JP2686930B2 - 人工移植物体 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は、ヒト（人）に移植するための人工移植物体
に関するものであり、より詳細には、現在ではヒト患者
の大静脈または大動脈を置換するために一般に用いられ
る血管移植片のような合成移植物に関するものである。
更に本発明は、そのような移植片を提供して内皮細胞粘
着および／またはその上での増殖を改善する処理に関係
する。 〔従来技術とその問題点〕 人工血管移植片の概念の発達は、最初の移植片が30年
以上も前に用いられて以来、血管外科の重要な目標であ
つた。大部分のアプローチは、抗凝血性である表面を作
り出すことに集中し、これら努力の大部分には改良ポリ
マー表面に向けられた、多分、理想的な血液・表面・界
面は天然に生成するヒト内皮であろう。もしそれが人工
的移植片に存在するならば、それは本来の血管の利点を
数多提供するであろう。残念なことに、ヒトに挿入され
た人工移植片には、移植片の内皮形成がおこる動物とは
対照的に、内皮形成は限られた程度にしかおこらない。
動物においては、移植前に予め凝固した人工移植片に内
皮細胞を植えつけると移植片の内皮細胞による被膜は改
善された。しかしこの技法の使用はヒトにおいては制限
される。ブルースジヤレル等（Bruce Jarrell etal）の
“培養させるヒト成内皮細胞の増殖（Human Adult Endo
thelial Cell Growth",ジヤーナル・オブ・ヴアスキユ
ラー・ザージエリー、第１巻、No.6、757−764ページ
（1984年11月）；ヘリング等（Herring et al）の“血
管移植片に自家内皮を植えつけるための単一および段階
的技術（A Single and Staged Technique for Seeding
Vascular Grafts with Autogenous Endothelium）”サ
ージエリー、1978、84巻498−504ページ；グラハム等
（Graham et al）の“培養自家内皮細胞の血管人工移植
片への播種（Cultured Autogenous Endothelial Cell S
eeding of Vascular Prosthetic Grafts）”、Sarg For
um30巻、204−６ページ（1979）；グラハム等（Graham
et al）の“酸素的に誘導し、培養したイヌ内皮細胞を
植えつけた拡散ポリテトラフルオロエチレン人工血管
（Expanded Polytetrafluoroethylene Vascular Prosth
eses Seeded with Enzymatically Derined and Culture
d Canine Endothelial cells）”サージエリー、91巻、
550−９ページ（1982）およびデイレイ等（Dilley et a
l）の“人工血管への内皮播種（Endothelial Seeding o
f Vascular Prostheses）”ジヤツフエ編集、内皮細胞
の生物学、The Hague:Martinus Nijhoff、1984、401−1
1ページを参照せよ。 過去30年間にわたつて、アテローム硬化性血管疾患の
結果として生じる虚血領域へ血流を速かに回復せしめる
ために、人工移植片が用いられてきた。その他に、慢性
腎不全患者における血液透析のための血管進入路を作る
ために、また動脈瘤の修復にも用いられている。最初は
虚血組織への潅流回復に成功するとはいえ、これら移植
片の長期予後はかんばしくない。長期に互ると、直径4m
m以下の移植片は、フイブリン沈着および細胞粘着によ
つて閉塞され、開放性を失う（デイレイ同上）。このプ
ロセスは二次的であるようにみえる。そして一部には、
移植人工物の露出した（すなわち内皮が形成されていな
い）表面の血栓形成性に因るようにみえる。バーガー等
（Berger et al）の“人におよる人工血管の治療；その
不完全性（Healing of Arterial Prostheses in Man,Tt
s′Incompleteness）"Ann.Surg.175巻、118−27ページ
（1972）参照。そこで現在の多くの研究は、ヒト本来の
血管にあるような、非血栓形成性内皮細胞表面を作り出
すことを望んで次のどちらかを目指している：（１）人
工的な、非血栓形成性表面をもつた移植片の開発、
（２）ヒト内皮細胞で内張りした人工血管。 1920年以来、動物由来の内皮細胞を培養して研究し
た、1973年にジヤツフエ等はヒト臍静脈の内皮細胞の培
養に成功し、これらの細胞を機能的に特徴づけた。ジヤ
ツフエ等の“培養ヒト内皮による抗血友病性因子抗原の
合成（Synthesis of Antihemophilai Factor Antigen b
y Cultured Human Endothelial Cell）”、J.Clin、Inv
est.55巻、2757−64ページ（1973）；およびレヴイス
（Lewis）の“組織培養における内皮（Endotheluim in
Tissue Culture）"Am.I.Anat.30巻、39−59ページ（192
2）：ジヤツフエ等、“静脈から取り出したヒト内皮細
胞の培養（Culture of Endothelial Cclls Derived Fro
m Umbilical Veins）"J.Clin.Invest.52巻、2745−56ペ
ージ（1973）を参照せよ。これらの培養細胞は増殖ポテ
ンシヤルを示すが、単一の臍静脈から生産される細胞の
総数は非常に限られるのが普通で、収穫内皮細胞では10
−100倍の範囲の増加に過ぎない。 ヒト臍静脈内皮を用いて生産される細胞数をふやすた
めにいくつかの技法が提案されたが、内皮細胞の大量培
養は理想にはまだ遠い。若干の研究者は肺動脈および静
脈からのヒト成内皮細胞の培養に或る程度成功したが、
これは短期間に過ぎなかつた。ヒト腸骨動脈内皮細胞が
不十分な回動ではあるが培養できることも証明された。
例えばグラスベルグ（Glassberg）等の研究において、1
2.7cm（５インチ）の血管切片あたり50〜500ケの生存能
力がある細胞が得られる。これは非常に低い収量であ
る。“ヒト腸骨動脈に由来せる内皮細胞の培養（Cultur
ed Endothelial Calls Derived From Human Iliac Arte
ries）"In vitro.18巻、859−66ページ（1982）。フラ
イ等（Fry et al）は、死体提供者からの腎摘出時に切
除した腹部動脈からのヒト成内皮細胞を培養することに
成功したと報告した。しかしこれらの細胞も増殖能力は
限定されていることが証明された。 現存の技術からは、提供患者から採取した血管の合理
的量で移植片にあらかじめ内皮を形成させるほど十分の
量の細胞を生産することはむづかしいことは明らかであ
る。移植前に移植片を完全に内皮化する代りに、前凝固
（（Preclotted）移植片の半融合の播種の概念が発生し
た。移植片に自家内皮細胞を播種すると、実験動物の移
植片の内皮被覆率が高まることが最近判明した。ヘリン
グ等およびグラハム等（同上）を参照せよ。ひとたび内
皮でおおわれた、イヌにおける移植物は、血小板反応に
よつて測定した場合、血栓形成性がより小さくなり、血
液中にある細菌の攻撃による感染に、より大きな抵抗性
を示し、直径の小さい血管移植の開放性を持続させるこ
とが判明した。シヤレフキン（Sharefikn）等の“イヌ
におけるダクロン人造動脈の内皮播種による血小板生存
性の早期正常化（Early Normalization of Platelet Su
rvival by Endothelial Seedig of Dacron Arterial Pr
osthestes in Doge"、サージエリー92巻385−93ページ
（1982）；スタンレー（Stanley）等の“内皮細胞を植
えつけた、小直径の外部から支持されたダクロン腸骨−
大腸骨移植片の開放性の増大（Enhanced Prtency of Sm
all Diameter Externally Supported Dacron Iliofemor
al Gafts Seedet With Endothelial Cells）”、サージ
エリー92巻;995−1005ページ（1982）；およびワトキン
ス（Watkins）等の“成ヒト伏在静脈内皮細胞：人造血
管への内皮播種に使用する場合のそれらの増殖能力の評
価（Adult Human Saphenous Vein Endothelial Cells A
ssessment of Then Reproductive Capacity for Use in
Endothelial Seeding of Vascular Prostheses）”、
J.Surg.Res.36巻588−96ページ（1984）を参照。 ヒト移植片に細胞を移す時の主要な問題点は、ヒト血
管組織を用いて移植片を内皮で被覆できるほど高密度に
播種するに十分な内皮細胞が生産できるかどうかであ
る。ワトキンス等は、冠動脈バイパス手術後のヒト伏在
静脈残遺物を用いて少量の内皮細胞を培養して生産する
ことに成功し、４〜６週後培養基の融合細胞領域に100
倍増殖したと報告した。ワトキンス等（同上）参照。 活発な培養技術によつて、使用できる細胞数を著しく
ふやすことはできるとはいえ、40または50回も細胞を倍
加させた後の内皮細胞の“健康”に関する懸念がまだ残
る。さらにこのような細胞の自然の環境とは別物（異
種）である培養基でこれらを培養することは、遺伝的変
化および／または患者がヴイルス、トキシンまたはその
他の侵害物質により汚染されることについての心配の種
である。 多くの内皮形成法が文献に示唆されている。この領域
の研究には、内皮そのものの多様性によつて、並びに内
皮の振舞および特性に関して見つかつた種間の相異によ
つて複雑である。フイツシユマン（Fishman）の“内
皮：多様の能力を有する分布器官（Endothelium:ADistr
ibuted Orgen of Diverse Capabilities）”、アナルス
・オブ・ニユーヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス
１−８ページ（1082）；ソーヴエイジ（Sauvage）等の
“多孔性人造動脈−種間治療（interspecies Heilang o
f Porous Arterial Prostheses"、Arch Surg109巻698−
705ページ（1974）；およびバーガーの“ヒトにおける
人造動脈治療”（同上）。それでもなお文献には種々の
種において種々の移植片に内皮細胞を播種することを含
む実験の報告が多数あり、結果はいろいろである。ヘス
等（F.Hess etal）の“ラットの腹部大動脈に移植した
繊維性ポリウレタン微小血管人工物の内皮形成プロセス
（The Endothelialization Proclss of a Fibrous Poly
urethane Microvascular Prostheses After Implantati
on in the Abdominal Aorta of the Rat）”、ジヤーナ
ル・オブ・カルジオヴアスキユラー・サージエリー、24
巻、No.5 516−524ページ（1983年９−10月）；ニコラ
ス（W.K.Nicholas）等の“細胞外基質（matrix）で前被
覆せるバイオマンに対する血管内皮細胞の粘着性の増大
（Increased Adherence of Vascular Endothelial Cell
s to Biomer Precoated with Extracel lular Matri
x）”、Trans Am Soc Artif Intern Organs、28巻208−
212ページ（1981）；イヴエス（C.L.Ines）等の“定常
流に反応する内皮細胞配列力学における細胞起源および
基質の重要性（The Importance of Cell Origin and Su
bstrate in the Kinetics of Endothelial cell Alignm
ent in Response to Steady Flow）”、Trans.Am.Soc.A
rtif Inten Organs、29巻269−274ページ（1983）；グ
ラハム（L.M.Graham）等の“酵素的に誘導し、培養した
イヌ内皮細胞を播種した拡張ポリテトラフルオロエチレ
ン人造血管（Expanded Poly tetrafluoroethylene Vasc
ular Prostheses Seeded winh enzymatically Derived
and Cultured Canine Endothelial Cells）”、サージ
エリー91巻No.5 550−559（1982）；エスキン（S.G.Es
kin）等、“in Vitroで流動条件下におけるシラスチツ
クおよびダクロンベロアに培養した内皮細胞の振舞：細
胞で内張りした血管移植片（Behavior of Endothelial
Cell Cultured on Silastic and Dacron Velour under
Flow Conditions In Vitro:Implicatwus for Prelining
Vascular Gafts with Cells）”、アーテイフイシヤル
オルガンズ、７（１）巻、31−37ページ（1982）；ベル
デン（T.A.Belden）等の“直径の小さい血管移植片の内
皮細胞播種（Endothelial Cell Seeding of Small−Dia
meter Vascular Grafts）”、Trans.Am.Soc.Artif.Inte
rn.Organs.28巻173−177ページ（1982）：バーケル（W.
E.Burkel）等の“酵素的に誘導せる自家イヌ内皮を播種
したニツトのダクロンベロア血管移植片の運命（Fate o
f Knitted Dacron Velour Vascular Grafts Seeded wit
h Enzymatically Derived Autologous Canine Endothel
ium）"Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs、28巻178−1
82ページ（1982）；ワトキンス等、“成ヒト伏在静脈内
皮細胞；人造血管への内皮播種に用いる場合のそれらの
増殖能力の評価（前出一訳著）”ジヤーナル・オブ・サ
ージカル・リサーチ、36巻、588−596ページ（1984）；
ヘリング（M.B.Herrlng）等の“人造動脈への血管内皮
播種（Seeding Arterial Prostheses with lascular En
dothelium）"Ann.Surg、190巻、No.1、84−90ページ（1
979年７月）；ウエソロウ（A.Wesolow）の“人造動脈治
療−技術の状態（The Healing of Arterial Prostheses
−The State of the Art）”、Thorac.Cardiovasc.Surg
eon、30巻196−208ページ（1982）；イシハラ（T.Ishih
ara）等の“移植したブタ生物人工弁における内皮細胞
の発生および意味（Ocurrence and Significaece of En
dothelial Cells in Implanted Porcine Bioprosthetic
Valves）”、アメリカン・ジヤーナル・オブ・カルジ
オロジー48巻443−454ページ（1981年９月）；バーゲル
等の“酵素的に誘導せる自家イヌ内皮を播種したニツト
のダクロンベロア血管移植片の運命（前出一訳者）"28
巻178−182ページ（1982）。 共同研究者スチユアートウイルアムスとの共著である
多数の論文は、副こう丸脂肪を含む種々の組織源に由来
するその種の細胞を含むラツトの微小血管内皮細胞の分
離および機能づけに関するものである。これらの論文に
はProc、Natl、Acad、Sci、USA、78（４）巻2393−2397
ページ（1981）；ミクロヴアスキユラー・リサーチ21
巻、175−182ページ（1981）;Anal.Biochemistry、107
巻、17−20ページ（1980）；ミクロヴアスキユラー、リ
サーチ、19巻、127−130ページ（1980）；ミクロヴアス
キユラーリサーチ、18;175−184（1979）；アナルス・
オブ・ザ・ニユーヨークアカデミー・オブ・サイエンシ
ス、457−467ページ（1983）；ミクロヴアスキユラーリ
サーチ、28巻311−321ページ（1984）；ジヤーナル・オ
ブ・セルラー・フイジオロジー、120巻、157−162（198
4）；およびジヤーナル・オブ・ニユーロケミストリ
ー、35（２）巻、374−381ページ（1980）がある。微小
血管研究のための螢光−蛋白質−結合体の製造および使
用に関するミクロヴアスキユラー、リサーチ27巻、14−
27ページ（1984）も参照せよ。 ケルン（kern）等はヒト微小血管内皮細胞の分離につ
いて報告し、それらを培養し、機能的研究に用いること
を記した。ケルン等、J.Clin.invest、71巻1822−1829
ページ（1983）。 マドリ（Madri）およびウイリアムス（Williams）の
“毛細血管内皮細胞の培養：基質成分による表現型の転
形（Capillary Endothelial Cells Cultures:Phenotypi
c Modulation by Matrix Components）”、ジヤーナル
・オブ・セルバイオロジー、97巻、153−165ページ（19
83）は、ラツト副こう丸脂肪からの毛細血管内皮細胞の
分離およびウシ大動脈内皮細胞およびI/III型およびIV/
V型コラーゲンを含む介在性または基礎膜コラーゲンか
ら成る基質とによつて条件づけられた培地に培養するこ
とを開示する。この論文は、間質性コラーゲンで細胞を
増殖させる時、それは増殖して連続せる細胞層を形成
し、長期間培養する場合は時々チユーブ様構造を形成す
ることを教示する。それは更に、これら細胞が基礎膜コ
ラーゲンで増殖する場合には、増殖しないで凝集し、培
養の初期にチユーブ様構造を形成することを開示した。 ウイリアム等の“成ヒト内皮細胞の、人工移植片材料
との適合性（Adult Human Endothelial Cell Compatibi
lity with Prosthetic Graft Material）”ジヤーナル
・オブ・サージカル・リサーチ、38巻、618−629ページ
（1985）も興味深い。主論文のアブストラクトが1984年
10月31日〜11月３日の“アソシエーシヨン・フオア・ア
カデミツク・サージエリー”の年会で配布された。論文
そのものは、1985年の８月にたまたま催された年会での
その学会の編集会議に提出された。このウイリアムス等
の論文は、人工移植片材料を細胞外基質（I/III型コラ
ーゲン）、フイブロネクチンまたは血漿で被覆する効果
について報じている。最大の密度の粘着性が認められた
のは、コラーゲン被覆ダクロン移植片で、その粘着性
は、ゼラチン被覆cultureplastic上で増殖したヒト成内
皮細胞（HAEC）の融合単層に認められる細胞密度に等し
かつた。 ジヤレル（Jarrell）等の、“培養基におけるヒト成
内皮細胞の増殖（Human Adult Endothelial Cell Growt
h in Culture）”、ジヤーナル・オブ・ヴアスキユラー
・サージエリー、１（６）巻、757−764ページ（1984年
11月）は、本出願に参照によつて挿入されるクロス−リ
フアレンス出願の開示と同様の開示を含む。762−664ペ
ージにある、脂肪中の毛細血管の内皮細胞に関する、共
同発明者ジヤレルとの議論が注目される。 多数の発表が、フイブロネクチン、血漿またはコラー
ゲンであらかじめ処理した移植片を用いる播種技術を明
らかにしている。エスキン等の“in Vitroで流動条件下
におけるシラスチツクおよびダクロンベロアに培養した
内皮細胞の振舞：細胞で内張りした血管移植片（前出一
訳著者）”、アーテイフイシアルオルガン、７（１）
巻、31−37ページ（1983）は、大動脈の流量および圧力
条件を刺激するように設計したin Vitro循環ルーブの流
れに、組織培養したウシ大動脈内皮細胞をさらす実験を
開示する。エスキン等は、生物材料基質に培養された内
皮細胞は、血液接触面として移植した場合非血栓形成性
であるが、この技法は臨床的に使用可能であることはま
だ証明されていない、と説明している。なぜならば二つ
の手術的処置が必要である（一つは細胞収穫のため、第
二のものは細胞移植のためで、その間にin Vitro細胞増
殖の期間がある）からであり、また、定常的環境で培養
された細胞は、流れる血液にさらされた時少なくとも一
部は除去されるからである。エスキン等は“より最近の
研究”を記した。そこでは、収穫したばかりの自家内皮
細胞を含む血液でpreclotした移植片は、血液のみでpre
clotしたそれよりも大きい開放性を示す。これは、細胞
を培養する介在期間なしに細胞収穫と細胞移植を一回の
操作で行うことができることを示すと言えよう。これ
は、この技法を非血栓形成性表面を生成する手段として
臨床的に使用可能にするものである。 ワトキンス等の“成ヒト伏在静脈内皮細胞：人造血管
への内皮播種に用いる場合の、その増殖能力の評価”ジ
ヤーナル・オブ・サージカル・リサーチ、36巻588−596
ページ（1984）において、静脈内皮細胞を用いる人造血
管の自己内皮播種は、血小板−人工物の相互作用を減少
させ、イヌにおける直径の小さい人工物の開放性を改善
することが報告された。イヌ試験で得られたデータは、
自己内皮播種がヒト患者を救うことを示唆している一
方、この方法には多くの欠点があることが論ぜられた。
それらの欠点としては、長い末梢静脈を使用すること。
この方法で用いる粗コラゲナーゼがロツト毎に差がある
こと。そして、静脈内皮細胞の増殖能が、末梢静脈のほ
んの小さいフラクシヨンから得られる内皮細胞で自己内
皮播種ができるほど十分に大きいという証明がないこと
である。 行われた試験は、成ヒト伏在静脈内皮細胞の増殖ポテ
ンシヤルは、“直接的に手術中に自己内皮播種するに
も、培養によつて移植前に内皮細胞を人造血管表面に増
殖させて内張りとするためにも、理論的には十分大き
い”ことを示唆している。その結果はヒト試験を行う一
つの条件は満足していることが示されるが、著者等は
“いくつかの理由によつて、そのようなヒト試験が成功
することを証明するには十分な結果ではない”と結論づ
ける。 近年、直径の小さい血管移植片で一般にあまり良くな
い結果が得られることが注目されている。4mm以下か4mm
の内径をもつことによつて一般に特徴づけられるような
移植片は用いないのが普通である。ヴアン・ヴアクメツ
ト（Van Wachemet）等の“培養ヒト内皮細胞と、種々の
浸潤性をもつ重合面との相互作用（Interaction of Cul
tured Human Endothelial Cells with Palymeric Sarfa
ces）”ビオマテリアルス、６巻、403−408（1985年11
月）は、比較的内径の大きい（4mm以上）合成ポリマー
移植片が、形成された生物学的内張りが“ほとんど非血
栓形成性でない”にもかかわらず、成功に至つた、と報
告した。そのような直径の大きい移植片はモレを防ぐた
めにあらかじめ血液でpreclotし、かなり血栓成形性の
面を残しているにもかかわらず、大きい血流速度（血流
量）および抗凝固処理により、移植片表面のそれ以上の
血栓生成による閉鎖が阻止されることが示唆される。直
径の小さい移植片を用いた場合の臨床的結果は、主とし
て“移植片の即時的閉鎖”のために、悲観的であると言
われている。イヌでは、直径の大きいおよび小さい移植
片両方共、その上に内皮細胞を植えつけると、１〜４カ
月間に完全な内皮張りを形成することがわかつた。血管
内皮は特異な非血栓形成性面であると言われているか
ら、内皮細胞は、“直径の小さい血管移植片の内張りの
ための第一の論理的選択である”と報告されている。内
皮細胞と、異なる表面特性をもつたポリマーとの相互作
用の系統的研究を行えば、“内皮細胞の過大増殖をおこ
す移植片の開発”に至るという仮説がある。これに関し
て、ヴアンヴアケム等は、或る材料の表面湿潤性は種々
の型の哺乳類細胞の粘着性および増殖に影響を与えると
言われ、細胞粘着は水に濡れる表面に優先的におこると
考えた。血清が培養培地にある時には、湿潤可能の基質
への細胞粘着は、血清蛋白質のその基質への吸着によつ
て影響を受けることが示唆される。血清を含まない培地
において細胞粘着を研究する場合には、その細胞に由来
する蛋白質の湿潤可能の基質への吸着が重要であるかも
知れない。 ヴアンヴアケム等は、内皮細胞はガラス上およびグロ
ー放電処理をしたポリスチレンである湿潤可能の組織培
養ポリスチレン上で培養できることを認めた。こうして
ヴアケム等は、血清を含む培養培地で、種々の湿潤性を
有する多数のポリマー上でのヒト内皮細胞の粘着性およ
び増殖性を試験し、それを報告し、示唆した。 既述の論文の他に、ヘス等の“ラツトの腹部大動脈に
移植した繊維性ポリウレタン微小血管人工物の内皮形成
プロセス”ジヤーナル・オブ・カルジオブアスキユラー
・サージエリー24（５）巻516−524ページ（1983）を参
照せよ。これは、繊維性微小血管ポリウレタン人工物を
用いて21日目に完全に内皮を形成した人工物が生成した
ことを報告している。 次の発表は、内皮細胞培養技術に関する開示が特に興
味深い。アジズカン（Azizkhan）等の発表では、in Vit
roウシ毛細血管内皮細胞およびマスト細胞から放出され
る因子に対するそれらの細胞の移動反応に関する開示が
興味深い。ロブリン（Roblin）等およびヤング（Yang）
等の発表では或る哺乳類培養細胞の増殖に影響を与える
因子の開示が興味深い。ソートン（Thorton）等では、
ヒト臍静脈内皮細胞の培養を含むヒト内皮細胞増殖に与
えるヘパリンの影響の開示が興味深い。ソートン等は彼
等が述べた連続二次培養の方法が、これまでに発表され
た方法に比べてHUVE細胞の収量を108倍も高め、成血管
内皮細胞の収量を12倍も高めることを教示する。これは
大量の培養内皮細胞を生産するために最小量のヒト血管
組織の使用ですみ、これにより内皮に関係するヒトの疾
患の問題に、ヒト内皮細胞モデルを用いて直接アプロー
チできるようになるのである。その上、その細胞系は、
血管作用性芽剤のin Vitro試験とか、人工移植片材料の
被覆とかのような種々の臨床応用のために価値があるこ
とが判つたと記されている。ラテラ（Latera）等の発表
では、線維芽細胞の原質粘着におけるフイプロネクチン
ヒアルロネートおよびヘパリンプロテオグリカンの機能
の開示が興味深い。マシアグ（Maciag）等（1979）で
は、中性のPHで調整されたウシ視床下部エキスから得た
ヒト内皮細胞mitogen（細胞分裂誘起物質）の記載が興
味深い。神経由来の内皮細胞増殖因子（ECGF）は静止し
たヒト臍静脈内皮細胞を培養基において刺激し増殖させ
る能力をもつといわれる。ウシ胎仔血清中にヒト臍静脈
（HUV）内皮細胞を小さい播種−密度で培養したものにE
CGFを加えると、血清のみの場合に比べて内皮細胞増殖
は著しく増加するといわれる。マシアグ（Maciag）等
（1981）は、ウシ胎仔血清および内皮細胞増殖因子を強
化した培地199を用い、フイブロネクチン基質でヒト臍
静脈内皮細胞を増殖させたと報告した。こうして、クロ
ス・リフアレンス関連出願における発表および開示は、
ヒト内皮細胞、特にヒト臍静脈内皮細胞（HUEC）のよう
な太い血管の内皮細胞を培養することに関する技術の現
状を示している。 この領域で報告された研究にもかかわらず、ヒト移植
物表面、例えば血管移植片の表面の内皮形成を成功させ
得る簡単な信頼できる方法の必要性がいまだに叫ばれて
いる。 本発明の主な目的は、血管移植片およびその他の移植
物体の内皮細胞による被覆を改善することにある。 本発明のその他の目的は、微小血管内皮細胞で内皮化
される。改良された合成または自然の移植物または移植
片、特に、改良された血管移植片を提供することであ
る。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 本発明に関係するヒト患者に移植する目的の移植物体
を処理する方法においては、合成基質材料を用意し、そ
の材料をIV/V型コラーゲンで処理してヒト内皮細胞の粘
着、増殖および形態を改良する段階を含んでいる。好ま
しい実施態様において、このような内皮細胞は、その患
者のヒト微小血管内皮細胞に富む組織から採取され、そ
れはその組織から分離され、その移植物のIV/V型コラー
ゲン面に適用され、処理すべき上記移植物表面に少くと
も50％以上の上記細胞の融合面を作る。本発明によれ
ば、移植の少し前に高密度で植えつけた時に、その患者
の微小血管内皮細胞の粘着および増殖を促進するように
十分適合するであろう。IV/V型コラーゲン表面層を備え
た移植物体を提供することができる。 好ましい移植物体は合成基質と1/111型コラーゲンの
１枚以上の直接層とIV/Vコラーゲン表面層とを含んで成
る。したがつて、移植される移植片は少くともIV/V型コ
ラーゲン最上面と、1/111コラーゲン下層とから成るラ
ミネートで被覆された基質を含んで成る。このコラーゲ
ンラミネートはヒト羊膜に由来する非細胞性ラミネート
であることが好ましい。好ましい移植物体は次のように
して作られる。オリマー（ダクロン）基質のような合成
基質をグロー放電血漿クリーナーを用いて処理し、コラ
ーゲン被覆のための移植片表面をつくる。なお、本案で
はポリエステル元素の合成繊維（テトロン）をダクロン
と呼ぶことにする。この装置によつて生成したグロー放
電血漿は、移植片表面のエツチングをおこし、コラーゲ
ンおよび移植片間をより強く結合させる。それからこの
移植片の表面を、ウシ、また好ましくはヒト、原料から
調製したエラーゲンＩおよび／またはIII混合物でマド
リ（Madri）の“細胞外基質の免疫科学（The Immunoche
mistry of Extracellular Matrix）”、ボサラントン、
フロリダ、CRCプレス、（1982）１巻、75−90ページに
報告されているような一般的方法を用いて処理する。生
成したコラーゲンを、その酢酸溶解性によつて混入蛋白
質から分離し、高塩化ナトリウム濃度における分別溶解
性によつてその他の基質蛋白質から分離する。それから
移植片基質を、前述のまだ酢酸に溶けているコラーゲン
溶液で処理し、中性緩衝液を加えて溶液のPHを上げるこ
とによつて、コラーゲンを移植片表面および移植片内で
重合させる。37℃でコラーゲンはゲル化する。それをそ
の後グルタールアルデヒドで架橋する。この処理はゲル
を安定化させ、その上アルデヒドにより活性化された表
面を作り出す。 移植片はその時、ヒト羊膜に由来するコラーゲンラミ
ネートを受け取るばかりになつている。この羊膜はリオ
ツタ（Liotta）等の方法〔カンサーレタース、11巻141
−152ページ（1980）〕にしたがつて用意されたヒト胎
盤から得られる。羊膜を繊毛膜から物理的に引つぱつて
とり、化学的に処理する。羊膜上皮細胞を羊膜表面から
物理的にはぎとり、基礎膜コラーゲン（IV/V型）を一面
に、間質性コラーゲン（1/III型）を他面に残す。半膜
は、前述のように処理した移植片材料に適用する前に、
燐酸緩衝食塩液に浸す。生成したコラーゲンラミネート
を、コラーゲン1/IIIを移植片の方へ向けて、移植片材
料のアルデヒド活性化表面上に置く。半膜層表面は相互
作用をおこして共有結合する。残つている遊離アルデヒ
ド基は、その後移植片をアミン、アミノ酸または、アル
デヒド活性アミノ基を含むペプチドで処理することによ
り不活性化される。リジンは、燐酸緩衝食塩液に溶解す
るため、現在のところ好ましい。今は羊膜の基底膜表面
は移植片から離れた方を向いている。そして続いてヒト
微小血管内皮細胞で処理して単層を形成することができ
る。生成した移植片を照射またはその他の適した方法に
よつて殺菌し、使用のために必要になるまで貯蔵する。
IV/V型コラーゲン表面は内皮細胞の高密度播種を受け入
れる用意ができている。このような播種は速かに（２時
間以内）剪断抵抗性内皮細胞単層の形成に導く。この単
層は自然界に出現する丸石（cobbestone）の形態を有す
る。 この方法にしたがつて作つた移植片を、イヌの大静脈
に置換するためにイヌに挿入する。普通の条件下では未
処理の移植片は常に急速に凝血をおこし、しばしば閉鎖
する。このようなイヌのかなりのパーセント、多分大部
分はこのような移植片のために移植後20分以内に死ぬこ
ともよくある。試験動物においては、ここに記載の方法
にしたがつて形成された大静脈を２日後にとり出したと
ころ、それは不定の開放性と矛盾する徴候は何も示さな
かつた。 出願人は太い血管の内皮細胞を微小血管内皮細胞との
間には、それら本来の組織においては形態学的並びに機
能的相異があるとはいえ、ヒト微小血管内皮細胞、すな
わち毛細血管、細静脈に由来する細胞は太い血管の細胞
の代りとしても十分良く機能することを認めた。その
上、微小血管内皮細胞は体組織に豊富にあり、脂肪組織
に最も顕著に認められる。そしてそれを用いて、大部分
の移植物の予後を劇的に改善するのどの移植前融合（す
なわち最低50％の融合）を確立することができるかも知
れない。その後の説明の目的のためには、脂肪組織を微
小血管内皮細胞の典型的原料とするが、他の組織原料か
らの内皮細胞も同様に使えることは当然である。 血管移植片またはその他の移植物を、連続的外科処置
の始めに得られる脂肪から分離した微小血管内皮細胞を
用いて融合するように処理する。無菌条件を確立してか
ら脂肪組織を患者からとる。その脂肪の微小血管内皮細
胞を、酵素的消化と遠心分離によつて組織から速かに分
離し、それを用いて同じ手術の後の方の段階で、その患
者に移植することになつている表面を処理する。この方
法では、成内皮細胞を培養して数をふやす必要がなくな
り、患者は自分自身の新鮮な“健康な”内皮細胞でそれ
が融合に至るまで、または過度に融合するまで処理した
移植片を受けることができる。 本発明の好ましい実施態様によると、得られた微小血
管に富む組織は腎周囲脂肪、皮下脂肪、網、または胸腔
または腹腔と関連ある脂肪である。この組織はカゼイン
分解酵素およびトリプシンから成るコラゲナーゼのよう
な蛋白分解酵素を用いて消化される。すなわちこの酵素
を、組織塊がばらばらになつて組織消化液が生ずるま
で、組織と共にインキユベートする。それら低速度遠心
分離によつて微小血管内皮細胞を消化液から分離し内皮
細胞に富むペレツトを形成する。ペレツトを緩衝食塩溶
液で洗う。連続勾配遠心分離プロセスによつて、または
選択的篩の使用によつて更に精製することもできる。生
成した微小血管内皮細胞を好ましくその後、血漿蛋白質
を、好ましくは１％血漿蛋白質の濃度で含む緩衝食塩溶
液に懸濁させる。それから、ペレツト対溶液の比が容量
ベースで1:5〜1:15またはより好ましくは約1:10である
この懸濁液を用いて表面を処理する。その場合、微小血
管内皮細胞がその表面に十分に粘着し、少くとも50％の
融合がおこるまで、細胞をその表面と共にインキユベー
トする。その結果、融合しているか、移植後非常に速く
（細胞数の一倍加以内に）融合に達する内皮化表面をも
つ改善された移植片または移植物が得られる。 内皮細胞が粘着する最初のパーセンテージは、IV/V型
表面層を有する人工物を用いた場合、さほど大きくない
のが普通であるとはいえ、生成した内皮細胞層の形態
は、その他の人工表面および／または表面前処理を用い
て得られるそれよりも遥かにすぐれている。こうして微
小血管内皮細胞の使用により、低い粘着率を補つてあま
りある高い密度の播種が可能になる。 よつて、本発明又は好ましい実施例によれば、血管移
植片およびその他の移植物の内皮細胞による被覆を改善
することができる。また微小血管内皮細胞で内皮化され
る改良された合成または自然の移植物または移植片、特
に、改良された血管移植片を提供することができる。 〔実施例〕 本発明に関係する好ましい方法は、種々の型の内皮細
胞の機能および特性を研究する仕事から発している。こ
こに記載せる方法は無菌条件下における（たとえば手術
室）ヒト微小血管化組織（腎周囲脂肪、網、または皮下
脂肪）からの大量の微小血管内皮細胞の分離を可能にす
る。大量の細胞の獲得のために、分離に続き組織培養を
行う必要がなくなる。これらの方法は、組織源としてラ
ツト副こう丸を用いて非ヒト（ラツト）微小血管内皮細
胞を分離する研究中に開発された方法と関係がある。最
近、非ヒト、ラツト脂肪−微小血管内皮細胞を分離する
方法が、皮膚および脂肪からヒト微小血管内皮細胞を分
離、培養するため役立つということが報告された。ケル
ン（Kern）等はこれらの分離した内皮細胞を次いで培養
し、機能的研究に用いた。J.Clin.Invest.71巻、1822−
1829ページ（1983）、ジヤレル等の“培養したヒト成内
皮細胞の増殖（Human Adult Endothelial Cell Growt
h）、ジヤーナル・オブ・ヴアスキユラー・サージエリ
ー１（６）巻、757−764ページ（1984年11月）、これは
参照によつてここに挿入される。 本発明は血管内移植物に内皮細胞内張りを作るため
に、分離した微小血管内皮細胞を用いる新規な方法を提
供する。このような移植物としては例えば人工血管、人
工心臓、心臓弁のような、血管関係の考案物があるが、
これらに限定されるわけではない。ここに説明する方法
がその他の人工器官または考案物の開発に通ずることが
期待される。これらの器官および考案物は移植後かまた
は体外回路において循環血液を受けとる。そして本法
は、血液と移植面との間に非血栓形成性の、または抗ト
ロンボゲン性の界面を提供する。本発明の直接の目的
は、ここに記載の方法を用いて既知の合成材料例えばポ
リエステリおよびポリテトラフルオロエチレンまたは天
然に発生する材料、例えば臍静脈、伏在静脈および本来
のウシ動脈から成る面に内皮を形成することである。 本発明は、ヒト患者に移植することを目的とした移植
物を処理する方法であつて、その患者からヒト微小血管
に富む組織を得ることと、その組織から微小血管内皮細
胞を分離することと、上記微小血管内皮細胞を上記移植
物上に置いて、処理すべき上記移植物表面に最低約50％
の上記細胞の融合を形成せしめることとから成る方法を
提供する。この方法は迅速かつ比較的簡単で、患者自身
の“新鮮な”（培養しない）内皮細胞で処理した人工物
または面の移植を容易にする。外科的処置がそつくり単
一の無菌環境で行われるから内皮化移植片が汚染される
可能性は最小である。 本発明の方法により、組織培養を行うことなく多量の
内皮細胞を分離することができる。しかも含まれる処置
は手術室で容易に行うことができる。患者の組織から微
小血管内皮細胞を分離する方法の一般的流れ図を第１図
に示す。これらの処理法は脂肪以外の組織、例えば脳、
肺、網膜、副腎、肝臓および筋肉から内皮細胞を分離す
るためにも用いられるが、細胞源として脂肪組織を用い
るのが好ましい。それは豊富にあり、手に入れ易く、そ
の切除が治療を受ける患者に不都合な作用をおこさない
からである。そこで、第１図に示すように、或る量のヒ
ト微小血管化脂肪（Ａ）を多数の原料の中から調達す
る。あまり好ましくはないが、脳死の心臓は生きている
死体提供者、また患者以外の他の提供者から（この場合
は提供者の手術中に）ヒト腎周囲脂肪を得ることも可能
である。いかなる場合も提供組織をすぐに氷冷緩衝食塩
液（PH7.4）に移す。この場合緩衝剤は燐酸塩、すなわ
ち燐酸緩衝食塩液（PBS）であるのが好ましい。よく切
れるはさみで組織を細切し（段階Ｂ）緩衝液を傾淳す
る。カゼイン分解酵素とトリブシンとを含む蛋白質分解
酵素コラゲナーゼをその組織に加え、組織塊がばらばら
になるまで37℃でインキユベートする。この消化は30分
以内におこり、一般には20分以内にするべきである。消
化液を減菌試験管に移しテーブルトツプ遠心分離器を用
いて低速度（700×ｇ）で室温で５分間遠沈する（段階
Ｃ）。こうして生成したペレツトは内皮細胞95％以上か
ら成る。これらの内皮細胞は、細胞脈、毛細血管および
細静脈、微小血管系のすべての成分に由来するから、こ
れらの内皮細胞をここでは微小血管内皮細胞（MEC）と
呼ぶことにする。このMECペレツトを緩衝食塩液、好ま
しくはPBSと共に遠沈することにより一回洗浄し、それ
以上精製することなく直接ここに記載の処理（適用）段
階に用いることができる。 別法として、これらの微小血管内皮細胞をその細胞を
連続的勾配で遠沈することにより、さらに精製すること
ができる（第１図段階Ｄ）。この勾配は多数の高分子溶
質から形成される。これら溶質としては、アルブミン、
デキストンラン、またはパーコール（Percoll）（フア
ルマシア社、ピスカタウエイ、N.J.）またはナイコデン
ツ（Nycodenz）（ナイエガールド社、ノールウエー）の
ような市販の密度勾配材料がある。勾配遠心沈殿は、赤
血球、白血球および平滑筋細胞を除去するために用いら
れる。ここに報告した研究においては、パーコール45％
溶液を常用した。細胞をパーコール溶液の表面に層状に
置き、13000×ｇで20分間遠沈した。または、形成され
たパーコール勾配上に細胞を置き、室温で５分間400×
ｇで遠沈した。内皮細胞の厚さバンドが勾配の上端に生
成する。これらの細胞をピペツトでとり、燐酸緩衝食塩
液と共に遠沈することにより一回洗つた。 ヒト微小血管組織に由来する微小血管内皮細胞を、人
工血管表面に適用するためにさらに治療したりすること
なく、直接本発明の播種段階に用いた。この方法の主な
利点は、血管移植片の被覆のために、多量の内皮細胞を
ヒト組織から調達することができることである。その
上、これら細胞を人工物移植を受ける提供者から得るこ
とができる。したがつてこの方法では、移植可能の表面
を同種内皮細胞で処理することができる。 本発明のもう一つの方法によると、MECを受けるとき
べき人工表面を、何ら前処理なしに、製造業者がそれら
を包装する条件下において直接用いることができる。し
かし、水性溶液でこれらの表面をあらかじめぬらしてお
く方が都合がよい。前処理は、内皮細胞の表面への粘
着、拡大および増殖を促進するために行われる。本発明
のもう一つの実施態様の処理段階の実施にあたつては、
分離したヒト微小血管内皮細胞を、その患者からの血漿
由来蛋白質を含む緩衝食塩液に懸濁させる。この蛋白質
溶液は６部分の緩衝溶液と１部分の血漿を混合し、約１
％の蛋白質を含む溶液を作る、というようにして調製さ
れる。１表のデータは、内皮付着が懸濁液中の蛋白質濃
度により影響されることを示してる。１表のデータが示
すように、至適蛋白質濃度は約１％である。そして表面
処理中に蛋白質が必要であることを示す。アルブミンが
好ましい蛋白質源であるが、非血漿性蛋白質源を用いる
こともできる。 第１表：種々のアルブミン濃度がHAECの最初の粘着およ
び増殖に与える影響。 融合パーセント アルブミン濃度 ２時間 24時間 ０ ％ 36.5％ 63.6％＊ 0.1％ 32.5％ 61.2％＊ 1.0％ 47.7％ 67.9％＊ 4.5％ 11.5％ 61.7％＊ 融合パーセントは＃ECM/105細胞/cm2で示す。 ＊は有意な変化を示す。 その後微小血管内皮細胞懸濁液を、好ましくは遠沈し
て（200×ｇ）ペレツトとし、そのペレツトを蛋白質含
有緩衝溶液に再懸濁させる。この再懸濁を行う場合、詰
まつた（包み込まれた）微小血管内皮細胞：緩衝溶液の
容量比は約1:5〜1:15または1:10にするべきである。そ
の細胞懸濁液を管状移植片に加えて両端を締めるか、ま
たは細胞を処理すべき表面上に層状に置く。細胞を相互
作用させる最適期間は正確には定まつていない。それは
人工物の材料、その材料が受ける前処理の性質、および
人工物の表面が微小血管内皮細胞をより良く受けとられ
るように変形されているかどうかによつて変化する。例
えば、未処理ポリエステル移植片表面への内皮細胞の粘
着には２時間必要であるが、蛋白質で処理した同様の表
面に粘着させるには10分以下でよいことがわかつた。こ
の粘着行動は、平らな未処理のダクロン移植片上のヒト
微小血管内皮細胞（MEC）の走査型電子顕微鏡研究によ
り確かめられた。内皮細胞が移植片表面に粘着するに十
分な時間インキユベーシヨン後、その表面を蛋白質含有
緩衝液で洗う。そこでその人工物を普通の方法で移植す
ることができる。 生化学的データと形態学的データの両方に基づいて、
ヒト微小血管内皮細胞は未処理の移植片表面に粘着する
ことがわかつている。走査型電子顕微鏡は、上述の方法
を用いて未処理ダクロンポリエステル上に置かれたヒト
MECは粘着をおこし、その後培養基で１日おいた後細胞
被覆（完全な融合）がおこることを明らかにした。細胞
は移植片の特殊の領域に付着し、未処理移植片表面を完
全には被覆しない。ヒトMECを血漿処理−ダクロン−ポ
リエステル移植片上に播種する時には、未処理ダクロン
表面に播種する時と比べて、被覆は最初は著しく大き
い。走査電子顕微鏡は、血漿−コーテイング移植片がヒ
トMECで融合被覆されていることを明らかにした。第２
表は、未処理および蛋白質コーテイング−ダクロン−ポ
リエステル移植片のヒト微小血管内皮細胞の粘着および
増殖（最初は１日目、そして14日後）を説明する。 上記の融合パーセントは＃EC/155細胞/cm2で示す。 ＊印は有意な変化を示す。 第２表が示すように、MEC粘着は移植片表面の蛋白質
処理によつて容易になる。人工物表面の内皮細胞増殖が
蛋白質処理の実施によつて促進されることもわかつた。 前述のように、人工物表面上の完全無傷の単層の形成
は、移植の前に形成されたならば最も都合が良いかも知
れない。この内皮化表面は、もし剪断抵抗を有するなら
ば直接的抗−トロンボゲン表面を提供するであろう。そ
こで、微小血管内皮細胞層の剪断抵抗を調べた。ヒト脂
肪をコラゲナーゼで25分間処理し、洗浄し、パーコール
勾配分離で精製した。この収量は1.25±0.45×106細胞/
g脂肪であつた。血漿コーテイング−ダクロン上で１時
間インキユベーシヨン後、2.8±1.5＋104が表面にしつ
かりと粘着して残つた。２時間、０〜80dynes/cm2の剪
断応力で流れにさらした時、最初に粘着していた細胞の
50〜100％が粘着したまま残つた。このデータの統計的
分析では、粘着細胞数と剪断速度との間に強い相関関係
を証明することはできなかつた。走査型電子顕微鏡は、
血漿コーテイング−ダクロンに付着した、種々の付着時
期における内皮細胞を明らかにする。大部分の細胞はま
だ丸く、焦点的に表面に付着しているだけだが、若干の
細胞は最大に平らになり、細胞−細胞接触を形成してい
た。大きい細胞収量としつかりした粘着性のため、微小
血管内皮細胞は、細胞培養の必要性なしに、外科移植時
に融合内皮細胞を移植片に播種する可能性を与える。 その他の実施例によつて、移植後、内皮細胞を植えつ
けた移植片が動脈血流にさらされる時の条件を模するた
めに、蛋白質処理表面への内皮細胞の粘着を剪断応力下
で試験した。ヒト成微小血管内包細胞を、IRB義定書
（プロトコール）にしたがつて、脳死状態で心臓は動い
ている死体器官提供者または無関係の手術的措置を受け
ている患者から採取したヒト腎周囲脂肪または腸網膜脂
肪から分離した。その脂肪を機械的に細切し、ダルベツ
コー陽イオン−free−（DCF）緩衝液、PH7.4、10mlをコ
ラゲナーゼ（ウオーシントンＩ型；クーバー、バイオメ
デイアル、マルヴエルン、PA）4mg/mlおよび血清アルブ
ミン（シグマＶ型；シグマケミカル社、セントルイス、
MO）4mg/mlと共に含む減菌50mlねじ蓋つきエルレンマイ
ヤーフラスコに入れた。そのフラスコをしづかに攪拌し
ながら37℃で25分間培養（インキユベート）した。フラ
スコの内容物を200×ｇで７分間遠沈した。ペレツトを
0.1％BSAを含むDCF緩衝液で２回洗い200×ｇで３分間回
した。 生成したペレツトをDCF中の45％パーコル（フアルマ
シアフアインケミカルス、ピスタカウエイ、N.J.）に再
懸濁し、４℃、20000×ｇで遠沈した。毛細管内皮細胞
の群即ち小血管束（タフト）は、ペレツト中の血管フラ
グメントおよび細胞破片と共に、密度勾配のてつぺんの
乳白色の層中にあつた。毛細管内皮細胞をDCF−BCA緩衝
液中で、３分間、200×ｇで２回洗つた。細胞群（タフ
ト）を20％ウシ胎仔血清（ハゼルタウンリサーチラボラ
トリース、デンバー、PA）と共に培地199に再懸濁させ
た。一次分離物中の内皮細胞の確認は、主として位相差
顕微鏡による形態学的試験に基づいて行われた。高密度
にプレート上に接種され、一次培養を受けた一次分離物
は、第VIII因子関連抗原が陽性の染色を示し、アンギオ
テンシンＩ変換酵素（ACE）活性をあらわした。 移植片表面を次の方法を用いて処理した。クーレイ・
グラフト・ウーヴン・ポロシテイー・ダクロン・フアブ
リツク（Cooley Graft Woven Porosity dacron Fabri
c）（メドツクスメデイカル、オークランド、NJ.から供
給される）をアセトン、8.5％H3PO3、INNaOHで次々に洗
つた。この後で２回、蒸溜水で大がかりに洗つた。乾い
てから、それを空気中で10-4トール（torr）において、
ハリク血漿クリーナー（ハリクインダストリー、オツシ
ニング、NY）中に10分間つけた。移植片材料の2.5×5cm
切片を、基質コーテイング並びに内皮細胞播種のために
用意した。 それから、ダクロン移植片材料を多血小板血漿で処理
した。多血小板血漿は、正常なヒト提供者から採取し
た、抗凝固化（ACD）したばかりの全血から作つた。そ
の多血小板血漿（PRP）を、移植治療の直前に50mMCaCl2
と混ぜた。それからPRPを播種室に固定した移植片材料
上に置いた。ひとたびPRPで処理すると、移植片表面に3
7℃でフイブリンクロアト（fibrin clot）が形成され
た。過剰のクロツト（clot）を除去し、EC播種に先立つ
て移植片表面を培養培地で洗つた。 播種室に固定され、PRPをコーテイングした織物のダ
クロン移植片に、培養培地0.5cc中の５×105ECを、播種
凹み（1cm2面積）に置いて播種し、37℃培養基中で１時
間以上培養する。培養（インキユベーシヨン）後、上澄
液を除去し、移植片表面を培養培地で軽く洗つた。対照
（制御）室には新鮮な培養培地0.5ccを充填し、これを
循環ループ試験管の中に置いた。それから再循環培養培
地を用いて、ECを37℃で２時間、０〜80dynes/cm2の剪
断応力に１回さらした。流している間に、無視し得る程
度の圧力勾配、PHおよび電解質濃度の変化が認められ
た。剪断応力は平行プレート間の運搬運動量の式を用い
て計算された。バード（Bird）等の“運搬現象（Transp
ort Phenomena）”、ニユーヨーク、1960、ジヨンウイ
リー＆サンズ社、１−70ページ参照。我々の研究で計算
された最大レイノズル数は600で、層流を示唆した。さ
らに、流量対圧力測定値は、遭遇する剪断速度全体を通
じて直線関係を示した。流れの終りに、室を分解して移
植片表面を光および走査型電子顕微鏡によつて調べた。 光顕微鏡は、0.1％BSAを含むダルベツコの燐酸緩衝食
塩液で洗い、95％エタノールで15分間固定した播種移植
片で行つた。移植片を蒸溜水で洗い、ギルのヘマトキシ
リンで染色した（フイツシヤーサイエンテイフイツク
社、フエアローン、NJ）、蒸溜水で２回洗つた後、移植
片をスコツトの水道水代用液の中に１分間浸した。表面
を蒸溜水および95％エタノールで２回洗つた。染色した
移植片をニコンのダイアフオト顕微鏡で試験した。 走査型電子顕微鏡検鏡も行つた。播種した表面を１％
グルタールアルデヒドで１時間、３％グルタールアルデ
ヒドで２時間固定した。それをタイロードのカゴダイレ
ート緩衝液（PH7.4）で20分づつ３回洗つた。サンプル
を１％O3O4で30分間後固定し、タイロード緩衝液で３回
洗つた。サンプルを臨界点で乾燥し、金パラジウムのス
パツタで被覆した。覆われたサンプルをフイリツプス走
査型電子顕微鏡で検査した。 内皮細胞のインジウム標識化も行つた。内皮細胞を既
述のようにして微小血管から分離した。100×ｇで３分
間遠沈することにより細胞をペレツトにし、PBS（PH7.
4）で１回洗つた。細胞を標識化前にPBS0.5mlに再懸濁
した。細胞濃度を2.5×105細胞/mlに調節した。20マイ
クロキユリーのインジウム111（インジウム111オキシン
として、イメージフイジイツクス、エメリーヴイル、C
A）を細胞懸濁液に加え、普通に攪拌しながら、30分ま
で細胞を標識化した。洗う直前に、標識化効率を最終的
に分析するために５μｌサンプルをとつた。標識化細胞
を完全組織培養培地を用いて遠沈により３回洗つた。最
後にできたペレツトを、最終濃度2.5×105細胞/mlにな
るように完全培養培地に再懸濁した。 放射性標識化ECの粘着量を、次の操作法を用いて測定
した。ビーム・カプセル（ポリサイエンシズ社、フオル
トワシントン、PA）に固定したダクロン被覆PRP上にそ
のECを播種し、特定の時間（ｔ＝10、20、30、60、120
分）インキユベートした。各々の時間でサンプルを調べ
た。培養培地を除去し、PBSをピペツドで表面全体に力
強くふりかけた。ビームカプセル全部を分析にかけた。
各時点の平均値を計算し、最大粘着を時間に対するパー
セントしてプロツトした。 フロー（flow）・スライド及び対照スライド上のECの
カウント数をIBM PC ATおよびフレーム・グラバーに
支持されたマイクロ・コンプ（Micro−Comp）グレイン
・カウンターを用いて計数した。フロー分析で得られた
データを二方法で評価した。第一に、EC粘着性を、フロ
ー後も（流した後も）粘着したままに残つている細胞を
対照スライドに比較したパーセントとしてあらわす。各
時点は少くとも４観察をあらわし、８観察もあらわす場
合もある。これを剪断応力に対してブロツトし、この曲
線で直線回帰分析を行つて、統計的有意性を検定した。
第二には、最初の粘着の比較をスチユーデント（Studen
t）のｔ−テストを用いて行つた。 EC粘着性はインジウム111標識によつて測定し、時間
に対してプロツトした。各データ点は別個のニサンプル
の平均をあらわす。 この試験では、脂肪組織を13人の提供者から得た。そ
れは腎周囲および網脂肪源が含まれていた。EC分離の３
段階にかかつた時間は、コラゲナーゼに29.9±３分（平
均±平均の標識誤差）、パーコールに20分洗浄と細胞計
数操作に30分であつた。湿脂肪の1gあたりの平均EC収量
は1.25±0.45×106細胞であつた。トリパンブルー染色
排除によつて調べた細胞生育性は、すべての分離におい
て95％以上であつた。 血漿被覆ダクロン上で１時間培養（インキユベーシヨ
ン）後、光顕微鏡により評価した内皮細胞粘着は2.8±1
04細胞/cm2であつた（ｎ＝９）。粘着性を融合パーセン
トとして測定した。これは１時間インキユベーシヨン後
の粘着内皮細胞の数を数え、105でそれを割ることによ
つて出した。それは細胞の播種密度に無関係に融合単層
中に存在するEC最大数である。統計的分析のために１提
供者につき４回粘着測定を行つた。第６図に見られるよ
うに、個々の提供者の粘着平均値の標準誤差は小さい。
それに対して、平均粘着は提供者＃２の1.13×104EC/cm
2から、提供者＃９の4.11×104ECまでに変化した。提供
者＃８おび９は＃１、２、４、５、６、７に比べて有意
に高い初粘着性を示した（ｐ＜0.005）。そして＃３は
スチユーデント（Student）ｔテストによると＃１、
２、４、５、７とは有意差を示した。 微小血管内皮細胞の血漿処理ダクロンへの粘着の短時
間の経過も、この試験で調べた。インジウム111で放射
性標識化した微小血管内皮細胞を、血漿処理ダクロン上
にプレートし、120分間に亘つて細胞粘着を分析した
（第７図参照）。左側のｙ軸は与えられた時点における
EC粘着数を、２時間インキユベーシヨン後の（最大粘
着）EC粘着数で割つたものをパーセントであらわしてい
る。右側のｙ軸は与えられた時点におけるEC粘着数を最
初に播種したEC数（105EC/cm2）で割り、融合パーセン
トとしてあらわした。粘着の二相性が認められた；最初
の60分間の速い粘着速度の次に、それから最後の120分
までの比較的遅い速度が続く。評価した最も早い時点、
10分の時点において、限られているとはいえ著しい粘着
が認められた。 フローを行つた血漿被覆ダクロンへの粘着をさらに調
べた。１時間インキユベーシヨン後、EC播種表面をフロ
ー室に置き、一定の剪断条件にさらした。各一人の提供
者からのECは唯一の剪断速度にさらした。第８図はダク
ロンへのEC粘着に与える剪断応力の影響を示す。データ
はダクロン移植片への粘着パーセントとしてあらわされ
る。これは２時間の実験後に表面に粘着したEC数を数
え、それをインキユベーシヨン前に表面に粘着したEC数
で割り、パーセントであらわしたものである。13人の提
供者からのECを用いた。各々の剪断応力につき、一人の
提供者で４回観察を行つた。２人の提供者からのECを与
えられた剪断応力（例えば20、30または50dynes/cm2）
で個々に試験した時、細胞粘着性の有意差は認められな
かつた。直線回帰分析は、ｙ軸を横切る所が91で、勾配
−0.33、ｒ値−0.26を明らかにした。この統計分析は、
分離しばかりの微小血管ECの粘着は80dynes/cm2までの
剪断応力には影響されない、という結論を支持する。 EC粘着性の定性的評価を走査型電子顕微鏡で行つた。
細胞を１時間、表面に結合させ、その後２時間剪断する
場合、低パワー観察は種々の密度のECを有する領域を明
らかにした。ダクロン表面は血漿かたまり（クロツト）
によつて一様におおわれ、細胞は、製織プロセス中にで
きた山（たて糸）および谷（よこ糸）両方を覆う血漿ク
ロツトの領域に粘着しているのが認められた。低パワー
観察によると、“より限定された細胞結合をあらわす”
と考えられた領域を、より高倍率にすると表面との結合
の種々の段階にあるECが明らかにされた。細胞の形態
は、細胞表面領域に劇的な増加を示す平らな細胞から、
限局的に付着して丸いままでいる細胞までいろいろであ
つた。それらの細胞はすべて剪断に抵抗した。 こうしてこの試験は、人工表面上に内皮を作り、先行
技術の人工表面の血栓形成性に起因する問題を避けるこ
とができることを裏づける。この試験は更に、あらかじ
めEC培養をしないで、移植時に完全に内皮化する人工移
植片を提供する可能性を示す。このやり方は、微小血管
はほとんどすべての組織に高密度で普遍的に存在するの
に、数の限られた大きい血管のみをEC供与体として使用
するという問題を回避する。これらECは脂肪組織から比
較的容易に分離され、太い血管に比べて組織1gあたり多
数のECを与える。組織培養ではこれらECは、大血管のEC
機能的および形態学的特徴の多くを示す。最も重要はこ
とは、それらが正常の大血管の内皮の丸石（cobbleston
e）の外観に全くよく似た、接触禁止（コンタクト・イ
ンヒビツト）融合単層を形成することできることであ
る。微小血管内皮細胞は、移植片に速やかに内皮を形成
できる細胞に要求される多くを満足せしめる。その細胞
は組織に普遍的に存在するところの大変な外科的措置な
しにそして患者には最小のリスクしか与えないで、大量
に採取できる提供組織である脂肪組織に存在する。その
ような細胞は大部分の患者から60〜90分で容易かつ確実
に分離され、混入平滑筋細胞のない、そしてPRPで前処
理したダクロンまたはその他の材料、例えば基礎膜に早
く、しつかりと粘着することのできる内皮細胞を多量に
生産することができる。それらはその上、融合細胞領域
を確立することができ、たつた１時または２時間のイン
キユベーシヨン後に生理的剪断応力に抵抗し、かつま
た、提供者の自家内皮細胞である。 既術の試験は、種々のヒト提供者から採取した脂肪が
1.25±0.45×106EC/g脂肪を与えること、そしてこれらE
Cの最初の粘着性がPRP処理をした移植片上でさえも適用
ECの10％〜40％の範囲であることを示す。患者の年会、
疾患または社会的行動に関して明確な傾向は確認されな
かつたが、ECの収量および粘着特性は個人個人で異なる
という証拠がある。これらの差にも拘らず、これらの粘
着変数は、採取する脂肪量をふやすことによつて埋め合
わせられる。 記載の試験により、新たに分離し、播種したECが生物
学的剪断応力に抵抗することができるというもう一つの
重要な必要条件をも調べた。大部分の試験管内の播種実
験と同様のシステムにおいて、内皮形成表面の、剪断に
対する抵抗性を調べた。これまでの研究では我々は、EC
がたとえ容易に融合単層を形成しなくても、表面にしつ
かり粘着できることを証明した。こうして、このモデル
は１個１個の細胞の、表面への粘着性を実際に測定し、
多分、流れにさらされる細胞の理想的環境よりより小さ
い粘着性を示す。だかEC粘着性は50％以上にとおまり、
大抵の場合遭遇するすべての剪断力レベルにおける粘着
性よりずつと大きかつた。これは、ひとたび細胞と表面
との相互作用および付着がおきたならば、ECは非常にし
つかり粘着することを意味する。このモデルには多くの
変数がある。その中には提供者の変数、血漿の変数およ
びインキユベーシヨン条件あがり、これらはこのプロセ
スをより完全に理解し、最適にするため研究される。 もう一つの重要な特性は、新たに分離され播種された
ECが速かに完全な細胞・細胞間相互作用を形成すること
ができることである。これらの相互作用が付加的にECを
剪断応力から守り、細胞の表面から剥離の防止を助ける
のは明白である。細胞・細胞間結合は血漿被覆ダクロン
（テトロン）上では限られた程度におこるが、この後に
説明する試験ではそのような細胞・細胞間相互作用を促
進するより適した表面が提供される。 上述の実験は、微小血管ECが有する特性のためにECが
移植片内皮形成のために潜在的にすぐれていることを実
証する。分離操作並びにその後の表面粘着および細胞・
細胞間相互作用に含まれる変数をこの後により十分に検
討する。しかしながらここで論じた、およびこの後に論
じる操作法はすべて手術室の環境における自己ヒト組織
の操作と一致することを覚えておくべきである。 人工表面上の好ましい内皮細胞融合層の形成は、今で
は最近三つの重要変数に依存すると考えられる。先づ、
第１に最初の細胞粘着は、少なくとも約50％の初期表面
被覆を提供するに十分でなければならない。少なくとも
約50％の被覆をもたらすほどの大血管内皮細胞の調達は
不可能でないにしても非常にむづかしい。なぜならば利
用できる唯一の細胞源は患者自身の大血管であるからで
ある。大血管の細胞を分離し、培養して多数の細胞を用
意することができるとしても組織培養培地と関係した明
白な問題が提起されるであろう。微小血管化脂肪は、播
種するための内皮細胞の豊富な資源となる。患者の脂肪
20gは180cm2の表面積（股動脈とひかがみ動脈とをバイ
パスする典型的移植片が示す表面積）に播種するに十分
な内皮細胞を提供する。 考慮すべき第二の変数は、内皮細胞が人工物表面で増
殖する能力である。50％融合で適用した場合、融合した
細胞層を形成するには細胞が一度２倍になることが必要
である。第２表は、好ましい蛋白質被覆表面（富血小板
・血漿で被覆した）上で増殖因子を含む組織培養培地中
で細胞は少なくとも１旦は２倍になることを示してい
る。しかしながら体内ではこれらの増殖因子は多分に存
在しない。したがつて融合でまたは融合の過剰で表面を
処理する能力があると好都合である。ここでもまた、ヒ
トMECが多量に使用できれば移植時に融合単層に近いも
のを確立することのできる密度で内皮細胞を表面に適用
することができる。 これら二変数は前記のように蛋白質で前処理した人工
物表面、または蛋白質表面に匹敵するように加工された
表面上にヒト内皮細胞を適用することにより十分に研究
されている。このような変形された表面は、内皮細胞組
織培養技術者には十分よく知られいる。別法として、内
皮細胞を移植片の内部および周囲に生成するフイブリン
（蛋白質）ゲル中にあからじめ凝固する。データはヒト
微小血管内皮細胞が蛋白質の網目構造の中でゲル化し、
培養倍地においてインキユベーシヨン後ゲルの表面に移
動するこを示す。これは走査型電子顕微鏡により確認さ
れた、それはヒト微小血管内皮細胞がヒト血漿中であら
かじめ凝固した後にダクロンポリエステル移植片の表面
に融合単層を生成することを示した。 第三の重要な変数は「技術」および「基礎にある表
面」が組織、剪断抵抗および抗血栓形成性を含むEC単層
の機能的特徴を持つことによる影響である。このような
機能的特徴を改善するために、ヒト成内皮細胞（以下HA
ECと呼ぶ）と、ヒト羊膜によつて示される天然コラーゲ
ン表面との相互作用を研究した。走査型電子顕微鏡によ
る評価の結果、HAECは羊膜の基礎面（コラーゲンVI/V）
にも間質面（コラーゲンI/III）にも速かに粘着するこ
とがわかる。しかしながら細胞の粘着は基礎膜表面の方
が著しく大きい。その上、HAECは間質性面に播種された
細胞に比較して、基礎膜面にすみやかにより密接な細胞
・細胞間（cell ot cell）相互作用をおこす。これらの
結果はもし表面を内皮細胞が元々粘着する天然の基礎膜
を模して作るならば、内皮細胞のその人造表面への播種
は容易になることを示唆している。 上述のように最近の証拠は、内皮細胞が未処理移植片
および／またはコラーゲン被覆人工物表面に粘着し、少
くともゆるい細胞・細胞間相互作用をそれとおこしてい
ることを示唆する。しかしながらこのような証拠から
は、そのような内皮細胞が本来のヒト血管に存在するよ
うなち密な細胞・細胞間結合物を形成することは証明さ
れない。しかしながらヒト内皮細胞と、普通は内皮細胞
が粘着する本来の基質との最初の相互相互は非常に重要
であつた。特に摘出ヒト羊膜は内皮細胞を剥ぎとつた時
には正常なヒト血管の内皮細胞の下にある面と同じ化学
構造であるからである。標本化羊膜も天然の血管も、内
皮細胞表面を除けばIV型、Ｖ型両方のコラーゲンの基礎
膜とその下にあるＩ型およびIII型コラーゲン基質とか
らなる。 主題の表面ができることを証明するためにジヤレル等
の“ヒト成内皮細胞の培養増殖"J.VascSurg,1（６）巻7
57−64ページ（198）に発表された操作法によつてヒト
成内皮細胞を分離し培養した。これらの細胞を標本化羊
膜上に播種し、本来のヒト血管の基質シユミレートした
基質に対する内皮細胞の最初の粘着を研究できるシステ
ムを作つた。光および走査型電子顕微鏡により評価し
た。 新鮮なヒト胎盤からとつたヒト羊膜を、リオツタ（Li
otta）等の“腫瘍侵入研究のための完全無傷ヒト基礎膜
の大きい面を作る新しい方法（New Method For Prepcri
ng Large Sufaces of Lntact Human Basement Membrane
For tumor Lnvasion Studies）、キヤンサーレター、1
1巻141−152ページ（1980）に記された方法の変法によ
つて作成した。全ての操作は無菌条件下で行われた。内
側羊膜をゆつくりと大胆に繊毛膜から切り裂き100単位/
mlのペニシリンと、025mcg/mlのフンギゾンを含む、氷
例−燐酸−緩衝食塩液中で２回洗つた。これに続きダル
ベツコの最小必須培地で、４℃で１回洗い。1mMN−エチ
ルマレイミドを含む蒸溜水で１時間４℃ですすいだ。そ
れから羊膜を４％デオキシコレート溶液中で20℃で２時
間インキユベートし、下にある基礎膜の構造を損傷する
ことなく上皮細胞をばらばらにほぐす。ゴムのポリスマ
ドでゆつくり攪拌すると上皮細胞は基礎膜からはぎ取ら
れる。基礎膜の統合性を墨汁染色によつて確めた。上皮
細胞の除去は形態学的に確認した。 上記のように用意し上皮を除去した羊膜を、ウイリア
ムズ等の“成ヒト内皮細胞の人工移植片材料との適合
性"J,Surg,Res（同上）に用いられたのと同様のプラス
チツクカプセル中に固定した。これはその後の内皮細胞
の播種および増殖のための安定した。輪郭をはつきりつ
けた羊膜表面（0.5cm2）を用意した。羊膜の基礎膜も介
在性コラーゲン側も細胞播種のために準備した。組織培
養研究に先立つて、羊膜を含むカプセルを500mcg/mlペ
ニシリン／ストレプトマイシンおよび0.25cmg/mlフンギ
ゾンを含む完全培地に４℃で一晩つけた。 ヒト内皮細胞を脳死で心臓は動いている死体の腎供与
体から採取した血管組織から分離し、上に参照した公表
されている操作法によつて培養した。この研究では新鮮
な腸骨静脈からのECを用いた。つまり、口径面をコラゲ
ナーゼ（ウオーシントンＩ型、ウオーシントン デイア
グノスチツク システムズ社 フリーホルド、N,J）で
処理することにより新鮮な腸骨静脈から分離し、ゼラン
チン（１％）の培養培地溶液（培地199 20％加熱不活
性化・ウシ胎仔血清、90μg/mlへパリン（プロシン）、
20μg/ml内皮細胞増殖因子）をあらかじめ被覆した25cm
2組織培養フラスコにおいて増殖させた。羊膜播種実験
に用いる細胞は累積的集団倍化（cumurative populetio
n doubling）が16〜25の間になるように計算した。集団
倍化（population doubling）は PD＝1og2（収穫細胞数）／（播種細胞数×付着効率） により計算し、合計して累積的集団倍加（CPDs）を与え
た。これらの細胞のEC同一性の確認は前に報告した。そ
して第VIII因子関連抗原のための陽性染色、丸石（cobb
lestone）の形態およびEC−特異−プロスタグランジン
およびアンギオテンシン変換酵素活性を含んでいた。 内皮細胞を播種した羊膜２％をグルタールアルデヒド
で一晩固定し、それから形成物を固定し、パラフインに
埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオシン染色用の切片
を作成した。染色した切片はニコン・デイアフオト・顕
微鏡で鏡を照射して明るくして調べた。 走査型電子顕微鏡では、EC播種羊膜を１％グルタール
アルデヒドで１時間、それからタイロード カコデイレ
ート緩衝液pH＝7.4中で４回洗つた（各20分づつ）。そ
の羊膜をアセトンの段階的系列で脱水し、臨界点で乾燥
し、金−パラジウムで被覆した。この時点においてプラ
スチツクカプセルを播種羊膜サンプルから除去した。こ
れらサンプルをフイリツプスの走査型電子顕微鏡にとり
つけ、検査した。 上述の方法によつて作成したヒト羊膜は、剥離走査に
抵抗し得た。基にある基礎膜構造が維持されていること
は墨汁を用いる走査によつて確かめられた。サンプルを
光および走査型電子顕微鏡を用いて検査した時、羊膜面
が完全無傷であつたこと、すなわち表面に破損、または
破れや裂けがなかつたことから膜の完全性も証明され
た。その上、播種しない、剥離した（露出）対照用の羊
膜をECなしのままであつた時、脱上皮下処理の効率が証
明された。 ヒト腸骨静脈内皮細胞（HIVE）を分離し樹立細胞系と
して組織培養で増殖させた。細胞を羊膜の基礎膜か支質
コラーゲン成分かどちらかに融合密度で播種した。どち
ら側に播種した細胞サンプルにも、洗浄および固定の前
に２時間培養し、それからECの基質への最初の粘着を評
価するための試験を行つた。走査型電子顕微鏡による観
察はIV/V型（基礎膜）コラーゲンおよびI/III型（介
在）コラーゲン両方にかなり大きい最初の粘着を示し
た。IV/Vコラーゲン上には融合したEC層が生成して維持
されており、若干の細胞は表面とゆるく結合しているの
が認められたが多くの細胞は緊密な細胞・細胞間結合を
示すのが認められた。I/IIIコラーゲン基質上では細胞
はIV/Vコラーゲン上に見られたよりも小さい密度で、そ
してよりゆるい細胞結合で粘着していた。組織培養７日
後光顕微鏡検鏡は細胞がI/III型およびIV/V型コラーゲ
ン表面どちらにも粘着し、ひろがつていることを示し
た。 主題の実験はこうして新鮮なヒト胎盤から得たヒト羊
膜を標本化して、天然の（本来）ヒト基礎膜の大きい面
を提供することができることを示した。この計画はECが
ヒト本来の血管で経験するであろう表面を模した基質の
豊富な、容易に使える原料を提供する。こうして、それ
は播種されたHAECと試験管内にあるようなコラーゲン表
面との最初のおよび持続する相互作用を研究する理想的
試験管内モデルである。羊膜を用いてHAECは基質膜およ
び間質コラーゲン基質両方に結合の最初の２時間以内に
粘着することが証明された。しかし基礎膜上の細胞の方
が本来の血管における内皮細胞の結合に似たち密な細胞
・細胞間相互関係を形成した。これは本来のヒト基礎膜
を模する物質がEC移植片相互作用を高め、移植片閉塞の
発生を低下させることを示唆する。これらの結果は、ア
メリカン・ジヤーナル・オブ・サージエリー150巻197〜
200ページ（1985年８月）に掲載のベーカー等の“ヒト
成内皮細胞をもつたヒトコラーゲン表面の内皮形成”に
報告された。この論文の主題は、臨床血管外科学会の第
13回年会（ランチヨ ミラージユ，カリホルニヤ,1985
年４月10〜14日）で講演された。この論文および特に図
（写真）（これらは本出願には都合よく再生できない）
はこの結果、参照によつて挿入される。 その後の研究は、内皮細胞と表面との最初の接触から
単層の形成までの短期間の事象に連続に焦点をあてて行
われた。培養したヒト成ECを放射能で標識化し、グクロ
ン上に播種し、烈しく洗つた後に粘着を定量した。播種
ECの70％がしつかり粘着するまでにかかつた時間は、未
処理グクロンでは２時間、本発明によるコラーゲン・ラ
ミネート、（間質性I/III型）コラーゲン下層および羊
膜由来の基礎膜（IV/V型）コラーゲン表面層であらかじ
め処理したダクロンでは30分間、血漿被覆ダクロンでは
19分間であつた。パラレル サンプルを走査型電子顕微
鏡によつて形態学的に調べ内皮細胞の表面への粘着を評
価した。単るダクロンに播種した内皮細胞は限られた粘
着性を示し、血漿処理ダクロン上の細胞は限られた細胞
・細胞間結合を示した。基礎膜で処理したダクロンでは
30分後までには内皮細胞は平らな形態を示し、移植片表
面を完全におおつた。この時間わくは、既時的内皮形成
移植片の実現を可能にする血管処理法の大部分と適合す
る。 自家播種を用いて融合を確立するための一時的事象系
列は小口径の移植片の短期間の開放性を改良するために
は特に重要である。ヒト以外の大部分の動物では、移植
片のかなりのパーセントが自然に内皮化されるには移植
後４〜６週間の期間が必要であると予想される。この時
間わくが大部分のヒト下肢人工移植片臨床系列にあては
まるならば、かなりのパーセンの移植片が血栓形成のた
めに移植後１ケ月以内に駄目になることがわかる。こう
して短期間の開放性に顕著な改善を見るためには移植時
またはその近辺に移植片上に完全無傷の内皮の確立が必
要であるかまたは少くとも望ましい。 すぐれた小径移植片を得るためには、多量の自家内皮
細胞、例えば微小血管性脂肪に由来するようなすぐ使え
る原料が必要である。人工表面基質は内皮細胞を受け入
れるものを選択すべきであり、その処理は付着に必要な
知識および、機能的並びに剪断抵抗のある単層を確実に
生成せしめるのに必要な一時パラメーターを用意して行
われるべきである。そこで、人工表面への内皮播種から
融合単層の生成までの短時間の事象連続が移植時にあら
かじめ内皮形成を可能とするほど十分に速いものである
ことを証明するために次の試験を行つた。 以下の研究を行うにあたつて、脳死で、心臓は動いて
いる死体の腎供与体から採取した血管組織から内皮細胞
を分離し、上述の操作法を用いて培養した。この研究で
は、上述のようにして分離した成ヒト腸骨静脈からの内
皮細胞を用いた。ヒト基礎膜も上述の操作法にしたがつ
て作つた。異種間質性コラーゲンI/III型はヒト胎盤か
らマドリ（Madri）の“Ｖ型コラーゲンの調製”（H,Fur
thmayr編集、細胞外基質の免疫化学、ボサラトンフロリ
ダ:CRCプレス、1982（１）巻75〜90ページ）の方法によ
り調整した。この報告はこの結果参照によつて挿入され
る。つまり細切し、凍結乾燥した胎盤をペプシン消化
し、コラーゲンフラクシヨンを0.5M酢酸で可溶化した。
I/III型を1.4M Naclで沈殿させ、沈殿物を集め、緩衝液
に対して大規模に透析した。白い毛羽のようにやわらか
いコラーゲンを直ちに用いるか、または凍結乾燥して使
用時まで保存するかした。 本発明の好ましい実施例によると、移植片表面を次の
ようにして作成した。織物のダクロン移植片の表面を、
前述のように調製した異種間質性コラーゲンＩおよびII
I型で被覆した。そのコラーゲンを0.0174M酢酸中で安定
化し、氷冷した培地199およびNaHCO3で0.32％コラーゲ
ンに希釈する。移植片を20℃で一晩放置することにより
沈着を捉した。その後その表面を0.2％グルタールアル
デヒドで１分間おおい単培地ですすいだ。標本化した羊
膜を、基礎膜面がダクロン面から離れる方向に向けて移
植片表面にかぶせた。これを37℃で２時間インキユベー
トして移植片と羊膜との粘着を促進する。羊膜・被覆・
移植片をプラスチツク環（ビームカプセル ポリサイエ
ンシスFW）内に固定し、0.5cm2表面積を用意する。この
点に関して用いる技法は、ウイアムズ等の“ヒト成内皮
細胞と人工移植片材料との適合成"J,Surg Res38巻618〜
629ページ（1985）に記載されたものである。この論文
はこれによつて参照により挿入される。 比較の目的のためにその他のダクロン移植片表面を多
血小板血漿（PRP）によつて処理した。PRPはヒトドナー
からの抗凝去（クエン酸ブドウ糖）血液から作られた。
PRPを移植処理の直線に50mMCaCl2と混ぜた。移植片をPR
Pで処理し、37℃でフイブリンクロツトを生成せしめ
た。そのクロツトをEC播種直前に培養培地で洗つた。 走査型電子顕微鏡を用いて内皮細胞播種移植片を検査
するために次の方法を用いた。腸骨静脈から分離したEC
を25cm2フラスコ中で融合するまで増殖させ、1:4分裂比
で２回細胞通過後、細胞播種のために用いた。ECをトリ
プシン溶液（正常食塩水中の0.25％トリプシンと0.09％
EDTA）で簡単に（1.5分）洗い培養培地で１回洗い移植
片表面播種前に完全培養培地に再懸濁した。ECは、ゼラ
チン被覆プラスチツク面上に100％融合した細胞単層を
作るのに十分な細胞濃度で播種した。この密度は１×10
5細胞/cm2に等しい。 適当な時に、播種移植片表面に向けてパスツールピペ
ツドから完全培養培地を強くかけることによつて播種移
植片表面から粘着していない、またはゆるく粘着した細
胞を洗いおとした。移植片表面を直ちに１％グルタール
アルデヒド中で固定し、走査型電子顕微鏡検査の準備を
した。 走査型電子顕微鏡検鏡を行う前に１％グルタールアル
デヒドで１時間、２％グルタールアルデヒドで２時間固
定し、タイロードカコジレート緩衝液（pH7.4）で３回
洗い（20分間の期間）アセトンの段階系列で脱水した。
移植片−まだプラスチツク環に固定されている−をそれ
らから臨界点で乾かし金パラジウムで被覆した。とりつ
けたサンプルをフイリツプツ走査型電子顕微鏡で調べ
た。 内皮細胞はこのテストでは二つの別個の操作法を用い
て放射性標識化された。Ｔ−25フラスコ中の融合ECをト
リプシン溶液で処理することによりチミジン標識化を行
つた。これらの細胞をその後培養培地で洗い、計数し、
Ｔ−75フラスコ上に104EC/cm2で再プレートする。24時
間増殖させた後、トリチウム化チミジン（アメルシヤ
ム、アーリントンハイツ、ILL）0.5μCiをフラスコに加
え、24時間インキユベートした。ECをトリプシン溶液で
処理し、シンチレーシヨンカウンターで計数した。25cm
2フラスコで融合するまで増殖させた内皮細胞にインジ
ウム標識化を行つた。細胞を短時間トリプシン処理し
た。放出した細胞を遠沈により（100×g:3分）ペレツト
にし燐酸緩衝食塩液で１回洗つた（pH7.4）。標識化す
る前に細胞を燐酸緩衝食塩液0.5mlに再懸濁した。細胞
濃度を2.5×105細胞/mlに調節した。20マイクロキユリ
ーのインジウム（メジ フイジツクス エメリーヴイル
CA）を細胞懸濁液に加え、細胞を洗い、５μｌサンプ
ルをとり、標識化効率の最終的分析を行つた。標識化細
胞を完全に組織培養培地を用いた遠沈により３回洗つ
た。最終的ペレツトを、最終的濃度が2.5×105細胞/ml
になるように完全組織培養培地に再懸濁した。 生成した放射性標識化内皮細胞を播種し、その粘着性
を次のように定量した。内皮細胞をビームカプセルに固
定した基質被覆・ダクロンに播種した特定の時間間隔イ
ンキユベートした（ｔ＝１、５、10、20、30、60、120
分）。各時間間隔毎にサンプルを得た。第１のサンプル
（上澄みと呼ばれるものはビームカプセルから上澄液を
ピペツトでとることにより得られる。第二のサンプル
（ゆるく粘着したと呼ばれるもの）はピペツトで培養培
地を表面に強くかけることにより移植片表面を烈しく洗
うことによつて得た。これらの洗浄を行うために用いた
培地を集め、全資料を第二のサンプルとした。第三のサ
ンプル（粘着したと言われるもの）はすべての粘着ECを
移植片面からとることによつて得た。これは、ECサンプ
ルを0.2ml0.3％ドデシル硫酸ナトリウムに３回溶かし、
生成した溶液ろ紙に移すことにより行われた。各ろ紙を
10％氷冷TCAに移し、沈殿物質を計数した。各サンプル
のカウントは、三試料全部の総カウント数のパーセント
にして標準化し、各フラクシヨンの％EC対時間（分）を
プロツトした。トリチウム化チミジンで標識化したECを
シンチレーシヨンカウンターで計数し、インジウム標識
化ECはガンマ・カウンターで計数した。 上記の試験から次の結果が得られた。内皮細胞の粘着
度を定量的に評価した。内皮細胞のインジウム標識化細
胞への粘着性。これらの方法のどちらも細胞放射性標識
化方法が細胞粘着の動態に影響を与えないことを示す同
様の結果をもたらした。ヒト内皮細胞は第４図に示され
るように未処理織物ダクロン移植片に時間に依存する粘
着を示した。10分までに加えた細胞の約30％がダクロン
表面にしつかりとくつつくことが認められた。しつかり
と粘着する細胞の数は時間と共に徐々に増加して１時間
までには50％がしつかり粘着し、２時間までには加えた
細胞の80％がしつかりと粘着した。ゆるく粘着した、ま
たは粘着しなかつた細胞の同時定量の結果（第４図）の
移植片表面にしつかりと粘着しなかつた細胞の大部分は
懸濁液中に遊離していることがわかつた。移植片表面と
の結合２時間までにゆるく粘着した細胞と懸濁液に遊離
している細胞は移植片に加えた全細胞の約20％であつ
た。移植片表面を前処理して多血小板血漿クロツト表面
かまたはヒト羊膜から調製した天然基礎膜表面を作つた
場合、ヒト内皮細胞の結合速度は著しく加速された（第
５図）。PRPクロツトは内皮細胞の70％がインキユベー
シヨン10分後にはしつかりと粘着した。多血小板血漿に
粘着した細胞数は２時間までに80％の最大値に増加し
た。ヒト基礎膜（羊膜）被覆ダクロンへのヒト成内皮細
胞の最初の粘着は未処理ダクロンとPRP処理ダクロンと
の中間であつた（第５図）。粘着した細胞数は時間と共
に増加し、羊膜に粘着した細胞数は30分〜60分間の間に
PRP処理ダクロンに粘着した細胞数と同じになつた。第
５図に見られるようにすべての表面は、２時間のインキ
ユベーシヨン後にはほぼ同じ粘着細胞数を示した。表面
を形態的に評価した。内皮細胞−移植片の定量分析から
内皮細胞の表面への粘着速度を分析できる。しかし内皮
細胞と移植片表面との相互作用の形について疑問が残
る。そこで我々は、内皮細胞の基礎膜処理移植片表面、
多血小板血漿処理移植片表面および未処理のダクロンそ
のものに対する粘着を形態学的に評価した。基礎膜処理
移植片に対するヒト成内皮細胞粘着の一時的経過を、走
査型電子顕微鏡検査によつて調べた。内皮細胞の添加後
移植片表面を１〜120分間いくつかの間隔で洗い、走査
型電子顕微鏡によつて評価した。頂度１分後に丸い内皮
細胞が比較的平滑な羊膜表面にしつかり粘着するのが認
められた。10分間インキユベーシヨン後内皮細胞はまだ
細胞性基礎表面の限られた部分への焦点性粘着を示唆す
る丸い外観を保つていた。 インキユベーシヨン20分後の、内皮細胞の基礎膜への
粘着の評価ではじめて細胞群の形の変化の証拠が得られ
た。球形の細胞がまだ存続する一方、比較的平らな形態
を有する細胞が認められた。より圧迫された細胞群の端
はまだ丸味を帯びておりそれらの遠位表面では細胞の結
合がまだ限られていることを示唆している。20分後の細
胞粘着数の増加も明白である。この時には羊膜表面に粘
着する内皮細胞の形態が認められた。最も容易に確認さ
れたのは一部および完全にひろがつた内皮細胞にくつつ
いた丸い細胞の存続である。数は一番多いが最も確認し
にくかつたのは、元の羊膜表面をほとんど完全におおつ
た広く広がつた内皮細胞である。 内皮細胞播種羊膜表面の完全な形態学的成熟が見られ
たのは、細胞結合がはじまつてから１時間後である。内
皮細胞は羊膜をおおい膜のしわの消失が平滑な内皮細胞
単層表面を形成する。内皮細胞のち密な結合は細胞の境
界の確認をむづかしくしている。しかしながら不完全に
薄くなつた細胞がところどころにあるので、これが下に
あるダクロン繊維によりこの単層の細胞的性質を評価す
る参考点となる。 多血小板血漿および未処理ダクロンに粘着した細胞の
形態も粘着60分後に評価した。PRP処理ダクロンへの内
皮細胞粘着は、細胞のない部分と、細胞が内皮細胞に特
徴的な細胞・細胞間相互作用を示している部分とを含
む。遍平内皮細胞の表面にフイプリンが明らかに沈着し
ているのも興味深い。このフイブリン層は播種前に形成
されたから、内皮細胞がそれらが完全に粘着し遍平にな
る前にフイブリン内張りの下に一部もぐり込むことがで
きることを示していると考えられる。最も重要なことは
内皮が全然なく、したがつてフイブリン層が露出してい
る領域が一般に見られることである。最後に60分後の未
処理ダクロン表面の粘着では固定前の洗浄中、および検
鏡のためのサンプル作成中に受ける力に抵抗するため
に、一本一本のダクロン繊維にまきついたり、それを横
切つたりしている内皮細胞が見られる。未処理ダクロン
表面にはマルチ内皮細胞の斑点は見つからなかつた。 理論的には血管移植片内皮化は低密度の内皮細胞播種
とそれに続くEC増殖、高密度EC播種、または移植後表面
にECが自然に内生することによつておこる。移植時に融
合層を形成する高密度EC播種が、血栓形成の危険性のあ
る手術後、最初の数週間は非血栓形成性移植片を提供す
る可能性の最も大きな方法である。前記の研究は、高密
度EC播種が手術室での血管処置と適合する時間的パラメ
ーター以内に形態学的に正常に見える内皮単層を生成す
ることができるかどうかを調べるために企てられた。実
験条件はEC−移植片相互作用に関する我々のこれまでの
観察に基づいて選んだ。しかしながら我々のこれまでの
研究と異なり、トリプシンにさらす前に、たつた２で速
く通過するECだけを選んだ。研究のために別個の二方法
を用いたのは、我々が以前接触禁止融合単層に相当する
細胞数（すなわち105EC/cm2）は必ずしも走査型電子顕
微鏡でみる融合単層と相関関係にないことを観察したか
らである。トリチウム化チミジンおよびインジウム両方
用いて細胞粘着を定量する放射能測定は、表面に粘着し
ていないか、しつかり粘着しているかまたは付着過程で
あるかのいずれかの内皮細胞数を測定する正確な方法と
して用いられた。これらの方法を用いて、血漿被覆ダク
ロンには30分以内にしつかりと粘着することを観察し
た。この速かな粘着性にもかかわらず、形態的に正常に
見える単層への増殖は遅れる。60分の内皮細胞はほとん
ど細胞・細胞間相互作用を示し、丸石（cobblestone）
の形態よりむしろ星状（stellate）の形を示す。この表
面の非血栓形成特性は試験しなかつたとはいえ、この異
常な形態学から、これら内皮細胞は理想的条件を生成し
ないし、流れの作用に耐えないことが示唆される。羊膜
コラーゲン・被膜・ダクロン移植片に対する内皮細胞粘
着は、血漿−被覆−移植片より緩徐であつたが、融合へ
の到着には著しい差があつた。20分までの早い時期には
粘着は焦点性であつたが、内皮細胞は表面に多くの付着
点を形成しつつあり、遍平になり広がる過程にあつた。
遍平化プロセスは30分までに最大となり、多くの細胞・
細胞間相互作用があつた。これは形態学的に本来の血管
内皮に似ている融合層を形成していた（走査型電子顕微
鏡で）。この興奮すべき観察は、短時間培養した内皮細
胞が血管移植片挿入前の外科的切開時に合う時間わく内
に単層となる能力をもつていることを示唆する。こうし
て、処置の始めに移植片に播種すれば血流を戻すまでに
融合層になる。 羊膜／コラーゲン被覆ダクロンについての粘着研究
は、播種内皮細胞の77％が30分までに表面に粘着したこ
とを示す。これは、短時間培養したECの大部分が表面に
粘着する能力を有し、十中八九、特種の付着特性をもつ
たECのサブグループは存在しないか必要ないことを示
す。ECは融合接触禁止単層密度（105EC/cm2）と等価の
密度で播種されたから、融合以下の付着（すなわち77
％）でも形態的には融合した層を付着せしめるというこ
とも注目すべきである。こうして、増殖させずとも移植
片を完全におおうのに必要な播種ECの最小数は7.7×104
EC/cm2より小さい。 この研究における融合は、走査型電子顕微鏡で見て人
工物表面をECが完全におおつていることと定義づけられ
る。細胞・細胞間結合は正常のように見える、しかし透
過性電子顕微鏡でさらに研究すれば、存在する接合の型
も、内皮細胞と移植片基質複合体との間の結合の型も知
ることができる。基質は細胞の形態および機能に影響を
有することがわかつており、確実な結論を引き出す前
に、実験的設定において調べなければならない。その上
移植片の基質として羊膜の使用を研究することによりさ
らに多くのことがわかるであろう。この生物学的に由来
する材料は、現在は広い臨床的応用には使用できない。
IV/V型コラーゲンの他に、羊膜はフイブロネクチンおよ
びラミニンの細胞付着因子を含む。血管移植片の大規模
生産のためにはI/III型コラーゲンの中間層と、天然基
礎膜に似ているIV/V型コラーゲンのてつぺん表面層から
成るラミネートを構成することが望ましい。所望なら
ば、フイブロネクチンおよび／またはラミニンを含む細
胞付着因子の添加によつてその膜をより一層似せること
ができる。用いる基礎膜は天然性のものであろうと、合
成のものであろうと、そのような膜は全く非細胞性であ
り、照射によつて殺菌し、その後の使用のために貯蔵
し、そして／または輸送することができることを記して
おかなければならない。或いは合成人工物の面を、所望
のIV/V型コラーゲンに化学的に似せることもできる。 前述の試験に由来するEC単層は、形態学的に正常のよ
うに見えるとはいえ、その他の試験（以下に記す）を行
つて、それが正常内皮のその他の機能的特性、特に非血
栓形成性に関する特性を有するかどうかを研究した。例
えば単層が生理的動脈剪断応力に抵抗し、その粘着性を
保つことができることを証明することが望ましい。これ
は、EC基礎膜粘着についてのみならず、基礎膜・血管移
植片相互作用、並びに内皮細胞と内皮細胞との付着につ
いても示された。しかしながら前記の研究から短時間培
養したヒト成大血管内皮細胞の大部分は、10分以内に血
漿被覆ダクロンに、そして30分以内に羊膜／コラーゲン
−被覆ダクロンに速やかに粘着する能力を有することが
結論づけられる。ダクロンそのものだけへの粘着の場合
には顕著な粘着があらわれる前により長い時間が必要で
ある。羊膜／コラーゲン−被覆ダクロンの粘着はより緩
徐であるとはいえ、30分後の正味の結果は基質を完全に
おおい、走査型電子顕微鏡で正常な血管内皮と同様に見
える内皮細胞単層である。完全な移植片被覆は、血漿被
覆ダクロンまたはダクロンのみの上には２時間のわく内
にはおきなかつた。羊膜／コラーゲン被覆移植片で得た
データは、もしも受け入れる移植片−基質−複合体が用
いられるならば、手術室にある間に内皮細胞単層の生成
が可能であることを示唆するものである。 羊膜上の高密度播種によつて作られる内皮細胞単層の
機能的特徴を確かめるために、そして微小血管の内皮細
胞を用いた時にこの処置が有効であることを証明するた
めに、羊膜被覆移植片表面を前述の如く行つた。但し、
コラーゲン被覆のための面を作るために、先づ最初にグ
ロー放電血漿クリーナーを用いて前処理を施したダクロ
ン移植片表面を用いた。この操作法は人工物をハリクの
血漿クリーナー中に５分間置くことを含む。この装置で
生成したグロー放電血漿は、移植片表面を腐蝕し、コラ
ーゲンと移植片との間により強い結合を作り出す。 この方法の可能性をイヌのモデルを使つて証明した。
羊膜被覆ダクロン移植片にイヌ微小血管内皮細胞を播種
し、播種移植片をイヌの大静脈に外科的に移植した。２
日後その移植物をとり出し、表面を走査型電子顕微鏡で
検鏡した。この検査により、その表面は血球（白血球お
よび血小板）の結合を阻止する細胞層によつておおわれ
ることが判つた。この検査は主題の移植片が不定の開放
性を持たないことを何らか示すことに失敗した。動脈の
上におかれた制御表面は、血にさらされた時に未処理ポ
リマーの通常のトロンボゲンの特性を禁止する。 以上のことからわかるように、本出願はヒト患者に移
植するための移植物を処理する新規な方法であつて、合
成基質材料を提供することと、その材料をIV/V型コラー
ゲンで処理し、ヒト内皮細胞の粘着、増殖およびその形
態を改善することとから成る方法を開示する。好ましい
実施例において、前述のコラーゲンラミネートはヒト繊
毛尿膜に由来し非細胞性ヒト羊膜を含む。このコラーゲ
ンラミネート（羊膜）を、結合した間質性コラーゲンベ
ース層を備えた基質に適用する。ベース層はグルタール
アルデヒドのような架橋剤はさらにベース層の表面を活
性化してコラーゲンラミネートをそのベース層に共有結
合させる。それから架橋剤は、緩衝食塩液に溶解性であ
るアミン、アミノ酸、またはリジンのようなアルデヒド
活性アミノ基を有するプペチドによつて安全に不活性化
される。洗つて不活性化剤と残留架橋剤とを除去した
後、その移植片は微小血管内皮細胞の高密度播種を受け
入れる用意が整う。これらの微小血管内皮細胞を1cm2に
つき最低５×104、好ましくは最低7.7×104細胞の密度
で播種し、播種から２時間内に移植片表面上に融合単層
を形成せしめる。現在のところ1cm2につき範囲１−３ま
たは約２×105細胞で播種することが好ましい。微小血
管内皮細胞が本発明の範囲内にあるとはいえ、２または
それ以下の通過で短時間培養されたヒト成内皮細胞を
（そのような細胞が容易に手に入る場合には）使用する
こともできる。生成した移植片は自家内皮細胞の内皮内
張りを有するからその開放性特に移植後の重要な初期の
時期における開放性は著しく改善すると期待される。静
脈移植物のために、およびそうでなければ開放性率がが
つかりする程低い直径4mm以下の血管（小口径移植片）
に主題の移植片を使用することが期待される。 “ダクロン”は、EIデュポン・ドウ・ネマーズ・アン
ド・カンパニー（ウイリントン・デエラウエア）の商標
であり、それはメチルテレフタレートとエチレングリコ
ールとの縮合産物である特殊のポリエチレン・テレフタ
レートポリエステルを指すために用いられる。一般当業
者の人々は、ここに添付の特許請求の範囲により詳しく
定められる本発明の範囲から逸脱することなくここに記
載の方法および操作法から種々の変更を行い得ることは
当然である。 ここに用いた丸石（cobblestone）という語は例えば
ウシ大静脈の培養内皮細胞があらわす典型的対称的な内
皮細胞・細胞間（cell−cell）形態（当業者は“true c
obblestone"と言う場合もある）にも、細胞は一般的に
丸いが突起とかその他の非対称的部分のある細胞形態に
も用いられる。特にこの出願に用いた場合丸石（cobble
stone）という語は、ち密な細胞・細胞間（cell to cel
l）結合をした、すなわち下にある層を最大に覆うよう
に薄くのびる内皮細胞の集団を指す。 〔発明の効果〕 本発明によれば、比較的質の良い移植物体を容易に提
供することができる。
に関するものであり、より詳細には、現在ではヒト患者
の大静脈または大動脈を置換するために一般に用いられ
る血管移植片のような合成移植物に関するものである。
更に本発明は、そのような移植片を提供して内皮細胞粘
着および／またはその上での増殖を改善する処理に関係
する。 〔従来技術とその問題点〕 人工血管移植片の概念の発達は、最初の移植片が30年
以上も前に用いられて以来、血管外科の重要な目標であ
つた。大部分のアプローチは、抗凝血性である表面を作
り出すことに集中し、これら努力の大部分には改良ポリ
マー表面に向けられた、多分、理想的な血液・表面・界
面は天然に生成するヒト内皮であろう。もしそれが人工
的移植片に存在するならば、それは本来の血管の利点を
数多提供するであろう。残念なことに、ヒトに挿入され
た人工移植片には、移植片の内皮形成がおこる動物とは
対照的に、内皮形成は限られた程度にしかおこらない。
動物においては、移植前に予め凝固した人工移植片に内
皮細胞を植えつけると移植片の内皮細胞による被膜は改
善された。しかしこの技法の使用はヒトにおいては制限
される。ブルースジヤレル等（Bruce Jarrell etal）の
“培養させるヒト成内皮細胞の増殖（Human Adult Endo
thelial Cell Growth",ジヤーナル・オブ・ヴアスキユ
ラー・ザージエリー、第１巻、No.6、757−764ページ
（1984年11月）；ヘリング等（Herring et al）の“血
管移植片に自家内皮を植えつけるための単一および段階
的技術（A Single and Staged Technique for Seeding
Vascular Grafts with Autogenous Endothelium）”サ
ージエリー、1978、84巻498−504ページ；グラハム等
（Graham et al）の“培養自家内皮細胞の血管人工移植
片への播種（Cultured Autogenous Endothelial Cell S
eeding of Vascular Prosthetic Grafts）”、Sarg For
um30巻、204−６ページ（1979）；グラハム等（Graham
et al）の“酸素的に誘導し、培養したイヌ内皮細胞を
植えつけた拡散ポリテトラフルオロエチレン人工血管
（Expanded Polytetrafluoroethylene Vascular Prosth
eses Seeded with Enzymatically Derined and Culture
d Canine Endothelial cells）”サージエリー、91巻、
550−９ページ（1982）およびデイレイ等（Dilley et a
l）の“人工血管への内皮播種（Endothelial Seeding o
f Vascular Prostheses）”ジヤツフエ編集、内皮細胞
の生物学、The Hague:Martinus Nijhoff、1984、401−1
1ページを参照せよ。 過去30年間にわたつて、アテローム硬化性血管疾患の
結果として生じる虚血領域へ血流を速かに回復せしめる
ために、人工移植片が用いられてきた。その他に、慢性
腎不全患者における血液透析のための血管進入路を作る
ために、また動脈瘤の修復にも用いられている。最初は
虚血組織への潅流回復に成功するとはいえ、これら移植
片の長期予後はかんばしくない。長期に互ると、直径4m
m以下の移植片は、フイブリン沈着および細胞粘着によ
つて閉塞され、開放性を失う（デイレイ同上）。このプ
ロセスは二次的であるようにみえる。そして一部には、
移植人工物の露出した（すなわち内皮が形成されていな
い）表面の血栓形成性に因るようにみえる。バーガー等
（Berger et al）の“人におよる人工血管の治療；その
不完全性（Healing of Arterial Prostheses in Man,Tt
s′Incompleteness）"Ann.Surg.175巻、118−27ページ
（1972）参照。そこで現在の多くの研究は、ヒト本来の
血管にあるような、非血栓形成性内皮細胞表面を作り出
すことを望んで次のどちらかを目指している：（１）人
工的な、非血栓形成性表面をもつた移植片の開発、
（２）ヒト内皮細胞で内張りした人工血管。 1920年以来、動物由来の内皮細胞を培養して研究し
た、1973年にジヤツフエ等はヒト臍静脈の内皮細胞の培
養に成功し、これらの細胞を機能的に特徴づけた。ジヤ
ツフエ等の“培養ヒト内皮による抗血友病性因子抗原の
合成（Synthesis of Antihemophilai Factor Antigen b
y Cultured Human Endothelial Cell）”、J.Clin、Inv
est.55巻、2757−64ページ（1973）；およびレヴイス
（Lewis）の“組織培養における内皮（Endotheluim in
Tissue Culture）"Am.I.Anat.30巻、39−59ページ（192
2）：ジヤツフエ等、“静脈から取り出したヒト内皮細
胞の培養（Culture of Endothelial Cclls Derived Fro
m Umbilical Veins）"J.Clin.Invest.52巻、2745−56ペ
ージ（1973）を参照せよ。これらの培養細胞は増殖ポテ
ンシヤルを示すが、単一の臍静脈から生産される細胞の
総数は非常に限られるのが普通で、収穫内皮細胞では10
−100倍の範囲の増加に過ぎない。 ヒト臍静脈内皮を用いて生産される細胞数をふやすた
めにいくつかの技法が提案されたが、内皮細胞の大量培
養は理想にはまだ遠い。若干の研究者は肺動脈および静
脈からのヒト成内皮細胞の培養に或る程度成功したが、
これは短期間に過ぎなかつた。ヒト腸骨動脈内皮細胞が
不十分な回動ではあるが培養できることも証明された。
例えばグラスベルグ（Glassberg）等の研究において、1
2.7cm（５インチ）の血管切片あたり50〜500ケの生存能
力がある細胞が得られる。これは非常に低い収量であ
る。“ヒト腸骨動脈に由来せる内皮細胞の培養（Cultur
ed Endothelial Calls Derived From Human Iliac Arte
ries）"In vitro.18巻、859−66ページ（1982）。フラ
イ等（Fry et al）は、死体提供者からの腎摘出時に切
除した腹部動脈からのヒト成内皮細胞を培養することに
成功したと報告した。しかしこれらの細胞も増殖能力は
限定されていることが証明された。 現存の技術からは、提供患者から採取した血管の合理
的量で移植片にあらかじめ内皮を形成させるほど十分の
量の細胞を生産することはむづかしいことは明らかであ
る。移植前に移植片を完全に内皮化する代りに、前凝固
（（Preclotted）移植片の半融合の播種の概念が発生し
た。移植片に自家内皮細胞を播種すると、実験動物の移
植片の内皮被覆率が高まることが最近判明した。ヘリン
グ等およびグラハム等（同上）を参照せよ。ひとたび内
皮でおおわれた、イヌにおける移植物は、血小板反応に
よつて測定した場合、血栓形成性がより小さくなり、血
液中にある細菌の攻撃による感染に、より大きな抵抗性
を示し、直径の小さい血管移植の開放性を持続させるこ
とが判明した。シヤレフキン（Sharefikn）等の“イヌ
におけるダクロン人造動脈の内皮播種による血小板生存
性の早期正常化（Early Normalization of Platelet Su
rvival by Endothelial Seedig of Dacron Arterial Pr
osthestes in Doge"、サージエリー92巻385−93ページ
（1982）；スタンレー（Stanley）等の“内皮細胞を植
えつけた、小直径の外部から支持されたダクロン腸骨−
大腸骨移植片の開放性の増大（Enhanced Prtency of Sm
all Diameter Externally Supported Dacron Iliofemor
al Gafts Seedet With Endothelial Cells）”、サージ
エリー92巻;995−1005ページ（1982）；およびワトキン
ス（Watkins）等の“成ヒト伏在静脈内皮細胞：人造血
管への内皮播種に使用する場合のそれらの増殖能力の評
価（Adult Human Saphenous Vein Endothelial Cells A
ssessment of Then Reproductive Capacity for Use in
Endothelial Seeding of Vascular Prostheses）”、
J.Surg.Res.36巻588−96ページ（1984）を参照。 ヒト移植片に細胞を移す時の主要な問題点は、ヒト血
管組織を用いて移植片を内皮で被覆できるほど高密度に
播種するに十分な内皮細胞が生産できるかどうかであ
る。ワトキンス等は、冠動脈バイパス手術後のヒト伏在
静脈残遺物を用いて少量の内皮細胞を培養して生産する
ことに成功し、４〜６週後培養基の融合細胞領域に100
倍増殖したと報告した。ワトキンス等（同上）参照。 活発な培養技術によつて、使用できる細胞数を著しく
ふやすことはできるとはいえ、40または50回も細胞を倍
加させた後の内皮細胞の“健康”に関する懸念がまだ残
る。さらにこのような細胞の自然の環境とは別物（異
種）である培養基でこれらを培養することは、遺伝的変
化および／または患者がヴイルス、トキシンまたはその
他の侵害物質により汚染されることについての心配の種
である。 多くの内皮形成法が文献に示唆されている。この領域
の研究には、内皮そのものの多様性によつて、並びに内
皮の振舞および特性に関して見つかつた種間の相異によ
つて複雑である。フイツシユマン（Fishman）の“内
皮：多様の能力を有する分布器官（Endothelium:ADistr
ibuted Orgen of Diverse Capabilities）”、アナルス
・オブ・ニユーヨーク・アカデミー・オブ・サイエンス
１−８ページ（1082）；ソーヴエイジ（Sauvage）等の
“多孔性人造動脈−種間治療（interspecies Heilang o
f Porous Arterial Prostheses"、Arch Surg109巻698−
705ページ（1974）；およびバーガーの“ヒトにおける
人造動脈治療”（同上）。それでもなお文献には種々の
種において種々の移植片に内皮細胞を播種することを含
む実験の報告が多数あり、結果はいろいろである。ヘス
等（F.Hess etal）の“ラットの腹部大動脈に移植した
繊維性ポリウレタン微小血管人工物の内皮形成プロセス
（The Endothelialization Proclss of a Fibrous Poly
urethane Microvascular Prostheses After Implantati
on in the Abdominal Aorta of the Rat）”、ジヤーナ
ル・オブ・カルジオヴアスキユラー・サージエリー、24
巻、No.5 516−524ページ（1983年９−10月）；ニコラ
ス（W.K.Nicholas）等の“細胞外基質（matrix）で前被
覆せるバイオマンに対する血管内皮細胞の粘着性の増大
（Increased Adherence of Vascular Endothelial Cell
s to Biomer Precoated with Extracel lular Matri
x）”、Trans Am Soc Artif Intern Organs、28巻208−
212ページ（1981）；イヴエス（C.L.Ines）等の“定常
流に反応する内皮細胞配列力学における細胞起源および
基質の重要性（The Importance of Cell Origin and Su
bstrate in the Kinetics of Endothelial cell Alignm
ent in Response to Steady Flow）”、Trans.Am.Soc.A
rtif Inten Organs、29巻269−274ページ（1983）；グ
ラハム（L.M.Graham）等の“酵素的に誘導し、培養した
イヌ内皮細胞を播種した拡張ポリテトラフルオロエチレ
ン人造血管（Expanded Poly tetrafluoroethylene Vasc
ular Prostheses Seeded winh enzymatically Derived
and Cultured Canine Endothelial Cells）”、サージ
エリー91巻No.5 550−559（1982）；エスキン（S.G.Es
kin）等、“in Vitroで流動条件下におけるシラスチツ
クおよびダクロンベロアに培養した内皮細胞の振舞：細
胞で内張りした血管移植片（Behavior of Endothelial
Cell Cultured on Silastic and Dacron Velour under
Flow Conditions In Vitro:Implicatwus for Prelining
Vascular Gafts with Cells）”、アーテイフイシヤル
オルガンズ、７（１）巻、31−37ページ（1982）；ベル
デン（T.A.Belden）等の“直径の小さい血管移植片の内
皮細胞播種（Endothelial Cell Seeding of Small−Dia
meter Vascular Grafts）”、Trans.Am.Soc.Artif.Inte
rn.Organs.28巻173−177ページ（1982）：バーケル（W.
E.Burkel）等の“酵素的に誘導せる自家イヌ内皮を播種
したニツトのダクロンベロア血管移植片の運命（Fate o
f Knitted Dacron Velour Vascular Grafts Seeded wit
h Enzymatically Derived Autologous Canine Endothel
ium）"Trans.Am.Soc.Artif.Intern.Organs、28巻178−1
82ページ（1982）；ワトキンス等、“成ヒト伏在静脈内
皮細胞；人造血管への内皮播種に用いる場合のそれらの
増殖能力の評価（前出一訳著）”ジヤーナル・オブ・サ
ージカル・リサーチ、36巻、588−596ページ（1984）；
ヘリング（M.B.Herrlng）等の“人造動脈への血管内皮
播種（Seeding Arterial Prostheses with lascular En
dothelium）"Ann.Surg、190巻、No.1、84−90ページ（1
979年７月）；ウエソロウ（A.Wesolow）の“人造動脈治
療−技術の状態（The Healing of Arterial Prostheses
−The State of the Art）”、Thorac.Cardiovasc.Surg
eon、30巻196−208ページ（1982）；イシハラ（T.Ishih
ara）等の“移植したブタ生物人工弁における内皮細胞
の発生および意味（Ocurrence and Significaece of En
dothelial Cells in Implanted Porcine Bioprosthetic
Valves）”、アメリカン・ジヤーナル・オブ・カルジ
オロジー48巻443−454ページ（1981年９月）；バーゲル
等の“酵素的に誘導せる自家イヌ内皮を播種したニツト
のダクロンベロア血管移植片の運命（前出一訳者）"28
巻178−182ページ（1982）。 共同研究者スチユアートウイルアムスとの共著である
多数の論文は、副こう丸脂肪を含む種々の組織源に由来
するその種の細胞を含むラツトの微小血管内皮細胞の分
離および機能づけに関するものである。これらの論文に
はProc、Natl、Acad、Sci、USA、78（４）巻2393−2397
ページ（1981）；ミクロヴアスキユラー・リサーチ21
巻、175−182ページ（1981）;Anal.Biochemistry、107
巻、17−20ページ（1980）；ミクロヴアスキユラー、リ
サーチ、19巻、127−130ページ（1980）；ミクロヴアス
キユラーリサーチ、18;175−184（1979）；アナルス・
オブ・ザ・ニユーヨークアカデミー・オブ・サイエンシ
ス、457−467ページ（1983）；ミクロヴアスキユラーリ
サーチ、28巻311−321ページ（1984）；ジヤーナル・オ
ブ・セルラー・フイジオロジー、120巻、157−162（198
4）；およびジヤーナル・オブ・ニユーロケミストリ
ー、35（２）巻、374−381ページ（1980）がある。微小
血管研究のための螢光−蛋白質−結合体の製造および使
用に関するミクロヴアスキユラー、リサーチ27巻、14−
27ページ（1984）も参照せよ。 ケルン（kern）等はヒト微小血管内皮細胞の分離につ
いて報告し、それらを培養し、機能的研究に用いること
を記した。ケルン等、J.Clin.invest、71巻1822−1829
ページ（1983）。 マドリ（Madri）およびウイリアムス（Williams）の
“毛細血管内皮細胞の培養：基質成分による表現型の転
形（Capillary Endothelial Cells Cultures:Phenotypi
c Modulation by Matrix Components）”、ジヤーナル
・オブ・セルバイオロジー、97巻、153−165ページ（19
83）は、ラツト副こう丸脂肪からの毛細血管内皮細胞の
分離およびウシ大動脈内皮細胞およびI/III型およびIV/
V型コラーゲンを含む介在性または基礎膜コラーゲンか
ら成る基質とによつて条件づけられた培地に培養するこ
とを開示する。この論文は、間質性コラーゲンで細胞を
増殖させる時、それは増殖して連続せる細胞層を形成
し、長期間培養する場合は時々チユーブ様構造を形成す
ることを教示する。それは更に、これら細胞が基礎膜コ
ラーゲンで増殖する場合には、増殖しないで凝集し、培
養の初期にチユーブ様構造を形成することを開示した。 ウイリアム等の“成ヒト内皮細胞の、人工移植片材料
との適合性（Adult Human Endothelial Cell Compatibi
lity with Prosthetic Graft Material）”ジヤーナル
・オブ・サージカル・リサーチ、38巻、618−629ページ
（1985）も興味深い。主論文のアブストラクトが1984年
10月31日〜11月３日の“アソシエーシヨン・フオア・ア
カデミツク・サージエリー”の年会で配布された。論文
そのものは、1985年の８月にたまたま催された年会での
その学会の編集会議に提出された。このウイリアムス等
の論文は、人工移植片材料を細胞外基質（I/III型コラ
ーゲン）、フイブロネクチンまたは血漿で被覆する効果
について報じている。最大の密度の粘着性が認められた
のは、コラーゲン被覆ダクロン移植片で、その粘着性
は、ゼラチン被覆cultureplastic上で増殖したヒト成内
皮細胞（HAEC）の融合単層に認められる細胞密度に等し
かつた。 ジヤレル（Jarrell）等の、“培養基におけるヒト成
内皮細胞の増殖（Human Adult Endothelial Cell Growt
h in Culture）”、ジヤーナル・オブ・ヴアスキユラー
・サージエリー、１（６）巻、757−764ページ（1984年
11月）は、本出願に参照によつて挿入されるクロス−リ
フアレンス出願の開示と同様の開示を含む。762−664ペ
ージにある、脂肪中の毛細血管の内皮細胞に関する、共
同発明者ジヤレルとの議論が注目される。 多数の発表が、フイブロネクチン、血漿またはコラー
ゲンであらかじめ処理した移植片を用いる播種技術を明
らかにしている。エスキン等の“in Vitroで流動条件下
におけるシラスチツクおよびダクロンベロアに培養した
内皮細胞の振舞：細胞で内張りした血管移植片（前出一
訳著者）”、アーテイフイシアルオルガン、７（１）
巻、31−37ページ（1983）は、大動脈の流量および圧力
条件を刺激するように設計したin Vitro循環ルーブの流
れに、組織培養したウシ大動脈内皮細胞をさらす実験を
開示する。エスキン等は、生物材料基質に培養された内
皮細胞は、血液接触面として移植した場合非血栓形成性
であるが、この技法は臨床的に使用可能であることはま
だ証明されていない、と説明している。なぜならば二つ
の手術的処置が必要である（一つは細胞収穫のため、第
二のものは細胞移植のためで、その間にin Vitro細胞増
殖の期間がある）からであり、また、定常的環境で培養
された細胞は、流れる血液にさらされた時少なくとも一
部は除去されるからである。エスキン等は“より最近の
研究”を記した。そこでは、収穫したばかりの自家内皮
細胞を含む血液でpreclotした移植片は、血液のみでpre
clotしたそれよりも大きい開放性を示す。これは、細胞
を培養する介在期間なしに細胞収穫と細胞移植を一回の
操作で行うことができることを示すと言えよう。これ
は、この技法を非血栓形成性表面を生成する手段として
臨床的に使用可能にするものである。 ワトキンス等の“成ヒト伏在静脈内皮細胞：人造血管
への内皮播種に用いる場合の、その増殖能力の評価”ジ
ヤーナル・オブ・サージカル・リサーチ、36巻588−596
ページ（1984）において、静脈内皮細胞を用いる人造血
管の自己内皮播種は、血小板−人工物の相互作用を減少
させ、イヌにおける直径の小さい人工物の開放性を改善
することが報告された。イヌ試験で得られたデータは、
自己内皮播種がヒト患者を救うことを示唆している一
方、この方法には多くの欠点があることが論ぜられた。
それらの欠点としては、長い末梢静脈を使用すること。
この方法で用いる粗コラゲナーゼがロツト毎に差がある
こと。そして、静脈内皮細胞の増殖能が、末梢静脈のほ
んの小さいフラクシヨンから得られる内皮細胞で自己内
皮播種ができるほど十分に大きいという証明がないこと
である。 行われた試験は、成ヒト伏在静脈内皮細胞の増殖ポテ
ンシヤルは、“直接的に手術中に自己内皮播種するに
も、培養によつて移植前に内皮細胞を人造血管表面に増
殖させて内張りとするためにも、理論的には十分大き
い”ことを示唆している。その結果はヒト試験を行う一
つの条件は満足していることが示されるが、著者等は
“いくつかの理由によつて、そのようなヒト試験が成功
することを証明するには十分な結果ではない”と結論づ
ける。 近年、直径の小さい血管移植片で一般にあまり良くな
い結果が得られることが注目されている。4mm以下か4mm
の内径をもつことによつて一般に特徴づけられるような
移植片は用いないのが普通である。ヴアン・ヴアクメツ
ト（Van Wachemet）等の“培養ヒト内皮細胞と、種々の
浸潤性をもつ重合面との相互作用（Interaction of Cul
tured Human Endothelial Cells with Palymeric Sarfa
ces）”ビオマテリアルス、６巻、403−408（1985年11
月）は、比較的内径の大きい（4mm以上）合成ポリマー
移植片が、形成された生物学的内張りが“ほとんど非血
栓形成性でない”にもかかわらず、成功に至つた、と報
告した。そのような直径の大きい移植片はモレを防ぐた
めにあらかじめ血液でpreclotし、かなり血栓成形性の
面を残しているにもかかわらず、大きい血流速度（血流
量）および抗凝固処理により、移植片表面のそれ以上の
血栓生成による閉鎖が阻止されることが示唆される。直
径の小さい移植片を用いた場合の臨床的結果は、主とし
て“移植片の即時的閉鎖”のために、悲観的であると言
われている。イヌでは、直径の大きいおよび小さい移植
片両方共、その上に内皮細胞を植えつけると、１〜４カ
月間に完全な内皮張りを形成することがわかつた。血管
内皮は特異な非血栓形成性面であると言われているか
ら、内皮細胞は、“直径の小さい血管移植片の内張りの
ための第一の論理的選択である”と報告されている。内
皮細胞と、異なる表面特性をもつたポリマーとの相互作
用の系統的研究を行えば、“内皮細胞の過大増殖をおこ
す移植片の開発”に至るという仮説がある。これに関し
て、ヴアンヴアケム等は、或る材料の表面湿潤性は種々
の型の哺乳類細胞の粘着性および増殖に影響を与えると
言われ、細胞粘着は水に濡れる表面に優先的におこると
考えた。血清が培養培地にある時には、湿潤可能の基質
への細胞粘着は、血清蛋白質のその基質への吸着によつ
て影響を受けることが示唆される。血清を含まない培地
において細胞粘着を研究する場合には、その細胞に由来
する蛋白質の湿潤可能の基質への吸着が重要であるかも
知れない。 ヴアンヴアケム等は、内皮細胞はガラス上およびグロ
ー放電処理をしたポリスチレンである湿潤可能の組織培
養ポリスチレン上で培養できることを認めた。こうして
ヴアケム等は、血清を含む培養培地で、種々の湿潤性を
有する多数のポリマー上でのヒト内皮細胞の粘着性およ
び増殖性を試験し、それを報告し、示唆した。 既述の論文の他に、ヘス等の“ラツトの腹部大動脈に
移植した繊維性ポリウレタン微小血管人工物の内皮形成
プロセス”ジヤーナル・オブ・カルジオブアスキユラー
・サージエリー24（５）巻516−524ページ（1983）を参
照せよ。これは、繊維性微小血管ポリウレタン人工物を
用いて21日目に完全に内皮を形成した人工物が生成した
ことを報告している。 次の発表は、内皮細胞培養技術に関する開示が特に興
味深い。アジズカン（Azizkhan）等の発表では、in Vit
roウシ毛細血管内皮細胞およびマスト細胞から放出され
る因子に対するそれらの細胞の移動反応に関する開示が
興味深い。ロブリン（Roblin）等およびヤング（Yang）
等の発表では或る哺乳類培養細胞の増殖に影響を与える
因子の開示が興味深い。ソートン（Thorton）等では、
ヒト臍静脈内皮細胞の培養を含むヒト内皮細胞増殖に与
えるヘパリンの影響の開示が興味深い。ソートン等は彼
等が述べた連続二次培養の方法が、これまでに発表され
た方法に比べてHUVE細胞の収量を108倍も高め、成血管
内皮細胞の収量を12倍も高めることを教示する。これは
大量の培養内皮細胞を生産するために最小量のヒト血管
組織の使用ですみ、これにより内皮に関係するヒトの疾
患の問題に、ヒト内皮細胞モデルを用いて直接アプロー
チできるようになるのである。その上、その細胞系は、
血管作用性芽剤のin Vitro試験とか、人工移植片材料の
被覆とかのような種々の臨床応用のために価値があるこ
とが判つたと記されている。ラテラ（Latera）等の発表
では、線維芽細胞の原質粘着におけるフイプロネクチン
ヒアルロネートおよびヘパリンプロテオグリカンの機能
の開示が興味深い。マシアグ（Maciag）等（1979）で
は、中性のPHで調整されたウシ視床下部エキスから得た
ヒト内皮細胞mitogen（細胞分裂誘起物質）の記載が興
味深い。神経由来の内皮細胞増殖因子（ECGF）は静止し
たヒト臍静脈内皮細胞を培養基において刺激し増殖させ
る能力をもつといわれる。ウシ胎仔血清中にヒト臍静脈
（HUV）内皮細胞を小さい播種−密度で培養したものにE
CGFを加えると、血清のみの場合に比べて内皮細胞増殖
は著しく増加するといわれる。マシアグ（Maciag）等
（1981）は、ウシ胎仔血清および内皮細胞増殖因子を強
化した培地199を用い、フイブロネクチン基質でヒト臍
静脈内皮細胞を増殖させたと報告した。こうして、クロ
ス・リフアレンス関連出願における発表および開示は、
ヒト内皮細胞、特にヒト臍静脈内皮細胞（HUEC）のよう
な太い血管の内皮細胞を培養することに関する技術の現
状を示している。 この領域で報告された研究にもかかわらず、ヒト移植
物表面、例えば血管移植片の表面の内皮形成を成功させ
得る簡単な信頼できる方法の必要性がいまだに叫ばれて
いる。 本発明の主な目的は、血管移植片およびその他の移植
物体の内皮細胞による被覆を改善することにある。 本発明のその他の目的は、微小血管内皮細胞で内皮化
される。改良された合成または自然の移植物または移植
片、特に、改良された血管移植片を提供することであ
る。 〔問題点を解決するための手段及び作用〕 本発明に関係するヒト患者に移植する目的の移植物体
を処理する方法においては、合成基質材料を用意し、そ
の材料をIV/V型コラーゲンで処理してヒト内皮細胞の粘
着、増殖および形態を改良する段階を含んでいる。好ま
しい実施態様において、このような内皮細胞は、その患
者のヒト微小血管内皮細胞に富む組織から採取され、そ
れはその組織から分離され、その移植物のIV/V型コラー
ゲン面に適用され、処理すべき上記移植物表面に少くと
も50％以上の上記細胞の融合面を作る。本発明によれ
ば、移植の少し前に高密度で植えつけた時に、その患者
の微小血管内皮細胞の粘着および増殖を促進するように
十分適合するであろう。IV/V型コラーゲン表面層を備え
た移植物体を提供することができる。 好ましい移植物体は合成基質と1/111型コラーゲンの
１枚以上の直接層とIV/Vコラーゲン表面層とを含んで成
る。したがつて、移植される移植片は少くともIV/V型コ
ラーゲン最上面と、1/111コラーゲン下層とから成るラ
ミネートで被覆された基質を含んで成る。このコラーゲ
ンラミネートはヒト羊膜に由来する非細胞性ラミネート
であることが好ましい。好ましい移植物体は次のように
して作られる。オリマー（ダクロン）基質のような合成
基質をグロー放電血漿クリーナーを用いて処理し、コラ
ーゲン被覆のための移植片表面をつくる。なお、本案で
はポリエステル元素の合成繊維（テトロン）をダクロン
と呼ぶことにする。この装置によつて生成したグロー放
電血漿は、移植片表面のエツチングをおこし、コラーゲ
ンおよび移植片間をより強く結合させる。それからこの
移植片の表面を、ウシ、また好ましくはヒト、原料から
調製したエラーゲンＩおよび／またはIII混合物でマド
リ（Madri）の“細胞外基質の免疫科学（The Immunoche
mistry of Extracellular Matrix）”、ボサラントン、
フロリダ、CRCプレス、（1982）１巻、75−90ページに
報告されているような一般的方法を用いて処理する。生
成したコラーゲンを、その酢酸溶解性によつて混入蛋白
質から分離し、高塩化ナトリウム濃度における分別溶解
性によつてその他の基質蛋白質から分離する。それから
移植片基質を、前述のまだ酢酸に溶けているコラーゲン
溶液で処理し、中性緩衝液を加えて溶液のPHを上げるこ
とによつて、コラーゲンを移植片表面および移植片内で
重合させる。37℃でコラーゲンはゲル化する。それをそ
の後グルタールアルデヒドで架橋する。この処理はゲル
を安定化させ、その上アルデヒドにより活性化された表
面を作り出す。 移植片はその時、ヒト羊膜に由来するコラーゲンラミ
ネートを受け取るばかりになつている。この羊膜はリオ
ツタ（Liotta）等の方法〔カンサーレタース、11巻141
−152ページ（1980）〕にしたがつて用意されたヒト胎
盤から得られる。羊膜を繊毛膜から物理的に引つぱつて
とり、化学的に処理する。羊膜上皮細胞を羊膜表面から
物理的にはぎとり、基礎膜コラーゲン（IV/V型）を一面
に、間質性コラーゲン（1/III型）を他面に残す。半膜
は、前述のように処理した移植片材料に適用する前に、
燐酸緩衝食塩液に浸す。生成したコラーゲンラミネート
を、コラーゲン1/IIIを移植片の方へ向けて、移植片材
料のアルデヒド活性化表面上に置く。半膜層表面は相互
作用をおこして共有結合する。残つている遊離アルデヒ
ド基は、その後移植片をアミン、アミノ酸または、アル
デヒド活性アミノ基を含むペプチドで処理することによ
り不活性化される。リジンは、燐酸緩衝食塩液に溶解す
るため、現在のところ好ましい。今は羊膜の基底膜表面
は移植片から離れた方を向いている。そして続いてヒト
微小血管内皮細胞で処理して単層を形成することができ
る。生成した移植片を照射またはその他の適した方法に
よつて殺菌し、使用のために必要になるまで貯蔵する。
IV/V型コラーゲン表面は内皮細胞の高密度播種を受け入
れる用意ができている。このような播種は速かに（２時
間以内）剪断抵抗性内皮細胞単層の形成に導く。この単
層は自然界に出現する丸石（cobbestone）の形態を有す
る。 この方法にしたがつて作つた移植片を、イヌの大静脈
に置換するためにイヌに挿入する。普通の条件下では未
処理の移植片は常に急速に凝血をおこし、しばしば閉鎖
する。このようなイヌのかなりのパーセント、多分大部
分はこのような移植片のために移植後20分以内に死ぬこ
ともよくある。試験動物においては、ここに記載の方法
にしたがつて形成された大静脈を２日後にとり出したと
ころ、それは不定の開放性と矛盾する徴候は何も示さな
かつた。 出願人は太い血管の内皮細胞を微小血管内皮細胞との
間には、それら本来の組織においては形態学的並びに機
能的相異があるとはいえ、ヒト微小血管内皮細胞、すな
わち毛細血管、細静脈に由来する細胞は太い血管の細胞
の代りとしても十分良く機能することを認めた。その
上、微小血管内皮細胞は体組織に豊富にあり、脂肪組織
に最も顕著に認められる。そしてそれを用いて、大部分
の移植物の予後を劇的に改善するのどの移植前融合（す
なわち最低50％の融合）を確立することができるかも知
れない。その後の説明の目的のためには、脂肪組織を微
小血管内皮細胞の典型的原料とするが、他の組織原料か
らの内皮細胞も同様に使えることは当然である。 血管移植片またはその他の移植物を、連続的外科処置
の始めに得られる脂肪から分離した微小血管内皮細胞を
用いて融合するように処理する。無菌条件を確立してか
ら脂肪組織を患者からとる。その脂肪の微小血管内皮細
胞を、酵素的消化と遠心分離によつて組織から速かに分
離し、それを用いて同じ手術の後の方の段階で、その患
者に移植することになつている表面を処理する。この方
法では、成内皮細胞を培養して数をふやす必要がなくな
り、患者は自分自身の新鮮な“健康な”内皮細胞でそれ
が融合に至るまで、または過度に融合するまで処理した
移植片を受けることができる。 本発明の好ましい実施態様によると、得られた微小血
管に富む組織は腎周囲脂肪、皮下脂肪、網、または胸腔
または腹腔と関連ある脂肪である。この組織はカゼイン
分解酵素およびトリプシンから成るコラゲナーゼのよう
な蛋白分解酵素を用いて消化される。すなわちこの酵素
を、組織塊がばらばらになつて組織消化液が生ずるま
で、組織と共にインキユベートする。それら低速度遠心
分離によつて微小血管内皮細胞を消化液から分離し内皮
細胞に富むペレツトを形成する。ペレツトを緩衝食塩溶
液で洗う。連続勾配遠心分離プロセスによつて、または
選択的篩の使用によつて更に精製することもできる。生
成した微小血管内皮細胞を好ましくその後、血漿蛋白質
を、好ましくは１％血漿蛋白質の濃度で含む緩衝食塩溶
液に懸濁させる。それから、ペレツト対溶液の比が容量
ベースで1:5〜1:15またはより好ましくは約1:10である
この懸濁液を用いて表面を処理する。その場合、微小血
管内皮細胞がその表面に十分に粘着し、少くとも50％の
融合がおこるまで、細胞をその表面と共にインキユベー
トする。その結果、融合しているか、移植後非常に速く
（細胞数の一倍加以内に）融合に達する内皮化表面をも
つ改善された移植片または移植物が得られる。 内皮細胞が粘着する最初のパーセンテージは、IV/V型
表面層を有する人工物を用いた場合、さほど大きくない
のが普通であるとはいえ、生成した内皮細胞層の形態
は、その他の人工表面および／または表面前処理を用い
て得られるそれよりも遥かにすぐれている。こうして微
小血管内皮細胞の使用により、低い粘着率を補つてあま
りある高い密度の播種が可能になる。 よつて、本発明又は好ましい実施例によれば、血管移
植片およびその他の移植物の内皮細胞による被覆を改善
することができる。また微小血管内皮細胞で内皮化され
る改良された合成または自然の移植物または移植片、特
に、改良された血管移植片を提供することができる。 〔実施例〕 本発明に関係する好ましい方法は、種々の型の内皮細
胞の機能および特性を研究する仕事から発している。こ
こに記載せる方法は無菌条件下における（たとえば手術
室）ヒト微小血管化組織（腎周囲脂肪、網、または皮下
脂肪）からの大量の微小血管内皮細胞の分離を可能にす
る。大量の細胞の獲得のために、分離に続き組織培養を
行う必要がなくなる。これらの方法は、組織源としてラ
ツト副こう丸を用いて非ヒト（ラツト）微小血管内皮細
胞を分離する研究中に開発された方法と関係がある。最
近、非ヒト、ラツト脂肪−微小血管内皮細胞を分離する
方法が、皮膚および脂肪からヒト微小血管内皮細胞を分
離、培養するため役立つということが報告された。ケル
ン（Kern）等はこれらの分離した内皮細胞を次いで培養
し、機能的研究に用いた。J.Clin.Invest.71巻、1822−
1829ページ（1983）、ジヤレル等の“培養したヒト成内
皮細胞の増殖（Human Adult Endothelial Cell Growt
h）、ジヤーナル・オブ・ヴアスキユラー・サージエリ
ー１（６）巻、757−764ページ（1984年11月）、これは
参照によつてここに挿入される。 本発明は血管内移植物に内皮細胞内張りを作るため
に、分離した微小血管内皮細胞を用いる新規な方法を提
供する。このような移植物としては例えば人工血管、人
工心臓、心臓弁のような、血管関係の考案物があるが、
これらに限定されるわけではない。ここに説明する方法
がその他の人工器官または考案物の開発に通ずることが
期待される。これらの器官および考案物は移植後かまた
は体外回路において循環血液を受けとる。そして本法
は、血液と移植面との間に非血栓形成性の、または抗ト
ロンボゲン性の界面を提供する。本発明の直接の目的
は、ここに記載の方法を用いて既知の合成材料例えばポ
リエステリおよびポリテトラフルオロエチレンまたは天
然に発生する材料、例えば臍静脈、伏在静脈および本来
のウシ動脈から成る面に内皮を形成することである。 本発明は、ヒト患者に移植することを目的とした移植
物を処理する方法であつて、その患者からヒト微小血管
に富む組織を得ることと、その組織から微小血管内皮細
胞を分離することと、上記微小血管内皮細胞を上記移植
物上に置いて、処理すべき上記移植物表面に最低約50％
の上記細胞の融合を形成せしめることとから成る方法を
提供する。この方法は迅速かつ比較的簡単で、患者自身
の“新鮮な”（培養しない）内皮細胞で処理した人工物
または面の移植を容易にする。外科的処置がそつくり単
一の無菌環境で行われるから内皮化移植片が汚染される
可能性は最小である。 本発明の方法により、組織培養を行うことなく多量の
内皮細胞を分離することができる。しかも含まれる処置
は手術室で容易に行うことができる。患者の組織から微
小血管内皮細胞を分離する方法の一般的流れ図を第１図
に示す。これらの処理法は脂肪以外の組織、例えば脳、
肺、網膜、副腎、肝臓および筋肉から内皮細胞を分離す
るためにも用いられるが、細胞源として脂肪組織を用い
るのが好ましい。それは豊富にあり、手に入れ易く、そ
の切除が治療を受ける患者に不都合な作用をおこさない
からである。そこで、第１図に示すように、或る量のヒ
ト微小血管化脂肪（Ａ）を多数の原料の中から調達す
る。あまり好ましくはないが、脳死の心臓は生きている
死体提供者、また患者以外の他の提供者から（この場合
は提供者の手術中に）ヒト腎周囲脂肪を得ることも可能
である。いかなる場合も提供組織をすぐに氷冷緩衝食塩
液（PH7.4）に移す。この場合緩衝剤は燐酸塩、すなわ
ち燐酸緩衝食塩液（PBS）であるのが好ましい。よく切
れるはさみで組織を細切し（段階Ｂ）緩衝液を傾淳す
る。カゼイン分解酵素とトリブシンとを含む蛋白質分解
酵素コラゲナーゼをその組織に加え、組織塊がばらばら
になるまで37℃でインキユベートする。この消化は30分
以内におこり、一般には20分以内にするべきである。消
化液を減菌試験管に移しテーブルトツプ遠心分離器を用
いて低速度（700×ｇ）で室温で５分間遠沈する（段階
Ｃ）。こうして生成したペレツトは内皮細胞95％以上か
ら成る。これらの内皮細胞は、細胞脈、毛細血管および
細静脈、微小血管系のすべての成分に由来するから、こ
れらの内皮細胞をここでは微小血管内皮細胞（MEC）と
呼ぶことにする。このMECペレツトを緩衝食塩液、好ま
しくはPBSと共に遠沈することにより一回洗浄し、それ
以上精製することなく直接ここに記載の処理（適用）段
階に用いることができる。 別法として、これらの微小血管内皮細胞をその細胞を
連続的勾配で遠沈することにより、さらに精製すること
ができる（第１図段階Ｄ）。この勾配は多数の高分子溶
質から形成される。これら溶質としては、アルブミン、
デキストンラン、またはパーコール（Percoll）（フア
ルマシア社、ピスカタウエイ、N.J.）またはナイコデン
ツ（Nycodenz）（ナイエガールド社、ノールウエー）の
ような市販の密度勾配材料がある。勾配遠心沈殿は、赤
血球、白血球および平滑筋細胞を除去するために用いら
れる。ここに報告した研究においては、パーコール45％
溶液を常用した。細胞をパーコール溶液の表面に層状に
置き、13000×ｇで20分間遠沈した。または、形成され
たパーコール勾配上に細胞を置き、室温で５分間400×
ｇで遠沈した。内皮細胞の厚さバンドが勾配の上端に生
成する。これらの細胞をピペツトでとり、燐酸緩衝食塩
液と共に遠沈することにより一回洗つた。 ヒト微小血管組織に由来する微小血管内皮細胞を、人
工血管表面に適用するためにさらに治療したりすること
なく、直接本発明の播種段階に用いた。この方法の主な
利点は、血管移植片の被覆のために、多量の内皮細胞を
ヒト組織から調達することができることである。その
上、これら細胞を人工物移植を受ける提供者から得るこ
とができる。したがつてこの方法では、移植可能の表面
を同種内皮細胞で処理することができる。 本発明のもう一つの方法によると、MECを受けるとき
べき人工表面を、何ら前処理なしに、製造業者がそれら
を包装する条件下において直接用いることができる。し
かし、水性溶液でこれらの表面をあらかじめぬらしてお
く方が都合がよい。前処理は、内皮細胞の表面への粘
着、拡大および増殖を促進するために行われる。本発明
のもう一つの実施態様の処理段階の実施にあたつては、
分離したヒト微小血管内皮細胞を、その患者からの血漿
由来蛋白質を含む緩衝食塩液に懸濁させる。この蛋白質
溶液は６部分の緩衝溶液と１部分の血漿を混合し、約１
％の蛋白質を含む溶液を作る、というようにして調製さ
れる。１表のデータは、内皮付着が懸濁液中の蛋白質濃
度により影響されることを示してる。１表のデータが示
すように、至適蛋白質濃度は約１％である。そして表面
処理中に蛋白質が必要であることを示す。アルブミンが
好ましい蛋白質源であるが、非血漿性蛋白質源を用いる
こともできる。 第１表：種々のアルブミン濃度がHAECの最初の粘着およ
び増殖に与える影響。 融合パーセント アルブミン濃度 ２時間 24時間 ０ ％ 36.5％ 63.6％＊ 0.1％ 32.5％ 61.2％＊ 1.0％ 47.7％ 67.9％＊ 4.5％ 11.5％ 61.7％＊ 融合パーセントは＃ECM/105細胞/cm2で示す。 ＊は有意な変化を示す。 その後微小血管内皮細胞懸濁液を、好ましくは遠沈し
て（200×ｇ）ペレツトとし、そのペレツトを蛋白質含
有緩衝溶液に再懸濁させる。この再懸濁を行う場合、詰
まつた（包み込まれた）微小血管内皮細胞：緩衝溶液の
容量比は約1:5〜1:15または1:10にするべきである。そ
の細胞懸濁液を管状移植片に加えて両端を締めるか、ま
たは細胞を処理すべき表面上に層状に置く。細胞を相互
作用させる最適期間は正確には定まつていない。それは
人工物の材料、その材料が受ける前処理の性質、および
人工物の表面が微小血管内皮細胞をより良く受けとられ
るように変形されているかどうかによつて変化する。例
えば、未処理ポリエステル移植片表面への内皮細胞の粘
着には２時間必要であるが、蛋白質で処理した同様の表
面に粘着させるには10分以下でよいことがわかつた。こ
の粘着行動は、平らな未処理のダクロン移植片上のヒト
微小血管内皮細胞（MEC）の走査型電子顕微鏡研究によ
り確かめられた。内皮細胞が移植片表面に粘着するに十
分な時間インキユベーシヨン後、その表面を蛋白質含有
緩衝液で洗う。そこでその人工物を普通の方法で移植す
ることができる。 生化学的データと形態学的データの両方に基づいて、
ヒト微小血管内皮細胞は未処理の移植片表面に粘着する
ことがわかつている。走査型電子顕微鏡は、上述の方法
を用いて未処理ダクロンポリエステル上に置かれたヒト
MECは粘着をおこし、その後培養基で１日おいた後細胞
被覆（完全な融合）がおこることを明らかにした。細胞
は移植片の特殊の領域に付着し、未処理移植片表面を完
全には被覆しない。ヒトMECを血漿処理−ダクロン−ポ
リエステル移植片上に播種する時には、未処理ダクロン
表面に播種する時と比べて、被覆は最初は著しく大き
い。走査電子顕微鏡は、血漿−コーテイング移植片がヒ
トMECで融合被覆されていることを明らかにした。第２
表は、未処理および蛋白質コーテイング−ダクロン−ポ
リエステル移植片のヒト微小血管内皮細胞の粘着および
増殖（最初は１日目、そして14日後）を説明する。 上記の融合パーセントは＃EC/155細胞/cm2で示す。 ＊印は有意な変化を示す。 第２表が示すように、MEC粘着は移植片表面の蛋白質
処理によつて容易になる。人工物表面の内皮細胞増殖が
蛋白質処理の実施によつて促進されることもわかつた。 前述のように、人工物表面上の完全無傷の単層の形成
は、移植の前に形成されたならば最も都合が良いかも知
れない。この内皮化表面は、もし剪断抵抗を有するなら
ば直接的抗−トロンボゲン表面を提供するであろう。そ
こで、微小血管内皮細胞層の剪断抵抗を調べた。ヒト脂
肪をコラゲナーゼで25分間処理し、洗浄し、パーコール
勾配分離で精製した。この収量は1.25±0.45×106細胞/
g脂肪であつた。血漿コーテイング−ダクロン上で１時
間インキユベーシヨン後、2.8±1.5＋104が表面にしつ
かりと粘着して残つた。２時間、０〜80dynes/cm2の剪
断応力で流れにさらした時、最初に粘着していた細胞の
50〜100％が粘着したまま残つた。このデータの統計的
分析では、粘着細胞数と剪断速度との間に強い相関関係
を証明することはできなかつた。走査型電子顕微鏡は、
血漿コーテイング−ダクロンに付着した、種々の付着時
期における内皮細胞を明らかにする。大部分の細胞はま
だ丸く、焦点的に表面に付着しているだけだが、若干の
細胞は最大に平らになり、細胞−細胞接触を形成してい
た。大きい細胞収量としつかりした粘着性のため、微小
血管内皮細胞は、細胞培養の必要性なしに、外科移植時
に融合内皮細胞を移植片に播種する可能性を与える。 その他の実施例によつて、移植後、内皮細胞を植えつ
けた移植片が動脈血流にさらされる時の条件を模するた
めに、蛋白質処理表面への内皮細胞の粘着を剪断応力下
で試験した。ヒト成微小血管内包細胞を、IRB義定書
（プロトコール）にしたがつて、脳死状態で心臓は動い
ている死体器官提供者または無関係の手術的措置を受け
ている患者から採取したヒト腎周囲脂肪または腸網膜脂
肪から分離した。その脂肪を機械的に細切し、ダルベツ
コー陽イオン−free−（DCF）緩衝液、PH7.4、10mlをコ
ラゲナーゼ（ウオーシントンＩ型；クーバー、バイオメ
デイアル、マルヴエルン、PA）4mg/mlおよび血清アルブ
ミン（シグマＶ型；シグマケミカル社、セントルイス、
MO）4mg/mlと共に含む減菌50mlねじ蓋つきエルレンマイ
ヤーフラスコに入れた。そのフラスコをしづかに攪拌し
ながら37℃で25分間培養（インキユベート）した。フラ
スコの内容物を200×ｇで７分間遠沈した。ペレツトを
0.1％BSAを含むDCF緩衝液で２回洗い200×ｇで３分間回
した。 生成したペレツトをDCF中の45％パーコル（フアルマ
シアフアインケミカルス、ピスタカウエイ、N.J.）に再
懸濁し、４℃、20000×ｇで遠沈した。毛細管内皮細胞
の群即ち小血管束（タフト）は、ペレツト中の血管フラ
グメントおよび細胞破片と共に、密度勾配のてつぺんの
乳白色の層中にあつた。毛細管内皮細胞をDCF−BCA緩衝
液中で、３分間、200×ｇで２回洗つた。細胞群（タフ
ト）を20％ウシ胎仔血清（ハゼルタウンリサーチラボラ
トリース、デンバー、PA）と共に培地199に再懸濁させ
た。一次分離物中の内皮細胞の確認は、主として位相差
顕微鏡による形態学的試験に基づいて行われた。高密度
にプレート上に接種され、一次培養を受けた一次分離物
は、第VIII因子関連抗原が陽性の染色を示し、アンギオ
テンシンＩ変換酵素（ACE）活性をあらわした。 移植片表面を次の方法を用いて処理した。クーレイ・
グラフト・ウーヴン・ポロシテイー・ダクロン・フアブ
リツク（Cooley Graft Woven Porosity dacron Fabri
c）（メドツクスメデイカル、オークランド、NJ.から供
給される）をアセトン、8.5％H3PO3、INNaOHで次々に洗
つた。この後で２回、蒸溜水で大がかりに洗つた。乾い
てから、それを空気中で10-4トール（torr）において、
ハリク血漿クリーナー（ハリクインダストリー、オツシ
ニング、NY）中に10分間つけた。移植片材料の2.5×5cm
切片を、基質コーテイング並びに内皮細胞播種のために
用意した。 それから、ダクロン移植片材料を多血小板血漿で処理
した。多血小板血漿は、正常なヒト提供者から採取し
た、抗凝固化（ACD）したばかりの全血から作つた。そ
の多血小板血漿（PRP）を、移植治療の直前に50mMCaCl2
と混ぜた。それからPRPを播種室に固定した移植片材料
上に置いた。ひとたびPRPで処理すると、移植片表面に3
7℃でフイブリンクロアト（fibrin clot）が形成され
た。過剰のクロツト（clot）を除去し、EC播種に先立つ
て移植片表面を培養培地で洗つた。 播種室に固定され、PRPをコーテイングした織物のダ
クロン移植片に、培養培地0.5cc中の５×105ECを、播種
凹み（1cm2面積）に置いて播種し、37℃培養基中で１時
間以上培養する。培養（インキユベーシヨン）後、上澄
液を除去し、移植片表面を培養培地で軽く洗つた。対照
（制御）室には新鮮な培養培地0.5ccを充填し、これを
循環ループ試験管の中に置いた。それから再循環培養培
地を用いて、ECを37℃で２時間、０〜80dynes/cm2の剪
断応力に１回さらした。流している間に、無視し得る程
度の圧力勾配、PHおよび電解質濃度の変化が認められ
た。剪断応力は平行プレート間の運搬運動量の式を用い
て計算された。バード（Bird）等の“運搬現象（Transp
ort Phenomena）”、ニユーヨーク、1960、ジヨンウイ
リー＆サンズ社、１−70ページ参照。我々の研究で計算
された最大レイノズル数は600で、層流を示唆した。さ
らに、流量対圧力測定値は、遭遇する剪断速度全体を通
じて直線関係を示した。流れの終りに、室を分解して移
植片表面を光および走査型電子顕微鏡によつて調べた。 光顕微鏡は、0.1％BSAを含むダルベツコの燐酸緩衝食
塩液で洗い、95％エタノールで15分間固定した播種移植
片で行つた。移植片を蒸溜水で洗い、ギルのヘマトキシ
リンで染色した（フイツシヤーサイエンテイフイツク
社、フエアローン、NJ）、蒸溜水で２回洗つた後、移植
片をスコツトの水道水代用液の中に１分間浸した。表面
を蒸溜水および95％エタノールで２回洗つた。染色した
移植片をニコンのダイアフオト顕微鏡で試験した。 走査型電子顕微鏡検鏡も行つた。播種した表面を１％
グルタールアルデヒドで１時間、３％グルタールアルデ
ヒドで２時間固定した。それをタイロードのカゴダイレ
ート緩衝液（PH7.4）で20分づつ３回洗つた。サンプル
を１％O3O4で30分間後固定し、タイロード緩衝液で３回
洗つた。サンプルを臨界点で乾燥し、金パラジウムのス
パツタで被覆した。覆われたサンプルをフイリツプス走
査型電子顕微鏡で検査した。 内皮細胞のインジウム標識化も行つた。内皮細胞を既
述のようにして微小血管から分離した。100×ｇで３分
間遠沈することにより細胞をペレツトにし、PBS（PH7.
4）で１回洗つた。細胞を標識化前にPBS0.5mlに再懸濁
した。細胞濃度を2.5×105細胞/mlに調節した。20マイ
クロキユリーのインジウム111（インジウム111オキシン
として、イメージフイジイツクス、エメリーヴイル、C
A）を細胞懸濁液に加え、普通に攪拌しながら、30分ま
で細胞を標識化した。洗う直前に、標識化効率を最終的
に分析するために５μｌサンプルをとつた。標識化細胞
を完全組織培養培地を用いて遠沈により３回洗つた。最
後にできたペレツトを、最終濃度2.5×105細胞/mlにな
るように完全培養培地に再懸濁した。 放射性標識化ECの粘着量を、次の操作法を用いて測定
した。ビーム・カプセル（ポリサイエンシズ社、フオル
トワシントン、PA）に固定したダクロン被覆PRP上にそ
のECを播種し、特定の時間（ｔ＝10、20、30、60、120
分）インキユベートした。各々の時間でサンプルを調べ
た。培養培地を除去し、PBSをピペツドで表面全体に力
強くふりかけた。ビームカプセル全部を分析にかけた。
各時点の平均値を計算し、最大粘着を時間に対するパー
セントしてプロツトした。 フロー（flow）・スライド及び対照スライド上のECの
カウント数をIBM PC ATおよびフレーム・グラバーに
支持されたマイクロ・コンプ（Micro−Comp）グレイン
・カウンターを用いて計数した。フロー分析で得られた
データを二方法で評価した。第一に、EC粘着性を、フロ
ー後も（流した後も）粘着したままに残つている細胞を
対照スライドに比較したパーセントとしてあらわす。各
時点は少くとも４観察をあらわし、８観察もあらわす場
合もある。これを剪断応力に対してブロツトし、この曲
線で直線回帰分析を行つて、統計的有意性を検定した。
第二には、最初の粘着の比較をスチユーデント（Studen
t）のｔ−テストを用いて行つた。 EC粘着性はインジウム111標識によつて測定し、時間
に対してプロツトした。各データ点は別個のニサンプル
の平均をあらわす。 この試験では、脂肪組織を13人の提供者から得た。そ
れは腎周囲および網脂肪源が含まれていた。EC分離の３
段階にかかつた時間は、コラゲナーゼに29.9±３分（平
均±平均の標識誤差）、パーコールに20分洗浄と細胞計
数操作に30分であつた。湿脂肪の1gあたりの平均EC収量
は1.25±0.45×106細胞であつた。トリパンブルー染色
排除によつて調べた細胞生育性は、すべての分離におい
て95％以上であつた。 血漿被覆ダクロン上で１時間培養（インキユベーシヨ
ン）後、光顕微鏡により評価した内皮細胞粘着は2.8±1
04細胞/cm2であつた（ｎ＝９）。粘着性を融合パーセン
トとして測定した。これは１時間インキユベーシヨン後
の粘着内皮細胞の数を数え、105でそれを割ることによ
つて出した。それは細胞の播種密度に無関係に融合単層
中に存在するEC最大数である。統計的分析のために１提
供者につき４回粘着測定を行つた。第６図に見られるよ
うに、個々の提供者の粘着平均値の標準誤差は小さい。
それに対して、平均粘着は提供者＃２の1.13×104EC/cm
2から、提供者＃９の4.11×104ECまでに変化した。提供
者＃８おび９は＃１、２、４、５、６、７に比べて有意
に高い初粘着性を示した（ｐ＜0.005）。そして＃３は
スチユーデント（Student）ｔテストによると＃１、
２、４、５、７とは有意差を示した。 微小血管内皮細胞の血漿処理ダクロンへの粘着の短時
間の経過も、この試験で調べた。インジウム111で放射
性標識化した微小血管内皮細胞を、血漿処理ダクロン上
にプレートし、120分間に亘つて細胞粘着を分析した
（第７図参照）。左側のｙ軸は与えられた時点における
EC粘着数を、２時間インキユベーシヨン後の（最大粘
着）EC粘着数で割つたものをパーセントであらわしてい
る。右側のｙ軸は与えられた時点におけるEC粘着数を最
初に播種したEC数（105EC/cm2）で割り、融合パーセン
トとしてあらわした。粘着の二相性が認められた；最初
の60分間の速い粘着速度の次に、それから最後の120分
までの比較的遅い速度が続く。評価した最も早い時点、
10分の時点において、限られているとはいえ著しい粘着
が認められた。 フローを行つた血漿被覆ダクロンへの粘着をさらに調
べた。１時間インキユベーシヨン後、EC播種表面をフロ
ー室に置き、一定の剪断条件にさらした。各一人の提供
者からのECは唯一の剪断速度にさらした。第８図はダク
ロンへのEC粘着に与える剪断応力の影響を示す。データ
はダクロン移植片への粘着パーセントとしてあらわされ
る。これは２時間の実験後に表面に粘着したEC数を数
え、それをインキユベーシヨン前に表面に粘着したEC数
で割り、パーセントであらわしたものである。13人の提
供者からのECを用いた。各々の剪断応力につき、一人の
提供者で４回観察を行つた。２人の提供者からのECを与
えられた剪断応力（例えば20、30または50dynes/cm2）
で個々に試験した時、細胞粘着性の有意差は認められな
かつた。直線回帰分析は、ｙ軸を横切る所が91で、勾配
−0.33、ｒ値−0.26を明らかにした。この統計分析は、
分離しばかりの微小血管ECの粘着は80dynes/cm2までの
剪断応力には影響されない、という結論を支持する。 EC粘着性の定性的評価を走査型電子顕微鏡で行つた。
細胞を１時間、表面に結合させ、その後２時間剪断する
場合、低パワー観察は種々の密度のECを有する領域を明
らかにした。ダクロン表面は血漿かたまり（クロツト）
によつて一様におおわれ、細胞は、製織プロセス中にで
きた山（たて糸）および谷（よこ糸）両方を覆う血漿ク
ロツトの領域に粘着しているのが認められた。低パワー
観察によると、“より限定された細胞結合をあらわす”
と考えられた領域を、より高倍率にすると表面との結合
の種々の段階にあるECが明らかにされた。細胞の形態
は、細胞表面領域に劇的な増加を示す平らな細胞から、
限局的に付着して丸いままでいる細胞までいろいろであ
つた。それらの細胞はすべて剪断に抵抗した。 こうしてこの試験は、人工表面上に内皮を作り、先行
技術の人工表面の血栓形成性に起因する問題を避けるこ
とができることを裏づける。この試験は更に、あらかじ
めEC培養をしないで、移植時に完全に内皮化する人工移
植片を提供する可能性を示す。このやり方は、微小血管
はほとんどすべての組織に高密度で普遍的に存在するの
に、数の限られた大きい血管のみをEC供与体として使用
するという問題を回避する。これらECは脂肪組織から比
較的容易に分離され、太い血管に比べて組織1gあたり多
数のECを与える。組織培養ではこれらECは、大血管のEC
機能的および形態学的特徴の多くを示す。最も重要はこ
とは、それらが正常の大血管の内皮の丸石（cobbleston
e）の外観に全くよく似た、接触禁止（コンタクト・イ
ンヒビツト）融合単層を形成することできることであ
る。微小血管内皮細胞は、移植片に速やかに内皮を形成
できる細胞に要求される多くを満足せしめる。その細胞
は組織に普遍的に存在するところの大変な外科的措置な
しにそして患者には最小のリスクしか与えないで、大量
に採取できる提供組織である脂肪組織に存在する。その
ような細胞は大部分の患者から60〜90分で容易かつ確実
に分離され、混入平滑筋細胞のない、そしてPRPで前処
理したダクロンまたはその他の材料、例えば基礎膜に早
く、しつかりと粘着することのできる内皮細胞を多量に
生産することができる。それらはその上、融合細胞領域
を確立することができ、たつた１時または２時間のイン
キユベーシヨン後に生理的剪断応力に抵抗し、かつま
た、提供者の自家内皮細胞である。 既術の試験は、種々のヒト提供者から採取した脂肪が
1.25±0.45×106EC/g脂肪を与えること、そしてこれらE
Cの最初の粘着性がPRP処理をした移植片上でさえも適用
ECの10％〜40％の範囲であることを示す。患者の年会、
疾患または社会的行動に関して明確な傾向は確認されな
かつたが、ECの収量および粘着特性は個人個人で異なる
という証拠がある。これらの差にも拘らず、これらの粘
着変数は、採取する脂肪量をふやすことによつて埋め合
わせられる。 記載の試験により、新たに分離し、播種したECが生物
学的剪断応力に抵抗することができるというもう一つの
重要な必要条件をも調べた。大部分の試験管内の播種実
験と同様のシステムにおいて、内皮形成表面の、剪断に
対する抵抗性を調べた。これまでの研究では我々は、EC
がたとえ容易に融合単層を形成しなくても、表面にしつ
かり粘着できることを証明した。こうして、このモデル
は１個１個の細胞の、表面への粘着性を実際に測定し、
多分、流れにさらされる細胞の理想的環境よりより小さ
い粘着性を示す。だかEC粘着性は50％以上にとおまり、
大抵の場合遭遇するすべての剪断力レベルにおける粘着
性よりずつと大きかつた。これは、ひとたび細胞と表面
との相互作用および付着がおきたならば、ECは非常にし
つかり粘着することを意味する。このモデルには多くの
変数がある。その中には提供者の変数、血漿の変数およ
びインキユベーシヨン条件あがり、これらはこのプロセ
スをより完全に理解し、最適にするため研究される。 もう一つの重要な特性は、新たに分離され播種された
ECが速かに完全な細胞・細胞間相互作用を形成すること
ができることである。これらの相互作用が付加的にECを
剪断応力から守り、細胞の表面から剥離の防止を助ける
のは明白である。細胞・細胞間結合は血漿被覆ダクロン
（テトロン）上では限られた程度におこるが、この後に
説明する試験ではそのような細胞・細胞間相互作用を促
進するより適した表面が提供される。 上述の実験は、微小血管ECが有する特性のためにECが
移植片内皮形成のために潜在的にすぐれていることを実
証する。分離操作並びにその後の表面粘着および細胞・
細胞間相互作用に含まれる変数をこの後により十分に検
討する。しかしながらここで論じた、およびこの後に論
じる操作法はすべて手術室の環境における自己ヒト組織
の操作と一致することを覚えておくべきである。 人工表面上の好ましい内皮細胞融合層の形成は、今で
は最近三つの重要変数に依存すると考えられる。先づ、
第１に最初の細胞粘着は、少なくとも約50％の初期表面
被覆を提供するに十分でなければならない。少なくとも
約50％の被覆をもたらすほどの大血管内皮細胞の調達は
不可能でないにしても非常にむづかしい。なぜならば利
用できる唯一の細胞源は患者自身の大血管であるからで
ある。大血管の細胞を分離し、培養して多数の細胞を用
意することができるとしても組織培養培地と関係した明
白な問題が提起されるであろう。微小血管化脂肪は、播
種するための内皮細胞の豊富な資源となる。患者の脂肪
20gは180cm2の表面積（股動脈とひかがみ動脈とをバイ
パスする典型的移植片が示す表面積）に播種するに十分
な内皮細胞を提供する。 考慮すべき第二の変数は、内皮細胞が人工物表面で増
殖する能力である。50％融合で適用した場合、融合した
細胞層を形成するには細胞が一度２倍になることが必要
である。第２表は、好ましい蛋白質被覆表面（富血小板
・血漿で被覆した）上で増殖因子を含む組織培養培地中
で細胞は少なくとも１旦は２倍になることを示してい
る。しかしながら体内ではこれらの増殖因子は多分に存
在しない。したがつて融合でまたは融合の過剰で表面を
処理する能力があると好都合である。ここでもまた、ヒ
トMECが多量に使用できれば移植時に融合単層に近いも
のを確立することのできる密度で内皮細胞を表面に適用
することができる。 これら二変数は前記のように蛋白質で前処理した人工
物表面、または蛋白質表面に匹敵するように加工された
表面上にヒト内皮細胞を適用することにより十分に研究
されている。このような変形された表面は、内皮細胞組
織培養技術者には十分よく知られいる。別法として、内
皮細胞を移植片の内部および周囲に生成するフイブリン
（蛋白質）ゲル中にあからじめ凝固する。データはヒト
微小血管内皮細胞が蛋白質の網目構造の中でゲル化し、
培養倍地においてインキユベーシヨン後ゲルの表面に移
動するこを示す。これは走査型電子顕微鏡により確認さ
れた、それはヒト微小血管内皮細胞がヒト血漿中であら
かじめ凝固した後にダクロンポリエステル移植片の表面
に融合単層を生成することを示した。 第三の重要な変数は「技術」および「基礎にある表
面」が組織、剪断抵抗および抗血栓形成性を含むEC単層
の機能的特徴を持つことによる影響である。このような
機能的特徴を改善するために、ヒト成内皮細胞（以下HA
ECと呼ぶ）と、ヒト羊膜によつて示される天然コラーゲ
ン表面との相互作用を研究した。走査型電子顕微鏡によ
る評価の結果、HAECは羊膜の基礎面（コラーゲンVI/V）
にも間質面（コラーゲンI/III）にも速かに粘着するこ
とがわかる。しかしながら細胞の粘着は基礎膜表面の方
が著しく大きい。その上、HAECは間質性面に播種された
細胞に比較して、基礎膜面にすみやかにより密接な細胞
・細胞間（cell ot cell）相互作用をおこす。これらの
結果はもし表面を内皮細胞が元々粘着する天然の基礎膜
を模して作るならば、内皮細胞のその人造表面への播種
は容易になることを示唆している。 上述のように最近の証拠は、内皮細胞が未処理移植片
および／またはコラーゲン被覆人工物表面に粘着し、少
くともゆるい細胞・細胞間相互作用をそれとおこしてい
ることを示唆する。しかしながらこのような証拠から
は、そのような内皮細胞が本来のヒト血管に存在するよ
うなち密な細胞・細胞間結合物を形成することは証明さ
れない。しかしながらヒト内皮細胞と、普通は内皮細胞
が粘着する本来の基質との最初の相互相互は非常に重要
であつた。特に摘出ヒト羊膜は内皮細胞を剥ぎとつた時
には正常なヒト血管の内皮細胞の下にある面と同じ化学
構造であるからである。標本化羊膜も天然の血管も、内
皮細胞表面を除けばIV型、Ｖ型両方のコラーゲンの基礎
膜とその下にあるＩ型およびIII型コラーゲン基質とか
らなる。 主題の表面ができることを証明するためにジヤレル等
の“ヒト成内皮細胞の培養増殖"J.VascSurg,1（６）巻7
57−64ページ（198）に発表された操作法によつてヒト
成内皮細胞を分離し培養した。これらの細胞を標本化羊
膜上に播種し、本来のヒト血管の基質シユミレートした
基質に対する内皮細胞の最初の粘着を研究できるシステ
ムを作つた。光および走査型電子顕微鏡により評価し
た。 新鮮なヒト胎盤からとつたヒト羊膜を、リオツタ（Li
otta）等の“腫瘍侵入研究のための完全無傷ヒト基礎膜
の大きい面を作る新しい方法（New Method For Prepcri
ng Large Sufaces of Lntact Human Basement Membrane
For tumor Lnvasion Studies）、キヤンサーレター、1
1巻141−152ページ（1980）に記された方法の変法によ
つて作成した。全ての操作は無菌条件下で行われた。内
側羊膜をゆつくりと大胆に繊毛膜から切り裂き100単位/
mlのペニシリンと、025mcg/mlのフンギゾンを含む、氷
例−燐酸−緩衝食塩液中で２回洗つた。これに続きダル
ベツコの最小必須培地で、４℃で１回洗い。1mMN−エチ
ルマレイミドを含む蒸溜水で１時間４℃ですすいだ。そ
れから羊膜を４％デオキシコレート溶液中で20℃で２時
間インキユベートし、下にある基礎膜の構造を損傷する
ことなく上皮細胞をばらばらにほぐす。ゴムのポリスマ
ドでゆつくり攪拌すると上皮細胞は基礎膜からはぎ取ら
れる。基礎膜の統合性を墨汁染色によつて確めた。上皮
細胞の除去は形態学的に確認した。 上記のように用意し上皮を除去した羊膜を、ウイリア
ムズ等の“成ヒト内皮細胞の人工移植片材料との適合
性"J,Surg,Res（同上）に用いられたのと同様のプラス
チツクカプセル中に固定した。これはその後の内皮細胞
の播種および増殖のための安定した。輪郭をはつきりつ
けた羊膜表面（0.5cm2）を用意した。羊膜の基礎膜も介
在性コラーゲン側も細胞播種のために準備した。組織培
養研究に先立つて、羊膜を含むカプセルを500mcg/mlペ
ニシリン／ストレプトマイシンおよび0.25cmg/mlフンギ
ゾンを含む完全培地に４℃で一晩つけた。 ヒト内皮細胞を脳死で心臓は動いている死体の腎供与
体から採取した血管組織から分離し、上に参照した公表
されている操作法によつて培養した。この研究では新鮮
な腸骨静脈からのECを用いた。つまり、口径面をコラゲ
ナーゼ（ウオーシントンＩ型、ウオーシントン デイア
グノスチツク システムズ社 フリーホルド、N,J）で
処理することにより新鮮な腸骨静脈から分離し、ゼラン
チン（１％）の培養培地溶液（培地199 20％加熱不活
性化・ウシ胎仔血清、90μg/mlへパリン（プロシン）、
20μg/ml内皮細胞増殖因子）をあらかじめ被覆した25cm
2組織培養フラスコにおいて増殖させた。羊膜播種実験
に用いる細胞は累積的集団倍化（cumurative populetio
n doubling）が16〜25の間になるように計算した。集団
倍化（population doubling）は PD＝1og2（収穫細胞数）／（播種細胞数×付着効率） により計算し、合計して累積的集団倍加（CPDs）を与え
た。これらの細胞のEC同一性の確認は前に報告した。そ
して第VIII因子関連抗原のための陽性染色、丸石（cobb
lestone）の形態およびEC−特異−プロスタグランジン
およびアンギオテンシン変換酵素活性を含んでいた。 内皮細胞を播種した羊膜２％をグルタールアルデヒド
で一晩固定し、それから形成物を固定し、パラフインに
埋め込み、ヘマトキシリンおよびエオシン染色用の切片
を作成した。染色した切片はニコン・デイアフオト・顕
微鏡で鏡を照射して明るくして調べた。 走査型電子顕微鏡では、EC播種羊膜を１％グルタール
アルデヒドで１時間、それからタイロード カコデイレ
ート緩衝液pH＝7.4中で４回洗つた（各20分づつ）。そ
の羊膜をアセトンの段階的系列で脱水し、臨界点で乾燥
し、金−パラジウムで被覆した。この時点においてプラ
スチツクカプセルを播種羊膜サンプルから除去した。こ
れらサンプルをフイリツプスの走査型電子顕微鏡にとり
つけ、検査した。 上述の方法によつて作成したヒト羊膜は、剥離走査に
抵抗し得た。基にある基礎膜構造が維持されていること
は墨汁を用いる走査によつて確かめられた。サンプルを
光および走査型電子顕微鏡を用いて検査した時、羊膜面
が完全無傷であつたこと、すなわち表面に破損、または
破れや裂けがなかつたことから膜の完全性も証明され
た。その上、播種しない、剥離した（露出）対照用の羊
膜をECなしのままであつた時、脱上皮下処理の効率が証
明された。 ヒト腸骨静脈内皮細胞（HIVE）を分離し樹立細胞系と
して組織培養で増殖させた。細胞を羊膜の基礎膜か支質
コラーゲン成分かどちらかに融合密度で播種した。どち
ら側に播種した細胞サンプルにも、洗浄および固定の前
に２時間培養し、それからECの基質への最初の粘着を評
価するための試験を行つた。走査型電子顕微鏡による観
察はIV/V型（基礎膜）コラーゲンおよびI/III型（介
在）コラーゲン両方にかなり大きい最初の粘着を示し
た。IV/Vコラーゲン上には融合したEC層が生成して維持
されており、若干の細胞は表面とゆるく結合しているの
が認められたが多くの細胞は緊密な細胞・細胞間結合を
示すのが認められた。I/IIIコラーゲン基質上では細胞
はIV/Vコラーゲン上に見られたよりも小さい密度で、そ
してよりゆるい細胞結合で粘着していた。組織培養７日
後光顕微鏡検鏡は細胞がI/III型およびIV/V型コラーゲ
ン表面どちらにも粘着し、ひろがつていることを示し
た。 主題の実験はこうして新鮮なヒト胎盤から得たヒト羊
膜を標本化して、天然の（本来）ヒト基礎膜の大きい面
を提供することができることを示した。この計画はECが
ヒト本来の血管で経験するであろう表面を模した基質の
豊富な、容易に使える原料を提供する。こうして、それ
は播種されたHAECと試験管内にあるようなコラーゲン表
面との最初のおよび持続する相互作用を研究する理想的
試験管内モデルである。羊膜を用いてHAECは基質膜およ
び間質コラーゲン基質両方に結合の最初の２時間以内に
粘着することが証明された。しかし基礎膜上の細胞の方
が本来の血管における内皮細胞の結合に似たち密な細胞
・細胞間相互関係を形成した。これは本来のヒト基礎膜
を模する物質がEC移植片相互作用を高め、移植片閉塞の
発生を低下させることを示唆する。これらの結果は、ア
メリカン・ジヤーナル・オブ・サージエリー150巻197〜
200ページ（1985年８月）に掲載のベーカー等の“ヒト
成内皮細胞をもつたヒトコラーゲン表面の内皮形成”に
報告された。この論文の主題は、臨床血管外科学会の第
13回年会（ランチヨ ミラージユ，カリホルニヤ,1985
年４月10〜14日）で講演された。この論文および特に図
（写真）（これらは本出願には都合よく再生できない）
はこの結果、参照によつて挿入される。 その後の研究は、内皮細胞と表面との最初の接触から
単層の形成までの短期間の事象に連続に焦点をあてて行
われた。培養したヒト成ECを放射能で標識化し、グクロ
ン上に播種し、烈しく洗つた後に粘着を定量した。播種
ECの70％がしつかり粘着するまでにかかつた時間は、未
処理グクロンでは２時間、本発明によるコラーゲン・ラ
ミネート、（間質性I/III型）コラーゲン下層および羊
膜由来の基礎膜（IV/V型）コラーゲン表面層であらかじ
め処理したダクロンでは30分間、血漿被覆ダクロンでは
19分間であつた。パラレル サンプルを走査型電子顕微
鏡によつて形態学的に調べ内皮細胞の表面への粘着を評
価した。単るダクロンに播種した内皮細胞は限られた粘
着性を示し、血漿処理ダクロン上の細胞は限られた細胞
・細胞間結合を示した。基礎膜で処理したダクロンでは
30分後までには内皮細胞は平らな形態を示し、移植片表
面を完全におおつた。この時間わくは、既時的内皮形成
移植片の実現を可能にする血管処理法の大部分と適合す
る。 自家播種を用いて融合を確立するための一時的事象系
列は小口径の移植片の短期間の開放性を改良するために
は特に重要である。ヒト以外の大部分の動物では、移植
片のかなりのパーセントが自然に内皮化されるには移植
後４〜６週間の期間が必要であると予想される。この時
間わくが大部分のヒト下肢人工移植片臨床系列にあては
まるならば、かなりのパーセンの移植片が血栓形成のた
めに移植後１ケ月以内に駄目になることがわかる。こう
して短期間の開放性に顕著な改善を見るためには移植時
またはその近辺に移植片上に完全無傷の内皮の確立が必
要であるかまたは少くとも望ましい。 すぐれた小径移植片を得るためには、多量の自家内皮
細胞、例えば微小血管性脂肪に由来するようなすぐ使え
る原料が必要である。人工表面基質は内皮細胞を受け入
れるものを選択すべきであり、その処理は付着に必要な
知識および、機能的並びに剪断抵抗のある単層を確実に
生成せしめるのに必要な一時パラメーターを用意して行
われるべきである。そこで、人工表面への内皮播種から
融合単層の生成までの短時間の事象連続が移植時にあら
かじめ内皮形成を可能とするほど十分に速いものである
ことを証明するために次の試験を行つた。 以下の研究を行うにあたつて、脳死で、心臓は動いて
いる死体の腎供与体から採取した血管組織から内皮細胞
を分離し、上述の操作法を用いて培養した。この研究で
は、上述のようにして分離した成ヒト腸骨静脈からの内
皮細胞を用いた。ヒト基礎膜も上述の操作法にしたがつ
て作つた。異種間質性コラーゲンI/III型はヒト胎盤か
らマドリ（Madri）の“Ｖ型コラーゲンの調製”（H,Fur
thmayr編集、細胞外基質の免疫化学、ボサラトンフロリ
ダ:CRCプレス、1982（１）巻75〜90ページ）の方法によ
り調整した。この報告はこの結果参照によつて挿入され
る。つまり細切し、凍結乾燥した胎盤をペプシン消化
し、コラーゲンフラクシヨンを0.5M酢酸で可溶化した。
I/III型を1.4M Naclで沈殿させ、沈殿物を集め、緩衝液
に対して大規模に透析した。白い毛羽のようにやわらか
いコラーゲンを直ちに用いるか、または凍結乾燥して使
用時まで保存するかした。 本発明の好ましい実施例によると、移植片表面を次の
ようにして作成した。織物のダクロン移植片の表面を、
前述のように調製した異種間質性コラーゲンＩおよびII
I型で被覆した。そのコラーゲンを0.0174M酢酸中で安定
化し、氷冷した培地199およびNaHCO3で0.32％コラーゲ
ンに希釈する。移植片を20℃で一晩放置することにより
沈着を捉した。その後その表面を0.2％グルタールアル
デヒドで１分間おおい単培地ですすいだ。標本化した羊
膜を、基礎膜面がダクロン面から離れる方向に向けて移
植片表面にかぶせた。これを37℃で２時間インキユベー
トして移植片と羊膜との粘着を促進する。羊膜・被覆・
移植片をプラスチツク環（ビームカプセル ポリサイエ
ンシスFW）内に固定し、0.5cm2表面積を用意する。この
点に関して用いる技法は、ウイアムズ等の“ヒト成内皮
細胞と人工移植片材料との適合成"J,Surg Res38巻618〜
629ページ（1985）に記載されたものである。この論文
はこれによつて参照により挿入される。 比較の目的のためにその他のダクロン移植片表面を多
血小板血漿（PRP）によつて処理した。PRPはヒトドナー
からの抗凝去（クエン酸ブドウ糖）血液から作られた。
PRPを移植処理の直線に50mMCaCl2と混ぜた。移植片をPR
Pで処理し、37℃でフイブリンクロツトを生成せしめ
た。そのクロツトをEC播種直前に培養培地で洗つた。 走査型電子顕微鏡を用いて内皮細胞播種移植片を検査
するために次の方法を用いた。腸骨静脈から分離したEC
を25cm2フラスコ中で融合するまで増殖させ、1:4分裂比
で２回細胞通過後、細胞播種のために用いた。ECをトリ
プシン溶液（正常食塩水中の0.25％トリプシンと0.09％
EDTA）で簡単に（1.5分）洗い培養培地で１回洗い移植
片表面播種前に完全培養培地に再懸濁した。ECは、ゼラ
チン被覆プラスチツク面上に100％融合した細胞単層を
作るのに十分な細胞濃度で播種した。この密度は１×10
5細胞/cm2に等しい。 適当な時に、播種移植片表面に向けてパスツールピペ
ツドから完全培養培地を強くかけることによつて播種移
植片表面から粘着していない、またはゆるく粘着した細
胞を洗いおとした。移植片表面を直ちに１％グルタール
アルデヒド中で固定し、走査型電子顕微鏡検査の準備を
した。 走査型電子顕微鏡検鏡を行う前に１％グルタールアル
デヒドで１時間、２％グルタールアルデヒドで２時間固
定し、タイロードカコジレート緩衝液（pH7.4）で３回
洗い（20分間の期間）アセトンの段階系列で脱水した。
移植片−まだプラスチツク環に固定されている−をそれ
らから臨界点で乾かし金パラジウムで被覆した。とりつ
けたサンプルをフイリツプツ走査型電子顕微鏡で調べ
た。 内皮細胞はこのテストでは二つの別個の操作法を用い
て放射性標識化された。Ｔ−25フラスコ中の融合ECをト
リプシン溶液で処理することによりチミジン標識化を行
つた。これらの細胞をその後培養培地で洗い、計数し、
Ｔ−75フラスコ上に104EC/cm2で再プレートする。24時
間増殖させた後、トリチウム化チミジン（アメルシヤ
ム、アーリントンハイツ、ILL）0.5μCiをフラスコに加
え、24時間インキユベートした。ECをトリプシン溶液で
処理し、シンチレーシヨンカウンターで計数した。25cm
2フラスコで融合するまで増殖させた内皮細胞にインジ
ウム標識化を行つた。細胞を短時間トリプシン処理し
た。放出した細胞を遠沈により（100×g:3分）ペレツト
にし燐酸緩衝食塩液で１回洗つた（pH7.4）。標識化す
る前に細胞を燐酸緩衝食塩液0.5mlに再懸濁した。細胞
濃度を2.5×105細胞/mlに調節した。20マイクロキユリ
ーのインジウム（メジ フイジツクス エメリーヴイル
CA）を細胞懸濁液に加え、細胞を洗い、５μｌサンプ
ルをとり、標識化効率の最終的分析を行つた。標識化細
胞を完全に組織培養培地を用いた遠沈により３回洗つ
た。最終的ペレツトを、最終的濃度が2.5×105細胞/ml
になるように完全組織培養培地に再懸濁した。 生成した放射性標識化内皮細胞を播種し、その粘着性
を次のように定量した。内皮細胞をビームカプセルに固
定した基質被覆・ダクロンに播種した特定の時間間隔イ
ンキユベートした（ｔ＝１、５、10、20、30、60、120
分）。各時間間隔毎にサンプルを得た。第１のサンプル
（上澄みと呼ばれるものはビームカプセルから上澄液を
ピペツトでとることにより得られる。第二のサンプル
（ゆるく粘着したと呼ばれるもの）はピペツトで培養培
地を表面に強くかけることにより移植片表面を烈しく洗
うことによつて得た。これらの洗浄を行うために用いた
培地を集め、全資料を第二のサンプルとした。第三のサ
ンプル（粘着したと言われるもの）はすべての粘着ECを
移植片面からとることによつて得た。これは、ECサンプ
ルを0.2ml0.3％ドデシル硫酸ナトリウムに３回溶かし、
生成した溶液ろ紙に移すことにより行われた。各ろ紙を
10％氷冷TCAに移し、沈殿物質を計数した。各サンプル
のカウントは、三試料全部の総カウント数のパーセント
にして標準化し、各フラクシヨンの％EC対時間（分）を
プロツトした。トリチウム化チミジンで標識化したECを
シンチレーシヨンカウンターで計数し、インジウム標識
化ECはガンマ・カウンターで計数した。 上記の試験から次の結果が得られた。内皮細胞の粘着
度を定量的に評価した。内皮細胞のインジウム標識化細
胞への粘着性。これらの方法のどちらも細胞放射性標識
化方法が細胞粘着の動態に影響を与えないことを示す同
様の結果をもたらした。ヒト内皮細胞は第４図に示され
るように未処理織物ダクロン移植片に時間に依存する粘
着を示した。10分までに加えた細胞の約30％がダクロン
表面にしつかりとくつつくことが認められた。しつかり
と粘着する細胞の数は時間と共に徐々に増加して１時間
までには50％がしつかり粘着し、２時間までには加えた
細胞の80％がしつかりと粘着した。ゆるく粘着した、ま
たは粘着しなかつた細胞の同時定量の結果（第４図）の
移植片表面にしつかりと粘着しなかつた細胞の大部分は
懸濁液中に遊離していることがわかつた。移植片表面と
の結合２時間までにゆるく粘着した細胞と懸濁液に遊離
している細胞は移植片に加えた全細胞の約20％であつ
た。移植片表面を前処理して多血小板血漿クロツト表面
かまたはヒト羊膜から調製した天然基礎膜表面を作つた
場合、ヒト内皮細胞の結合速度は著しく加速された（第
５図）。PRPクロツトは内皮細胞の70％がインキユベー
シヨン10分後にはしつかりと粘着した。多血小板血漿に
粘着した細胞数は２時間までに80％の最大値に増加し
た。ヒト基礎膜（羊膜）被覆ダクロンへのヒト成内皮細
胞の最初の粘着は未処理ダクロンとPRP処理ダクロンと
の中間であつた（第５図）。粘着した細胞数は時間と共
に増加し、羊膜に粘着した細胞数は30分〜60分間の間に
PRP処理ダクロンに粘着した細胞数と同じになつた。第
５図に見られるようにすべての表面は、２時間のインキ
ユベーシヨン後にはほぼ同じ粘着細胞数を示した。表面
を形態的に評価した。内皮細胞−移植片の定量分析から
内皮細胞の表面への粘着速度を分析できる。しかし内皮
細胞と移植片表面との相互作用の形について疑問が残
る。そこで我々は、内皮細胞の基礎膜処理移植片表面、
多血小板血漿処理移植片表面および未処理のダクロンそ
のものに対する粘着を形態学的に評価した。基礎膜処理
移植片に対するヒト成内皮細胞粘着の一時的経過を、走
査型電子顕微鏡検査によつて調べた。内皮細胞の添加後
移植片表面を１〜120分間いくつかの間隔で洗い、走査
型電子顕微鏡によつて評価した。頂度１分後に丸い内皮
細胞が比較的平滑な羊膜表面にしつかり粘着するのが認
められた。10分間インキユベーシヨン後内皮細胞はまだ
細胞性基礎表面の限られた部分への焦点性粘着を示唆す
る丸い外観を保つていた。 インキユベーシヨン20分後の、内皮細胞の基礎膜への
粘着の評価ではじめて細胞群の形の変化の証拠が得られ
た。球形の細胞がまだ存続する一方、比較的平らな形態
を有する細胞が認められた。より圧迫された細胞群の端
はまだ丸味を帯びておりそれらの遠位表面では細胞の結
合がまだ限られていることを示唆している。20分後の細
胞粘着数の増加も明白である。この時には羊膜表面に粘
着する内皮細胞の形態が認められた。最も容易に確認さ
れたのは一部および完全にひろがつた内皮細胞にくつつ
いた丸い細胞の存続である。数は一番多いが最も確認し
にくかつたのは、元の羊膜表面をほとんど完全におおつ
た広く広がつた内皮細胞である。 内皮細胞播種羊膜表面の完全な形態学的成熟が見られ
たのは、細胞結合がはじまつてから１時間後である。内
皮細胞は羊膜をおおい膜のしわの消失が平滑な内皮細胞
単層表面を形成する。内皮細胞のち密な結合は細胞の境
界の確認をむづかしくしている。しかしながら不完全に
薄くなつた細胞がところどころにあるので、これが下に
あるダクロン繊維によりこの単層の細胞的性質を評価す
る参考点となる。 多血小板血漿および未処理ダクロンに粘着した細胞の
形態も粘着60分後に評価した。PRP処理ダクロンへの内
皮細胞粘着は、細胞のない部分と、細胞が内皮細胞に特
徴的な細胞・細胞間相互作用を示している部分とを含
む。遍平内皮細胞の表面にフイプリンが明らかに沈着し
ているのも興味深い。このフイブリン層は播種前に形成
されたから、内皮細胞がそれらが完全に粘着し遍平にな
る前にフイブリン内張りの下に一部もぐり込むことがで
きることを示していると考えられる。最も重要なことは
内皮が全然なく、したがつてフイブリン層が露出してい
る領域が一般に見られることである。最後に60分後の未
処理ダクロン表面の粘着では固定前の洗浄中、および検
鏡のためのサンプル作成中に受ける力に抵抗するため
に、一本一本のダクロン繊維にまきついたり、それを横
切つたりしている内皮細胞が見られる。未処理ダクロン
表面にはマルチ内皮細胞の斑点は見つからなかつた。 理論的には血管移植片内皮化は低密度の内皮細胞播種
とそれに続くEC増殖、高密度EC播種、または移植後表面
にECが自然に内生することによつておこる。移植時に融
合層を形成する高密度EC播種が、血栓形成の危険性のあ
る手術後、最初の数週間は非血栓形成性移植片を提供す
る可能性の最も大きな方法である。前記の研究は、高密
度EC播種が手術室での血管処置と適合する時間的パラメ
ーター以内に形態学的に正常に見える内皮単層を生成す
ることができるかどうかを調べるために企てられた。実
験条件はEC−移植片相互作用に関する我々のこれまでの
観察に基づいて選んだ。しかしながら我々のこれまでの
研究と異なり、トリプシンにさらす前に、たつた２で速
く通過するECだけを選んだ。研究のために別個の二方法
を用いたのは、我々が以前接触禁止融合単層に相当する
細胞数（すなわち105EC/cm2）は必ずしも走査型電子顕
微鏡でみる融合単層と相関関係にないことを観察したか
らである。トリチウム化チミジンおよびインジウム両方
用いて細胞粘着を定量する放射能測定は、表面に粘着し
ていないか、しつかり粘着しているかまたは付着過程で
あるかのいずれかの内皮細胞数を測定する正確な方法と
して用いられた。これらの方法を用いて、血漿被覆ダク
ロンには30分以内にしつかりと粘着することを観察し
た。この速かな粘着性にもかかわらず、形態的に正常に
見える単層への増殖は遅れる。60分の内皮細胞はほとん
ど細胞・細胞間相互作用を示し、丸石（cobblestone）
の形態よりむしろ星状（stellate）の形を示す。この表
面の非血栓形成特性は試験しなかつたとはいえ、この異
常な形態学から、これら内皮細胞は理想的条件を生成し
ないし、流れの作用に耐えないことが示唆される。羊膜
コラーゲン・被膜・ダクロン移植片に対する内皮細胞粘
着は、血漿−被覆−移植片より緩徐であつたが、融合へ
の到着には著しい差があつた。20分までの早い時期には
粘着は焦点性であつたが、内皮細胞は表面に多くの付着
点を形成しつつあり、遍平になり広がる過程にあつた。
遍平化プロセスは30分までに最大となり、多くの細胞・
細胞間相互作用があつた。これは形態学的に本来の血管
内皮に似ている融合層を形成していた（走査型電子顕微
鏡で）。この興奮すべき観察は、短時間培養した内皮細
胞が血管移植片挿入前の外科的切開時に合う時間わく内
に単層となる能力をもつていることを示唆する。こうし
て、処置の始めに移植片に播種すれば血流を戻すまでに
融合層になる。 羊膜／コラーゲン被覆ダクロンについての粘着研究
は、播種内皮細胞の77％が30分までに表面に粘着したこ
とを示す。これは、短時間培養したECの大部分が表面に
粘着する能力を有し、十中八九、特種の付着特性をもつ
たECのサブグループは存在しないか必要ないことを示
す。ECは融合接触禁止単層密度（105EC/cm2）と等価の
密度で播種されたから、融合以下の付着（すなわち77
％）でも形態的には融合した層を付着せしめるというこ
とも注目すべきである。こうして、増殖させずとも移植
片を完全におおうのに必要な播種ECの最小数は7.7×104
EC/cm2より小さい。 この研究における融合は、走査型電子顕微鏡で見て人
工物表面をECが完全におおつていることと定義づけられ
る。細胞・細胞間結合は正常のように見える、しかし透
過性電子顕微鏡でさらに研究すれば、存在する接合の型
も、内皮細胞と移植片基質複合体との間の結合の型も知
ることができる。基質は細胞の形態および機能に影響を
有することがわかつており、確実な結論を引き出す前
に、実験的設定において調べなければならない。その上
移植片の基質として羊膜の使用を研究することによりさ
らに多くのことがわかるであろう。この生物学的に由来
する材料は、現在は広い臨床的応用には使用できない。
IV/V型コラーゲンの他に、羊膜はフイブロネクチンおよ
びラミニンの細胞付着因子を含む。血管移植片の大規模
生産のためにはI/III型コラーゲンの中間層と、天然基
礎膜に似ているIV/V型コラーゲンのてつぺん表面層から
成るラミネートを構成することが望ましい。所望なら
ば、フイブロネクチンおよび／またはラミニンを含む細
胞付着因子の添加によつてその膜をより一層似せること
ができる。用いる基礎膜は天然性のものであろうと、合
成のものであろうと、そのような膜は全く非細胞性であ
り、照射によつて殺菌し、その後の使用のために貯蔵
し、そして／または輸送することができることを記して
おかなければならない。或いは合成人工物の面を、所望
のIV/V型コラーゲンに化学的に似せることもできる。 前述の試験に由来するEC単層は、形態学的に正常のよ
うに見えるとはいえ、その他の試験（以下に記す）を行
つて、それが正常内皮のその他の機能的特性、特に非血
栓形成性に関する特性を有するかどうかを研究した。例
えば単層が生理的動脈剪断応力に抵抗し、その粘着性を
保つことができることを証明することが望ましい。これ
は、EC基礎膜粘着についてのみならず、基礎膜・血管移
植片相互作用、並びに内皮細胞と内皮細胞との付着につ
いても示された。しかしながら前記の研究から短時間培
養したヒト成大血管内皮細胞の大部分は、10分以内に血
漿被覆ダクロンに、そして30分以内に羊膜／コラーゲン
−被覆ダクロンに速やかに粘着する能力を有することが
結論づけられる。ダクロンそのものだけへの粘着の場合
には顕著な粘着があらわれる前により長い時間が必要で
ある。羊膜／コラーゲン−被覆ダクロンの粘着はより緩
徐であるとはいえ、30分後の正味の結果は基質を完全に
おおい、走査型電子顕微鏡で正常な血管内皮と同様に見
える内皮細胞単層である。完全な移植片被覆は、血漿被
覆ダクロンまたはダクロンのみの上には２時間のわく内
にはおきなかつた。羊膜／コラーゲン被覆移植片で得た
データは、もしも受け入れる移植片−基質−複合体が用
いられるならば、手術室にある間に内皮細胞単層の生成
が可能であることを示唆するものである。 羊膜上の高密度播種によつて作られる内皮細胞単層の
機能的特徴を確かめるために、そして微小血管の内皮細
胞を用いた時にこの処置が有効であることを証明するた
めに、羊膜被覆移植片表面を前述の如く行つた。但し、
コラーゲン被覆のための面を作るために、先づ最初にグ
ロー放電血漿クリーナーを用いて前処理を施したダクロ
ン移植片表面を用いた。この操作法は人工物をハリクの
血漿クリーナー中に５分間置くことを含む。この装置で
生成したグロー放電血漿は、移植片表面を腐蝕し、コラ
ーゲンと移植片との間により強い結合を作り出す。 この方法の可能性をイヌのモデルを使つて証明した。
羊膜被覆ダクロン移植片にイヌ微小血管内皮細胞を播種
し、播種移植片をイヌの大静脈に外科的に移植した。２
日後その移植物をとり出し、表面を走査型電子顕微鏡で
検鏡した。この検査により、その表面は血球（白血球お
よび血小板）の結合を阻止する細胞層によつておおわれ
ることが判つた。この検査は主題の移植片が不定の開放
性を持たないことを何らか示すことに失敗した。動脈の
上におかれた制御表面は、血にさらされた時に未処理ポ
リマーの通常のトロンボゲンの特性を禁止する。 以上のことからわかるように、本出願はヒト患者に移
植するための移植物を処理する新規な方法であつて、合
成基質材料を提供することと、その材料をIV/V型コラー
ゲンで処理し、ヒト内皮細胞の粘着、増殖およびその形
態を改善することとから成る方法を開示する。好ましい
実施例において、前述のコラーゲンラミネートはヒト繊
毛尿膜に由来し非細胞性ヒト羊膜を含む。このコラーゲ
ンラミネート（羊膜）を、結合した間質性コラーゲンベ
ース層を備えた基質に適用する。ベース層はグルタール
アルデヒドのような架橋剤はさらにベース層の表面を活
性化してコラーゲンラミネートをそのベース層に共有結
合させる。それから架橋剤は、緩衝食塩液に溶解性であ
るアミン、アミノ酸、またはリジンのようなアルデヒド
活性アミノ基を有するプペチドによつて安全に不活性化
される。洗つて不活性化剤と残留架橋剤とを除去した
後、その移植片は微小血管内皮細胞の高密度播種を受け
入れる用意が整う。これらの微小血管内皮細胞を1cm2に
つき最低５×104、好ましくは最低7.7×104細胞の密度
で播種し、播種から２時間内に移植片表面上に融合単層
を形成せしめる。現在のところ1cm2につき範囲１−３ま
たは約２×105細胞で播種することが好ましい。微小血
管内皮細胞が本発明の範囲内にあるとはいえ、２または
それ以下の通過で短時間培養されたヒト成内皮細胞を
（そのような細胞が容易に手に入る場合には）使用する
こともできる。生成した移植片は自家内皮細胞の内皮内
張りを有するからその開放性特に移植後の重要な初期の
時期における開放性は著しく改善すると期待される。静
脈移植物のために、およびそうでなければ開放性率がが
つかりする程低い直径4mm以下の血管（小口径移植片）
に主題の移植片を使用することが期待される。 “ダクロン”は、EIデュポン・ドウ・ネマーズ・アン
ド・カンパニー（ウイリントン・デエラウエア）の商標
であり、それはメチルテレフタレートとエチレングリコ
ールとの縮合産物である特殊のポリエチレン・テレフタ
レートポリエステルを指すために用いられる。一般当業
者の人々は、ここに添付の特許請求の範囲により詳しく
定められる本発明の範囲から逸脱することなくここに記
載の方法および操作法から種々の変更を行い得ることは
当然である。 ここに用いた丸石（cobblestone）という語は例えば
ウシ大静脈の培養内皮細胞があらわす典型的対称的な内
皮細胞・細胞間（cell−cell）形態（当業者は“true c
obblestone"と言う場合もある）にも、細胞は一般的に
丸いが突起とかその他の非対称的部分のある細胞形態に
も用いられる。特にこの出願に用いた場合丸石（cobble
stone）という語は、ち密な細胞・細胞間（cell to cel
l）結合をした、すなわち下にある層を最大に覆うよう
に薄くのびる内皮細胞の集団を指す。 〔発明の効果〕 本発明によれば、比較的質の良い移植物体を容易に提
供することができる。
【図面の簡単な説明】
第１図は、本発明にしたがつて使用するためのヒト微小
血管内皮細胞を得るための段階を示す線図である。 第2A図及び第2B図は、チミジン標識化ヒト成内皮細胞
（HAEC）の、未処理（2A図）、および多血小板血漿処理
（2B図）のダクロンポリエステル移植片への粘着を、移
植時から24時間に互つて説明する図である。 第３図は、IV−Ｖ型コラーゲン表面層を備えたコラーゲ
ンラミネートを有する本発明の移植片を作る好ましい方
法を説明する線図である。 第４図はヒト成内皮細胞の、未処理ダクロン移植片への
粘着を示す図である；内皮細胞を放射性標識化し、細胞
結合をここに記載のように定量した。指示された時間
に、上澄液に遊離している内皮細胞（三角形のプロツ
ト）を定量した。それから移植片の表面をパスツールピ
ペツトから培地を表面に強くかけることによつて洗いゆ
るく結合している細胞（四角いプロツト）およびしつか
り粘着している細胞（丸いプロツト）を定量した。短時
間培養し最小にトリプシン消化された内皮細胞は、未処
理ダクロンに時間に依存して粘着した。 第５図は、ヒト成内皮細胞の、未処理ダクロン、多血小
板血漿処理ダクロンまたはヒト羊膜処理ダクロンへの粘
着を比較する特性図である。ダクロンに蛋白質面を作り
つけると、内皮細胞の表面への粘着は加速する。PRPプ
ロツトは、ダクロン上に多血小板血漿が凝固することに
より生成した面をあらわす。AMNION（羊膜）プロツト
は、非細胞性羊膜のダクロン表面ヘの結合から生じる表
面を明らかにする。羊膜の基礎膜表面はダクロン表面か
ら離れた方に向いている。PLAINプロツトは未処理ダク
ロン織物に関するものである。細胞の粘着はここに記載
のように定量した。 第６図は、血漿被覆ダクロンへの最初の粘着において提
供者毎に差のある微小血管内皮細胞の特性図である。新
たに分離した微小血管内皮細胞を血漿被覆ダクロンに１
時間播種した。簡単に洗つた後移植片をギルのヘマトキ
シンで染色し、粘着内皮細胞を数えた。提供者＃８およ
び＃９は＃１、２、４、５、６、７、に比べて統計的に
有意に増加した粘着を示し＃３は、Student tテストで
検定した場合＃１、２、４、５、７と異なる。 第７図は、インジウム111標識化微小血管ECの血漿被覆
ダクロンへの粘着の一時的経過を示す特性図である。EC
を示した時間移植片表面と結合させ、その後ここに記さ
れるように、粘着しなかつた細胞を除去する。放射能標
識化細胞は60分間は速い粘着速度を示し、その後最後の
120分の粘着測定までは速度が減少する。データはサン
プルの平均±標準偏差をあらわす。 第８図は、血漿処理ダクロンに播種した微小血管内皮細
胞が、広範囲の剪断速度にさらされた後、移植片に永久
的に粘着して残つている部分を示す特性図である。分離
したばかりの微小血管内皮細胞を血漿被覆ダクロン上に
１時間播種した。簡単に洗つた後、濯流液として培養培
地を用いて、移植片を２時間流れの条件にさらした。移
植片上に残つた内皮細胞を数え、同じように播種したが
流れにさらさなかつた対照移植片と比較した。直線回帰
分析を用いる統計的評価はγ−値が−0.26でｙ＝91−0.
33×をあらわした。 Ａ……脂肪、Ｂ……細切片、Ｃ……血管ペレツト。
血管内皮細胞を得るための段階を示す線図である。 第2A図及び第2B図は、チミジン標識化ヒト成内皮細胞
（HAEC）の、未処理（2A図）、および多血小板血漿処理
（2B図）のダクロンポリエステル移植片への粘着を、移
植時から24時間に互つて説明する図である。 第３図は、IV−Ｖ型コラーゲン表面層を備えたコラーゲ
ンラミネートを有する本発明の移植片を作る好ましい方
法を説明する線図である。 第４図はヒト成内皮細胞の、未処理ダクロン移植片への
粘着を示す図である；内皮細胞を放射性標識化し、細胞
結合をここに記載のように定量した。指示された時間
に、上澄液に遊離している内皮細胞（三角形のプロツ
ト）を定量した。それから移植片の表面をパスツールピ
ペツトから培地を表面に強くかけることによつて洗いゆ
るく結合している細胞（四角いプロツト）およびしつか
り粘着している細胞（丸いプロツト）を定量した。短時
間培養し最小にトリプシン消化された内皮細胞は、未処
理ダクロンに時間に依存して粘着した。 第５図は、ヒト成内皮細胞の、未処理ダクロン、多血小
板血漿処理ダクロンまたはヒト羊膜処理ダクロンへの粘
着を比較する特性図である。ダクロンに蛋白質面を作り
つけると、内皮細胞の表面への粘着は加速する。PRPプ
ロツトは、ダクロン上に多血小板血漿が凝固することに
より生成した面をあらわす。AMNION（羊膜）プロツト
は、非細胞性羊膜のダクロン表面ヘの結合から生じる表
面を明らかにする。羊膜の基礎膜表面はダクロン表面か
ら離れた方に向いている。PLAINプロツトは未処理ダク
ロン織物に関するものである。細胞の粘着はここに記載
のように定量した。 第６図は、血漿被覆ダクロンへの最初の粘着において提
供者毎に差のある微小血管内皮細胞の特性図である。新
たに分離した微小血管内皮細胞を血漿被覆ダクロンに１
時間播種した。簡単に洗つた後移植片をギルのヘマトキ
シンで染色し、粘着内皮細胞を数えた。提供者＃８およ
び＃９は＃１、２、４、５、６、７、に比べて統計的に
有意に増加した粘着を示し＃３は、Student tテストで
検定した場合＃１、２、４、５、７と異なる。 第７図は、インジウム111標識化微小血管ECの血漿被覆
ダクロンへの粘着の一時的経過を示す特性図である。EC
を示した時間移植片表面と結合させ、その後ここに記さ
れるように、粘着しなかつた細胞を除去する。放射能標
識化細胞は60分間は速い粘着速度を示し、その後最後の
120分の粘着測定までは速度が減少する。データはサン
プルの平均±標準偏差をあらわす。 第８図は、血漿処理ダクロンに播種した微小血管内皮細
胞が、広範囲の剪断速度にさらされた後、移植片に永久
的に粘着して残つている部分を示す特性図である。分離
したばかりの微小血管内皮細胞を血漿被覆ダクロン上に
１時間播種した。簡単に洗つた後、濯流液として培養培
地を用いて、移植片を２時間流れの条件にさらした。移
植片上に残つた内皮細胞を数え、同じように播種したが
流れにさらさなかつた対照移植片と比較した。直線回帰
分析を用いる統計的評価はγ−値が−0.26でｙ＝91−0.
33×をあらわした。 Ａ……脂肪、Ｂ……細切片、Ｃ……血管ペレツト。
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フロントページの続き
(72)発明者 ブルース・エバンズ・ジアレール
アメリカ合衆国、ペンシルバニア州、フ
イラアデイルフイア、マーチンス レイ
ン 8101
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．ヒト患者に移植するための人工移植物体であつて、 合成基質と表面層とを含んで成り、上記表面層がIV/V型
コラーゲンおよび／または少なくとも約50％融合して存
在するヒト内皮細胞から成るものであることを特徴とす
る人工移植物体。 ２．上記人工移植物体は、更に中間蛋白質層を含むもの
である特許請求の範囲第１項記載の人工移植物体。 ３．上記蛋白質層が、上記基質と上記IV/V型コラーゲン
の表面層との間に位置する間質性コラーゲン層である特
許請求の範囲第２項記載の人工移植物体。 ４．上記移植物体は、上記基質を上記表面層に結合する
結合剤を含んでいるものである特許請求の範囲第１項記
載の人工移植物体。 ５．上記結合剤が、グルタールアルデヒドであり、上記
グルタールアルデヒドの遊離アルデヒド基が、結合後著
しく不活性化されるものである特許請求の範囲第４項記
載の人工移植物体。 ６．上記間質性コラーゲン層および上記IV−Ｖ型コラー
ゲンの表面層がヒト漿尿膜から成る薄膜である特許請求
の範囲第３項記載の人工移植物体。 ７．上記内皮細胞が、培養されない自家内皮細胞である
特許請求の範囲第１項乃至第６項記載の人工移植物体。 ８．上記内皮細胞が、移植前に融合するものである特許
請求の範囲第１項乃至第７項記載の人工移植物体。 ９．上記内皮細胞が、ほとんど平らで、且つ丸石（cobb
lestone）の形態を示す自家内皮細胞である特許請求の
範囲第１項乃至第８項記載の人工移植物体。 １０．上記内皮細胞が、脂肪誘導内皮細胞である特許請
求の範囲第１項乃至第９項記載の人工移植物体。 １１．上記内皮細胞が、微小血管内皮細胞である特許請
求の範囲第１項乃至第10項記載の人工移植物体。 １２．上記人工移植物体が、たつた約4mmの内径を有す
る血管移植片の表面である特許請求の範囲第１項乃至第
11項記載の人工移植物体。 １３．ヒト患者に移植するための移植物体を処理する方
法であつて、 （ａ） 合成基質材料を用意すること、 （ｂ） 間質性コラーゲン層を上記基質材料に結合させ
ること、 （ｃ） IV/V型コラーゲン表面層を上記間質性コラーゲ
ン層に結合させること、 （ｄ） 上記IV/V型コラーゲン表面層にヒト内皮細胞
を、移植前に少なくとも50％の融合で粘着させること を含んでいることを特徴とする人工移植物体の製造方
法。 １４．上記コラーゲン層を、結合後および移植前は不活
性化される結合剤を用いて結合する特許請求の範囲第13
項記載の人工移植物体の製造方法。 １５．上記IV/V型コラーゲン表面層が、ヒト漿尿膜から
成る薄膜を上記コラーゲン層に結合することによつて結
合されるものである特許請求の範囲第13項記載の人工移
植物体の製造方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US06/742,086 US4820626A (en) | 1985-06-06 | 1985-06-06 | Method of treating a synthetic or naturally occuring surface with microvascular endothelial cells, and the treated surface itself |
| US742086 | 1985-06-06 | ||
| US84845386A | 1986-04-04 | 1986-04-04 | |
| US848453 | 1986-04-04 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| JP (1) | JP2686930B2 (ja) |
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| DE (2) | DE206025T1 (ja) |
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