JP5331960B2 - 脱細胞化軟組織の調製方法、移植片、及び培養部材 - Google Patents
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Description
単離された軟組織に媒体中で超高静水圧を印加することで、前記軟組織内の細胞を破壊する印加手順と、
破壊された細胞を除去する除去手順と、を含み、
前記媒体は、水溶性多糖を含有する水溶液である調製方法。
ここで、印加手順における媒体として、水溶性多糖を含有する水溶液を採用したので、超高圧処理の印加後における軟組織の膨潤を抑制できる。
そこで(3)の発明によれば、超高静水圧を1000気圧以上としたので、常在菌の細胞が充分に破壊され、脱細胞化組織への常在菌の残存が抑制される。よって、安全性を向上できる。
(6)の発明によれば、軟組織として角膜を採用したので、角膜由来の脱細胞化組織の膨潤が抑制される。これにより、動物への移植後における有用性を向上できる。
(1)から(6)いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備える移植片。
本発明の脱細胞化組織の調製方法は、印加手順と、除去手順とを含む。各手順の詳細を以下に説明する。
印加手順は、単離された軟組織に媒体中で超高静水圧を印加することで、軟組織内の細胞を破壊する手順である。使用される軟組織としては、特に限定されないが、例えば、角膜、軟骨、気管、心膜、羊膜、及び皮膚が挙げられる。
印加手順は温度保持手順を有することが好ましく、この温度保持手順は、媒体の温度を、超高静水圧における媒体の融点以上に保持する手順である。これにより、超高静水圧まで昇圧された条件においても、媒体の凝固が抑制され、調製される脱細胞化組織の構造や特性の損傷を抑制できる。
印加手順は圧力制限手順を有することが好ましく、この圧力制限手順は、媒体に印加される印加圧が、媒体の融解圧以上になることを制限する手順である。印加圧の昇圧や降圧の開始時には、瞬間的に媒体の温度が急変し、軟組織の構造や特性が大きく損傷される場合がある。圧力制限手順では、媒体の組成に基づいて融解圧を予め算出し、特に印加圧の昇圧及び/又は降圧の速度を所定値以下に低減することで、媒体温度の急変を抑制する。これにより、昇圧及び降圧の過程での媒体の凝固が抑制され、脱細胞化組織の構造や特性の損傷をより抑制できる。
除去手順は、破壊された細胞を除去する手順である。移植後において、破壊された細胞の残渣が免疫反応等を誘発することが懸念されるが、この懸念は除去手順により払拭される。
本発明の脱細胞化組織は、動物に移植される移植片の構成として有用である。即ち、本発明の移植片は、前述の脱細胞化組織を備える。また、移植片は、脱細胞化組織が由来する軟組織が動物体内において隣接していた隣接組織を、脱細胞化組織上に備えてよい。例えば、脱細胞化組織(図1(B)参照)が由来する軟組織が角膜であった場合(図1(A)参照)、隣接組織は角膜上皮又は角膜内皮となる。
本発明の脱細胞化組織は、隣接組織の細胞を培養するために用いられる培養部材としても有用である。即ち、本発明の培養部材は、前述した脱細胞化組織を備えるものであり、この脱細胞化組織上に隣接組織由来の細胞を載置し、適切な条件下で培養することで、特別な装置を使用する必要なく且つ感染を抑制しつつ、細胞培養を行うことができる。これらの点は、従来公知の培養シートや羊膜に比べて格別に有利な効果である。
食用ブタ養殖場からブタ由来の角膜を購入し、4℃にて搬送した。この角膜をPBS溶液で洗浄した後、媒体としての3.5質量%デキストラン70を含むPBS溶液が満たされたポリエチレン製フィルムの袋内に湿潤させた。この袋を、「Dr.CHEF」(神戸製鋼所社製)のチャンバー内に載置し、温度を30℃に保持しつつ、4000気圧の静水圧を30分間印加した(印加手順)。この間、昇圧及び降圧速度がそれぞれ5000気圧/分となるように、「Dr.CHEF」を制御した(圧力制限手順)。その後、印加後の角膜をPBS溶液で72時間洗浄し、角膜内部の細胞を除去した(除去手順)。これにより、脱細胞化組織を調製した。
印加圧を10000気圧の静水圧とした点を除き、実施例1と同様の手順で、脱細胞化組織を調製した。
媒体の温度を10℃とした点を除き、実施例2と同様の手順で、脱細胞化組織を調製した。
実施例1で使用した角膜を、1w/v%SDSを含むPBS溶液に37℃で24時間浸漬した後、PBS溶液に24時間浸漬した。これにより、脱細胞化組織を調製した。
実施例1で使用した角膜を、1w/v%「TritonX−100」(登録商標)を含むPBS溶液に37℃で24時間浸漬した後、PBS溶液に24時間浸漬した。これにより、脱細胞化組織を調製した。
実施例1で使用した角膜を、1w/v%コール酸ナトリウムを含むPBS溶液に37℃で24時間浸漬した後、PBS溶液に24時間浸漬した。これにより、脱細胞化組織を調製した。
デキストラン70を含むPBS溶液の代わりに、デキストラン70を含まないPBS溶液を用いた点を除き、実施例1と同様の手順で脱細胞化組織を調製した。
(膨潤度)
実施例及び比較例で調製した脱細胞化組織と、対照区として実施例で使用した印加前の角膜(未処理)とについて、膨潤の程度を観察した。この結果を図2及び図3に示す。図2における(A)は対照区、(B)は比較例1、(C)は比較例2、(D)は比較例3、(E)は実施例1、(F)は実施例2の結果をそれぞれ示す。また、(A)、(E)、(F)は、各脱細胞化組織の上面図であり、(B)、(C)、(D)は、各脱細胞化組織の側面図である。図3における左側は比較例4、右側は実施例1の結果を示す。
実施例及び比較例で調製した脱細胞化組織と、対照区として実施例で使用した印加前の角膜(未処理)との断面について、通常の手順でHE染色を行った。染色後の各組織断面の顕微鏡写真を図2に示す。(G)は対照区、(H)はSDSを用いた比較例、(I)はTritonX−100を用いた比較例、(J)はコール酸ナトリウムを用いた比較例、(K)は実施例1、(L)は実施例2の結果をそれぞれ示す。
生体角膜は、角膜内皮細胞のポンプ機能により約70%の膨潤度に調節され、その透明性が維持されていることが既に知られている。従って、角膜由来の脱細胞化組織を脱水により収縮させた際、透明性が回復するのであれば、移植後に膨潤度が調節されて透明性が回復する可能性が高く、移植片としての応用可能性が示唆されることになる。
次に、脱細胞化組織の力学的特性についての評価を行った。まず、実施例2、3で調製した脱細胞化組織と、これら脱細胞化組織を50%グリセロール水溶液に3日間浸漬し脱水処理を行ったものとを、それぞれ幅3mm、長さ15mmの短冊状に切り取り、この切片に対して、力学試験機「レオナーII」(山電社製)を用いて、種々の張力を負荷した際の応力を計測した。また、対照区として、角膜(対照区1)、この角膜をPBS溶液中に72時間浸漬したもの(対照区2)、並びに対照区2のものを100質量%グリセロールに1時間浸漬したもの(対照区3)をそれぞれ用意し、張力及び応力の関係を併せて測定した。この結果を図6(A)に示す。なお、図6(A)におけるAは実施例3、Bは実施例2、Cは実施例3の脱水処理後、Dは実施例2の脱水処理後、Eは対照区1、Fは対照区2、Fは対照区3をそれぞれ示す。
ウサギの角膜実質のみを、4箇所において部分的に切除した。一方、実施例2で調製した脱細胞化組織及び実施例2で使用した角膜を、切除部位と同じ大きさに切り取ることで、移植片を作製した。この移植片の各々を、切除部位に埋入し、残しておいた角膜上皮を被せた。この時点におけるウサギの眼球の状態を図7に示す。その後、ウサギを通常の条件で8週間飼育した後、眼球の状態を再び観察した。この結果を図8に示す。図7及び8における1及び4で示される切除部位には角膜の移植片を、2及び3で示される切除部位には脱細胞化組織の移植片を、それぞれ埋入した。
角膜上皮を被せず、脱細胞化組織の移植片を露出させた点を除き、臨床1で述べると同様の手順で試験を行った。移植1週後、2週後、及び3週後において、フルオレセインナトリウムを、フローレンス試験紙を用いて眼球に滴下し、その後1〜10分の間における眼球を蛍光照射下で観察した。なお、この蛍光色素は、角膜上皮を染色することはできず、角膜実質を染色できることが既に確認されている。この結果を図10の上段に示す。観察後は試薬を生理食塩水にて洗い流し、1週間ごとに繰り返し観察を行った。また、移植1週後、2週後、及び3週後における眼球を可視光下で観察した結果を図10の下段に示す。
Claims (8)
- 動物由来の軟組織が脱細胞化された脱細胞化軟組織の調製方法であって、
単離された軟組織に媒体中で4000気圧以上の超高静水圧を印加することで、前記軟組織内の細胞を破壊する印加工程と、
破壊された細胞を除去する除去工程と、を含み、
前記媒体は、水溶性多糖を含有する水溶液である調製方法。 - 前記水溶性多糖は、デキストラン、アルギン酸、ヒアルロン酸、トレハロース、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、ポリビニルピロリドンからなる群より選ばれる少なくとも1種である請求項1記載の調製方法。
- 前記印加工程は、前記媒体の温度を、前記超高静水圧における前記媒体の融点以上に保持する温度保持工程を有する請求項1又は2記載の調製方法。
- 前記印加工程は、前記媒体に印加される印加圧が、前記媒体の融解圧以上になることを制限する圧力制限工程を有する請求項1から3いずれか記載の調製方法。
- 前記軟組織は、角膜である請求項1から4いずれか記載の調製方法。
- 動物に移植される移植片であって、
請求項1から5いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備える移植片。 - 前記脱細胞化軟組織上に位置し、前記動物において前記軟組織に隣接する隣接組織を更に備える請求項6記載の移植片。
- 請求項1から5いずれか記載の調製方法で調製された脱細胞化軟組織を備え、前記脱細胞化軟組織が由来する動物と同種の動物由来の軟組織に隣接する隣接組織の細胞を生体外で培養するために用いられる培養部材。
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JPN6008017173; 木村剛他: '人工角膜としての脱細胞化角膜の創製' 東京医科歯科大学生体材料工学研究所年報 Vol.40, 20070303, p.16-19 * |
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