WO2004024170A1 - 超高静水圧印加による移植用生体組織の処理方法 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a technique for achieving destruction of donor cells, cell death, and virus inactivation from a biological tissue for transplantation.
  • a tissue piece for transplantation is produced by chemical treatment of a living tissue with a fixing agent such as glutaraldehyde, or by removing cellular components from the living tissue, and is widely applied clinically.
  • a fixing agent such as glutaraldehyde
  • a heterogeneous biological valve is a buyu heart valve or ushi pericardium immobilized with glutaraldehyde to reduce immunogenicity. Although this heterogeneous valve is superior in anticoagulant properties,
  • An object of the present invention is to improve the problems of the prior art as described above. That is, firstly, the removal of cellular components and cells and viruses inside a large tissue that cannot be achieved by chemical treatment, secondly, processing without sacrificing biomechanical properties, and third, It is a simple and quick sterilization of tissue.
  • a method for treating a biological tissue for transplantation is utilized by utilizing the destruction of cell membranes, the death of bacteria, and the inactivation of viruses under high pressure. It was devised to be used as
  • an ultrahigh hydrostatic pressure is applied to a transplantable animal-derived tissue in a medium so that the connective tissue is in contact with other components including cells while maintaining the structure and biomechanical properties.
  • a method for treating a biological tissue for transplantation characterized by being separable from the body.
  • Fig. 1 Cross-sectional picture of porcine heart valve tissue. Surfactant treatment for 24 hours on the left, high pressure treatment for 10 hours, 10 minutes on the right, surfactant treatment reveals cell nuclei remaining in the deep tissue (lower left).
  • FIG. 2 Cross-sectional picture of porcine heart valve tissue. Surfactant treatment for 24 hours on the left, high pressure treatment for 100 hours on the right, 100 minutes at 100 minutes. In either case, the tissue is well preserved without any loosening of the tissue.
  • Fig. 3 Processing time dependence of breaking strength of porcine heart leaflets. Surfactant treatment on the left, high pressure treatment on the right, 100 atm, and surfactant treatment, the breaking strength tends to increase with the treatment time, but no change is observed in the high pressure treatment.
  • Fig. 4 Processing time dependence of elastic modulus of porcine heart leaflets. Surfactant treatment on the left, high pressure treatment on the right 1 0 0 0 atmosphere. In the surfactant treatment, the elastic modulus tends to increase with the treatment time, but no change is observed in the high pressure treatment.
  • Fig. 5 Results of culturing for 1 day after high-pressure treatment of vascular tissue previously infected with resident bacteria. In the treatment at 100 atm, turbidity of the medium due to cell growth is observed, but not at 500 atm or more.
  • the high pressure used here is in the range from 500 to 1500 atm, and research in the food field has already shown that sterilization is possible. It has also been reported that cell destruction and virus inactivation occur. However, there are no examples that have been comprehensively taken into consideration and proposed as a treatment method for transplantation. Considering all these factors, we have developed a new treatment method for biological tissue for transplantation by setting a condition range and a new treatment temperature range for each factor.
  • a device such as a Kobe Steel Docsiff can be used.
  • an ultra-high pressure experimental device manufactured by Kogaku Engineering Co., Ltd. can be used.
  • a treatment system is installed in a small chamber, and a hydrostatic pressure of up to about 150,000 atmospheres can be applied using a liquid as a medium.
  • the temperature in the chamber can be controlled by controlling the temperature in the outer jacket.
  • the removal of cell nuclei is diffusion from the surface of the surfactant. Because of the permeation and permeation, it took a long time to remove cells deep in the tissue. Ultra-high pressure treatment can completely destroy and remove cells in the tissue in a short time of 30 minutes. Furthermore, it can be processed evenly to the inside of the cell debris.
  • the efficiency of the washing process for removing cellular components can be dramatically increased.
  • a significant reduction in antigenic causative substances can be achieved.
  • Example Similar to the above, hard tissue processing such as bone, cartilage, and teeth can be performed.
  • Example It can be used for cell destruction treatment of animal and plant-derived tissues that contain cells.
  • a pig heart was purchased from an edible pig breeding ground and transported at 4 ° C.
  • the warm ischemic time at the time of heart removal was set to 20 minutes or less.
  • the pulmonary valve and blood vessel were removed and washed with Hank's solution.
  • the donor cells were applied with a hydrostatic pressure of 37 ° (: 10 00 to 100 0 00 atmospheres) for 10 to 30 minutes using a doctor-made shaft manufactured by Kobe Steel.
  • Treatment The tissue cross-section of the specimen was histologically evaluated by light microscopic observation with HE staining and EVG staining. The biomechanical characteristics of the heart valve leaf treated with high pressure were 3 mm wide and long.
  • a strip of about 15 mm in length was cut out and subjected to a tensile test with a mechanical testing machine (Tensilon) to measure the tension until breakage. .
  • the film thickness of the leaflets was obtained from the weight and specific gravity of the cut piece after measurement, and the elastic modulus was calculated from the stress strain characteristics.
  • the infectivity of the tissue was evaluated by evaluating the bacterial growth ability by culturing the vascular tissue previously infected with resident bacteria after high-pressure treatment. As a result, as shown in Fig. 1, in the porcine pulmonary leaflet tissue decellularized by ultrahigh pressure treatment, the cells could be completely removed to the deep part of the tissue.
  • the nucleus was not stained after 6 hours of immersion in the several hundred / m-thick leaflets, but the myocardium at the base of the leaflets The nuclei of cells in the tissue were stained at 1 mm or more from the surface even after 4 hours of treatment I.
  • the biomechanical characteristics of the normal porcine pulmonary valve leaflets were about 1.05, which was almost equal to the vessel wall. Reference to the tangential direction of the vascular wall of the leaflet 0.

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Abstract

移植用生体組織の処理方法は、移植可能な動物由来組織へ媒体中で超高静水圧を印加する。この処理によって、構造および生体力学的性をインタクトに保った状態で結合組織を細胞を含む他の成分から分離可能になる。

Description

明細」 超高静水圧印加による移植用生体組織の処理方法 〔技術分野〕
本発明は、 移植用の生物由来組織から ドナー細胞の破壊、 細胞の 死滅とウィルス不活化を達成する技術に関する。
〔背景技術〕
生体組織をグルタルアルデヒ ドのような固定剤によつて化学処理 することによって、 あるいは生体組織から細胞成分を取り去ること によって移植用組織片が作成され、 広く臨床応用されている。 例え ば心臓弁置換術において、 異種生体弁はブ夕心臓弁あるいはゥシ心 膜を免疫原性の低下のためにグルタルアルデヒ ドで固定化したもの である。 この異種生体弁は抗凝固性に優れてはいるが、 若年者では
5〜 1 0年程度の耐久性しかなく.、 通常は 6 0歳以上の高齢者への 適用とされる。 欧米では 1 9 8 5年頃から、 我が国でも近年、 凍結 保存による組織バンクが整備されたことで、 死体から提供された凍 結保存同種弁が臨床で使用されつつある。 この同種弁は機械弁に比 ベて抗血栓性で、 異種生体弁に比べて耐久性で、 そして両者に対し て抗感染性で優れているとされる。 しかしながら、 提供数が絶対的 に不足しているのが大きな問題である。 また、 若年者では比較的早 期に機能不全を来す症例も報告されており、 免疫反応の関与が強く 示唆されている。 若年者に有効とされる R o s s手術では、 自己肺 動脈弁を大動脈弁位に置換移植し、 欠損した肺動脈弁を凍結保存同 種弁によって再建するが、 大動脈弁位に移植された自己肺動脈弁は 患者の成長とともに増大するという特徴がある。 これに対して、 機 械弁ゃ異種生体弁はもとより、 凍結保存同種弁でも成長性を有しな いため、 小児患者の場合では再移植となる場合が少なくない。 最近 、 これらの問題を解決するために、 同種弁から ドナ一由来細胞を除 去することで抗原性の減弱によつて免疫反応の関与を低下させるこ とで、 耐久性及び自己化を向上させる研究の報告がなされてきた。 米国 C r y o L i f e社は S y n e r G r a f t と称する薬液処理 による細胞除去方法を発表しており、 移植後数ケ月間で自己細胞が 組織内に浸潤し、 自己組織化すると報告している。 また、 ドイツ · ハノーバー医科大学の H a V e r i c hらのグループは、 界面活性 剤である T r i r o n X - 1 0 0やタンパク分解酵素である ト リプ シン溶液を細胞除去に用いている。 しかしながら、 従来の界面活性 剤あるいは薬液のみによる洗浄工程だけでは、 組織片内部の細胞成 分および細菌やゥィルスの除去は薬液の表面からの拡散および浸透 によるため、 十分ではない。 また、 このような制約のため、 大型の 組織片の処理については完全な細胞除去や細菌、 ゥィルス除去が困 難であった。 また、 化学処理による場合では、 十分な効果を得るた めには処理の度合いを高める必要があり、 それによつて埋入後の石 灰化や処理試薬の除去などの問題が生じる。 さ らに、 硬膜移植にお ける B S E及び C J Dの感染で明らかとなったように、 移植組織の 安全性確保は極めて重要であるが、 現在の化学薬液処理においては 、 組織内のゥィルスを完全に不活化できるとの保証が得られていな い。 また、 処理過程における汚染によって、 移植用組織からの感染 事故もしばしば発生している。
〔発明の開示〕 本発明の目的は、 上記のような従来技術の問題点を改善すること にある。 すなわち、 まず第 1 に、 薬液処理では達成できない大型組 織内部の細胞成分および細胞やウィルスの除去を達成すること、 第 2 に、 生体力学特性を損なう ことなく処理を行う こと、 第 3 に、 簡 便かつ短時間にて組織の滅菌を行う ことである。
本発明では、 上記の課題を解決するために鋭意研究した結果、 高 圧下においては、 細胞膜の破壊、 細菌の死滅、 ウィルスの不活化の 起こることを利用して、 移植用生物由来組織の処理法として利用す ることを考案した。
本発明は移植可能な動物由来組織へ媒体中で超高静水圧を印加す ることによ り、 構造および生体力学的性をィ ンタク トに保った状態 で結合組織を細胞を含む他の成分から分離可能とすることを特徴と する移植用生体組織の処理方法を提供する。
〔図面の簡単な説明〕
図 1 ブタ心臓弁組織の組織断面写真。 左が界面活性剤処理 2 4時 間、 右が高圧処理 1 0 0 0 0気圧 1 0分、 界面活性剤処理では組織 深部 （左下） 内では細胞核の残存が認められる。
図 2 ブタ心臓弁組織の組織断面写真。 左が界面活性剤処理 2 4時 間、 右が高圧処理 1 0 0 0 0気圧 1 0分、 いずれも、 組織のルーズ 二ング等が見られずに、 コラーゲン組織が良好に保存されている。 図 3 ブタ心臓弁葉の破断強度の処理時間依存性。 左が界面活性剤 処理、 右が高圧処理 1 0 0 0 0気圧、 界面活性剤処理では破断強度 が処理時間に従って増加する傾向にあるが、 高圧処理では変化が認 められない。 図 4 ブタ心臓弁葉の弾性率の処理時間依存性。 左が界面活性剤処 理、 右が高圧処理 1 0 0 0 0気圧。 界面活性剤処理では弾性率が処 理時間に従って増加する傾向にあるが、 高圧処理では変化が認めら れない。
図 5 あらかじめ常在菌を感染させた血管組織を高圧処理した後、 1 日間培養した結果。 1 0 0 0気圧処理では細胞の増殖による培地 の混濁が見られるが、 5 0 0 0気圧以上では認められない。
〔発明を実施するための最良の形態〕
ここで用いる高圧とは 5 0 0 0気圧から 1 5 0 0 0気圧程度まで の範囲であり、 食品分野での研究において、 滅菌が可能であること がすでに示されている。 また、 細胞破壊およびウィルス不活化がお こることも報告されている。 しかしながら、 これらを総合的に勘案 し、 移植用処理法と して提案した事例はない。 これらの要因をすベ て勘案し、 かつ、 それぞれの要因についての条件範囲および新たに 処理温度範囲を設定することで、 新しい移植用生物由来組織の処理 法を開発した。 超高静水圧印加には、 例えば、 神戸製鋼所製ドク夕 ーシ フ等の装置が使用可能である。 あるいは光工学社製の超高圧 実験装置も使用可能である。 いずれも、 小型チャンバ一内に処理組 織を設置し、 液体を媒体として 1 5 0 0 0気圧程度までの静水圧が 印加できる。 また、 同時にチャンバ一内の温度を、 チャンバ一外套 の温度をコン トロールする事によつて制御可能である。 食品分野と 異なり、 移植用生体組織の場合は、 生体力学特性を変化させないた めに、 構成マ ト リ ッ タスの変性を防ぐ必要があり、 高圧印加時にお いて温度が氷点以下や 4 0 °C以上になることを避けなければならな い。 薬液処理の場合、 細胞核の除去は界面活性剤の表面からの拡散 および浸透によるため、 組織深部の細胞除去には長時間の処理が必 要であった。 超高圧処理では、 3 0分という短時間で、 組織内の細 胞を完全に破壊し、 除去することが可能である。 さらに、 細胞片の 内部まで均等に処理することができる。 利用分野または用途は、
1 ) 移植用動物由来軟組織
例 ： 脳死あるいは心臓死ドナ一からの移植用軟組織処理。 も しく はブタ、 ゥシ等の異種動物からの移植用軟組織処理。 細胞成分を除 去する洗浄処理工程の効率を飛躍的に高めることができる。 また、 抗原性原因物質の大幅な減少が達成できる。
2 ) 移植用動物由来硬組織
例 ： 上記と同様に、 骨 · 軟骨 · 歯などの硬組織処理を行う ことが できる。
3 ) 医療用生物組織の処理
例 ： 動物および植物由来組織のうち、 細胞を含んだものについて の細胞破壊処理に用いることができる。
実施例
1 . 食用ブタ繁殖場からブタ心臓を購入し、 4 °Cにて搬送した。 心 臓摘出時における温阻血時間は 2 0分以内と した。 肺動脈弁、 血管 を摘出し、 ハンクス液で洗浄した。 ドナー細胞を神戸製鋼所製ドク タ一シヱフにて、 3 7 ° (：、 1 0 0 0 〜 1 0 0 0 0気圧の静水圧を 1 0〜 3 0分印加した。 処理後、 P B S溶液にて洗浄除去した。 処理 標本の組織断面を H E染色及び E V G染色によ り光顕観察すること で、 組織学的に評価した。 生体力学的特性は、 高圧処理した心臓弁 葉を幅 3 m m、 長さ約 1 5 m mの短冊状に切り取り、 力学試験機 （ テンシロン） にて引っ張り試験を行い、 破断までの張力を測定した 。 測定後の切断片の重量と比重から弁葉の膜厚を求め、 応力歪み特 性から弾性率を計算した。 組織の感染性は、 あらかじめ常在菌にて 感染させた血管組織を高圧処理した後、 培養するこ とで細菌増殖能 を評価して行った。 その結果、 図 1 に示すように、 超高圧処理によ つて脱細胞化したブタ肺動脈弁葉組織では、 組織深部まで完全に細 胞を除去することができた。 これに対して、 界面活性剤で処理した 肺動脈弁葉断面では、 厚さ数百/ / mの弁葉内においては、 浸漬処理 6時間後には細胞核は染色されなかったが、 弁葉基部の心筋組織内 細胞の核は処理 I 4時間後でも、 表面から 1 m m以遠では染色され た。 また、 図 2 に示すように、 超高圧処理後においても弁葉内のコ ラ一ゲン線維やエラスチン線維が保存されていることが認められた 。 生体力学特性は、 正常ブタ肺動脈弁葉の比重は約 1 . 0 5であり 、 血管壁とほぼ等しい値であった。 弁葉の血管壁接線方向を基準 0 。 と して、 力学特性の異方性について検討したところ、 9 0 ° 方向 はしなやかで弱く、 0 ° 方向は硬くて強い特性を持っていた。 図 3 および 4 に示すように、 超高圧による脱細胞化処理においては、 力 学特性への影響が全く みられなかった。 これに対し、 界面活性剤処 理では、 処理時間によって強度、 弾性率とも増加する傾向を示した 。 さ らに、 あらかじめ常在菌によって感染させた血管組織を高圧処 理したところ、 図 4 に示すように、 5 0 0 0気圧以上印加した場合 、 細菌感染が認められなく なった。

Claims

請求の範囲
1 . 移植可能な動物由来組織へ媒体中で超高静水圧を印加するこ とによ り、 構造および生体力学的特性をィ ンタク トに保った状態で 結合組織を細胞を含む他の成分から分離可能とすることを特徴とす る移植用生体組織の処理方法。
2 . 処理される組織は、 血管、 心臓弁膜、 角膜、 羊膜、 および硬 膜を含む軟組織である請求項 1 の方法。
3 . 処理される組織は、 骨、 軟骨、 歯を含む硬組織である請求項 1 の方法。
4 . 処理される組織は、 心臓、 腎臓、 肝臓、 膝臓、 骨、 脳を含む 臓器も しく はその一部である請求項 1 の方法。
5 . 超高静水圧は 5 0 0 0〜 1 5 0 0 0気圧である請求項 1 の方 法。
6 . 超高静水圧の印加は、 0 ：〜 4 0 °Cの温度で実施される請求 項 1 の方法。
7 . 前記媒体は、 水、 高張液、 低張液、 界面活性剤溶液、 酵素液 、 または少割合の有機溶媒を含むこれらの媒体である請求項 1 の方 法。
8 . 処理後、 洗浄によ り破壊された細胞を組織から除去する工程 を含む請求項 1 ないし 7のいずれかの方法。
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