JPWO2014065017A1 - 人工血管、および、人工血管の製造方法 - Google Patents
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Abstract
血栓の形成を防ぐことができる人工血管、および、当該人工血管の製造方法を提供するために、生体由来の血管組織から得られる細胞外マトリックスに対して、特定のアミノ酸配列を含むペプチドが付加されて形成されている、内腔断面の直径が４ｍｍ以下である人工血管を用いる。
Description
本発明は、人工血管、および、人工血管の製造方法に関する。
現在、生体内の元々の組織に代わって生体内で機能し得る人工組織に注目が集まっており、その開発が進められている。
例えば、特許文献１および２には、移植可能な動物に由来する各種組織から細胞等を除去して結合組織を取り出し、当該結合組織を人工組織として用いる技術が開示されている。
人工組織の種類としては多様であり、例えば、軟組織（例えば、血管、心臓弁膜、角膜、羊膜、および硬膜など）、硬組織（例えば、骨、軟骨、および歯など）、または、臓器（例えば、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、および脳など）として機能し得る人工組織の開発が進められている。
生体内に存在する組織の中でも、血管は、様々な太さ、長さ、分岐等を有するバリエーションに富んだ組織であるといえる。また、血管は、絶えず血流からの圧力を受けるという過酷な環境に晒されるため、また、縫合等の手術時に大きな力が加わるため、強度が高い必要がある。
近年、循環器系の疾患を患う患者の数が増加するにしたがって、人工血管の需要が増加し、当該需要に応えるために、様々な人工血管が開発され用いられている。
例えば、ｅＰＴＦＥやダクロン（登録商標）などの合成高分子によって作製された人工血管が開発され、用いられている。このような合成高分子によって作製される人工血管は、内腔の断面が太い場合（換言すれば、中口径や大口径である場合）には有効に機能し、このような人工血管は、年間略７０万本も使用されている。
しかしながら、上述のような従来の人工血管は、人工血管の内腔が細いと、内腔に血栓が生じ易いという問題点を有している。
例えば、人工血管の断面における内腔の形状を円形と考えた場合に、当該円の直径が４ｍｍ以下になると、移植してから短時間の間に人工血管の内腔に血栓が形成され、これによって血流が阻害される。
本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、血栓の形成を防ぐことができる人工血管、および、当該人工血管の製造方法を提供することにある。
本発明の人工血管は、上記課題を解決するために、生体由来の血管組織から細胞を除去して得られる細胞外マトリックスによって形成されている人工血管であって、上記人工血管の内腔断面の直径が４ｍｍ以下であり、上記細胞外マトリックスには、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドが付加されていることを特徴としている。
本発明の人工血管の製造方法は、上記課題を解決するために、血管の内腔断面の直径が４ｍｍ以下である生体由来の血管組織から細胞が除去された細胞外マトリックスを得る第１工程と、上記細胞外マトリックスに対して、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドを付加する第２工程と、を有することを特徴としている。
本発明は、内腔が細い人工血管であったとしても、当該人工血管の内腔に血栓が形成されることを防止することができるという効果を奏する。
本発明では、生体に由来する細胞外マトリックスを用いて人工血管が作製されているので、生体適合性が高い人工血管を実現することができるという効果を奏する。
本発明では、細胞外マトリックスから生体に由来する細胞および細胞の構成成分（例えば、ＤＮＡなど）が効率よく除去されているので、人工血管の移植時の拒絶反応の発生を防ぐことができる。具体的に言えば、細胞外マトリックスに細胞および細胞の構成成分が残存していると、このような細胞外マトリックスによって作製された人工血管を、細胞外マトリックスが由来する生物種（例えば、ダチョウ）とは異なる生物種（例えば、ヒト、ブタ）へ移植した場合に、拒絶反応が生じてしまう。しかしながら、本発明では、細胞外マトリックスから生体に由来する細胞および細胞の構成成分が効率よく除去されているので、このような拒絶反応が生じることを防ぐことができる。
本発明は、内腔が細く（例えば、内腔の断面形状を円形と考えた場合に、当該円の直径が４ｍｍ以下）、長く（例えば、４０ｃｍ以上）、かつ、分岐の少ない（例えば、分岐が無い）人工血管を実現することができるという効果を奏する。このような人工血管であれば、臨床でも、幅広く利用可能である。例えば、臨床においては、遠く離れた血管の間にバイパスを形成する必要が生じる場合がある。本発明の人工血管であれば、このようなバイパスを容易に形成することができる。
本発明は、強度が高い人工血管を実現することができるという効果を奏する。つまり、本発明は、手術時の縫合処理によって破損することが無い、換言すれば、手術が容易な人工血管を実現することができるという効果を奏する。また、本発明は、静脈用の血管としては勿論のこと、動脈用の血管としても利用できる強度が高い人工血管を実現することができるという効果を奏する。
本発明は、移植先にて著期間にわたって安定に機能することが可能な人工血管を実現することができるという効果を奏する。
本発明の一実施の形態について以下に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
〔１．人工血管〕
本実施の形態の人工血管は、加圧処理などによって、生体由来の血管組織から細胞を除去して得られる細胞外マトリックスによって形成されている人工血管である。なお、細胞を除去する方法は当該方法に限定されない。この点については後述する。
本実施の形態の人工血管は、加圧処理などによって、生体由来の血管組織から細胞を除去して得られる細胞外マトリックスによって形成されている人工血管である。なお、細胞を除去する方法は当該方法に限定されない。この点については後述する。
血管組織を加圧処理することによって得られる細胞外マトリックスは、極めてインタクトな状態に近い細胞外マトリックスであるとともに、効率よく細胞および細胞の構成成分が除去された細胞外マトリックスである。このような細胞外マトリックスを用いて作製された人工血管は、基本的に、生体適合性が高く拒絶反応が低い人工血管となり得る。
上述した生体としては特に限定されないが、例えば、非ヒト動物（例えば、走鳥類、鳥類、または、哺乳類など）を挙げることが可能である。
上記哺乳類としては特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サルなどを揚げることができる。
上述した生体の中では、走鳥類（例えば、エミュー、キーウィ、ダチョウ、ヒクイドリ、または、レアなど）が好ましいといえる。走鳥類の首は一般的に長く、当該首に存在する頚動脈などの血管は、細く、長く、かつ、分岐が少ない。それ故に、走鳥類の血管を用いて人工血管を作製すれば、内腔の断面がより小さく、より長く、かつ、より分岐の少ない人工血管を実現することができる。このような人工血管は、臨床の現場において、極めて有用であるといえる。また、走鳥類などは飼育が容易であるために、多量の血管組織を安定的に供給することもできる。
本実施の形態の人工血管は、上述した生体に由来する血管組織から細胞を除去して得られる細胞外マトリックスによって形成されている。なお、本明細書において「血管組織」とは、血管を構成する細胞外マトリックスと、血管を構成する細胞と、によって形成されている組織を意図する。更に具体的には、本明細書において「血管組織」とは、内皮細胞などによって形成されている内膜と、平滑筋細胞、弾性繊維およびコラーゲン繊維などによって形成されている中膜と、繊維芽細胞および結合組織などによって形成されている外膜と、によって形成されている組織を意図する。
生体由来の血管組織の具体的な構成としては特に限定されず、動脈であってもよいし、静脈であってもよい。本実施の形態の人工血管は、インタクトな状態に極めて近い細胞外マトリックスによって形成されているので、材料として動脈を用いたとしても、また、静脈を用いたとしても、非常に強度の高い人工血管を実現することができる。但し、より強度の高い人工血管を実現するという観点からは、血管組織は動脈であることが好ましいといえる。一方、より容積の大きな内腔を有する人工血管を実現するという観点からは、血管組織は静脈であることが好ましいといえる。それ故に、人工血管の目的に合わせて、血管組織の種類を適宜選択すればよい。
本実施の形態の人工血管は、動脈用の人工血管として用いることも可能であるし、静脈用の人工血管として用いることも可能である。本発明の人工血管は、より血流の早い箇所の血管（具体的には、動脈用の人工血管）として用いた場合に、より効果的に血栓を防止することができる傾向を有している。このような血流の早い箇所では人工血管に対してより高い圧力が加わるので、人工血管の強度が、より高いことが好ましいといえる。したがって、動脈用の人工血管を製造する場合には、上記血管組織は動脈であることが好ましいといえる。
また、本実施の形態の人工血管は、細胞外マトリックスの供給源である上記生体に由来する細胞および細胞の構成成分の含有量が極めて少ないので、人工血管に対する拒絶反応の発生を防ぐことができる。それ故に、本実施の形態の人工血管は、細胞外マトリックスの供給源である生体（例えば、走鳥類）とは異なる種の生体（例えば、哺乳類）に対して移植するための人工血管であってもよい。勿論、本実施の形態の人工血管は、細胞外マトリックスの供給源である生体と同じ種の生体に対して移植するための人工血管であってもよい。
本発明では、細胞外マトリックスから生体に由来する細胞および細胞の構成成分（例えば、ＤＮＡなど）が効率よく除去されているので、人工血管の移植時の拒絶反応の発生を防ぐことができる。具体的に言えば、細胞外マトリックスに細胞および細胞の構成成分が残存していると、このような細胞外マトリックスによって作製された人工血管を、細胞外マトリックスが由来する生物種（例えば、ダチョウ）とは異なる生物種（例えば、ヒト、ブタ）へ移植した場合に、拒絶反応が生じてしまう。しかしながら、本発明では、細胞外マトリックスから生体に由来する細胞および細胞の構成成分が効率よく除去されているので、このような拒絶反応が生じることを防ぐことができる。
上述したように、本実施の形態の人工血管は、血管組織に対して加圧処理などの処理を行うことによって得られる、細胞外マトリックスによって形成されている。
上記処理の詳細については、後述する〔２−１．第１工程〕の欄で詳細に説明するので、ここでは、その詳細な説明を省略する。
本実施の形態の人工血管の構成成分は限定されないが、本実施の形態の人工血管は、例えば、少なくともｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、および、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色によって染色される物質によって形成されていてもよい。
更に具体的には、本実施の形態の人工血管は、少なくともｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色によって染色される物質、コラーゲン、および、エラスチンによって形成されていてもよい。
上記構成によれば、本実施の形態の人工血管がインタクトな状態に極めて近い細胞外マトリックスを含んでいるので、より良く機能する人工血管を実現することができる。
本実施の形態の人工血管は、その断面における内腔の形状を円形と考えた場合に、当該円の直径が４ｍｍ以下であってもよく、３ｍｍ以下であってもよく、２ｍｍ以下であってもよく、１．５ｍｍ以下であってもよく、または、１ｍｍ以下であってもよい。なお、材料となる血管組織を適宜選択することによって、所望の太さの内腔を有する人工血管を実現することができる。
本実施の形態の人工血管は、血栓が形成されることを効果的に防ぐことができるので、人工血管の内腔の円形状が大きい場合は勿論のこと、たとえ人工血管の内腔の円形状が小さい場合（例えば、円の直径が４ｍｍ以下）であっても、内腔に血栓が形成されることを防ぐことができる。
また、本実施の形態の人工血管は、その断面における内腔の面積が、π×２２ｍｍ２以下であってもよく、π×１．５２ｍｍ２以下であってもよく、π×１２ｍｍ２以下であってもよく、π×０．７５２ｍｍ２以下であってもよく、π×０．５２ｍｍ２（π≒３．１４）。なお、この場合には、人工血管の断面における内腔の形状は、真円に限らない。
本実施の形態の人工血管は、血栓が形成されることを効果的に防ぐことができるので、人工血管の内腔の断面積が大きい場合は勿論のこと、たとえ人工血管の内腔の断面積が小さい場合（例えば、断面における内腔の面積がπ×２２ｍｍ２以下）であっても、内腔に血栓が形成されることを防ぐことができる。
本実施の形態の人工血管は、その長さは特に限定されないが、例えば、１０ｃｍ以上であってもよく、２０ｃｍ以上であってもよく、３０ｃｍ以上であってもよく、４０ｃｍ以上であってもよく、５０ｃｍ以上であってもよく、６０ｃｍ以上であってもよく、７０ｃｍ以上であってもよく、８０ｃｍ以上であってもよい。人工血管の長さは、好ましくは４０ｃｍ以上であり、より好ましくは８０ｃｍ以上である。
上記構成によれば、臨床でも十分に利用可能な長さの人工血管を実現することができる。例えば、臨床においては、遠く離れた血管の間にバイパスを形成する必要が生じる場合がある。上記構成であれば、このようなバイパスを容易に形成することができる。
本実施の形態の人工血管では、上述した細胞外マトリックスに、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドが付加され得る。なお、当該アミノ酸配列において「Ｏ」は、ヒドロキシプロリンを示している。
上記アミノ酸配列中の「ＰＯＧ」は、細胞外マトリックス中に含まれるコラーゲンに対して結合すると考えられるアミノ酸配列であり、上記アミノ酸配列中の「ＲＥＤＶ」（配列番号１）は、人工血管を移植した後で、移植先の細胞（例えば、血管を構成する細胞）に対して結合すると考えられるアミノ酸配列である。
上記細胞外マトリックスに対して上記ペプチドを付加する場合、化学結合（例えば、共有結合など）を介して、上記細胞外マトリックスに上記ペプチドを連結させてもよいし、化学結合（例えば、疎水結合や水素結合など）を介して、上記細胞外マトリクスに上記ペプチドを吸着させてもよい。つまり、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの間の相互作用の様式は、特に限定されない。
上述したペプチドは、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドであってもよいし、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドに対して更に別のアミノ酸配列が連結されているペプチドであってもよい。
別のアミノ酸配列を連結する場合、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドのＣ末端およびＮ末端の少なくとも一方に、別のアミノ酸配列を連結することが可能である。
連結される別のアミノ酸配列の具体例としては特に限定されないが、例えば、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドのＣ末端およびＮ末端の少なくとも一方に、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドをタンデムに連結してもよい。なお、この場合には、各アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍは、同じものであってもよいし、異なるものであってもよい。上記構成によれば、人工血管の内腔に血栓が形成されることを、より効果的に防ぐことができる。
また、連結される別のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、各種タグ（例えば、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ＧＳＴタンパク質など）であってもよい。上記構成によれば、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドを、簡便にかつ純度高く精製することができる。
また、連結される別のアミノ酸配列の具体例としては、例えば、ＲＧＤＳ配列、または、ＧＶＰＧＩ配列であってもよい。上記構成によれば、細胞接着を促進させる、および／または、内皮細胞の接着および増殖を促進させることができる。
上述したアミノ酸配列において、ｎおよびｍは、各々独立して、１以上の任意の整数であり得る。
例えば、ｎは、１以上の整数であればよく特に限定されないが、例えば、１以上２０以下の整数であってもよく、２以上２０以下の整数であってもよく、３以上２０以下の整数であってもよく、４以上２０以下の整数であってもよく、５以上２０以下の整数であってもよく、６以上２０以下の整数であってもよく、７以上２０以下の整数であってもよく、８以上２０以下の整数であってもよく、９以上２０以下の整数であってもよく、１０以上２０以下の整数であってもよい。なお、上述した例ではｎの上限値を２０としたが、これに限定されない。例えば、各場合において、ｎの上限値は、３０であってもよいし、４０であってもよいし、５０であってもよいし、それよりも大きくてもよい。
一方、ｍは、１以上の整数であればよく特に限定されないが、例えば、１以上５０以下の整数であってもよく、１以上４０以下の整数であってもよく、１以上３０以下の整数であってもよく、１以上２０以下の整数であってもよく、１以上１５以下の整数であってもよく、１以上１０以下の整数であってもよく、１以上５以下の整数であってもよい。勿論、ｍの上限値は、５０よりも大きくてもよい。
ｎとｍとの組み合わせは、上述したものの全ての組み合わせであり得る。例えば、ｎが「３以上２０以下の整数」でありｍが「１以上１０以下の整数」であってもよいし、ｎが「７以上２０以下の整数」でありｍが「１以上１０以下の整数」であってもよい。当該構成によれば、より良く血栓の形成を防ぐことができる。
上記アミノ酸配列中の「Ｘ」は、「ＰＯＧ」と「ＲＥＤＶ」とを連結するためのペプチドリンカーである。本実施の形態の人工血管では、「ＰＯＧ」と「ＲＥＤＶ」とを直接連結することも可能であって、この場合には「Ｘ」が省略されることになる。
上記Ｘの具体的な構成としては特に限定されないが、「ＰＯＧ」や「ＲＥＤＶ」の機能を損なわないものであるとともに、「ＰＯＧ」および「ＲＥＤＶ」を、各々の相手である、コラーゲンおよび細胞に対して効果的に提示し得るものであることが好ましい。
上記Ｘの具体的な構成としては、例えば、１以上の任意の数のＧ（グリシン）からなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のＡ（アラニン）からなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のＳ（セリン）からなるペプチドリンカー、または、Ｇ（グリシン）、Ａ（アラニン）およびＳ（セリン）からなる群から選択される少なくとも２種類のアミノ酸からなるペプチドリンカーであることが好ましい。
上記Ｘの具体的な構成としては、１以上の任意の数のＧ（グリシン）からなるペプチドリンカー、または、１以上の任意の数のＡ（アラニン）からなるペプチドリンカーであることが更に好ましいといえる。
Ｇ（グリシン）およびＡ（アラニン）は、脂肪族である小さな側鎖を有するアミノ酸である。これらのアミノ酸であれば、側鎖が小さく立体障壁が小さいので、「ＰＯＧ」および「ＲＥＤＶ」を、各々の相手に対して効果的に提示することができる。例えば、これらのアミノ酸であれば、「ＰＯＧ」および「ＲＥＤＶ」が各々の相手と接近および接触することを妨げることが無い。また、これらのアミノ酸であれば、側鎖が小さな脂肪酸であるので、「ＰＯＧ」や「ＲＥＤＶ」の機能に対して影響を与えることを抑えることができる。例えば、これらのアミノ酸であれば、側鎖に大きな極性が存在しないので、「ＰＯＧ」や「ＲＥＤＶ」の立体構造を大きく変化させることが無い。
上記「Ｘ」が複数のアミノ酸によって形成されている場合、上記「Ｘ」を形成するアミノ酸の数は特に限定されないが、例えば、１個であってもよく、２個であってもよく、３個であってもよく、４個であってもよく、５個であってもよい。勿論、６個以上であってもよい。例えば、上記Ｘとしては、「Ｇ」、「ＧＧ」、「ＧＧＧ」、「ＧＧＧＧ」（配列番号２）、「ＧＧＧＧＧ」（配列番号３）、「Ａ」、「ＡＡ」、「ＡＡＡ」、「ＡＡＡＡ」（配列番号４）または「ＡＡＡＡＡ」（配列番号５）を用いることができるが、勿論、これらに限定されない。
アミノ酸からなるペプチドリンカーである上記「Ｘ」を省略する場合、「ＰＯＧ」と「ＲＥＤＶ」とを直接連結することも可能であるが、「ＰＯＧ」と「ＲＥＤＶ」とをアミノ酸以外のリンカーによって連結してもよい。
このようなリンカーとしては特に限定されないが、例えば、糖、脂肪、核酸、または、合成高分子などを挙げることができる。上述したアミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍからなるペプチドにおいて、「Ｘ」が０個のアミノ酸からなるペプチドリンカーである場合には、「ＰＯＧ」と「ＲＥＤＶ」とを直接連結する場合と、「ＰＯＧ」と「ＲＥＤＶ」とをアミノ酸以外のリンカーによって連結する場合と、が包含される。
本実施の形態の人工血管では、上述した細胞外マトリックスは、ＤＮａｓｅ処理されたものであることが好ましい。
上記構成によれば、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く破壊および除去することができる。細胞外マトリクスからの細胞および細胞の構成成分の除去率が上がれば上がるほど、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。
なお、ＤＮａｓｅ処理の詳細は、後述する〔２−３．第３工程〕の欄にて詳細に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本実施の形態の人工血管では、上述した細胞外マトリックスは、洗浄液にて洗浄されたものであることが好ましい。
上記構成によれば、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く除去することができる。細胞外マトリクスからの細胞および細胞の構成成分の除去率が上がれば上がるほど、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。
なお、洗浄処理の詳細は、後述する〔２−４．第４工程〕の欄にて詳細に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
本発明の人工血管は、以下のように構成することも可能である。
本発明の人工血管では、上記ｎは、３以上２０以下の整数であり、上記ｍは、１以上１０以下の整数であることが好ましい。
本発明の人工血管では、上記Ｘは、１以上の任意の数のグリシンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のアラニンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のセリンからなるペプチドリンカー、または、グリシン、アラニンおよびセリンからなる群から選択される少なくとも２種類のアミノ酸からなるペプチドリンカーであることが好ましい。
本発明の人工血管では、上記細胞外マトリックスは、生体由来の血管組織を加圧処理することによって細胞を除去して得られるものであることが好ましい。
本発明の人工血管では、上記細胞外マトリックスは、ＤＮａｓｅ処理されたものであることが好ましい。
本発明の人工血管では、上記細胞外マトリックスは、３日間以内の期間、洗浄液にて洗浄されたものであることが好ましい。
本発明の人工血管では、上記細胞外マトリックスは、インタクトな状態で保持されているｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色によって染色される物質、コラーゲン、および、エラスチンを含んでいることが好ましい。
本発明の人工血管では、上記生体由来の血管組織は、走鳥類、鳥類、または、哺乳類に由来するものであることが好ましい。
本発明の人工血管は、上記生体とは異なる種の生体に対して移植するためのものであることが好ましい。
〔２．人工血管の製造方法〕
本実施の形態の人工血管の製造方法は、第１工程と第２工程とを有している。
本実施の形態の人工血管の製造方法は、第１工程と第２工程とを有している。
また、本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記工程以外に、第３工程、第４工程などを有していてもよい。
以下に、各工程について説明する。
〔２−１．第１工程〕
本実施の形態の人工血管の製造方法は、生体由来の血管組織から細胞が除去された細胞外マトリックスを得る第１工程を有している。
本実施の形態の人工血管の製造方法は、生体由来の血管組織から細胞が除去された細胞外マトリックスを得る第１工程を有している。
第１工程の具体的な方法としては特に限定されず、例えば、生体由来の血管組織を加圧処理することによって細胞が除去された細胞外マトリックスを得る工程であってもよいし、生体由来の血管組織を界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム、トリトンＸ−１００（登録商標）、または、ソルビタン）にて処理することによって細胞が除去された細胞外マトリックスを得る工程であってもよいし、高塩濃度の溶媒によって処理する工程であってもよい。
血管組織を加圧処理することによって得られる細胞外マトリックスは、極めてインタクトな状態に近い細胞外マトリックスであるとともに、効率よく細胞および細胞の構成成分が除去された細胞外マトリックスである。このような細胞外マトリックスを用いて人工血管を作製すれば、基本的に、生体適合性が高く拒絶反応が低い人工血管となり得る。
上述した生体としては特に限定されないが、例えば、非ヒト動物（例えば、走鳥類、鳥類、または、哺乳類など）を挙げることが可能である。更に、上記哺乳類としては特に限定されないが、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、サルなどを揚げることができる。
上述した生体の中では、走鳥類（例えば、エミュー、キーウィ、ダチョウ、ヒクイドリ、または、レアなど）が好ましいといえる。走鳥類の首は一般的に長く、当該首に存在する頚動脈などの血管は、細く、長く、かつ、分岐が少ない。それ故に、走鳥類の血管を用いて人工血管を作製すれば、より内腔が細く、より長く、かつ、より分岐の無い人工血管を実現することができる。このような人工血管は、臨床の現場において、より有用であるといえる。また、走鳥類などは飼育が容易であるために、多量の血管組織を安定的に供給することもできる。
上記生体に由来する血管組織としては特に限定されず、動脈であってもよいし、静脈であってもよい。より強度の高い人工血管を実現するという観点からは、上記血管組織は動脈であることが好ましいといえる。一方、より容積の大きな内腔を有する人工血管を実現するという観点からは、上記血管組織は静脈であることが好ましいといえる。それ故に、人工血管の目的に合わせて、血管組織の種類を適宜選択すればよい。
上記血管組織は、その断面における内腔の形状を円形と考えた場合に、当該円の直径が４ｍｍ以下である。更に具体的には、上記円の直径が、３ｍｍ以下であってもよく、２ｍｍ以下であってもよく、１．５ｍｍ以下であってもよく、または、１ｍｍ以下であってもよい。なお、材料となる血管組織を適宜選択することによって、所望の太さの内腔を有する人工血管を実現することができる。
上記血管組織は、その断面における内腔の面積が、π×２２ｍｍ２以下であってもよく、π×１．５２ｍｍ２以下であってもよく、π×１２ｍｍ２以下であってもよく、π×０．７５２ｍｍ２以下であってもよく、π×０．５２ｍｍ２以下であってもよい（π≒３．１４）。なお、この場合には、血管組織の断面における内腔の形状は、真円に限らない。
上記血管組織は、その長さは特に限定されないが、例えば、１０ｃｍ以上であってもよく、２０ｃｍ以上であってもよく、３０ｃｍ以上であってもよく、４０ｃｍ以上であってもよく、５０ｃｍ以上であってもよく、６０ｃｍ以上であってもよく、７０ｃｍ以上であってもよく、８０ｃｍ以上であってもよい。血管組織の長さは、好ましくは４０ｃｍ以上であり、より好ましくは８０ｃｍ以上である。
本実施の形態の人工血管の製造方法では、第１工程において、上述した血管組織に対して加圧処理などの処理を行い、細胞が除去された細胞外マトリックスを得る。このとき、略インタクトな状態の細胞外マトリックスが得られるので、本実施の形態の人工血管のサイズと、元々の血管組織のサイズとは、略同じになる。
例えば、生体由来の血管組織を加圧処理することによって細胞が除去された細胞外マトリックスを得る場合、血管組織を加圧した後で減圧する時に、化学物質等を使用すること無く、細胞を破裂させて除去するとともに、細胞外マトリックスの構造を圧縮状態から復元する。それ故に、当該方法であれば、より、インタクトな状態に近い細胞外マトリックスを得ることができる。
上述した血管組織は、外科的な手術によって生体（例えば、非ヒト動物）から摘出して入手することが可能である。また、市販されている既に摘出されている血管組織を購入することによって入手することも可能である。
上記第１工程では、例えば、生体由来の血管組織を加圧処理することによって、細胞が除去された細胞外マトリックスを得る。加圧処理の具体的な方法としては特に限定されず、血管組織から細胞および細胞の構成成分が除去される程度に、血管組織に対して圧力を加えられる方法であればよい。それ故に、適宜、周知の加圧装置を用いて第１工程を行うことが可能である。
血管組織に対して加える圧力の大きさは特に限定されないが、例えば、２００ＭＰａ以上１０００ＭＰａ以下であることが好ましく、３００ＭＰａ以上１０００ＭＰａ以下であることが更に好ましく、５００ＭＰａ以上１０００ＭＰａ以下であることが最も好ましい。
上記構成によれば、血管組織に含まれる細胞を、より効率良く破壊できるとともに、当該破壊された細胞および細胞の構成成分を、より効率よく細胞外マトリックスから除去することができる。細胞外マトリクスからの細胞および細胞の構成成分の除去率が上がれば上がるほど、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。
血管組織に対して圧力を加える場合の具体的な方法は特に限定されないが、例えば、液体中の血管組織に対して圧力を加えればよい。
上記液体の具体的な構成としては特に限定されず、例えば、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）、または、生理食塩水などを用いることができる。よりインタクトに近い状態の細胞外マトリクスを得て、これによって、より強度の高い人工血管を実現するという観点からは、上記液体は、生理食塩水であることが好ましいといえる。
第１工程を行う場合、血管組織の温度を特定の温度に制御してもよいし、特定の温度に制御しなくてもよい。血管組織の温度を特定の温度に制御する場合、例えば、３７℃以上１００℃以下に制御してもよい。上記構成によれば、よりインタクトに使い状態の細胞外マトリクスを得ることができる。
〔２−２．第２工程〕
本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドを付加する第２工程を有している。
本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドを付加する第２工程を有している。
上記アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍを含むペプチドの構成の詳細については既に説明したので、ここでは、その説明を省略する。
第２工程において、上記細胞外マトリックスに対して上記ペプチドを付加する場合、化学結合（例えば、共有結合など）を介して、上記細胞外マトリックスに上記ペプチドを連結させてもよいし、化学結合（例えば、疎水結合や水素結合など）を介して、上記細胞外マトリクスに上記ペプチドを吸着させてもよい。つまり、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの間の相互作用の様式は、特に限定されない。
細胞外マトリックスにペプチドを付加する具体的な方法は特に限定されないが、例えば、細胞外マトリックスとペプチドとを混合することによって、細胞外マトリックスにペプチドを付加することができる。更に具体的には、ペプチドを含む液体中に細胞外マトリックスを浸漬することによって、細胞外マトリックスにペプチドを付加することができる。
ペプチドを含む液体の具体的な構成としては特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）、または、生理食塩水などを用いることができる。よりインタクトに近い状態の細胞外マトリクスを得て、これによって、より強度の高い人工血管を実現するという観点からは、上記液体は、生理食塩水であることが好ましいといえる。
第２工程では、細胞外マトリックスとペプチドとの混合物を加熱しながら、細胞外マトリックスにペプチドを付加してもよい。上記加熱温度としては特に限定されないが、混合物を、例えば３７℃以上１００℃以下に加熱することが好ましく、６０℃以上１００℃以下に加熱することが更に好ましく、６０℃以上８０℃以下に加熱することが更に好ましく、６０℃以上７５℃以下に加熱することが最も好ましい。
上記構成によれば、細胞外マトリックスに対して上記ペプチドを効率よく付加できるだけでなく、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分を、より効率良く破壊および除去することができる。
第２工程において、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの混合物を加熱する時間としては特に限定されないが、例えば、１分間以上１８０分間以下であることが好ましく、１０分間以上１２０分間以下であることが更に好ましく、３０分間以上６０分間以下であることが最も好ましい。
上記構成によれば、長すぎず、かつ、短すぎない時間にて混合物を加熱するので、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分を、より効率良く破壊および除去することができる。
第２工程では、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの混合物における上記ペプチドの濃度は特に限定されず、適宜、設定することが可能である。例えば、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの混合物における上記ペプチドの濃度は、１μＭ以上１Ｍ以下であってもよく、１０μＭ以上１Ｍ以下であってもよく、１００μＭ以上１Ｍ以下であってもよく、１ｍＭ以上１Ｍ以下であってもよく、１０ｍＭ以上１Ｍ以下であってもよく、１００ｍＭ以上１Ｍ以下でもあってもよい。勿論、本発明は、これらの濃度に限定されない。
上記構成によれば、細胞外マトリックスに対して多量のペプチドを付着させることができるので、人工血管の内腔に血栓が形成されることをより良く防止することができる。
第２工程において細胞外マトリックスとペプチドとの混合物を加熱する場合、当該加熱の後で、混合物の温度を下げる処理を行ってもよい。
この場合、温度を下げる具体的な方法は特に限定されないが、例えば、加熱された混合物を室温（例えば、２５℃）に放置することによって、徐々に温度を下げてもよい。上記構成によれば、混合物の温度が徐々に低下するので、細胞外マトリックスにペプチドを効率よく付加することができるとともに、急激な温度変化によって生じ得るペプチドの変性を防ぐことができる。
〔２−３．第３工程〕
本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して、ＤＮａｓｅ処理を行う第３工程を有していてもよい。
本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して、ＤＮａｓｅ処理を行う第３工程を有していてもよい。
上記構成によれば、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く破壊および除去することができる。細胞外マトリクスからの細胞および細胞の構成成分の除去率が上がれば上がるほど、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。
第３工程が行われるタイミングは特に限定されないが、例えば、第１工程と第２工程との間に行われてもよいし（例えば、第１工程→第３工程→第２工程の順番）、第１工程および第２工程の後に行われてもよい（例えば、第１工程→第２工程→第３工程の順番）。勿論、本発明は、上述したタイミングに限定されない。
第３工程におけるＤＮａｓｅ処理は、ＤＮａｓｅ（例えば、市販されている各種ＤＮａｓｅ）が機能し得る液体中に、ＤＮａｓｅおよび上記細胞外マトリックスを加えることによって行うことが可能である。
上記液体の具体的な構成としては特に限定されず、例えば、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）または生理食塩水などに、ＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２などの２価イオンの供給源を加えたＤＮａｓｅ処理溶液を用いることができる。よりインタクトに近い状態の細胞外マトリクスを得て、これによってより強度の高い人工血管を実現するという観点からは、上記液体は、生理食塩水であることが好ましいといえる。
上記ＤＮａｓｅ処理溶液中のＤＮａｓｅの濃度としては特に限定されないが、例えば、１Ｕ／ｍＬ以上１０００Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、１０Ｕ／ｍＬ以上５００Ｕ／ｍＬ以下であってもよく、４０Ｕ／ｍＬ以上１００Ｕ／ｍＬ以下であってもよい。
上記構成であれば、低すぎず、かつ、高すぎないＤＮａｓｅの濃度にてＤＮａｓｅ処理を行うので、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く破壊および除去することができるのみならず、人工血管に残留するＤＮａｓｅの量を低く抑えることができる。そして、これによって、強度の高い人工血管を実現することができるとともに、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。
ＤＮａｓｅは、その活性を発現するために２価イオン（例えば、マグネシウムイオンおよび／またはカルシウムイオンなど）を必要とするので、ＤＮａｓｅ処理溶液はＭｇＣｌ２および／またはＣａＣｌ２などの２価イオンの供給源を含んでいることが好ましい。
上記構成によれば、ＤＮａｓｅ処理溶液中のＤＮａｓｅの活性を上げることができるので、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く破壊および除去することができる。
上記ＤＮａｓｅ処理溶液中のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の濃度としては特に限定されず、用いるＤＮａｓｅの特性に応じて適宜設定することができる。上記ＤＮａｓｅ処理溶液中のＭｇＣｌ２およびＣａＣｌ２の濃度は、例えば、１０ｍＭ以上５０ｍＭ以下であってもよいし、２０ｍＭ以上４０ｍＭ以下であってもよいし、２０ｍＭであってもよい。勿論、本発明は、これらに限定されない。
第３工程におけるＤＮａｓｅ処理の温度は特に限定されず、適宜、設定することができる。上記温度としては、例えば、３５℃以上４０℃以下であってもよいし、３７℃であってもよい。
第３工程におけるＤＮａｓｅ処理の処理時間は特に限定されず、適宜、設定することができる。上記処理時間としては、例えば、６日間以下であることが好ましく、５日間以下であることが更に好ましく、４日間以下であることが更に好ましく、３日間以下であることが最も好ましい。なお、当該処理時間の下限値は特に限定されず、例えば、０．５日間であってもよいし、１日間であってもよい。
上記構成によれば、よりインタクトな状態に近い細胞外マトリックスによって人工血管が作製されるので、より強度が高い人工血管を実現することができる。
第３工程におけるＤＮａｓｅ処理の処理時間は、後述する第４工程の処理時間に応じて設定することもできる。例えば、第３工程におけるＤＮａｓｅ処理の処理時間と第４工程における処理時間との合計が、６日間以下であることが好ましい。
上記構成によれば、よりインタクトな状態に近い細胞外マトリックスによって人工血管が作製されるので、より強度が高い人工血管を実現することができる。
以上、第３工程の具体的な構成について説明したが、第３工程は、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く破壊および除去することができる工程であることが好ましい。
例えば、第１工程によって得られた細胞外マトリックスに残存している細胞、および細胞の構成成分の量を１００（１００％）とした場合、第３工程は、当該量を、９０（９０％）以下にする工程であることが好ましく、８０（８０％）以下にする工程であることが更に好ましく、７０（７０％）以下にする工程であることが更に好ましく、６０（６０％）以下にする工程であることが更に好ましく、５０（５０％）以下にする工程であることが更に好ましく、４０（４０％）以下にする工程であることが更に好ましく、３０（３０％）以下にする工程であることが更に好ましく、２０（２０％）以下にする工程であることが更に好ましく、１０（１０％）以下にする工程であることが更に好ましく、５（５％）以下にする工程であることが更に好ましく、１（１％）以下にする工程であることが更に好ましいといえる。
〔２−４．第４工程〕
本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して洗浄処理を施す第４工程を有していてもよい。
本実施の形態の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して洗浄処理を施す第４工程を有していてもよい。
上記構成によれば、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く除去することができる。細胞外マトリクスからの細胞および細胞の構成成分の除去率が上がれば上がるほど、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。
第４工程における洗浄処理は、洗浄液にて細胞外マトリックスを洗浄することによって行うことができる。更に具体的には、洗浄液中に細胞外マトリックスを浸し、場合によっては更に振とうすることによって、細胞外マトリックスを洗浄すればよい。
上記洗浄液の具体的な構成は特に限定されないが、例えば、ＰＢＳ（phosphate buffered saline）、または、生理食塩水などを用いることができる。よりインタクトに近い状態の細胞外マトリクスを得て、これによって、より強度の高い人工血管を実現するという観点からは、上記液体は、生理食塩水であることが好ましいといえる。
上記洗浄液は、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を含んでいることが好ましい。上記構成によれば、ＥＤＴＡによって２価イオン（例えば、マグネシウムイオンなど）をキレートすることができ、これによって、ＤＮａｓｅ（例えば、血管組織に由来するＤＮａｓｅおよび／または第３工程に用いるＤＮａｓｅなど）などの酵素の活性を抑制することができる。ＤＮａｓｅなどの酵素の活性を抑制することができれば、よりインタクトに近い状態の細胞外マトリクスを得て、これによって、より強度の高い人工血管を実現することができる。
洗浄液中のＥＤＴＡの濃度は特に限定されないが、例えば、１ｍｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下であってもよく、１０ｍｇ／Ｌ以上１ｇ／Ｌ以下であってもよく、１００ｍｇ／Ｌ以上５００ｍｇ／Ｌ以下であってもよく、５００ｍｇ／Ｌであってもよい。
第４工程における洗浄処理の時間は特に限定されないが、例えば、６日間以下であることが好ましく、５日間以下であることが更に好ましく、４日間以下であることが更に好ましく、３日間以下であることが最も好ましい。なお、当該処理時間の下限値は特に限定されず、例えば、０．５日間であってもよいし、１日間であってもよい。
上記構成によれば、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く除去することができるので、人工血管を移植したときに起こる様々な問題（例えば、拒絶反応など）を、より良く防ぐことができる。更に、実施例において示しているように、洗浄処理の時間が長すぎると人工血管の強度が低下する。一方、上記構成によれば、強度が高い人工血管を作製することができる。
第４工程における洗浄処理の温度は特に限定されないが、例えば、４℃以上３７℃以下であってもよいし、４℃であってもよいし、３７℃であってもよい。
第４工程が行われるタイミングは特に限定されないが、例えば、第３工程の後に行われることが好ましい（例えば、第１工程→第２工程→第３工程→第４工程の順番、第１工程→第３工程→第２工程→第４工程の順番、または、第１工程→第３工程→第４工程→第２工程の順番）。勿論、本発明は、上述したタイミングに限定されない。上記構成によれば、少なくとも「第１工程で発生する細胞などの破壊物」および「第３工程にて使用されるＤＮａｓｅ」の両方を確実に除去することができる。
例えば、第１工程→第２工程→第３工程→第４工程の順番にて各工程を行えば、第４工程を行うことによって、「第１工程で発生する細胞などの破壊物」、「第２工程で発生する細胞外マトリックスへ付加されていないペプチド」および「第３工程にて使用されるＤＮａｓｅ」を除去することができる。
一方、第１工程→第３工程→第２工程→第４工程の順番にて各工程を行えば、第４工程を行うことによって、「第１工程で発生する細胞などの破壊物」、「第２工程で発生する細胞外マトリックスへ付加されていないペプチド」および「第３工程にて使用されるＤＮａｓｅ」を除去することができる。
一方、第１工程→第３工程→第４工程→第２工程の順番にて各工程を行えば、「第１工程で発生する細胞などの破壊物」および「第３工程にて使用されるＤＮａｓｅ」を除去することができる。
本実施の形態の人工血管の製造方法では、第３工程を行わない場合であっても、第４工程を行うことが可能である（例えば、第１工程→第２工程→第４工程の順番、または、第１工程→第４工程→第２工程の順番）。勿論、本発明は、上述したタイミングに限定されない。上記構成によれば、少なくとも「第１工程で発生する細胞などの破壊物」を確実に除去することができる。
例えば、第１工程→第２工程→第４工程の順番にて各工程を行えば、第４工程を行うことによって、「第１工程で発生する細胞などの破壊物」および「第２工程で発生する細胞外マトリックスへ付加されていないペプチド」を除去することができる。
一方、第１工程→第４工程→第２工程の順番にて各工程を行えば、第４工程を行うことによって、「第１工程で発生する細胞などの破壊物」を除去することができる。
以上、第４工程の具体的な構成について説明したが、第４工程は、細胞外マトリクスに残存している細胞、および、細胞の構成成分（具体的にはＤＮＡ）を、より効率良く除去することができる工程であることが好ましい。
例えば、第１工程によって得られた細胞外マトリックスに残存している細胞、および細胞の構成成分の量を１００（１００％）とした場合、第４工程は、当該量を、９０（９０％）以下にする工程であることが好ましく、８０（８０％）以下にする工程であることが更に好ましく、７０（７０％）以下にする工程であることが更に好ましく、６０（６０％）以下にする工程であることが更に好ましく、５０（５０％）以下にする工程であることが更に好ましく、４０（４０％）以下にする工程であることが更に好ましく、３０（３０％）以下にする工程であることが更に好ましく、２０（２０％）以下にする工程であることが更に好ましく、１０（１０％）以下にする工程であることが更に好ましく、５（５％）以下にする工程であることが更に好ましく、１（１％）以下にする工程であることが更に好ましいといえる。
本発明の人工血管の製造方法は、以下のように構成することも可能である。
本発明の人工血管の製造方法では、上記ｎは、３以上２０以下の整数であり、上記ｍは、１以上１０以下の整数であることが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法では、上記Ｘは、１以上の任意の数のグリシンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のアラニンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のセリンからなるペプチドリンカー、または、グリシン、アラニンおよびセリンからなる群から選択される少なくとも２種類のアミノ酸からなるペプチドリンカーであることが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法では、上記第１工程は、上記生体由来の血管組織を加圧処理することによって、細胞が除去された細胞外マトリックスを得る工程であることが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法では、上記第１工程では、２００ＭＰａ以上１０００ＭＰａ以下にて加圧処理を行うことが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法では、上記第２工程では、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの混合物を、３７℃以上１００℃以下に加熱することが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して、ＤＮａｓｅ処理を行う第３工程を有することが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法は、上記細胞外マトリックスに対して、３日間以内の期間、洗浄液による洗浄を施す第４工程を有することが好ましい。
本発明の人工血管の製造方法では、上記生体由来の血管組織は、走鳥類、鳥類、または、哺乳類に由来するものであることが好ましい。
＜１．ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞接着試験＞
周知のペプチド合成方法に従って、下記ペプチドを合成した。なお、下記ペプチドにおいて「Ｏ」は、ヒドロキシプロリンを示している。
・ペプチド１：（ＰＯＧ）３ＧＧＧ ・・・・・（配列番号６）
・ペプチド２：（ＰＯＧ）３ＧＧＧＲＥＤＶ ・・・・・（配列番号７）
・ペプチド３：（ＰＯＧ）７ＧＧＧ ・・・・・（配列番号８）
・ペプチド４：（ＰＯＧ）７ＧＧＧＲＥＤＶ ・・・・・（配列番号９）
・ペプチド５：（ＯＰＧ）７ＧＧＧＲＥＤＶ ・・・・・（配列番号１０）
次いで、上記ペプチド１〜５について、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞接着試験を行った。
周知のペプチド合成方法に従って、下記ペプチドを合成した。なお、下記ペプチドにおいて「Ｏ」は、ヒドロキシプロリンを示している。
・ペプチド１：（ＰＯＧ）３ＧＧＧ ・・・・・（配列番号６）
・ペプチド２：（ＰＯＧ）３ＧＧＧＲＥＤＶ ・・・・・（配列番号７）
・ペプチド３：（ＰＯＧ）７ＧＧＧ ・・・・・（配列番号８）
・ペプチド４：（ＰＯＧ）７ＧＧＧＲＥＤＶ ・・・・・（配列番号９）
・ペプチド５：（ＯＰＧ）７ＧＧＧＲＥＤＶ ・・・・・（配列番号１０）
次いで、上記ペプチド１〜５について、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける細胞接着試験を行った。
まず、各ペプチド１〜５を、最終濃度が１０μＭとなるように生理食塩水に溶解し、５種類のペプチド含有溶液を作製した。
次いで、各ペプチド含有溶液を用いて、細胞培養用の培養皿（ＡＧＣ旭硝子社製の接着細胞培養皿）の表面をコーティングした。このとき、ネガティブコントロールとして、ペプチドを含まない生理食塩水によって表面をコーティングした培養皿も用意した。
各培養皿に対して、１０万個のヒト臍帯静脈内皮細胞（Human Umbilical Vein Endothelial Cells：ＨＵＶＥＣ）をまき、内皮細胞基本培地中で３７℃、５％ＣＯ２の条件下で、２４時間培養した。
上記培養の後、培養皿内の培地を捨てるとともに、培養皿の表面を生理食塩水にて数回洗浄し、当該洗浄の後でも培養皿の表面に接着しているヒト臍帯静脈内皮細胞の数を数えた。そして、培養開始時に培養皿へ加えたヒト臍帯静脈内皮細胞の数に対する、洗浄の後でも培養皿の表面に接着しているヒト臍帯静脈内皮細胞の数の割合を算出した。
図１に試験の結果を示す。上述したペプチド１〜５のうち、ペプチド４は、培養皿へ細胞を接着させる活性を有していることが明らかになった。
＜２．人工血管の作製＞
上述したペプチド４を用いて、人工血管を作製した。以下に、人工血管の作製方法の詳細を説明する。
上述したペプチド４を用いて、人工血管を作製した。以下に、人工血管の作製方法の詳細を説明する。
まず、ダチョウの首から採取した頚動脈（内腔の断面の径：略２．０ｍｍ、全長：略４０ｃｍ）を生理食塩水で洗浄した後、当該頚動脈を生理食塩水にてパックした。
生理食塩水に浸った状態の頚動脈に対して、１０分間、１０００ＭＰａの加圧処理を施した（コベルコ社製の超高圧印加処理装置を使用）。つまり、当該処理によって、頚動脈に含まれる細胞を破壊および除去し、頚動脈を構成する細胞外マトリクスを取り出した。
上記加圧処理の後、頚動脈に由来する細胞外マトリクスを、ＤＮａｓｅを４０Ｕ／ｍＬ、ＭｇＣｌ２を２０ｍＭ含有する生理食塩水中で、３７℃にて３日間放置した。つまり、当該処理によって、細胞外マトリクスに残存している細胞および細胞の構成成分（具体的には、ＤＮＡ）を完全に分解した。
上記ＤＮａｓｅによる処理の後、細胞外マトリクスを、ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）を５００ｍｇ／Ｌの濃度にて含有する生理食塩水中で、３７℃にて３日間洗浄した。つまり、当該処理によって、細胞外マトリクスから、細胞、細胞の構成成分、および、ＤＮａｓｅを完全に除去した。なお、以上のようにして得られた頚動脈由来の細胞外マトリクスを保存する場合には、ＥＤＴＡを５００ｍｇ／Ｌ含有する生理食塩水中に浸した状態で、４℃にて保存した。
上記洗浄した後の細胞外マトリクスのヘマトキシリン・エオシン染色の結果を、図２に示す。なお、ヘマトキシリン・エオシン染色は、周知の方法にしたがった。
図２から明らかなように、洗浄した後の細胞外マトリクスには、核または細胞質（換言すれば、細胞）に対応する染色像が観察されなかった。つまり、洗浄した後の細胞外マトリクスからは、効果的に細胞および細胞の構成成分が除去されていることが明らかになった。
次いで、周知の染色法によって、上記洗浄した後の細胞外マトリクスに含まれる成分を特定した。具体的には、上記洗浄した後の細胞外マトリクスに、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）、および、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色によって染色される物質（ＥＶＧ）、が含まれているか否かを調べた。
なお、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）の識別には、ダコ社製の抗ヒト第VIII因子関連抗原・ウサギポリクロナール抗体を用いた。そして、具体的な染色方法は、周知の一般的な免疫染色法に従った。
Ｖｉｍｅｎｔｉｎの識別には、ダコ社製の抗ブタビメンチンＶ９・マウスモノクロナール抗体を用いた。そして、具体的な染色方法は、周知の一般的な免疫染色法に従った。
α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（αＳＭＡ）の識別には、ダコ社製の抗ヒト平滑筋アクチン、１Ａ４・マウスモノクローナル抗体を用いた。そして、具体的な染色方法は、周知の一般的な免疫染色法に従った。
また、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色には、周知の一般的な染色方法を採用した。
図３に、上述した各種染色の結果を示す。図３から明らかなように、洗浄した後の細胞外マトリクスには、ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ（ｖＷＦ）、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ（αＡＭＡ）、および、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色によって染色される物質、の何れもが、インタクトな状態に近い状態で含まれていた。
最後に、以上のようにして得られた頚動脈由来の細胞外マトリクスを、上述したペプチド４を１０μＭの濃度にて含有する生理食塩水に浸漬して、６０℃にて６０分間、加熱処理した。その後、加熱物を、室温にて徐々に冷却した。つまり、当該処理によって、細胞外マトリクスの内腔の表面にペプチド４を付加させた。以後、当該ペプチドを付加させた細胞外マトリクスを、本実施例の人工血管と呼ぶ。
図４に、本実施例の人工血管の写真を示す。本実施例の人工血管は、内径が略２．０ｍｍであり、全長が略４０ｃｍであって、材料であるダチョウの首から採取した頚動脈のサイズと略同じであった。
＜３．人工血管の移植、および、移植後の人工血管の観察＞
本実施例の人工血管をブタに移植して、その機能を検討した。
本実施例の人工血管をブタに移植して、その機能を検討した。
人工血管の移植手術は、一般的な、大腿−大腿交叉バイパス術（Femoral Femoral crossover bypass）にしたがった。図５を用いて、人工血管の移植手術の概要について、簡単に説明する。
図５に示すように、まず、右足側の大腿部の動脈（ＲＦＡ）を、縫合することによって閉じた。これによって、縫合した箇所から足先側への血流を阻害した。
同時に、上述した人工血管を用いて、左足側の大腿部の動脈（ＬＦＡ）から、右足側の大腿部の動脈へバイパス経路を形成した。これによって、バイパス経路を介して、縫合した箇所から足先側への血流を復活させた。
移植手術後のブタについては、手術した箇所を縫合した状態で飼育を継続し、手術後の経過を観察した。人工血管を移植したブタの手術後の経過、および、移植後の人工血管の観察結果を以下に示す。
＜３−１．試験結果１＞
手術後のブタの歩行の状態について観察した。つまり、バイパス経路として使用した本実施例の人工血管に血栓が生じれば、右足側への血流が阻害されて、その結果、ブタは歩行することが困難になる。一方、バイパス経路として使用した本実施例の人工血管に血栓が生じなければ、右足側への血流が維持されて、その結果、ブタは正常に歩行することができる。つまり、ブタの歩行の状態を観察することによって、人工血管に血栓が生じたか否かを判定することができる。
手術後のブタの歩行の状態について観察した。つまり、バイパス経路として使用した本実施例の人工血管に血栓が生じれば、右足側への血流が阻害されて、その結果、ブタは歩行することが困難になる。一方、バイパス経路として使用した本実施例の人工血管に血栓が生じなければ、右足側への血流が維持されて、その結果、ブタは正常に歩行することができる。つまり、ブタの歩行の状態を観察することによって、人工血管に血栓が生じたか否かを判定することができる。
手術後のブタの歩行の状態を観察したところ、手術後２週間経っても、正常な歩行を行っていた。つまり、手術後２週間経っても、人工血管に血栓が生じておらず、右足側へ正常な血流が維持されていた。
＜３−２．試験結果２＞
周知のレーザードップラーを用いて、手術後２１日目のブタについて、バイパス経路を形成している人工血管の中央部位における血流の有無を確認した。試験結果を、図６（ａ）および図６（ｂ）に示す。
周知のレーザードップラーを用いて、手術後２１日目のブタについて、バイパス経路を形成している人工血管の中央部位における血流の有無を確認した。試験結果を、図６（ａ）および図６（ｂ）に示す。
図６（ａ）は、バイパス経路を形成している人工血管の中央部位における、超音波診断の画像結果であり、図６（ｂ）は、バイパス経路を形成している人工血管の中央部位における、血流シグナルである。
図６（ａ）および図６（ｂ）に示すように、手術後２１日経っても、人工血管において正常な血流が確認された。つまり、手術後２１日経っても、人工血管に血栓が生じておらず、右足側へ正常な血流が維持されていた。
また、バイパス経路を形成している人工血管の中央部位における血圧は６０／４９であり、左足側の大腿部の動脈の血圧（７９／５４）と同程度であった。このことからも、人工血管の血流が十分な量であることが確認できた。
＜３−３．試験結果３＞
手術後２０日目のブタの移植箇所を開き、移植した人工血管内の血流の有無を肉眼にて観察した。なお、図７（ａ）および図７（ｂ）において、「ＲＦＡ」は、右足側の大腿部の動脈に近い側の人工血管の部分を示し、「ＬＦＡ」は、左足側の大腿部の動脈に近い側の人工血管の部分を示している。
手術後２０日目のブタの移植箇所を開き、移植した人工血管内の血流の有無を肉眼にて観察した。なお、図７（ａ）および図７（ｂ）において、「ＲＦＡ」は、右足側の大腿部の動脈に近い側の人工血管の部分を示し、「ＬＦＡ」は、左足側の大腿部の動脈に近い側の人工血管の部分を示している。
図７（ａ）に、手術後２０日目のブタの移植箇所を切開した様子を示している。図７（ａ）に示すように、移植した人工血管では、右足側の大腿部の動脈に近い側の部分、および、左足側の大腿部の動脈に近い側の部分の両方に拍動があることを確認できた。このことは、人工血管によって形成されているバイパス経路を介して、右足側の大腿部の動脈へ十分な血流が流れていることを示している。
図７（ｂ）に、手術後２０日目のブタから取り出した人工血管の様子を示している。図７（ｂ）の上側は、切り開く前の人工血管の様子を示す写真であり、図７（ｂ）の下側は、切り開いた後の人工血管の様子を示す写真である。
図７（ｂ）に示すように、移植された人工血管は、正常な形態を示していた。このことは、移植後の人工血管を介した正常な血流があったことを示している。また、図７（ｂ）に示すように、移植された人工血管の内部には血栓の形成が観察されなかった。
図８および図９に、移植後の人工血管の更に詳細な様子を示す。図８は、ペプチドが付加されている本実施例の人工血管をブタに移植後２０日目に取り出し、その様子を観察した結果であり、図９は、ペプチドを付加していない人工血管（ネガティブコントロール）をブタに移植後７日目に取り出し、その様子を観察した結果である。
図８に示すように、ペプチドが付加されている本実施例の人工血管を移植した場合には、移植後の人工血管は正常な形態を示していた。このことは、移植した人工血管に、正常な血流があったことを示している。
また、人工血管を切り開いて内部を確認したところ、人工血管の内部には血栓の形成が観察されなかった。
一方、図９に示すように、ペプチドを付加していない人工血管（ネガティブコントロール）を移植した場合には、移植後の人工血管が異状な形態を示していた。このことは、移植した人工血管には、正常な血流が無かったことを示している。つまり、このことは、ペプチドを付加していない人工血管（ネガティブコントロール）には血栓が形成され、当該血栓によって、右足側の大腿部の動脈への血流が阻害されたことを示している。
また、人工血管を切り開いて内部を確認したところ、人工血管の内部には血栓の形成が観察された。
＜３−４．試験結果４＞
手術後２０日目のブタの移植箇所を開き、移植された人工血管内の血流の有無を肉眼にて確認するとともに、人工血管内を内視鏡にて観察して、血栓の形成の有無を確認した。
手術後２０日目のブタの移植箇所を開き、移植された人工血管内の血流の有無を肉眼にて確認するとともに、人工血管内を内視鏡にて観察して、血栓の形成の有無を確認した。
図１０（ｂ）に、手術後２０日目のブタの移植箇所を切開した様子を示している。図１０（ｂ）に示すように、ブタに移植した人工血管に脈動があることを確認できた。このことは、人工血管によって形成されているバイパス経路を介して、右足側の大腿部の動脈へ十分な血流が流れていることを示している。
図１０（ｃ）に、図１０（ｂ）に示す人工血管の内部を内視鏡にて観察した結果を示す。なお、当該試験では、図１０（ａ）に示すように、左足側の大腿部の動脈（ＬＦＡ）側から右足側の大腿部の動脈（ＲＦＡ）側へ向かって、人工血管内の様子を連続的に観察した。図１０（ｃ）の写真は、連続的に撮影した複数の写真の中の一例である。
図１０（ｃ）に一例を示すように、人工血管内には、血栓が形成されていなかった。
＜３−５．試験結果５＞
手術後２０日目のブタの人工血管について、血管内超音波診断（ＩＶＡＳ）によって、その形態を観察した。図１１（ａ）および図１１（ｂ）に、血管内超音波診断の結果を示す。
手術後２０日目のブタの人工血管について、血管内超音波診断（ＩＶＡＳ）によって、その形態を観察した。図１１（ａ）および図１１（ｂ）に、血管内超音波診断の結果を示す。
図１１（ａ）および図１１（ｂ）から、移植された人工血管の内腔サイズは略１．５ｍｍであり、当該人工血管の外側は繊維組織で覆われていることが明らかになった。また、図１１（ａ）および図１１（ｂ）から、人工血管には、脂質が蓄積した様子や、人工血管が石灰化した様子は観察されなかった。
当該手術後２０日目のブタの人工血管を取り出し、人工血管の様子を更に詳細に観察した。具体的には、人工血管をヘマトキシリン・エオシン染色およびフォン・ビィレブランド染色して、移植後２０日目の人工血管の内外に存在する、生体由来の細胞を確認した。なお、ヘマトキシリン・エオシン染色、および、フォン・ビィレブランド染色の具体的な方法は、周知の方法に従った。
図１２（ａ）にヘマトキシリン・エオシン染色の結果を示し、図１２（ｂ）にフォン・ビィレブランド染色の結果を示す。
図１２（ａ）に示すように、人工血管の内部に多くの細胞の浸潤が観察されると共に、人工血管の内腔側の表面に厚い組織が再生されていることが観察された。
また、図１２（ｂ）に示すように、図１２（ａ）で観察された、人工血管の内部に浸潤した細胞、および、人工血管の内腔側の表面に再生された組織に含まれる細胞は、フォン・ビィレブランド染色に対して陽性であり、これらの細胞が内皮細胞であることが明らかになった。
＜３−６．試験結果６＞
人工血管の作製時の洗浄時間が、人工血管の強度に及ぼす影響を検討した。
人工血管の作製時の洗浄時間が、人工血管の強度に及ぼす影響を検討した。
具体的には、上述した＜２．人工血管の作製＞において、ＤＮａｓｅ処理（３日間のＤＮａｓｅ処理）の後で細胞外マトリクスをＥＤＴＡを含有する生理食塩水（ＥＤＴＡ濃度：５００ｍｇ／Ｌ）中で洗浄する時間を変化（３日間または１１日間）させ、これによって作製される人工血管の強度を検討した。
まず、図１３を用いて、試験方法を説明する。
縦が略１ｃｍ、横が略３〜４ｍｍのサイズの人工血管１の一方の端部の近傍に、穴４を形成し、当該穴４へ紐３を通した。なお、上記穴４は、上記端部からの距離が１ｍｍの位置に形成されている。更に、人工血管１の別の端部を、クランプ２によって固定した。
紐３に力を加えて、当該紐３を２ｍｍ／ｍｉｎの引張速度にて引っ張った。そして、人工血管１が破れて人工血管１から紐３が外れるときに紐３に対して加えられている力を測定した。当該当該測定結果から、人工血管の強度（具体的には、血圧に対する強度、および、手術時の縫合処理に対する強度など）を予測することができる。
図１４に試験結果を示す。図１４の「Ａ」は、ダチョウの首から採取したネイティブな頚動脈（未処理の頚動脈）の試験結果を示し、図１４の「Ｂ」は、３日間のＤＮａｓｅ処理の後に３日間洗浄した人工血管の試験結果を示し、図１３の「Ｃ」は、３日間のＤＮａｓｅ処理の後に１１日間洗浄した人工血管の試験結果を示している。
図１４に示すように、洗浄時間が長すぎると人工血管の強度が低下することが明らかになった。
＜３−７．試験結果７＞
当該試験では、＜２．人工血管の作製＞の欄で説明した第１工程、第３工程および第４工程の細胞除去効果を検討した。なお、当該試験では、ラット由来の血管組織（下行大動脈）と、ダチョウ由来の血管組織（頚動脈）とを用いて、人工血管を作製している。
当該試験では、＜２．人工血管の作製＞の欄で説明した第１工程、第３工程および第４工程の細胞除去効果を検討した。なお、当該試験では、ラット由来の血管組織（下行大動脈）と、ダチョウ由来の血管組織（頚動脈）とを用いて、人工血管を作製している。
また、本試験では、人工血管を作製する各過程において、人工血管をヘマトキシリン・エオシン染色し、細胞外マトリックス内に残存している細胞（細胞核）を確認した。
図１５（Ａ）は、第１工程を施す前（高圧処理前）のラットの下行大動脈の染色像である。図１５（Ｂ）は、第１工程を施した後（高圧処理後）のラットの下行大動脈の染色像である。図１５（Ｃ）は、第１工程を施す前（高圧処理前）のダチョウの頚動脈の染色像である。図１５（Ｄ）は、第１工程を施した後（高圧処理後）のダチョウの頚動脈の染色像である。図１５（Ｅ）は、第３工程（３日間のＤＮａｓｅ処理）および第４工程（３日間の洗浄処理）を施した後のダチョウの頚動脈の染色像である。
図１５（Ａ）〜図１５（Ｅ）から明らかなように、第１工程、第３工程、第４工程と進むにつれて、細胞外マトリックスに残存している細胞（細胞核）の量が減少した。特に、第３工程および第４工程による細胞除去効果は高いものであった。
本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。
本発明は、生体等に移植可能な人工血管に利用することができる。本発明の人工血管は、動脈用の人工血管として利用することができ、静脈用の人工血管としても利用することができる。また、本発明の人工血管は、細胞外マトリックスが由来する生物と異なる種の生物に対して移植するための人工血管として利用することができ、細胞外マトリックスが由来する生物と同じ種の生物に対して移植するための人工血管としても利用することができる。
１ 人工血管
２ クランプ
３ 紐
４ 穴
２ クランプ
３ 紐
４ 穴
Claims (18)
- 生体由来の血管組織から細胞を除去して得られる細胞外マトリックスによって形成されている人工血管であって、
上記人工血管の内腔断面の直径が４ｍｍ以下であり、
上記細胞外マトリックスには、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドが付加されていることを特徴とする人工血管。 - 上記ｎは、３以上２０以下の整数であり、
上記ｍは、１以上１０以下の整数であることを特徴とする請求項１に記載の人工血管。 - 上記Ｘは、１以上の任意の数のグリシンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のアラニンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のセリンからなるペプチドリンカー、または、グリシン、アラニンおよびセリンからなる群から選択される少なくとも２種類のアミノ酸からなるペプチドリンカーであることを特徴とする請求項１または２に記載の人工血管。
- 上記細胞外マトリックスは、生体由来の血管組織を加圧処理することによって細胞を除去して得られるものであることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の人工血管。
- 上記細胞外マトリックスは、ＤＮａｓｅ処理されたものであることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載の人工血管。
- 上記細胞外マトリックスは、３日間以内の期間、洗浄液にて洗浄されたものであることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の人工血管。
- 上記細胞外マトリックスは、インタクトな状態で保持されているｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ、Ｖｉｍｅｎｔｉｎ、α Ｓｍｏｏｔｈ ｍｕｓｃｌｅ ａｃｔｉｎ、Ｅｌａｓｔｉｃａ ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ染色によって染色される物質、コラーゲン、および、エラスチンを含んでいることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の人工血管。
- 上記生体由来の血管組織は、走鳥類、鳥類、または、哺乳類に由来するものであることを特徴とする請求項１〜７の何れか１項に記載の人工血管。
- 上記生体とは異なる種の生体に対して移植するためのものであることを特徴とする請求項１〜８の何れか１項に記載の人工血管。
- 血管の内腔断面の直径が４ｍｍ以下である生体由来の血管組織から、細胞が除去された細胞外マトリックスを得る第１工程と、
上記細胞外マトリックスに対して、アミノ酸配列（ＰＯＧ）ｎ−Ｘ−（ＲＥＤＶ）ｍ（ここで、ｎおよびｍは、各々１以上の任意の整数であり、Ｘは、０個以上の任意の数の任意のアミノ酸からなるペプチドリンカーである）を含むペプチドを付加する第２工程と、
を有することを特徴とする人工血管の製造方法。 - 上記ｎは、３以上２０以下の整数であり、
上記ｍは、１以上１０以下の整数であることを特徴とする請求項１０に記載の人工血管の製造方法。 - 上記Ｘは、１以上の任意の数のグリシンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のアラニンからなるペプチドリンカー、１以上の任意の数のセリンからなるペプチドリンカー、または、グリシン、アラニンおよびセリンからなる群から選択される少なくとも２種類のアミノ酸からなるペプチドリンカーであることを特徴とする請求項１０または１１に記載の人工血管の製造方法。
- 上記第１工程は、上記生体由来の血管組織を加圧処理することによって、細胞が除去された細胞外マトリックスを得る工程であることを特徴とする請求項１０〜１２の何れか１項に記載の人工血管の製造方法。
- 上記第１工程では、２００ＭＰａ以上１０００ＭＰａ以下にて加圧処理を行うことを特徴とする請求項１３に記載の人工血管の製造方法。
- 上記第２工程では、上記細胞外マトリックスと上記ペプチドとの混合物を、３７℃以上１００℃以下に加熱することを特徴とする請求項１０〜１４の何れか１項に記載の人工血管の製造方法。
- 上記細胞外マトリックスに対して、ＤＮａｓｅ処理を行う第３工程を有することを特徴とする請求項１０〜１５の何れか１項に記載の人工血管の製造方法。
- 上記細胞外マトリックスに対して、３日間以内の期間、洗浄液による洗浄を施す第４工程を有することを特徴とする請求項１０〜１６の何れか１項に記載の人工血管の製造方法。
- 上記生体由来の血管組織は、走鳥類、鳥類、または、哺乳類に由来するものであることを特徴とする請求項１０〜１７の何れか１項に記載の人工血管の製造方法。
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