DE3650134T2

DE3650134T2 - Beschichtung für Prothesen.

Info

Publication number: DE3650134T2
Application number: DE3650134T
Authority: DE
Inventors: Bruce Evans Jarrell; Stuart Konradd Williams
Original assignee: Thomas Jefferson University
Current assignee: Thomas Jefferson University
Priority date: 1985-06-06
Filing date: 1986-06-04
Publication date: 1995-06-22
Anticipated expiration: 2006-06-05
Also published as: CA1293700C; DE206025T1; ATE113850T1; EP0206025A2; JPS6249857A; EP0206025A3; AU590573B2; ES8900149A1; AU5830586A; MX165125B; IL78950A; IL78950A0; DE3650134D1; EP0518389A2; EP0206025B1; JP2686930B2; BR8602659A; ES555739A0; EP0518389A3

Description

Allgemeiner Stand der Technik

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet implantierbarer Prothesen zur Implantation in Menschen, und die Erfindung betrifft im besonderen künstliche Implantate, wie etwa Gefäßtransplantate, die heute allgemein dafür verwendet werden, große Venen bzw. Arterien menschlicher Patienten zu ersetzen. Ferner betrifft die Erfindung Behandlungen dieser Transplantate zur Verbesserung der endothelialen Zelladhäsion und/oder Proliferation an diesen Transplantaten.
Die Entwicklung der Idee prothetischer Gefäßtransplantate ist seit der Verwendung der ersten Transplantate vor mehr als 30 Jahren eine Hauptaufgabe der Gefäßchirurgie. Die meisten Annäherungen konzentrierten sich auf die Erzeugung einer thromboresistenten Oberfläche, wobei die Mehrzahl dieser Bemühungen auf eine verbesserte Polymeroberfläche gerichtet war. Bei der idealen Blut-Oberflächen-Zwischenfläche handelt es sich wahrscheinlich um natürlich auftretendes menschliches Endothelium. Beim Vorhandensein an einem prothetischen Transplantat würde es viele Vorteile eines natürlichen Gefässes aufweisen. Leider tritt die Endothelialisation bei der Plazierung prothetischer Transplantate in Menschen nur in beschränktem Maße auf, während eine Transplantat-Endothelialisaton bei Tieren auftritt. Das Impfen von Endothelzellen auf vorkoagulierte prothetische Transplantate vor der Implantation, verbesserte die Endothelzellenbedeckung von Tiertransplantaten, wobei diese Technik bei Menschen nur eingeschränkte Anwendung fand. Siehe "Human Adult Endothelial Cell Growth in Culture", Bruce Jarrell u.a., Journal of Vascular Surgery, Band 1, Nr. 6, Seiten 757-764 (November 1984); Herring u.a., "A Single and Staged Technique for Seeding Vascular Grafts with Autogenous Endothelium", Surgery, 1978, 84:498-504; Graham u.a., "Cultured Autogenous Endothelial Cell Seeding of Vascular Prosthetic Grafts", Surg Forum 30:204-6 (1979); Graham u.a. "Expanded Polytetrafluoroethylene Vascular Prostheses Seeded with Enzymatically Derived and Cultured Canine Endothelial Cells", Surgery 91:550-9 (1982) und Dilley u.a., "Endothelial Seeding of Vascular Prostheses", Jaffe ed Biology of Endothelial Cells, The Hague: Martinus Nijhoff, 1984, Seiten 401- 11.
In den letzten drei Jahrzehnten wurden künstliche Transplantate zur sofortigen Wiederherstellung des Blutstroms in Bereiche einer Ischämie als Folge einer atherosklerotischen Gefäßerkrankung verwendet. Außerdem wurden die Transplantate für einen Gefäßzugang für die Hemodialyse in Patienten mit chronischem Nierenversagen sowie bei der Wiederherstellung arterieller Aneurysmen verwendet. Diese Transplantate erwiesen sich bei der Wiederherstellung der Durchblutung ischämischer Gewebe zwar als erfolgreich, doch ist die langfristige Prognose bezüglicher dieser Transplantate nicht ermutigend. Nach einem längeren Zeitraum verlieren die Transplantate mit einem kleineren Durchmesser als 4 mm ihre Durchgängigkeit, da sie durch Faserstoffablagerungen und Zelladhäsion verstopft werden. Siehe Dilley oben. Dieser Vorgang erscheint als sekundär und ist wohl teilweise auf der thrombogenen Eigenschaft der nackten (d.h. nicht endothelialisierten) Oberfläche der implantierten Prothesen begründet. Siehe Berger u.a., "Healing of Arterial Prostheses in Man: It's Incompleteness", Ann. Surg. 175:118-27 (1972). Demgemäß richtet sich ein Großteil der aktuellen Forschungsarbeit entweder auf (1) die Entwicklung von Transplantaten mit einer künstlichen, nicht-thrombogenen Oberfläche, oder (2) auf die Auskleidung von Gefäßprothesen mit menschlichen Endothelzellen, in der Hoffnung der Erzeugung einer nicht-thrombogenen Endothelzellenoberfläche, wie diese etwa in natürlichen menschlichen Gefässen existiert.
Die Kulturen tierischer Endothelzellen werden seit den zwanziger Jahren untersucht. 1973 gelang es Jaffe u.a. aus menschlichen umbilikalen Venen erfolgreich Endothelzellen zu züchten, wobei diese Zellen funktionell charakterisiert worden sind. Siehe Jaffe u.a., "Synthesis of Antihemophilia Factor Antigen by Cultured Human Endothelial Cells", J. Clin. Invest. 55:2757:64 (1973); und Lewis, "Endothelium in Tissue Culture", Am. J. Anat. 30:39-59 (1922); Jaffe u.a. "Culture of Human Endothelial Cells Derived From Umbilical Veins", J. Clin. Invest. 52:2745-56 (1973). Diese Zellkulturen demonstrieren ein Wachstumspotential, wobei die Gesamtanzahl der aus einer einzigen umbilikalen Vene erzeugbarer Zellen für gewöhnlich ziemlich begrenzt ist und im Bereich einer 10-100fachen Erhöhung geernteter Endothelzellen liegt.
Zur Erhöhung der Anzahl von Zellen, die bei der Verwendungg menschlicher umbilikaler Venen als Endothelzellen erzeugt werden, wurden zwar mehrere Techniken vorgeschlagen, doch bleibt die Fähigkeit der Kultivierung von Endothelzellen in einer großen Anzahl weiterhin nicht ideal. Bei einigen Untersuchungen konnte bei der Kultivierung von Endothelzellen erwachsener Menschen aus Lungenarterien und Lungenvenen ein gewisser Erfolg verzeichnet werden, jedoch nur über sehr kurze Zeiträume. Ferner wurde gezeigt, daß Endothelzellen aus menschlichen Darmbeinarterien für eine geringe Anzahl von Durchgängen kultiviert werden können. In einer Untersuchung von Glassberg u.a. wird zum Beispiel berichtet, daß 50 bis 500 lebensfähige Zellen je Gefäßsegment einer Größe von 5 Inch erzielt werden können, wobei es sich dabei um einen sehr geringen Ertrag handelt. "Cultured Endothelial Cells Derived From Human Iliac Arteries", In Vitro 18:859-66 (1982). Fry u.a. berichteten über die erfolgreiche Kultivierung von Endothelialzellen menschlicher Erwachsener aus Baucharterien, die zum Zeitpunkt der Spenderleichennephrektomie entfernt werden, wobei diese Zellen ebenfalls nur eine beschränkte Proliferationsfähigkeit offenbarten.
Aus den bestehenden Techniken wird deutlich, daß es schwierig ist, genug Zellen zur Vorendothelialisierung eines Transplantats mit einer angemessenenen Gefäßmenge des Spenders zu erzeugen. An Stelle der vollständigen Endothelialisierung eines Transplantats vor der Implantation, entwickelte sich das Konzept der Unterhöhlen-"Beimpfung" eines vorkoagulierten Transplantats. Es hat sich vor kurzem gezeigt, daß die Beimpfung von Gefäßtransplantaten mit autogenen Endothelzellen den Grad der endothelialen Bedeckung der Transplantate von Versuchstieren erhöht. Siehe Herring u.a. sowie Graham u.a. oben. Nach der Beschichtung mit Endothelium haben sich Transplantate in Hunden bei einer Messung der Blutplättchenreaktivierung als weniger thrombogen erwiesen, wobei die Transplantate auch gegen eine Beimpfung bluterzeugter bakterieller Expositionen widerstandsfähiger sind, und wobei sie die verlängerte Durchgängigkeit von Gefäßtransplantaten mit geringen Durchmessern aufweisen. Siehe Sharefkin u.a., "Early Normalization of Platelet Survival by Endothelial Seeding of Dacron Arterial Prostheses in Dogs", Surgery 92:385-93 (1982); Stanley u.a., "Enhances Patency of Small Diameter Externally Supported Dacron Iliofemoral Grafts Seeded with Endothelial Cells", Surgery 92:994-1005 (1982); und Watkins u.a., "Adult Human Saphenous Vein Endothelial Cells: Assessment of Their Reproductive Capacity for Use in Endothelial Seeding of Vascular Prostheses", J. Surg. Res. 36:558-96 (1984).
Ein Hauptproblem bei der Umsetzung auf das Beimpfen menschlicher Transplantate war die Fähigkeit zur Erzeugung einer ausreichenden Anzahl von Endothelzellen bei der Verwendung menschlichen Gefäßgewebes, um eine Beimpfung in einer Dichte zu ermöglichen, die ausreicht, um das Transplantat endothelial zu bedecken. Watkins u.a., die nach einer Herzkranzarterien-Bypassoperation menschliche Wadenvenenreste verwendeten, gelang es, geringe Mengen von Endothelzellen als Kulturen zu erzeugen, wobei nach 4 bis 6 Wochen eine 100fache Erhöhung konfluenter kultivierter Zellen erreicht wurde.
Selbst wenn es möglich wäre, die Anzahl der durch starke Kultivierungstechniken erzielbaren Endothelzellen wesentlich zu erhöhen, bleiben immer noch Bedenken bezüglich der "Gesundheit" dieser Endothelzellen nach 40 bis 50 Populationsverdoppelungen zurück. Die Inkubation solcher Zellen in Kulturen, die sich in einer zu ihrer natürlichen Umgebung fremden Umgebung befinden, wirft ferner weitere Bedenken bezüglich genetischer Veränderungen und/oder einer Kontamination des Patienten mit Viren, Toxinen oder anderen schädlichen Stoffen auf.
In der Literatur existieren viele Vorschläge bezüglich Endothelialisationsverfahren. Die Untersuchungen auf diesem Gebiet wurden durch die vielfältigen Eigenschaften des Endothelium an sich verkompliziert sowie durch die Unterschiede von Spezies zu Spezies, die in Verbindung mit dem Verhalten und den Eigenschaften des Endotheliums stehen. Fishman "Endothelium: A Distributed Organ of Diverse Capabilities", Annals of New York Academy of Sciences, Seiten 1-8 (1982); Sauvage u.a., "Interspecies Healing of Porous Arterial Prostheses", Arch Surg. 109:698-705 (1974); und Berger, "Healing of Arterial Prostheses in Man: Its Completeness", oben. Desweiteren gibt es in der Literatur zahlreiche Berichte über Versuche, die das Beimpfen von Endothelzellen an verschiedenen Transplantaten und in verschiedenen Spezies umfassen, wobei sich unterschiedliche Ergebnisse ergaben. F. Hess u.a., "The Endothelialization Process of a Fibrous Polyurethan Microvascular Prostheses After Implantation in the Abdominal Aorta of the Rat", Journal of Cardiovascular Surgery, Band 24, Nr. 5, Seiten 516-524 (September-Oktober 1983); W.K. Nicholas u.a., "Increased Adherences of Vascular Endothelial Cells to Biomer Precoated with Extracellular Matrix", Trans. Am. Soc. Artif. Intern Organs, 28:208-212 (1981); C.L Ives u.a., "The Importance of Cell Origin and Substrate in the Kinetics of Endothelial Cell Alignment in Response to Steady Flow", Trans. Am. Soc. Artif. Intern Organs, 29:269-274 (1983); L. M. Graham u.a., "Expanded Polytetrafluoroethylene Vascular Prostheses Seeded with Enzymatically Derived and Cultured Canine Endothelial Cells", Surgery, Band 91, Nr. 5, Seiten 550-559 (1982); S. G. Eskin u.a., "Behavior of Endothelial Cells Cultured on Silastic and Dacron Velour Under Flow Conditions In Vitro: Implications for Prelining Vascular Grafts with Cells", Artificial Organs, 7(1):31-37 (1983); T. A. Belden u.a., "Endothelial Cell Seeding of Small- Diameter Vascular Grafts", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 28:173-177 (1982); W. E. Burkel u.a., "Fate of Knitted Dacron Velour Vascular Grafts Seeded with Enzymatically Derived Autologous Canine Endothelium", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 28:178-182 (1982); M. T. Watkins u.a., "Adult Human Saphenous Vein Endothelial Cells: Assessment of Their Reproductive Capacity for Use in Endothelial Seeding of Vascular Prostheses", Journal of Surgical Research, 36:588-596 (1984); M. B. Herring u.a., "Seeding Arterial Prostheses with Vascular Endothelium", Ann. Surg., Band 190, Nr. 1, Seiten 84-90 (Juli 1979); A. Wesolow, "The Healing of Arterial Prostheses - The State of the Art", Thorac. Cardiovasc. Surgeon, 30:196-208 (1982); T. Ishihara u.a., "Occurence and Significance of Endothelial Cells in Implanted Porcine Bioprosthetic Valves", Amercian Journal of Cardiology, 48:443-454 (September 1981); W. E. Burkel u.a., "Fate of Knitted Dacron Velour Vascular Grafts Seeded with Enzymatically Derived Autologeous Canine Endothelium", Trans. Am. Soc. Artif. Intern. Organs, 28:178-182 (1982).
Ein Anzahl von Schriften, deren Co-Autor der Miterfinder Stuart Williams ist, beziehen sich auf die Isolierung und die Funktionsweise von Mikrogefäß-Endothelzellen von Ratten, einschließlich der von verschiedenen Geweben abgeleiteten Zellen, wie etwa von Nebenhodenfett. Zu diesen Veröffentlichungen gehören: Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 78 (4) :2392-2397 (1981); Microvascular Research, 21:175-182 (1981); Anal. Biochemistry, 107:17-20 (1980); Microvascular Research, 19:127-130 (1980); Microvascular Research, 18:175-184 (1979); Annals of the New York Academy of Sciences, 457-467 (1983); Microvascular Research, 28: 311-321 (1984); Journal of Cellular Physiology, 120:157-162 (1984); und Journal of Neurochemistry, 35(2):374-381 (1980). Siehe auch Microvascular Research, 27:14-27 (1984), das sich auf die Erzeugung und Verwendung von Fluoreszen-Protein-Konjugaten für die Mikrogefäßforschung bezieht.
Kern u.a. berichten über die Isolierung menschlicher Mikrogefäß- Endothelzellen, und sie geben an, daß diese in Funktionsuntersuchungen in Kulturen angelegt und verwendet werden können. Kern u.a., J. Clin. Invest., 71:1822-1829 (1983).
In Madri und Williams, "Capillary Endothelial Cell Cultures: Phenotypic Modulation by Matrix Components", Journal of Cell Biology, 97:153-165 (1983), ist die Isolierung und Kultur kapillarer Endothelzellen aus Ratten-Nebenhodenfett in Medien offenbart, die durch Endothelzellen einer Rinderaorta und Substrate vorbehandelt werden, die Zwischen- bzw. Basalmembrankollagene umfassen, zu denen die Kollagene der Typen I/III und IV/V gehören. Diese Schrift lehrt, daß die Zellen bei einem Wachstum an Zwischenkollagenen einer Proliferation unterliegen, so daß sie eine ununterbrochene Zellschicht bilden, und wobei die Zellen bei einer Züchtung über längere Zeiträume einzelne rohrförmige Strukturen bilden. Ferner wird offenbart, daß diese Zellen bei einem Wachstum an Basalmembrankollagenen nicht proliferieren, sondern sich anhäufen und früh rohrförmige Strukturen bilden.
Ebenfalls von Interesse ist William u.a., "Adult Human Endothelial Cell Compatibility with Prosthetic Graft Material", Journal of Surgical Research, 38:618-629 (1985). Eine Zusammenfassung dieses Schriftstücks wurde bei dem jährlichen Treffen der Association for Academic Surgery vom 31. Oktober bis 3. November 1984 vorgelegt. Das Dokument an sich wurde der Redaktion der Association bei diesem Treffen zugeleitet, so daß es schließlich ungefähr im August 1985 erscheint. In dem Schriftstück von Williams u.a. wird über die Auswirkungen eines Überzugs des prothetischen Transplantatmaterials mit einer extrazellulären Matrix (Kollagen vom Typ I/III), Fibronectin oder Plasma berichtet. Die höchste Adhäsionsdichte wurde an mit Kollagen beschichteten Dacron-Transplantaten beobachtet, wobei diese Dichte der Zelldichte entsprach, die bei konfluenten Monoschichten von HAEC beobachtet wird, die an mit Gelatine beschichtetem Kulturkunststoff gewachsen sind. Jarrell u.a., "Human Adult Endothelial Cell Growth in Culture", Journal of Vascular Surgery, 1(6):757-764 (November 1984) umfaßt eine Offenbarung, die der Offenbarung der rückverwiesenen Anmeldung entspricht, die in der vorliegenden Anmeldung durch Verweis enthalten ist. Ferner wird auf die Erörterung mit dem Miterfinder Jarrell hingewiesen, die auf den Seiten 762-764 erscheint und sich auf die Endothelzellen von Kapillargefäßen in Fett bezieht.
In einer Vielzahl von Veröffentlichungen werden die Impftechniken unter Verwendung von Transplantaten beschrieben, die mit Fibronectin, Plasma oder Kollagen vorbehandelt worden sind. In Eskin u.a., "Behavior of Endothelial Cells Cultured on Silastic and Dacron Velour Under Flow Conditions In Vitro: Implications for Prelining Vascular Grafts with Cells", Artificial Organs, 7(1):31-37 (1983), sind Versuche über gewebegezüchtete Endothelzellen der Rinderaorta offenbart, die in einem Laborversuch der Strömung in einer Kreislaufschleife ausgesetzt waren, die zur Stimulierung der Strömung und der Druckzustände in der Aorta gestaltet war. Eskin u.a. erläutern, daß an biologischen Substraten gezüchtete Endothelzellen nichtthrombogen sind, wenn sie als Blutkontaktoberflächen implantiert werden, wobei diese Technik für klinische Anwendungen noch nicht anwendbar ist, da die beiden erforderlichen chirurgischen Vorgänge (einer für die Zellernte und der zweite für die Zellimplantation, mit einer Interventiosperiode für das Zellwachstum im Labor) und die Zellen, die in einer stationären Umgebung gezüchtet werden, zumindest teilweise entfernt werden, wenn sie strömendem Blut ausgesetzt werden. Eskin u.a. zitieren "neuere Untersuchungen", wobei die Transplantate mit bluthaltigen, frisch geernteten autologen Endothelzellen vorkoaguliert werden, wobei diese eine bessere Durchgängigkeit als die Transplantate aufweisen, die nur mit Blut vorkoaguliert worden sind. Dies zeigt, daß die Zellernte und die Implantation in einem Vorgang ausgeführt werden können, ohne daß eine Zwischenperiode für die Kultivierung der Zellen erforderlich ist, wodurch die Technik für klinische Anwendungen als Mittel zur Erzeugung einer nicht-thrombogenen Oberfläche anwendbar ist.
In "Adult Human Saphenous Vein Endothelial Cells: Assessment of their Reproductive Capacity for Use in Endothelial Seeding of Vascular Prostheses", von Watkins u.a., Journal of Surgical Research, 36:588-596 (1984), wird über die autogene endotheliale Beimpfung von Gefäßprothesen unter Verwendung venöser Endothelzellen derart berichtet, daß dadurch die Blutplättchen- Prothesen-Wechselwirkungen reduziert und die Durchgängigkeitsgrade in Prothesen mit geringen Durchinessern in Hunden verbessert werden. Die Daten aus den Hundeversuchen geben zwar Anlaß zu der Vermutung, daß eine autogene endotheliale Beimpfung auch für den Menschen hilfreich ist, jedoch werden auch mehrere Nachteile dieses Verfahrens erläutert. Zu diesen Nachteilen gehören das zur Verfügung stehen langer peripherer Venen, Abweichungen der verschiedenen für das Verfahren verwendeten Anteile an Rohkollagenase und das Fehlen des erforderlichen Beweises dafür, daß die Wachstumskapazität venöser Endothelzellen groß genug ist, um eine autogene endotheliale Beimpfung mit Endothelzellen von nur einem geringen Teil der zur Verfügung stehenden peripheren Venen auszuführen. Die ausgeführten Versuche führen zu dem Schluß, daß das Wachstumspotential von Endothelzellen aus der Vena saphena eines erwachsenen Menschen "theoretisch entweder für die sofortige interoperative autogene endotheliale Impfung oder für das Vorimplantationswachstum von Endothelzellauskleidungen an Gefäßprothesen durch Kulturverfahren geeignet ist". Die Ergebnisse erfüllen zwar eine Bedingung für den Versuch am Menschen, doch kommen die Autoren zu dem Schluß, "daß die Ergebnisse aus verschiedenen Gründen nicht dafür ausreichen, darzustellen, daß ein solcher Versuch erfolgreich verlaufen würde".
In den vergangenen Jahren galt das Interesse den schlechten Ergebnissen, die im allgemeinen bei Gefäßtransplantaten mit geringen Durchmessern erzielt wurden. Diese Transplantate, die allgemein dadurch gekennzeichnet sind, daß sie Innendurchmesser von 4 mm oder weniger aufweisen, werden im allgemeinen nicht verwendet. van Wachemet u.a., "Interaction of Cultured Human Endothelial Cells with Polymeric Surfaces of Different Wettabilities", Biomaterials, 6:403-408 (November 1985), berichten, daß der Erfolg synthetischer Polymertransplantate mit verhältnismäßig großen Innendurchmessern (größer oder gleich 4 mm) auch trotz einer erzeugten biologischen Auskleidung, die "kaum thrombogen" ist, erzielt wird. Eine starke Durchblutung sowie eine Therapie mit Antikoagulantien werden zur Vermeidung eines Verschlusses durch eine weitere Thrombosebildung an der Transplantatoberfläche vorgeschlagen, ungeachtet der Tatsache, daß solche Transplantate mit großem Durchmesser für gewöhnlich mit Blut vorkoaguliert werden, um eine Undichtigkeit zu verhindern, wobei eine ziemlich thrombogene Oberfläche verbleibt. Die klinischen Ergebnisse mit Transplantaten mit geringen Durchmessern werden als "enttäuschend" bezeichnet, und zwar hauptsächlich wegen des "sofortigen Verschlusses der Transplantate". Bei Hunden hat sich bezüglich dem Beimpfen von Endothelzellen auf Transplantate mit großen und mit kleinen Durchmessern gezeigt, daß dies zu einer vollständigen endothelialen Auskleidung von einem bis zu vier Monaten führte.
Da davon ausgegangen wird, daß Gefäßendothelium eine einzigartige nicht-thrombogene Oberfläche darstellt, werden die Endothelzellen als "die erste logische Wahl für die Auskleidung von Gefäßtransplantaten mit geringen Durchmessern" bezeichnet. Bezüglich einer systematischen Untersuchung der Interaktion der Endothelzellen und Polymere mit unterschiedlichen Oberflächeneigenschaften wird angenommen, daß diese zu "der Entwicklung von Transplantaten führen kann, die eine Wucherung von Endothelzellen fördern". In diesem Zusammenhang berücksichtigen van Wachem u.a. die Oberflächenbenetzbarkeit bestimmter Materiale, welche die Adhäsion und Proliferation bestimmter Arten von Zellen von Säugetieren anscheinend beeinflussen, wobei die Zelladhäsion vorzugsweise an wasserbenetzbaren Oberflächen auftritt. Wenn in dem Kulturträger Serum vorhanden ist, so wird vorgeschlagen, daß die Zelladhäsion an benetzbaren Substraten durch die Adsorption der Serumproteine in die Substrate beeinflußt wird. Wenn die Zelladhäsion in einem serumfreien Träger untersucht wird, so kann die Adsorption von aus den Zellen stammenden Proteinen auf benetzbare Substrate von Bedeutung sein.
Van Wachem u.a. stellen fest, daß Endothelzellen auf Glas und benetzbarem Gewebekulturpolystyrol kultiviert werden können, wobei es sich um eine mit Polystyrol behandelte Glimmentladung handelt. Van Wachem u.a. schlagen somit die Prüfung der Adhäsion und Proliferation menschlicher Endothelzellen an einer Anzahl von Polymeren mit unterschiedlichen Benetzbarkeiten in einem serumhaltigen Kulturträger vor.
Siehe zusätzlich zu den oben angeführten Artikeln auch Hess u.a., "The Endothelialization Process of a Fibrous Polyurethane Microvascular Prostheses After Implantation in the Abdominal Aorta of the Rat", Journal of Cardiovascular Surgery, 24(5):516- 524 (1983), worin über die Erzeugung vollständig endothelialisierter Prothesen am 21. Tag berichtet wird, und zwar unter Verwendung einer faserförmigen Mikrogefäß- Polyurethanprothese.
Die folgenden Veröffentlichungen sind bezüglich ihrer Offenbarungen in bezug auf Techniken zum Züchten von Endothelzellen von besonderem Interesse. Das Interesse bei Azizkhan u.a. gilt der Offenbarung in bezug auf kapillare Endothelzellen von Rindern aus der Retorte sowie deren Wanderansprechverhalten auf einen von den Mastzellen freigesetzten Faktor. Die Veröffentlichungen von Roblin u.a. und Yang u.a. sind bezüglch ihrer Offenbarungen von Faktoren von Interesse, die das Wachstum bestimmter Säugetier-Zellkulturen bewirken. Bei Thorton u.a. gilt das Interesse der Offenbarung der Wirkung von Heparin auf das menschliche Endothelzellwachstum, einschließlich der Kultivierung menschlicher Endothelzellen der umbilikalen Vene. Thorton u.a. lehren, daß die Vorgänge zur seriellen Subkultivierung im Vergleich zu den vorher veröffentlichten Verfahren, den Ertrag der HUVE-Zellen um das 10&sup8;-fache und den Ertrag der Endothelzellen von Gefässen Erwachsener um das 10¹²-fache erhöhen können. Es wird davon ausgegangen, daß sehr kleine Mengen menschlichen Gefäßgewebes für die Erzeugung großer Mengen kultivierter Endothelzellen verwendet werden können, wodurch Probleme der menschlichen Pathologie in bezug auf das Endothelium durch ein Modell menschlicher Endothelzellen direkt behandelt werden kann. Ferner wird beschrieben, daß sich das Zellsystem für verschiedene klinische Anwendungen eignet, wie etwa für den Laborversuch gefäßaktiver Mittel und eine Beschichtung künstlicher Transplantatmateriale. Das Interesse bei Latera u.a. gilt der Offenbarung von Funktionen für Fibronectin-Hyaluronat und Heparin-Proteoglycane bei der Substratadhäsion von Bindegewebszellen. Maciag u.a. (1979) beschreiben ein menschliches Endothelzellen-Mytogen, das von den Rinderhypthalamusextrakten mit neutralem pH-Wert gewonnen wird. Der nervenabgeleitete Endothelzellen-Wachstumsfaktor (ECGF) hat demgemäß die Fähigkeit, ruhende menschliche Endothelzellen der umbilikalen Vene so zu stimulieren, daß sie in einer Kultur wachsen. Der Zusatz von ECGF in Kulturen mit geringer Impfdichte von HUV-Endothelzellen in fetalem Rinderserum führt demgemäß zu einem stark erhöhten Endothelzellwachstum im Vergleich zu reinem Serum. Maciag u.a. (1981) beschreiben das Wachstum menschlicher Endothelzellen an einer Fibronectinmatrix in einem Träger 199, der mit fetalem Rinderserum und Endothelzellen-Wachstumsfaktor ergänzt ist. Demgemäß stellen diese Veröffentlichungen und die Offenbarung in der rückverwiesenen verwandten Anmeldung den Stand der Technik in bezug auf die Bemühungen dar, die zur Kultivierung menschlicher Endothelzellen unternommen worden sind, und zwar insbesondere in bezug auf menschliche Endothelzellen großer Gefäße, wie etwa die Endothelzellen der menschlichen umbilikalen Vene (HUEC).
Trotz der auf diesem Gebiet erfolgten Arbeit, besteht weiterhin Bedarf nach einem einfachen und zuverlässigen Verfahren zur erfolgreichen Endothelialisation der Oberflächen von Implantaten im Menschen, wie etwa der Oberflächen von Gefäßtransplantaten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung sieht eine implantierbare Prothesenoberfläche zur Implantation in den menschlichen Patienten vor, mit einem synthetischen Substrat und einer Oberflächenschicht, wobei die Oberflächenschicht mikrovaskuläre Endothelzellen umfaßt, die in einer Konfluenz von mindestens 50% vorhanden sind. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel werden die Endothelzellen von menschlichem, mikrovaskulärem endothelzellenreichem Gewebe des Patienten abgeleitet, das von dem Gewebe getrennt wird und auf die Kollagenoberfläche vom Typ IV/V des Implantats aufgetragen wird, um auf der Oberfläche des zu behandelnden Implantats eine Konfluenz der Zellen von mindestens etwa 50% oder darüber vorzusehen. Die Erfindung sieht ferner ein Implantat mit einer gebundenen Kollagenoberflächenschicht vom Typ IV/V vor, die zur Förderung der Adhäsion und Proliferation der mikrovaskulären Endothelzellen des Patienten gut geeignet ist, wenn diese in hoher Dichte kurz vor der Implantation geimpft werden.
Das bevorzugte Implantat umfaßt ein synthetisches Substrat, eine oder mehrere Zwischenschichten des Kollagens vom Typ I/III und eine Kollagenoberflächenschicht vom Typ IV/V, auf welche die mikrovaskulären Endothelzellen aufgetragen werden. Das entsprechende Transplantat umfaßt somit ein Substrat, auf das ein Laminat aufgetragen wird, das mindestens eine obere Kollagenoberfläche vom Typ IV/V und eine darunterliegende Kollagenschicht vom Typ I/III umfaßt. Bei diesem Kollagenlaminat handelt es sich um ein zellfreies Laminat, das vorzugsweise von menschlichem Amnion abgeleitet wird. Das bevorzugte Implantat wird wie folgt präpariert. Ein synthetisches Substrat, wie etwa ein Polymersubstrat (z.B. ein Polyestersubstrat, wie etwa Dacron), wird unter Verwendung eines Glimmplasmareinigers behandelt, um die Transplantatoberfläche für die Kollagenbeschichtung vorzubereiten. Das durch diese Vorrichtung erzeugte Glimmplasma ätzt in die Transplantatoberfläche und erzeugt eine engere Verbindung zwischen dem Kollagen und dem Transplantat. Die Oberfläche des Transplantats wird danach mit einer Mischung aus Kollagen I und/oder III behandelt, das vom Rind bzw. vorzugsweise vom Menschen unter Verwendung herkömmlicher Verfahren präpariert worden ist, wie diese etwa bei Madri, "The Immunochemistry of Extracellular Matrix", Boca Raton, Florida, CRC Press, (1982) Band 1:75-90, beschrieben sind. Das resultierende Kollagen wird durch seine Löslichkeit in Essigsäure von verunreinigenden Proteinen getrennt. Ferner wird es durch seine andere Löslichkeit in hohen Natriumchloridkonzentrationen von anderen Matrixproteinen getrennt. Das Transplantatsubstrat wird dann mit der obengenannten Kollagenlösung weiter behandelt, wobei das Kollagen immer noch in Essigsäure gelöst wird, und wobei das Kollagen auf der Oberfläche und in dem Transplantat dadurch polymerisiert wird, daß der pH-Wert der Lösung durch den Zusatz eines neutralen Puffers erhöht wird. Bei 37ºC bildet sich ein Kollagengel, das danach mit Glutaraldehyd vernetzt wird. Dadurch wird das Gel stabilisiert und eine zusätzliche aldehydaktivierte Oberfläche erzeugt.
Danach ist das Transplantat für die Aufnahme eines von menschlichem Amnion abgeleiteten Kollagenlaminats bereit. Das Amnion wird von der menschlichen Plazenta abgeleitet, die gemäß den Verfahren von Liotta u.a. Cancer Letters, 11:141-152 (1980) präpariert ist. Das Amnion wird physikalisch von dem Chorion weggezogen und chemisch behandelt. Die Amnion-Endothelzellen werden dann physikalisch von der Amnionoberfläche abgezogen, wobei auf einer Seite ein zellfreier Stoff mit Basalmembrankollagen (Typen IV/V) und auf der anderen Seite ein Zwischenkollagen (Typen IV/V) verbleiben. Das Amnion wird in phosphatgepufferter Kochsalzlösung getränkt, bevor es auf das obengenannte behandelte Transplantatmaterial aufgetragen wird.
Das präparierte Kollagenlaminat wird danach auf die aldehydaktivierte Oberfläche des Transplantatmaterials gegeben, wobei das Kollagen I/III zu dem Transplantat gerichtet ist. Die Amnionschichtoberfläche kann eine Wechselwirkung eingehen und atomgebunden werden. Etwaige verbleibende freie Aldehydgruppen werden dann dadurch inaktiviert, daß das Transplantat mit einem Amin, einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer aldehydaktiven Amingruppe behandelt wird. Zur Zeit wird Lysin aufgrund der Löslichkeit von Lysin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bevorzugt. Die Basalmembranoberfläche des Amnions ist nun von dem Transplantat weg gerichtet und kann danach mit menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen zur Erzeugung einer Monoschicht behandelt werden. Das resultierende Transplantat kann durch Bestrahlung oder andere geeignete Techniken sterilisiert und bis zur Anwendung gelagert werden. Die Kollagenoberfläche vom Typ IV/V des Transplantats steht zur Aufnahme einer Beimpfung von Endothelzellen mit hoher Dichte bereit. Diese Beimpfung führt zur schnellen Bildung (innerhalb von 2 Stunden) einer scherbeständigen Endothelzellen-Monoschicht, die eine Kopfstein- Morphologie mit natürlichem Erscheinungsbild aufweist.
Ein gemäß den vorliegenden Verfahren vorbereitetes Transplantat wurde in einem Hund implantiert, um die Vena cava zu ersetzen. Unter normalen Umständen weist ein unbehandeltes Transplantat imme eine schnelle Koagulatbildung auf, wobei es häufig verstopft. Ein hoher prozentualer Anteil, eventuell sogar die Mehrzahl dieser Hunde stirbt an diesen Transplantaten, und zwar häufig innerhalb von zwanzig Minuten nach der Implantation. Bei dem Versuchstier wurde die gemäß den hier beschriebenen Techniken präparierte Vena cava nach zwei Tagen entfernt und diese zeigte dabei keinerlei Anzeichen, die einer unbestimmten Durchgängigkeit entgegenstehen.
Die Anmelder erkennen, daß menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen, das heißt, die von Kapillargefäßen, Arteriolen und kleinen Venen abgeleiteten Zellen, anstelle großer Gefäßzellen in geeigneter Weise funktionsfähig sind, obwohl zwischen Endothelzellen großer Gewebe und mikrovaskulären Endothelzellen in ihren natürlichen Geweben morphologische und funkionale Unterschiede existieren. Desweiteren sind mikrovaskuläre Endothelzellen in Körpergeweben, insbesondere in Fettgeweben, in übermäßigen Mengen vorhanden, wobei sie dazu verwendet werden können, einen Grad der Vorimplantations- Konfluenz (d.h. eine Konfluenz von mindestens 50%) zu erzeugen, welche die Prognose der meisten Implantate wesentlich verbessert. Zum Zwecke der weiteren Beschreibung wird Fettgewebe als beispielhafte Quelle mikrovaskulärer Endothelzellen bezeichnet, wobei hiermit jedoch festgestellt wird, daß Endothelzellen von anderen Gewebequellen ebenso verwendet werden können.
Ein Gefäßtransplantat bzw. ein anderes Implantat wird unter Verwendung mikrovaskulärer Endothelzellen, die von dem am Anfang des ununterbrochenen chirurgischen Vorgangs gewonnenen Fett getrennt sind, für eine Konfluenz behandelt. Nach der Erzeugung steriler Zustände wird Fettgewebe von dem Patienten entfernt. Die mikrovaskulären Endothelzellen in diesem Fett werden dann schnell von ihrem verwandten Gewebe durch enzymatische Digestion und Zentrifugation getrennt, wobei sie dazu verwendet werden, eine Oberfläche zu behandeln, die während späteren Stadien der gleichen Operation in den Patienten implantiert werden. Durch dieses Verfahren ist es nicht mehr nötig, erwachsene Endothelzellen zu kultivieren, um deren Anzahl zu erhöhen, wobei es das Verfahren ermöglicht, daß der Patient ein Transplantat empfangen kann, das bis zu einer Konfluenz mit dessen eigenen frischen, "gesunden" Endothelzellen bzw. über diese Konfluenz hinaus behandelt worden ist.
Gemäß dem bevorzugten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem mikrogefäßreichen Gewebe um perinephetisches Fett, subkutanes Fett, Omentum oder ein der Brusthöhle bzw. der Bauchfellhöhle zugeordnetes Fett. Dieses Gewebe wird dann unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms, wie etwa einer Kollagenase, die Caseanase und Trypsin umfaßt, einer Digestion unterzogen, wobei das Enzym solange mit dem Gewebe einer Inkubation unterzogen wird, bis sich die Gewebemasse zerlegt, wobei ein Gewebeaufschluß erzeugt wird. Die mikrovaskulären Endothelzellen werden dann unter Verwendung einer niedertourigen Zentrifugation von dem Aufschluß getrennt, so daß ein endothelzellenreiches Kügelchen erzeugt wird. Das Kügelchen wird mit einer gepufferten Kochsalzlösung gewaschen und es kann unter Verwendung eines kontinuierlichen Gradienten- Zentrifugationsverfahrens bzw. durch selektives Sieben weiter purifiziert werden. Die resultierenden mikrovaskulären Endothelzellen werden danach vorzugsweise in einer plasmaproteinhaltigen gepufferten Kochsalzlösung suspendiert, die vorzugsweise etwa 1% an Plasmaprotein aufweist. Diese Suspension, die volumenmäßig ein Kügelchen-Lösungs-Verhältnis von 1:5 bis 1:15, bzw. vorzugsweise 1:10 aufweist, wird dann zur Behandlung der Oberfläche verwendet, wobei die Zellen mit der Oberfläche solange einer Inkubation unterzogen werden, bis eine ausreichende Adhäsion der mikrovaskulären Endothelzellen an der Oberfläche auftritt, um eine Konfluenz von mindestens 50% vorzusehen. Als Ergebnis ist ein verbessertes Transplantat bzw. Implantat vorgesehen, das endothelialisierte Oberflächen aufweist, die entweder konfluent sind, oder die nach der Implantation verhältnismäßig schnell (innerhalb einer Populationsverdoppelung) eine Konfluenz erreichen.
Die anfänglichen prozentualen Anteile der Endothelzellenadhäsion sind zwar unter Verwendung von Prothesen mit Oberflächenschichten vom Typ IV/V im allgemeinen nicht so hoch, jedoch übertrifft die Morphologie der resultierenden Endothelzellschicht andere Morphologien bei weitem, die unter Verwendung anderer Prothesenobeflächen und/oder Oberflächenvorbehandlungen erzielt werden können. Die Verwendung mikrovaskulärer Endothelzellen ermöglicht demgemäß eine Beimpfung mit höherer Dichte, wodurch eine niedrigere Haftergiebigkeit kompensiert werden kann.
Demgemäß liegt der vorliegenden Erfindung die Hauptaufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Verbesserung der Bedeckung von Gefäßtransplantaten und anderen Implantaten vorzusehen.
Der vorliegenden Erfindung liegt die weitere Aufgabe zugrunde, ein verbessertes synthetisches bzw. natürlich auftretendes Implantat bzw. Transplantat vorzusehen; insbesondere ein verbessertes Gefäßtransplantat, das mit mikrovaskulären Endothelzellen endothelialisiert werden kann.
Diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden aus der folgenden genaueren Beschreibung deutlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Es zeigen:
Figur 1 ein Diagramm der zu folgenden Schritte, durch die menschliche Endothelzellen zur erfindungsgemäßen Verwendung erhalten werden.
Figur 2 Graphen, welche die Adhäsion thymidinmarkierter Endothelzellen (HAEC) des erwachsenen Menschen an unbehandelten (Figur 2A) und mit blutplättchenreichem Plasma behandelten (Figur 2B) Transparenten aus Dacron-Polyester vom Zeitpunkt der Beimpfung über einen Zeitraum von 24 Stunden darstellen.
Figur 3 ein Diagramm des bevorzugten Verfahrens zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Transplantats mit einem Kollagenlaminat mit einer Kollagenoberflächenschicht des Typs IV/V.
Figur 4 einen Graph der Adhäsion von Endothelzellen eines erwachsenen Menschen an unbehandelten Dacron-Transplantaten; wobei die Endothelzellen radioaktiv markiert und die Zellverbindung quantifiziert worden sind, wie dies hier beschrieben ist. Die in dem Überstand (Dreieckssymbol) verbliebenen freien Endothelzellen wurden zu einem angegebenen Zeitpunkt quantifiziert. Die Oberfläche des Transplantats wurde dann gewaschen, wobei der Träger von einer Pasteur-Pipette über die Oberfläche ausgestossen wurde, und wobei die lose haftenden Zellen (quadratisches Symbol) und die fest haftenden Zellen (Kreissymbol) quantifiziert wurden. Kurz kultivierte und geringfügig trypsinierte Endothelzellen weisen eine zeitabhängige Haftfähigkeit an unbehandeltem Dacron auf.
Figur 5 einen Graphen, in dem die Adhäsion von Endothelzellen erwachsener Menschen an unbehandeltem Dacron und an mit blutplättchenreichem Plasma bzw. mit menschlichem Amnionhäutchen behandeltem Dacron verglichen wird. Die Erzeugung einer Proteinoberfläche an dem Dacron beschleunigt die Adhäsion endothelialer Zellen an der Oberfläche. Das PRP-Symbol bezieht sich auf die Oberfläche, die aus dem Koagulieren blutplättchenreichen Plasmas an Dacron entsteht. Das AMNION- Symbol kennzeichnet die Oberfläche, die aus der Bindung des zellfreien Amnionhäutchens an der Dacronoberfläche ergibt. Die Basalmembranoberfläche des Amnion war von der Dacronoberfläche weg gerichtet. Das Symbol REIN bezieht sich auf das unbehandelte Dacrongewebe. Die Zelladhäsion wurde gemäß der hierin erfolgten Beschreibung quantifiziert.
Figur 6 ein Balkendiagramm der Ausgangsadhäsion von Mikrogefäß- Endothelzellen an plasmabeschichtetem Dacron von Spender zu Spender. Frisch isolierte Mikrogefäß-Endothelzellen wurden eine Stunde lang auf plasmabeschichtetes Dacron geimpft. Nach einem kurzen Waschvorgang wurden die Transplantate mit dem Hematoxylin von Gill kontrastiert und die haftenden Endothelzellen wurden danach gezählt. Die Spender #8 und #9 offenbarten eine statistisch stark erhöhte Adhäsion im Vergleich zu den Nummern 1, 2, 4, 5, 6 und 7, wobei sich #3 von den Nummern 1, 2, 4, 5 und 7 unterscheidet, wie dies durch einen Studentenversuch festgestellt worden ist.
Figur 7 ein Diagramm der zeitlichen Folge der Adhäsion mit Indium¹¹¹ markierter Mikrogefäß-Endothelzellen an plasmabeschichtetem Dacron. Die Endothelzellen konnten sich über den dargestellten Zeitraum mit einer Transplantatoberfläche verbinden, worauf die Entfernung nichthaftender Zellen erfolgte, was nachstehend im Text beschrieben ist. Die radioaktiv markierten Zellen weisen über 60 Minuten eine schnelle Adhäsionsgeschwindigkeit auf, auf die bis zu der letzten Bewertung der Adhäsion nach 120 Minuten eine geringere Geschwindigkeit folgt. Die Daten stellen den Mittelwert von 6 Proben ± Standardabweichung dar.
Figur 8 einen Graphen von Mikrogefäß-Endothelzellen, die auf plasmabehandeltes Dacron geimpft worden sind, wobei die Zellen dargestellt sind, die nach der Aussetzung eines umfassenden Bereichs von Schergeschwindigkeiten dauerhaft haftend bleiben. Frisch isolierte Mikrogefäß-Endothelzellen wurden 1 Stunde lang auf plasmabeschichtetes Dacron geimpft. Nach einem kurzen Waschvorgang wurden die Transplantate unter Verwendung eines Kulturmediums als Perfusat 2 Stunden lang Strömungsbedingungen ausgesetzt. Die auf dem Transplantat verbleibenden Endothelzellen wurden gezählt und mit Vergleichstransplantaten verglichen, die auf die gleiche Weise geimpft, jedoch keiner Strömung ausgesetzt wurden. Die statistische Bewertung unter Verwendung einer linearen Regressionsanalyse offenbarte y=91-0,33x, mit einem R- Wert von -0,26.

Beschreibung des bevorzugten Ausführungsbeispiels

Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung ergab sich aus Untersuchungen der Funktionsweise und Eigenschaften verschiedener Arten von Endothelzellen. Das hierin beschriebene Verfahren ermöglicht die Isolierung großer Mengen mikrovaskulärer Endothelzellen von menschlichem, mikrovaskularisiertem Gewebe (perinephetischen Fett, Omentum bzw. subkutanen Fett) unter sterilen Bedingungen (z.B. im Operationssaal). Die Gewinnung großer Zellmengen erfordert nach der Isolierung keine Gewebekultivierung. Diese Verfahren beziehen sich auf die Verfahren, die während Untersuchungen bezüglich der Isolierung nicht-menschlicher (Ratte) Mikrogefäß-Endothelzellen unter Verwendung von Ratten-Nebenhodenfett als Gewebequelle entwickelt wurden. Vor kurzem wurde festgestellt, daß sich die Verfahren zur Isolierung tierischer Rattenfett-Mikrogefäß-Endothelzellen zur Isolierung und Kultivierung menschlicher mikrovaskulärer Endothelzellen aus Haut und Fett als nützlich erwiesen haben. Kern u.a. berichten, daß diese isolierten Endothelzellen später kultiviert und in Funktionsuntersuchungen verwendet werden können. J. Clin. Invest. 71:1822-1829 (1983). Siehe auch Jarrell u.a., "Human Adult Endothelial Cell Growth in Culture", Journal of Vascular Surgery 1(6) :757-764 (November 1984), hierbei durch Verweis enthalten.
Die vorliegende Erfindung sieht ein neuartiges Verfahren der Verwendung isolierter mikrovaskulärer Endothelzellen zur Erzeugung einer Endothelzellauskleidung an intravaskulären Implantaten vor. Zu diesen Implantaten gehören zum Beispiel intravaskuläre Vorrichtungen, wie etwa künstliche Gefäßprothesen, künstliche Herzen und Herzklappen, wobei diese Auflistung nicht einschränkend ist. Es wird davon ausgegangen, daß die hierin beschriebenen Verfahren zu der Entwicklung anderer künstlicher Organe bzw. Vorrichtungen führen können. Diese Organe und Vorrichtungen empfangen zirkulierendes Blut entweder nach der Implantation oder in einem extrakorporalen Kreislauf, wobei die vorliegenden Verfahren eine nicht-thrombogene bzw. antithrombogene Zwischenfläche zwischen dem Blut und der implantierten Oberfläche vorsehen. Die unmittelbare Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Anwendung der hierin offenbarten Verfahren zur Endothelialisation von Oberflächen, die sich aus bekannten synthetischen Materialen zusammensetzen, wie etwa Polyester und Polytetrafluorethylen oder aus natürlichen Stoffen, wie etwa einer umbilikalen Vene, einer Wadenvene und einer natürlichen Rinderarterie.
Die vorliegende Erfindung sieht ein Verfahren zur Behandlung eines Implantats vor, das für die Implantation in einem menschlichen Patienten gedacht ist, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: die Entnahme menschlichen mikrovaskulärreichen Gewebes von dem Patienten; das Trennen der mikrovaskulären Endothelzellen von dem Gewebe; und die Positionierung der mikrovaskulären Endothelzellen auf dem Implantat, um eine Konfluenz der Zellen von mindestens fünfzig Prozent (50%) auf der Oberfläche des zu behandelnden Implantats vorzusehen. Dieses Verfahren ist kurz und verhältnismäßig einfach und es ermöglicht die Implantation einer Prothese bzw. einer Oberfläche, die mit den eigenen "frischen" (unkultivierten) Endothelzellen des Patienten behandelt worden ist. Da der operative Vorgang vollständig in einer einzigen sterilen Umgebung ausgeführt werden kann, ist die Wahrscheinlichkeit der Verunreinigung des endothelialisierten Transplantats minimal.
Das erfindungsgemäße Verfahren sorgt für die Isolierung großer Mengen von Endothelzellen, ohne daß eine Gewebekultivierung erforderlich ist. Die vorkommenden Vorgänge können jedoch leicht in einem Operationssaal ausgeführt.werden. In Figur 1 ist ein allgemeines Ablaufdiagramm des Verfahrens zum Trennen der mikrovaskulären Endothelzellen von dem Gewebe eines Patienten dargestellt. Diese Verfahren können zwar auch zur Isolierung endothelialer Zellen von anderen Geweben als Fett verwendet werden, wie etwa von dem Gehirn, der Lunge, der Netzhaut, der Nebenniere, der Leber und Muskeln. Bevorzugt wird jedoch die Verwendung von Fettgewebe als Zellquelle, aufgrund der Masse und Verfügbarkeit von Fettgewebe, sowie aufgrund der Tatsache, daß die Entfernung des Gewebes keine nachteiligen Auswirkungen auf den zu behandelnden Patienten haben sollte. Wie dies in Figur 1 dargestellt ist, kann eine bestimmte Menge menschlichen mikrovaskularisierten Fetts (A) einer Reihe von Quellen entnommen werden. Obwohl dies zwar weniger bevorzugt wird, ist es auch möglich, menschliches perinephritisches Fett hirntoten Spenders, deren Herz noch schlägt, zu entnehmen oder von anderen Spenders, bei denen es sich nicht um den Patienten handelt, wobei die Entnahme während der Operation des Spenders erfolgt. Das Spendergewebe wird auf jeden Fall sofort in eisgekühlte gepufferte Kochsalzlösung (pH-Wert 7,4) übertragen, wobei es sich bei dem Puffermittel vorzugsweise um ein Phosphat handelt, d.h. eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Das Gewebe wird durch feine Scheren zerkleinert (Schritt B) und das Puffermittel dekantiert. Die proteolytische Enzymkollagenase, die Caseanase und Trypsin aufweist, wird zu dem Gewebe hinzugegeben und bei 37ºC einer Inkubation unterzogen, bis die Gewebemasse dispergiert. Diese Digestion tritt innerhalb von dreißig (30) Minuten ein und liegt im allgemein unter zwanzig (20) Minuten. Der Aufschluß wird in ein steriles Reagenzglas gegeben und mit niedriger Geschwindigkeit (700 x g) fünf (5) Minuten lang auf Zimmertemperatur in einer Tischzentrifuge zentrifugiert (Schritt C). Das auf dieses Weise gebildete Zellkügelchen umfaßt mehr als fünfundneunzig Prozent (95%) endotheliale Zellen. Diese Endothelzellen sind hierin als mikrovaskuläre Endothelzellen (MEC) beschrieben, da sie von Arteriolen, Kapillargefäßen und kleinen Venen stammen, die alle Elemente der Mikrovaskulatur darstellen. Das MEC-Kügelchen wird einmal durch Zentrifugation mit gepufferter Kochsalzlösung, vorzugsweise PBS, gewaschen und kann ohne weitere Reinigung in dem hierin beschriebenen Schritt der Behandlung (Anwendung) verwendet werden.
Alternativ können diese mikrovaskulären Endothelialzellen durch Zentrifugation der Zellen mit einem kontinuierlichen Gradienten (Schritt D aus Figur 1) weiter gereinigt werden. Dieser Gradient kann aus einer Mehrzahl gelöster Stoffe mit hohem Molekulargewicht gebildet werden, wozu Albumin, Dextran oder handelsübliche Dichtegradientstoffe wie etwa Percoll (Pharmacia Inc., Piscataway, N.J.) bzw. Nycodenz (Nyegaard and Company, Norwegen) gehören. Die Gradientenzentrifugation wird zur Entfernung roter Blutkörperchen, weißer Blutkörperchen und glatter Muskelzellen verwendet. Im allgemeinen wurde bei den hier aufgezeichneten Untersuchungen eine fünfündvierzigprozentige (45%) Percoll-Lösung verwendet. Die Zellen werden auf der Oberfläche der Percoll-Lösung aufgeschichtet und bei 13.000 x g zwanzig (20) Minuten lang zentrifugiert. Alternativ werden die Zellen auf einem ausgeführten Percoll-Gradienten schichtweise aufgetragen und fünf Minuten lang bei Zimmertemperatur mit 400 x g zentrifugiert. An dem oberen Ende des Gradienten ergibt sich ein dickes Band endothelialer Zellen. Diese Zellen werden mit einer Pipette entfernt und einmal durch Zentrifugation mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen.
Die von menschlichem, mikrovaskularisiertem Gewebe abgeleiteten mikrovaskulären Endothelzellen können danach ohne weitere Behandlung oder Kultivierung direkt in dem Impfschritt der vorliegenden Erfindung zum Auftragen auf die Gefäßprothesenoberflächen verwendet werden. Ein Hauptvorteil dieses Verfahrens liegt in der Gewinnung großer Mengen endothelialer Zellen aus menschlichem Gewebe für die Beschichtung von Gefäßtransplantaten. Außerdem können diese Zellen dem gleichen Spender entnommen werden, der das prothetische Implantat empfängt. Diese Methodik ermöglicht somit die Behandlung implantierbarer Oberflächen mit autologen Endothelzellen.
Gemäß einem alternativen Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Prothesenoberflächen für die Aufnahme der mikrovaskulären Endothelzellen ohne jede Vorbehandlung direkt in dem Zustand verwendet werden, in dem sie vom Hersteller verpackt worden sind. Es kann jedoch von Vorteil sein, diese Oberflächen vorher wenigstens mit einer wäßrigen Lösung vorzubenetzen. Vorzugsweise wird die Prothesenoberfläche vorbehandelt. Die Vorbehandlung beschleunigt die Adhäsion, die Verteilung und das Wachstum der endothelialen Zellen auf der Oberfläche.
Bei der Ausführung eines Behandlungsschrittes des alternativen Ausführungsbeispiels der vorliegenden Erfindung werden die isolierten menschlichen, mikrovaskulären Endothelzellen in einer gepufferten Kochsalzlösung suspendiert, wobei die Lösung plasmaabgeleitete Proteine des Patienten aufweist. Diese Proteinlösung wird dadurch vorbereitet, daß sechs Teile der gepufferten Lösung mit einem Teil Plasma gemischt werden, so daß eine Lösung erzeugt wird, die ungefähr ein Prozent (1%) an Protein aufweist. Die in der Tabelle 1 ausgeführten Daten zeigen, daß die endotheliale Bindung durch die Proteinkonzentration in der Suspension beeinflußt wird. Die optimale Proteinkonzentration liegt gemäß der Darstellung aus Tabelle 1 bei etwa einem Prozent (1%), wobei die Erforderlichkeit von Protein während der Oberflächenbehandlung angezeigt wird. Bei der bevorzugten Proteinquelle handelt es sich um Albumin, wobei jedoch auch plasmafremde Quellen verwendet werden können. TABELLE 1 Auswirkungen unterschiedlicher Albuminkonzentrationen auf die Ausgangsadhäsion und das Wachstum von HAEC Prozentuale Konfluenz+ Albuminkonzentration Zeit Stunden +(#EC/10&sup5; Zellen/cm²) *starke Veränderung
Die mikrovaskularisierte, endotheliale Zellsuspension wird danach vorzugsweise durch Zentrifugation (200 x g) pelletisiert, und wobei das Kügelchen mit einer proteinhaltigen Pufferlösung resuspendiert wird. Diese Resuspension sollte in einem Verhältnis von 1:5 bis 1:15 bzw. etwa 1:10 Volumenanteilen gepackter mikrovaskulärer Endothelzellen zur Pufferlösung ausgeführt werden. Die Zellsuspension wird den rohrförmigen Transplantaten zugeführt und die Enden werden geklemmt. Die Zellen können aber auch auf die zu behandelnde Oberfläche geschichtet werden. Die optimalen Perioden für die Zellwechselwirkung konnten bisher noch nicht präzise definiert werden und sie variieren abhängig von dem Material der Prothese, der Art der empfangenen Vorbehandlungen und von der Tatsache, ob die Oberfläche der Prothese modifiziert worden ist, um die Akzeptanz der mikrovaskulären Endothelzellen zu verbessern. Es wurde zum Beispiel festgestellt, daß für die Adhäsion der endothelialen Zellen auf einer unbehandelten Transplantatoberfläche aus Polyester zwei Stunden erforderlich sind, und daß auf den gleichen Oberflächen, die jedoch mit Protein vorbehandelt worden sind, für die Adhäsion weniger als zehn Minuten erforderlich sind. Das Adhäsionsverhalten wurde durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen menschlicher Mikrogefäß-Endothelzellen (MEC) auf glatten, unbehandelten Dacron-Transplantaten bestätigt. Nach der Inkubation über einen ausreichenden Zeitraum zur Ermöglichung einer Adhäsion der endothelialen Zellen an der Transplantatoberfläche wird die Oberfläche mit einem proteinhaltigen Puffer gewaschen. Die Prothese kann nun auf normale Weise implantiert werden.
Auf der Basis biochemischer und morphologischer Daten wurde festgestellt, daß menschliche, mikrovaskuläre Endothelzellen an unbehandelten Transplantatoberflächen haften.
Rasterelektronenmikroskopaufnahmen zeigen, daß unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren, auf einem unbehandelten Dacron- Polyester plazierte menschliche, mikrovaskuläre Endothelzellen zu einer Adhäsion führen, wobei nach einem Tag der Kultivierung die Zelldeckung (vollständige Konfluenz) erfolgt. Die Zellen setzen sich an bestimmten Bereichen auf den Transplantaten fest und sehen keine vollständige Bedeckung unbehandelter Transplantatoberflächen vor. Wenn menschliche, mikrovaskuläre Endothelzellen auf mit Plasma behandelte Transplantate aus Dacron-Polyester geimpft werden, ist die Deckung anfangs im Vergleich zu unbehandelten Dacron-Oberflachen wesentlich größer. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen eine fast konfluente Bedeckung plasmabeschichteter Transplantate mit menschlichen, mikrovaskulären Endothelzellen. Die Tabelle 2 veranschaulicht die Adhäsion und das Wachstum menschlicher Mikrogefäß-Endothelzellen an unbehandelten und an proteinbeschichteten Transplantaten aus Dacron-Polyester, und zwar anfangs am Tag 1 und nach vierzehn (14) Tagen. TABELLE 2 Adhäsion und Wachstum menschlicher Mikrogefäß-Endothelzellen an unbehandelten und proteinbeschichteten Dacron-Transplantaten. PROZENTUALE KONFLUENZ + DACRON VORBEHANDLUNG Zeit (Tage) Unbehandelt Kollagen und Plasma +(#EC/10&sup5; Zellen/cm²) * Starke Veränderung
Wie dies in Tabelle 2 dargestellt ist, wird die Adhäsion mikrovaskulärer Endothelzellen durch die Proteinbehandlung der Transplantatoberflächen erleichtert. Ferner wurde festgestellt, daß die Endothelzellenproliferation an Prothesenoberflächen dürch das Vorhandensein einer Proteinbehandlung stimuliert wird.
Wie dies bereits vorstehend beschrieben worden ist, ist die Erzeugung einer unversehrten Monoschicht an einer Prothesenoberfläche am günstigsten, wenn sie vor der Implantation erzeugt wird. Wenn diese endothelialisierte Oberfläche scherbeständig wäre, würde sie eine sofort anti-thrombogene Obeffläche vorsehen. Demgemäß wurde auch die Scherbeständigkeit von mikrovaskulären Endothelzellschichten untersucht. Menschliches Fett wurde 25 Minuten lang mit Kollagenase behandelt, gewaschen und in einer Percoll-Gradiententrennung purifiziert. Dies ergab 1,25 ± 0,45 x 10&sup6; Zellen je Gramm Fett. Nach einer 1-stündigen Inkubation auf plasmabeschichtetem Dacron verblieben 2,8 ± 1,5 x 10&sup4; fest an der Oberfläche haften. Nach einer 2 Stunden langen Strömungsaussetzung bei einer Scherbeanspruchung von 0 bis 80 Dyn/cm² blieben 50 bis 100% der anfangs haftenden Zellen weiterhin haften. Eine statistische Analyse dieser Daten konnte keine feste Beziehung zwischen der Anzahl haftender Zellen und der Scherrate nachweisen. Die Rasterelektronenmikroskopie veranschaulichte die Endothelzellen in verschiedenen Phasen der Anhaftung an dem plasmaüberzogenen Dacron. Die meisten Zellen waren zwar weiterhin rund und nur fokal an der Oberfläche haftend, doch waren einige Zellen auch maximal abgeflacht und gestalteten einen Zellen-an-Zellen- Kontakt. Aufgrund des hohen Zellertrages und der festen Adhäsionseigenschaften, können mikrovaskuläre Endothelzellen die Möglichkeit für eine konfluente Endothelzellenbeimpfung auf einem Transplantat vorsehen, und zwar zum Zeitpunkt der operativen Implantation, wobei keine Zellkultivierung erforderlich ist.
Die Adhäsion endothelialer Zellen an proteinbehandelten Oberflächen wurde zur beispielhaften Erläuterung unter Scherbeanspruchung getestet, um Bedingungen zu simulieren, die existieren, wenn ein mit Endothelzellen geimpftes Transplantat nach der Implantation einer Arteriendurchblutung ausgesetzt ist. Mikrovaskuläre Endothelzellen eines erwachsenen Menschen wurden von menschlichem perinephritischen bzw. Omentumfett isoliert, das von hirntoten Organspendern, deren Herz noch schlug entnommen wurde bzw. von Patienten, die sich gemäß dem IRB-Protokoll einem anderen operativen Eingriff unterzogen. Das Fett wurde mechanisch zerkleinert und in sterile 50 ml Erlenmeyerkolben mit Schraubkappe gegeben, die 10 ml Dulbecco's Cation Free (DCF) Puffer (kationenfreier Puffer von Dulbecco) enthielten, mit einem pH-Wert von 7,4, mit Kollagenase (Worthington Typ I; Cooper, Biomedial, Malvern, PA) 4 mg/ml und Rinderserumalbumin (Sigma Typ V; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 4 mg/ml. Die Kolben wurden bei 37ºC und unter leichtem Rühren 25 Minuten lang einer Inkubation unterzogen. Die Kolbeninhalte wurden bei 200 x g 7 Minuten lang zentrifugiert. Das Kügelchen wurde zweimal in dem DCF-Puffer gewaschen, der 0,1% BSA aufwies, und bei 200 x g 3 Minuten lang geschleudert.
Das resultierende Kügelchen wurde in 45% Percoll (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) in DCF resuspendiert und bei 4ºC bei 20.000 x g 20 Minuten lang zentrifugiert. Die Bündel der kapillaren Endothelzellen befanden sich in einer milchweißen Schicht oben auf dem Dichtegradient, wobei sich die Gefäßfragmente und Zelltrümmer in dem Kügelchen befanden. Die kapillaren Endothelzellen wurden zweimal 3 Minuten lang bei 200 x g in dem DCF-BSA-Puffer gewaschen. Die Bündel wurden in dem Medium 199 mit 20% fetalem Kälberserum (Hazeltown Research Labs, Denver, PA) resuspendiert. Die Identifikation der Endothelzellen in der primären Isolierung basierte hauptsächlich auf der morphologischen Überprüfung durch Phasenkontrastmikroskopie. Die primären Isolierungen, die mit hoher Dichte beschickt and der primären Kultur ausgesetzt wurden, zeigten bei antihämpophilem Globelin A eine positive Verfärbung und eine Umwandlungsenzymaktivität (ACE).
Die Transplantatoberfläche wurde gemäß dem folgenden Verfahren vorbereitet. Cooley Graft Woven Porosity Dacron Fabric (Meadox Medicals, Oaklang, NJ) wurde hintereinander in Aceton, 8,5% H&sub3;PO&sub4; und 1 N NaOH, gewaschen; darauf folgte ausgiebiges Waschen mit doppeltdestilliertem H&sub2;O. Nach dem Trocknen wurde es für 10 Minuten bei 10&supmin;&sup4; Torr in einer Luftatmosphäre in einen Harrick- Plasmareiniger (Harrick Industry, Ossining, NY) gegeben. Ein Segment des Transplantatmaterials mit einer Größe von 2,5 x 2,5 cm wurde für die Substratbeschichtung und Endothelzellenbeimpfung vorbereitet.
Das Dacron-Transplantatmaterial wurde dann mit blutplättchenreichem Plasma behandelt. Das blutplättchenreiche Plasma (PRP) wurde aus frisch antikoaguliertem (ACD) Blut von normalen menschlichen Spendern vorbereitet. Das PRP wurde kurz vor der Transplantatbehandlung mit 50 mM CaCl&sub2; gemischt. Das PRP wurde dann auf das in einer Impfkammer immobilisierte Transplantatmaterial gegeben. Nach der Behandlung mit PRP konnte sich bei 37ºC auf der Transplantatoberfläche ein Fibringerinnsel bilden. Das überschüssige Koagulum wurde danach entfernt, und die Transplantatoberfläche wurde vor der Endothelzellenimpfung mit einem Nährmedium gewaschen.
Das in der Impfkammer immobilisierte und mit PRP beschichtete Dacrongewebe-Transplantat wurde in 0,5 cc in der Impfquelle (1 cm² Fläche) plaziertem Nährmedium mit 5 x 10&sup5; EC beimpft, um es zu ermöglichen, daß in einer Stunde in einem Inkubationsapparat bei 37º eine Inkubation erfolgt. Nach der Inkubation wurde der Überstand entfernt und die Transplantatoberfläche leicht mit dem Nährmedium gewaschen. Die Kontrollkanirnern wurden mit 0,5 cc frischem Nährmedium gefüllt und in eine Zirkulationsschleife im Labor plaziert. Die Endothelzellen wurden dann bei 37ºC unter Verwendung eines rezirkulierenden Nährmediums 2 Stunden lang einer einzigen Scherbeanspruchung zwischen 0 und 80 Dyn/cm² ausgesetzt. Während der Strömung wurden zu vernachlässigende Veränderungen der Druckgradienten, des pH-Wertes und der Elektrolytkonzentrationen beobachtet. Die Scherbeanspruchungen wurden unter Verwendung der Formel für die Impulsübertragung zwischen parallelen Platten berechnet. Siehe Bird u.a., Transport Phenomena, New York, 1960, John Wiley & Sons, Inc., Seiten 1-70. Die maximale errechnete Reynolds-Zahl betrug bei unserer Untersuchung 600, was eine laminare Strömung annehmen läßt. Ferner zeigten Messungen des Drucks im Verhältnis zu der Strömung eine lineare Beziehung bei den auftretenden Scherraten. Bei Beendigung der Strömung wurden die Kammern auseinandermontiert und die Transplantatoberflächen wurden durch Licht- und Rasterelektronenmikroskopie überprüft.
Die Lichtmikroskopie wurde an beimpften Transplantaten ausgeführt, die mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung von Dulbecco, die 0,1% BSA enthielt, gewaschen und dann 15 Minuten lang mit 95% Ethanol fixiert wurden. Die Transplantate wurden mit destilliertem H&sub2;O gespült und mit Gill Hematoxylin (Fisher Scientific Co., Fairlawn, NJ) gefärbt. Nach zwei Spülungen mit destilliertem H&sub2;O wurden die Transplantate eine Minute lang in Leitungswassersubstitut von Scott (Scott's Tap Water Substitute) gegeben. Die Oberflächen wurden zweimal mit destilliertem Wasser und 95% Ethanol gespült. Die gefärbten Transplantate wurden dann mit einem Nikon-Diaphonmikroskop überprüft.
Eine Rasterelektronenmikroskopie wurde ebenfalls ausgeführt. Die beimpften Transplantatoberflächen wurden 1 Stunde lang mit 1% Glutaraldehyd und 2 Stunden lang mit 3% Glutaraldehyd fixiert. Danach wurden sie dreimal jeweils zwanzig Minuten lang mit Tyrode-Kakodylatpuf fer (pH-Wert 7,4) gewaschen. Proben wurden dreißig Minuten lang in 1% OsO&sub4; nachfixiert und dreimal mit Tyrode-Puffer gewaschen. Die Proben wurden umwandlungspunktgetrocknet und mit Goldpalladium besputtert Die anheftenden Proben wurden in einem Rasterelektronenmikroskop von Phillips überprüft.
Eine Indiummarkierung der Endothelzellen wurde ebenfalls ausgeführt. Die Endothelzellen wurden gemäß der obigen Beschreibung von den Mikrogefäßen isoliert. Die Zellen wurden bei 100 x g 3 Minuten lang durch Zentrifugieren pelletisiert und einmal mit PBS (pH-Wert 7,4) gewaschen. Die Zellen wurden vor der Markierung in 0,5 ml PBS resuspendiert. Die Zellkonzentration wurde auf 2,5 x 10&sup5; Zellen/ml angepaßt. Der Zellsuspension wurden 20 Mikrocurie Indium¹¹¹ hinzugefügt (als Indium¹¹¹oxin, Medi- Physics, Emeryville, CA), und die Zellen wurden bei allgemeiner Bewegung 30 Minuten lang markiert. Kurz vor dem Waschen wurde eine Probe von 5 ul entnommen, um eine Endanalyse der Markierungseffizienz zu ermöglichen. Die markierten Zellen wurden dreimal durch Zentrifugieren gewaschen, wobei ein vollständiges Gewebenährmedium verwendet wurde. Das letztendliche Kügelchen wurde in dem vollständigen Nährmedium auf eine Endkonzentration von 2,5 x 10&sup5; Zellen/ml resuspendiert.
Die Adhäsionsquantifizierung der radioaktiv markierten Endothelzellen wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens bestimmt. Die Endothelzellen wurden auf das mit PRP beschichtete Dacron, das in Beem-Kapseln (Polysciences, Inc., Fort Washington, PA) immobilisiert wurde, geimpft und über bestimmte Zeitintervalle (t= 10, 20, 30, 60, 120 Minuten) einer Inkubation unterzogen. In jedem Zeitintervall wurden Proben untersucht. Das Nährmedium wurde entnommen und das PBS zwangsläufig über der Oberfläche pipettiert. Die ganze Beem-Kapsel wurde analysiert. Der Mittelwert zu jedem Zeitpunkt wurde berechnet, und die maximale Adhäsion wurde als prozentualer Wert im Verhältnis zur Zeit dargestellt.
Die Endothelzell-Zählungen auf den Strömungs- und Kontrollobjektträgern wurden mit einem Micro-Comp-Grain-Zähler durchgeführt, der von einem IBM AT-PC und einem Frame Grabber unterstützt wurde. Die während der Strömungsanalyse gewonnenen Daten wurden auf zwei Arten bewertet. Erstens wurde die Endothelzellen-Adhäsion als prozentualer Anteil der Zellen ausgedrückt, die nach der Strömung im Vergleich mit den Kontrollobjektträgern übriggeblieben sind. Jeder Punkt stellt mindestens 4 und teilweise 8 Beobachtungen dar. Diese Darstellung erfolgte im Verhältnis zu der Scherbeanspruchung, und an dieser Kurve wurde eine lineare Regressionsanalyse zur Bestimmung der statistischen Signifikanz ausgeführt. Zweitens wurden Vergleiche der Ausgangsadhäsionen unter Verwendung des Studenten T-Tests durchgeführt. Die Endothelzellen-Adhäsion wurde durch eine Darstellung der Indium¹¹¹-Markierung gegenüber der Zeit bestimmt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert von zwei getrennten Proben dar.
Bei diesem Versuch wurde 13 individuellen Spendern Fettgewebe entnommen, und zwar von perinephritischen und Omentum- Fettquellen. Die Endothelzellen wurden von allen 13 Spendern erfolgreich isoliert. Die abgelauf ene Zeit für die 3 Stufen der Endothelzellisolation betrugen 29,9 ± 3 (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwertes) für Kollagenase, 20 Minuten für Percoll und 30 Minuten für Spülungen und Zellzählungen. Der mittlere Endothelzellertrag je Gramm feuchten Fetts lag bei 1,25 ± 0,45 x 10&sup6; Zellen. Die Lebensfähigkeit der Zellen betrug gemäß einer Bestimmung durch Trypanblauexklusion bei allen Isolierungen mehr als 95%.
Nach einer Stunde der Inkubation an plasmabeschichtetem Dacron lag die Endothelzelladhäsion gemäß einer Lichtmikroskopie bei 2,8 ± 1,5 x 10&sup4; Zellen/cm² (n=9). Die Adhäsion wurde als prozentualer Anteil der Konfluenz gemessen. Dies wurde durch Zählen der Anzahl haftender Endothelzellen nach einer einstündigen Inkubationszeit und einer Division des Wertes durch 10&sup5; gemessen, wobei es sich um die maximale Zahl in einer zusammenfließenden Monoschicht vorhandener Endothelzellen handelt, und zwar unabhängig von der Zellimpfdichte. Für eine statistische Analyse wurden vier getrennte Adhäsionsmessungen je Spender durchgeführt. Wie dies in Figur 6 dargestellt ist, war die Standardabweichung vom Mittelwert der Adhäsion bezüglich dem einzelnen Spender sehr gering. Im Gegensatz dazu schwankte die mittlere Adhäsion von 1,13 x 10&sup4; EC/cm² bei dem Spender #2 bis 4,11 x 10&sup4; EC/cm² bei dem Spender #9. Die Spender #8 und #9 offenbarten im Vergleich zu den Spendern #1, 2, 4, 5, 6 und 7 eine wesentliche höhere Ausgangsadhäsion auf (p kleiner als 0,05), wobei sich der Spender #3 von den Nummern 1, 2, 4, 5 und 7 durch den Studenten T-Test wesentlich unterschied.
In diesem Versuch wurde auch die zeitliche Folge der Adhäsion der mikrovaskulären Endothelzellen an mit Plasma behandeltem Dacron untersucht. Mit Indium¹¹¹ radioaktiv markierte Mikrogefäß- Endothelzellen wurden auf mit Plasma behandeltem Dacron aufgetragen, und die Zelladhäsion wurde über einen Zeitraum von 120 Minuten analysiert (siehe Figur 7). Die linke Y-Achse stellt die Anzahl haftender Endothelzellen zu einem gegebenen Zeitpunkt dividiert durch die Anzahl haftender Endothelzellen nach einer zweistündigen Inkubation (maximale Adhäsion) in Prozent dar. Die rechte Y-Achse stellt die Anzahl haftender Endothelzellen zu einem gegebenen Zeitpunkt dividiert durch die Anzahl anfangs geimpfter Endothelzellen (10&sup5; EC/cm²) als prozentualen Konfluenzanteil dar. Beobachtet wurde eine Zweiphasen- Adhäsionsrate, wobei während den ersten 60 Minuten eine anfänglich schnelle Adhäsionsrate auftrat, auf die bis zu dem zeitlichen Endpunkt bei 120 Minuten eine langsamere Rate folgte. Bei 10 Minuten, dem ersten zeitichen Bewertungspunkt, wurde eine starke, jedoch beschränkte Adhäsion beobachtet.
Die Adhäsion an plasmabeschichtetem Dacron wurde weiter bestimmt. Nach einer einstündigen Inkubation wurden die mit Endothelzellen beimpften Oberflächen in die Strömungskammer gegeben und bestimmten Scherbedingungen ausgesetzt. Die Endothelzellen jedes einzelnen Spenders wurden nur einer Scherrate ausgesetzt. In Figur 8 ist die Auswirkung der Scherbeanspruchung auf die Adhäsion der Endothelzellen an dem Dacron-Transplantat dargestellt. Die Daten sind als prozentualer Anteil der Adhäsion an dem Dacron-Transplantat ausgedrückt. Diese Bestimmung erfolgte durch Zählen der Anzahl der nach dem zweistündigen Versuch an der Oberfläche haftenden Endothelzellen und durch Division dieser durch die Anzahl der vor der Inkubation an der Oberfläche haftenden Endothelzellen, und zwar in Prozent ausgedrückt. Es wurden Endothelzellen von 13 Spendern verwendet. Bei jeder Scherrate wurden für jeden Spender jeweils 4 getrennte Beobachtungen durchgeführt. Bei einer gegebenen Scherbeanspruchung (z.B. 20, 30 oder 50 Dyn/cm²) konnten bei einer getrennten Prüfung der Endothelzellen von 2 Spendern keine wesentlichen Unterschiede der Zelladhäsion festgestellt werden. Die lineare Regressionsanalyse offenbarte einen Abschnitt auf der Y-Achse von 91 und eine Neigung von -0,33 mit einem R-Wert von -0,26. Diese statistische Analyse unterstützt die Schlußfolgerung, daß die Adhäsion frisch isolierter Mikrogefäß- Endothelzellen durch Scherbeanspruchungen bis 80 Dyn/cm² nicht beeinflußt wird.
Die qualitative Bewertung der Endothelzelladhäsion wurde durch Rasterelektronenmikroskopie durchgeführt. Wenn die Zellen sich 1 Stunde lang mit der Oberfläche verbinden konnten, worauf eine Scherung von 2 Stunden folgte, offenbarten Observationen mit schwacher Leistung veränderliche Dichten der Endothelzellen. Die Dacron-Oberfläche war gleichmäßig mit Plasmakoagulum bedeckt, und es wurde festgestellt, daß die Zellen an Bereichen der Plasmagerinnsel haften, welche die Höhen (Kette) und Tiefen (Schuß) überlagern, die während dem Webvorgang erzeugt werden. Eine durch die Observation mit geringer Leistung in Betracht gezogene stärkere Vergrößerung der Bereiche zur Anzeige einer eingeschränkteren Zellverbindung, offenbarte das Vorhandensein von Endothelzellen in verschiedenen Phasen der Oberflächenverbindung. Die Zellmorphologie variierte von abgeflachten Zellen, die im Vergleich zu rundgebliebenen Zellen, die nur fokal haften, einen dramatischen Anstieg des Zelloberflächenbereichs aufwiesen. Alle Zellen waren scherbeständig.
Dieser Versuch unterstützt somit die Vermutung, daß es möglich ist, auf einer Prothesenoberfläche ein Endothelium zu erzeugen, um Komplikationen zu vermeiden, die von der Thrombogenizität dem Stand der Technik entsprechender Prothesenoberflächen stammen. Der Versuch zeigt ferner die Durchführbarkeit der Gestaltung eines prothetischen Transplantats, das zum Zeitpunkt der Implantation vollständig endothelialisiert ist, ohne vorherige Endothelzellenkultivierung. Dieser Versuch umgeht das Problem, daß nur eine beschränkte Anzahl großer Gefäße als Endothelzellspender zur Verfügung steht, wohingegen Mikrogefäße universal in hoher Dichte so gut wie in allen Geweben vorhanden sind. Diese Endothelzellen können auf einfache Weise von Fettgewebe isoliert werden, wobei sich im Gegensatz zu großen Gefäßen eine große Anzahl von Endothelzellen je Gewebegramm ergibt. In der Gewebekultur weisen diese Endothelzellen viele der funktionalen und morphologischen Eigenschaften von Endothelzellen großer Gefäße auf. Am wichtigsten ist dabei, daß sie eine kontaktgehemmte, zusammenfließende Monoschicht bilden können, die dem Kopfstein-Erscheinungsbild eines normalen Endotheliums eines großen Gewebes im wesentlichen gleicht. Die Mikrogefäß- Endothelzellen erfüllen viele der Anforderungen einer Zelle, die im Stande ist, ein Transplantat schnell zu endothelialisieren. Die Zellen sind in dem Gewebe allgemein gegenwärtig, und da sie in Fettgewebe vorhanden sind, kann ein Spendergewebe ohne einen größeren chirurgischen Eingriff in großen Mengen und mit minimalem Risiko für den Patienten entnommen werden. Diese Zellen können den meisten Patienten leicht und zuverlässig innerhalb von 60 bis 90 Minuten entnommen werden, wobei große Mengen endothelialer Zellen erzeugt werden können, die frei von verunreinigenden glatten Muskelzellen sind und die schnell fest an mit PRP oder anderen Stoffen, wie etwa Basalmembran, behandeltem Dacron haften. Ferner können sie Bereiche zusammenfließender Zellen begründen, die nach nur 1 oder 2 Stunden der Inkubation physiologischen Scherbeanspruchungen widerstehen können und die für den Spender autolog sind.
Der oben beschriebene Versuch zeigt, daß das von verschiedenen menschlichen Spendern entnommene Fettgewebe zu einem Ertrag von 1,25 ± 0,45 x 10&sup6; Endothelzellen je Gramm Fett führt und daß die Ausgangsadhäsion dieser Endothelzellen von 10% bis 40% der angewandten Endothelzellen reicht, und zwar selbst an mit PRP behandelten Transplantaten. Es wurde zwar keine deutliche Tendenz bezüglich dem Alter, den Krankheiten oder dem Sozialverhalten der Patienten festgestellt, doch ist erwiesen, daß der Endothelzellertrag und die Adhäsionseigenschaften zwischen den einzelnen Patienten schwanken. Trotz dieser Unterschiede können die Adhäsionsschwankungen durch Erhöhung der Fettentnahmemenge kompensiert werden.
Der beschriebene Versuch überprüfte auch eine weitere bedeutsame Anforderung, nämlich, daß die frisch isolierten und beimpften Endothelzellen physiologischen Scherbeanspruchungen widerstehen können. Die Scherbeständigkeit endothelialisierter Oberflächen in einem System, das den meisten Impfversuchen am lebenden Objekt entspricht, wurde erreicht. Wir haben in früheren Untersuchungen gezeigt, daß Endothelzellen fest an einer Oberfläche haften können, selbst wenn sie nicht leicht zusammenfließende Monoschicht bilden. Dieses Modell mißt somit tatsächlich die Adhäsion einzelner Zellen an einer Oberfläche und stellt wahrscheinlich nicht ganz die ideale Zellumgebung dar, wenn-diese einer Strömung ausgesetzt werden. Die Endothelzelladhäsion blieb jedoch bei über 50% und in den meisten Fällen bei allen Scherbeanspruchungspegeln sogar darüber. Dies impliziert, daß die Endothelzellen nach einer Zellen-Oberflächen-Wechselwirkung und Anhaftung sehr stark haften. In diesem Modell existieren viele Variablen, wie etwa die Spendervariablen, die Plasmavariablen und die Inkubationsbedingungen, die untersucht werden müssen, um dieses Verfahren mehr verstehen und optimieren zu können.
Es ist eine weitere wichtige Eigenschaft, daß die frisch isolierten und geimpften Endothelzellen schnell vollständige Zellen-Zellen-Wechselwirkungen bilden. Zweifelsohne schützen diese Wechselwirkungen die Endothelzellen zusätzlich gegen Scherbeanspruchungen, wobei sie dabei unterstützend wirken, die Zellen gegen ein Abziehen von der Oberfläche zu schützen. Da die Zellverbindungen miteinander auf plasmabeschichtetem Dacron nur in begrenztem Maße auftreten, sind in den nachstehend beschriebenen Versuchen optimalere Oberflächen zur Förderung dieser Zellen-Zellen-Wechselwirkungen vorgesehen.
Der oben beschriebene Versuch bestätigt, daß Mikrogefäß- Endothelzellen Eigenschaften aufweisen, durch welche sie für die Endothelialisierung von Transplantaten hervorragend geeignet sind. Nachstehend werden die in den Isolierungsverfahren vorkommenden Variablen ebenso beschrieben wie die folgende Oberflächenadhäsion und die Zellen-Zellen-Wechselwirkung. Hiermit wird jedoch festgestellt, daß die hierin und nachstehend beschriebenen Verfahren alle zu der Manipulation autologer menschlicher Gewebe in einem Operationssaal kompatibel sind.
Es wird nun davon ausgegangen, daß die Erzeugung der bevorzugten zusammenfließenden Endothelzellschicht auf Prothesenoberflächen von mindestens drei Hauptvariablen abhängt. Erstens muß die Ausgangsadhäsion der Zellen ausreichend sein, so daß eine Anfangsoberflächenbedeckung von mindestens etwa fünfzig Prozent (50%) vorgesehen wird. Die Gewinnung von Endothelzellen großer Gefäße zur Bereitstellung einer Bedeckung von mindestens etwa fünfzig Prozent (50%) ist außerordentlich schwierig, wenn nicht gar unmöglich, da es sich bei der einzigen möglichen Zellquelle um die großen Gefäße des Patientens selbst handelt. Die Zellen großer Gefäße können zwar isoliert und kultiviert werden, um eine große Anzahl an Zellen vorzusehen, doch würden sich dann offensichtliche Probleme in bezug auf das Gewebekulturmedium ergeben. Mikrovaskularisiertes Fett sieht eine reiche Quelle endothelialer Zellen zur Beimpfung vor. Zwanzig Gramm Fett des Patienten sehen eine ausreichende Menge endothelialer Zellen zur Beimpfung eines Oberflächenbereichs von einhundertachtzig Quadratzentimetern vor (180 cm²), wobei der Oberflächenbereich durch ein kennzeichnendes Bypass-Transplantat von einer Oberschenkelarterie zu einer poplitealen Arterie dargestellt wird.
Bei einer zweiten Variable handelt es sich um die Fähigkeit der endothelialen Zellen an einer Prothesenoberfläche zu wachsen (proliferieren). Bei einer Konfluenz von fünfzig Prozent (50%) müssen sich die Zellen einmal verdoppeln, um eine konfluente Zellschicht zu bilden. In der Tabelle ist dargestellt, daß sich die Zellen auf einer bevorzugten, mit Protein beschichteten Oberfläche (mit blutplättchenreichem Plasma beschichtet) in dem Gewebenährmedium, welches den Wachstumsfaktor aufweist, mindestens einmal verdoppeln. In dem Körper wären diese Wachstumsfaktoren wahrscheinlich jedoch nicht vorhanden, und somit ist die Fähigkeit zur Behandlung von Oberflächen mit bzw. über einer Konfluenz vorteilhaft. Es gilt noch einmal anzumerken, daß es die Verfügbarkeit menschlicher Mikrogefäß-Endothelzellen in großen Mengen ermöglicht, die Endothelzellen in Dichten auf einer Oberfläche aufzutragen, durch welche zum Zeitpunkt der Implantation eine zusammenfließende bzw. beinahe zusammenfließende Monoschicht erzeugt werden kann.
Diesen beiden Variablen wird dadurch ausreichend entsprochen, daß menschliche Endothelzellen auf mit Proteinen vorbehandelten Prothesenoberflächen aufgetragen werden, wie dies vorstehend beschrieben worden ist, wobei die Zellen auch auf Oberflächen aufgetragen werden können, die so modifiziert worden sind, daß sie Proteinoberflächen nachahmen. Diese modifizierten Oberflächen sind im Fach der Endothelzell-Gewebekultur allgemein bekannt. Alternativ dazu können die Endothelzellen in ein Fibringel (Proteingel) "vorkoaguliert" werden, das sich in und um das Transplantat bildet. Daten indizieren, daß menschliche, mikrovaskuläre Endothelzellen in einem Proteinnetz gelatiniert werden können und nach einer Inkubation in einem Nährmedium an die Oberfläche des Gels wandern. Dies wurde durch rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen bestätigt, welche zeigen, wie menschliche, mikrovaskuläre Endothelzellen eine konfluente Monoschicht an der Oberfläche eines Dacron-Polyester- Transplantats bilden, nachdem diese Zellen in menschlichem Plasma vorkoaguliert worden sind.
Bei der dritten Variable handelt es sich um den Effekt, den die Technik und die darunterliegende Oberfläche auf die Funktionseigenschaften der Endothelzell-Monoschicht haben, einschließlich deren Morphologie, Scherbeständigkeit und den anti-thrombogenen Eigenschaften. Zur Verbesserung dieser Funktionseigenschaften wurde die Wechselwirkung von Endothelzellen erwachsener Menschen (HAEC) mit den natürlichen Kollagenoberflächen untersucht, die durch menschliches Amnion vorgesehen sind. Die Rasterelektronenmikroskopie offenbart, daß die Endothelzellen erwachsener Menschen schnell sowohl an der Basaloberfläche (Kollagen IV/V) als auch an der Zwischenoberfläche (Kollagen I/III) des Amnion haften. Dabei ist die Adhäsion der Zellen an der Basalmembranoberfläche jedoch wesentlicht stärker. Zusätzlich dazu bilden die Endothelzellen erwachsener Menschen im Vergleich zu Zellen, die auf die Zwischenoberfläche geimpft werden, dichte Zellen-Zellen- Wechselwirkungen an der Basalmembran. Diese Ergebnisse führen zu dem Schluß, daß die Beimpfung endothelialer Zellen auf künstliche Oberflächen erleichtert wird, wenn die Oberfläche die natürliche Basalmembran simuliert, an der Endothelium natürlich haftet.
Zur Erzielung verbesserter Transplantate mit geringen Durchmessern ist es erforderlich, eine Quelle großer Mengen autologer Endothelzellen zur Verfügung zu haben, wie etwa von mikrovaskulärem Fett. Das Prothesenoberflächensubstrat muß so ausgewählt werden, daß es für Endothelzellen aufnahmefähig ist, wobei das Verfahren mit dem Wissen um die Anforderungen bezüglich der Anhaftung und der erforderlichen temporalen Parameter ausgeführt werden muß, welche notwendig sind, um die zuverlässige Gestaltung einer funktionalen sowie scherbeständigen Monoschicht zu ermöglichen. Demgemäß wurden die folgenden Versuche durchgeführt, um zu zeigen, daß die zeitliche Folge der Ereignisse von der Endothelzellbeimpfung auf einer Prothesenoberfläche bis zur Erzeugung einer konfluenten Monoschicht derart verläuft, daß das Erreichen einer Konfluenz schnell genug verläuft, so daß zum Zeitpunkt der Implantation eine Vorendothelialisierung möglich ist.
Die Adhäsion endothelialer Zellen an verschiedenen Transplantatoberflächen wurde morphologisch bewertet. Bei der quantitativen Analyse der Wechselwirkung zwischen Endothelzellen und Transplantat handelte es sich um eine Analyse der Geschwindigkeit der Endothelzelladhäsion an der Oberfläche, wobei bezüglich der Art der Wechselwirkung der Endothelzellen mit den Transplantatoberflächen Fragen offen blieben. Aus diesem Grund bewerteten wir die Adhäsion der Endothelzellen an Transplantatoberflächen, die mit Basalmembran und blutplättchenreichem Plasma behandelt waren, sowie an unbehandeltem Dacron. Die zeitliche Folge der Adhäsion von Endothelzellen erwachsener Menschen an einem mit Basalmembran behandelten Transplantat wurde durch Überprüfung von Rasterelektronenmikroskopaufnahmen bestimmt. Nach dem Zusatz der Endothelzellen wurden die Transplantatoberflächen in verschiedenen Intervallen zwischen 1 und 120 Minuten gewaschen und durch Rasterelektronenmikroskopie bewertet. Nach nur 1 Minute konnte eine feste Adhäsion runder Endothelzellen an der vergleichsweise glatten Amnionoberfläche beobachtet werden. Nach einer Inkubation von 10 Minuten wiesen die Endothelzellen weiterhin ein rundes Erscheinungsbild auf, das eine fokale Adhäsion an einem begrenzten Bereich der zellförmigen Basaloberfläche suggeriert.
Die Bewertung der Adhäsion der Endothelzellen an der Basalmembran ergab nach einer Inkubation von 20 Minuten erste Anzeichen für eine Veränderung der Zellform. Es verblieben zwar sphärische Zellen, doch konnte auch eine abgeflachtere Morphologie beobachtet werden. Die Ränder der komprimierteren Zellen waren weiterhin abgerundet, so daß von einer begrenzten Verbindung der Zellen an deren distalen Oberflächen ausgegangen wurde. Nach 20 Minuten konnte auch ein Anstieg der haftenden Zellen festgestellt werden. Zu diesem Zeitpunkt werden zahlreiche Morphologien von Endothelzellen beobachtet, die an der Amnionoberfläche haften. Am einfachsten identifizierbar ist die Beharrlichkeit runder Zellen, die sowohl an teilweise als auch an vollständig ausgebreiteten Endothelzellen haften. Die zahlenmäßig größte, jedoch am wenigsten identifizierbare Zellenmorphologie, ist die der stark ausgebreiteten Endothelzellen, die die ursprüngliche Amnionoberfäche fast vollständig bedecken. Ferner sind Endothelzellen identifizierbar, die nicht vollständig gestreckt sind.
Eine Stunde nach dem Beginn der Zellverbindung kann eine vollständige morphologische Reifung der mit Endothelzellen geimpften Amnionoberfläche beobachtet werden. Die Endothelzellen haben die Amnionoberfläche bedeckt, und der Verlust der Membrankräuselungen führt zu einer glatten Endothelzellen- Monoschichtoberfläche. Die enge Verbindung der Endothelzellen erschwert die Identifikation der Zellgrenzen, wobei die gelegentlich vorkommenden, nicht vollständig gestreckten Zellen, einen Bezugspunkt zur Bewertung der Zelleigenschaft der Monoschicht aufgrund der Topologie der darunterliegenden Dacronfasern vorsehen.
Nach einer Adhäsionszeit von 60 Minuten wurde auch die Morphologie der an dem blutplättchenreichen Plasma und dem unbehandelten Dacron haftenden Zellen ausgewertet. Bezüglich der Adhäsion von Endothelzellen an mit PRP behandeltem Dacron konnte ein Einschluß von Bereichen beobachtet werden, die frei von Zellen waren, sowie von Bereichen, in denen Zellen die Endothelzelleigenschaft einer Zellen-Zellen-Wechselwirkung aufwiesen. Von Interesse ist ferner die beobachtete deutliche Ablagerung von Fibrin auf der Oberfläche der abgeflachten Endothelzellen. Da diese Fibrinschicht vor der Impfung gebildet worden ist, gehen wir davon aus, daß Endothelzellen die Fähigkeit aufweisen, unter einer Fibrinauskleidung teilweise zu wandern, bevor sie vollständig haften und abflachen. Von großer Bedeutung ist die allgemeine Beobachtung von Bereichen, die gar kein Endothelium aufweisen und somit die Fibrinschicht offenbaren. Schließlich zeigt die Adhäsion der unbehandelten Dacronoberflächen nach 60 Minuten Endothelzellen, die teilweise um und über einzelne Dacronfasern gewickelt sind, um den Kräften zu widerstehen, die während dem Waschen vor dem Fixieren und während der Probenpräparation für eine mikroskopische Überprüfung erzeugt werden. An unbehandelten Dacronoberflächen wurden keine Flecken mehrerer Endothelzellen festgestellt.
Theoretisch könnte die Endothelialisierung eines Gefäßtransplantats durch eine Endothelzellimpfung mit geringer Dichte erzeugt werden, worauf eine Endothelzellproliferation folgt, wobei die Endothelialisierung auch durch eine Endothelzellimpfung mit hoher Dichte möglich ist oder durch Selbsteinwachsen von Endothelzellen in eine Oberfläche nach der Implantation. Die Endothelzellimpfung mit hoher Dichte und der Erzeugung einer konfluenten Monoschicht zum Zeitpunkt der Implantation stellt die beste Möglichkeit für ein nichtthrombogenes Transplantat in den ersten Wochen nach einem operativen Eingriff dar, in denen das Risiko einer Thrombose besteht. Die vorstehenden Untersuchungen wurden somit durchgeführt, um festzustellen, ob durch eine Endothelzellimpfung mit hoher Dichte innerhalb der zu einem Gefäßeingriff im Operationssaal kompatiblen zeitlichen Parameter eine morphologisch normal erscheinende endotheliale Monoschicht erzeugt werden kann. Die Versuchsbedingungen wurden auf der Basis unserer früheren Beobachtungen der Wechselwirkungen zwischen Endothelzellen und Transplantat ausgewählt. Im Gegensatz zu unseren früheren Untersuchungen wurden nur Endothelzellen mit früher Verbindung mit nur 2 vorherigen Trypsinexpositionen verwendet. Zur Untersuchung der Adhäsion wurden zwei getrennte Verfahren ausgeführt, da wir vorher festgestellt hatten, daß eine zu einer kontaktgehemmten konfluenten Monoschicht (d.h. 10 EC/cm²) kompatible Zellenanzahl bei der Rasterelektronenmikroskopie nicht immer einer konfluenten Monoschicht entspricht. Das radiometrische Verfahren der Quantifizierung der Zelladhäsion unter Verwendung mit Tritium behandelten Thymidins und Indiums, wurde als genaues Verfahren zur Messung der Anzahl von Endothelzellen verwendet, die nicht haften, die fest haften, oder die sich im Begriff der Adhäsion an der Oberfläche befinden. Durch diese Hilfsmittel konnten wir feststellen, daß innerhalb von 30 Minuten eine feste Adhäsion an mit Plasma beschichtetem Dacron erfolgt. Trotz dieser Eigenschaft der schnellen Adhäsion wird die Progression zu einer morphologisch normal erscheinenden Monoschicht verzögert. Die Endothelzellen offenbaren bei 60 Minuten eine geringe Zellen- Zellen-Wechselwirkung, und sie weisen eine "sternförmige" Morphologie anstelle einer "Kopfstein"-Morphologie auf. Obwohl die nicht-thrombogenen Eigenschaften dieser Oberfläche nicht überprüft worden sind, gibt die anomale Morphologie Grund zu der Vermutung, daß diese Endothelzellen keine idealen Bedingungen haben und den Wirkungen der Strömung vielleicht nicht genügen. Die Endothelzelladhäsion an dem mit Amnion-Kollagen beschichteten Dacron-Transplantat erfolgte langsamer als an plasmabeschichtetem Dacron, doch gestaltete sich die Konfluenzgestaltung deutlich unterschiedlich. In den ersten 20 Minuten war die Adhäsion zwar fokal, doch bildeten die Endothelzellen viele Anhaftungspunkte an der Oberfläche, und sie begannen sich abzuflachen und auszubreiten. Nach 30 Minuten erreichte der Abflachungsvorgang das maximale Ausmaß und es existierten viele Zellen-Zellen- Wechselwirkungen. Dies führte zu einer konfluenten Monoschicht an SEM, die morphologisch ähnlich natürlichem Gefäßendothelium erschien. Durch diese beeindruckende Beobachtung kann angenommen werden, daß kurz kultivierte Endothelzellen fähig sind, innerhalb eines Zeitraums eine Monoschicht zu bilden, der zu der operativen Sektion vor dem Einsatz eines Gefäßtransplantats kompatibel ist. Somit kann ein Transplantat zu Beginn des Verfahrens beimpft werden, wobei sich bis zur Wiederherstellung der Durchblutung eine konfluente Monoschicht ergibt.
Die Adhäsionsuntersuchungen an mit Amnion/Kollagen beschichtetem Dacron offenbarten, daß 77% der geimpften Endothelzellen innerhalb von 30 Minuten an der Oberfläche hafteten. Dies indiziert, daß die Mehrzahl der kurz kultivierten Endothelzellen die Fähigkeit zur Adhäsion an der Oberfläche besitzt und daß mit hoher Wahrscheinlichkeit keine Untergruppe endothelialer Zellen mit besonderen Hafteigenschaften vorhanden bzw. erforderlich ist. Da die Endothelzellen mit einer Dichte geimpft worden sind, die der einer kontaktgehemmten Monoschicht (10&sup5; EC/cm²) entspricht, gilt es ferner festzustellen, daß die subkonfluente Anhaftung (d.h. 77%) weiterhin die Anhaftung einer morphologisch konfluenten Schicht ermöglicht. Somit kann die minimal erforderliche Anzahl geimpfter Endothelzellen zur Erzeugung einer vollständigen Bedeckung eines Transplantats ohne Wachstum weniger als 7,7 x 10&sup4; EC/cm² betragen.
Die Konfluenz ist in dieser Untersuchung als vollständige Endothelzell-Bedeckung der Prothesenoberfläche gemäß der Darstellung durch eine Rasterelektronenmikroskopie definiert. Die Zellverbindungen erscheinen normal, doch können durch weitere Untersuchungen durch Transmissions-Elektronenmikroskopie die Art der existierenden Verbindungen sowie die Art der Verbindung zwischen Endothelzellen und Transplantatsubstratkombinationen bestimmt werden. Es ist bekannt, daß das Substrat eine Auswirkung auf die Morphologie und Funktion der Zellen hat, wobei dies in einem Versuch untersucht werden muß, bevor Rückschlüsse gezogen werden können. Ferner wird durch die Untersuchung der Verwendung von Amnion als Transplantatoberfläche mehr erfahren. Dieser biologisch abgeleitete Stoff steht derzeit für weitverbreitete klinische Anwendungen nicht zur Verfügung. Zusätzlich zu dem Kollagen vom Typ IV/V umfaßt das Amnion die Zellanhaftungsfaktoren von Fibronectin und Laminin. Bei Großversuchen von Gefäßtransplantaten kann es wunschenswert sein, ein Laminat zu bilden, das eine Zwischenschicht Kollagen vom Typ I/III und eine obere Oberflächenschicht Kollagen des Typs IV/V umfaßt, welche die natürliche Basalmembran imitiert. Diese Membran kann nach Wunsch ferner durch die Zusätze von Zellanhaftungsfaktoren imitiert werden, zu denen Fibronectin und/oder Laminin gehören. Unabhängig davon, ob die verwendete Basalmembarn natürlichen oder künstlichen Ursprungs ist, wird hiermit festgestellt, daß diese Nembrane vollständig zellfrei sind, durch Bestrahlung sterilisiert werden können und zur späteren Verwendung gelagert und/oder versandt werden können. Alternativ ist es möglich das Kollagen vom Typ IV/V auf der Oberfläche einer künstlichen Prothese chemisch nachzubilden.
Die aus dem vorstehend erwähnten Versuch abgeleitete Endothelzellen-Monoschicht erscheint morphologisch zwar normal, doch wurden zusätzliche Versuche (die nachstehend beschrieben sind) ausgeführt, um festzustellen, ob die Schicht andere funktionale Eigenschaften normalen Endotheliums besitzt, und zwar insbesondere in Verbindung mit der Nicht-Thrombogenität. So ist es zum Beispiel wünschenswert zu zeigen, daß die Monoschicht physiologischen arteriellen Scherbeanspruchungen widerstehen und die enthaltene Adhäsion beibehalten kann. Dies wurde nicht nur für die Adhäsion der Endothelzellen an der Basalmembran gezeigt, sondern auch für die Verbindung zwischen Basalmembran und Gefäßtransplantat sowie zwischen Anhaftungen von Endothelzellen untereinander. Aus der vorstehenden Untersuchung kann somit zu dem Schluß gelangt werden, daß die Mehrzahl der kurz kultivierten Endothelzellen aus großen Gefäßen erwachsener Menschen die Fähigkeit aufweist, innerhalb von 10 Minuten schnell an mit Plasma beschichtetem Dacron und innerhalb von 30 Minuten an mit Amnion/Kollagen beschichtetem Dacron zu haften. Die Adhäsion an unbeschichtetem Dacron setzt längere Zeiträume voraus, bis eine wesentliche Adhäsion erfolgt. Die Adhäsion von mit Amnion/Kollagen beschichtetem Dacron vollzieht sich zwar langsamer, doch handelt es sich bei dem letztendlichen Ergebnis nach 30 Minuten um eine Monoschicht endothelialer Zellen, welche das Substrat vollständig bedecken, und wobei das Erscheinungsbild auf rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen dem normaler Gefäß- Endothelzellen entspricht. Auf dem mit Plasma beschichteten bzw. unbeschichteten Dacron tritt innerhalb eines Zeitraums von 2 Stunden keine vollständige Transplantatbedeckung auf. Die Daten des mit Amnion/Kollagen beschichteten Transplantats zeigen an, daß die Erzeugung einer Monoschicht endothelialer Zellen noch in dem Operationssaal durchführbar ist, wenn eine aufnahmefähige Kombination aus Transplantat und Substrat verwendet wird.
Zur Bestätigung der funktionalen Eigenschaften der Monoschicht endothelialer Zellen, die durch die hochdichte Beimpfung auf Amnion erzeugt worden ist, sowie zur Darstellung der Wirksamkeit des Verfahrens bei der Verwendung endothelialer Zellen mikrovaskulärer Herkunft, wurde die Präparation der mit Amnion beschichteten Transplantatoberfläche gemäß der vorstehenden Beschreibung durchgeführt, wobei jedoch eine Dacron- Transplantatoberfläche verwendet wurde, die zuerst unter Verwendung eines Glimm-Plasmareinigers vobehandelt worden war, um die Oberfläche für die Kollagenbeschichtung vorzubereiten. Dieses Verfahren umfaßt die Positionierung der Prothese für 5 Minuten in einem Harrick-Plasmareiniger. Das in dieser Vorrichtung erzeugte Glimmplasma ätzt die Transplantatoberfläche und erzeugt eine stärkere Verbindung zwischen dem Kollagen und dem Transplantat.
Die Durchführbarkeit des Verfahrens wurde an einem Hund demonstriert. Ein mit Amnion beschichtetes Dacron-Transplantat wurde mit Mikrogefäß-Endothelzellen eines Hundes geimpft, und das beimpfte Transplantat wurde operativ in die Vena cava eines Hundes implantiert. Das Transplantat wurde nach zwei Tagen entfernt und die Oberfläche durch Rasterelektronenmikroskopie untersucht. Diese Untersuchung offenbarte eine Bedeckung der Oberfläche mit einer Zellschicht, welche die Verbindung von Blutzellen (weiße Blutkörperchen und Blutplättchen) hemmt. Durch diesen Versuch konnte nicht festgestellt werden, daß das gegenständliche Substrat keine unbeschränkte Durchgängigkeit aufweist. Eine in der Arterie plazierte Kontrolloberfläche wies im Gegensatz dazu die normale thrombogene Eigenschaft eines unbehandelten Polymers auf, das Blut ausgesetzt ist.
Wie dies vorstehend deutlich gemacht worden ist, offenbart die vorliegende Erfindung ein neuartiges Verfahren zur Behandlung eines Implantats zur Implantation in einem menschlichen Patienten, wobei das Verfahren die Bereitstellung eines synthetischen Substratmaterials und die Behandlung dieses Materials mit Kollagen des Typs IV/V umfaßt, um die Adhäsion menschlicher Endothelzellen, deren Prolierfation und Morphologie daran zu verbessern, In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Kollagen vom Typ IV/V als eine Oberflächenschicht zum Empfang von Endothelzellen gebunden. Vorzugsweise wird die Kollagenoberflächenschicht vom Typ IV/V als Laminat aufgetragen, das eine darunterliegende Kollagenschicht vom Typ I/III aufweist. In dem bevorzugten Ausführungsbeispiel wird das obengenannte Kollagenlaminat von menschlicher, chorioallantoischer Membran abgeleitet und umfaßt zellfreies, menschliches Amnion. Dieses Kollagenlaminat (Amnion) wird auf ein Substrat aufgetragen, das eine daran ausgebildete gebundene Zwischenkollagenbasisschicht aufweist. Die Basisschicht haftet unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie etwa Glutaraldehyd, an dem Substrat, wodurch die Oberfläche der Basisschicht weiter aktiviert wird, um eine kovalente Bindung des Kollagenlaminats an der Basisschicht zu ermöglichen. Das Vernetzungsmittel wird dann unter Verwendung von Amin, Aminosäure oder Peptid mit einer aldehydaktiven Amingruppe, wie etwa Lysin, das in gepufferter Kochsalzlösung löslich ist, deaktiviert. Nach dem Waschen zur Entfernung des Deaktivierungsmittels und des restlichen Vernetzungsmittels, ist das Transplantat zur Aufnahme einer hochdichten Impfung von Mikrogefäß-Endothelzellen bereit. Diese Mikrogefäß-Endothelzellen werden mit einer Dichte von mindestens 5 x 10&sup4;, vorzugsweise mindestens 7,7 x 10&sup4; Zellen je cm² geimpft, so daß sie auf der Transplantatoberfläche innerhalb von zwei Stunden nach der B Beimpfung eine konfluente Monoschicht bilden. Zur Zeit wird eine Beimpfung von 1-3 bzw. etwa 2 x 10&sup5; Zellen je cm² bevorzugt. Mikrogefäß-Endothelzellen werden zwar aufgrund ihrer unkultivierten, autologen Eigenschaft bevorzugt, doch können gemäß dem Umfang der vorliegenden Erfindung auch in zwei oder weniger Durchläufen kurz kultivierte Endothelzellen erwachsener Menschen verwendet werden, wenn diese Zellen zur Verfügung stehen. Da das resultierende Transplantat eine endotheliale Auskleidung autologer Endothelzellen aufweist, wird davon ausgegangen, daß dessen Durchgängigkeit insbesondere während der kritischen frühen Phase nach der Implantation stark verbessert ist. Somit wird die Verwendung dieser Transplantate für venöse Implantate und in Gefäßen mit Durchmessern von 4 mm oder weniger (Transplantate mit kleinen Durchmessern) erwägt, bei denen die Durchgängigkeitsraten ansonsten enttäuschend niedrig waren.
"Dacron" ist ein Warenzeichen von E.I. duPont de Nemours and Company, Wilmington, Delaware, wobei Dacron ein bestimmtes Polyethylenterephthalatpolyester kennzeichnet, bei dem es sich um ein Kondensationsprodukt von Methylterephthalat und Ethylenglykol handelt. Für den Fachmann mit durchschnittlichen Kenntnissen wird ferner deutlich, daß verschiedene Abänderungen von den hier beschriebenen Vorgängen und Verfahren möglich sind, ohne dabei vom Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen, der in den anhängigen Ansprüchen genauer definiert ist.
Der Begriff "Kopfstein" bezieht sich hierin sowohl auf die kennzeichnende symmetrische, endotheliale Zellen-Zellen- Morphologie, die zum Beispiel in kultivierten Rinderaorta- Endothelzellen (im Fach manchmal als "echter Kopfstein" bezeichnet) vorkommt, sowie auf zellförmige Morphologien, bei denen die Zellen im allgemeinen rund sind und dabei jedoch gewisse Vorsprünge bzw. andere asymmetrische Teilstücke aufweisen. In der Verwendung in dieser Anmeldung bezieht sich der Begriff Kopfstein im besonderen auf die Populationen endothelialer Zellen, die enge Zellen-Zellen-Verbindungen bilden, d.h., die sich so strecken, daß sie die darunterliegende Oberfläche maximal bedecken.

Claims

1. Implantierbare Prothesenoberfläche zur Implantation in einem Menschen, mit:

einem synthetischen Substrat und einer Oberflächenschicht, wobei die Oberflächenschicht mikrovaskuläre menschliche endotheliale Zellen umfaßt, die in einer Konfluenz von mindestens 50% vorhanden sind.

2. Prothesenoberfläche nach Anspruch 1, wobei zwischen dem synthetischen Substrat und der Oberflächenschicht, welche menschliche endotheliale Zellen umfaßt, eine Kollagenschicht vom Typ IV/V vorhanden ist.

3. Prothesenoberfläche nach Anspruch 1 oder 2, ferner mit einer zwischenliegenden Proteinschicht.

4. Prothesenoberfläche nach Anspruch 2 oder 3, wobei es sich bei der Proteinschicht um eine Zwischenkollagenschicht handelt, die sich zwischen dem Substrat und der Kollagenschicht vom Typ IV/V befindet.

5. Prothesenoberfläche nach einem der vorstehenden Ansprüche, mit einem Bindemittel, welches das Substrat mit der Oberflächenschicht verbindet.

6. Prothesenoberfläche nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Bindemittel um Glutaraldehyd handelt, und wobei die freien Aldehydgruppen des Glutaraldehyds nach der Verbindung im wesentlichen deaktiviert worden sind.

7. Prothesenoberfläche nach Anspruch 4, wobei es sich bei der Zwischenkollagenschicht und der Kollagenschicht vom Typ IV/V um menschliche Chorioallantoismembrane handelt.

8. Prothesenoberfläche nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die endothelialen Zellen unkultivierte, autologe, endotheliale Zellen darstellen.

9. Prothesenoberfläche nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die endothelialen Zellen vor der Implantation konfluent sind.

10. Prothesenoberfläche nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die endothelialen Zellen autologe, endotheliale Zellen darstellen, die eine im wesentlichen flache Kopfstein-Morphologie darstellen.

11. Prothesenoberfläche nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Prothesenoberfläche um die Oberfläche eines vaskulären Transplantats mit einem Innendurchmesser von nicht mehr als etwa 4 mm handelt.

12. Verfahren zur Behandlung eines zur Implantation in einen Menschen gedachten Implantates, folgende Schritte umfassend:

(a) Bereitstellung eines synthetischen Substratmaterials;

(b) Verbindung einer Zwischenkollagenschicht mit dem Substratmaterial;

(c) Verbindung einer Kollagenoberflächenschicht vom Typ IV/V mit der Zwischenkollagenschicht; und

(d) Kleben der mikrovaskulären, menschlichen, endothelialen Zellen an die Kollagenoberflächenschicht vom Typ IV/V, mit einer Konfluenz von mindestens 50% vor der Implantation.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Kollagenschichten unter Verbindung eines Bindemittels verbunden sind, das nach der Verbindung und vor der Implantation deaktiviert wird.

14. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Kollagenoberflächenschicht vom Typ IV/V durch Verbindung der Zwischenkollagenoberfläche der menschlichen Chorioallentoismembran mit der Zwischenkollagenschicht gebunden wird.