為了製造本發明之移植用去細胞化材料所使用之自具有分枝之血管切除分枝部分而得之血管。作為具有分枝之血管，可使用與上述製造方法中所使用之血管相同者，若考慮到作為移植片組成物之物理特性(伸展性、生體適合性、強度等)，則較佳為動脈，更佳為內胸動脈。
使用於本發明之移植片組成物中之移植用去細胞化材料具有蛋白質變性部。具體而言，分枝部分的切除處呈開管的狀態，可藉由施行蛋白質變性處理而塞住開管部。 　　蛋白質變性處理之具體方法係與上述移植用去細胞化材料同樣地並無特別限定，可使用超音波手術刀或電動手術刀。由對組織之損傷較少而言，較佳係使用超音波手術刀。
在本發明之移植片組成物中，關於用於使蛋白質進行變性之超音波的頻率及處理時間之條件係與上述移植用去細胞化材料之製造方法中之超音波的頻率及處理時間之條件相同。
針對使用於本發明之移植片組成物中之移植用去細胞化材料，關於去細胞化處理，可施行與上述去細胞化處理同樣的去細胞化處理，較佳係藉由高靜水壓處理進行去細胞化處理。 　　關於施行高靜水壓處理時之壓力，只要是會破壞源自屬於脊椎動物之供體之細胞或病原體之程度的壓力即可，可以與上述靜水壓之條件相同的條件施行。此外，作為施加高靜水壓時所使用之介質，可列舉水、生理食鹽水、緩衝液、丙二醇或其水溶液、甘油或其水溶液以及糖類水溶液等，作為各溶媒之具體例，可使用與上述溶媒之具體例相同的溶媒。
本發明之移植片組成物係由特定的生體適合性材料而成。在此處，所謂「生體適合性」，係意味移植片受到被移植組織接受，不會誘發毒性或顯著的免疫排斥。
作為生體適合性材料，只要是不具流動性且呈固體狀者，即無特別限定，可列舉非再吸收性聚合物或吸收性聚合物、金屬類、玻璃類、陶瓷類。
作為上述非再吸收性聚合物，可列舉聚乙烯、聚對酞酸乙二酯、聚丁烯、聚對酞酸丁二酯、聚丙烯、丙烯酸樹脂、聚醯胺-醯亞胺、聚醚醚酮、聚芳基醚酮、聚碳酸酯、聚醯胺、聚氟乙烯、聚偏二氟乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯以及此等之組合及等價物，但不限定於此等。
作為上述吸收性聚合物，可為合成聚合物，亦可為天然聚合物，可列舉聚胺基酸、聚醯胺、脂肪酸聚酯，作為天然聚合物，可列舉膠原蛋白、彈力蛋白、玻尿酸、層黏連蛋白、明膠、角蛋白、硫酸軟骨素及去細胞化組織。
作為上述金屬類，可列舉鉭、鉭合金、不鏽鋼、鈦、鈦合金、鈷-鉻合金等，可使用自以往以來在醫療機器等中所使用之生體適合性金屬類。
作為上述玻璃類或陶瓷類，可列舉磷酸四鈣、α-及β-磷酸三鈣、磷酸八鈣、羥基磷灰石、經取代之磷灰石、三斜磷鈣石、偏磷酸鹽、焦磷酸鹽、磷酸鹽玻璃等磷酸鹽、鈣及鎂之碳酸鹽、硫酸鹽及氧化物以及此等之組合，但不限定於此等。
本發明之移植片組成物係由至少一部分包含特定的移植用去細胞化材料之生體適合性材料而成。在此處，所謂「至少一部分包含」，係意味該移植用去細胞化材料可以1種以上複數存在於生體適合性材料中。就更有效地達成自體細胞的浸潤之方面而言，生體適合性材料更佳係僅由去細胞化材料所構成。
本發明之移植片組成物移植後能夠作為生體組織的一部分而發揮機能。特定而言，可作為移植用血管代用物而發揮機能。 [實施例]
1.去細胞化豬內胸動脈的製作 (豬內胸動脈的採取(分枝血管的處理)) 　　將月齡3～4個月的食用豬(SPF(specific pathogen free)豬，雌性，體重約50公斤)在麻醉下進行開胸，使內胸動脈露出。將超音波手術刀(Harmonic Scalpel II，HARMONIC SYNERGY，Ethicon Endo-Surgery公司)的設定設為55500Hz、輸出位準2，使分枝血管接觸，一面使其凝固一面自胸壁剝離(採取)內胸動脈。 　　自2頭豬採取4根內胸動脈。
2.豬內胸動脈的觀察 　　測定4根所採取之豬內胸動脈的長度及內徑。各自為(1)長度：140mm，內徑：3.2mm；(2)長度：135mm，內徑：2.6mm；(3)長度：95mm，內徑：2.9mm；(4)長度：105mm，內徑：2.8mm。將所獲得之豬內胸動脈(1)～(4)示於圖2。此外，將其剖面圖(HE染色)示於圖3。
3.豬內胸動脈的去細胞化處理 [使用試藥] ・DNs溶液 　　含有DNase I(Roche，Grade II)50mg/L、MgCl2 ・6H2 O (Wako，試藥特級)2.55g/L之大塚生理食鹽水 ・EtOH溶液 　　將日本藥局方乙醇及大塚生理食鹽水以依體積比成為80％之方式進行調製而得之溶液 ・檸檬酸溶液 　　將檸檬酸三鈉二水合物(Calbiochem，Molecular Biology Grade)及檸檬酸酐(Wako，特級)加至大塚生理食鹽水中，調製成pH7.4而得之溶液
將上述豬內胸動脈以水作為介質藉由超高靜水壓裝置(Dr. Chef，神戶製鋼(股)製)進行處理。超高靜水壓處理係在施加壓力600MPa、升壓時間9分鐘、壓力維持時間120分鐘、降壓時間9分鐘、壓力介質溫度30℃之條件下施行。 　　超高壓處理後以50mg/L DNase I溶液施行洗淨4日，以EtOH溶液施行洗淨3日，以檸檬酸溶液施行洗淨4日，完成去細胞化。
去細胞化係藉由施行蘇木精/伊紅染色(Hematoxylin-Eosin染色，以下，有時亦稱為HE染色)，以顯微鏡確認在HE染色切片影像中並無核酸而施行。 　　另外，HE染色為使用蘇木精及伊紅2種色素，染色區分細胞核及核以外之組織、成分之方法，可以蘇木精將核染成靛藍色，以伊紅將細胞質/纖維類或紅血球染成粉紅色。
4.耐壓強度的測定 　　去細胞化後，以夾具夾持各豬內胸動脈的一端，自相反側使用20mL注射器將生理食鹽水進行送液，而測定耐壓強度。在使用除了上述(3)以外之(1)、(2)、(4)之豬內胸動脈之移植用去細胞化材料中，耐壓強度為150mmHg以上。 　　此外，在分枝部分的一部分未被堵塞之(3)中，可確認到生理食鹽水洩漏。 　　另外，耐壓強度的測定係以注射泵(YSP-101)自20mL注射器以3mL/min的速度將生理食鹽水送液至豬內胸動脈內，以數位壓力計(KDM30)計測此時之壓力。 　　在以後之實驗中，將(1)、(2)、(4)作為實施例，將(3)作為比較例。
5.比較例之血管的縫合 　　針對(3)之移植用去細胞材料，將已切除可確認到生理食鹽水洩漏之分枝血管之部分以6-0脯胺酸線進行結紮。結紮係將縫合線穿通至血管外膜部分後，以自外側綁緊分枝的管狀部分之方式施行。
6.去細胞化豬內胸動脈(由移植用去細胞化材料而成之移植片組成物)至兔大動脈之長期移植 ・移植方法 　　將戊巴比妥鈉鹽酸鹽(商品名：Somnopentyl(註冊商標)0.2ml)、生理食鹽水(1.8ml/兔)、鹽酸美托咪定(medetomidine hydrochloride)(商品名：Dorbene Vet 1ml)皮下注射至體重3.70-4.00kg的兔(品種：日本白兔，5個月齡，雄性)。確認不動化後，將腹部皮膚進行剃毛。進行作為呼吸麻醉之異氟烷吸入(導入時2％，手術時1％)，保定於保定台後，以浸漬著聚維酮碘(povidone iodine)製劑之紗布將皮膚進行消毒。接著，將生理食鹽水3倍稀釋利多卡因(lidocaine)注射液(商品名：Xylocaine(註冊商標))注射於腹部皮下，自耳的靜脈裝設點滴管線，靜脈注射Solita(註冊商標)T-3。使用電動手術刀、剪刀，將皮膚、腹膜切開，使腹部大動脈露出，自點滴管線靜脈注射肝素1000單位(1000單位/mL肝素1mL)，然後確認肝素靜脈注射後經過3分鐘，阻斷腹部大動脈中樞側。將分流管插入至腹部大動脈後，解除血流阻斷。一面以分流管確保血流，一面使用8-0脯胺酸線以端側吻合法將去細胞化豬內胸動脈與腹部大動脈中樞部進行吻合。接著，以同樣的方法將去細胞化豬內胸動脈與腹部大動脈末稍部進行吻合，製作繞道血管。除此以外，為了使血流朝向繞道血管，將中樞吻合部與末稍吻合部之間之腹部大動脈以6-0脯胺酸線進行結紮。去細胞化豬內胸動脈移植後，以4-0PDS線縫合腹膜，以2-0PDS縫合肌層，以4-0PDS線縫合皮膚，將腹部閉合。投予0.5mL作為抗生素之Bayer(註冊商標)，將作為鹽酸美托咪定拮抗劑之鹽酸阿替美唑(atipamezole hydrochloride)(商品名：Atipam Vet 1ml)注射至大腿部皮下。確認清醒後，將兔移至飼育籠中。
・剖檢 　　針對去細胞化豬內胸動脈移植後1個月或3個月之兔施行剖檢。並未自兔裝設點滴管線，以與移植時同樣的方法使腹部大動脈(所移植之去細胞化豬內胸動脈)露出。接著，施行血管開放評估、血栓形成評估。血管開放評估係將腹部大動脈的末稍側切斷，以放血的有無進行判斷。在所有的樣本中確認到放血，顯示出血管已開放。血管開放評估後，將戊巴比妥鈉(Somnopentyl(註冊商標)5mL)注射至耳靜脈，予以犧牲。心臟、呼吸停止後，取出去細胞化豬內胸動脈。將去細胞化豬內胸動脈內部以生理食鹽水洗淨後，沿長軸方向切開，以目視觀察血栓形成。於去細胞化豬內胸動脈的內腔面並未附著血栓，顯示出抗血栓性較高。另外，所謂「開放」，係指在血管的內腔並未堵塞之情形下，維持中空的狀態。
・病理標本製作 　　所移植之去細胞化豬內胸動脈之病理標本的製作係由新組織科學研究所(股)進行。此時，在去細胞化豬內胸動脈之可確認以超音波手術刀或6-0脯胺酸線堵塞之分枝血管部分的組織結構之部分施行HE染色切片、范吉爾森彈性纖維染色(Elastica van Gieson染色，以下，有時亦稱為EVG染色)，並施行EVG染色切片的製作。具體而言，沿血管的長軸方向以大約5μm厚連續地製成切片，在可確認以超音波手術刀或6-0脯胺酸線堵塞之分枝血管部分的組織結構之部分製成切片。
另外，EVG染色為鑑定彈性纖維之染色方法，可將結締組織中之彈力蛋白染色區分成黑紫色，將膠原蛋白染色區分成紅紫色。
將實施例樣本之HE染色影像、EVG染色影像(3個月)、比較例樣本之HE染色影像、EVG染色影像(3個月)示於下(圖4)。在實施例樣本中，得知細胞亦浸潤於以EVG染色染成黑紫色之去細胞化豬內胸動脈組織部分中。另一方面，在比較例樣本中，得知在以EVG染色染成黑紫色之去細胞化豬內胸動脈組織部分中並未看到細胞的浸潤。 　　此外，在實施例樣本中，發現在移植後1個月之階段，分枝血管的段差被兔細胞所覆蓋之觀察結果(圖5)。
7. 　　由源自流通食用豬之肉塊，將超音波手術刀(EES Generator，HARMONIC SYNERGY，HARMONIC FOCUS+，＜使用Blue Handpiece＞，Ethicon Endo-Surgery公司)的設定設為55500Hz、輸出位準5及2，使分枝血管接觸，一面使其凝固一面自胸壁剝離(採取)內胸動脈。使分枝血管的凝固在離血管的分岔部分3-5mm之位置施行，剝離(採取)5根內胸動脈。以上述「3」所記載之方法施行去細胞化處置後，以上述「4」所記載之方法施行耐壓強度的測定。其結果，確認在所有5根樣本中，耐壓強度為250mmHg以上。
1‧‧‧具有分枝之血管
2‧‧‧分枝部分(分枝血管)
3‧‧‧蛋白質變性部
[圖1]圖1示出具有分枝之血管之概略圖。(i)之1表示具有分枝之血管，2表示分枝部分(分枝血管)，以及虛線表示切除分枝部分之位置之一例。此虛線較佳係離血管1mm～2mm。此外，作為另一實施態樣，此虛線之位置亦可離血管5mm～數cm。(ii)之3表示蛋白質變性部。 　　[圖2]圖2係示出在實施例中，採取自豬之已切除分枝部分之內胸動脈片之圖。另外，在以下實施例中，使用圖中(3)之內胸動脈片作為比較例。 　　[圖3]圖中(α)為將所採取之豬的內胸動脈片進行蘇木精/伊紅染色而得之剖面圖的放大照片。此外，(β)為將所採取之豬的內胸動脈片進行去細胞化，並進行蘇木精/伊紅染色而得之移植用去細胞化材料之剖面圖的放大照片。可確認核酸不存在而經去細胞化。另外，各線狀比例尺表示1000μm。此外，在以下實施例中，使用圖中(3)之內胸動脈片作為比較例。 　　[圖4]圖4為將屬於移植用去細胞化材料之去細胞化豬內胸動脈片移植至兔3個月後之藉由蘇木精/伊紅染色(HE染色)或范吉爾森彈性纖維染色(Elastica van Gieson stain，EVG染色)進行染色而得之切片的放大照片。在比較例中，圓圈所圍繞之部分之箭頭所指之白色小圓為脯胺酸線通過之痕跡。脯胺酸線係對著紙面垂直通過。可理解在脯胺酸線通過之周邊並未看到細胞的浸潤。另外，各線狀比例尺表示500μm。 　　[圖5]左側的圖為將屬於移植前之本發明之移植用去細胞化材料之去細胞化豬內胸動脈片進行HE染色而得之分枝部分之切片的放大照片。右側的圖為移植1個月後之經HE染色之分枝部分之切片的放大照片。移植後可看到細胞的浸潤。另外，各線狀比例尺表示500μm。

Claims (7)

  1. 一種移植用去細胞化材料之製造方法，其包含 　　(a)自脊椎動物(供體)採取具有分枝之血管之步驟； 　　(b)將該血管進行去細胞化之步驟；以及 　　(c)將已切除分枝之部分藉由蛋白質變性處理來黏接並閉管之步驟。
  2. 如申請專利範圍第1項之移植用去細胞化材料之製造方法，其中，在前述步驟(a)之後，包含(d)切除所採取之血管的分枝之步驟。
  3. 如申請專利範圍第1或2項之移植用去細胞化材料之製造方法，其中，前述蛋白質變性處理為超音波振動處理。
  4. 如申請專利範圍第1至3項中任一項之移植用去細胞化材料之製造方法，其中，步驟(b)之去細胞化包含超高靜水壓處理。
  5. 一種移植片組成物，其係包含移植用去細胞化材料之生體適合性材料而成，該移植用去細胞化材料係由脊椎動物(供體)之已切除分枝之血管而成，且具有至少1個以上藉由蛋白質變性而閉管之分枝切除部。
  6. 如申請專利範圍第5項之移植片組成物，其中，前述血管包含內胸動脈。
  7. 一種移植片組成物，其係由包含豬的內胸動脈之血管的去細胞化組織而成，且具有藉由蛋白質變性而閉管之分枝切除部。
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